NO322521B1

NO322521B1 - Avkortet gliacellelinjeavledet neurotrof faktor (GDNF)-proteinprodukt, plynukleotid som koder for dette, vektor omfattende polynukleotidet, anvendelse av GDNF-proteinproduktet for fremstilling av medikament, anvendelse av nebnte polynukleotid for fremstilling av medikament, anvendelse av celle som er transformert med polynukleotidet for fremstilling av medikament, prokaryot eller eukaryot vertscelle som er transfektert med polynukleotidet, fremgangsmate for fremstilling av avkortet GDNF-protein, farmasoytisk preparat som omfatter dette og fremgangsmate for fremstilling av preparatet.

Info

Publication number: NO322521B1
Application number: NO19981430A
Authority: NO
Inventors: Shaw-Fen Sylvia Hu
Original assignee: Amgen Inc
Priority date: 1995-09-28
Filing date: 1998-03-30
Publication date: 2006-10-16
Also published as: ZA968087B; SK288094B6; JPH11512709A; IL123761A; HK1021823A1; HUP9802262A3; MX9802278A; CN1283659C; CN1197461A; DE69635675D1; AU7074696A; US20040127419A1; SI0920448T1; EA199800301A1; IL144018A0; HUP9802262A2; NZ318697A; JP4153036B2; KR100334739B1; CZ88298A3

Description

Oppfinnelsens område

Foreliggende oppfinnelse gjelder generelt proteiner som heri betegnes gliacellelinjeavledede, neurotrofe faktorer (også betegnet gliaavledet, neurotrof faktor eller GDNF) som særpreges ved evnen til å fremme dopaminopptak av dopaminerge

neuroner og understøtte overlevelse av neuronene som dør ved Parkinsons sykdom.Foreliggende oppfinnelse gjelder nærmere bestemt nye, avkortede GDNF-proteiner.

Oppfinnelsens bakgrunn

Neurotrofe faktorer er proteiner som finnes i nervesystemet eller i ikke-nervevev som innerveres av nervesystemet hvis funksjon det er å fremme overlevelse og opprettholde den fenotypiske differensiering av nerveceller og/eller gliaceller (Varon et al., Ann. Rev. Neuroscience 1:327, 1979, Thoenen et al., Science 225:238, 1985). Grunnet denne fysiologiske rolle er neurotrofe faktorer anvendbare ved behandling av nervecel-ledegenerering og tapet av differensiert funksjon som forekommer i en rekke neurodegenerative sykdommer.

For at en gitt, neurotrof faktor skal ha mulig anvendelse ved behandling av nerveskader, må klassen eller klassene av skadede nerveceller kunne respondere på faktoren. Typisk har forskjellige neurotrofe faktorer en distinkt påvirkning på forskjellige klasser av nerveceller. Det er derfor fordelaktig å ha tilgang til en rekke forskjellige neurotrofe faktorer for behandling av hver av klassene av skadede neuroner som kan

foreligge ved forskjellige sykdomsformer eller skader.

Neurotrofe faktorer kan beskytte responderende neuroner mot en rekke ubeslektede skader. For eksempel vil nervevekstfaktor (NGF) redde en vesentlig del av sensoriske neuroner fra død forårsaket av overkutting av deres aksonale utvekster (Rich et al., J. Neurocytol. 15:261, 1987, Otto et al., J. Neurosci. 83:156, 1987), fra ontogenetisk død under embryoutviklingen (Hamburger et al., J. Neurosci. 4:767, 1984), og fra skade forårsaket av tilførsel av taxol eller cisplatin (Apfel et al., Ann. Neurol. 29:87, 1991). Denne tilsynelatende generelle beskyttelse har ført til antakelsen om at dersom en neurotrof faktor beskytter responderende neuroner mot eksperimentell skade, kan den også være anvendbar ved behandling av sykdommer som omfatter skade av de samme neuroner hos pasienter, selv om sykdommens etiologi kan være ukjent.

En gitt, neurotrof faktor må i tillegg til å ha den korrekte, neuronale spesifisitet være tilgjengelig i tilstrekkelig mengde til å kunne anvendes ved farmasøytisk behandling. Da neurotrofe faktorer typisk foreligger i små mengder i vev (f.eks. Hofer og Barde, Nature 331:261, 1988; Lin et al., Science 246:1023, 1989), ville det være upraktisk å fremstille farmasøytiske mengder av neurotrofe faktorer direkte fra dyre-vev. Som et alternativ er det ønskelig å benytte et rekombinant ekspresjonssystem for fremstilling av det ønskede protein.

Lin et al. beskrev tidligere en fremgangsmåte for gjennomsøking av biologiske prøver for neurotrof aktivitet overfor de embryonale forløpere for dopaminerge neuroner i substantia nigra (se US patentsøknad nr. 08/182 183, innlevert 23. mai 1994 og dens forløpersøknader, PCT/US92/07888, innlevert 17. september 1992 (WO 93/06116), og europeisk patent-søknad nr. 92921022.7 (publikasjonsnr. EP 610 254)). Denne bioanalyse er anvendbar for identifisering av neurotrofe faktorer som kan benyttes ved behandling av Parkinsons sykdom (Friedman et al., Neuro. Sei. Lett. 79:65-72, 1987) da denne sykdom særpreges ved degenerering av dopaminerge neuroner i midthjernen som innerverer striatum.

Lin et al. beskrev videre karakterisering av en ny, neurotrof faktor som ble renset fra én slik kilde, det kondisjonerte dyrkningsmedium fra en glioblastomcellelinje, B49 (Schubert et al., Nature 249:224-27, 1974). Det kondisjonerte medium fra denne cellelinje var tidligere blitt rapportert å inneholde dopaminerg, neurotrof aktivitet (Bohn et al., Soc. Neurosci. Abs. 15:277, 1989). Før beskrivelsen til Lin et al. var gliacellelinjeavledet, neurotrof faktor (GDNF) ikke blitt identifisert som en egen, biologisk aktiv forbindelse eller isolert som et i det vesentlige rent protein. I tillegg beskrev Lin et al. fremgangsmåter for kloning av humane gener som koder for GDNF, nukleinsyresekvensen til de humane gener som koder for GDNF og aminosyresekvensene til GDNF-proteinet. GDNF-genet ble subklonet i en ekspresjonsvektor, og vektoren ble benyttet til ekspresjon av biologisk aktivt GDNF. GDNF-proteinet er en homodimer som består av to subenheter på

134 aminosyrer,.. 22 kDa, sammenkoblet med disulfidbinding. Beskrivelsen omfattet videre anvendelse av GDNF for forebyggelse og behandling av nerveskade og sykdommer i nervesystemet, f.eks. Parkinsons sykdom.

GDNF-behandling er nyttig ved behandling av nerveskade forårsaket av betingelser som bringer overlevelse og/eller korrekt funksjon av én eller flere typer nerveceller i fare. Slik nerveskade kan skyldes et bredt utvalg av forskjellige årsaker. Nerveskade kan forekomme hos én eller flere typer nerveceller ved (1) fysisk skade som forårsaker degenerering av de aksonale utvekster og/eller nervecellelegemer nær skadesetet, (2) forbigående eller permanent avbrytelse av blodstrømmen til deler av nervesystemet, f.eks. ved slag, (3) utsettelse for neurotoksiner med vilje eller ved uhell, f.eks. kjemoterapeutiske midler (f.eks. cisplatinum) for behandling av cancer eller dideoksycytidin (ddC) for behandling av AIDS, (4) kroniske, metabolske sykdommer, f.eks. diabetes eller nyresvikt, eller (5) neurodegenererende sykdommer som Parkinsons sykdom, Alzheimers sykdom og amyotrof, lateral sklerose (ALS) som skyldes degenerering av spesifikke neuronpopulasjoner.

GDNF-behandling kunne være spesielt nyttig ved behandling av neurodegenerative tilstander som omfatter degenerering av de dopaminerge neuroner i substantia nigra, f.eks. Parkinsons sykdom. I dag er de eneste behandlingsformer for Parkinsons sykdom lindrende og er rettet mot å forhøye dopaminnivået i striatum. Den forventede virkning i GDNF-be-handl ing er ikke kun å frembringe en forhøyet dopaminerg neurotransmisjon i de dopaminerge nerveender i striatum (noe som ville føre til lindring av symptomene), men også å for-sinke, eller til og med stoppe, forløpet av de degenerative prosesser og å reparere den skadede nigrostriatale reaksjons-vei og gjenopprette dens funksjon. GDNF kan også benyttes ved behandling av andre former av skade av eller uønsket funksjon av dopaminerge nerveceller hos mennesker. Slik skade eller funksjonssvikt kan forekomme ved schizofreni og andre psykose- former. For tiden er de eneste behandlingsformer for slike tilstander symptomatiske og krever medikamenter som virker på dopaminreseptorer eller dopaminopptaksseter, i samsvar med det syn at funksjonssvikten hos de dopaminerge neuroner som innerverer disse reseptorbærende neuronpopulasjoner, kan inngå i sykdomsforløpet.

Oppsummering av oppfinnelsen

Én side ved foreliggende oppfinnelse tilveiebringer nye, avkortede proteinprodukter av gliacellelinjeavledet, neurotrof faktor (GDNF). I én utførelse fremstilles avkortede GDNF-proteiner ved rekombinante genutformingsteknikker. I en alternativ utførelse syntetiseres de avkortede GDNF-proteiner ved kjemiske teknikker, eller ved en kombinasjon av de rekombinante og de kjemiske teknikker.

Oppfinnelsen gjelder spesifikt avkortet, gliacellelinjeavledet, neurotrof faktor(GDNF)-proteinprodukt, kjennetegnet ved at det har aminosyresekvensen

X-[Cys41-Cys<133>]-Y, og kjemisk modifiserte derivater derav,

hvori

[Cys<41->Cys<133>] står for aminosyresekvensen fra Cys<41>til og med Cys<133>som avbildet i figur 1 (SEKV.ID NR. 2),

Y står for den terminale karboksygruppe i Cys<133>eller en karboksyterminal aminosyrerest, Ile134, og

X står for en metionylert eller ikke-metionylert amingruppe i Cys<41>eller aminoterminale aminosyrerester utvalgt fra gruppen:

der nevnte GDNF-proteinprodukt har evnen til å tilveiebringe en neurotrofisk effekt på dopaminerge nerveceller.

Det omfattes at slike avkortede GDNF-proteinprodukter ville omfatte avkortet GDNF-protein med aminosyresekvensen som representeres av X- [Cys41-Cys133] -Y og varianter og derivater av denne. De avkortede GDNF-proteinprodukter ifølge foreliggende oppfinnelse omfatter således også addisjonsvarianter, substitusjonsvarianter og interne delesjonsvarianter, og derivater av aminosyresekvensene representert ved X-[Cys<41->Cys<133>]-Y. De avkortede GDNF-proteinprodukter omfatter videre metionylerte eller ikke-metionylerte former, så vel som glykosylerte og ikke-glykosylerte former av avkortet GDNF-protein.

Eksempler på avkortede GDNF-proteiner ifølge foreliggende oppfinnelse omfatter de avkortede GDNF-proteiner [Arg<16->Ile134] , [Asn22 - Ile134] , [Pro23-Ile134] , [Ser26-Ile134] , [Arg32-Ile134] , [Gly33-Ile134] , [Lys37-Ile134] og [Asn38-Ile134] , enten metionylerte eller ikke-metionylerte, og varianter og derivater av disse. For tiden foretrukne, avkortede GDNF-proteiner ifølge foreliggende oppfinnelse omfatter de avkortede GDNF-proteiner [Lys3<7->Ile<134>] og [Asn38-Ile134] , enten metionylerte eller ikke-metionylerte, og varianter og derivater av disse. Eksempler på substitusjonsvarianter er de avkortede GDNF-proteiner

[Asn<22>Ser23-Ile134] og [Pro23-Lys<37>Asn37-1 le134] . Et eksempel på en addisjonsvariant er det avkortede GDNF-protein Ser- [Pro23-Ile<134>].

Ved en annen side av foreliggende oppfinnelse kan de avkortede GDNF-proteiner fremstilles i glykosylerte eller ikke-glykosylerte former. Derivater av avkortet GDNF-protein omfatter typisk tilkobling av det avkortede GDNF-protein til en vannløselig polymer. Det avkortede GDNF-protein kan f.eks. konjugeres til ett eller flere polyetylenglykolmolekyler for å redusere utfelling av det avkortede GDNF-proteinprodukt i vandig miljø.

Nok en annen side ved foreliggende oppfinnelse omfatter de forskjellige polynukleotider som koder for avkortede GDNF-proteiner. Disse nukleinsyresekvenser benyttes generelt ved ekspresjon av avkortet GDNF i en eukaryot eller prokaryot vertscelle, hvor ekspresjonsproduktet eller et derivat av dette særpreges ved evnen til å forhøye dopaminopptaket hos dopaminerge celler. Polynukleotidene kan også benyttes i an-vendelser som omfatter celleterapi eller genterapi. Egnede nukleinsyresekvenser omfatter dem som er angitt spesielt i figurene, så vel som ytterligere degenererte sekvenser og naturlig forekommende, alleliske varianter.

En annen side ved foreliggende oppfinnelse omfatter vektorer som inneholder polynukleotidene som koder for avkortede GDNF-proteiner operativt koblet til ampiifiserings-og/eller ekspresjonskontrollsekvenser. Både prokaryote og eukaryote vertsceller kan transformeres stabilt eller transfekteres med slike vektorer for ekspresjon av den avkortede, gliaavledede, neurotrofe faktor. Foreliggende oppfinnelse omfatter videre rekombinant fremstilling av et avkortet GDNF-protein hvor således transformerte eller transfekterte vertsceller dyrkes i et egnet næringsmedium og hvor det avkortede GDNF som uttrykkes av cellene, om ønskelig, isoleres fra vertscellene og/eller næringsmediet. Foreliggende oppfinnelse omfatter videre anvendelse av polynukleotider som koder for avkortet GDNF og vektorer som inneholder slike polynukleotider i genterapi eller celleterapi.

Oppfinnelsen omfatter dermed en vektor som er kjennetegnet ved at den omfatter et polynukleotid ifølge oppfinnelsen opererbart bundet til en uttrykkingskontrollsekvens.

En annen side ved foreliggende oppfinnelse omfatter et rekombinant fremstilt GDNF-preparat som inneholder en blanding av et modent GDNF-protein og ett eller flere avkortede GDNF-proteiner avledet fra dette, hvor det modne GDNF-protein har en molekylvekt på tilnærmet 44 kDa, og hvor det avkortede GDNF-protein har en molekylvekt på tilnærmet 36 til 40 kDa. GDNF-preparatet kan inneholde minst to avkortede GDNF-typer hvor den ene har en molekylvekt på tilnærmet 36 kDa og den andre en molekylvekt på tilnærmet 40 kDa. Den avkortede GDNF-type med molekylvekt på tilnærmet 40 kDa er en heterodimer av en GDNF-monomer med molekylvekt på tilnærmet 22 kDa og en avkortet GDNF-monomer med molekylvekt på tilnærmet 18 kDa. Det omfattes også at én eller flere av de avkortede GDNF-typer kan isoleres fra en slik blanding for terapeutisk anvendelse.

Oppfinnelsen gjelder også anvendelse av et avkortet GDNF-proteinprodukt ifølge oppfinnelsen for fremstilling av et medikament til behandling av Parkinsons sykdom, anvendelse av et polynukleotid ifølge oppfinnelsen for fremstilling av et medikament til behandling av Parkinsons sykdom, som er passende til å tilveiebringe in vivo-produksjon av nevnte avkortede GDNF-proteinprodukt, anvendelse av en celle som er transformert med et polynukleotid ifølge oppfinnelsen for fremstilling av et medikament til behandling av Parkinsons sykdom, der cellen tilveiebringer in vivo-produksjon av nevnte avkortede GDNF-protein, prokaryot eller eukaryot vertscelle, kjennetegnet ved at den er transfektert med et polynukleotid ifølge oppfinnelsen, fremgangsmåte for fremstilling av et avkortet GDNF-protein, kjennetegnet ved at den omfatter dyrking av vertsceller ifølge oppfinnelsen i et passende næringsmedium, og eventuelt isolere nevnte avkortede GDNF fra nevnte celler eller nevnte næringsmedium, og fremgangsmåte for fremstilling av et avkortet GDNF-protein, kjennetegnet ved at den omfatter trinnene: (a) dyrke en prokaryot eller eukaryot vertscelle som er transformert eller transfektert med en vektor ifølge

oppfinnelsen,

(b) opprettholde nevnte vertscelle ved betingelser som tillater uttrykkingen av avkortet GDNF-protein fra nevnte vertscelle og (c) eventuelt isolere det avkortede GDNF-proteinet som blir uttrykt av nevnte vertscelle.

Nok en side ved foreliggende oppfinnelse omfatter farmasøytiske preparater som inneholder avkortet GDNF-proteinprodukt. Det avkortede GDNF-proteinprodukt utformes typisk sammen med et farmasøytisk aksepterbart bærerstoff. En rekke andre utformingsforbindelser kan benyttes for å lette fremstilling, lagring, håndtering, tilførsel og/eller effektivi-tet. Ved nok en annen side ved foreliggende oppfinnelse for-høyer avkortede GDNF-proteinprodukter dopaminopptak og overlevelse av dopaminerge neuroner. De avkortede GDNF-proteinprodukter er således spesielt anvendbare for behandling av ner-ve sy st ems kader forårsaket av skader eller sykdom, f.eks. Parkinsons sykdom.

Oppfinnelsen gjelder dermed farmasøytisk preparat, kjennetegnet ved at det omfatter et avkortet GDNF-proteinprodukt ifølge oppfinnelsen sammen med en farmasøytisk akseptabel vehikkel, farmasøytisk preparat kjennetegnet ved at det omfatter et avkortet GDNF-protein som er fremstilt i henhold til fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen, sammen med en farmasøytisk akseptabel vehikkel, fremgangsmåte for fremstilling av et farmasøytisk preparat kjennetegnet ved at en terapeutisk effektiv mengde av et avkortet GDNF-proteinprodukt ifølge oppfinnelsen blir blandet med én eller flere farmasøytisk akseptable vehikler og anvendelse av avkortet GDNF-proteinprodukt ifølge oppfinnelsen for fremstilling av et medikament til behandling av skade på nervesystemet forårsaket av sykdom eller skade.

I tillegg omfatter oppfinnelsen et GDNF-proteinprodukt, kjennetegnet ved at det omfatter en dimer av en moden GDNF-aminosyresekvens ifølge SEKV.ID NR.2 og et avkortet GDNF-proteinprodukt ifølge oppfinnelsen, der nevnte dimer og nevnte GDNF-proteinprodukt har evnen til å tilveiebringe en

neurotrofisk effekt på dopaminerge nerveceller og GDNF-

proteinprodukt, kjennetegnet ved at det omfatter en dimer av to avkortede GDNF-proteinprodukter ifølge krav 1, der nevnte dimer har evnen- til -å tilveiebringe en neurotrof i sk effekt på dopaminerge nerveceller.

Ytterligere sider og fordeler ved oppfinnelsen vil være åpenbare for fagkyndige ved betraktning av den påfølgende beskrivelse som gir detaljer for utførelse av foreliggende oppfinnelse.

Kort beskrivelse av figurene

En rekke egenskaper og fordeler ved foreliggende oppfinnelse vil bli åpenbaret ved gjennomgang av figurene hvor: Figur 1 viser en nukleinsyresekvens (SEKV.ID NR. 1) som koder for moden, human gliacellelinjeavledet, neurotrof faktor (hGDNF). Videre avbildes aminosyresekvensen (SEKV.ID NR. 2) for det modne, humane GDNF-protein. Figur 2 viser skjematisk en plasmidkonstruksjon fremstilt for ekspresjon av rekombinante, avkortede GDNF-proteiner. Figur 3 viser et restriksjonskart over en alternativ nukleinsyresekvens (SEKV.ID NR. 39) som koder for GDNF og avkortede GDNF-polynukleotider. Figur 4 viser et restriksjonskart over nok en annen nukleinsyresekvens (SEKV.ID NR. 40) som koder for GDNF og avkortede GDNF-polynukleotider. Figur 5 viser en nukleinsyresekvens (SEKV.ID NR. 41) som koder for den avkortede GDNF-proteinsubstitusjonsvariant [Pro23-Lys37 Asn37-Ile134] (SEKV.ID NR. 42). Dette protein kan også beskrives som en addisjons/substitusjonsvariant av avkortet GDNF-protein, Met-Ser- [Pro23-Lys37 Asn<37->Ile134]. Figur 6 viser en nukleinsyresekvens (SEKV.ID NR. 43) som koder for et avkortet GDNF-protein, [Arg<32->Ile<134>] (SEKV.ID NR. 44). Figur 7 viser en nukleinsyresekvens (SEKV.ID NR. 45) som koder for et avkortet GDNF-protein, [Gly<33->Ile<134>] (SEKV.ID NR. 46). Figur 8 viser aminosyresekvensen til moden hGDNF (SEKV.ID NR. 47) sammenlignet med flere eksempler på avkortede

GDNF-proteiner: Met-[Arg<32->Ile<134>] (SEKV.ID NR. 48), Met-[Gly33-Ile<134>] (SEKV.ID NR. 49) og Met-Ser-[Pro<23->Lys<37>Asn<37->Ile<134>]

(SEKV.ID NR. 50).

