TW570926B

TW570926B - Truncated glial cell line-derived neurotrophic factor

Info

Publication number: TW570926B
Application number: TW085111819A
Authority: TW
Inventors: Shaw-Fen Sylvia Hu
Original assignee: Amgen Inc
Priority date: 1995-09-28
Filing date: 1996-09-26
Publication date: 2004-01-11
Also published as: ZA968087B; SK288094B6; JPH11512709A; IL123761A; HK1021823A1; HUP9802262A3; MX9802278A; CN1283659C; CN1197461A; DE69635675D1; AU7074696A; US20040127419A1; SI0920448T1; EA199800301A1; IL144018A0; HUP9802262A2; NZ318697A; JP4153036B2; KR100334739B1; CZ88298A3

Description

登明背景 * 一般而言，本發明係關於在本文中叫做切截之神經膠質細胞株衍生神經營養因子（亦被稱爲神經膠質細胞衍生之神經營養因子或GDNF )的蛋白質，其特徵爲它能夠助長多巴胺系的神經元攝入多巴胺，並支持在帕金森氏症中死亡 <神經元的存活。本發明更特別地關於一種新穎的切截之 GDNF蛋白質。發明背景神經營養因子是蛋白質，在神經系統或在由神經系統支配之非-神經的組織中發現，它的功能是促進存活並維持神經及/或神經膠質細胞的表現型分化（Var〇n等人，

Rev. Neuroscience i : 327, 1979; 丁h〇enen等人，^⑽e 229 :238, 1985)。因爲這樣的生理學角色，可使用神經營養因子來治療在各種神經變性疾病中發生的神經細胞變性和喪失分化功能。爲了使特殊的神經營養因+有用來治療神經損傷的可能性，受到損傷之神經細胞的種類必須是對神經營養因子有感受性的。不同的神經營養因子通常無疑地影響不同種類經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 释，的神經細胞。因此，利用各種不同的神經營養因子來治療每種因爲不同形式之疾病或傷害而受到損傷的神經元是有利的。神經營養因子可保護易感受的神經元，使其免於受到各種無關的侮辱。例如，神經生長因子（NGF)將可解救感覺神經元的重要部份，使其免於因爲切斷其軸突而引起 -4- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（ 210X297公釐）---一~ _________ 570926 A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製五、發明説明f ) Neuro. Sci· Lett. 79 : 65-72，1987)，因爲該疾病之特徵爲在以神經支配紋狀體的中腦處，發生多巴胺系神經元的變性。 L i η等人更描述了新穎神經營養因子的特啟，係從一種得自神'經膠母細胞瘤細胞株Β 4 9、經過調節之培養基的來源中將其純化出來（Schubert等人，Nature 249 : 224-27， 1974 )。先前已經報告了得自該細胞株之經過調節的培養基含有多巴胺系神經營養活性（Bohn等人，Soc. Neurosci. Abs. 15 : 277，1989)。在Lin等人的揭示内容之前，未曾證實神經膠質細胞株-衍生的神經營養因子（GDNF )是個別具有生物活性的物質，或是分離出大體上純的蛋白質。此夕卜，L i η等人描述了選殖編碼GDNF之人類基因的方法、編碼GDNF之人類基因的核酸序列，以及該GDNF蛋白質之胺基酸序列。將GDNF基因繼代選殖到表現載體中，並利用該載體表現出具有生物活性的GDNF。該GDNF蛋白質是一個同二聚體，由兩個134個胺基酸，22kDa構成，藉著雙硫鍵連結亞單元。該説明進一步包含了 GDNF在預防或治療神經損傷，以及諸如帕金森氏症之類神經相關疾病上的用途0 GDNF療法在處理因爲危及一或多種神經細胞之存活及 /或其獨特功能的狀況所引起之神經損傷是有幫助的。這類的神經損傷可能因各式各樣的原因而產生。對於一或多種神經細胞而言，發生神經損傷可能是因爲··（ 1)生理傷害，其引起接近傷害位置之軸突及/或神經細胞本體的變 -6- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 570926 A7 --------- B7 _ 五、發明説明（4 ) -- 性’（2 )暫時或永久地停止血流至一部份神經系統，像是腦溢血；（3)故意或偶然地暴露在神經毒素之下，像是爲了治療癌症而使用的化學治療劑（例如氣氨鉑），或是爲了治療AIDS而使用的二脱氧胞甞（ddc) ; (4)慢性的代謝疾病，如糖尿病或腎機能障礙；或（5)神經變性疾病，諸如帕金森氏症、阿耳滋海默症，以及肌萎縮性側索硬化症 (A L S )，它們導致特定神經元族群的變性。 · GDNF療法在治療涉及黑質之多巴胺系神經元變性的神經變性疾病方面，可能是特別有幫助的，如帕金森氏病。目前對於帕金森氏症的治療只是減緩的手段，企圖增加黑質中多巴胺的含量。GDNF療法的預期影響，不只是單純地在黑質之多巴胺系神經終端處，產生多巴胺系神經傳遞的增加（這將會引起徵候的減輕），還能減慢或甚至使變性過程的進行停止，並修補受到損傷之黑質通路，而使其功旎恢復。也可以在人類患者身上，利用Gdnf來治療其他形式之夕巴胺系神經細胞的損傷或功能失當。這類損傷或功能障礙，可能是由精神分裂症或其他形式之精神病而引起。目前對於這類病狀的治療，僅是對症和必需的藥杨，其作用在多巴胺受體或多巴胺攝入位置上，與可能涉及疾病過程之多巴胺系神經元功能失當的觀點—致，該多巴胺神經元係以神經支配帶有受體的神經元族群。發明概述在一個觀點中，本發明提供新穎的切截之神經膠質細胞株衍生神經營養因子（GDNF)蛋白質產物。在一個具體實本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210x297公釐） II 4 — (請先聞讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 570926 A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製五、發明説明（）施例中，係藉著重組之遺傳工程技術來產製該切截之 GDNF蛋白質。在另一個具體實施例中，係藉著化學技術，或重組與化學技術的組合，來合成該切截之GDNF蛋白質。本發明所產製的切截之GDNF蛋白質產物，包括以胺基酸序列X _ [ C y s 4 1 - C y s 13 3 ] - Y代表的蛋白質。利用圖1之胺基酸殘基編號計劃（序列識別2號），使得比較成熟的GDNF 蛋白質更爲容易。[〇丫541^丫5133]代表如同圖1描述，從 Cys4 1到C y s 13 3的胺基酸序列（序列識別2號）。Y代表 C y s 13 3之羧基終端基團，或11 e 13 4之羧基終端的胺基酸殘基。X代表C y s 4 1之曱硫胺醯基化或非曱硫胺醯基化的胺基，或選自下列基團之胺基終端的胺基酸殘基： G RG NRG KNRG(SEQIDNO : 3) GKNRG (SEQ ID NO :· 4) RGKNRG (SEQ ID NO : 5) QRGKNRG (SEQ ID NO : 6) GQRGKNRG (SEQ ID NO ： 7) RGQRGKNRG (SEQ ID NO : 8) RRGQRGKNRG (SEQ ID NO ： 9) G RRGQRGKNRG (SEQ ID NO : 10) -8- (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 570926 A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製五、發明説明（） KG RRGQRGKNRCx (SEQ ID NO ： 11) GKG RRGQRGKNRG (SEQ ID NO : 12) RGKG RRGQRGKNRG (SEQ ID NO : 13) SRGKG RRGQRGKNRG (SEQ ID NO ： 14) NSRGKG RRGQRGKNRG (SEQ ID NO : 15) ENSRGKG RRGQRGKNRG (SEQ ID NO ： 16) PENSRGKG RRGQRGKNRG (SEQ ID NO ： 17) NPENSRGKG RRGQRGKNRG (SEQ ID NO ： 18) ANPENSRGKG RRGQRGKNRG (SEQ ID NO ： 19) A ANPENSRGKG RRGQRGKNRG (SEQ ID NO ： 20) AA ANPENSRGKG RRGQRGKNRG (SEQ ID NO ： 21) AAA ANPENSRGKG RRGQRGKNRG (SEQ ID NO ： 22) QAAA ANPENSRGKG RRGQRGKNRG (SEQ ID NO ： 23) RQAAA ANPENSRGKG RRGQRGKNRG (SEQ ID NO ： 24) NRQAAA ANPENSRGKG RRGQRGKNRG (SEQ ID NO ： 25) RNRQAAA ANPENSRGKG RRGQRGKNRG (SEQ ID NO ： 26) ERNRQAAA ANPENSRGKG RRGQRGKNRG (SEQ ID NO ： 27) RERNRQAAA ANPENSRGKG RRGQRGKNRG (SEQ ID NO ： 28) RRERNRQAAA ANPENSRGKG RRGQRGKNRG (SEQ ID NO · 29) P RRERNRQAAA ANPENSRGKG RRGQRGKNRG (SEQ ID NO : 30) LP RRERNRQAAA ANPENSRGKG RRGQRGKNRG (SEQ ID NO ： 31) VLP RRERNRQAAA ANPENSRGKG RRGQRGKNRG (SEQ ID NO ： 32) AVLP RRERNRQAAA ANPENSRGKQ RRGQRGKNRG (SEQ ID NO : 33) MAVLP RRERNRQAAA ANPENSRGKG RRGQRGKNRG (SEQ ID NO ： 34) -9- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格(210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 7 570926 A7 B7 五、發明説明（ QMAVLP RRERNRQAAA ANPENSRGKG RRGQRGKNRG (SEQ ID NO ： 35) KQMAVLP RRERNRQAAA ANPENSRGKG RRGQRGKNRG (SEQ ID NO ： 36) DKQMAVLP RRERNRQAAA ANPENSRGKG RRGQRGKNRG (SEQ ID NO ： 37) PDKQMAVLP RRERNRQAAA ANPENSRGKG RRGQRGKNRG (SEQ ID NO ： 38) 企圖將使如此切截的GDNF蛋白質產物，包括具有如同藉

著X - [ C y s 4 1 · C y s 13 3 ] - Y代表之胺基酸序列的切截GDNF 蛋白質，及其變體和衍生物。因此，本發明所產製的切截之GDNF蛋白質產物’亦包括加成、取代和内部刪除的變體，以及藉著x-[cys4i-Cysi33] — Y代表之胺基酸序列的衍生物。切截之GDNF蛋白質產物更包括了甲硫胺醯基化或非甲&胺酸基化形式’以及糖基化或非-糖基化形式的切截之GDNF蛋白質。本發明典型的切截GDNF蛋白質，包括[Argl6-Ilel34]、 [ASn22_Ilel34] 、 [Pr〇23-Ilel34] 、 [Ser26_Ilel34]、 [Arg”_Ile"4]、 [Gly33_Ilel34]、 [Lys37_iiei34]和 [ASn”_„ei34]之切截GDNF蛋白質，是甲硫胺酿基化或非甲硫胺醯基化的，以及其變體和衍生物。目前較佳的本發明之切截GDNF蛋白質，包括[Lys37_nel34^ [ASn38-Ile"4]之切截GDNF蛋白質，是甲硫胺酿基化或非甲硫胺醯基化的，及其變體和衍生物。典型的取代變體爲[AsW Ser”-Ile"4]和[pr〇23_Lys37A As〆 Μ34]之切截·蛋白質。典型的加成變體爲Ser· [Pro23 —Ilei34]之切截 gdnf 蛋白質。 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

經濟部中央標準局員工消費合作社印製 -10- 570926 — _ 丨·五、發明説明（8 A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製在本發明另外的觀點中，可將切截之GDNF蛋白質製成糖基化或非糖基化的形 <。㈣之6刪蛋白質的衍生物，通常涉及將該切截G卿蛋白質附接到水溶性的聚合物上二例如，可以使切截之GDNF蛋白質與一或多種聚乙二醇分子結合，以便減少該㈣之GDNF蛋白質產物在含水環境中的沉澱。本發明的另一個觀點，包括編碼切截之GDNF蛋白f的各種聚核I酸。通常利用這些核酸序列在眞核生物或原核生物的馆主細胞中，表現該切截之GDNF，其中表現產物或其衍生物的特徵爲它們能夠使多巴胺能細胞增加攝取多巴胺。聚核甞酸也可以用在細胞療法或基因療法的應用中。適當之核酸序列，包括在圖中特別加以描述的那些，以及其他簡併的序列，和自然發生的對偶變化。本發明的進一步觀點，涉及含有編碼切截Gdnf蛋白質之聚核苷酸的載體，可有效地連接氨苄青黴素及/或表現控制序列。利用這類載體可穩定地轉化或轉移感染原核生物或眞核生物的宿主細胞，以便表現切截之神經膠質細胞衍生的神經營養因子。本發明更包括切截之GDNF蛋白質的重組產製，其中使如此轉化或轉移感染的宿主細胞在適當的營養培養基中生長，可视需要從該宿主細胞及/或營養培養基中，分離車由該細胞表現的切截之GDNF。本#明還包括編碼切截之GDNF之聚核菩酸和含有這類核：y：酸之載體，在基因療法或細胞療法上的用途。在另外的觀點中，本發明涉及以重組方式產製的GDNF組 -11 - (請先閱讀背面之注意事項再填寫本1) 1- i I - - i - I - ·

、1T 蜂本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 570926 A7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 B7五、發明説明（9 ) 合物，其含有成熟的GDNF蛋白質與一或多個從其中衍生之切截GDNF蛋白質的混合物，其中該成熟的GDNF蛋白質具有大約44kDa的分子量，且其中該切截之GDNF蛋白質具有大約3 6到40kDa之分子量。該GDNF組合物可含有至少兩個切截之GDNF物種，其中第一種具有大約36 kDa之分子量，而第二種則具有大約40kDa之分子量。具有大約 40kDa之分子量的切截GDNF物種，是具有大約22kDa之分子量的GDNF單體和具有大約1 8 kDa之分子量的切截GDNF 單體的雜二聚體。亦企圖爲了治療之用途，從這類混合物中分離出一或多個切截的GDNF物種。本發明的另一個觀點，包括含有切截之GDNF蛋白質產物的醫藥組合物。通常將切截之GDNF蛋白質產物與藥學上可接受的載劑一起調製。可使用各種不同的調製材料，以利於製造、儲存、操作、遞送及/或功效。在本發明另一個觀點中，切截之GDNF蛋白質產物增加了多巴胺的攝取，和多巴胺系神經元的存活。因此，切截之GDNF蛋白質產物特別適合用來治療由傷害或疾病，諸如帕金森氏症，對神經元所引起的損傷。考量以下詳細描述本發明之實施的説明，將使熟諳此藝者明暸本發明的其他觀點和利益。圖片説明在回顧圖片時，將使本發明極多的特徵和優點變得更清楚，其中：圖1描述編碼成熟人類神經膠質細胞株衍生之神經營養 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 12- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐」 570926 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 10 --- 五、發明説明（）卜因子（hGDNF)的核酸序列（序列識別1號）。亦描述成巧人類GDNF蛋白質之胺基酸序列（序列識別2號）。圖2描述爲了表現重組之切截GDNF蛋白質而製造的質體構築體之圖式。圖3描述編碼GDNF和切截之GDNF聚核甞酸的另一種核酸序列（序列識別3 9號）之限制舆圖。圖4描述編碼GDNF和切截之GDNF聚核苷酸的另一種核酸序列（序列識別4 0號）之限制輿圖。

圖 5 描述編碼[p r 〇 2 3 L y s 3 7 △ A s n 3 7 -【1 e 13 4 ]切截 GDNF ’ Λ 蛋白質取代變體（序列識別4 2號）的核酸序列（序列識別4 1 號）。亦可將該蛋白質描述爲Met_Ser-[Pro23_Lys37A A s η3 7 - Π e 1 3 4 ]切截GDNF蛋白質之加成/取代變體。· 圖6描述編碼[Arg3 2-Ile13 4]切截GDNF蛋白質（序列識別4 4號）的核酸序列（序列識別4 3號）。圖7描述編碼[Gly 33-lie134]切截GDNF蛋白質（序列識別4 6號）的核酸序列（序列識別45號）。圖8描述成熟hGDNF之核酸序列（序列識別4 7號），與數個典型的切截GDNF蛋白質：Met-[Arg3 2-Ile1 3 4](序列識別48號）、Met-[Gly33-Ile134](序列識別49號）和 Met-Ser-[Pr〇23-Lys37A Asn37-Ile134](序列識別 50號）的比較。發明詳述以前驅物之形式合成人類神經膠質細胞株·衍生之神經營養因子（hGDNF)，將其加以處理並分泌出134個胺基酸的 -13- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） ----------Φ I — (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

、tT 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 570926 A7 ______B7 Τϊ 1 — _______ 五、發明説明（） — 成一蛋白為。預先決定了諱成熟人類的GDNF具有圖1中描述的胺基酸序列（序列識別2號）。 β 本發明係以可將成熟的GDNF蛋白質縮減尺寸（在本文中也稱作’’修剪’’或”切截”之本發明，或切截之GDNF蛋白質）但仍保留其生物活性的意外發現爲基礎。首先在中國倉鼠即巢（CHO)細胞中重组產製GDNF的期間内，發現被修剪的蛋白質。簡吕之，以下法製備重組的人類GDNF (hGDNF) 。將編碼成熟人類GDNF蛋白質之整個打開密碼的核酸序列，選殖到表現質體内。已經證實該核酸序列是正確的（藉奢走出D N A序列’與在基因銀行中的hGDNF序列相同），並將其轉譯成與公告之成熟人類GDNF序列相同的胺基酸序列（Lin等人，Science 260，1 130-1 132，1993 )。將質體 DNA弄成直線狀，並利用磷酸鈣沉澱法將其轉移感染鉤缺乏-一氫葉酸還原酶的C Η Ο細胞（C Η Ο d-細胞）中。將經過轉移感染的細胞培養在選擇性培養基中，選出在選擇過程中存活的菌落，以便進行個別的hGDNF表現分析。收集得自個別菌落的不含血清之經過調節的培養基，並利用對hGDNF有專一性之抗血清，對其進行西方墨點分析。该抗血清包含了利用在大腸桿菌（Escherichia coli)中表現之重組hGDNF來免疫兔子所謗發的兔子之多株抗體。在還原的條件下，出現在這些試樣中的hGDNF被解析戒兩個主要的帶狀區中，其顯然具有大約22kDa和1 8 kDa之分子量。每個帶狀區分別由大約22 + 22.5kDa和1 8+ 17.5 kDa緊密隔開的雙重體組成（爲了簡化，將這些雙重體稱爲2 2 kDa -14- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） ---------41 — • ^ (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 570926 A7 B7 五、發明説明（和1 8 kDa的帶狀區或物種）。先前已經報告了該GDNF係以藉雙硫鍵結合的同二聚體之形式存在，包括兩個相同亞單位之具有大約2 〇到2 2 kDk之分子量的成熟GDNF蛋白f。當在非還原的條件下分析 GDNF時，報告中説已經確認出3 2到42kDa(Lin等人， Science 260，1130-1132，1993 )，或是33 到 45kDa (Lin 等人，J· Neurochem. 63(2)758-768，1994)的寬闊帶狀區。範圍的存在，被解釋爲係因爲在成熟單體上糖基化作用的異源性，並進一步利用脱-糖基化實驗來證實之。同時出現的2 2 kDa帶狀區，相當於文獻中報告的成熟 GDNF蛋白質，以前未曾報告過i 8 kDa的帶狀區。在由個別純種系收集之試樣中，2 2 kDa和1 8 kDa蛋白質之相對含量是多變化的。此外，發現得自相同純種系的複數收穫物 ’顯示出兩個帶狀區有多變的比例。然而，也發現C H〇_ 表現之GDNF蛋白質的儲藏，通常導致1 s kDa帶狀區出現的增加，同時發生2 2kDa帶狀區的減少。經濟部中央標準局員工消費合作社印製 -- 相 Μ (請先聞讀背面之注意事項再填寫本頁} 當在非還原的條件下，利用西方墨點法來分析得自轉化之CHOd-細胞的經過調節之培養基時，觀察到三個具有3 6 、4 0和44kDa之明顯分子量、完全解析的帶狀區。此一發現亦與先前的報告有顯著差別。這些帶狀區的相對強度是多變的，但是它們與出現在每個試樣中之22*18kDa單體帶狀區的比例，有頗深的相互關係。在利用單株抗體的進一步分析中，證實了在非還原凝膠中的三個帶狀區，相當於由兩個單體組成的三種可能的二聚體。最大的4 4kDa蛋 15- 570926 A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製五、發明説明（白質爲兩個如同先前報告之22kDa成熟GDNF蛋白質的二聚體。中間的40kDa蛋白質，包含其中一個成熟蛋白質在分子量上已被減少到i 8kDa之形式的二聚體。最小的 3 6 kDa二聚體，顯然含有兩個1 8 kDa之蛋白質，也就▲兩個2 2kDa形式在分子量上都已經減少。此數據不僅首次證實了新穎形式之GDNF單體的存在，也證實了以二聚體構型之修剪GDNF蛋白質的存在。亦發現自儲藏之時，t體組合物之試樣朝向修剪形式和相對應的二聚體物種轉移，也就是看到3 6 kDa蛋白質的含量增加。然後進行研究，以便確認是那一部份的蛋白質被除去或改變，而引起與先前報告之成熟GDNF蛋白質分子量相比較的分子量減少。首先證實了分子量的減少，並不袅因爲糖基化作用的改變。 GDNF蛋白質含有兩個可能wN_連結之糖基化位置，並已經被報告其爲經過糖基化了的。然而，經過修剪的蛋白質並非單純地是成熟之GDNF的非糖基化或糖基化不足之形式。這些脱糖基化作用的實驗中被證實了，在其中利用 N_聚醣酶、〇_聚醣酶和神經胺（糖）酸誓酶來處理試樣。在达原的凝膠上’藉著N ·聚醋酶的消化作用，將1 $ 的蛋白質減少到13.5kDa的帶狀區，暗示有等値的4 5kDaiN· 連結糖的存在。利用神經胺（糖）酸苷酶和〇·聚醣酶來處理，引起18kDa的帶狀區稍微被轉移成171^^。這暗示在該蛋白質上存在著0-連結的糖。已經報告了成熟的221^以帶狀區是經過糖基化的，而藉著N _聚醣酶亦被減少到 -16- 本紙張尺度適财酬家標準（CNS ) A4規格（21GX297公釐） " -- ί:1': #11 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 570926 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 五、發明説明（ 18kDa(也就是説，亦被減少了 4 5kDa)。經由在凝膠上使用對該22kDa帶狀區有專一性的單株抗體，進一步加以證貝。非還原之一聚體的聚醣酶消化模式更加複雜，但也是可以解釋的，並符合三種形式最初的分配。因此，然後再查看蛋白質分子量中4 5kDa的減少，結果是因爲大約3 0 - 3 5個胺基酸殘基的刪除，而不是因爲糖基化作用的改變。認爲該刪除作用最可能因爲下列的理由而發生在成熟GDNF蛋白質的胺基-終端。成熟的GDNF總共含有七個胱胺酸。如果刪除作用來自羧基-終端，將會喪失七個胱胺酸中的2到4個，而這可能將產生失活的蛋白質。然而，當使主要含有修剪形式之受試試樣接受生物分析，以便測量其多巴胺系神經元之神經營養活性時，證實該試樣的活性可與在比例上含有較多成熟形式之Gdnf的試樣相比擬。然後經由經過純化之蛋白質的胺基酸序列分析，來定出切開位置。根據製造者的指示，使用Applied Bi〇systems 494A蛋白貝序列儀，以十次循環定出試樣的序列。同時胺基酸序列分析技術和程序，爲熟諳此藝者所熟知，在

Fausset 等人，Electrophoresis 12 : 22_27，1991，和 1990 年 8月24曰提出申請的美國專利申請案第576 316號（歐洲專利申請案第903 10899號，公告編號歐洲專利第423 980號， 1 990年1 〇月4日提出申請，名叫”幹細胞因子”）中提供了訂定蛋白質之序列的進一步説明，其揭示内容均合併幹此以作爲參考。在該分析中定出被修剪之蛋白質的胺基終端爲 17- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） Φ-- ~ Μ (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 570926 A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製五、發明説明（1 "RGQRGK”或 Arg-Gly_Gln_Arg-Gly_Lys。因此在經過調節的培養基中，已經從成熟蛋白質中移除了前31個胺基酸。經過修剪之蛋白質殘餘的胺基酸序列係從胺基酸 Arg32開始，其他的則與圖i中描述的成熟基酸序列（序列識別2號）一致。，發現[AI'g32-Ile134]切截之GDNF蛋白質在多巴胺系神紅元刀析中，以足性爲基礎具有活性的。利用該多巴胺系之神纟工營養活性为析來確認在治療帕金森氏症方面可能是有利的神經營養因子。該分析係以先前描述之分析爲基礎 (Friedman等人，Neuro, Sci. Lett. 79 : 65-72，1987，其揭 7F内答均合併於此以作爲參考），並可包含如Lin等人所描述的修改（參見1994年5月2 3日提出申請的美國專利申請案第〇8/182，183號’及其母專利申請案；i"2年9月1 7日提出申请的PC T/US92/078 88 (WO 93/06116);以及歐洲專利申請案第92921022.7號（公告編號歐洲專利61〇 254號））。在下文的實例5中提供該分析的詳細説明。 * 在胺基酸可定序列之後的後續純化程序，導出其他蛋白質的發現，從其中已經由成熟GDNF的N 終端處移除3 6個胺基酸殘基：[Lys37-Ile134]切截之GDNF蛋白質，具有 KNRG(C)VL -的N -終端序歹ij 。此夕卜，經過修剪之蛋白質殘餘的胺基酸序列，與成熟人類GDNF胺基酸序列的那些胺基酸序列一致。亦在多巴胺攝取的生物分析中，分析 [Lys37-lie134]切截之GDNF蛋白質。發現該切截之GDNF 蛋白質具有ED50約爲50微微克/毫升的活性，類彳以經過 18- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（21〇χ297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -訂_ 57〇926 A7

可以在某些組織中、在活體内發生。經濟部中央標準局員工消費合作社印製此外，發現了成熟的大腸桿菌_表現之hGDNF的衍生物，如聚乙二醇化的GDNF(亦描述在Lin等人，美國專利申請案第08/182，183號中，在前），可在chq-調節之培養基的存在下，被加工成切截的形式。可在胺基終端將成熟的 DNF聚乙二醇化，以便促進其在循環中的清除時間。聚乙二醇化作用增加了蛋白質的大小’而經過修改的成熟 GDNF，在還原的條件下移動到大約45kDa之處。像未聚乙二醇化的成熟形式-€ ’將聚乙二醇化之大腸桿菌 GDNF與C Η 0細胞（未被轉移感染的）調節之培養基一起炉養，產生12.5kDa之帶狀區。在這兩個案例中，該12.讣加 -19- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210x297公釐） 570926 A7 B7 五、發明説明（經濟部中央標準局員工消費合作社印製之物種均以雙硫鍵結的一聚體形式存在，如同在非·還原凝膠上所'顯示的。從N-終端聚乙二醇化之成熟蛋白質中產生修剪形式，進一步證實了修剪事件發生在蛋白質的N_終端，因爲在修剪過程中喪失了聚乙二醇化的殘基。 ' 以這些發現爲基礎’且因爲修剪事件亦可能發生在活體内，所以切截形式之GDNF蛋白質可以是在生理條件下， hGDMF經過最後天然加工的形式。因此，爲了治療之用途而產製切截之GDNF蛋白質或其衍生物被視爲是有利的。例如，直接表現或合成的切截之GDNF蛋白質，諸如 [Arg3 2-Ile 134]切截之GDNF蛋白質，將預期它們對上述之蛋白水解活性是具抵抗力的。然而，若想要產製切截之 GDNF的衍生物，諸如聚乙二醇化的[a r g3 2 -11 e 13 4 ]切截之GDNF蛋白質，將會預期所得之衍生物具有的優點，不是對專一性修剪有感受性的，這是在成熟GDNF蛋白質中觀察到的。 » 也可以預期到切截之GDNF蛋白質產物的其他優點。首先，切截蛋白質，如[Arg3 2-lie134]切截之GDNF蛋白質的 pi，將會從大約10降至大約8.0-8.5。這使得該蛋白質明顯地減少了鹼性，而能夠依序提供有利的影響，包括較佳的受體結合，並在諸如脊髓腔内注射部位之類的投藥部位降低細胞毒性。其次，在成熟GDNF之胺基酸序列的前2 6個胺基酸中，爲兩個脱醯胺的位置：Arg-Asn-Arg(胺基酸 14_16)，以及Glu-Asn-Ser(胺基酸24_26)。在缺乏這些位置其中一個或兩個的切截之GDNF蛋白質中，預期將或 . 丨、 -20- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（21〇χ297公釐） > «m —ϋ I 111 --- I. i #! (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂經濟部中央標準局員工消費合作社印製 570926 A7 ______ B7 ： '""" ------—_______ 五、發明説明（）增加該蛋白質的穩定性。切截之GDNF蛋白質產物在基本的具體實施例中，本發明的切截之GDNF蛋白質可藉著下列的胺基酸序列來表示，其中係使用圖〗的胺基酸殘基編號計劃，以便與成熟的GDNF蛋白質相比較：

X_[Cys41-Cys133]-Y 其中 .

