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CN1154717C - 改良无限增殖化人类皮肤细胞系和用于其生产的新型无血清培育基 - Google Patents

改良无限增殖化人类皮肤细胞系和用于其生产的新型无血清培育基 Download PDF

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Abstract

本发明涉及改良的连续(无限增殖化)细胞系,特别是从正常人类皮肤组织衍生的角化细胞和黑素细胞。本发明也涉及用于分离、生产和保持所述改良的无限增殖化角化细胞系和黑素细胞系的新型无血清培养基。本发明也涉及在无血清的条件下、不加任何饲养细胞生产原代角化细胞和黑素细胞的方法。

Description

改良无限增殖化人类皮肤细胞系和用于 其生产的新型无血清培育基
本发明涉及从正常人类皮肤组织衍生而来的,特别是从保持有表达分化角化细胞或分化黑素细胞的特征性分化蛋白质的角化细胞和黑素细胞衍生而来的改良连续性(无限增殖化)细胞系,这些细胞即使是多次传代仍保持这种能力。本发明还涉及到不需要使用饲养细胞的新型无血清培养基。
发明背景
生产从人类皮肤组织衍生来的无限增殖化细胞系以前已有报道。通常这些方法包括用提供无限增殖化的因子转染或转化体外培养的人类皮肤细胞,例如角化细胞和黑素细胞。
无限增殖化是指能够长时间在体外培养的细胞的生产,理想的是无限制性生产。这些细胞也称为连续细胞系。相反,非无限增殖化细胞在体外仅能生长有限的几个细胞分裂周期。非常需要无限增殖化细胞,因为它们提供一个具有确定特征而且稳定的、可能有无限来源的细胞。用于生产无限增殖化细胞系和无限增殖化人类皮肤细胞系的传统因子具体包括病毒、重组病毒、以及包含提供无限增殖化DNA序列的质粒。
生产无限增殖化人类细胞系最通常的方法可能是用SV40序列,更准确地说是用SV40大T抗原DNA作为无限增殖化试剂。例如,Steinberg等, J.Cell Phys.,123:117-125(1985);Reddel等,颁发于1989年12月5日的美国专利4,885,238;Major,颁发于1987年11月17日的美国专利4,707,448;Stoner等, Cancer Res.,51:365-371(1991);Chopra等, In Vitro Cell Dev.Biol.,30A:539-546(1994);Chopra等, In Vitro Cell Dev. Biol.,27A:763-765(1991);Christian等, Cancer Res.,47:6066-6073(1987);Rhim等, Science,227:1250-1252(1985);和Grubman等Gastrointest.Liver Physiol.,29:G1060-G1070(1994),这些报道描述了用SV40载体和包含SV40大T抗原序列的载体来生产人类无限增殖化细胞系。这些序列的插入一般是用SV40病毒或杂种腺病毒-12与SV40的杂交病毒来感染细胞,或通过磷酸锶共沉淀,用包含Rous肉瘤病毒长末端重复序列和Ori-SV40早期区域的重组质粒来转染细胞。(见Brash等, Mol.Cell.Biol.,7:2031-2034(1987))。
无限增殖化细胞系,特别是无限增殖化人角化细胞的另一生产方法涉及用人类乳头状瘤病毒DNA序列来转染或感染细胞。例如,由Schlegel在1994年12月27日颁发的第5,376,542号美国专利描述了用分离的HPV-16、18、31、33、或35的E6和E7基因或单独的E7基因使人上皮细胞无限增殖化,生产非致瘤的无限增殖化细胞系。另外,Barbosa等, Oncogene,4:1529-1532(1989)和Münger等, J.Virol.,63(10):4417-4421(1989)指出,用HPV-16和HPV-18的E6和E7基因来生产无限增殖化的人类角化细胞。
许多研究组已报道了无限增殖化细胞株及它们在体外分析中的用途,以前的无限增殖化角化细胞系和黑素细胞系通常表现出使其应用有缺点的一个或几个性能。例如:以前报道的无限增殖高化角化细胞表现出以下一个或几个特征:(i)降低或丧失分化标记的表达,该标记例如为正常分化角化细胞所表达的蛋白质,(ii)改变组织培养中的生长特征。
例如Jetten等, J.Invest.Dermatol.,92:203-209(1989)报道了用NHEK-SV40-T8-1载体多次传代后(>12代)获得的SV40无限增殖化角化细胞,这种细胞不能分化。同样,Bernard等, Cancer Res.,45:1707-1716(1985)报道了分离一个称为SVK14的无限增殖化角化细胞系,据报道这种细胞系几乎完全不能分化,而且该细胞系不表达角蛋白K1/10(>53kD)和50D角蛋白(角蛋白K14),这些角蛋白在正常的分化细胞中能够表达。
Steinberg等, J.Cell.Physiol.,123:117-125(1985)报道了一种SV40转化角化细胞,这种细胞逐渐丧失表达角蛋白的能力,而这些角蛋白是正常角蛋白细胞骨架的特征性蛋白质。这种正常角蛋白表达的丧失发生在大约10-15次传代以后。另外,Hronis等, Cancer.Res.,44:5797-5804(1984)报道了一种SV40 DNA无限增殖化角化细胞,这些细胞丧失产生角蛋白K5、K6、K14/15、K16和K17以及角化细胞蛋白(involucrin)的能力,这些蛋白质是正常分化角化细胞的特征性蛋白质。再者,Morris等, Proc.Natl.Acad.Sci.USA,82:8498-8502(1985)指出,SV40无限增殖化细胞系在多次传代后(>14代),表现了II型和I型角蛋白表达的高度降低。如这些角化细胞几乎不表达K13( Id.)。
此外,Banks-Schegel等, J.Cell.Biol.,96:330-337(1983)公开了在组织培养中表现改变生长特性的SV40无限增殖化角化细胞。例如,不同于正常角化细胞,这些无限增殖化细胞需要3T3饲养层来进行生长。
以前描述的生产无限增殖化人类角化细胞和黑素细胞的方法一般使用饲养细胞技术(其中成纤维细胞通常作为“饲养”细胞)一般在含血清的培养基中培养。例如,Sexton等“人类细胞的稳定转染:HPV无限增殖化”,Keratinocyte Methods,Leigh.I.M.等编辑,大学出版,179-180,(1994);Garlick,“逆转录病毒载体”,Keratinocyte Methods,(Leigh I.M.等编辑,剑桥大学出版,181-183(1993))指出在无限增殖化角化细胞的分离和生产中使用含胎牛血清和饲养细胞的培养基。
以前已描述了在无限增殖化上皮细胞系,更准确地说是人类角化细胞的分离和生产期间使用无血清培养基。例如Barbosa等, Oncogene,4:1529-1532(1989)描述了最初在低钙、无血清培养基中培养通过电穿孔或脂质转染转染的人类角化细胞,直到细胞铺满。
然而,尽管以前已有这方面的报道,但本领域仍非常需要具有改良性能的无限增殖化人类角化细胞和黑素细胞,这些细胞特别是甚至在多次传代后仍保持正常的角化细胞和黑素细胞的分化潜力,并能表达分化黑素细胞和角化细胞的特征性分化蛋白质。这类细胞对许多应用都非常有利,特别是在需要分化皮肤细胞的分析中。另外本领域还需要改良培养基,该培养基能培养原代和无限增殖化角化细胞和黑素细胞的,还需要不需要使用饲养细胞的改良培养方法。
本发明的目的
至此,本发明的目的是生产从正常人皮肤组织衍生而来的改良连续(无限增殖化)细胞系,特别是生产从正常人皮肤组织衍生来的在多次传代后仍保持分化能力和表达分化蛋白质的无限增殖化角化细胞系和/或黑素细胞系。更确切地说,本发明的目的是获得保持表达角蛋白、细胞色素和其它分化蛋白质的能力的无限增殖化角化细胞,这些分化的蛋白质如角化细胞蛋白、人上皮结构蛋白(filaggrin)、细胞外被蛋白(loricrin),这些蛋白质在传统的无限增殖化角化细胞系中不表达或低水平表达。本发明的另一个目的是获得无限增殖化的角化细胞和黑素细胞,这些细胞能够表达分化的角化细胞和黑素细胞正常表达的酶,特别是例如谷胱甘肽-S-转移酶的II相酶以及参与细胞氧化和炎症反应的酶和/或蛋白质。