Detaljert beskrivelse av oppfinnelsen

Human, gliacellelinjeavledet, neurotrof faktor (hGDNF) syntetiseres som en forløper som prosesseres og ut-skilles som et modent protein på 134 aminosyrer. Det ble tidligere fastslått at moden, human GDNF har aminosyresekvensen som er avbildet i figur 1 (SEKV.ID NR. 2) .

Foreliggende oppfinnelse er basert på den uventede oppdagelse at modent GDNF-protein kan reduseres i størrelse (også heri betegnet som et "avklippet" eller "avkortet" protein eller avkortet GDNF-protein) og fortsatt beholde sin biologiske aktivitet. Det avklippede protein ble først oppdaget ved rekombinant fremstilling av GDNF i "Chinese hamster ovary"-celler (CHO-celler). Kort beskrevet ble rekombinant, human GDNF (rhGDNF) fremstilt som følger. En nukleinsyresekvens som kodet for hele den åpne leseramme for det modne, humane GDNF-protein, ble klonet i et ekspresjonsplasmid. Nukleinsyresekvensen ble bekreftet å være korrekt (ved DNA-sekvensering som ekvivalent med hGDNF-sekvensen i GeneBank) og ble translatert til en aminosyresekvens som var identisk med den publiserte sekvens til moden, human GDNF (Lin et al., Science 260, 1130-1132, 1993). Plasmid-DNA ble linearisert og transfektert inn i dihydrofolatreduktasedefisiente CHO-celler (CHOd"-celler) ved å benytte kalsiumfosfatutfellingsfremgangsmåten. De transfekterte cellene ble dyrket i et selektivt medium, og kolonier som overlevde seleksjonsprosessen, ble utvalgt for enkeltvis analyse av hGDNF-ekspresjon.

Serumfritt, kondisjonert medium fra enkeltklonene ble oppsamlet og behandlet ved Western blot-analyse med antiserum spesifikt for hGDNF. De benyttede antisera omfattet polyklonale antistoffer fra kanin fremstilt fra kaniner immunisert med rekombinant hGDNF uttrykt i Escherichia coli. Under reduserende betingelser ble hGDNF som forelå i disse prøver, atskilt i to hovedbånd med tilsynelatende molekylvekt på tilnærmet 22 kDa, hhv. 18 kDa. Hvert bånd besto av to nær hverandre lig- gende bånd på tilnærmet 22 + 22,5 kDa, hhv. 18 + 17,5 kDa (for enkelhets skyld vil disse dobbeltbånd betegnes som 22 kDa-båndet eller -arten og 18 kDa-båndet eller -arten).

GDNF var tidligere rapportert å foreligge som en homodimer sammenbundet med disulfidbroer som besto av to identiske subenheter av det modne GDNF-protein med molekylvekt på tilnærmet 20 til 22 kDa. Når GDNF ble analysert under ikke-reduserende betingelser, ble det rapportert at et bredt bånd på 32 til 42 kDa (Lin et al., Science 260, 1130-1132, 1993) eller til 45 kDa (Lin et al., J. Neurochem. 63( 2), 758-768, 1994) kunne identifiseres. Forekomsten av dette molekylvektom-råde ble tolket til å skyldes glykosyleringsheterogenitet blant de modne monomerer, noe som ble ytterligere understøttet av deglykosyleringseksperimenter.

Mens det foreliggende 22 kDa-bånd tilsvarer det modne GDNF-protein som er rapportert i litteraturen, er 18 kDa-båndet ikke tidligere beskrevet. De relative mengder av 22 kDa-protein og 18 kDa-protein varierte i prøver oppsamlet fra enkeltkloner. I tillegg ble det funnet at gjentatt pro-teinisolering fra samme klon viste et variabelt forhold mellom disse to bånd. Det ble videre funnet at lagring av CHO-uttrykt GDNF-protein ofte førte til økt forekomst av 18 kDa-båndet med en tilsvarende reduksjon av 22 kDa-båndet.

Ved analyse av kondisjonert medium fra de transformerte CHOd"-celler under ikke-reduserende betingelser ved Western-blotting, ble tre godt atskilte bånd med tilsynelatende molekylvekter på 36, 40 og 44 kDa observert. Dette funn var heller ikke i overensstemmelse med tidligere rapporter. Den relative intensitet av disse bånd varierte, men samsvarte godt med forholdet mellom de monomere 22 kDa-bånd og 18 kDa-bånd som forelå i hver av prøvene. Ved videre analyse med monoklonale antisera ble det fastslått at de tre bånd i den ikke-reduserende gel tilsvarte tre mulige dimerer sammensatt av de to monomerer. Det største protein på 44 kDa er en dimer av to modne GDNF-proteiner på 22 kDa som tidligere rapportert. Det mellomliggende 40 kDa-protein består av en dimer i hvilken ett modent protein har fått molekylvekten redusert til en form på 18 kDa. Den minste dimer på 3 6 kDa inneholder tilsynelat ende to 18 kDa-proteiner, dvs. at begge 22 kDa-former har fått redusert molekylvekt. Disse resultater viser for første gang ikke bare forekomst av en ny form for GDNF-monomer, men også forekomst av det avkortede GDNF-protein i den dimere konfi-gurasjon. Det ble også funnet at ved lagring av prøvene endret monomersammensetningen seg i retning av den avkortede form og den tilsvarende dimertype, dvs. at mengden 36 kDa-protein kunne ses å øke.

Undersøkelser ble så utført for å fastslå hvilken del av proteinet som ble fjernet eller endret for å gi reduksjonen i molekylvekt sammenlignet med det tidligere rapporterte,

modne GDNF-protein. Det ble først fastslått at reduksjonen i molekylvekt ikke skyldtes endringer i glykosylering.

GDNF inneholder to mulige seter for N-koblet glykosylering og er blitt rapportert å være glykosylert. Det avkortede protein er imidlertid ikke en ikke-glykosylert eller underglykosylert form av moden GDNF. Dette ble vist i deglykosyleringseksperimenter hvor prøver ble behandlet med N-glykanase, O-glykanase og neuraminidase. I reduserende geler ble 18 kDa-proteinet redusert til et bånd på 13,5 kDa ved N-gly-kanasebehandling, noe som tyder på nærvær av N-koblet sukker tilsvarende 4,5 kDa. Behandling med neuraminidase og O-glykanase ga en svak forskyvning av 18 kDa-båndet til 17 kDa. Dette tyder på nærvær av O-koblede sukkere på proteinet. Det modne 22 kDa-bånd er rapportert å være glykosylert og ble også redusert til 18 kDa (dvs. også med 4,5 kDa) med N-glykanase. Dette ble ytterligere bekreftet ved anvendelse av et monoklon-alt antistoff som er spesifikt for 22 kDa-båndet i gelen. Gly-kanasekløyvingsmønsteret for den ikke-reduserte dimer var mer komplisert, men kunne tolkes og var i samsvar med den opprin-nelige angivelse av de tre former.

Som en følge av dette ble reduksjonen i molekylvekt

av proteinet på 4,5 kDa sett som et resultat av delesjon av tilnærmet 30-35 aminosyrerester snarere enn endringer i glykosylering. Delesjonen var forventet å mest sannsynlig foreligge ved aminoenden til det modne GDNF-protein av følgende grunner. Moden GDNF inneholder totalt 7 cysteiner. Dersom delesjonen var fra karboksylenden, ville 2 til 4 av de 7 cysteiner"mis-

tes, og dette ville mest sannsynlig føre til et inaktivt protein. Når en analyseprøve som besto av hovedsakelig den avkortede form ble analysert for å måle dens neurotrofe aktivitet på dopaminerge neuroner, viste prøven imidlertid tilsvarende aktivitet som en prøve som inneholdt mer av den modne form av

GDNF.

Kløyvingssetet ble så bestemt ved aminosyresekvens-analyse av det rensede protein. Prøvene ble sekvensert ifølge produsentens instruksjoner ved benyttelse av et Applied Bio-systems 494A-proteinsekvenseringsinstrument i 10 sykluser. Selv om aminosyresekvensanalyseteknikker og fremgangsmåter for dette er velkjent blant fagfolk, .tilveiebringes ytterligere beskrivelser av sekvensering av proteiner i Fausset et al., Electrophoresis 12:22-27, 1991 og i US patentsøknad nr.

576 316, innlevert 24. august 1990 (europeisk patentsøknad nr. 90310899, publikasjonsnr. EP 423 980, innlevert 4. oktober 1990 under tittelen "Stamcellefaktor"). Ved analyse ble det fastslått at aminoenden til det avkortede protein var "RGQRGK" eller Arg-Gly-Gln-Arg-Gly-Lys. Følgelig var de 31 første aminosyrene blitt fjernet fra det modne protein i de kondisjonerte medier. Den gjenværende aminosyresekvens til det avkortede protein, med start ved aminosyre Arg<32>, var ellers i samsvar med aminosyresekvensen til moden GDNF avbildet i figur 1 (SEKV.ID NR. 2).

Det avkortede GDNF-protein [Arg<32->Ile<134>] ble funnet å være aktivt, kvalitativt sett, i en analyse med dopaminerge neuroner. Analyse av den dopaminerge, neurotrofe aktivitet benyttes for identifisering av neurotrofe faktorer som kan være gunstige ved behandling av Parkinsons sykdom. Analysen bygger på en tidligere beskrevet analyse (Friedman et al., Neuro. Sei. Lett. 79:65-72, 1987) og kan omfatte modifikasjoner som beskrevet i Lin et al. (se US patentsøknad nr. 08/182 183, innlevert 23. mai 1994, og dennes opphavssøknader: PCT/US92/07888, innlevert 17. september 1992 (WO 93/06116) og europeisk patentsøknad nr. 92921022.7 (publikasjonsnr. EP

610 254)). En detaljert beskrivelse av analysen tilveiebringes i eksempel 5 nedenfor.

En påfølgende rensefremgangsmåte, fulgt av aminosyre- sekvensering, førte til oppdagelsen av et annet protein i hvilket de 36 første aminosyrer var blitt fjernet fra N-enden

i moden GDNF: et avkortet GDNF-protein [Lys<37->Ile<134>] med den N-terminale sekvens KNRG(C)VL--. Igjen var de gjenværende aminosyrerester i det avkortede protein ellers i samsvar med aminosyresekvensen til moden, human GDNF. Det avkortede GDNF-protein [Lys<37->Ile<134>] ble også analysert ved dopaminopptaks-bio-analysen. Dette avkortede GDNF-protein ble funnet å være aktivt med en ED50på tilnærmet 50 pg/ml, tilsvarende den til renset, rekombinant E. coli-uttrykt, moden GDNF.

Det ble videre oppdaget at bakterielt uttrykt, moden GDNF kunne endres til en avkortet form. Moden GDNF uttrykt i transformert E. coli (som beskrevet i Lin et al., US patent-søknad nr. 08/182 183, supra), ble inkubert med CHO-avledet, kondisjonert medium. Rekombinant E. coli-GDNF har en tilsynelatende molekylvekt på 17 kDa i en reduserende gel. Dersom materialet blandes med CHO-cellekondisjonert medium og inku-beres i 5 dager ved 4 °C, avkortes proteinet fullstendig til

12,5 kDa. Denne kløyving var mindre fullstendig med en inkuba-sjonstid på 1 time eller 24 timer, noe som tyder på en tidsav-hengig prosess under slike betingelser. Det ble også funnet at en enkel inkubering av rekombinant E. coli-GDNF over natten

med medium tilsatt 0,1% føtalt, bovint serum, ikke ga dannelse av den avkortede form. Nærvær av levende celler i kulturen ser således ut til å være nødvendig for at avkortingsprosessen skal foregå. Det er derfor mulig at avkortingsbegivenheten også foregår in vivo i visse vev.

I tillegg ble det funnet at derivater av moden E. coli-uttrykt hGDNF, f.eks. pegylert GDNF (også beskrevet i Lin et al., US patentsøknad nr. 08/182 183, supra) kan prosesseres til en avkortet form i nærvær av CHO-avledet, kondisjonert medium. Moden GDNF kan pegyleres ved aminoenden for å øke hal-veringstiden i sirkulasjonen. Pegylering øker proteinets stør-relse, og det modifiserte, modne GDNF migrerer ved tilnærmet 45 kDa under reduserte betingelser. Som for den ikke-pegylerte, modne form førte inkubering av pegylert E. coli-GDNF med kondisjonert medium fra CHO-celler (ikke-transfekterte) til dannelse av et bånd på 12,5 kDa. I begge tilfeller forelå

12,5 kDa-typen som en disulfidsammenbundet dimer som vist i ikke-reduserende geler. Dannelsen av denne avkortede form fra det N-terminalt pegylerte, modne protein viste videre at av-kort ingsbegivenhe ten foregikk ved proteinets N-ende da den pegylerte aminosyrerest gikk tapt under avkortingsprosessen.

Basert på disse funn, og da avkortingsbegivenheten også kan tenkes å foregå in vivo, kan en avkortet form av GDNF-proteinet være den endelige, naturlig prosesserte form av hGDNF under fysiologiske betingelser. Det ble derfor betraktet som fordelaktig å fremstille et avkortet GDNF-protein, eller et derivat av dette, for terapeutisk anvendelse. For eksempel ville et direkte uttrykt eller syntetisert, avkortet GDNF-protein, f.eks. det avkortede GDNF-protein [Arg32-I le134] , forventes å være resistent overfor den ovenfor beskrevne proteolyt-iske aktivitet. Videre ville, dersom det var ønskelig å fremstille et avkortet GDNF-derivat, f.eks. et pegylert, avkortet GDNF-protein [Arg32-Ile134] , det resulterende derivat forventes å ha den fordel at det ikke var følsomt overfor den spesifikke avkorting som kunne observeres med det modne GDNF-derivat.

Ytterligere fordeler kan også forventes for avkortede GDNF-proteinprodukter. For det første vil pl for et avkortet protein, f.eks. det avkortede GDNF-protein [Arg32-I le134] , reduseres fra tilnærmet 10 til tilnærmet 8,0-8,5. Dette gjør proteinet vesentlig mindre basisk, noe som i sin tur kunne gi fordelaktige virkninger, heriblant bedre reseptorbinding og redusert cytotoksisitet ved tilføringsstedet, f.eks. et intra-tekalt injeksjonssete. For det andre ligger det to deamideringsseter innen de 26 første aminosyrer i aminosyresekvensen til moden GDNF: Arg-Asn-Arg (aminosyrene 14-16) og Glu-Asn-Ser (aminosyrene 24-26). Fravær av ett eller begge av disse seter i et avkortet GDNF-protein forventes å forhøye proteinets stabilitet.

Avkortede GDNF- proteinprodukter

I en grunnleggende utførelse kan de avkortede GDNF-proteiner ifølge foreliggende oppfinnelse representeres ved den påfølgende aminosyresekvens hvor aminosyrerestnummerer-ingsskjemaet i figur 1 benyttes for å lette sammenligning med modent GDNF-protein:

hvori

[Cys<41->Cys<133>] står for aminosyresekvensen fraCys<41>til Cys<1>" som avbildet i figur 1 (SEKV.ID NR. 2),

Y står for den terminale karboksygruppe i Cys133 eller en karboksyterminal aminosyrerest, Ile"<4>, og

Som benyttet heri, omfatter begrepet "avkortet GDNF-proteinprodukt" biologisk aktive, syntetiske eller rekombinante, avkortede GDNF-proteiner, avkortede GDNF-proteiner fremstilt fra moden GDNF, biologisk aktive, avkortede GDNF-varianter (heriblant insersjonsvarianter, substitusjonsvarianter og delesjonsvarianter) og kjemisk modifiserte derivater av disse. Videre omfattes avkortede GDNF-proteiner som i det vesentlige er homologe med det humane GDNF-protein med aminosyresekvensen beskrevet i SEKV.ID NR. 2.

Begrepet "biologisk aktiv" som det benyttes heri, betyr at det avkortede GDNF-protein viser tilsvarende neurotrofe egenskaper, men ikke nødvendigvis alle de samme egenskaper, og ikke nødvendigvis i samme grad, som GDNF-proteinet med aminosyresekvensen beskrevet i SEKV.ID NR. 2. Utvelgelse av de spesielle, neurotrofe egenskaper av interesse avhenger av anvendelsen for hvilken det avkortede GDNF-proteinprodukt tilføres. De avkortede GDNF-proteinprodukter er biologisk aktive og viser overlevelsesegenskaper for dopaminerge neuroner som tilsvarer dem som vises av modent GDNF-protein ved å benytte evaluering av dopaminopptak og tyrosinhydroksylase(TH)-ekspresjon som et eksempel på en bioanalyse, som beskrevet i eksemplene nedenfor.

Begrepet "i det vesentlige homolog" som benyttet her, betyr en homologigrad sammenlignet med det humane GDNF med aminosyresekvensen beskrevet i SEKV.ID NR. 2 som fortrinnsvis er høyere enn 70%, mest foretrukket høyere enn 80%, og enda mer foretrukket høyere enn 90%, eller til og med 95%. Prosent homologi som beskrevet heri, beregnes som prosent aminosyrerester som foreligger i den kortere av de to sekvenser som kan oppstilles med identiske aminosyrerester i sekvensen som sam-menlignes, når fire gap i en lengde på 100 aminosyrer kan inn-føres for å lette oppstillingen, som beskrevet av Dayhoff i Atlas of Protein Sequence and Structure, bind 5, s. 124

