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KR100334739B1 - 절단된신경교세포주-유래신경영양성인자단백질산물 - Google Patents

절단된신경교세포주-유래신경영양성인자단백질산물 Download PDF

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KR100334739B1
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샤우-펜 실비아 후
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암젠 인코포레이티드
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Abstract

본 발명은 도파민작용성 세포에 의한 도파민 섭취 및 신경 세포의 생존을 돕는, 절단된 신경교세포주 - 유래 신경영양성 인자(절단된 GDNF) 단백질이라 명명한 신규한 단백질에 관한 것이다. 또한 본 발명은 재조합 유전공학 기술에 의해 절단된 GDNF 단백질을 수득하는 방법에 관한 것이다.

Description

절단된 신경교세포주 - 유래 신경영양성 인자
발명의 분야
일반적으로 본 발명은, 도파민작용성 신경원에 의해 도파민을 섭취하는 능력을 갖는 것이 특징이며 파킨슨병으로 사멸되는 신경원의 생존을 돕는, 본원에서 신경교세포주 - 유래 신경영양성 인자 (신경교 유래 신경영양성 인자 또는 GDNF 라고도 함) 로 규정한 단백질에 관한 것이다. 특히 본 발명은 신규한 절단된 GDNF 단백질에 관한 것이다.
발명의 배경
신경영양성 인자는 신경계 또는 신경계에 의해 자극되는 비-신경 조직에서 발견되는 단백질로, 그것의 기능은 신경 및/또는 신경교세포의 표현형 분화를 돕고 생존을 촉진시키는 것이다(Varon 등의 Ann. Rev. Neuroscience 1:327, 1979 ; Theonen 등의 Science 229 : 238, 1985 참조). 이러한 생리학적 기능으로 인해, 신경영양성 인자는 신경 세포의 변성 및 각각의 신경변성 질환에서 발생하는 분화 기능의 상실을 치료하는 데 유용하다.
특정 신경영양성 인자가 신경 손상 치료에 매우 유용하려면, 손상된 신경 세포군이 인자에 민감해야 한다. 상이한 신경영양성 인자는 일반적으로 각각 다른 신경 세포군에 영향을 끼친다. 따라서 상이한 형태의 질병이나 손상으로 발생하는 각각의 손상 신경원군을 치료하기 위해 각각의 상이한 신경영양성 인자를 갖는 것이바람직하다.
신경영양성 인자는 각각의 비관련 손상에 대해 반응하는 신경원을 보호할 수 있다. 예를들어, 신경 성장 인자(NGF) 는 그것의 축삭 돌기를 절단함으로써 야기되는 사멸(Rich 등의 J. Neurocytol 16:261, 1987 ; Otto 등의 J. Neurosci. 83 : 156, 1987 참조), 배 발생 중의 종양형성성 사멸 (Hamburger 등의 J. Neurosci. 4 : 767, 1984 참조) 및 탁솔 또는 시스플라틴 투여로 인한 사멸(Apfel 등의 Ann. Neurol. 29 : 87, 1991 참조) 로 부터 감각신경원의 중요부를 구제할 것이다. 이처럼 명백한 보호 원칙은, 신경영양성 인자가 실험적 손상에 대하여 반응하는 신경원을 보호한다면 병인학이 알려지지 않았음에도 불구하고 이들 손상된 신경원을 갖는 환자의 질병을 치료하는 데 유용할 것이라는 개념을 이끌어냈다.
또한 정확한 신경원 특이성을 갖는 신경영양성 인자는 제약학적 치료제로 사용하기에 충분한 양으로 입수가능해야 한다. 일반적으로 신경영양성 인자는 조직내에 소량으로 존재하므로(예를들어, Hofer 및 Barde Nature 331 : 261, 1988 ; Lin 등의 Science 246 : 1023, 1989 참조), 동물 조직으로부터 직접 제약학적 양의 신경영양성 인자를 얻는 것은 불리할 것이다. 대안으로서, 원하는 단백질을 생산하는 재조합 발현계를 이용하는 것이 바람직하다.
이보다 앞서 Lin 등은 흑색질의 도파민작용성 신경원의 배 전구체 상에서 신경영양성 활성에 대한 생물학적 시료를 선별하는 방법에 대하여 기술하였다[1994년 5월 23일자로 제출된 미국 특허 출원 번호 제 08/182,183 호 및 그것의 모출원 ; 1992년 9월 17일자로 제출된 제 PCT/US92/07888 호 (WO 93/06116) ; 및 유럽 특허출원 번호 제 92921022.7 호 (공개번호 제 EP 610 254 호) 참조 ; 이들 문헌은 본원에서 참고문헌으로 인용하였다]. 이러한 생검정은 파킨슨병 치료에 이용하는 신경영양성 인자를 확인하는 데 유용한데 (Friedman 등의 Neuro. Sci. Lett. 79 : 65 - 72, 1987 참조), 그 이유는 이 질병이 선조체를 자극하는 중뇌내 도파민작용성 신경원이 변성됨을 특징으로 하기 때문이다.
Lin 등은 또한 이러한 원(source) 중 하나인 교아종 세포주 B49 (Schubert 등의 Nature 249 : 224 - 27, 1974 참조)의 조정 배양 배지에서 정제한 새로운 신경영양성 인자의 특징을 기술하였다. 이러한 세포주의 조정 배양 배지는 도파민작용성 신경영양성 활성을 갖는 것으로 앞서 보고되었다 (Bohn 등의 Soc. Neurosci. Abs. 15 : 277,1989 참조). Lin 등의 공개 이전에, 신경교세포-유래 신경영양성 인자(GDNF) 는 각각의 생물학적으로 활성인 물질로서 확인되지 않았거나, 실질적으로 순수한 단백질로 분리되지 않았다. 또한, Lin 등은 GDNF 를 코드하는 인체 유전자의 클로닝 방법, GDNF 를 코드하는 인체 유전자의 핵산 서열 및 GDNF 단백질의 아미노산 서열에 대하여 기술하였다. GDNF 유전자를 발현 벡터 내로 서브클로닝하여 생물학적으로 활성인 GDNF 를 발현시키는 데 사용하였다. GDNF 단백질은 이황화물 결합에 의해 연결된 두 개의 소단위체로 이루어진 호모이량체이며 이 소단위체는 22 kDa 의 134 개 아미노산으로 구성된다. 또한 상기 기술에는 파킨슨병과 같은 신경 손상 및 신경 관련 질병을 예방하고 치료하기 위한 GDNF 의 이용에 대한 것도 포함되었다.
GDNF 치료는 하나 또는 그 이상의 신경 세포 형태의 본래 기능 및/또는 생존을 위협하는 조건에서 야기되는 신경 손상 치료에 도움이 된다. 이러한 신경 손상은 광범위하게 다른 원인들로부터 발생할 것이다. 신경 손상은 다음에 의해 하나 또는 그 이상의 신경 세포 형태에 대하여 발생할 것이다 :(1) 손상 부위 주변의 축삭 돌기 및/또는 신경 세포체의 변성을 야기시키는 물리적 손상 ; (2) 발작시와 같이 신경계 일부에 대한 일시적 또는 영구적 혈액 순환 중단 ;(3) 암 치료용 화학치료제 (예를들어, 시스플라티늄) 또는 AIDS 치료용 디데옥시시티딘(ddC) 과 같은 신경독에 대한 의도적, 우연적 노출 ; (4) 당뇨병이나 신기능부전과 같은 만성적 대사 질환 ; 또는 (5) 특이 신경 집단의 변성을 초래하는 파킨슨병, 알츠하이머병 및 근위축성측삭경화증(ALS) 과 같은 신경변성 질환.
GDNF 치료는 특히 파킨슨병과 같은 흑색질의 도파민작용성 신경원의 변성을 포함한 신경변성 상태를 치료하는 데 유용할 것이다. 현재의 파킨슨병 치료는 선조체내 도파민 수준을 증가시킬 목적으로 병을 완화시킬 뿐이다. 기대되는 GDNF 치료 효과는 단순히 선조체내 도파민작용성 신경 말단에 도파민작용성 신경전달을 증가시키는 것 (증상 완화)이 아니라, 변성 과정의 진행 속도를 줄이거나 심지어는 정지시킴으로써 손상된 흑질선조체 경로를 복구하고 그 기능을 회복시키는 것이다. GDNF 는 또한 환자의 도파민작용성 신경 세포의 비정상적 기능 또는 다른 형태의 손상을 치료하는 데에도 이용된다. 이러한 손상이나 기능부전은 정신분열증과 그외의 정신병에서 발생할 것이다. 이러한 상태에 대하여 현재 행해지는 치료는 징후에 의한 것일 뿐이며 도파민 수용체나 도파민 섭취 부위에 작용하는 약물이 필요한데, 이것은 이들 도파민 수용체와 관련된 신경 집단을 자극하는 도파민작용성 신경원의비정상적인 기능이 질병 과정에 관계할 것이라는 사실과 양립한다.
발명의 요약
본 발명의 한 양상은 신규한 절단된 신경교세포주 - 유래 신경영양성 인자(GDNF) 단백질 산물을 제공하는 것이다. 한 실시형태에 있어서, 절단된 GDNF 단백질은 재조합 유전공학 기술로 생산된다. 택일적인 실시형태에 있어서, 절단된 GDNF 단백질은 화학 기술로 합성되거나 재조합 기술과 화학 기술이 연합되어 합성된다.
본 발명의 절단된 GDNF 단백질 산물은 아미노산 서열 X -[Cys41-Cys133] - Y 로 나타나는 단백질을 포함한다. 도 1 (서열 2)의 아미노산 잔기 번호도는 성숙한 GDNF 단백질과 쉽게 비교할 수 있도록 사용된다. [Cys41- Cys133] 은 도 1 (서열 2)에 나타나 있는 바와 같이 Cys41내지 Cys133아미노산 서열을 나타내는 것이다. Y 는 카르복시 말단기인 Cys133또는 카르복시 - 말단 아미노산 잔기인 Ile134를 나타낸다. X 는 메티오닐화되거나 메티오닐화되지 않은 아민기인 Cys41또는 다음 중에서 선택한 아미노-말단 아미노산 잔기를 나타낸다:
이러한 절단된 GDNF 단백질 산물은 X - [Cys41- Cys133] - Y 로 나타낸 아미노산 서열을 갖는 절단된 GDNF 단백질 및 그것의 변이체와 유도체를 포함할 것으로 생각된다. 따라서, 본 발명의 절단된 GDNF 단백질 산물은 X - [Cys41- Cys133] - Y 로 나타낸 아미노산 서열의 부가, 치환 및 내부 결실 변이체와 유도체도 포함한다. 절단된 GDNF 단백질 산물은 메티오닐화되거나 메티오닐화되지 않은 형태 뿐만 아니라 글리코실화되거나 글리코실화되지 않은 형태의 절단된 GDNF 단백질을 더 포함한다.
본 발명의 전형적인 절단된 GDNF 단백질은 메티오닐화되거나 메티오닐화되지 않은 [Arg16-lle134], [Asn22-lle134],[Pro23-lle134],[Ser26-lle134], [Arg32-lle134],[Gly33-lle134],[Lys37-lle134],[Asn38-lle134] 절단된 GDNF 단백질 및 그것의 변이체와 유도체를 포함한다. 현재 본 발명의 바람직한 절단된 GDNF 단백질은 메티오닐화되거나 메티오닐화되지 않은 [Lys37-Ile134] 및 [Asn38-Ile134] 절단된 GDNF 단백질 및 그것의 변이체와 유도체를 포함한다. 전형적인 치환 변이체는 [Asn22△Ser22-Ile134] 및 [Pro23-Lys37△Asn37-Ile134] 절단된 GDNF 단백질이다. 전형적인 부가 변이체는 Ser-[Pro23-Ile134] 절단된 GDNF 단백질이다.
본 발명의 다른 양상에 있어서, 절단된 GDNF 단백질은 글리코실화 또는 글리코실화되지 않은 형태로 만들어질 것이다. 일반적으로 절단된 GDNF 단백질 유도체는 수용성 중합체에 대한 절단된 GDNF 단백질 결합과 관계가 있다. 예를들어, 절단된 GDNF 단백질은 수성 환경에서 절단된 GDNF 단백질 산물이 침전되는 것을 줄이기 위해 하나 또는 그 이상의 폴리에틸렌 글리콜 분자에 결합될 수 있다.
본 발명의 또다른 양상은 절단된 GDNF 단백질을 코드하는 다양한 폴리누클레오티드를 포함한다. 이들 핵산의 염기서열은 일반적으로 진핵 또는 원핵 숙주 세포내 절단된 GDNF 의 발현에 이용하는데, 여기에서 발현 산물 또는 그것의 유도체는 도파민작용성 세포에 의한 도파민 섭취를 증가시키는 능력을 갖는 것이 특징이다. 또한 폴리누클레오티드는 세포 치료 또는 유전자 치료에 사용될 수 있다. 적합한 핵산 염기 서열은 도면에 특정하게 기술한 것들 이외에도 부가적인 동의성 서열과 자연적으로 발생하는 대립형질 변이체를 포함한다.
본 발명의 다른 양상은 작용상 증폭과 관련된 절단된 GDNF 단백질을 코드하는 폴리누클레오티드 및/또는 발현 조절 서열을 함유하는 벡터를 포함한다. 원핵 및 진핵 숙주 세포 모두 절단된 신경교 유래 신경영양성 인자를 발현시키기 위하여 이러한 벡터로 안정하게 형질전환시키거나 형질감염시킬 수 있다. 본 발명은 절단된 GDNF 단백질의 재조합 생산을 더 포함하는데, 여기에서 형질전환되거나 형질감염된 숙주 세포는 적합한 영양 배지에서 성장시키고 세포에서 발현되는 절단된 GDNF 를 숙주 세포 및/또는 영양 배지에서 선택적으로 분리하였다. 본 발명은 유전자 치료 또는 세포 치료에 있어서 절단된 GDNF 를 코드하는 폴리누클레오티드 및 그러한 폴리누클레오티드를 함유하는 벡터의 용도를 더 포함한다.
또다른 양상에 있어서, 본 발명은 성숙한 GDNF 단백질 및 그것으로부터 유도한 하나 또는 그 이상의 절단된 GDNF 단백질 혼합물을 함유하는, 재조합적으로 생산된 GDNF 조성물을 포함하는데, 여기에서 성숙한 GDNF 단백질은 대략 44 kDa 의 분자량을 가지며 절단된 GDNF 단백질은 대략 36 내지 40 kDa 의 분자량을 갖는다. GDNF 조성물은 적어도 두 개의 절단된 GDNF 종을 함유하는데, 하나는 분자량이 약 36 kDa 이며 두 번째 종은 분자량이 약 40 kDa 이다. 약 40 kD 의 분자량을 갖는 절단된 GDNF 종은 분자량이 대략 22 kDa 인 GDNF 단량체와 분자량이 대략 18 kDa 인 절단된 GDNF 단량체의 헤테로이량체이다. 하나 또는 그 이상의 절단된 GDNF 종은 치료학적으로 이용하기 위해 혼합물로부터 분리할 수 있을 것으로 생각된다.
본 발명의 또다른 양상은 절단된 GDNF 단백질 산물을 함유하는 제약학적 조성물을 포함한다. 일반적으로, 절단된 GDNF 단백질 산물은 제약학적으로 용인가능한 부형제와 함께 제형화된다. 다양한 그외의 제제형 물질은 제조, 보관, 취급, 운반 및/또는 효능이 용이하도록 하기 위해 사용할 것이다. 본 발명의 다른 양상에 있어서, 절단된 GDNF 단백질 산물은 도파민 섭취 및 도파민작용성 신경원의 생존을 높인다. 따라서, 절단된 GDNF 단백질 산물은 파킨슨병과 같은 질병이나 손상으로야기되는 신경계 손상 치료에 특히 적합하다.
본 발명의 부가적인 양상 및 이점은 본 발명의 실시를 상세히 기술한 하기 상세한 설명을 고려하여 본 분야의 숙련자들에게 자명할 것이다.
본 발명의 무수한 특징 및 이점은 도면에 의해 자명할 것이다.
도 1 은 성숙한 인체 신경교세포주-유래 신경영양성 인자(hGDNF) 를 코드하는 핵산의 염기서열 (서열 1) 을 나타낸다. 또한 성숙한 인체 GDNF 단백질의 아미노산 서열 (서열 2) 도 나타낸다.
도 2 는 재조합 절단된 GDNF 단백질을 발현시키기 위해 제조한 플라스미드 구성물의 지도이다.
도 3 은 GDNF 와 절단된 GDNF 폴리누클레오티드를 코드하는 선택적인 핵산 염기서열 (서열 39) 의 제한 지도이다.
도 4 는 GNDF 와 절단된 GDNF 폴리누클레오티드를 코드하는 그외의 핵산 염기서열 (서열 40) 의 제한 지도이다.
도 5 는 [Pro23-Lys37△Asn37-Ile134] 절단된 GDNF 단백질 치환 변이체 (서열 42) 를 코드하는 핵산의 염기서열 (서열 41) 을 나타낸다.
도 6 은 [Arg32-Ile134] 절단된 GDNF 단백질 (서열 44) 을 코드하는 핵산의 염기서열 (서열 43) 을 나타낸 것이다.
도 7 은 [Gly33-Ile134] 절단된 GDNF 단백질 (서열 46) 을 코드하는 핵산의 염기서열 (서열 45) 을 나타낸 것이다.
도 8 은 수 개의 전형적인 절단된 GDNF 단백질인 Met - [Arg32-Ile134] (서열 48), Met - [Gly33-Ile134] (서열 49) 및 Met - Ser - [Pro23-Lys37△Asn37-Ile134] (서열 50) 에 대한 성숙한 hGDNF 의 아미노산 서열 (서열 47) 을 비교한 것이다.
134 개 아미노산으로 된 성숙한 단백질로 프로세싱되어 분비되는 전구체로서 인체 신경교세포주 - 유래 신경영양성 인자 (hGDNF) 를 합성한다. 성숙한 인체 GDNF 가 도 1 에 나타나 있는 아미노산 서열 (서열 2) 을 가짐을 앞서 기술하였다.
본 발명은 성숙한 GDNF 단백질이 그것의 생물학적 활성도는 유지하지만 크기가 감소 (본원에서는 "잘린" 또는 "절단된" 단백질 또는 절단된 GDNF 단백질이라고도 함) 될 수 있다는 예상외의 발견에 근거한다. 잘린 단백질은 처음에는 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포에서 GDNF 의 재조합 생산 중에 발견되었다. 간단히 말하면, 재조합 인체 GDNF (rhGDNF) 는 다음과 같이 제조되었다. 성숙한 인체 GDNF 단백질의 전체 전사 해독 프레임을 코드하는 핵산 염기서열을 발현 플라스미드 내로 클로닝하였다. 핵산 서열이 정확히 확인되었고 (GeneBank 내 동일한 hGDNF 서열과 마찬가지로 DNA 염기서열을 결정함으로써), 성숙한 인체 GDNF 에 대해 공개된 서열과 동일한 아미노산 서열로 해독되었다 (Lin 등의 Science 260, 1130 - 1132, 1993 참조). 플라스미드 DNA 를 선형화하고, 인산칼슘 침전법을 이용하여 디히드로엽산환원효소 - 결핍 CHO 세포 (CHOd-세포) 내로 형질감염시켰다. 형질감염시킨 세포를선택 배지에서 배양하여 각각의 hGDNF 발현 분석을 위해 생존 콜로니를 선택하였다.
각각의 콜로니에서 무혈청 조정 배지를 모으고, hGDNF 에 특이한 항혈청을 이용하여 웨스턴 블롯 분석을 실시하였다. E. coli 에서 발현된 재조합 hGDNF 로 면역화한 토끼에서 토끼의 폴리클로날 항체와 관련된 항혈청을 제거하였다. 환원 조건하에서, 이들 시료에 존재하는 hGDNF 는 대략 22 kDa 및 18 kDa 의 겉보기 분자량을 갖는 두 개의 주요 밴드로 분리되었다. 각 밴드는 매우 가깝게 위치한 한 쌍의 약 22 + 22.5 kDa 및 18 + 17.5 kDa 으로 각각 이루어져 있다 (이들 쌍은 간단히 22 kDa 과 18 kDa 의 밴드 또는 종으로 간주할 것이다).
GDNF 는 대략 20 내지 22 kDa 의 분자량을 갖는 두 개의 동일한 성숙 GDNF 단백질로 이루어진 이황화물 - 결합 호모이량체로 존재하는 것으로 앞서 보고되었다. 비환원 조건하에서 GDNF 를 분석하였을 때, 32 ~ 42 kDa (Lin 등의 Science 260, 1130 - 1132, 1993 참조) 또는 33 ~ 45 kDa (Lin 등의 J. Neurochem. 63 (2), 758 - 768, 1994 참조) 의 넓은 밴드가 확인된 것으로 보고되었다. 이러한 분포는 성숙한 단량체 상의 이질적인 글리코실화 때문인 것으로 해석되며 이것은 탈-글리코실화 실험으로 더 증명되었다.
이러한 22 kDa 의 밴드가 문헌에 보고된 성숙한 GDNF 단백질에 해당하는 반면에, 18 kDa 밴드는 앞서 보고되어 있지 않다. 22 kDa 과 18 kDa 의 상대량은 각각의 클론에서 모은 시료에서 달라졌다. 또한 동일한 클론에서 모은 다수의 수확물의 두 밴드 비율도 다양하게 나타났다. 게다가 CHO - 발현 GDNF 단백질을 저장하면종종 22 kDa 밴드가 감소하는 동시에 18 kDa 밴드가 증가함을 발견하였다.
형질전환 CHOd-세포 조정 배지를 웨스턴 블로팅에 의해 비환원 조건하에서 분석하였을 때, 겉보기 분자량이 36, 40 및 44 kDa 인 세 개의 잘 분리된 밴드가 관찰되었다. 이러한 발견은 앞서 보고된 것과는 대조적인 것이었다. 이들 밴드의 상대적인 강도는 다양하였으나, 각 시료에 존재하는 22 및 18 kDa 단량체 밴드의 비와 깊은 관계가 있었다. 모노클로날 항혈청을 더 분석하였을 때, 비환원 겔 상의 세 밴드는 두 단량체로 이루어진 세 개의 있을 수 있는 이량체에 해당하는 것으로 나타났다. 가장 큰 44 kDa 단백질은 앞서 보고된 바와 같이 22 kDa 의 성숙한 두 GDNF 단백질로 된 이량체이다. 중간 크기의 40 kD 단백질은 성숙 단백질 중 하나의 분자량이 18 kDa 형으로 작아진 이량체로 구성된다. 가장 작은 36 kDa 이량체는 두 개의 18 kDa, 즉 둘다 22 kDa 형의 분자량이 감소된 단백질을 함유할 것이다. 최초에는 이 데이터로 신규한 형태의 GDNF 단량체의 존재 뿐만 아니라 이량체 형태내 잘린 GDNF 단백질의 존재를 확인하였다. 또한, 저장시에 단량체 조성물 시료는 잘린 형태 및 그에 상응하는 이량체 종으로 바뀌었음을 발견하였다. 즉, 36 kD 단백질의 양이 증가하는 것으로 나타났다.
다음으로, 단백질의 일부가 제거되거나 변화되어 앞서 보고된 성숙한 GDNF 단백질에 비해 분자량이 감소되었는 지를 확인하기 위한 연구를 실시하였다. 우선, 분자량의 감소가 글리코실화의 변화에서 기인하지 않았음을 확인하였다.
GDNF 는 두 개의 잠재적인 N - 결합 글리코실화 부위를 함유하며, 글리코실화되는 것으로 보고되었다. 그러나 잘린 단백질은 단순히 성숙한 GDNF 의 글리코실화되지 않은 형태나 글리코실화 중인 형태가 아니다. 이것은 글리코실화 실험으로 입증하였는데, 이 때 시료는 N - 글리카나제, O - 글리카나제 및 누라미니다제로 처리하였다. 환원 겔 상에서, N - 글리카나제 절단에 의해 18 kDa 단백질이 13.5 kDa 밴드로 감소되었는데, 이것은 N - 결합된 4.5 kDa 의 당이 존재함을 의미한다. 누라미니다제와 O - 글리카나제로 처리하면 18 kD 밴드가 17 kD 으로 약간 전위되었다. 이것은 단백질 상에 O - 결합 당이 존재함을 의미하였다. 성숙한 22 kDa 밴드는 글리코실화된 것으로 보고되었으며 N - 글리카나제에 의해 18 kDa (즉, 4.5 kDa 감소) 으로 감소되었다. 이것은 겔 상의 22 kDa 밴드에 대해 특이적인 모노클로날 항체의 이용을 통해 더 입증되었다. 비환원 이량체의 글리카나제 절단 양식은 더 복잡하지만, 이들 형태의 초기 지정을 판단할 수 있으며 그것과 일치하였다.
