JP2002505576A

JP2002505576A - 神経栄養因子レセプター

Info

Publication number: JP2002505576A
Application number: JP50067499A
Authority: JP
Inventors: フオツクス，ギヤリー・エム; チン，シユウチエン; ウエン，ドウアンチイ
Original assignee: アムジエン・インコーポレーテツド
Priority date: 1997-05-30
Filing date: 1998-04-27
Publication date: 2002-02-19
Also published as: CA2291608C; WO1998054213A3; CA2291608A1; WO1998054213A2; EP0983354A2; ZA984404B; AU7165998A

Abstract

(57)【要約】本発明は、中枢および末梢神経系の両方の種々の細胞型において広範な生物学的活性スペクトルを示す強力な神経栄養因子である、グリア細胞系由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）に関する。本発明は、ＧＤＮＦレセプターのクローニングおよび特徴付けを含む。核酸およびアミノ酸配列は、ＧＤＮＦＲタンパク質産物に関して記載する。シグナルペプチドの特徴を示す疎水性ドメインがアミノ末端に認められるが、カルボキシ末端の第二疎水性ドメインは、細胞膜へのレセプターの結合に関与している。トランスメンブランドメインおよび細胞質領域の欠失により、トランスメンブランシグナリングを仲介するために、ＧＤＮＦＲは１つ以上の補助分子を必要とすることが示唆される。ＧＤＮＦＲｍＲＮＡは、神経系および非−神経組織の両方に広範に分布しており、ＧＤＮＦで見られる類似した分布と一致している。

Description

【発明の詳細な説明】神経栄養因子レセプター１．発明の分野本発明は神経栄養因子レセプターに関する。特に、本発明はグリア細胞系由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）およびニューチュリン（ｎｅｕｒｔｕｒｉｎ）のレセプターに関し、このレセプターをコードする核酸およびアミノ酸を提供する。本発明はまた、神経栄養因子応答症状の処置における治療技術に関する。２．発明の背景グリア細胞系由来神経栄養因子グリア細胞系由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）が、中脳ドーパミン作動性ニューロンの生存を亢進する強力な神経栄養因子として初めてラットＢ４９細胞から単離およびクローン化された（Ｌｉｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２６０、１１３０−１１３２、１９９３）。近年、研究により、この分子は種々の他の生物学的活性を示し、中枢および末梢神経系両方の数種のニューロンに対して効果を有することが示された。中枢神経系（ＣＮＳ）において、ＧＤＮＦは哺乳動物顔面および脊髄運動ニューロンの軸索切断誘導死を防ぎ（Ｌｉら、ＰｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓＯｆＴｈｅＮａｔｉｏｎａｌＡｃａｄｅｍｙＯｆＳｃｉｅｎｃｅｓ、Ｕ．Ｓ．Ａ．、９２、９７７１−９７７５、１９９５；Ｏｐｐｅｎｈｅｉｍら、Ｎａｔｕｒｅ、３７３、３４４−３４６、１９９５；Ｙａｎら、Ｎａｔｕｒｅ、３７３、３４１ −３４４、１９９５；Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２６６、１０６２−１０６４、１９９４；Ｚｕｒｎら、Ｎｅｕｒｏｒｅｐｏｒｔ、６、１１３− １１８、１９９４）、発達中トリ運動ニューロンを自然にプログラムされた細胞死から助ける（Ｏｐｐｅｎｈｅｉｍら１９９５上記）ことが示された。ＧＤＮＦの局所投与により、軸索切断誘導（ＫｅａｒｎｓおよびＧａｓｈ、ＢｒａｉｎＲｅｓｅａｒｃｈ、６７２、１０４−１１１、１９９５；Ｂｅｃｋら、Ｎａｔｕｒｅ、３７３、３３９−３４１、１９９５）または神経毒誘導変性（Ｓａｕｅｒら、ＰｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓＯｆＴｈｅＮａｔｉｏｎａｌＡｃａｄｅｍｙＯｆＳｃｉｅｎｃｅｓＵ．Ｓ．Ａ．、９２、８９３５−８９３９、１９９５；Ｔｏｍａｃら、Ｎａｔｕｒｅ、３７３、３３５−３３９、１９９５）から黒質ドーパミン作動性ニューロンを保護することが示された。さらに、ＧＤＮＦの局所投与は、ドーパミン作動性ニューロンの出芽を誘導し、ドーパミン、ノルアドレナリン、およびセロトニンのレベルを増加させ、運動行動を亢進することが示された（Ｔｏｍａｃら、１９９５上記）。より近年では、ＧＤＮＦは脳ノルアドレナリンニューロンおよびプルキンエ細胞の強力な栄養因子であることが報告されている。ＧＤＮＦを異所的に発現している線維芽細胞の移植により、インビボにおいて、６−ヒドロキシドーパミン− 誘導変性を防ぎ、成人ノルアドレナリンニューロンの表現型を促進し（Ａｒｅｎａｓら、Ｎｅｕｒｏｎ、１５、１４６５−１４７３、１９９５）、一方、外因的に適用したＧＤＮＦによりインビトロにおいて肝プルキンエ細胞の生存および形態学的分化を効果的に促進した（Ｍｏｕｎｔら、ＰｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓＯｆＴｈｅＮａｔｉｏｎａｌＡｃａｄｅｍｙＯｆＳｃｉｅｎｃｅｓＵ．Ｓ．Ａ．、９２、９０９２−９０９６、１９９５）。末梢神経系において、ＧＤＮＦは結節、毛様体および交換神経神経節のニューロン、並びに後根神経節（ＤＲＧ）および三叉神経神経節の小群の胚感覚ニューロンの生存を促進することが示された（ＴｒｕｐｐらＪｏｕｒｎａｌｏｆＣｅｌｌＢｉｏｌｏｇｙ、１３０、１３７−１４８、１９９５；Ｅｂｅｎｄａｌら、ＪｏｕｒｎａｌＯｆＮｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅＲｅｓｅａｒｃｈ、４０、２７６−２８４、１９９５；Ｏｐｐｅｎｈｅｉｍら、１９９５上記；Ｙａｎら、１９９５上記；Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎら、１９９４上記）。ＧＤＮＦはまた、培養上頚部神経節（ＳＣＧ）ニューロンにおいて血管作動性腸ペプチドおよびプレプロタキキニン−ＡｍＲＮＡの発現を亢進し、従ってＳＣＧニューロンの発現型に影響を与え束様出芽を誘導することが報告されている（Ｔｒｕｐｐら、１９９５上記）。ＧＤＮＦの発現が、神経系の数多くの異なる細胞型および構造において観察されている。ＣＮＳにおいて、ＧＤＮＦｍＲＮＡ発現が、逆転写ポリメラーゼ鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）により、発育中および成人ラット線状体の両方、黒質ドーパミン作動性神経支配の主要標的、および海馬、皮質、視床、隔膜、小脳、脊髄、および延髄を含む他領域において広範に観察されている（Ａｒｅｎａｓら、上記１９９５；Ｐｏｕｌｓｅｎら、Ｎｅｕｒｏｎ、１３、１２４５−１２５２、１９９４；Ｓｐｒｉｎｇｅｒら、ＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌＮｅｕｒｏｌｏｇｙ、１２７、１６７−１７０、１９９４；Ｓｔｒｏｅｍｂｅｒｇら、ＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌＮｅｕｒｏｌｏｇｙ、１２４、４０１−４１２、１９９３；Ｓｃｈａａｒら、ＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌＮｅｕｒｏｌｏｇｙ、１２４、３６８−３７１、１９９３）。ヒトにおいて、ＧＤＮＦ転写物はまた線状体において、尾状核で最も高いレベルで、被殻でより低いレベルで観察された。検出可能なレベルはまた、海馬、皮質、および脊髄にも認められたが、小脳には観察されなかった（Ｓｃｈａａｒら、ＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌＮｅｕｒｏｌｏｇｙ、１３０、３８７−３９３、１９９４；Ｓｐｒｉｎｇｅｒら１９９４上記）。末梢において、ＧＤＮＦｍＲＮＡ発現が、生後１目のラットのＤＲＧおよびＳＣＧ、坐骨神経、および新生児シュワン細胞の一次培養物において報告されている（Ｔｒｕｐｐら、１９９５上記；Ｈｏｆｆｅｒら、ＮｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅＬｅｔｔｅｒｓ、１８２、１０７−１１１、１９９４；Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎら、１９９４上記；Ｓｐｒｉｎｇｅｒら、１９９４上記）。さらに、近年の研究により、ＧＤＮＦ転写物はまた、生後精巣および腎臓を含む末梢非ニューロン器官、胚髭パッド、胃、および皮膚において広範に発現されていることが示された。発現は、胚筋肉、副腎および肢芽、および生後肺、肝臓および卵巣において低いレベルで検出できる（Ｔｒｕｐｐら、１９９５上記；Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎら、１９９４上記）。しかしこれまでに、ＧＤＮＦの非ニューロン発現の生物学的重要性は明らかでない。「ニューチュリン」と呼ばれる神経栄養因子は、Ｎａｔｕｒｅ３８４（５）：４６７−４７０、１９９６に記載されている。ＧＤＮＦタンパク質産物の製造および特性の詳細な記述は、１９９４年５月２３日出願の米国特許出願番号０８／１８２，１８３およびその親出願（１９９２年９月１７日出願ＰＣＴ／ＵＳ９２／０７８８８、ＷＯ９３／０６１１６および欧州特許出願番号９２９２１０２２．７、公開番号ＥＰ６１０２５４も参照）に認められ得、その開示は引用によりここに援用する。さらに別のＧＤＮＦタンパク質産物が、１９９５年９月２８日出願の出願中米国特許出願番号０８／５３５，６８１に記載されており、その開示は引用によりここに援用する。本明細書に使用されているように、「ＧＤＮＦタンパク質産物」という用語は、生物学的に活性な合成または組換えＧＤＮＦタンパク質および類似体、並びにその化学的修飾誘導体を含む。ＧＤＮＦ類似体は切形ＧＤＮＦタンパク質などの欠失変異体、並びにＧＤＮＦの挿入および置換変異体を含む。その他にヒトＧＤＮＦタンパク質に実質上相同的なＧＤＮＦタンパク質が含まれる。ＧＤＮＦ療法ＧＤＮＦ療法は、１つ以上の型の神経細胞の生存および／または適当な機能が傷害を受けた症状により引き起こされた神経障害の処置に有効である。かかる神経障害は、多くの異なる原因により生じ得る。神経障害は、（１）傷害部位付近の軸索プロセスおよび／または神経細胞体の変性を引き起こす、物理的傷害；（２）卒中など神経系部分への血流の一時的または永久的停止；（３）恣意的または偶発的神経毒への暴露（例えば、癌治療の化学療法剤（例えばシスプラチン）またはＡＩＤＳ治療のジデオキシシチジン（ｄｄＣ））；（４）慢性代謝疾患、例えば糖尿病または腎機能不全；または（５）神経変性疾患、例えばパーキンソン病、アルツハイマー病、および筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）（これは特定のニューロン個体群の変性により生じる）により、１つ以上の型の神経細胞に生じ得る。いくつかの研究により、ＧＤＮＦ療法は、例えばパーキンソン病における黒質のドーパミン作動性ニューロンの変性などの神経変性症状の処置に特に有用であることが示唆されている。パーキンソン病の現在の唯一の治療法は、待機的であり、線状体におけるドーパミンレベルの上昇を目標としている。ＧＤＮＦ療法の期待する効果は単に、線状体におけるドーパミン作動性神経終末でのドーパミン作動性神経伝達の増加だけでなく（これは症候の緩解をもたらす）、また変性プロセスの進行を遅延または停止させ傷害黒質線状体路を修復しその機能を回復することである。ＧＤＮＦはまたヒト患者においてドーパミン作動性神経細胞の他の形の傷害または不適当な機能の処置に使用し得る。かかる傷害または機能不全は分裂病および他の形の精神病において生じ得る。かかる症状の唯一の治療法は、対症療法であり、ドーパミンレセプターまたはドーパミン取り込み部位に作用する薬剤を必要とし、これらのレセプターを有するニューロン個体群に分布するドーパミンニューロンの不適切な機能が疾患プロセスに関与し得るという見解と一致する。レセプタータンパク質因子への結合および応答を仲介する数多くのレセプター（インシュリン、血小板由来増殖因子、表皮増殖因子およびその関連物、線維芽細胞増殖因子、種々のインターロイキン、造血増殖因子および毛様体神経栄養因子のレセプターを含む）が特徴づけられ分子クローニングされた（Ｕ．Ｓ．５，４２６，１７７）。研究結果により、いくつかのレセプターが複数（関連）増殖因子に結合でき、一方、他の場合では同因子が複数（関連）レセプターに結合および活性化できることが示される（例えば、Ｌｕｐｕら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４９：１５５２−１５５５、１９９０；Ｄｉｏｎｎｅら、ＥＭＢＯＪ．、９：２６８５−２６９２、１９９０；Ｍｉｋｉら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２５１：７２ −７５、１９９１）。ほとんどのレセプターはおおまかに、タンパク質因子への特異的結合に関与する細胞外部分またはドメイン、細胞膜に及ぶトランスメンブランドメイン、およびタンパク質因子のレセプター細胞外部分への結合時においてシグナル変換の開始にしばしば関与する細胞内ドメインを有することを特徴とする。多くのレセプターが１本のポリペプチド鎖から成るが、他のレセプターは、タンパク質因子を高親和性で結合させ、結合後に機能性応答が可能となるように、明らかに２つ以上の別々のサブユニットを必要とする（例えば、Ｈｅｍｐｓｔｅａｄら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４３：３７３−３７５、１９８９；Ｈｉｂｉら、Ｃｅｌｌ、６３：１１４９−１１５７、１９９０）。該レセプターの細胞外および細胞内部分は、他のレセプターの対応する領域と共通した構造モチーフを所有し得、このことは異なるレセプター間の進化的および機能的関係を示唆する。これらの関係は、しばしば極めて希薄であり得、単にある一般的なドメイン構造の反復使用を反映することもある。例えば、非関連因子に結合する種々の異なるレセプターは、細胞外部分に「免疫グロブリン」ドメインを使用し、一方、他のレセプターはその因子結合領域に「サイトカインレセプター」ドメインを使用する（例えば、Ａｋｉｒａら、ＴｈｅＦＡＳＥＢＪ．、４：２８６０−２８６７、１９９０）。別個の細胞外結合ドメインをもつ（従って異なる因子に結合する）数多くのレセプターは、因子結合に応答して活性化されるチロシン特異的プロテインキナーゼをコードする関連細胞質内ドメインを含む（例えば、Ｕｌ１ｒｉｃｈおよびＳｃｈｌｅｓｓｉｎｇｅｒ、Ｃｅｌｌ、６１：２０３−２１２、１９９０）。因子結合がシグナル変換を「活性化」する機構は、レセプターチロシンキナーゼの場合でさえもよく理解されていない。細胞内ドメインが未知の機能のドメインをコードするか、または結合成分が第２の未知の機能を有するタンパク質と結合した他のレセプターにおいて（例えばＨｉｂｉら、Ｃｅｌｌ、６３：１１４９−１１５７、１９９０）、シグナル変換の活性化は、十分に特徴づけられていない。インビボにおけるＧＤＮＦの作用形式は、当分野で明らかには解明されていないが、これはＧＤＮＦレセプターに関する情報不足も一因である。２つのグループが別個に、線状体注入［¹²⁵Ｉ］−標識ＧＤＮＦは黒質においてドーパミン作動性ニューロンにより逆送できることを発見した（Ｔｏｍａｃら、ＰｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓＯｆＴｈｅＮａｔｉｏｎａｌＡｃａｄｅｍｙＯｆＳｃｉｅｎｃｅｓＯｆＴｈｅＵｎｉｔｅｄＳｔａｔｅｓＯｆＡｍｅｒｉｃａ、９２、８２７４−８２７８、１９９５；Ｙａｎら、１９９５上記）。脊髄運動ニューロン、ＤＲＧ感覚ニューロンおよび網膜神経節のＢ層のニューロンによる［¹²⁵Ｉ］−ＧＤＮＦ逆行性移送もまた観察された。これらの逆行性移送現象は、全て特異的に１００倍またはそれ以上の濃度の非標識ＧＤＮＦにより阻害することができ、これは飽和可能なレセプター仲介移送プロセスを示唆する。インビトロにおいて、組換えＧＤＮＦは、生存を亢進し、非常に低い濃度で培養ドーパミン作動性ニューロンのドーパミン取り込みを促進することが示された。これらのニューロンにおいて観察されたＧＤＮＦの５０％有効濃度（ＥＣ₅₀）は、０．２−１．６ｐＭである（Ｌｉｎら、１９９３上記）。ＧＤＮＦはまた、低濃度で解離運動ニューロンの生存を支持することが示された。報告された運動ニューロンにおける５−１０ｆＭ範囲におけるＧＤＮＦのＥＣ₅₀は、ドーパミン作動性ニューロンに対するよりも低い（Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎら、１９９４上記）。総合すると、こららの観察は、これらの細胞で発現されたＧＤＮＦレセプターは非常に高いリガンド結合親和性を有することを示唆する。ＴＧＦ−βファミリーのメンバーと類似して、異なる細胞個体群上におけるＧＤＮＦの広範に分散した組織分布および種々の生物学的機能は、異なる種類のＧＤＮＦレセプターまたはレセプター複合体が存在し得ることを示唆する。Ｅ１０ひよこ交換神経ニューロンの飽和定常状態および［¹²⁵Ｉ］−ＧＤＮＦの競合結合により、これらのニューロンはドーパミンおよび運動ニューロンで観察されたものとは異なるＧＤＮＦ結合部位を発現することが示される。これらの結合部位上におけるＧＤＮＦの５０％飽和濃度および５０％阻害濃度は、１−５ｎＭの範囲にある（Ｔｒｕｐｐら、１９９５上記）。同様に、Ｐ１ラットＳＣＧ由来の交換神経ニューロンの生存を支持するＧＤＮＦのＥＣ₅₀がナノモルの範囲であることが報告された（Ｔｒｕｐｐら、１９９５上記）。ＧＤＮＦがシグナル変換を活性化し細胞上にその効果を奏効する機構をより理解するためには、このタンパク質因子への結合および応答を仲介するレセプターを同定することが有益であろう。また、ＧＤＮＦ療法において、ＧＤＮＦシグナル変換を提供または亢進する補助分子を同定およびその産生を可能とすることが有益であろう。さらに、ＧＤＮＦタンパク質レセプターの同定は、例えば個体がＧＤＮＦタンパク質療法の効果を受けているかを決定する手段などの診断用途において効果的な適用を提供する。さらに、ＧＤＮＦのタンパク質レセプターは、レセプターに結合し、結果として所望の生物学的活性をもたらす付加分子を同定するアッセイにおいて鍵成分となり得る。発明の要約本発明は、図に示したアミノ酸配列を有する神経栄養因子レセプタータンパク質をコードする核酸配列並びに生物学的等価類似体を提供する。本発明の神経栄養因子レセプタータンパク質およびタンパク質産物は、本明細書ではグリア細胞系由来神経栄養因子レセプター（ＧＤＮＦＲ）タンパク質およびタンパク質産物を意味する。本明細書で言及した特定のレセプタータンパク質は、ＧＤＮＦＲ−α、およびグリア細胞系由来神経栄養因子レセプター −α−関連レセプタータンパク質２および３（ＧＲＲ２およびＧＲＲ３）を含む。新規タンパク質は、ＧＤＮＦおよび／またはニューチュリンに特異的に結合し、およびＧＤＮＦおよび／またはニューチュリンのシグナル変換効果を仲介または亢進する分子複合体の一部として作用できることにより機能的に特徴付けられる。ＧＤＮＦＲタンパク質産物は、典型的には、可溶性レセプタータンパク質として、実質的に純粋な形で提供される。１つの態様において、本発明は、組換え遺伝子工学技術によるＧＤＮＦＲタンパク質産物の産生を提供する。別の態様において、ＧＤＮＦＲタンパク質は、化学技術または組換えおよび化学技術の組合せにより合成する。本発明のまた別の態様において、ＧＤＮＦＲタンパク質は、グリコシル化または非−グリコシル化形で製造し得る。ＧＤＮＦＲタンパク質の誘導体は典型的に、水溶性ポリマーへのＧＤＮＦＲタンパク質の結合を含む。例えば、ＧＤＮＦＲタンパク質は１つ以上のポリエチレングリコール分子とコンジュゲートさせ、水性環境においてＧＤＮＦＲタンパク質産物の沈殿を減少させ得る。また別の本発明の態様は、ＧＤＮＦＲタンパク質をコードする種々のポリヌクレオチドを含む。これらの核酸配列は、真核または原核宿主細胞におけるＧＤＮＦＲの発現に使用され、ここでこの発現産物またはその誘導体はＧＤＮＦに結合し、よってドーパミン作動性細胞によるドーパミン取り込み増加などのＧＤＮＦ活性を仲介できる複合体を形成できることを特徴とする。ポリヌクレオチドはまた細胞療法または遺伝子療法において使用し得る。適当な核酸配列は、特に図に示したもの並びに本発明に基づいた変性配列、天然に存在する対立遺伝子変異および修飾配列を含む。核酸配列の例は、グリア細胞系由来神経栄養因子（ＧＦＮＦ）および／またはニューチュリンと複合体を形成でき、ＧＤＮＦおよび／またはニューチュリンに細胞応答を仲介できる図に示したアミノ酸配列を含む神経栄養因子レセプタータンパク質をコードする配列、およびその生物学的等価類似体を含む。かかる配列は、（ａ）グリア細胞系由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）と複合体を形成でき、ＧＤＮＦへの細胞応答を仲介できる神経栄養因子レセプター（ＧＤＮＦＲ−α）並びにＧＲＲ２およびＧＲＲ３をコードする、Ｍｅｔ¹からＳｅｒ⁴⁶⁵をコードするヌクレオチドを含む図１（配列番号１）またはＭｅｔ¹からＳｅｒ⁴⁶⁸をコードするヌクレオチドを含む図３（配列番号３）に示す配列；（ｂ）（１）（ａ）の相補的配列にハイブリダイズし、（２）ＧＤＮＦＲ活性を有するアミノ酸配列をコードする核酸配列；および（ｃ）遺伝子コードの縮重がなければ（ａ）の相補的配列にハイブリダイズし、（２）ＧＤＮＦＲ活性を有するアミノ酸をコードする核酸配列を含む。その他に本明細書で開示されるものは、配列が典型的に、核酸配列の増幅または発現を行える１つ以上の機能エレメントに機能的に結合させた核酸配列を含むベクターである。かかるベクターを含む宿主細胞もまた考えられる。典型的には、宿主細胞は、例えばＣＯＳ−７細胞または大腸菌などのそれぞれ哺乳動物細胞および細菌細胞から選択する。本発明にさらに別の目的は、増幅および／または発現調節配列に機能的に結合させたＧＤＮＦＲタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むベクターを含む。原核および真核宿主細胞は両方共、かかるベクターを用いて安定に形質転換またはトランスフェクションし、ＧＤＮＦＲタンパク質を発現し得る。本発明はさらに、タンパク質ＧＤＮＦＲの組換え産物を含み、ここでかかる形質転換またはトランスフェクト宿主細胞は適当な栄養培地で成育させ、細胞により発現されるＧＤＮＦＲタンパク質を、任意に、宿主細胞および／または栄養培地から単離する。本発明はさらに、遺伝子療法または細胞療法における、ＧＤＮＦＲタンパク質をコードするポリヌクレオチドおよびかかるポリヌクレオチドを含むベクターの使用を含む。宿主細胞はまた、ヒト移植への適合性について選択し得、移植細胞は本発明の栄養因子レセプターを発現および分泌する。宿主細胞はまた、ヒト移植に適当な半透膜に封入され得る。宿主細胞は生体外で形質転換またはトランスフェクトさせ得る。神経傷害処置装置の例は（ａ）移植に適当な半透膜；および（ｂ）膜内に被包された細胞を含み、ここで細胞は本明細書で開示したように神経栄養因子レセプターを発現および分泌する。膜は、神経栄養因子レセプタータンパク質に透過性であるが、被包細胞に傷害性の物質には不透過性である物質から選択する。本発明の神経栄養因子レセプターの組換え産生法もまた開示される。方法例は（ａ）グリア細胞系由来神経栄養因子および／またはニューチュリンと複合体を形成でき、ＧＤＮＦおよび／またはニューチュリンに細胞応答を仲介できる図に示すアミノ酸配列などの、本発明のＧＤＮＦＲタンパク質をコードする核酸配列またはその生物学的等価類似体を含む宿主細胞を培養し；（ｂ）該宿主細胞を、該宿主細胞による該神経栄養因子レセプターの発現に適当な条件下で維持し；（ｃ）任意に、該宿主細胞により発現される該神経栄養因子レセプターを単離することを含む。宿主細胞は原核または真核細胞であり得る。細菌発現が関与すれば、方法はさらに神経栄養因子レセプターをリホールド（ｒｅ−ｆｏｌｄ）する段階を含み得る。本発明は、グリア細胞系由来神経栄養因子および／またはニューチュリンと複合体を形成でき、ＧＤＮＦおよび／またはニューチュリンへの細胞応答を仲介できる図に示すアミノ酸配列およびその生物学的に等価な類似体を含む単離および精製タンパク質を含む。類似体の例は、図２（配列番号２）に示すアミノ酸配列Ｓｅｒ¹⁸からＰｒｏ⁴⁴⁶、Ａｓｐ²⁵からＬｅｕ⁴⁴⁷およびＣｙｓ²⁹からＣｙｓ⁴⁴² を含むタンパク質並びに図４（配列番号４）に示すアミノ酸配列Ｍｅｔ¹⁷からＰｒｏ⁴⁴⁹およびＣｙｓ²⁹からＣｙｓ⁴⁴³を含むタンパク質を含むが、これらに限定されない。本発明のタンパク質はグリコシル化または非グリコシル化され得、組換え技術または化学合成により産生し得る。本発明はさらにかかるアミノ酸配列を含むレセプタータンパク質をコードする核酸配列を含む。本明細書ではまた、医薬的に許容できる担体と組合せて本発明のＧＤＮＦＲタンパク質を含む医薬組成物が開示される。種々の他の製剤物質を使用して製造、貯蔵、取扱、送達および／または効力を高め得る。本発明の別の態様は、ＧＤＮＦＲ遺伝子およびタンパク質の治療使用を含む。例えば、循環または可溶性ＧＤＮＦＲタンパク質産物は、ＧＤＮＦおよび／またはニューチュリンのトランスメンブランシグナリングの活性を亢進することにより、神経系の疾患または傷害の処置に、単独でまたはＧＤＮＦおよび／またはニューチュリンと共に使用し得る。従って、本発明のタンパク質および医薬組成物は、不適切に機能しているドーパミン作動性神経細胞、パーキンソン病、アルツハイマー病および筋萎縮性側索硬化症の処置に使用し得る。また、組換えＧＤＮＦＲ遺伝子を、筋萎縮性側索硬化症罹患患者における運動ニューロンなどの、ＧＤＮＦまたはニューチュリンへの感受性の増加が望ましい組織の細胞に挿入し得るという利点がある。さらに別の実施形態において、ＧＤＮＦまたはニューチュリン活性が有害であると考えられる場合、ＧＤＮＦＲはＧＤＮＦまたはニューチュリン活性を遮断し得る。ＧＤＮＦＲタンパク質を用いてＧＤＮＦまたはニューチュリンの観察された効果はＧＤＮＦＲタンパク質に起因するかを確認するために使用し得る。本発明の別の態様において、ＧＤＮＦＲプローブを用いて、正常または疾患状態においてＧＤＮＦまたはニューチュリンに応答する細胞および組織を同定し得る。また、このプローブを用いて、ＧＤＮＦ−関連疾患またはニューチュリンー関連疾患に罹患する患者におけるＧＤＮＦＲタンパク質発現の異常を検出し得る。本発明のさらに別の態様において、核酸を含むＧＤＮＦＲプローブ並びに抗体プローブを用いて、ＧＤＮＦＲ−関連分子を同定し得る。例えば、本発明は、ＧＤＮＦＲタンパク質と複合体を形成し、よってＧＤＮＦＲタンパク質機能を示す分子を提供する。別の例として、本発明は相同的または抗原交差反応するが、ＧＤＮＦＲ−α、ＧＲＲ２またはＧＲＲ３とは同一でないレセプター分子（図に示す共通配列を含む）を提供する。本発明はまた、レセプターに基づくＧＤＮＦまたはニューチュリンに関する結合および機能の両アッセイの開発を提供する。例えば、ＧＤＮＦ活性を検出するアッセイシステムは、高レベルのＧＤＮＦＲ−αを発現し、それゆえ非常に低い濃度のＧＤＮＦまたはＧＤＮＦ様分子にさえ極めて感受性の高い細胞を含み得る。類似アッセイは、ニューチュリンおよびＧＲＲ２を含み得る。さらに別の実施形態において、可溶性ＧＤＮＦＲを使用し、ＧＤＮＦまたはＧＤＮＦ様分子に結合またはその存在を検出し得る。さらに、本発明は、ＧＤＮＦまたはニューチュリンの生理学的役割を研究する実験モデル系を提供する。かかる系は、抗−ＧＤＮＦＲ抗体またはオリゴヌクレオチドプローブ並びに動物モデル、例えばトランスジェニック動物（高レベルのＧＤＮＦＲを発現し、よってＧＤＮＦおよび／またはニューチュリンに過敏である）または肝幹細胞技術を用いて誘導した動物（ここで内因性ＧＤＮＦＲ遺伝子はゲノムから削除する）を含むアッセイを含む。抗−ＧＤＮＦＲ抗体は、神経栄養因子レセプタータンパク質のペプチド部分に結合する。抗体は、モノクローナルおよびポリクローナル抗体を含む。また、抗体がすでに存在する免疫タグをＧＤＮＦＲタンパク質に結合させ検出可能とし得る。かかるタグは、フラッグ（ＩＢＩ／ＥａｓｔｍａｎＫｏｄａｋ）およびｍｙｃ配列を含むがこれに限定されない。ポリヒスチジンなどの他のタグ配列もまた検出および金属キレートカラム上での精製に使用する。本発明のさらに別の態様は、以下の詳細な記載および実施例に記載したレセプターを活性化するリガンド同定のためのＧＤＮＦＲの使用を含む。タンパク質並びに小分子神経栄養因子疑似物は、本明細書に記載の結合研究により同定および研究され得る。本発明のさらに別の態様および利点は、本発明の実施を詳述した以下の記載を考慮すれば当業者には明らかであろう。図面の簡単な説明図１は、ヒトグリア細胞系由来神経栄養因子レセプター（ＧＤＮＦＲ−α）をコードする核酸配列（配列番号１）を示す。全長ＧＤＮＦＲタンパク質のアミノ酸配列は、核酸５４０−１９３４によりコードされる。図２は、全長ヒトＧＤＮＦＲ−αタンパク質のアミノ酸配列（配列番号２）を示す。図３は、ラットＧＤＮＦＲ−αをコードする核酸配列（配列番号３）を示す。全長ＧＤＮＦＲ−αタンパク質のアミノ酸配列は核酸３０２− １７０５によりコードされる。図４は、全長ラットＧＤＮＦＲ−αタンパク質のアミノ酸配列（配列番号４）を示す。図５は、種々のクローンにおいて産生されたＧＤＮＦＲ−αｃＤＮＡ配列の一部の配列および比較、並びにヒトＧＤＮＦＲ−αの共通配列を示す。図６は、ＧＤＮＦＲ−αを発現するニューロ−２Ａ由来細胞系の同定を示す。図７Ａおよび７Ｂは、ＧＤＮＦＲ−αを発現する細胞への［¹²⁵Ｉ］ＧＤＮＦの平衡結合の結果を示す。図８は、［¹²⁵Ｉ］ＧＤＮＦのＧＤＮＦＲ−αへの化学的架橋結合およびＧＤＮＦＲ−α発現細胞におけるＲｅｔ発現の結果を示す。図９は、ＧＤＮＦＲ−α発現細胞におけるＧＤＮＦによるｃ−Ｒｅｔ自己リン酸化誘導の結果を示す。図１０は、ＧＤＮＦおよび可溶性ＧＤＮＦＲ−αによるｃ−Ｒｅｔ自己リン酸化誘導の結果を示す。図１１は、Ｒｅｔ−Ｆｃ融合タンパク質によるｃ−Ｒｅｔ自己リン酸化の遮断結果を示す。図１２は、運動ニューロンにおけるＧＤＮＦによるｃ−Ｒｅｔ自己リン酸化の誘導結果を示す。図１３は、ＧＤＮＦＲ−αおよびＲｅｔにより仲介されるＧＤＮＦシグナリングのモデルを示す。図１４は、ヒトグリア細胞系由来神経栄養因子レセプター−α−関連タンパク質２（ＧＲＲ２）をコードする核酸配列（配列番号）を示す。全長ＧＲＲ２タンパク質のアミノ酸配列は、核酸１５８５−２９８９によりコードされている。図１５は、ヒトグリア細胞系由来神経栄養因子レセプター−α−関連タンパク質３（ＧＲＲ３）をコードする核酸配列（配列番号）を示す。図１６は、ラットグリア細胞系由来神経栄養因子レセプター−α−関連タンパク質２（ラットＧＲＲ２）をコードする核酸配列（配列番号）を示す。図１７は、ラットグリア細胞系由来神経栄養因子レセプター−α−関連タンパク質３（ラットＧＲＲ３）をコードする核酸配列（配列番号）を示す。図１８は、種々のヒト、ラットおよびマウスＧＤＮＦＲアミノ酸配列の配列および比較を示す。図１９は、ヒト、ラットおよびマウスＧＤＮＦＲ−α、ＧＲＲ２およびＧＲＲ３アミノ酸配列の配列および比較並びに例示的共通ＧＤＮＦＲ配列を示す。図２０は、ヒトおよびラットＧＤＮＦＲ−αおよびＧＲＲ２ペプチド配列の配列および比較を示す。図２１（パネルＡおよびＢ）は、ニューチュリンおよびＧＤＮＦのＬＡ−Ｎ− ％およびＮＧＲ−３８細胞への結合を示す。ＬＡ−Ｎ−５（パネルＡ）およびＮＧＲ−３８（パネルＢ）細胞を、５０ｐＭの［¹²⁵Ｉ］ＮＴＮまたは［¹²⁵Ｉ］ＧＤＮＦいずれかと共に、非標識ＧＤＮＦ（暗灰色棒）またはニューチュリン（黒色棒）の非存在（明灰色棒）または存在下で４℃で２時間インキュベートした。図２２は、ニューチュリンおよびＧＤＮＦのＧＤＮＦＲ−αおよびＧＲＲ２への化学的架橋結合の結果を示す。図２３は、ＮＧＲ−３８細胞におけるニューチュリン誘導ｒｅｔ自己リン酸化の結果を示す。図２４は、ＬＡ−Ｎ−５細胞におけるニューチュリン誘導ｒｅｔ自己リン酸化の結果を示す。図２５（パネルＡおよびＢ）は、ＬＡ−Ｎ−５およびＮＧＲ−３８細胞におけるニューチュリンおよびＧＤＮＦ誘導ＭＡＰキナーゼ活性化の結果を示す。図２６は、ＧＤＮＦＲ−α、ＧＲＲ２およびＧＲＲ３のアミノ酸配列を並べ、共通配列を３つのレセプター配列上に示すことを表す。共通配列の大文字は、３つ全てのレセプターで保存されているアミノ酸を示し、小文字は３つのレセプター中２つが該アミノ酸を共有し、点は３つ全てのレセプターがその位置で異なるアミノ酸を有することを示す。仮想シグナルペプチド配列は、ＧＤＮＦＲ−αおよびＧＲＲ３に下線を付け；ＧＲＲ２にはシグナルペプチドは全く予想されない。３つ全ての仮想レセプターの疎水性Ｃ−末端領域に下線を付ける。可能なＮ− グリコシル化部位が太文字で示され、２つのレセプター間で保存された部位は四角で囲む。