(1972), National Biochemical Research Foundation, Washington, D.C. Videre omfattet som i det vesentlige homologt er ethvert avkortet GDNF-protein som kan isoleres på grunnlag av kryss- reaktivitet med antistoffer rettet mot GDNF ifølge SEKV.ID NR. 2 og hvis gener kan isoleres ved hybridisering med genet eller segmenter av genet som koder for GDNF ifølge SEKV.ID NR. 1. I det vesentlige homologe proteiner vil, sfl» o.m det vil være åpenbart for fagfolk ved gjennomlesning av foreliggende beskrivelse, omfatte én eller flere delesjoner fra eller addisjoner eller substitusjoner til, aminosyrerestene i det avkortede GDNF-protein som representeres ved X-[Cys<41->Cys133]-Y. Fremstilling av slike varianter beskrives mer detaljert nedenfor. Det vil videre forstås at da foreliggende oppfinnelse tydelig gjelder "avkortede" GDNF-proteiner, omfattes aminoterminale addisjonsvarianter som omfatter addering av en metion-inrest eller en ikke-GDNF-aminosyrerest eller -sekvens, mens addering av en aminosyrerest eller aminosyrerester som ville føre til rekonstruksjon av det modne GDNF-protein, ikke omfattes. Avkortede GDNF-proteiner basert på naturlig forekommende alleliske mutanter eller varianter, ligger også innenfor foreliggende oppfinnelses område. Fremstilling av avkortede GDNF-proteinvarianter beskrives mer detaljert nedenfor. Lin et al. (US patentsøknad nr. 08/182 183, supra) beskrev avkorting av moden GDNF ved karboksylenden ved proteolytisk prosessering av Lys-Arg-restene som er sjette, hhv. femte aminosyrerest fra den karboksyterminale ende av moden GDNF (dvs. Lys<129->Arg130 ifølge aminosyrerestnummereringen i figur 1 (likeså i SEKV.ID NR. 1 eller SEKV.ID NR. 2)). En slik avkorting vil fjerne to cysteinrester fra det modne GDNF-protein. Dette vil sannsynligvis føre til ukorrekt folding av proteinet og følgelig føre til dannelse av et inaktivt protein. I motsetning til dette bibeholder de avkortede GDNF-proteinprodukter X- [Cys41-Cys133] -Y ifølge foreliggende oppfinnelseCys13<1->og Cys<133->restene og er aktive proteiner som bestemt ved dopaminopptaksanalyse. I én utførelse av foreliggende oppfinnelse mangler foretrukne, avkortede GDNF-proteinprodukter ett eller flere deamideringsseter. Denne mangel på deamideringsseter ville føre til forhøyet biokjemisk stabilitet av det rensede protein og redusert antall degraderingsprodukter, noe som ville føre til et mer lagringsstabilt protein. Et eksempel på et avkortet GDNF-proteinprodukt er det avkortede GDNF-protein [Ser26-Ile134]som mangler setene som ellers ville føre til deamidering av det modne protein. Alternativt ville det avkortede GDNF-protein [Arg<16->Ile<134>] mangle i det minste det første deamiderings-sete som ellers foreligger i det modne protein. Et for tiden foretrukket, avkortet GDNF-proteinprodukt er det avkortede GDNF-protein [Arg32-Ile134] . Dette avkortede GDNF-protein mangler setet i eller nær hvilket proteolytisk kløyving av det modne protein skjer. Dette avkortede GDNF-protein forventes derfor å være resistent overfor prosesser-ingsbegivenheten som også kan tenkes å skje in vivo. Et annet for tiden foretrukket, avkortet GDNF-proteinprodukt er det avkortede GDNF-protein [Lys37-Ile134] . Denne avkorting vil redusere pl for det avkortede protein ytterligere, i likhet med andre avkortinger hvor aminosyrerester opp til og innbe-fattet Gly<40>og Ile<134>fjernes fra N-terminalen, hhv. C-terminalen. De for tiden mest foretrukne, avkortede GDNF-proteinprodukter bibeholder alle cysteinrestene som finnes i modent GDNF-protein, men mangler alle påvisbare seter for hurtig proteolytisk prosessering av det avkortede GDNF-protein under ekspresjon og fremstilling eller etter in vivo tilførsel. Disse foretrukne proteiner omfatter de avkortede GDNF-proteinprodukter [Arg32-Ile134] , [Gly33-Ile134] , [Gln34-Ile134] ,[Arg3S-Ile134] , [Gly36-Ile134] , [Lys37-Ile134] , [Asn38-Ile134] og [Arg<39->Ile<134>].På samme måte som for resultatene tidligere beskrevet for moden GDNF av Lin et al. (US patentsøknad nr. 07/855 413, supra), har de avkortede GDNF-proteiner ifølge foreliggende oppfinnelse vist evnen til å forhøye dopaminopptaket av de embryonale forløpere for de dopaminerge neuroner i substantia nigra. Bioanalyser av de avkortede GDNF-proteiner er videre beskrevet i eksempel 4 nedenfor. De nye, avkortede GDNF-proteiner isoleres og renses typisk slik at det oppnås avkortede GDNF-proteiner som i det vesentlige er fri for nærvær av andre (ikke-GDNF) protein-holdige forbindelser. De avkortede GDNF-proteinprodukter er fortrinnsvis tilnærmet 80% fri for andre proteiner som kan foreligge grunnet fremstillingsteknikken som benyttes ved fremstilling av det avkortede GDNF-proteinprodukt. Mer foretrukket er de avkortede GDNF-proteinprodukter tilnærmet90% fri for andre proteiner, spesielt foretrukket tilnærmet 95% fri for andre proteiner, og mest foretrukket tilnærmet >98% fri for andre proteiner. I tillegg gir foreliggende oppfinnelse den enestående fordel at det tilveiebringes polynuk-leotidsekvenser for fremstilling av homogene, avkortede GDNF-proteiner. For eksempel tillater anvendelse av polynukleotid-sekvensen som koder for det avkortede GDNF-protein [Arg<12->Ile134] , rekombinant fremstilling av det avkortede GDNF-protein i E. coli og andre egnede ekspresjonssystemer. Med andre ord tillater de nye polynukleotider fremstilling av avkortede GDNF-proteiner som ikke er utsatt for proteolytisk prosessering, eller som har redusert følsomhet overfor slik prosessering eller andre biokjemiske prosesseringseffekter som beskrevet ovenfor. Således gjør de nye polynukleotider det enklere å fremstille og/eller isolere enkeltutgaver av avkortede GDNF-proteiner, og de avkortede GDNF-proteiner og/eller produktene av disse inneholder derfor ikke den ovenfor beskrevne blanding av hetero- og homodimerer, eller kun reduserte mengder av disse. Det vil imidlertid forstås at de endelige avkortede GDNF-proteinprodukter kan kombineres med andre faktorer, kjemiske preparater og/eller egnede, farmasøytiske utformingsstoffer før tilførsel, som beskrevet mer detaljert nedenfor. I én utførelse av foreliggende oppfinnelse fremstilles de avkortede GDNF-proteiner fordelaktig ved rekombinante teknikker da disse kan gi relativt høyere mengder protein med større renhet. Rekombinante, avkortede GDNF-proteinformer omfatter glykosylerte og ikke-glykosylerte former av proteinet og protein uttrykt i bakteriecellesystemer, pattedyrcellesys-temer eller insektcellesystemer. Alternativt kan de avkortede GDNF-proteiner syntetiseres kjemisk. For tiden foretrukne fremstillingsfremgangsmåter er beskrevet mer i detalj nedenfor.

Avkortede GDNF- varianter og - derivater

A. Avkortede GDNF- varianter

En annen utførelse av foreliggende oppfinnelse omfatter varianter av avkortet GDNF-protein. Begrepet "avkortede GDNF-proteinprodukter" som det benyttes heri, omfatter vari-antproteiner i hvilke aminosyrer er blitt delert fra ("delesjonsvarianter"), innsatt i ("addisjonsvarianter") eller erstatter ("substitusjonsvarianter") aminosyrerester i aminosyresekvensen til naturlig forekommende GDNF. Slike varianter fremstilles ved å innføre passende nukleotidendringer i DNA som koder for proteinet eller ved kjemisk syntese in vitro av det ønskede protein. Fagfolk vil forstå at mange kombinasjoner av delesjoner, insersjoner og substitusjoner kan utføres så lenge som det endelige protein besitter GDNF-biologisk aktivitet .

Mutageneseteknikker for erstatning, insersjon eller delesjon av én eller flere utvalgte aminosyrerester er velkjent blant fagfolk (f.eks. US patentskrift nr. 4 518 584). Det er to prinsipielle variabler ved konstruksjon av amino-syresekvensvarianter: plasseringen av mutasjonssetet og typen mutasjon. Ved utforming av avkortede GDNF-varianter vil plasseringen av mutasjonssetet og typen mutasjon avhenge av de biokjemiske egenskaper som skal modifiseres. Mutasjonssetene kan modifiseres enkeltvis eller i serie, f.eks. ved (1) først å erstatte med konservative aminosyrevalg og deretter med mer radikale valg avhengig av de oppnådde resultater, (2) delering av målaminosyreresten, eller (3) innsetting av aminosyrerester i nabostilling til det lokaliserte sete.

Aminosyresekvensdelesjoner ligger generelt i området fra tilnærmet 1 til 30 aminosyrerester, mer vanlig fra tilnærmet 1 til 10 aminosyrerester, og typisk fra tilnærmet 1 til 5 aminosyrerester. For eksempel kan delesjoner i "X"-delen med aminosyrerester plassert N-terminalt for Cys<41>, variere fra tilnærmet 1 til 30 aminosyrerester, mens delesjoner mellom cysteinrestene i [Cys<41->Cys133]typisk er fra tilnærmet 1 til 5 aminosyrerester, avhengig av plasseringen, slik at protein-foldingen ikke forstyrres. Delesjoner i de avkortede GDNF-proteiner kan utføres i områder med lav homologi med transformer- ende vekstfaktor-beta(TGF- )familiemedlemmer. Delesjoner fra avkortede GDNF-proteiner i områder med vesentlig homologi med andre TGF- -familiesekvenser vil mer sannsynlig modifisere den biologiske aktivitet i større grad. Antallet totaldelesjoner og/eller på hverandre følgende delesjoner vil utvelges slik at tertiærstrukturen til det avkortede GDNF-protein bevares i det påvirkede domene, f.eks. cysteinkryssbinding.

Aminosyresekvensaddisjoner kan omfatte amino-og/eller karboksylterminale fusjoner som varierer i lengde fra 1 aminosyrerest til 100 eller flere aminosyrerester, så vel som interne insersjoner av enkeltaminosyrerester eller flere aminosyrerester i sekvensen. Interne addisjoner kan generelt variere fra tilnærmet 1 til 10 aminosyrerester, mer typisk fra tilnærmet 1 til 5 aminosyrerester, og vanligvis fra tilnærmet 1 til 3 aminosyrerester. Som beskrevet ovenfor, vil de aminoterminale addisjonsvarianter av foreliggende oppfinnelse omfatte addisjon av et metionin (f.eks. som en artefakt grunnet direkte ekspresjon av GDNF i cellekultur med rekombinante bakterier) eller en ikke-GDNF-aminosyrerest eller -sekvens. Aminoterminale addisjonsvarianter omfatter ikke addisjon av én eller flere aminosyrerester som ville føre til rekonstruksjon av det modne GDNF-protein. Nok et eksempel på en terminal insersjon omfatter fusjon av en heterolog, N-terminal signalsekvens til aminoenden for å lette sekresjon av proteinet fra rekombinante vertsceller. Slike signalsekvenser vil generelt erholdes fra, og således være homologe med, den forventede vertscelleart. Insersjoner eller addisjoner kan også omfatte aminosyresekvenser avledet fra sekvensen til andre neurotrofe faktorer.

En annen gruppe varianter er aminosyresubstitusjons-varianter. I disse varianter er minst én aminosyrerest fjernet fra det avkortede GDNF-protein og en forskjellig aminosyrerest innsatt i stedet. Se f.eks. figur 5 hvori naturlig forekommende Asn<22>ble endret til Ser for å lette videre fjerning av Met-resten. Ved å benytte X- [Cys41-Cys133] -Y-aminosyresekvens-fremstillingen og den foreliggende definisjon av avkortede GDNF-proteinprodukter vil et således avkortet GDNF-protein betegnes enten som en substitusjonsvariant av et avkortet GDNF-protein Met-[Asn" Ser"-Ile<1>"], eller en addisjonsvariant av et avkortet GDNF-protein, Met-Ser- [Pro"-Ile134] . Substitusjonsvarianter omfatter alleiiske varianter som særpreges ved naturlig forekommende nukleotidsekvensendringer i artspopula-sjonen som enten fører til en aminosyreendring eller ikke gjør det.

Spesifikke mutasjoner i sekvensene til de avkortede GDNF-proteiner kan omfatte modifiseringer av et glykosyler-ingssete (f.eks. serin, treonin eller asparagin). Fravær av glykosylering eller kun delvis glykosylering kan være en følge av aminosyresubstitusjon eller -delesjon i ethvert asparaginkoblet glykosyleringsgjenkjenningssete eller i ethvert sete i proteinet som modifiseres ved tilkobling av et O-koblet kar-bohydrat. Et asparaginkoblet glykosyleringsgjenkjenningssete omfatter en tripeptidsekvens som gjenkjennes spesifikt av egnede, cellulære glykosyleringsenzymer. Disse tripeptidsekvenser er enten Asn-Xaa-Thr eller Asn-Xaa-Ser, hvor Xaa kan være enhver aminosyre bortsett fra Pro. En rekke aminosyresubstitu-sj oner eller -delesjoner i første eller tredje aminosyreposi-sjon eller begge i et glykosyleringsgjenkjenningssete {og/eller aminosyredelesjon i posisjon 2) fører til ikke-glykosylering av den modifiserte tripeptidsekvens. Således gir ekspresjon av passende endrede nukleotidsekvenser varianter som ikke er glykosylert i dette sete. Alternativt kan sekvensen modifiseres slik at det innføres glykosyleringsseter i det avkortede GDNF-protein.

Én fremgangsmåte for å identifisere aminosyrerester eller områder i avkortet GDNF for mutagenese betegnes "alanin-søkmutågenese" som beskrevet av Cunningham og Wells {Science, 244:1081-1085, 1989). I denne fremgangsmåte identifiseres en aminosyrerest eller en gruppe av målaminosyrerester (f.eks. ladede aminosyrerester som Arg, Asp, His, Lys og Glu) og erstattes med en nøytral eller negativt ladet aminosyre (fortrinnsvis alanin eller polyalanin) for å påvirke interaksjonen av aminosyrene med det omliggende, vandige miljø i eller uten-for cellen. De domener som viser funksjonell sensitivitet overfor substitusjonene, raffineres så ved innføring av ytterligere aminosyrerester eller alternative aminosyrerester i

substitusjonssetene. Således bestemmes setet for innføring av en aminosyresekvensmodifisering, og for optimalisering av virkningen av en mutasjon i et gitt sete kan alaninsøk eller tilfeldig mutagenese utføres, hvoretter variantene gjennom-søkes for den optimale kombinasjon av ønsket aktivitet og ak-tivitetsgrad.

Setene som er mest interessante for substitusjons-mutagenese, omfatter seter hvor aminosyrene som foreligger i GDNF-proteiner fra forskjellige arter, er vesentlig forskjellige med hensyn til sidekjedevolum, ladning og/eller hydro-fobisitet. Andre seter av interesse omfatter de seter i hvilke aminosyrerester i GDNF-lignende proteiner erholdt fra forskjellige arter, er identiske. Slike posisjoner er generelt viktige for et proteins biologiske aktivitet. I første omgang modifiseres disse seter ved substitusjon på en relativt kon-servativ måte. Slike konservative substitusjoner er vist i tabell 1 i søylen med tittelen foretrukne substitusjoner. Dersom slike substitusjoner fører til endret biologisk aktivitet, innføres mer vesentlige endringer (eksempler på substitusjoner) og/eller andre addisjoner/delesjoner kan utføres, og de resulterende produkter undersøkes.

Konservative modifikasjoner av aminosyresekvensen (og de tilsvarende modifikasjoner i de kodende nukleinsyresekvenser) forventes å gi avkortede GDNF-proteiner med funksjonelle og kjemiske egenskaper som ligner dem til de avkortede GDNF-proteiner som beskrives i eksemplene nedenfor. I motsetning til dette kan vesentlige modifikasjoner i de funksjonelle og/eller kjemiske egenskaper til avkortede GDNF-pro teiner oppnås ved å utvelge substitusjoner som avviker vesentlig i sin virkning når det gjelder bibeholdelse av (a) struk-turen til polypeptidryggraden i substitusjonsområdet, f.eks. i platekonformasjon eller helikskonformasjon, (b) ladningen eller hydrofobisiteten til proteinet i målsetet, eller (c) volumet av sidekjeden. Naturlig forekommende aminosyrerester inndeles i grupper basert på felles sidekjedeegenskaper: 1) hydrofobe: norleucin, Met, Ala, Val, Leu, Ile; 2) nøytrale, hydrofile: Cys, Ser, Thr; 3) sure: Asp, Glu; 4) basiske: Asn, Gin, His, Lys, Arg; 5) aminosyrerester som påvirker kjedeorientering: Gly, Pro og

6) aromatiske: Trp, Tyr, Phe.

Ikke-konservative substitusjoner kan omfatte utbyt-ting av et medlem av én av disse klasser med et annet. Slike substituerte aminosyrerester kan innføres i områder i de avkortede GDNF-proteiner som er homologe med andre TGF- -proteiner eller i de ikke-homologe områder i proteinet.

B. Avkortede GDNF- derivater

Kjemisk modifiserte derivater av avkortet GDNF eller avkortede GDNF-varianter kan fremstilles av en fagmann ut fra beskrivelsene heri. De kjemiske rester som er mest egnet for derivatisering av avkortede GDNF-proteineromfatter vannløse-lige polymerer. En vannløselig polymer er ønskelig da proteinet til hvilket den er koblet, ikke vil utfelles i vandig miljø, f.eks. i et fysiologisk miljø. Polymeren vil fortrinnsvis være farmasøytisk aksepterbar for fremstilling av et terapeutisk produkt eller preparat. Fagfolk vil kunne utvelge den ønskede polymer basert på betraktninger som hvorvidt polymer/proteinkonjugatet vil benyttes terapeutisk, og hvis så, den ønskede dose, sirkulasjonstiden, proteolyseresistens og andre betraktninger. Effektiviteten av derivatiseringen kan bekreftes ved å tilføre derivatet i den ønskede form (dvs. ved en osmotisk pumpe eller, mer foretrukket, ved injeksjon eller infusjon, eller videre utformet for oral eller pulmonal til-førsel eller via andre tilførselsveier) og bestemmelse av ef-

fektiviteten.

Egnede, vannløselige polymerer omfatter, men er ikke begrenset til, polyetylenglykol (PEG), kopolymerer av etylen-glykol/propylenglykol, monometoksypolyetylenglykol, karboksy-metylcellulose, dekstran, polyvinylalkohol, polyvinylpyrroli-don, poly-1, 3-dioksolan, poly-1,3,6-trioksan, etylen/malein-syreanhydridkopolymer, polyaminosyrer (enten homopolymerer eller tilfeldige kopolymerer), poly(n-vinylpyrrolidon)polyetylenglykol , propylenglykolhomopolymerer, propylenoksid/etyl-enoksidkopolymerer, polyoksyetylerte polyoler (f.eks. glyser-ol) , polyetylenglykolpropionaldehyd og blandinger av disse. Som benyttet heri, er polyetylenglykol ment å omfatte enhver av de PEG-former som er blitt benyttet til derivatisering av andre proteiner, f.eks. mono-(C^-Cj^)-alkoksy- eller aryloksy-polyetylenglykol. Polyetylenglykolpropionaldehyd kan ha fordeler under fremstillingen grunnet stabilitet i vann. Polymeren kan ha enhver molekylvekt og kan være forgrenet eller uforgrenet.

Foreliggende oppfinnelse gjelder spesielt avkortede GDNF-proteinprodukter hvor et avkortet GDNF-protein er koblet til minst ett PEG-molekyl. I en annen utførelse gjelder foreliggende oppfinnelse avkortet GDNF-protein koblet til minst ett PEG-molekyl via en acylbinding eller en alkylbinding.

Pegylering kan utføres ved enhver av pegyleringsreaksjonene som er kjent innen faget. Se f.eks. Focus on Growth Factors 3(2):4-10 (1992); EP 0 154 316; EP 0 401 384 og Malik et al., Exp. Hematol. 20:1028-1035 (1992) (som rapporterer pegylering av GM-CSF ved å benytte tresylklorid). Pegyleringen utføres fortrinnsvis via en acyleringsreaksjon eller en alkyl-eringsreaksjon med en reaktiv, vannløselig polymer. Disse foretrukne midler for derivatisering diskuteres mer detaljert nedenfor. For acyleringsreaksjonene har den eller de utvalgte polymerer fortrinnsvis en enkelt reaktiv estergruppe. For de reduktive alkyleringsreaksjoner har den eller de utvalgte polymerer fortrinnsvis en enkelt reaktiv aldehydgruppe. I tillegg kan den utvalgte polymer modifiseres slik at den har en enkelt reaktiv gruppe, f.eks. en aktiv ester for acylering eller et aldehyd for alkylering, slik at polymeriseringsgraden kan kontrolleres. Generelt vil den vannløselige polymer ikke utvelges blant naturlig forekommende glykosylrester da disse vanligvis fremstilles mer enkelt ved mamma1ske, rekombinante ekspresj onssystemer.

Acylering

I foreliggende oppfinnelse omfatter pegylering ved acylering generelt å la et aktivt esterderivat av polyetylenglykol reagere med et avkortet GDNF-protein. Ethvert kjent eller senere oppdaget, reaktivt PEG-molekyl kan benyttes for utførelse av pegyleringsprosessen. En foretrukket, aktivert PEG-ester er PEG forestret til N-hydroksysuccinimid ("NHS"). Som benyttet heri, er "acylering" ment å omfatte uten be-grensninger følgende typer bindinger mellom et avkortet GDNF-protein og en vannløselig polymer som PEG: amid, karbamat, uretan og lignende. Se Bioconjugate Chem. 5:133-140 (1994). ReaksjonsbetingeIsene kan utvelges blant dem kjent innen pegyleringsfaget eller slike som senere vil bli utviklet, men bør unngå eller begrense utsettelse for reaksjonsbetingelser vedrørende temperatur, løsemiddel og pH-nivåer som ville inak-tivere det avkortede GDNF-protein som skal modifiseres.

Pegylering ved acylering vil generelt føre til et polypegylert, avkortet GDNF-protein hvor -aminogruppene i lysin er pegylert via en acylkoblingsgruppe. Bindingen vil fortrinnsvis være en amidbinding. Videre vil det resulterende produkt fortrinnsvis være i det vesentlige kun {f.eks. >95%) mono-, di- eller tripegylert. Imidlertid kan noen konjugater med høyere pegyleringsgrad dannes i mengder som avhenger av de spesifikke reaksjonsbetingelser som benyttes. Om ønskelig, kan mer rensede pegyleringskonjugater fremstilles fra blandingen ved gjengse renseteknikker, heriblant dialyse, utsalting, ultrafiltrering, ionebytterkromatografi, gelfiltreringskroma-tografi og elektroforese.

Alkylering

I foreliggende oppfinnelse omfatter pegylering ved alkylering generelt å la et terminalt aldehydderivat av PEG reagere med et avkortet GDNF-protein i nærvær av et reduk sjonsmiddel. Pegylering ved alkylering kan også føre til polypegylert, avkortet GDNF-protein. I tillegg kan man manipulere reaksjonsbetingelsene for å fremme pegylering i det vesentlige kun ved -aminogruppen i proteinets aminoende (dvs. et mono-pegylert molekyl). Både for monopegylering og polypegylering kobles PEG-gruppene fortrinnsvis til proteinet via en -CH2-NH-gruppe. Med spesiell henvisning til -CH2-gruppen betegnes denne koblingstype heri som "alkyl"-kobling.

Selektiv, N-terminal, kjemisk modifisering kan oppnås ved reduktiv alkylering som utnytter forskjellen i reaktivitet mellom forskjellige typer primære aminogrupper(lysin sammenlignet med den N-terminale aminogruppe) som er tilgjengelige for derivatisering i et gitt protein. Under egnede reaksjonsbetingelser oppnås i det vesentlige selektiv derivatisering av proteinet ved aminoenden med en karbonylgruppeholdig polymer. For eksempel kan man selektivt pegylere proteinet N-terminalt ved å utføre reaksjonen ved en pH som tillater en å dra fordel av pKa-forskjellene mellom -aminogruppen i lysinrestene og aminogruppen til den N-terminale aminosyrerest i proteinet. Ved slik selektiv derivatisering kontrolleres koblingen av en vannløselig polymer til et protein: konjugeringen med polymeren finner hovedsakelig sted ved proteinets aminoende, og det foregår ingen vesentlig modifisering av andre reaktive grupper, f.eks. aminogruppene i lysinsidekjedene. Når reduktiv alkylering benyttes, har den vannløselige polymer fortrinnsvis en enkelt reaktiv aldehydgruppe for kobling til proteinet. Polyetylenglykolpropionaldehyd som inneholder en enkelt reaktiv aldehydgruppe, kan benyttes.