결과적으로, 단백질 분자량이 4.5 kDa 감소한 것은 글리코실화의 변화라기보다는 대략 30 - 35 개 아미노산 잔기가 결실됨으로써 초래된 결과였다. 상기 결실은 아마도 다음과 같은 이유로 성숙한 GDNF 단백질의 아미노 - 말단에서 발생할 것으로 기대되었다. 성숙한 GDNF 는 총 7 개의 시스테인을 함유한다. 만약 카르복시 말단이 결실된다면, 7 개의 시스테인 중 2 ~ 4 개가 소실될 것이며 그렇게 되면 단백질이 불활성화될 것이다. 그러나, 분명하게 잘린 형태로 이루어진 실험 시료의 도파민작용성 신경원 신경영양성 활성도를 측정하기 위해 생검정을 실시하였을 때 이 시료는 GDNF 의 성숙형을 상대적으로 더 많이 함유하는 시료와 필적할만한 활성도를 보였다.
절단 부위는 정제된 단백질의 아미노산 서열 분석으로 결정하였다. 제작자의 지시에 따라 10 주기의 어플라이드 바이오시스템스 494A 단백질 시퀀서(Applied Biosystems 494A protein sequencer) 를 이용하여 시료의 서열을 결정하였다. 아미노산 서열 분석 기술 및 방법은 본 분야의 숙련자들에게 매우 널리 공지되어 있으나, 단백질의 서열 결정에 대한 보다 상세한 것은 본원에서 참고문헌으로 인용한 문헌인 Fausset 등의 Electrophoresis 12 :22 - 27 , 1991 및 1990 년 8월 24일자로 제출된 미국 특허 출원 번호 제 576,316 호[1990년 10월 4일자로 제출된 유럽 특허 출원 번호 제 90310899 호 , 공개번호 EP 423 980, 발명의 명칭은 "간(幹) 세포 인자"] 에 기술되어 있다. 잘린 단백질의 아미노 말단이 "RGQRGK" 또는 Arg-Gly-Gln-Arg-Gly-Lys 임을 분석에 의해 입증하였다. 따라서, 초기 31 개 아미노산을 조정 배지내 성숙 단백질로부터 제거하였다. Arg32아미노산으로 시작되는 잘린 단백질의 나머지 아미노산 서열은 도 1 (서열 2) 에 나타낸 성숙한 단백질의 GDNF 아미노산 서열의 위치 32 이상의 서열과 일치하였다.
[Arg32- Ile134] 절단된 GDNF 단백질은 도파민작용성 신경원 검정에서 그것의 성질상 활성인 것으로 나타났다. 도파민작용성 신경영양성 활성도 검정은 파킨슨병 치료에 유리한 신경영양성 인자를 확인하는 데 사용된다. 검정은 앞서 기술한 검정(Friedman 등의 Neuro. Sci. Lett. 79 : 65 - 72, 1987 참조, 본원에서 참고문헌으로 인용함) 을 기초로 하며, Lin 등의 [1994년 5월 23일에 제출된 미국 특허 출원 번호 제 08/182,183 호 및 그것의 모출원 ; 1992년 9월 17일자PCT/US92/07888 (WO 93/06116) ; 및 유럽 특허 출원 번호 제 92921022. 7 호 (공개 번호 EP 610 254) 참조] 문헌에 기술된 것의 변형도 포함될 것이다. 검정의 상세한 설명은 하기 실시예 5 에 기술되어 있다.
아미노산 서열 결정 후에 연속적인 정제 과정으로, 초기 36 개 아미노산 잔기가 성숙한 GDNF 의 N - 말단에서 절단된 다른 단백질을 발견하였다. : KNRG(C)VL - 의 N - 말단 서열을 갖는 [Lys37- Ile134] 절단된 GDNF 단백질. 절단된 단백질의 나머지 아미노산 잔기는 성숙한 인체 GDNF 아미노산 서열과 일치하였다. [Lys37- Ile134] 절단된 GDNF 단백질도 도파민 섭취 생검정으로 분석하였다. 이러한 절단된 GDNF 단백질은 정제된 재조합 E.coli - 발현 성숙 GDNF 와 유사하게 약 50 pg/ml 의 ED 50 을 가지므로 활성인 것으로 밝혀졌다.
또한 박테리아에서 발현되는 성숙한 GDNF 도 절단된 형태로 변화될 수 있음을 발견하였다. 형질전환된 E.coli 에서 발현되는 성숙한 GDNF (상기 Lin 등의 미국 특허 출원 번호 제 08/182,183 호에 기술되어 있음) 를 CHO - 유도 조정 배지와 함께 항온하였다. 재조합 E.coli GDNF 는 환원 겔 상에서 17 kDa 의 겉보기 분자량을 갖는다. 물질을 CHO 세포 조정 배지와 혼합하여 4 ℃ 에서 5 일간 항온하였을 때, 단백질은 12.5 kDa 으로 완전히 잘렸다. 이러한 절단은 한 시간 또는 24 시간 항온시에는 불완전하였는데, 이것은 이러한 조건하에서 시간 - 의존성임을 시사한다. 또한 0.1 % 우태아혈청을 함유하는 배지와 함께 재조합 E.coli GDNF 를 단순히 밤새 항온한다고 해서 잘린 형태가 생성되지는 않음을 발견하였다. 이와 같이 배양액내에 살아 있는 세포가 존재해야만 절단 과정이 일어날 수 있을 것이다. 그러므로, 절단은 특정 조직의 생체내에서 일어나는 것이 가능하다.
더욱이, 폴리에틸렌 글리콜화된 GDNF (상기 Lin 등의 미국 특허 출원 번호 제 08/182,183 호에 기술되어 있음) 와 같은 성숙한 E.coli - 발현 hGDNF 유도체가 CHO - 유도 조정 배지의 존재하에 절단형으로 프로세싱됨을 발견하였다. 성숙한 GDNF 는 혈행내 그것의 제거율을 높이기 위해 아미노 말단이 폴리에틸렌 글리콜화될 수 있다. 폴리에틸렌 글리콜화는 단백질의 크기를 증가시키고, 변이된 성숙한 GDNF 는 환원 조건하에서 약 45 kDa 으로 이동한다. 폴리에틸렌 글리콜화되지 않은 성숙형과 마찬가지로, 폴리에틸렌 글리콜화된 E. coli GDNF 를 CHO 세포(비형질감염된) 조정 배지와 항온하면 12.5 kDa 밴드가 생성되었다. 두 경우 모두에 있어서, 12.5 kDa 종은 비 - 환원 겔에서 나타나는 바와 같이 이황화물 - 결합된 이량체로서 존재하였다. N - 말단이 폴리에틸렌 글리콜화된 성숙한 단백질로부터 잘린 형태의 생성은, 폴리에틸렌 글리콜화된 잔기가 절단 과정 중에 소실되므로 절단이 단백질의 N - 말단에서 일어났음을 더 입증하였다.
절단이 생체내에서 일어날 것이라는 이러한 발견과 그 이유를 근거로 하여, GDNF 단백질의 절단형은 생리학적 조건하에서 최종적인 hGDNF 의 자연발생적인 프로세싱형일 것이다. 이와 같이 치료학적으로 이용하기 위해 절단된 GDNF 단백질 또는 그것의 유도체를 생산하는 것이 바람직하다. 예를들어, [Arg32-Ile134] 절단된 GDNF 단백질과 같이 직접 발현시키거나 합성한 절단된 GDNF 단백질은 상기 언급한단백질 분해 활성에 대해 저항성을 가질 것으로 기대된다. 게다가, 폴리에틸렌 글리콜화된 [Arg32-Ile134] 절단된 GDNF 단백질과 같은 절단된 GDNF 유도체를 생산하는 것이 바람직하다면 결과적인 유도체는 성숙한 GDNF 유도체에서 관찰되는 특이 절단에 민감하지 않은 이점을 가질 것으로 기대된다.
절단된 GDNF 단백질 산물에 대하여 부가적인 이점도 기대할 수 있다. 첫째, [Arg32-Ile134] 절단된 GDNF 단백질과 같은 절단된 단백질의 pI 는 약 10 에서 약 8.0 - 8.5 로 감소될 것이다. 이것은 초내 주입 부위와 같은 투여 부위에 더 나은 수용체 결합 및 감소된 세포독성을 포함한 바람직한 효과를 교대로 제공할 수 있는, 매우 낮은 염기성 단백질이 되도록 한다. 둘째, 성숙한 GDNF 아미노산 서열의 초기 26 개 아미노산 내에는 두 개의 아마이드분해 부위 : Arg-Asn-Arg (아미노산 14-16) 및 Glu-Asn-Ser (아미노산 24-26) 이 존재한다. 절단된 GDNF 단백질 내에 이들 부위 중 하나 또는 두 개가 없으면 단백질의 안정성이 증가할 것으로 기대된다.
절단된 GDNF 단백질 산물
기본적인 실시형태에 있어서, 본 발명의 절단된 GDNF 단백질은 다음 아미노산 서열로 나타낼 수 있는데, 도 1 의 아미노산 잔기 번호도는 성숙한 GDNF 단백질과 쉽게 비교하기 위해 이용된다 :
X - [Cys41- Cys133] -Y
여기에서
[Cys41-Cys133] 은 도 1 (서열 2) 에 나타나 있는 바와 같이 Cys41내지 Cys133의 아미노산 서열을 나타내고 ;
Y 는 카르복시 말단기인 Cys133또는 카르복시 말단 아미노산 잔기 Ile134를 나타내며 ;
X 는 메티오닐화되거나 메티오닐화되지 않은 아민기인 Cys41또는 다음 중에서 선택한 아미노- 말단 아미노산 잔기를 나타낸다 :
본원에서 사용한 바와 같이, 용어 "절단된 GDNF 단백질 산물" 은 생물학적으로 활성인 합성 또는 재조합 절단된 GDNF 단백질, 성숙한 GDNF 로부터 생산된 절단된 GDNF 단백질, 생물학적으로 활성인 절단된 GDNF 변이체(삽입, 치환 및 결실 변이체 포함) 및 화학적으로 변이된 그것의 유도체를 포함한다. 또한 서열 2 에 기술한 아미노산 서열을 갖는 인체 GDNF 단백질과 실질적으로 상동인 절단된 GDNF 단백질도 포함한다.
용어 "생물학적 활성" 은 본원에 사용한 바와 같이 절단된 GDNF 단백질이 유사한 신경영양성 특성을 가지나, 서열 2 에 기술한 아미노산 서열을 갖는 GDNF 단백질과 반드시 동일한 성질 및 동일한 정도일 필요는 없음을 의미한다. 흥미있는 특정 신경영양성 특성은 절단된 GDNF 단백질이 투여되는 용도에 따라 선택된다. 절단된 GNDF 단백질 산물은 생물학적으로 활성이며, 하기 실시예에 논의된 바와 같이 전형적인 생검정으로서 도파민 섭취 및 티로신 수산화효소(TH) 발현 평가를 이용하여 성숙한 GDNF 단백질에 의해 설명되는 것과 유사한 도파민작용성 신경원 생존 특성을 설명한다.
본원에 사용한 바와 같이 용어 "실질적으로 상동"은 서열 2 에 기술한 아미노산 서열을 갖는 인체 GDNF 에 대한 상동 정도를 의미하는 것으로, 바람직하게는 70 % 이상, 더욱 바람직하게는 80 % 이상이고, 심지어는 90 % 또는 95 % 이상이다. 본원에 사용한 상동성의 백분율은, 본원에서 참고문헌으로 인용한 Dayhoff, in Atlas of Protein sequence and Structure Vol. 5, p. 124 (1972), National Biochemical Research Foundation, Washington, D.C. 에 기술되어 있는 배열을 원조하기 위해 100 개의 아미노산내 네 개의 갭이 도입될 경우와 비교하여 서열내 동일한 아미노산 잔기로 배열된 두 서열 중 더 작은 것에서 발견되는 아미노산 잔기의 백분율로 계산한다. 또한 실질적으로 상동인 것에는 서열 2 의 GDNF 에 대한 항체로 교차-반응성에 의해 분리되거나 그것의 유전자가 서열 1 의 GDNF 를 코드하는 유전자 또는 그 단편과의 혼성화를 통해 분리되는 모든 절단된 GDNF 단백질이 포함된다.
본 발명의 명세서를 읽음으로써 본 분야의 숙련자들에게 자명해지는 것과 같이, 실질적으로 상동인 단백질은 X -[Cys41-Cys133] -Y 로 나타나는 절단된 GDNF 단백질의 아미노산 잔기가 하나 또는 그 이상 결실, 부가 또는 치환된 것을 포함할 것이다. 이러한 변이체의 생산은 하기에 더 상세히 기술되어 있다. 본 발명은 명백히 "절단된" GDNF 단백질에 관한 것이므로, 아미노 - 말단 부가 변이체는 메티오닌잔기 또는 비 - GDNF 아미노산 잔기나 서열의 부가체를 포함하는 것으로 숙지되지만, 성숙한 GDNF 단백질을 재구성하는 아미노산 부가는 포함하지 않는 것으로 인지될 것이다. 자연발생적인 대립형질 돌연변이체 또는 변이체에 근거한 절단된 GDNF 단백질도 또한 본 발명의 범주내에 속한다. 절단된 GDNF 단백질 변이체의 생산은 하기에 더 상세히 기술되어 있다.
Lin 등의 상기 미국 특허 출원 번호 제 08/182,183 호에는 성숙한 GDNF 의 카르복시 말단으로부터 각각 6 번째와 5 번째 잔기인 Lys - Arg 잔기의 단백질 분해 과정에 의해 카르복시 말단이 절단된 성숙한 GDNF 에 대해 기술되어 있다 [즉, 도 1 (서열 1 또는 서열 2) 에 번호가 기재된 아미노산 잔기에 따라 Lys129-Arg130]. 이러한 절단은 성숙한 GDNF 단백질로부터 두 개의 시스테인 잔기를 제거하는 것이다. 이것은 단백질의 부적절한 접힘을 초래할 것이므로 불활성 단백질이 생성될 것이다. 그와는 대조적으로, 본 발명의 X - [Cys41-Cys133] - Y 절단된 GDNF 단백질 산물은 Cys131및 Cys133잔기를 보유하며 도파민 섭취 검정에 의해 측정한 바와 같이 활성 단백질이다.
본 발명의 한 실시형태에 있어서, 바람직한 절단된 GDNF 단백질 산물은 하나 또는 그 이상의 아마이드분해 부위가 결핍되어 있다. 이러한 아마이드분해 부위의 결핍으로 정제된 단백질의 생화학적 안정성이 증가하고 있을 법한 분해 산물이 감소함으로써 보관시에 더욱 안정한 단백질이 되게 한다. 전형적인 절단된 GDNF 단백질 산물은 다른 방법으로 성숙한 단백질의 아마이드분해를 유도하는 부위가 결핍된[Ser26-Ile134] 절단된 GDNF 단백질이다. 택일적으로, [Arg16-Ile134] 절단된 GDNF 단백질은 성숙한 단백질내에 달리 존재하는 적어도 첫 번째의 아마이드분해 부위가 결핍되어 있을 것이다.
현재 바람직한 절단된 GDNF 단백질 산물은 [Arg32-Ile134] 절단된 GDNF 단백질이다. 이러한 절단된 GDNF 단백질은 성숙한 GDNF 의 단백질분해 절단이 발생하는 부위나 그 주위가 결핍되어 있다. 따라서, 이러한 절단된 GDNF 단백질은 생체내에서 일어나는 프로세싱 과정에 대한 저항성을 가질 것으로 기대된다. 현재 바람직한 다른 절단된 GDNF 단백질 산물은 [Lys37-Ile134] 절단된 GDNF 단백질이다. 이러한 절단은 Gly40및 Ile134는 포함하며 각각 N - 및 C - 말단으로부터 Gly40및 Ile134에 달하는 잔기는 제거되므로, 절단된 단백질의 pI 를 더 감소시킬 것이다. 현재 가장 바람직한 절단된 GDNF 단백질 산물은 성숙한 GDNF 단백질에서 발견되는 시스테인 잔기를 모두 보유하지만 발현 및 제조 중에 또는 생체내 투여 후에 절단된 GDNF 단백질의 신속한 단백질분해 프로세싱을 식별할 수 있는 모든 부위는 결핍되어 있다. 이들 바람직한 단백질은 [Arg32-Ile134], [Gly33-Ile134], [Gln34-Ile134], [Arg35-Ile134], [Gly36-Ile134], [Lys37-Ile134], [Asn38-Ile134] 및 [Arg39-Ile134] 절단된 GDNF 단백질 산물을 포함한다.
Lin 등의 (상기 미국 특허 출원 번호 제 07/855,413 호) 에서 앞서 기술된성숙한 GDNF 에 대한 결과와 유사하게, 본 발명의 절단된 GDNF 단백질로 흑색질 도파민작용성 신경원의 배 전구체에 의해 도파민 섭취를 증가시키는 능력을 설명하였다. 절단된 GDNF 단백질의 생검정은 하기 실시예 4 에 더 기술되어 있다.
신규한 절단된 GDNF 단백질을 전형적으로 분리정제하여 실질적으로 다른 (비 - GDNF) 단백질성 물질이 존재하지 않는 절단된 GDNF 단백질을 생성하였다. 바람직하게, 절단된 GDNF 단백질 산물은 그것의 제조시에 사용하는 생산 기술에서 기인하여 존재할 수 있는 다른 단백질의 약 80 % 가 제거된 것이다. 더욱 바람직하게, 절단된 GDNF 단백질 산물은 다른 단백질의 약 90 %, 특히 바람직하게는 약 95 % , 가장 바람직하게는 약 〉98 % 가 제거된 것이다. 또한, 본 발명은 균질의 절단된 GDNF 단백질을 제조하기 위한 폴리누클레오티드 서열을 제공하는 독독특한 이점을 갖추고 있다. 예를들어,[Arg32-Ile134] 절단된 GDNF 단백질을 코드하는 폴리누클레오티드 서열을 이용하면 E.coli 와 다른 적당한 발현계에서 절단된 GDNF 단백질의 재조합 생산을 가능하게 한다. 환언하면, 신규한 폴리누클레오티드는 단백질분해 프로세싱에 민감하지 않거나 이러한 프로세싱 또는 상기 언급한 바와 같은 그외의 생화학적 프로세싱 효과에 대한 민감성이 감소된 절단된 GDNF 단백질의 생산을 가능하게 한다. 따라서, 신규한 폴리누클레오티드는 단일 종의 절단된 GDNF 단백질 제조 및/또는 분리를 더 용이하게 하며, 따라서 절단된 GDNF 단백질 및/또는 그것의 산물은 상기 언급한 헤테로 - 및 호모이량체 혼합물을 함유하지 않거나 함유량이 감소된다. 그러나 최종적인 절단된 GDNF 단백질 산물은 하기에 더 상세히 기재되는바와 같이, 투여 전에 다른 인자, 화학 조성물 및/또는 적합한 제약학적 제제형 물질과 결합될 것으로 생각된다.
본 발명의 한 양상에 있어서, 절단된 GDNF 단백질은 재조합 기술을 통해 생산되는 것이 바람직한데, 그 이유는 상대적으로 보다 많은 양의 단백질을 보다 순도 높게 수득할 수 있기 때문이다. 절단된 GDNF 단백질의 재조합 형태는 글리코실화되거나 그렇지 않은 형태이 단백질, 및 박테리아, 포유동물 또는 곤충 세포계에서 발현되는 단백질을 포함한다. 선택적으로, 절단된 GDNF 단백질은 화학적으로 합성될 것이다. 현재로서 바람직한 생산 방법은 아래에 더 자세히 기재되어 있다.
절단된 GDNF 변이체 및 유도체
A.절단된 GDNF 변이체
본 발명의 다른 양상은 절단된 GDNF 단백질 변이체를 포함한다. 본원에 사용한 용어 "절단된 GDNF 단백질 산물" 은 아미노산이 자연발생적인 GDNF 의 아미노산 서열내 잔기로부터 결실되거나 ("결실 변이체") 그안으로 삽입되거나 ("삽입 변이체") 치환된 ("치환 변이체") 변이 단백질을 포함한다. 이러한 변이체는 단백질을 코드하는 DNA 내로 적당한 누클레오티드 변화체를 도입하거나 원하는 단백질을 시험관내에서 화학 합성하여 제조한다. 최종적인 단백질이 GDNF 생물학적 활성도를 갖도록 다양한 결실, 삽입 및 치환 연합체를 제조할 수 있음은 본 분야의 숙련자들에 의해 인지될 것이다.
하나 또는 그 이상의 선택적인 아미노산 잔기를 치환, 삽입 또는 결실시키기 위한 돌연변이유발 기술은 본 분야의 숙련자들에게 널리 알려져 있다 (예를들어,본원에서 참고문헌으로 인용한 문헌인 미국 특허 번호 제 4,518,584 호 참조). 아미노산 서열 변이체를 구성하는 데에는 두 가지 중요한 변수가 존재한다 : 돌연변이 부위의 위치 및 돌연변이의 성질. 절단된 GDNF 변이체를 계획함에 있어서, 돌연변이 부위의 위치와 돌연변이의 성질은 변이시키는 생화학적 특성에 의존할 것이다. 돌연변이 부위는 예를들어 (1) 우선 보존적인 아미노산을 선택한 다음 이루고자 하는 결과에 따라 보다 근본적으로 정선하여 치환, (2)표적 아미노산 잔기 삭제, 또는 (3) 위치한 부위 주변에 아미노산 잔기 삽입에 의해 개별적으로 또는 연속적으로 변형시킬 수 있다.
일반적으로는 약 1 내지 30 개 아미노산 잔기, 보다 일반적으로는 약 1 내지 10 개 잔기, 전형적으로는 약 1 내지 5 개 잔기에 걸쳐 아미노산 서열을 결실시킨다. 예를들어, N - 말단에서 Cys41까지에 위치하는 "X" 부분의 아미노산 잔기는 대략 1 내지 30 개 잔기를 결실시키는 반면에, [Cys41-Cys133] 의 시스테인 잔기 사이에서는 위치에 따라 단백질 접힘이 파괴되지 않도록 전형적으로 약 1 내지 5 개의 잔기를 결실시킨다. 절단된 GDNF 단백질 내부를 결실시키면 형질전환 성장 인자 - 베타 (TGF - β) 군의 멤버들과 낮은 상동성을 갖는 영역이 생성될 것이다. 절단된 GDNF 단백질 중 다른 TGF - β 군의 서열과 상당한 상동성을 갖는 영역을 결실시키면 아마도 보다 현저하게 생물학적 활성도가 변화될 것이다. 총 결실체 및/또는 연속적인 결실체의 수는 영향을 받는 도메인 내에서 절단된 GDNF 단백질의 3 차 구조, 예를들어 시스테인 교차결합을 보호하기 위해 선택될 것이다.
아미노산 서열 부가체는 하나 또는 다수의 아미노산 잔기의 내부 서열내 삽입체 뿐만 아니라 1 개 내지 100 개 또는 그 이상의 잔기의 아미노 - 및/또는 카르복시 - 말단 융합체를 포함할 것이다. 내부에 부가되는 잔기 수는 일반적으로 약 1 내지 10 개 아미노산 잔기, 보다 일반적으로는 약 1 내지 5 개 아미노산 잔기, 통상적으로는 약 1 내지 3 개 아미노산 잔기이다. 상기 언급한 바와 같이, 본 발명의 아미노 - 말단 부가 변이체는 메티오닌 변이체 (예를들어, 박테리아성 재조합 세포 배양액내에서 GDNF 가 직접 발현된 인공산물) 또는 비 - GDNF 아미노산 잔기 또는 서열을 포함하는 것으로 생각된다. 아미노 - 말단 부가 변이체는 성숙한 GDNF 단백질을 재구성하는 아미노산 잔기의 삽입은 포함하지 않는다. 말단 삽입의 다른 예로서 재조합 숙주 세포로부터 단백질의 분비를 촉진시키기 위하여 N - 말단에 이질성의 N - 말단 시그날 서열을 융합시키는 것이 포함된다. 이러한 시그날 서열은 일반적으로 의도하는 숙주 세포 종과 균질성이므로 그것으로부터 수득할 것이다. 삽입체 또는 부가체는 다른 신경영양성 인자의 서열에서 유래한 아미노산 서열을 포함한다.
다른 군의 변이체는 아미노산 치환 변이체이다. 이들 변이체는 절단된 GDNF 단백질에서 제거되는 적어도 하나의 아미노산 잔기와 그 위치에 삽입되는 다른 잔기를 갖는다. 예를들어 도 5 를 참조하라. 여기에서 자연발생적인 Asn22는 Met 잔기를 용이하게 제거하기 위해 Ser 으로 치환되었다. X - [Cys41-Cys133] - Y 아미노산 서열 표시 및 절단된 GDNF 단백질 산물의 본 정의를 이용하여, 이러한 절단된GDNF 단백질을 치환 변이체 Met-[Asn22△Ser22-Ile134] 절단된 GDNF 단백질 또는 부가 변이체 Met-Ser-[Pro23-Ile134] 절단된 GDNF 단백질로 언급할 수 있다. 치환 변이체는 대립형질 변이체를 포함하는데, 그것은 아미노산 치환을 초래하거나 그렇지 않은 종이 집단내에서 자연적으로 발생하는 누클레오티드 서열 치환을 특징으로 한다.