本发明的另外一个目的是提供新型无血清培养基,用于在组织培养中培养、生产、维持正常或连续的角化细胞和/或黑素细胞。这些新型无血清培养基还可用于分离、建立和无限增殖化人类皮肤细胞,以获得按照本发明的连续角化细胞和黑素细胞。本发明的再一目的是为培养角化细胞提供一个完全规定性的培养基(没有未知或不定的添加物),而不用含肾上腺素的饲养细胞,已惊奇地发现肾上腺素为在无血清培养基中正常角化细胞的强生长增强剂。
本发明的另一目的是提供一个分离、建立和无限增殖化人类皮肤细胞的新方法,以获得从正常皮肤组织衍生来的连续角化细胞细胞系和连续黑素细胞细胞系,所述方法使用无血清培养基,这种细胞外被层含有纤维粘连蛋白、BSA和I型胶原蛋白,不带“饲养细胞”(如成纤维细胞),适合细胞附着生长。
本发明的另一目的是提供在无血清的条件下,不用任何饲养细胞产生的原代角化细胞或黑素细胞,所述原代角化细胞或黑素细胞用于皮肤移植和体内遗传治疗。
本发明的另一目的是提供这类新的改良连续角化细胞系和黑素细胞系的使用方法,例如用于免疫学、药理学、光和化学毒理学的皮肤反应分析和用于异源基因的表达。
附图简述
图1比较了非无限增殖化的DKO-NR角化细胞在三种不同培养基中6天的生长(根据细胞数目),三种培养基是NR-3、补充肾上腺素的修饰MCDB153和MCDB153。
图2a描绘最好用来无限增殖化题述黑素细胞和/或角化细胞的SV40逆转录病毒构成物pLXSHD+SV40(#328)。
图2b描绘HPV16逆转录病毒构成物pLXSHD+E6/E7。
本发明的详细说明
本发明提供从正常人皮肤组织衍生来的连续(无限增殖化)细胞系,即无限增殖化的角化细胞和黑素细胞,这些细胞保持分化能力,甚至在多次传代中仍保持表达正常角化细胞或黑素细胞所表达的分化蛋白质的能力。多次传代是指在培养中至少10代,优选至少20-30代,更优选为50代,理想的是无限制传代。例如,依照本发明产生的无限增殖化角化细胞即使在组织培养中多次传代后仍表达分化蛋白质角蛋白K1/10、角蛋白K14、角化细胞蛋白、人上皮结构蛋白和细胞外被蛋白。这与以前所报道的无限增殖化角化细胞形成对比,以前报道的角化细胞不表达或低水平地表达这些分化蛋白质。
另外,本发明提供在无血清和无饲养细胞的条件下产生的原代角化细胞和黑素细胞,它们保持分化和表达角化细胞和黑素细胞的特征蛋白质的能力。
题述无限增殖化角化细胞具有细胞色素P450的描绘(CYP450),如果不与正常角化细胞相同,也与其类似。例如题述细胞表达CYP4503A5,而不表达CYP450 3A4。另外,与正常的非无限增殖化角化细胞一样,题述无限增殖化角化细胞表达II相酶,如谷胱甘肽-S-转移酶(GST),更准确地说,是表达GSTα、GSTμ和GSTπ。
此外,与正常角化细胞类似或相同,题述无限增殖化角化细胞表达参与细胞氧化和炎症反应的蛋白质和酶(如超氧化物岐化酶(SOD))用佛波醇酯处理后的I型胶原酶和肿瘤坏死因子α(TNFα)。具有以上特性的细胞系提供了一个高度稳定、能再生长的细胞来源,这些细胞能用于免疫学、药理学、炎症、光毒理学和化学毒理学皮肤反应研究。
而且,题述无限增殖化黑素细胞表达内源性的、与黑色素有关的蛋白质(见以下的实施例14-15)。
另外,当将题述无限增殖化角化细胞系和黑素细胞系在有机型培养基中培养时,形成高度分层和极化的、具有角质化表面层的上皮。这种上皮以前仅在传统培养条件下得到,如用含有血清的培养基、饲养层技术得到(见Lechner等, Virology,185:536-571,1991)。
另外,题述无限增殖化角化细胞和黑素细胞是在无血清、不用任何饲养细胞的条件下从正常皮肤得到的。通常题述无限增殖化角化细胞和黑素细胞通过以下几个步骤获得:
(i)获得人类皮肤组织样本;
(ii)制备用于体外培养的所述皮肤样本;
(iii)从所述制备的皮肤样本获得角化细胞和/或黑素细胞,再将所述角化细胞和/或黑素细胞接种到培养皿上的无血清生长培养基中,最好不是NR-3培养基,就是NR-4培养基(为黑素细胞用)(见后说明),该培养皿备有包含纤维粘连蛋白、I型胶原蛋白和BSA的外被层,能促进细胞附着和生长;
(iv)必要时更新培养基,使培养细胞的铺满生长最佳化,同时连续保持培养皿上的外被层;
(v)将角化细胞和黑素细胞转移到预铺外被层的培养皿上的选择性培养基中,最好是无血清培养基;
(vi)用逆转录病毒构成物-SV40或乳头瘤病毒16的构成物来感染角化细胞或黑素细胞,诸如SV40质粒pLXSHD+SV40(#328)或pLXSHD+E6/E7质粒,前者包含猿猴病毒40的大T抗原(TAg),后者含有乳头瘤病毒16(HPV16)的E6/E7基因(见后说明)。
(vii)将产生的无限增殖化角化细胞或黑素细胞转移到同样预铺外被层的培养皿上的增殖培养基中,这种培养基适合于无限增殖化角化细胞或黑素细胞的增殖,最好不是NR-2培养基,就是NR-3培养基(见后说明)以及黑素细胞培养基M2(来源为M.Olsson,皮肤病学研究所,乌浦沙拉,瑞典)。
(viii)将重产生的增殖角化细胞转移到预铺外被层的培养皿上的分化培养基中,最好是NR-2培养基(见后说明)或修饰MCDB153培养基(说明见后),后者含高钙,最好为1.5mM(Boyce等,J.Tissue Cult.Meth.,9:83-93,1985;Pittlekow等, T.Invest.Dermatol,86:410-417,1986)。
更具体地讲,步骤(i)通常包括从捐献人获得人皮肤组织样本,例如从外科或儿科获得的那些样本。单个皮肤细胞样本(即自体皮肤细胞样本)的无限增殖化允许表现出限定特征的无限增殖化角化细胞和黑素细胞系的生产,这些特征例如为具有特定捐献者特征性的特定受体描绘。
然后在步骤(2)中制备皮肤样本,使得它适于体外培养。这最好通过最初例如采用用于培养的相同培养基清洗皮肤样本来实现。这最好在NR-2培养基中实现,该培养基为无血清培养基,其具体组成在下面公开,已发现这种培养基在培养正常角化细胞和黑素细胞上具有优越性。清洗后,皮肤样本最好用植皮刀修剪,然后切成小片。
将产生的皮肤切片分离为真皮和表皮,这可以用物理和/或酶学方法实现。例如可以通过胰蛋白酶消化实现,例如在含有EDTA(例如0.1%)的蛋白酶溶液中(例如0.5%)漂浮皮肤片段足够时间,促使细胞分离,例如在37℃约需30-60分钟,或在4℃下需过夜。
分离真皮(分离成纤维细胞,见实施例2)后,然后将表皮放入一悬浮培养基中。悬浮培养基最好含有大豆胰蛋白酶抑制剂溶液(SBTI),应与细胞接触足够长的时间,通常是5分钟,以便失活胰蛋白酶并提供细胞释放。随后加入组织培养基,最好是无血清NR-2培养基(说明见后),并过滤(用100mm滤膜)以获得所需的细胞,即角化细胞和/或黑素细胞。
然后,将步骤(ii)中得到的所得原代角质形成/黑素细胞培养物,以合适的细胞浓度,最好大约为1.2×104细胞/cm2,接种到预铺外被层的培养皿上的无血清培养基中,最好是NR-3培养基(说明见后)。但该细胞浓度可在宽范围内变动。培养皿最好连续覆盖一种组合物,已惊奇地发现该组合物显著提高角化细胞和黑素细胞的附着和生长,更准确地说该组合物是含纤维粘连蛋白、BSA和1型胶原蛋白的一种溶液。该细胞覆盖组合物以前已报道用于支气管细胞。(Lechner等, J.Tissue Cult.Meth.9:43-48(1885)),该文献通过引用结合到本文中。
在步骤(iv)中,尽可能地经常更换培养基,以使细胞生长最佳化。最好二天更换一次培养基。但更换时间可根据具体的皮肤样本来确定。当达到几乎全部铺满时,例如大约90%铺满,一般发生在10-14天后,角化细胞和黑素细胞就分离开来。这能通过提供合适的细胞分离的任何手段来完成,而该手段对角化细胞和/或黑素细胞没有不利影响。例如,这可以通过差别胰蛋白酶消化过程来实现。最好用胰蛋白酶/EDTA溶液处理角化细胞或黑素细胞,然后将其转移到选择性培养基中。在角化细胞的情况下,细胞最好用胰蛋白酶/EDTA溶液(0.025%/0.01%)处理大约5-10分钟,然后在步骤(v)中接种到预铺外被层的培养皿上的NR-3培养基中。重要的是应当注意到,与黑素细胞相比,NR-3培养基更促进角化细胞的生长。在黑素细胞的情况下,细胞最好用胰蛋白酶/EDTA(0.025%/0.01%)处理大约2-4分钟,然后在步骤(v)中接种到预铺外被层的培养皿上的NR-4培养基中。重要的是应当注意到,NR-4培养基专一性地抑制角化细胞的生长。