[Cys41-Cys133]代表如圖1(序列識別2號）中描述的〇丫841到〇丫8133之胺基酸序列； Y代表C y s 13 3之羧基終端基團或11 e 13 4之羧基終端的胺基酸殘基；且 X代表C y s 4 1之甲硫胺醯基化或非曱硫胺醯化的胺基，或選自下列基團的胺基-終端的胺基酸殘基：

G RG NRG KNRG (SEQ ID NO ： 3) GKNRG (SEQ ID NO ： 4) RGKNRG (SEQ ID NO : 5) QRGKNRG (SEQ ID NO : 6) GQRGKNRG (SEQ ID NO : 7) -21 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） Φ II 』 · Μ (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁} 、11' 19 570926 A7 B7 五、發明説明（） * RGQRGKNRG (SEQ ID NO ： 8) RRGQRGKNRG (SEQ ID NO : 9) G RRGQRGKNRG (SEQ ID NO ： 10) KG RRGQRGKNRG (SEQ ID NO ： 11) GKG RRGQRGKNRG (SEQ ID NO ： 12) RGKG RRGQRGKNRG (SEQ ID NO ： 13) SRGKG RRGQRGKNRG (SEQ ID NO : 14) NSRGKG RRGQRGKNRG (SEQ ID NO : 15) ENSRGKG RRGQRGKNRG (SEQ ID NO ： 16) PENSRGKG RRGQRGKNRG (SEQ ID NO ： 17) NPENSRGKG RRGQRGKNRG (SEQ ID NO ： 18) ANPENSRGKG RRGQRGKNRG (SEQ ID NO ： 19) A ANPENSRGKG RRGQRGKNRG (SEQ ID NO ： 20) AA ANPENSRGKG RRGQRGKNRG (SEQ ID NO ： 21) AAA ANPENSRGKG RRGQRGKNRG (SEQ ID NO ： 22) QAAA ANPENSRGKG RRGQRGKNRG (SEQ ID NO ： 23) RQAAA ANPENSRGKG RRGQRGKNRG (SEQ ID NO ·· 24) - . s 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 -» a (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) NRQAAA ANPENSRGKG RRGQRGKNRG (SEQ ID NO ： 25) RNRQAAA ANPENSRGKG RRGQRGKNRG (SEQ ID NO ： 26) ERNRQAAA ANPENSRGKG RRGQRGKNRG (SEQ ID NO ： 27) RERNRQAAA ANPENSRGKG RRGQRGKNRG (SEQ ID NO ： 28) RRERNRQAAA ANPENSRGKG RRGQRGKNRG (SEQ ID NO : 29) P RRERNRQAAA ANPENSRGKG RRGQRGKNRG (SEQ ID NO ： 30) LP RRERNRQAAA ANPENSRGKG RRGQRGKNRG (SEQ ID NO ： 31) -22- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐）經濟部中央標準局員工消費合作社印製 570926 A7 B7 五、發明説明Γ ) VLP RRERNRQAAA ANPENSRGKG RRGQRGKNRG (SEQ ID NO ： 32) AVLP RRERNRQAAA ANPENSRGKG RRGQRGKNRG (SEQ ID NO ： 33) MAVLP RRERNRQAAA ANPENSRGKG RRGQRGKNRG (SEQ ID NO ： 34) QMAVLP RRERNRQAAA ANPENSRGKG RRGQRGKNRG (SEQ ID NO ： 35) KQMAVLP RRERNRQAAA ANPENSRGKG RRGQRGKNRG (SEQ ID NO ： 36) DKQMAVLP RRERNRQAAA ANPENSRGKG RRGQRGKNRG (SEQ ID NO ： 37) PDKQMAVLP RRERNRQAAA ANPENSRGKG RRGQRGKNRG (SEQ ID NO : 38) • Λ 當本文中使用’’切截之GDNF蛋白質產物” 一詞時，包括具有生物活性之合成或重組的切截之GDNF蛋白質、得自成熟GDNF的切截之GDNF蛋白質產物、具有生物活性的切截之GDNF變體（包括插入、取代和刪除的變體），以及其化學修改的衍生物。也包括大體上與人類GDNF蛋白質同源，具有在序列識別2號中陳述之胺基酸序列的切截之 GDNF蛋白質。當本文中使用，，生物活性，，一詞時，意指該切截之GDNF 蛋白質顯露出類似神經營養的特性，但不一定是像具有序列識別2號中陳述之胺基酸序列的GDNF蛋白質一樣巧全部特性，也不一定是同樣的程度。依據所投予之切截GDNF 蛋白質產物的用途，來選擇感興趣之特定神經營養特性。切截之GDNF蛋白質產物具有生物活性’ I顯露出多巴胺系神經元的生存特徵，類似利用作爲代表性生物分析之多巴胺攝取和酪胺酸羥化酶（TH)表現，如同在下文實例中所討論的，由成熟的GDNF蛋白質顯露出的。 -23- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（21〇X 297公釐） ------------ -- - (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 570926 A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製五、發明説明（21 ) 當本文中使用”大體上同源的” 一詞時，意指與具有序列識別2號中陳述之胺基酸序列的人類GDNF，同源的程度較好是超過7 0 %，更佳的是超過8 0 %，而再佳的是超過9 0 % ，甚至高達9 5 %。在本文中説明的同源性之百分比，係按照在兩個序列的較小序列中所發現之胺基酸的百分比來計算，將欲比較之序列中相同的胺基酸殘基排整齊，此時可 100個胺基酸長的地方將四個缺口導入，以便協助排列，如同 Dayhoff 在 Altas of Protein Sequence and Structure 第 5 册，124 頁（ 1972)，National Biochemical Research Foundation, Washington，D.C.中所陳述的，其揭示内容均合併於此以作爲參考。大體上同源的也包括可以藉著與序列識別2號之 GDNF的抗體發生交互反應來分離的任何切截之GDNF蛋白質，或是其基因可經由與編碼序列識別1號之GDNF的基因或基因片段雜交來分離的切截之GDNF蛋白質。在閲讀了本發明説明之後，熟諳此藝者將會知曉，大體上同源的蛋白質將涉及從以X-[Cys4 kCys 133]-Y代表之切截GDNF蛋白質的胺基酸殘基中發生一或多個的刪除，或是對其加成或取代。在下文中會更詳細地描述這類變體的產製。將會進一步察知，因爲本發明清楚地稱呼”切截之 ” GDNF蛋白質，胺基-終端加成的變體預期包括甲硫胺酸殘基，或非-GDNF之胺基酸殘基或序列的添加，但是並未包括添加會導致成熟GDNF蛋白質再建構的胺基酸殘基。以天然存在的對偶突變體或變體爲基礎的切截之GDNF蛋白質，亦在本發明的範圍内。在下文中更詳細地描述變體 -24- ------------ J*rt (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

、1T 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ297公釐） 570926 A7 B7 22 五、發明説明之切截GDNF蛋白質的產製。 · (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

Lin等人（美國專利申請案第08/182,183號，在前）描述了在叛基終端，藉著第六和第五殘基之L y s - A r g殘基的蛋白水解過程，分別從成熟gdnf之羧基終端，切截成熟gdnf 的作用、（也就是根據圖1之胺基酸殘基編號的LyS2 9 _ Arg13〇(亦如同序列識別1號或序列識別2號中的）。這樣的切截作用，將會從成熟的GDNF蛋白質中除去兩個半胱胺酸。這將可能造成蛋白質不適當的折疊，並因此將導致失活蛋白質的形成。相反的，本發明之X _ [ C y s 4 1 - C y s 1 3 3 J _ Y切截之GDNF蛋白質產物，保留了 Cys13 1和Cys133殘基 ’並藉奢多巴胺攝取分析證實了它是有活性的蛋白質。經濟部中央標準局員工消費合作社印製在本發明的一個具體實施例中，較佳的切截之GC)N,Fi白質產物缺少一或多個脱醯胺位置。這類脱醯胺位置的缺少 ’將會導致經過純化之蛋白質增進其生化穩定性，並減少可能的降解產物，藉此產生更具儲藏穩定性的蛋白質。典型切截之GDNF蛋白質產物是切截之gdnf 蛋白質，其缺乏另一個也可以引導成熟蛋白質之脱醯胺作用的位置。此外，[Arg16-lie 13 4]切截之GDNF蛋白質，至少會缺之出現在成熟蛋白質中的第一個脱醯胺位置。目前較佳的切截之GDNF蛋白質產物爲[Arg3 2 _ he 13 4] 切截之GDNF蛋白質。該切截之GDNF蛋白質缺少位在或接近使成熟蛋白質發生蛋白水解修剪的位置。因此，預崎該切截之G D N F蛋白質對於可能在活體内發生的加工處理是有抵抗力的。其他目前較佳的切截之GDNF蛋白質產物爲 -25- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 570926 A7 B7 五、發明説明< [CyS37·Ilel34]切截之GDNF蛋白質。該切截作用更轉少了切截蛋白質的p I，如同其中分別從N -和c -終端移除高達並包含G1 y 4 0和π e 1 3 4的其他切截作用。現在最佳的切截之GDNF蛋白質產物，保留了所有在成熟GDNF蛋白質中發現的半胱胺酸，但缺少任何在表現和製造期間，或是在下列的活體内投藥時，關於切截之GDNF蛋白質迅速蛋白水解加工的可辨別位置。這些較佳的蛋白質包括[Arg32-Ile134]、[Gly33_Ilel34]、[Gln34-Ilel34]、[Arg35- lie ]、[ G ly3 6 -11 e 13 4 ]、[ Ly s 3 7 -11 e 13 4 ]、[ A sn3 8 _ 116134]和[八1^3 9“卜13 4]切截之(}1^17蛋白質產物。類似先前由Lin等人（美國專利申請案第07/855,413號，在别）對於成熟GDNF所描述的結果，本發明之切截GDNF 蛋白貝已經顯露出藉著黑質之多巴胺系神經元的胚胎前驅物，來增加多巴胺攝取的能力。在下文的實例4中更進一步描述了切截之GDNF蛋白質的生物分析。經濟部中央標準局員工消費合作社印製 !||4丨_ (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 通常分離和純化該新穎的切戴之Gdnf蛋白質，以便形成大把上不含其他（非-GDNF)蛋白質性物質存在的切截之 GDNF蛋白質。較佳的是切截之GDNF蛋白質產物約有8 〇 % 不含其他的蛋白質，可因爲在製造切截之gDNF蛋白質產物中所使用的產製技術而使其出現。更佳的是該切截之 GDNF蛋白質產物約有9〇%不含其他的蛋白質，特佳的是約有9 5 %不含其他的蛋白質，而最佳的是大約〉9 8 %不含其他的蛋白質。此外，本發明供給提供製造同質性切截之 GDNF蛋白質之聚核苷酸序列的獨特優點。例如，使用編

24 24 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 570926 A7 B7 五、發明説明（）、 • Λ 碼[Arg32-Ile134]切截之GDNF蛋白質的聚核苷酸序列，容許在大腸桿菌及其他適當的表現系統中，重組產製該切截之GDNF蛋白質。換句話説，該新穎的聚核苷酸容許產製對蛋白水解之加工處理不敏感，或是對這類加工處理或如同上述的其他生化加工影響具有降低之敏感性的切截之 GDNF蛋白質。因此，該新穎之聚核嘗酸使得製備及/或分離單一物種之切截GDNF蛋白質更爲容易，並因此使切截之GDNF蛋白質及/或其產物不含或含有減低含量的上述異·或同二聚體之混合物。然而，將會明瞭到最後的切截之GDNF蛋白質可在投藥之前，與其他頂子、化學組合物及/或適當之藥學調配物質混合，如同在下文中詳細描述的0 在本發明的一項觀點中，經由重組技術來有利地產製切截之GDNF蛋白質，因爲它們能夠以較高的純度，達較高含量的蛋白質。重組的切截之GDNF蛋白質形式包括該蛋白質的糖基化和非-糖基化形式，且該蛋白質在細菌、哺乳動物或昆蟲細胞系統中表現。另外，該切截之GDNF蛋白質也可以是化學合成的。在下文中更詳細地描述目前較佳的產製方法。切截之GDNF變體和衍生物 A.切截之GDNF變體本發明的其他觀點包括切截之GDNF蛋白質的變體、當本文中使用”切截之GDNF蛋白質產物” 一詞時，包括從天然存在之GDNF的胺基酸序列内的殘基中，已經刪除了騎基 -27- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -- < > 屬會 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) -訂 570926 A7 、發明説明（ 25 經濟部中央標準局員工消費合作社印製酸（”刪除變體”# (，^.4 " }插入妝基酸（”插入變體"），或將莫取代甞酸微彳卜道、1蛋白貝。這類變係藉著將適當的核六、、工A 贫曰貝又DNA中，或疋精著想要蛋白質在活隨外的化學合成來借 ^ * 成术I備您。熟請此藝者將會察知可以 :種組合的刪除、插人和取代作用，其限制條件爲最後的蛋白質必須具有GDNF之生物活性。 …、叫此藝者热知有關一或多個選定胺基酸殘基之置換、插入或刪除的突變生成技術（例如，美國專利第4,518,584 j其揭示内容均合併於此以作爲參考）。在胺基酸序列變體：建構作用巾，有兩個主要的變數：突變位置所在之處和突變的性質。在設計切截之GDNF變體時，突變位置所在又處和突變的性質將依據待修改的生化特徵。可以個別地或連續地修改突變的位置，例如藉著（1)首先利用保守的胺基酸選擇，然後利用較激進的選擇，係依據所要達到的結果，（2)刪除該目標胺基酸殘基，或（3)在鄰近已設定位置之處插入胺基酸殘基。胺基酸序列的刪除通常範圍在大約1到3 〇個胺基酸殘基之間’較常見的是從大約1到1 〇個殘基，而代表性的是從大約1到5個殘基。例如，位在n _終端到C y s 4 1之胺基酸殘基的” X "部份的刪除作用中，可能範圍在大約1到3 〇個殘基之間，而在[C y s 4 1 - C y s 13 3 ]的半胱胺酸殘基之間的刪除作用，通常是從大約1到5個殘基，係依據免於使蛋白質折疊破裂的位置而定。在切截之GDNF蛋白質中的刪除作用，可以在與轉化生長因子-/?(TGF-y5)之家族成員具有 28 表紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（21〇x297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 I I - —二·-- - m n^i · 570926 經部中標準局員工消費合作社五發明説明（26

車父低同源性的區域上彳隹 ,t ^ ^ η Λ k仃。在大體上與其他T OF家族序列同源之區域上，竹+ #、 A 攸切截惑GDNF蛋白質中删除，將更有可能修改了較重要的& & I要的生物活性。將會選擇總刪除及/或 ^貝刪除的數里’以便保護切截之GDNF蛋白質在受到影響之功能部位’例如半胱胺酸交聯中的三級結構。胺基酸序列的加成作用，可包括胺基-及/或幾基-終端的融^ ’其長度範圍從_個殘基到m更多的殘基，乂及單或夕數胺基酸殘基的内部序列内插入作用。内部加成作用的範圍通常可從大約i到丨〇個胺基酸殘基，較具代表性的是從大約丨到5個胺基酸殘基，通常是從大約丨到3 個胺基酸殘基。如同上述，意圖使本發明之胺基-終端的加成夂fa，包括曱硫胺酸（例如，像是在細菌重組之細胞培養中’ GDNF之直接表現的人工製品），或非_ GDNF之胺基酸殘基或序列的加成。胺基-終端加成變體並未包含將會導致成熟GDNF蛋白質再建構之胺基酸殘基的加成。終端g入的較佳實例，包括異源性-N -終端信號序列與N —終端的融合’而使得從重組的宿主細胞中分泌該蛋白質更爲容易。這類信號序列通常將會從預定的宿主細胞物種中獲得，並因此與之同源。插入或加成作用也可以包括衍生自其他神經營養因子之序列的胺基酸序列。其他種類的變體爲胺基酸取代變體。這些變體至少有一個在切截之GDNF蛋白質中的胺基酸殘基被移除，並將一個不同的殘基插入其位置中。參見例如圖5，其中蔣天然存在的A s η 2 2更換爲S e r，以便進一步移除M e t殘基。利用 C請先聞讀背面之注意事項存填寫本頁) 訂

本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 570926 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 -------- B7 ___五、發明説明（27 ) " ~~；- X-[Cys4i-Cys133]-Y胺基酸序列代表，以及本定義之切截之GDNF蛋白質產物，可將這類的切截gdnf蛋白質稱爲取代變體Met-[AsnW^Ser22_Ilel34]切截之gdnf蛋白質，或加成變體Met-Ser-[Pr〇23]lel34]切截之gdnf蛋白質。取代變體包括對偶變體，其特徵爲在物種族群中自然發生的核省:酸序列改變，其可能或可能不會導致胺基酸的改變。切截之GDNF蛋白質的序列專一性突變，可能涉及糖基化位置的修改（例如，絲胺酸、蘇胺酸或天冬醯胺）。糖基化作用的缺少或只有部份的糖基化作用，可能起因於在任何天冬醯胺-連結之糖基化辨認位置之處，或在任何藉著加入 Ο -連結之碳水化合物來修改蛋白質的位置之處，有胺基酸的取代或刪除。一個天冬醯胺_連結的糖基化辨認位置包括可由適當的細胞糖基化酵素專一性辨認出的三肽序列。這些二肽序列爲Asn-Xaa-Thr或Asn-Xaa_Ser，此處之 Xaa可以是任何pro以外的胺基酸。在糖基化辨認位置的第一或第三個胺基酸位置中的一或兩個之上，各種胺基酸的取代或刪除（及/或在第二個位置處的胺基酸刪除），會導致經過修改之三肽序列的非·糖基化作用。因此，適當改變之核甞酸序列的表現，產生了該位置處未被糖基化的變體。另外，可將序列修改成在切截之GDNF蛋白質中加入糖基化位置。將一種確認切截之GDNF胺基酸殘基或突變生成區域的方法叫做”丙胺酸掃描突變生成法”，如同Cunningham和 .___ -30- · 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) i m In 訂 Αν·. 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 570926 A7 B7 五、發明説明（）

Wells所描述的（Science，244 : 1081-1085，1989)。在此方法中，確認胺基酸殘基或一群目標殘基(例如帶電荷的殘基，像是Arg、Asp、His、Lys和Glu) ’並藉著中性或帶負電荷的胺基酸來替換之（最佳的是丙胺酸或聚丙胺酸），以便完成胺基酸與在細胞内或外侧之周圍含水環境的交互作用。然後藉著在取代位置導入額外或其他的殘基，#那些被證實對取代作用有功能敏感性的功能部位精製。因此，預先決定導入胺基酸序列修改的位置，並在指定的位置上使突變的效率達到最高，可經營丙胺酸掃描或隨機的突變生成，並篩選具有想要活性及活性程度之最佳組合的變體。對於取代突變生成，最感興趣的位置包括在得自各種物種之GDNF蛋白質中找到的胺基酸，它大體上在側鏈主體、電荷及/或忌水性等方面是不同的。其他感興趣4位置，包括其中獲自各種物種的類似· GDNF蛋白質之特定殘基是相同的那些。這類位置通常對蛋白質之生物活性是彳+重要的。一開始藉著取代作用，以相對上較保守的方式來修改這些位置。在表1中，在較佳取代物的標題之下顯示這類保守的取代作用。如果這類取代物導致生物活性的改變 ’此時導入更豐冨的改變（代表性的取代物），及/或可以進行其他的加成/刪除作用，並篩選所得的產物。 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

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570926 A7 B7 五、發明説明（) 表1 胺基酸取代作用經濟部中央標準局員工消費合作社印製原始殘基較佳的取代物代表性的取 Ala(A) Val Val; Leu; lie Arg(R) Lys Lys; Gin; Asn Asn(N) Gin Gin; His; Lys; Arg Asp(D) Glu Glu Cys(C) Ser Ser Gln(Q) Asn Asn Glu(E) Asp Asp Gly(G) Pro Pro His(H) Arg Asn; Gin; Lys; Arg He(I) Leu Leu; Val; Met; Ala Phe;正亮胺酸 Leu(L) lie 正亮胺酸;lie; Val Met; Ala; Phe Lys(K) Arg Arg; Gin; Asn Met(M) Leu Leu; Phe; lie Phe(F) Leu Leu; Val; lie; Ala Pro(P) Gly Gly Ser(S) Thr Thr Thr(T) Ser Ser Trp(W) Tyr Tyr Tyr(Y) Phe Trp; Phe; Thr; Ser Val(V) Leu lie; Leu; Met; Phe; Ala;正亮胺酸 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 32 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 30570926 A7 B7 五、發明説明（經濟部中央標準局員工消費合作社印製預期對胺基酸序列的保守修改（以及對於編碼核酸序列的相對應修改）’產生切截之GDNF蛋白質，具有類似如下文實例中描述之切截GDNF蛋白質的那些功能和化學特性。相反的，在切截之GDNF蛋白質的功能及/或化學特性上的豐富修改，可藉著選擇取代物來完成之，該取代物在它們對於維持（a)在取代物區域中的多肽主鏈結構，例如像是片狀或螺旋構象，（b)蛋白質在目標位置的電荷或忌水性，或（c)侧鏈的主體之影響上有明顯的差異。天然存在的殘基，以一般側鏈特性爲基礎而被分成數群： 1)忌水性的：Met、Ala、Va卜 Leu、lie ; · 2 )中性忌水性的：Cys、Ser、Thi* ; 3) 酸性的：Asp、Glu ; 4) 鹼性的：Asn、Gin、His、Lys、Arg ; 5 )影響鍵方向的：Gly、Pro ;以及 6 )芳香族的 Trp、Tyr、Phe ° 非-保守的取代物可涉及這些群中的一員與其他成員的交換。可將這類被取代的殘基導入切截之GDnF蛋白質與其他TGF- 蛋白質同源的區域中，或將其導入該蛋白質之非·同源的區域中。 B ·切截之GDNF衍生物了由為清本文提供之揭示内容的技師，來製備切挺之 GDNF 或切截之GDNF變體的化學修改衍生物。最適合切截之GDNF蛋白質衍生作用的化學部份包括水溶性聚合物。想要水溶性的聚合物，因爲將蛋白質附接於其上時，不會