Foreliggende oppfinnelse omfatter pegylerte, avkortede GDNF-proteiner hvor PEG-gruppen(e) er koblet via acyl-grupper eller alkylgrupper. Som diskutert ovenfor, kan slike avkortede GDNF-proteinprodukter være monopegylerte eller polypegylerte (dvs. inneholdende 2-6, fortrinnsvis 2-5, PEG-grupper). PEG-gruppene er generelt koblet til proteinet via aminosyrenes - eller -aminogrupper, men det omfattes også at PEG-grupper kan kobles til enhver reaktiv gruppe i proteinet som er tilstrekkelig reaktivt til å kunne kobles til en PEG-gruppe under egnede reaksjonsbetingelser. Således kan poly etylenglykol bindes kovalent til et protein via en reaktiv gruppe, f.eks. en fri aminogruppe eller karboksylgruppe.Reak-tive grupper er grupper til hvilke et aktivert PEG-molekyl kan bindes. Aminosyrerester med en fri aminogruppe omfatter lysin-rester og den N-terminale aminosyrerest. Aminosyrerester med en fri karboksylgruppe omfatter asparaginsyrerester, glutamin-syrerester og den C-terminale aminosyrerest. Sulfhydrylgrupper kan også benyttes som reaktiv gruppe for tilkobling av PEG-molekylet. For terapeutiske formål foretrekkes typisk tilkobling til en aminogruppe, f.eks. kobling til N-terminalen eller en lysingruppe. Kobling til aminosyrerester som er viktige for reseptorbinding, bør unngås dersom reseptorbinding er ønskelig.

I én utførelse tilveiebringer foreliggende oppfinnelse et i det vesentlige homogent preparat av et monopoly-mer/avkortet GDNF-proteinkonjugat hvori et polymermolekyl hovedsakelig er blitt koblet kun (dvs. >95%) i et enkelt sete. Nærmere bestemt tilveiebringer foreliggende oppfinnelse også, dersom PEG benyttes, et pegylert, avkortet GDNF-protein som mangler mulige antigene koblingsgrupper og som har PEG-mole-kylet direkte koblet til det avkortede GDNF-protein.

I tillegg kan derivater fremstilles ved å benytte glykosylerte, ikke-glykosylerte eller avglykosylerte, avkortede GDNF-proteiner. Typisk benyttes ikke-glykosylerte, avkortede GDNF-proteiner. For eksempel kan det prokaryotuttrykte, avkortede GDNF-protein [Arg<32->Ile<134>] derivatiseres kjemisk slik at det inneholder mono- eller poly-, f.eks. 2-4, PEG-rester koblet via en acylgruppe eller en alkylgruppe): Generelt kan kjemisk derivatisering utføres under ethvert egnet sett av betingelser som benyttes for å la en biologisk aktiv forbindelse reagere med et aktivert polymermolekyl. Fremgangsmåter for fremstilling av pegylerte, avkortede GDNF-proteiner vil generelt omfatte følgende trinn: (a) å la et avkortet GDNF-protein reagere med polyetylenglykol

(f.eks. en reaktiv PEG-ester eller et aldehydderivat av PEG)

under betingelser hvor det avkortede GDNF-protein blir koblet til én eller flere PEG-grupper, og (b) å erholde reaksjonspro-duktet eller -produktene. Generelt vil de optimale reaksjons-

betingelser for acyleringsreaksjonene bestemmes fra tilfelle til tilfelle, basert på kjente parametrer og det ønskede resultat. For eksempel vil prosent polypegylert produkt være større jo større forholdet mellom PEG og protein er. Det optimale forhold (når det gjelder reaksjonseffektivitet i den forstand at det ikke foreligger store mengder ureagert protein eller polymer) kan bestemmes ut fra faktorer som den ønskede derivatiseringsgrad (f.eks. mono-, di-, tri- osv.), molekylvekten til den utvalgte polymer, hvorvidt polymeren er forgrenet eller uforgrenet, og de benyttede reaksjonsbetingelser.

Reduktiv alkylering for fremstilling av en i det vesentlige homogen populasjon av monopolymer/avkortet GDNF-proteinkonjugat vil generelt omfatte følgende trinn: (a) å la et avkortet GDNF-protein reagere med et reaktivt PEG-molekyl under betingelser for reduktiv alkylering, ved en pH som er egnet for selektiv modifisering av -aminogruppen i det avkortede GDNF-proteins aminoende, og (b) å erholde reaksjonspro-duktet eller -produktene.

For en i det vesentlige homogen populasjon av mono-polymer/avkortet GDNF-proteinkonjugat er reaksjonsbetingelsene for reduktiv alkylering slike som tillater selektiv tilkobling av den vannløselige polymerrest til et avkortet GDNF-proteins aminoende. Slike reaksjonsbetingelser tilveiebringer generelt pKa-forskjeller mellom lysinaminogruppene og -aminogruppen i aminoenden (hvor pKaer den pH ved hvilken 50% av aminogruppene er protonert og 50% ikke er det). pH påvirker også forholdet mellom polymer og protein som bør benyttes. Dersom pH er lavere, vil det generelt være ønskelig med et større overskudd av polymer relativt til protein (dvs. at jo mindre reaktiv den N-terminale -aminogruppe er, jo mer polymer kreves for å oppnå optimale betingelser). Dersom pH er høyere, behøver polymer :proteinforholdet ikke være så stort (dvs. at flere reaktive grupper er tilgjengelige slik at færre polymermolekyler kreves). For foreliggende oppfinnelses formål vil pH generelt ligge i området fra 3-9, fortrinnsvis 3-6.

En annen faktor å ta i betraktning er polymerens molekylvekt. Generelt er det slik at jo større polymerens molekylvekt er, jo færre polymermolekyler kan det settes til proteinet. På tilsvarende måte må forgrening av polymeren tas i betraktning når disse parametrer optimaliseres. Generelt er det slik at jo høyere molekylvekt (eller jo flere forgren-inger) , jo høyere polymer:proteinforhold. Generelt er, for pegyleringsreaksjonene som omfattes heri, den foretrukne, gjennomsnittlige molekylvekt fra tilnærmet 2 kDa til tilnærmet 100 kDa (begrepet "tilnærmet" viser til at i polyetylenglykol-preparater vil noen molekyler veie mer, noen mindre enn den oppgitte molekylvekt). Den foretrukne gjennomsnittsmolekylvekt er tilnærmet S kDa til tilnærmet 50 kDa, spesielt foretrukket er fra tilnærmet 12 kDa til tilnærmet 25 kDa. Forholdet mellom vannløselig polymer og avkortet GDNF-protein vil generelt ligge i området fra 1:1 til 100:1, fortrinnsvis (for polypegylering) 1:1 til 20:1, og (for monopegylering) 1:1 til 5:1.

Ved å benytte betingelsene som er antydet ovenfor, vil reduktiv alkylering tilveiebringe selektiv tilkobling av polymeren til ethvert avkortet GDNF-protein som har en aminogruppe i aminoenden, og tilveiebringe et i det vesentlige homogent preparat av monopolymer/avkortet GDNF-proteinkonjugat. Begrepet "monopolymer/avkortet GDNF-proteinkonjugat" benyttes heri for å betegne et derivat som inneholder et enkelt polymermolekyl koblet til et avkortet GDNF-protein. Monopoly-mer/avkortet GDNF-proteinkonjugatet vil fortrinnsvis ha et polymermolekyl plassert i aminoenden, men ikke på aminogrupper i lysinsidekjeder. Preparatet vil fortrinnsvis inneholde mer enn 90% monopolymer/avkortet GDNF-proteinkonjugat, mer foretrukket mer enn 95% monopolymer/avkortet GDNF-proteinkonjugat, hvor resten av de observerbare proteiner er ikke-reagerte (dvs. protein som mangler polymerresten).

For reduktiv alkylering bør reduksjonsmidlet være stabilt i vandig løsning og fortrinnsvis i stand til kun å redusere Schiff-basen som dannes i den innledende prosess ved reduktiv alkylering. Eksempler på reduksjonsmidler kan utvelges fra gruppen som består av natriumborhydrid, natriumcyan-borhydrid, dimetylaminboran, trimetylaminboran og pyridin-boran. Et spesielt foretrukket reduksjonsmiddel er natrium-cyanborhydrid. Andre reaksjonsparametrer som løsemiddel, reak-sjonstider, temperaturer osv., og midler for rensing av pro dukter, kan bestemmes fra tilfelle til tilfelle basert på vanlig tilgjengelig informasjon når det gjelder derivatisering av proteiner med vannløselige polymerer.

Man kan velge å fremstille en blanding av polymer/proteinkonjugater ved acylerings- og/eller alkylerings-fremgangsmåter, og fordelen som dette innebærer er at man kan velge andelen av monopolymer/proteinkonjugat som inngår i blandingen. Om ønskelig, kan man således fremstille en blanding av protein med forskjellig antall polymermolekyler til-koblet (dvs. di-, tri-, tetra- osv.) og kombinere med mono-polymer/proteinkonjugatmaterialet fremstilt ved benyttelse av de foreliggende fremgangsmåter, og oppnå en blanding med en på forhånd bestemt andel av monopolymer/proteinkonjugat.

Polynukleotider som koder for avkortede GDNF- proteiner

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer videre nye polynukleotider som koder for avkortede GDNF-proteiner. Ved benyttelse som hybridiseringsprobe eller amplifiseringsprimer vil nukleinsyresekvensen være i det vesentlige fri for alle andre nukleinsyresekvenser. For anvendelse ved rekombinant proteinekspresjon vil nukleinsyresekvensen generelt være i det vesentlige fri for nukleinsyresekvenser som koder for andre proteiner med mindre hensikten er å fremstille et fusjonspro-tein. Basert på den foreliggende beskrivelse og ved å benytte den universelle kodontabell, kan en gjennomsnittsfagmann lett bestemme alle nukleinsyresekvenser som koder for aminosyresekvensene til avkortede GDNF-proteiner. For tiden foretrukne nukleinsyresekvenser omfatter polynukleotidene som koder for de avkortede GDNF-proteiner [Arg16-Ile134] , [Ser26-Ile134] ,[Arg32-Ile<134>] og [Lys37-Ile134] . Eksempler på en rekke polynukleotider er gitt i figurene 5, 6 og 7, så vel som i de deler av figurene 1, 3 og 4 som koder for avkortede GDNF-proteiner. Det vil også forstås av fagfolk at de nye polynukleotider som koder for avkortede GDNF-proteiner, omfatter nukleinsyresekvenser som koder for avkortede GDNF-proteinvarianter, både kunstig fremstilte og naturlig forekommende.

Teknikker for rekombinant ekspresjon utført i samsvar med beskrivelsene gitt nedenfor, kan følges for fremstilling av disse polynukleotider og ekspresjon av de forskjellige avkortede GDNF-proteiner. Ved f.eks. å innsette en nukleinsyresekvens som koder for et avkortet GDNF-protein i en egnet vektor kan en fagmann lett fremstille store mengder av den ønskede nukleotidsekvens. Sekvensene kan så benyttes for frem-bringelse av deteksjonsprober eller amplifiseringsprimere. Alternativt kan et polynukleotid som koder for et avkortet GDNF-protein, innsettes i en ekspresjonsvektor. Ved å innføre ekspresjonsvektoren i en egnet vert kan det ønskede, avkortede GDNF-protein fremstilles i store mengder.

Som videre beskrevet heri, er en rekke vert/vektor-systemer tilgjengelige for oppformering av nukleinsyresekvenser og/eller fremstilling av avkortede GDNF-proteiner. Disse omfatter, men er ikke begrenset til, plasmidvektorer, virale vektorer og insersjonsvektorer, og prokaryote og eukaryote verter. En fagmann kan tilpasse et vert/vektorsystem som kan oppformere eller uttrykke heterologt DNA for fremstilling eller ekspresjon av sekvensene ifølge foreliggende oppfinnelse .

Ved hjelp av slike rekombinante teknikker kan de avkortede GDNF-proteiner ifølge foreliggende oppfinnelse lett fremstilles i kommersielle mengder. Fagfolk vil videre forstå at i lys av foreliggende beskrivelse omfatter de nye nukleinsyresekvenser degenererte nukleinsyresekvenser som koder for de avkortede GDNF-proteiner som spesifikt er beskrevet i figurene, varianter av slike avkortede GDNF-proteiner og nukleinsyresekvenser som hybridiserer, fortrinnsvis under stringente hybridiseringsbetingelser, til komplementer av disse nukleinsyresekvenser (se Maniatis et al., Molecular Cloning (A Laboratory Manual); Cold Spring Harbor Laboratory, s. 387-389, 1982). Eksempler på stringente hybridiseringsbetingelser er hybridisering i 4 x SSC ved 62-67 °C, fulgt av vask i 0,1 x SSC ved 62-67 °C i tilnærmet 1 time. Et alternativt eksempel på stringente hybridiseringsbetingelser er hybridisering i 45-55% formamid, 4 x SSC ved 40-45 °C. DNA-sekvenser som hybridiserer til de komplementære sekvenser for avkortet GDNF-protein under mindre strenge hybridiseringsbetingelser og som koder for et avkortet GDNF-protein ifølge foreliggende oppfin- neise, omfattes også. Eksempler på slike mindre strenge hybridiseringsbetingelser er 4 x SSC ved 45-55 °C eller hybridisering med 30-40% formamid ved 40-45 °C.

Videre tilveiebringer foreliggende oppfinnelse rekombinante DNA-konstruksjoner som omfatter vektor-DNA sammen med DNA-sekvensen som koder for et avkortet GDNF-protein. I slike DNA-konstruksjoner er nukleinsyresekvensen som koder for avkortet GDNF-protein {med eller uten signalpeptider), operativt koblet til en egnet ekspresjonskontrollsekvens eller regula-torisk sekvens som kan styre replikasjon og/eller ekspresjon av det avkortede GDNF-protein i en utvalgt vert.

Rekombinant ekspresjon av avkortet GDNF- protein Fremstilling av polynukleotider som koder for avkortet GDNF

En nukleinsyresekvens som koder for avkortet GDNF eller et modent GDNF-utgangsmateriale, kan lett erholdes på en rekke måter, heriblant, men ikke begrenset til, kjemisk syntese, gjennomsøking av cDNA-biblioteker eller genomiske biblioteker, gjennomsøking av ekspresjonsbiblioteker og/eller PCR-amplifisering av cDNA. Disse fremgangsmåter og andre som er anvendbare for isolering av slike nukleinsyresekvenser, er f.eks. beskrevet av Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989), av Ausubel et al., red. (Current Protocols in Molecular Biology, Current Protocols Press, 1994), og av Berger og Kimmel (Methods in Enzymology: Guide to Molecular Cloning Techniques, vol. 152, Academic-Press, Inc., San Diego, CA, 1987) . Foretrukne nukleinsyresekvenser som koder for GDNF, er pattedyrsekvenser.

Kjemisk syntese av en nukleinsyresekvens som koder for et avkortet GDNF-protein, kan også oppnås ved å benytte fremgangsmåter som er velkjente innen faget, f.eks. dem beskrevet av Engels et al. (Angew. Chem. Intl. Ed., 25:716-734, 1989). Disse fremgangsmåter omfatter bl.a. fosfotriester, fos-foramiditt- og H-fosfonatfremgangsmåtene for nukleinsyresek-venssyntese. Nukleinsyresekvensen som koder for det avkortede GDNF-protein, vil være flere hundre basepar (bp) eller nukleotider lang. Store nukleinsyresekvenser, f.eks. sekvenser større enn tilnærmet 100 nukleotider lange, kan syntetiseres som flere fragmenter. Fragmentene kan så ligeres sammen slik at det dannes en nukleinsyresekvens som koder for avkortet GDNF-protein. En foretrukket fremgangsmåte er polymerunder-støttet syntese ved benyttelse av gjengs fosforamidittkjemi.

Alternativt kan en egnet nukleinsyresekvens erholdes ved gjennomsøking av et passende cDNA-bibliotek (dvs. et bibliotek fremstilt fra ett eller flere vev som antas å uttrykke proteinet) eller et genomisk bibliotek (et bibliotek fremstilt fra totalt genomisk DNA). Kilden for cDNA-biblioteket er typisk et vev fra enhver art som antas å uttrykke GDNF i rimelige mengder. Kilden for det genomiske bibliotek

kan være ethvert vev eller vev fra enhver pattedyrart eller annen art som antas å inneholde et gen som koder for GDNF

eller en GDNF-homolog. Biblioteket kan gjennomsøkes for forekomst av GDNF-cDNA/gen ved å benytte én eller flere nuklein-syreprober (oligonukleotider, cDNA eller genomiske DNA-fragmenter som besitter et aksepterbart nivå av homologi med det GDNF-cDNA eller GDNF-homo1og-cDNA eller -gen som skal klones) som vil hybridisere selektivt med GDNF-cDNA eller GDNF-homolog-cDNA eller -gen som foreligger, i biblioteket. Probene som typisk benyttes for slik gjennomsøking av biblioteker, koder vanligvis for et lite område av GDNF-DNA-sekvensen fra samme art eller en art som ligner på den art fra hvilken biblioteket ble fremstilt. Alternativt kan probene være degenererte, som diskutert heri.

Gjennomsøking av biblioteker oppnås typisk ved å hybridisere oligonukleotidproben eller cDNA til klonene i biblioteket under stringensbetingelser som forhindrer uspesifikk binding, men tillater binding til de kloner som har et signifikant nivå av homologi med proben eller primeren. Typiske hybridiserings- og vaskestringensbetingelser avhenger delvis av størrelsen (dvs. antall nukleotider i lengde) i cDNA eller oligonukleotidproben, og hvorvidt proben er degenerert. Sannsynligheten for å erholde én eller flere kloner tas også i betraktning ved utforming av hybridiseringsløsningen (dvs. hvorvidt det er et cDNA-bibliotek eller et genomisk bibliotek som gjennomsøkes, og dersom det er et cDNA-bibliotek, sannsyn ligheten for at cDNA av interesse vil foreligge på høyt nivå).

Dersom DNA-fragmenter (f.eks. cDNA) benyttes som probe, omfatter typiske hybridiseringsbetingelser dem beskrevet av Ausubel et al., red., supra. Etter hybridisering vaskes blottet som inneholder biblioteket ved en passende stringens som avhenger av flere faktorer som probestørrelse, forventet homologi mellom probe og klon, type bibliotek som gjennomsøkes, antall kloner som gjennomsøkes osv. Eksempler på stringente vaskeløsninger (som vanligvis har lav ionestyrke og benyttes ved relativt høye temperaturer) er som følger. Én slik stringent vask er 0,015 M NaCl, 0,005 M Na-sitrat og 0,1% SDS ved 55-65 °C. En annen slik stringent buffer er 1 mM Na2EDTA, 40 mM NaHP04, pH 7,2, og 1% SDS ved tilnærmet 40-50 °C. En annen stringent vask er 0,2 x SSC og 0,1% SDS ved tilnærmet 50-65 °C.

Det finnes også eksempler på fremgangsmåter for stringente vaskebetingelser dersom oligonukleotidprober benyttes for gjennomsøking av cDNA-biblioteker eller genombiblio-teker. For eksempel benytter en første fremgangsmåte 6 x SSC med 0,05% natriumpyrofosfat ved en temperatur mellom tilnærmet 35 og 62 °C, avhengig av probens lengde. For eksempel vaskes prober med 14 baser ved 35-40 °C, prober med 17 baser ved 45-50 °C, prober med 20 baser ved 52-57 °C og prober med 23 baser ved 57-63 °C. Temperaturen kan forhøyes med 2-3 °C dersom bak-grunnen av uspesifikk binding synes høy. En annen fremgangsmåte benytter tetrametylammoniumklorid (TMAC) for vask. Én slik stringent vaskeløsning er 3 M TMAC, 50 mM Tris-HCl, pH 8,0, og 0,2% SDS.