절단된 GDNF 단백질의 서열에 대한 특이 돌연변이는 글리코실화 부위 (예를들어, 세린, 트레오닌 또는 아스파라긴) 의 변형을 포함할 수 있다. 글리코실화되지 않거나 일부만이 글리코실화되는 것은, O - 결합 탄수화물의 부가로 변형되는 단백질의 모든 아스파라긴- 결합 글리코실화 인식 부위 또는 모든 부위의 아미노산 치환 또는 결실에 의해 초래된다. 아스파라긴- 결합 글리코실화 인식 부위는 적당한 세포성 글리코실화 효소에 의해 특이하게 인식되는 트리펩티드 서열을 포함한다. 이들 트리펩티드 서열은 Asn-Xaa-Thr 또는 Asn-Xaa-Ser 중 하나이며, 이 중 Xaa 는 Pro 이외의 모든 아미노산일 수 있다. 글리코실화 인식 부위의 첫 번째 또는 세 번째 아미노산 위치 중 하나 또는 둘다에서 다수의 아미노산이 치환되거나 결실 (및/또는 두 번째 위치의 아미노산 결실) 되면 변형된 트리펩티드 서열 글리코실화되지 않는다. 따라서, 적절하게 변이된 누클레오티드 서열을 발현시키면 그 부위가 글리코실화되지 않은 변이체가 생성된다. 선택적으로, 서열은 절단된 GDNF 단백질의 글리코실화 부위가 부가되도록 변이시킬 수 있다.
돌연변이유발에 대한 절단된 GDNF 아미노산 잔기나 영역을 확인하는 방법 중하나는 Cunningham 및 Wells (Science, 244 : 1081 - 1085, 1989) 문헌에 기술되어 있는 바와 같이 "알라닌 스캐닝 돌연변이유발" 이라 부른다. 이 방법으로 표적 잔기 중 아미노산 잔기 또는 기를 확인하고(예를들어, Arg, Asp, His, Lys 및 Glu 와 같은 하전 잔기), 세포 내외의 주변 수성 환경과 아미노산이 상호작용하도록 중성 또는 음하전 아미노산 (알라닌 또는 폴리알라닌이 가장 바람직함) 으로 치환한다. 치환에 대한 기능상 민감성을 나타내는 이들 도메인을, 치환 부위에 부가적인 또는 택일적인 잔기를 도입함으로써 개량한다. 따라서, 아미노산 서열 변형 부위는 미리 정해져 있으며, 주어진 부위에서 가장 효과적으로 돌연변이가 실시되도록 알라닌 스캐닝 또는 무작위 돌연변이유발을 실시할 수 있고 바람직한 활성도와 활성화를 정도로 최적 결합된 변이체를 선별한다.
치환 돌연변이유발에 대하여 가장 중요한 부위는, 각각의 종으로부터의 GDNF 단백질에서 발견되는 아미노산이 곁가지 크기, 전하 및/또는 소수성에 있어서 실질적으로 다른 부위를 포함한다. 그외의 중요한 부위는 각각의 종에서 수득한 GDNF - 유사 단백질의 특정 잔기와 동일한 부위를 포함한다. 이러한 위치는 일반적으로 단백질의 생물학적 활성도에 중요하다. 초기에, 이들 부위는 상대적으로 보존적인 방식으로 치환에 의해 변이된다. 이러한 보존적 치환은 바람직한 치환이라는 항목으로 표 1 에 나타나 있다. 이러한 치환으로 생물학적 활성도가 변화된다면, 보다 다양한 치환 (예시적 치환) 을 실시하고/하거나 부가/결실도 실시하여 결과적인 산물을 선별하였다.
아미노산 치환
원래의 잔기 바람직한 치환 예시적 치환
Ala (A) Val Val;Leu;lle
Arg (R) Lys Lys;Gln;Asn
Asn (N) Gln Gln;His;Lys;Arg
Asp (D) Glu Glu
Cys (C) Ser Ser
Gln (Q) Asn Asn
Glu (E) Asp Asp
Gly (G) Pro Pro
His (H) Arg Asn;Gln;Lys;Arg
lle (I) Leu Leu;Val;Met;Ala;Phe;노르로이신
Leu (L) lle 노르로이신 ; lle;Val;Met;Ala;Phe
Lys (K) Arg Arg;Gln;Asn
Met (M) Leu Leu;Phe;lle
Phe (F) Leu Leu;Val;lle;Ala
Pro (P) Gly Gly
Ser (S) Thr Thr
Thr (T) Ser Ser
Trp (W) Tyr Tyr
Tyr (Y) Phe Trp;Phe;Thr;Ser
Val (V) Leu lle;Leu;Met;Phe;Ala;노르로이신
아미노산 서열의 보존적 변형 (및 코팅 핵산 서열에 대한 상응 변형) 으로, 하기 실시예에 기술되어 있는 절단된 GDNF 단백질과 유사한 기능적 및 화학적 특성을 갖는 절단된 GDNF 단백질이 생산될 것으로 기대된다. 그와는 대조적으로, 절단된 GDNF 단백질의 기능적 및/또는 화학적 특성을 본질적으로 변형시키는 것은 (a) 예를들어 쉬트 또는 나선형 구조와 같은 치환 영역내 폴리펩티드 골격 구조, (b) 표적 부위의 단백질 변화 또는 소수성, 또는 (c) 곁가지의 크기에 따라 미치는 영향이 상당히 다른 선택적인 치환에 의해 이룰 수 있다. 자연발생적인 잔기는 공통적인 곁가지 특성에 따라 나뉜다 :
(1) 소수성 : 노르로이신, Met, Ala, Val, Leu,Ile ;
(2) 중성 친수성 : Cys, Ser, Thr ;
(3) 산성 : Asp, Glu ;
(4) 염기성 : Asn, Gln, His, Lys, Arg ;
(5) 사슬 방향을 좌우하는 잔기 : Gly, Pro ; 및
(6) 방향성 : Trp,Tyr,Phe.
비-보존적인 치환은 다른 잔기를 이들 부류 중 한 요소로 치환하는 것을 포함할 것이다. 이러한 치환 잔기는 다른 TGF - β 단백질과 상동인 절단된 GDNF 단백질 영역 또는 단백질의 비 - 상동 영역 내로 도입될 수 있다.
B.절단된 GDNF 유도체
화학적으로 변형된 절단된 GDNF 유도체 또는 절단된 GDNF 변이체는 본 분야의 숙련자들에 의해 제조될 수 있다. 절단된 GDNF 단백질 유도에 가장 적당한 화학적 반분은 수용성 중합체를 포함한다. 수용성 중합체는 그것에 결합하는 단백질이 생리학적 환경과 같은 수성 환경에서 침전되지 않기 때문에 바람직하다. 중합체는 치료학적 산물이나 조성물을 제조하기 위해 제약학적으로 용인가능한 것이 바람직할 것이다. 본 분야의 숙련자들은 중합체/단백질 복합체가 치료학적으로 사용되는 지의 여부와 만약 그렇다면 바람직한 투여량, 순환 시간, 단백질 분해에 대한 저항성 및 그외의 고려사항에 근거하여 바람직한 중합체를 선택할 수 있을 것이다. 유도화의 유효성은 바람직한 형태 (즉, 삼투압 펌프 또는 더욱 바람직하게는 주사나 주입에 의해, 또는 경구, 폐나 다른 수송 경로에 적합하도록 더 제형화함) 로 유도체를 투여하거나 그것의 유효성을 결정함으로써 확인할 수 있다.
적당한 수용성 중합체는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG), 에틸렌 글리콜/프로필렌글리콜 공중합체, 모노메톡시 - 폴리에틸렌 글리콜, 카르복시메틸셀룰로스, 덱스트란, 폴리비닐 알코올, 폴리비닐 피롤리딘, 폴리-1, 3-디옥소란, 폴리-1,3,6-트리옥산, 에틸렌/말레산 무수물 공중합체, 폴리아미노산 (동종중합체 또는 무작위 공중합체 중 하나), 폴리(n - 비닐 피롤리딘) 폴리에틸렌 글리콜, 프로프로필렌 글리콜 동종중합체, 프롤리프로필렌 산화물/에틸렌 산화물 공중합체, 폴리옥시에틸화된 폴리올 (예를들어,글리세롤), 폴리에틸렌 글리콜 프로피온알데히드 및 그것의 혼합물을 포함하지만 그것으로 제한되지는 않는다. 본원에 사용한 바와 같이, 폴리에틸렌 글리콜은 모노-(C1-C10) 알콕시 - 또는 아릴록시 - 폴리에틸렌 글리콜과 같은 다른 단백질을 유도하는 데 사용해 왔던 모든 형태의 PEG 를 포함한다. 폴리에틸렌 글리콜 프로피온알데히드는 물에 대한 안정성 때문에 제조하기에 유리할 것이다. 중합체는 모든 분자량을 가질 수 있으며 가지난 것이거나 그렇지 않은 것일 수 있다.
본 발명은 특히 적어도 하나의 PEG 분자와 결합하는 절단된 GDNF 단백질을 포함하는 절단된 GDNF 단백질에 관한 것이다. 다른 양상에 있어서, 본 발명은 아실 또는 알킬 결합을 통해 적어도 하나의 PEG 와 결합하는 절단된 GDNF 단백질에 관한 것이다.
폴리에틸렌 글리콜화는 본 분야에 공지된 모든 폴리에틸렌 글리콜화반응에 의해 실시할 수 있다. 예를들어 Focus on Growth Factors 3 (2) ; 4 - 10 (1992) ; EP O 154 316 ; EP 0 401 384 ; 및 트레실 클로라이드를 이용한 GM-CSF 의 폴리에틸렌 글리콜화에 대해 보고한 Malik 등의 Exp. Hematol. 20 : 1028 - 1035 (1992) 를 참조하라. 폴리에틸렌 글리콜화는 반응성인 수용성 중합체와의 아실화반응 또는알킬화반응을 통해 실시하는 것이 바람직하다. 유도화에 바람직한 이들 방법은 하기에 더 상세히 기술되어 있다. 아실화반응의 경우, 중합체는 단일 반응성 에스테르기를 선택하는 것이 바람직하다. 환원성 알킬화반응의 경우, 중합체는 단일 반응성 알데히드기를 선택하는 것이 바람직하다. 또한, 선택한 중합체는 아실화의 경우 활성 에스테르이거나 알킬화의 경우 알데히드와 같은 단일 반응기를 갖도록 변형시켜 중합반응 정도를 조절할 수 있다. 일반적으로, 수용성 중합체는 보통 포유동물의 재조합 발현계에 의해 보다 편리하게 제조되므로 자연발생적인 글리코실 잔기에서 선택하지는 않을 것이다.
아실화
본 발명에 있어서, 아실화에 의한 폴리에틸렌 글리콜화는 일반적으로 절단된 GDNF 단백질과 폴리에틸렌 글리콜의 활성 에스테르 유도체를 반응시키는 것과 관계가 있다. 공지된 모든 PEG 분자 또는 계속 발견되는 반응성 PEG 분자를 폴리에틸렌 글리콜화 과정 실시에 이용할 수 있다. 바람직한 활성화 PEG 에스테르는 N - 히드록시숙시니미드 ("NHS") 에 대해 에스테르화한 PEG 이다. 본원에 사용한 바와 같이, "알킬화" 는 PEG 와 같은 수용성 중합체 및 절단된 GDNF 단백질 간의 다음 결합 형태 : 아미드, 카바메이트, 우레탄 등을 포함하며 그것으로 제한되지는 않는 것으로 여겨진다. Bioconjugate Chem. 5 : 133 - 140 (1994) 를 참조하라. 반응 조건은 폴리에틸렌 글리콜화 분야에 공지된 모든 것이나 계속 개발되는 것 중에서 선택할 수 있으나, 변형되는 절단된 GDNF 단백질을 불활성화시키는 온도, 용매 및 pH 수준과 같은 반응 조건에 대한 노출은 피하거나 제한해야 한다.
아실화에 의한 폴리에틸렌 글리콜화는 일반적으로 폴리-폴리에틸렌 글리콜화된 절단된 GDNF 단백질을 생산할 것이며, 여기에서 리신 ε - 아미노기는 아실 결합기를 통해 폴리에틸렌 글리콜화된다. 바람직하게, 연결 고리는 아미드일 것이다. 또한 결과적으로 생성되는 산물은 실질적으로 모노-, 디- 또는 트리-폴리에틸렌 글리콜화만이 존재할 것이다 (예를들어, ≥ 95 %). 그러나, 고도로 폴리에틸렌 글리콜화된 일부 복합체는 사용된 특이 반응 조건에 따라 통틀어 생성될 것이다. 원한다면, 투석, 염석, 한외여과, 이온 - 교환 크로마토그래피, 겔 여과 크로마토그래피 및 전기영동을 특히 포함하는 표준적인 정제 기술에 의해 더욱 정제된 폴리에틸렌 글리콜화 복합체를 혼합물로부터 제조할 수 있다.
알킬화
본 발명에 있어서, 알킬화에 의한 폴리에틸렌 글리콜화는 일반적으로 환원제의 존재시에 절단된 GDNF 단백질과 PEG 의 말단 알데히드 유도체를 반응시키는 것을 포함한다. 알킬화에 의한 폴리에틸렌 글리콜화 또한 폴리-폴리에틸렌 글리콜화된 절단된 GDNF 단백질을 생성시킬 수 있다. 게다가, 실질적으로 단백질 (즉, 모노-폴리에틸렌 글리콜화된 종) 의 N - 말단, α - 아미노기에서의 폴리에틸렌 글리콜화에 가장 유리한 반응 조건은 누구나 조작할 수 있다. 모노-폴리에틸렌 글리콜화 또는 폴리폴리에틸렌글리콜화 중 한 경우에 있어서, PEG 기는 - CH2- NH -기에 의해 단백질에 결합되는 것이 바람직하다. 특히 - CH2- 기에 관하여, 이러한 고리 형태는 본원에서 "알킬" 고리로 언급한다.
선택적인 N - 말단의 화학적 변형은 특정 단백질을 유도하는 데 이용할 수 있는 상이한 형태의 상이한 반응성을 갖는 1 차 아미노기 (리신 대 N - 말단) 를 이용하는 환원성 알킬화반응에 의해 실시할 수 있다. 적당한 반응 조건하에서, 실질적으로 N - 말단에 카르보닐기 - 함유 중합체를 갖는 단백질을 선택적으로 유도한다. 예를들어, 단백질의 리신 잔기의 ε - 아미노기와 N - 말단 잔기의 α - 아미노기 간의 pKa차이를 이용할 수 있게 하는 pH 에서 반응을 실시함으로써 선택적으로 단백질의 N - 말단을 폴리에틸렌 글리콜화할 수 있다. 이러한 선택적인 유도화에 의해, 단백질에 대한 수용성 중합체의 결합이 조절된다 : 중합체와의 결합은 단백질의 N - 말단에서 현저하게 나타나며, 리신 곁가지 아미노기와 같은 그외의 반응기에 대한 주목할 만한 변형은 일어나지 않는다. 환원성 알킬화반응을 이용하여, 수용성 중합체는 단백질에 결합하기 위해 단일 반응성 알데히드를 갖는 것이 바람직하다. 단일 반응성 알데히드를 비롯한 폴리에틸렌 글리콜 프로피온알데히드를 사용할 수 있다.
본 발명은 폴리에틸렌 글리콜화된 절단된 GDNF 단백질을 포함하는데, 여기에서 PEG 기는 아실기나 알킬기에 의해 결합된다. 상기한 바와 같이, 이러한 절단된 GDNF 단백질 산물은 모노 - 폴리에틸렌 글리콜화 또는 폴리 - 폴리에틸렌 글리콜화된 것일 수 있다 (예를들어, 2-6, 바람직하게는 2-5 개의 PEG 기 함유). PEG 기는 일반적으로 아미노산의 α - 또는 ε - 아미노기에서 단백질에 결합되지만, 적당한 반응 조건 하에서 PEG 기가 결합하기에 충분히 반응성인 단백질의 모든 반응기에결합할 수 있는 것으로 생각된다. 따라서, 폴리에틸렌 글리콜은 유리 아미노기 또는 카르복시기와 같은 반응기에 의해 단백질에 공유결합될 것이다.
반응기는 활성화된 PEG 분자가 결합되는 기이다. 유리 아미노기를 갖는 아미노산 잔기는 리신 잔기와 N - 말단 아미노산 잔기를 포함한다. 유리 카르복시기를 갖는 것들은 아스파르트산 잔기, 글루타민산 잔기 및 C - 말단 아미노산 잔기를 포함할 것이다. 설프히드릴기는 PEG 분자를 결합시키는 반응기로도 사용된다. 치료학적 목적을 위해, 일반적으로 N - 말단 또는 리신기와 같은 아미노기에서의 결합이 바람직하다. 수용체 결합을 원한다면 수용체 결합에 중요한 잔기에서의 결합은 피해야 한다.
또다른 양상에 있어서, 본 발명은 모노 - 중합체/절단된 GDNF 단백질 복합체의 실질적으로 균질인 제제를 제공하는데, 여기에서 중합체 분자는 실질적으로 한 장소에만 결합되었다 (즉, ≥95 %) . 특히 PEG 를 사용하면, 본 발명은 있을 수 있는 항원성 결합기는 결핍되어 있고 절단된 GDNF 단백질에 직접 결합하는 PEG 분자를 갖는 폴리에틸렌 글리콜화된 절단된 GDNF 단백질을 제공한다.
또한, 유도체는 글리코실화되거나 글리코실화되지 않은 또는 탈 - 글리코실화된 절단된 GDNF 단백질을 이용하여 제조할 수 있다. 일반적으로는 글리코실화되지 않은 절단된 GDNF 단백질을 이용한다. 예를들어, 원핵 - 발현된 [Arg32-Ile134] 절단된 GDNF 단백질은 모노 - 또는 폴리 - (예를들어, 2 - 4 개의 PEG 반분이 아실기나 알킬기에 의해 결합) 를 포함하도록 화학적으로 유도할 수 있다.
일반적으로, 화학적 유도는 활성화된 중합체 분자를 생물학적으로 활성인 기질과 반응시키는 데 사용하는 모든 적합한 조건하에서 실시할 수 있다. 폴리에틸렌 글리콜화된 절단된 GDNF 단백질의 제조방법은 일반적으로 (a) 절단된 GDNF 단백질이 하나 또는 그 이상의 PEG 기에 결합되는 조건하에서 폴리에틸렌 글리콜 (PEG 의 반응성 에스테르 또는 알데히드 유도체와 같은) 을 절단된 GDNF 단백질과 반응시키고,(b) 반응 산물을 수득하는 단계를 포함할 것이다. 일반적으로, 알킬화 반응에 대한 최적 반응 조건은 공지된 파라미터와 원하는 결과에 기초하여 경우에 따라 결정될 것이다. 예를들어, PEG : 단백질의 비가 클수록 폴리-폴리에틸렌 글리콜화된 산물의 백분율이 더 커진다. 최적비 (반응하지 않는 단백질 또는 중합체 초과량이 없기 때문에 반응 효율로 환산) 는 원하는 유도화 정도 (예를들어, 모노 -, 디 -, 트리 - 등), 선택한 중합체의 분자량, 중합체가 가지난 것인지 아닌지 여부 및 사용된 반응 조건과 같은 인자에 의해 결정될 것이다.
모노 - 중합체/절단된 GDNF 단백질 복합체의 실질적으로 균질인 집단을 생산하는 환원성 알킬화는 일반적으로 (a) 환원성 알킬화 조건하에서 절단된 GDNF 단백질의 아미노 말단에서 α - 아미노기를 선택적으로 변형시키기에 적당한 pH 로 반응성 PEG 분자를 절단된 GDNF 단백질과 반응시키고, (b) 반응 산물을 수득하는 단계를 포함할 것이다.
모노 - 중합체/절단된 GDNF 단백질 복합체의 실질적으로 균질인 집단일 경우, 환원성 알킬화 반응 조건은 절단된 GDNF 단백질의 N - 말단에 수용성 중합체 반분을 선택적으로 결합시키는 조건이다. 이러한 반응 조건은 일반적으로 N - 말단에서 리신 아미노기와 α - 아미노기 간의 pKa차이를 제공한다 (pKa는 아미노기의 50 % 는 양자수여되고 50 % 는 그렇지 않은 pH 이다). 또한 pH 는 사용되는 단백질에 대한 중합체의 비에 영향을 끼친다. 일반적으로 pH 가 더 낮으면 단백질에 대한 중합체의 초과량은 많은 것이 바람직할 것이다 (즉, N - 말단 α - 아미노기의 보다 낮은 반응성과 다량의 중합체가 최적 조건을 이루는 데 필요하였다). pH 가 더 높으면, 중합체 : 단백질 비는 클 필요가 없다 (즉, 보다 적은 중합체 분자가 필요하므로 더 많은 반응기를 이용할 수 있다). 본 발명의 목적을 위하여, 일반적으로 pH 는 3 - 9, 바람직하게는 3 - 6 범위내에 속할 것이다.
중합체의 분자량 또한 고려해야 한다. 일반적으로, 중합체의 분자량이 더 클 수록 단백질에 부착될 수 있는 중합체 분자의 수는 더 적다. 유사하게, 이 변수들을 최적화할 때 중합체의 분지(branching) 도 고려해야 한다. 일반적으로 분자량이 더 클 수록 (또는 더 많이 분지될 수록) 중합체 : 단백질 비율은 더 크다. 대개, 본원에서 의도하는 폴리에틸렌 글리콜화 반응에 대한 바람직한 평균 분자량은 약 2 kDa 내지 약 100 kDa 이다 (용어 "약" 은 폴리에틸렌 글리콜 제제에 있어 어떤 분자의 분자량이 상태 분자량 보다 더 크거나, 더 적을 것이라는 것을 의미함). 바람직한 평균 분자량은 약 5 kDa 내지 약 50 kDa 이며, 약 12 kDa 내지 약 25 kDa 이 특히 바람직할 것이다. 절단된 GDNF 단백질에 대한 수용성 중합체의 비율은 일반적으로 1 : 1 내지 100 : 1 의 범위일 것이며, 1 : 1 내지 20 : 1 (폴리폴리에틸렌 글리콜화에 대해) 및 1 : 1 내지 5 : 1 (모노 - 폴리에틸렌 글리콜화에 대해) 이바람직할 것이다.
상기 조건들을 이용하면, 환원성 알킬화가 아미노 말단에서 α - 아미노기를 갖는 어떠한 절단된 GDNF 단백질에도 중합체의 선택적 부착을 제공할 것이며, 모노 - 중합체/절단된 GDNF 단백질 복합체의 실질적으로 균질한 제제를 제공할 것이다. 여기에 사용된 용어 "모노 - 중합체/절단된 GDNF 단백질 복합체" 란 절단된 GDNF 단백질에 부착된 단일 중합체 분자를 함유하는 유도체를 의미한다. 모노 - 중합체/절단된 GDNF 단백질 복합체는 리신 아미노 곁기상이 아니라 N - 말단에 위치한 중합체 분자를 갖는 것이 바람직할 것이다. 제제는 90 % 이상의 모노 - 중합체/절단된 GDNF 단백질 복합체가 바람직할 것이며, 95 % 이상의 모노 - 중합체/절단된 GDNF 단백질 복합체가 더 바람직할 것인데, 관찰가능한 단백질 잔류물은 반응되지 않은 것이다 (즉, 중합체 성분이 결여된 단백질).
환원성 알킬화에 있어서, 환원제는 수용액에 안정해야 하며 바람직하게 환원성 알킬화의 초기 과정에 형성된 쉬프 염기만을 환원시킬 수 있어야 한다. 전형적인 환원제는 다음으로 구성된 군 중에서 선택할 수 있다 : 수소화붕소 나트륨, 시아노수소화붕소 나트륨, 디메틸아민 보란, 트리메틸아민 보란 및 피리딘 보란. 특히 바람직한 환원제는 시아노수소화붕소 나트륨이다. 용매, 반응 시간, 온도등과 같은 다른 환원 변수 및 산물 정제수단은 수용성 중합체를 수반한 단백질의 유도체화와 관련되는 상업적으로 이용할 수 있는 정보를 기초로 하여 그때그때에 결정할 수 있다.