(請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 4 訂

I I - - - - II 570926 、發明説明^ 在邊如生理學環境之類的含水環聚人舲嵙、人制衣兄肀心巍。較佳的是，該 h t備治療產物或組合物而言將是藥學上可接受 X热請此藝者將能夠選擇想要的聚合物，係㈣聚合物 /蛋白質共物是否將被使用在治療上，而如果是這樣，要的劑量、循環時間、對蛋白水解作用的抵抗力及八他考量之類的考量爲基礎。衍生作用的效力，可藉著以想要的形式來投予該衍生物來探知（也就是藉著滲透幫浦，或更佳的藉著注射或輸液，或進一步爲了口服、肺部或其他遞送途徑來調製的），並定出它的效力。週當的水溶性聚合物包括但不限於聚乙二醇（pEG)、乙二醇’丙二醇共聚物、單甲氧基-聚乙二醇、羧甲基纖維素、葡聚醣、聚乙晞醇、聚乙晞吡咯烷酮、聚_丨，3 _二氧戊環、聚· 1，3，6 -三呤烷、乙晞/順丁烯二酸酐共聚物、多元胺基酸（同聚物或任意的共聚物）、聚（正_聚乙烯吡咯烷酮）聚乙二醇、聚丙二醇同聚物、聚環氧丙烷/環氧乙烷共聚物、聚氧乙基化之多元醇（例如甘油）、聚乙二醇丙醛，及其混合物。當在本文中使用時，聚乙二醇意味者包括已經使用在衍生其他蛋白質的任何形式之PEG，諸如單經濟部中央標準局員工消費合作社印製烷氧基或芳氧基-聚乙二醇。聚乙二醇丙醛在製造上也可能疋有利的’因爲b在水中的穩定性。該聚合物可以具有任何的分子量，且可以是分支或未分支的。本發明特別關於切截之GDNF蛋白質產物，包括與至少— 個P E G分子連結的切截之GDNF蛋白質。在其他的觀點中 ’本發明係關於經由酿基或燒基連結，與至少一個p E G分 -34 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 570926 Α7 Β7 32 -—：- 五、發明説明（) 子附接的切截之GDNF蛋白質。 · 可藉著此項技藝中已熟知的任何聚乙二醇化反應來完成聚乙二醇化作用。參見例如：Focus on Growth Factors 3(2) :4_ 10 (1992);歐洲專利〇 154 3 16號；歐洲專利0 401 384 號；以及Malik等人，Exp. Hematol· 20 ·· 1028-1035 (1992)( 報告使用崔斯基（tresyl)氯的G Μ - C S F聚乙二醇化作用）。較佳的是與具反應性的水溶性聚合物，經由醯基化反應或烷基化反應來完成聚乙二醇化作用。在下文中更詳細地討論這些衍生作用的較佳方法。關於醯基化反應，該聚合物最好是選擇具有單一反應性的酯基團。關於還原烷基化反應’該聚合物最好是選擇具有單一反應性的醛基團。此外 ’可將選定的聚合物修改成具有單一反應性的基團，譜如酷基化作用的活性g旨或燒基化作用的趁，以便於可控制聚合作用的程度。一般而言，水溶性的聚合物將不會選自天然存在的糖基化殘基，因爲這些通常更便利地藉著哺乳動物重組表現系統來製造。醯基化作& 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 在本發明中，藉著醯基化作用的聚乙二醇化作用，通常涉及使聚乙二醇的活性酯衍生物與切截之GDNF蛋白質反應。可以使用任何已知或後續發現的反應性P E G分芋來完成孩聚乙二醇化之程序。較佳的活化p E g酯是將p E G酯化成N-輕基琥珀醯亞胺（”NhS”）。當在本文中使用”醯基化作用” 一词時，企圖包括但不限於下列在切截之GDNF蛋白質和諸如P E G之類水溶性聚合物之間的連結形式：醯胺、 _ 35 · ^紙張尺度適用中) A4規格（21〇χ297公慶）~'- 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 570926 A7 ------— B7 五、發明説明（33 ) —~ 胺基曱故、尿燒及其類似物。參見Bi〇c〇njugate Chem. 5 : 133-140 (1994)。反應條件可選自任何此項聚乙二醇化‘技藝中已熟知的，或是後續發展的那些，但應該避免或限制暴露在將會使待修改之切截GDNF蛋白質失活，諸如溫度、溶劑和p Η値之類的反應條件下。藉著醯基化作用的聚乙二醇化作用，通常產生多·聚乙二醇的切截之GDNF蛋白質，其中經由醯基連結的基團將離胺酸ε -胺基聚乙二醇化。連結之鍵結最好是醯胺。所得的產物也最好大體上只是（例如>9 5 % )單-、二-或三-聚乙二醇化的。然而，依據所使用的特定反應條件，形成一些在數里上具有較鬲含量聚乙二醇的共扼物。如果需要，可藉著標準純化技術，其中包括透析、鹽析、超過濾作用、離子-父換層析法、凝膠過濾層析法和電泳法，從混合物中製備更加純化的聚乙二醇化之共軛物。烷基化作用在本發明中，藉著烷基化作用的聚乙二醇化作用，通常涉及在還原試劑的存在下，使ρ Ε 〇終端的醛衍生物與切截之GDNF蛋白質反應。藉著燒基化作用的聚乙二醇化作用，也可產生多-聚乙二醇的切截之GDNF蛋白質。此外，可以操縱反應條件，以便使大體上僅在該蛋白質之泛_胺基和 Ν -終端處（也就是單·聚乙二醇化之物種）的聚乙二醇化作用更順利。在單·聚乙二醇化或多聚乙二醇化的案例中，最好是經由- CH2_NH -基團將PEG基團附接在該蛋白質上。特別提及-C Η 2 -基團’這類鍵結在本文中被稱爲，，烷基”鍵 _ -36- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（21〇χ^97公楚） '' ---------4! 二 ,- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -訂 570926

、發明説明（34 1^1 mi · 結。可藉著還原性烷基化作用來完成選擇性N-終端的化學修改’其利用不同種類之一級胺基的（離胺酸對N _終端的）不同反應性，可供特定蛋白質的衍生作用使用。在適當的反應條件下，大體上在N-終端與含有羰基之聚合物完成蛋白質的選擇性衍生作用。例如可藉著在容許利用在離胺酸殘基之ε -胺基和該蛋白質之n -終端殘基的α ·胺基之間的 p K a差異的ρ η値下執行反應，而選擇性地在蛋白質之Ν -終知聚乙二醇化。藉著這類選擇性衍生作用，來控制水溶性聚合物對蛋白質的附接作用：利用聚合物的共軛作用主要發生在蛋白質的Ν -終端，並且未出現諸如離胺酸側鏈胺基之類其他反應基團的重大修改。使用還原性烷基化作用，該水溶性聚合物最好具有供偶聯蛋白質使用的單一反應性路。可以使用含有單一反應性醛的聚乙二醇丙醛。本發明包括聚乙二醇化的切截之GDNF蛋白質，其中該 P E G基團係經由醯基或烷基來附接之。如同上文所討論的，這類切截之GDNF蛋白質產物可以是單·聚乙二醇或多_ 聚乙二醇化的（例如，含有2 - 6個P E G基團，較佳的是2 - 5 個PEG基團）。PEG基團通常在胺基酸的泛-或8-胺基處被附接在蛋白質上，但是亦企圖使P E G基團能夠被附接在蛋白質的任何反應性基團上，該基團具有足以在適當之反應條件下附接P E G基團的反應性。因此，聚乙二醇可經由一個反應性基團而被共價結合到蛋白質上，像是自由的胺基或複基。反應性基團是可以結合被活化之P E G分子的那 -37- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ297公釐） ·—ϋ —ϋ 1 -1 · (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂經濟部中央標準局員工消費合作社印製 570926 A7 B7 五、發明説明（: 經濟部中央標準局員工消費合作社印製些。具有自由胺基的胺基酸殘基可包括離胺酸殘基和N -終端的胺基酸殘基。具有自由羧基的那些可包括天冬胺酸殘基、穀胺酸殘基和C -終端的胺基酸殘基。也可以使用硫氫基作爲附接P E G分子的反應性基團。爲了治療之目的，胺基的附接，諸如在N -終端或離胺酸基團處的附接作用通常是較佳的。若是想要受體結合作用，應該避免在對受體結合作用有重要性之殘基處的附接作用。在一個觀點中，本發明提供單-聚合物/切截之GDNF蛋白質共軛物大體上同源的製備作用，其中已經將該聚合物大體上僅（也就是>9 5 %)附接到單一的位置中。更特別的是 ’如果使用P E G，本發明亦提供缺乏可能抗原連接基團之聚乙二醇化的切截之GDNF蛋白質，並具有直接與切截之 GDNF蛋白質偶聯的p e G分子。此外，也可以利用糖基化、非·糖基化或脱-糖基化Θ切截之GDNF蛋白質來製備衍生物。代表性使用非·糖基化的切截之GDNF蛋白質。例如，可將原核生物表現的[Arg32-I 1 e 1 3 4 ] 切截之 GDNF 蛋白質以化學方式衍生，成爲包含單-或多-’例如2 - 4個P E G部份，並經由醯基或烷基附接之。通常’可在使用任何適當的條件下，使具有生物活性的物質與活化的聚合物分子反應，來完成化學性衍生作用。製備I乙一醇化的切截之GDNF蛋白質的方法，通常將包括下列步驟(a)使切截之GDNF蛋白質與聚乙二醇（徐是具有反應性的P E G之酯或酸衍生物）在條件下反應，藉此使切截之GDNF蛋白質附接在一或多個peg基團上，和（b)獲 -38- 私紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公着） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 4

、1T 0 n -^11 n —ϋ · 570926

發明説明（ 36 經濟部中央標準局員工消費合作社印製知反α產物。_般而言，醯基化反應之最適當的反應條件 :隨各個不同場合，並以已知之參數和想要的結果爲基礎來決定之。例如，PEG :蛋白質的比例越高，多·聚乙二醇化乏產物的百分比便越高。可藉著諸如想要的衍生程度（例如單-、二_、三-等等）、選定之聚合物的分子量聚合物是否是分支或未分支的，以及所使用的反應條件之類的因子來決定最適當的比例（由反應效力來看，在其中沒有過量的未反應蛋白質或聚合物）。產製大體上同源族群之單-聚合物/切截之GdNF蛋白質共軛物的還原性烷基化作用，通常將包括下列步驟（a)使切截之GDNF蛋白質在還原性烷基化作用條件下，在適合容許切截之GDNF蛋白質之胺基酸終端處的q _胺基之選擇性修改作用的ρ Η値之下，與具有反應性之P E G分子反應，以及（b )獲得反應產物。關於大體上同源族群之單-聚合物/切截之GdNF蛋白質共軛物，還原性烷基化作用的反應條件是容許水溶性聚合物部份與切截之G D N F蛋白質之N ·終端的選擇性附接作用的那些。這類反應條件通常提供在離胺酸胺基和位在N-終 ^之α 胺基之間的p K a差異（p K a爲在該處有5 〇 %胺基被質子化而5 0 %未被質子化的ρ Η値）。該ρ η値也影響聚合物與所使用之蛋白質的比例。一般而言，若ρ Η値較低，將會想要比蛋白質過量更多的聚合物（也就是説，Ν -終端之α _ 胺基的反應性越低，需要更多的聚合物來達到最適★的條件）。爲了本發明之目的，pH値通常將會落在3_9的範園内 -39- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） ---------Φ II ·*«黌 J (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 37570926 、發明説明（，較佳的是3 - 6。其他的考量是聚合物的分子量。一般而言，聚合物的分子量越高，可被附接到蛋白質上的聚合物分子數量就越少。類似地，在應用這些參數時，應該也將聚合物的分支狀況列入考量。通常分子量越高（或較多的分支），則聚合物 :蛋白質的比例就越高。一般而言，在本文中企圖進行聚乙二醇化的反應時，較佳的平均分子量爲大約2kDa到大約 l〇〇kDa(”大約” 一詞代表在聚乙二醇的製備作用中，有些分子較重而有一些較輕，然後再指定分子量）。較佳的平均刀子量爲大約5 kDa到大約5 0 kDa ’特佳的是大約1 2 kDa到大約2 5 kDa。水溶性聚合物對切截之GDNF蛋白質的比例將是在從1 : 1到100 : 1的範園内，較佳的是（對多聚乙二醇化作用而言）1 : 1到20 '1，和（對單-聚乙二醇化作用而言）1 : 1 到 5 : 1。經濟部中央標準局員工消費合作社印製 ----------Φ丨丨 ·»«Γ 知 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁} -、11- 利用上文指示的條件，還原性烷基化作用將提供聚合物對任何在胺基終端具有α -胺基的切截之GDNF蛋白質的選擇性附接作用，並提供單-聚合物/切截之GDNF蛋白質共軛物的大體上同源之製品。當在本文中使用，，單·聚合物切截之GDNF蛋白質共軛物”一詞時，意指含有附接在切截 GDNF蛋白質上之單一聚合物分子的衍生物。單-聚合物/ 切截之GDNF蛋白質共軛物最好將具有位在^^_終端的聚合物分子，但不是在離胺酸胺基的副基團上。製品最好是= 有9 0%以上的單-聚合物/切截iGDNF蛋白質共軛物，更佳的是95%以上的單·聚合物/切截之GDNF蛋白質共軛物 -40 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 570926 ^ A7 -------------- B7 五、發明説明^ *--- ，其餘可觀察到的蛋白質爲未反應的（也就是缺乏聚合物部份的蛋白質）。關於還原性烷基化作用，該還原試劑在水溶液中轉該是穩定的，且最好能夠只還原在還原性烷基化作用之初期過程中形成的西福鹽基（Schiffbase)。典型的還原試劑可以選自爛氫化鈉、氰基硼氫化鈉、二甲胺甲硼烷、三甲胺甲硼烷和吡啶甲硼烷。特佳的還原試劑爲氰基硼氫化鈉。其他的反應參數，諸如溶劑、反應時間、溫度等等，以及純化產物的方法，可隨著各種不同的場合，以與蛋白質與水溶性聚合物之衍生作用有關的常用資訊爲基礎來決定之。可以選擇藉著醯基化作用及/或烷基化作用方法來製備聚合物/蛋白質共軛物的混合物，而其所提供的優點爲可以選擇在該混合物中所包含之單-聚合物/蛋白質共軛物的比例。因此，如果想要則可以製備具有各種數量之聚合物分子（也就是二·、三、四·等等）附接於其上的蛋白質之混合物，並與使用本方法製備之單_聚合物/蛋白質共軛物1 質混合，而具有攜帶預先決定比例之單·聚合物/蛋白寶共，軏物的混合物。赛碼切截之GDNF蛋白質的聚核苷酸本發明更進一步提供編碼切截之GDNF蛋白質的新穎聚核芬。當作爲雜交探針或括大引子來使用時，該核酸序列大體上將不含所有其他的核酸序列。爲了使用在重組蛋白質的表現中，該核酸序列通常大體上不含編碼其他蛋白質的核酸序列，除非打算使用融合蛋白。以本説明爲基礎， -41· 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS ) A4規格（2ΐϋ7公釐） ---- ---------Φ! -碌 11·· (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

、1T 570926 五、發明説明（ 39 經濟部中央標準局員工消費合作社印製並使用完整的密碼表，熟諳此藝者可輕易地定出編碼切截心GDOT蛋白質之胺基酸序列的所有核酸序列。目前較佳的核酸序列包括那些編碼[Argl6_nel34]、[bp、 He134]、[Arg”_Ilel34]和[Lys37七el34]切截之 g_ 蛋白質啲聚核苷酸。在圖5、6和7中描述了各種聚核茌酸的實例，以及在圖1、3和4中編碼切截之GDNF蛋白質的那些部伤。热躡此藝者亦將會知曉編碼切截之gdnf蛋白質的新穎聚核甞酸，包括編碼變體切截2GDNF蛋白質的那些核紅序列’無論是人造或天然存在的。根據下文的説明來經營之重組表現的技術，可以伴隨在產製這些聚核甞酸之後，並表現出各種切截之GDNF蛋白質。例如，藉著將編碼該切截之GDNF蛋白質的核酸序列插入適當的載體中，熟諳此藝者得以輕易地產製出大量想要的核苷酸序列。然後可以利用該序列來產生檢測探針或擴大引子。另外，也可以將編碼切截之GDNF蛋白質的聚核苷酸插入表現載體内。藉著將該表現載體導入適當的宿主中’而可以大量生產想要的切截之GDNF蛋白質。當在文中進一步説明時，有極多的宿主/載體系統可供核酸序列的繁殖，及/或切截之GDNF蛋白質的產製使用。這包括但不限於質體、病毒和插入載體，以及原核生物與眞核生物之宿主。熟諳此藝者能夠改編有能力繁殖或表現異源性D N A的宿主/載體系統，以便產製或表現本發明之序列。藉著這類重組技術，可輕易地大量生產本發明之切截之 -42 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（21〇><297公潑） -- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -訂· A7 B7 570926 五、發明説明（4Q ) GDNF蛋白質。而且由於本揭示内容的緣故，熟諳此藝者將會知曉該新穎的核酸序列包括編碼特別陳述於表中之切截之GDNF蛋白質的簡併核酸序列，這類切截之gdnf蛋白質的變體，以及最好是在嚴格的雜交條件下，與這些核酸序列之互補物雜交的那些核酸序列（參見Maniatis等人， Molecular Cloning (A Laboratory Manual) ； Cold Spring

Harbor Laboratory，第 387-389 頁，1982)。典型的嚴格雜交條件爲在4xSSC中，在62-67X：下的雜交作用，接著在 6 2 - 6 7 C下以0 · 1 X S S C沖洗大約1小時。另外，典型的嚴格雜叉條件也可以是在4 5 - 5 5 %甲醯胺、4 X S S C中，在4 0 -4 5 C下的雜交作用。在放寬的雜交條件下與切截之gdNF 蛋白質之互補序列雜交的D N A序列，以及編碼本發明的切截心GDNF蛋白質者亦包括於其中。這類放寬的嚴格雜交條件之實例爲4xSSC，在45-55°C下，或是在40-45°C下利用3 0 - 4 0 %甲醯胺的雜交作用。亦由本發明提供的是重組的DNA構築體，其包括與载體 DNA在一起、編碼切截之gdnf蛋白質的DNA序列。在這樣的D N A構築體中，編碼切截之gdnF蛋白質的核酸序列（攜帶或不攜帶信號肽），與有能力指揮切截之GDNF蛋白質 ’在所選擇之宿主中複製及/或表現的適當之表現控制或调節序列有操作上的關連。蛋白質的重組砉現 GDNF的聚核竑醢可經由各種方式，包括但不限於化學合成、cDNA或基因 Φ! >·« * (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -訂經濟部中央標準局員工消費合作社印製

570926 Α7 Β7 經濟部中央標準局員工消費合作杜印製五、發明説明（41 ) 組庫篩選、表現基因庫的篩選、及/或cDNA的P C R擴大作用，輕易地獲得編碼切截之GDNF的核酸序列或成熟的 GDNF起始物質。這些方法及其他可用來分類這類核酸序歹1J 的方法，由例如 Sambrook 等人（Molecular Cloning : A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor，NY, 1989)、Ausubel等人編著（Current Protocols in Molecular Biology，Current Protocols Press， 1994)，以及 Berger*Kimmel(MethodsinEnzymology: Guide to Molecular Cloning Techniqure,第 152 册， Academic Press, Inc.，San Diego，CA，1987)描述過了。較佳之編碼GDNF的核酸序列是哺乳動物的序列。也可利用此項技藝中已熟知的方法，像是由Engels等人 (Angew. Chem. Inti. Ed·, 28 : 716-734，1989)陳述的那些方法，來完成編碼切截之GDNF蛋白質之核酸序列的化學合成。這些方法包括，特別是核酸序列合成的磷酸三酯、類核甞酸法和Η -膦酸鹽法。編碼切截之GDNF蛋白質的核酸序列在長度上將是數百個鹼基對（bp)或核苷酸。可以數個片段的形式來合成大的核酸序列，例如在長度上超過大約 100個核芸酸的那些。然後可將這些片段連結在一起 '而形成編碼切截之GDNF蛋白質的核酸序列。較佳的方法是利用標準核苷酸化學的聚合物-支撑合成作用。另外’也可以藉著篩選適當的cDNA庫（也就是從一或多個相信能表現該蛋白質的組織來源來製備的資料庫），或是基因組庫（由全部基因組DNA來製備的資料庫），而獲得適 — :_—__- 44 - 本紙張尺度適用中國國家榡準（CNS ) M規格（21〇><297公釐） ' (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 、1Τ 42570926 A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製五、發明説明（當的核酸序列。cDNA庫的來源，通常是得自被認爲能以合理的量來表現GDNF之任何物種的組織。基因組庫的來源，可以是被認爲能藏匿編碼GDNF或GDNF同源物之基因的任何組織，或得自任何哺乳動物或其他物種的組織。可對資料庫篩選有關GDNFcDNA/基因的存在，係利用一或多個核酸探針（寡核甞酸、cDNA或基因組DNA片段，相對於待選殖之GDNF或GDNF同源性的cDNA或基因其具有可接受的同源程度），使其與出現在資料庫中的GDNF或 GDNF同源性之cDNA或基因，選擇性地雜交。典型供這類資料庫篩選使用的探針，通常得自與製備該基因庫之物種的相同或類似物種、編碼GDNF DNA序列的小區域。此外 ’该探針也可以是簡併的，如同在本文中討論的。資料庫的篩選通常是藉著使寡核苷酸探針*cDNA，在防礙非-專一性結合但容許那些與探針或引子有明顯的同源程度之純種系的結合的嚴格條件下，連接到資料庫中的純種系來完成之。典型的雜交作用和沖洗嚴格條件，一部份依據cDNA或寡核甞酸探針的大小（也就是核苷酸在長度上的數目），以及是否該探針是簡併的。亦考慮到在經過設計的雜交溶液中獲得純種系的可能性（也就是説，或基因組庫是已經篩選過的，如果是cDNA庫，感興趣的cDnA就可能以高含量存在）。在使用DNA片段（如cDNA)作爲探針之處，典型的雜交條件包括在Ausubel等人，編著，在前中陳述的那些。在雜交之後，以適當的嚴格度沖洗含有資料庫的墨點，係依據 f請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁}

-45- 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 570926 A7 -------- B7 ~~ ----—__ 五、發明説明（）逢如探針大小、預期探針對純種系的同源性、待篩選之資料庫的種類、待篩選之純種系的數目，及其類似物等等的數個因素來決定。嚴格的沖洗溶液之實例（其通常具有低的離子強度，並可在相對上較高的溫度下來使用）如下。一種這類的、嚴格沖洗液爲在55°C下的0.015M NaC卜〇·〇〇5Μ檸檬酸鈉和0.1%SDS。另一種這類的嚴格緩衝溶液爲在大約 40-50°C 下的 ImM Na2EDTA、40 mM NaHP〇4，PH 値 7.2 ，和1 /〇 SDS。另外一種嚴格的沖洗液爲在大約5 〇 6 5下的 0.2xSSC 和 0.1% SDS。

亦有一種嚴格沖洗條件的典型草案，爲使用寡核菩酸探針來篩選cDNA或基因組庫。例如，第一個草案係依據所使用的探針長度，在大約3 5到62。(：之間的溫度下，使用帶有0.05%焦磷酸鈉的6xSSC。例如，在35-4(rc下沖洗14 個鹼基的探針，在45-5 (TC下沖洗17個鹼基的探針，在 5 2 - 5 7 C下沖洗2 0個鹼基的探針，在5 7 _ 6 3下沖洗2 3個鹼基的探針。可將溫度昇高2_3Χ：，此時背景的非_專一性結合顯然板南。第二個草案係利用氯化四曱銨（tmac )來沖洗’ 一個這類的嚴格沖洗溶液爲3M TMAC、50 mM

Tris-Ηα，pH8.0 和 0.2o/〇SDS〇其他獲得編碼GDNF蛋白質之核酸序列的適當方法爲考合酶連鎖反應（P C R)。在該方法中，從表現GDNF的組織中萃取聚(A) + RNA或全部的RNA。然後利用酵素逆轉錄酶，從RNA中製備cDNA。然後將兩個引子，通常是與gDNf cDNA的兩個分離區域（寡核苷酸）互補的，連同諸如Taq聚 — t · · I (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) -訂 •46-

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經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 ; ^ ---44~ ---- -- 五、發明説明（） --- 合酶之類的聚合酶一起加至cDNA中，而該聚合酶在兩個引子之間擴大了該cDNA區域。爲了製備編碼想要之切截GDNF蛋白質的核酸序列所選擇的方法，需要使用寡核甞酸引子或探針（例如pCR、或基因組庫篩選），被選出來作爲探針或引子的寡核苷酸序列應該具有適當的長度，並且是充份明白的，以便將會在資料庫篩選或PCR擴大作用期間發生的非·專一性的^合減到最少。探針或引子的確實序列，通常以得自相同基因或來自不同生物之類似基因的被保存或較具同源性之序列或區域爲基礎。可視需要將探針或引子全部或部份地簡併，也就是祝，含有探針/引子的混合物，都可以編碼相同的胺基酸序列，但是使用不同的密碼子來這樣做。另一種製備簡併探針的方法，是將纖維核甞放置在那些密碼子位置的一些或全邵中，係依據物種而有所改變。可藉著上述之D N A的化學合成法來製備寡核:y：酸探針或引子。以編碼GDNF的這些核酸序列爲基礎的切截iGDNF蛋白質，亦打算將其突變或變體序列包含在本發明的範圍内。如同上述，突變或變體序列是與野外型序列相比較之下，含有一或多個核苷酸的取代、刪除及/或插入，並且與野外型胺基酸序列相比較，產生胺基酸序列改變的表現。在 ——些案例中，可能出現天然存在的GDNF胺基酸突變或變 fa ’係知因於天然對偶基因改變的存在。以這類天然存在之突變或變體爲基礎的切截之GDNF蛋白質，亦在本發明的範圍内。合成的突變序列之製備亦是此項技藝中已熟知 -47 _ 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（2獻297公釐) 一 ----