発明の詳細な説明グリア細胞系神経由来栄養因子（ＧＤＮＦ）は強力な神経栄養因子であり、中枢および末梢神経系両方の種々の細胞型において広範な生物学的活性を示す。グリコシル化されたジスルフィド−結合ダイマーであり、これは形質転換増殖因子 −β （ＴＧＦ−β）スーパーファミリーとは関連性が低い（相同性２０％未満）。ドーパミン作動性ニューロンおよび他のニューロン集合の生存を亢進するＧＤＮＦの能力により、パーキンソン病並びに他の形の神経傷害または機能不全の処置に治療有効性が示される。ニューチュリン神経栄養因子の記載の生物学的活性（Ｎａｔｕｒｅ３８４（５）：４６７−４７０、１９９６）は、上頚部神経節交換神経ニューロンに加えて、結節神経節感覚ニューロンおよび小群の後根神経節感覚ニューロンの生存の促進を含む。活性により、共通または類似のシグナル経路の可能性が示唆される。さらに、ニューチュリンの生物学的活性は、運動ニューロンおよびドーパミンニューロンに伸長し得る。従って、ニューチュリンはＧＤＮＦの使用が指示され得る疾患の処置に有用であり得る。本発明は、生後ラットの培養網膜細胞の表面上で初めて発見された高親和性レセプターの発見に基づいている。これらのレセプターは、ドーパミン作動性および運動ニューロン；中脳ドーパミン作動性ニューロン（Ｌｉｎら、１９９３上記；Ｓａｕｅｒら、１９９５上記；ＫｅａｒｎｓおよびＧａｓｈ、１９９５上記；Ｂｅｃｋら、１９９５上記；Ｔｏｍａｃら、１９９５ａ上記）、顔面および脊髄運動ニューロン（Ｌｉら、１９９５上記；Ｏｐｐｅｎｈｅｉｍら１９９５上記；Ｙａｎら１９９５上記；Ｚｕｒｎら、１９９４上記；Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎら１９９４上記）に見られるレセプターと同等の推定ＧＤＮＦ結合親和性を有する。レセプター分子は、ＧＤＮＦのレセプターシステムの最初に知られた成分であるため、ＧＤＮＦレセプター−アルファ（ＧＤＮＦ−α）と呼ばれる。本発明はまた、ＧＤＮＦＲ−αタンパク質の発現クローニングおよび特性に関する最初の記載を提供する。組換えレセプターを発現するように修飾された細胞は高親和性でＧＤＮＦに結合する。さらに別のレセプタータンパク質は、グリア細胞系由来神経栄養因子レセプター−α関連レセプタータンパク質２および３（ＧＲＲ２およびＧＲＲ３）を含む。培養細胞上でドーパミン取り込みアッセイおよび［¹²⁵Ｉ］−ＧＤＮＦ結合を用いて、ＧＤＮＦへの高親和性レセプターを、ラット光受容体細胞の表面上で検出した。実施例でさらに記載するように、光レセプター細胞の研究により、ＧＤＮＦＲ−αの発現クローニングによるｃＤＮＡクローンが単離できる。ＧＤＮＦＲ−αの核酸配列は３１システイン残基および３つのＮ−グリコシル化可能部位を有する４６８アミノ酸のタンパク質をコードする。次に、ラットｃＤＮＡクローン由来の核酸配列を用いて、そのヒト相同体を単離し、これはアミノ酸レベルでラットレセプターとほぼ同一であることが判明した。ヒトＧＤＮＦＲ −αｃＤＮＡ配列は、全システイン残基およびＮ−グリコシル化可能部位がラットレセプターと比較して保存されている４６５アミノ酸のタンパク質をコードする。この高い一次配列保存は、ＧＤＮＦの生物学的機能においてこのレセプターが重要な役割を果たしていることを示唆する。上記で議論したように、多くのレセプターが３つの主要ドメインを有する。すなわち：タンパク質因子との特異的結合に関与する細胞外または細胞表面ドメイン、細胞膜に及ぶトランスメンブランドメイン；およびタンパク質因子が細胞外ドメインに結合する場合にシグナル変換の開始に典型的に関与する細胞内または細胞質ドメインである。しかし、下記に詳述したように、ＧＤＮＦＲ−αは任意の公知のタンパク質と配列または構造特性において相関性がなく（例えばレセプターキナーゼまたはサイトカインレセプターのいずれかに見られる共通配列）、細胞質ドメインを欠失し、トランスメンブランドメインに特徴的なＣ末端荷電残基を欠失し、グリコシル−ホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）結合により細胞膜に固定されていると決定された。細胞内触媒ドメインが存在しないことによりトランスメンブランシグナリングにおける直接的な役割は除外されるが、高結合親和性および強い進化配列保存により、さらにこのレセプターはＧＤＮＦ機能に重要であることが示唆された。ＧＤＮＦＲ−αは細胞質ドメインを欠失するので、このレセプターはトランスメンブランシグナリングに役割を果たす１つ以上の補助分子と共に作用するに違いないと考えられた。次いで、ＧＤＮＦ遺伝子を欠失するトランスジェニックマウスは死亡し全く腎臓がないことが発見された。ｃ−ｒｅｔ癌原遺伝子を欠失したトランスジェニックマウス（Ｓｃｈｕｃｈａｒｄｔら、Ｎａｔｕｒｅ、３６７、３８０−３８３、１９９４）は類似の発現型を有することが判明した。ｃ−ｒｅｔ癌原遺伝子は、正常な機能が依然決定されていないレセプターチロシンキナーゼ（ＲＴＫ）をコードする。全ＲＴＫは、類似のトポロジーを有する：それらは細胞外リガンド結合ドメイン、トランスメンブランドメインおよび触媒タンパク質チロシンキナーゼドメインを含む細胞質部分を保持する。リガンドの結合により、キナーゼドメインの活性化および細胞内の特定の基質のリン酸化が生じ、細胞内シグナリングを仲介する。本発明は、ＧＤＮＦＲ−αの可溶形を用いてＧＤＮＦのｃ−ｒｅｔ癌原遺伝子への結合を仲介し、よってＧＤＮＦへの細胞応答を顕現しその細胞型特異性を修飾し得るという発見を含む。類似の種である「レセプターアルファ」と呼ばれる成分は、リガンド結合特異性を提供するが、それ自体でシグナルを変換する能力はもたない。かかる成分は毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）およびインターロイキン−６（ＩＬ−６）レセプターシステムに認められる。ＧＤＮＦＲ−αと同様、およびＩＬ−６レセプターと対照的に、ＣＮＴＦレセプターは高親和性でそのリガンドに結合し、疎水性Ｃ末端を保持し、全く細胞質ドメインを保持せず、ＧＰＩ結合により細胞膜に固定されている（Ｄａｖｉｓら、１９９１）。シグナル変換を仲介するために、ＣＮＴＦは始めにＣＮＴＦレセプターに結合し、ｇｐ１３０に結合可能な複合体を形成する。この不活性複合体は次いで、ＬＩＰレセプターに結合し、活性シグナリング複合体を形成する（Ｄａｖｉｓら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２６０、１８０５− １８０７、１９９３）。本発明では、ＣＮＴＦレセプター（リガンド特異的結合成分）はシグナリングを起こすために存在しなければならないが、膜に結合する必要はない（Ｅｃｏｎｏｍｉｄｅｓら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２７０、１３５１−１３５３、１９９５）。さらに以下に記載したように、ＧＤＮＦＲタンパク質は、細胞表面に固定し得るか、または可溶形で提供され得る。どちらの場合でも、ＧＤＮＦＲタンパク質はＧＤＮＦおよび／またはニューチュリンとリガンド複合体を形成し、リガンド複合体は細胞表面レセプターに結合し、細胞内シグナリングを奏効する。従って、ＧＤＮＦＲタンパク質の可溶形を用いて、それに結合および／またはその細胞型特異性を修飾する神経栄養因子の作用を高め得る。ＧＤＮＦＲタンパク質は、以前に公知のレセプターとは関連性がない。関連配列に対して、ゲンバンク（Ｇｅｎｂａｎｋ）およびワシントン大学−メルクデータベースには全く見かけ上適合がない。ワシントン大学−メルクＥＳＴデータベースに見られる発現配列タグ（ＥＳＴ）は、ＧＤＮＦＲ−αのコード領域の小部分（クローンの５’端から作製した５２１ヌクレオチド配列の約３４０ヌクレオチド）に７５％相同性を示す。このクローン（ゲンバンクアクセス番号＃Ｈ１２９８１）はオリゴ−ｄＴプライムヒト乳児脳ライブラリーから単離され、ＬａｆｍｉｄＢＡベクターに直接クローン化された（Ｈｉｌｌｅｒ，Ｌら、非公開データ）。＃Ｈ１２９８１クローンの３’端を配列決定したが、ＧＤＮＦＲ−αのどの部分とも相同性を示さない。短い領域におけるこの＃Ｈ１２９８１クローンおよびＧＤＮＦＲ−α間の相同性の出現、次いで相同性の消失は、＃Ｈ１２９８１クローンは非スプライス転写物、またはボナフィドｃＤＮＡ転写物よりもクローニングアーチファクト（人為構造）を示すことを示唆する。従って本発明は、ＧＤＮＦＲタンパク質を発現する標的細胞を選択する方法の提供により、ＧＤＮＦＲタンパク質のクローニングを可能とする。ＧＤＮＦＲタンパク質コード配列を増やす方法を提供することにより、本発明はさらにＧＤＮＦＲタンパク質の精製およびＧＤＮＦＲ−コードＤＮＡの直接的クローニングを提供する。ＧＤＮＦＲ核酸およびアミノ酸配列の本記載は、これらの実体並びに種々のＧＤＮＦＲ類似体の再生に必要な情報を提供する。この情報を用いて、ＧＤＮＦＲタンパク質産物を、当業者に公知の任意の方法により単離または産生し得る。ＧＤＮＦＲタンパク質の組換えまたは合成産生の種々の方法が開示される。本明細書で使用されているように、「ＧＤＮＦＲタンパク質産物」という用語は、生物学的に活性な精製天然、合成または組換えＧＤＮＦＲ−α、ＧＲＲ２およびＧＲＲ３（合わせてグリア細胞由来神経栄養因子レセプター、ＧＤＮＦＲ、ＧＤＮＦＲタンパク質と呼ぶ）、ＧＤＮＦＲ類似体（すなわち、図に示す共通配列に基づく、挿入、置換および欠失変異体を含むＧＤＮＦＲ相同体および変異体）およびその化学的修飾誘導体を含む。ＧＤＮＦＲ類似体は実質的に図に示したＧＤＮＦＲアミノ酸配列に相同である。本明細書で使用した「生物学的に活性」という用語は、ＧＤＮＦＲタンパク質産物はＧＤＮＦおよび／またはニューチュリンに対して高親和性結合を示し、ＧＤＮＦ−誘導またはニューチュリンー誘導シグナル変換を仲介または亢進することを意味する。本開示を用いて、ＧＤＮＦＲタンパク質類似体が図に示したＧＤＮＦＲタンパク質産物と実質的に同じ生物学的活性を有するかを決定することは十分当業者の能力の範囲内である。本明細書で使用した「実質的に相同的」アミノ酸配列という用語は、相同配列がこれらＧＤＮＦＲのアミノ酸配列に記載したものと類似した生物学的活性または機能を有するように、図に示したＧＤＮＦＲアミノ酸配列に「類似」または相同性を有するアミノ酸配列を意味する。比較的多くの個々または一群のアミノ酸残基を、全アミノ酸配列において、分子の３次元立体構造または活性に影響を与えることなく、変化、位置的な交換（例えば逆順番または再追加）または欠失できることは当業者により理解されるだろう。かかる修飾は、本開示により十分当業者の能力内である。かかる修飾配列の同定および提供法は、以下で詳細に記載する。実質的に相同なタンパク質（ペプチド）の相同性度は７０％またはそれ以上であることが好ましい（すなわち７０％から１００％の範囲の相同性）。従って、好ましい「実質的に相同」なＧＤＮＦＲアミノ酸配列は、ＧＤＮＦＲ−α、ＧＲＲ２、ＧＲＲ３および図に示したその共通配列も示したアミノ酸配列の７０％またはそれ以上の相同度を有し得る。より好ましくは、相同度は、８０％または８５％またはそれ以上であり得る。さらにより好ましくは９０％またはそれ以上、または最も好ましくは９５％またはそれ以上である。本明細書で記載した相同比率は、第２タンパク質配列の同一または類似アミノ酸残基と並ぶあるタンパク質配列に見られるアミノ酸残基の比率として計算する。従って、ＧＤＮＦＲタンパク質相同の場合、配列相同性度は比較分子のアミノ酸配列を、図に示した対照ＧＤＮＦＲポリペプチドのそれと、または図に示した核酸配列によりコードされるものに対して最適に並べ、２つの配列間で残基の適合を最大にすることにより決定し得る。かかるアラインメントは、適当な保存残基置換を含み得、必要とされる間隙の導入による比較配列の切形および内部欠失または挿入は考慮しないことは当業者により理解されよう；例えば、Ｄａｙｈｏｆｆ、ＡｔｌａｓｏｆＰｒｏｔｅｉｎＳｅｑｕｅｎｃｅａｎｄＳｔｒｕｃｔｕｒｅＶｏｌ．５（１００アミノ酸長中平均３または４間隙が導入されアラインメントに参入し得る）参照（ｐ．１２４、ＮａｔｉｏｎａｌＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌＲｅｓｅａｒｃｈＦｏｕｎｄａｔｉｏｎ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．、１９７２；その開示は引用によりここに援用する）。一旦並べたら、比較ポリペプチドのアラインした残基の数を比較ポリペプチドの全残基数で割ることにより比率を測定する。本発明のＧＤＮＦＲタンパク質配列を用いて、少なくとも部分的にＧＤＮＦＲタンパク質活性を有する融合タンパク質またはキメラタンパク質の一部を形成し得ることがさらに考えられる。かかるタンパク質のアラインメントおよび相同性は、ＧＤＮＦＲタンパク質活性と関連する融合タンパク質またはキメラタンパク質の一部を用いて決定する。かかる実質的に相同なＧＤＮＦＲタンパク質源は、ヒトＧＤＮＦＲタンパク質に対して高い相同性を有することが期待される他の哺乳動物（例えば図に示したもの）のＧＤＮＦＲタンパク質を含む。例えば、本明細書に開示したラットおよびヒトＧＤＮＦＲ−αタンパク質間の相同度は、約９３％である。実質的に相同なＧＤＮＦＲタンパク質は、図に示したＧＤＮＦＲアミノ酸配列に対する抗体を用いた交差反応によりを該哺乳動物から単離し得る。また、それらは、ＧＤＮＦＲタンパク質をコードする遺伝子または遺伝子断片とのハイブリダイゼーションにより単離されるか、または図に示した核酸配列の相補的配列とハイブリダイズする核酸配列により発現され得る。適当なハイブリダイゼーション条件は以下に詳細に記載する。新規ＧＤＮＦＲタンパク質産物は典型的に単離および精製されて、ＧＤＮＦＲタンパク質産物を形成し、これは目的の用途における本発明のポリペプチドの使用に障害となる望ましくない物質が実質上含まれていない。例えば、好ましいＧＤＮＦＲタンパク質産物には、他のヒト（例えば、非−ＧＤＮＦＲ）タンパク質様物質または病原物質が実質的に含まれ得ない。好ましくは、ＧＤＮＦＲタンパク質産物は、約８０％他のタンパク質（これはＧＤＮＦＲタンパク質産物の製造に使用する生成技術に起因して存在し得る）が含まれていない。より好ましくは、ＧＤＮＦＲタンパク質産物は約９０％他のタンパク質が含まれず、特に好ましくは約９５％他のタンパク質が含まれず、最も好ましくは約＞９８％他のタンパク質が含まれない。さらに、本発明は、相同ＧＤＮＦＲタンパク質製造用のポリヌクレオチド配列を提供するという独特の利点を有する。種々のＧＤＮＦＲ変異体（付加、欠失および置換変異体を含む）が考えられる。例えば、一連の欠失変異体は、ＧＤＮＦＲタンパク質のアミノおよび／またはカルボキシ末端から１つ以上のアミノ酸残基を除去することにより作製し得る。ｖｏｎＨｅｉｊｎｅによる記載のシグナルペプチド除去の推定法則を用いて（ｖｏｎＨｅｉｊｎｅ、ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ、１４、４６８３−４６９０、１９８６）、ＧＤＮＦ結合に関与するＧＤＮＦＲ−αタンパク質の最初のアミノ酸残基は、Ｓｅｒ¹⁸である（これは図２（配列番号２）のヒトＧＤＮＦＲ−αの全長アミノ酸配列に示す）。アミノ酸残基Ｍｅｔ¹からＳｅｒ¹⁸は、アミノ末端疎水性領域にあり、シグナルペプチド配列の一部のようであり、従ってレセプタータンパク質の成熟形には含まれない。同様に、ＧＤＮＦ結合に必要であると思われるＧＤＮＦＲ−αタンパク質の最後のアミノ酸残基はＳｅｒ⁴⁴⁶である。アミノ酸残基Ｌｅｕ⁴⁴⁷からＳｅｒ⁴⁶⁵は、カルボキシ末端疎水性領域にあり、細胞表面へのタンパク質のＧＰＩ結合に関与している。従って、Ｍｅｔ¹からＳｅｒ¹⁸および／またはＬｅｕ⁴⁴⁷からＳｅｒ⁴⁶⁵の数個または全ての残基（図２（配列番号２）に記載）は、ＧＤＮＦＲ−αタンパク質へのＧＤＮＦ結合に影響を与えることなくタンパク質から除去し得、従ってＡｌａ¹⁹からＰｒｏ⁴⁴⁶の「コア」配列を残すと考えられる。公知の分析法を用いて、Ｎ−末端切形は、Ｇｌｙ²⁴を含むこれまでの１つ以上のアミノ酸残基除去を含み得ることがさらに考えられる。従って、ＧＤＮＦＲ−α切形類似体はまた、一端または両端の１つ以上のアミノ酸残基の欠失を含み得、Ａｓｐ²⁵からＰｒｏ⁴⁴⁶またはＬｅｕ⁴⁴⁷ のアミノ酸配列がコア分子の基礎を形成する。追加のＧＤＮＦＲ−α類似体は、図４（配列番号４）のＧＤＮＦＲ−αアミノ酸配列に示すアミノ酸残基Ｓｅｒ¹⁸ からＰｒｏ⁴⁴⁹を含む、すなわち、アミノ酸残基Ｍｅｔ¹からＳｅｒ¹⁸および／またはＰｒｏ⁴⁴⁹からＳｅｒ⁴⁶⁸で示される疎水性領域を含む一端または両端の１つ以上のアミノ酸残基を欠失すると考えられる。同様の類似体が、図に示した、ＧＲＲ２およびＧＲＲ３のアミノ酸配列、並びに共通配列を用いて設計され得る。さらに、全長配列の最初および最後のシステイン残基に達するまで、ＧＤＮＦＲタンパク質のアミノおよびカルボキシ末端の一端または両端から１つ以上のアミノ酸残基が除去され得ることが考えられる。ＧＤＮＦＲタンパク質の適当な分子内結合のためにシステイン残基を保持することが有利である。図２（配列番号２）のヒトＧＤＮＦＲ−αの全長アミノ酸配列に示すように、Ｍｅｔ¹からＡｓｐ²⁸までの数個または全てのアミノ酸残基は、Ｃｙｓ²⁹として現れる最初のシステイン残基を除去することなくアミノ末端から除去され得る。同様に、Ｇｌｙ⁴⁴ ³ からＳｅｒ⁴⁶⁵までの数個または全てのアミノ酸残基は、Ｃｙｓ⁴⁴²として現れる最後のシステイン残基を除去することなくカルボキシ末端から除去され得る。他のＧＤＮＦＲ−α類似体は、図４（配列番号４）のＧＤＮＦＲ−αアミノ酸配列に示されるＣｙｓ²⁹からＣｙｓ⁴⁴³のアミノ酸残基を用いて製造され得、すなわち、アミノ酸残基、Ｍｅｔ¹からＡｓｐ²⁸および／またはＳｅｒ⁴⁴⁴からＳｅｒ⁴⁶⁸で示される全てまたは一部の末端領域を削除する。同様の類似体は、図に示したＧＲＲ２およびＧＲＲ３のアミノ酸配列、並びに共通配列を用いて設計され得る。同理由のために、これらの同定アミノ酸残基は、ＧＤＮＦＲタンパク質の機能に影響を与えることなく、欠失よりもむしろ置換され得ると考えられることは当業者により理解されるだろう。また、これらの同定アミノ酸残基は、ＧＤＮＦＲタンパク質の機能に影響を与えることなく、残基内挿入または末端付加により修飾され得る。さらに別の実施形態において、１つ以上の欠失、置換または付加の組合せを作製し得る。本ＧＤＮＦＲタンパク質または核酸は、処置法、または処置用医薬品の製造法に使用され得る。かかる処置はＧＤＮＦまたはニューチュリンの過剰産生を特徴とする症状を含み、ここで本ＧＤＮＦＲ、特に可溶形を用いて複合体を形成し、従って過剰ＧＤＮＦまたはニューチュリンを不活性化し得る。この処置は、可溶性レセプターの製造（例えば、ＧＤＮＦまたはニューチュリン結合ドメインの使用）によりまたは該ＧＤＮＦＲを含む細胞集合を調製し、かかる細胞を必要とする個体に移植することにより達成され得る。本ＧＤＮＦＲタンパク質産物はまた、欠損ＧＤＮＦおよび／またはニューチュリンレセプターを有するものの処置に使用され得る。例えば、可溶性レセプターの製造および送達により、またはかかる非欠損ＧＤＮＦＲを含む細胞集合を製造し、かかる細胞を個体に移植することにより、欠損ＧＤＮＦＲを有する個体を処置し得る。または、個体は不適切な数のＧＤＮＦまたはニューチュリンレセプターを有し得、かかるレセプターを含む細胞は、個体に利用できるＧＤＮＦまたはニューチュリンレセプターの数を増加させるために移植し得る。かかる組成物はＧＤＮＦまたはニューチュリンの送達と共に使用し得る。また、ＧＤＮＦＲタンパク質産物は、ｃ−ｒｅｔレセプターチロシンキナーゼの活性化に応答する症状の処置に使用し得ることが考えられる。本発明のさらに別の態様において、新規組成物のさらに別の利点は、ＧＤＮＦタンパク質またはニューチュリン医薬組成物を安定化させるＧＤＮＦＲの使用である。本発明の別の態様において、ＧＤＮＦＲを用いて化合物をアンタゴニスト活性についてスクリーニングし得る。本発明の別の態様および利点は、当業者には明らかであろう。例えばさらに別の使用は、新規アッセイ系、トランスジェニック動物および抗体産生を含む。研究モデル本発明は、ペプチドまたは非ペプチド化合物への暴露から生じたＧＤＮＦまたはニューチュリン活性またはＧＤＮＦまたはニューチュリン活性に類似の活性が、本発明のＧＤＮＦＲ分子を発現する細胞または細胞系における生理学的応答の顕現を測定することにより検出し得るアッセイ系を提供する。生理学的応答は、ＧＤＮＦまたはニューチュリンの任意の生理学的効果を含み得、これは、ドーパミン取り込み、神経突起伸長、細胞生存または増殖の亢進、並びにある核酸配列の転写活性化（例えばプロモーター／エンハンサーエレメント並びに構造遺伝子）、ＧＤＮＦ−関連プロセシング、翻訳またはリン酸化、および実質的には少ないがＧＤＮＦにより直接または間接的に誘導されたプロセスに応答した二次プロセスの誘導を含むが、これらに限定されない。例えば、モデル系を作成し、これを用いて過剰ＧＤＮＦ活性の効果を研究し得る。かかる系では、細胞のＧＤＮＦへの応答は、修飾されていない細胞に対して増加数の適当なＧＤＮＦＲをモデル系の細胞上で工作することにより増加させ得る。また系を改良して、ＧＤＮＦＲを正常に発現する細胞上で増加数の該ＧＤＮＦＲを選択的に提供し得る。ＧＤＮＦＲの発現を確実にするために、ＧＤＮＦＲ遺伝子を、適当なプロモーター配列の制御下に配置し得る。構成および／または組織特異的プロモーター（ＣＮＳニューロン特異的エノラーゼ、ニューロフィラメント、およびチロシンヒドロキシラーゼプロモーターを含むがこれに限定されない）、誘導プロモーター（例えばメタロチオネインプロモーター）、ヒト免疫不全ウイルス長末端反復におけるＵＶ活性化プロモーター（Ｖａｌｅｒｉら、１９８８、Ｎａｔｕｒｅ３３３：７８−８１）、またはＣＭＶプロモーター（ｐＣＭＸに含まれる、下記）または発達性調節プロモーターの制御下にＧＤＮＦＲ遺伝子を置くことが望ましくあり得る。細胞性ＧＤＮＦＲの数を増加することにより、内因性ＧＤＮＦに対する応答を増加し得る。モデル系がＧＤＮＦを殆どまたは全く含まなければ、ＧＤＮＦを系に添加し得る。モデル系に追加のＧＤＮＦを加えて、過剰ＧＤＮＦ活性の効果を測定することが望ましくあり得る。ＧＤＮＦ（または分泌ＧＤＮＦ）の過剰発現は、すでにＧＤＮＦＲを発現している細胞上でＧＤＮＦレベル上昇の効果を研究する１つの方法であり得る。ＧＤＮＦＲ療法別の態様において、ある状態において、ＧＤＮＦおよび／またはニューチュリン応答性の増加は利点があり得る。ゆえに、ＧＤＮＦおよび／またはニューチュリン療法に応答性の症状に罹患している患者においてＧＤＮＦＲの数または結合親和性を増加させることは利点があり得る。これは遺伝子療法により達成でき、ここでは適当な細胞における組換えＧＤＮＦＲの選択的発現が、例えば、組織特異的または誘導プロモーターにより調節したＧＤＮＦＲ遺伝子を用いることにより、または組換えＧＤＮＦＲ遺伝子を有する複製欠損ウイルスを用いて局所感染を産生することにより達成される。ＧＤＮＦＲまたは組換えＧＤＮＦまたはニューチュリン／ＧＤＮＦＲ送達により利点が得られる症状は、運動ニューロン疾患（筋萎縮性側索硬化症、糖尿病関連神経疾患、パーキンソン病、アルツハイマー病およびハンティングトン舞踏病を含む）を含むがこれに限定されない。ＧＤＮＦＲまたは組合せＧＤＮＦまたはニューチュリン／ＧＤＮＦＲ送達の使用のさらに別の適用は上記し、さらに、緑内障または網膜神経節細胞変性を含む他の疾患および症状：感覚ニューロンへの傷害、損傷または変性により生じた感覚神経障害：例えば遺伝性網膜変性および年齢、疾患または障害関連網膜症（ここでは光受容体の変性が生じ、聴覚消失に関与する）などの病的状態：および様々な原因による聴覚消失を予防および／または処置する毛細胞などの内耳感覚細胞および感覚ニューロンの障害または変性の処置を含む。トランスジェニック動物さらに別の態様において、組換えＧＤＮＦＲ遺伝子を用いて、内因性遺伝子を不活性化または「ノックアウト」し（例えば相同的組換えにより）、よってＧＤＮＦＲ欠損細胞、組織または動物を作製し得る。例えば、組換えＧＤＮＦＲ−α 遺伝子を工作して、ＧＤＮＦＲ−αを不活性化する挿入変異を含ませ得る。適当なプロモーターの制御下でかかる構築物は、胚幹細胞などの細胞中に、トランスフェクション、形質導入、注入等を含む慣用的な技術により導入し得る。この構築物を含む細胞は、次いで、例えばＧ４１８耐性などにより選択し得る。次いで、無傷ＧＤＮＦＲ−α遺伝子を欠失する細胞を同定する（例えば、サザンブロットまたはノーザンブロットまたは発現アッセイによる）。次いで、無傷ＧＤＮＦＲ−α遺伝子を欠失する細胞を、初期肝細胞に融合し、ＧＤＮＦＲ欠損トランスジェニック動物を作製する。かかる動物を内因性ＧＤＮＦを発現しない動物と比較すると、２つの発現型が完全に適合するか否かが判明し、このことは追加的ＧＤＮＦ様因子またはレセプターが存在することを示唆する。かかる動物を用いて、通常ＧＤＮＦに依存的な、インビボプロセスにおける特定のニューロン集合、またはその他を規定し得る。従って、これらの集合またはプロセスは、動物はＧＤＮＦＲ−αを発現せず、よってＧＤＮＦに応答できないかにより影響を受けることが予測され得る。類似の構築物が製造され得、方法はＧＲＲ２およびＧＲＲ３と同様である。診断適用本発明により、ＧＤＮＦＲプローブを用いて、正常または疾患状態において、ＧＤＮＦまたはニューチュリンに応答性の細胞および組織を同定し得る。本発明は、かかる細胞におけるＧＤＮＦＲ発現を検出することにより、ＧＤＮＦまたはニューチュリンに応答性の細胞を同定する方法を提供する。ＧＤＮＦＲ発現は、ＧＤＮＦＲｍＲＮＡの転写またはＧＤＮＦＲタンパク質の産生により確認され得る。ＧＤＮＦＲ発現は、ＧＤＮＦＲ核酸またはタンパク質を同定するプローブを用いて、またはＧＤＮＦＲタンパク質に人工的に加えられた「タグ」配列を検出することにより検出し得る。ＧＤＮＦＲ発現を検出するために使用され得る１種類のプローブは、核酸プローブであり、これは当業者に公知の任意の方法（インサイトハイブリダイゼーション、ノーザンブロット解析、またはＰＣＲ関連技術を含むがこれに限定されない）によるＧＤＮＦＲコードＲＮＡの検出に使用され得る。本発明の核酸産物は、検出可能なマーカー（例えば放射標識および非同位体標識、例えばビオチン）で標識し、ハイブリダイゼーションプロセスで使用し、ヒトＧＤＮＦＲ遺伝子位置および／または任意の関連遺伝子ファミリーの位置を染色体マップに配置し得る。それらはまた、ＤＮＡレベルにおけるヒトＧＤＮＦＲ遺伝子疾患の同定に使用し得、および近隣遺伝子およびその疾患を同定する遺伝子マーカーとして使用し得る。本明細書ではかかる標識物質を含むキットにも関する。本発明のポリペプチド産物は、検出可能なマーカー物質または標識（例えば放射性同位体、蛍光または化学蛍光化学物質、酵素または当業者により入手可能な他の標識）と結合させることにより「標識」され得、固体組織および液体サンプル、例えば血液または尿などにおけるＧＤＮＦまたはニューチュリンの検出および定量に有用な試薬を提供する。かかる産物はまた、正常または疾患状態のＧＤＮＦまたはニューチュリンに応答性の細胞および組織の検出に使用され得る。試験サンプルにおけるＧＤＮＦまたはニューチュリンの存在を検出またはＧＤＮＦ様分子の存在をスクリーニングする他の可能なアッセイは、試験サンプルを、固定相に固定した、ＧＤＮＦまたはニューチュリン結合に適当なＧＤＮＦＲタンパク質と接触させ、よってＧＤＮＦＲ結合ＧＤＮＦまたはニューチュリンタンパク質を産生することを含む。ＧＤＮＦＲ結合ＧＤＮＦまたはニューチュリンは、任意に、検出試薬、例えばＧＤＮＦまたはニューチュリンに特異的な標識抗体と接触させ、よって検出可能な産物を産生し得る。かかるアッセイは、試験サンプル分析用アッセイ装置の形で開発され得る。基本形において、かかる装置は、適当なＧＤＮＦＲタンパク質を含むまたはこれで被覆された固体相を含む。ＧＤＮＦ様タンパク質の存在について試験サンプルを分析する方法は、サンプルを、ＧＤＮＦＲタンパク質を含むアッセイ試薬に接触させ、該ＧＤＮＦＲタンパク質を試験サンプルに存在するＧＤＮＦ様タンパク質と反応させ、ＧＤＮＦの存在を示唆する検出可能な反応産物を産生することを含み得る。本明細書で提供するアッセイ試薬は、キットの一部または製造品として具体化し得る。パッケージング物質および１つ以上の本明細書で提供した核酸またはアミノ酸配列の調製物を含む製品にも関する。かかるパッケージング物質は標識を含み、このことは製品は生物学的サンプルにおけるＧＤＮＦ、ニューチュリン、ＧＤＮＦＲまたはＧＤＮＦＲ欠損の検出に有用であることを示す。このように、キットは任意に、例えば、血液、尿、または組織サンプルにおけるタンパク質分析、ＤＮＡまたはＲＮＡハイブリダイゼーション分析、またはＰＣＲ分析を実施するに有用な試薬などの、かかる試験を実施する物質を含む。抗−ＧＤＮＦＲ抗体本発明により、ＧＤＮＦＲタンパク質、またはフラグメントまたはその誘導体は、抗−ＧＤＮＦＲ抗体を産生する免疫原として使用され得る。抗−ＧＤＮＦＲ免疫応答産生をさらに亢進するために、ＧＤＮＦＲのアミノ酸配列を分析して、免疫原性増加と関連し得る分子の部分を同定し得る。例えば、アミノ酸配列をコンピューター解析にかけ、親水性、表面確率、柔軟性、抗原性指数、両極性ヘリックス、両極性シート、およびＧＤＮＦＲの二次構造のコンピューター作成図を提示する表面エピトープを同定し得る。また、異なる種由来のＧＤＮＦＲのアミノ酸配列を比較し、相対的非相同性領域を同定し；これらの相同性領域は種々の種に及び免疫原性がより高いようである。また、ＧＤＮＦＲ内で連続アミノ酸または二次コンフォメーションのほんの一部が複製したポリペプチドフラグメントが考えられ、かかるフラグメントは、哺乳動物ＧＤＮＦＲのある活性（例えば、免疫活性）を有するが他の活性（例えば、ＧＤＮＦタンパク質結合活性）は保持し得ない。従って、抗体の産生は、抗− ペプチド抗体の産生を含むことができる。以下の例示的ペプチドはＧＤＮＦＲ配列を用いて合成した：ペプチドＳＪＰ−６、７および８は、ラットおよびヒトＧＤＮＦＲ−αにおいて同一である。ペプチドＳＪＰ−９および１０はラット配列から誘導され、ヒトと各１つのアミノ酸が異なる。ポリクローナルおよびモノクローナル両方の抗体が、これらのペプチドまたは他の部分のＧＤＮＦＲを用いて当業者に公知の方法により作製され得る。ＧＤＮＦＲに対して指向したモノクローナル抗体は、任意の公知の技術により製造され得、培養における連続細胞系による抗体分子の産生を提供する。例えば、元来ＫｏｈｌｅｒびＭｉｌｓｔｅｉｎにより開発されたモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ技術（Ｎａｔｕｒｅ、２５６：４９５−４９７、１９７５）並びにトリオーマ技術、ヒトＢ−細胞ハイブリドーマ技術（Ｋｏｚｂｏｒら、ＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙＴｏｄａｙ４：７２、１９８３）、ＥＢＶ−ハイブリドーマ技術（Ｃｏｌｅら、「モノクローナル抗体および癌療法」、ＡｌａｎＲ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．ｐｐ．７７−９６、１９８５）等を使用し得る。ヒトモノクローナル抗体またはキメラヒト−マウス（または他の種）モノクローナル抗体もまた治療用途に製造し得、当分野で公知の数多くの任意の技術により製造し得る（例えば、Ｔｅｎｇら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、８０：７３０８−７３１２、１９８３；Ｋｏｚｂｏｒら、ＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙＴｏｄａｙ、４：７２−７９、１９８３；Ｏｌｓｓｏｎら、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．、９２：３−１６、１９８２）。ヒト定常領域と共にマウス抗原−結合ドメインを含むキメラ抗体分子を製造し得る（Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８１：６８５１、１９８４；Ｔａｋｅｄａら、Ｎａｔｕｒｅ、３１４：４５２、１９８５）。当分野で公知の種々の方法を、ポリクローナル抗体の産生に使用し得る。抗体の産生に、種々の宿主動物（ウサギ、マウス、ラット等を含むがこれに限定されない）を、ＧＤＮＦＲタンパク質、またはそのフラグメントまたは誘導体の注入により免疫化できる。種々のアジュバンドを用いて、選択した宿主種により、免疫応答を増加させ得る。有用なアジュバンドは、フロイント（完全および不完全）、水酸化アルミニウムなどのミネラルゲル、リソレシチンなどの界面活性物質、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、オイルエマルション、キーホールリムペットヘモシアニン、ジニトロフェノール、およびＢＣＧ（ＢａｃｉｌｌｅＣａｌｍｅｔｔｅＧｕｅｒｉｎ）などのヒトアジュバント、およびコリネバクテリウムパルブムを含むがこれに限定されない。ＧＤＮＦＲエピトープに対する抗体の分子クローンはまた、公知の技術により製造し得る。組換えＤＮＡ技術（例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓら、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ、ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．