这些细胞然后用无限增殖化因子来处理。或者可以将细胞例如在液氮中冷冻,直至进行无限增殖化。最好用由Stockshlaeder等描述的(基因库,登记号M64753;Stockshlaeder等,人类基因治疗(Human Gen.Therapy), 2,33-39,1991)、图2a中描述的SV40构成物(鉴定为pLXSHD+SV40(#328))或用图2b中描述的鉴定为pLXSHD+E6/E7的HPV16构成物来实现感染和无限增殖化。在pLXSHD+SV40(#328)构成物与其它序列一起,含有SV40 T-Ag序列、SV40的5’和3’LTR序列、提供在大肠杆菌中复制的PBR322序列、一个多克隆位点和SV40多腺苷酸化序列。pLXSHD+E6/E7构成物除含有T-Ag外,还包含人类乳头瘤病毒16的E6/E7基因的NcoI/CfoI片断。构建E6/E7质粒的方法是以Dürst等(Dürst等,1987,Oncogene 1:251-256)为根据的。无限增殖化后,不许必要时细胞在培养期间传代,然后将产生的无限增殖化细胞转移到步骤(vii)中的增殖培养基中。在角化细胞的情况下,该转移最好在第二代进行。
在步骤(viii)中,无限增殖化细胞在增殖培养基中增殖,该培养基用于无限增殖化角化细胞或黑素细胞,包括一种无血清培养基,最好包括NR-2或NR-3和用于黑素细胞的M2-培养基(说明见后)。然后,将无限增殖化细胞在连续预铺外被层的培养皿上培养,外被层含纤维粘连蛋白、BSA和1型胶原蛋白的溶液。
无限增殖化细胞在增殖培养基增殖后,在步骤(viii)中将它们转移到提供正常和无限增殖化角化细胞分化的培养基中。该培养基最好包括NR-2或含高钙(最好大约1.5mM钙)的修饰型MCDB153培养基,培养在连续涂有纤维粘连蛋白、BSA和I型胶原蛋白溶液的外被层的培养皿中进行。
如上所述,已惊人地发现,按照此方法生产的无限增殖化角化细胞系和黑素细胞系保持分化并表达正常分化角化细胞和黑素细胞特征性分化蛋白质的能力,即使在组织培养中多次传代,即最少10次传代后仍如此。例如,题述无限增殖化角化细胞多次传代后表达角蛋白和其它一些蛋白质,例如角化细胞蛋白、人上皮结构蛋白和细胞外被蛋白.,以前报道的SV40无限增殖化角化细胞不表达或低水平表达这些蛋白质。
更具体地讲,依照本发明产生的几个无限增殖化角化细胞系DK2-NR、DK3-NR和FK2-NR(见下面表7和表8),即使在多次传代后(>30代)仍表达分化蛋白质角蛋白K1/10、角蛋白K14、角化细胞蛋白、人上皮结构蛋白和细胞外被蛋白。
另外,依照本发明产生的无限增殖化角化细胞具有CYP450的描绘,如果不与正常人角化细胞相同,也与其相似。例如,题述无限增殖化角化细胞表达CYP450 1A1、2C、2E1和3A5,但不表达CYP4501A2、2A6、2B6和作为正常角化细胞细胞色素450描绘特征的2D6。这第一次证明了正常的和无限增殖化人类角化细胞表达CP450 3A5,而不是CYP450 3A4。
而且,题述无限增殖化角化细胞系表达II相酶,如谷胱甘肽-S-转移酶(GST),可与正常分化角化细胞相比拟。更准确地说,与正常角化细胞类似,题述无限增殖化角化细胞系表达GSTα、GSTμ和GSTπ。
此外,与正常角化细胞类似,题述无限增殖化角化细胞表达参与细胞氧化和炎症反应的酶和蛋白质。例如,依照本发明产生的无限增殖化角化细胞表达超氧化物歧化酶(SOD)。另外,按照本发明产生的无限增殖化角化细胞对佛波醇酯有反应,产生I型胶原酶(炎症的介质)和TNF-α(肿瘤坏死因子α)。
题述黑素细胞有能力表达黑色素相关蛋白质和中间丝蛋白。
而且,题述无限增殖化细胞系在有机类型的培养基中生长时,形成高度分层和极化的上皮,这种上皮具有角质化的表面层(角质层),即使在多次传代后(>20代)仍如此。以前报道的无限增殖化角化细胞系只有在传统的培养条件下,即用含血清的培养基、用饲养层时才有这种特性。
题述无限增殖化细胞系是在培养期间在完全无血清、不用任何饲养层的培养条件下得到的。
此外,如后面更详细描述的,已惊奇地发现肾上腺素在用于无血清培养基时,是正常人角化细胞的强生长因子。具体地说,后面描述的NR-3培养基含有肾上腺素,后者已发现促进正常角化细胞的生长(见图1)。这是一个相当让人吃惊的事实:以前曾报道过肾上腺素抑制角化细胞的生长(Harlprin, J.Invest..Dermatol.,81:553-557(1983)或对角化细胞的生长仅有中等作用(Koizumi等, J.Invest.Dermatol.,96:234-237,1991)。
另外,已吃惊地发现用于培养原代和无限增殖化的角化细胞和/或黑素细胞的培养皿的连续外被层,特别是含有纤维粘连蛋白、BSA、和I型胶原蛋白的外被层既能促进角化细胞和黑素细胞贴附于培养皿上,又能促进细胞的生长。这种外被层材料的使用用于无限增殖化角化细胞和/或黑素细胞以前未见报道。
如上所述,本发明还特异性地提供了一个新型无血清培养基—称为NR-3培养基。这种培养基允许在无血清、不用饲养层的条件下,培养和分离来自人类皮肤的正常角化细胞和/或黑素细胞。已发现该培养基促进正常角化细胞的生长,而且允许不用与血清或饲养细胞有任何接触而建立正常角化细胞培养物。
NR-3培养基具体的组成见表1的说明。该培养基包含各种氨基酸、作为微量元素的无机盐、维生素、生长因子和其它组分。如该培养基包含作为生长因子的表皮生长因子(EGF重组体)、胰岛素、皮质醇、铁传递蛋白(人类)、牛脑垂体提取物和肾上腺素。如上所述,已经发现肾上腺素在组织培养中促进原代角化细胞的生长。
关于氨基酸,该培养基含有L-丙氨酸、L-精氨酸-盐酸、L-天冬酰胺-H2O、L-天冬氨酸、L-半胱氨酸-HCl-H2O、L-谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、L-组氨酸-HCl-H2O、L-异亮氨酸、L-亮氨酸、L-赖氨酸-HCl、L-甲硫氨酸、L-苯丙氨酸、L-脯氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-色氨酸、L-酪氨酸和L-缬氨酸。
该培养基包含的无机盐是:偏钒酸铵、钼酸铵、氯化钙、硫酸铜、硫酸铁、氯化镁、硫酸镍、氯化钾、乙酸钠、碳酸氢钠、氯化钠、磷酸氢二钠、丙酮酸钠、亚硒酸钠、硅酸钠、氯化锡和硫酸锌。
NR-3培养基中含有的维生素为d-生物素、d-泛酸钙、氯化胆碱、维生素B12、叶酸、i-肌醇、尼古酰胺、吡哆醇和核黄素。
该培养基还含有腺嘌呤、乙醇胺、磷酸乙醇胺、酚红钠、二盐酸腐胺、盐酸硫胺素、硫辛酸、胸苷、葡萄糖、HEPES和抗生素(两性霉素B、青霉素和链霉素)
表12中描述了NR-3培养基的推荐组成。但是预计NR-3培养基中含有的组成浓度可在宽范围内进行变化。更详细地说,预计各种组分的量可在表12公开的±50%至±0.1%的范围内变化,更优选在±10%至±0.1%的范围内变化。此外,预计前面列举的一个或多个组分可以删除,并且可以加入其它组分,前提是这类组分对角化细胞或黑素细胞的原代细胞培养物和无限增殖化细胞系的分离和建立大致没有副面影响。本领域技术人员可以通过实验和错误分析来确定这一点。
如上所述,NR-3无血清培养基的一个重要组分是肾上腺素。已发现肾上腺素对原代人角化细胞具有很强的生长促进活性。
肾上腺素促进角化细胞增殖的原因尚不清楚。有报道人类角化细胞表达用于肾上腺素合成的酶,而且表达高浓度的β-2-肾上腺素受体(Schallreuther等,“人类表皮中儿茶酚胺的产生”, Biochem.& Biophys. Res.Commun.,189:72-78(1992))。这些酶参与儿茶酚胺的生物合成路线,特别是苯乙醇胺-N-甲基转移酶和依赖生物喋呤的酪氨酸羟化酶。相比之下,这类酶的活性在黑素细胞和成纤维细胞中不能检测到。相应的,该酶活性和/或受体表达能够解释肾上腺素调节角化细胞增殖的能力。
本发明人假设NR-3培养基促进原代细胞培养物和细胞系的分离和建立,因为它抑制细胞分化,而细胞分化会导致保持分化并表达正常角化细胞和黑素细胞表达的蛋白质和酶的能力的细胞的富集。
更确切地说,相信角化细胞或黑素细胞在含血清培养基中的生长有助于第一代的分化。但这是不利的(在初始培养阶段),因为分化细胞生长不好。这依次造成过度生长和选择仅具有很弱分化能力的增殖性皮肤细胞。结果是,如果在无限增殖化之前将血清加入该培养基中,那么具有高度分化能力的细胞数目减少。
相反,在本发明中,角化细胞和黑素细胞在无血清培养基中和抑制角化细胞和黑素细胞分化的条件下培养。在本发明中,无血清培养基最好在整个培养阶段使用,既在无限增殖化前和无限增殖化期间,又在增殖和分化期间使用。