En annen egnet fremgangsmåte for erholdelse av en nukleinsyresekvens som koder for et GDNF-protein, er polymer-asekjedereaksjonen (PCR). I denne fremgangsmåte ekstraheres poly(A)+RNA eller total-RNA fra et vev som uttrykker GDNF. cDNA fremstilles så fra RNA ved å benytte enzymet revers-transkriptase. To primere som typisk er komplementære til to atskilte områder i GDNF-cDNA (oligonukleotider), tilsettes så til cDNA sammen med en polymerase, f.eks. Taq-polymerase, og polymerasen amplifiserer cDNA-området mellom de to primere. Dersom den valgte fremgangsmåte for fremstilling av nukleinsyresekvensen som koder for det ønskede, avkortede GDNF-protein krever anvendelse av oligonukleotidprimere eller -prober (f.eks. PCR, gjennomsøking av cDNA-bibliotek eller genomisk bibliotek), bør oligonukleotidsekvensene som utvelges som prober eller primere, være tilstrekkelig lange og tilstrekkelig entydige til at mengden uspesifikk binding som vil skje under gjennomsøkingen av biblioteket eller PCR-amplifis-eringen, minimaliseres. Den faktiske sekvens av probene eller primerne baseres vanligvis på konserverte eller svært homologe sekvenser eller områder fra samme gen eller et tilsvarende gen fra en annen organisme. Om ønskelig, kan probene eller primerne være fullstendig eller delvis degenererte, dvs. at de omfatter en blanding av prober/primere som alle koder for samme aminosyresekvens, men som benytter forskjellige kodoner til dette. Et alternativ til fremstilling av degenererte prober er å plassere et inosin i noen av eller alle de kodon-posisjoner som varierer fra art til art. Oligonukleotidprobene eller -primerne kan fremstilles ved fremgangsmåter for kjemisk syntese av DNA som beskrevet ovenfor.

Avkortede GDNF-proteiner basert på disse nukleinsyresekvenser som koder for GDNF, så vel som muterte sekvenser eller sekvensvarianter av disse, omfattes også innenfor foreliggende oppfinnelses område. Som beskrevet ovenfor, er en mutert sekvens eller en sekvensvariant en sekvens som inneholder én eller flere nukleotidsubstitusjoner, -delesjoner og/eller -insersjoner sammenlignet med villtypesekvensen, noe som fører til ekspresjon av aminosyresekvensvariasjoner sammenlignet med villtypens aminosyresekvens. I noen tilfeller kan naturlig forekommende GDNF-aminosyremutanter eller -varianter foreligge grunnet forekomst av naturlig allelisk variasjon. Avkortede GDNF-proteiner som bygger på slike naturlig forekommende mutanter eller varianter, ligger også innenfor foreliggende oppfinnelses område. Fremstilling av syntetiske, muterte sekvenser er også velkjent innen faget og er f.eks. beskrevet i Wells et al. (Gene, 34:315, 1985) og i Sambrook et al., supra.

Vektorer

cDNA eller genomisk DNA som koder for et avkortet GDNF-protein, innsettes i en vektor for videre kloning (ampii-fisering av DNA) eller for ekspresjon. Egnede vekto tu-rer er kom-mersielt tilgjengelige, eller vektoren kan konstrueres spesielt. Seleksjon eller konstruksjon av den egnede vektor vil avhenge av 1) hvorvidt den skal benyttes for DNA-amplifisering eller for DNA-ekspresjon, 2) størrelsen av DNA som skal innsettes i vektoren, og 3) vertscellen (f.eks. pattedyrceller, insektsceller, gjærceller, soppceller, planteceller eller bakterieceller) som skal transformeres med vektoren. H<y>er vektor inneholder forskjellige bestanddeler som avhenger av dens funksjon (amplifisering av DNA eller ekspresjon av DNA) og dens kompatibilitet med den tilsiktede vertscelle. Vektorbes-tanddelene omfatter vanligvis, men er ikke begrenset til, én eller flere av følgende: en signalsekvens, en replikasjonsorigo, ett eller flere seleksjonsgener eller markørgener, enhancerelementer, promoterer, en transkripsjonstermineringssek-vens og lignende. Disse bestanddeler kan erholdes fra naturlige kilder eller syntetiseres ved kjente fremgangsmåter. Vek-torene ifølge foreliggende oppfinnelse omfatter en nukleinsyresekvens som koder for det avkortede GDNF-protein av interesse, operativt koblet til én eller flere av følgende ekspresjonskontrollsekvenser eller regulatoriske sekvenser som kan styre, kontrollere eller på annet vis påvirke ekspresjonen av det avkortede GDNF-protein av en utvalgt vertscelle.

Signalsekvens

Signal sekvensen kan være en bestanddel i vektoren, eller den kan være en del av GDNF-DNA som innsettes i vektoren. Det naturlige GDNF-DNA koder for en signalsekvens ved proteinets aminoende som avkløyves ved posttranslasjonell prosessering av proteinet slik at det modne GDNF-protein dannes. Omfattet innenfor foreliggende oppfinnelses område er avkortede GDNF-polynukleotider med den native signalsekvens og . andre pre-prosekvenser, så vel som avkortede GDNF-polynukleotider hvor den native'signalsekvens er delert og erstattet med en heterolog signalsekvens. Den heterologe signalsekvens som utvelges, bør være én som gjenkjennes og prosesseres, dvs. kløyves av en signalpeptidase, av vertscellen". For prokaryote vertsceller som ikke gjenkjenner og prosesserer den native GDNF-signalsekvens, erstattes signalsekvensen med en prokaryot signalsekvens, f.eks. valgt fra gruppen som består av leder-sekvenser fra alkalisk fosfatase, penicillinase eller varme-stabilt enterotoksin II. For sekresjon i gjær kan den native GDNF-signalsekvens erstattes med gjærledersekvenser fra inver-tase, alfa-faktor eller sur fosfatase. Ved ekspresjon i pattedyrceller er den native signalsekvens tilfredsstillende selv om andre pattedyrsignalsekvenser kan være egnet.

Replikasjonsorigo

Ekspresjonsvektorer og kloningsvektorer omfatter generelt en nukleinsyresekvens som tillater replikasjon av vektoren i én eller flere utvalgte vertsceller. I kloningsvektorer er denne sekvens typisk én som tillater replikasjon av vektoren uavhengig av vertens kromosomale DNA og omfatter replikasjonsorigoer eller autonomt replikerende sekvenser. Slike sekvenser er velkjente i en rekke bakterier, gjær og virus. Replikasjonsorigo fra plasmid pBR322 er egnet for de fleste gramnegative bakterier, og flere origoer (f.eks. SV40, polyoma, adenovirus, VSV eller BPV) er anvendbare for kloningsvektorer i pattedyrceller. Generelt er replikasjonsorigo-bestanddelen ikke nødvendig for pattedyrekspresjonsvektorer (f.eks. benyttes SV40-origo ofte kun fordi den inneholder den tidlige promoter).

Seleksjonsgen

Ekspresjons- og kloningsvektorene inneholder typisk et seleksjonsgen. Dette gen koder for et "markør"-protein som er nødvendig for overlevelse eller vekst av de transformerte vertsceller når disse dyrkes i et selektivt dyrkningsmedium. Vertsceller som ikke er transformert med vektoren, vil ikke inneholde seleksjonsgenet og derfor ikke overleve i dyrkningsmediet. Typiske seleksjonsgener koder for proteiner som (a) overfører antibiotikaresistens eller resistens overfor andre toksiner, f.eks. ampicillin, neomycin, metotrexat eller tetra- syklin, (b) kompiementerer auxotrofe mangler, eller (c) tilveiebringer nødvendige næringsstoffer som ikke er tilgjengelige fra dyrkningsmediet.

Andre seleksjonsgener kan benyttes for amplifisering av genet som skal uttrykkes. Amplifisering er en prosess hvori gener som det er stort behov for, for fremstilling av et protein som er kritisk for vekst, gjentas i tandem i kromosomene i på hverandre følgende generasjoner av rekombinante celler. Eksempler på egnede seleksjonsmarkører for pattedyrceller omfatter dihydrofolatreduktase (DHFR) og tymidinkinase. Patte-dyrcelletransformanter plasseres under seleksjonstrykk hvor kun transformantene er tilpasset overlevelse grunnet markøren som foreligger i vektoren. Seleksjonstrykk innføres ved dyrkning av de transformerte celler under betingelser hvor konsen-trasjonen av seleksjonsmiddel i mediet endres gradvis, noe som fører til amplifisering av både seleksjonsgenet og DNA som koder for avkortet GDNF. Resultatet er at forhøyede mengder avkortet GDNF syntetiseres fra det amplifiserte DNA.

For eksempel identifiseres celler transformert med DHFR-seleksjonsgenet, først ved dyrkning av alle transformanter i et dyrkningsmedium som inneholder metotrexat, en kom-petitiv DHFR-antagonist. En egnet vertscelle ved anvendelse av villtype-DHFR er "Chinese hamster ovary"-cellelinjen som mangler DHFR-aktivitet (se f.eks. Urlaub og Chasin, Proe. Nati. Acad. Sei., USA, 77(7) :4216-4220 (1980)). De transformerte celler utsettes så for økte mengder metotrexat. Dette fører til syntese av flere kopier av DHFR-genet og samtidig flere kopier av annet DNA som foreligger i ekspresjonsvektoren, f.eks. DNA som koder for et avkortet GDNF-protein.

Promoter

Ekspresjons- og kloningsvektorene ifølge foreliggende oppfinnelse vil typisk inneholde en promoter som gjenkjennes av vertsorganismen og som er operativt koblet til nukleinsyresekvensen som koder for det avkortede GDNF-protein. Promoterer er ikke-translaterte sekvenser plassert oppstrøms (5') for startkodonet i et strukturelt gen (generelt innenfor tilnærmet 100 til 1 000 bp) som kontrollerer transkripsjon og transla- sjon av en gitt nukleinsyresekvens, f.eks. en sekvens som koder for avkortet GDNF. Det er hensiktsmessig å fordele promoterer i én av to klasser, induserbare promoterer og konsti-tutive promoterer. Induserbare promoterer gir forhøyet transkripsjonsnivå fra DNA under sin kontroll som svar på en endring i dyrkningsbetingelser, f.eks. nærvær eller fravær av et næringsstoff eller endret temperatur. Et stort antall promoterer som gjenkjennes av en rekke mulige vertsceller, er kjent. Disse promoterer er operativt koblet til DNA som koder for avkortet GDNF ved å fjerne promoteren fra utgangs-DNA ved restriksjonsenzymkutting og innsetting av den ønskede promotersekvens i vektoren. Den naturlige GDNF-promotersekvens kan benyttes for å styre amplifisering og/eller ekspresjon av avkortet GDNF-DNA. En heterolog promoter foretrekkes imidlertid dersom den tillater høyere transkripsjon og høyere utbytte av det uttrykte protein sammenlignet med den naturlige promoter, og dersom den er kompatibel med vertscellesystemet som er valgt for anvendelse.

Promoterer som er egnet for anvendelse med prokaryote verter, omfatter beta-laktamase og laktosepromotersystemene, promotersystemet fra alkalisk fosfatase, et tryptofan(trp)-promotersystem og hybride promoterer, f.eks. tac-promoteren. Andre kjente, bakterielle promoterer er også egnet. Deres nukleotidsekvenser er publisert, noe som gjør det mulig for en fagmann å ligere dem til den eller de ønskede DNA-sekvenser ved å benytte linkere eller adaptorer etter behov for tilveie-bringelse av påkrevde restriksjonsseter.

Egnede promotersekvenser for anvendelse med gjær-verter er også velkjente innen faget. Gjærenhancere benyttes med fordel sammen med gjærpromoterer. Egnede promoterer for anvendelse med pattedyrvertsceller er velkjente og omfatter promoterer erholdt fra virusgenomer, f.eks. polyomavirus, kyl-lingkoppevirus, adenovirus (f.eks. adenovirus 2), storfepapil-lomvirus, fuglesarkomvirus, cytomegalovirus, et retrovirus, hepatitt B-virus og, mest foretrukket, apevirus 40 (SV40). Andre egnede pattedyrpromoterer omfatter heterologe pattedyrpromoterer, f.eks. varmesjokkpromoterer og aktinpromoteren. En for tiden anvendt promoter ved fremstilling av GDNF-proteiner i CHO-celler er SR . Se Takebe et al., Mol. Cell. Biol. 8(l):466-472 (1988). En egnet ekspresjonsvektor er pDSR 2 som beskrives mer detaljert nedenfor.

Enhancerelement

En enhancersekvens kan innsettes i vektoren for å øke transkripsjonen av en DNA-sekvens som koder for et avkortet GDNF-protein ifølge foreliggende oppfinnelse i høyere eukary-oter. Enhancere er cis-virkende DNA-elementer, vanligvis tilnærmet 10-300 bp lange, som virker på promoteren slik at transkripsjonen økes. Enhancere er relativt orienterings- og posisjonsuavhengige. De er blitt funnet 5' og 3' for transkripsjonsenheten. Flere enhancersekvenser som er tilgjengelige fra pattedyrgener, er kjente (f.eks. globin, elastase, albumin, alfa-fetoprotein og insulin). Imidlertid vil typisk en enhancer fra et virus benyttes. SV40-enhanceren, enhanceren fra tidlig promoter i cytomegalovirus, polyomaenhanceren og adenovirusenhancere er eksempler på enhancerelementer for ak-tivering av eukaryote promoterer. Selv om en enhancer kan innsettes i vektoren i en posisjon 5' eller 3' for avkortet GDNF-DNA, er den typisk plassert i et sete 5' for promoteren.

Transkripsj onsterminering

Ekspresjonsvektorer som benyttes i eukaryote vertsceller (gjær, sopp, insektsceller, planteceller, dyreceller, menneskeceller eller celler med kjerne fra andre multicellulære organismer), vil også inneholde sekvenser som er nødven-dige for transkripsjonsterminering og stabilisering av mRNA. Slike sekvenser er vanligvis tilgjengelige fra 5'- og av og til 3<1->utranslaterte områder i eukaryot DNA eller cDNA. Disse områder inneholder nukleotidsegmenter som transkriberes som polyadenylerte fragmenter i den ikke-translaterte del av mRNA som koder for avkortet GDNF.

Konstruksjon av egnede vektorer som inneholder én eller flere av bestanddelene opplistet ovenfor sammen med den ønskede, kodende sekvens for avkortet GDNF, oppnås ved gjengse ligeringsteknikker. Isolerte plasmider eller DNA-fragmenter kuttes, tilpasses og religeres i ønsket rekkefølge for frem stilling av de påkrevde plasmider. For å bekrefte at de korrekte sekvenser er konstruert, kan ligeringsblandingene benyttes til transformasjon av E. coli, og vellykkede transformanter kan utvelges ved kjente teknikker, f.eks. ampicillin-resistens eller tetrasyklinresistens som beskrevet ovenfor. Plasmider fra transformantene fremstilles så og analyseres ved restriksjonsendonukleasekutting og/eller sekvensering for å bekrefte forekomst av den ønskede konstruksjon.

Vektorer som tilveiebringer forbigående ekspresjon av DNA som koder for avkortet GDNF i pattedyrceller, kan også benyttes. Generelt omfatter forbigående ekspresjon anvendelse av en ekspresjonsvektor som kan replikeres effektivt i en vertscelle slik at vertscellen akkumulerer mange kopier av ekspresjonsvektoren og deretter syntetiserer høye nivåer av det ønskede protein som kodes av ekspresjonsvektoren. Systemer for forbigående ekspresjon som består av en egnet ekspresjonsvektor og en vertscelle, tillater hensiktsmessig positiv identifisering av proteiner som kodes av klonede DNA, så vel som hurtig gjennomsøking for slike proteiner for ønskede, biologiske eller fysiologiske egenskaper. Systemer for forbigående ekspresjon er således spesielt anvendbare for identifisering av varianter av proteinet.

Seleksjon og transformasjon av vertsceller

Vertsceller (f.eks. bakterieceller, pattedyrceller, insektsceller, gjærceller eller planteceller) transformert med nukleinsyresekvenser for anvendelse ved ekspresjon av et rekombinant, avkortet GDNF-protein, tilveiebringes også av foreliggende oppfinnelse. Den transformerte vertscelle dyrkes under egnede betingelser som tillater ekspresjon av nukleinsyresekvensen. Valg av egnede vertsceller og fremgangsmåter for transformasjon, dyrkning, amplifisering, gjennomsøking og produktfremstilling og -rensing er velkjent innen faget. Se f.eks. Gething og Sambrook, Nature 293:620-625 (1981) eller alternativt Kaufman et al., Mol. Cell. Biol., 5(7):1750-1759

(1985) eller Howley et al., US patentskrift nr. 4 419 446. Avkortet GDNF kan uttrykkes i E. coli i samsvar med beskrivelsen til Lin et al. (US patentsøknad nr. 07/855 413, søknad nr. PCT/US92/07888, WO 93/06116) som omhandlet ekspresjon av moden GDNF. Andre eksempler på utgangsforbindelser og fremgangsmåter diskuteres mer detaljert nedenfor. Den transformerte vertscelle dyrkes i et egnet medium, og den uttrykte faktor kan så, om ønskelig, gjenvinnes, isoleres og renses fra dyrkningsmediet (eller fra cellen dersom det uttrykkes intracellulært) ved egnede midler kjent blant fagfolk.

Egnede vertsceller for kloning og ekspresjon av vek-torene heri er de prokaryote celler, gjærcellene og de høyere eukaryote celler som er beskrevet ovenfor. Prokaryote vertsceller omfatter, men er ikke begrenset til, eubakterier, som gramnegative eller grampositive organismer, f.eks. E. coli, Bacilli som B. subtilis, Pseudomonas-arter som P. aeruginosa, Salmonella typhimurium eller Serratia marcescans. Alternativt er in vitro-fremgangsmåter for kloning, f.eks. PCR eller andre nukleinsyrepolymerasereaksj oner, egnet.

I tillegg til prokaryote vertsceller kan eukaryote mikrober som filamentøs sopp eller gjær, være egnede verter for ekspresjon av avkortede GDNF-proteiner. Saccharomyces cerevisiae, eller vanlig brødgjær, er den vanligst benyttede blant lavere eukaryote vertsmikroorganismer, men et stort antall andre slekter, arter og stammer er velkjente og lett tilgjengelige .

Egnede vertsceller for ekspresjon av glykosylert, avkortet GDNF-protein er avledet fra multicellulære organismer. Slike vertsceller er i stand til komplekse prosesserings-og glykosyleringsaktiviteter. I prinsippet kan enhver høyere eukaryot cellekultur benyttes uansett om den omfatter vertebratceller eller invertebratceller, heriblant planteceller og insektsceller. Vertebratceller benyttes generelt da dyrkning av vertebratceller i kultur (vevskultur) er en velkjent fremgangsmåte. Eksempler på egnede pattedyrvertscellelinjer omfatter, men er ikke begrenset til, apenyrelinjen CV1 transformert med SV40 (COS-7), humane, embryonale nyrelinjer (293-celler eller 293-celler subklonet for vekst i suspensjonskultur), "baby hamster kidney"-celler og "Chinese hamster ovary"-celler. Andre egnede pattedyrcellelinjer omfatter, men er ikke begrenset til, HeLa, muse L-929-celler, 3T3-linjer avledet fra Swiss-, Balb-c- eller NIH-raus, BHK- eller HaK-hamstercellelin-jer.

Like anvendbare som vertsceller egnet for foreliggende oppfinnelse, er bakterieceller. For eksempel er forskjellige E. coli-stammer (f.eks. HB101, DH5 , DH10 og MC1061) velkjente som vertsceller innen faget bioteknologi. Forskjellige stammer av Streptomyces spp. og lignende kan også benyttes. For tiden foretrukne vertsceller for fremstilling av avkortede GDNF-proteiner er bakterieceller (f.eks. Escherichia coli) og pattedyrceller (som "Chinese hamster ovary"-celler, COS-celler osv.).

Vertscellene transfekteres og, fortrinnsvis, transformeres med de ovenfor beskrevne ekspresjonsvektorer eller kloningsvektorer og dyrkes i et konvensjonelt næringsmedium. Mediet kan modifiseres etter behov for induksjon av promoterer, seleksjon av transformanter eller amplifisering av genene som koder for de ønskede sekvenser. Transfeksjon og transformasjon utføres ved å benytte standardteknikker som er velkjente blant fagfolk, og som utvelges som passende for vertscellene det gjelder. For eksempel kan, for pattedyrceller uten cellevegger, kalsiumfosfatutfellingsfremgangsmåten benyttes. Elektroporering, mikroinjeksjon og andre kjente teknikker kan også benyttes.

Dyrkning av vertscellene

Transformerte celler som benyttes for fremstilling av avkortede GDNF-proteiner ifølge foreliggende oppfinnelse, dyrkes i egnede medier. Mediene kan etter behov suppleres med hormoner og/eller andre vekstfaktorer (f.eks. insulin, transferrin eller epidermal vekstfaktor), salter (f.eks. natrium-klorid, kalsium, magnesium og fosfat), buffere (f.eks. HEPES), nukleosider (f.eks. adenosin og tymidin), antibiotika (f.eks. gentamicin), sporstoffer (definert som uorganiske forbindelser som vanligvis foreligger i sluttkonsentrasjoner i mikromolar-området), og glukose eller andre energikilder. Andre tilset-ningsstoffer kan også innbefattes ved passende konsentrasjoner, noe som vil forstås av fagfolk. Egnede dyrkningsbetingelser med hensyn til temperatur, pH og lignende, er også vel kjent blant fagfolk for anvendelse med de utvalgte vertsceller.