、１９８２）を用いて、モノクローナル抗体分子、またはその抗原結合領域をコードする核酸配列を構築し得る。抗体分子は、例えば免疫吸着または免疫アフィニティークロマトグラフィー、クロマトグラフ法（例えば高速液体クロマトグラフィー）またはその組合せ等の公知の技術により精製し得る。本発明は、抗体分子並びにかかる抗体分子のフラグメントを提供する。分子のイディオタイプを含む抗体フラグメントは公知の技術により産生できる。例えば、かかるフラグメントは、以下を含むがこれに限定されない：抗体分子のペプシン消化により産生できるＦ（ａｂ ’）２フラグメント；Ｆ（ａｂ’）２フラグメントのジスルフィド橋を還元することにより産生できるＦａｂ’フラグメント、およびパパインおよび還元剤で抗体分子を処理することにより産生できるＦａｂフラグメント。かかる選択的結合分子は、それ自体ＧＤＮＦＲの代価物であり得、医薬組成物として製剤化し得る。ＧＤＮＦＲタンパク質の組換え発現本発明は、ＧＤＮＦＲタンパク質をコードする種々のポリヌクレオチドを提供する。発現産物またはその誘導体は、ＧＤＮＦまたはニューチュリンへの結合能を特徴とし、よってさらにシグナル分子との相互作用が可能となり、よってＧＤＮＦまたはニューチュリン活性を提供または亢進する（例えばドーパミン細胞によるドーパミン取り込み増加）。ポリヌクレオチドはまた細胞療法または遺伝子療法に使用し得る。本発明により、かかるレセプターの全部または一部をコードする新規ＧＤＮＦＲタンパク質およびＤＮＡ配列が提供される。本発明の新規核酸配列は、少なくとも一部の一次構造コンフォメーションおよび１つ以上の組換えヒトＧＤＮＦＲの生物学的特性を有するポリペプチド産物の原核または真核宿主細胞における発現に有用である。核酸は精製および単離し得、所望のコード領域が本ポリペプチドの産生に有用である。また、核酸配列は、下記でより完全に記載したように、診断目的に使用し得る。本発明の例示的ＤＮＡ配列は、図２および４および配列番号２および４に示すＧＤＮＦＲ−αアミノ酸配列およびをコードする核酸配列を含む。さらに、本発明により開示されるＤＮＡ配列は、以下を含む：（ａ）図に示したＧＤＮＦＲＤＮＡ配列（および相補鎖）；（ｂ）亜部分（ａ）またはそのフラグメントのＤＮＡ配列にハイブリダイズ（下記のｃＤＮＡライブラリースクリーニング章で開示したハイブリダイゼーション条件下、または等価の条件またはよりストリンジェントな条件下）するＤＮＡ配列；および（ｃ）遺伝子コードの縮重がなければ亜部分（ａ）のＤＮＡ配列にハイブリダイズするＤＮＡ配列。（ｂ）および（ｃ）部分に特異的に含まれるものは、ヒトＧＤＮＦＲの対立遺伝子変異体形をコードおよび／または他の哺乳動物種のＧＤＮＦＲをコードするゲノムＤＮＡ配列、およびＧＤＮＦＲ、ＧＤＮＦＲのフラグメントおよびＧＤＮＦＲの類似体をコードする製造ＤＮＡ配列（ＤＮＡ配列は、細菌宿主においてメッセンジャーＲＮＡの転写および翻訳を容易にするコドンを取り込み得る）である。このように製造された配列は、当分野で公知の方法並びに本明細書に記載の方法により容易に構築され得る。本明細書の記載または他の公知の方法に従って実施する組換え発現技術を用いて、これらのポリヌクレオチドを産生し、種々のＧＤＮＦＲタンパク質を発現し得る。例えば、ＧＤＮＦＲタンパク質をコードする核酸配列を適当なベクターに挿入することにより、当業者は容易に大量の所望のヌクレオチド配列を製造できる。次いで、配列を用いて検出プローブまたは増幅プライマーを産生できる。また、ＧＤＮＦＲタンパク質をコードするポリヌクレオチドは、発現ベクターに挿入できる。発現ベクターを適当な宿主に導入することにより、所望のＧＤＮＦＲタンパク質を大量に産生し得る。本明細書でさらに記載するように、核酸配列の伸長および／またはＧＤＮＦＲタンパク質の産生に利用可能な数多くの宿主／ベクター系がある。これらはプラスミド、ウイルスおよび挿入ベクターおよび原核および真核宿主を含むがこれに限定されない。当業者は、異種ＤＮＡを伸長または発現できる宿主／ベクター系を適合させ、本発明の配列を産生または発現することができる。かかる組換え技術により、本発明のＧＤＮＦＲタンパク質は、商業的量および高純度で容易に産生される。さらに、本開示により、新規核酸配列は、図に特別に示したＧＤＮＦＲタンパク質をコードする変性核酸配列、ＧＤＮＦＲタンパク質の変異体をコードする配列、および好ましくはストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でこれらの核酸配列の相補鎖にハイブリダイズする核酸配列含むことが当業者により理解されるだろう（Ｍａｎｉａｔｉｓら、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ（ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ）；ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ、ｐｐ．３８７−３８９、１９８２参照）。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の例は、４×ＳＳＣで６２−６７℃、次いで０．１×ＳＳＣで６２−６７℃で約１時間洗浄である。別に、ストリンジェントなハイブリダイゼーションの例は、４５−５５％ホルムアミド、４×ＳＳＣで４０−４５℃でのハイブリダイゼーションである。緩和なハイブリダイゼーション条件下でＧＤＮＦＲタンパク質の相補配列にハイブリダイズし、本発明のＧＤＮＦＲタンパク質をコードするＤＮＡ配列もまた本明細書に含まれる。かかる緩和ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の例は、４×ＳＳＣで４５−５５℃または３０−４０％ホルムアミドで４０−４５℃でのハイブリダイゼーションである。ＧＤＮＦＲをコードするポリヌクレオチドの製造本発明の開示を基本として、全長ＧＤＮＦＲタンパク質またはそのフラグメントをコードする核酸配列は、種々の方法（化学的合成、ｃＤＮＡまたはゲノムライブラリースクリーニング、発現ライブラリースクリーニング、および／またはｃＤＮＡのＰＣＲ増幅を含むがこれに限定されない）により容易に製造または得られ得る。核酸配列の製造に有用なこれらの方法およびその他は、当分野で公知であり、例えばＳａｍｂｒｏｏｋら（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ、ＮＹ、１９８９）により、Ａｕｓｕｂｅｌら編（ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ、ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓＰｒｅｓｓ、１９９４）およびＢｅｒｇｅｒおよびＫｉｍｍｅｌ（ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ：ＧｕｉｄｅｔｏＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ,ｖｏｌ．１５２、ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．、ＳａｎＤｉｅｇｏ、ＣＡ、１９８７）により記載されている。ＧＤＮＦＲをコードする好ましい核酸配列は哺乳動物配列である。ＧＤＮＦＲタンパク質をコードする核酸配列の化学的合成はまた、当分野で公知の方法、例えばＥｎｇｅｌｓらにより記載された方法を用いて実施できる（Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔｌ．Ｅｄ．、２８：７１６−７３４、１９８９）。これらの方法は、すなわち、核酸配列合成のホスホトリエステル、ホスホルアミジトおよびＨ−ホスホネート法を含む。かかる化学合成の好ましい方法は、標準的なホルホルアミジト化学を用いたポリマー支持合成である。典型的に、所望のポリペプチドをコードするＤＮＡは、数百塩基対（ｂｐ）またはヌクレオチド長である。ヌクレオチドが約１００以上の核酸配列は、これらの方法を用いて数個のフラグメントとして合成できる。次いで、フラグメントは共に結合させて全長ＧＤＮＦＲタンパク質またはその部分の発現用の配列を形成することができる。また、適当な核酸配列が、適当なｃＤＮＡライブラリー（すなわち、タンパク質を発現すると信じられている１つ以上の組織源から調製したライブラリー）またはゲノムライブラリー（全ゲノムＤＮＡから調製したライブラリー）をスクリーニングすることにより得られ得る。ｃＤＮＡライブラリー源は、典型的に、適当な量でＧＤＮＦＲを発現すると信じられている組織である。典型的に、ゲノムライブラリー源は、ＧＤＮＦＲをコードする遺伝子を有すると信じられている任意の組織または哺乳動物種由来の組織である。ライブラリーは、ＧＤＮＦＲｃＤＮＡまたはライブラリーに存在する遺伝子と選択的にハイブリダイズする１つ以上の核酸プローブ（例えば、本開示配列に基づいた、オリゴヌクレオチド、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡフラグメント）を用いて、ＧＤＮＦＲｃＤＮＡ／遺伝子の存在に関してスクリーニングできる。かかるライブラリースクリーニングに典型的に使用されるプローブは、通常、ライブラリーを調製した種と同一または類似種由来のＧＤＮＦＲ核酸配列の小領域をコードする。また、プローブは、本明細書で記載のように変性させ得る。ライブラリースクリーニングは、典型的に、非特異的結合を防ぐが、プローブまたはプライマーと有意な相同性レベルを有するクローンの結合（ハイブリダイゼーション）は許容するストリンジェントな条件下、オリゴヌクレオチドまたはｃＤＮＡをライブラリー中のクローンにアニーリングさせることにより達成される。典型的なハイブリダイゼーションおよびストリンジェントな条件の洗浄は、部分的に、ｃＤＮＡまたはオリゴヌクレオチドプローブののサイズ（すなわちヌクレオチド数長）、およびプローブが変性しているかに依存する。クローンが得られる可能性はまた、ハイブリダイゼーション溶液（例えばｃＤＮＡまたはゲノムライブラリーがスクリーニングされる；それがｃＤＮＡライブラリーであるならば、目的とするｃＤＮＡが高レベルで存在する可能性がある）を設計する上で考慮する。ＤＮＡフラグメント（例えばｃＤＮＡ）をプローブとして使用する場合、典型的なハイブリダイゼーション条件はＡｕｓｕｂｅｌら編、上記に記載のものを含む。ハイブリダイゼーション後、ライブラリーを含むブロットを、プローブサイズ、予測されるプローブのクローンに対する相同性、スクリーニングするライブラリーの型、スクリーニングするクローン数等などの種々の因子により適当なストリンジェンシーで洗浄する。ストリンジェントな洗浄溶液の例（通常イオン強度が低く、比較的高温で使用する）は、以下の通りである。あるストリンジェント洗浄は０．０１５ＭＮａＣｌ、０．００５ＭＮａクエン酸および０．１％ＳＤＳで５５−６５℃である。別のかかるストリンジェント緩衝液は１ｍＭＮａ₂ＥＤＴＡ、４０ｍＭＮａＨＰＯ₄、ｐＨ７．２および１％ＳＤＳで約４０−５０℃である。他のストリンジェント洗浄は、０．２×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳで約５０−６５℃である。また、オリゴヌクレオチドプローブをｃＤＮＡまたはゲノムライブラリーのスクリーニングに使用するストリンジェントな洗浄条件のプロコトール例がある。例えば、最初のプロトコールは、プローブ長により、約３５ないし６２℃の温度で、０．０５％ピロリン酸ナトリウムと共に６×ＳＳＣを使用する。例えば、１４塩基プローブを３５−４０℃で、１７塩基プローブを４５−５０℃で、２０塩基プローブを５２−５７℃で、および２３塩基プローブを５７−６３℃で洗浄する。バックグラウンドの非特異的結合が高いと考えられる場合、温度を２−３℃増加させることができる。二番目のプロトコールは洗浄に塩化テトラメチルアンモニウム（ＴＭＡＣ）を使用する。あるストリンジェントな洗浄溶液は３ＭＴＭＡＣ、５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．０および０．２％ＳＤＳである。ＧＤＮＦＲタンパク質をコードする核酸配列を得る他の適当な方法は、複製連鎖反応（ＰＣＲ）である。この方法では、ポリ（Ａ）＋ＲＮＡまたは全ＲＮＡを、ＧＤＮＦＲを発現する組織から抽出する。次いで、ｃＤＮＡを逆転写酵素を用いてＲＮＡから調製する（すなわちＲＴ−ＰＣＲ）。ＧＤＮＦＲｃＤＮＡの２つの別々の領域に典型的に相補的な２つのプライマーを、次いで、Ｔａｑポリメラーゼなどのポリメラーゼと共にｃＤＮＡに加え、ポリメラーゼは２つのプライマー間でｃＤＮＡ領域を増幅する。所望のＧＤＮＦＲタンパク質をコードする核酸配列を調製する選択法が、オリゴヌクレオチドプライマーまたはプローブの使用を必要とする場合（例えばＰＣＲ、ｃＤＮＡまたはゲノムライブラリースクリーニング）、プローブまたはプライマーとして選択したオリゴヌクレオチド配列は、ライブラリースクリーニングまたはＰＣＲ増幅間に生じる非特異的結合の量を最小化する適当な長さであり十分に明瞭であるべきである。プローブまたはプライマーの実際の配列は、通常、他の有機体のものと同一または類似した遺伝子の保存または高度に相同的な配列または領域（例えば本発明に含まれるラット核酸配列）に基づく。任意に、プローブまたはプライマーは、全体的にまたは部分的に変性でき、すなわちプローブ／プライマーの混合物を含み得、全て同じアミノ酸配列をコードするが、そうするために異なるコドンを使用する。変性プローブを調製する別法は、種により異なるこれらのコドン位置の数個または全てにイノシンを配置することである。オリゴヌクレオチドプローブまたはプライマーは上記したＤＮＡの化学合成法により製造し得る。ＧＤＮＦＲ並びにその突然変異体または変異体をコードするこれらの核酸配列に基づいたＧＤＮＦＲタンパク質もまた、本発明の範囲内と考えられる。突然変異体または変異体配列は、野生型配列と比較して１つ以上のヌクレオチド置換、欠失および／または挿入を含み、その結果野生型アミノ酸配列と比較して種々のアミノ酸配列を発現する配列を含む。ある場合では、天然に存在するＧＤＮＦＲアミノ酸突然変異体または変異体が、天然対立遺伝子対変異の存在により生じ得る。かかる天然に存在する突然変異体または変異体に基づくＧＤＮＦＲタンパク質もまた本発明の範囲内である。合成突然変異体配列の製造は当分野で既知であり、例えばＷｅｌｌｓら（Ｇｅｎｅ、３４：３１５、１９８５）およびＳａｍｂｒｏｏｋら、上記で記載されている。ある場合では、天然に存在するＧＤＮＦＲの核酸および／またはアミノ酸変異体を調製することが望ましい。核酸変異体（１つ以上のヌクレオチドが、野生型または天然に存在するＧＤＮＦＲと異なるように設計されている）は、部位特異的突然変異誘発またはＰＣＲ増幅（ここで、プライマーは所望の点突然変異を有する）を用いて産生し得る（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、上記およびＡｕｓｕｂｅｌら、上記、突然変異技術の記載参照）。Ｅｎｇｅｌｓら、上記により記載の方法を用いた化学合成もまた使用して、かかる変異体を調製し得る。当業者に公知の他の方法も同様に使用し得る。好ましい核酸変異体は、ＧＤＮＦＲを組換え産生するために使用する宿主細胞におけるコドン選択の原因となるヌクレオチド置換を含むものである。他の好ましい変異体は、野生型に比較して保存的アミノ酸変化（例えば、天然存在アミノ酸側鎖の荷電または極性が、異なるアミノ酸での置換により実質的に変化しない）をコードし、および／またはＧＤＮＦＲ上に新規グリコシル化および／またはリン酸化部位を産生するように設計されたもの、またはＧＤＮＦＲ上に存在するグリコシル化および／またはリン酸化部位を欠失するように設計されたものである。さらに別の好ましい変異体は、図に示したＧＤＮＦＲ共通配列に基づいたＧＤＮＦＲをコードするものである。ベクター所望のＧＤＮＦＲタンパク質をコードするｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡを、さらにクローニング（ＤＮＡの増幅）または発現するために、ベクターに挿入する。適当なベクターは市販により入手できるか、またはベクターを特別に構築し得る。可能なベクターは、コスミド、プラスミドまたは修飾ウイルスを含むがこれに限定されない、しかしベクター系は選択した宿主細胞と相容性でなければならない。かかるベクターは、ラムダ誘導体などのバクテリオファージ、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ、またはＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（登録商標）プラスミド誘導体（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、ＬａＪｏｌｌａＣＡ）などのプラスミドを含むがこれに限定されない。組換え分子は、形質転換、トランスフェクション、感染、電気穿孔、または他の公知の技術により宿主細胞に導入できる。例えば、ＧＤＮＦＲコード核酸配列をクローニングベクターに挿入し、これを用いて適当な宿主細胞を形質転換、トランスフェクト、または感染させ、核酸配列の多くのコピーを作製する。これはＤＮＡフラグメントを、相補的結合端を有するクローニングベクターに連結させることにより達成できる。ＤＮＡのフラグメント化に使用した相補的制限部位がクローニングベクター中に存在しない場合、ＤＮＡ分子端を酵素的に修飾し得る。また、制限エンドヌクレアーゼ開裂部位を、複製連鎖反応に使用したオリゴヌクレオチドプライマーに取り込むことは、得られた核酸配列のベクターへの挿入を容易にするのに有利であり得る。また、所望の任意の部位を、ヌクレオチド配列（リンカー）をＤＮＡ末端に連結させることにより産生し得；これらの連結されたリンカーは、制限エンドヌクレアーゼ認識配列をコードする特異的化学合成オリゴヌクレオチドを含み得る。別の方法では、開裂ベクターおよびＧＤＮＦＲコード核酸配列を、ホモポリマーテイリングにより修飾し得る。特別な実施形態において、単離ＧＤＮＦＲ遺伝子、ｃＤＮＡ、または合成ＤＮＡ配列を取り込む組換えＤＮＡ分子で宿主細胞を形質転換することにより、遺伝子の複数のコピーの作製が可能となる。従って、ＧＤＮＦＲコード核酸配列は、形質転換体を成育し、組換えＤＮＡ分子を形質転換体から単離し、必要であれば挿入遺伝子を単離組換えＤＮＡから取り出すことにより大量に得られ得る。適当なベクターの選択または構築は、１）ＤＮＡ増幅またはＤＮＡ発現に使用するか、２）ベクターに挿入するＤＮＡのサイズ、および３）ベクターで形質転換する宿主細胞（例えば、哺乳動物、昆虫、酵母、菌、植物または細菌細胞）に依存する。各ベクターは、その機能（ＤＮＡの増幅またはＤＮＡの発現）および目的の宿主細胞との相容性により種々の成分を含む。ＤＮＡ発現では、ベクター成分は、１つ以上の下記を含み得るがこれに限定されない：シグナル配列、複製起源、１つ以上の選択またはマーカー遺伝子、エンハンサーエレメント、プロモーター、転写終結配列等。これらの成分は、天然源から得られるか、または公知の方法により合成され得る。本発明のベクターは、選択宿主細胞においてＧＤＮＦＲコード核酸配列の増幅または発現を、指示、制御または別様に奏効可能な、１つ以上の増幅、発現制御、調節または類似の機能エレメントに機能的に結合させた目的のＧＤＮＦＲタンパク質をコードする核酸配列を含む。ＧＤＮＦＲ核酸配列挿入物を含む発現ベクターは、３つの一般的な方法により同定できる：（ａ）ＤＮＡ−ＤＮＡハイブリダイゼーション；（ｂ）「マーカー」遺伝子機能の存在または非存在、および（ｃ）挿入配列の発現。最初の試みにおいて、発現ベクターに挿入された外来核酸配列の存在は、挿入ＧＤＮＦＲ−コード核酸配列に相同的な配列を含むプローブを用いたＤＮＡ−ＤＮＡハイブリダイゼーションにより検出できる。第２の試みにおいて、組換えベクター／宿主系は、外来核酸配列のベクターへの挿入に起因する、特定の「マーカー」遺伝子機能（例えばチミジンキナーゼ活性、抗生物質抵抗性、形質転換表現型、バキュロウイルスにおける閉塞体形成等）の存在または非存在に基づいて同定および選択できる。例えば、ＧＤＮＦＲコードタンパク質核酸配列をベクターのマーカー遺伝子配列内に挿入すれば、ＧＤＮＦＲ挿入物を含む組換え体を、マーカー遺伝子機能の欠損により同定できる。第３の試みにおいて、組換え発現ベクターを、組換え核酸配列により発現される外来タンパク質産物を検出することにより同定できる。かかるアッセイは、例えば、ＧＤＮＦＲ−αタンパク質のＧＤＮＦ、または直接的にＧＤＮＦＲ−αを認識する抗体への結合により発現ＧＤＮＦＲタンパク質産物の物理的または機能的特性に基づくことができる。シグナル配列シグナル配列は、ベクターの成分であり得るか、またはベクターに挿入されるＧＤＮＦＲＤＮＡの一部であり得る。天然ＧＤＮＦＲＤＮＡは、タンパク質の翻訳後プロセシング間で開裂され、成熟ＧＤＮＦＲタンパク質を形成するタンパク質のアミノ末端でシグナル配列をコードする。本発明の範囲内に含まれるものは、天然シグナル配列（ただし天然シグナル配列は、異種シグナル配列で欠失および置換されている）並びにＧＤＮＦＲポリヌクレオチドを有するＧＤＮＦＲポリヌクレオチドである。選択した異種シグナル配列は、宿主細胞により、認識およびプロセス化、すなわちシグナルペプチダーゼにより開裂されるされるものである。天然ＧＤＮＦＲシグナル配列を認識およびプロセス化しない原核宿主細胞では、シグナル配列は、例えばアルカリホスファターゼ、ペニシリナーゼまたは熱安定性エンテロトキシンＩＩリーダーの群から選択された原核シグナル配列により置換される。酵母分泌では、天然ＧＤＮＦＲシグナル配列は酵母インベルターゼ、アルファ因子、または酸性ホスファターゼリーダーにより置換され得る。哺乳動物細胞発現において、他の哺乳動物のシグナル配列が適当であり得るが、天然シグナル配列は満足のいくものである。複製起源発現およびクローニングベクターは一般的に、ベクターを１つ以上の選択した宿主細胞において複製可能とする核酸配列を含む。クローニングベクターにおいて、この配列は典型的にベクターが宿主染色体ＤＮＡとは独立的に複製可能とさせ、複製起源または自律的複製配列を含むものである。かかる配列は種々の細菌、酵母、およびウイルスでよく知られている。プラスミドｐＢＲ３２２由来の複製起源は、ほとんどのグラム陰性菌に適当であり、種々の起源（例えばＳＶ４０、ポリオーマ、アデノウイルス、ＶＳＶまたはＢＰＶ）は哺乳動物細胞におけるクローニングベクターに有用である。一般的に、複製成分の起源は、哺乳動物発現ベクター（例えば、ＳＶ４０起源はしばしば初期プロモーターを含む理由のみで使用される）には必要でない。選択遺伝子発現およびクローニングベクターは選択遺伝子を含み得る。この遺伝子は、選択培養培地での成育時に、形質転換宿主細胞の生存または成育に必要な「マーカー」タンパク質をコードする。ベクターで形質転換されない宿主細胞は、選択遺伝子を含まず、ゆえに培養培地で生存しない。典型的な選択遺伝子は（ａ）抗生物質または他の毒素（例えばアンピシリン、ネオマイシン、メトトレキサート、またはテトラサイクリン）に抵抗性を付与し；（ｂ）栄養要求性欠損を補足し；または（ｃ）培養培地から得られない必須栄養分を供給するタンパク質をコードする。他の選択遺伝子を使用して、発現される遺伝子を増幅し得る。増幅は、増殖に必須なタンパク質の産生に要求が高い遺伝子を、組換え細胞の連続的産生の染色体内で直列に反復したプロセスである。哺乳動物細胞の適当な選択マーカーの例は、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）およびチミジンキナーゼを含む。哺乳動物細胞形質転換体は、形質転換体のみがベクター中に存在するマーカーにより唯一生存適合する、選択圧力下に置く。選択圧力は、選択剤の培地中濃度が連続的に変化し、従って選択遺伝子およびＧＤＮＦＲをコードするＤＮＡの両方が増幅される条件下で、形質転換細胞を培養することにより課せられる。結果として、増加量のＧＤＮＦＲが増幅ＤＮＡから合成される。例えば、ＤＨＦＲ選択遺伝子で形質転換した細胞を、最初に全形質転換体を、ＤＨＦＲの競合的アンタゴニストであるメトトレキサートを含む培養培地中で培養することにより同定する。野生型ＤＨＦＲを使用した場合の適当な宿主細胞は、ＤＨＦＲ活性を欠損したチャイニーズハムスター卵巣細胞系である（例えば、ＵｒｌａｕｂおよびＣｈａｓｉｎ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ、Ｕ．Ｓ．Ａ．、７７（７）：４２１６−４２２０、１９８０参照）。次いで、形質転換細胞を増量したメトトレキサートにさらす。これにより、ＤＨＦＲ遺伝子の複数のコピー、および、同時に発現ベクターに存在する他のＤＮＡの複数のコピー（例えばＧＤＮＦＲタンパク質をコードするＤＮＡ）が合成される。プロモーター本発明の発現およびクローニングベクターは、典型的に、宿主有機体により認識され、ＧＤＮＦＲタンパク質をコードする核酸配列に機能的に結合させたプロモーターを含む。プロモーターは、ＧＤＮＦＲをコードするものなどの、特定の核酸配列の転写および翻訳を調節する構造遺伝子（一般的に約１００ｋから１０００ｂｐ内）の開始コドンに対して上流（５’）に位置する非翻訳配列である。プロモーターは、慣用的には、誘導プロモーターおよび構成プロモーターの２つのクラスの１つに該当する。誘導プロモーターは、栄養の存在または非存在または温度変化などの培養条件における変化に応答してその制御下でＤＮＡの転写レベルの増加を開始する。種々の効力のある宿主細胞により認識されるプロモーターが数多く公知である。これらのプロモーターは、ＤＮＡ源から制限酵素消化によりプロモーターを取り出し、所望のプロモーター配列をベクターに挿入することにより、ＧＤＮＦＲをコードするＤＮＡに機能的に連結させている。天然ＧＤＮＦＲプロモーター配列を用いて、ＧＤＮＦＲＤＮＡの増幅および／または発現を指向し得る。しかし、もし天然プロモーターに比較して多くの転写および高収量の発現タンパク質を可能とし、使用するために選択した宿主細胞系と相容性であるならば、異種プロモーターが好ましい。原核宿主での使用に適当なプロモーターは、ベーターラクタマーゼおよびラクトースプロモーター系；アルカリホスファターゼ、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系；およびハイブリッドプロモーター例えばｔａｃプロモーターを含む。他の公知の細菌プロモーターも適当である。そのヌクレオチド配列が刊行され、これにより当業者はそれらを、任意の必要な制限部位の供給に必要なリンカーまたはアダプターを用いて所望のＤＮＡ配列に連結させることができる。酵母宿主に使用する適当なプロモーター配列もまた当分野でよく知られている。酵母エンハンサーは、有利には酵母プロモーターと共に使用する。哺乳動物宿主細胞に使用する適当なプロモーターは、よく知られており、ポリオーマウイルス、鶏痘ウイルス、アデノウイルス（例えばアデノウイルス２）、ウシパピローマウイルス、トリサルコーマウイルス、サイトメガロウイルス、レトロウイルス、Ｂ型肝炎および最も好ましくはシミアン（Ｓｉｍｉａｎ）ウイルス４０（ＳＶ４０）などのウイルスのゲノムから得られたものを含む。他の適当な哺乳動物プロモーターは、異種哺乳動物プロモーター、例えば熱ショックプロモーターおよびアクチンプロモーターを含む。ＣＨＯ細胞においてＧＤＮＦＲタンパク質の産生に使用可能なプロモーターは、ＳＲａである（Ｔａｋｅｂｅら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．、８（１）：４６６−４７２、１９８８参照）。適当な発現ベクターは、ｐＤＳＲａ２である。適当なＧＤＮＦＲｃＤＮＡを含むｐＤＳＲａ２プラスミド構築物は、実質的に、１９９０年３月２９日出願の共有および同時係属出願中の米国特許出願番号５０１，９０４に記載のプロセスに従って調製し得る（また、１９９０年３月１８日出願、欧州特許出願番号９０３０５４３３、公開番号ＥＰ３９８７５３およびＷＯ９０／１４３６３（１９９０）も参照、この開示は引用によりここに援用する）。ＧＤＮＦＲ発現を調節する目的のさらに別のプロモーターは、以下を含むがこれに限定されない：ＳＶ４０初期プロモーター領域（ＢｅｒｎｏｉｓｔおよびＣｈａｍｂｏｎ、Ｎａｔｕｒｅ、２９０：３０４−３１０、１９８１）；ＣＭＶプロモーター；ラウスサルコーマウイルスの３’長末端反復に含まれるプロモーター（Ｙａｍａｍｏｔｏら、Ｃｅｌｌ、２２：７８７−７９７、１９８０）；ヘルペスチミジンキナーゼプロモーター（Ｗａｇｎｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、７８：１４４−１４４５、１９８１）；メタロチオネイン遺伝子の調節配列（Ｂｒｉｎｓｔｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ、２９６：３９−４２、１９８２）；β−ラクタマーゼプロモーターなどの原核発現ベクター（Ｖｉｌｌａ−Ｋａｍａｒｏｆｆら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、７５：３７２７−３７３１、１９７８）；またはｔａｃプロモーター（ＤｅＢｏｅｒらＰｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８０：２１−２５、１９８３）。その他の目的のものは、以下の動物転写調節領域であり、これは組織特性を示し、トランスジェニックマウスに使用される：膵臓小核細胞において活性なエラスターゼＩ遺伝子調節領域（Ｓｗｉｆｔら、Ｃｅｌｌ、３８：６３９−６４６、１９８４；Ｏｒｎｉｔｚら、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＳｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．５０：３９９−４０９、１９８６；ＭａｃＤｏｎａｌｄ、Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ、７：４２５−５１５、１９８７）；膵臓β細胞で活性なインシュリン遺伝子調節領域（Ｈａｎａｈａｎ、Ｎａｔｕｒｅ、３１５：１１５− １２２、１９８５）；リンパ細胞で活性な免疫グロブリン遺伝子調節領域（Ｇｒｏｓｓｃｈｅｄｌら、Ｃｅｌｌ、３８：６４７−６５８、１９８４；Ａｄａｍｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ、３１８：５３３−５３８、１９８５；Ａｌｅｘａｎｄｅｒら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．、７：１４３６−１４４４、１９８７）；精巣、乳房、リンパおよび肥満細胞で活性なマウス動物腫瘍ウイルス調節領域（Ｌｅｄｅｒら、Ｃｅｌｌ、４５：４８５−４９５、１９８６）、肝臓で活性なアルブミン遺伝子調節領域（Ｐｉｎｋｅｒｔら、ＧｅｎｅｓａｎｄＤｅｖｅｌ、１：２６８−２７６、１９８７）；肝臓で活性なα−フェトプロテイン遺伝子調節領域（Ｋｒｕｍｌａｕｆら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．、５：１６３９−１６４８、１９８５；Ｈａｍｍｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２３５：５５３−５８、１９８７）；肝臓で活性なα１−抗トリプシン遺伝子調節領域（Ｋｅｌｓｅｙら、ＧｅｎｅｓａｎｄＤｅｖｅｌ．、１：１６１−１７１、１９８７）；骨髄細胞で活性なβ−グロビン遺伝子調節領域（Ｍｏｇｒａｍら、Ｎａｔｕｒｅ、３１５：３３８−３４０、１９８５；Ｋｏｌｌｉａｓら、Ｃｅｌｌ、４６：８９−９４、１９８６）；脳のオリゴデンドロサイト細胞において活性なミエリン塩基性タンパク質遺伝子調節領域（Ｒｅａｄｈｅａｄら、Ｃｅｌｌ、４８：７０３−７１２、１９８７）；骨格筋で活性なミオシン軽鎖−２遺伝子調節領域（Ｓａｎｉ、Ｎａｔｕｒｅ、３１４：２８３−２８６、１９８５）；および視床下部で活性なゴナドトロピン放出ホルモン遺伝子調節領域（Ｍａｓｏｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３４：１３７２−１３７８、１９８６）。エンハンサーエレメントエンハンサー配列をベクターに挿入し、より高等真核細胞による、本発明のＧＤＮＦＲタンパク質をコードするＤＮＡ配列の転写を増加させ得る。エンハンサーは、ＤＮＡのシス作用エレメントであり、通常約１０−３００ｂｐ長で、プロモーターに作用してその転写を増加させる。エンハンサーは比較的配向および位置独立性である。それらは転写単位の５’および３’に見られる。哺乳動物遺伝子から入手できるいくつかのエンハンサー配列が公知である（例えば、グロビン、エラスターゼ、アルブミン、α−フェエト−タンパク質およびインシュリン）。典型的には、しかし、ウイルス由来のエンハンサーを使用する。ＳＶ４０エンハンサー、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、ポリオーマエンハンサー、およびアデノウイルスエンハンサーは、真核細胞プロモーターの活性化における例示的亢進エレメントである。