--------9—— : (請先聞讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂經濟部中央標準局員工消費合作社印製 570926 A7 B7 45 一------— 五、發明説明（）的，並描述在例如Wells等人（Gene，34 : 3 15，1985 )和在 Sambrook等人，在前之中。载體爲了進一步選殖（DN A的擴大）或是爲了表現，將編碼切截之GDNF蛋白質的cDNA或基因組DNA插入載體中。適當的載體是可以購得的，或是特地建構的载體。適當載體的選擇或建構，將依據：1)它是否可以供DNA擴大或DNA 表現使用，2)被插入載體中的DNA的大小，以及3)利用該载體來轉化的宿主細胞（例如哺乳動物、昆蟲、酵母A、眞菌、植物或細菌細胞）。每個載體依據其功能（DNA的擴大或 D N A的表現）及其與想要宿主細胞的可相容性，而含有各種組成。載體組成通常包括但不限於一或多種下列物質：信號序列、複製起點、一或多個選擇或標記基因、促進子要素、啓動基因、轉綠終止序列及其類似物。這些組成可從天然來源獲得，或藉著已知的程序來合成之。本發明之載體包含編碼感興趣之切截GDNF蛋白質的核酸序列，將其有效地連接到一或多個下列的表現控制或調節序列，而能夠藉著所選出之宿主細胞來指揮、控制或完成切截之 GDNF蛋白質的表現。信號序列 ^ 信號序列可以是載體的一個组成，或者是被插入載體之 GDNF舰的-部份。天然的GDNF職在蛋白質的胺基終端編碼信號序列，它在蛋白質的轉譯後加工期間内被切開，而形成成熟的GDNF蛋白質。亦包括在本發明範圍内 ----------— <»* * (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 -48 570926 A7 B7 46 -------- 五、發明説明（），的切截之GDNF聚核：y：酸，具有天然的信號序列和其畔的前-pro序列，以及切截之GDNF聚核苷酸，其中刪除了天然的信號序列，並以異源性的信號序列來替換。該異源性的#號序列應该選擇能被宿主細胞辨認並加工處理的，也就是藉著信號肽酶將其切開。因爲原核生物的宿主細胞無法辨認並處理天然的GDNF信號序列，所以藉著選自例如驗性磷酸酶、青黴素酶或熱-穩定的腸毒素π引導子的原核生物之信號序列來取代該信號序列。爲了酵母分泌，可藉酵母轉化酶、α因子或酸性嶙酸酶引導子來取代天然的

A GDNF信號序列。在哺乳動物細胞的表現中，天然的信號序列是令人滿意的，雖然其他哺乳動物的信號序列也是適合的。複製起點經濟部中央標準局員工消費合作社印製表現和選殖載體通常含有使該載體能夠在一或多種選定之宿主細胞中複製的核酸序列。在選殖載體中，該序列通常是一個能夠使該載體不依賴宿主染色體D N A而進行複製的，並含有複製起點或自動複製的序列。已熟知有關於各種細菌、酵母和病毒的這類序列。得自質體pBR322的複製起點，適用於大部份的革蘭氏陰性細菌，且可利用各種起點（例如SV40、多瘤病毒、腺病毒、vsv或Bpv)將該載體選殖到哺乳動物細胞中。一般而言，哺乳動物表現載體並不需要複製起點的成份（例如，往往僅使用SV4〇起點，因爲它含有早期啓動基因）。 . 選擇基因 -49-

570926 47 五、發明説明（表現和選殖載體通常含有選擇基因。該基因編碼"標記" 蛋白質，這是當經過轉化之宿主細胞在選擇性培養基中生長時，細胞存活或生長所必需的蛋白質。未利用载體轉化的宿主細胞將不含該選擇基因，並因此存活。典型的選擇基因所編碼之蛋白質，其⑷;;= 素或其他毒素的抵抗力，例如氨苄青黴素、新黴素、胺甲碟呤或四環素，（b)補充營養的缺陷；或（c)提供無法從培養基中獲得的重要營養物。經濟部中央標準局員工消費合作社印製

可利用其他的選擇基因來擴大將要表現的基因。擴大作用是一個過程，其中在產製對生長具有決定性之蛋白質方面非常需要的基因，在重組細胞之連續世代的染色體中，以縱向方式重複排列。哺乳動物細胞的適當選擇標記之實例包括二氫葉酸還原酶（DHFR)和胸腺核苷激酶。將哺乳動物細胞轉化物放置在選擇性壓力之下，只有轉化物由於载體中存在有標記，獨自適應而得以存活。藉著將經過轉化的細胞培養在下述的條件下來施加選擇性壓力，在該條件中連續地改變選擇試劑在培養基中的濃度，藉此來引導選擇基因和編碼切截之GDNF的DNA兩者的擴大作用。結果，從經過擴大的DNA中合成了增加數量的切截之gdNF 例如，首先藉著將所有的轉化物培養在含有胺甲碟呤， D H F R之競爭性拮抗物的培養基中，來確認以〇 η ρ r選擇基因轉化的細胞。當使用野外型D H F R時，適當的宿矣細胞爲在DHFR活性上有缺陷的中國倉鼠卵巢細胞株（參見例 -50- ‘紙張尺度適用中i國家標準（CNS ) Α4規格（21〇χ297公着 570926 A7 ---- B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製五、發明説明（48 ) 如 Urlaub 和 Chasin，Proc，Natl，Acad. Sci·，USA 77(7) : 4216- 4220 (1980))。然後將經過轉化的細胞暴露在漸增含量的胺甲碟呤中。這引導DHFR基因之多重副本的合成，益伴隨著出現在表現載體中的其他DNA多重副本的合成，諸如編碼切截之GDNF蛋白質的DNA。本發明之表現和選殖載體通常將會含有由宿主生物辨認的啓動基因，並可實施將其連接到編碼切截之GDNF蛋白質的核酸序列上。啓動基因是未經轉譯的序列，位在結構基因之起始密碼子的上游（5，）（通常在大約100到1000bpR) ’控制特定核酸序列，諸如編碼切截之GDNF的核‘序列的轉錄和轉譯。啓動基因傳統上被分類成兩種中之一：可誘發的啓動基因和組成的啓動基因。可謗發的啓動基因回應一些諸如營養物的出現或缺乏，或是溫度改變之類的培養條件上的改變，開始在它們的控制之下增加來自D N a的轉錄程度。很多由各種可能的宿主細胞辨認的啓動基因都是爲人所熟知的。可藉著從起源DN A中經由限制酶消化作用移出該啓動基因並將想要的啓動基因序列插入載體中，而將這些啓動基因連接到編碼切截之GDNF的DN A上。也可以使用天然的GDNF啓動基因序列來指揮切截之gdnf DNA的擴大作用及/或表現。然而，若異源性啓動基因比天然的啓動基因，容許更多的轉錄作用和更高的表現蛋白質之產量，且若它能與已經被選用的宿主細胞系統相容共存，則該異源性啓動基因是較佳的。 · 51 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4根狄f 八楱、 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本I)

、1T 舞 A7 B7 570926 五、發明説明（49 適用於原核生物宿主的啓動基因包括内醯胺酶和乳糖啓動基因系統；鹼性磷酸酶，色胺酸（trp )啓動基因系統；以及諸如t a c啓動基因之類的雜交啓動基因。其他已知的細菌啓動基因也是適合的。已經公告了它們的核甞酸序列，藉此使得熟諳此藝者能夠利用供給任何必要之限制位置所需的連接子或轉接子，將它們與想要的Dna序列連接。供酵母宿主使用之適當的啓動序列也是熟諳此藝者已知的。酵母促進子可有利地與酵母啓動基因一起使用。供哺乳動物宿主細胞使用的適當啓動基因已爲人所熟知，並且包括獲自病毒基因組的那些，像是多瘤病毒、難痘病毒、腺病毒（如腺病毒2型）、牛乳頭狀瘤病毒、禽肉瘤病毒、巨大細胞病毒、反轉錄病毒、B型肝炎病毒和最佳的猿病毒 (S V4 0)。其他適當的哺乳動物啓動基因包括異源性的哺乳動物啓動基因，例如熱-休克（heat-shock)啓動基因和肌動蛋白啓動基因。目前在C ΗΌ細胞中產製GDNF蛋白質所使用的啓動基因是SR々。參見Takebe等人，Mol. Cell. Biol. MU : 466_472 (1988)。適當的表現載體爲pDSR“2，在下文中進一步説明。可將促進子序列插入載體中，以便藉著較高級的眞核生物增加編碼本發明之切截之GDNF蛋白質的DN A序列的轉錄作用。促進子是D N A的順向作用要素，在長度上通常約爲10-300bp，其作用在啓動基因上，係增加它的轉錄作用 °促進子具有相關的方位和獨立的位置。已經發現它們在 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) Φ. 經濟部中央標準局員工消費合作社印製

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轉綠單位的5 ’和3，。p ^ 、、、已知可從哺乳動物的基因中獲得數個促進子序列（例如血球蛋白、彈性蛋白酶、白蛋白u 兒蛋白貝和胰島素）。然而，通常將會使用得自病毒的促進子。SV4G促進子、巨大細胞病毒早期啓動基因促進子、多瘤病毒促進子和腺病毒促進子，是活化眞核生物啓動基因的典型促進序列。也可以在切截之gdNF DNA的5，或 3’位置處將促進子接合到载體内，它通常是位在啓動基因的5 ’位置處。轉錄終止在眞核生物宿主細胞中(酵母；眞菌、昆蟲、植物、動物、人類或得自其他多細胞生物的有核細胞）所使用的表現載體，亦將含有轉錄終止所必需的序列，並用以穩定WRNA 。這類序列通常獲自眞核生物DNA或cDNAW，未轉譯區域，偶爾獲自3 ’未轉譯區域。這些區域所含有的核嘗酸片段，在編碼切截之GDNF的mRNA未轉譯部份中，轉錄成聚腺苷酸化的片段。 " 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 ----------ΦII ♦ 1 t · (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 含有一或多個上文列舉之組成，與想要的切截之gdnf密碼序列在一起之適當載體的建構，係藉著標準連接技術^ 完成。切開經過分離之質體的DNA片段，縫製，並以想要的順序再連接，而產生所需的質體。要證實已經建構了正確的序列，可利用連接混合物來轉化大腸桿菌，並藉著已知的技術來選擇成功的轉化物，像是如同上述的氨爷青徽素或四環素抗藥性。然後從轉化物中製備質體，藉著核酸内切限制酶的消化作用來分析，並/或定出序列，而4登實 53- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 570926 A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製五、發明説明f 想要構築體的存在。也可以使用在哺乳動物細胞中提供暫時表現編碼切截之 GDNF的DN A的载體。一般而言，暫時性表現涉及使用能夠在宿主細胞中有效地複製的表現載體，如此使宿主細胞累積了許多表現載體的副本，接著合成高含量的、由該表現載體編碼的想要蛋白質。暫時性表現系統包括適當的表現載體和宿主細胞，容許方便肯定地確認由經過選殖之 D N A編碼的蛋白質，以及迅速地對於想要的生物或生理特性來篩選這類蛋白質。因此，暫時性表現系統在確認蛋白質變體上是特別有用的。宿主細胞的選擇和棘化以用來表現重組之切截GDNF蛋白質的核酸序列來轉化的宿主細胞（例如細菌、哺乳動物、昆蟲、酵母或植物細胞） ’亦由本發明來提供。在適當的條件下培養經過轉化的宿主細胞，容許該核酸序列表現。適當之宿主細胞的選擇和轉化、培養、擴大與產物產製及純化的方法是此項技藝中已熟知的。參見例如Gething和Sambrook，Nature 293 : 620-625 (1981 )，或者是Kaufman等人，Mol. Cell· Biol· 5(7) :1750-1759 (1985 )或 Howley 等人，美國專利第 4,419,446 號。可根據Lin等人的敘述（美國專利申請案第〇7/855,413 號；申請案第PCT/US92/07888; WO 93/06116)在大腸桿菌中表現切截之GDNF，其涉及成熟GDNF的表現。在下文中更詳細地討論其他的代表性材料及方法。將經過轉化的宿主細胞培養在適當的培養基中，然後可視需要從培養基 54 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210χ297公釐） ΦII -·7- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂經濟部中央標準局員工消費合作社印製 570926 A7 ___________ B7 五、發明説明（52 ) 一 ' -- 中(或是從細胞中，如果是在細胞内表現)藉著熟諳此藝者已知的適當方法回收、分離及純化表現因子。在本文中供選殖或表現載體用的適當宿主細胞爲原核生物，酵母或如同上述的較高級之眞核生物細胞。原核生物宿主細胞包括但不限於眞細菌，像是革蘭氏陰性和革蘭氏陽性的生物，例如大腸桿菌、桿菌，如枯草桿菌，假單孢菌，如綠膿桿菌，鼠傷寒沙門氏桿菌或萎垂桿菌。另外，在活體外選殖的方法，例如PCR或其他的核酸聚合酶反應也是適合的。除了原核生物宿主細胞之外，眞核微生物，像是絲狀眞菌或酵母也是適合用來表現切截之GDNf蛋白質的宿主。在低級眞核生物宿主微生物中，酒酵母菌或常見的麵包酵母是最常用的，但是各種其他的屬、種和品系也是爲人所熟知的並經常被使用的。爲了表現糖基化的切截之GDNF蛋白質，適當的宿主細胞係衍生自多細胞生物。這類宿主細胞可以複雜加工並具有糖基化活性。原則上可以使用任何高級的眞核生物細胞培養物’典論這類培養物是否涉及脊椎動物或無脊椎動物細胞，包括植物和昆蟲細胞。通常利用脊椎動物細胞在培養中繁殖脊椎動物細胞（組織培養），是已爲人所熟知的過程。有用的哺乳動物宿主細胞株之實例包括但不限於：以 SV40轉化的猴子腎臟c VI細胞株（COS· 7)、人類胚胎腎臟細胞株（爲了在懸浮培養基中生長，傳代選殖293或293 細胞）、幼倉鼠腎臟細胞株和中國倉鼠卵巢細胞。其他適合

A -55 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） ' 气着II I - « (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁} 訂 570926

經濟部中央標準局員工消費合作社印製的細胞株包括但不限於HeLa、老鼠L_929細胞、衍生自 Swiss、Balb-c或NIH鼠的3Τ3細胞株、BHK或HaK倉鼠細胞株。同樣地’細菌細胞亦適合本發明，而可用來作爲宿主細胞。例如在生物技術的領域中，已熟知各種擔任宿主細胞的大腸桿菌品系（例如HB101、DH5“、DH1〇4MC1〇61) 。也可以使用各種品系的鏈黴菌及其類似物。目前用來產製切截之GDNF蛋白質的最佳宿主細胞是細菌細胞（例如大腸桿菌）和哺乳動物細胞（諸如中國倉鼠卵巢細胞、（：〇8細胞等等）。轉移感染宿主細胞，而最好是以上述的表現或選殖載體來轉化之，並將其培養在傳統的營養培養基中。可將該培養基修改成適合謗發啓動基因、選擇轉化物或擴大編碼想要序列之基因的。利用熟諳此藝者已熟知，並爲了適合所涉及之宿主細胞而選擇的標準技術，來完成轉移感染和轉化作用。例如’不含細胞壁的哺乳動物細胞，可使用嶙酸躬沉殿法。也可以使用電穿透作用、微量注射和其他已知的技術。 . 培養宿主細1 將產製本發明之切截之GDNF蛋白質所使用的轉化細胞培養在適當的培養基中。按照需求，將培養基補充荷爾蒙及 /或其他的生長因子（如胰島素、鐵傳遞蛋白或上皮生長因子）、鹽（如氯化鈉、鈣、鎂和磷酸）、緩衝溶液（如HEpES ) 、核誓（如腺核甞和胸腺核甞）、抗生素（如健大黴素）微量 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) Φ. 訂

— - I -= I -56 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 570926 A7 B7 五、發明説明（）元素（限定無機化合物，通常以毫莫耳範圍之終濃度存在）和葡萄糖或其他能量來源。亦可包含熟諳此藝者所熟知的其他添加物，以適當的濃度存在。諸如溫度、pH値及其類似物等等，選擇宿主細胞所使用的適當培養條件，亦是熟諳此藝者所熟知的。

A 也有可能藉著同源重組，或以重組的產製方法，利用對照要素導入已經含有編碼GDNF之D N A的細胞中，來產製切截之GDNF蛋白質。同源重組是原本爲了在具有轉錄活性的基因中，使目標基因誘發或修正突變而發展出的技術 (Kucherlapati，Prog, in Nucl. Acid· Res.和 Mol. Biol. 36 : 301 (1989 ))。將基礎的技術發展成將特定的突變導入哺乳動物基因組之特定區域中的方法（Thomas等人，Cell. 44 : 419-428，1986 ; Thomas 和 Capecchi，Cell. 51 : 503-512, 1987 ; Doetschman 等人，Proc. Natl. Acad. Sci. 85 : 8583-8587, 1988)，或是在缺陷基因内修正特定突變的方法 (Doetschman等人，Nature· 330 : 576-578，1987)。典型的同源重組技術被描述於美國專利第5,272,071號（歐洲專利 91 90 3051號，歐洲專利出版物第505 500號； PCT/US90/07642，國際出版物第WO 91/09955號），其揭示内容均合併於此以作爲參考。經由同源重組’可精者將待插入基因組内的D N A序列附接在目標D N A上，而將其指引到感興趣基因的特定區域。目標D N A是與基因組D N A之區域互補的（同源的）D N A。在DN A複製過程中，使一小片與基因組之特定區域互補的 -57-

A 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（21〇><297公董) ------------ -A · > (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) -訂 570926

經濟部中央標準局員工消費合作社印製目標D N A與親代股接觸。沪Θ α / & ^ 绝疋已經插入細胞中以便雜交之 D N A的一般特性，並因此補山口此通過共旱的共源區域與内源 DN A的其他部份進行曹知。』田、、置、、且如果m互補股被附接在含有突變或不同D N A序列的寡核：y：龄μ ju ^ ^ Δ ^ n发甘蛟上，則由於重組的結果，它也被合併到重新合成的股中。由於校讀功能的結果，新的 DN Α序列擔任模板《職務是可能的。因&，將被轉移的 D N A合併到基因組中。如果特殊的基因序列是已知的，像是gdnf的核酸序列、前-pro序列或表現控制序列等等，則可合成或相反地獲得與選定之基因區域互補的—小片DNA，如藉著天然dna 在與感興趣（區域結合的特定辨認位置處#適當限制作用。將攻一小片擔任目標序列的碎片插入細胞中，而它將會與基因組中其同源區域雜交。若是在DNA複製期間發生該雜交作用，這一小片DNA和任何附接於其上的其他序列，將會像岡崎片段一樣地發生作用，並會被倒縫於新合成之 DNA後裔股内。在本發明中，附接在這些目標DN A片段上的，是可與 GDNF蛋白質之表現進行交互作用的DN a區域。例如，被插入預定之宿主細胞的基因組中，接近並具有足以影響編碼想要惑切截GDNF的D N A之轉錄方位的啓動基因/楗進子要素、抑制基因或外源係轉錄調節要素。控制要素不编碼切截之GDNF ,但轉而控制宿主細胞基因組中存在的部份D N A。因此切截之GDNF蛋白質的表現，並未藉著編碼切截之GDNF基因本身的DNA轉移感染來完成，而是藉著 -58- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（2ΐ〇χ297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 570926

五、發明説明（使用與DNA調節片段偶聯的目標DNA(含有與感興趣之内源基因同源的區域）來完成之，該DN A調節片段提供的内源係基因序列，帶有可供切截之GDNF蛋白質的轉錄作用來辨認的信號。根據本發明，也可以使用同源重組方法來修改含有正常在轉錄上無聲之GDNF基因的細胞，而產生能表現(3〇1^1?的細胞。然後可加工處理該GDNF蛋白質，形成切截之gdnf 蛋白質。 ' 切截之GDNF的醫藥組合物切截之GDNF蛋白質產製醫藥組合物，通常含有治療有效量的切截之GDNF蛋白質產物，與一或多種藥學上或生理上可接受的調配物質混合。適當的調配物質包括但不限於抗氧化劑、防腐劑、色素、香料和稀釋劑、乳化劑、懸浮劑、溶劑、填料、填充劑、緩衝溶液、遞送載劑、稀釋劑、賦形劑及/或藥學佐劑，例如，適當的載劑可以是注射用水、生理鹽水溶液，或人造的腦脊髓液（CSF)，可補充一般在非經腸投藥之組合物中的其他物質。中性的緩衝鹽水溶液或是與血清白蛋白混合的鹽水是更典型的载劑。經濟部中央標準局員工消費合作社印製 — I ί * 4 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂在載劑中主要溶劑實際上可以是含有水或非_含水的。此外，載劑可含有其他藥學上可接受的賦形劑，用來修改或維持pH値、滲透性、黏度、澄清度、顏色、無菌性、移^ 性、溶解速率或調配物的氣味。同樣地，載劑也可以另外的藥學上可接受之賦形劑，用來修改或維持切&之 GDNF蛋白質產物的穩定性、溶解速率或釋放速率，或是 -59- 570926

用來促進切截之GDNF蛋白質產物通過血-腦障礙的吸收或通透性。這類賦形劑是經常或習慣上用來調配以單位劑量或多重·劑量之形式來進行非經腸投藥，或是藉著從植入幫浦連續或定期輸液而直接輸液至CSF中之劑量的那些物質〇一旦已經調配好了治療組合物，便可將它以溶液、懸浮液、凝膠、乳劑、固體或脱水或冷凍乾燥之粉末的形式儲存在小瓶中。這類調配物也可以立即可用之形式，戈是例如在投藥前需要再組成的冷凍乾燥之形式來儲存。' 最適宜的醫藥調配物，將由熟諳此藝者依據投藥的途徑及想要的劑量來決定。參見例如Remington，s Pharmaceutieal

Sciences，第 18版（ 1990, Mack Publishing Co.，East〇n，pA 18042)第1435-1712頁，其揭示内容合併於此以作爲參考。該組合物也可以涉及特殊聚合化合物的製備，諸如多乳酸、多乙醇酸等等，或是在微脂粒内。也可以使用亥勞若尼酸（hylauronic acid)，這可能具有在循環期間中促進維持的效果。這類組合物可能影響生理狀態、穩定性、在活體内的釋放速率’以及在活體内清除本發明蛋白質和衍生物的速率。經濟部中央標準局員工消費合作社印製 ------------ -m * ♦ (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂其他有效的投藥形式也是可以預見的，諸如非經腸的緩慢釋放之調配物、吸入的霧、具有口服活性的調配物或坐劑。目前將切截之GDNF蛋白質產物醫藥組合物調製成供非經腸投藥使用’例如腦室内注射。這類以非經腸方式投藥之治療組合物，通常以不含熱原、以非經腸方式可接受 _ 60 - ^紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） —~~ ---- 58 570926 五、發明説明（之含水溶液形式，其包括在藥學上可接受之載劑中的切截之GDNF蛋白質產物。一種較佳的載劑爲生理鹽水。也想要某種含有切截之GDNF蛋白質產物的口服調配物。以此種形式投藥的切截之GDNF蛋白質產物，可能被包封到膠囊中，也可與成不與在固體劑量形式混合時所習慣使用的那些載劑一起調製。可將膠囊設計成與胃腸道中的某一處釋放調配物的活性部份，此時生物利用率最大，而前全身性降解作用爲最小。可含有額外的賦形劑，以便促進切截之GDNF蛋白質產物的吸收。也可以使用稀釋劑、香料、低熔點的蠟、植物油、潤滑劑、懸浮劑、錠劑崩解劑和枯合劑。切截之GDNF番白皙產物60崧苹 ^ 可經由皮下、肌肉内、靜脈内、經肺、經皮、脊髓腔内或大腦内之途徑，以非經腸方式來投予切截之GDNF蛋白質產物。無法通過血腦障礙的蛋白質生長因子，可直接以大腦内的方式給予，或是與其他可將其運送通過該障礙的要素結合。以腦室内方式投予切截之GDNF蛋白質產物，或使其進入大腦或脊髓蜘蛛膜下腔是較佳的。也可以大腦内之方式將切截之GDNF蛋白質產物直接投予至大腦實質中。在大腦中緩慢-釋放的植入器，含有被埋在可經生物降解之聚合物基質中的神經營養因子，也可以遞送切截之 GDNF蛋白質產物。切截之GdnF蛋白質產物，可利用已經以化學方式修改或加以包裝而使其得以通過血·腦障礙冯形式，以大腦外的方式來投予，或是可將其與一或多種能夠 I--------φII 鱗 < 鱗i (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂經濟部中央標準局員工消費合作社印製 61 570926 59 、發明説明（促進切截之GDNF蛋白質產物通過該障礙之通透性的試劑連結j再投予之。例如，已經顯示NGF和單株抗_鐵傳遞蛋白爻體抗體的共軛物，經由與鐵傳遞蛋白受體的結合而 =運送，大腦。要達到切截之GDNF蛋白質產物的想要劑、了母天重複彳又藥或以較低之頻率注射，或是可將切截之GONF蛋白質產物從恆定-或可設計之-慢速植入幫浦中連續或定時地輸液。劑量的頻度將依據如何調配切截之 GDNF蛋白質的藥物動力學參數以及投藥的途徑來決定。經濟部中央標準局員工消費合作社印製不考慮投藥的方式，通常根據體重或體表面積來計算特定的劑量。關於涉及大腦的疾病，通常根據患者的概略腦重來計算特定的劑量，這也可以按體重或體表面積爲基礎來建立。決定適當治療劑量所需要的更精確計算，涉及每種由熱碏此藝者日常製造的上文提及之調配物，尤其‘根據在本文中揭示的劑量資訊和分析。經由使用確定劑量的建立分析，連同使用適當的劑量·反應數據，可以探知適當的劑里。涉及治療特定狀況之方法的最終劑量攝生法，將由負責知顧的主治醫師，考量各種修改藥物作用的因子來決定，例如患者的年齡、狀況、體重、姓別和飲食、任何感染的嚴重性、投藥時間及其他臨床因子。也可以單獨或與其他治療神經疾病的生長因子混合使用本發明的切截之GDNF蛋白質產物。例如可將切截之gdnF 蛋白質產物與神經生長因子混合，用來治療某些形式的神經疾病。此外’其他因子或其他分子，包括化學組合辞，也可以與切截之GDNF蛋白質產物一起使用。在治療帕金 -62- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 570926 A7 B7 五、發明説明（） Λ 森氏症時’企圖單獨使用切截之GDNF蛋白質產物，或是結合左旋多巴胺（Levodopa)的投予，其中切截之GDNF將會促進内源性多巴胺的產製，並促使神經攝取增加濃度的多巴胺。 · 如同上述，亦期待額外的神經營養或神經元營養因子，對於治療某些神經元細胞群或某種類型之傷害或疾病將是有用的或必需的。可與切截之GDNF —同使用的其他因子包括但不限於：有絲分裂原，如胰島素、類-胰島素生長因子、上皮生長因子、影響血管之生長因子、腦下垂體腺哲酸環化酶活化多肽、干擾素和生長激素釋放抑制因子；神經營養因子，如腦衍生之神經營養因子，神經營養素_3、神經營養素-4/5、神經營養素_6、類·胰島素生長因子、纖毛的神經營養因子、酸性及鹼性之纖維母細胞生長因子、纖維母細胞生長因子_ 5、轉化生長因子_々、可卡因·-苯異丙胺調節轉錄本（CART)和成熟的GDNF ;以及其他的生長因子，如上皮生長因子、白血病抑制因子、介白素、干擾素，以及菌落刺激因還有與這些因子功能相等的分子和物質。經濟部中央標準局員工消費合作社印製期望切截之GDNF蛋白質產物的連續投藥或持續遞送，可有利於特定的治療。連續投藥可經由機械方式來完成，像是利用輸液f浦，企圖實施連續或接近連續投藥=皇他模式。例如，化學衍生作科產生持續釋放形式的蛋白質，其具有以可預測之含量連續出現在血流中的效果，嗜本丄係以已經決定的劑量攝生法爲基礎。因邊〇里