아실화 및/또는 알킬화 방법에 의해 중합체/단백질 복합체의 혼합물을 제조하는 것을 선택할 수도 있는데, 본원에서 제공하는 잇점은 혼합물내에 포함시키기 위해 모노 - 중합체/단백질 복합체의 비율을 선택할 수 있다는 것이다. 따라서, 원한다면 다양한 수의 중합체 분자가 부착된 (즉, 디 -, 트리 -, 테트라 - 등) 단백질 혼합물을 제조할 수 있고, 본 방법을 사용하여 제조한 모노 - 중합체/단백질 복합체 물질과 결합시킬 수 있으며, 예정된 비율의 모노 - 중합체/단백질 복합체와의 혼합물을 가질 수도 있다.
절단된 GDNF 단백질을 코딩하는 폴리누클레오티드
본 발명은 절단된 GDNF 단백질을 코딩하는 새로운 폴리누클레오티드를 더 제공한다. 혼성화 프로브나 증폭 프라이머로서 사용할 때, 이 핵산 서열은 실질적으로 모든 다른 핵산 서열이 없을 것이다. 재조합 단백질 발현에 사용하기 위한 핵산 서열은, 융합 단백질을 의도하지 않는다면, 대개 다른 단백질을 코딩하는 핵산 서열이 실질적으로 없을 것이다. 본 상세한 설명을 기초로 하고 일반 코돈표를 사용하면, 본 기술분야의 통상의 지식을 가진자들은 절단된 GDNF 단백질의 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 서열 모두를 쉽게 결정할 수 있다. 현재 선호되는 서열은 [Arg16- lle134], [Ser26- lle134], [Arg32-lle134] 및 [Lys37- lle134] 절단된 GDNF 단백질을 코딩하는 그것의 폴리누클레오티드를 포함한다. 다양한 폴리누클레오티드의 예는 절단된 GDNF 단백질을 코딩하는 도 1,3 및 4 의 부분 뿐만 아니라 도 5, 6 및 7 에 도시되어 있다. 절단된 GDNF 단백질을 코딩하는 새로운 폴리누클레오티드에는 합성한 것이든지 자연 발생적이든지 간에 절단된 GDNF 단백질 변종을 코딩하는 핵산 서열이 포함된다는 것 역시 본 분야의 숙련된 기술자들이 인식할 것이다.
이들 폴리누클레오티드를 생산하여 다양한 절단 GDNF 단백질을 발현시킬 수 있는 재조합 발현 기술은 하기 설명에 따라 수행하였다. 예를들어, 절단된 GDNF 단백질을 코딩하는 핵산 서열을 고유 벡터내로 삽입시킴으로써, 본 분야의 기술자들은 원하는 누클레오티드 서열을 쉽게 대량으로 생산할 수 있다. 그런 다음 이 서열을 사용하여 검출 프로브나 증폭 프라이머를 생성시킬 수 있다. 택일적으로, 절단된 GDNF 단백질을 암호하는 폴리누클레오티드를 발현벡터내에 삽입시킬 수 있다. 이 발현벡터를 고유 숙주내로 도입시킴으로써, 원하는 GDNF 단백질을 대량으로 생산할 수 있다.
본원에 더 기술한 바와 같이, 핵산 서열의 신장 및/또는 절단된 GDNF 단백질의 생산에 이용할 수 있는 다수의 숙주/벡터계가 존재한다. 이것은 플라스미드, 바이러스 및 삽입 벡터와 원핵 및 진핵 숙주를 포함하나, 이에 국한되지는 않는다. 본 분야의 숙련된 기술자들은 이종 DNA 를 신장시키거나 발현할 수 있는 숙주/벡터계를 본 발명의 서열을 생산하거나 발현하도록 적응시킬 수 있다.
그와 같은 재조합 기술에 의해, 본 발명의 절단된 GDNF 단백질은 쉽게 상업적 양으로 생산된다. 게다가, 본 분야의 숙련된 기술자들은 새로운 핵산 서열에는 도에 명확하게 도시한 절단된 GDNF 단백질, 그와 같은 절단된 GDNF 단백질의 변종을 코딩하는 동의성 핵산 서열 및 바람직하게 엄격한 혼성화 조건하에서 이들 핵산 서열에 상보적으로 혼성화하는 핵산 서열이 포함된다는 것을 본 명세서를 고려하여 인식할 것이다 [ Maniatis 등의 Molecular Cloning (A Laboratory Manual); ColdSpring Harbor Laboratory, pages 387 to 389, 1982 참조]. 전형적인 엄격한 혼성화 조건은 62 - 67 ℃ 에서 4 X SSC 로 혼성화한 다음 62 - 67 ℃ 에서 약 1 시간 동안 0.1 X SSC 로 세척하는 것이다. 택일적으로, 전형적인 엄격한 혼성화 조건은 40 - 45 ℃ 에서 45 - 55 % 포름아미드, 4 X SSC 로 혼성화하는 것이다. 완화된 혼성화 조건하에서 절단된 GDNF 단백질에 대한 상보적 서열에 혼성화하고 본 발명의 절단된 GDNF 단백질을 코딩하는 DNA 서열 역시 본원에 포함된다. 그와 같은 완화된 엄격한 혼성화 조건의 예는 45 - 55 ℃ 에서 4 X SSC 로 혼성화하거나 40 - 45 ℃ 에서 30 - 40 % 포름아미드로 혼성화하는 것이다.
또한 본 발명은 절단된 GDNF 단백질을 코딩하는 DNA 서열과 함께 벡터 DNA 를 포함하는 재조합 DNA 구성물을 제공한다. 그와 같은 DNA 구성물에 있어, 절단된 GDNF 단백질 (시그널 펩티드를 수반하거나 수반하지 않는) 을 코딩하는 핵산 서열은 절단된 GDNF 단백질의 복제 및/또는 발현을 지시할 수 있는 선택된 숙주내 적합한 발현 조절 서열과 관련하여 작동된다.
절단된 GDNF 단백질의 재조합 발현
절단된 GDNF 를 코딩하는 폴리누클레오티드 제조
절단된 GDNF 를 코딩하는 핵산 서열, 또는 성숙한 GDNF 출발 물질은 화학 합성, cDNA 나 게놈 라이브러리 선별, 발현 라이브러리 선별 및/또는 cDNA 의 PCR 증폭을 포함하는 다양한 방식으로 제한없이 쉽게 수득할 수 있다. 이들 방법 및 그와 같은 핵산 서열을 분리하는데 유용한 다른 방법들은 예를들어, Sambrook 등의 문헌 (Molecular Cloning : A Laboratory Manual, Cold spring Harbor LaboratoryPress, Cold Spring Harbor, NY, 1989), Ausubel 등의 문헌 (Current Protocols in Molecular Biology, Current Protocols Press, 1994) 및 Berger 및 Kimmel 의 문헌 (Methods in Enzymology : Guide to Molecular Cloning Techniques, vol. 152, Academic Press, Inc., San Diego, CA, 1987) 에 기술되어 있다. GDNF 를 코딩하는 바람직한 핵산 서열은 포유동물 서열이다.
절단된 GDNF 단백질을 코딩하는 핵산 서열의 화학 합성 또한 Engels 등의 문헌 (Angew. Chem. Intl. Ed., 28 : 716 - 734, 1989) 에 기술되어 있는 방법과 같이, 본 기술분야에 공지되어 있는 방법을 이용하여 수행할 수 있다. 이들 방법은, 특히, 포스포트리에스테르, 포스포라미디트 및 H - 포스포네이트 핵산 서열 합성법을 포함한다. 절단된 GDNF 단백질을 코딩하는 핵산 서열은 몇 백 염기쌍 (bp) 또는 누클레오티드 길이일 것이다. 예를들어 약 100 누클레오티드 길이 이상인 큰 핵산 서열을 몇 개의 단편으로서 합성할 수 있다. 그런 다음 이 단편을 서로 결합시켜 절단된 GDNF 단백질을 코딩하는 핵산 서열을 형성할 수 있다. 바람직한 방법은 표준 포스포라미디트 화학을 이용하는 중합체 - 지지 합성법이다.
택일적으로, 적당한 cDNA 라이브러리 (즉, 단백질을 발현한다고 여겨지는 하나 또는 그 이상의 조직원(들)로 부터 제조한 라이브러리) 또는 게놈 라이브러리 (총 게놈 DNA 로 부터 제조한 라이브러리) 를 선별함으로써 적합한 핵산 서열을 수득할 수도 있다. cDNA 라이브러리원은 전형적으로 적당량의 GDNF 를 발현할 것이라고 여겨지는 임의의 생검물질로 부터의 조직이다. 게놈 라이브러리의 원은 GDNF 나 GDNF 동족체를 코딩하는 유전자를 함유하고 있다고 여겨지는 임의의 포유동물 또는다른 생검물질로 부터의 임의의 조직이거나 조직일 수도 있다. 라이브러리에 존재하는 GDNF 나 GDNF 동족체의 cDNA(s) 또는 유전자(들)과 선택적으로 혼성화할 하나 또는 그 이상의 핵산 프로브 (클로닝될 GDNF 나 GDNF 동족체의 cDNA 또는 유전자에 대해 수용가능한 상동성 수준을 갖는 올리고누클레오티드, cDNA 또는 게놈 DNA 단편) 를 사용하여 GDNF cDNA/유전자의 존재에 대해 라이브러리를 선별할 수 있다. 그와 같은 라이브러리 선별을 위해 전형적으로 사용되는 프로브는 보통 라이브러리의 제조원인 생검물질과 같거나 유사한 생검물질로 부터의 GDNF DNA 서열의 작은 부위를 암호한다. 택일적으로, 본원에 기술한 바와 같이, 프로브는 동의성일 수도 있다.
비-특이 결합은 방지하지만 프로브나 프라이머와 상당한 수준의 상동성을 갖는 클론의 결합을 허용하는 엄격한 조건하에서 올리고누클레오티드 프로브나 cDNA 를 라이브러리 클론에 어닐링시킴으로써 라이브러리 선별을 수행한다. 전형적인 혼성화 및 세척의 엄격한 조건은 부분적으로, cDNA 나 올리고누클레오티드 프로브 - 프로브가 동의성이든지 간에 - 의 크기(즉, 누클레오티드 길이의 수) 에 달려있다. 혼성화 용액을 고안하는데 있어 클론(들) 수득 가능성 역시 고려한다 (즉, cDNA 라이브러리가 선별되든지 게놈 라이브러리가 선별되든지 간에 ; 만일 cDNA 라이브러리가 선별된다면, 흥미있는 cDNA 가 고수준으로 존재한다는 가능성이다).
DNA 단편 (이를테면, cDNAs) 이 프로브로서 사용될 경우 전형적인 혼성화 조건은 Ausubel 등의 상기문헌에 기술되어 있는 조건을 포함한다. 혼성화 후에 라이브러리를 함유하고 있는 블롯을 적합한 엄격성으로 세척하는데, 이 엄격성은 프로브 크기, 클론에 대한 프로브의 예상 상동성, 선별되는 라이브러리 유형, 선별되는 클론의 수등과 같은 몇몇 인자에 좌우된다. 엄격한 세척용액 (보통 이온세기가 낮고 비교적 고온에서 사용) 의 예는 다음과 같다. 하나의 그와 같은 엄격한 세척용액은 55 - 65 ℃ 에서 0.015 M NaCl, 0.005 M 시트르산 나트륨 및 0.1 % SDS 이다. 다른 그와 같은 엄격한 완충용액은 약 40 - 50 ℃ 에서 1 mM Na2EDTA, 40 mM NaHPO4, pH 7.2 및 1 % SDS 이다. 하나의 다른 엄격한 세척용액은 약 50 - 65 ℃ 에서 0.2 X SSC 및 0.1 % SDS 이다.
올리고누클레오티드가 cDNA 나 게놈 라이브러리를 선별하는데 사용되는 경우 엄격한 세척 조건에 대한 전형적인 프로토콜 또한 존재한다. 예를들어, 첫 번째 프로토콜은 프로브의 길이에 좌우되는 약 35 - 62 ℃ 의 온도에서 0.05 % 피로인산 나트륨과 함께 6 X SSC 를 사용하는 것이다. 예를들어, 14 염기 프로브는 35 - 40 ℃ 에서 세척하고, 17 염기 프로브는 45 - 50 ℃ 에서, 20 염기 프로브는 52 - 57 ℃ 에서 세척하며, 23 염기 프로브는 57 - 63 ℃ 에서 세척한다. 바탕 비-특이 결합이 높게 나타날 경우 이 온도를 2 - 3 ℃ 증가시킬 수 있다. 두 번째 프로토콜은 세척용으로 염화 테트라메틸암모니움 (TMAC) 을 사용하는 것이다. 하나의 그와 같은 엄격한 세척용액은 3 M TMAC, 50 mM 트리스 - HCl, pH 8.0 및 0.2 % SDS 이다.
GDNF 단백질을 코딩하는 핵산 서열을 수득하기 위한 또 다른 적합한 방법은 폴리머라제 사슬 반응 (PCR) 이다. 이 방법에 있어, GDNF 를 발현하는 조직으로 부터 폴리(A) + RNA 나 총 RNA 를 추출한다. 그런 다음 효소 역전사효소를 이용하여이 RNA 로 부터 cDNA 를 제조한다. 전형적으로 GDNF cDNA 의 두 개의 분리 부위에 상보적인 두 개의 프라이머 (올리고누클레오티드) 를 Taq 폴리머라제와 같은 폴리머라제 - 이 폴리머라제는 두 개의 프라이머 사이의 cDNA 부위를 증폭시킨다 - 와 함께 cDNA 에 부가한다.
원하는 절단된 GDNF 단백질을 코딩하는 핵산 서열을 제조하기 위한 선택적 방법이 올리고누클레오티드 프라이머나 프로브의 사용을 필요로 할 경우 (예를들어, PCR, cDNA 나 게놈 라이브러리 선별), 프로브나 프라이머로서 선택하는 올리고누클레오티드 서열은 라이브러리 선별이나 PCR 증폭 중에 발생될 비-특이 결합의 양을 최소화하도록 알맞은 길이이어야 하며 충분히 명백해야 한다. 프로브나 프라이머의 실제 서열은 보통 다른 유기체로 부터 얻은 동일하거나 유사한 유전자로 부터의 보존적이거나 고상동성 서열 또는 부위를 기초로 한다. 임의로, 프로브나 프라이머는 완전히 동의성이거나 부분적으로 동의성일 수 있는데, 즉 모두 동일한 아미노산 서열을 암호하지만, 그렇게 하기 위해 다른 코돈을 사용하는, 프로브/프라이머의 혼합물을 포함할 수 있다. 동의성 프로브를 제조하는 택일적 방법은, 종에 의해 변화되는 그것의 코돈 위치 중 일부나 전부에 이노신을 위치시키는 것이다. 상기한 바와 같은 DNA 화학합성법에 의해 올리고누클레오티드 프로브나 프라이머를 제조할 수도 있다.
GDNF 를 코딩하는 이들 핵산 서열 뿐만 아니라 , 그것의 돌연변이체 또는 변종 서열에 근거한 절단된 GDNF 단백질 역시 본 발명의 범위 이내이다. 상기한 바와같이, 돌연변이체 또는 변종 서열은 야생형 서열에 비해 하나 또는 그 이상의 누클레오티드 치환, 결실 및/또는 삭제를 함유하며 그 결과 야생형 아미노산 서열에 비해 아미노산 서열 변형을 발현시키는 서열이다. 어떤 경우에는 천연 대립형질 변형이 존재함으로 인해, 자연 발생적인 GDNF 아미노산 돌연변이체 또는 변종이 존재할 수 있다. 그와 같은 자연 발생적인 돌연변이체 또는 변종에 기초하는 절단된 GDNF 단백질 또한 본 발명의 범위 이내이다. 또한 합성 돌연변이체 서열의 제조에 관하여 본 기술분야에 공지되어 있는데, 예를들면 Wells 등의 문헌 (Gene, 34 : 315, 1985 참조) 과 Sambrook 등의 상기 문헌에 기술되어 있다.
벡터
절단된 GDNF 단백질을 코딩하는 cDNA 나 게놈 DNA 를 더 클로닝시키거나(DNA 증폭) 발현시키기 위해 벡터내에 삽입한다. 적합한 벡터는 상업적으로 입수할 수 있으나, 특별히 구성할 수도 있다. 알맞은 벡터의 선택 또는 구성은 다음에 좌우될 것이다 :
1) DNA 증폭용 또는 DNA 발현용으로 사용되는지의 여부, 2)
벡터내에 삽입될 DNA 의 크기, 및 3) 벡터에 의해 형질전환될 숙주세포 (예를들어, 포유동물, 곤충, 효모, 곰팡이, 식물 또는 박테리아 세포). 각 벡터는 그 기능 (DNA 증폭 또는 DNA 발현) 및 계획된 숙주세포와의 양립성에 좌우되는 다양한 성분을 함유한다. 벡터 성분에는 일반적으로 다음 중 하나 또는 그 이상이 포함되나, 이에 국한되지는 않는다 : 시그널 서열, 복제 기원, 하나 또는 그 이상의 선택 또는 표식 유전자, 인헨서 요소, 프로모터, 전사 종결 서열등. 이들 성분은 천연원으로 부터 수득할 수 있거나, 공지 방법으로 합성할 수 있다.
본 발명의 벡터는, 선택된 숙주 세포에 의해서 절단된 GDNF 단백질의 발현을 지시하거나, 조절하거나 그렇지 않으면 그것에 영향을 미칠 수 있는 다음의 발현 조절 서열 중 하나 또는 그 이상과 효과적으로 연결된, 흥미 있는, 절단된 GDNF 단백질을 코딩하는 핵산 서열을 포함한다.
시그널 서열
시그널 서열은 벡터의 성분일 수도 있거나, 벡터내로 삽입되는 GDNF DNA 의 부분일 수도 있다. 천연 GDNF DNA 는 단백질의 아미노 말단에 있는 시그널 서열을 코딩하는데, 이 서열은 번역후 프로세싱 중에 성숙한 GDNF 단백질을 형성하기 위해 절단된다. 천연 시그널 서열이 삭제되고 이종 시그널 서열로 대체된 절단된 GDNF 폴리누클레오티드 뿐만 아니라 천연 시그널 서열 및 다른 프리-프로 서열을 갖는 절단된 GDNF 폴리누클레오티드도 본 발명의 범위 이내이다. 선택된 이종 시그널 서열은 숙주세포에 의해 인식되고 처리되는, 즉 시그널 펩티다제에 의해 절단되는 서열이어야 한다. 원핵 숙주 세포가 천연 GDNF 시그널 서열을 인식하고 처리하지 않는 경우에는, 예를들어 알칼린, 포스파타제, 페니실리나제 또는 열-안정 엔테로톡신 Ⅱ 리더 군 중에서 선택한 원핵 시그널 서열로 상기 시그널 서열을 치환한다. 효모 분비를 위해서는 천연 GDNF 시그널 서열을 효모 인베르타제, 알파 인자 또는 에시드 포스파타제 리더로 치환할 수도 있다. 포유동물 세포 발현에 있어서는, 비록 다른 포유동물 시그널 서열이 적합할 수 있을지라도, 천연 시그널 서열이 만족스럽다.
복제 기원
일반적으로 발현 및 클로닝 벡터는 하나 또는 그 이상의 선택 숙주세포내에서 벡터를 복제시킬 수 있는 핵산 서열을 포함한다. 클로닝 벡터에 있어, 전형적으로 이 서열은 벡터를 독립적으로 복제시킬 수 있는, 숙주 염색체 DNA 로 된 서열이며, 복제 기원 또는 자율적 복제 서열을 포함한다. 다양한 박테리아, 효모 및 바이러스에 대한 그와 같은 서열은 공지되어 있다. 플라스미드 pBR322 로 부터의 복제 기원이 대부분 그람 - 음성 박테리아에 적합하며 다양한 기원들 (예를들어, SV40, 폴리오마, 아데노바이러스, VSV 또는 BPV) 은 포유동물 세포내에서 벡터를 클로닝시키는데 유용하다. 일반적으로, 복제 기원 성분은 포유동물 발현 벡터에는 필요하지 않다 (예를들어, SV40 기원이 초기 프로모터를 함유하고 있기 때문에 단지 이것만이 종종 이용된다).
선택 유전자
발현 및 클로닝 벡터는 전형적으로 선택 유전자를 함유한다. 이 유전자는 형질전환된 숙주세포를 선택 배지에 성장시켰을 때 이 세포의 생존 또는 성장에 필수적인 "표식자" 단백질을 코딩한다. 이 벡터로 형질전환되지 않은 숙주세포는 선택 유전자를 함유하지 않을 것이며, 따라서 배지내에 생존하지 않을 것이다. 전형적인 선택 유전자는 다음과 같은 단백질을 코딩한다 : (a) 항생제나 다른 독소, 예를들어, 암피실린, 네오마이신, 메토트렉세이트, 또는 테트라사이클린에 내성을 부여하는 단백질 ; (b) 영양요구 결핍을 보충하는 단백질 ; 또는 (c) 배지로 부터 이용할 수 없는 임계 영양을 공급하는 단백질.
발현될 유전자를 증폭시키기 위해 다른 선택 유전자를 사용할 수도 있다. 증폭은 성장을 위해 임계 단백질 생산이 더 많이 요구되는 유전자를 계속적으로 생성되는 재조합 세포의 염색체 내부에 세로로 일렬로 반복시키는 과정이다. 포유동물 세포에 대해 선택가능한 적합한 표식자의 예로는 디히드로 엽산 환원효소 (DHFR) 및 티미딘 키나제가 포함된다. 포유동물 세포 형질전환체는, 오직 이 형질전환체가 벡터에 존재하는 표식자에 의해서만 독특하게 생존되도록 순응시킨 선택 압력하에 위치시킨다. 배지내 선택 인자의 농도를 연속적으로 변화시킴으로써 그 결과 선택 유전자와 절단된 GDNF 를 코딩하는 DNA 둘 다가 증폭되게 하는 조건하에서 형질전환체 세포를 배양함으로써 선택 압력은 강요된다. 결과로서, 절단된 GDNF 의 증가된 양은 증폭된 DNA 로 부터 합성된 것이다.
예를들어, DHFR 선택 유전자로 형질전환된 세포는 먼저 메토트렉세이트, DHFR 의 경쟁적 길항물질을 함유하는 배지에 이 형질전환체 모두를 배양함으로써 확인된다. 야생형 DHFR 이 사용될 때, 적합한 숙주세포는 DHFR 활성도가 결여된 중국 햄스터 난소 세포이다 {예를들어, Urlaub 및 Chasin 의 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77 (7) : 4216 - 4220 (1980) 문헌 참조}. 그런 다음 형질전환된 세포를 증가된 수준의 메토트렉세이트에 노출시킨다. 이로 인해 DHFR 유전자의 다중 복사 합성이 야기되며, 동시에, 절단된 GDNF 단백질을 코딩하는 DNA 와 같은, 발현 벡터내에 존재하는 다른 DNA 의 다중 복사 합성이 야기된다.
프로모터
본 발명의 발현 및 클로닝 벡터는 전형적으로, 숙주 유기체에 의해 인식되며 절단된 GDNF 단백질을 코딩하는 핵산 서열에 효과적으로 연결된 프로모터를 함유할것이다. 프로모터는 절단된 GDNF 를 코딩하는 서열과 같은 특정 핵산 서열의 전사 및 번역을 조절하는, 구조 유전자 (대개 약 100 - 1000 bp 이내) 의 출발 코돈 상류 (5') 에 위치하는 비번역 서열이다. 프로모터는 종래적으로, 유도 프로모터와 구성 프로모터 두 종류 중 하나로 분류된다.유도 프로모터는, 영양의 존재나 부재 또는 온도 변화와 같은, 일부 배양 조건 변화에 반응하는 그것의 조절하에서 DNA 로 부터 증가된 수준의 전사를 개시한다. 다양한 잠재적 숙주세포에 의해 인식되는 다수의 프로모터들은 공지되어 있다. 이들 프로모터는, 제한 효소로 절단하여 원 DNA 로 부터 프로모터를 제거하고 원하는 프로모터 서열을 벡터내에 삽입함으로써, 절단된 GDNF 를 코딩하는 DNA 에 효과적으로 연결시킨다. 절단된 GDNF DNA 의 증폭 및/또는 발현을 지시하기 위해 천연 GDNF 프로모터 서열을 사용할 수도 있다. 그러나, 이종 프로모터가 천연 프로모터에 비해 발현 단백질을 더 많이 전사하여 더 고수득량을 산출한다면, 그리고 이종 프로모터가 사용하고자 선택한 숙주세포계와 양립할 수 있다면, 이 이종 프로모터가 바람직하다.
원핵 숙주와 함께 사용하기에 적합한 프로모터는 베타 - 락타마제 및 락토스 프로모터계 ; 알칼린 포스파타제, 트립토판 (trp) 프로모터계 ; 및 tac 프로모터와 같은 하이브리드 프로모터를 포함한다. 다른 공지된 박테리아 프로모터 또한 적합하다. 그것의 누클레오티드 서열은 공개되어 있으므로, 본 분야의 기술자들은 임의의 필수 제한부위를 공급하기 위해 요구되는 링커나 어댑터를 사용하여, 상기 서열을 원하는 DNA 서열(들)과 결합시킬 수 있다.