エンハンサーをＧＤＮＦＲＤＮＡの５’または３ ’位でベクターにスプライシングし得るが、それは典型的にプロモーターから５ ’部位に位置する。転写終結真核宿主細胞に使用する発現ベクター（他の多細胞有機体由来の酵母、菌、昆虫、植物、動物、ヒト、または有核細胞）はまた、転写終結およびｍＲＮＡを安定化させるために必要な配列を含む。かかる配列は共通して真核ＤＮＡまたはｃＤＮＡの５’および時に３’非翻訳領域から得られる。これらの領域は、ＧＤＮＦＲをコードするｍＲＮＡの非翻訳部分におけるポリアデニル化フラグメントとして転写したヌクレオチド断片を含む。１つ以上の上記の成分を、所望のＧＤＮＦＲコード配列と共に含む適当なベクターの構築は、標準的な連結法により達成される。単離プラスミドまたはＤＮＡフラグメントを、開裂し、尾部をつけ、所望の順序で再度連結させ、必要なプラスミドを産生する。正しい配列が構築されたことを確認するために、連結混合物を用いて大腸菌を形質転換し、成功した形質転換体を、上記した例えばアンピシリンまたはテトラサイクリン抵抗性などの公知の技術により選択し得る。次いで、形質転換体からのプラスミドを調製し、制限エンドヌクレアーゼ消化により分析し、および／または配列決定し所望の構築物を確認し得る。哺乳動物細胞におけるＧＤＮＦＲをコードするＤＮＡの一過性発現を提供するベクターを使用し得る。一般的に、一過性発現は、宿主細胞で効果的に複製できる発現ベクターの使用を含み、宿主細胞は発現ベクターの多くのコピーを蓄積し、代わって、発現ベクターによりコードされる所望のタンパク質を高レベルで合成する。適当な発現ベクターおよび宿主細胞を含む一過性発現系により、クローン化ＤＮＡによりコードされるタンパク質の簡便な同定、並びに所望の生物学的または生理学的特性に関してかかるタンパク質を急速にスクリーニングすることが可能となる。従って、一過性発現系はタンパク質変異体の同定に特に有用である。宿主細胞の選択および形質転換組換えＧＤＮＦＲタンパク質の発現に使用するために核酸配列で形質転換した宿主細胞（例えば、細菌、哺乳動物、昆虫、酵母または植物細胞）もまた本発明により提供される。形質転換宿主細胞は、核酸配列の発現が可能な適当な条件下で培養する。適当な宿主細胞の選択および形質転換、培養、増幅、スクリーニングおよび産物産生および精製法は、当分野でよく知られている。例えば、ＧｅｔｈｉｎｇａｎｄＳａｍｂｒｏｏｋ、Ｎａｔｕｒｅ、２９３：６２０ −６２５（１９８１）、または別にＫａｕｆｍａｎら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．、５（７）：１７５０−１７５９（１９８５）またはＨｏｗｌｅｙら、米国特許第４，４１９，４４６号参照。追加の例示的物質および方法を本明細書で議論する。形質転換宿主細胞を適当な培地で培養し、次いで、発現ＧＤＮＦＲタンパク質を任意に、培養培地から（またはもし細胞内的に発現されていれば細胞から）当業者に公知の適当な方法を用いて回収、単離および精製する。異なる宿主細胞はタンパク質の翻訳および翻訳後プロセシングおよび修飾（例えばグリコシル化、開裂）に関して特徴的および特異的機構を有する。適当な細胞系または宿主系を選択して、発現される外来タンパク質の所望の修飾およびプロセシングを確認することができる。例えば、細菌系での発現を用いて、非グリコシル化コアタンパク質産物を産生し得る。酵母における発現を用いて、グリコシル化産物を産生し得る。哺乳動物での発現を用いて異種ＧＤＮＦＲタンパク質の「天然」グリコシル化を確認できる。さらに、異なるベクター／宿主発現系は、種々の範囲で原核細胞開裂などのプロセシング反応を奏効し得る。本明細書で開示したベクターをクローニングまたは発現する適当な宿主細胞は、原核細胞、酵母、または高等真核細胞である。糸状菌または酵母などの真核微生物が、ＧＤＮＦＲタンパク質を発現する適当な宿主であり得る。サッカロマイセスセレビジアエ、または共通のベーカー酵母菌は、低級真核宿主微生物の間で最も一般的に使用されているが、数多くの他の属、種、および株がよく知られており一般に入手できる。グリコシル化ＧＤＮＦＲタンパク質の発現に使用される宿主細胞はまた、多細胞生物体から誘導される。かかる宿主細胞は、プロセシングおよびグリコシル化活性を複合できる。原則的に、培養物が脊椎または非脊椎細胞（植物および昆虫細胞を含む）を含むかにより、任意の高等真核細胞培養物も使用し得る。培養（組織培養）における脊椎細胞の増殖は、よく知られた方法である。有用な哺乳動物宿主細胞系の例は、ＳＶ４０により形質転換されたサル腎臓ＣＶ１系（ＣＯＳ７）、ヒト胚腎臓系（懸濁培養における増殖にサブクローニングされた２９３または２９３細胞）、ベビーハムスター腎臓細胞、およびチャイニーズハムスター卵巣細胞を含むがこれに限定されない。他の適当な哺乳動物細胞系は、ＨｅＬａ、マウスＬ−９２９細胞、Ｓｗｉｓｓ、Ｂａｌｂ−ｃまたはＮＩＨマウス由来３Ｔ３系、ＢＨＫまたはＨａＫハムスター細胞系を含むがこれに限定されない。適当な宿主細胞はまた、原核細胞を含む。原核宿主細胞は、細菌細胞、例えばグラム陰性またはグラム陽性生物体、例えば大腸菌、枯草菌などの桿菌、シュードモナス種、例えば緑膿菌、ネズミチフス菌、または霊菌を含むがこれに限定されない。例えば、種々の大腸菌（例えば、ＨＢ１０１、ＤＨ５ａ、ＤＨ１０、およびＭＣ１０６１）が、バイオテクノロジーの分野で宿主細胞としてよく知られている。種々のストレプトマイセス属の株等もまた使用し得る。ＧＤＮＦＲタンパク質産生に本明細書で好ましい宿主細胞は、細菌細胞（例えば大腸菌）および哺乳動物細胞（例えばチャイニーズハムスター卵巣細胞、ＣＯＳ細胞等）である。宿主細胞をトランスフェクトさせ、好ましくは上記の発現またはクローニングベクターで形質転換させ、慣用的な栄養培地で培養する。培地は、プロモーターの誘導、形質転換体の選択、または所望の配列をコードする遺伝子の増幅に適当に修飾し得る。トランスフェクションおよび形質転換は、当業者によく知られ、関与する宿主細胞に適当に選択した標準的な技術を用いて実施する。例えば、細胞壁のない哺乳動物細胞では、リン酸カルシウム沈降法を使用し得る。電気穿孔、マイクロインジェクションおよび他の公知の技術も使用し得る。宿主細胞の培養本発明のＧＤＮＦＲタンパク質の産生に使用した形質転換細胞を、適当な培地中で培養する。培地に、必要であれば、ホルモンおよび／または他の増殖因子（例えば、インシュリン、トランスフェリン、または上皮増殖因子）、塩（例えば、塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウム、およびリン酸）、緩衝液（例えばＨＥＰＥＳ）、ヌクレオシド（例えばアデノシンおよびチミジン）、抗体（例えばゲンタマイシン）、微量元素（通常マイクロモルの範囲の最終濃度で存在する無機化合物として定義する）、およびグルコースまたは他のエネルギー源を補足し得る。他の補足物もまた、当業者により理解される適当な濃度で含み得る。選択した宿主細胞での使用に適当な培養条件、例えば温度、ｐＨ等もまた当業者によりよく知られている。ＧＤＮＦＲタンパク質を産生すれば、クロマトグラフィー（例えば、イオン交換、アフィニティー、およびサイズカラムクロマトグラフィー）、遠心、溶解度の差を含む標準的な方法、またはタンパク質精製の任意の他の標準的な技術により単離および精製し得る。例えば、ＧＤＮＦＲ−αタンパク質は、固定支持体に結合させたＧＤＮＦまたは抗−ＧＤＮＦＲ−α抗体を含むアフィニティーカラムに結合させることにより単離し得る。同様に、ＧＲＲ２タンパク質は、固定支持体に結合させたニューチュリンまたは抗−ＧＲＲ２抗体を含むアフィニティーカラムに結合させることにより単離し得る。相同的組換えＧＤＮＦＲタンパク質は相同的組換えにより、またはすでにＧＤＮＦＲをコードするＤＮＡを含む細胞に導入した調節エレメントを用いた組換え産生法を用いて産生され得ると考えられる。例えば、相同的組換え法を用いて、正常な転写性サイレントＧＤＮＦＲ遺伝子または低発現遺伝子を含む細胞を修飾し、よってＧＤＮＦＲを発現する細胞を産生し得る。相同的組換えは、転写活性遺伝子における変異を誘導または修正する遺伝子を標的化するために元来開発された技術である（Ｋｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉ、Ｐｒｏｇ．ｉｎＮｕｃｌ．ＡｃｉｄＲｅｓ．およびＭｏｌ．Ｂｉｏｌ、３６：３０１、１９８９）。基本的な技術が、特異的変異を哺乳動物ゲノムの特定領域に導入する方法として（Ｔｈｏｍａｓら、Ｃｅｌｌ、４４：４１９−４２８、１９８６；ＴｈｏｍａｓおよびＣａｐｅｃｃｈｉ、Ｃｅｌｌ、５１：５０３−５１２、１９８７；Ｄｏｅｔｓｃｈｍａｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、８５：８５８３−８５８７、１９８８）、または欠損遺伝子内の特異的変異を修正するために開発された（Ｄｏｅｔｓｃｈｍａｎら、Ｎａｔｕｒｅ、３３０：５７６−５７８、１９８７）。相同的組換え技術の例は、Ｕ．Ｓ．５，２７２，０７１（ＥＰ９１９０３０５１、ＥＰ公開番号５０５５００；ＰＣＴ／ＵＳ９０／０７６４２、国際公開番号ＷＯ９１／０９９５５）に記載され、その開示は引用してここに援用する。相同的組換えにより、ゲノムに挿入するＤＮＡ配列を、標的ＤＮＡに結合させることにより目的の遺伝子の特定領域に指向化できる。標的ＤＮＡは、ゲノムＤＮＡの領域に相補的（相同）なＤＮＡである。ゲノムの特定領域に相補的な標的ＤＮＡの小片を、ＤＮＡ複製プロセスの間、親鎖と接触させる。ハイブリダイズし、よって、共有相同領域を通して内因性ＤＮＡの他の部分と再度結合するのは、細胞に挿入されたＤＮＡの一般的特徴である。この相補鎖がＤＮＡの変異または異なる配列を含むオリゴヌクレオチドと結合すれば、組換えの結果として新規に合成された鎖に組み込まれる。校正機能の結果として、ＤＮＡの新規配列を鋳型として使用することが可能である。従って、転移ＤＮＡがゲノムに取り込まれる。特定の遺伝子の配列が知られていれば（例えば、本明細書で提示したＧＤＮＦＲの核酸配列、配列前後、または発現調節配列）、遺伝子の選択領域に相補的なＤＮＡ片を、例えば目的の領域に結合する特異的認識部位での天然ＤＮＡの適当な制限により合成または得ることができる。この片は、細胞への挿入時に標的配列として作用し、ゲノム内の相同領域にハイブリダイズする。このハイブリダイゼーションがＤＮＡ複製間に起これば、このＤＮＡ片、およびそれに結合した任意の追加的配列は、Ｏｋａｚａｋｉフラグメントとして作用し、新規に合成されたＤＮＡの娘鎖に逆戻りする。標的ＤＮＡのこれらの断片に結合したものは、ＧＤＮＦＲタンパク質の発現と相互作用し得るＤＮＡ領域である。例えば、プロモーター／エンハンサーエレメント、サプレッサー、または外因性転写調節エレメントを、所望のＧＤＮＦＲタンパク質をコードするＤＮＡの転写に影響を与えるに十分な近接度および配向性で目的の宿主細胞のゲノムに挿入する。調節エレメントはＧＤＮＦＲをコードしないが、代わりに宿主細胞ゲノムに存在するＤＮＡの一部を調節する。従って、ＧＤＮＦＲタンパク質の発現は、ＤＮＡのＧＤＮＦＲ遺伝子自体をコードするＤＮＡのトランスフェクションによるのではなく、むしろＧＤＮＦＲタンパク質の認識可能な転写シグナルと共にの内因性遺伝子配列を提供するＤＮＡ調節セグメントと結合した標的ＤＮＡ（目的の内因性遺伝子との相同性領域を含む）の使用により達成され得る。Ａ．ＧＤＮＦＲ変異体上記で議論したように、本明細書で使用する「ＧＤＮＦＲ類似体」という用語は、図に示したものを含む天然に存在するＧＤＮＦＲポリペプチドのアミノ酸配列内で、アミノ酸が（「欠失変異体」）から欠失し、（「付加変異体」）に挿入し、または（「置換変異体」）残基で置換したポリペプチドを含む。かかる変異体は、適当なヌクレオチド変化をポリペプチドをコードするＤＮＡに導入することにより、または所望のポリペプチドのインビトロ化学合成により調製する。最終分子がＧＤＮＦＲ活性を有するならば、欠失、挿入、および置換の多くの組合せを、成熟ヒトＧＤＮＦＲなどのアミノ酸配列に施し得ることは当業者により理解されるだろう。多種由来の特定のＧＤＮＦＲ−α、ＧＲＲ２およびＧＲＲ３アミノ酸配列の本記載並びに、それから誘導した共通配列に基づき、図に示したものとは１つ以上の残基の同一性または位置の点で異なる一次構造を有するポリペプチドの組換え（例えば細菌）発現における使用に適当な種々の核酸配列を容易に設計および製造できる。図２および４に示す核酸配列によりコードされる１つ以上の選択したアミノ酸残基の置換、挿入または欠失の突然変異誘発は、当業者にはよく知られている（例えば、米国特許第４，５１８，５８４号、その開示は引用してここに援用する）。置換変異体の構築において２つの原則的に可変なものは、変異部位の位置および変異の性質である。ＧＤＮＦＲ置換変異体の設計において、変異部位の選択および変異の性質は、修飾するＧＤＮＦＲの特性による。変異の部位は、例えば（１）最初に保存的アミノ酸修飾物で置換し、次いで、得られた結果により根本的な選択物で置換し、（２）標的アミノ酸残基を削除し、または（３）位置する部位に隣接したアミノ酸残基を挿入することにより、個々にまたは連続して修飾できる。１−３０連続アミノ酸の保存的変化が好ましい。Ｎ−末端およびＣ−末端欠失ＧＤＮＦＲタンパク質変異体もまたタンパク質分解酵素により産生し得る。ＧＤＮＦＲ欠失変異体において、欠失は、一般的に、約１−３０連続残基、より通常には約１−１０連続残基および典型的には約１−５連続残基の範囲である。Ｎ−末端、Ｃ−末端および内部配列内欠失が考えられる。欠失は、非−ヒトＧＤＮＦＲと相同性の低い分子の領域に導入し、ＧＤＮＦＲの活性を修飾し得る。非−ヒトＧＤＮＦＲ配列と大きな相同性がある領域での欠失は、ＧＤＮＦＲの生物学的活性を大きく修飾するようである。連続欠失数は、典型的に、影響を受けるドメインにおけるＧＤＮＦＲタンパク質産物の３次構造、例えばシステイン架橋を保持するように選択する。欠失変異体の非制限的な例は、Ｎ−末端またはＣ −末端アミノ酸残基を欠失する切形ＧＤＮＦＲタンパク質産物を含む。例えば、ＧＤＮＦＲレセプターの細胞質膜へのグリコシル−ホスファチジルイノシトール（ＧＩＰ）固定に関与するペプチド領域の削除により可溶性レセプターを調製し得る。ＧＤＮＦＲ付加変異体において、アミノ酸配列付加は典型的に、１残基から１００以上の残基を含むポリペプチド長の範囲のＮ−および／またはＣ−末端融合または末端付加、並びに単一または複数アミノ酸残基の内部または中部付加を含む。本発明のポリペプチドは、開始メチオニンアミノ酸残基を（所望のポリペプチドの最初のアミノ酸残基に関して−１位に）含み得る。内部付加は、一般的に、約１−１０連続残基、より典型的には約１−５残基、および通常約１−３アミノ酸残基の範囲であり得る。Ｎ−末端付加変異体の例は、異種Ｎ−末端シグナル配列がＧＤＮＦＲのＮ−末端に封入されたＧＤＮＦＲを含み、組換え宿主細胞からの成熟ＧＤＮＦＲの分泌を促進し、よって収量またはバイオアベイラビリティーを高める。かかるシグナル配列は、一般的に、目的の宿主細胞種から得られ、従って、それに相同的である。付加はまた他の神経栄養因子の配列から誘導されたアミノ酸配列を含み得る。例えば、ＧＤＮＦおよびＧＤＮＦＲ−α、またはニューチュリンおよびＧＲＲ２の融合タンパク質は、連結配列と共にまたは無しで産生され得、よって単一分子治療体を形成すると考えられる。ＧＤＮＦＲ置換変異体は、除去されたＧＤＮＦＲアミノ酸配列およびその場所に挿入された異なる残基の１つ以上のアミノ酸残基を有する。かかる置換変異体は、対立遺伝子変異体を含み、アミノ酸変化を引き起こし得るまたは得ない種の集合における、天然に存在するヌクレオチド配列変化を特徴とする。他の変異体形と同様に、置換変異体は、１つ以上の異なる位置における単一または連続アミノ酸残基の置換を含み得る。ＧＤＮＦＲアミノ酸配列の特異的変異は、グリコシル化部位（例えば、セリン、トレオニン、またはアスパラギン）への修飾を含み得る。グリコシル化の不在または部分的グリコシルは、任意のアスパラギン−結合グリコシル化認識部位またはＯ−結合炭水化物の付加により修飾される任意の分子の部位におけるアミノ酸置換または欠失から生じる。アスパラギン−結合グリコシル化認識部位は、適当な細胞グリコシル化酵素により特異的に認識されるトリペプチド配列を含む。これらのトリペプチド配列は、Ａｓｎ−Ｘａａ−Ｔｈｒ、またはＡｓｎ−Ｘａａ −Ｓｅｒ（ただし、ＸａａはＰｒｏ以外の任意のアミノ酸であり得る）である。グリコシル化認識部位の第１または第３アミノ酸位置の一方または両方における種々のアミノ酸置換または欠失（および／または第２位におけるアミノ酸欠失）により、修飾トリペプチド配列に非グリコシル化を受ける。従って、適当な変化ヌクレオチド配列の発現は、この部位でグリコシル化されない変異体を産生する。また、ＧＤＮＦＲアミノ酸配列は修飾を受け、グリコシル化部位が加わり得る。突然変異誘発ＧＤＮＦＲアミノ酸残基または領域を同定する１つの方法は、ＣｕｎｎｉｎｇｈａｍおよびＷｅｌｌｓにより記載（Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４４：１０８１−１０８５、１９８９）の「アラニン走査突然変異誘発」と呼ばれる。この方法では、標的残基のアミノ酸残基または群が同定され（例えば、Ａｒｇ、Ａｓｐ、Ｈｉｓ、ＬｙｓおよびＧｌｕなどの荷電残基）、中性または陰性荷電アミノ酸（最も好ましくはアラニンまたはポリアラニン）により置換され、細胞の内外で周辺の水性環境とアミノ酸との相互作用に影響を与える。次いで、置換基に対してこれらのドメインが示す機能的感受性は、置換部位に付加または別の残基を導入することにより亢進され得る。従って、アミノ酸配列変異を導入する標的部位を決定し、アラニン探索またはランダム突然変異を、ＤＮＡ配列の対応する標的コドンまたは領域上で行い、発現されたＧＤＮＦＲ変異体を所望の活性および活性度の最適の組合せに関してスクリーニングする。置換突然変異の最大の目的の部位は、種々の種由来のＧＤＮＦＲタンパク質に認められるアミノ酸が側鎖の容積、荷電、および／または疎水性の点で実質的に異なる部位を含む。目的の他の部位は、種々の種から得られたＧＤＮＦＲ様タンパク質の特定の残基が同一であるものである。かかる位置は、タンパク質の生物学的活性に一般的に重要である。始めに、これらの部位を比較的保守的な方法で置換する。かかる保守的置換を、好ましい置換基の題名で表２に示す。かかる置換が生物学的活性を変化させれば、次いで、より実質的な変化（例示的置換基）が導入され得、および／または他の付加または欠失を施し得、得られた産物は活性スクリーニングする。アミノ酸配列に対する保存的修飾（およびコード核酸配列に対する対応する修飾）は、天然に存在するＧＤＮＦＲと類似した機能的および化学的特性を有するＧＤＮＦＲタンパク質産物を産生することが予測される。対照的に、ＧＤＮＦＲタンパク質産物の機能および／または化学的特徴の実質的修飾は、（ａ）置換領域におけるポリペプチド骨格の構造、例えばシートまたはラセンコンフォメーション、（ｂ）標的部位における分子の荷電または疎水性、または（ｃ）側鎖の容積を維持する効果が大きく異なる置換基を選択することにより達成され得る。天然に存在する残基は、共通側鎖特性に基づき群に分け得る：１）疎水性：ノルロイシン、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ；２）中性親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ；３）酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ；４）塩基性：Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ；５）鎖の配向性に影響を与える残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ；および６）芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ。非保存的置換は、これらのクラスの１つのメンバーの、別のクラスのメンバーとの交換を含み得る。かかる置換残基は、非−ヒトＧＤＮＦＲタンパク質と相同的なヒトＧＤＮＦＲタンパク質の領域に、または分子の非−相同領域に導入し得る。従って、ＧＤＮＦＲタンパク質は、図に示したアミノ酸配列の全部または一部、並びに共通および修飾配列を含む生物学的に活性な分子を含み、生物学的に等価なアミノ酸残基は、配列内で、サイレントな変化が起こる残基で置換する。例えば、配列内の１つ以上のアミノ酸残基を、機能性等価体として作用する類似の極性を有する別のアミノ酸で置換でき、サイレント変化が生じる。配列内でのアミノ酸の置換は、アミノ酸が属する他のクラスのメンバーから選択し得る。例えば、非極性（疎水性）アミノ酸は、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファンおよびメチオニンを含む。極性中性アミノ酸は、グリシン、セリン、トレオニン、システイン、チロシン、アスパラギンおよびグルタミンを含む。正に荷電した（塩基正）アミノ酸は、アルギニン、リジンおよびヒスチジンを含む。負に荷電した（酸性）アミノ酸は、アスパラギン酸およびグルタミン酸を含む。また、ＧＤＮＦＲタンパク質、類似体、またはそのフラグメントまたは誘導体は、翻訳中または後、例えば、リン酸化、グリコシル化、架橋、アシル化、タンパク質分解開裂、抗体分子、膜分子または他のリガンドへの結合により、異なって修飾され得る。Ｂ．ＧＤＮＦＲ誘導体ＧＤＮＦＲまたはＧＤＮＦＲ類似体の化学的修飾誘導体は、当業者により本開示に基づき製造され得る。誘導体化に最も適当な化学部分は、水溶性ポリマーを含む。水溶性ポリマーは、結合するタンパク質が生理学的環境などの水性環境では沈殿しないため、望ましい。好ましくは、ポリマーは、治療産物または組成物の製造において医薬的に許容される。ポリマー／タンパク質コンジュゲートを治療に使用するかの考察、もしそうであれば、望ましい用量、循環時間、タンパク質加水分解に対する抵抗性、および他の考察に基づいて、当業者は望ましいポリマーを選択できる。誘導体化の効果は、望ましい形で（例えば、浸透ポンプにより、またはより好ましくは、注射または注入により、またはさらに経口、経肺または他の送達経路により）誘導体を投与し、その効果を測定することにより確認され得る。適当な水溶性ポリマーは、ポリエチレングリコール、エチレングリコール／プロピレングリコールのコポリマー、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリ−１，３−ジオキソラン、ポリ−１，３，６−トリオキサン、エチレン／無水マレイン酸コポリマー、ポリアミノ酸（ホモポリマーまたはランダムコポリマーのいずれか）、およびデキストランまたはポリ（ｎ−ビニルピロリドン）ポリエチレングリコール、プロプロピレングリコールホモポリマー、プロリプロピレンオキシド／エチレンオキシドコポリマー、ポリオキシエチレン化ポリオール（例えば、グリセロール）、ポリビニルアルコール、およびその混合物を含むがこれに限定されない。ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒドは、水中での安定性により製造利点を有し得る。ポリマーは、任意の分子量であり得、分枝または非分枝であり得る。ポリエチレングリコールにおいて、好ましい分子量は、取扱および製造が容易なことから、約２ｋＤａないし約１００ｋＤａである（「約」という用語は、ポリエチレングリコールの製造において、いくつかの分子は記載の分子量より多い、または少ないことを示す）。所望の治療プロフィール（例えば、望む持続放出時間；もしあれば生物学的活性の効果；扱い易さ；抗原性度またはその欠失およびポリエチレングリコールの治療タンパク質または変異体に対する他の公知の効果）により、他のサイズを使用し得る。結合したポリマー分枝の数は変化し得、当業者は機能の効果を確認できる。モノ誘導体化、または同じまたは異なる化学部分（例えば、異なる分子量のポリエチレングリコールなどのポリマー）を用いたジ−、トリ−、テトラ−またはいくつかの組合せの誘導体化を提供し得る。ポリマー分子のタンパク質（またはペプチド）分子に対する比率は、その反応混合物中での濃度が変化するように変化する。一般的に、最適比（全く過剰の末反応タンパク質またはポリマーが存在しない反応の効率の点から）を、所望の誘導体化度（例えば、モノ、ジ−、トリ−等）、分泌されるポリマーの分子量、ポリマーは分枝または非分枝か、および反応条件などの因子により決定する。ポリエチレングリコール分子（または他の化学部分）を、タンパク質の機能または抗原ドメイン上への効果を考慮してタンパク質に結合させる。当業者に利用可能な数多くの結合法がある。例えばＥＰ０４０１３８４参照、この開示は引用してここに援用する（ＰＥＧのＧ−ＣＳＦへのカップリング）、またＭａｌｉｋら、Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ．、２０：１０２８−１０３５、１９９２（塩化トレシルを用いたＧＭ−ＣＳＦのペギレーション報告）参照。例えば、ポリエチレングリコールは、遊離アミノまたはカルホキシ基などの反応性基を介してアミノ酸残基を通して共有結合させ得る。反応性基は、活性化ポリエチレングリコール分子が結合し得るような基である。遊離アミノ基を有するアミノ酸残基は、リジン残基およびＮ−末端アミノ酸残基を含み得る。遊離カルボキシ基を有するものは、アルパラギン酸残基、グルタミン酸残基、およびＣ−末端アミノ酸残基を含み得る。スルフヒドリル基もまた、ポリエチレングリコール分子を結合させる反応性基として使用し得る。治療目的のために、アミノ基における結合、例えばＮ −末端またはリジン基での結合が好ましい。レセプター結合に重要な残基での結合は、レセプター結合が望ましいならば回避する。特に、Ｎ−末端化学修飾タンパク質を所望し得る。ポリエチレングリコールを本組成物の例示として用いて、種々のポリエチレングリコール分子（分子量、分枝等により）から、反応混合物におけるポリエチレングリコール分子のタンパク質（またはペプチド）に対する比率、実施するペギレーション反応の型、および選択したＮ−末端ペギレーション化タンパク質を得る方法を選択し得る。Ｎ−末端ペギレーション調製物を得る方法（すなわち、この部分を他のモノペギレーション部分から必要であれば分離する）は、ペギレーションタンパク質分子の集合からのＮ−末端ペギレーション物質の精製であり得る。選択的Ｎ−末端化学修飾は、特定のタンパク質における誘導体化に利用できる一次アミノ基（リジン対Ｎ−末端）の異なる型の異なる反応性を活用した還元アルキル化により達成され得る。適当な反応条件下、ポリマーを含むカルボニル基を用いたＮ−末端におけるタンパク質の実質的に選択的な誘導体化が達成される。例えば、リジン残基のｅ−アミノ基およびタンパク質のＮ−末端残基のａ−アミノ基間でのｐＫａの差を利用できるｐＨで反応を実施することにより選択的にタンパク質をＮ−末端ペギレーションし得る。かかる選択的誘導体化により、水溶性ポリマーのタンパク質への結合を調節する：ポリマーとのコンジュゲートは、優先的にタンパク質のＮ−末端で起こり、リジン側鎖アミノ基などの他の反応性基の修飾が全く有意に生じない。還元的アルキル化を用いて、水溶性ポリマーは上記した型であり得、タンパク質へのカップリングのために単一の反応性アルデヒドを有する。単一の反応性アルデヒドを含むポリエチレングリコールプロピオンアルデヒドを使用し得る。本発明は、少なくとも１つのポリエチレングリコール分子に結合させた原核細胞−発現ＧＤＮＦＲタンパク質またはその変異対である誘導体の使用、並びにアシルまたはアルキル結合により１つ以上のポリエチレングリコール分子に結合したＧＤＮＦＲタンパク質、またはその変異体の使用を含む。ペギレーションは、当分野で公知の任意のペギレーション反応により実施し得る。例えば、ＦｏｃｕｓｏｎＧｒｏｗｔｈＦａｃｔｏｒｓ、３（２）：４ −１０、１９９２；ＥＰ０１５４３１６参照、この開示は引用によりここに援用する：ＥＰ０４０１３８４；およびペキレーションに関連する本明細書に記載の他の刊行物。ペキレーションは、アシル化反応によりまたはアルキル化反応により、反応性ポリエチレングリコール分子（または類似反応性水溶性ポリマー）を用いて実施し得る。アシル化によるペギレーションは、一般的に、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）の活性エステル誘導体とＧＤＮＦＲタンパク質または変異体との反応を含む。任意の公知または次いで発見された反応性ＰＥＧ分子を用いて、ＧＤＮＦＲタンパク質または変異体のペギレーションを実施し得る。好ましい活性化ＰＥＧエステルは、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）にエステル化されたＰＥＧである。本明細書で使用するように、「アシル化」という用語は、治療タンパク質とＰＥＧなどの水溶性ポリマーとの間に以下の型の結合を制限なく含むと考える：アミド、カルバメート、ウレタン等。ＢｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅＣｈｅｍ．、５：１３３−１４０、１９９４参照。反応条件は、ペギレーション分野で公知の任意のものまたは後に開発されたものから選択し得るが、修飾するＧＤＮＦＲまたは変異体を不活性化する温度、溶媒およびｐＨなどの条件は避ける。アシル化によるペギレーションは、一般的に、ポリ−ペギレート化ＧＤＮＦＲタンパク質または変異体を生じる。好ましくは、連結結合はアミドである。また好ましくは、得られた産物は、実質的に唯一（例えば＞９５％）モノ、ジ−またはトリ−ペギレート化される。しかし、高度のペキレーションを有する種が、使用する特定の反応条件による量で形成され得る。所望であれば、より精製したペギレート化種を混合物から、特に非反応種から、標準的な精製法（とりわけ、透析、塩析、限外濾過、イオン−交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィーおよび電気穿孔を含む）により分離し得る。アルキル化によるペギレーションは、一般的に、ＰＥＧの末端アルデヒド誘導体をＧＤＮＦＲタンパク質または変異体と、還元剤の存在下で反応させることを含む。アルキル化によるペギレーションにより、ポリ−ペギレートＧＤＮＦＲタンパク質または変異体を得ることができる。さらに、ＧＤＮＦＲタンパク質または変異体のＮ−末端のａ− アミノ基でのみ実質的にペギレーションが起こる（すなわち、モノ−ペギレート化タンパク質）反応条件を操作することができる。モノペギレーションまたはポリペキレーションのどちらの場合でも、ＰＥＧ基は好ましくは−ＣＨ₂−ＮＨ− 基を介してタンパク質に結合する。特に−ＣＨ₂−基に関して、この型の結合は本明細書で「アルキル」結合と呼ぶ。モノペギレート化産物を産生する還元的アルキル化による誘導体化は、誘導体化に利用できる一次アミノ基（リジン対Ｎ−末端）の異なる型の異なる反応性を活用する。反応は、リジン残基のｅ−アミノ基の間およびタンパク質のＮ−末端残基のａ−アミノ基の間のｐＫａ差を利用可能なｐＨで実施する。かかる選択的誘導体化により、アルデヒドなどの反応性基を含む水溶性ポリマーのタンパク質への結合が調節される：ポリマーとのコンジュゲートはタンパク質のＮ−末端で優先的に起こり、リジン側鎖アミノ基などの他の反応性基の有意な修飾は全く起こらない。１つの重要な態様において、本発明は、モノポリマー／ＧＤＮＦＲタンパク質（または変異体）コンジュゲート分子（ポリマー分子が実質的に単一の位置にのみ結合している（すなわち、＞９５％）ＧＤＮＦＲタンパク質または変異体）の実質的に相同な調製物の使用を含む。より具体的には、ポリエチレングリコールを使用すれば、本発明はまた、あるいは抗原結合を欠失し、直接ＧＤＮＦＲタンパク質または変異体に結合したポリエチレングリコール分子を有する、ペギレート化ＧＤＮＦＲタンパク質または変異体の使用を含む。従って、本発明に記載のＧＤＮＦＲタンパク質産物は、ＰＥＧ基がアシルまたはアルキル基を介して結合している、ペギレート化ＧＤＮＦＲタンパク質または変異体を含む。上記で議論したように、かかる産物はモノ−ペギレート化またはポリ−ペギレート化し得る（例えば、２−６、および好ましくは２−５、ＰＥＧ基を含む）。ＰＥＧ基は、一般的に、アミノ酸のａ−またはｅ−アミノ基でタンパク質に結合するが、ＰＥＧ基は、タンパク質に結合した任意のアミノ基（適当な反応条件下でＰＥＧ基に結合するに十分な程活性である）に結合できることが考えられる。アシル化およびアルキル化法の両方で使用するポリマー分子は、上記した水溶性ポリマーから選択し得る。選択したポリマーを、アシル化の活性エステルまたはアルキル化のアルデヒドなどの単一の反応性基を有するように修飾し、好ましくは重合度を本法で提供したように調節し得る。反応性ＰＥＧアルデヒドの例は、ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒド（これは水に安定である）、またはそのモノＣ１−Ｃ１０アルコキシまたはアリールオキシ誘導体である（米国特許第５，２５２，７１４号参照）。ポリマーは分枝または非分枝であり得る。アシル反応において、選択したポリマーは単一の反応性エステル基を有する。本還元アルキル化において、選択したポリマーは、単一の反応性アルデヒド基を有する。一般的に、水溶性ポリマーは、天然に存在するグリコシル残基から選択されない。