Det er også mulig at avkortede GDNF-proteiner kan fremstilles ved homolog rekombinasjon, eller ved rekombinante fremstillingsfremgangsmåter som benytter kontrollelementer innført i celler som allerede inneholder DNA som koder for GDNF. Homolog rekombinasjon er en teknikk som opprinnelig ble utviklet for målstyring mot gener for induksjon eller korrek-sjon av mutasjoner i transkripsjonelt aktive gener (Kucher-lapati, Prog. in Nucl. Acid Res. and Mol. Biol. 36:301

(1989)). Den grunnleggende teknikk ble utviklet som en fremgangsmåte for innføring av spesifikke mutasjoner i spesifikke områder i pattedyrgenomet (Thomas et al., Cell. 44:419-428, 1986; Thomas og Capecchi, Cell. 51:503-512, 1987; Doetschman et al., Proe. Nati. Acad. Sei. 85:8583-8587, 1988) eller for korrigering av spesifikke mutasjoner i defekte gener (Doetschman et al., Nature, 330:576-578, 1987). Eksempler på homologe rekombinasjonsteknikker er beskrevet i US 5 272 071 (EP 91 90 3051, EP-publikasjon nr. 505 500; PCT/US90/07642, inter-nasjonalt patentskrift nr. WO 91/09955). Ved homolog rekombinasjon kan DNA-sekvensen som skal innsettes i genomet, styres til et spesifikt område av genet av interesse ved å koble den til målrettende DNA. Det målrettende DNA er DNA som er komplementært (homologt) til et område i det genomiske DNA. Små biter målrettende DNA som er komplementære til et spesifikt område i genomet, settes i forbindelse med utgangstråden under DNA-replikasjonsprosessen. Det er en generell egenskap ved DNA som er innsatt i en celle, at det hybridiserer, og derfor rekombinerer, med andre biter av endogent DNA via felles, homologe områder. Dersom denne komplementære tråd er festet til et oligonukleotid som inneholder en mutasjon eller en forskjellig DNA-sekvens, vil også dette inn-føres i den nysyntetiserte tråd som en følge av rekombina-sjonen. Som et resultat av korrekturlesningsfunksjonen, er det mulig for den nye DNA-sekvens å fungere som templat. Således innføres det overførte DNA i genomet. Dersom sekvensen til et gitt gen er kjent, f.eks. nukleinsyresekvensen til GDNF, pre-prosekvensen eller ekspre- sjonskontrollsekvensen, kan et stykke DNA som er komplementært til et utvalgt område av genet, syntetiseres eller erholdes på annet vis, f.eks. ved passende restriksjon av det naturlige DNA ved spesifikke gjenkjenningsseter som avgrenser området av interesse. Dette stykke fungerer som en målrettende sekvens ved innsetting i cellen og vil hybridisere til sitt homologe område i genomet. Dersom denne hybridisering skjer under DNA-replikasjonen, vil dette DNA-stykke og eventuelle tilleggssek-venser som er koblet til dette, fungere som et Okazaki-fragment og vil "innsys" i den nysyntetiserte DNA-dattertråd. I foreliggende oppfinnelse er det til disse biter med målrettende DNA koblet DNA-områder som kan interagere med ekspresjonen av et GDNF-protein. For eksempel innsettes et promoter/enhancerelement, en suppressor eller et eksogent, transkripsjonsmodulerende element i genomet i den utvalgte vertscelle i en avstand og orientering som er tilstrekkelig til å påvirke transkripsjon av DNA som koder for den ønskede, avkortede GDNF. Kontrollelementet koder ikke for avkortet GDNF, men kontrollerer i stedet en del av det DNA som foreligger i vertscellegenomet. Således kan ekspresjon av avkortede GDNF-proteiner oppnås, ikke ved transfeksjon med DNA som koder for det avkortede GDNF-gen selv, men snarere ved å benytte målrettende DNA (som inneholder områder med homologi med det endogene gen av interesse) koblet til DNA-regulatoriske segmenter som gir den endogene gensekvens gjenkjennelige signaler for transkripsjon av et avkortet GDNF-protein. I samsvar med foreliggende oppfinnelse kan homologe rekombinasjonsfremgangsmåter også benyttes for modifisering av en celle som inneholder et GDNF-gen som normalt er transkrip-sjonsmessig inaktivt, slik at det dannes en celle som uttrykker GDNF. GDNF-proteinet kan så prosesseres slik at det dannes ett eller flere avkortede GDNF-proteiner.

Farmasøytiske preparater med avkortet GDNF

Farmasøytiske preparater med avkortede GDNF-proteinprodukter omfatter typisk en terapeutisk effektiv mengde av et avkortet GDNF-proteinprodukt i blanding med én eller flere farmasøytisk og fysiologisk aksepterbare utformingsforbindel- seir. Egnede ut formings forbinde Iser omfatter, men er ikke begrenset til, antioksidanter, konserveringsmidler, fargestof-fer, smaksstoffer og fortynningsstoffer, emulsjonsmidler, sus-pens jonsmidler, løsemidler, fyllstoffer, volumgivende midler, buffere, leveringsmidler, fortynningsmidler, eksipienser og/eller farmasøytiske adjuvanser. Et egnet bærerstoff kan f.eks. være vann for injeksjon, fysiologisk saltvann eller kunstig cerebrospinalvæske (CSF), muligens tilsatt andre forbindelser som vanligvis forekommer i preparater for parenteral tilførsel. Nøytralt, bufret saltvann eller saltvann blandet med serumalbumin, er ytterligere eksempler på bærerstoffer.

Primærløsemidlet i et bærerstoff kan være enten vandig eller ikke-vandig av natur. I tillegg kan bærerstoffet inneholde andre farmasøytisk aksepterbare eksipienser for modifisering eller bibeholdelse av pH, osmolaritet, viskosi-tet, klarhet, farge, sterilitet, stabilitet, oppløsningshas-tighet eller lukt av preparatet. På tilsvarende måte kan bærerstoffet inneholde ytterligere andre farmasøytisk aksepterbare eksipienser for modifisering eller bibeholdelse av stabilitet, oppløsningshastighet eller frigjøringshastighet for avkortet GDNF-proteinprodukt, eller for å fremme absorpsjon eller penetrering av avkortet GDNF-proteinprodukt over blod-hjernebarrieren. Slike eksipienser er forbindelser som vanligvis eller sedvanlig benyttes til utforming av doser for parenteral tilførsel i enten enhetsdoseform eller multidose-form, eller for direkte infusjon i CSF ved kontinuerlig eller periodisk infusjon fra en implantert pumpe.

Når først det terapeutiske preparat er blitt utformet, kan det lagres i sterile ampuller som en løsning, suspensjon, gel, emulsjon, fast stoff eller dehydrert eller fryse-tørket pulver. Slike preparater kan lagres enten i en bruks-ferdig form eller i en form som krever rekonstituering før tilførsel, f.eks. frysetørket form.

Det optimale, farmasøytiske preparat vil bestemmes av en fagmann avhengig av tilførselsveien og den ønskede dose. Se f.eks. Remington's Pharmaceutical Sciences, 18. utgave {1990, Mack Publishing Co., Easton, PA 18042), s. 1435-1712. Preparatet kan også omfatte faste preparater av polymere forbin- deiser, f.eks. polymelkesyre, polyglykolsyre osv., eller i liposomer. Hyaluronsyre kan også benyttes, og dette kan ha den virkning at det fremmer vedvarende forekomst i sirkulasjons-systemet. Slike preparater kan påvirke den fysiske tilstand, stabilitet, hastighet for in vivo frigjøring og hastighet for in vivo fjerning av de foreliggende proteiner og derivater.

Andre effektive tilførselsformer, f.eks. preparater for parenteral, langsom frigjøring, inhaleringsmidler, for-støvede midler, oralt aktive preparater eller stikkpiller, omfattes også. For tiden foreliggende farmasøytiske preparater med avkortet GDNF-proteinprodukt er utformet for parenteral tilførsel, f.eks. intracerebroventrikulær injeksjon. Slike parenteralt tilførte, terapeutiske preparater foreligger typisk i form av en pyrogenfri, parenteralt aksepterbar, vandig løsning som omfatter avkortet GDNF-proteinprodukt i et farma-søytisk aksepterbart bærerstoff. Et foretrukket bærerstoff er fysiologisk saltvann.

Det omfattes også at visse preparater som inneholder avkortet GDNF-protein, skal tilføres oralt. Avkortet GDNF-proteinprodukt som tilføres på denne måte, kan være innkapslet og kan utformes med eller uten de bærerstoffer som vanligvis benyttes ved utforming av faste doseringsformer. Kapselen kan utformes slik at den aktive del av preparatet frigjøres på det punkt i mage-tarmsystemet hvor biotilgjengeligheten er maksi-mal og presystemisk degradering minimal. Ytterligere eksipienser kan omfattes for å lette absorpsjon av avkortet GDNF-proteinprodukt. Fortynningsmidler, smaksstoffer, vokser med lavt smeltepunkt, planteoljer, smøremidler, suspensjonsmidler,

tablettoppløsende midler og bindestoffer kan også benyttes.

Tilførsel av avkortet GDNF- proteinprodukt

Det avkortede GDNF-proteinprodukt kan tilføres parenteralt via en subkutan, intramuskulær, intravenøs, transpul-monal, transdermal, intratekal eller intracerebral vei. Pro-teinvekst f aktorer som ikke krysser blod-hjernebarrieren, kan gis enten direkte intracerebralt eller på annet vis i forbindelse med andre elementer som vil transportere dem over barrieren. Det foretrekkes at det avkortede GDNF-proteinprodukt tilføres intracerebroventrikulært eller inn i hjernens eller ryggmargens subaraknoidrom. Avkortet GDNF-proteinprodukt kan også tilføres intracerebralt, direkte inn i hjernens parenkym. Hjerneimplantater for langsom frigjøring som inneholder den neurotrofe faktor innbakt i en biodegraderbar polymermatriks, kan også tilføre avkortet GDNF-proteinprodukt. Avkortet GDNF-proteinprodukt kan tilføres ekstracerebralt i en form som er kjemisk modifisert eller pakket på et vis som gjør at det pas-serer blod-hjernebarrieren, eller det kan tilføres sammen med ett eller flere midler som kan fremme penetrering av avkortet GDNF-proteinprodukt over barrieren. For eksempel er et konju-gat mellom NGF og monoklonale anti-transferrinreseptoranti-stoffer blitt vist å transporteres til hjernen via binding til transferrinreseptorer. For å oppnå den ønskede dose av avkortet GDNF-proteinprodukt kan gjentatte daglige eller mindre hyppige injeksjoner tilføres, eller avkortet GDNF-proteinprodukt kan infuseres kontinuerlig eller periodisk fra en implantert pumpe med konstant eller programmerbar gjennomstrømning. Dosefrekvensen vil avhenge av de farmakokinetiske parametrer til det avkortede GDNF-proteinprodukt som inngår i preparatet, og tilførselsveien.

Uavhengig av tilførselsveien beregnes den spesifikke dose typisk ved å ta hensyn til kroppsvekt eller kroppens overflateareal. For sykdommer som omfatter hjernen, beregnes den spesifikke dose typisk ved å ta hensyn til pasientens til-nærmede hjernevekt som også kan beregnes med utgangspunkt i kroppsvekt eller kroppens overflateareal. Videre raffinering av beregningene som er nødvendige for å fastslå en passende behandlingsdose med de ovenfor nevnte preparater, utføres rutinemessig av fagfolk, særlig i lys av doseringsinforma-sjonen og analysene som beskrives heri. At dosene er passende, kan sikres ved å anvende de etablerte analyser for dosebestem-melser benyttet sammen med passende dose-responsverdier. Det endelige doseringsskjema som benyttes i en fremgangsmåte for behandling av en gitt tilstand, vil bestemmes av den behand-lende lege ved at han tar hensyn til forskjellige faktorer som påvirker medikamenters virkning, f.eks. pasientens alder, tilstand, kroppsvekt, kjønn og diett, omfanget av eventuelle in^feksjoner, tilførselstidspunktet og andre kliniske faktorer.

Avkortet GDNF-proteinprodukt ifølge foreliggende oppfinnelse kan også benyttes, alene eller sammen med andre vekstfaktorer, ved behandling av nervesykdommer. Avkortet GDNF-proteinprodukt kan f.eks. benyttes ved behandling av visse nervesykdomsformer sammen med nervevekstfaktor. I tillegg kan andre faktorer eller andre molekyler, heriblant kjemiske preparater, benyttes sammen med avkortet GDNF-proteinprodukt. Ved behandling av Parkinsons sykdom forventes det at avkortet GDNF-proteinprodukt kan benyttes alene eller med samtidig tilførsel av Levodopa, hvor den avkortede GDNF vil fremme produksjonen av endogent dopamin og neuronalt opptak av den forhøyede dopaminkonsentrasjon.

Som nevnt ovenfor, forventes det også at ytterligere neurotrofe eller neuronnærende faktorer vil være anvendbare eller nødvendige for behandling av visse neuronale cellepopu-lasjoner eller visse typer skade eller sykdom. Andre faktorer som kan benyttes sammen med avkortet GDNF, omfatter, men er ikke begrenset til: mitogener som insulin, insulinlignende vekstfaktorer, epidermal vekstfaktor, vasoaktiv vekstfaktor, adenylatsyklaseaktiverende polypeptid fra hypofyse, interferon og somatostatin, neurotrofe faktorer som hjerneavledet, neurotrof faktor, neurotrofin-3, neurotrofin-4/5, neurotrofin-6, insulinlignende vekstfaktor, ciliær, neurotrof faktor, sur og basisk fibroblastvekstfaktor, fibroblastvekstfaktor-5, trans-formerende vekstfaktor- , kokain-amfetaminregulert transkript (CART) og moden GDNF, og andre vekstfaktorer som epidermal vekstfaktor, leukemiinhiberende faktor, interleukiner, inter-feroner og kolonistimulerende faktorer, så vel som molekyler og forbindelser som er funksjonelle ekvivalenter av disse faktorer.

Det forventes at kontinuerlig tilførsel eller vedvarende tilførsel av et avkortet GDNF-proteinprodukt vil være fordelaktig for en gitt behandling. Selv om kontinuerlig til-førsel kan oppnås på mekaniske måter, f.eks. med en infusjons-pumpe, forventes det at andre fremgangsmåter for kontinuerlig eller nesten kontinuerlig tilførsel kan benyttes. For eksempel kan kjemisk derivatisering føre til vedvarende frigjørings- former av proteinet som fører til kontinuerlig nærvær i blod-strømmen i forutsigbare mengder, basert på et gitt doseringsskjema. Således omfatter avkortede GDNF-proteinprodukter avkortet GDNF-protein som er derivatisert slik at slik kontinuerlig tilførsel oppnås.

Celleterapi med avkortet GDNF-protein, f.eks. intracerebral implantasjon av celler som produserer avkortet GDNF-protein, omfattes også. Denne utførelse av foreliggende oppfinnelse kan omfatte implantasjon i pasienter av celler som kan syntetisere og utskille en biologisk aktiv form av avkortet GDNF-protein. Slike avkortede GDNF-proteinproduserende celler kan være celler som normalt ikke produserer en neurotrof faktor, men som er modifisert slik at de produserer avkortet GDNF, eller de kan være celler hvis evne til å produ-sere GDNF er forsterket ved transformasjon med et polynukleotid som er egnet for ekspresjon og sekresjon av avkortet GDNF-protein. For å minimalisere pasienters mulige immunologiske reaksjon som en følge av tilførsel av GDNF fra en fremmed art foretrekkes det at cellene er av menneskelig opphav og produserer humant, avkortet GDNF-protein.

Implanterte celler kan innkapsles for å unngå infil-trering av cellene i hjernevev. Humane eller ikke-humane dyreceller kan implanteres i pasienter i biokompatible, semiper-meable, polymere beholdere eller membraner som tillater fri-gjøring av et avkortet GDNF-proteinprodukt, men som forhindrer destruksjon av cellene av pasientens immunsystem eller ved andre skadelige faktorer fra det omgivende vev. Alternativt kan pasientens egne celler, transformert ex vivo slik at de produserer avkortet GDNF, implanteres direkte i pasienten uten slik innkapsling.

Metodologien for membraninnkapsling av levende celler er kjent blant fagfolk, og fremstilling av de innkapslede celler og implantering av disse i pasienter kan oppnås. Se f.eks. US patentskrifter nr. 4 892 538, 5 Oll 472 og 5 106 627. Et system for innkapsling av levende celler er også beskrevet i PCT-søknad WO 91/10425 tilhørende Aebischer et al. Se også PCT-søknad WO 91/10470 tilhørende Aebischer et al., Winn et al., Exper. Neurol., 113:322-32 9, 1991, Aebischer et al., Exper. Neurol. 111:269-275, 1991; Tresco et al., ASAIO, 38:17-23, 1992.

Gent(erapi med avkortet GDNF-protein in vivo omfattes også hvor en nukleinsyresekvens som koder for et avkortet GDNF-protein, innføres direkte i pasienten. For eksempel inn-føres en nukleinsyresekvens som koder for et avkortet GDNF-protein, i målceller ved lokal injeksjon av en nukleinsyrekon-struksjon med eller uten en egnet leveringsvektor, f.eks. en adenoassosiert virusvektor. Alternative, virale vektorer omfatter, men er ikke begrenset til, retrovirus, adenovirus, herpes simplex-virus og papillomvirusvektorer. Fysisk overfør-ing kan oppnås in vivo ved lokal injeksjon av den ønskede nuk-leinsyrekonstruksjon eller en annen egnet leveringsvektor som inneholder den ønskede nukleinsyresekvens, liposommediert overføring, direkte injeksjon (nakent DNA), reseptormediert overføring (ligand-DNA-kompleks) eller mikropartikkelbombar-dering ("gen-pistol").

Det bør bemerkes at de heri beskrevne preparater med avkortet GDNF-proteinprodukt kan benyttes i veterinærmedisin så vel som ved behandling av mennesker, og at begrepet "pasi-ent" ikke skal oppfattes på begrensende måte. Når det gjelder veterinærmedisin, bør doseringsområdene være de samme som angitt ovenfor.

Som et middel for ytterligere karakterisering av avkortede GDNF-proteiner ifølge foreliggende oppfinnelse kan antistoffer som bindes til det avkortede GDNF-protein, f.eks. til epitoper innen aminosyresekvensen X- [Cys41-Cys133] -Y, utvik-les. En gjennomsnittsfagmann kan benytte velkjente, publiserte fremgangsmåter for erholdelse av monoklonale og polyklonale antistoffer eller rekombinante antistoffer som spesifikt gjenkjenner og bindes til de forskjellige proteiner som kodes av aminosyresekvensene ifølge foreliggende oppfinnelse. Slike antistoffer kan så benyttes for rensing og karakterisering av avkortet GDNF-protein. Alternativt kan antistoffene benyttes som terapeutiske inhibitorer av proteinene mot hvilke de er rettet.

Andre sider og fordeler ved foreliggende oppfinnelse vil forstås ved betraktning av de påfølgende, illustrerende eksempler. Eksempel 1 gjelder ekspresjon av moden GDNF i et pattedyrcellesystem og fremstilling av avkortet GDNF-protein. Eksempel 2 gjelder ekspresjon av moden GDNF i et bakteriecellesystem. Eksempel 3 gjelder ekspresjon av forskjellige avkortede GDNF-proteiner i et bakteriecellesystem. Eksempel 4 sam-menligner den biologiske aktivitet av modent GDNF-protein og avkortet GDNF-protein i en analyse for neurotrof aktivitet i dopaminerge neuroner.

Eksempler

Eksempel 1

Ekspresjon av moden, human GDNF i CHO- celler og rensing av CHO- celleavledet, avkortet GDNF- protein

Utgangsforbindelser

Følgende utgangsforbindelser benyttes ved ekspresjon av human GDNF i dihydrofolatreduktasedefisiente CHO-celler

<CHOd"-celler, f.eks. som beskrevet av Urlaub og Chasin, Proe. Nati. Acad. Sei., USA 77(7):4216-4220 (1980)).

CHOd"-medium inneholdt: Dulbeccos modifiserte Eagles medium (DMEM) - høy glukose (Gibco/BRL), 5% føtalt, bovint serum (HyClone), MEM ikke-essensielle aminosyrer (1%)

(Gibco/BRL), hypoxantin/tymidin (1%) (Gibco/BRL) og glutamin/penicillin/streptomycin (1%) (Irvine Scientific).

Selektivt medium inneholdt: DMEM (høy glukose), 5% dialysert, bovint serum (HyClone), MEM ikke-essensielle aminosyrer og glutamin/penicillin/streptomycin.

2X HEPES-bufret saltvann (HBS) inneholdt: 280 mM NaCl, 10 mM KCl, 1,5 mM Na2HP04, 12 mM dekstrose og 50 mM

HEPES.

Tris-bufret saltvann pluss "Tween" (TBST) inneholdt: 137 mM NaCl, 20 mM Tris/HCl, pH 7,5, og 0,1% "Tween-20".

Fremgang små t e r

Transfeksjon og seleksjon

CHOd"-celler (passasje 20) ble utsådd i 60 mm vevs-dyrkningsskåler (Falcon) ved en tetthet på 8 x 10s celler pr. skål i CHOd"-vekstmedium. Følgende dag, tilnærmet 3 timer før transfeksjon, ble mediet erstattet med ferskt medium.