효모 숙주와 함께 사용하기 위한 적합한 프로모터 서열 또한 본 기술분야에잘 알려져 있다. 효모 인헨서는 효모 프로모터와 함께 이롭게 사용된다. 포유동물 숙주세포와 함께 사용하기에 적합한 프로모터는 공지되어 있으며 폴리오마 바이러스, 계두 (fowlpox) 바이러스, 아데노바이러스 (이를테면, 아데노바이러스 2), 소유두종 바이러스, 조류 육종 바이러스, 사이토메갈로 바이러스, 레트로바이러스, B 형 간염 바이러스 및 가장 바람직하게 시미안 바이러스 40 (SV40) 과 같은 바이러스 게놈으로 부터 수득한 프로모터를 포함한다. 다른 적합한 포유동물 프로모터는 이종 포유동물 프로모터, 예를들어, 열-쇽 프로모터 및 액틴 프로모터를 포함한다. CHO 세포내에서 GDNF 단백질을 생산하는데 있어 현재 사용되는 프로모터는 SRα 이다. Takebe 등의 Mol. Cell. Biol. 8 (1) : 466 - 472 (1988) 문헌을 참조하시오. 적합한 발현 벡터는 pDSRα2 이며, 하기에 더 설명되어 있다.
인헨서 요소
더 고등 진핵생물에 의해 본 발명의 절단된 GNDF 단백질을 코딩하는 DNA 서열의 전사를 증가시키기 위해 인헨서 서열을 벡터내에 삽입할 수 있다. 인헨서는 DNA 의 시스 - 작용 요소로서, 보통 약 10 - 300 bp 길이이며, 전사를 증가시키기 위해 프로모터에 작용한다. 인헨서는 비교적 배향(orientation) 및 위치 (position) 가 독립적이다. 그것들은 전사 단위의 5 ' 및 3' 에서 발견되어 왔다. 포유동물 유전자로 부터 이용할 수 있는 몇몇 인헨서 서열은 공지되어 있다 (예를들어, 글로빈, 엘라스타제, 알부민, 알파 - 페토 - 단백질 및 인슐린). 그러나, 전형적으로는 바이러스로 부터의 인헨서가 사용될 것이다. SV40 인헨서, 사이토메갈로바이러스 초기 프로모터 인헨서, 폴리오마 인헨서 및 아데노바이러스 인헨서가진핵 프로모터 활성화를 위한 전형적인 인헨서 요소이다. 절단된 GDNF DNA 의 5' 또는 3' 위치에서 인헨서가 벡터내에 적합될 수 있을지라도, 그것은 전형적으로 프로모터의 5' 부위에 위치된다.
전사 종결
진핵 숙주세포 (효모, 곰팡이, 곤충, 식물, 동물, 인체, 또는 다른 다세포 유기체로 부터의 핵소유 세포) 에 사용되는 발현 벡터 또한 전사의 종결에 필수적이고 mRNA 를 안정화시키는데 필수적인 서열을 함유할 것이다. 그와 같은 서열은 보통 진핵 DNAs 나 cDNAs 의 5' 및 때때로 3' 비번역 부위로 부터 이용할 수 있다. 이 부위는 절단된 GDNF 을 코딩하는 mRNA 중 비번역 부위가 폴리아데닐화된 단편으로서 전사되는 누클레오티드 절편을 함유한다.
원하는 절단된 GDNF 코딩 서열과 함께 상기한 성분 중 하나 또는 그 이상을 함유하는 적합한 벡터의 구성은 표준 결합 기술에 의해 수행한다. 분리된 플라스미드 또는 DNA 단편을 절단하고, 맞추어, 원하는 순서로 재결합하여 필요한 플라스미드를 생성한다. 정확한 서열이 구성되어 졌는지 확인하기 위해, 결합 혼합물을 E. coli 를 형질전환시키는데 사용할 수도 있으며, 상기한 암피실린 또는 테트라시클린 내성 같은 공지 기술에 의해 성공적인 형질전환체를 선택할 수도 있다. 형질전환체로 부터 플라스미드를 제조한 다음, 제한 엔도누클레아제로 절단하여 분석하고/분석하거나 원하는 구성물이 존재하는지 확인하기 위해 서열결정한다.
포유동물 세포내에서 절단된 GDNF 를 코딩하는 DNA 의 일시적 발현을 제공하는 벡터를 사용할 수도 있다. 일반적으로 일시적 발현은 숙주세포가 발현벡터의 많은 복제물을 축적하고 차례로, 발현벡터에 의해 코딩되는 원하는 단백질을 고수준으로 합성하도록, 숙주세포에서 효과적으로 복제될 수 있는 발현벡터의 사용과 관계가 있다. 적합한 발현벡터와 숙주세포를 포함하는 일시적 발현계는 클로닝된 DNAs 에 의해 암호되는 단백질을 편리하게 양성 확인하게 할 뿐만 아니라 원하는 생물학적 또는 생리학적 특성에 대해 상기 단백질을 신속하게 선별하게 한다. 따라서, 단백질 변종을 확인하는데 있어 일시적 발현계가 특히 유용하다.
숙주세포의 선택 및 형질전환
재조합 절단된 GDNF 단백질을 발현시키는데 사용하는 핵산 서열로 형질전환시킨 숙주세포 (예를들어, 박테리아, 포유동물, 곤충, 효모 또는 식물 세포) 또한 본 발명에 의해 제공된다. 형질전환된 숙주세포는 핵산 서열의 발현을 허용하는 적당한 조건하에서 배양한다. 적합한 숙주세포의 선택, 및 형질전환, 배양, 증폭, 선별 및 산물 생산과 정제를 위한 방법은 본 기술분야에 잘 알려져 있다. 예를들어, Gething and Sambrook 의 Nature 293 : 620 - 625 (1981) 문헌, 또는 택일적으로, kaufman 등의 Mol. Cell. Biol. 5 (7) : 1750 - 1759 (1985) 문헌이나 Howley 등의 미국 특허 번호 제 4,419,446 호를 참조하시오. 성숙한 GDNF 의 발현과 관계가 있는 Lin 등의 출원 명세서 (미국 특허 출원 번호 제 07/855,413 호 ; 출원 번호 제 PCT/US92/07888 호 ; 제 WO 93/06116 호) 에 따라 절단된 GDNF 를 E.coli 에서 발현시킬 수도 있다. 다른 전형적인 물질 및 방법은 하기에 더 상세히 기술되어 있다. 형질전환된 숙주세포를 적합한 배지에 배양한 다음, 발현된 인자를 본 분야의 숙련된 기술자들에게 공지되어 있는 적당한 수단에 의해 배지로 부터 (또는, 세포내적으로 발현된다면, 세포로부터) 임의로 회수하고, 분리하여 정제한다.
본원의 벡터를 클로닝시키거나 발현시키는데 적합한 숙주세포는 상기한 바와 같은 원핵, 효모 또는 더 고등 진핵 세포이다. 원핵 숙주세포에는 다음이 포함되나, 이에 국한되지 않는다 : 그람-음성이나 그람-양성 유기체 같은 진정세균 (eubacteria), 예를들어 E.coli, 비. 섭틸리스 (B.subtilis) 같은 바실리 (Bacilli), 피. 아에루기노사 (P. aeruginosa) 같은 슈도모나스 (Pseudomonas)종, 살모넬라 티피무리움 (Salmonella typhimurium) 또는 세라티아 마르세스칸스 (Serratia marcescans). 택일적으로는 시험관내 클로닝 방법, 예를들어 PCR 이나 다른 핵산 폴리머라제 반응법이 적합하다.
원핵 숙주세포 이외에, 선상 곰팡이나 효모 같은 진핵 미생물이 절단된 GDNF 단백질의 발현에 적합한 숙주일 수도 있다. 사카로마이세스 세레비시애 (Saccharomyces cerevisiae) 또는 보통 빵 효모가 더 하등 진핵 숙주 미생물 중에서 가장 일반적으로 사용되지만, 다수의 다른 속, 종 및 계통도 공지되어 있으며 일반적으로 유용하다.
글리코실화된 절단된 GDNF 단백질을 발현시키는데 적합한 숙주세포는 다세포 유기체로부터 유래된다. 그와같은 숙주세포는 복합 프로세싱과 글리콜실화 활성의 능력이 있다. 원칙적으로는 어떠한 고등 진핵세포 배양 - 이 배양이 척추동물 세포와 관련이 있든지, 아니면 식물 및 곤충 세포를 포함하는 무척추동물 세포와 관련이 있든지 간에 - 도 사용할 수가 있다. 공지된 과정인, 배양(조직배양) 내 척추동물 세포의 신장에 따라 척추동물 세포를 사용한다. 유용한 포유동물 숙주세포주의예로는 다음이 포함되지만, 이에 국한되는 것은 아니다 : SV40 에 의해 형질전환된 원숭이 신장 CV1 주 (COS - 7), 사람 배 신장주 (293 또는 현탁 배양내 성장을 위해 서브클로닝 시킨 293 세포), 어린 햄스터 신장세포 및 중국 햄스터 난소세포. 다른 적합한 포유동물 세포주에는 HeLa, 마우스 L - 929 세포, 스위스에서 유래된 3T3 주, Balb - c 또는 NIH 마우스, BHK 또는 HaK 햄스터 세포주가 포함되지만, 이에 국한되는 것은 아니다.
유사하게 박테리아 세포가 본 발명에 적합한 숙주세포로서 유용하다. 예를들어, 다양한 E.coli 균주 (예를들어, HB101, DH5α, DH10 및 MC1061) 가 생물공학 분야에서 숙주세포로서 공지되어 있다. 스트렙토마이세스 에스피피.(Streptomyces spp.) 등의 여러 가지 균주 또한 사용할 수 있다. 현재 절단된 GDNF 단백질을 생산하는 바람직한 숙주세포는 박테리아 세포 (예를들어, E.coli) 및 포유동물 세포 (이를테면, 중국 햄스터 난소 세포, COS 세포등) 이다.
상기한 발현 또는 클로닝 벡터로 숙주세포를 형질감염시키고 바람직하게 형질전환시켜서 종래 영양 배지에 배양한다. 프로모터를 유도시키거나, 형질전환체를 선택하거나, 원하는 서열을 코딩하는 유전자를 증폭시키도록 적당하게 배지를 변형시킬 수도 있다. 본 기술분야의 숙련된 기술자들에게 공지되어 있으며, 관련된 숙주세포에 따라 적합하게 선택한 표준 기술을 이용하여 형질감염 및 형질전환을 수행한다. 예를들어, 세포벽이 없는 포유동물 세포에 대해서는 인산 칼슘 침전법을 사용할 수 있다. 일렉트로포레이션, 미세주사 및 다른 공지 기술을 이용할 수도 있다.
숙주세포 배양
본 발명의 절단된 GDNF 단백질을 생산하는데 사용되는 형질전환 세포는 적합한 배지에서 배양시킨다. 필요에 따라 호르몬 및/또는 다른 성장인자 (이를테면 인슐린, 트란스페린 또는 상피 성장인자), 염 (이를테면 염화나트륨, 칼슘, 마그네슘 및 인산염), 완충용액 (이를테면 HEPES), 누클레오시드 (이를테면 아데노신 및 티미딘), 항생제 (이를테면 젠타미신), 미량원소 (보통 최종 농도에서 마이크로몰 범위로 존재하는 무기 화합물이라 규정함) 및 글루코스나 다른 에너지원을 배지에 보충할 수도 있다. 본 분야의 숙련된 기술자들이 인식하는 바와 같이 적당한 농도로 다른 보충물이 포함될 수도 있다. 선택된 숙주세포와 함께 사용하기 위한, 온도, pH 등과 같은 적합한 배양 조건 역시 본 기술 분야의 숙련된 기술자들에게 공지되어 있다.
절단된 GDNF 단백질은 상동 재조합에 의해 생산될 수 있거나, 이미 GDNF 를 코딩하는 DNA 를 함유하고 있는 세포내로 도입시킨 대조 요소를 이용하는 재조합 생성법으로 생산될 수 있다는 것 또한 가능하다. 상동 재조합은 본래, 전사적으로 활성인 유전자의 돌연변이를 유도하거나 이를 보정하는 표적 유전자를 발달시키는 기술이다 [Kucherlapati, Prog. In Nucl. Acid Res. and Mol. Biol. 36 : 301 (1989) 문헌 참조]. 포유동물 게놈의 특이 부위내에 특이 돌연변이를 도입시키는 방법 (Thomas 등의 Cell. 44 : 419 - 428, 1986 ; Thomas 및 Capecchi, Cell. 51 : 503 - 512, 1987 ; Doetschman 등의 Proc. Natl. Acad. Sci 85 : 8583 - 8587, 1988) 또는 결여 유전자내에서 특이 돌연변이를 보정하는 방법 (Doetschman 등의Nature. 330 : 576 - 578, 1987 문헌 참조) 으로서 기본 기술이 개발되었다. 전형적인 상동 재조합 기술은 미국 특허 제 5,272, 071 호 (제 EP 91 90 3051 호, EP 공개 번호 제 505500 호 ; 제 PCT/US90/07642호, 국제 공개 번호 제 WO91/09955 호) 에 기술되어 있으며 이 명세서는 본원에서 참고문헌으로 인용된다.
상동 재조합에 의해, 게놈내에 삽입시킬 DNA 서열을 표적 DNA 와 부착시킴으로써 흥미있는 유전자의 특이 부위로 상기 서열을 향하게 할 수 있다. 표적 DNA 는 게놈 DNA 부위와 상보적이다(상동성이다). 게놈의 특이 부위와 상보적인 표적 DNA 의 작은 단편은 DNA 복제 과정중에 모가닥 가까이에 위치한다. 이것은, 공유된 상동 부위를 통해 외인성 DNA 의 다른 단편과 혼성화시켜 재조합시키기 위해 세포내로 삽입시킨 DNA 의 일반적인 특성이다. 이 상보가닥이 돌연변이나 DNA 의 다른 서열을 함유하는 올리고누클레오티드에 부착된다면, 그것도 역시 재조합의 결과로서 새로이 합성된 가닥내로 포함된다. 교정 기능의 결과로서, 새로운 DNA 서열이 주형의 역할을 하는 것이 가능하다. 전이된 DNA 는 게놈내에 포함된다.
GDNF 의 핵산 서열, 프리-프로 서열이나 발현 조절 서열 같은 특정 유전자의 서열이 공지되어 있다면, 흥미있는 부위와 결합하는 특이 인식 부위에서의 천연 DNA 를 적합하게 제한함으로써, 유전자의 선택 부위에 상보적인 DNA 단편을 합성할 수 있거나 수득할 수 있다. 이 단편은 세포내에 삽입시킬 때 표적 서열로서의 역할을 하며 게놈 내에서 그것의 상동 부위와 혼성화할 것이다. 만일 DNA 복제 중에 이러한 혼성화가 발생한다면, 이 DNA 단편과, 그것에 부착되는 임의의 부가 서열이 오카자키 단편으로서 작용할 것이며 새로이 합성된 DNA 딸 가닥내에 박음질 될 것이다.
본 발명에 있어, 이들 표적 DNA 단편에 부착되는 것은 GDNF 단백질의 발현과 상호작용할 수도 있는 DNA 부위이다. 예를들어, 프로모터/인헨서 요소, 서프레서 또는 외인성 전사 조절 요소는, 원하는 절단된 GDNF 를 코딩하는 DNA 의 전사에 영향을 미치기에 충분히 근접하며 충분한 배향으로 의도된 숙주세포의 게놈에 삽입시킨다. 대조 요소는 절단된 GDNF 를 코딩하지 않지만, 대신 숙주세포 게놈에 존재하는 DNA 의 부분을 대조시킨다. 따라서, 절단된 GDNF 유전자 자체를 코딩하는 DNA 를 형질감염시킴으로써가 아니라, 절단된 GDNF 단백질 전사를 위한 인식가능한 시그널과 함께 내인성 유전자 서열을 제공하는 DNA 조절 절편과 결합되는 표적 DNA (흥미있는 내인성 유전자와 상동인 부분 함유) 를 사용함으로써, 절단된 GDNF 단백질의 발현을 획득할 수 있다.
본 발명에 따라, 정상적으로 전사하는 사일런트 GDNF 유전자를 함유하는 세포를 변형시켜 GDNF 를 발현하는 세포를 생산하는데도 상동 재조합 방법을 이용할 수 있다.
절단된 GDNF 제약학적 조성물
절단된 GDNF 단백질 산물 제약학적 조성물은 전형적으로, 하나 또는 그 이상의 제약학적으로 및 생리학적으로 용인가능한 제제형 물질과 혼합된 치료학적 유효량의 절단된 GDNF 단백질 산물을 포함한다. 적합한 제제형 물질로는 다음이 포함되나, 이에 국한되는 것은 아니다 : 항산화제, 방부제, 착색제, 조미료 및 희석제, 유화제, 현탁제, 용매, 충전제, 부피 조정제, 완충용액, 운반용 매개물 (vehicle),희석제, 부형제 및/또는 제약학적 보조제. 예를들어, 적합한 부형제는 주사용 물, 생리학적 식염수 또는 인공 뇌척수액 (CSF) 일 수 있으며, 가능하다면 비경구 투여용 조성물에 일반적인 다른 물질을 보충할 수도 있다. 중성 완충 식염수나 혈청 알부민과 혼합된 식염수가 더 전형적인 매개물이다.
매개물의 일차 용매는 사실상, 수성이거나 아니면 비-수성일 수도 있다. 게다가, 매개물은 제제형의 pH, 삼투 몰농도, 점도, 정화도, 색체, 무균성, 안정도, 용해 속도, 또는 냄새를 변화시키거나 유지하는 제약학적으로 용인가능한 다른 부형제를 함유할 수도 있다. 유사하게, 매개물은 절단된 GDNF 단백질 산물의 안정도, 용해 속도, 또는 방출 속도를 변화시키거나 유지하는, 또는 혈액뇌 장벽을 가로질러 절단된 GDNF 단백질이 흡수되거나 통과되는 것을 촉진시키는 제약학적으로 용인가능한 다른 부형제를 함유할 수도 있다. 그와 같은 부형제는 보통 물질이며 단위 투여 형태나 아니면 다투여 형태로 비경구 투여하거나, 이식된 펌프로 부터의 연속적이거나 주기적인 주입에 의해 CSF 내로 직접 주입하기 위한 투여량을 제형화하는데 주로 사용된다.
치료학적 조성물이 일단 제형화되면, 그것을 용액, 현탁액, 겔, 에멀션, 고체 또는 탈수나 동결 분말로서 무균 용기에 저장할 수 있다. 그와 같은 제제형은 사용할 준비가 되어 있는 형태나 아니면 투여하기 전에 재구성할 필요가 있는 형태, 예를들면 동결건조 형태로 저장할 수도 있다.
본 분야의 기술자들은 투여경로 및 원하는 투여량에 따라서 최적의 제약학적 제제형을 결정할 것이다. 예를들어, 본원에서 참고문헌으로 인용한 Remington'sPharmaceutical Science, 18 th Ed. (1990, Mack Publishing Co., Easton, PA 18042) pages 1435 - 1712 문헌을 참조하시오. 또한 조성물은 리포좀내에 함유시킨 폴리락트산, 폴리글리콜산등과 같은 중합체 화합물의 입자상 제제형을 포함한다. 하이라우론산 (hylauronic acid) 역시 사용될 수 있는데, 이것은 지속되는 순환 기간을 증진시키는 효과를 가질 수 있다. 그와 같은 조성물은 본 단백질 및 유도체의 물리적 상태, 안정도, 생체내 방출 속도 및 생체내 청소율에 영향을 미칠 수 있다.
비경구적 서방 제제형, 흡입용 합제, 경구적 활성 제제형, 또는 좌약 같은 다른 유효 투여형태를 계획할 수도 있다. 현재 절단된 GDNF 단백질 산물의 제약학적 조성물은 비경구 투여용, 예를들어 대뇌실내 주사용으로 제형화되어 있다. 그와 같은 비경구적으로 투여되는 치료학적 조성물은 전형적으로, 제약학적으로 용인가능한 매개물내에 절단된 GDNF 단백질 산물을 포함시킨 비경구적으로 용인가능한 무피로겐 수용액 형태이다. 하나의 바람직한 매개물은 생리학적 식염수이다.
또한 절단된 GDNF 단백질 산물을 함유하는 어떤 제제형은 경구적으로 투여될 수도 있다. 이러한 양식으로 투여되는 절단된 GDNF 단백질 산물은 캡슐로 쌀 수도 있으며 고체 투여형태의 조제시에 주로 사용되는 담체를 수반하거나 수반하지 않고 제형화할 수도 있다. 캡슐은, 생체내이용율이 극대화되고 예비전신성 붕괴가 최소화되는 위장관내 지점에서 제제형의 활성부분이 방출되도록 고안할 수 있다. 절단된 GDNF 단백질 산물의 흡수를 촉진시키기 위해 부형제를 더 포함시킬 수도 있다. 희석제, 조미료, 저융점 왁스, 식물성 기름, 윤활제, 현탁제, 정제 붕괴제 및 결합제를 사용할 수도 있다
절단된 GDNF 단백질 산물의 투여
피하, 근육내, 정맥내, 경폐적, 경피적, 초내, 대뇌내 경로를 통해 절단된 GDNF 단백질 산물을 경구적으로 투여할 수 있다. 혈액뇌 장벽을 가로지르지 않는 단백질 성장 인자는, 대뇌내적으로 직접 제공하거나, 상기 인자를 장벽을 가로질러 수송할 다른 요소와 공동으로 제공할 수 있다. 절단된 GDNF 단백질 산물을 대뇌실내로 투여하거나 뇌 또는 척수 지주막하강 (subarachnoid space) 내로 투여하는 것이 바람직하다. 또한 절단된 GDNF 단백질 산물을 뇌 실질 (parenchyma) 내로 직접 대뇌실내 투여 할 수도 있다. 생분해가능한 중합체 기질내에 삽입되어 있는 신경영양성 인자를 함유하는 뇌의 서방형 이식물 또한 절단된 GDNF 단백질 산물을 운반할 수 있다. 절단된 GDNF 단백질 산물이 혈액-뇌 장벽을 통과하도록 화학적으로 변형시키거나 패키지한 형태로 이 단백질 산물을 대뇌외 투여할 수도 있으며, 또는 장벽을 가로지르는 절단된 GDNF 단백질 산물의 침투를 촉진시킬 수 있는 하나 또는 그 이상의 인자와 함께 투여할 수도 있다. 예를들어, NGF 와 모노클로날 항 - 트란스페린 수용체 항체의 복합체가 트란스페린 수용체와 결합함으로써 뇌로 수송된다고 밝혀졌다. 절단된 GDNF 단백질 산물의 원하는 투여량을 획득하기 위해, 매일 또는 덜 빈번히 반복되는 주사를 투여할 수 있으며, 또는 절단된 GDNF 단백질 산물을 일정 흐름 또는 프로그램화된 흐름 이식 펌프로 부터 연속적으로나 간헐적으로 주입할 수도 있다. 투여 빈도는 공식화된 것으로, 절단된 GDNF 단백질 산물의 약력학 변수 및 투여경로에 좌우될 것이다.
이러한 투여 방식에도 불구하고, 특정 투여량은 전형적으로 체중 또는 체표면적에 따라 계산한다. 뇌와 관련된 질병에 있어, 특정 투여량은 전형적으로 환자의 대략적인 뇌 중량에 따라 계산하는데, 또한 체중이나 체표면적을 기초로 하여 추정할 수도 있다. 상기 언급한 각각의 제제형을 수반하는 치료를 위한 적합한 투여량을 결정하는데 필요한 계산법은 본 분야에서 통상의 지식을 가진 자들에 의해 일상적으로, 특히 본원에 기술한 투여량 정보 및 검정에 비추어 더 개선될 수 있다. 적합한 투여량 - 반응 데어터와 관련하여 이용되는, 투여량을 결정하는 확정된 검정법을 사용함으로써 적합한 투여량을 확인할 수도 있다. 특이 증상을 치료하는 방법과 관계가 있는 최종 투여량 양생법은 약물의 작용을 변경시키는 여러 가지 인자, 예를들어, 연령, 증상, 체중, 성별 및 환자의 식이, 감염의 심각성 정도, 투여 시간 및 다른 임상 인자들을 고려하여 주치의가 결정할 것이다.
신경 질병 치료에 있어 본 발명의 절단된 GDNF 단백질 산물을 단독으로, 또는 다른 성장인자와 함께 사용할 수도 있다. 예를들어, 절단된 GDNF 단백질 산물을 신경 성장 인자와 함께 어떤 형태의 신경 질병을 치료하는데 사용할 수도 있다. 또한, 화학 조성물을 포함하는 다른 인자 또는 다른 분자를 절단된 GDNF 단백질 산물과 함께 사용할 수도 있다. 파킨슨병 치료에 있어, 절단된 GDNF 단백질 산물을 단독으로 또는 레보도파 (Levodopa) 투여와 함께 사용할 수도 있는데, 여기서 절단된 GDNF 가 내인성 도파민의 생성 및 증가된 농도의 도파민의 신경세포 섭취를 증진시킬 것이다.