なぜなら、これらは通常より簡便には哺乳動物組換え発現系により作製されているためである。ポリマーは任意の分子量であり得、分枝または非分枝であり得る。本明細書で使用する水溶性ポリマーの例は、ボリエチレングリコールである。本明細書で使用した、ポリエチレングリコールは、モノ（Ｃ１−Ｃ１０）アルコキシ−またはアリールオキシ−ポリエチレングリコールなどの他のタンパク質を誘導体化するために使用する任意の形のＰＥＧを含むことを意味する。一般的に、化学的誘導体化は、生物学的活性物質と活性化ポリマー分子の反応に使用する任意の適当な条件下で実施し得る。ペギレート化ＧＤＮＦＲタンパク質産物の製造法は、一般的に、（ａ）タンパク質が１つ以上のＰＥＧ基に結合するような条件下で、ＧＤＮＦＲタンパク質産物をポリエチレングリコール（例えばＰＥＧの反応性エステルまたはアルデヒド誘導体）と反応させ、および（ｂ）反応産物を得る段階を含む。一般的に、アシル化反応の最適反応条件は、既知のパラメーターおよび所望の結果により場合によって決定する。例えば、ＰＥＧ：タンパク質の比が大きくなればなる程、ポリーペギレート化産物の比も高くなる。実質的に均一な集合のモノ−ポリマー／ＧＤＮＦＲタンパク質産物を産生する還元的アルキル化は、一般的に、（ａ）ＧＤＮＦＲタンパク質または変異体を反応性ＰＥＧ分子と、還元的アルキル化条件下、該ＧＤＮＦＲタンパク質または変異体のアミノ末端におけるａ−アミノ基の選択的修飾を実施するに適当なｐＨで反応させ；および（ｂ）反応産物を得る段階を含む。実質的に均一な集合のモノ−ポリマー／ＧＤＮＦＲタンパク質産物では、還元アルキル化反応条件は、ＧＤＮＦＲタンパク質または変異体のＮ−末端への水溶性ポリマー部分の選択的結合を可能とするものである。かかる反応条件は、一般的に、リジンアミノ基とＮ−末端のａ−アミノ基の間のｐＫａ差を提供する（ｐＫａは５０％のアミノ基がプロトン化され、５０％がされていないｐＨである）。ｐＨはまた使用するタンパク質に対するポリマーの比にも影響を与える。一般的に、ｐＨが低ければ、タンパク質に対して過剰なポリマーが望ましい（すなわち、Ｎ−末端ａ−アミノ基の反応性が低い程、最適条件を得るためにより多くのポリマーが必要となる）。ｐＨが高ければ、ポリマー：タンパク質比が大きい必要はない（すなわち、より多くの反応性基が利用できる程、必要なポリマー分子の量は少ない）。本発明の目的のために、ｐＨは一般的に３− ９、好ましくは３−６の範囲である。別の重要な考察は、ポリマーの分子量である。一般的に、ポリマーの分子量が高ければ高い程、タンパク質に結合するポリマー分子は少ない。同様に、ポリマー分枝を、これらのパラメーターを最適化する場合には考慮するべきである。一般的に、分子量が大きい程（または分枝が多い程）、ポリマー：タンパク質比は高い。一般的に、本明細書で考察するペギレート反応について、好ましい平均分子量は約２ｋＤａから約１００ｋＤａである。好ましい平均分子量は約５ｋＤａから約５０ｋＤａ、特に好ましくは約１２ｋＤａから約２５ｋＤａである。水溶性ポリマーのＧＤＮＦＲタンパク質または変異体に対する比は、一般的に、１：１から１００：１、好ましくは（ペキレーションに対し）１：１から２０：１および（モノペギレーションに対して）１：１から５：１である。上記した条件を用いて、還元的アルキル化により、アミノ末端にａ−アミノ基を有する任意のＧＤＮＦＲタンパク質または変異体に対するポリマーの選択的結合が提供され、および実質的に均一なモノポリマー／ＧＤＮＦＲタンパク質（または変異体）コンジュゲートの調製物が提供される。「モノポリマー／ＧＤＮＦＲタンパク質（または変異体）コンジュゲート」という用語は、本明細書ではＧＤＮＦＲタンパク質またはＧＤＮＦＲ変異体タンパク質の分子に結合した単一ポリマー分子からなる組成物を意味する。モノポリマー／ＧＤＮＦＲタンパク質（または変異体）コンジュゲートは、典型的に、リジンアミノ側基上ではなくＮ− 末端に位置したポリマー分子を有する。調製物は、一般的に、９０％モノポリマー／ＧＤＮＦＲタンパク質（または変異体）コンジュゲートよりも多く、より通常では９５％モノポリマー／ＧＤＮＦＲタンパク質（または変異体）コンジュゲートよりも多く、観察可能な分子の残りは未反応である（すなわち、ポリマー部分を欠失したタンパク質）。ＧＤＮＦＲタンパク質産物は、ＧＤＮＦＲ−αおよびＧＤＮＦ分子またはＧＲＲ２およびニューチュリン分子などの、融合タンパク質または結合ＧＤＮＦＲおよび神経栄養因子を含むペギレート分子の調製物を含み得る。本還元的アルキル化において、還元剤は水溶液で安定であり、好ましくは還元的アルキル化の最初のプロセスで形成されるシッフ塩基のみを還元できる。適当な還元剤は、水素化ホウ素ナトリウム、シアノボロハイドライドナトリウム、ジメチルアミンボラン、トリメチルアミンボランおよびピリジンボランから選択し得る。特に適当な還元剤は、シアノボロハイドライドナトリウムである。溶媒、反応時間、温度等の他の反応パラメーター、および産物の精製法は、タンパク質の水溶性ポリマーを用いた誘導体化に関する刊行された情報に基づき場合により決定できる（本明細書に記載の刊行物参照）。Ｃ．ＧＤＮＦＲタンパク質産物医薬組成物ＧＤＮＦＲタンパク質産物医薬組成物は、典型的に、治療または予防に有効な量のＧＤＮＦＲタンパク質産物を、投与形態との適合性から選択した１つ以上の医薬的および生理学的に許容可能な製剤物質と共に含む。適当な製剤物質は、抗酸化剤、保存剤、着色剤、矯臭剤および希釈剤、乳化剤、懸濁剤、溶媒、増量剤、充填剤、緩衝剤、送達媒体、希釈剤、添加剤および／または医薬的アジュバントを含むがこれに限定されない。例えば、適当な媒体は、おそらく非経口投与用組成物と共通の他の物質を補足した、注射用水、生理学的食塩水、または人工脳脊髄液であり得る。中和緩衝食塩水または血清アルブミンと混合した食塩水はさらに別の例の媒体である。本明細書で使用する「医薬的に許容される担体」または「生理学的に許容される担体」という用語は、医薬組成物であるＧＤＮＦＲタンパク質産物の輸送を実施または亢進するのに適当な製剤物質を意味する。媒体における一次溶媒は、水性または非水性であり得る。さらに、媒体は、製剤のｐＨ、浸透圧、粘度、透明度、色、無菌性、安定性、溶解速度、またはにおいを改変または維持する他の製剤物質を含み得る。同様に、媒体は、ＧＤＮＦＲタンパク質産物の放出速度を修飾または維持、または血液−脳関門をＧＤＮＦＲタンパク質産物が吸収または透過するのを促進する追加の製剤物質を含み得る。治療医薬組成物が製剤化されれば、溶液、懸濁液、ゲル、エマルション、固体または脱水または凍結乾燥粉末として無菌バイアル中に保存し得る。かかる製剤は、直ちに使用できる形または投与前に再構成を必要とする形（例えば、凍結乾燥）で貯蔵し得る。最適の医薬製剤は、当業者により投与経路および所望の用量に基づき決定する。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ、１８巻（１９９０、ＭａｃｋＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇＣｏ．、Ｅａｓｔｏｎ、ＰＡ１８０４２）ページ１４３５−１７１２参照、この開示は引用によりここに援用する。かかる組成物は物理的状態、安定性、インビボ放出速度、および本タンパク質および誘導体のインビボ消失速度に影響を与え得る。（１）遅延放出製剤、（２）吸入ミスト、または（３）経口有効製剤などの効果的な投与形が考えられる。ＧＤＮＦＲタンパク質産物医薬組成物はまた、非経口投与用に製剤化し得る。かかる非経口投与治療組成物は、典型的に、医薬的に許容される媒体中にＧＤＮＦＲタンパク質産物を含む、発熱性物質非含有の非経口投与的に許容される水溶液の形である。１つの好ましい媒体は生理学的食塩水である。ＧＤＮＦＲタンパク質産物医薬組成物はまた、ポリ乳酸、ポリグリコール酸等、またはリポソーム中などのポリマー化合物の粒子組成物を含み得る。ヒアルロン酸も使用され得、循環中の持続放出を促進する効果を有し得る。非経口注射に特に適当な媒体は、無菌蒸留水であり、ここでＧＤＮＦＲタンパク質産物は、無菌、等張溶液として製剤化され、適当に保持されている。また別の調製物は、注射可能なミクロスフェアまたはリポソームなどの試薬と共にＧＤＮＦＲタンパク質産物の製剤を含み得、これは貯蔵注射として送達され得るタンパク質の遅延または持続放出を提供する。ＧＤＮＦＲタンパク質産物の他の適当な導入方法は、ＧＤＮＦＲタンパク質産物を含む移植可能な薬物送達装置を含む。本発明の調製物は、当業者にはよく知られているように、例えば非経口投与に許容される保存剤、強壮剤、共溶媒、湿潤剤、錯化剤、緩衝剤、抗菌剤、抗酸化剤および界面活性剤などの他の成分を含み得る。例えば、適当な強壮亢進剤は、アルキル金属ハライド（好ましくは塩化ナトリウムまたはカリウム）、マンニトール、ソルビトール等を含む。適当な保存剤は、塩化ベンザルコニウム、チメロサール、フェネチルアルコール、メチルパラベン、プロピルパラベン、クロルヘキシジン、ソルビン酸等を含むがこれに限定されない。過酸化水素も保存剤として使用し得る。適当な共溶媒は、例えば、グリセリン、プロピレングリコールおよびポリエチレングリコールである。適当な錯化剤は、例えば、カフェイン、ポリビニルピロリドン、β−シクロデキストリンまたはヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリンである。適当な界面活性化剤または湿潤剤は、ソルビタンエステル、ポリソルベート、例えばポリソルベート８０、トロメタミン、レシチン、コレステロール、チロキサパル等を含む。緩衝剤は、ホウ酸塩、クエン酸、リン酸、重炭酸塩、またはトリス−ＨＣｌなどの慣用的な緩衝剤であり得る。製剤成分は、投与部位に許容される濃度で存在する。例えば、緩衝剤を用いて生理学的ｐＨまたは僅かに低いｐＨ、典型的には約５−約８のｐＨ範囲内で組成物を維持する。医薬組成物は吸入用に製剤化し得る。例えば、ＧＤＮＦＲタンパク質産物は、吸入用乾燥粉末として製剤化し得る。ＧＤＮＦＲタンパク質産物吸入溶液はまた、エアゾール送達用液体推進薬に製剤化し得る。さらに別の製剤において、溶液は噴霧化し得る。ＧＤＮＦＲタンパク質産物を含む特定の製剤は経口投与することも考えられる。このように投与するＧＤＮＦＲタンパク質産物は、錠剤およびカプセル化剤などの固体薬用形の化合物化に慣用的に使用する担体と共にまたは無しで製剤化し得る。例えば、カプセルは、胃腸管においてバイオアベイラビリティーが最大となり、プレ−全身性分解が最小化となる時点で製剤の活性部分を放出するように設計し得る。追加の製剤物質は、ＧＤＮＦＲタンパク質産物の吸収を促進することを含み得る。希釈剤、矯臭剤、低融点ワックス、植物油、滑沢剤、懸濁剤、錠剤崩壊剤、および結合剤も使用し得る。別の調製物は、錠剤の製造に適当な非毒性添加剤との混合物中、ＧＤＮＦＲタンパク質産物の有効量を含み得る。錠剤を無菌水または他の適当な媒体に溶解することにより、溶液を単位用量形で調製できる。適当な添加剤は、不活性希釈剤、例えば炭酸カルシウム、炭酸または重炭酸ナトリウム、ラクトース、またはリン酸カルシウム；または結合剤、例えばデンプン、ゼラチン、またはアカシア；または滑沢剤、例えばステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、またはタルクを含むがこれに限定されない。追加のＧＤＮＦＲタンパク質産物製剤は、当業者には明らかであり、ＧＤＮＦタンパク質産物と組合せてＧＤＮＦＲタンパク質産物と共に含む製剤を含む。例えばリポソーム担体、生体−腐食微粒子または多孔性ビーズおよび貯蔵注射などの、種々の他の持続−または調節−輸送方法を製剤化する方法はまた、当業者によく知られている。例えば、Ｓｕｐｅｒｓａｘｏら医薬組成物の送達における多孔性ポリマー微粒子放出制御の記載（国際公開番号ＷＯ９３／１５７２２；国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ９３／００８２９）参照、この開示は引用によりここに援用する。Ｄ．ＧＤＮＦＲタンパク質産物の投与ＧＤＮＦＲタンパク質産物は、皮下、筋肉内、静脈内、経肺、経皮、髄腔内および脳内送達を含む種々の経路を介して非経口投与的に投与し得る。さらに、容易に血液−脳関門を通過しないタンパク質因子は、直接脳内でまたはそれ以外では関門を横切ってそれらを輸送する他の要素と結合して投与し得る。例えば、ＧＤＮＦＲタンパク質産物は、脳内脳室にまたは脳にまたは脊髄くも膜下空間に投与し得る。ＧＤＮＦＲタンパク質産物はまた、脳実質に直接脳内的に投与し得る。ＧＤＮＦＲタンパク質産物は、血液−脳関門を通過するように化学的に修飾またはパッケージングされた形で、または関門を横切ってＧＤＮＦＲタンパク質産物の透過を促進可能な１つ以上の薬剤と共に脳外的に投与し得る。例えば、ＮＧＦおよびモノクローナル抗−トランスフェリンレセプター抗体のコンンジュゲートが、トランスフェリンレセプターへの結合を介して脳に輸送されることが示された。所望レベルのＧＤＮＦＲタンパク質産物を得るために、繰り返し毎日またはそれ以下の頻度の注射を投与し得るか、またはＧＤＮＦＲタンパク質産物は、一定またはプログラム可能フロー具備ポンプから連続的または周期的に注入し得る。生物分解可能ポリマー基質に固定した神経栄養因子を含む遅延放出インプラントもまたＧＤＮＦＲタンパク質産物を送達できる。用量の頻度は、製剤化したＧＤＮＦＲタンパク質産物の薬物動態パラメーターおよび投与経路および部位に左右される。投与方法に関係なく、特定の用量は、体重、体表面積または器官のサイズにより計算し得る。各上記製剤を含む、処置に適当な用量を測定するに必要な計算のさらなる改良は、通常当業者によりなされ、彼らにより通常実施される仕事の範囲内である。適当な用量は、適当な用量反応データの使用により確認され得る。特定の傷害または症状の処置法に関与する最終用量管理は、担当医師により決定される。一般的に、有効量のＧＤＮＦＲタンパク質産物は、年令、症状、体重、性および患者の食事、感染の重度、投与時間および他の臨床因子などの薬物の作用を修飾する種々の因子を考慮することにより決定される。Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ、上記、ページ６９７−７７３参照、引用によりここに援用する。例えば、もしＧＤＮＦＲ−αがＧＤＮＦ作用を亢進するために使用されるならば、ＧＤＮＦＲ−α用量はＧＤＮＦ療法に必要な用量と類似するように選択され；もしＧＤＮＦＲ−αがＧＤＮＦ作用を拮抗するために使用されるならば、ＧＤＮＦＲ−α用量はＧＤＮＦ用量の数倍であろう。投薬は１日１回以上、またはそれ以下であり得、本明細書に記載の他の組成物と組合せ得る。本発明は、本明細書に記載の用量に限定しないことに注意されたい。ＧＤＮＦＲタンパク質産物の連続投与または持続送達は、該処置に有利であり得ると考えられる。連続的投与は注入ポンプなどの機械的手段を用いて達成され得るが、他の形の連続またはほぼ連続的な投与も実施し得ることが考えられる。例えば、化学誘導体化またはカプセル化により、タンパクは持続放出形となり得、これは決定された用量管理に基づいた、検出可能量で、血流中に連続的に存在する効果を有する。従って、ＧＤＮＦＲタンパク質産物は、かかる連続投与を可能とする誘導体化または別様に製剤化されたタンパク質を含む。ＧＤＮＦＲタンパク質産物の持続放出形は、製剤化されて所望の１日または１週の有効量を提供する。さらに、ＧＤＮＦＲタンパク質産物はＧＤＮＦおよび／またはニューチュリンと組合せた形で投与し得る。また、ＧＤＮＦＲタンパク質産物は、順次または同時に、神経栄養因子とは別に投与し得ることが考えられる。本発明のＧＤＮＦＲタンパク質産物はまた、単独または他の増殖因子と共に、神経疾患の処置に使用され得る。さらに、化学組成物を含む他の因子または他の分子は、ＧＤＮＦＲタンパク質産物と共に使用され得る。例えば、パーキンソン病の処置において、ＧＤＮＦＲタンパク質産物は単独でまたはレボドパの投与と合わせて使用され、ここでＧＤＮＦＲは内因性ＧＤＮＦの活性を亢進し、よって、増加ドーパミン濃度の神経取り込みを亢進すると考えられる。上記したように、追加の神経栄養性または神経に栄養を与える因子は、ニューロン細胞集合またはある型の傷害または疾患の処置に有用または必要である。ＧＤＮＦＲと共に、またはＧＤＮＦＲとＧＤＮＦまたはニューチュリンなどの神経栄養因子と組合せて使用し得る他の因子は、以下を含むがこれに限定されない：インシュリン、インシュリン様増殖因子、上皮増殖因子、血管作動性増殖因子、下垂体アデニル酸シクラーゼ活性化ポリペプチド、インターフェロンおよびソマトスタチンなどのマイトジェン：神経栄養因子、例えば、神経増殖因子、脳由来神経栄養因子、ニューロトロフィン−３、ニューロトロフィン−４／５、ニューロトロフィン−６、インシュリン様増殖因子、毛様体神経栄養因子、酸性および塩基性線維芽細胞増殖因子、線維芽細胞増殖因子−５、形質転換成長因子−β、コカイン−アンフェタミン調節転写物（ＣＡＲＴ）；および上皮増殖因子、白血球阻害因子、インターロイキン、インターフェロン、およびコロニー刺激因子などの他の増殖因子；並びにこれらの因子と機能的に等価な分子および物質。ＧＤＮＦＲタンパク質産物細胞療法および遺伝子療法ＧＤＮＦＲタンパク質産物細胞療法、例えば、ＧＤＮＦＲタンパク質産物を産生する細胞の脳内移植も考えられる。この実施形態は、ＧＤＮＦＲタンパク質産物の生物学的に活性な形を合成および分泌できる細胞の患者への移植を含む。かかるＧＤＮＦＲタンパク質産物産生細胞は、ＧＤＮＦＲタンパク質産物の天然産生体である細胞であり得るか、またはＧＤＮＦＲタンパク質産物産生能が、所望のＧＤＮＦＲタンパク質産物をコードする遺伝子で形質転換することにより増加させた組換え細胞であり得る。かかる修飾は、遺伝子送達並びにその発現および分泌を促進するに適当なベクターによりなされ得る。外来種由来のＧＤＮＦＲタンパク質産物を投与した患者における起こり得る免疫学的反応を最小限にするために、ＧＤＮＦＲタンパク質産物を産生する天然細胞はヒト起源であり、ヒトＧＤＮＦＲタンパク質産物を産生することが好ましい。同様に、ＧＤＮＦＲタンパク質産物を産生する組換え細胞は、ヒトＧＤＮＦＲタンパク質産物をコードする遺伝子を含む発現ベクターで形質転換することが好ましい。移植細胞は周囲組織の浸潤を防ぐためにカプセル化し得る。ヒトまたは非−ヒト動物細胞は、患者に、ＧＤＮＦＲタンパク質産物を放出可能であるが、患者の免疫系によるまたは周辺組織からの他の有害な因子による細胞の破壊を防ぐ、生物学的適合性の半透過性ポリマー封入物または膜で移植し得る。また、ＧＤＮＦＲタンパク質産物を生体外で産生するように形質転換された患者自身の細胞は、かかるカプセル化を行わずに患者に直接、移植できる。生細胞のカプセル化法は、当業者によく知られており、カプセル化細胞の調製および患者への移植は、過度の実験を行わずに達成され得る。例えば、Ｂａｅｔｇｅら（国際公開番号ＷＯ９５／０５４５２；国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ９４／０９２９９この開示は引用によりここに援用する）は、生物学的に活性な分子を効果的に送達する遺伝子工学細胞を含む生物学的適合性カプセルを記載する。さらに、米国特許番号第４，８９２，５３８号、５，０１１，４７２号および５，１０６，６２７号参照、各々特別に引用によりここに援用する。生細胞をカプセル化する系は、ＡｅｂｉｓｃｈｅｒらのＰＣＴ出願ＷＯ９１／１０４２５に記載されており、特別に引用によりここに援用する。また、ＡｅｂｉｓｃｈｅｒらのＰＣＴ出願ＷＯ９１／１０４７０、Ｗｉｎｎら、Ｅｘｐｅｒ．Ｎｅｕｒｏｌ．、１１３：３２２−３２９、１９９１、Ａｅｂｉｓｃｈｅｒら、Ｅｘｐｅｒ．Ｎｅｕｒｏｌ.、１１１：２６９−２７５、１９９１；Ｔｒｅｓｃｏら、ＡＳＡＩＯ、３８：１７−２３、１９９２参照、各々引用により特別にここに援用する。ＧＤＮＦＲタンパク質産物のインビボおよびインビトロ遺伝子療法送達もまた考えられる。インビトロ遺伝子療法は、ＧＤＮＦＲタンパク質産物をコードする遺伝子を標的細胞に、核酸構築物の局所注入または他の適当な運搬ベクターを介して導入することにより達成され得る。（Ｈｅｆｔｉ、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．、２５：１４１８−１４３５、１９９４）。例えば、ＧＤＮＦＲタンパク質産物をコードする核酸配列は、標的細胞への送達用のアデノ−関連ウイルスベクターに含まれ得る（例えば、Ｊｏｈｎｓｏｎ、国際公開番号ＷＯ９５／３４６７０；国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ９５／０７１７８、この開示は引用によりここに援用する）。選択し得るウイルスベクターは、レトロウイルス、アデノウイルス、単純ヘルペスウイルスおよびパピローマウイルスベクターを含むがこれに限定されない。適宜インビホまたは生体外のいずれかである物理的転移はまた、リポソーム仲介転移、直接注入（裸ＤＮＡ）、レセプター仲介転移（リガンド−ＤＮＡ複合体）、電気穿孔、リン酸カルシウム沈降法または微小粒子衝撃（遺伝子ガン）により達成され得る。また、ＧＤＮＦＲタンパク質産物遺伝子療法または細胞療法は、さらに、ＧＤＮＦタンパク質産物の送達を含むことができると考えられる。例えば、宿主細胞を修飾して、ＧＤＮＦＲ−αタンパク質産物およびＧＤＮＦ、またはＧＲＲ２およびニューチュリンの両方を発現および放出し得る。また、ＧＤＮＦＲ−αおよびＧＤＮＦタンパク質産物、またはＧＲＲ２およびニューチュリンは、別々の細胞で発現され、別々の細胞から放出され得る。かかる細胞は、患者に別々に導入し得、細胞は、上記のカプセル化膜などの単一の移植可能な装置に含み得る。本明細書に記載のＧＤＮＦＲタンパク質産物製剤は、動物並びにヒト適用に使用し得、「患者」という用語は、限定された意味で解釈しないことに注意されたい。動物適用の場合、用量範囲は上記したように決定し得る。実施例実施例１高親和性ＧＤＮＦ結合部位を発現する細胞の同定発現クローニングは、有意な量の標的転写物を含むｍＲＮＡ源の選択を含む。網膜光受容体細胞は、非常に低い濃度でＧＤＮＦに応答するものとして同定され、このことは機能生高親和生レセプターの存在を示唆する。ラット光受容体細胞がＧＤＮＦの高親和生レセプターを発現することを確認するために、［¹²⁵Ｉ］ＧＤＮＦ結合および写真感光乳剤解析を実施した。ラット網膜細胞培養物５日目のＣ５７Ｂ１／６マウス子供または３日目のスプラウグ−ダウリー（Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ）ラット子供の神経網膜（ＪａｃｋｓｏｎＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ＢａｒＨａｒｂｏｒ、ＭＡ）を、色素上皮がないように注意して取り出し切断し、１ｍｍ²のフラグメントに切断し、氷冷リン酸緩衝溶液（ＰＢＳ）に置く。次いで、網膜を、１２０単位のパパインおよび２０００単位のＤＮＡａｓｅを含む、１０ｍＬのハンク平衡塩溶液（ＨＢＳＳ）に移し、２０分間３７℃で回転プラットフォーム撹拌器で約２００ｒｐｍでインキュベートした。次いで、細胞を、十分磨いたパスツールピペットで粉砕することにより拡散し、２０μｍニテックス（Ｎｉｔｅｘ）ナイロンメッシュを通してふるいをかけ、５分間２００×ｇで遠心した。得られた細胞ペレットを、１％オホアルブミンおよび５００単位のＤＮＡａｓｅを含むＨＢＳＳに懸濁し、４％オホアルブミン溶液（ＨＢＳＳ中）の先端に重ね、１０分間５００×ｇで遠心した。最終ペレットを、完全培養培地（下記参照）に再懸濁し、約１５０００細胞／ｍＬに調節し、９０μｌアリコート中、前記したポリオルニチンおよびラミニンで被覆した組織培養プレートに接種した（Ｌｏｕｉｓら、ＪｏｕｒｎａｌＯｆＰｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙＡｎｄＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌＴｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、２６２、１２７４−１２８３、１９９２）。培養培地は、ダルベッコ修飾イーグルス培地（ＤＭＥＭ）およびＦ１２培地の１：１混合物から構成し、２．５％熱不活性化ウマ血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ、Ｌｏｇａｎ、ＵＴ）、Ｂ２７培地補足（ＧＩＢＣＯ、ＧｒａｎｄＩｓｌａｎｄ、ＮＹ）、Ｄ− グルコース（最終濃度：５ｍｇ／ｍＬ）、Ｌ−グルタミン（最終濃度：２ｍＭ）、２０ｍＭＨＥＰＥＳ、ウシインシュリンおよびヒトトランスフェリン（最終濃度：それぞれ２．５および０．１ｍｇ／ｍＬ）を補足した。光受容体の免疫細胞化学同定光受容体は、桿状体−特異的抗原であるアレスチンの免疫染色により同定した。光受容体の培養物を、３０分間室温で、４％パラホルムアルデヒド（ＰＢＳ中、ｐＨ７．４）を用いて固定し、次いで、ＰＢＳ中で３回洗浄した。次いで、固定培養物を、抗体の透過を増加させるために１％ノニデットＰ−４０を含むスーパーブロック遮断緩衝液（Ｐｉｅｒｃｅ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）中インキュベートした。次いで、抗−アレスチン抗体（アレスチンの合成ペプチド配列に対するポリクローナルウサギ抗体：Ｖａｌ−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｃｙｓ）を同緩衝液中１：２０００間の希釈で適用し、培養物を１時間３７℃で回転撹拌器でインキュベートした。ＰＢＳで３回洗浄後、培養物を１時間３７℃でヤギ−抗−ウサギＩｇＧ（ＶｅｖｔｏｒＬａｖｏｒａｔｏｒｉｅｓからのＶｅｃｔａｓｔａｉｎキット、Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ、ＣＡ）と共に１：５００の希釈度でインキュベートした。ＰＢＳで３回洗浄後、次いで、二次抗体を、１：５００に希釈したアビジン− ビオチン−ペルオキシダーゼ複合体で標識した（４５分３７℃）。さらに３回ＰＢＳで洗浄した後、標識した細胞培養物を、０．０４％３’，３’−ジアミノベンジン−（ＨＣｌ）４、０．０６％ＮｉＣｌ₂および０．０２％過酸化水素を含む０．１Ｍトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．４の溶液中で５−２０分間反応させた。アレスチン−免疫反応生に基づき、培養物中約９０％の細胞が桿状体光受容体であった。光受容体の生存は、２００倍率の明光レンズにおけるアレスチン染色培養物の測定により決定した。アレスチン−陽性光受容体数は、６ｍｍウエルの全表面積の約２０％を示す１つの直径１×６ｍｍ片で計測した。生存可能な光受容体は、通常短いアクソン様プロセスと共に一定の型の細胞体を有すると特徴付けられた。不規則な空胞のある核周部またはフラグメント化神経突起を有するなどの変性の徴候を示す光受容体は、計測から除外した（しかし、ほとんどの変性光受容体は培養実体から分離した）。細胞数は、細胞／６−ｍｍウエルとして表現した。光受容体に富む培養ラット網膜細胞（１０，０００／６−ｍｍウエル）を、ヒト組換えＧＤＮＦ（１０ｎｇ／ｍＬから１ｐｇ／ｍＬの範囲の１０倍連続希釈）で処理した。培養物を、６日後固定し、光受容体特異的抗原であるアレスチンで免疫染色した。ＧＤＮＦで処理しなかった培養物において、光受容体数は、時間毎に着実に減少し、培養物中で６日後に最初の数値の約２５％に達した。培養物をＧＤＮＦで処置すると、培養物中６日後に生存可能なアレスチン−陽性光受容体が約２倍高い数値となった。ＧＤＮＦの効果は２００ｐｇ／ｍＬで最大であり、ＥＤ₅₀は約３０ｐｇ／ｍＬであった。光受容体生存の亢進に加えて、ＧＤＮＦの添加もまた、そのアクソン様プロセスの伸長を刺激し、よって光受容体の形態学的発達における効果を実証した（ＧＤＮＦにおける光受容体の平均神経突起長：６８μｍ、対照培養物における２７±１８μｍと比較）。ラット網膜細胞が高親和生ＧＤＮＦレセプターを発現することを確認するために、［¹²⁵Ｉ］ＧＤＮＦ結合および写真感光乳剤分析を実施した。生後ラット光受容体細胞を、実験の３−４日前に２８００細胞／ｍｍ２の密度で、プラスティックスライドフラスケット（Ｎｕｎｃ）に接種した。細胞を、氷冷洗浄緩衝液（２５ｍＭＮ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ’−２−エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）；ｐＨ７．５を含むダルベッコ修飾イーグル培地（ＤＭＥＭ））を用いて１回洗浄した。競合的結合において、細胞を、４時間４℃で５００ｎＭ非標識ＧＤＮＦの存在または非存在下、結合緩衝液（２５ｍＭＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５および２ｍｇ／ｍＬウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含むＤＭＥＭ）中における種々の濃度の［¹²⁵Ｉ］ＧＤＮＦを用いてインキュベートした。細胞を、氷冷洗浄緩衝液で４回洗浄し、１ＭＮａＯＨに溶解し、細胞関連放射活性をガンマカウンターで計測した。低いリガンド濃度（３０ｐＭの低さ）でも有意な量の［¹²⁵Ｉ］ＧＤＮＦが光受容体細胞に結合し、この結合は、過剰の非標識ＧＤＮＦの存在により完全に阻害された。写真感光乳剤検出において、細胞を、結合緩衝液中、５００ｎＭの非標識ＧＤＮＦの存在または非存在下、４℃で４時間、５０ｐＭの［¹²⁵Ｉ］ＧＤＮＦと共にインキュベートした。細胞を６回氷冷洗浄緩衝液で洗浄し、２．５％グルタルアルデヒドで固定し、５０％および７０％エタノールで連続的に脱水し、ＮＴＢ −２写真感光乳化剤に浸した（ＥａｓｔｍａｎＫｏｄａｋ、ＲｏｃｈｅｓｔｅｒＮＹ）。５日間さらした後、スライドを現像し、検証した。写真感光乳化剤分析により、いくつかの光受容体細胞への［¹²⁵Ｉ］ＧＤＮＦの会合が実証され、これはＧＤＮＦレセプターの存在を示唆する。しかし、この会合は非標識ＧＤＮＦの添加により十分に遮断された。実施例２光受容体細胞由来ＧＤＮＦＲ−αの発現クローニングラット光受容体細胞を、実施例１に記載のように、放射標識ＧＤＮＦの細胞表面結合および非常に低濃度のリガンドに応答する能力に基づいて、ＧＤＮＦへの高親和性レセプター源として選択した。レセプターを同定するために、約５０，０００の独立したクローンのサイズ−選択ｃＤＮＡライブラリーを、哺乳動物発現ベクター（ｐＳＲの誘導体、Ｔａｋｅｂｅら、１９８８上記）を用いて構築し、ｍＲＮＡを下記した方法により培養生後ラット光受容体細胞から単離した。ライブラリーを、約１，５００から２，０００の独立したクローンのプールに分割し、確立された発現クローニング法を用いてスクリーニングした（Ｇｅａｒｉｎｇら、ＥＭＢＯＪｏｕｒｎａｌ、８、３６６７−３６７６、１９８９）。各ライブラリーのプールを示すプラスミドＤＮＡを調製し、プラスティック顕微鏡スライドフラスケット上で成育したＣＯＳ７細胞にトランスフェクトさせた（Ｎｕｎｃ、Ｎａｐｅｒｖｉｌｌｅ、ＩＬ）。トランスフェクトした細胞は、［¹²⁵Ｉ］ＧＤＮＦで処置し、グルタルアルデヒドで固定し、脱水し、オートラジオグラフィー用に写真感光乳化剤中に浸した。５目間さらした後、スライドを現像し、銀色の粒子により覆われた細胞の存在について検証し、これはＧＤＮＦレセプターの細胞発現の結果としての細胞表面への［¹²⁵Ｉ］ＧＤＮＦの結合を示唆した。［¹²⁵Ｉ］ＥＧＦで処理したＥＧＦレセプタートランスフェクト細胞を陽性対照として用いた。このようにスクリーニングした２７プール（Ｆ８−１１）中１つが、トランスフェクション後、１９の陽性細胞を示した。従って、単一のｃＤＮＡライブラリープールを同定し、これはＧＤＮＦＲ−αを発現するｃＤＮＡクローンを含んだ。このプールは、１００クローン／プールの６０の小サブプールに分割され、これを上記の同法により再度スクリーニングした。これらのプールの５つが陽性と同定され、５つのプールの２つがさらに再分割され、ＧＤＮＦ結合活性に関与する単一のクローンを産生した。単一クローンからのＣＯＳ７細胞へのプラスミドＤＮＡのトランスフェクションにより、［¹²⁵Ｉ］ＧＤＮＦが細胞の約１５％に結合する結果となった。この結合は過剰の非標識ＧＤＮＦとの競合により特異的に阻害された。発現ｃＤＮＡライブラリーの構築ラット網膜細胞を、生後３−７日のラットから採取し、ラミニンおよびポリオルニチンでで被覆した培養皿に、約５７００細胞／ｍｍ²の密度で接種した。培養３−４日後、個体群は、約８０％の光受容体細胞を含むと推定された。全ＲＮＡは、この培養物から標準的な方法により調製し、ポリＡ＋ＲＮＡを、ポリＡ− トラクトキット（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）を用いて精製した。ｃＤＮＡライブラリーを、ギブコ・スーパースクリプト・チョイス・システム（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）を用いてラット光受容体ポリＡ＋ＲＮＡから構築した。２μｇのポリＡ＋ＲＮＡを、５０ｎｇのランダムヘキサマーと混合し、１０分間７０℃に加熱し、次いで氷上で急速に冷凍した。最初の鎖合成は、４００ＵスーパースクリプトＩＩＲＴを用いて３７℃で１時間実施した。