如上所述,题述NR-3无血清培养基抑制角化细胞的分化,因此便于改善角化细胞原代细胞培养物和由其衍生的无限增殖化细胞系的分离。而且,这种无血清培养基的钙浓度低,这选择性地抑制共分离的成纤维细胞的生长。这产生一个高选择性的生长培养基,它促进主要含有角化细胞和黑素细胞的培养物的生长。相应的,因为题述无血清NR-3培养基抑制角化细胞的分化,也抑制成纤维细胞的生长,所以这种培养基具有优势。
如上所述,从单个皮肤样本产生的细胞悬浮液包含游离的黑素细胞、角化细胞和成纤维细胞,该细胞悬浮液最好在题述NR-3培养基中培养。这可通过将这类细胞接种到连续覆盖一组合物的培养皿上来实现,该组合物促进细胞的附着。该外被层最好由纤维粘连蛋白、牛血清白蛋白和I型胶原蛋白的混合物组成。这种外被层或“鸡尾酒”外被层以前曾有报道用于支气管细胞(Lechner等, J.Tiss.Cult.Meth.,9:43-48(1985))。本发明人已经发现该鸡尾酒也促进角化细胞和黑素细胞附着于塑料培养皿上。而且惊奇地发现,用来培养原代和无限增殖化角化细胞的培养皿的连续外被层还促进细胞生长。未见报道培养皿的连续外被层用于无限增殖化角化细胞或黑素细胞。
在原代细胞的培养期间,当它们达到或大致达到铺满时,就将其分离,并在其它具有外被层的培养基上进行扩增。一般来说,细胞培养物大约每10-14天扩增一次。
当原代黑素细胞和/或角化细胞在NR-3无血清培养基中,用所述具有外被层的培养皿培养并扩增到所需细胞数目后,将它们无限增殖化。最好将呈现最佳生长性的黑素和角化细胞无限增殖化。然而,扩增性的原始黑素细胞或角化细胞可选择地在无限增殖化前使用,如用于分析、皮肤移植或基因治疗中。
黑素细胞和角化细胞的无限增殖化都可以用提供表达SV40 T抗原或表达人乳头瘤病毒16(HPV16)的E6/E7基因的载体来实现。最好通过用提供表达SV40 T抗原或HPV16的E6/E7基因的逆转录病毒构成物来感染黑素细胞或角化细胞,实现无限增殖化。细胞T-抗原感染是以下Pfeifer等Meth.Cell.Sci.,17:83-89,1995的操作步骤为基础(除非病毒从DEME、10%的胎牛血清中形成(forwing)的包装细胞系中收集)。在感染期间,可用含血清的培养基。但对于黑素细胞和角化细胞,最好使用无血清培养基,最好是例如Pfeifer等的论文( Meth.Cell.Sci.,14,83-89(1995))中描述的PC-1培养基,该文献通过引用结合到本文中。最优选的是用称为pLXSHD+SV40(#328)或pLXSHD+E6/E7的逆转录病毒构成物来实现无限增殖化,pLXSHD+SV40(#328)示于图2a中,并基于Pfeifer等和Stockshlaeder等(基因库,登记号M64753),而pLXSHD+E6/E7示于图2b中,并基于Düret等,1987,Oncogene 1,251-256。
无限增殖化后,采用预铺外被层的培养皿将无限增殖化细胞系转移到增殖培养基中,最好是NR-2或NR-3,或M2(用于黑素细胞)。在细胞增殖到所需细胞数目后,将细胞转移到适于培养正常和无限增殖化角化细胞培养的鉴别性培养基中。最好这包括NR-2培养基或含有高钙(1.5mM)的修饰型MCDB13培养基或M2培养基(用于黑素细胞),采用预铺外被层的培养皿(同样是含有BSA、I型胶原蛋白、纤维粘连蛋白的外被层)。
如上所述,按照本发明生产的预先分化的无限增殖化角化细胞和黑素细胞系表现出改良性能,使这些细胞能够很好地适用于需要分化人皮肤细胞的分析中。特别是已发现这些细胞系甚至在多次传代后,仍表达正常分化黑素细胞和角化细胞的特征性蛋白质。
例如,当按照本发明生产的无限增殖化角化细胞用Western印迹法和RT-PCR法分析时,它们具有细胞色素P450(CYP450)的描绘,如不等同于也类似于正常的角化细胞。更具体地讲,按照本发明生产的无限增殖化角化细胞表达CYP450的1A1、2C、2E1、3A5,而不表达CYP450的1A2、2A6、2B6和2D6。这种CYP450的描绘与正常角化细胞一致。这一代谢描绘对于无限增殖化角化细胞以前未见报道。实际上,这是第一次能够证明正常和无限增殖化角化细胞表达CYP450的3A5而不是CYP450的3A4。另外,按照本发明生长的无限增殖化角化细胞用对抗体特异性的分化标志分析时,发现即使在多次传代后仍表达其它分化蛋白质。更准确地讲,题述细胞系甚至在多次传代后,即十代或更多代后,表达分化蛋白K1/10、角蛋白K14、角化细胞蛋白、人上皮结构蛋白和细胞外被蛋白。
题述无限增殖化角化细胞和黑素细胞也摄取外源性必需脂肪酸(EFA),并表现出与正常黑素细胞和角化细胞高度一致的EFA减饱和作用和链延伸作用。
此外,如后面更详细描述的,题述无限增殖化角化细胞当用波佛醇酯处理时,表达TNFα和炎症传递质I型胶原酶,类似于正常角化细胞。此外,题述角化细胞与正常细胞相似,表达超氧化物歧化酶-一种参与细胞氧化。
另外,按本发明生长的无限增殖化角化细胞用黑素生成诱导剂(如茶碱和酪氨酸)和黑素生成抑制剂(如曲酸)处理时,发生类似于正常黑素细胞的反应。
由于具有这些特性,题述无限增殖化角化细胞和黑素细胞很好地适用于免疫学、病理学、光毒理学和化学毒理学的皮肤反应研究。
例如,题述无限增殖化角化细胞系和黑素细胞系与原代黑素细胞和角化细胞系都可以用于需要分化皮肤细胞的分析中,如重建皮肤的屏障功能研究(角质化)、分化角化细胞的代谢研究(脂肪酸代谢、抗氧化代谢)、与紫外辐射对皮肤细胞的作用有关的研究、与潜在皮肤刺激物和皮肤致敏物对皮肤细胞作用有关的研究、测定一些化合物对黑色素产生作用的研究、脂类代谢的研究,用异生物质(如润肤油、筛选假定的保护性化合物,如光保护因子)进行的局部处理、皮肤炎症和刺激的研究等等。
另外,按本发明生产的无限增殖化角化细胞系和黑素细胞系以及原代黑素细胞和角化细胞能用于潜在抗肿瘤治疗化合物和皮肤病治疗化合物的筛选。这通常包括将该细胞系或原代细胞暴露在这类化合物中一段时间,确定它们是否会诱导任何副作用,如遗传毒性、DNA加合物的形成、诱变性、细胞转化或细胞毒性。
另外,题述黑素细胞系和角化细胞系都适用于重组蛋白质(如人类蛋白质和多肽)的表达以及RNA和DNA的生产。
此外,题述无限增殖化细胞系具有潜在的体内基因治疗的实用性。这些细胞系应该提供一个有用的工具,用于基因导向和研制表达所需基因产物的遗传工程细胞,例如用于治疗应用,或用于细胞毒性/诱变剂研究。而且,已知题述细胞系精密地模拟正常皮肤细胞,它们应该很好地适用于生物敏感性的分析。
另外,按本发明生产的原代角化细胞和黑素细胞,已知它们是在无血清的条件下生产出来的,可以用于基因治疗。必须指出的是,因为这些细胞没有暴露在血清中,如牛和其它动物血清(病毒感染期和存储在液氮中的除外),它们应该极少被病毒和其它的病原性因子的潜在污染。因此,这应该将基因治疗期间这些细胞传染病原性或传染性因子的风险减小到最低程度。这种体内基因治疗在治疗一些失调中具有潜力,这些失调诸如大疱型表皮松懈(角蛋白突变失调)、白斑病(涉及黑色素合成基因的失调)、癌和黑素瘤、过敏性失调和与炎症有关的失调。关于治疗处理,唯一潜在的污染源是牛脑垂体提取物、牛胰岛素,牛胶原蛋白、牛血清白蛋白或人类纤维粘连蛋白和人转铁蛋白。
另外,题述无限增殖化黑素细胞系和角化细胞系以及原代黑素细胞和角化细胞能用于DNA诱变分析、皮肤诱变剂筛选分析、鉴定染色体损伤剂的分析、恶性转化研究、细胞生物化学研究(如CYP450激活分析)、筛选化合物和组合物(如参与炎症反应和过敏反应的必需脂肪酸鸡尾酒)、胶原蛋白酶活化分析(与炎症有关),涉及TNFα、白介素的检测。
按本发明生产的原代角化细胞或黑素细胞已知它们的能力和生产方法,其重要潜在应用是用于皮肤移植。因为这些原代角化细胞和黑素细胞是在无血清条件下生产的,因此它们被病原体(如病毒)和传染性因子污染的风险应该极小。而且,因为这些题述角化细胞和黑素细胞是得自自体宿主,即有大伤口的病人,这应该将皮肤移植排斥反应或其它不利的免疫学反应的风险减小到最低程度或消除风险,也将感染的风险减小到最低程度。
按照本发明生产的特异性无限增殖化角化细胞系的实例为FK2-NR、DK2-NR和DK3-NR,这些细胞系于1995年10月5日存放在DSM-Deutsche Sammlung von Mikrorganismen Und ZellKulturen GmbH(德意志微生物保藏中心),地址是:Mascheroder Weg 1b D-38124 Branschweig,德国,这些细胞系分别给予登记入册,号码是DSM ACC2240、DSMACC2238和DSM ACC2239。按照本发明生产的无限增殖化人角化细胞系的其它具体实例是DM2-NR,它于1996年12月11日存放在巴斯德研究所,地址是:25rue de Docteur Roux,巴黎,法国,它已给予登记入册,号码是CNCM-I-1796。这些存放符合布达佩斯公约。当本申请颁发专利或具有本申请优先权的另一申请颁发专利时,对获取这些细胞系的所有限制将不可改变的撤消。