상기한 바와 같이, 부가 신경영양성 인자나 신경원 양육 인자가 어떤 신경원 세포 집단이나 어떤 유형의 상해 또는 질병을 치료하는데 유용하거나 필수적일 것이다. 절단된 GDNF 와 함께 사용할 수 있는 다른 인자들에는 다음이 포함되지만, 이에 국한되는 것은 아니다 : 인슐린, 인슐린 - 유사 성장인자, 표피 성장인자, 혈관작용 성장인자, 폴리펩티드를 활성화하는 하수체 아데닐레이트 사이클라제, 인터페론 및 소마토스타틴 같은 마이토젠 ; 뇌유래 신경영양성 인자, 뉴로트로핀 - 3, 뉴로트로핀 - 4/5, 뉴로트로핀 - 6, 인슐린 - 유사 성장인자, 모양체 신경영양성 인자, 산 및 염기성 섬유아세포 성장인자, 섬유아세포 성장인자 - 5, 형질전환 성장인자 - β, 코카인 - 암페타민 조절된 전사 (CART) 및 성숙한 GDNF 같은 신경영양성 인자 ; 및 표피 성장인자, 백혈병 억제인자, 인터루킨, 인터페론 및 군체 자극 인자 같은 다른 성장인자 뿐만아니라 이들 인자와 기능적 동등물인 분자 및 물질.
절단된 GDNF 단백질 산물의 연속적인 투여나 지속적인 운반은 주어진 치료를 위해 유리할 수 있다. 주입 펌프와 같은 기계적 수단에 의해서 연속적인 투여를 수행할 수 있을지라도, 연속적이거나 거의 연속적인 다른 투여 양식을 실행할 수도 있다. 예를들어, 화학 유도체화로 인해, 혈류내에서 연속적으로 존재하는 효과를 갖는, 결정된 투여량 섭생에 기초하여 예상할 수 있는 양으로 연속적인 방출 형태의 단백질이 초래될 수 있다.
절단된 GDNF 단백질 세포 요법, 예를들어, 절단된 GDNF 단백질을 생산하는 세포의 대뇌내 이식 또한 예상한다. 본 발명의 이 실시구체 형태는 생물학적 활성 형태의 절단된 GDNF 단백질을 합성하여 분비할 수 있는 환자의 세포내로 이식시키는 것을 포함할 수 있다. 그와 같은 절단된 GDNF 단백질 생성-세포는 보통 신경영양성 인자를 생산하지 않지만 절단된 GDNF 를 생산하도록 변형시킨 세포이다, 즉 절단된 GDNF 단백질의 발현 및 분비에 적합한 폴리누클레오티드로 형질전환됨으로써 증가된 GDNF 를 생산하는 능력을 갖는 세포일 수 있다. 외래종 GDNF 의 투여로 인한 환자의 잠재성 면역학적 반응을 최소화하기 위해서는 상기 세포가 인체 기원이며 절단된 인체 GDNF 단백질을 생산하는 것이 바람직하다.
뇌 조직내로 세포가 침윤되는 것을 방지하기 위해 이식세포를 캡슐로 쌀 수 있다. 절단된 GDNF 단백질 산물의 방출은 허용하지만, 환자의 면역계에 의하거나 주변 조직으로 부터의 다른 해로운 인자들에 의하여 세포가 분포되는 것을 방지하는 생체적합성의, 반-투과성 중합체 포위물이나 막을 지닌 환자에게 인체 또는 비인체 동물 세포를 이식시킬 수 있다. 택일적으로, 절단된 GDNF 를 생산하도록 생체외 형질전환시킨, 환자 자체 세포를 상기와 같은 캡슐로 싸지 않고서 환자에게 직접 이식시킬 수 있었다.
생존 세포를 막 캡슐로 싸는 것에 대한 방법론은 본 분야의 통상의 지식을 가진자들이 잘 알고 있으며, 캡슐로 싼 세포 제제 및 그것의 환자 이식을 수행할 수 있다. 예를들어, 미국 특허 번호 제 4,892,538 호 ; 제 5,011,472 호 및 제 5,106,627 호를 참조하되, 이것의 명세서는 본원에서 참고문헌으로 인용된다. 캡슐로 싸인 생존 세포에 대한 계(system) 역시 Aebischer 등의 PCT 출원 제 WO 91/10425 호에 기술되어 있으며, 특히 이것을 본원에서 인용한다. 또한 명세서를 본원에서 참고로 인용한 다음 문헌을 참조하시오 : Aebischer 등의 PCT 출원 제 WO 91/10470 호 ; Winn 등의 Exper. Neurol., 113 : 322 - 329, 1991 ; Aebscher 등의Exper. Neurol., 111 : 269 - 275, 1991 ; Tresco 등의 ASAIO, 38 : 17 - 23, 1992.
또한 생체내 절단된 GDNF 단백질 유전자 요법도 계획하는데, 여기서 절단된 GDNF 단백질을 코딩하는 핵산서열을 환자내로 직접 도입시킨다. 예를들어, 적합한 운반용 벡터, 이를테면 아데노 - 관련 바이러스 벡터를 수반하거나 수반하지 않는 핵산 구성물을 국소 주사함으로써, 표적 세포내로 절단된 GDNF 단백질을 코딩하는 핵산 서열을 도입시킨다. 택일적인 바이러스 벡터에는 다음이 포함되지만, 이에 국한되는 것은 아니다 : 레트로바이러스, 아데노바이러스, 허피스 단순 바이러스 및 파필로마 바이러스 벡터. 원하는 핵산 구성물, 또는 원하는 핵산서열, 리포좀 - 매개 이동, 직접 주사 {나(naked) DNA}, 수용체 - 매개 이동(리간드 - DNA 복합체) 또는 미량입자 충격(유전자 총)을 포함하는 다른 적당한 운반용 벡터를 국소 주사함으로써 생체내 물리적 이동을 획득할 수 있다.
본원에 기술한 절단된 GDNF 단백질 산물 제제형은 인체 적용 뿐만 아니라 수의학용으로 사용할 수 있으며 용어 "환자"를 제한된 방식으로 구성해서는 안된다는 것을 주목해야 한다. 수의학으로 적용할 경우에 투여량 범위는 상기한 바와 동일해야 한다.
본 발명의 절단된 GDNF 단백질을 더 특정화하는 수단으로서, 절단된 GDNF 단백질에, 이를테면 X - [Cys41- Cys133] - Y 아미노산 서열 내의 에피토프에 결합하는 항체를 개발할 수 있다. 본 분야의 통상의 지식을 가진 자들은, 본 발명의 아미노산 서열에 의해 코딩되는 여러 가지 단백질을 특이적으로 인식하고 결합하는, 모노클로날 및 폴리클로날 항체, 또는 재조합 항체를 수득하기 위한 잘 알려져 있고 공개된 방법을 이용할 수 있다. 그런 다음 그와 같은 항체를 절단된 GDNF 단백질을 정제하고 특정화하는데 사용할 수 있다. 택일적으로, 항체에 의해 대항되는 단백질의 치료학적 저해제로서 이 항체를 사용할 수도 있다.
다음 실시예를 고려하면 본 발명의 다른 양상 및 잇점이 이해될 것이다. 실시예 1 은 포유동물 세포계내 성숙한 GDNF 의 발현 및 절단된 GDNF 단백질의 제조를 기술한 것이다. 실시예 2 는 박테리아 세포계내 성숙한 GDNF 의 발현을 기술한 것이다. 실시예 3 은 박테리아 세포계내 여러 가지 절단된 GDNF 단백질의 발현을 기술한 것이다. 실시예 4 는 도파민작용성 신경원 신경영양성 활성도를 검정하여 성숙한 GDNF 단백질과 절단된 GDNF 단백질의 생물학적 활성도를 비교한 것이다.
실시예 1
CHO 세포내 성숙한 인체 GDNF 의 발현 및 CHO 세포 - 유래 절단된 GDNF 단백질의 정제물질
다음 물질들은 디히드로엽산 환원효소 - 결핍 CHO 세포 {CHOd-세포 ; 예를들어, Urlaub 및 Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci., USA 77(7) : 4216 - 4220(1980) 문헌에 기술되어 있음, ATCC 제 CRL - 9096 호로 입수가능} 내에서 인체 GDNF 를 발현시키는 데 사용한다.
CHOd-배지는 다음을 함유한다 : 둘베코의 변형된 이글 배지(DMEM) - 고글루코스(깁코/BRL) ; 5 % 태아 소 혈청(하이클론) ; MEM 비필수 아미노산(1 %)(깁코/BRL) ; 하이폭산틴/티미딘(1 %)(깁코/BRL) ; 및 글루타민/페니실린/스트렙토마이신(1 %)(어빈 사이언티픽).
선택 배지는 다음을 함유한다 : DMEM(고글루코스) ; 5 % 투석된 태아 소 혈청(하이클론) ; MEM 비필수 아미노산 ; 및 글루타민/페니실린/스트렙토마이신.
2X 헤페스(HEPES) - 완충 식염수(HBS)는 다음을 함유한다 : 280 mM NaCl ; 10 mM KCl ; 1.5 mM Na2HPO4; 12 mM 덱스트로스 ; 및 50 mM 헤페스.
트리스 - 완충 식염수 + 트윈(TBST)는 다음을 함유한다 : 137 mM NaCl ; 20 mM 트리스/HCl pH 7.5 ; 및 0.1 % 트윈 - 20.
방법
형질감염 및 선택
CHOd-세포(계대배양 20)를 CHOd-성장 배지 접시 당 8 × 105세포의 밀도로 60 mm 조직 배양 접시(팔콘)내에 접종하였다. 다음 날, 형질감염 약 3 시간 전에 세포 배지를 신선한 배지로 대체하였다.
공지 기술을 이용하여 적당한 GDNF cDNA 를 함유하는 플라스미드 구성물을 제조하였다. 예를들어, 실질적으로, 공동 소유이고 공동 계류중인 1990년 3월 29일자로 제출한 미국 특허 출원 번호 제 501,904 호 {또는 1990년 5월 18일자로 제출한 유럽 특허 출원 번호 제 90305433 호, 공개 번호 제 EP 398 753 호 및 제 WO90/14363 호(1990) 참조}에 기술되어 있는 방법에 따라 플라스미드 구성물 pDSRα2 를 제조하였으며, 상기 문헌은 본원에서 참고로 인용한 것이다. 이 벡터의 구조적 구성을 설명하는 전형적인 플라스미드 지도는 도 2 에 도시되어 있다. 성숙한 GDNF 단백질을 코딩하는 여러 가지 핵산서열, 이를테면 도 1, 3 및 4 에 도시되어 있는 서열을 사용할 수도 있다는 것을 본 기술 분야의 숙련자들은 인식할 것이다.
pcDNA 기저 발현벡터(미국 캘리포니아 산 디에고에 소재하는 인비트로겐에서 입수)를 제한효소 절단하여 인체 GDNF 코딩 서열 및 칸센서스 코작 서열, 즉 CCACC(ATG)를 함유하는 Hind Ⅲ - Xbal DNA 단편을 회수하였다. 이 DNA 단편을 Hind Ⅲ / Xbal 절단된 pDSRα2 내에 직접 클로닝하였다. 결과적으로 생성된 플라스미드를 pSW5 라 명명하였다. 형질감염 전에 pSW5 의 플라스미드 DNA 를 Puvl 부위에서 선형화시켰다.
pDSRα2(도 2)는 다음의 3 가지 주요 변형을 갖는 플라스미드 pCD(Okayama & Berg, Mol. Cell Biol. 3 : 280 - 289, 1983 참조, 미국 캘리포니아 산디에고에 소재하는 인비트로겐에서 입수)의 유도체이다 : (ⅰ) SV40 폴리아데닐화 시그널을 소 난포자극호르몬의 α - 소단위체, 즉 α - bFSH(Goodwin 등의 Nucleic Acids Res. 11 : 6873 - 6882, 1983)로 부터의 시그널로 대체하였다 ; (ⅱ) 형질전환체의 선택 및 증폭을 허용하도록 마우스 디히로엽산 환원효소 미니유전자(Gasser 등의 Proc. Natl. Acad. Sci. 79 : 6522 - 6526, 1982)를 발현 카세트의 하류에 삽입하였다 ; 및 (ⅲ) 인체 T - 세포 I 형 백혈병 바이러스(HTLV - I)의 긴 말단 반복체(LTR)의 "U5" 서열 부분과 "R - 요소" 를 함유하는 267 bp 단편을, 이미 기술한 바와같이(Takebe 등의 Mol. Cell Biol. 8 : 466 - 472, 1988 참조) 클로닝시켜 SV40 프로모터와 접합 시그널 사이에 삽입하였다.
최종 농도가 3.0 μg/접시인 GDNF - 플라스미드 DNA, 7.0 μg/접시의 마우스 신장 게놈 운반체 DNA(클론테크), 25 μl/접시의 2.5 M CaCl2및 무균 증류수를 함유하는 DNA 용액을 250 μl/접시의 최종 부피로 제조하였다. pDSRα2 벡터 DNA 를 함유하거나, 또는 운반체 DNA 만을 함유하는 DNA 용액을 각각 양성 및 음성 대조로서 비슷하게 제조하였다. 용액에서 기포가 사라지게 하는 동안 DNA 용액을 동일 부피의 2 × HEPES - 완충 식염수에 한 방울씩 가하였다. DNA/HBS 용액을 실온에서 30 분간 배양하였다.
CHOd-세포 배양물로 부터 배지를 제거하고, 500 μl 의 DNA 용액을 접시에 가하였다. 이 접시를 실온에서 30 분간 배양한 후 이 때에 CHOd-배지(5.0 ml)를 각 접시에 가하였다. 그런 다음 접시를 37 ℃ 에서 밤새 배양하였다.
다음 날에 배지를 신선한 CHOd-배지로 대체하였다. 다음 날, 세포가 전면상태로 되었을 때, 배양물을 트립신처리하여 8 × 100 mm 접시에 대한 1 × 60 mm 접시의 비율로 100 mm 접시(팔콘)에 재평판화하였다. 선택 배지에 세포를 재평판화하였다. 2 - 3 일 마다 신선한 배지를 배양물에 재공급하였다.
15 일 후에 유리 클로닝 실린더를 사용하여 형질감염된 세포의 콜로니를 분리하고, 트립신처리하여, 24 - 웰 접시(팔콘)내에 재평판화하였다. GDNF/pSW5 - 형질감염 세포로 부터 총 40 콜로니를 분리하였다. 접시에 남아 있는 세포를 트립신처리하고, 풀로 만들어(pooled) 두 개의 100 mm 접시내에 재평판화하였다(각 DNA 구성물에 대한 하나의 풀)
형질감염 세포 선별 :
24 - 웰 및 풀 배양물이 전면성장 되었을 때, 성장 배지를 제거하고 무혈청 배지(400 μl/웰 또는 4 ml/접시)로 대체하였다. 세포를 48 시간 동안 배양하여, 조정 배지를 수확하였다. 조정배지 시료를 웨스턴 블로팅하여 GDNF 단백질 발현에 대해 분석하였다. 분취량의 조정배지(20 μl 또는 40 μl)를 전기영동 시료 완충액(β - 머캅토에탄올 첨가 및 무첨가)으로 희석하였다. β - 머캅토에탄올을 함유하는 시료는 3 분간 끓였다(환원 조건). 환원 및 비환원 시료 둘 다 16 % 트리스 - 글리신겔(노벡스)에 러닝시켰다. 니트로셀룰로스 필터(Schleicher 및 Schuell BA - 83, 0.2 μl) 상에 겔을 전기블로팅시켰다. TBST 로 블롯을 헹군 다음 TBST 내에 5 % 건조우유(카르네이션)가 함유된 차단 용액내에 실온에서 30 분간 배양하였다. 그런 다음 실온에서 1 시간 동안 GDNF 항혈청(E. coli - 유래 GDNF 에 대항하는 토끼 폴리클로날 항혈청 ; 5 % 우유/TBST 1 : 1000)으로 블롯을 처리하였다. TBST 로 블롯을 헹군 후 1 % 우유/TBST 로 1 × 10 분 및 2 × 5 분 세척하였다. 그런 다음 항 - 토끼 Ig - 호스 래디시 과산화효소 - 복합 이차 항체(1 % 우유/TBST 1 : 15,000)로 20 분간 처리하였다. 블롯을 TBST 1 × 20 분 및 2 × 10 분 헹구어 세척한 다음 ECL 시약(아머샴)으로 1 분간 처리하고 하이퍼필름 - ECL(아머샴)에 노출시켰다.
다음 과정은 1 리터의 조정배지로 부터 CHO - 발현 GDNF 및 CHO - 유래 잘라진(clipped) GDNF 동이량체를 정제하는 방법을 기술하고 있다. 잔기 31 에서 사슬을 자르는, CHO 배지내의 상당한 프로테아제 작용 때문에 이 과정은 정제 동안 프로테아제 억제제의 사용을 포함할 수 있다.
1 단계. 비드(bead) 크로마토그래피 :
20 mM 2 - [N - 모르폴리노] 에탄 술포네이트(MES), pH 6.0 에 1/15 부피의 1 M MES, pH 6.0 을 가하여 무혈청 조정 배지를 제조하였다. 20 mM MES, pH 6.0 으로 평형화시킨, 25 ml 의 에스피 세파로스 빅 비드 수지(파마시아)를 가하여 1 시간 동안 4 ℃ 에서 교반하였다. 수지는 고정시키고 조정 배지를 가만히 따라 냄으로써 수지를 모았다. 따라낸 배지를 프릿화된 디스크 필터를 통하여 여과하여 비고정된 어떤 수지라도 회수시켰다. 여과에 의해 회수한 고정된 수지를 재현탁하여 2.5 cm 직경의 컬럼내에 붓고 3 컬럼 부피의 0.15 M NaCl, 20 mM MES, pH 6.0(A 완충액)으로 세척하였다. A 완충액에서 1.0 M NaCl, 20 mM MES, pH 6.0(B 완충액)까지 300 ml 기울기로, 280 nm 에서 측정한 흡광도와 함께 0.2 컬럼 부피/분의 유속에서 단백질을 용리하였다. 1.1 컬럼 부피를 함유하는 분획을 모았다. 웨스턴 블로팅 분석함으로써 분획내 GDNF 의 존재를 검출하였다. 더 정제하기 위해 GDNF 를 함유하는 분획을 풀로 만들었다. GDNF 는 0.3 M 내지 0.6 M NaCl 사이에서 용리되었다.
2 단계. HPLC C4 크로마토그래피 :
1 단계로부터의 풀을 0.45 미크론 필터를 통해 진공 여과시킨 0.1 %(v/v) 트리플루오로아세트산(TFA)으로 제조하여 수성 10 % 아세토니트릴, 0.1 % TFA(A 완충액)로 조정시킨 비닥 C4 칼럼(0.46 × 25 cm)에 가하였다. A 완충액에서 280 nm 에서 측정한 흡광도를 갖는 수성 90 % 아세토니트릴, TFA(B 완충액)까지 50 분 동안 2 %/분의 선형기울기로 단백질을 용리시켰다. 1 밀리리터의 분획들을 수집하여 웨스턴 블로팅 분석함으로써 GDNF 의 존재를 검출하였다. GDNF 는 45 % 내지 55 % 아세토니트릴 사이에서 용리되었다. 분획들을 진공건조시켰다.
3 단계. 고성능 에스 크로마토그래피 :
2 단계로 부터의 GDNF 를 함유하는 분획들을 0.15 M NaCl, 10 mM 트리스, pH 8.0 1 밀리리터에 재용해하여 0.75 × 7.5 cm TSK - 겔 5WP 고성능 에스 칼럼(토소해스)에 가하였다. 1 ml/분의 유속에서 50 분간 0.15 M NaCl, 10 mM 트리스, pH 8.0(A 완충액)에서 1.0 M NaCl, 10 mM 트리스, pH 8.0(B 완충액)까지 0.4 %/분의 선형기울기를 실행하였다. 280 nm 에서 측정한 흡광도를 갖는 1 분 분획들을 수집하였다. 35 % B 완충액일 때 기울기를 10 분간 6.5 %/분으로 바꾸었다. 분획들을 웨스턴 블롯 분석한 결과 4 개의 주요 GDNF 성분들이 나타났다. 성분 중 3 개는 0.4 %/분 기울기 중에 용리되었고 네 번째는 6.5 %/분 기울기 중에 용리되었다. 유사한 성분들로 적당한 풀을 제조하여 서열결정하였다. 서열결정 분석 결과 [Arg32- lle134] 절단된 GDNF 단백질로서 약 29 - 36 kD 풀이 확인되었다. 약 38 - 40 kD 에서의 성분은 [Arg32- lle134] 절단된 GDNF/성숙한 GDNF 이종이량체(heterodimer)로서 확인되었다. 최종적으로, 기울기의 마지막 부분중에 분리한 약 41 - 44 kD 성분은 서열결정에 의해 성숙한 GDNF 동종이량체(homodimer)로서 확인되었다.
실시예 2
E.coli 내 생산된 성숙한 인체 GDNF
성숙한 인체 GDNF 의 박테리아 발현은 그 명세서를 본원의 참고문헌으로 인용한, 1994년 5월 23일자로 제출된 Lin 등의 미국 특허 출원 번호 제 08/182,183 호 및 그것의 모출원 ; 1992년 9월 17일자로 제출된 제 PCT/US92/07888 호(제 WO 93/06116 호) ; 및 유럽 특허 출원 번호 제 92921022.7 호(공고번호 제 EP 610 254 호)에 기술되어 있는 방법에 따라 수행할 수 있다. 본 발명의 명세서를 기초로 하여, 본 기술분야에서 통상의 지식을 가진자들은 E.coli 및 다른 박테리아내 적합한 발현을 위해 다양한 물질 및 방법들이 용이하게 이용될 수 있거나 적응될 수 있다는 것을 인식할 것이다. 예를들어, 도 1, 3 및 4 에 도시한 바와 같은 선택적 폴리누클레오티드를 발현과정에 이용할 수도 있다.
발현된 성숙한 GDNF 의 재생(refolding) 및 정제
형질전환된 세포를 다음과 같이 5 ℃(다른 주의사항이 없을 경우)에서 처리하였다 : 5 mM EDTA 를 함유하는 25 mM 트리스, pH 8.5 를 사용하여 200 밀리리터의 최종 부피내로 세포 페이스트(30 gm)를 재현탁하여 15 %(w/v)의 최종 세포 슬러리를 산출하였다. 바이오스펙(Biospec) 손바닥 크기의 저전단 균질기를 사용하여 세포를 완전히 분산시켰다. 마이크로유량기(microfluidizer)에 14,500 psi 에서 슬러리를 2 회 통과시켜 세포를 붕괴하고 세포 봉입체를 방출시켰다. 그런 다음 결과적으로 생성된 균질물을 16,000 xg 에서 30 분간 원심분리하였다. 슬러리를 형성하기 위해, 이 전에 바이오스펙 균질기를 사용하여 240 밀리리터의 최종부피까지 원심분리에 의해 생성된 세포 봉입체 펠릿을 냉각수에 재현탁함으로써 세척하였다. 이 슬러리 시료를 GDNF 발현수준의 HPLC 분석에 두었다. 남아 있는 슬러리는 16,000 xg 에서 30 분간 원심분리하였다. 상청액은 따라내고 소량의 찬물을 원심분리용 병에 가하여 세포 봉입체 펠릿 상단에 느슨하게 형성되는 막층을 제거하기 위해 서서히 소용돌이 나게 하였다. 충분한 부피의 찬물을 사용하여 바이오스펙 균질기로 펠릿을 재현탁하여 2 mg/ml 농도의 GDNF 를 산출하였다. 최종 세포 봉합체 현탁액(25 ml)과, 180 mM 시스테인 HCl 을 함유하는 8 M 구아니딘 HCl(25 ml) 및 50 mM 트리스 HCl, pH 8.7 을 혼합하여 세포 봉입체를 가용화시켰다. 가용화 혼합물을 25 ℃ 에서 60 내지 90 분간 교반한 후에 그것을 혼합하면서, 20 mM 트리스 HCl, pH 8.75 와 0.2 M 구아니딘 HCl 을 함유하는 2 M 요소(5 ℃, 450 ml)에 부었다. 이 재생 혼합물을 5 ℃ 에서 72 시간 동안 서서히 교반하였다.