二番目の鎖合成は、ｄＮＴＰ、１０Ｕの大腸菌ＤＮＡリガーゼ、４０Ｕの大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩ、および２Ｕの大腸菌ＲＮａｓｅＨの添加後、同チューブで実施した。１６℃で２時間後、ｃＤＮＡ末端を１０ＵのＴ４ポリメラーゼでさらに５分間１６℃で処理することにより平滑にした。イソプロパノール沈殿後、１０μｇの非リン酸化ＥｃｏＲＩアダプターオリゴヌクレオチドを用いて一晩ライゲートすることにより、ＥｃｏＲＩクローニング部位をｃＤＮＡに加えた。次いで、ＥｃｏＲＩ接着ｃＤＮＡをリン酸化し、セファクリルＳ−５００ＨＲサイズ分画カラムに適用した。適用した後、カラムを、１００μｌアリコートのＴＥＮ緩衝液（１０ｍＭトリス−ＨＣｌｐＨ７．５、０．１ｍＭＥＤＴＡ、２５ｍＭＮａＣｌ）で洗浄し、３０μｌ画分を回収した。画分６−８（これは約３４ｎｇの高分子量ｃＤＮＡを含む）をプールし沈殿させた。回収したＥｃｏＲＩ− 接着ｃＤＮＡを一晩、５０ｎｇのＥｃｏＲＩ切断ベクターｐＢＪ５を用いてライゲートさせた。約１５ｎｇのｃＤＮＡを含むライゲート混合物のアリコートを、コンピテント細胞（大腸菌株ＤＨ１０Ｂ；ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）に電気穿孔により形質転換した。形質転換混合物を滴定し、次いで２７Ａｍｐ／ＬＢプレート上に１５００コロニー／プレートの密度で置いた。コロニーを各プレートから採取し、１０ｍＬのルリアブイヨン（ＬＢ）に回収し、各１５００の独立したクローンを２７プール作成した。各プールからの細胞部分をグリセロール中で凍結し、残りを用いてキアーゲン・チップ−５００キット（ＱｉａｇｅｎＩｎｃ．、Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ、ＣＡ）を用いてプラスミドＤＮＡを単離した。ＣＯＳ細胞トランスフェクションおよび写真感光乳化剤解析ＣＯＳ７細胞を、トランスフェクションの１日前に、プロネクチン（１０μｇ／ｍｌリン酸緩衝溶液（ＰＢＳ）中）で被覆したプラスティックスライドフラスケット（Ｎｕｎｃ）上に接種した（２２０，０００細胞／スライド）。トランスフェクションでは、２μｇのｃＤＮＡを含む、７００μｌのオプチＭＥＭＩ（ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）を、３５μｌのＤＥＡＥデキストラン溶液（１０ｍｇ／ｍＬ、Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）と共にエッペンドルフチューブ中穏やかに混合した。細胞を２回ＰＢＳで洗浄し、トランスフェクション混合物と共に３０分間３７℃で５％ＣＯ₂雰囲気中インキュベートした。インキュベート後、１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）および８０ｎＭクロロキン（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を含む３ｍＬのＤＭＥＭ培地を、各フラスケットに加えた。細胞をさらに３．５時間インキュベートし、ＤＭＥＭ中室温で２分間１０％ジメチルスルホキシドで衝撃を与え、ＰＢＳで１回洗浄し、１０％ＦＣＳを含むＤＭＥＭ中で成育させた。４８時間後、トランスフェクトＣＯＳ７細胞を１回氷冷洗浄緩衝液（２５ｍＭＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５を含むＤＭＥＭ）で洗浄し、５０ｐＭ［¹²⁵Ｉ］ＧＤＮＦを補足した、氷冷結合緩衝液（２５ｍＭＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５および２ｍｇ／ｍＬＢＳＡを含むＤＭＥＭ）中４℃で４時間インキュベートした。細胞を６回氷冷洗浄緩衝液中で洗浄し、２．５％グルタルアルデヒドを用いて室温で５分間固定し、５０％および７０％エタノールで順次脱水し、次いでＮＴＢ− ２写真感光乳剤（ＥａｓｔｍａｎＫｏｄａｋ）に浸した。４−５日４℃で暗所においた後、スライドを現像し、明野および暗野顕微鏡で映した。陽性プールの再分推定ＧＤＮＦレセプタークローンを含む単一のプールを同定した。このプール由来のクローンは、１００コロニー／プレートの密度で６０プレートに配置した。細胞を各プレートから採取し、ＬＢに回収し、４−５時間３７℃で成育させた。凍結貯蔵およびＤＮＡ調製物は、前記のように各プールから作製し、各１００の独立したクローンを含む６０のサブプールを作製した。これら６０サブプールの２つを、上記の方法を用いて陽性と同定し、これらのプール由来のクローンを、単一のコロニーが単離できるように低密度で配置した。単一のコロニー（３８４）を、２つのサブプールの各々から拾い、６時間９６−ウエルプレートの２００μｌＬＢ中で成育させた。ＧＤＮＦＲ−α を発現する単一のクローンを選択するために、４つの９６−ウエルプレートを、１６横列および２４縦列からなる単一の大きなマトリックスに配列させた。各横列および各縦列におけるウエルの細胞は合わせると全部で４０混合物となる。これらの混合物は一晩、１０ｍＬＬＢ／Ａｍｐ（１００μｇ／ｍＬ）中で成育させ、ＤＮＡをキアーゲンチップ−２０キットを用いて調製した。推定ＧＤＮＦレセプタークローンについて解析した場合、３つの横列混合物および３つの縦列混合物により、陽性シグナルが得られ、これは９つの有効な陽性単一クローンを示唆する。各々の有効な陽性単一クローンのＤＮＡが調製され、ＥｃｏＲＩおよびＰＳｔＩを用いて消化された。９つの単一クローンの３つのＤＮＡは、同一の制限パターンを示したか、他の６つは相関せず、これは３つがＧＤＮＦＲ− αを含む真のクローンを提示することを示す。実施例３ＤＮＡ配列決定および配列解析陽性で単一のクローン由来のＤＮＡを調製し、自動ＡＢＩ３７３ＡＤＮＡシークエンサー（Ｐｅｒｋｉｎ／ＥｌｍｅｒＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、ＳａｎｔａＣｌａｒａ、ＣＡ）およびジデオキシ−ダイ−ターミネーターを用いて製造業者の指示に従って配列決定した。ＧＤＮＦＲ−α配列と全ての利用可能な公開データベースとの比較は、ウイスコンシン・ジェネティクス・コンピューター・グループ・パッケージ（ウイスコンシンパッケージのプログラムマニュアル、バージョン８、１９９４年９月、ジェネティクス・コンピューター・グループ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）に記載のＦＡＳＴＡ（ＰｅａｒｓｏｎａｎｄＬｉｐｍａｎ、ＰｒｏｃｅｅｄｉｎｇＯｆＴｈｅＮａｔｉｏｎａｌＡｃａｄｅｍｙＯｆＳｃｉｅｎｃｅｓＵ．Ｓ．Ａ．、８５、２４４４−２４４８、１９８８）プログラムアルゴリズムを用いて実施した。ラットＧＤＮＦＲ−αの配列特性上記実施例２に記載のクローン由来のプラスミドＤＮＡを調製し、ＤＮＡ配列決定解析にかけた。クローン化２１３８ｂｐラットｃＤＮＡのヌクレオチド配列解析により、４６８アミノ酸残基の翻訳タンパク質をコードする単一の大きなオープンリーディングフレームが示された（図３）。コード配列は、３０１ｂｐの５’−非翻訳領域および４３０ｂｐの３’−非翻訳領域にフランキングし、ポリアデニル化可能部位を含まない。最初のＡＴＧの上流の３０２塩基対におけるインフレーム停止コドンの存在およびその周辺のヌクレオチド配列により、このメチオニンコドンが翻訳開始部位である可能性が最も高いことが示唆される（Ｋｏｚａｋ、ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ、１５、８１２５−８１４８、１９８７）。ラットｃＤＮＡクローンの３’非翻訳配列の４３０ヌクレオチドには全くポリアデニル化シグナルが認められない。ノーザンブロットデータにより、最も短いｍＲＮＡ転写物は約３．６ｋｂであることが示されているため、これは驚くべきことではない。ＧＤＮＦＲ−αポリペプチド配列は、分泌シグナルペプチドの特徴を有する、約１９残基（メチオニン−１からアラニン−１９、図３）のＮ−末端疎水性領域を有する（ｖｏｎＨｅｉｊｎｅ、タンパク質配列およびデータ解析、１、４１ −４２、１９８７；ｖｏｎＨｅｉｊｎｅ、ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ、１４、４６８３−４６９０、１９８６）。トランスメンブランドメインとして機能できる内部疎水性ドメインは全く見られなかった。その代わりに、２１残基のカルボキシ−末端疎水性領域（図３のロイシン−４４８からセリン−４６８）が存在し、レセプターの細胞室膜へのグリコシル−ホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）固定に関与し得る。３つの有効なＮ−結合グリコシル化部位の存在以外は、保存配列または構造モチーフは全く見られなかった。タンパク質は、システイン（４６８アミノ酸残基中３１）に極めて富むが、その空間は公知のレセプターの細胞外部分に見られるシステインに富むドメインのとは共有していない。ＧＤＮＦＲ−α配列は、ＦＡＳＴＡを用いて利用可能な公開データベースにおける配列と比較した。探索により、他の公開配列との有意な相同性は認められなかった。ラットｃＤＮＡクローンが得られれば、放射標識し、実施例５に下記のヒト脳黒質から調製したｃＤＮＡライブラリーをプローブするために使用された。実施例４ＧＤＮＦＲ−α発現細胞へのＧＤＮＦ結合結合アッセイを、Ｊｉｎｇら（ＪｏｕｒｎａｌＯｆＣｅｌｌＢｉｏｌｏｇｙ、１１０、２８３−２９４、１９９０）により以前に記載されたアッセイ法に従って実施した。アッセイは、［¹²⁵Ｉ］ＧＤＮＦの、ＧＤＮＦＲ−αを発現するようにトランスフェクトされたラット光受容体細胞、ＣＯＳ７細胞または２９３Ｔ細胞に対する結合を含んだ。２９３Ｔ細胞表面上に発現した組換えＧＤＮＦＲ−αは、ＧＤＮＦに、特異的に、およびラット網膜細胞上のＧＤＮＦ結合部位で観察されたものと同等の親和性で結合できた。ラット光受容体細胞は、上記実施例１に記載のように調製し、アッセイの２から３日前に、ポリオルニチンおよびラミニンで前以て被覆した２４−ウエル・コースター組織培養プレート中、５．７×１０⁵細胞／ｃｍ²の密度で接種した。ＣＯＳ７細胞は、２．５×１０⁴細胞／ｃｍ²の密度で、アッセイの１日前に接種し、ＤＥＡＥ−デキストラン−クロロキン法を用いて１０−２０μｇのプラスミドＤＮＡでトランスフェクトした（ＡｒｕｆｆｏおよびＳｅｅｄ、ＰｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓＯｆＴｈｅＮａｔｉｏｎａｌＡｃａｄｅｍｙＯｆＳｃｉｅｎｃｅｓＵ．Ｓ．Ａ．、８４、８５７３−８５７７、１９８７）。各皿の細胞を取り出し、トランスフェクションの２４時間後、２４−ウエルコスター組織培養プレートの３０ウエルに再度接種しさらに４８時間成育させた。次いで、細胞を５−１０分間氷上に放置し、氷冷洗浄緩衝液で１回洗浄し、４℃で４時間非標識ＧＤＮＦと共にまたは無しで種々の濃度の［¹²⁵Ｉ］ＧＤＮＦを含む結合緩衝液０．２ｍＬと共にインキュベートした。細胞を０．５ｍＬ氷冷洗浄緩衝液で洗浄し、０．５ｍＬの１ＭＮａＯＨで溶解した。溶解物を１４７０ウィザード自動ガンマカウンターで計測した。結合実験において、一過性にトランスフェクトした２９３Ｔ細胞を用いた（下記２９３Ｔ細胞トランスフェクション参照）。トランスフェクション２日後、細胞を２×ベルシンによりIIIから取り出した。細胞をペレット化し、１回氷冷結合緩衝液で洗浄し、氷冷結合緩衝液中３×１０⁵細胞／ｍＬの密度で再懸濁した。細胞懸濁液を１．５×１０⁵細胞／サンプルを含むアリコートに分割した。次いで、細胞をペレット化し、種々の濃度の［¹²⁵Ｉ］ＧＤＮＦと共に非標識ＧＤＮＦ５００ｎＭの存在下または非存在下で４℃で４時間穏やかに撹拌しながらインキュベートした。細胞を４回氷冷洗浄緩衝液で洗浄し、０．５ｍＬ洗浄緩衝液に再懸濁した。懸濁液の２つの０．２ｍＬアリコートをガンマカウンターで計測し、細胞に結合した［¹²⁵Ｉ］ＧＤＮＦの量を測定した。全アッセイにおいて、非特異的結合を二重サンプルを用いて測定し、その１つは非標識ＧＤＮＦ５００ｎＭを含む。非特異的結合のレベルは、非標識ＧＤＮＦの非存在下で測定した特異的結合において１０％から２０％に変化し、特異的結合から引く。アッセイにより、細胞をＧＤＮＦＲ−αｃＤＮＡクローンでトランスフェクトさせなければ細胞はＧＤＮＦに結合しないことが示された。実施例５ＧＤＮＦＲ−αｍＲＮＡの組織分布胚マウス、成人マウス、ラット、およびヒト組織におけるＧＤＮＦＲ−αｍＲＮＡの発現パターンは、ノーザンブロット解析により確認した。クローン化ラットＧＤＮＦＲ−αｃＤＮＡは、製造業者の指示に従ってランダムプライムドＤＮＡ標識キット（ＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒＭａｎｎｈｅｉｍ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）を用いて標識した。ラット、マウスおよびヒト組織ＲＮＡブロット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、ＰａｌｏＡｌｔｏ、ＣＡから購入）をプローブとハイブリダイズさせ、製造業者の指示に従ってＥｘｐｒｅｓｓＨｙｂキット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）の試薬を用いて洗浄した。成人ラット、マウス、およびヒト組織から調製した組織ノーザンブロットにより、ＧＤＮＦＲ−αｍＲＮＡは、肝臓、脳、および腎臓において最も高く発現されることが示された。高ｍＲＮＡ発現はまた、肺にも検出され、脾臓、腸、精巣、および骨格筋においてはより低いまたは検出不可能な量であった。マウス胚から単離したｍＲＮＡから作製したブロットにおいて、発現は胚７日目では検出不可能であり、肝１１日目に明らかになり、胚１７日目に非常に高かった。ＧＤＮＦＲ−αｍＲＮＡは比較的等レベルで成人ヒト脳の数個の小領域から単離された組織において発現された。ヒト成人脳におけるＧＤＮＦＲ− αｍＲＮＡの発現は、任意の特定の領域にほとんど特異性を示さなかった。ほとんどの組織において、２つの異なるサイズの転写物が存在した。マウスおよびヒト組織において、８．５および４．４ｋｂの転写物が認められたが、ラットにおける転写物は８．５および３．６ｋｂであった。大および小転写物の相対量は、組織の型により変化し、小転写物が肝臓および腎臓において優勢であり、大転写物は脳においてより豊富であった。ｐＢＫＲＳＶベクターにおけるＧＤＮＦＲ−αｃＤＮＡでトランスフェクトさせた２９３Ｔ細胞へのＧＤＮＦの結合は、スッキャチャード解析により確認した。２つのクラスの結合部位が検出され、１つは低ピコモル範囲の結合親和性を有し、他方は約５００ｐＭの親和性を有する。実施例６組換えヒトＧＤＮＦＲ−α バクテリオファージｇｔ１０にクローン化した成人ヒト黒質ｃＤＮＡライブラリー（５’−伸長プラスｃＤＮＡライブライリー、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、ＰａｌｏＡ１ｔｏ、ＣＡ）を、プローブとして実施例１のラットＧＤＮＦＲ−αｃＤＮＡクローンを用いてスクリーニングした。プローブを、製造業者の指示に従って、ランダムプライムドＤＮＡ標識キット（ＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒＭａｎｎｈｅｉｍ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）を用いて［³²Ｐ］−ｄＮＴＰｓで標識した。ヒト黒質ｃＤＮＡライブラリー由来の約１．２×１０⁶ｇｔ１０ファージを、１５ｃｍアガロースプレート上に置き、二重ニトロセルロースフィルター上に複製した。次いで、フィルターを放射標識プローブでハイブリダイゼーションすることによりスクリーニングした。フィルターを、２００ｍＬの６×ＳＳＣ、１×デンハード、０．５％ＳＤＳ、５０μｇ／ｍＬサケ精子ＤＮＡ中、５５℃で３．５時間プレハイブリダイズした。放射標識プローブ２×１０⁸ｃｐｍ添加後、１８時間ハイブリダイゼーションを続けた。次いで、フィルターを２回３０分間、各０．５ ×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中５５℃で洗浄し、強化スクリーンで一晩Ｘ線フィルムにさらした。ｃＤＮＡ挿入物がヒトＧＤＮＦＲ−αｃＤＮＡの部分を示す５つの陽性プラークを単離した。図３に示したラットＧＤＮＦＲ−αの核酸配列と比較して（ｂｐ０−２１４０）、５つのヒトＧＤＮＦＲ−αクローンが以下の配列を含むことが判明した：図５に示した配列のアラインメントおよび比較によりヒトＧＤＮＦＲ−αの共通配列が提供された。ヒトｃＤＮＡ配列により予想される翻訳産物は４６５アミノ酸からなり、ラットＧＤＮＦＲ−αに９３％相同性である。全長ＧＤＮＦＲ−αをコードするヒトｃＤＮＡクローンを産生するために、クローン２１Ｂおよび２の部分を内部ＢｇｌＩＩ部位で共に接合し、哺乳動物ベクターｐＢＫＲＳＶ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、ＬａＪｏｌｌａ、ＣＡ）にサブクローニングした。組換えヒトＧＤＮＦＲ発現ベクターは、哺乳動物細胞において発現用に調製し得る。上記に示した通り、発現は細菌細胞などの非哺乳動物細胞においてもなし得る。本明細書で開示した核酸配列は、哺乳動物細胞における発現用の市販の哺乳動物ベクター（例えば、ＣＥＰ４、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）（市販のヒト肝腎臓細胞系「２９３」を含む）中に配置し得る。細菌細胞における発現では、リーダー配列をコードする部分を典型的には削除する（例えば、図１の核酸１−５９０）。細菌発現用にＮ−末端に追加のメチオニルを加え得る。さらに、発現を容易にするために、天然のリーダー配列を異なるリーダー配列、または他の開裂配列に置換し得る。実施例７可溶性ＧＤＮＦＲ構築物可溶性ヒトＧＤＮＦＲタンパク質産物を作製した。以下の例は４つの異なる形を提供し、カルボキシ末端のみが異なり、これは図２で提供される残基ナンバリングにより示唆される。２つは、疎水性テイルから上流および最後のシステイン残基から下流の異なる点で切形した可溶形である。その他の２つは同じ切形であるが、市販の抗体が使用できるオクタペプチドである「ＦＬＡＧ」配列が付加する（ＥａｓｔｍａｎＫｏｄａｋ）。ＦＬＡＧ配列はＨ₂Ｎ−ＤＹＫＤＤＤＤＫ −ＣＯＯＨである。方法ヒトＧＤＮＦＲ−αのほぼ全てのコード領域を含むラムダファージクローン＃２１を、ＥｃｏＲＩで消化し、ｃＤＮＡインサートを切断した。このフラグメントを精製し、ＥｃｏＲＩ切断ｐＢＫＲＳＶベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、ＬａＪｏｌｌａ、ＣＡ）にライゲートし、クローン２１−Ｂ−３／ｐＢＫＲＳＶを産生した。下記に示したプライマー１および２を、鋳型としてヒトＧＤＮＦＲ−αクローン２１−Ｂ−３／ｐＢＫＲＳＶと共にＰＣＲ反応に使用した。ＰＣＲ条件は９４℃、５分間、次いで２５サイクル、９４℃、１分間；５５℃１分間；７２℃、２分間および７２ ℃で５分間の最後の伸長であった。これにより、ヒトＧＤＮＦＲ−αクローンのヌクレオチド１２６５−１８６８、および終始コドンおよびプライマー２により提供されるＨｉｎｄＩＩＩ制限部位からなるフラグメントが産生された。このフラグメントを、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ（プライマー２に含まれる）およびＢｇｌＩＩ（ヒトＧＤＮＦＲ−αの１３０４位）で消化し、得られた５７２ヌクレオチドフラグメントをゲル電気泳動により単離した。このフラグメントは、イソロイシン−２２５からグリシン−４４３までのｈＧＤＮＦＲ−αコード領域を含んだ。同様の方法をプライマーおよび３と共に用いて、イソロイシン−２５５からプロリン−４４６をコードする、ＢｇｌＩＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ端を有するフラグメントを産生した。プライマー４および５は、ｈＧＤＮＦＲ−αの同領域およびプライマー１および３をコードするが、Ｆｌａｇペプチドコード配列（ＩＢＩ／Ｋｏｄａｋ、ＮｅｗＨａｖｅｎ、ＣＮ）が追加されたフラグメントを産生するように設計された。Ｆｌａｇペプチド配列は、８つのアミノ酸（Ｈ₂Ｎ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ− Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−ＣＯＯＨ）から構成され、これに対する抗体は市販により入手できる。プライマー１および４または１および５は、ＰＣＲ反応において前記と同じ鋳型と共に使用し、前記のようにＨｉｎｄＩＩＩおよびＢｇｌＩＩで消化した。この方法により、イソロイシン−２５５からグリシン−４４３およびイソロイシン−２５５からプロリン−４４６をコードするが、そのカルボキシ末端にＦｌａｇペプチドが追加されているフラグメントが産生された。プライマー前記のように産生した全４つのフラグメントを、２１Ｂ３／ｐＢＫＲＳＶに戻した。２１Ｂ３／ｐＢＫＲＳＶクローンを、ＢｇｌＩＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化し、ウシ腸アルカリホスファターゼ（ＣＩＡＰ）で処理した。ベクターおよびＢｇｌＩＩ部位までのヒトＧＤＮＦＲ−αコード領域を含む大フラグメントを、ゲル精製し、ゲルから抽出した。上記のように産生した各４つのＢｇｌＩＩ／ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントを、このベクターにライゲートさせるとｐＢＫＲＳＶベクターにおける以下の構築物が得られた。全クローンの正しい構築は、ＤＮＡ配列決定により確認された。ｐＢＫＲＳＶクローンからのインサートは、下記のｐＢＫＲＳＶポリリンカー配列に存在する酵素部位を用いて他の発現ベクターに移行した。可溶性ＧＤＮＦＲ（例えば、ｓＧＤＮＦＲ−α／ｇｌｙおよびｓＧＤＮＦＲ−α／ｐｒｏ）もまた、一過性発現用ベクターおよびＣＨＯ細胞における安定発現用ｐＤＳＲ−２に移行した。ｐＤＳＲα２＋ＰＬクローン：適当なｐＢＫＲＳＶクローンを、ＸｂａＩおよびＳａｌＩで消化する。インサートを、同酵素で切断しＣＩＡＰで処理したｐＤＳＲα＋ＰＬにライゲートする。この構築物はＣＨＯ細胞におけるＧＤＮＦＲの安定発現に使用し得る。ｐＣＥＰ４クローン：適当なｐＢＫＲＳＶクローンを、ＳｐｅＩおよびＸｈｏＩで消化する。インサートを、ＮｈｅＩ（ＳｐｅＩ端）およびＸｈｏＩで消化したｐＣＥＰ４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＳａｎＤｉｅｇｏ、ＣＡ）にライゲートさせ、ＣＩＡＰで処理した。この構築物はＧＤＮＦＲの一過性発現に使用し得る。プラスミド構築物ｐＤＳＲ−２を、１９９０年３月２９日に出願の共有および同時係属中の米国特許出願番号５０１，９０４（また、１９９０年５月１８日出願欧州特許出願番号９０３０５４３３、公開番号ＥＰ３９８７５３、およびＷＯ９０／１４３６３（１９９０）参照、この開示は引用によりここに援用する）に記載の方法に従って実質的に調製する。ＧＤＮＦＲ類似体をコードする種々の核酸配列を使用し得ることが当業者により理解されるだろう。別の構築物は、プラスミドｐＣＤの誘導体であるｐＤＳＲα２（Ｏｋａｙａｍａ＆Ｂｅｒｇ、Ｍｏｌ．ＣｅｌｌＢｉｏｌ．３：２８０−２８９、１９８３）であり、以下の３つの主な修飾を有する：（ｉ）ＳＶ４０ポリアデニル化シグナルは、ウシ小胞刺激ホルモンであるα−ｂＦＳＨのα−サブユニットからのシグナルで置換されている（Ｇｏｏｄｗｉｎら、ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．１１：６８７３−６８８２，１９８３）；（ｉｉ）マウスジヒドロ葉酸還元酵素ミニゲン（Ｇａｓｓｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７９：６５２２−６５２６，１９８２）は、形質転換体の選択および増幅が可能となるように、発現カセットから下流に挿入されている；および（ｉｉｉ）ヒトＴ− 細胞白血球ウイルス型Ｉ（ＨＴＬＶ−Ｉ）の長い末端反復（ＬＴＲ）の「Ｒ−エレメント」および「Ｕ５」配列を含む２６７ｂｐフラグメントがクローン化され、前記のＳＶ４０プロモーターおよびスプライスシグナルの間に挿入された（Ｔａｋｅｂｅら、Ｍｏｌ．ＣｅｌｌＢｉｏｌ．８：４６６−４７２、１９８８）。ＣＨＯ細胞におけるＧＤＮＦＲ−αの発現は、細胞表面へのヨード化ＧＤＮＦの結合により確認された。上記で議論したように、組換え発現可溶性ＧＤＮＦＲ −αタンパク質産物を用いてＧＤＮＦの活性または細胞特異性を亢進し得る。検出可能な標識に結合した可溶性ＧＤＮＦＲ−αもまた上記で議論したように診断に使用し得る。実施例８ＧＤＮＦＲ−αとＧＤＮＦの化学的架橋結合特性および分子の特徴を研究するために、ＧＤＮＦＲ−αを、ラットｃＤＮＡクローンのトランスフェクションにより２９３Ｔの細胞表面上に一過性的に発現させた。２９３Ｔ細胞のトランスフェクションは、製造業者の指示に従ってリン酸カルシウムトランスフェクションシステム（ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）を用いて実施した。トランスフェクション２日後、細胞を２×ベルシン処理で取り出し、１回洗浄緩衝液で洗浄し、２×１０⁶細胞／ｍＬの密度で洗浄緩衝液に再懸濁した。細胞の二重セットを、［¹²⁵Ｉ］ＧＤＮＦ結合の前に、０．５ｕ／ｍＬＰＩ−ＰＬＣと共に３７℃で３０分間インキュベートした。これらの細胞を氷冷結合緩衝液で３回洗浄し、次いで、他の細胞と１− ３ｎＭの［¹²⁵Ｉ］ＧＤＮＦと共に４℃で４時間インキュベートした。細胞を４回氷冷洗浄緩衝液で洗浄し、架橋のために１ｍＭのビススベレート（ＢＳ³Ｐｉｅｒｃｅ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）で補足した洗浄緩衝液に再懸濁し、室温で３０分問インキュベートした。ＴＢＳで３回洗浄した後、二重のサンプル群を、３７℃で３０分間０．５ｕ／ｍＬのＰＩ−ＰＬＣにより処理した。これらの細胞をペレット化し、上清を回収した。次いで、細胞を洗浄緩衝液で洗浄し、他の全ての細胞と共に２×ＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプル緩衝液で溶解した。細胞溶解液および回収した上清は７．５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で解析した。細胞懸濁液を、１．５×１０⁵細胞／サンプルを含むアリコートに分割した。次いで、細胞をペレット化し、種々の濃度の［¹²⁵Ｉ］ＧＤＮＦと共に、５００ｎＭの非標識ＧＤＮＦの存在下または非存在下、４℃で４時間穏やかに撹拌しながらインキュベートした。細胞を４回氷冷洗浄緩衝液で洗浄し、０．５ｍＬ洗浄緩衝液に再葱濁した。懸濁液の２つの０．２ｍＬアリコートを、ガンマカウンターで計測し、細胞に結合した［¹²⁵Ｉ］ＧＤＮＦの量を測定した。偽トランスフェクト２９３Ｔ細胞は、ＧＤＮＦ結合能力を全く示さなかったが、ＧＤＮＦＲ−αトランスフェクト細胞はピコモルの濃度でも［¹²⁵Ｉ］ＧＤＮＦに強く結合する。この結合は、５００ｎＭの非標識ＧＤＮＦによりほぼ完全に阻害され、このことは天然ＧＤＮＦの発現レセプターへの特異的結合を示唆する。２９３Ｔ細胞により発現されたＧＤＮＦＲ−αは、ホスファチジルイノシトール−特異的ホスホリパーゼＣ（ＰＩ−ＰＬＣ、ＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒＭａｎｎｈｅｉｍ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）での処理により細胞から放出できる。リガンド結合前におけるトランスフェクト細胞のＰＩ−ＰＬＣでの処理は、細胞のＧＤＮＦ結合能をほぼ完全に削除した。さらに、架橋後のトランスフェクト細胞の処理は、架槁産物の大半を中膜に放出した。これらの結果により、ＧＤＮＦＲ−αｈがＧＰＩ結合を介して細胞膜に固定されていることが強く示唆される。架橋データはさらに、ＧＤＮＦＲ−αの分子量は、約５０−６５ｋＤａであることを示し、このことはグリコシル化レベルが低いことを示唆する。主要な架槁種は、レセプターのモノマーと等しい分子量を有するが、少数派の種はダイマーが認められると予測される分子量に近い。実施例９ＧＤＮＦシグナリングは、ＧＤＮＦＲ−αおよびＲｅｔレセプタ−タンパク質チロシンキナーゼの複合体により仲介される序論ＧＤＮＦ遺伝子において標的化ヌル変異を有するマウスは、自立神経系、および三叉神経および脊髄運動ニューロンにおいて、神経堤細胞由来組織において種々の欠損を示す。最も重度の欠損は、腎臓の欠失および消化管における腸ニューロンの完全な欠失である。ＧＤＮＦノックアウトマウスの発現型は、ｃ−ｒｅｔノックアウト動物のそれと著しく類似しており（Ｓｃｈｕｃｈａｒｄｔら１９９４）、これはＧＤＮＦおよびｃ−ｒｅｔのシグナル変換経路の間に連鎖がある可能性を示唆する。癌原遺伝子ｃ−ｒｅｔは、遺伝子移動実験において単離した癌遺伝子から誘導したプローブを用いて同定した（Ｔａｋａｈａｓｈｉら、Ｃｅｌｌ．４２、５８１−５８８、１９８５；ＴａｋａｈａｓｈｉおよびＣｏｏｐｅｒ、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．、７、１３７８−１３８５、１９８７）。ｃ−ｒｅｔｃＤＮＡの配列解析により、新規レセプタータンパク質チロシンキナーゼ（ＰＴＫ）をコードする大きいオープンリーディングフレームが示された。レセプターＰＴＫのファミリーは、細胞外ドメイン構造および細胞内キナーゼドメインとの配列相同性によりサブファミリーに分類した（ｖａｎｄｅｒＧｅｅｒら、１９９４）。Ｒｅｔの特異な細胞外ドメイン構造は、他の公知のレセプターＰＴＫサブファミリーから逸脱し；シグナルペプチド、カドヘリン様モチーフ、およびシステインに富む領域を含む（ｖａｎＨｅｙｎｉｎｇｅｎ、Ｎａｔｕｒｅ、３６７、３１９−３２０、１９９４；Ｉｗａｍｏｔｏら、１９９３）。インサイトハイブリダイゼーションおよび免疫組織学的分析により、発達中の中枢および末梢神経系およびマウス胚の排出系において高レベルのｒｅｔｍＲＮＡおよびタンパク質発現が示され（Ｐａｃｈｎｉｓら、１９９３；Ｔｓｕｚｕｋｉら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ、１０、１９１−１９８、１９９５）、これによりこれらの組織の発達およびその機能におけるＲｅｔレセプターの役割を示唆する。Ｒｅｔレセプターの機能性リガンドは、同定されておらず、よってＲｅｔシグナリングの分子機構のさらなる理解は制限される。ｃ−ｒｅｔ遺伝子の変異は、家族性髄様甲状腺癌(ＦＭＴＣ)、および多発性分泌腫瘍形成２Ａ（ＭＥＮ２Ａ）および２Ｂ（ＭＥＮ２Ｂ）型において癌の遺伝素因と関連している。これらの疾患は、構成的にＲｅｔキナーゼを活性化する「機能の獲得」変異におそらく起因するだろう（Ｄｏｎｉｓ−Ｋｅｌｌｅｒら、Ｈｕｍ．Ｍｏｌｅｃ．Ｇｅｎｅｔ．２、８５１−８５６、１９９３；Ｈｏｆｓｔｒａら、Ｎａｔｕｒｅ、３６７、３７５−３７６、１９９４；Ｍｕｌｌｉｇａｎら、Ｎａｔｕｒｅ、３６３、４５８−４６０、１９９３；Ｓａｎｔｏｒｏら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２６７、３８１−３８３、１９９５）。それらはｒｅｔが通常発達初期に発現されている特に神経堤由来の組織において癌への素因を付与する。別のｒｅｔ−関連遺伝子疾患である、ヒルシュプルング病（ＨＳＣＲ）は、下部腸管における先天性副交感神経支配欠失を特徴とする（Ｅｄｅｒｙら、Ｎａｔｕｒｅ、３６７、３７８−３８０、１９９４；Ｒｏｍｅｏら、１９９４）。ＨＳＣＲの最も可能性の高い原因は、ナンセンス変異であり、結果としてＲｅｔキナーゼを不活性化するキナーゼドメインまたはミスセンス変異を欠失する切形Ｒｅｔタンパク質が産生される。上記したように、マウスにおけるｃ−ｒｅｔ癌原遺伝子の標的破壊により、腎非形成または重度の発育不全および消化管全体におよぶ腸ニューロンの欠失が生じる（Ｓｃｈｕｃｈａｒｄｔら、１９９４）。この表現型は、ＧＤＮＦノックオウトマウスのそれと極めて類似している。両者を合わせると、これらのデータにより、ＲｅｔおよびＧＤＮＦの両方が、腎臓および腸神経系の発達に極めて重要なシグナル変換経路に関与していることが示唆される。しかしどのようにＲｅｔおよびＧＤＮＦが関与しているかは明らかにされていない。上記したように発現クローニングによるＧＤＮＦＲ−αにおけるｃＤＮＡの単離および特徴付けにより、形質転換ヒト胚腎臓細胞系２９３ＴにおけるＧＤＮＦＲ−αの発現がもたらされる。形質転換により、高（約２ｐＭのＫｄ）および低（約２００ｐＭのＫｄ）親和性結合部位の両方が出現する。この高親和性結合部位は、ＧＤＮＦＲ−αのみのホモダイマーまたはホモーオリゴマー、または他の分子とＧＤＮＦＲ−αのヘテロダイマーまたはヘテロ−オリゴマーからなる。上記で議論したように、ＧＤＮＦＲ−αは細胞質ドメインを欠失しているので、ＧＤＮＦシグナル変換に役割を果たすためには１つ以上の補助分子を介して機能しなければならない。