本发明的其它特征将在后面例举实施方案的具体描述中出现,这些实施方案用来说明本发明,不而不是限制性的。
实施例1:稳定皮肤细胞的特征
表1列出了经过病毒感染加工的所有皮肤样本。使用显示最佳生长性的分离角化细胞用于无限增殖化。
                        表1
       在NR-3-培养基中用于细胞分离的皮肤样本
  组织来源   细胞株名称   年龄   性别   细胞生长1
  大腿   OS1   36   女   ++
  大腿   OS2   68   女   -
  大腿   OS3   51   女   +
  眼睑   EL1   46   女   +
  眼睑   EL2   49   女   +
  腹部   Thorl   58   女   -
  包皮   FK1-NR   5   男   +++
  包皮   FK0-NR   13   男   ++++
  腹部   GK0-NR   26   女   +++
  乳房   DK0-NR   29   女   +++
1方法:将细胞收获在胰蛋白酶/EDTA(0.05%/0.01%)中,用血球计数器计数,结果取三次重复测定的平均值。
从皮肤样本FKO-NR、GKO-NR、DKO-NR中分离人成纤维细胞。真皮和表皮分离后,将真皮切成0.2×0.2mm的小片,然后用血清将其固定在6cm的培养皿上。2-4小时后加入Dulbecco基本必需培养基(DMEM,10%FCS)。然后培养该外植体培养物,直到成纤维细胞生长到可见程度,将铺满的成纤维细胞分离和扩增,以用于冷冻贮存物。
实施例2
1)在无血清培养基中角化细胞生长的特征:原代细胞培养物在修饰型MCD153培养基[Boyce等, J.Tissue Cult.Meth.,9:83-93(1985);和Pittlekow等, J.Invest.Dermatol.,86:410-417(1986)]和NR-3培养基中培养。已观察到在NR-3培养基中细胞生长得最好(图1)。与不具有BPE的修饰型MCDB153培养基相比,在完全限定的NR-3培养基中(不具有牛脑垂体提取物BPE的NR-3)也发现细胞生长改善。
图1包括在NR-3和在添加肾上腺素的修饰型MCDB153培养基中培养6天后的细胞生长情况。修饰型培养基MCDB153称为修饰型MCDB153,角化细胞在胰蛋白酶/EDTA(0.05%/0.01%)中收获,用血球计数器计数。图1所示结果为三次测定的平均值。
2)外被层对细胞附着和细胞生长的作用:发现培养皿的外被层能改善正常角化细胞的细胞附着和生长。特别是,表2显示的结果比较了在外被层型和非外被层型培养皿中角化细胞的生长情况。将100,000个角化细胞接种到含有NR-3培养基的3.5cm培养皿上。
                             表2
                 表面外被层对细胞附着的作用
    接种后24小时的附着细胞1        4天后的细胞数2
非外被层型%   外被层型%   非外被层型   外被层型
DK0-NR分离后 21.4 68.2 44600 143800
DK0-NR第2代 73.8 86.8 175500 282300
1附着细胞数除以接种细胞数。附着细胞收获在胰蛋白酶/EDTA(0.05%/0.01%)中,用血球计数器计数。
2细胞收获在胰蛋白酶/EDTA(0.05%/0.01%)中,用血球计数器计数,结果取三次重复测定的平均值。
实施例3
1)角化细胞的无限增殖化:将实施例1中描述的从皮肤样本生产的细胞悬浮液(含有游离的黑素细胞、角化细胞和成纤维细胞)培养在题述NR-3培养基中。这是通过将这类细胞接种到连续覆盖“鸡尾酒”外被层的培养皿上实现的,这种外被层据描述用于支气管细胞(Lechner等, J.Tiss.Cult.Meth.,9:43-48(1985))。在原代细胞培养中,当它们达到或大致达到铺满时,将这些细胞用胰蛋白酶/EDTA(0.025%/0.01%)处理4分钟。在该处理过程中,黑素细胞从角化细胞培养物中脱离出来,将它们分开收集。因此,原代黑素细胞和角化细胞在该阶段分离。当采用外被层型培养皿,将原代角化细胞在无血清NR-3培养基(与黑素细胞相比,该培养基更能促进角化细胞的生长)中培养并扩增到所需细胞数后,就将它们无限增殖化。用逆转录病毒构成物pLXSHD+SV40(#328)来实现角化细胞的无限增殖化,该病毒构成物提供SV40 T-抗原的表达[见Pfeifer等,Meth.Cell.Sci.,17:83-89(1995);除非从在DMEM、10%胎牛血清培养基中形成的包装细胞系中收集病毒]。在感染期间,使用PC-1无血清培养基,后者已在Pfeifer等的论文中说明,Meth.Cell.Sci.,14:83-89(1995)。无限增殖化完成后,将无限增殖化细胞系转移到NR-2或NR-3增殖培养基中,采用预铺外被层的培养皿。当细胞扩增到所需细胞数后,就将其转移到适于培养正常的和无限增殖化角化细胞的分化培养基中。
2)多次传代中无限增殖化角化细胞的细胞增殖:证明无限增殖化角化细胞在多次传代中,表现出细胞生长改善。见以下表3。这可通过估计群体加倍时间(PDT:对数生长期期间细胞群体增加一倍的时间)来证实。方法:在胰蛋白酶/EDTA(0.05%/0.01%)中收获角化细胞,用血球计数器计数,结果取三次测定的平均值。
                       表3
     角化细胞系在NR-3中生长细胞总数增倍的时间(PDT)
角化细胞     传代次数     PDT(h)    传代临界点*
FK2-NR     15     48.00    16-18
FK2-NR     39     21.16
DK1-NR     12     23.20    25-30
DK1-NR     15     31.05
DK1-NR     31     32.99
DK2-NR     15     22.26    20-21
DK3-NR     40     24.34    -
*临界点:细胞以降低的增殖速度生长
3)在无限增殖化人类角化细胞系中CYP450的表达:在正常的和无限增殖化角化细胞皮肤细胞中,通过Western印迹法(蛋白质表达)和RT-PCR(mRNA表达,见表4)分析CYP450的1A1、1A2、3A5、2E1、2B6、2A6和2D6的表达。在无限增殖化角化细胞中表达的CYP450类似于正常的角化细胞,表达速率稍低些。但DK2-NR系显示几乎正常的CYP450表达速率。方法:用CYP450的特异性引物(Mace等,在制备中)的RT-PCR(逆转录酶-聚合酶链反应)。
                                   表4
                     人类角化细胞中CYPmRNA的表达
角化细胞 传代次数   1A1*     2C**     2E1     3A5   1A2,2A6,2B6,2D6
FK0-NR     4     +     +     +     +   -
FK2-NR     36     +     +     +     +   -
DK0-NR     3     +     +     +     +   -
DK1-NR     31     +     +     +     +   -
DK2-NR     13     +     +     +     +   -
*用苯并芘(1.5μM;Amersham公司)诱导后,无限增殖化细胞系中的1A1 mRNA表达增加。增加程度可与正常细胞相比。
**2C17/19和2C18
4)对CYP450-诱变物的反应:与非无限增殖化细胞一样,这些细胞系甚至在多次传代中,仍对CYP450-诱变物苯并芘有反应(见表5)。该诱导对于T-Ag无限增殖化角化细胞没有报道。
                        表5
人类角化细胞用苯并芘(B(a)P)诱导后的7-乙氧基试卤灵
   O-脱乙基酶(EROD;Sigma公司)的活性
角化细胞     传代次数     EROD(pmol/mg蛋白)
FK0-NR     2     未检测到