재생된 GDNF 를 다음과 같이 부분적으로 정제하였다. 5 ℃ 에서 20 mM 아세트산 나트륨 완충액을 신속히 교반하면서 재생 혼합물에 가하고, 빙초산으로 pH 를 5 에 맞추었다. 5 ℃, 13,600 xg 에서 45 분간 원심분리하여 결과적으로 생성된 침전물을 제거하였다. 이 원심분리에 의한 상청액을, SP - 빅 비드 수지(파마시아)를 갖는 양이온 교환 크로마토그래피와 관계하는 다음 정제 단계를 위한 부하 용액으로서 사용하였다. 평형화, 헹굼 및 용리 완충액계로서 20 mM 아세트산 나트륨(pH 5)을 사용하여 5 ℃ 에서 칼럼을 작동시켰다. 수지의 베드(5 ml)를 0.2 N NaOH 의 5 컬럼 부피(CV)로 소독한 다음 아세트산염 완충액(5 CV)으로 평형화시켰다. 0.5CV/분으로 부하 용액(190 ml)을 칼럼에 가한 후에 이어서 동일 유속으로 아세트산염 완충액으로 10 CV 헹구었다. 0.1 CV/분 유속에서 아세트산염 완충액내 0.3 M 내지 0.9 M 까지 NaCl 의 20 CV 선형 기울기로 수지로 부터 GDNF 를 용리시켰다. 280 nm 에서 컬럼 용리액의 흡광도를 측정하여 수집된 분획들을 SDS - PAGE 로써 검정하였다. 10 % 피크 높이인 GDNF 피크의 앞에서 부터 10 % 피크 높이에 대한 피크의 뒤까지 GDNF 를 함유하는 분획들을 풀로 만들었다. 이 풀내의 단백질은 전적으로 GDNF 인데, 이는 사용된 생성 균주에 따라 좌우되며, 변형된 GDNF 형태로서 32 % 내지 12 % 오염을 포함했다. 그런 다음 풀을 PBS 나 다른 제제형 완충액에 대해 투석하되, 일부 경우에는 한외여과에 의해 25 mg/ml 까지 농축시켰다. 야생형, 및 이 과정에 의해 정제된 GDNF 의 동족체 형태 둘 다 상응 생성 균주와 관련하여 제제의 순도를 비교하기 위해 역상 HPLC, 양이온 교환 HPLC, 질량 분광법 및 내독소 수준에 의해 특정화하였다.
실시예 3
E.coli 내 절단된 GDNF 의 재조합 생산
Lin 등의 문헌(미국 특허 출원 번호 제 08/182,183 호, 1994년 5월 23일자 제출, 상기문헌)에 기재되어 있는 기술에 따라 실질적으로 전형적인 절단된 GDNF 단백질을 생산하였다. 상기한 바와 같은, 택일적인 박테리아 발현 물질 및 방법을 사용할 수도 있다. E.coli - 발현 절단된 GDNF 단백질은 각각 도 5, 6 및 7 에 도시되어 있는 바와 같이 [Pro23- lle134], [Arg32- lle134] 및 [Gly33- lle134] 절단된GDNF 단백질을 포함한다. 이들 전형적인 절단된 GDNF 단백질을 코딩하는 폴리누클레오티를 도 5, 6 및 7 에 도시된 바와 같이 구성하였으나, 도 1, 3 및 4 에 도시된 바와 같은 상응 폴리누클레오티드를 사용할 수도 있다. 본원에서 참고문헌으로 인용한, PCT Technology, Principles and Applications for DNA Amplification, Henry A. Erlich, ed., Stockton Press, NY, 1989(Chapter 6, Using PCR to Engineer DNA)에 기술되어 있는 표준 PCR 과정에 의해 폴리누클레오티드를 구성할 수 있다.
실시예 4
도파민작용성 신경원 신경영양성 활성도에 대한 생물검정
실시예 3 의 E.coli - 발현 [Pro23- lle134], [Arg32- lle134], [Gly33- lle134] 및 [Lys37- lle134] 절단된 GDNF 단백질과 실시예 1 의 CHO - 유래 [Arg32- lle134] 절단된 GDNF 단백질을, 흑질 도파민작용성 신경원에 의한 도파민 섭취를 촉진시키는 그 능력에 대해 정성 기초를 평가하였다.
물질
절단된 GDNF 단백질의 존재하에서 도파민작용성 신경원의 생존을 평가하기 위한 검정에 다음 물질이 사용된다 :
세포 배지
고글루코스 둘베코의 변형된 이글 배지(DMEM ; 카탈로그 번호 제 11965 - 092 호), 햄의 F12 배지(F12 ; 제 11765 - 021 호), 중탄산나트륨이 없는 라이보비쯔의 L15 배지(제 41300 - 039 호), B27 배지 보충물(제 17504 - 010 호), 페니실린/스트렙토마이신(제 15070 - 014 호), L - 글루타민(# 25030 - 016 호), 둘베코의 인산염 완충 식염수(D - PBS ; 제 14190 - 052 호), 칼슘과 마그네슘염을 갖는 행크의 균형된 염 용액(HBSS ; 제 24020 - 026 호), N - 2 - 히드록시에틸피페라진 - N' - 2 - 에탄술폰산(HEPES ; 제 15630 - 015 호), 마우스 라미닌(제 23017 - 015 호) 및 소 혈청 알부민 분획 V(제 110 - 18 - 017 호) 모두는 미국 뉴욕 그랜드 아일랜드에 소재하는 깁코(GIBCO)로 부터 수득하였다. 열 - 비활성화된 말 혈청은 미국 유타 로간에 소재하는 하이클론(Hyclone)에서 수득하였다. 콘알부민(C - 7786), 폴리 - L - 오르니틴 하이드로 브로마이드( P - 3655), 소 인슐린(I - 5500), 인체 트란스페린(T - 2252), 푸트레신(P - 6024), 프로게스테론(P - 6149), 셀렌산 나트륨(S - 9133), 메트리자마이드(M - 3383) 모두는 미국 미주리 세인트 - 루이스에 소재하는 시그마 케미컬 컴퍼니에서 수득하였다. 파파인, 데옥시리보누클레아제 I (DNAase) 및 오브알부민(파파인 해리계)은 미국 뉴저지 프리홀드에 소재하는 워싱톤 바이오케미컬스에서 수득하였다.
팔콘 무균 96 - 웰 미량평판(제 3072 호), 조직배양 플라스틱 용품 및 폴리프로필렌 원심분리 튜브는 미국 캘리포니아 옥스너드에 소재하는 벡톤 - 디킨슨에서 구입하였다. 넝크 랩 - 텍 조직 배양 체임버 커버글라스(제 136439 호)는 미국 캘리포니아 어빈에 소재하는 박스터에서 구입하였고 ; 20 μm(제 460 호) 나일론 메시는 미국 뉴욕 엘름스포드에 소재하는 텍코에서 구입하였으며 ; 4" 해부 핀셋과 4" 해부 가위는 워싱톤 디시에 소재하는 로보쯔 서지컬에서 구입하였다.
항체 및 관련 시약
폴리클로날 토끼 항 - 티로신 히드록실라제 항체(TE 101)는 미국 뉴저지 리지필드에 소재하는 유진 테크에서 구입하였고 ; 폴리클로날 토끼 항 - 신경원 - 특이 에놀라제 항체(NSE, AB 951)는 미국 캘리포니아 테머큘라에 소재하는 케미콘에서 구입하였으며 ; 비오티닐화된 염소 항 - 토끼 IgG 및 과산화효소 - 복합 아비딘/비오틴 복합체(ABC 엘리트 ; 벡타스타인 키트 PK - 6100)는 미국 캘리포니아 버링게임에 소재하는 벡터 라보라토리스에서 구입하였다. 3',3' - 디아미노벤지딘은 미국 펜실베니아 웨스트 체스터에 소재하는 카펠 라보라토리스에서 구입하였다. PBS 내의 수퍼블록 차단 완충액(제 37515 호)은 미국 일리노이 록크포드에 소재하는 피어스 케미컬 컴퍼니에서 구입하였다. 트리톤 X - 100(X100), 노니데트 P - 40(N 6507) 및 과산화수소(30 %, v/v ; H 1009)는 시그마에서 구입하였다. GBR - 12909 도파민 섭취 억제제(D - 052)는 미국 메사츄세츠 나틱에 소재하는 RBI 에서 구입하였다.3H - 도파민(삼중수소화된 도파민, NE - 131 ; 21 Ci/mmol)은 미국 메사츄세츠 보스톤에 소재하는 뉴 잉글랜드 뉴클리어에서 구입하였다. 옵티페이즈 수퍼믹스 섬광 칵테일은 핀란드 터쿠에 소재하는 왈락에서 구입하였다. 화이트 뷰플레이트 - 96 마이크로플레이트(제 6005182 호)는 미국 코네티컷 메리덴에 소재하는 팩카드 인스트루먼츠 코포레이션에서 구입하였다. 다른 모든 시약들은, 다른 특별한 지시가 없는 한, 시그마 케미컬 컴퍼니에서 구입하였다.
배지 제조
DMEM 과 F12 배지의 1 : 1 혼합물로서 기본 배지를 제조하고 50 배 농축된 저장 용액으로서 가한 B27 배지 보충물을 보충하였다. L - 글루타민을 약 2 mM 의 최종 농도로, 페니실린은 약 100 IU/I 로, 스트렙토마이신은 약 100 mg/l 로 가하였다. 약 15 % 의 최종 농도까지 열 - 비활성화된 말 혈청을 가하였다. 이를 혼합한 후에 pH 를 약 7.3 으로 맞추고, 배지를 4 ℃ 에 유지시켰다. 실험중의 변화를 최소화하기 위해 사용하기 바로 전에 배지를 신선하게 제조하였다. 단백질 흡착을 최소화하기 위해 전반적으로 플라스틱 피펫과 용기를 사용하였다.
배양 기질(culture substratum)
기질 신경원 및 신경돌기 부산물(outgrowth)의 최적 부착을 촉진시키기 위해, 미량역가 평판 표면(배양 기질)을 다음과 같이 폴리 - L - 오르니틴 및 라미닌으로 연속하여 피막시킴으로써 변형시켰다. 0.1 M 붕산(pH 8.4)내에 함유되어 있는 폴리 - L - 오르니틴으로 된 0.1 mg/ml 살균액으로 실온에서 최소한 1 시간 동안 평판 표면을 완전히 덮은 다음 이 살균액을 수퍼 - Q 물로 세척하였다. 물 세척물을 흡입시킨 다음, PBS 내의 마우스 라미닌으로 된 1.0 μg/ml 용액을 가하고 2 시간 동안 37 ℃ 에서 배양하였다. 결과물의 재현성을 지키기 위해 평판 사용 직전에 이 과정을 수행하였다.
태아 랫 흑질 배양물 제조
흑질 도파민작용성 신경원의 원(source)으로서 태아 랫 뇌를 사용하였다. 15 일 된 태아를 임신한 스프래그 - 돌레이 랫을 사용하였다. 실험 당 최대한 36태아(약 세 마리의 랫으로 부터의 태아)를 처리하였다. 임신한 랫을 CO2에 노출시켜서 죽이고, 해부 가위로 복강을 개복하여 자궁으로 부터 태아를 제거하였다. 그런 다음 태아 뇌를 해부하여 혈액과 수막을 제거하고, 흑질을 함유하는 복개부위(ventral tegmental area)를 잘 규정된 해부학적 표인점(Altman and Bayer, Atlas of Prenatal Rat Brain Development, CRC Press, Boca Raton, FL, 1995 참조)을 이용하여 해부하였다. 얼음같이 찬 D - PBS 내에 조직을 모아서 10 밀리리터의 해리 배지(HBSS 내에 함유되어 있는 120 단위 파파인과 2000 단위 DNAase)내로 옳긴 다음 약 200 rpm 의 회전 플랫폼 셰이커 상에서 약 37 ℃ 에서 45 분간 배양하였다. 그런 다음 세포를 불 다듬질된 파스퇴르 피펫을 통하여 분쇄시킴으로써 분산시켜서, 해리되지 않은 조직을 따라내기 위해 20 μm 니텍스(Nixex) 메시를 통해 체를 치고, IEC 임상 원심분리기를 사용하여 200 xg 에서 5 분간 원심분리하였다. 결과적으로 생성된 세포 펠릿을 오브알부민과 약 500 단위 DNAase 를 함유하는 HBSS 내에 재현탁시켜서 4 % 오브알부민 용액(HBSS 내)의 상단을 층으로 만든 후 500 xg 에서 약 10 분간 원심분리하였다. 최종 펠릿을 완전한 배지(상기 참조)에 재현탁시켜서 약 28,000 세포/ml 로 맞추고, 폴리오르니틴과 라미닌으로 미리 피막시킨 6 mm - 웰로 된 96 - 웰 미량평판 내에 분취량(90 μl)을 접종하였다. 세포 부착은 신속히 일어났으며, 평판화 효율은 약 75 % 였다.
도파민작용성 신경원의 면역조직화학
흑질 배양물내의 도파민작용성 신경원을 특정화하기 위해, 다음과 같이,Louis 등의 문헌(J. Pharmacol. Exp. Therap., 262 : 1274 - 1283, 1992 ; Science, 259 : 689 - 692, 1993)에 기술되어 있는 간접 면역과산화효소법을 약간 변형시켜 이용하였다. D - PBS 내 4 % 파라포름알데히드, pH 7.4 와 함께 배양물을 실온에서 약 30 분간 고정시킨 다음, D - PBS 로 3 회 세척하였다(6 - mm 웰 당 200 μl). 항체 침투를 증가시키기 위해 1 % NP - 40 을 함유하는, PBS 내 수퍼블록 차단 완충액에 고정된 배양물을 배양하였다. 일차 토끼 항 - 티로신 수산화효소 항체를 동일 완충액으로 약 1 : 2000 희석하여 가하고 회전 셰이커 상에서 37 ℃ 에서 1 시간 동안 배양하였다. D - PBS 로 3 회 세척한 후에 약 1 : 500 희석한 염소 - 항 - 토끼 비오티닐화된 IgG 를 사용하여 결합된 항체를 검출하되, 이들 이차 항체는 37 ℃ 에서 약 1 시간 동안 세포와 배양하였다. 그런 다음 세포를 D - PBS 로 3 회 세척하여, 1 : 500 희석한 아비딘 - 비오틴 - 과산화효소 복합체로 이차 항체를 검출하고, 세포는 37 ℃ 에서 45 분간 배양하였다. 이 배양물을 3 회 이상 D - PBS 로 세척한 후에, 0.04 % 3',3' - 디아미노벤지딘 - (HCl)4, 0.06 % NiCl2및 0.02 % 과산화수소를 함유하는, 0.1 M 트리스 - HCl, pH 7.4 용액에 5 - 20 분간 반응시켰다.
신경원 생존 결정
상기한 바와 같이 흑질 배양물을 고정시켜서 면역염색 처리한 다음 200 X 배율에서 밝은 - 빛 광학으로 조사하였다. 6 mm - 웰로 된 전체 96 - 웰 미량평판에서 티로신 수산화효소에 대해 염색된 신경원수를 세었다. 생존 신경원은 주요 축삭- 유사 돌기와 몇몇 수상 돌기 - 유사 돌기를 수반한, 규칙적인 모양의 세포체를 갖는 것으로 간주하였다. 변성의 신호를 나타내는, 이를테면 불규칙한, 소포성 핵주위부세포체나 단편화된 신경돌기를 갖는 신경원은 계산에서 제외하였다(그러나, 대부분 변성 신경원은 배양 기질로 부터 해리된다). 도파민작용성 신경원 세포수는 TH - 양성 신경원/6 - mm 웰로서나 아니면 대조 도파민작용성 신경원 밀도에 비례하는 접힘 - 변화(fold - change)로서 표현하였다.
도파민 섭취 측정
도파민 섭취는, 화이트 뷰플레이트 - 96 미량평판에서 확립시킨 15 일 된 태아 랫 흑질 신경원 배양물에서 측정하였다. 약 120 mM NaCl, 4.7 mM KCl, 1.8 mM CaCl2, 1.2 mM MgSO4, 32 mM NaHPO4, 1.3 mM EDTA 및 5.6 mM D - 글루코스를 함유하는 변형되는 크렙스 - 린저 용액, pH 7.4 로 구성되어 있는 미리 데워 놓은 섭취 완충액(약 100 μl)으로 배양물을 세척하였다. 또한 도파민의 산화를 방지하기 위해 1 mM 아스코르브산 및 50 μM 파르길린을 섭취 완충액에 함유시켰다. 섭취 완충액내에서 세포를 37 ℃ 에서 약 10 분간 예비배양하였다. 75 μl 의 섭취 완충액내 약 50 nM 의 농도로 흑질 배양물에 삼중수소화된 도파민(3H - DA, 21 Ci/mmol)을 가하고, 이 배양물을 37 ℃ 에서 약 60 분간 배양하였다. 도파민 섭취 억제제 GBR - 12909(1 μM)를 함유하는 섭취 완충액과 함께 배양물을 배양함으로써 비 - 특이 도파민 섭취를 측정하였다. 비특이 섭취는 총 섭취의 약 1 % 보다 적게 나타났다. 배양 배지를 흡입시킨 다음 얼음같이 찬 섭취 완충액(약 120 μl)으로 신속히 3 회세척함으로써 섭취 검정을 중지하였다. 그런 다음 옵티페이즈 수퍼믹스 섬광 칵테일(200 μl)을 부가하여 세포를 용균시키고, 월락 마이크로베타플러스 96 - 웰 미량평판 계수기를 사용하여 섬광 분광법으로 방사능을 측정하였다(즉, 배양물내에 남아있는 트리티움을 섬광 계수하여 도파민 섭취를 분석한다). 그 결과는 dpm/6-mm 웰로서나 아니면 대조 배양물에 비례하는 접힘 - 변화로서 표현한다.
검정
도파민작용성 신경원 생존 및 형태학적 발육
도파민작용성 신경원이 풍부한 15 일 된 태아(E15) 랫 흑질 배양물을 도파민작용성 신경원의 생존에 대한 절단된 GDNF 단백질의 효과를 입증하기 위해 사용하였다. 폴리오르니틴- 및 라미닌- 피막된 96 - 웰 미량 평판에서 6 일 동안 까지 배양물을 단독으로 또는 여러 농도(약 1 pg/ml 내지 약 10 ng/ml 의 범위)의 다음 단백질의 존재하에서 성장시켰다 : E.coli - 발현 성숙한 hGDNF ; E.coli - 발현 [Pro23- lle134], [Arg32- lle134], [Gly33- lle134] 및 [Lys37- lle134] 절단된 GDNF 단백질 ; CHO 세포 - 발현 성숙한 hGDNF ; 및 CHO 세포 - 유래 [Arg32- lle134] 절단된 GDNF 단백질. 배지는 15 % 열 - 비활성화된 말 혈청(E15 배양물) 또는 2.5 % 열 - 비활성화된 말 혈청, D - 글루코스, HEPES, 인슐린 및 트란스페린(P6 배양물)로 보충된 DMEM/F12 로 구성된다. 티로신 수산화효소(TH)에 대한 면역염색법에 있어, 도파민작용성 신경원에 대한 표식자로서 도파민 생합성에서의 율속 효소(rate - limiting enzyme)를 사용하였다. 능뇌의 노르아드레날린성 신경원 또한 TH 에 대해 양성으로 염색되기 때문에, 중뇌의 복피개(ventral tegmentum)로 제한되고 노르아드레날린성 세포체를 함유하는 보다 미방 부분을 회피하는 부위를 해부하기 위해서는 더 많은 주위을 기울여야 한다. 6 일 후에 E15 세포는 신경원 특이 에놀라제 면역염색법(상기에 기술되어 있음)으로 확인한 바와 같이 전형적으로 약 70 % 신경원과 30 % 비 - 신경원 세포(어두운 상의 평평한 외양을 가짐)로 구성되어 있되, 도파민작용성 신경원은 신경원 집단중 약 10 - 15 % 에 상당한다.
6 일 후, 배양물을 파라포름알데히드로 고정시키고 티로신 수산화효소, 즉 이들 배양물내의 도파민작용성 신경원을 확인하는 표식자에 대해 면역염색하였다. 6 - mm 웰에 존재하는 모든 티로신 - 수산화효소 - 양성 신경원을 명시야 광학 하에서 계수하였다. 6 개의 다른 웰에 대한 3 개 웰을 각 실험조건에서 분석하였다. 그 결과는 대조 배양물에서 발견된 티로신 - 수산화효소 - 양성 신경원수의 백분율로서 나타냈다.
1.0 ng/ml 의 GDNF, CHO 세포 - 발현 GDNF 또는 E.coli - 발현 GDNF 로 처리한, 비처리한 대조 배양물 보다 각각 약 38 % 및 27 % 더 많은 TH - 면역반응성 신경원을 함유하는 E15 흑질 배양물은 두 GDNF 종이 도파민작용성 신경원의 생존을 촉진시키는 것으로 나타났다. 1.0 ng/ml 의 절단된 GDNF 단백질로 처리한 E15 흑질 배양물은 시험관내 6 일 후에 배양물내 TH - 양성 신경원수가 유사하게 증가되었다 : CHO 세포 - 유래 [Arg32- lle134] 절단된 GDNF 단백질에 대해 42 %, 및 E.coli - 발현 [Arg32- lle134] 와 [Gly33- Ile134] 절단된 GDNF 단백질에 대해 각각 26 % 와17 %.
성숙한, 절단된 GDNF 단백질로 처리한 배양물과 대조 배양물을 비교한 결과 역시 도파민작용성 신경원의 형태학적 차별에 대한 모든 GDNF 단백질의 명백한 효과가 나타났다. [Arg32- lle134] 및 [Gly33- Ile134] 절단된 GDNF 단백질의 효과는 그 각각의 성숙한 GDNF 단백질 대조와 동일하였다. 모든 GDNF - 처리 배양물에서의 TH - 면역반응 신경원은 대조 배양물내의 TH - 양성 신경원 보다 상당히 더 복잡하고 신장된 신경염 분지(arborization)를 가질 뿐만 아니라, 더 높은 정도의 신경돌기 분지(branching)와 전체적으로 더 큰 세포체(soma) 크기를 가졌다.
도파민 섭취
도파민 섭취는 고친화성 도파민 재섭취 수송체 부위의 수와 활성도를 측정하는 것으로 도파민작용성 신경원의 기능적 차별을 반영하는 것이다. 시험관 내 6 일 후에 성숙한 GDNF 나 절단된 GDNF 단백질을 수반하거나 수반하지 않은 E15 랫 흑질 배양물에서 도파민 섭취를 측정하였다. 이들 배양물에 있어, 도파민 섭취는 도파민작용성 신경원의 특징인 약리학적 프로필을 가졌다, 즉 그것은 1.0 μM GBR - 12909, 도파민작용성 신경원에 특이적인 도파민 수송체 억제제(ID50 = 20 nM)에 의해 거의 완전히 차단되었다(98 % 이상). 이것은 도파민 섭취 측정량이 노르에피네프린 수송체를 통하여 도파민을 섭취할 수 있지만 GBR - 12909 억제제에 민감하지 않는, 오염성 노르아드레날린성 신경원의 존재를 반영하지 않는다는 것을 암시한다. CHO - 세포 - 발현 성숙한 GDNF 와 CHO - 유래 [Arg32- lle134] 절단된 GDNF 단백질의 효과는 동일하였다 : 약 20 pg/ml 의 ED50 을 가지며, 약 65 % 증가. 도 5 에 도시된 바와 같이, E.coli - 발현 [Pro23- Lys37△Asn37- lle134] 절단된 GDNF 단백질로 약 40 pg/ml 의 ED50 을 가지며, 65 % 증가했음이 입증되었다. E.coli - 발현 성숙한 단백질과 E.coli - 발현 [Arg32- lle134], [Gly33- Ile134] 및 [Lys37- Ile134] 절단된 GDNF 단백질의 도파민 섭취에 대한 효과는 동일하였다 : 약 50 pg/ml 의 ED50s 을 가지며, 약 50 % 증가.
이 결과는 절단된 GDNF 단백질이 흑질 도파민작용성 신경원에 대한 잠재적 생존 - 촉진 인자 및 차별 - 유도 인자로서 작용한다는 것을 암시한다. 이와 같이, 절단된 GDNF 단백질은 파킨슨병, 즉 정동 시력이 감소하고 수의와 불수의 둘 다의 근육 운동이 느려지며, 근경직과 진전을 특징으로 하는 신경학적 장애를 치료하는데 특히 유용할 것이다. 그와 같은 증상은 흑질에 위치한 도파민 - 생성 신경원의 진행성 변성에 기인한다. 이들 신경원이 변성됨으로 인해("도파민작용성 신경원") 선조체라 불리는 뇌의 인접 부분에서의 도파민은 감소한다.