本研究において、我々はＧＤＮＦＲ−αの存在下で、ＧＤＮＦはＲｅｔタンパク質チロシンキナーゼレセプターと結合し、迅速にＲｅｔ自己リン酸化を誘導することを確認する。結果ＧＤＮＦＲ−αを発現するニューロ−２ａ細胞は、高親和性でＧＤＮＦに結合するニューロ−２ａは、内因性に高レベルのＲｅｔタンパク質を発現するが（Ｉｋｅｄａら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ、５、１２９１−１２９６、１９９０；Ｉｗａｍｏｔｏら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ、８、１０８７−１０９１、１９９３；ＴａｋａｈａｓｈｉおよびＣｏｐｐｅｒ、１９８７）、ノーザンブロットにより判断して検出可能なレベルのＧＤＮＦＲ−αｍＲＮＡを発現しないマウス神経芽細胞系である。ＲｅｔはＧＤＮＦＲ−αの存在下でＧＤＮＦと結合できるかを決定するために実験を行い、ＧＤＮＦＲ−αを発現するように工作したニューロ−２ａ細胞への［¹²⁵Ｉ］ＧＤＮＦの結合を調べた。ニューロ−２ａ細胞を、ラットＧＤＮＦＲ −αｃＤＮＡを含む哺乳動物発現ベクター（例えば上記の発現プラスミド）でトランスフェクションさせた。３つのクローン系、ＮＧＲ−１６、ＮＧＲ−３３、およびＮＧＲ−３８を［¹²⁵Ｉ］ＧＤＮＦ結合能について試験した。非結合［¹²⁵Ｉ］ＧＤＮＦをインキュベートの最後に取り除き、細胞に結合した放射活性の量を、実験方法に記載のように決定した。３つ全ての系が［¹²⁵Ｉ］ＧＤＮＦに特異的に結合できたが、親ニューロ−２ａ細胞は殆どもしくは全く［¹²⁵Ｉ］ＧＤＮＦ結合を示さなかった（図６）。結合は、５００ｎＭ非標識ＧＤＮＦの添加により効果的に競合できた。これらの結果は、ニューロ−２ａ細胞上に発現されたＲｅｔレセプターは、ＧＤＮＦＲ−αの非存在下でＧＤＮＦに結合できず、このことはＧＤＮＦＲ−αはニューロ−２ａ細胞において評価可能なレベルで発現されないという以前の観察と一致する。［¹²⁵Ｉ]ＧＤＮＦのＮＧＲ−３８細胞に対する平衡結合は、幅広いリガンド濃度（５００ｎＭ非標識ＧＤＮＦの存在下または非存在下で０．５ｐＭから１ｎＭの［¹²⁵Ｉ］ＧＤＮＦ）で検証した（図７Ａ参照）。インキュベート後、非結合［¹²⁵Ｉ］ＧＤＮＦを除去し、細胞に結合した放射活性を実験方法に記載のように測定した。結果は図７に示す：（Ａ）非標識ＧＤＮＦの存在下（白抜き丸および白抜き四角）または非存在下（黒丸および黒四角）におけるＮＧＲ−３８細胞（丸）およびニューロ−２ａ細胞(四角)に対する［¹²⁵ Ｉ］ＧＤＮＦの平衡結合；（Ｂ）ＮＧＲ−３８細胞への［¹²⁵Ｉ］ＧＤＮＦ結合のスッキャチャード解析。ニューロ−２ａ細胞は、１ｎＭの［¹²⁵Ｉ］ＧＤＮＦの濃度でもほとんど結合を示さず、この結合は過剰の非標識ＧＤＮＦの添加により影響を受けなかった。ＮＧＲ−３８細胞への結合は、図７Ｂに示したようにスキャッチャードプロットにより解析した。２つのクラスの結合部位が検出され、１つはＫｄ＝１．５±０．５ｐＭであり、他方はＫｄ＝３３２±５３ｐＭであった。これらの解離定数は、上記したように、ＧＤＮＦＲ−αを一過性に発現した２９３Ｔ細胞における高および低親和性結合部位で得られた値と非常に近似している。ＧＤＮＦはＧＤＮＦＲ−αを発現するニューロ−２ａ細胞においてＲｅｔと結合するＲｅｔレセプターＰＴＫが、ＧＤＮＦＲ−αを発現する細胞においてＧＤＮＦと結合できるか否かを決定するために、架橋実験をＮＧＲ−３８および親ニューロ−２ａ細胞を用いて実施した。ＮＧＲ−３８細胞を［¹²⁵Ｉ］ＧＤＮＦと共にインキュベートし、架橋試薬で処理し、次いでＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプル緩衝液中またはトリトンＸ−１００溶解緩衝液中で直接溶解し、さらに実験方法に記載のように抗−Ｒｅｔ抗体で免疫沈降させた。免疫沈降物を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによりメルカプトエタノールの非存在下（ＮＲ）または存在下（Ｒ）解析した。溶解物をＲｅｔ特異的抗体で処理し、免疫沈降させ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより還元条件下で解析した（図８参照、バンドは以下のように記録した：〜７５ｋＤａ、黒三角；〜１５０ｋＤａ、白抜き三角；〜１８５ｋＤａ、黒矢印；〜２５０ｋＤａ、アスタリスク；〜４００ｋＤａ、白抜き矢印）。最も際だった架橋種は、〜７５ｋＤａおよび〜１８５ｋＤａであり、強度のやや低いものは〜１５０ｋＤａおよび〜２５０ｋＤａであった。非常に弱い〜４００ｋＤａのバンドも見られた（図８、レーン２）。免疫沈降物を非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより解析した場合、〜７５ｋＤａ、〜１５０および〜１８５ｋＤａバンドが、還元ゲルとほぼ同じ強度で存在したが、〜４００ｋＤａバンドの量は劇的に増加した（図８、レーン４）。より際だってくるものは〜２５０ｋＤでのバンドであった。還元および非還元条件下、親ニューロ−２ａ細胞をＮＧＲ− ３８の代わりに使用した場合、類似の分子量を有するが強度が大きく減少したバンドが観察された（図８、レーン１および３）。〜７５ｋＤａおよび〜１５０ｋＤａ種は、ＧＤＮＦおよびＧＤＮＦＲ−αの架橋複合体を示すようである。なぜなら、同一の分子量を有する種が、Ｒｅｔを発現しない２９３Ｔ細胞において架橋により産生されるからである。さらに、Ｒｅｔの分子量は１７０ｋＤａであるので、Ｒｅｔを含む任意の複合体は、少なくともこのサイズでなければならない。これらの複合体は抗−Ｒｅｔ抗体により免疫沈降するという事実は、それらはゲル解析の条件下で分解するＲｅｔおよびＧＤＮＦ／ＧＤＮＦＲ−α複合体の間の結合産物であることを示唆する。〜１８５ｋＤａでの幅広いバンドは、いくつかのダイマーＧＤＮＦも含まれ得るであろうが、おそらく１分子のモノマー組換えＧＤＮＦ（１５ｋＤａ）と架橋した１分子のＲｅｔ（１７０ｋＤａ）からなると考えられる。この種でのＲｅｔの存在は、別々の実験により確認され、非標識ＧＤＮＦをＮＧＲ−３８細胞に架橋した場合に同分子量のバンドが観察され、産物を抗−Ｒｅｔ抗体でウエスタンブロットにより確認した（データは示していない）。〜４００ｋＤａバンドは、一部にはその分子量を測定することが困難であるため確実に同定されていない。非還元条件下でのみ際だつという事実は、それは還元条件下で観察された１つ以上の種のジスルフィド結合ダイマーであることを示唆する。最も妥当な説明は、それは１８５ｋＤａ種のダイマーであるというものであるが、２つのＲｅｔ、１または２つのＧＤＮＦＲ−α、および１または２つのＧＤＮＦ分子からなる高分子量複合体の混合物ということもあり得る。２５０ｋＤバンドの正確な実体は依然明らかにされていない。１つの可能性は、〜７５ｋＤ（ＧＤＮＦ＋ＧＤＮＦＲ−α）および〜１８５ｋＤ（ＧＤＮＦ＋Ｒｅｔ）複合体の架橋ヘテロダイマーを示すというものである。ＧＤＮＦはＧＤＮＦＲ−αを発現するニューロ−２ａ細胞においてＲｅｔの自己リン酸化を刺激するＧＤＮＦＲ−α存在下における、Ｒｅｔタンパク質チロシンキナーゼのＧＤＮＦとの結合能から、Ｒｅｔの自己リン酸化のＧＤＮＦ刺激の研究が行われた。ＮＧＲ−３８細胞をＧＤＮＦで処理し、溶解し、溶解物を抗−Ｒｅｔ抗体で免疫沈降させた。免疫沈降物を、実験方法に記載した抗−ホスホチロシン抗体を用いてウエスタンブロットにより解析した。ＮＧＲ−３８細胞（図９Ａ、レーン２−４）を、哺乳動物（ＣＨＯ細胞；図９Ａ、レーン４）または大腸菌細胞（図９Ａ、レーン１、３）のいずれかで産生した精製組換えＧＤＮＦで処置した場合、強力なバンドが１７０ｋＤａで観察され、これは成熟形のＲｅｔのチロシン残基の自己リン酸化を示唆する。はるかに弱い対応するバンドがＧＤＮＦ−処理ニューロ−２ａ細胞において観察された（図９Ａ、レーン１）。Ｒｅｔの任意にグリコシル化された１５０ｋＤａ前駆体形上には全くリン酸化が観察されなかった（図９Ａ）。ＧＤＮＦによるＲｅｔ自己リン酸化の誘導は、用量依存性であった。ＮＧＲ−３８細胞におけるＧＤＮＦ−誘導Ｒｅｔチロシンリン酸化の用量応答および動力学は、パネルＢおよびＣに示す。全パネルにおいて、チロシンリン酸化１７０ｋＤＲｅｔバンドは黒矢印で示す。抗−Ｒｅｔ抗体（ＳａｎｔａＣｒｕｚ、Ｃ−１９、カタログ番号＃ｓｃ−１６７）でイムノブロットを再プローブすることにより測定した各レーンにのせたＲｅｔタンパク質の量は、パネルＡの右側に示す。〜１５０ｋＤのバンドは、自己リン酸化されていない任意にグリコシル化した非成熟形Ｒｅｔを示す。図９Ｂに示したように、ＮＧＲ −３８細胞におけるＲｅｔ自己リン酸化の刺激は、５０ｐｇ／ｍＬのＧＤＮＦで検出でき、応答は２０−５０ｎｇ／ｍＬＧＤＮＦで飽和となった。処置後０−２０分間におよぶＮＧＲ−３８細胞における精製組換えＧＤＮＦによるＲｅｔ自己リン酸化の刺激は、図９Ｃに示す。Ｒｅｔ自己リン酸化のレベルの上昇は、ＧＤＮＦ処置の１分以内に観察でき、処置後１０分が最大であった（図９Ｃ）。ＧＤＮＦおよび可溶性ＧＤＮＦＲ−αは、ニューロ−２Ａ細胞においてＲｅｔ自己リン酸化を誘導する上記で議論したように、ＧＤＮＦＲ−αは、ＧＰＩ結合を介して細胞質膜に固定され、ホスファチジルイノシトール特異的ホスホリパーゼＣ（ＰＩ−ＰＬＣ）で処置することにより放出できる。ＮＧＲ−３８細胞をＰＩ−ＰＬＣと共にインキュベートした場合、これらの細胞におけるＲｅｔのＧＤＮＦ−誘導レセプター自己リン酸化は消失した（図１０Ａ；ＰＩ−ＰＬＣ処置（レーン１）または非処置（レーン２および３）ＮＧＲ−３８細胞をＧＤＮＦと共に（レーン１および３）または無しで（レーン２）インキュベートし、実験方法に記載のイムノブロットによりＲｅｔ自己リン酸化について解析した）。図１０Ｂは、ニューロ−２ａまたはＮＧＲ−３８細胞から得られた、ＰＩ−ＰＬＣ／ＣＭの存在下（レーン５−８）または非存在下（レーン１−４）、ＧＤＮＦで処理（レーン２、４、６、８）または処理しない（レーン１、３、５、７）親ニューロ−２ａ細胞、実験方法に記載のイムノブロットによりＲｅｔ自己リン酸化について解析したものを示す。ＧＤＮＦで処置したＮＧＲ−３８細胞を陽性対照として用いた。パネルＡおよびＢの両方において、自己リン酸化１７０ｋＤＲｅｔバンドは黒矢印で示す。ＮＧＲ−３８細胞のＰＩ−ＰＬＣ処理（ＰＩ−ＰＬＣ／ＣＭ）により放出された可溶性ＧＤＮＦＲ−αを含むならし培地を、親ニューロ−２ａ細胞にＧＤＮＦと共に加えた場合、ＮＧＲ−３８細胞のＧＤＮＦ処置で得られたものと同等なＲｅｔレセプターの自己リン酸化が観察された（図１０Ｂ、レーン２および８）。ＧＤＮＦを全く加えない場合、またはニューロ−２ａ細胞のＰＩ−ＰＬＣ処置から誘導したならし培地を試験した場合、バックグラウンドレベルのＲｅｔ自己リン酸化のみが観察された（図１０Ｂ、レーン３−７）。Ｒｅｔ−Ｆｃ融合タンパク質は、ＧＤＮＦおよび可溶性ＧＤＮＦＲ−αにより誘導されるＲｅｔリン酸化を遮断するＧＤＮＦＲ−αの存在下でＧＤＮＦにより誘導されたＲｅｔリン酸化は、レセプター自己リン酸化の結果であることを確認するために、実験を行い、Ｒｅｔ細胞外ドメイン／免疫グロブリンＦｃ（Ｒｅｔ−Ｆｃ）融合タンパク質はＲｅｔ活性化を遮断できるか否かを決定した。ＮＧＲ−３８細胞上で発現された多くのＧＤＮＦαレセプターを遮断することは技術的に困難であるため、Ｒｅｔリン酸化アッセイを、ニューロ−２ａを標的細胞として、およびＰＩ− ＰＬＣで処置したＮＧＲ−３８細胞から除去した培養培地をＧＤＮＦＲ−α源として用いて実施した。細胞を、種々の組合せのＧＤＮＦ（５０ｎｇ／ｍＬ）、可溶性ＧＤＮＦＲ−αを含む培地（例えば、ＮＧＲ−３８細胞から誘導したＰＩ− ＰＬＣ／ＣＭ）、および異なる濃度のＲｅｔ−Ｆｃ融合タンパク質を、図１１に示したように単独でまたは種々の組合せで含む混合物で処置した。ニューロ−２ａ細胞をＧＤＮＦ、可溶性ＧＤＮＦＲ−αを含む培地、Ｒｅｔ−Ｆｃ、またはプレーインキュベート混合物で処理した。次いで、細胞を溶解し、実験方法に記載のように、抗−Ｒｅｔ抗体を用いて、溶解物を免疫沈降によりｃ−Ｒｅｔ自己リン酸化について解析した。免疫沈降物を、抗−ホスホチロシン抗体を用いてウエスタンブロットにより解析した。ＧＤＮＦおよび可溶性ＧＤＮＦＲ−αを含む培地のプレ−インキュベート混合物は、ニューロ−２ａに発現されたＲｅｔレセプターのチロシンリン酸化を、ＧＤＮＦ−処理ＮＧＲ−３８対照細胞と同等のレベルで誘導した（図１１、レーン７および２）。自己リン酸化１７０ｋＤａＲｅｔバンドの位置は、黒矢印で示す。Ｒｅｔ−Ｆｃ融合タンパク質がプレーインキュベートＧＤＮＦ／ＧＤＮＦＲ− α混合物に含まれた場合、Ｒｅｔリン酸化は用量依存的に阻害された（図１１、レーン８−１０）。これにより、Ｒｅｔリン酸化は、ＧＤＮＦＲ−αにより仲介されるＧＤＮＦ／Ｒｅｔ相互作用の結果であることが示唆される。非処理ニューロ−２ａ細胞において、またはＧＤＮＦまたはＲｅｔ−Ｆｃ融合タンパク質の任意の組合せを用いてＧＤＮＦＲ−αの非存在下で処置した細胞において、バックグラウンドレベルのＲｅｔリン酸化のみが観察された（図１１、レーン３−６）。ＧＤＮＦは、胚運動ニューロンにおいて発現されたｃ−ＲＥＴの自己リン酸化を誘導する脊髄運動ニューロンは、インビボにおけるＧＤＮＦ作用の主要な標的の１つである（Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２６６、１０６２−１０６４、１９９４；Ｌｉら、ＰｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓＯｆＴｈｅＮａｔｉｏｎａｌＡｃａｄｅｍｙＯｆＳｃｉｅｎｃｅｓ，Ｕ．Ｓ．Ａ．、９２、９７７１−９７７５、１９９５；Ｏｐｐｅｎｈｅｉｍら、Ｎａｔｕｒｅ、３７３、３４４−３４６、１９９５；Ｙａｎら、Ｎａｔｕｒｅ、３７３、３４１−３４４、１９９５；Ｚｕｒｎら、Ｎｅｕｒｏｒｅｐｏｒｔ、６、１１３−１１８、１９９５）。これらの細胞におけるＧＤＮＦのＲｅｔ自己リン酸化誘導能について試験するために、胚ラット脊髄運動ニューロンを、２０ｎｇ／ｍＬＧＤＮＦを用いて（レーン２および４）または無しで（レーン１および３）処理し、次いで細胞を溶解し、抗−Ｒｅｔ抗体で免疫沈降し、実験方法に記載のように抗−ホスホチロシン抗体でウエスタンブロットにより解析した。ＧＤＮＦで処理した細胞の溶解物において、分子量〜１７０ｋＤａのチロシンリン酸化タンパク質のバンドが観察された（図１２、レーン２）。結合緩衝液のみで処理した細胞には全くシグナルは観察されなかった（図１２、レーン１）。同ウエスタンブロットフィルターを剥がし、抗−Ｒｅｔ抗体で再プローブした場合（すなわち、各レーンにのせたｃ−Ｒｅｔタンパク質の量は、抗−Ｒｅｔ抗体でイムノブロットを再プローブすることにより決定した）、同分子量および類似の強度を有するバンドが両方のサンプルにおいて認められた（図１２、レーン３および４）。ＧＤＮＦ−処理細胞におけるホスホチロシンバンドは、Ｒｅｔタンパク質と共に移動し、このことはＧＤＮＦはＲｅｔの自己リン酸化を刺激することを示す。自己リン酸化Ｒｅｔバンド（レーン１および２）および対応するタンパク質バンド（レーン３および４）は黒矢印で示した。議論ポリペプチド増殖因子は、その同種の細胞表面レセプターへの結合を介して、生物学的効果を顕現する。レセプターは、その構造および作用機構により数個のクラスに分類することができる。これらの分類は、タンパク質チロシンキナーゼ（ＰＴＫ）、セリン／トレオニンキナーゼ、およびサイトカインレセプターを含む。レセプターＰＴＫシグナリングは、リガンドとの直接的な相互作用により開始され、これはレセプタータイマー化またはオリゴマー化を誘導し、次いでレセプター自己リン酸化を誘導する。次いで、活性化レセプターは、細胞内基質を取り入れリン酸化し、カスケード反応を開始し、ついに生物学的応答が引き起こされる（ＳｃｈｌｅｓｓｉｎｇｅｒａｎｄＵｌ１ｒｉｃｈ、Ｎｅｕｒｏｎ９、３８３−３９１、１９９２）。対照的に、セリン／トレオニンキナーゼまたはサイトカインレセプターによるシグナル変換はしばしば、多成分レセプター複合体の形成を含む（ただしリガンド結合およびシグナル変換成分は別個である）。例はＴＧＦ−レセプター複合体、別々の結合（ＩＩ型）およびシグナリング（Ｉ型）成分からなるセリン／トレオニンキナーゼレセプターおよびＣＮＴＦファミリーである。ＣＮＴＦ、インターロイキン−６（ＩＬ−６）および白血球阻害因子（ＬＩＦ）は、そのそれぞれのレセプター複合体において、共通のシグナリング成分、ｇｐ１３０および／またはＬＩＦＲを共有している。これらの複合体のリガンド特異性は、各個々のリガンドへの特異的結合サブユニットにより決定されるが、シグナル変換は、リガンドおよびリガンド結合サブユニットの最初の複合体と、リガンドに直接結合できない他のレセプターサブユニットとの結合を必要とする（Ｉｐら、Ｃｅｌｌ、６９、１１２１−１１３２、１９９２）。ＣＮＴＦレセプター複合体において、リガンド結合成分は、ＣＮＴＦレセプター（ＣＮＴＦＲ）であり、ＧＤＮＦＲと同様、ＧＰＩ−固定膜タンパク質である。本発明は、自己リン酸化が別々のリガンド−特異的結合成分との結合に依存する、レセプターＰＴＫの初めての例の記載を含む。本研究により、ＧＤＮＦＲ−α、高い親和性でＧＤＮＦに結合するＧＰＩ−連結膜タンパク質は、ＧＤＮＦのＲｅｔレセプターＰＴＫとの十分な結合に必要であることが確認される。ＧＤＮＦＲ−αの非存在下で、ＧＤＮＦは、Ｒｅｔに結合またはＲｅｔレセプター自己リン酸化を刺激できない。ＧＤＮＦＲ−αの存在下、ＧＤＮＦはＲｅｔと結合し、用量依存的にＲｅｔ自己リン酸化を急速に誘導する。ＧＤＮＦＲ−αは、上記で議論したように、膜結合または可溶形（図１１）で機能できる。５０ｐｇ／ｍＬ（１．７ｐＭ）のＧＤＮＦ濃度で、ＧＤＮＦＲ −αを発現する細胞のＲｅｔチロシンキナーゼを活性化できるこれはＮＧＲ−３８細胞上の高親和性ＧＤＮＦ結合部位で見られる解離定数（１．５ｐＭ）と一致する。ＧＤＮＦによるＲｅｔ自己リン酸化の急速な誘導（処置の１分後に検出可能）およびＲｅｔ−Ｆｃの自己リン酸化遮断能により、Ｒｅｔは、いくつかの他のレセプターのリン酸化の流れつく結果としてではなく直接活性化されることが示唆される。架橋研究により、ＲｅｔのＧＤＮＦとの十分な結合はＧＤＮＦＲ−αに依存するという仮説が支持される。高レベルのＧＤＮＦＲ −αを発現するＮＧＲ−３８細胞におけるＧＤＮＦのＲｅｔへの架橋は、確固としているが、親ニューロ−２ａ細胞において架橋産物はほとんど検出できない。全ての架橋複合体の決定的な同定は困難であるが、データは明らかに、ＧＤＮＦＲ−αの存在に依存的なＲｅｔとＧＤＮＦの結合を示し、およびＧＤＮＦＲ−α は架橋産物のいくつかに含まれていることを示している。ニューロ−２ａ細胞における少数派の架橋種が存在する理由については明らかでない。ニューロ−２ａ細胞におけるＧＤＮＦＲ−αｍＲＮＡの発現はノーザンブロットでは検出できないが、ＧＤＮＦＲ−αをこれらの細胞で非常に低いレベルで発現することは可能である。Ｒｅｔは培養ラット肝脊髄運動ニューロンにおいてＧＤＮＦにより活性化できるという事実は、さらにＲｅｔ／ＧＤＮＦ相互作用の生物学的相関を示唆する。これらの細胞はインビボにおけるＧＤＮＦの一次標的であり、インビトロにおいて低用量のＧＤＮＦに反応することが示された（Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎら１９９４）。Ｒｅｔリン酸化の刺激は、運動ニューロン細胞を、ＰＩ−ＰＬＣで前処理した場合には消失し（データは示していない）、このことはＧＤＮＦによるＲｅｔの活性化にはＧＤＮＦＲ −αが必要であることを示唆する。リガンドのレセプター細胞外ドメインへの結合は、他の公知のレセプターＰＴＫの活性化における第一段階であるが、本データにより、これはＧＤＮＦおよびＲｅｔには当てはまらないことが示された。図１３は、ＧＤＮＦのＧＤＮＦＲ− αおよびＲｅｔへの結合モデル、およびＧＤＮＦに応答し結果としてＲｅｔＰＴＫの活性化が生じることを示す。このプロセスで最初に生じる事象は、ジスルフィド連結ダイマーＧＤＮＦの、モノマーまたはダイマー形のＧＤＮＦＲ−αへの結合である。現在ダイマーＧＤＮＦＲ−αの存在に関する直接的な証拠は全くないが、２９３Ｔ細胞をＧＤＮＦＲ−αｃＤＮＡでトランスフェクトさせた場合、２つのクラスの結合部位が出現した。この観察に対する最も簡単な説明は、各々それ自体結合親和性を有する、モノマーおよびダイマーＧＤＮＦＲ−αの存在である。これはＧＤＮＦ結合親和性が、Ｒｅｔの存在により見かけ上影響を受けないという発見と一致する。本実験では、ダイマーＧＤＮＦＲ−αは、ＧＤＮＦの非存在下においてそのモノマーと平衡状態にあるかどうか、またはダイマー化はＧＤＮＦ結合により誘導されるかという疑問を解明するものではないので、これらの可能性は別の経路として提示される。ダイマーＧＤＮＦＲ−αおよびダイマーＧＤＮＦからなる複合体は、２つのＲｅｔ分子に結合でき、活性化シグナル複合体を形成する。他のＰＴＫのように、２つのＲｅｔ分子の細胞内触媒ドメイン間の密接な接触により、レセプター自己リン酸化が引き起こされるようである。Ｒｅｔはこの機構により機能するという認識は、Ｒｅｔの定常状態ダイマー化を引き起こすＭＥＮ２Ａ変異により、Ｒｅｔキナーゼの構成的活性化が引き起こされるという事実により支持される（Ｓａｎｔｏｒｏら、１９９５）。運動ニューロンは、５ｆＭという低いＥＤ₅₀でＧＤＮＦに応答することが報告されている（Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎら、１９９４）。生物学的応答についてＥＤ₅₀ で結合親和性を比較することは困難であるが、非常に高親和性のＧＤＮＦ結合部位がこれらの細胞上に存在することは可能である。例えば肝ヒヨコ交換神経ニューロンなどの他の細胞が、１−５ｎＭのＫｄでＧＤＮＦと結合することが報告されている（Ｔｒｕｐｐら、ＪｏｕｒｎａｌＯｆＣｅｌｌＢｉｏｌｏｇｙ、１３０、１３７−１４８、１９９５）。ＧＤＮＦＲ−αは、かかる低い親和性部位のレセプター複合体に関与してないと考えられるが、ＧＤＮＦおよびＲｅｔ間の弱い直接的相互作用は存在し得る。ｃ−ｒｅｔの発現は、発達中の中枢および末梢神経形の多くの細胞系統（腸神経形の細胞を含む）で肝形成の間に観察された（Ｐａｃｈｎｉｓら、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ、１１９、１００５−１０１７、１９９３；Ｔｓｕｚｕｋｉら、１９９５）。神経系外で、ｃ−ｒｅｔ発現は、ウォルフ氏管、尿管芽上皮および腎臓集合管で検出された（Ｐａｃｈｎｉｓら、上記；Ｔｓｕｚｕｋｉら、１９９５）。Ｒｅｔ発現はまた、神経堤から（Ｉｋｅｄａら、１９９０）および外科的に切除した神経芽細胞から（Ｎａｇａｏら、１９９０；Ｔａｋａｈａｓｈｉ＆Ｃｏｏｐｅｒ、１９８７）誘導した全神経芽腫細胞系において検出された。ＧＤＮＦ発現は、胚発達の間、ＣＮＳおよびＰＮＳの両方において、並びに非−ニューロン組織において観察された。多くの非−ニューロン組織に見られるＧＤＮＦ発現のレベルは、神経系におけるよりも高かった（Ｃｈｏｉ−ＬｕｎｄｂｅｒｇおよびＢｏｈｎ、ＢｒａｉｎＲｅｓ．Ｄｅｖ．ＢｒａｉｎＲｅｓ．８５、８０− ８８、１９９５）。ＧＤＮＦＲ−αの発現は、十分に研究されていないが、基本的なノーザンブロット解析により、成人ラットおよびマウスの肝臓、脳、および腎臓において高レベルのＧＤＮＦＲ−αｍＲＮＡの存在が検出された。発達中神経系および腎臓におけるｒｅｔ、ＧＤＮＦおよびＧＤＮＦＲ−αの発現パターンの類似性は、発達中の複合作用と一致する。哺乳動物腎臓発達は、後腎および発達中尿管、ウォルフ氏管の尾部から生じた分枝間の相反する相互作用から生じると推定されている（Ｓａｘｅｎ、腎臓の器官形成、ＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｎｄＣｅｌｌＢｉｏｌｏｇｙｓｅｒｉｅｓ、ＣａｍｂｒｉｄｇｅＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＰｒｅｓｓ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、Ｅｎｇｌａｎｄ、１９８７）。Ｒｅｔの発現は、発達中胚における尿管芽で見られるが、その周辺間葉では見られず、ＧＤＮＦの発現は腎臓の成人後腎帽ではなく非分化で検出された。これらの観察は、ＧＤＮＦおよびＲｅｔの相互作用は、尿管構造の発達の開始に関与することを示唆する。この仮説をさらに支持するものは、腎臓における非常に類似した表現型欠損につながる、ＧＤＮＦおよびｒｅｔ遺伝子の標的破壊により提供される（Ｓｃｈｕｃｈａｒｄｔら、Ｎａｔｕｒｅ、３６７、３８０−３８３、１９９４；Ｓａｎｃｈｅｚ、刊行物）。ＧＤＮＦ（−／−）およびｒｅｔ（−／−）ノックアウト動物の両方で観察された別の主要な表現型欠損は、消化管全体におよぶ腸ニューロンの完全な欠失である。下部腸管における副交感神経支配の先天性欠失を特徴とする遺伝子疾患であるヒルシュプルング病は、ｒｅｔにおける「機能の消失」変異に関連している（Ｒｏｍｅｏら、Ｎａｔｕｒｅ、３６７、３７７−３７８、１９９４、Ｅｄｅｒｙら、１９９４）。その後の報告により（Ａｎｇｒｉｓｔら、Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ、４、８２１−８３０、１９９５）、以前の観察とは対照的に、幾人かのヒルシュプルング患者はｒｅｔに変異がないことが示された。かかる患者は、ＧＤＮＦ、ＧＤＮＦＲ−αまたはこのシグナリング経路の他の重要な成分に変異を有し得ることが今回考えられる。実験方法ＧＤＮＦＲ−αを発現するニューロ−２ａ細胞への［¹²⁵Ｉ］ＧＤＮＦの結合ニューロ−２ａ細胞（ＡＴＣＣ＃ＣＣＬ１３１）を、上記のように、リン酸カルシウム・トランスフェクション・システム（ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ）を用いて製造業者の指示に従って、発現プラスミドを用いてトラスフェクトさせた。トラスフェクトした細胞を、４００μｇ／ｍＬＧ４１８抗生物質（Ｓｉｇｍａ）中での増殖による、プラスミドの発現について選択した。Ｇ４１８耐性クローンを増殖し、［¹²⁵Ｉ］ＧＤＮＦへの結合によりＧＤＮＦＲ−α発現について解析した（Ａｍｅｒｓｈａｍ，Ｉｎｃ．、慣用的ヨード化、カクログ番号＃ＩＭＱ１０５７）。各クローンの細胞を、３×１０⁴細胞／ｃｍ²の密度で、ポリオルニチンで前以て被覆した２４−ウエル組織培養プレートの二重ウエル（ＢｅｃｔｏｎＤｉｃｋｉｎｓｏｎ）に接種した。細胞を、１回氷冷洗浄緩衝液（２５ｍＭＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５を含むＤＭＥＭ）で洗浄し、次いで、５００ｍＭ非標識ＧＤＮＦの存在下または非存在下のいずれかで４℃で４時間結合緩衝液（洗浄緩衝液および０．２％ＢＳＡ）中、５０ｐＭ［¹²⁵Ｉ］ＧＤＮＦと共にインキュベートした。次いで、細胞を４回氷冷洗浄緩衝液で洗浄し、１ＭＮａＯＨに溶解し、細胞結合放射標識を１４７０ウィザード自動ガンマカウンター（ＷａｌｌａｃＩｎｃ．）で定量した。個々のクローンにより発現されたＧＤＮＦＲ−αの量は、非標識ＧＤＮＦの非存在下または存在下における細胞への［¹²⁵１］ＧＤＮＦ結合の比により判断した。３つのクローンを、結合実験に使用する、高、中、および低レベルＧＤＮＦＲ−α発現体の代表例として選択した。これらのクローンにおける、非標識ＧＤＮＦの非存在下および存在下で［¹²⁵Ｉ］ＧＤＮＦ結合比は：ＮＧＲ−３８）１６：１、ＮＧＲ−１６）１２．８：１、およびＮＧＲ −３３）８：１であった。ＮＧＲ−３８細胞への［¹²⁵Ｉ］ＧＤＮＦの平衡結合は、標識ＧＤＮＦの濃度は０．５ｐＭから１ｎＭの範囲である以外は、上記に記載の通りに実施した。全アッセイにおいて、５００ｎＭ非標識ＧＤＮＦの存在下における細胞への放射標識結合の量により判断した非特異的結合は、非標識ＧＤＮＦの非存在下における結合から差し引いた。結合データは、スキャッチャードプロットにより解析した。化学的架橋ニューロ−２ａまたはＮＧＲ−３８細胞を、１回リン酸緩衝液（ＰＢＳ、ｐＨ７．１）で洗浄し、次いで、４時間４℃で１−３ｎＭ［¹²⁵Ｉ］ＧＤＮＦを用いて結合緩衝液中、５００ｎＭ非標識ＧＤＮＦの存在下または非存在下で処理した。結合させた後、細胞を４回氷冷洗浄緩衝液で洗浄し、室温で４５分間１ｍＭビススベレート（ＢＳ³、Ｐｉｅｒｃｅ）と共に洗浄緩衝液中インキュベートした。架橋反応は、細胞を３回トリス−緩衝食塩水（ＰＢＳ、ｐＨ７．５）で洗浄することにより反応停止した。次いで、細胞を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプル緩衝液（８０ｍＭトリスＨＣｌ［ｐＨ６．８］、１０％グリセロール、１％ＳＤＳ、０．０２５％ブロモフェノールブルー）中またはトリトンＸ−１００溶解緩衝液（５０ｍＭＨｅｐｅｓ、ｐＨ７．５、１％トリトンＸ−１００、５０ｍＭＮａＣｌ、５０ｍＭＮａＦ、１０ｍＭピロリン酸ナトリウム、１％アプロチニン（Ｓｉｇｍａ、製造番号Ａ −６２７９）、１ｍＭＰＭＳＦ（Ｓｉｇｍａ、製造番号Ｐ−７６２６）、０．５ｍＭＮａ₃ＶＯ₄（Ｆｉｓｈｅｒ、製造番号＃Ｓ４５４−５０））中に直接溶解した。溶解物を、遠心により清澄とし、５μｇ／ｍＬ抗−Ｒｅｔ抗体（ＳａｎｔａＣｒｕｚ抗体、Ｃ−１９、製造番号＃ＳＣ−１６７）と共にインキュベートし、得られた免疫複合体をプロテインＡ−セファロースＣＬ−４Ｂ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）で沈降させることにより回収した。免疫沈降物を、３回溶解緩衝液で、１回５０ｍＭＮａＣｌおよび２０ｍＭトリス−Ｃｌ、ｐＨ７．５を含む０．５％ＮＰ−４０で洗浄し、次いで、ＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプル緩衝液に再懸濁した。全細胞溶解物および免疫沈降物両方を、ビス：アクリルアミド比１：２００で７．５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分画した。ウエスタンブロット解析Ｒｅｔレセプターの自己リン酸化をウエスタンブロツト解析により検証した。簡潔には、細胞をアッセイの２４時間前に６−ウエル組織培養皿に１.５×１０⁶ 細胞／ウエルの密度で接種した。細胞を１回結合緩衝液で洗浄し、単独または組合せて種々の濃度の異なる試薬（ＧＤＮＦ、ＰＩ−ＰＬＣ、ＰＩ−ＰＬＣ／ＣＭ、およびＲｅｔ−Ｆｃ融合タンパク質を含む）を用いて、結合緩衝液中、種々の反応時間で処理した。処理した細胞および非処理対照を、トリトン−Ｘ溶解緩衝液中で溶解し、上記の抗−Ｒｅｔ抗体（ＳａｎｔａＣｒｕｚ、Ｃ−１９、製造番号＃ＳＣ−１６７）およびプロテイン−Ａセファロースを用いて免疫沈降した。免疫沈降物をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分画し、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅにより記載されたようにニトロセルロース膜に移行した（抗体：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ．ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ：ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ、ＮｅｗＹｏｒｋ、１９８８）。膜は５％ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ）により前以て遮断し、レセプターのチロシンリン酸化レベルを、膜を抗−ホスホチロシンモノクローナル抗体４Ｇ１０（ＵＢＩ、製造番号＃０５−３２１）で室温で２時間ブロッティングすることにより測定した。各レーンに含まれるタンパク質の量は、同膜を抗−Ｒｅｔ抗体を用いて剥がし再プローブすることにより測定した。最後に、膜を製造業者の指示に従って化学蛍光試薬（ＥＣＬ、Ａｍｅｒｓｈａｍ）で処理し、Ｘ線フィルム（Ｈｙｐｅｒｆｉｌｍ−ＥＬＣ、Ａｍｅｒｓｈａｍ）にあてた。ＰＩ−ＰＬＣを用いた細胞の処理およびＰＩ−ＰＬＣ処理ならし培地の作成ＧＰＩ−結合ＧＤＮＦＲ−αを細胞表面から放出するために、細胞を１回洗浄緩衝液で洗浄し、次いで、１Ｕ／ｍＬホスファチジルイノシトール特異的ホスホリパーゼＣ（ＰＩ−ＰＬＣ、ＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒＭａｎｎｈｅｉｍ、製造番号＃１１４３０６９）と共に結合緩衝液中３７℃で４５分間インキュベートした。次いで、細胞を３回洗浄緩衝液で洗浄し、さらにＲｅｔ自己リン酸化アッセイまたは架槁のために処理した。ＰＩ−ＰＬＣ処理ならし培地（ＰＩ−ＰＬＣ／ＣＭ）の作成のために、８×１０⁶細胞を、細胞を３７℃で５−１０分間、２ｍＭＥＤＴＡを含むＰＢＳで処理することにより組織培養皿から取り出した。細胞を１回洗浄緩衝液で洗浄し、１Ｕ／ｍＬＰＩ−ＰＬＣを含む結合緩衝液１ｍＬ中に再懸濁し、３７℃で４５分間インキュベートした。細胞をペレット化し、ＰＩ−ＰＬＣ／ＣＭを回収した。Ｒｅｔ−Ｆｃ融合タンパク質の調製ｃ−Ｒｅｔの全コード領域を含むｃＤＮＡを、マウスｃ−Ｒｅｔの最初の２０アミノ酸に対応するオリゴヌクレオチドプローブを用いて、１７日目の胎盤ｃＤＮＡライブラリーから単離した（Ｉｗａｍｏｔｏら、１９９３；ｖａｎＨｅｙｎｉｎｇｅｎ、１９９４）。