FK0-NR+B(a)P     2     0.58
FK2-NR     37     0.01
FK2-NR+B(a)P     37     1.05
DK0-NR     1     0.02
DK0-NR+B(a)P     1     1.03
DK1-NR     32     0.04
DK1-NR+B(a)P     32     1.78
DK2-NR     14     0.02
DK2-NR+B(a)P     14     0.69
DK3-NR     39     0.01
DK3-NR+B(a)P     39     1.86
*角化细胞用B(a)P(1.5μM)培养24小时。在37℃培养后,通过荧光检测试卤灵产物(560nm激发波长586nm发射波长)测定EROD活性。
5)细胞分化:用特异性抗体分析分化标志。使用的特异性抗体在表6中鉴定。可证明DK2-NR和DK1-NR克隆具有最高分化能力(表7、表8)。
                          表6
          用于检测角化细胞特异性蛋白质的抗体
特异性  抗体名称 公司/出处
T-Ag  Ab-2 Oncogene,Manhassat,纽约
角化细胞蛋白  BTI BT-576 bti,Stoughton,马里兰
人上皮结构蛋白  人上皮结构蛋白 Paesel+Lorei,Frankfurt,德国
细胞外被蛋白  aAg73 Magnaldo et al. 1992
中间丝蛋白  V9 Dako,Glostrup,丹麦
角蛋白K4  6B10 Sigma,St.Louis,美国
角蛋白K7  LDS-68 Sigma,St.Louis,美国
角蛋白K8  M20 Sigma,St.Louis,美国
角蛋白K10/1  K8.60 Sigma,St.Louis,美国
角蛋白K13  KS-1A3 Sigma,St.Louis,美国
角蛋白K14  CKB1 Sigma,St.Louis,美国
角蛋白K17  CK-E3 Sigma,St.Louis,美国
角蛋白K18  CY-90 Sigma,St.Louis,美国
角蛋白K19  A53-B/A2 Sigma,St.Louis,美国
                                表7
                T-抗原和表皮角化细胞分化产物的检测
  角化细胞 传代次数 T-Ag 角化细胞蛋白   人上皮结构蛋白 细胞外被蛋白    中间丝蛋白
FK0-NR     2 -   +++     ++     +     ++
FK2-NR     25 +++   ++     ++     +     ++
DK0-NR     2 -   +++     +++     ++     +++
DK1-NR     13 +++   +++     ++     ++     ++
DK1-NR     30 +++   ++     ++     +     ++
DK2-NR     11 +++   +++     +++     ++     +++
DK3-NR     36 +++   ++     ++     +     ++
                                        表8
                              角化细胞中角蛋白(K)的检测
角化细胞 传代次数 K4  K7 K8  K10/1  K13  K14  K17  K18  K19
FK0-NR 2 ++  - ++  ++  +++  ++  ++ +  +
FK2-NR 25 +++  - ++  ++  +++  ++  ++  +  +
DK0-NR 2 ++  - -  +++  +++  +++  +++  -  +
DK1-NR 13 ++  - ++  +++  +++  ++  ++  +  +
DK1-NR 30 +  - ++  ++  ++  ++  +  ++  +
DK2-NR 11 +++  - +++  +++  +++  +++  +++  +++  ++
DK3-NR 36 +  - +++  +++  +++  +++  +++  +++  ++
方法(表7和表8):在腔载玻片上生长的角化细胞在纯甲醇中固定后,用表6列出的抗体染色。
+++:蛋白质最高浓度,用荧光显微镜定量测定。
-:无蛋白质表达。
6)谷胱苷肽-S-转移酶的表达:用Northern印迹法和Western印迹法分析了II相酶谷胱苷肽-S-转移酶(GST)。所有的角化细胞系强烈地表达GSTπ的mRNA,而不表达GSTα和GSTμ的mRNA(表9,方法:Northern印迹法)。在这些细胞系中GSTα和GSTμ和GSTπ的蛋白质表达描绘类似于正常的角化细胞。
               表9
          GST酶的蛋白表达
角化细胞    GSTα     GSTμ     GSTπ
FK2-NR    -     -     +++
DK0-NR    -     -     +++
DK1-NR    -     -     +++
DK2-NR    -     -     +++
DK3-NR    -     -     +++
7)必需脂肪酸(EFA)的代谢:为了分析和比较角化细胞中加入的EFA的去饱和和链延伸,用亚油酸(LA,15μM)和α-亚麻酸(LN,15μM)处理无限增殖化角化细胞(DK1-NR、FK2-NR)和正常角化细胞。这些实验使用EFA-缺乏的NR-2培养基(Biofluids公司)。当细胞培养到铺满并转移到NR-2高钙(1.5mM)培养基后,处理细胞培养物。细胞用EFA处理4天(2天后更换EFA)。
通过提取和用TLC(薄层色谱法)分离磷脂,并用GLC(气液色谱法)定量分析脂肪酸甲酯,进行EFA分析。可以证明LA(20:4n-6和22:4n-6)和LN(20:5n-3、22:5n-3和22:6n-3)的去饱和产物和延伸产物。该代谢形式与在正常角化细胞中观察到的形式一致。
8)核型分析:所有细胞系都是亚二倍体,大多数染色体是在二倍体范围内(DK2-NR除外,它的染色体在亚四倍体范围)。在培养物中没有观察到除所分析的细胞系以外的细胞。该结果证实了细胞系的纯度,并证实不存在其它来源的细胞污染。
9)体内特征记述:通过皮下注射(1-2mio角化细胞)裸鼠,测定无限增殖化角化细胞的致瘤性。测试的角化细胞系DK2-NR、DK3-NR、FK2-NR对裸鼠不具有致瘤性(4个月培养期)。DK3-NR在培养5个月后,在10个动物中6个有弱致瘤性。
10)对皮肤刺激物的反应:用皮肤刺激物PMA(佛波醇-12-肉豆蔻酸酯-13-乙酸酯)、SDS(十二烷基硫酸钠)、DMSO(二甲基亚砜)、IL-1β(白介素1β)、UV-B(紫外线-B)处理后,用Northern印迹法和生物学检验分析“应激基因”TNFα(肿瘤坏死因子α)的诱导(表10)。角化细胞系甚至在多次传代中仍对PMA和UV-B有反应,并且表达蛋白TNFα。
无限增殖化角化细胞用佛波醇酯(PMA)处理后,观察到胶原蛋白酶(I型)表达的增加。
                             表10
           用皮肤刺激物诱导后角化细胞TNFα的分泌
    蛋白质活性分析:3H-胸苷掺合到TNFα-敏感型细胞*
         用以下物质诱导后TNFα的分泌
  角化细胞  传代次数     PMA   SDS   DMSO     IL-1β     UV-B
  DK0-NR  3     +   -   -     nt     +
  DK1-NR  20-22     +   +   -     +     +
  DK1-NR  32     +   -   -     nt     +
  DK2-NR  16     +   -   -     -     +
  DK2-NR  31     +   -   -     nt     +
nt:未检测
*:敏感型细胞:小鼠纤维肉瘤细胞系WEHI164克隆1.14(ATCC)。
11)有机型培养物:也进行人角化细胞在有机型条件下的培养(生长的角化细胞空气暴露于带有饲养细胞的胶原蛋白凝胶上)。与正常角化细胞相比,所有角化细胞系显示出过度增殖的形态。在含血清的培养基中已经进行了这些研究。在无血清条件下,过度增殖型细胞的生长降低(在塑料插入培养皿上的含高钙(1.5mM)的NR-2培养基,不加胶原蛋白凝胶,不用饲养细胞)。