Plasmidkonstruksjoner som inneholdt passende GDNF-cDNA, ble fremstilt ved å benytte velkjente teknikker. For eksempel ble plasmidkonstruksjonen pDSR 2 fremstilt i det vesentlige i samsvar med fremgangsmåten beskrevet i den også eide, ikke avgjorte US patentsøknad med serienr. 501 904, innlevert 29. mars 1990 (se også europeisk patentsøknad nr. 90305433, publikasjonsnr. EP 398 753, innlevert 18. mai 1990 og WO 90/14363 (1990)). Et eksempel på et plasmidkart som il-lustrerer den strukturelle organisering av vektoren, er avbildet i figur 2. Fagfolk vil forstå at en rekke nukleinsyresekvenser som koder for det modne GDNF-protein, f.eks. sekvensene avbildet i figurene 1, 3 og 4, også kan benyttes.

Et HindiII-Xbal-DNA-fragment som omfattet de kodende sekvenser for human GDNF og Kozak-konsensussekvensene, CCACC( ATG), ble erholdt ved restriksjonserizymkutting av en pcDNA3-basert ekspresjonsvektor (Invitrogen, San Diego, CA). DNA-fragmentet ble direkte klonet i pDSR 2 kuttet med Hindlll/Xbal. Det resulterende plasmid ble betegnet pSW5. Plasmid-DNA fra pSW5 ble linearisert i Puvl-setet før transfeksjon.

pDSR 2 (figur 2) er et derivat av plasmidet pCD (Okayama & Berg, Mol. Cell Biol. 3:280-289, 1983) med tre hovedmodifikasjoner: (i) SV40-polyadenyleringssignalet er erstattet med signalet fra -subenheten av follikkelstimuler-ende hormon fra storfe, -bFSH (Goodwin et al., Nucleic Acids Res. 11:6873-6882, 1983); (ii) et dihydrofolatreduktase-mini-gen fra mus (Gasser et al., Proe. Nati. Acad. Sei. 79:6522-6526, 1982) er innsatt nedstrøms for ékspresjonskassetten for å tillate seleksjon og amplifisering av transformantene, og (iii) et fragment på 267 bp som inneholder "R-elementet" og deler av "U5"-sekvensene fra den lange enderepetisjon (LTR) fra humant T-celleleukemivirus type I (HTLV-I), er klonet og innsatt mellom SV40-promoteren og spleisesignalene som beskrevet tidligere (Takebe et al., Mol. Cell Biol. 8:466-472, 1988).

Det ble fremstilt DNA-løsninger som inneholdt en

sluttkonsentrasjon på 3,0 g/skål GDNF-plasmid-DNA,

7,0 g/skål bærer-DNA fra musenyregenom (Clontech), 25 l/skål 2,5 M CaCl2og sterilt, destillert vann til et sluttvolum på 250 l/skål. DNA-løsninger som inneholdt pDSR 2-vektor-DNA eller bærer-DNA alene, ble fremstilt på tilsvarende måte som positive, hhv. negative kontroller. DNA-løsningene ble tilsatt dråpevis til et likt volum 2X HEPES-bufret saltvann mens luft-bobler ble passert gjennom løsningen. DNA/HBS-løsningene ble inkubert ved romtemperatur i 30 minutter.

Mediet ble fjernet fra CHOd"-cellekulturene, og

500 1 av DNA-løsningene ble tilsatt pr. skål. Skålene ble inkubert ved romtemperatur i 30 minutter, hvoretter CHOd"-medium (5,0 ml) ble tilsatt til hver skål. Skålene ble så inkubert ved 37 °C over natten.

På følgende dag ble mediet erstattet med ferskt CHOd"-medium. Neste dag da cellene hadde nådd konfluens, ble kulturene trypsinert og utsådd i 100 mm skåler (Falcon) ved et forhold på 1 x 60 mm skål til 8 x 100 mm skåler. Cellene ble utsådd i seleksjonsmedium. Kulturene ble tilsatt ferskt medium hver annen til hver tredje dag.

Etter 15 dager ble kolonier med transfekterte celler isolert ved å benytte kloningssylindere av glass, trypsinert og utsådd i 24-brønners skåler (Falcon). I alt 40 kolonier ble isolert fra de GDNF/pSW5-transfekterte celler. De gjenværende celler i skålene ble trypsinert, slått sammen og utsådd i to 100 mm skåler (én porsjon for hver DNA-konstruksjon).

Gjennomsøking av transfekterte celler 24-brønnerskulturene og de sammenslåtte kulturer ble dyrket til konfluens, hvoretter dyrkningsmediet ble fjernet og erstattet med serumfritt medium (400 l/brønn eller 4 ml/skål). Cellene ble inkubert i 48 timer og det kondisjonerte medium høstet. Prøver av kondisjonert medium ble analysert for GDNF-proteinekspresjon ved Western-blotting. Porsjoner av kondisjonert medium (20 1 eller 40 1) ble fortynnet med elektroforeseprøvebuffer (med eller uten -merkaptoetanol). Prøver som inneholdt -merkaptoetanol, ble kokt i 3 minutter (reduserende betingelser). Både reduserte og ikke-reduserte prøver ble analysert i 16% Tris-glysingeler (Novex). Gelene ble elektroblottet til nitrocellulosefiltre (Schleicher og Schuell BA-83, " 0, 2 ~). Blottene ble vasket med TBST og deretter inkubert i en blokkeringsløsning med 5% tørrmelk (Car-nation) i TBST i 30 minutter ved romtemperatur. Blottene ble så behandlet med GDNF-antiserum (polyklonale antisera fra kanin rettet mot E. coli-avledet GDNF, 1:1 000 i 5% melk/TBST) i 1 time ved romtemperatur. Blottene ble så renset med TBST og vasket i 1 x 10 minutter og 2 x 5 minutter med 1% melk/TBST. De ble deretter behandlet med anti-kanin-Ig-pepperrotperoksi-dasekonjugert, sekundært antistoff (1:15 000 i-1% melk/TBST) i 20 minutter. Blottene ble renset og vasket med' TBST i 1 x 20 minutter og 2 x 10 minutter fulgt av behandling med ECL-reagenser (Amersham) i 1 minutt og eksponering med "Hyperfilm-ECL" (Amersham).

Følgende prosess beskriver rensing av CHO-uttrykt GDNF og en CHO-avledet, avkortet GDNF-homodimer fra 1 liter kondisjonert medium. Grunnet betydelig proteaseaktivitet i CHO-mediet, noe som førte til kutting av kjeden ved aminosyrerest 31, kan fremgangsmåten omfatte benyttelse av en protease-inhibitor under rensingen.

Trinn 1. Kulekromatografi

Serumfritt, kondisjonert medium ble justert til 20 mM 2-[N-morfolino]-etansulfonat (MES), pH 6,0, ved tilsetning av 1/50 volum 1 M MES, pH 6,0. 25 ml "SP Sepharose Big Bead"-resin (Pharmacia), ekvilibrert med 20 mM MES, pH 6,0, ble tilsatt, og suspensjonen ble omrørt ved 4 °C i 1 time. Resinet ble oppsamlet ved å la det sette seg og dekantering av det kondisjonerte medium. Det dekanterte medium ble filtrert gjennom et frittet sidefilter for gjenvinning av gjenværende resin. Resin som hadde satt seg og resin gjenvunnet ved fil-trering, ble resuspendert og helt i en kolonne med 2,5 cm dia-meter og vasket med tre kolonnevolumer 0,15 M NaCl, 20 mM MES, pH 6,0 (A-buffer). Protein ble eluert med en 300 ml gradient fra A-buffer til 1,0 M NaCl, 20 mM MES, pH 6,0 (B-buffer), ved en gjennomstrømningshastighet på 0,2 kolonnevolumer/minutt mens absorbansen ved 280 nm ble fulgt. Fraksjoner som inne holdt 1,1 kolonnevolurner, ble oppsamlet. Forekomst av GDNF i fraksjonene ble påvist ved Westem-blottinganalyse. Fraksjoner som inneholdt GDNF, ble slått sammen for ytterligere rensing. GDNF eluerte mellom 0,3 og 0,6 M NaCl.

Trinn 2. HPLC C4- kromatografi

Sammenslåtte fraksjoner fra trinn 1 ble justert til 0,1% (vol/vol) trifluoreddiksyre (TFA), vakuumfiltrert gjennom et 0,45 m filter og påsatt en "Vydac C4"-kolonne (0,46 x 25 cm) ekvilibrert med vandig 10% acetonitril, 0,1% TFA (A-buffer). Protein ble eluert med en 2%/minutt lineær gradient over 50 minutter fra A-buffer til vandig 90% acetonitril, 0,1% TFA (B-buffer), mens absorbansen ved 280 nm ble målt. Fraksjoner på 1 ml ble oppsamlet, og forekomst av GDNF ble påvist ved Western-blottinganalyse. GDNF ble eluert mellom 45% og55% acetonitril. Fraksjonene ble tørket under vakuum.

Trinn 3. Høyytelses S- kromatografi

Fraksjoner fra trinn 2 som inneholdt GDNF, ble løst i 1 ml 0,15 M NaCl, 10 mM Tris, pH 8,0, og påsatt en 0,75 x 7,5 cm "TSK-Gel 5WP"-høyytelses S-kolonne (Toso Haas). En lineær gradient på 0,4%/minutt ble kjørt fra 0,15 M NaCl, 10 mM Tris, pH 8,0 (A-buffer) til 1,0 M NaCl, 10 mM Tris, pH 8,0 (B-buffer) over 50 minutter ved en gjennomstrømningshas-tighet på 1 ml/minutt. Fraksjoner på 1 minutt ble oppsamlet mens absorbansen ved 280 nm ble målt. Ved 35% B-buffer ble gradienten endret til 6,5%/minutt over 10 minutter. Western-blotanalyse av fraksjonene viste fire hoved-GDNF-bestanddeler. Tre av bestanddelene ble eluert under 0,4%/minutt-gradienten, mens den fjerde ble eluert under 6,5%/minutt-gradienten. Porsjoner av bestanddelene ble sekvensert. Sekvensanalysene iden-tifiserte en porsjon på tilnærmet 29-36 kD som det avkortede GDNF-protein [Arg32-I le134] . Bestanddelen på tilnærmet 38-40 kD ble identifisert som en heterodimer mellom den avkortede GDNF [Arg32-Ile134] og moden GDNF. Endelig ble bestanddelen på tilnærmet 41-44 kD som ble isolert i den senere del av gradienten, identifisert ved sekvensering som moden GDNF-homodimer.

Eksempel 2

Moden, human GDNF fremstilt i E . coli

Bakteriell ekspresjon av moden, human GDNF kan oppnås 1 samsvar med fremgangsmåten beskrevet i Lin et al. (US patentsøknad nr. 08/182 183, innlevert 23. mai 1994, og dennes utgangssøknader: PCT/US92/07888, innlevert17. september 1992 {WO 93/06116), og europeisk patentsøknad nr. 92921022.7 (publikasjonsnr. EP 610 254). Basert på beskrivelsen i foreliggende oppfinnelse, vil gjennomsnittsfagfolk forstå at en rekke utgangsforbindelser og fremgangsmåter lett kan benyttes eller tilpasses for egnet ekspresjon i E. coli og andre bakterier. For eksempel kan alternative polynukleotider, f.eks. dem avbildet i figurene 1, 3 og 4, benyttes i ekspresjons-prosessen.

Refolding og rensing av uttrykt, moden GDNF

De transformerte celler ble behandlet ved 5 °C {dersom ikke annet er angitt) som følger: cellemasse {3 0 g) ble suspendert i et sluttvolum på 200 ml ved å benytte 25 mM Tris, pH 8,5 tilsatt 5 mM EDTA, for erholdelse av en cellesuspensjon på 15% (vekt/vol). Cellene ble grundig fordelt ved å benytte en håndholdt "Biospec"-homogenisator med lavt skjærmoment. Suspensjonen ble passert to ganger gjennom en mikrofluidisator ved 103 400 kPa for å åpne cellene og frigjøre inklusjonslegemer. Det resulterende homogenat ble så sentrifugert i 30 minutter ved 16 000 x g. Nedsentrifugerte inklusjonslegemer ble vasket ved re suspendering i isvann til et sluttvolum på 240 ml ved å benytte "Biospec"-homogenisatoren som tidligere for å danne en suspensjon. Et uttak av denne suspensjon ble lagret for HPLC-analyse av GDNF-ekspresjonsnivået. Den gjenværende suspensjon ble sentrifugert i 3 0 minutter ved 16 000 x g. Supernatanten ble fjernet, og et lite volum kaldt vann ble tilsatt sentrifugeflasken og omristet forsiktig for å fjerne det løse membranlag som var dannet over de nedsentrifugerte inklusjonslegemer. Nedsentrifugert materiale ble resuspendert med "Biospec"-homogenisatoren ved å benytte et volum av kaldt vann som var tilstrekkelig til å gi en konsentrasjon på 2 mg/ml GDNF. Inklusjonslegemene ble så solubilisert ved å blande den endelige suspensjon av inklusjonslegemer (25 ml) med 8 M guanidin-HCl (25 ml) tilsatt 180 mM cystein-HCl og 50 mM Tris-HCl, pH 8,7. Solubiliseringsblandingen ble omrørt ved 25 °C i 60 til 90 minutter, hvoretter den ble utfelt under omrøring i 2 M urea (450 ml, ved 5 °C) tilsatt 20 mM Tris-HCl, pH 8,75 og 0,2 M guanidin-HCl. Denne refoldingsblanding ble forsiktig omrørt ved 5 °C i 72 timer.

Refoldet GDNF ble delvis renset som følger: 20 mM natriumacetatbuf f er (250 ml, pH 5) ved 5 °C ble tilsatt under hurtig omrøring til refoldingsblandingen, og pH ble justert til 5 med iseddik. Den resulterende utfelling ble fjernet ved sentrifugering ved 13 600 x g i 45 minutter ved 5 °C. Supernatanten fra denne sentrifugering ble benyttet som påsettings-løsning for neste rensetrinn som omfattet kationbytterkromato-grafi med "SP-big bead"-resin (Pharmacia). Kolonnen ble kjørt ved 5 °C med 20 mM natriumacetat (pH 5) som ekvilibrerings-, vaske- og elueringsbuffersystem. Søylematérialet (5 ml) ble renset med 5 kolonnevolumer (CV) 0,2 N NaOH og deretter ekvilibrert med acetatbufferen (5 CV). Påsettingsløsningen (190 ml) ble påsatt kolonnen ved 0,5 CV/minutt fulgt av 10 CV vask med acetatbuffer ved samme gjennomstrømningshastighet. GDNF ble så eluert fra resinet med en 20 CV lineær gradient med NaCl fra 0,3 M til 0,9 M i acetatbufferen ved en gjennom-strømningshastighet på 0,1 CV/minutt. Absorbansen ved 280 nm ble målt i kolonneeluatet som ble oppsamlet som fraksjoner som ble analysert ved SDS-PAGE. Fraksjonene som inneholdt GDNF, ble slått sammen fra fronten av GDNF-toppen ved 10% topphøyde til ryggen av toppen til 10% topphøyde. Proteinet i denne porsjon var utelukkende GDNF og inneholdt, avhengig av den benyttede produksjonsstamme, 32% til 12% kontaminering i form av modifiserte GDNF-former. Porsjonen ble så dialysert mot PBS eller andre preparatbuffere, og i noen tilfeller konsentrert ved ultrafiltrering til 25 mg/ml. Både villtype-GDNF og ana-loge GDNF-former renset ved denne fremgangsmåte, blekarakterisert vedreversfase-HPLC, kationbytter-HPLC, massespektro-metri og måling av endotoksinnivå for å sammenligne renheten av preparatene som ble relatert til de tilsvarende produk-sjons st ammer .

Eksempel 3

Rekombinant fremstilling av avkortet GDNF i E . coli

Eksempler på avkortede GDNF-proteiner ble fremstilt i det vesentlige i samsvar med teknikkene beskrevet i Lin et al.

(US patentsøknad nr. 08/182 183, innlevert 23. mai 1994, supra). Alternative utgangsstoffer og fremgangsmåter for bakteriell ekspresjon som beskrevet ovenfor, kan også benyttes. De E. coli-uttrykte, avkortede GDNF-proteiner omfattet de avkortede GDNF-proteiner [Pro23-Ile134] , [Arg<32->Ile<134>] og [Gly<33->Ile<134>] som avbildet henholdsvis i figurene 5, 6 og 7. Polynukleotidene som koder for disse eksempler på avkortede GDNF-proteiner, ble konstruert som avbildet i figurene 5, 6 og 7, men tilsvarende polynukleotider som dem avbildet i figurene 1, 3 og 4, kan også benyttes. Polynukleotidene ble konstruert ved gjengse PCR-fremgangsmåter som beskrevet i PCR Technology, Principles and Applications for DNA Amplification, Henry A. Erlich, red., Stockton Press, NY, 1989 (kapittel 6: Using PCR to Engineer DNA).

Eksempel 4

Bioanalyse for neurotrof aktivitet overfor dopaminerge neuroner

De E. coli-uttrykte, avkortede GDNF-proteiner [Pro<23->Ile134] , [Arg32-Ile134] , [Gly33-Ile134] og [Lys37-Ile134] fra eksempel 3 og det CHO-avledede, avkortede GDNF-protein [Arg<32->Ile<134>] fra eksempel 1 ble analysert kvalitativt for evne til å fremme dopaminopptak av dopaminerge neuroner fra substantia nigra.

Utgangsforbindelser

Følgende utgangsforbindelser benyttes i en analyse for å anslå overlevelse av dopaminerge neuroner i nærvær av avkortede GDNF-proteiner:

Celledyrkningsmedier

Dulbeccos modifiserte Eagles medium med høy glukose (DMEM, katalog nr. 11965-092), Hams F12-medium (F12, nr. 11765-021), Leibovitz'3L15-medium uten natriumbikarbonat (nr.

41300-039), B27-mediumtilsetning (nr. 17504-010), peni-cillin/streptomycin (nr. 15070-014), L-glutamin (nr. 25030-016), Dulbeccos fosfatbufrede saltvann (D-PBS, nr. 14190-052), Hanks balanserte saltløsning med kalsium- og magnesiumsalter (HBSS, nr. 24020-026), N-2-hydroksyetylpiperazin-N'-2-etansul-fonsyre (HEPES, nr. 15630-015), muselaminin (nr. 23017-015) og bovint serumalbumin, fraksjon V (nr. 110-18-017) var alle fra Gibco, Grand Island, NY. Varmeinaktivert hesteserum var fra HyClone, Logan, Utah. Konalbumin (C-7786), poly-L-ornitin-hydrobromid (P-3655), bovint insulin (1-5500), humant transferrin (T-2252), putrescin (P-6024), progesteron (P-6149), natriumselenitt (S-9133) , metrizamid (M-3383-) var alle fra Sigma Chemical Company, Saint-Louis, MO. Papain, deoksyribo-nuklease I (DNAase) og ovalbumin (papaindissosieringssystem) var fra Worthington Biochemicals, Freehold, NJ.

Sterile 96-brønners mikrotiterplater fra Falcon (nr. 3072), plastutstyr for vevsdyrkning og sentrifugerør av poly-propylen var fra Becton-Dickinson, Oxnard, CA. "Nunc Lab-Tek"-dekkglass for vevsdyrkningskammere (nr. 136439) var fra Bax-ter, Irvine, CA, 20 m (nr. 460) nylonduk var fra Tetko, Elms-ford, NY, og 10 cm disseksjonspinsetter og 10 cm disseksjonssakser var fra Roboz Surgical, Washington, DC.

Antistoffer og beslektede reagenser

Polyklonale anti-tyrosinhydroksylase-antistoffer fra kanin (TE101) var fra Eugene Tech, Ridgefield Park, NJ, polyklonale, anti-neuronalspesifikke enolase-antistoffer fra kanin (NSE, AB951) var fra Chemicon, Temecula, CA, og biotinylert anti-kanin-IgG fra geit og perioksidasekonjugert avidin/bio-tinkompleks ("ABC Elite", "Vectastain-kit PK-6100") var fra Vector Laboratories, Burlingame, CA. 3<1>,3'-diaminobenzidin var fra Cappel Laboratories, West Chester, PA. "Superblock"-blok-keringsbuffer i PBS (nr. 37515) var fra Pierce Chemical Company, Rockford, IL. "Triton X-100" (X100), "Nonidet P-40"

(N6507) og hydrogenperoksid (30%, vol/vol; H1009) var fra Sigma. GBR-12909 dopaminopptaksinhibitor (D-052) var fra RBI, Natick, MA.<3>H-dopamin (tritiert dopamin, NE-131, 21 Ci/mmol) var fra New England Nuclear, Boston, MA. "Optiphase Supermix"-

scintillasjonsblanding var fra Wallac, Turku, Finland. "White ViewPlate-96"-arikrotiterplater (nr. 6005182) var fra Packard Instruments Corporation, Meriden, CT. Alle andre reagenser ble erholdt fra Sigma Chemical Company, dersom ikke annet er angitt .