U此，切截之GDNF -63- 570926 A7

經濟部中央標準局員工消費合作社印製蛋白質產物，包括進行衍生以便實現這類連續投藥的切截之GDNF蛋白質。切截之GDNF蛋白質的細胞療法也是令人期待的，例如大腦内移植產製切截之GDNF蛋白質的細胞。本發明的具體實施例包括將能夠合成並分泌具有生物活性形式的切截之 GDNF蛋白質移殖到患者的細胞内。這類產製·切截之 GDNF蛋白質的細胞，可以是無法正常產製神經營養因子 ’但是被修改成產製切截之GDNF的細胞，或是藉著利用適合表現和分泌切截之GDNF蛋白質的聚核誓酸來轉化，已經將其產製GDNF的能力增強的細胞。爲了減少患者因投丁外來物種之GDNF引起可能的免疫反應，該細胞最兮是人類來源的並能產製切截之人類GDNF蛋白質。可將移殖細胞包封於膠囊中，以免細胞浸潤到腦組織内。可利用生物可相容的半透性聚合包封物或膜，將人類或非-人類的動物細胞移殖到患者體内，其容許切截之GDNF 蛋白質產物的釋放，但防止該細胞被患者的免疫系統或其他來自周圍組織的有害因子破壞。另外，在活體外被轉化成產製切截之GDNF的患者自己的細胞，可直接移殖到患者體内，而不需要這類的包膠作用。活細胞之膜包膠作用的方法學，是熟諳此藝者所熟悉的，並可完成包膠細胞的製備和將其移殖到患者體内的。參見例如美國專利第4,892,538號、5,01 1,472號和5,106,627號，將其揭示内容合併於此以作爲參考。亦將包膠活細胞的方法描述於Aebischer等人的PCT申請案WO 91/10425中， -64 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） ------------ • Λ -ί (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 570926 Α7 Β7 五、發明説明（62 )

特別合併於此以作爲參考。也可參見AAischer等人的p c T 申明案 WO 91/10470 ; Winn 等人，Exper· Neurol.，113 : 322 329，1991 ’ Aebischer等人，Exper.Neurol·，lll:269-275, 1991 ; Tresco 等人，ASAIO，38 : 17·23，1992，將其揭示内容合併於此以作爲參考。切截之GDNF蛋白質在活體外的基因療法也是令人期待的 ’其中將編碼切截之GDNF蛋白質的核酸序列直接導入患者體内。例如，經由局部注射帶有或不帶有適當遞送載體 ’如與腺苷酸有關之病毒載體的核酸構築體，將編碼切截之GDNF蛋白質的核酸序列導入目標細胞中。其他的病毒載體包括但不限於逆轉綠病毒、腺病毒、單純疱疹病毒和乳頭狀瘤病毒載體。在活體内的物理運送，可藉著扃部注

A 射想要的核酸構築體或其他含有想要之核酸序列的適當遞送載體、微脂粒-調節的運送、直接注射（裸露的D N A)、受體調節的運送（配體-D N A複合物）或微粒撞擊（基因槍）來完成之。應該注意到在本文中描述的切截之GDNF蛋白質產物調配物’可供坡醫和人類應用使用，而”患者”一詞不應該以限經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先聞讀背面之注意事項再填寫本頁) 定的方式來解釋。在獸醫應用的案例中，劑量範圍應該與上文列舉的相同。如同進一步描述本發明之切截之GDNF蛋白質的方法，可發展出與切截之GDNF蛋白質結合的抗體，像是在乂· [C y s 4 1 - C y s 13 3 ] - Y胺基酸序列中的抗原決定位。熟諳此藝者可使用已熟知的公告程序，獲得專一性地辨認並與由 ___ -65-本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) μ規格（21〇><297公釐） 570926 Α7 Β7 五、發明説明（63 ) 本發明之胺基酸序列編碼的各種蛋白質結合的單株或多株抗體，或是重組抗體。然後可利用這類抗體來純化並定出

A 切截之GDNF蛋白質的特徵。另外，也可以利用該抗體作爲其管理之蛋白質的治療抑制劑。藉由考量下列作爲例證之實例，將會瞭解本發明的其他觀點和優點。實例1提出成熟之GDNF在哺乳動物細胞系統中的表現，和切截之GDNF蛋白質的製備。實例2提出成熟 GDNF在細菌細胞系統中的表現。實例3提出各種切截之 GDNF蛋白質在細菌細胞中的表現。實例4在多巴胺系神經元之神經營養活性分析中，比較成熟GDNF蛋白質和切截之GDNF蛋白質的生物活性。實例實例1 、成熟人類之GDNF在C Η 0細胞中的表現，以及C Η 0細胞衍生·切截之GDNF蛋白質的純化材料 ' 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 使用下列的材料，在二氫葉酸還原酶-缺乏的C Η 0細胞中（CHOd-細胞；例如像是由 Urlaub 和 Chasin，Proc. Natl. Acad· Sci· USA 77 (7) : 4216-4220 (1980)描述的）表現人類的 GDNF。 CHOd -培養基含有：杜必可（Dulbecco’s )經過修改的鷹氏培養基（DMEM)-高葡萄糖（Gibco/BRL);5%胎牛血清 (Hyclone) ; MEM 非·必需胺基酸（l%Gibco/BRL);次黃嘌呤/胸腺核苷（l%)(Gibco/BRL);以及穀胺醯胺/青 -66 - Λ 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X297公釐） 570926 A7 B7 五、發明説明（64 ) 黴素 /鏈黴素（1%)(Irvine Scientific) 〇選擇性培養基含有：DMEM(高葡萄糖）；5%經過透析的胎牛血清（HyClone) ; MEM非-必需胺基酸；以及穀胺醯胺/青黴素/鏈黴素。 2X HEPES-緩衝的生理鹽水（HBS)含有：280 mM NaCl ; 10 mM KC1 ； 1.5 mM Na2HP04 ； 12. mM右旋糖；和· 50 mM HEPES 〇

Tris-緩衝的生理鹽水加上吐溫（TBST)含有：137mM NaCl ; 20mM Tris/HCl pH 7·5 ;和 0.1% 吐溫-20。方法轉移感染和選擇將CHOd ·細胞（繼代2 0次）播種到6 0毫米的組織培養盤 (Falcon)中，在CHOd·生長培養基中的濃度爲每盤8xl05 個細胞。在第二天時，於轉移感染之前大約3小時a，以新鮮的培養基更換細胞上的培養基。經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 利用已熟知的技術製備含有適當之GDNF cDNA的質體構築體。例如，大體上根據描述在同一作者且同在申請中， 1990年3月2 9日提出申請的美國專利申請案序列編號 501,904(也可參見1990年5月1 8日提出申請之歐洲專利申請案第90305433，公告編號歐洲專利398 753號，以及WO 90/14363 (1990)，將其揭示内容合併於此以作爲參考）中的過程，來製備質體構築體pDSR α 2。説明載體之結構組織的典型質體舆圖描述於圖2中。熟諳此藝者將會知曉各種編碼成熟之GDNF蛋白質的核酸序列，也可以使用諸如圖1 -67- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X297公釐） β 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 570926 A7 B7 五、發明説明（65 ) 、3和4中描述的序列。藉著限制酶消化作用從以pcDNA3爲基礎的表現載體 (Invitrogen，San Diego，CA )中，將含有人類 GDNF 密碼序列的Hindlll-Xbal DNA片段，和一致的Kozak'序列 CCACC(ATG)退回。將該DNA片段直接選殖到 Hindlll/Xbal切割的pDSR泛2。所得的質體叫做pSW5。在轉移感染之前，先在Puvl位置處將pSW5的DNA弄成直線〇 pDSR從2(圖2)是質體pCD的衍生物（Okayama & Berg， Mol. Cell Biol· 3 : 280-289, 1983 )，具有三個主要的修改： (i)已經利用得自牛促濾泡激素之從·亞單元，沒-bFSH (Goodwin 等人，Nucleic Acids Res. 1 1 : 6873-6882，1983 ) 的信號來代替SV40聚腺甞酸化的信號；（ii)已經將老鼠二鼠葉酸這原酶的迷你基因（Gooser等人，Proc. Natl. Acad. Sci· 79 : 6522-6526，1982)插入表現卡匣的下游，奴便容許轉化物的選擇和擴大；以及（iii)按照先前的描述 (Takebe等人，Mol. Cell. Biol. 8 : 466-472，1988)，已經將含有” R -要素’’的267bp片段和人類T 細胞白血病病毒1 型（Η T L V - 1)之長終端重複段（L T R)的” U 5，，序列部份，選殖並插入SV40啓動基因和接合信號之間。製備含有終濃度3.0微克/盤的GDNF-質體DNA，7.0微克/盤的老鼠腎臟基因組媒體DNA(Clontech)、25微升/ 盤的2.5M CaCl2和終體積爲250微升/盤之蒸餾水的DNA 溶液。以類似方式製備單獨含有pDSR α 2載體D N A和媒體

A -68 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐）一 I---------ΦII * ir· (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 、11 A7 B7 570926 五、發明説明（66 DNA的DNA溶液，分別作爲正和負對照組。將該〇1^八溶液築滴加至等體積的2X HEPES -緩衝的生理鹽水中，同時使氣泡通過該溶液。將DNA/HBS溶液培養在室溫下3〇分鐘。 a 伙CHOd細胞培養物中移除培養基，每盤中加入5⑼微升的DNA溶液。在室溫下培養這些培養盤3 〇分鐘，隨後將 CHOd培養基（5.0毫升）加至每盤中。然後將培養盤培養在 3 7 °C下過夜。第二天，以新鮮的CHOd-培養基來更換培養基。隔天，當細胞達到匯合之時，以胰蛋白酶消化培養物，並以1χ6〇毫米培養盤對8 X 1 〇〇毫米培養盤之比例填滿1 〇〇毫米之培養盤（Falcon)。以選擇培養基填滿細胞。每隔二到三天以新鮮的培養基再-餵食培養物。在1 5天之後，利用玻璃選殖滾筒來分離已經轉移感染之細胞的菌落、以胰蛋白酶消化，並填滿到2 4 ·孔的禧養盤 (Falcon)内。從GDNF_pSW5轉移感染的細胞中總共分離出4 0個菌落。以胰蛋白酶消化培養盤中殘餘的細胞，收集並填滿到兩個100毫米培養盤内（每個DNA構築體一個集合) 〇師選轉移感染的細胞使2 4 -孔和集合培養物生長至匯合，在此時移除生長培養基，並以不含·血清的培養基（400微升/孔或4毫升/盤) 來替換。培養細胞4 8小時，收獲經過調節的培養基。藉著西方墨點法來分析經過調節之培養基試樣的GDNF蛋白質

A -69- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） ------------ iar* (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂經濟部中央標準局員工消費合作社印製經濟部中央標準局員工消費合作社印製 570926 A7 _______ B7_ 五、發明説日) ' 一——— 之表現。以電泳試樣緩衝溶液（含有或不含卢-鐵基乙醇）稀釋一等份經過調節的培養基（20微升或40微升）。將含有冷鏡基乙醇的試樣煮沸3分鐘（還原條件）。在16%的丁^^甘胺鉍凝膠（Novex)上跑還原和未·還原的試樣。在硝基纖維素濾紙（Schleicher和Schuell BA-83，〇.2u)上對凝膠進行電子墨點分析。以T B S T清洗墨點，然後在室溫下將其培養在含有5 %無水牛奶（carnation)之TBST的阻斷溶液中3 p分鐘。然後在室溫下以GDNF抗血清（對大腸桿菌衍生之 GDNF會昇高的兔子多株抗體；在5 〇/。牛奶/ τ b S T中爲1 : 1000)處理墨點1小時。然後以TBST清洗墨點，並沖洗 1x10分鐘，並以1%牛奶/TBST沖洗2χ5分鐘。然後再以抗·兔子I g的馬·蘿蔔過氧化酶-結合的二次抗體（在i %牛奶 / TBST中爲1 : 15,000)處理20分鐘。清洗墨點並以 T B S T沖洗1 X 2 0分鐘和2 X 1 0分鐘，隨後利用E c L試劑 (Amersham)處理1分鐘，並暴露在高感軟片（Hyperfilm)_ ECL(Amersham)下。下列的過程説明從一公升經過調節的培養基中，純化 C Η Ο -表現之GDNF和C Η Ο -衍生之經過修剪的GDNF同二聚體。因爲在C Η Ο培養基中有明顯的蛋白酶活動，所以剪去了在殘基3 1處的鏈，這個程序可包含在純化作用期間蛋白酶抑制劑的使用。步驟1 .小珠層析法藉著加入50分之1體積的1Μ MES，ΡΗ6·0，將不含血清的調節培養基製成20mM 2 - [ Ν ·嗎啉基]磺酸乙醋（M E s )， -70 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） ' ' - ----------— 一Μ.^ - (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁} 、11 570926 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（68 ΡΗ6·0。加入25毫升以20mMMES，pH6 〇平衡過的”瓊脂糖大珠樹脂（Pharmacia)，並在4°C下攪拌工小時。藉著容許其沉降並慢慢倒出上方的調節培養基來收集樹脂。通過多孔圓盤濾紙過濾傾倒出的培養基，以便移除任何未沉降的樹脂。將沉降和藉著過濾回收的樹脂再懸浮，並倒入2·5 公分直徑的管柱中，再以三倍管柱體積的〇 15M NaCb 20mM MES，ρ Η 6.0 (緩衝溶液a )沖洗之。利用goo毫升從a 緩衝溶液到l.OMNaCn、20mMMES，ρΗ6·0(Β緩衝溶液）的梯度’以〇 · 2管柱體積/分鐘的流速來洗脱蛋白質，在 280耄微米處以吸光度來監視。收集含有1」管柱體積的溶離份。藉著西方墨點分析來檢測溶離份中GDNF的存在。收集含有GDNF的溶離份以供進一步的純化作用。在,〇 3到 0.6Μ NaCl之間洗脱出GDNF。步驟2. HPLC C4層析法將得自步驟1之收集物溶解於〇· 1 %(體積/體積）的三氟乙酸（TFA)中，通過0.45微米之濾紙眞空過濾，並施用在以1 0 %含水乙腈、〇· 1 % TFA (緩衝溶液A)調整過的Vydac C4管柱（0.46x25公分）中。以2%/分鐘之直線梯度，在5〇分鐘内利用從A緩衝溶液到9 0 %含水乙腈、〇· 1%TFA (B緩衝溶液）來洗脱蛋白質，在280毫微米處測量吸光度。收集 1毫升的溶離份，藉著西方墨點分析來檢測溶離份中GDNF 的存在。在4 5 %到5 5 %乙腈之間洗脱出GDNF。取得溶離份，以便在眞空中脱水。步驟3.高效率S層析法 -71 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） ---------Φ! \ 卷 < - (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂經濟部中央標準局員工消費合作社印製 570926 A7 ___ B7 五、發明説明（69 )

A 將得自步驟2含有GDNF的溶離份再度溶解於1亳升〇 15M NaC卜lOmMTris，ρΗ8·0中，並施用在〇·75χ7·5公分’的 TSK-Gel5WP高效率S管柱（TosoHaas)中。在50分鐘内，以1毫升/分鐘之流速，進行從〇 15m NaCl、10mM Tris， ρΗ8·0 (A 緩衝落液）到 1 ·0Μ NaCl、10mM Tris，ρΗ8·0(Β 緩衝溶液）’ 0 · 4 % /分鐘的直線梯度。收集一分鐘的溶離份並在280毫微米處測量吸光度。在35%3缓衝溶液之處，在 1 0分鐘内將梯度改變成6,5 % /分鐘。溶離份的西方墨點分析顯示出四個主要的GDNF成份。在〇·4%/分鐘梯度的期間，洗脱出其中三個成份，而在6.5%/分鐘梯度期間中丨先脱出第四個。以同類的成份來製造適當的收集物，並使其接受訂定序列。訂定序列的分析確認了大約2 9 - 3 6 k D之收集物即爲[Arg3 2-lie134]切截之GDNF蛋白質。在大約38· 40kD處之成份被確認爲[Arg32_Ile134]切截之GDNF /成熟GDNF雜二聚體。最後，在梯度的較晚部份期間中被分離出的大約4 1 - 4 4 k D之成份，藉著訂定序列確認其爲成熟之GDNF同二聚體。實例2 在大腸桿菌中產製成熟人類的GDNF 在細菌中表現成熟人類的GDNF，可根據描述在Lin等人

A (I994年5月23曰提出申請的美國專利申請案第08/182,183 號；及其母申請案；1992年9月1 7日提出申請的 PCT/US92/07888 (WO 93/061 16);以及歐洲專利申請案第 92921022.7號（公告編號：歐洲專利610 254號）；將其揭示 -72- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS )八4規格（210X297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

、1T 570926

'發明説明（經濟部中央標準局員工消費合作社印製内么合併於此以作爲參考）中的方法來完成。以本發明之説明爲基礎’熟諳此藝者將會知曉各種可以容易使用，為適泛在大勝标菌及其他細菌之適當表現的材料和方法。例如，也可以在表現方法中使用另外的聚核苷酸，像是在圖1 、3或4中描述的那些。經過表現之成熟GDNF的再摺疊及純化在5 °C下（除非另外指定），按照下述來處理經過轉化的細胞’利用含有5mM EDTA的25mM Tris，ρΗ8·5，將細胞糊懸浮至終體積爲200毫升，產生15%(重量/體積）的終細胞於漿。利用Biospec手握式低剪力均質機使細胞徹底分散

A 。使該於漿以14,500磅/平方英吋通過微量流化器 (microfluidizer)兩次，以便弄破細胞並釋放出包涵體。然後以16,000xg離心所得的勻漿3〇分鐘。藉著再懸浮於冷卻水中至240愛；升之終體積，沖洗從離心作用中獲得的包涵體小球，利用Biospec均質機，如前，形成淤漿。保留該淤漿之試樣以供GDNF表現程度的Η P L C分析使用。以 16,000xg離心剩餘的淤漿3 〇分鐘。抛棄上清液，將少量的冷水加至離心瓶中並溫和的攪動，以便移除在包涵體小球頂端上方鬆散形成的細胞膜層。以Biospec均質機，利用足夠體積之冷水將小球再懸浮，產生濃度爲2毫克/毫升的 GDNF。然後藉著使最終的包涵體懸浮液（2 5毫升）與含有 180mM半胱胺酸 HC1 和 50mM Tris HC卜 pH 8.7 的 8M胍 HC1(25毫升）混合，而將包涵體溶解。在25°C下攪拌溶解混合物6 0到9 0分鐘，隨後將其倒入含有20mM Tris Ηά， -73 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

、1T 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 570926 A7 B7 71 - ---------- 五、發明説明（） 014 8.75和〇.21^^^(：1的2]^尿素（45〇毫升，在5。(：卡）中，並加以混合。在5 °C下慢慢地攪拌該再摺疊的混合物7 2小時0 按照下述將再摺疊之GDNF部份純化：在5°C下將醋酸鈉緩衝溶液（250毫升，PH5)加至再摺疊的混合物中，並迅速地攪拌，以冰醋酸將pH値調整到5。藉著在5°C下以 13,600xg離心4 5分鐘，移除所得的沉澱物。得自該離心作用的上清液，用來當作下一個純化步驟的裝填溶液，該步驟涉及使用S P -大珠樹脂（Pharmacia)的陽離子交換層析法。在5 °C下操作管柱，利用2〇mM醋酸鈉（p Η 5 )作爲平衡、清洗和洗脱的緩衝溶液系統。以5倍管柱體積（c V)之0.2Ν

A

NaOH洗滌樹脂床（5毫升），然後以醋酸緩衝溶液（5 c V)平衡之。以0.5CV/分鐘將裝填溶液（19〇毫升）施用於管柱中，接著以相同的流速以10CV醋酸緩衝溶液清洗。然後以 0.1CV/分鐘之流速，利用20CV在醋酸緩衝溶液中〇.3M 到0·9M的NaCl直線梯度，將GDNF從樹脂中洗脱出來。藉著在280耄微米處的吸光度來監視管柱洗脱物，並收集經由S D S - P A G E分析的溶離份。從在1 〇〇/〇峰高處的GDNF高峰前部到1 0 %峰高處的高峰後部，收集含有GDNF的溶離份。在該收集物中的蛋白質完全是GDNF，並依據所使用的產製品系，含有3 2 %到1 2 %污染物則爲經過修改的 GDNF形式。然後將收集物對p b S或其他配方之緩衝溶液進行透析’而在一些案例中，藉著超透析濃縮成2 5毫克/ 毫升。藉著逆相HPLC、陽離子交換HPLC、質譜分析及 -74- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） I -- -* ,, (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 570926 A7 B7 五、發明説明（内毒素含量，定出藉此程序純化外型和類似物形式的特徵，以便比較製品純度與相對應之產製品桌的關實例3 在大腸桿菌中重組產製切截之GDNF 大體上根據在Lin等人（1994年5月23日提出申請之美國專利申請案第08/182，183號，在前）中描述的技術來產製典型的切截之GDNF蛋白質。也可以使用如同上述之其他細菌表現的材料和方法。大腸桿菌表現的切截之Gdnf蛋白質包括[Pr〇23-Ile134]、[Arg32_Ile134]和[Gly33_Ile134] 切截之GDNF蛋白質，分別如同圖5、6和7中的描述。按照圖5、6和7中的描述，建構編碼這些典型切截之gdNF蛋白質的聚核菩酸，但是也可以使用相對應的聚核牮酸，像是在圖1、3和4中描述的那些。藉著標準p c r程序，如圖在 PCR Technology ? Principles and Applications for DNA -

Amplification，Henry A. Erlich編著，Stockton Press，NY ’ 1989(第 6 章 ’ Using PCR to Engineer DNA)中所描述的 ’來建構聚核甞酸，將其揭示内容合併於此以作爲參考。實例4 多巴胺系神經元神經營養活性的生物分析在定性的基礎上，評估實例3的[Pro2 3-lie 13 4]、 [Arg32-Ile134]、[Gly3^Ilel34]和[Lys37-Ilel34]切截之GDNF蛋白質，及實例1的CHO-衍生之[Arg32-Ile134] 切截之GDNF蛋白質，它們促進黑質之多巴胺系神經元攝 -75- 各紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐）

Mu n -- (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂經濟部中央標準局員工消費合作社印製 570926 A7 B7 73 --------- 五、發明説明（）取多巴胺的能力。材料在評估多巴胺系神經元在切截之GDNF蛋白質存在下的存活分析中，使用下列的材料：細胞培養基 β 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 高葡萄糖·杜必可經過修改的鷹氏培養基（D Μ Ε Μ ;目錄 # 11965-092)、漢氏（Ham’s)Fl 2培養基（F 12 ; # 1 1765-021 ) 、不含碳酸氫鈉的賴伯菲崔氏（Leibovitz，s)L15培養基 (#41300_039)、B27培養基添加物（#17504-010)、青黴素 / 鏈黴素（#15070-014)、L-穀胺醯胺（#25030-016)、杜必可磷酸-緩衝的生理鹽水（D-PBS ; #14190_052)、含有鈣和鎂鹽之漢克氏（Hank’s)平衡鹽溶液（HBSS ; #24020-026)、 N-2-羥乙基六氫吡畊_N’_2_乙烷磺酸（HEPES ;故15630-015)、老鼠昆布胺酸（1 a-minin)(#23017-015 )，以及牛血清白蛋白餾份V(#110-18-017)，均得自GIBCO，Grand Island，NY。熱-失活的馬血清，得自HyClone，Logan， Utah。伴清蛋白（C_7786)、多-L -鳥胺酸氫溴化物（p-3 655 )、牛胰島素（1-5500)、人類鐵傳遞蛋白（T-2252 )、腐胺（P-6024)、黃體酮（P-6149)、亞硒酸鈉（S-9133)、米翠醯胺（metrizamide) (M-3383 )，均得自 Sigma Chemical Company，Saint-Louis，MO。木瓜蛋白酶、脱氧核糖核酸酶（DNA酶），以及卵清蛋白（木瓜蛋白酶解離系統）均得自 Worthington Biochemicals，Freehold，NJ 〇