实施例4
1)黑素细胞的无限增殖化:将实施例1所述从DKO-NR皮肤样本生产的细胞悬浮液(其中含有游离黑素细胞、角化细胞和成纤维细胞)在题述NR-3培养基中培养。这是通过将这类细胞接种到连续覆盖“鸡尾酒”外被层的培养皿中实现的,这种外被层据描述曾用于支气管细胞((Lechner等, J.Tiss.Cult.Meth.9:43-48(1985))。在原代细胞的培养过程中,当这些细胞达到或大致达到铺满时,将这些细胞用胰蛋白酶/EDTA(0.25%/0.01%)处理4分钟。在该处理期间,黑素细胞从角化细胞培养物中脱离开来,将它们分别收集。在该阶段,原代黑素细胞和角化细胞分离。然后将收集的原代黑素细就接种在NR-4无血清培养基中,这种培养基专一性地抑制角化细胞的生长。原代黑素细胞在NR-4无血清培养基中,用前所属外被层型培养皿培养并扩增到所需细胞数后,将它们无限增殖化。用逆转录病毒构成物pLXSHD+SV40(#328)实现角化细胞的无限增殖化,这种构成物提供SV40 T抗原基因的表达(见Pfeifer等的论文Meth.Cell.Sci.,17:83-89,1995;除非病毒从在DEME、10%胎牛血清中形成的包装细胞系中收集)。在感染期间,使用PC-1无血清培养基,这种培养基的说明见Pfeifer等的论文 Meth.Cell. Sci.,14:83-89(1995)。无限增殖化后,将无限增殖化细胞系转移到M2增殖分化培养基(DMEM/F12培养基,Biofluid,No 148;也可以从Olssen,Uppsala,瑞典购买)中。
2)表达T-Ag的人类黑素细胞的特征:按照本发明生产的无限增殖化黑素细胞(特别是DM2-NR)黑色素相关蛋白的表达可与正常角化细胞相比。证明无限增殖化细胞表达的黑色素相关蛋白、黑素瘤相关抗原(MAA)和HMB45类似于正常细胞,尽管表达水平较低。
3)黑色素合成的诱导:表达T-Ag的黑素细胞系(特别是DM2-NR)的黑素生成可与正常黑素细胞相比。将黑素细胞用黑色素生成诱变剂酪氨酸和茶碱以及黑色素生成抑制剂曲酸处理。黑素细胞系(特别是DM2-NR)对黑色素生成调节剂的反应可与正常细胞相比。也证明黑色素生成的诱导/抑制也依赖于剂量的。
实施例5
如上所述,用基于HPV16的逆转录病毒构成物pLXSHD+E6/E7(在图2b中描绘)对实施例1描述的DK0-NR进行无限增殖化处理。选择几个连续角化细胞系。根据分化产物(细胞角蛋白、GST、TNFα、角化细胞蛋白、人上皮结构蛋白、细胞外被蛋白、中间丝蛋白),这些细胞系的分析结果与DK2-NR和DK3-NR细胞系得到的结果相似。
实施例6
本发明的新型NR-3培养基的组成和本发明的几种其它无血清培养基(即NR-1、NR-2和NR-4)的组成比较如下:
1)NR-1培养基的组成(见下表)
                                    NR1
                                    [milligram/liter]
氨基酸
L-丙氨酸                            9.0000
L-精氨酸,HCl                       316.0000
天冬酰胺,H2O                      15.0000
L-天冬氨酸                          4.0000
L-半胱氨酸,HCl,H2O               42.0000
L-谷氨酸                            14.8000
谷氨酰胺                            877.0000
甘氨酸                              7.6000
L-组氨酸,HCl,H2O                 50.4000
L-异亮氨酸                          98.4000
L-亮氨酸                            131.2000
L-赖氨酸,HCl                       36.6000
L-甲硫氨酸                          13.4000
L-苯丙氨酸                          14.9000
L-脯氨酸                            34.6000
L-丝氨酸                            126.2000
                                        NR1
                                        [milligram/liter]
L-苏氨酸                                23.8000
L-色氨酸                                9.2000
L-酪氨酸                                13.6000
L-缬氨酸                                70.2000
无机盐
偏矾酸铵[NH4VO3]                      0.0006
钼酸铵[(NH4)6Mo7O24×4H2O]        0.0010
氯化钙[CaCl2×2H2O]                   16.2000
硫酸铜[CuSO4×5H2O]                   0.0025
硫酸铁[FeSO4×7H2O]                   1.4000
氯化镁[MgCl2×6H2O]                   122.0000
氯化锰[MnCl2×4H2O]                   0.0002
硫酸镍[NiSO4×6H2O]                   0.0003
氯化钾[KCl]                             112.0000
乙酸钠                                  301.5000
碳酸氢钠[NaHCO3]                       1088.0000
氯化钠[NaCl]                             5200.0000
磷酸氢二钠[Na2HPO4×7H2O]            536.0000
丙酮酸钠                                 55.5000
亚硒酸钠[Na2SeO3]                     0.0050
硅酸钠[Na2SiO3×9H2O]                0.1420
氯化锡[SnCl2×2H2O]                   0.0001
硫酸锌[ZnSO4×7H2O]                   0.5100
维生素
d-生物素                                 0.0200
d-泛酸钙                                 0.2600
氯化胆碱                                 28.0000
维生素B12(B12)                           0.4100
叶酸                                     0.7900
i-肌醇                                   18.0000
尼古酰胺(B3)                             0.0400
吡哆醇(B6×H2O)                         0.0600
核黄素(B2)                               0.0400
其他
                                       NR1
                                       [milligram/liter]
腺嘌呤                                  27.3000
表皮生长因子(EGF,人类重组体)           0.0010
乙醇胺                                  0.0310