서열 목록
(1) 일반적 정보 :
(ⅰ) 출원인 : 후, 실비아
(ⅱ) 발명의 명칭 : 절단된 신경교세포주 - 유래 신경영양성 인자
(ⅲ) 서열의 개수 : 50
(ⅳ) 통신 주소 :
(A) 수신인 : 암젠 인코포레이티드
(B) 스트리트 : 디하빌랜드 드라이브 1840
(C) 시 : 사우전드 오크스
(D) 주 : 캘리포니아
(E) 국명 : 미국
(F) 우편번호 : 91320
(ⅴ) 컴퓨터 판독 형태 :
(A) 매체타입 : 플로피 디스크
(B) 컴퓨터 : IBM PC 호환기종
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(D) 소프트웨어 : PatentIn Release #1.0, Version #1.25
(ⅵ) 현출원 데이터 :
(A) 출원번호 :
(B) 출 원 일 :
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(C) 참조/문서 번호 : A - 357
(ⅸ) 통신 정보:
(A) 전화번호 : 805-447-8102
(B) 팩스 : 805-499-8011
(C) 텔렉스 :
(2) 서열 번호 : 1
(ⅰ) 서열 특징 :
(A) 서열의 길이 : 402 염기쌍
(B) 서열의 타입 : 핵산
(C) 쇄의 수 : 1 본쇄
(D) 토폴로지 : 직쇄상
(ⅱ) 서열의 종류 : 단백질
(ⅸ) 특징적 부분 :
(A) 특징 기호 : CDS
(B) 존재 위치 : 1..402
[서열 1]
(2) 서열 번호 : 2
(ⅰ) 서열 특징 :
(A) 서열의 길이 : 134 아미노산
(B) 서열의 타입 : 아미노산
(D) 토폴로지 : 직쇄상
(ⅱ) 서열의 종류 : 단백질
[서열 2]
(2) 서열 번호 : 3
(ⅰ) 서열 특징 :
(A) 서열의 길이 : 4 아미노산
(B) 서열의 타입 : 아미노산
(C) 쇄의 수 : 1 본쇄
(D) 토폴로지 : 직쇄상
(ⅱ) 서열의 종류 : 펩티드
[서열 3]
(2) 서열 번호 : 4
(ⅰ) 서열 특징 :
(A) 서열의 길이 : 5 아미노산
(B) 서열의 타입 : 아미노산
(C) 쇄의 수 : 1 본쇄
(D) 토폴로지 : 직쇄상
(ⅱ) 서열의 종류 : 펩티드
[서열 4]
(2) 서열 번호 : 5
(ⅰ) 서열 특징 :
(A) 서열의 길이 : 6 아미노산
(B) 서열의 타입 : 아미노산
(C) 쇄의 수 : 1 본쇄
(D) 토폴로지 : 직쇄상
(ⅱ) 서열의 종류 : 펩티드
[서열 5]
(2) 서열 번호 : 6
(ⅰ) 서열 특징 :
(A) 서열의 길이 : 7 아미노산
(B) 서열의 타입 : 아미노산
(C) 쇄의 수 : 1 본쇄
(D) 토폴로지 : 직쇄상
(ⅱ) 서열의 종류 : 펩티드
[서열 6]
(2) 서열 번호 : 7
(ⅰ) 서열 특징 :
(A) 서열의 길이 : 8 아미노산
(B) 서열의 타입 : 아미노산
(C) 쇄의 수 : 1 본쇄
(D) 토폴로지 : 직쇄상
(ⅱ) 서열의 종류 : 펩티드
[서열 7]
(2) 서열 번호 : 8
(ⅰ) 서열 특징 :
(A) 서열의 길이 : 9 아미노산
(B) 서열의 타입 : 아미노산
(C) 쇄의 수 : 1 본쇄
(D) 토폴로지 : 직쇄상
(ⅱ) 서열의 종류 : 펩티드
[서열 8]
(2) 서열 번호 : 9
(ⅰ) 서열 특징 :
(A) 서열의 길이 : 10 아미노산
(B) 서열의 타입 : 아미노산
(C) 쇄의 수 : 1 본쇄
(D) 토폴로지 : 직쇄상
(ⅱ) 서열의 종류 : 펩티드
[서열 9]
(2) 서열 번호 : 10
(ⅰ) 서열 특징 :
(A) 서열의 길이 : 11 아미노산
(B) 서열의 타입 : 아미노산
(C) 쇄의 수 : 1 본쇄
(D) 토폴로지 : 직쇄상
(ⅱ) 서열의 종류 : 펩티드
[서열 10]
(2) 서열 번호 : 11
(ⅰ) 서열 특징 :
(A) 서열의 길이 : 12 아미노산
(B) 서열의 타입 : 아미노산
(C) 쇄의 수 : 1 본쇄
(D) 토폴로지 : 직쇄상
(ⅱ) 서열의 종류 : 펩티드
[서열 11]
(2) 서열 번호 : 12
(ⅰ) 서열 특징 :
(A) 서열의 길이 : 13 아미노산
(B) 서열의 타입 : 아미노산
(C) 쇄의 수 : 1 본쇄
(D) 토폴로지 : 직쇄상
(ⅱ) 서열의 종류 : 펩티드
[서열 12]
(2) 서열 번호 : 13
(ⅰ) 서열 특징 :
(A) 서열의 길이 : 14 아미노산
(B) 서열의 타입 : 아미노산
(C) 쇄의 수 : 1 본쇄
(D) 토폴로지 : 직쇄상
(ⅱ) 서열의 종류 : 펩티드
[서열 13]
(2) 서열 번호 : 14
(ⅰ) 서열 특징 :
(A) 서열의 길이 : 15 아미노산
(B) 서열의 타입 : 아미노산
(C) 쇄의 수 : 1 본쇄
(D) 토폴로지 : 직쇄상
(ⅱ) 서열의 종류 : 펩티드
[서열 14]
(2) 서열 번호 : 15
(ⅰ) 서열 특징 :
(A) 서열의 길이 : 16 아미노산
(B) 서열의 타입 : 아미노산
(C) 쇄의 수 : 1 본쇄
(D) 토폴로지 : 직쇄상
(ⅱ) 서열의 종류 : 펩티드
[서열 15]
(2) 서열 번호 : 16
(ⅰ) 서열 특징 :
(A) 서열의 길이 : 17 아미노산
(B) 서열의 타입 : 아미노산
(C) 쇄의 수 : 1 본쇄
(D) 토폴로지 : 직쇄상
(ⅱ) 서열의 종류 : 펩티드
[서열 16]
(2) 서열 번호 : 17
(ⅰ) 서열 특징 :
(A) 서열의 길이 : 18 아미노산
(B) 서열의 타입 : 아미노산
(C) 쇄의 수 : 1 본쇄
(D) 토폴로지 : 직쇄상
(ⅱ) 서열의 종류 : 펩티드
[서열 17]
(2) 서열 번호 : 18
(ⅰ) 서열 특징 :
(A) 서열의 길이 : 19 아미노산
(B) 서열의 타입 : 아미노산
(C) 쇄의 수 : 1 본쇄
(D) 토폴로지 : 직쇄상
(ⅱ) 서열의 종류 : 펩티드
[서열 18]
(2) 서열 번호 : 19
(ⅰ) 서열 특징 :
(A) 서열의 길이 : 20 아미노산
(B) 서열의 타입 : 아미노산
(C) 쇄의 수 : 1 본쇄
(D) 토폴로지 : 직쇄상
(ⅱ) 서열의 종류 : 펩티드
[서열 19]
(2) 서열 번호 : 20
(ⅰ) 서열 특징 :
(A) 서열의 길이 : 21 아미노산
(B) 서열의 타입 : 아미노산
(C) 쇄의 수 : 1 본쇄
(D) 토폴로지 : 직쇄상
(ⅱ) 서열의 종류 : 펩티드
[서열 20]
(2) 서열 번호 : 21
(ⅰ) 서열 특징 :
(A) 서열의 길이 : 22 아미노산
(B) 서열의 타입 : 아미노산
(C) 쇄의 수 : 1 본쇄
(D) 토폴로지 : 직쇄상
(ⅱ) 서열의 종류 : 펩티드
[서열 21]
(2) 서열 번호 : 22
(ⅰ) 서열 특징 :
(A) 서열의 길이 : 23 아미노산
(B) 서열의 타입 : 아미노산
(C) 쇄의 수 : 1 본쇄
(D) 토폴로지 : 직쇄상
(ⅱ) 서열의 종류 : 펩티드
[서열 22]
(2) 서열 번호 : 23
(ⅰ) 서열 특징 :
(A) 서열의 길이 : 24 아미노산
(B) 서열의 타입 : 아미노산
(C) 쇄의 수 : 1 본쇄
(D) 토폴로지 : 직쇄상
(ⅱ) 서열의 종류 : 펩티드
[서열 23]
(2) 서열 번호 : 24
(ⅰ) 서열 특징 :
(A) 서열의 길이 : 25 아미노산
(B) 서열의 타입 : 아미노산
(C) 쇄의 수 : 1 본쇄
(D) 토폴로지 : 직쇄상
(ⅱ) 서열의 종류 : 펩티드
[서열 24]
(2) 서열 번호 : 25
(ⅰ) 서열 특징 :
(A) 서열의 길이 : 26 아미노산
(B) 서열의 타입 : 아미노산
(C) 쇄의 수 : 1 본쇄
(D) 토폴로지 : 직쇄상
(ⅱ) 서열의 종류 : 펩티드
[서열 25]
(2) 서열 번호 : 26
(ⅰ) 서열 특징 :
(A) 서열의 길이 : 27 아미노산
(B) 서열의 타입 : 아미노산
(C) 쇄의 수 : 1 본쇄
(D) 토폴로지 : 직쇄상
(ⅱ) 서열의 종류 : 펩티드
[서열 26]
(2) 서열 번호 : 27
(ⅰ) 서열 특징 :
(A) 서열의 길이 : 28 아미노산
(B) 서열의 타입 : 아미노산
(C) 쇄의 수 : 1 본쇄
(D) 토폴로지 : 직쇄상
(ⅱ) 서열의 종류 : 펩티드
[서열 27]
(2) 서열 번호 : 28
(ⅰ) 서열 특징 :
(A) 서열의 길이 : 29 아미노산
(B) 서열의 타입 : 아미노산
(C) 쇄의 수 : 1 본쇄
(D) 토폴로지 : 직쇄상
(ⅱ) 서열의 종류 : 펩티드
[서열 28]
(2) 서열 번호 : 29
(ⅰ) 서열 특징 :
(A) 서열의 길이 : 30 아미노산
(B) 서열의 타입 : 아미노산
(C) 쇄의 수 : 1 본쇄
(D) 토폴로지 : 직쇄상
(ⅱ) 서열의 종류 : 펩티드
[서열 29]
(2) 서열 번호 : 30
(ⅰ) 서열 특징 :
(A) 서열의 길이 : 31 아미노산
(B) 서열의 타입 : 아미노산
(C) 쇄의 수 : 1 본쇄
(D) 토폴로지 : 직쇄상
(ⅱ) 서열의 종류 : 펩티드
[서열 30]
(2) 서열 번호 : 31
(ⅰ) 서열 특징 :
(A) 서열의 길이 : 32 아미노산
(B) 서열의 타입 : 아미노산
(C) 쇄의 수 : 1 본쇄
(D) 토폴로지 : 직쇄상
(ⅱ) 서열의 종류 : 펩티드
[서열 31]
(2) 서열 번호 : 32
(ⅰ) 서열 특징 :
(A) 서열의 길이 : 33 아미노산
(B) 서열의 타입 : 아미노산
(C) 쇄의 수 : 1 본쇄
(D) 토폴로지 : 직쇄상
(ⅱ) 서열의 종류 : 펩티드
[서열 32]
(2) 서열 번호 : 33
(ⅰ) 서열 특징 :
(A) 서열의 길이 : 34 아미노산
(B) 서열의 타입 : 아미노산
(C) 쇄의 수 : 1 본쇄
(D) 토폴로지 : 직쇄상
(ⅱ) 서열의 종류 : 펩티드
[서열 33]
(2) 서열 번호 : 34
(ⅰ) 서열 특징 :
(A) 서열의 길이 : 35 아미노산
(B) 서열의 타입 : 아미노산
(C) 쇄의 수 : 1 본쇄
(D) 토폴로지 : 직쇄상
(ⅱ) 서열의 종류 : 펩티드
[서열 34]
(2) 서열 번호 : 35
(ⅰ) 서열 특징 :
(A) 서열의 길이 : 36 아미노산
(B) 서열의 타입 : 아미노산
(C) 쇄의 수 : 1 본쇄
(D) 토폴로지 : 직쇄상
(ⅱ) 서열의 종류 : 펩티드
[서열 35]
(2) 서열 번호 : 36
(ⅰ) 서열 특징 :
(A) 서열의 길이 : 37 아미노산
(B) 서열의 타입 : 아미노산
(C) 쇄의 수 : 1 본쇄
(D) 토폴로지 : 직쇄상
(ⅱ) 서열의 종류 : 펩티드
[서열 36]
(2) 서열 번호 : 37
(ⅰ) 서열 특징 :
(A) 서열의 길이 : 38 아미노산
(B) 서열의 타입 : 아미노산
(C) 쇄의 수 : 1 본쇄
(D) 토폴로지 : 직쇄상
(ⅱ) 서열의 종류 : 펩티드
[서열 37]
(2) 서열 번호 : 38
(ⅰ) 서열 특징 :
(A) 서열의 길이 : 39 아미노산
(B) 서열의 타입 : 아미노산
(C) 쇄의 수 : 1 본쇄
(D) 토폴로지 : 직쇄상
(ⅱ) 서열의 종류 : 펩티드
[서열 38]
(2) 서열 번호 : 39
(ⅰ) 서열 특징 :
(A) 서열의 길이 : 417 염기쌍
(B) 서열의 타입 : 핵산
(C) 쇄의 수 : 1 본쇄
(D) 토폴로지 : 직쇄상
(ⅱ) 서열의 종류 : DNA
[서열 39]
(2) 서열 번호 : 40
(ⅰ) 서열 특징 :
(A) 서열의 길이 : 417 염기쌍
(B) 서열의 타입 : 핵산
(C) 쇄의 수 : 1 본쇄
(D) 토폴로지 : 직쇄상
(ⅱ) 서열의 종류 : DNA
[서열 40]
(2) 서열 번호 : 41
(ⅰ) 서열 특징 :
(A) 서열의 길이 : 345 염기쌍
(B) 서열의 타입 : 핵산
(C) 쇄의 수 : 1 본쇄
(D) 토폴로지 : 직쇄상
(ⅱ) 서열의 종류 : 단백질
(ⅸ) 특징적 부분 :
(A) 특징 기호 : CDS
(B) 존재 위치 : 1..342
[서열 41a]
[서열 41b]
(2) 서열 번호 : 42
(ⅰ) 서열 특징 :
(A) 서열의 길이 : 114 아미노산
(B) 서열의 타입 : 아미노산
(D) 토폴로지 : 직쇄상
(ⅱ) 서열의 종류 : 단백질
[서열 42a]
[서열 42b]
(2) 서열 번호 : 43
(ⅰ) 서열 특징 :
(A) 서열의 길이 : 315 염기쌍
(B) 서열의 타입 : 핵산
(C) 쇄의 수 : 1 본쇄
(D) 토폴로지 : 직쇄상
(ⅱ) 서열의 종류 : 단백질
(ⅸ) 특징적 부분 :
(A) 특징 기호 : CDS
(B) 존재 위치 : 1..312
[서열 43a]
[서열 43b]
(2) 서열 번호 : 44
(ⅰ) 서열 특징 :
(A) 서열의 길이 : 104 아미노산
(B) 서열의 타입 : 아미노산
(D) 토폴로지 : 직쇄상
(ⅱ) 서열의 종류 : 단백질
[서열 44a]
[서열 44b]
(2) 서열 번호 : 45
(ⅰ) 서열 특징 :
(A) 서열의 길이 : 312 염기쌍
(B) 서열의 타입 : 핵산
(C) 쇄의 수 : 1 본쇄
(D) 토폴로지 : 직쇄상
(ⅱ) 서열의 종류 : 단백질
(ⅸ) 특징적 부분 :
(A) 특징 기호 : CDS
(B) 존재 위치 : 1..309
[서열 45a]
[서열 45b]
(2) 서열 번호 : 46
(ⅰ) 서열 특징 :
(A) 서열의 길이 : 103 아미노산
(B) 서열의 타입 : 아미노산
(D) 토폴로지 : 직쇄상
(ⅱ) 서열의 종류 : 단백질
[서열 46a]
[서열 46b]
(2) 서열 번호 : 47
(ⅰ) 서열 특징 :
(A) 서열의 길이 : 135 아미노산
(B) 서열의 타입 : 아미노산
(C) 쇄의 수 : 1 본쇄
(D) 토폴로지 : 직쇄상
(ⅱ) 서열의 종류 : 단백질
[서열 47a]
[서열 47b]
(2) 서열 번호 : 48
(ⅰ) 서열 특징 :
(A) 서열의 길이 : 104 아미노산
(B) 서열의 타입 : 아미노산
(C) 쇄의 수 : 1 본쇄
(D) 토폴로지 : 직쇄상
(ⅱ) 서열의 종류 : 단백질
[서열 48a]
[서열 48b]
(2) 서열 번호 : 49
(ⅰ) 서열 특징 :
(A) 서열의 길이 : 103 아미노산
(B) 서열의 타입 : 아미노산
(C) 쇄의 수 : 1 본쇄
(D) 토폴로지 : 직쇄상
(ⅱ) 서열의 종류 : 단백질
[서열 49]
(2) 서열 번호 : 50
(ⅰ) 서열 특징 :
(A) 서열의 길이 : 114 아미노산
(B) 서열의 타입 : 아미노산
(C) 쇄의 수 : 1 본쇄
(D) 토폴로지 : 직쇄상
(ⅱ) 서열의 종류 : 단백질
[서열 50]

Claims (36)

  1. 아미노산 서열
    X - [Cys41- Cys133] - Y
    또는 X 의 치환 변이체나 결실 변이체(여기에서, 변이체는 정렬을 돕기 위해 100개의 아미노산에 네 개의 갭을 도입하였을 때 하기한 X 의 아미노산 서열과 70 % 이상 동일함)로 구성되면 도파인작용성 신경원에 대해 신경영양 효과를 갖는 절단된 신경교세포주 - 유래 신경영양성 인자(GDNF) 단백질 산물로서,
    [Cys41- Cys133] 은 서열 2 의 Cys41내지 Cys133으로 구성되고 ;
    Y 는 카르복시 말단기인 Cys133, 카르복시 - 말단 아미노산 잔기인 Ile134또는 치환된 아미노산 잔기를 나타내며 ;
    X 는 메티오닐화되거나 메티오닐화되지 않은 아민기인 Cys41또는 다음 중에서 선택한 아미노 - 말단 아미노산 잔기를 나타낸다 :
  2. 제 1 항에 있어서, X = RQAAA ANPENSRGKG RRGQRGKNRG (서열 24) 임을 특징으로 하는 절단된 GDNF 단백질 산물.
  3. 제 1 항에 있어서, X = NPENSRGKG RRGQRGKNRG (서열 18) 임을 특징으로 하는 절단된 GDNF 단백질 산물.
  4. 제 1 항에 있어서, X = PENSRGKG RRGQRGKNRG (서열 17) 임을 특징으로 하는 절단된 GDNF 단백질 산물.
  5. 제 1 항에 있어서, X = SRGKG RRGQRGKNRG (서열 14) 임을 특징으로 하는 절단된 GDNF 단백질 산물.
  6. 제 1 항에 있어서, X = RGQRGKNRG (서열 8) 임을 특징으로 하는 절단된 GDNF 단백질 산물.
  7. 제 1 항에 있어서, X = GQRGKNRG (서열 7) 임을 특징으로 하는 절단된 GDNF 단백질 산물.
  8. 제 1 항에 있어서, X = KNRG (서열 3) 임을 특징으로 하는 절단된 GDNF 단백질 산물.
  9. 제 1 항에 있어서, X = NRG 임을 특징으로 하는 절단된 GDNF 단백질 산물.
  10. 제 1 항 내지 9 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 아미노산 서열은 글리코실화됨을 특징으로 하는 절단된 GDNF 단백질 산물.
  11. 제 1 항 내지 9 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 아미노산 서열은 글리코실화되지 않음을 특징으로 하는 절단된 GDNF 단백질 산물.
  12. 제 1 항에 있어서, X - [Cys41- Cys133] - Y 는 수용성 중합체와 결합됨을 특징으로 하는 절단된 GDNF 단백질 산물.
  13. 제 1 항의 절단된 GDNF 단백질을 코드하는 폴리누클레오티드.
  14. 제 13 항에 있어서, 폴리누클레오티드는 도 1 에 나타낸 서열의 일부를 포함함을 특징으로 하는 폴리누클레오티드.
  15. 제 13 항에 있어서, 폴리누클레오티드는 도 3 에 나타낸 서열의 일부를 포함함을 특징으로 하는 폴리누클레오티드.
  16. 제 13 항에 있어서, 폴리누클레오티드는 도 4 에 나타낸 서열의 일부를 포함함을 특징으로 하는 폴리누클레오티드.
  17. 제 13 항에 있어서, 폴리누클레오티드는 도 5 에 나타낸 서열을 포함함을 특징으로 하는 폴리누클레오티드.
  18. 제 13 항에 있어서, 폴리누클레오티드는 도 6 에 나타낸 서열을 포함함을 특징으로 하는 폴리누클레오티드.
  19. 제 13 항에 있어서, 폴리누클레오티드는 도 7 에 나타낸 서열을 포함함을 특징으로 하는 폴리누클레오티드.
  20. 발현 조절 서열에 유효하게 결합된 제 13 항의 폴리누클레오티드를 포함하는 벡터.
  21. 제 13 항의 폴리누클레오티드로 형질전환시키거나 형질감염시킨 원핵 또는 진핵 숙주 세포.
  22. 영양 배지에서 제 21 항의 숙주 세포를 성장시키고, 상기 세포 또는 상기 영양 배지로부터 상기 절단된 GDNF 를 분리함을 포함하는 절단된 GDNF 단백질의 생산방법.
  23. 제 22 항에 있어서, 상기 숙주 세포는 E.coli 임을 특징으로 하는 절단된 GDNF 단백질의 생산방법.
  24. 제 22 항에 있어서, 상기 숙주 세포는 차이니즈 햄스터 난소 세포임을 특징으로 하는 절단된 GDNF 단백질의 생산방법.
  25. 다음 단계로 이루어지는 절단된 신경교세포주 - 유래 신경영양성 인자(GDNF) 단백질의 생산방법 :
    (a) 제 20 항의 벡터로 형질전환시키거나 형질감염시킨 원핵 또는 진핵 숙주 세포를 배양하고 ;
    (b) 상기 숙주 세포에 의해 절단된 GDNF 단백질이 발현되는 조건하에서 상기 숙주 세포를 보존하며 ;
    (c) 상기 숙주 세포에 의해 발현되는 절단된 GDNF 단백질을 분리한다.
  26. 제 1 항의 단백질 산물을 코드하는 외인성 폴리누클레오티드를 함유하는 원핵 또는 진핵 숙주 세포의 재조합 발현 산물인 절단된 GDNF 단백질 산물.
  27. 제 1 항의 절단된 GDNF 단백질 산물과 제약학적으로 용인가능한 부형제를 함유하는, 질병이나 손상으로 야기되는 신경계 손상 치료용 제약학적 조성물.
  28. 제 22 항의 방법에 의해 생산한 절단된 GDNF 단백질과 제약학적으로 용인가능한 부형제를 함유하는, 질병이나 손상으로 야기되는 신경계 손상 치료용 제약학적 조성물.
  29. 제 25 항의 방법에 의해 생산한 절단된 GDNF 단백질과 제약학적으로 용인가능한 부형제를 함유하는, 질병이나 손상으로 야기되는 신경계 손상 치료용 제약학적 조성물.
  30. 제 1 항에 있어서, X 는 다음 중에서 선택함을 특징으로 하는 절단된 GDNF 단백질 산물 :
  31. 제 1 항에 있어서, 상기 절단된 GDNF 단백질은 시험관내 또는 생체내에서 생산됨을 특징으로 하는 절단된 GDNF 단백질 산물.
  32. 제 1 항의 절단된 GDNF 단백질 산물의 치료학적 유효량을 하나 또는 그 이상의 제약학적으로 용인가능한 부형제와 혼합하는, 제약학적 조성물의 제조방법.
  33. 제 13 항에 있어서, 상기 폴리누클레오티드는 파킨슨병 치료를 위한 제 1 항의 절단된 GDNF 단백질을 코드함을 특징으로 하는 폴리누클레오티드.
  34. 제 1 항의 절단된 GDNF 단백질 산물을 함유하는 질병이나 손상으로 야기되는 신경계 손상 치료용 제약학적 조성물.
  35. 제 1항의 절단된 GDNF 단백질 산물을 함유하는 파킨슨병 치료용 제약학적 조성물.
  36. 질병이나 손상으로 야기되는 신경계 손상 치료용 제약학적 조성물을 제조하기 위한 제 1 항의 절단된 GDNF 단백질 산물을 함유하는 제약학적 조성물.
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