Falcon滅菌的96-孔微量培養盤（#3072)、組織培養的塑 -76 - . 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（2丨〇><297公瘦) " 一 — 570926 A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 74 -—--五、發明説明（）膠製品和聚丙缔離心管’均得自Becton-Dickinson，Oxnard ，CA。NuncLab_Tek組織培養室的保護玻璃（#136439)係得自Baxter，Irvine，CA ; 20微米（#460)尼龍網係得自 Tetko，Elmsford，NY ;而4 ”解剖鎮子和4 ’’解剖剪刀係得自 Roboz Surgical，Washington，DC。 ;抗體和相關試劑 - 多株的兔抗酪胺酸羥化酶抗體（TE101)，係得自Eugene Tech，Ridgefield Perk，NJ ;多株的兔抗-神經元專一性之晞醇酶抗體（NSE AB05 1)係得自 Chemicon，Temecula，CA ;以及生物素基化之羊抗-兔I g G和過氧化酶連結的抗生物素蛋白/生物素複合物（ABC Elite ; Vectastain kit PK_ 6100)係得自 Vector Laboratories，Burlingame，CA。3’，3’-二胺基聯苯胺係得自 Cappel Laboratories，West Chester， PA。在PBS中的超阻擋之封阻緩衝溶液（#37515 )係得自 Pierce Chemical Company，Rockford，IL。三通 Χ·100 (Χ100)、Nonidet P-40 (Ν6507)過氧化酶（30%，體積 / 體積；H1009)係得自Sigma。GBR_ 12909多巴胺攝取抑制劑 (D - 052 )係得自RBI，Natick，MA。3 Η -多巴胺（氚化的多巴胺，ΝΕ-131 ; 21居里/毫莫耳）係得自New England Nuclear，Boston，ΜΑ。光相超混合閃爍難尾酒（Optiphase Supermix scintillation cocktail)係得自 Wallac，Turku， Finland。White ViewPlate_96孔微量培養盤（#6005 182)係得自 Packard Instruments Corporation，Meriden，CT。除非另行指定，所有其他的試劑均獲自Sigma Chemical * A -77- (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 570926 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（75 )

Company 〇培養基之製備按照DMEM和F12的1 : 1混合物來製備基礎培養基，並補充B 2 7培養基添加物，做成5 〇倍濃縮的母溶液。加入L _ 穀胺醯胺至大約2mM的終濃度，青黴素至大約100111/公升，和鏈黴素至大約100毫克/公升的終濃度。加入熱-失活的馬血清至大約1 5 %的終濃度。在混合之後，將ρ η値調整到大約7.3，並將培養基保持在4 X：下。在使用之前才製備新鮮的培養基，以便將實驗中的變數減到最少。完全使用塑膠的吸移管和容器，以便減少蛋白質的吸附。培養物底層要促進底層神經元的最佳附著和軸突的自然生長，藉著按照下述連績塗覆多· L -鳥胺酸和昆布胺酸，來修改微量滴定盤的表面（培養物底層）。以〇丨毫克/毫升在〇丨Μ硼酸（ρΗ8·4)中的滅菌多-L-鳥胺酸溶液，在室溫下完全塗覆盤的表面至少1小時，接著以超級q水滅菌沖洗。然後吹乾沖洗的水，加入1 ·〇微克/毫升在p B S中的老鼠昆布胺酸溶液’並在3 7 °C下培養2小時。在使用滴定盤之前才進行這些程序，以便確保結果的可再現性。製備大鼠胚胎的黑質培養物利用大鼠胚胎的腦作爲黑質之多巴胺系神經元的來源。使用確定懷孕時間之Sprague-Dawley鼠的1 5日齡胚胎。每個實驗最多處理36個胚胎。藉著暴露在C02下殺死懷孕鼠，以解剖剪刀打開牠們的腹腔，並從子宮中移出胎兒。然

A -78- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） ---------_|丨 1 * « W (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

、IT 570926 A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製五、發明説明（76 後切開胎兒的知，清除血和腦膜，並利用明確定義的解剖界 ir： (Altman和 Bayer ’ Atlas of Prenatal Rat Brain Development，CRC Press，BoeaRat〇n，FL，1995)切開含有黑質的大腦腳盍腹面區域。將該組織收集在冰冷的D _ PBS中’移至10¾升的解離培養基（在HBSS中有12〇單位的木瓜蛋白酶和2000單位的d N A酶）中，然後在大約3 7 °C 下，在旋轉平台式振盪器上以大約2〇〇rpm培養45分鐘。然後通過火琢的巴斯德吸移管，藉著研製使細胞分散，通過 2 0微米的Nitex網來篩選，以便拋棄未解離的組織，並利用 I E C臨床離心機以200xg將其離心5分鐘。將所得的細胞小球再懸浮於含有卵清蛋白和大約5〇〇單位之dn A酶的 Η B S S中’在頂邵的層中含有4 %卵清蛋白溶液（在η β s S中），並以500xg離心大約丨〇分鐘。將最後的小球再懸浮於完整的培養基中（參見上文），調節成大約28,〇〇〇細胞/毫升，並按每一等份（9 0微升）播種到預先以多·鳥胺酸和昆布胺酸塗覆之6毫米·孔的96 -孔微量培養盤中。迅速地發生細胞的附著，而形成平面的效力約爲7 5 %。多巴胺系神經元的免疫組織化聲按照下述’利用稍加修改、由Louis等人（J. Pharmdcol.

Exp. Therap·, 262 : 1274-1283，1992 ； Science，259 ： 689-692，1993 )描述的間接免疫過氧化酶法，定出多巴胺系神經元在黑質培養物中的特徵。在室溫下，以在D · P B S中 4 %的仲甲醛，p Η 7.4固定該培養物3 0分鐘，接著以D PBS(每個6_毫米孔各200微升）沖洗三次。然後將已經固 -79 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 570926 A7 B7 五、發明説明（77 ) · \ 定的培養物培養在P B S中、含有1 %N P - 4 0的超阻擒之封阻緩衝溶液中，以便增加抗體的滲透性。然後以在相同的緩衝溶液中大約1 : 2000的稀釋度，來應用一級兔抗-酪胺酸護化酶抗體，並在3 7 °C下，在旋轉振盪器上培養1小時。以D-PBS沖洗三次之後，利用大約1 : 500稀釋度的羊抗一兔生物素基化之I g G來檢測已經結合的抗體；將這些二次

A 抗體與細胞一起培養在3 7 °C下大約1小時。然後以D - P B S 沖洗該細胞三次，並以稀釋成1 : 500的抗生物素蛋白生物素-過氧化酶複合物來檢測二次抗體，並將該細胞培養在 3 7°C下大約45分鐘。以D-PBS沖洗三次此上之後，使該培養物在含有0.04% 3，，3，·二胺基聯苯胺-(HC 1)4、0.06% NiCl2 和〇.〇2〇/0過氧化氫的〇 1M Tris-HCU，pH 7.4 中反應 5-20分鐘。座元的存活經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 按照上述固定黑質培養物，並免疫染色處理之，然後在 200X放大倍率下以亮-光光學來檢查。計算在今卜孔微量培養盤全部的6-毫米孔中，被酪胺酸羥化酶染色之神經元的數目。定出存活神經元有關具有形狀規則的細胞體、帶有王要類似軸突之突起和數個類似樹突之突起等特徵。從計數中排除顯示變性徵兆的神經元，如具有不規則、空泡化的核外原漿（Perikarya)或破碎的軸突（然而，大部份的變性神經疋都脱離培養物底層）。以T Η -陽性神經元/ 6 _亳米孔或相對於對照組多巴胺系神經元密度的倍率變化，來表示多巴胺系神經元細胞的數目。 ______ -80- 本紙張尺度適) Α4規格（21GX297公釐)--—~—— 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 570926 A7 B7 五、發明説明（78 ) 決定多巴胺的攝取在已經建立於white ViewPlate-96微量培養盤中的15日齡胚胎鼠黑質神經之培養物上，決定多巴胺的攝取。以預先-加溫的攝取缓衝溶液（約100微升）沖洗該培養物，該攝取緩衝溶液包括經過修改的Krebs-Ringer溶液，p Η 7.4，含有大

約 120mM Naa、4.7 mM KC卜 1.8mM CaCl2、1.2mM

MgS04、32mMNaHP〇4、1.3mMEDTA和 5.6mMD-葡萄糖。攝取緩衝溶液亦含有ImM抗壞血酸和50uM優降寧 (pargyline )，以避免多巴胺的氧化。然後在3 7 °C下將該細胞預培養在攝取緩衝溶液中大約1 0分鐘。然後以在7 5微升攝取緩衝溶液中約有50ιιΜ的濃度，將氚化的多巴胺（3<1 D A，2 1居里/毫莫耳）加至黑質培養物中，並在3 7 下培養該培養物大約60分鐘。藉著將培養物與含有多巴胺攝取抑制劑GBR- 12909(luM)的攝取緩衝溶液一起培養，定出非-特異性多巴胺的攝取。非·專一性的攝取大約相當於低於1 %的總攝取量。藉著抽吸培養基，接著以冰冷的攝取緩衝溶液（約120微升）迅速沖洗三次，而中止該攝取分析。然後藉著加入光相超混合閃爍難尾酒（2〇〇微升）將細胞溶解，並藉著閃爍分光測定法，利用Wallac MicrobetaPlus 96 孔微量培養盤計數器定出放射性（也就是説，藉著在培養物中殘留之氚的閃爍計數來分析多巴胺的攝取），以dpm/6•亳米孔或相對於對照組培養物的倍率變化來表示結果。分析系神經元的存活和形熊 -I -- ί«* · C請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁} ’、!!' -81 -

570926

(請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 使用冨含多巴胺系神經元之15日齡胚胎（E15)鼠黑質的培養物，並出切截之GDNF蛋白質對多巴胺系神經先存活的影響。使該培養物在單獨以多-鳥胺酸和昆布胺酸-塗覆之9 6 -孔微量培養盤中，或是在各種濃度（範圍從約丨微微克/耄升到約1 0毫微克/毫升）的下列蛋白質的存在下生長南達6天：大腸桿菌-表·現的成熟hGDNF ;大腸桿菌表現的[Pr〇23-Ile134]、[Arg32-nel34]、[Gly33_ne134] ，以及[Lys37-Ilel34]切截之gdnf蛋白質；CHO細胞表現的成熟hGDNF，以及CHO細胞衍生的[Arg32-Ile134] 切截之GDNF蛋白質。培養基由DMEM/F12構成，補充有1 5 %熱-失活馬血清（£ 1 5培養物）或2.5 %熱-失活馬血清、D•葡萄糖、HEPES、胰島素和鐵傳遞蛋白（P6培養物）。路胺酸羥化酶（T Η)的免疫染色，使用在多巴胺生物合成作用中的速率-限制酵素，作爲多巴胺系神經元的標記。因爲在菱腦中具有正腎上腺素功能的神經元在Τ Η染色上也是陽性的，因此特別小心地切開受限於中腦之大腦腳蓋腹面的區域，並避開含有正腎上腺功能之細胞體的較尾端區域。經濟部中央標準局員工消費合作社印製在6天之後，該Ε 1 5培養物通常含有大約7 0 %的神經元，係由神經元專一性的稀醇酶免疫染色法（上述）確認之，以及30%非-神經元之細胞（其具有扁平、暗相位的外觀）；多巴胺系神經元佔神經元族群約1 0 - 1 5 %。在6天之後，以仲甲醛固定該培養物，並進行酪胺酸羥化酶之免疫染色，它是確認在這些培養物中之多巴胺系神經元的標記。在亮場光學下計算出現在6 -毫米孔中所有的赂 -82- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X297公釐）經濟部中央標準局員工消費合作社印製 570926 A7 -—__ __B7 五、發明説明（80 ) 胺酸·羥化酶-陽性之神經元。對每個實驗條件分析3到6個不同的孔。以在對照組培養物中發現的酪胺酸_羥化酶-陽性之神經元數目的百分比來表示結果。、以1.0亳微克/毫升之GDNF、CHO細胞-表現之GDNF或大腸桿菌-表現之GDNF處理的E 1 5黑質培養物，分別含有比未處理對照組培養物多大約3 8 %和2 7 %的T Η _具有兔疫反應性之神經元，暗示兩種GDNF物種都促進了多巴胺系神經tl的存活。以1 .〇毫微克^/毫升切截之GDNF蛋白質處理的E 1 5黑質培養物，顯示在活體外6天後的培養物上，於 T Η -陽性神經元的數量上有類似的增加；匸η 〇細胞-衍生的[Arg3 2-lle 13 4]切截之GDNF蛋白質爲42% ;而大腸桿菌表現的[A r g 2 _ n e 13 4 ]和[g 1 y 3 3 _ n e 13 4 ]切截之 gdnf 蛋白質則分別爲2 6 %和1 7 %。對照組培養物與利用成熟和切截之GDNF蛋白質處逵之培養物的比較，亦顯示所有的GDNF蛋白質對於多巴胺系神經元之形態學分化上的顯著影響。確認[Arg32_Ilel34〕* [Gly3 3-lie134]切截之GDNF蛋白質的效果，和它們各自的成熟GDNF蛋白質對應物相同。比起對照組培養物中 TH-陽性的神經元，在所有以〇〇>^處理過培養物中，具有TH-免疫反應性的神經元明顯地擁有較複雜且更廣泛的軸突之樹狀分枝，以及較高程度的軸突分支和整體上較大的軀幹尺寸。免旦胺攝取多巴胺攝取係濟ϋ高親和力之乡巴胺再攝入運送者位置 — ___ -83_ 本紙張尺度國國家標準（CNS) ------ ----------— m 0 0 m (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂- 570926 81 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（的數目和活性，並反映出多巴胺系神經元的功能性分化。在6天之後、在活體外、含有或不含成熟GDNF或切截之 GDNF蛋白質的E 1 5鼠黑質培養物中，測量多巴胺的攝取。在這些培養物中’多巴胺的攝取具有多巴胺系神經元的藥學輪廓特徵，也就是説它被l.OuM GBR_12909，一種對多巴胺系神經元有專一性的多巴胺運送者抑制劑，幾乎完全地阻斷了（ID 50 = 2 OnM)。這顯示多巴胺攝取的測量値，並未反映出污染之具有正腎上腺素功能系之神經元的出現，該神經元能夠經由正腎上腺素運送者來攝取多巴胺，但疋對GBR-12909的抑制作用不具有敏感性。確認cH〇r細胞表現的成熟GDNF和CHO_衍生的[八巧32-11^34]切截之GDNF蛋白質的效果：關於大約2 〇微微克/毫升之E D w ，增加了大約6 5 %。證實如圖5所述之大腸桿菌-表現的 [ProU-LysPz^Asnn-neiw]切截之 GDNF 蛋白質，關於大約40微微克/毫升之ED”，增加了大約65%。大腸桿菌表現的成熟蛋白質，以及大腸桿菌-表現之[Arg32_

Ile ]、[Gly33-Ilel34]和[Lys37-Ile134]切截之GDNF 蛋白貝對夕巴胺攝取的影響也是相同的：關於大約5 〇微微克/ ¾升之ED50，增加了大約50%。這些結果顯示，切截之GDNF蛋白質作用就像是黑質多巴胺系神經元的可能促進-存活及謗發_分化之因子。如此，期望它們在治療帕金森氏症、情緒敏銳度降低、隨意和不隨=肌的運動變慢、肌肉強直和顫抖之特徵的神經學失調疋特別有用的。這類症狀被認爲是位在黑質之產製多巴 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

-84 570926 A7 B7五、發明説明（82 )胺的神經元之進行性變性的結果。這些神經元（”多巴胺系神經元”）的變性，導致大腦内叫做紋狀體的鄰近區域中多巴胺的減少。 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 -85- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 570926 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7五、發明説明（83 )序列一覽表 (1)共同訊息 A (i) 申請者：Hu· Sylvia (ii) 發明標題··切截之神經膠質細胞株-衍生的神經黄養因子 (iii) 序列數目：50 (iv) 通信地址： (A) 收件人：AMGEN INC· (B) 街道：1840 DeHavilland Drive (C) 城市：Thousand Oaks (D )州·· California (E) 國家：United States of America (F) 郵遞區號：91320 (v) 電腦可讀形式： (A) 媒體型式··軟碟 - (B) 電腦：IBM PC可相容的 (C) 操作系統：PC-DOS/MS-DOS (D) 軟體：Patentln Release #1.0，Version #1.25 (vi) 最近的申請資料： (A)申請號碼： (B )建檔日期： (C)分類： (viii)律師/代理人之資訊： . (A)姓名：Curry, Daniel R. -86· 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210 X 297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 570926 A7 B7 ~~ *84~" 一一 "" 五、發明説明（） (B)註册號碼：32,727 (C )參考資料/摘要號碼：A - 3 5 7 (i X)電信資料： (A) 電話：805-447-8102 (B) 傳眞：805-499-8011 (C )電傳： (2)序列識別1號的訊息： (i) 序列特徵： (A)長度：402個鹼基對 (B )類型：核酸 (C )股，：單股 (D )局部解剖學：直線狀 (ii) 分子類型；蛋白質 (ix)特徵：、

(A) 名稱/關鍵：C D S (B) 位置：1...402 (xi)序列説明：序列識別1號：經濟部中央標準局員工消費合作社印製

丁CA CCA GAT AAA CAA ATG GCACTT CCT AGA AGA GAG CGT； ΛΛΤ CGO

Ser Pro A«?p Lys Gin Met Λ1 o Va 1 L^u Pro Arg Arg Q1 u Arq Asn Arg

1 5 , 10 IS

CAG GCT GCA GC丁 GCC AAC CCA GAG AA丁丁CC ACA GGA ΑΛΑ GGT CGG ACA

Gin Ala Ala Ala Ala Asn Pro Glu Asn Ser Arg Gly Lys? Gly Arg Arg 20 25 、 30

GGC CAG AGG OOC ΛΑΑ AAC CGG GGT TGT CTC 丁ΤΛ ACT ATA CAT TTA

Gly Gin Arg Gly Lys Asn Arg Gly C/s Val Leu Thr AU lie His Leu 35 4/3 45 -87 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（21 〇x297公釐） 570926 A7 B7 五、發明説明（85 ) ΛΑΤ GTC Asn Va1 50 TTT AGC Phe Arg 65 八AA ΛΤΛ Lys lie ACT GAC TTG Thr Asp Lea TAC TGC AGC Tyr Cys Ser GTA GGG Val Gly TTT TTA Phe Leu AAA AGG Lys Arg 130 TTG AAA AAC Leu Lys Asn 85 CAG GCA TGT Gin Ala Cys 100 GAT GAT AAC Asp Λ^ρ Λr;n 115 TGT GCA I'GT Cys Gly Cys GGT CTG Gly Le.j S5 GGC TCT Gly Ser 70 TTA TCC Leu Ser TGC AGA Cys Arg CTG GTT Lf?u Vn 1 ATC lie C：y TGC cys AC A Arg CCC Pro TAC ，:、vr 1 ΤΛΤ C；AA ACC AAG GAG GAA CTG ATT 19 2 ?yr GL-j Thr Lys Glu Glu Leu lie 60 CiA丁 GCA GCT GAG ACA \CG TAC GAC 240 Asp Ala Ala Glu Thr rhr Tyr Asp 90 Λ.·\Τ AGA AGG CTG C/VG ACT GAC Λ,\Λ 2 TUI ;'sn Arg Arg Leu νΛ 1 Ser Asp Lys 90 95 ATC GCC TTT GAT GA丁 GAC CTC 丁CG ile Ala Phe Asp Asp Asp Leu Ser 135 110 3 36 CAT AT丁 CTA AGA AAG CAT TCC GCT 1Π ,1 1“ r*· 1】” I <»mi Λ I r j I ,y 11 j m .'··<，丨，\ln 402 ----------Φ I — < 秦»- (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) (2)序列識別2號的訊息： (i) 序列特徵： (A) 長度：134個胺基酸 (B) 類型：胺基酸 (D )局部解剖學：直線狀 (ii) 分子類型：蛋白質 (xi)序列説明··序列識別2號

Ser Pro Asp Lys Gin Met Ala Val -Leu Pro Arg Arg Glu Arg Asn Arg 1 5 ,1*0 15

Gin Ala Ala Ala Ala Asn Pro Glu Asn Ser Arg Gly Lys Gly Ajrg Krg 20 25 30

Gly Gin Arg Gly Lys Asn Argv Gly Cys Val Leu Thr Ala lie His Leu 3S 4C 45 '

Asn Val Thr Anp Lou Gly Leu Gly Tyr Glu Thr Lye Glu Glu L^?u 11« 50 Sr, 、 60

Phe Arg Tyr Cys Ser Gly Ser Cys Asp Ala Ala Glu Thr Thr Tyr Asp 65 70 75 Θ0

Lys lie Leu Lys Asn Leu Ser Arg Asn Arg Arg Leu Vo 1 Anp Lyn 85 90 95 88 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐）、11 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 570926 A7 B7 ~86~' _ '~ 五、發明説明（)

Val Gly Gin Ala Cys Cys Arg Pro lie Ala Phie Asp Asp Asp Leu Ser 100 105 110

Phe Leu Asp Asp Asn Leu Va1 Tyr His lie Leu Arg Lys His Ser Ala 115 120 125

Lys Arg Cys Gly Cys lie 130 * (2)序列識別3號的訊息： (i) 序列特徵： (A) 長度·· 4個胺基酸 (B) 類型：胺基酸 (C) 股：單股 (D )局部解剖學：直線狀· (ii) 分子類型：肽 (xi)序列説明：序列識別3號：/

Lys Asn Arg Gly 1 (2)序列識別4號的訊息： ' (i) 序列特徵： (A) 長度：5個胺基酸 (B) 類型：胺基酸 1 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) (C) 股：單股、 (D) 局部解剖學：直線狀 (ii) 分子類型：肽 (xi)序列説明··序列識別4號、：

Gly Lys Asn Arg Gly · 1 5 -89- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 87 570926 A7 B7 五、發明説明（） (2)序列識別5號的訊息： (i) 序列特徵： (A) 長度·· 6個胺基酸 (B) 類型：胺基酸 (C) 股：單股 (D )局部解剖學：直線狀 (ii) 分子類型：肽 (xi)序列説明：序列識別5號： Arg Gly Lys Asn Arg Gly 1 5 (2)序列識別6號的訊息： (i) 序列特徵： (A) 長度：7個胺基酸 (B) 類型：胺基酸 (C) 股：單股 (D )局部解剖學：直線狀 (ii) 分子類型：肽經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) (xi)序列説明：序列識別6號： Gin Arg Gly Lys Asn Arg Gly 1 5 (2)序列識別7號的訊息： (i)序列特徵： (A) 長度：8個胺基酸 (B) 類型：胺基酸 -90- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210 X297公釐） 570926 A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製五、發明説明（88 ) (C)股：單股 (D )局部解剖學：直線狀 (ii)分子類型：肽 (xi)序列説明：序列識別7號： Gly Gin Arg Gly Lys Asn Arg Gly 1 5 (2)序列識別8號的訊息： (i) 序列特徵： (A) 長度：9個胺基酸 (B) 類型：胺基酸 (C) 股：單股 (D )局部解剖學：直線狀 (ii) 分子類型：肽 (xi)序列説明：序列識別8號： Arg Gly Gin Arg Gly Lys Asn Arg Gly 1 5 (2)序列識別9號的訊息： (i) 序列特徵： (A)長度：10個胺基酸 (B )類型：胺基酸 (C) 股：單股 (D) 局部解剖學：直線狀 (ii) 分子類型：肽 (xi)序列説明：序列識別9號： -91 - (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 570926 A7 B7 五、發明説明（89 )

Arg Arg Gly Gin Arg Gly Lys Asn Arg Gly 1 5 10 (2)序列識別10號的訊息： (i) 序列特徵： (A) 長度：1 1個胺基酸 (B) 類型：胺基酸 (C) 股：單股 (D )局部解剖學：直線狀 (ii) 分子類型：肽 (xi)序列説明：序列識別1 0號：

Gly Arg Arg Gly Gin Arg Gly Lys Asn Arg Gly 1 5 10 (2)序列識別1 1號的訊息： (i) 序列特徵： (A) 長度：12個胺基酸 (B) 類型：胺基酸 (C) 股：單股 (D) 局部解剖學：直線狀經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) (ii) 分子類型：肽 (xi)序列説明：序列識別1 1號：

Lys Gly Arg Arg Gly Gin Arg Gly Lys Asn Arg Gly 1 5 10 (2)序列識別12號的訊息： (i)序列特徵： -92- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 570926 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（9〇 ) (A) 長度·· 13個胺基酸 (B) 類型：胺基酸 (C) 股：單股 (D )局部解剖學：直線狀 (ii)分予類型：肽 (xi)序列説明：序列識別1 2號：

Gly Lys Gly Arg Arg Gly Gin Arg Gly Lys Asn Arg Gly 1 5 10 (2)序列識別13號的訊息： (i) 序列特徵： (A) 長度：14個胺基酸 (B) 類型：胺基酸 (C) 股：單股 (D )局部解剖學：直線狀 (ii) 分子類型：肽 (xi)序列説明：序列識別1 3號：

Arg Gly Lys Gly Arg Arg Gly Gin Arg Gly Lys Asn Arg Gly 1 5 10 (2)序列識別14號的訊息： (i)序列特徵： (A)長度：15個胺基酸 (B )類型：胺基酸 (C)股：單股 (D )局部解剖學：直線狀 _-93- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

570926 A7 B7 五、發明説明（91 ) (ii)分子類型：肽 (xi)序列説明：序列識別1 4號：

Ser Arg Gly Lys Gly Arg Arg Gly Gin Arg Gly Lys Asn Arg Gly 1 5 ^ l〇 15 (2)序列識別15號的訊息： (i) 序列特徵： (A) 長度：16個胺基酸 (B) 類型：胺基酸、 (C) 股：單股 (D )局部解剖學：直線狀 (ii) 分子類型：肽 (xi)序列説明：序列識別1 5號：

Asn Ser Arg Gly Lys Gly Arg Arg Gly Gin Arg Gly Lys Asn Arg Gly 15 10 15 (2)序列識別16號的訊息： (i) 序列特徵： (A) 長度：17個胺基酸 (B) 類型：胺基酸

A 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) (C) 股：單股 (D )局部解剖學：直線狀 (ii) 分子類型：肽 (xi)序列説明：序列識別16號：

Glu Asn Ser Arg Gly Lys Gly Arg Arg Gly Gin Arg Gly Lys Asn Arg 1 5 10 15 -94· 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐）經濟部中央標準局員工消費合作社印製 570926 A7 B7 五、發明説明（92 ) (2)序列識別17號的訊息： (i) 序列特徵： (A) 長度：18個胺基酸 (B) 類型：胺基酸 (C) 股：單股 (D) 局部解剖學：直線狀 (ii) 分子類型：肽 (xi)序列説明：序列識別1 7號： '