葡萄糖                                  1080.0000
HEPES                                   6000.0000
皮质醇                                  0.5000
胰岛素(牛)                              5.0000
酚红                                    1.2000
磷酸乙醇胺                              0.0710
二盐酸腐胺                              0.1600
盐酸硫胺素                              0.3400
硫辛酸                                  0.2100
胸苷                                    0.7300
转铁蛋白(人类)                          10.0000
渗透性                                  280-285mOsm/kg
2)NR-2培养基的组成:与NR-1培养基相同,但添加35mg/l牛脑垂体提取物(Biofluid公司),还包含抗生素(Gibco BRL,生命技术公司)两性霉素(0.25mg/l)、青霉素(10.000单位/l)和链霉素(10mg/l)。
3)NR-3培养基的组成:与NR-2组成相同,但添加250μg/l肾上腺素(Biofluid公司)。
4)NR-4培养基的组成:与NR-2培养基组成相同,但添加βFGF(3μg/l)(成纤维细胞基本生长因子从Sigma公司获得)和佛波醇12-肉豆蔻酸酯-13-乙酸酯(10μg/L)(PMA)(C.C.R.公司)。
尽管已经参考某些推荐实施方案,相当详细地描述了本发明,但本发明解说范围内的其它实施方案也是可允许的。因此,该说明书和随后的权利要求书不打算、也不应该解释为受其中包含的推荐实施方案描述的限制。

Claims (25)

1.无限增殖化人皮肤细胞以获得无限增殖化角化细胞和黑素细胞的改良方法,包括以下步骤:
(i)获取人皮肤组织样本;
(ii)制备用于体外培养的所述皮肤样本;
(iii)从所述制备的皮肤样本中获取角化细胞和/或黑素细胞,将这些角化细胞和/或黑素细胞接种到备有外被层的培养皿上的无血清生长培养基中,该外被层包含纤维粘连蛋白、I型胶原蛋白和BSA,该外被层促进细胞附着和生长;
(iv)必要时更换培养基,以使培养细胞的铺满生长达到最佳化,同时在培养皿上连续保持该外被层;
(v)将角化细胞或黑素细胞转移到同样预铺外被层的培养皿上的无血清选择培养基;
(vi)用逆转录病毒构建体感染角化细胞或黑素细胞;
(vii)将产生的无限增殖化角化细胞或黑素细胞转移到同样预铺外被层的培养皿上的无血清增殖培养基上,这种培养基适用于无限增殖化角化细胞或黑素细胞的增殖;
(viii)将产生的增殖角化细胞转移到同样预铺外被层的培养皿上的含高钙的无血清分化培养基中。
2.权利要求1的方法,其中该逆转录病毒构建体是SV40构建体pLXSHD+SV40或HPV16构建体pLXSHD+E6/E7。
3.权利要求1的方法,其中步骤(iii)中的无血清培养基是NR-3培养基,该培养基包括NR-1培养基中的化合物和牛脑垂体提取物35mg/l、两性霉素0.25mg/l、青霉素10000单位/l、链霉素10mg/l和肾上腺素250μg/l。
4.权利要求1的方法,其中步骤(v)中的培养基是根据权利要求3的NR-3培养基或NR-4培养基,该NR-4培养基包括NR-1培养基中的的化合物和牛脑垂体提取物35mg/l、两性霉素0.25mg/l、青霉素10000单位/l、链霉素10mg/l和β成纤维细胞生长因子(βFGF)3μg/l和佛波醇12-肉豆蔻酸酯-13-乙酸酯10μg/L。
5.权利要求1的方法,其中步骤(vii)中增殖培养基是NR-2培养基或NR-3培养基和用于黑素细胞的M2培养基,其中NR-2培养基包括NR-1培养基中的化合物和牛脑垂体提取物35mg/l、两性霉素0.25mg/l、青霉素10000单位/l、链霉素10mg/l。
6.权利要求1的方法,其中步骤(viii)中分化培养基是NR-2培养基或改良型MCDB153培养基,后者的钙含量至少为1.5mM。
7.根据权利要求1-6任一项的方法获得的无限增殖化人类角化细胞系或黑素细胞系。
8.权利要求7的无限增殖化角化细胞系,其中所述角化细胞系表达角蛋白类蛋白的图谱和正常分化的角化细胞相同。
9.权利要求8的无限增殖化角化细胞系,其中所述角蛋白类蛋白包括角蛋白K1/10、角蛋白K14,而所述其它蛋白包括角化细胞蛋白、人上皮结构蛋白和细胞外被蛋白。
10.权利要求7的无限增殖化角化细胞系,其中所述无限增殖化角化细胞系的CYP450图谱和正常分化角化细胞的图谱相同。
11.权利要求10的无限增殖化角化细胞系,其中所述细胞系表达CYP450的1A1、2C、2E1和3A5,而不表达CYP450的1A2、2A6、2B6和2D6。
12.选自角化细胞系DK2-NR,其保藏号为DSM ACC2238、DK3-NR,其保藏号为DSM ACC2239、FK2-NR,其保藏号为DSM ACC2240和黑素细胞系DM2-NR,其保藏号为CNCM I-1796的无限增殖化的人皮肤细胞系。
13.权利要求7的无限增殖化角化细胞系,其中所述角化细胞系表达编码谷胱苷肽-S-转移酶GST-π、GST-μ和GST-α的mRNA。
14.权利要求7的无限增殖化角化细胞系,它当培养在有机型培养基中时,在缺乏无血清或无饲养细胞的情况下形成高度分层和极化的上皮,这种上皮具有角质化表面层。
15.权利要求7的无限增殖化角化细胞系,它用佛波醇酯处理时,表达I型胶原蛋白和TNF-α。
16.权利要求7的无限增殖化角化细胞系,其中所述角化细胞系表达和正常角化细胞相同的选自角化细胞蛋白、人上皮结构蛋白和细胞外被蛋白的蛋白。
17.改良无血清培养基,适合于根据权利要求1-6任一项的方法分离和生产人角化细胞和黑素细胞;该培养基含有:氨基酸;无机盐;维生素;腺嘌呤、乙醇胺、葡萄糖、羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)、酚红、二盐酸腐胺、盐酸硫胺素、胸苷、表皮生长因子、胰岛素、皮质醇、磷酸乙醇胺和牛脑垂体提取物,其还包括其含量足以用于分离和生产根据权利要求7-16任一项的角化细胞或黑素细胞的硫辛酸和转铁蛋白。
18.权利要求17的培养基,它还包含肾上腺素。
19.权利要求18的培养基,其中肾上腺素的浓度足以促进角化细胞的生长。
20.权利要求17的培养基,其中该培养基中含有的氨基酸选自L-丙氨酸、L-精氨酸·HCl、天冬酰胺·H2O、L-天冬氨酸、L-半胱氨酸·HCl·H2O、L-谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、L-组氨酸·HCl·H2O、L-异亮氨酸、L-亮氨酸、L-赖氨酸·HCl、L-甲硫氨酸、L-苯丙氨酸、L-脯氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-色氨酸、L-酪氨酸、L-缬氨酸和它们相应的盐。
21.权利要求17的培养基,其中所述无机盐选自偏钒酸铵、钼酸铵、氯化钙、硫酸铜、硫酸铁、氯化镁、氯化锰、硫酸镍、氯化钾、乙酸钠、碳酸氢钠、氯化钠、磷酸氢二钠、丙酮酸钠、亚硒酸钠、硅酸钠、氯化锡和硫酸锌。
22.权利要求17的培养基,其中维生素选自d-生物素、d-泛酸钙、氯化胆碱、维生素B12、叶酸、i-肌醇、尼古酰胺、吡哆醇和核黄素。
23.改良无血清培养基,用于分离、生产和/或保持无限增殖化角化细胞和/或黑素细胞,选自权利要求4的NR-3培养基、NR-4培养基或权利要求5的NR-2培养基、NR-3培养基。
24.权利要求7的无限增殖化角化细胞和/或黑素细胞在炎症分析改良中的应用。
25.权利要求24的应用,其中所述的角化细胞和/或黑素细胞选自DK2-NR,其保藏号为DSM ACC2238、DK3-NR,其保藏号为DSMACC2239、DM2-NR,其保藏号为CNCM I-1796和FK2-NR,其保藏号为DSM ACC2240。
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