Fremstilling av medier

Basalmediet ble fremstilt som en 1:1 blanding av DMEM-medium og Fl2-medium og ble tilsatt B27-mediumtilsetning fra en 50 gangers konsentrert lagerløsning. L-glutamin ble tilsatt til en sluttkonsentrasjon på tilnærmet 2 mM, penicil-lin til tilnærmet 100 IU/1 og streptomycin til tilnærmet 100 mg/l. Varmeinaktivert hesteserum ble tilsatt til en sluttkonsentrasjon på tilnærmet 15%. Etter omblanding ble pH justert til tilnærmet 7,3, og mediene ble oppbevart ved 4 °C. Mediene ble fremstilt like før anvendelse for å minimalisere variasjon mellom eksperimentene. Plastpipetter og -beholdere ble benyttet gjennomgående for å minimalisere proteinadsorp-sjon.

Dyrkningssubstrat

For å oppnå optimal festing av substratneuroner og utvekst av neuritter ble mikrotiterplateoverflåtene (dyrkningssubstrat et) modifisert ved på hverandre følgende beleg-ging med poly-L-ornitin og laminih som følger. Plateover-flåtene ble fullstendig dekket med en 0,1 mg/ml steril løsning av poly-L-ornitin i 0,1 M borsyre (pH 8,4) i minst 1 time ved romtemperatur fulgt av steril vask med "Super-Q"-vann. Vaske-vannet ble så avsugd, og en 1,0 g/ml løsning av muselaminin i PBS ble tilsatt, hvoretter platen ble inkubert ved 37 °C i 2 .timer. Disse fremgangsmåter ble utført like før anvendelse av platene for å sikre reproduserbarhet av resultatene.

Fremstilling av substantia niqra- kulturer fra embryonal rotte

Embryonale rottehjerner ble benyttet som kilde for dopaminerge neuroner fra substantia nigra. Drektige Sprague-Dawley-rotter ved embryodag 15 ble benyttet. Maksimalt

36 embryoer (tilnærmet tre kull) ble behandlet pr. eksperi- ment. De drektige rottene ble drept ved behandling med C0I#bukhulene åpnet med disseksjonssakser og fostrene fjernet fra uterus. Fosterhjernene ble så utdissekert og renset for blod og hjernehinne, og det ventrale, tegmentale område som inneholder substantia nigra, ble utdissekert ved å benytte vel-definerte, anatomiske landemerker (Altman og Bayer, Atlas of Prenatal Rat Brain Developent, CRC Press, Boca Raton, FL, 1995). Vevene ble oppsamlet i iskald D-PBS, overført til 10 ml dissosieringsmedium (120 enheter papain og 2 000 enheter DNAase i HBSS) og så inkubert i 45 minutter ved tilnærmet 37 °C i en ristemaskin med roterende plattform ved tilnærmet 200 rpm. Cellene ble så finfordelt ved triturering gjennom flammepolerte Pasteur-pipetter, filtrert gjennom et 20 m Nitex-filter for å fjerne ikke-dissosiert vev, og sentrifugert i 5 minutter ved 200 x g i en IEC klinisk sentrifuge. De nedsentrifugerte celler ble resuspendert i HBSS tilsatt ovalbumin og tilnærmet 500 enheter DNAase, lagt på toppen av en 4% oval-buminløsning (i HBSS) og sentrifugert i tilnærmet 10 minutter ved 500 x g. Det nedsentrifugerte materiale ble resuspendert i fullstendig dyrkningsmedium (se ovenfor), justert til tilnærmet 28 000 celler/ml og utsådd i porsjoner (90 1) i brøn-nene på 6 mm i 96-brønners mikrotiterplater som på forhånd var belagt med polyornitin og laminin. Festing av cellene skjedde raskt, og utsåingseffektiviteten var tilnærmet 75%.

Immunohi st ok j etnisk analyse av dopaminerge neuroner

En indirekte immunoperoksidasefremgangsmåte beskrevet av Louis et al. (J. Pharmacol. Exp. Therap., 262:1274-1283, 1992; Science, 259:689-692, 1993), ble benyttet med mindre modifikasjoner, som følger, for karakterisering av de dopaminerge neuroner i kulturer av substantia nigra. Kulturene ble fiksert i tilnærmet 30 minutter ved romtemperatur med 4% para-formaldehyd i D-PBS, pH 7,4, fulgt av tre gangers vask med D-PBS (200 1 pr. 6 mm brønn). De fikserte kulturer ble så inkubert i "Superblock"-blokkeringsbuffer i PBS, tilsatt 1% NP-40 for å forhøye antistoffenes penetrering. De primære anti-tyro-sinhydroksylaseantistoffer fra kanin ble så tilsatt ved en fortynning på tilnærmet 1:2 000 i samme buffer og inkubert i 1 time ved 37 °C i en roterende ristemaskin. Etter tre gangers vask med D-PBS ble de bundne antistoffer påvist ved å benytte biotinylert anti-kanin-IgG fra geit ved en fortynning på tilnærmet 1:500, og disse sekundærantistoffer ble inkubert med cellene i tilnærmet 1 time ved 37 °C. Cellene ble så vasket tre ganger med D-PBS, og sekundærantistoffene ble påvist med avidin-biotin-peroksidasekompleks fortynnet 1:500, og cellene ble inkubert i tilnærmet 45 minutter ved 37 °C. Etter ytterligere tre gangers vask med D-PBS fikk kulturene reagere i 5-20 minutter i en løsning av 0,1 M Tris-HCl, pH 7,4, tilsatt 0,04% 3',3 *-diaminobenzidin-(HC1)4, 0,06% NiCl2og 0,02% hydrogenperoksid. ;Bestemmelse av neuronal overlevelse ;Substantia nigra-kulturer ble fiksert og prosessert for immunofarging som beskrevet ovenfor, og deretter undersøkt med hvitt lys-optikk ved 200X forstørrelse. Antall neuroner farget for tyrosinhydroksylase, ble tellet i hele brønnen på 6 mm i 96-brønners-mikrotiterplaten. Levedyktige neuroner særpreges ved at de har et normalt formet cellelegeme med en ak-sonlignende hovedutgrening og flere dendrittlignende utgren-inger. Neuroner som viste tegn på degenerering, f.eks. ved å ha irregulære, vakuolerte perikarya eller fragmenterte neuritter, ble ekskludert fra tellingene (de fleste av de degenererte neuroner hadde imidlertid løsnet fra dyrkningssub-stratet). Antall dopaminerge neuronceller ble uttrykt enten som TH-positive neuroner/6 mm brønn, eller som antall gangers endring relativt til kontrolltettheten av dopaminerge neuroner . ;Bestemmelse av dopaminopptak ;Dopaminopptak ble bestemt i kulturer av substantia nigra-neuroner fra 15 dager gamle embryonale rotter som var etablert i hvite "ViewPlate-96"-mikrotiterplater. Kulturene ble vasket med forvarmet opptaksbuffer (tilnærmet 100 1) som besto av en modifisert Krebs-Ringer-løsning, pH 7,4, tilsatt tilnærmet 120 mM NaCl, 4,7 mM KC1, 1,8 mM CaCl2, 1,2 mM MgS04, 32 mM NaHP04, 1,3 mM EDTA og 5,6 mM D-glukose. Opptaksbufferen inneholdt også 1 mM askorbinsyre og 50 M pargylin for å hindre oksidasjon av dopamin. Cellene ble så preinkubert ved 37 °C i tilnærmet 10 minutter i opptaksbuffer. Tritiert dopamin (<3>H-DA, 21 Ci/mmol) ble så tilsatt til substantia nigra-kulturene ved en konsentrasjon på tilnærmet 50 nM i 75 1 opptaksbuffer, og kulturene ble inkubert i tilnærmet ;60 minutter ved 37 °C. Uspesifikt dopaminopptak ble bestemt ;ved å inkubere kulturene med opptaksbuffer tilsatt dopaminopp-taksinhibitoren GBR-12909 (1 M). Uspesifikt opptak represen-terte mindre enn tilnærmet 1% av totalopptaket. Opptaksana-lysene ble stoppet ved avsuging av inkubasjonsmediet fulgt av tre gangers hurtig vask med iskald opptaksbuffer (tilnærmet 120 1). Cellene ble så lysert ved tilsetning av "Optiphase Supermix"-scintillasjonsblanding (200 1), og radioaktiviteten ble bestemt ved seintillasjonsspektrometri ved å benytte en "Wallac MicrobetaPlus" 96-brønners mikrotiterplateteller (dvs. at dopaminopptaket analyseres ved scintillasjonstelling av tilbakeholdt tritium i kulturene). Resultatene uttrykkes enten som dpm/6 mm brønn eller som antall gangers endring relativt til kontrollkulturene. ;Analyser ;Overlevelse og morfologisk utvikling av dopaminerge ;neuroner ;Kulturer av substantia nigra fra rotte ved embryodag 15 (E15) anriket på dopaminerge neuroner, ble benyttet for å ;vise virkningen av avkortede GDNF-proteiner på overlevelse av dopaminerge neuroner. Kulturene ble dyrket i polyornitin- og laminin-belagte 96-brønners mikrotiterplater i opp til ;6 dager, alene eller i nærvær av forskjellige konsentrasjoner ;(i området fra tilnærmet 1 pg/ml til tilnærmet 10 ng/ml) av følgende proteiner: E. coli-uttrykt, moden hGDNF, de E. coli-uttrykte, avkortede GDNF-proteiner [Pro23-Ile134] ,[Arg<32->Ile<134>] , [Gly33-Ile134] og [Lys37-Ile134] , CHO-celleuttrykt, moden hGDNF og det CHO-celleavledede, avkortede GDNF-protein [Arg32-Ile134] . ;Dyrkningsmediet besto av DMEM/F12 tilsatt 15% varmeinaktivert hesteserum (E15-kulturer) eller 2,5% varmeinaktivert hesteserum, D-glukose, HEPES, insulin og transferrin (P6-kulturer) . Immunofarging for tyrosinhydroksylase (TH), det hastighets-begrensende enzym i dopaminbiosyntese, ble benyttet som markør for dopaminerge neuroner. Da noradrenerge neuroner i romben-cefalon også gir positiv farge for TH, ble det utvist stor forsiktighet når det gjelder å utdissekere et område begrenset til det ventrale tegmentum av mesencefalon og for å unngå de mer kaudale områder som inneholder de noradrenerge celle-legemer. Etter 6 dager besto El5-kulturene typisk av 70% neuroner identifisert ved immunofarging for neuronalspesifikk enolase (beskrevet ovenfor), og 30% ikke-neuronale celler (som hadde et flatt, fasemørkt utseende); dopaminerge neuroner ut-gjorde tilnærmet 10-15% av neuronpopulasjonen. ;Etter 6 dager ble kulturene fiksert med paraformal-dehyd og immunofarget for tyrosinhydroksylase, en markør som identifiserer dopaminerge neuroner i disse kulturer. Alle de tyrosinhydroksylasepositive neuroner som forelå i en 6 mm brønn, ble tellet under "brightfield"-optikk. 3 til 6 forskjellige brønner ble analysert for hver eksperimentell betin-gelse. Resultatene ble uttrykt som prosent av antallet tyrosinhydroksylasepositive neuroner i kontro11kulturene. ;Kulturer av El5 substantia nigra behandlet med ;1,0 ng/ml GDNF, CHO-celleuttrykt GDNF eller E. coli-uttrykt GDNF, inneholdt tilnærmet 38%, hhv. 27% flere TH-immunoreaktive neuroner enn ubehandlede kontrollkulturer, noe som tyder på at begge GDNF-typer fremmer overlevelse av dopaminerge neuroner. Kulturer av El5 substantia nigra behandlet med 1,0 ng/ml avkortet GDNF-protein, viste en tilsvarende økning av antall TH-positive neuroner i kulturene etter 6 dager in vitrot42% for det CHO-celleavledede, avkortede GDNF-protein [Arg32-I le134] , og 26% og 17% for de E. coli-uttrykte, avkortede GDNF-proteiner [Arg"-Ile13*] , hhv. [Gly33-Ile134] .

Sammenligning av kontrollkulturer og kulturer behandlet med modne og avkortede GDNF-proteiner, viste også ut-talte virkninger av alle GDNF-proteinene på den morfologiske differensiering av dopaminerge neuroner. Virkningene av de avkortede GDNF-proteiner [Arg32-Ile<134>]og[Gly<33->Ile<134>] var identiske med de tilsvarende, modne GDNF-proteinmotpartene. TH-immunoreaktive neuroner i alle de GDNF-behandlede kulturer viste vesentlig mer komplisert og omfattende neurittarboriser-ing, så vel som en høyere grad av neurittforgrening og en gjennomgående større somastørrelse, enn TH-positive neuroner i kontro11kulturene.

Dopaminopptak

Dopaminopptak måler antallet og aktiviteten av høyaf-finitets dopamingjenopptaks-transportørseter og gjenspeiler den funksjonelle differensiering av dopaminerge neuroner.Dopaminopptak ble målt i kulturer av E15 substantia nigra fra rotte etter 6 dager in vitro, enten med eller uten moden GDNFeller avkortede GDNF-proteiner. I disse kulturer hadde dopaminopptaket en farmakologisk profil som er karakteristisk for dopaminerge neuroner, dvs. at det ble nærmest fullstendig blokkert (mer enn 98%) av 1,0 M GBR-12909, en dopamintrans-portørinhibitor som er spesifikk for dopaminerge neuroner (ID50= 20 nM). Dette antyder at dopaminopptaksmålinger ikke gjenspeiler nærvær av kontaminerende, noradrenerge neuroner som kan ta opp dopamin gjennom norepinefrintransportører, men som ikke er sensitive overfor GBR-12909-inhibering. Virkningene av CHO-celleuttrykt, moden GDNF og det CHO-avledede, avkortede GDNF-protein [Arg32-I le134] var identiske: tilnærmet 65% økning med en EDS0på tilnærmet 20 pg/ml. Det E. coli-uttrykte, avkortede GDNF-protein [Pro<23->Lys<31>Asn<37->Ile<134>] som avbildet i figur 5, viste 65% økning med en EDS0på tilnærmet 40 pg/ml. Virkningene på dopaminopptak av det J5f. coli-uttrykte, modne protein og de E. coli-uttrykte, avkortede GDNF-proteiner [Arg32-Ile134] , [Gly3<3->Ile<134>] og [Lys<37->Ile<134>] var de samme: tilnærmet 50% økning med ED50på tilnærmet 50 pg/ml.

Disse resultater antyder at de avkortede GDNF-proteiner virker som kraftige overlevelsesfremmende og differen-sierings induserende faktorer for dopaminerge neuroner fra substantia nigra. Som sådanne forventes de å være spesielt anvendbare ved behandling av Parkinsons sykdom, en neurologisk forstyrrelse som særpreges ved redusert, emosjonell oppmerk-somhet, reduksjon av både viljestyrt og ufrivillig muskel-bevegelse, muskelrigiditet og tremor. Slike symptomer til-skrives den progressive degenerering av dopaminproduserende neuroner lokalisert i substantia nigra. Degenerering av disse neuroner ("dopaminerge neuroner") fører til en reduksjon av dopamin i et nærliggende område i hjernen som kalles striatum.

Claims

1. Avkortet, gli-acellelinjeavledet, neurotrof faktor-(GDNF)-proteinprodukt, karakterisert vedat det har aminosyresekvensen X- [Cys41-Cys133] -Y, og kjemisk modifiserte derivater derav, hvori [Cys41-Cys<133>] står for aminosyresekvensen fra Cys41til og med Cys<133>som avbildet i figur 1 (SEKV.ID NR. 2), Y står for den terminale karboksygruppe i Cys<133>eller en karboksyterminal aminosyrerest, Ile134, og X står for en metionylert eller ikke-metionylert amingruppe i Cys<41>eller aminoterminale aminosyrerester utvalgt fra gruppen:

2. Avkortet GDNF-proteinprodukt ifølge krav 1,karakterisert vedat X = S RGKGRRGQRGKNRG (SEKV.ID NR.14).

3. Avkortet GDNF-proteinprodukt ifølge krav 1,karakterisert vedat X =RGQRGKNRG(SEKV.ID NR.8).

4. Avkortet GDNF-proteinprodukt ifølge krav 1,karakterisert vedat X =GQRGKNRG (SEKV.ID NR.7).

5. Avkortet GDNF-proteinprodukt ifølge krav 1,karakterisert vedat X =KNRG(SEKV.ID NR.3).

6. Avkortet GDNF-proteinprodukt ifølge krav 1,karakterisert vedat X =NRG.

7. Avkortet GDNF-proteinprodukt ifølge krav 1-6,karakterisert vedat nevnte aminosyresekvens er glykosylert.

8. Avkortet GDNF-proteinprodukt ifølge krav 1-6,karakterisert vedat nevnte aminosyresekvens er ikke-glykosylert.

9. Avkortet GDNF-proteinprodukt ifølge krav 1,karakterisert vedat det er konjugert med en vannløselig polymer.

10. Polynukleotid, karakterisert vedat det koder for et avkortet GDNF-protein ifølge krav 1.

11. Vektor, karakterisert vedat den omfatter et polynukleotid ifølge krav 10 opererbart bundet til en uttrykkingskontrollsekvens.

12. Anvendelse av et avkortet GDNF-proteinprodukt ifølge krav 1 for fremstilling av et medikament til behandling av Parkinsons sykdom.

13 . Anvendelse av et polynukleotid ifølge krav 10 for fremstilling av et medikament til behandling av Parkinsons sykdom, som er passende til å tilveiebringe in vivo-produksjon av nevnte avkortede GDNF-proteinprodukt.

14. Anvendelse av en celle som er transformert med et polynukleotid ifølge krav 10 for fremstilling av et medikament til behandling av Parkinsons sykdom, der cellen tilveiebringer in vivo-produksjon av nevnte avkortede GDNF-protein.

15. Prokaryot eller eukaryot vertscelle,karakterisert vedat den er transfektert med et polynukleotid ifølge krav 10.

16. Fremgangsmåte for fremstilling av et avkortet GDNF-protein, karakterisert vedat den omfatter dyrking av vertsceller ifølge krav 18 i et passende næringsmedium, og eventuelt isolere nevnte avkortede GDNF fra nevnte celler eller nevnte næringsmedium.

17. Fremgangsmåte for fremstilling av et avkortet GDNF-protein ifølge krav 16, karakterisert vedat nevnte vertsceller er E.coli.

18. Fremgangsmåte for fremstilling av et avkortet GDNF-protein ifølge krav 16, karakterisert vedat nevnte vertsceller er kinesiske hamsterovarieceller.

19. Fremgangsmåte for fremstilling av et avkortet GDNF-protein, karakterisert vedat den omfatter trinnene: (a) dyrke en prokaryot eller eukaryot vertscelle som er transformert eller transfektert med en vektor ifølge krav 17, (b) opprettholde nevnte vertscelle ved betingelser som tillater uttrykkingen av avkortet GDNF-protein fra nevnte vertscelle og (c) eventuelt isolere det avkortede GDNF-proteinet som blir uttrykt av nevnte vertscelle.

20. Farmasøytisk preparat, karakterisert vedat det omfatter et avkortet GDNF-proteinprodukt ifølge krav 1 sammen med en farmasøytisk akseptabel vehikkel.

21. Farmasøytisk preparat, karakterisert vedat det omfatter et avkortet GDNF-protein som er fremstilt i henhold til fremgangsmåten ifølge krav 10, sammen med en farmasøytisk akseptabel vehikkel.

22. Farmasøytisk preparat, karakterisert vedat det omfatter et avkortet GDNF-protein som er fremstilt i henhold til fremgangsmåten ifølge krav 17, sammen med en farmasøytisk akseptabel vehikkel.

23. Avkortet GDNF-protein ifølge krav 1,karakterisert vedat det er avledet fra et modent GDNF-protein uttrykt av en rekombinant modifisert bak-teriecelle eller pattedyrcelle.

24. Avkortet GDNF-protein ifølge krav 23,karakterisert vedat modent GDNF-protein blir produsert in vitro eller in vivo.

25. Fremgangsmåte for fremstilling av et farmasøytisk preparat, karakterisert vedat en terapeutisk effektiv mengde av et avkortet GDNF-proteinprodukt ifølge krav 1 blir blandet med én eller flere farmasøytisk akseptable vehikler.

26. Anvendelse av avkortet GDNF-proteinprodukt ifølge krav 1 for fremstilling av et medikament til behandling av skade på nervesystemet forårsaket av sykdom eller skade.

27. Avkortet GDNF-proteinprodukt ifølge krav 1,karakterisert vedat nevnte proteinprodukt er avledet fra en moden GDNF-aminosyresekvens ifølge SEKV.ID NR.2 uttrykt av en rekombinant modifisert vertscelle.

28. GDNF-proteinprodukt, karakterisert vedat det omfatter en dimer av en moden GDNF-aminosyresekvens ifølge SEKV.ID NR.2 og et avkortet GDNF-proteinprodukt ifølge krav 1, der nevnte dimer og nevnte GDNF-proteinprodukt har evnen til å tilveiebringe en neurotrofisk effekt på dopaminerge nerveceller.

29. GDNF-proteinprodukt, karakterisert vedat det omfatter en dimer av to avkortede GDNF-proteinprodukter ifølge krav 1, der nevnte dimer har evnen til å tilveiebringe en neurotrofisk effekt på dopaminerge nerveceller.

30. GDNF-proteinprodukt ifølge krav 29,karakterisert vedat nevnte dimer er en homodimer.

31. GDNF-proteinprodukt ifølge krav 29,karakterisert vedat nevnte dimer er en heterodimer.