Pro Glu Asn Ser Arg Gly Lys Gly Arg Arg Gly Gin Arg Gly Lys Asn 15 10 15

Arg Gly (2)序列識別18號的訊息： (i) 序列特徵： (A)長度：19個胺基酸 (B )類型：胺基酸 (C) 股：單股 (D) 局部解剖學：直線狀 (ii) 分子類型：肽 (xi)序列説明：序列識別1 8號：、

Asn Pro Glu Asn Ser Arg Gly Lys Gly Arg Arg Gly Gin Arg Gly Lys 1 5 10 15

Asn Arg Gly (2)序列識別i 9號的訊息： (i)序列特徵： _ -95- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -- 舞· φ β (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 、1Τ 93570926 A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製五、發明説明（） ' (A) 長度：20個胺基酸 (B) 類型：胺基酸 (C) 股：單股 (D )局部解剖學：直線狀 (ii)分子類型：肽 (xi)序列説明··序列識別1 9號： Ala Asn Pro Glu Asn Ser Arg Gly Lys Gly Arg Arg Gly Gin Arg Gly 1 5 10 15 Lys Asn Arg Gly 20 A (2)序列識別20號的訊息： (i) 序列特徵： (A) 長度：2 1個胺基酸 (B) 類型：胺基酸 (C) 股：單股 (D )局部解剖學：直線狀 (ii) 分子類型：肽 (xi)序列説明：序列識別20號： Ala Ala Asn Pro Glu Asn Ser Arg Gly Lys Gly Arg Arg Gly Gin Arg 1 5 10 15 Gly Lys Asn Arg Gly 20 (2)序列識別2 1號的訊息： (i)序列特徵： (A) 長度：22個胺基酸 (B) 類型：胺基酸 -96- ------------ 一 · * » (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 570926 A7 B7 五、發明説明（） (C)股：單股 (D )局部解剖學：直線狀 (ii)分子類型：肽 (xi)序列説明：序列識別21號：

Ala Ala Ala Asn Pro Glu Asn Ser Arg Gly Lys Gly Arg Arg Gly Gin 1 5 10 15

Arg Gly Lys Asn Arg Gly 20 (2)序列識別22號的訊息： (i) 序列特徵： (A) 長度：23個胺基酸 ' (B) 類型··胺基酸 (C) 股：單股 (D) 局部解剖學：直線狀 (ii) 分子類型：肽 (xi)序列説明：序列識別22號：

Ala Ala Ala Ala Asn Pro Glu Asn Ser Arg Gly Lys Gly Arg Arg Gly 15 10 15

Gin Arg Gly Lys Asn Arg Gly 20 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) (2)序列識別23號的訊息： (i)序列特徵： (A) 長度：24個胺基酸 (B) 類型：胺基酸 (C) 股：單股 (D )局部解剖學：直線狀 •97- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐）經濟部中央標準局員工消費合作社印製 570926 A7 B7 五、發明説明（95 )

* A (ii)分子類型：肽 (xi)序列説明：序列識別2 3號：

Gin Ala Ala Ala Ala Asn Pro Glu Asn Ser Arg Gly Lys Gly Arg Arg 1 5 10 15

Gly Gin Arg Gly Lys Asn Arg Gly 20 (2)序列識別24號的訊息： (i) 序列特徵： (A) 長度：25個胺基酸 (B) 類型：胺基酸 (C) 股：單股 (D) 局部解剖學：直線狀 ' (ii) 分子類型：肽 (xi)序列説明：序列識別24號：

Arg Gin Ala Ala Ala Ala Asn Pro Glu Asn Ser Arg Gly Lys Gly Arg 15 10 15

Arg Gly Gin Arg Gly Lys Asn Arg Gly 20 25 (2)序列識別2 5號的訊息： (i )序列特徵： (A) 長度：26個胺基酸 (B) 類型：胺基酸 (C) 股：單股 (D )局部解剖學：直線狀 (ii)分子類型：肽 (xi)序列説明：序列識別25號： -98 - 丨本紙張尺度適用中酬家標準（ CNS ) A4規格（210X297公酱^ (請先聞讀背面之注意事項再填寫本頁)

570926 A7 B7 五、發明説明（96 )

Asn Arg Gin Ala Ala Ala Ala Asn Pro Glu Asn Ser Arg Gly Lys Gly 1 5 10 15 、

Arg Arg Gly Gin Arg Gly Lys Asn Arg Gly 20 25 (2)序列識別26號的訊息： (i )序列特徵： (A) 長度：27個胺基酸 (B) 類型：胺基酸 (C) 股：單股 (D )局部解剖學：直線狀 (ii)分子類型：肽 (xi)序列説明：序列識別2 6號：

Arg Asn Arg Gin Ala Ala Ala Ala Asn Pro Glu Asn Ser Arg Gly Lys, 15 10 15

Gly Arg Arg Gly Gin Arg Gly Lys Asn Arg Gly 20 25 (2)序列識別2 7號的訊息： (i) 序列特徵： (A)長度：28個胺基酸 (B )類型：胺基酸經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) (C) 股：單股 (D) 局部解剖學：直線狀 (ii) 分子類型：肽 (xi)序列説明：序列識別27號：

Glu Arg Asn Arg Gin Ala Ala Ala Ala Asn Pro Glu Asn Ser Arg Gly 1 5 10 15

Lys Gly Arg Arg Gly Gin Arg Gly Lys Asn Arg Gly 20 25 -99- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 570926 A7 B7 五、發明説明（97 ) (2)序列識別28號的訊息： (i) 序列特徵： (A) 長度：29個胺基酸 (B) 類型：胺基酸 (C) 股：單股 (D) 局部解剖學：直線狀 (ii) 分子類型：肽 (xi)序列説明：序列識別2 8號：

Arg Glu Arg Asn Arg Gin Ala Ala Ala Ala Asn Pro Glu Asn Ser Arg 15 10 15

Gly Lys Gly Arg Arg Gly Gin Arg Gly Lys Asn Arg Gly 20 25 (2)序列識別29號的訊息： ' (i) 序列特徵： (A) 長度：30個胺基酸 (B) 類型：胺基酸 (C) 股··單股 (D )局部解剖學：直線狀經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) (ii) 分子類型：肽 (xi)序列説明：序列識別29號··

Arg Arg Glu Arg Asn Arg Gin Ala Ala Ala Ala Asn Pro Glu Asn Ser 15 10 15

Arg Gly Lys Gly Arg Arg Gly Gin Arg Gly Lys Asn Arg Gly 20 25 30 (2)序列識別3 0號的訊息： _____-100-_ 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐) 570926 A7 B7 五、發明説明（98 ) (i) 序列特徵： (A )長度：3 1個胺基酸 (B) 類型：胺基酸 ' (C) 股：單股 (D )局部解剖學：直線狀 (ii) 分子類型：肽 (xi)序列説明：序列識別3 0號：

Pro Arg Arg Glu Arg Asn Arg Gin Ala Ala Ala Ala Asn Pro Glu Asn 15 10 15

Ser Arg Gly Lys Gly Arg Arg Gly Gin Arg Gly Lys Asn Arg Gly 20 25 30 (2)序列識別3 1號的訊息： (i) 序列特徵： (A) 長度：32個胺基酸 (B) 類型··胺基酸 (C) 股：單股 (D )局部解剖學：直線狀 (ii) 分子類型：肽 (xi)序列説明：序列識別3 1號：經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

Leu Pro Arg Arg Glu Arg Asn Arg Gin Ala Ala Ala Ala Asn Pro Glu 15 10 15

Asn Ser Arg Gly Lys Gly Arg Arg Gly Gin Arg Gly Lys Asn Arg Gly 20 25 30 (2)序列識別3 2號的訊息： (i)序列特徵： (A)長度：3 3個胺基酸 , -101 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 570926 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 Α7 Β7 i、發明説明（"） (B) 類型：胺基酸 (C) 股：單股 (D) 局部解剖學：直線狀

(ii)分子類型：肽 A (xi)序列説明··序列識別3 2號：

Val Leu Pro Arg Arg Glu Arg Asn Arg Gin Ala Ala Ala Ala Asn Pro 1 5 10 15

Glu Asn Ser Arg Gly Lys Gly Arg Arg Gly Gin Arg Gly Lys Asn Arg . 20 25 30

Gly (2)序列識別33號的訊息： (0序列特徵： (A) 長度：34個胺基酸 (B) 類型：胺基酸 (C) 股：單股 (D) 局部解剖學：直線狀 , (ii)分子類型：肽 (xi)序列説明：序列識別33號：

Ala Val Leu Pro Arg Arg Glu Arg Asn Arg Gin Ala Ala Ala Ala Asn e 15 10 15

Pro Glu Asn Ser Arg Gly Lys Gly Arg Arg Gly Gin Arg Gly Lys Asn 20 25 30

Arg Gly (2)序列識別3 4號的訊息： (i)序列特徵： (A) 長度：35個胺基酸 (B) 類型：胺基酸 λ -102- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

570926 A7 B7 五、發明説明（1QQ ) (C)股：單股 (D )局部解剖學：直線狀 (ii)分子類型：肽 (xi)序列説明：序列識別3 4號：

Met Ala Val Leu Pro Arg Arg Glu Arg Asn Arg Gin Ala Ala Ala Ala 15 l〇 15 '

Asn Pro Glu Asn Ser Arg Gly Lys Gly Arg Arg Gly Gin Arg Gly Lys 20 25 30

Asn Arg Gly 35 (2)序列識別35號的訊息： (i) 序列特徵： (A) 長度：36個胺基酸 (B) 類型：胺基酸 (C) 股：單股 (D )局部解剖學：直線狀 (ii) 分子類型：肽

A (xi)序列説明：序列識別3 5號：

Gin Met Ala Val Leu Pro Arg Arg Glu Arg Asn Arg Gin Ala Ala Ala 1 5 10 15

Ala Asn Pro Glu Asn Ser Arg Gly Lys Gly Arg Arg Gly Gin Arg Gly 20 25 ~ 30 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

Lys Asn Arg Gly 35 (2)序列識別3 6號的訊息： (i)序列特徵： (A) 長度：37個胺基酸 (B) 類型：胺基酸 -103- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 570926 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7五、發明説明（Μ ) (C) 股：單股 (D) 局部解剖學：直線狀 (ii)分子類型：肽 (xi)序列説明：序列識別3 6號： Lys Gin Met Ala Val Leu Pro Arg Arg Glu Arg Asn Arg Gin Ala Ala 1 5 10 15 Ala Ala Asn Pro Glu Asn Ser Arg Gly Lys Gly Arg Arg Gly Gin Arg 20 25 30 Gly Lys Asn Arg Gly 35 (2)序列識別37號的訊息： (i) 序列特徵： (A) 長度：38個胺基酸 (B) 類型：胺基酸 (C) 股：單股 (D) 局部解剖學：直線狀 (ii) 分子類型：肽 (xi)序列説明：序列識別37號： λ Asp Lys Gin Met Ala Val Leu Pro Arg Arg Glu Arg Asn Arg Gin Ala 1 5 10 15 Ala Ala Ala Asn Pro Glu Asn Ser Arg Gly Lys Gly Arg Arg Gly Gin 20 25 30 Arg Gly Lys Asn Arg Gly 35 (2)序列識別38號的訊息： (i)序列特徵： (A)長度：39個胺基酸 (B )類型：胺基酸 _____»104- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS )八4規格（210X297公釐）：； (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

570926 A7 ___ B7____ 五、發明説明（1〇2 ) (C)股：單股 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) (D )局部解剖學：直線狀 (ii)分子類型：肽 (xi)序列説明：序列識別3 8號：

Pro Asp Lys Gin Met Ala Val Leu Pro Arg Arg Cxlu Arg Asn Arg Gin 1 5 i〇 15

Ala Ala Ala Ala Asn Pro Glu Asn Ser Arg Gly Lys Gly Arg Arg Gly 20 25 30

Gin Arg Gly Lys Asn Arg Gly · A 35 (2)序列識別3 9號的訊息： (i) 序列特徵： (A)長度：417個鹼基對 (B )類型：核酸 (C) 股··單股 (D) 局部解剖學，直線狀 (ii) 分子類型：DNA 、 (xi)序列説明··序列識別3 9號： CATATGTCTC CGGATAAACA AATGGCTGTT CTTCCACGTC GTGAACGT^A CCGTCAGGCG 60 GCCGCTGCTA ACCCGGAGAA TTCCCGTGG^ KAAQGTQGTC GTGGTCAGCG TGGTAAAAAC 120 CGCGGTTGCG TTCTGACCGC TATCCACCTG AACGTTACCG ACCTGGGTCT CGGTTACGAA 180 TACGACAAAA TCCTGAAAAA CCTHTCCCGT MCCGTCCTC TGOTTTCCGA CAAAGTTGCrr 300 C^AGCTTOCT GCCGTCCGAT CCCTTTCGAC GACGACCTOT CCTTCCTCCA CGACAJSCCTG )60 GTTTACCACA TCCTCCGTXA ACACTCCGCT AJVGCGTTGCG GTT^CATCTA Ap3ATCC 417 105- 570926 A7 B7 ^ 經濟部中央標準局員工消費合作社印製五、發明説明（1Q3) Γ (2)序列識別40號的訊息： (i) 序列特徵； (A)長度：417個鹼基對 (B )類型··核酸 (C)股：單股 (D )局部解剖學：直線狀 (ii) 分子類型：DNA · (xi)序列説明：序列識別40號：卜 CATATGAGCC CGGACAJ^ACA GATGGCAGTA CTTCCACCTC GTGAACGT^A TCGCCAGGCA 60 ； GCAGCTGCAA ACCCGGAAAA CTCCCGTGGT AAAGGTCGCC GTGGCCAGCG CGGCAAAAAC 120 CGTGGTTGTG TTCTGACTGC 'A^TCCACCTG .^ACGTTACTG ACCTGGGTCT GGGCTACGAA 180 ACCAAAGAAG AACTGATCTT CCGCTACTGC AGCGGCfCTT GCGACGCAGC TGAAACCACT 240 TACGACAAAA TCCTG^AAAA CCTGTCCCGT AACCGCCGTC TGGTAACCGA CAAAGTAGGT 300 CAGGCATGQT GCCG1CCGAT CGCATTCGAC GATGACCTGA GCTTCCTGGA TGACAACCTG 360 GTTTACCACA TCCTGCGTAA ACACTCCGC7 AAACGCTGCG GTTGCATCTA AGGATCC 417 (2)序列識別4 1號的訊息：v (i) 序列特徵： (A)長度·· 345個鹼基對 / (B )類型··核酸 (C)股：單股 (D )局部解剖學：直線狀 (ii) 分子類型：蛋白質、 (ix)特徵： (A)名稱/關鍵：CDS -106- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

570926 A7 B7 五、發明説明（1Q4 (B)位置·· 1 · .342 (xi)序列説明··序列識別4 1號： ATG TCC CCA GAA ΛΑΤ TCT CGT GGT ΛΑΑ GGT CGT CGT GGT CAG CGT GGT 48 Mec Ser Pro Glu Asn Ser Arg Gly Lys Giy Arg Arg Gly Gin Gly 135 140 145 150 Α.ΛΤ AAC CGC GGT TGC GTT CTG ACC GCT ATC CAC CTG AAC GTT ACC GAC 96 Asn Asn Arg Gly Cys Val T eu Thr Ala He His Leu Asn Val Thr Asp 155 160 165 CTG GGT CTC GCT TAC G/^A ACC ΛΛΛ (;ΛΛ C;八Λ ΤΤΛ ATC TTC CGT TAC TTV： 1 ΛΑ Gly Lou Cly Tyr Glu Thr Lyn Glu G1 υ Leu I l e Phr Arg Ty r Cy · 170 175 10〇 TCC GGT TCC TGC GAC GCT GCT GAA ACC ACG TAC CAC ΛΑΑ ATC CTC ΛΑΚ 192 Ser Gly Ser Cy 弓 A??p Ala A l λ Glu Thr Thr Tyr Asp Lye lie Ly* 185 190 195 ^AC CTG TCC CGT KAC CGT CGT CTG GTT TCC GAC ΛΑΑ GTT GCT CAA GCT 240 Asn Leu Ser Arg Asn Arg Arg Leu Val Ser Asp.Lys V« 1 Gly Gin AJLa 200 205 / 210 TGC TGC CGT CCG ATC GCT TTC GAC GAC GAC CTG TCC TTC CTG GAC0GAC 288 Cys, Cys Arg Pro lie Ala Phe Asp Asp Asp Leu Ser Phe Leu Asp Asp 215 220 , , * 225 230 ) AAC CTG GTT TAC CAC ATC CTG CGf ΛΑΑ CAC TCC GCT AAG CGT TGC GCT 3 36 Asn Leu Val Tyr His lie Leu Arg Lys His Ser A1 λ Lys Arg Cys Cly 235 240 245 TGC ATC TAA Cys lie 345 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (2)序列識別42號的訊息： · (i) 序列特徵：(A) 長度：114個胺；i酸 (B) 類型：胺基酸 (C )股：單股 (D)局部解剖學：直線狀 (ii) 分子類型··蛋白質 (χί)序列説明··序列識別42號： 107- 本紙珉尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210 X297公釐） 570926 A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製五、發明説明（1G5) Met Ser Pro Glu Asn Ser Arg Gly Lys Gly Arg Axg Gly Gin Arg Gly 1 5 10 X5 Asn Asn Arg Gly Cys Val Leu Thr Ala lie His Leu Asn Val Thr Asp 20 25 30 Leu Cly Leu Gly Tyr Glu Thr Lys Glu Glu Leu lie Phe Arg Tyr Cys 35 40 45 Ser Gly Ser Cys Asp Ala Ala Glu Thr Thr Tyr Asp Lys lie Leu Lys 50 55 60 Asn Leu Ser Arg Asn Arg Arg Leu Va1 Ser Asp Lys Val Gly Gin Ala S5 70 * 75 80 Cys Cys Arg Pro Ιΐσ ΑΙλ Pho Asp Λπρ Λπρ [>nu r»hr? I.nu Asp Λ*·;， 8 5 90 ”， Asn Leu Val Tyr His lie Leu Arg Lys His Ser Ala Lys Arg Cys Gly 令 100 105 · l10 Cys lie r. * / (2)序列識別43號的訊息、： (i) 序列特徵： (A)長度：315個鹼基對 (B )類型：核酸 1 (C)股：單股 ’ ， (D )局部解剖學··直線狀 (ii) 分子類型··蛋白質 (ix)特徵·· (A) 名稱/關鍵·· CDS (B) 位置·· 1 · .312 (xi)序列説明：序列識別4 3號： ----------·! i 鲁 m 0 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

、1T

-108 - 本紙張尺度適财_家標準（CNS ) A4規格（21。297公B 570926 A7B7 五、發明説明（1Q6 ) ATG CGT GGT CAA CGT GOT ΑΛΑ AAC CGC GGT TGC GTT CTG ACT CCA ATC 4Θ Met Arg Gly Gin Arg Gly Lys Asn Arg Gly Cys Val Leu Thr Ala lie 115 120 .. · 125 130 CAC CTG AAC GTT ACT GAC CTG GGT CTG GGC TAC GAA ACC AAA GAA GAA 96 His Leu Asn Val Thr Asp Ltu Gly Leu Gly Tyr Glu Thr Lys Glu Clu 135 140 145 CTG ATC TTC CGC TAC TGC AGC GGC TCT TGC GAC GCA GCT GAA ACC ACT 1.44 Leu lie Phe Arg Tyr Cys Ser Gly Ser Cys Asp Ala Ala Glu Thr Thr 150 155 160 TAC GAC ^AA ATC CTG ΛΑΑ AAC CTG TCC CGT AAC CGC CGT CTG GTA AGC 192 Tyr Asp Lys lie* Leu* Lys Asn Leu Ser Ajpg Asn Arg Arg L«u Val Ser 165 ^ 170 175 GAC ΛΑΛ GTA CGT CAG GCA TGC TGC CGT CCG ATC GCA TTC GAC GAT GAC 240 Asp Lys Val Gly Gin Ala. Cys Cys Arg·Pro lie Ala Pne Asp Asp Asp 180 185 v 190 CTG AGC TTC CTG GAT GAC AAC CTG GTT TAC CAC ATC CTG CGT AAA CAC 280 Leu Ser Phe Leu Asp Asp Asn. Leu Val Tyr His lie Leu Axg Lys His ! 195 200 205 210 TCC GCT AAA CGC TGC GGT TGC ATC TAA 315 Ser Ala Lys Arg Cys Gly Cys lie ^ 215 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (2)序列識別44號的訊息··· (i) 序列特徵： (A) 長度：1〇4個胺基酸 (B) 類型··胺基酸 (C) 股：單股 (D) 局部解剖學··直線狀 (ii) 分子類型··蛋白質 (xi)序列説明：序列識別44號

Met Arg Gly Gin Arg Gly Lys Asn Arg Gly Cys Val Leu Thr Ala lie 1 5 10 15

His Leu Asn Val Thr Asp Lou Gly Leu Gly Tyr G1u Thr Lya Glu Clu 20 25 30 109- >紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（21GX297公釐）

570926 A7 B7 一五、發明説明（） Leu He Phe Arg Tyr Cys Ser Gly Ser Cys Asp Ala *AU Clu Thr Thr 35 40 45 J ^ Asp LyS lie Leu Lys Agp. Lc-j Ser Arg Asn Arg. Arg L^u Va 1 Ser 50 60 Asp Lys Val Gly Gin Ala Cys Cys Arg Pro lie Ala Phe Asp Aep Asp 65 70 , ' 75 80 Leu Ser Phe Leu Asp Asp Asn Leu Vd1 Tyr Hi9 U〇 Leu A L ； Hi„ 85 90 95 Ser ΛΙλ Lys Arg Cys Gly Cys lie 100 (2)序列識別45號的訊息 (i) 序列特徵： (A)長度：312個鹼基對 (B )類型：核酸 · (C) 股··單股 (D) 局部解剖學：直綠狀 (ii) 分子類型：蛋白質： (ix)特徵： (A) 名稱/關鍵：CDS (B) 位置：1 ..309 (xi)序列説明：序列識別4 5號： (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 、1.τ 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 ATG GGT CAA CGT GGT AAA CGT t；GT TGT GTT CTG ACT GCA ATC CAC 43 Mec Gly Gin Arg Gly Lys Asn Arg Gly Cys Val Leu Thr Ala lie His 105 110 115 120 CTG AAC GTT ACf GAC CTG GGT CTG GGC TAC GAA ACC ΛΑΑ GAA GAA CTG 96 Leu Asn Val Thr Asp Leu Gly Leu Gly Tyr Glu Thr Lys Glu Glu Leu 125 130 135 ATC TTC CGC TAC TX3C AGC GGC TCT TGC GAC GCA GCT GAA ACC ACT TAC 144 lie Phe Arg Tyr Cys Ser Gly Ser Cy3 Asp Λ1·* Ala Glu Thr Thr Tyr 140 145 > 150 GAC AAA ATC CTG ΛΑΑ AJVC CTG TCC CGT AAC CGC CGT CTG GTA AGC GAC 19 2 Asp Lys 11« Leu Lys Asn Leu Scr Arg 八sn 入rg Arg Vai Ser Asp 155 160’ ， 165 / -110_本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐 570926 A7 B7 五、發明説明（1ί)8 ) AAA GTA GGT CAG GCA TGC TGC CGT CCG ATC -GCA TTC GAC CAT GAC CTG 240 Lys Val Gly Gin Ala Cys Cys Arg Pro lie Ala Phe Asp Asp Asp· Leu 170 175. · 180 _ ί； AGC TTC CTG GAT GAC AAC CTG GTT TAC1}CAC ATC CTG CGT AAA CAC TCC 2Θ8 Ser Phe Leu Asp Asp Asti Leu Val Tyr His He Leu Arg Lys^ His Ser 185 190 195 200 GCT AAA CGC TGC GGT TGC ATC ΤΛΛ 八la Lya Arg Cys Gly Cys lie 205 3 12 (2)序列識別46號的訊息： (i) 序列特徵： (A) 長度：103個胺基酸 (B) 類型：胺基酸 (C) 股：單股 (D )局部解剖學：直線狀 (ii) 分子類型：蛋白質〇i)序列説明：序列識別46號： (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂經濟部中央標準局員工消費合作社印製

Met Gly Gin Arg Gly Lvs Asn Arg Gly Cys Val Leu Thr Aia lie His 1 · 5 1° ”

Leu Asn Val Thr Asp Leu Gly Leu Gly Tyr Cυ Thr Lys Glu Glu 20 25 30 lie Phe Arg Tyr Cys Ser Gly Ser Cys Asp Ala Ala Glu Thr Thr Tyr 35 40 45

Asp Lys lie Leu Lys Asn Leu Ser Arg Asn Arg Arg Leu Val Ser Asp 50- 55 60

Lys Val Gly Gin Ala Cys Cys Arg Pro He Ala Phe Asp Asp Asp heu 65 70 75 · 80 # i·

Ser Phe Leu Asp Asp Asn Leu Val Tyr His 11^ Leu Arg Lys His Ser 85 90 95 ^

Ala Lys Arg Cys Gly Cys lie , 100 ' 111 -

570926 A7B7

1 HQ 五、發明説明（） (2)序列識別4 7號的訊息： (i) 序列特徵： (A)長度：135個胺基酸 (B )類型··胺基酸 (C) 股··單股 (D) 局部解剖學：直線狀 (ii) 分子類型：蛋白質 (xi)序列説明：序列識別47號：

Met Scr. Pro Asp Lys Gin Met Ala Va 1 Leu Pro Arg 八：rg Glu Arg Asn 15 10 15

Arg Gin Ala Ala Ala Ala Asn Pro Glu Asn Ser Arg Gly Lys Cly Arg 20 .2 5 30

Arg Gly Gin Arg Gly Lys Asn Arg Gly Cys Val Leu Thr Ala lie His 35 40 45

LfcU Asn Val Thr Asp Leu Gly Leu Gly Tyf Glu Thr Lys Glu Glu ku 50 55 60 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂

Tl〇 Ph〇 Λ，口 Ty i- r，,，〇 ::。I r；ly r,n，rVB Λ。。Λΐη 6 b 7 0 7 5 v ΊΊιι Th 80

Asp Lys lie Leu Lys Asn Leu Ser Arg Asn Arg Arg Leu Val Ser Asp 85 90 95 Lys Val Gly Gin Ala Cys Cys Arg Pro He Ala Phe Asp Asp Asp Leu 100 105 110 Ser Phe Leu Asp Asp Asn Leu Val Tyr His lie Leu Arg bys His Ser 115 120 125 Ala Lys Arg Cys Gly Cys lie · 130 135 # 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (2)序列識別48號的訊息： (i)序列特徵·· (A)長度：104個胺基酸 (B )類型：胺基酸 -112- 適用中國國家標準（CNS ) A4規格（2 — 297公釐）經濟部中央標準局員工消費合作社印製 570926 l·' A7 B7 五、發明説明（110) (C) 股··單股、 (D) 局部解剖學··直線狀：

(ii)分子類型··蛋白質I A (xi)序列説明：序列識別48號：

Met Arg Gly Gin Arg Gly Lys Asn Arg Gly Cys Val Leu Thr Ala lie 1 5 10 15

His Leu Asn Val Thr Asp Leu Gly I,»eu Gly Tyr Glu Thr Lys Glu 7lu

20 · ,25 JO

Leu lie Phe Arg Tyr Cys Ser Gly Ser Cys Asp Ala Ala Glu Thr Thr 35 40 45

Tyr Asp Lys lie Leu Lys Asn Leu Ser Arg Asn Arg Arg Leu Val Ser 5〇 55 60

Asp Lys Val Gly Gin Ala Cys Cys Arg Pro lie Ala Phe Asp Asp Asp 65 70 75 80

Ser Phe Leu Asp Asp Asn Leu Val Tyr His lie Leu Arg Lys His 85 90 95

Ser Ala Lys Arg Cys Giy Qys lie

100 J (2)序列識別49號的訊息： ★ (i) 序列特徵： (A) 長度：103個胺基酸 (B) 類型：胺基酸 (C) 股：單股 .(D)局部解剖學：直線狀* (ii) 分子類型：蛋白質 (xi)序列説明··序列識別4 9號：

Met Gly Gin Arg Gly Lys Asn Arg Gly Cys Val Leu Thr Ala lie His 5 10 15 -113- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 -^91. 570926 A7B7 五、發明説明（111)

Leu Asn Val Thr Asp Leu Gly Leu Gly Tyr Glu Thr Lys Glu Glu Leu 20 . 25 30 lie Phe Arg Tyr Cys Ser Gly €er Cys Asp Ala Ala Glu Thr Thr Tyr 35 40 45 ' Asp Lys He Leu Lys Asn Leu Ser Arg Asn Arg Arg Leu Val Ser Acp 5〇 ' 55 60 L*ys Va 1 Gly Gin Ala Cys Cys Arg Pro He Alλ Phe Anp Aup Asp Lr；u 65 70 . 75 80 * . · A Ser Phe Leu Asp Asp Asn Leu Val Tyr His lie Leu Arg Lys His Ser 85 90 95 α1λ Lys Arg Cys Gly Cys lie 100 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (2)序列識別5 0號的訊息： (i) 序列特徵： (A) 長度：114個胺基酸。 (B) 類型：胺基酸 (C )股，·單股. (D )局部解剖學：直線狀 (ii) 分子類型：蛋白質 (xi)序列説明：序列識別50號： Met Ser Fro Glu Asn Ser Arg Gly Lys Gly Arg Arg Gly Gin Krg Gly 1 5 10 15 Asn Asn Arg Gly Cys Val Leu Thr Ala lie His»Leu Asn Val Thr Asp 20 25 30 1 Leu Gly Leu Gly Tyr Glu Thr Lys Glu,Glu Leu lie Phe 'rg Tyr Cys 35 40 45 Ser Gly Ser Cys Asp Ala Ala Glu Thr Thr Tyr. Asp Lys lie Leu Lys 50 55 ； 60 Asn Leu Ser Arg Asn Arg Arg Leu Val Ser Asp Lys Val Gly Gin A丄a 65 70 75 80 、 ^ · Cys Cys Arg Pro lie Ala Phe Asp Asp Asp Leu Ser Phe Leu Asp Asp 85 90、 · 95

Asn Leu Val Tyr His Il〇 Lou Arg Lys His Ser Ala Lys Arg Cys Gly 100 105 no Cys，Ile ___ - 114- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂

Claims

570926 第085111819號專利嫩 έ88 中文申請專利範圍替換本(92年11月）C8 申請專利範圍

1. 一種具有X-[Cys41-Cys133]-Y的胺基酸序列之切截神經膠質細胞株-衍生神經營養因子 (GDNF)蛋白質產物，其中 [Cys41-Cys133]由序列識別 2 號從 Cys41 到 Cys133 所組成， Y代表Cys 133之羧基終端基團，或lie 134之羧基終端的胺基酸殘基；且 X代表C y s 4 1之甲硫胺醯基化或非甲硫胺醯基化的胺基，或選自下列基團之胺基終端的胺基酸殘基： G RG NRG KNRG (SEQ K) NO ： 3) GKNRG (SEQ ED NO ： 4) RGKNRG (SEQ ID NO ： 5) QRGKNRG (SEQ ID NO ： 6) GQRGKNRG (SEQ E) NO ： 7) RGQRGKNRG (SEQ ID NO ： 8) RRGQRGKNRG (SEQ ID NO ： 9) G RRGQRGKNRG (SEQ ID NO ： 10) KG RRGQRGKNRG (SEQ ID NO ： 11) GKG RRGQRGKNRG (SEQ ID NO ： 12) O:\45\45046-92l 11 l.CKDC 1 本紙張尺度適用中國國家榡準(CNS) A4規格(21〇 χ 297公釐） 570926 A8 B8 C8 D8 六、申請專利範圍 RGKG RRGQRGKNRG(SEQIDNO ： 13) SRGKG RRGQRGKNRG (SEQ ED NO ： 14) NSRGKG RRGQRGKNRG (SEQ ED NO ： 15) ENSRGKG RRGQRGKNRG (SEQ ID NO ： 16) PENSRGKG RRGQRGKNRG (SEQ ED NO : 17);及 SPENSRGKG RRGQRGKNRG (SEQ ID NO ： 51) 或一 X之保守性取代變體，其中該變體相較於上述X之胺基酸序列時，有超過9 0 %之同一性（其中可於1 0 0個胺基酸長度時，導入4個缺口以協助排列），且其中該神經膠質細胞株-衍生神經營養因子蛋白質物質可提供多巴胺能細胞之神經營養性作用。 2. 根據申請專利範圍第1項之切截之GDNF蛋白質產物，其中 X = RQAAA ANPENSRGKG RRGQRGKNRG(序列識另|J 24號）。 3. 根據申請專利範圍第1項之切截之GDNF蛋白質產物，其中 X = NPENSRGKG RRGQRGKNRG(序列識別1 8號）。 4. 根據申請專利範圍第1項之切截之GDNF蛋白質產物，其中 X = PENSRGKG RRGQRGKNRG(序列識別1 7號）。 5. 根據申請專利範圍第1項之切截之GDNF蛋白質產物，其中X = SRGKG RRGQRGKNRG(序列識別 O:\45\45046-921111.DOC 1 - 2 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) Α4規格(210 X 297公釐）

裝 η

570926 A B c D 六、申請專利範圍 1 4 號）。 6. 根據申請專利範圍第1項之切截之GDNF蛋白質產物，其中X = RGQRGKNRG(序列識別8號）。 7. 根據申請專利範圍第1項之切截之GDNF蛋白質產物，其中X = GQRGKNRG(序列識別7號）。 8. 根據申請專利範圍第1項之切截之GDNF蛋白質產物，其中X = KNRG(序列識別3號）。 9. 根據申請專利範圍第1項之切截之GDNF蛋白質產物，其中X = NRG。 10. 根據申請專利範圍第1至9項中任一項之切截之 GDNF蛋白質產物，其中該月安基酸序列為糖基化。 11. 根據申請專利範圍第1至9項中任一項之切截之 GDNF蛋白質產物，其中該胺基酸序列為非糖基化。 12. 根據申請專利範圍第1項之切截之GDNF蛋白質產物，其中X-[Cys41-Cys133]-Y與水溶性聚合物共輛。 13. —種編碼根據申請專利範圍第1項之切截之 GDNF蛋白質的聚核棼酸。 14. 根據申請專利範圍第1.3項之聚核$:酸，其由以下序列所組成： O:\45\45046-921111.DOC 1 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) 570926 8 8 8 8 ABCD 六、申請專利範圍 TCA CCA GAT AAA CAA ATG GCA GTG CTT CCT AGA AGA GAG CGG AAT Ser Pro Asp .Lys Gin Met Ala Val Leu Pro Arg Arg Glu Arg Asa 5 10 15 CGG CAG GCT GCA GCT GCC AAC CCA GAG ΑΑΎ TCC AGA GGA AAA GGT Arg Gin Ala Ala Ala Ala As.n Pro Gla Asn Ser Arg Giy .Lys Gly 20 25 30 CGG AGA GGC CAG AGG GGC AAA AAC CGG GGT TGT GTC TTA ACT GCA Arg Arg Gly Gin Arg Gly Lys Asn Arg Gly Cys Val Leu Thr Ala 35 40 45 ΑΤΛ CAT TTA AAT GTC ACT GAC TTG GGT CTG -GGC TAT GAA ACC AAG lie His Leu Asn Val Thr Asp Leu Gly Leu Gly Tyr Glu Thr Lys 50 55 . 60 GAG GAA CTG ATT TTT AGG TAC TGC AGC GGC TCT TGC GAT GCA GCT Glu Glu Leu lie Phe Arg Tyr Cys Ser Gly Ser Cys Asp Ala Ala 65 70 75 GAG ACA ACG TAC GAC Pu\A ATA TTG AAA AAC TTA TCC AGA AAT AGA Glu Thr Thr Tyr Asp Lys lie Leu Lys Asn Leu Ser Arg Asn.. Arg 80 85 90 AGG CTG GTG AGT GAC ΛΑΑ GTA GGG CAG GCA TGT TGC AGA CCC ATC Arg Leu Val Ser Asp Lys Val Gly Gin. Ala Cys Cys Arg Pro lie 95 · 100 105 GCC TTT GAT GAT GAC CTG TCG TTT TTA GAT GAT AAC CTG GTT TAC Ala Phe Asp Asp Asp Leu Ser Phe Leu Asp Asp Asn Leu Val Tyr 110 115 ^ 120 CAT ATT CTA AGA AAG CAT TCC GCT AAA AGG TGT GGA TCT ATC His lie Leu Arg Lys His Ser Ala Lys Arg Cys Gly Cys lie 125 130 O:\45\45046-921111.DOC1 ~ 4 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X297公釐） 570926 8 8 8 8 A B c D 申請專利範圍 15.根據申請專利範圍第1 3項之聚核苷酸，其由以下序列所組成： N d B s P e Ξ # 1 r CATATGTCTCCGGATAAACAAATGGCTGTTCTTCCAC -------+----------i----------+---------+ 6〇 MetSer E N C 〇〇 t R T I GTCGTGAACGTAACCGTCAGGCGGCCGCTGCTAACCCGGAGAATTCCCGTGGTAAAGGTC 61 .---------+---------+---------： +---------+---------+---------+ 120 S a c τ I * GTCGTGGTCAGCGTGGTAAAAACCGGGGTTGCGTTCTGACCGCTATCCACCTGAACGTTA 121---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 180 P s h A I CCGACCTGGGTCTCGCTTACGAAACCAAAGAAGAATTAATCTTCCGTTACTGCTCCGGTT 181---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 2 4 0 O:\45\45046-92111l.DOC 1 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 x 297公釐） 570926 8 8 8 8 A Β c D 六、申請專利範圍 s - u π I . cctgcgacgctgctgaaaccacgtacgacaaaatcctgaaAaacctgtcccgtaaccgtc 241---------+---------+ .-------+ -------+---------+---------+ 300 E H. a i m η 1 d P 1 I V 〇 I : u 5 I I I • GTCTGGTTTCCGACAAAGTTGGTCAAGCTTGCTGCCGTCCGATCGCTTTCGACGACGACC 3 01--------•-η----------------------π----------+---------η----------+ 3 60 TGTCCTTCCTGGACGACAACCTGGTrTACCACATCCTGCG丁AAACACTCCGCTAAGCGTT 361 ---------------------+---------η----------η----------^----------+ 4 20 、 Β a m Η I GCGGTTGCATCTAAGGATCC 421 -------------------- 440 O:\45\45046-921111.DOC 1 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 x 297公釐） 570926 8 8 8 8 A B c D 申請專利範圍 N d e I 16.根據申請專利範圍第1 3項之聚核甞酸，其由以下序列所組成： CATATGAGCCCGCACAAAC八G 60 MetSer ATGGCAGTACTTCCACGTCGTGAACGTAATCGCCAGGCAGCAGCTGCAAACCCGGA^AAC 61---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 120 TCCCGTGGTAAAGGTCGCCGTGGCCAGCGCGGCAAAAACCGTGGTTGTGTTCTGACTGCA # 121---------+ ---------+--------- +---------+---------4----------+ 丄 80 P s r · h · 、 A , . I · ATCCACCTGAACGTTACTGACCTGGGTCTGGGCTACGAAACCAAAGAAGAACTGATCTTC 181-------一-4*'---*------1-----------f-----------^----- ----------------μ 2 4 0 P s 匕 . ·. ' I . · CGCTACTGCAGCGGCTCTTGCGACGCAGCTGAAACCACTTACGACAAAATCCTGAAAAAC 2 41---------+---------+---------4----------+---------+---------+ 300 p . v u T CTGTCCCGTAACCGCCGTCTGGTAAGCGACAAAGTAGGTCAGGCATGCTGCCGTCCGATC 3 01---------+ 1-------：---+·----------十—-----—+ ---------+ 3 60 8 s m I GCATTCGACGATGACCTGAGCTTCCTGGATGACAACCTGGTTTACCACATCCTGCGTAAA 3 61------- + — — 一一 +---------h----------♦-一----- - - ί----------+ 4 20 B a m H I CACTCCGCTAAACGCTGCGGTTGCATCTAAGGATCC 421-------------------------+------456 O:\45\45046-921111 DOC 1 - 7 · 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X 297公釐） 570926 8 8 8 8 A B c D 六、申請專利範圍 17.根據申請專利範圍第1 3項之聚核嘗酸，其由以下序列所組成： ATGTCCCCAGAAAATTCTCGTGGTAAAGGTCGTCGTGGTCAGCGTGGTAATAACCGCGGT 21---------十------------------------------+---------+---------+ 8 0 M S ,·'Ρ ； E NS. RGKGRRGQRG NRG TGCGTTCTGACCGCTATCCACCTGAACGTTACCGACCTGGGTCTCGOTTACGAAACCAAA 8 1---------+---------+-----.----+----------f----------4----------4- 140 CVLTAIHLNVTDLGLGYETK • GAAGAATTAATCTTCCGTTACTGCTCCGGTTCCTGCGACGCTGCTGAAACCACGTACGAC 141---------+---------+---------十----------+---------+----------+ 200 EELIFRYCSGSCDAAETTYD ； · AAAATCCTGAAAAACCTGTCCCGTAACCGTCGTCTGGTTTCCGACAAAGTTGGTCAAGCT 201. — — — — — — — — 一. + — — — — — — — — — + — — _ — — — — — — + — — — — _ — — — — + — — — — — — — — — + — — — — — — — — — + 2 60 KILKNLSRNRRLVSDKV^QA TGCTGCCGTCCGATCGCTTTCGACGACGACCTGTCCTTCCTGGACGACAACCTGGTTTAC 脅 2 61 — — 一― 一一 — 一 — + 一 — 一 — — — — 一― + ― 一 — — — 一 — — 一 4· 一一一 — 一 — — — 一+ — 一一一一 — — — — + 一一一一 — —_ — — + 3 2 0 CCRPIAFDDDLSFLDDNLVY CACATCCTGCGTAAACACTCCGCTAAGCGTTGCGGTTGCATCTAA 321-------------------+ +--------- hilrkhsakrcgci，# O:\45\45046-921111.DOC 1 - δ - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) Α4規格(210X 297公釐） 570926 8 8 8 8 A BCD 六、申請專利範圍 18.根據申請專利範圍第1 3項之聚核甞酸’其由以下序列所組成： ATGCGTGGTCAACGTGGTAAAAACCGCGGTTGCGTTCTGACTGCAATCCACCTGAACGTT 4 X — — — — — — — — — + — — — — ~ — — 一 — 一 4* 一 — 一 — · — — + — — — 一一 — — — — 4* 一一一- 一 — 一 — -4* 100 MRGQRGKMRGCVLTAIHLNV ACTGACCTGGGTCTGGGCTACGAAACCAAAGAAGAACTGATCTTCCGCTACTGCAGCGGC 101---------+---------^----------+----------1----------·+·---------+ 160 TDLGLGYETKE.ELrF^RYCSG TCTTGCGACGCAGCTGAAACCACTTACGACAAAATCCTGAAAAACCTGTCCCGTAACCGC 161 ----------- 7 *------**-----------i----:------+ -------^ — ---+ 220 SCDAAETTYDKILKNLSRNR CGTCTGGTAAGCGACAAAGTAGGTCAGGCATGCTGCCGTCCGATCGCATTCGACGATGAC 221 — — — — — -f· — — — — — — — — — 4· — — — — — — — — — 4· — — — — — — — — — + — — — — — — — — — 280 RLVSDKVGQAC-.CRPIAFDDD CTGAGCTTCCTGGATGACAACCTGGTTTACCACATCCTGCGTAAACACTCCGCTAAACGC 2 81 ---------+---------+---------+-----·----+---------+---------+ 3 4 0 LSFLDDMLVYHILRKHSAKR TGCGGTTGCATCTAA 341---------------355 C G C I * O:\45\45046-921111.DOC 1 - 9 _ 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X 297公釐） 570926 A8 B8 C8 D8 申請專利範圍 19.根據申請專利範圍第1 3項之聚核茹酸，其由以下序列所組成： 41 ATGGGTCAACGTGGTAAAAACCGTGGTTGTGTTCTGACTGCAATCCACCTGAACGTTACT ---------4----------+---------+---------+---------+---------+ 100 mgqrgknrgcvltaihlnvt 101 161 GACCTGGGTCTGGGCTACGAAACCAAAGAAGAACTGATCTTCCGCTACTGCAGCGGCTCT---------+---------+---------+---------+---------+ ---------+ 160 DLGLGYETKEE. LIFRYCSGS TGCGACGCAGCTGAAACCACTTACGACAAAATCCTGAAAAACCTGTCCCGTAACCGCCGT ----------+---------+---------+---------+---------+.---------+· 220 C DAAETTYDKILKNLSRNRR 221 CTGGTAAGCGACAAAGTAGGTCAGGCATGCTGCCGTCCGATCGCATTCGACGATGACCTG---------4.---------+----------+---------+--------->---------+ 280 ·. LVSDKVGQACCRP.IAFDDDL 281 341 AGCTTCCTGGATGACAACCTGGTTTACCACATCCTGCGT.^AACACTCCGCTAAACGCTGC -----------------------------+------；---如---------4.---------‘ 3 4 0 sflddnlvyhilrkhsakrc GGTTGCATCTAA---------一 352 σ c r * O:\45\45046-921U1.DOC 1 -10- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐） 570926 A8 B8 C8

2〇· —種載體，其包括可操縱性連結到表現控制序列上的根據申請專利範圍第1 3項之聚核菩酸。 21· —種以根據申請專利範圍第丨3項之聚核菩酸轉化或轉移感染的原核生物或真核生物、谓王細胞。 22· —種產製如申請專利範圍第！項之切截之蛋白質的方法，其包括使根據申請專利範園第 2 1項之大腸桿囷（E. Coil)或中國倉藏卵巢細胞 (Chinese hamster ovary cell)做為宿主細胞，在適當的營養培養基中生長，且可視需要從該細胞或該營養培養基中分離出該切截之GDNP。 23· —種產製如申請專利範圍第i項之切截之神經膠質細胞株-衍生神經營養因子（GDNF)蛋白質的方法，其包括下列步騾： (a) 培養以根據申請專利範圍第2 0項之載體轉化或轉移感染的大腸桿菌或中國倉鼠卵巢細胞做為宿主細胞； (b) 在容許由該宿主細胞表現切截之G D N F蛋白質的條件下，維持該宿主細胞；並 (c) 可視需要分離出由該宿主細胞表現的切截之 GDNF蛋白質。 24. —種切截之g D N F蛋白質產物，其係含有編碼如申請專利範圍第1項之蛋白質產物之外源性聚核茹酸的原核生物或真核生物宿主細胞的重組 O:\45\45046-92111M 本紙張尺度適用中國國家標準(CMS) A4規格(210 X 297公爱） 570926 A B c D 六、申請專利範圍表現產物。 25. —種可增加多巴胺能細胞之多巴胺能活性之醫藥組合物，其含有根據申請專利範圍第1項之切截之GDNF蛋白質產物與藥學上可接受之載劑。 26. —種可增加多巴胺能細胞之多巴胺能活性之醫藥組合物，其含有根據申請專利範圍第22項之方法產製的切截之GDNF蛋白質產物與藥學上可接受之載劑。 27. —種可增加多巴胺能細胞之多巴胺能活性之醫藥組合物，其含有根據申請專利範圍第2 3項之方法產製的切截之GDNF蛋白質產物與藥學上可接受之載劑。 28. 根據申請專利範圍第2 5項之醫藥組合物，其用於治療帕金森氏症。 29. —種可增加多巴胺能細胞之多巴胺能活性之醫藥組合物，其包含根據申請專利範圍第1 3項之聚核茹酸序列，以便在活體内產製該切截之 GDNF蛋白質產物與藥學上可接受之載劑。 30. —種可增加多巴胺能細胞之多巴胺能活性之醫藥組合物，其包含以根據申請專利範圍第1 3項之聚核甞酸序列轉化的細胞，以便在活體内產製該切截之GDNF蛋白質產物與藥學上可接受之載劑。 31. —種切截之GDNF蛋白質產物，係衍生自由以重 O:\45\45046-921111.DOC 1 - 12 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐） 570926 A BCD 六、申請專利範圍組方式修改的細菌或哺乳動物細胞所表現之成熟GDNF蛋白質，該切截之GDNF蛋白質係由 X-[Cys41-Cys133]-Y的胺基酸序列所組成，其中 [Cys41-Cys133]由序列識別 2 號從 Cys41 到 Cys133 所組成； Y代表Cys 133之羧基終端基.，或lie 134之羧基終端的胺基酸殘基；且 X代表Cys41之胺基，或選自下列基團之胺基終端的胺基酸殘基： G RG NRG KNRG (SEQ ID NO ： 3) GKNRG (SEQ ED NO ： 4) RGKNRG (SEQ ID NO ： 5) QRGKNRG (SEQ ID NO ： 6) GQRGKNRG (SEQ ID NO ： 7) RGQRGKNRG (SEQ ID NO ： 8) RRGQRGKNRG (SEQ ID NO ： 9) G RRGQRGKNRG (SEQ ID NO ： 10) KG RRGQRGKNRG (SEQ ID NO ： 11) GKG RRGQRGKNRG (SEQ ID NO ： 12) RGKG RRGQRGKNRG (SEQ ID NO ： 13) O:\45\45046-921111.DOC l -13- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐） 570926 A8 B8 C8 D8 六、申請專利範圍 SRGKG RRGQRGKNRG (SEQ ID NO ： 14) NSRGKG RRGQRGKNRG (SEQ ID NO ： 15) ENSRGKG RRGQRGKNRG (SEQ ID NO ： 16) PENSRGKG RRGQRGKNRG (SEQ ID NO : 17);及 SPENSRGKG RRGQRGKNRG (SEQ ID NO ： 51) 或一 X之保守性取代變體，其中該變體相較於上述X之胺基酸序列時，有超過90%之同一性（其中可於1 0 0個胺基酸長度時，導入4個缺口以協助排列），且其中該神膠質細胞株-衍生神經營養因子蛋白質物質可提供多巴胺能細胞之神經營養性作用。 32.根據申請專利範圍第31項之切截之GDNF蛋白質，其中X係選自包括 G RG NRG KNRG(SEQIDNO ： 3) GKNRG (SEQ ID NO ： 4) RGKNRG (SEQ ID NO ： 5) QRGKNRG (SEQ Π) NO ： 6) GQRGKNRG (SEQ ID NO ： 7) RGQRGKNRG (SEQ ID NO : 8)和 RRGQRGKNRG (SEQ ID NO : 9)。 33·根據申請專利範圍第3 i項之切截之G D N F蛋白 O:\45\45046-921111.DOC 1 - 1 4 _ 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 x 297公釐） 570926 8 8 8 8 A B c D ~、申請專利範圍質，其中該成熟的GDNF蛋白質係由以重組方式修改的細菌細胞來表現，且該切截之G D N F蛋白質係在活體外或活體内產製。 34. —種用於治療因為疾病或傷害而引起之神經系統損傷之醫藥組合物，其含有根據申請專利範圍第1項之切截之GDNF蛋白質產物與藥學上可接受之載劑。 35. 根據申請專利範圍第3 4項之醫藥組合物，其係用於治療帕金森氏症。 O:\45\45046-9211 ll.DOC 1 -15 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐） 570926^7^7正、 -暮號專利申請案中文補充說明書Γ92年7月） (2)序列識別51號的訊息： (i) 序列特徵： (A) 長度：19個胺基酸 (B) 類型：胺基酸 (C) 股：單股 (D) 局部解剖學：直線狀 (ii) 分子類型：肽 (xi)序列說明：序列識別51號： Ser Pro Glu Asn Ser Arg Gly Lys Gly Arg Arg Gly Gin Arg Gly Lys Asn Arg Gly 15 10 15 P:\HHT\C03\官方\45046ROA2-AMGEN.DOC 3