Ｒｅｔレセプターの細胞外ドメインのコード領域（最後のアミノ酸Ｒ６３６で終結する）を、ヒトＩｇＧ（ＩｇＧＩ）のＦｃ領域をコードするＤＮＡでインフレーム融合し、前記したように発現ベクターｐＤＳＲ２にサブクローニングした（Ｂａｒｔｌｅｙら、Ｎａｔｕｒｅ、３６８、５５８ −５６０、１９９４）。ｒｅｔ−Ｆｃ／ｐＤＳＲａ２プラスミドを、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞にトランスフェクトし、組換えＲｅｔ−Ｆｃ融合タンパク質をＮｉ⁺⁺カラム（Ｑｉａｇｅｎ）を用いてアフィニティークロマトグラフィーにより精製した。胚ラット脊髄運動ニューロン培養物の調製富化胚ラット脊髄運動ニューロン培養物を、Ｅ１５スプラウグ−ダウリーラット胎児の全脊髄から実験の２４時間前に調製した。脊髄を切開し、髄膜および後根神経節（ＤＲＧ）を取り出した。脊髄を小片に切断し、Ｌ１５培地中パパインで消化した（パパインキット、Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ）。解離細胞懸濁液に含まれる他の型の細胞よりも大きい運動ニューロンを、６．８％メトリザミド勾配を用いて富化した（ＣａｍｕおよびＨｅｎｄｅｒｓｏｎ、ＪＮｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ、４４、５９−７０、１９９２）。メトリザミド緩衝剤および細胞懸濁液の間の界面に位置する富化運動ニューロンを、回収し、洗浄し、およびポリ−Ｌ−オルニチンおよびラミニンで前以て被覆した組織培養皿に、〜９×１０⁴細胞／ｃｍ²の密度で接種し、３７℃で培養した。実施例１０ニューチュリンおよびＧＤＮＦ−誘導Ｒｅｔ活性化のＧＲＲ２仲介本研究は、ニューチュリンが、ＧＤＮＦＲ−αおよびＧＤＮＦＲ−αに関連した新規なレセプターであるＧＲＲ２の両方に結合することを示す。ＧＤＮＦＲ− αおよびＧＲＲ２の両方共、Ｒｅｔタンパク質チロシンキナーゼのニューチュリン−誘導自己リン酸化を仲介できる。ＧＤＮＦはまた、ＧＤＮＦＲ−αおよびＧＲＲ２の両方に結合し、どちらの結合レセプターの存在下でもＲｅｔを活性化する。しかし、ニューチュリンはＧＤＮＦよりもより効果的にＧＲＲ２に結合するが、ＧＤＮＦはニューチュリンよりもより効果的にＧＤＮＦＲ−αに結合する。これらのデータにより、交差はあるが、ＧＤＮＦはＧＤＮＦＲ−αの基本的なリガンドであり、ニューチュリンはＧＲＲ２に選択性を示すことが示唆される。序論近年、Ｋｏｔｚｂａｕｅｒら（Ｎａｔｕｒｅ、３８４、４６７−４７０、１９９６）は、ＧＤＮＦとアミノ酸配列が約４２％同一である新規栄養因子のニューチュリンのクローニングを報告した。ＧＤＮＦおよびニューチュリンは両方共、前後の形で合成され、その前駆体分子はタンパク質加水分解プロセスを受けて、約１００アミノ酸の成熟タンパク質を生成し、結合してジスルフィド結合ホモダイマーとなる。ＧＤＮＦの構造およびその空間パターンに必須な全７つのシステイン残基は、ニューチュリンにおいて保存されている（Ｋｏｔｚｂａｕｅｒら、１９９６）。ニューチュリンの生物学的活性は依然完全に調査されていないが、ＧＤＮＦのそれと非常に近似しているようである。ニューチュリンおよびＧＤＮＦは両方共、上頚神経節（ＳＣＧ）由来の交換神経ニューロン、および結節（ＮＧ）および後根神経節（ＤＲＧ）両方の感覚ニューロンの生存を亢進することが示された。ニューチュリンおよびＧＤＮＦｍＲＮＡは、胚および成人の種々のニューロン性および非−ニューロン性組織の両方に広範に分布している。両方共、脳、腎臓、および肺において認められ、ニューチュリンｍＲＮＡはまた新生児血液にも高レベルで発現されている。ＧＤＮＦおよびニューチュリン間の構造的および生物学的類似性により、その作用は同一または関連レセプターにより仲介され得ることが示唆される。ＧＤＮＦレセプターは、ＧＤＮＦレセプターα（ＧＤＮＦＲ−α）およびＲｅｔタンパク質チロシンキナーゼ（ＰＴＫ）の複合体からなる（Ｊｉｎｇら、Ｃｅｌｌ、８５、１１１３−１１２４、１９９６；Ｔｒｅａｎｏｒら、Ｎａｔｕｒｅ、３８２、８０−８３、１９９６）。ＧＤＮＦＲ−αは、グリコシル−ホスファリジルイノシトール（ＧＰＩ）固定細胞表面分子であり、ＧＤＮＦと結合する機能を有するが、細胞質ドメインを欠失しているため独立してシグナルを出すことはできない。ＧＤＮＦシグナリングは、ＧＤＮＦおよびＧＤＮＦＲ−αの複合体とＲｅｔとの結合によりなされ、その結果Ｒｅｔキナーゼが活性化される。ＧＤＮＦＲ−αｍＲＮＡは、ニューロン性および非ニューロン性組織に広範に分布し、肝発達から成人を通して発現されており、生物学的機能の範囲が広範であることを示す（Ｔｒｅａｎｏｒら、１９９６；Ｆｏｘら、非公開データ）。ＧＤＮＦレセプター複合体の他の成分であるＲｅｔは、ｒｅｔ癌原遺伝子によりコードされるレセプター型ＰＴＫである。ＲｅｔｍＲＮＡおよびタンパク質は、ＣＮＳおよびＰＮＳ並びに腎臓において高度に発現されている。ｒｅｔ遺伝子における種々の変異は、家族性髄様甲状腺癌（ＦＭＴＣ）、多発性分泌腫瘍形成２Ａ（ＭＥＮ２Ａ）および２Ｂ（ＭＥＮ２Ｂ）型、およびヒルシュプルング病を含む、遺伝性ヒト疾患に関連性がある。ノックアウトマウスにおけるｒｅｔ遺伝子の標的破壊により、腎非形成または重度の発育不全および全体の腸神経形の欠失を含む、重度の表現型傷害が引き起こされる。これらの傷害は、ＧＤＮＦヌル変異により引き起こされるものと極めて類似しており、このことはＲｅｔを介したＧＤＮＦ−仲介シグナリングは、これらの組織の発達に必要とされることを示す。しかし、はるかに重篤度の低い傷害が、ＧＤＮＦＲ−αおよびＲｅｔの両方が発現されている数多くのニューロン構造において、例えば三叉および前庭神経節、顔面運動ニューロン、黒質、および青斑に検出された（Ｓｃｈｕｃｈａｒｄｔら、Ｎａｔｕｒｅ、３６７、３８０− ３８３、１９９４；Ｔｒｅａｎｏｒら、１９９６）。これにより、ＧＤＮＦシグナリングはこれらの構造の胚発達には必要でないか、またはそれらの代価となり得るＧＤＮＦまたはＲｅｔに類似した未知のシグナリング分子が存在し得ることが示される。また、これらの組織の胚発達は、別の依然として未知のシグナリング系に完全に依拠しているかもしれない。本実施例は、新規ＧＤＮＦＲ−α関連レセプターＧＲＲ２のクローニングを記載し、ＧＲＲ２はニューチュリンのレセプターである証拠を提供する。ＧＤＮＦおよびＧＤＮＦＲ−αに類似して、ニューチュリンは効果的にＧＲＲ２に結合し、Ｒｅｔ活性化を誘導する。またデータにより、ＧＤＮＦおよびニューチュリンの両方共、ＧＤＮＦＲ−αまたはＧＲＲ２のいずれかと相互作用でき、いずれかの結合レセプターの存在下でＲｅｔＰＴＫを活性化できることを示す。ＧＲＲ２のクローニングおよび配列解析ＧＤＮＦＲ−αに高い相同性を示すヒト発現配列タグ（ＥＳＴ）が、公共的に入手できる核酸配列データベースのＦＡＳＴＡ検索により判明した（Ｍａｒｒａら、１９９６、ＷａｓｈＵ−ＨＨＭＩマウスＥＳＴプロジェクト、非公開）。このＥＳＴの末端に対応するオリゴヌクレオチドを合成し、逆転写−複製連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）において鋳型であるヒト胎児脳ｍＲＮＡと共に使用した。期待した長さのフラグメントを単離し、ハイブリダイゼーションプローブとして使用し、ヒト胎児脳ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングした。５つの陽性クローンを同定し、最も長いクローンを配列決定した。このクローンは、配列がＧＤＮＦＲ−αに関連性のある４６４アミノ酸タンパク質をコードする大きなオープンリーディングフレームを含んだ。我々はこのタンパク質をＧＤＮＦＲ−α関連レセプター２（ＧＲＲ２）と呼ぶ。上記のオリゴヌクレオチドはまた、ラット光受容体ｃＤＮＡライブラリー（Ｊｉｎｇら、１９９６）からのプールのＰＣＲによるスクリーニングに使用し、期待した長さの産物を単一のプールから得た。このプールの個々のｃＤＮＡクローンを、放射標識ＰＣＲ産物に対してハイブリダイゼーションし、配列決定することにより同定した。このクローンは、ヒトＧＲＲ２とほぼ同一な４６０アミノ酸ペプチドをコードするオープンリーディングを有する２．２ｋｂのインサートを含んだ。ヒトおよびラットＧＤＮＦＲ−αとＧＲＲ２のアミノ酸配列の比較を、図２０に示す。影の領域は、全４つのレセプター間のアミノ酸配列保存を示し、囲った領域は異なる種由来の同一のレセプター間でのみの保存を示す。ＧＤＮＦＲ−α およびＧＲＲ２両方のアミノ酸配列は、種間で極めてよく保存されており、各ヒトレセプターはそのラット対応物に対して９２％同一である。ヒトＧＤＮＦＲ− α（ｈＧＤＮＦＲ−α）およびヒトＧＲＲ２（ｈＧＲＲ２）間での全体のアミノ酸配列同一性は４８％である。配列はＣ−末端領域で最も相違し、ｈＧＤＮＦＲ −αのアミノ酸３５０−４６５は、ｈＧＲＲ２のアミノ酸３６１−４６４とはわずか２２％の同一性である。Ｎ−末端領域において、ｈＧＤＮＦＲ−αおよびｈＧＧＲ２はより密接に関連し、５６％アミノ酸同一性を有する。ラットＧＤＮＦＲ−αおよびＧＲＲ２（ｒＧＤＮＦＲ−αおよびｒＧＲＲ２）間の対応する同一性は非常に類似している：全体で４８％、Ｃ−末端領域で２６％、およびＮ−末端領域で５５％。配列の比較により、ＧＤＮＦＲ−αおよびＧＲＲ２は構造的に非常に類似しているようである。ＧＤＮＦＲ−αに見られる３１システイン残基の３０位（太文字で示す、図２０）はヒトおよびラットＧＲＲ２の両方で保存されている（１つの追加のシステイン残基がｈＧＲＲ２のＮ −末端付近に存在している）。さらに、細胞膜へのＧＤＮＦＲ−αのＧＰＩ−結合に関与している疎水性Ｃ−末端も（Ｊｉｎｇら、１９９６；Ｔｒｅａｎｏｒら、１９９６）、ＧＲＲ２に存在する。図２０ＧＤＮＦＲ−αおよびＧＲＲ２ペプチド配列の比較ヒトおよびラットＧＤＮＦＲ−αおよびＧＲＲ２のアミノ酸配列をアラインした。影の領域は、全４つの配列で同一なアミノ酸を示す。囲った領域は、ＧＤＮＦＲ−αおよびＧＲＲ２間ではなく、同一レセプターのラットおよびヒトのオルトログ（ｏｒｔｈｏｌｏｇ）間の保存を示す。ニューチュリンおよびＧＤＮＦは両方共ＬＡ−Ｎ−５およびＮＧＲ−３８細胞に結合するＬＡ−Ｎ−５は、高レベルのｒｅｔｍＲＮＡを発現するヒト神経芽細胞腫細胞系（ＳｏｎｎｅｎｆｅｌｄおよびＩｓｈｉｉ、Ｊ．ＮｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅＲｅｓｅａｒｃｈ、８：３７５−３９１、１９８２）である（Ｂｏｕｎｏｎｅら、Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ．Ｒｅｓ．、２１７：９２ −９９、１９９５）。ＧＤＮＦＲ−αおよびＧＲＲ２に特異的なプライマーを用いたＲＴ−ＰＣＲ実験により、これらの細胞がＧＲＲ２ｍＲＮＡを発現することが示されたが、ＧＤＮＦＲ−αｍＲＮＡは検出されなかった（データは示していない）。ＮＧＲ−３８は、マウスニューロ−２ａ細胞から誘導した細胞系である（Ｊｉｎｇら、１９９６）。高レベルのＧＤＮＦＲ−αおよびＲｅｔの両方を発現するが（Ｊｉｎｇら、１９９６）、検出可能なＧＲＲ２（データは示していない）は全く発現せず、ＧＤＮＦに特異的に結合する。ＬＡ−Ｎ−５およびＮＧＲ−３８細胞を、［¹²⁵ Ｉ］−標識組換えヒトニューチュリン（ＮＴＮ）またはＧＤＮＦと共に、過剰の非標識リガンドの非存在下または存在下でインキュベートした。図２１Ａに示されるように、［¹²⁵Ｉ］ＮＴＮは、［¹²⁵Ｉ］ＧＤＮＦよりも強力にＬＡ−Ｎ−５細胞に結合したが、両方の結合共検出可能なレベルであった。［¹²⁵Ｉ］ＮＴＮのＬＡ−Ｎ−５細胞への結合は、非標識ニューチュリンにより大きく阻害されたが、ＧＤＮＦによっては阻害されなかった。［¹²⁵Ｉ］ＧＤＮＦはまたＬＡ−Ｎ−５細胞にも結合したが、結合は冷ＧＤＮＦまたはニューチュリンのいずれかにより阻害された図２１Ｂは、［¹²⁵Ｉ］ＮＴＮおよび［¹²⁵Ｉ］ＧＤＮＦのＧＤＮＦＲ−α発現細胞系ＮＧＲ−３８への結合を示す。［¹²⁵Ｉ］ＮＴＮおよび［¹²⁵Ｉ］ＧＤＮＦの両方共ＮＧＲ−３８細胞に結合するが、［¹²⁵Ｉ］ＧＤＮＦはより強力に結合した。ＬＡ−Ｎ−５細胞において観察されたように、［¹²⁵Ｉ］ＧＤＮＦのＮＧＲ−３８細胞への結合は、非標識ニューチュリンおよびＧＤＮＦの両方により阻害されたが、［¹²⁵Ｉ］ＮＴＮの結合はニューチュリンによってのみ置換できた（図２１Ｂ）。図２１ニューチュリンおよびＧＤＮＦのＬＡ−Ｎ−５およびＮＧＲ−３８細胞への結合ＬＡ−Ｎ−５（Ａ）およびＮＧＲ−３８（Ｂ）細胞を、５０ｐＭの［¹²⁵Ｉ］ＮＴＮまたは［¹²⁵Ｉ］ＧＤＮＦのいずれかと共に、非標識ＧＤＮＦ（暗灰色棒）またはニューチュリン（黒棒）の非存在下（明灰色棒）または存在下、４℃で２時間インキュベートした。非結合リガンドを、インキュベートの最後に除去し、細胞に結合した放射活性を記載のように測定した。ニューチュリンおよびＧＤＮＦのＧＤＮＦＲ−αおよびＧＲＲ２への架橋結合実験により、ニューチュリンおよびＧＤＮＦの両方共ＧＤＮＦＲ−αおよびＧＲＲ２と相互作用することが示唆される。しかし、ＧＲＲ２特異的抗体の欠失により、これらの相互作用の研究がより困難となった。この困難を克服するために、２９３Ｔ細胞にトランスフェクトさせた時に一過性的にＧＤＮＦＲ−α／ＦｃおよびＧＲＲ２／Ｆｃ融合タンパク質を発現するプラスミドを産生した。ＧＤＮＦＲ−α／ＦｃまたはＧＲＲ２／Ｆｃ融合タンパク質のいずれかを含むならし培地（ＣＭ）を、［¹²⁵Ｉ］ＮＴＮまたは［¹²⁵Ｉ］ＧＤＮＦと共にインキュベートし、化学架橋させ、次いで、プロテイン−Ａセファロースビーズを用いて直接沈降させた。免疫沈降物をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより解析した（図２２）。［¹² ⁵ Ｉ］ＧＤＮＦまたは［¹²⁵Ｉ］ＮＴＮを用いた場合、それぞれ、主な種である１００−１２０ｋＤおよび９０−１１０ｋＤが観察された（図２２）。高分子量の強いバンド、ＧＤＮＦＲ−α／Ｆｃの〜３００ｋＤおよびＧＲＲ２／Ｆｃの〜２８０ｋＤもまた観察された（図２２）。さらに、少量のバンドである、［¹²⁵Ｉ］ＧＤＮＦレーンにおける〜１５ｋＤ、３５ｋＤ、および６０ｋＤ、および［¹²⁵Ｉ］ＮＴＮレーンにおける〜１２ｋＤ、２６ｋＤ、および５０ｋＤが可視的であった（図２２）。偽トランスフェクト細胞のＣＭを用いた場合、架橋バンドは全くプロテイン−Ａセファロースによって沈降しなかった（データは示していない）。過剰の非標識リガンドを対照サンプルに添加した場合、皆無またははるかに弱い放射標識バンドが検出された（図２２）。図２２ニューチュリンおよびＧＤＮＦのＧＤＮＦＲ−αおよびＧＲＲ２レセプターへの化学的架橋ＧＤＮＦＲ−α／Ｆｃ（ＧＤＮＦＲ−α）またはＧＲＲ２／Ｆｃ（ＧＥＥ２）融合タンパク質を含むＣＭを、１０ｎＭの［¹²⁵Ｉ］ＮＴＮ（Ｎ）または５ｎＭの［¹²⁵Ｉ］ＧＤＮＦ（Ｇ）のいずれかと共に、ニューチュリン（Ｎ）またはＧＤＮＦ（Ｇ）の存在下（＋非標識）または非存在下（−非標識）でインキュベートした。結合したレセプター−リガンド複合体を、１ｍＭのＢＳ³により化学的に架橋し、プロテイン−Ａセファロースで沈降させ、記載のようにＳＤＳ−ＰＡＧＥで解析した。黒矢印は、９０−１１０ｋＤおよび１００−１２０ｋＤの架橋種を示す。白抜き矢印は〜２８０ｋＤおよび〜３００ｋＤの複合体を示す。ニューチュリンはＧＤＮＦＲ−αを発現する細胞においてＲｅｔ自己リン酸化を誘導するニューチュリンのＧＤＮＦＲ−αとの結合能は、ＧＤＮＦのようにニューチュリンはＧＤＮＦＲ−αを介してＲｅｔを活性化し得ることを示す。この可能性を検証するために、ＮＧＲ−３８細胞におけるニューチュリンのＲｅｔ自己リン酸化誘導能について試験した。ＮＧＲ−３８細胞を、０−５０ｎＭの範囲のニューチュリン濃度で処理し、溶解し、溶解物を抗−Ｒｅｔ抗体で免疫沈降させた。免疫沈降物をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより解析し、次いで、抗−ホスホチロシン抗体を用いてイムノブロットを行った。成熟形のＲｅｔにおけるチロシン残基の自己リン酸化を示す１７０ｋＤのバンドが、全レーンにおいて認められた（図２３、左からレーン８−１４）。はるかに弱い対応するバンドがニューチュリン−処理ニューロ−２ａ細胞において認められた（データは示していない）。ニューチュリンによるＲｅｔ自己リン酸化の誘導は、用量依存的である。ＮＧＲ−３８細胞におけるＲｅｔ自己リン酸化の刺激は、５００ｐＭニューチュリンで検出できた（図２３）。ニューチュリンの代わりにＧＤＮＦを用いた平行実験において、バックグラウンド以上の１７０ｋＤのＲｅｔバンドのリン酸化レベルの上昇が、５ｐＭのＧＤＮＦ濃度で見られた（図２３、左からレーン１−７）。フィルターを剥がし、抗Ｒｅｔ−抗体で再プローブした場合、１７０ｋＤのＲｅｔタンパク質バンドがほぼ等しい強度で全レーンに出現した（データは示していない）。図２３ニューチュリンおよびＧＤＮＦは、ＮＧＲ−３８細胞においてＲｅｔ自己リン酸化を誘導するＮＧＲ−３８細胞を、記載のように種々の濃度のＧＤＮＦまたはニューチュリンで処理した。細胞を溶解し、抗−Ｒｅｔ抗体で免疫沈降させ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分画し、Ｒｅｔリン酸化について抗−ホスホチロシン抗体でブロッティングした。リン酸化Ｒｅｔのバンドは矢印で示す。ニューチュリンおよびＧＤＮＦは、ＬＡ−Ｎ−５細胞においてＲｅｔ自己リン酸化を誘導するニューチュリンおよびＧＤＮＦの両方共、ＧＲＲ２に結合し、ＲｅｔＰＴＫは、ニューチュリンまたはＧＤＮＦのいずれかによりＧＤＮＦＲ−αを介して活性化できる。これらの観察により、ＧＲＲ２は、Ｒｅｔのニューチュリンおよび／またはＧＤＮＦ活性化を仲介可能であり得ることが示唆される。この可能性を検証するためにＧＲＲ２およびＲｅｔを発現するヒトＬＡ−Ｎ−５線維芽細胞腫細胞を、種々の濃度のニューチュリンまたはＧＤＮＦで処理し、前記の章で記載のようにイムノブロッティング用に処理した（図２４）。示されるように、ニューチュリンおよびＧＤＮＦの両方共、Ｒｅｔ自己リン酸化を誘導する（図２４）。図２４ニューチュリンおよびＧＤＮＦはＬＡ−Ｎ−５細胞においてＲｅｔ自己リン酸化を誘導するＬＡ−Ｎ−５細胞を、記載のように種々の濃度のＧＤＮＦまたはニューチュリンで処理した。細胞を溶解し、抗−Ｒｅｔ抗体で免疫沈降させ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分画し、Ｒｅｔリン酸化について抗−ホスホチロシン抗体でブロッティングした。リン酸化Ｒｅｔのバンドは矢印で示す。ニューチュリンおよびＧＤＮＦはＬＡ−Ｎ−５およびＮＧＲ−３８細胞においてＭＡＰキナーゼ活性化を誘導する我々は、ニューチュリンおよびＧＤＮＦの両方共、ＧＤＮＦＲ−αまたはＧＲＲ２のいすれかを発現する細胞において、Ｒｅｔ自己リン酸化を誘導できることを実証した。次いで、我々はニューチュリンおよび／またはＧＤＮＦによるＲｅｔキナーゼの活性化は、下流シグナリング分子であるＭＡＰキナーゼの活性化をもたらすかを試験した。ＬＡ− Ｎ−５およびＮＧＲ−３８細胞の両方共、ニューチュリン、ＧＤＮＦまたはＮＧＦのいずれかで処理した。処理した細胞を、直接ＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプル緩衝液に溶解し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分画し、抗−リン酸化ＭＡＰキナーゼ抗体を用いてイムノブロッティングした（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ、Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ）。図２５に示したように、ＭＡＰキナーゼのｐ４４およびｐ４２アイソフォームの両方共、ニューチュリンおよびＧＤＮＦの両方により、ＬＡ−Ｎ−５またはＮＧＲ−３８細胞のいずれかにおいて活性化されるようである。ＮＧＦによるＭＡＰキナーゼ活性化（陽性対照として用いた）もまた観察された。図２５（パネルＡおよびＢ）ニューチュリンおよびＧＤＮＦはＬＡ−Ｎ−５およびＮＧＲ−３８細胞においてＭＡＰキナーゼ活性化を誘導する２５ＡＬＡ−Ｎ−５細胞を、記載のように種々の濃度のＧＤＮＦまたはニューチュリンで処理した。細胞を、０．５ｍＭＮａＶＯ₄を含む２×ＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプル緩衝液中で直接溶解し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分画し、リン酸化ＭＡＰキナーゼ（ＭＡＰＫ−Ｐ）に対する抗体でブロッティングした。２５Ｂ膜を剥がし、各レーンにのせたＭＡＰキナーゼタンパク質の量について（ＭＡＰＫ）抗−ＭＡＰキナーゼ抗体で再プローブした。議論ほとんどのレセプターＰＴＫによるシグナル変換は、そのリガンドとの直接的相互作用によりおよび続くレセプターの活性化により開始される。リガンド結合における補助分子であるＧＤＮＦＲ−αのクローニングおよび特徴付けにより、ＲｅｔレセプターＰＴＫがＧＤＮＦシグナルを変換する新規な機構が判明した。ＧＤＮＦはＲｅｔのみに結合するのではなく、代わりに、初めにＧＤＮＦＲ−α に結合し、次いでＧＤＮＦ−ＧＤＮＦＲ−α複合体の一部としてＲｅｔと相互作用する。新規にクローン化されたＧＲＲ２は、アミノ酸レベルおよび３次元構造の両方においてＧＤＮＦＲ−αと関連する。それはＧＤＮＦＲ−αと４８％同一のアミノ酸残基を有し、その中には３１システイン中３０がある。我々は、ニューチュリンおよびＧＤＮＦの両方共、ＧＤＮＦＲ −αおよびＧＲＲ２に結合することを実証した。ＧＤＮＦまたはニューチュリンのＧＤＮＦＲ−αまたはＧＲＲ２への結合により、リガンドのＲｅｔとのさらなる結合、および結果として下流シグナリング分子であるＲｅｔＰＴＫおよびＭＡＰキナーゼの活性化がもたらされる。しかし、各リガンドは１つのレセプターに優先的に結合するようである。ニューチュリンは、ＧＤＮＦよりも効果的にＧＲＲ２発現ＬＡ−Ｎ−５細胞に結合し、ＧＤＮＦは、ニューチュリンよりも効果的にＧＤＮＦＲ−α発現ＮＧＲ−３８細胞に結合する。なぜＧＤＮＦＲ−αおよびＧＲＲ２の両方への［¹²⁵Ｉ］ＧＤＮＦの結合は、非標識ＧＤＮＦおよびニューチュリンにより置換できるが、［¹²⁵Ｉ］ＮＴＮの結合は冷ニューチュリンによってのみ阻害できるのか、この時点では明らかではない。結合研究と一致して、ＧＤＮＦは、ＧＲＲ２／Ｆｃよりも、より効果的にＧＤＮＦＲ−α／Ｆｃ融合レセプターに架橋するが、ニューチュリン架橋は逆の結果を示す。実験方法ＧＲＲ２のｃＤＮＡクローニングＧＤＮＦＲ−αに関連した配列に関するゲンバンクデータベースの探索により、ＥＳＴ、Ｈ１２９８１．Ｇｂ＿Ｅｓｔ１が同定された。Ｈ１２９８１．Ｇｂ＿ＥＳｔ１のヌクレオチド４７−６５（５’−ＣＴＧＣＡＡＧＡＡＧＣＴＧＣＧＣＴＣＣ−３’）および２４４−２６５（５’−ＣＴＴＧＴＣＣＴＣＡＴＡＧＧＡＧＣＡＧＣ−３’）に対応するプライマーを合成し、鋳型としてヒト胎児脳ｍＲＮＡと共にＲＴ−ＰＣＲに用いた（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、製造番号＃６４０１９−１）。２１８ｎｔフラグメントを増幅し、ｐＢｌｕｅ−Ｓｃｒｉｐｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、ＬａＪｏｌｌａ、ＣＡ）にサブクローニングし、配列決定して元のＥＳＴとの対応性を確かめた。次いで、フラグメントを、ランダム・プライムドＤＮＡ標識キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、ＬａＪｏｌｌａ、ＣＡ）を用いて製造業者の指示に従って［³²Ｐ］−ｄＣＴＰで放射標識した。放射標識プローブを用いて、ヒト胎児脳ｃＤＮＡライブラリーをスクリ−ニングした（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、ＬａＪｏｌｌａ、ＣＡ）。２百万クローンを１５ｃｍアガロースプレートにのせ、二重ニトロセルロースフィルター上で複製した。フィルターを５５℃で３．５時間、２００ｍｌの６×ＳＳＣ、１×デンハード、０．５％ＳＤＳ、および５０μｇ／ｍｌサケ精子ＤＮＡ中プレハイブリダイズさせた。２×１０⁸ｃｐｍの放射標識プローブを添加した後、ハイブリダイゼーションを１８時間続けた。次いで、フィルターを２回３０分間各５５℃で０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中洗浄し、一晩強化スクリーンと共にＸ線フィルムにあてた。５つの陽性クローンを同定し、そのＤＮＡ配列を決定した。上記のオリゴヌクレオチドプライマーはまた、ラット光受容体ｃＤＮＡライブラリーの２７プール（各１５００クローン）から単離したＤＮＡのＰＣＲスクリーニングに用いた（Ｊｉｎｇら、１９９６）。単一の陽性プールを同定し、上記の同放射標識プローブに対するハイブリダイゼーションによりスクリーニングした。このプール由来の個々のｃＤＮＡクローンを同定および配列決定した。ＤＮＡ配列決定および配列解析自動アプライド・バイオシステム３７３ＡＤＮＡシークエンサーおよびＴａｑダイデオキシターミネーター・サイクル・配列決定キット（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、ＦｏｓｔｅｒＣｉｔｙＣＡ）を用いて、ＤＮＡ配列決定を行った。ＧＤＮＦＲ−αおよびＧＲＲ２配列と公共データベースとの比較は、ＦＡＳＴＡコンピューターアルゴリズムを用いて行った（ＰｅａｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎ、ＰｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓＯｆＴｈｅＮａｔｉｏｎａｌＡｃａｄｅｍｙＯｆＳｃｉｅｎｃｅｓＯｆＴｈｅＵｎｉｔｅｄＳｔａｔｅｓＯｆＡｍｅｒｉｃａ、８５、２４４４−２４４８、１９８８）。ＧＤＮＦＲ−αおよびＧＲＲ２のペプチド配列は、ラインアッププログラムを用いてアラインした。用いた全配列解析プログラムは、ウイスコンシン配列解析パッケージに含まれた（ＷｉｓｃｏｎｓｉｎＰａｃｋａｇｅＶｅｒｓｉｏｎ９．０、ＧｅｎｅｔｉｃｓＣｏｍｐｕｔｅｒＧｒｏｕｐ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）。ＮＧＲ−３８およびＬＡ−Ｎ−５細胞への［¹²⁵Ｉ］ＧＤＮＦおよび［¹²⁵Ｉ］ＮＴＮの結合組換えヒトニューチュリンは、可溶性タンパク質として大腸菌で発現させた。封入体を可溶化し、ニューチュリンタンパク質をリホールドし、イオン交換および疎水性相互作用クロマトグラフィーにより精製した。［¹²⁵Ｉ］ＮＴＮ（〜２０００Ｃｉ／ｍｍｏｌｅ）を、精製大腸菌発現タンパク質を用いて調製した（Ａｍｅｒｓｈａｍ，Ｉｎｃ．、ＡｒｌｉｎｇｔｏｎＨｅｉｇｈｔｓ、ＩＬ；慣用的ヨウ素化、カタログ番号＃ＩＭＱ１０５７）。組換えヒトＧＤＮＦもまた放射ヨウ素化した（Ｊｉｎｇら、１９９６）。［¹²⁵Ｉ］ＮＴＮおよび［¹²⁵Ｉ］ＧＤＮＦの、ＬＡ−Ｎ −５およびＮＧＲ−３８細胞への結合は、前記のように実施した（Ｊｉｎｇら、１９９０）。簡潔には、細胞を、ポリオルニチンで前以て被覆した２４ウエル組織培養プレート中に、３×１０⁴細胞／ｃｍ²の密度でアッセイ１日前に接種した。細胞を氷上に５−１０分間置き、１回氷冷緩衝液（２５ｍＭＨＥＰＥＳ［ｐＨ７．０］）で洗浄し、種々の濃度の［¹²⁵Ｉ］ＮＴＮまたは［¹²⁵Ｉ］ＧＤＮＦを含む０．２ｍｌ結合緩衝液（２ｍｇ／ｍｌのウシ血清アルブミンを含む洗浄緩衝液）中４℃で、５００ｎＭ非標識リガンドの非存在下または存在下で４時間インキュベートした。細胞を４回０．５ｍｌ氷冷洗浄緩衝液で洗浄し、０．５ｍｌの１ＭＮａＯＨで溶解した。溶解物を１４７０ウィザード自動ガンマカウンター（ＷａｌｌａｃＩｎｃ．、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）で計測した。化学的架橋ヒトＧＤＮＦＲ−αの最初の４５５アミノ酸およびヒトＧＲＲ２ｃＤＮＡの最初の４５１残基のコード領域を、カルボキシ末端において６ヒスチジン残基で標識したヒトＩｇＧ１のＦｃ領域をコードするＤＮＡフラグメントでインフレーム融合した（Ｃｕｌｏｕｓｃｏｕら、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ、２７０：１２８５７−１２８６３、１９９５）。次いで、この構築物を前記（Ｊｉｎｇら、１９９６）のように発現ベクターｐＢＫＲＳＶ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、ＬａＪｏｌｌａ、ＣＡ）に挿入した。ＧＤＮＦＲ−α／ＦｃおよびＧＲＲ２／Ｆｃ融合構築物を、２９３Ｔ細胞にトランスフェクトし、融合タンパク質を含むならし培地（ＣＭ、０．５％ウシ胎児血清を補給したＤＭＥＭ）をトランスフェクション４目後に回収した。１ｍｌＣＭおよび５０μｌの１ＭＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５のアリコートを、４℃で１０ｎＭ［¹²⁵Ｉ］ＮＴＮまたは５ｎＭ［¹ ²⁵ Ｉ］ＧＤＮＦと共に、１μＭの非標識リガンドの存在下または非存在下で４時間インキュベートした。洗浄緩衝液中ビススベレート（ＢＳ³Ｐｉｅｒｃｅ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）保存溶液（４０ｍＭ）を、各結合混合物に加え最終濃度１ｍＭとし、混合し、室温で３０分間合およびインキュベートした。反応は、５０μｌの１Ｍグリシンを添加して停止し、室温で１５分間インキュベートした。トリトンＸ−１００を加え最終濃度１％とし、架橋産物を２００μｌのプロテイン−ＡセファロースＣＬ−４Ｂ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を用いて直接沈降させた。架橋産物を、還元条件下で７．５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより解析した。イムノブロット解析Ｒｅｔ自己リン酸化は、前記のようにイムノブロット解析により検証した（Ｊｉｎｇら、１９９６）。簡潔には、細胞をアッセイの２４時間前に６−ウエル組織培養皿中１．５×１０⁶細胞／ウエルの密度で接種した。細胞を１回結合緩衝液で洗浄し、結合緩衝液中、３７℃で１０分間、種々の濃度のニューチュリンまたはＧＤＮＦ（０．５ｐＭ−５０ｎＭ）で処理した。処理した細胞および非処理対照を、トリトン−Ｘ溶解緩衝液（５０ｍＭＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５、１％トリトンＸ−１００、５０ｍＭＮａＣｌ、５０ｍＭＮａＦ、１０ｍＭピロリン酸ナトリウム、１％アプロチニン（Ｓｉｇｍａ、製造番号Ａ−６２７９）、１ｍＭＰＭＳＦ（Ｓｉｇｍａ、製造番号＃Ｐ−７６２６）、０．５ｍＭＮａ₃ ＶＯ₄（Ｆｉｓｈｅｒ製造番号＃Ｓ４５４−５０））中で溶解し、記載の抗−Ｒｅｔ抗体（ＳａｎｔａＣｒｕｚＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）およびプロテイン−Ａセファロースを用いて免疫沈降した（Ｊｉｎｇら、１９９６）。免疫沈降物を７．５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分画し、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅにより記載されたようにニトロセルロース膜に移行した（抗体：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ．ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ：ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＰｒｅｓｓ、１９８８）。膜は５％ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ）により遮断し、Ｒｅｔレセプターのチロシンリン酸化を、抗−ホスホチロシンモノクローナル抗体４Ｇ１０（ＵＢＩ、製造番号＃０５−３２１）を用いて室温で２時間ブロッティングすることにより検出した。各レーンのＲｅｔタンパク質の量は、同膜を抗−Ｒｅｔ抗体を用いて剥がし再度プローブすることにより測定した。検出は、製造業者の指示に従って、化学蛍光試薬（ＥＣＬ、Ａｍｅｒｓｈａｍ）と組合せてセイヨウワサビペルオキシダーゼ（Ａｍｅｒｓｈａｍ、製造番号＃ＮＡ９３１）にコンジュゲートさせたヒツジ抗−マウス二次抗体またはプロテイン−Ａを用いて行った。ＭＡＰキナーゼの活性化は、製造業者の指示に従ってホスホプラスＭＡＰＫ抗体キット（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ、Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ、製造番号＃９１００）を用いて解析した。ＬＡ−Ｎ−５およびＮＧＲ−３８細胞を、上記のように６−ウエル皿に接種した。細胞を０．５％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）を含むＤＭＥＭ中で３７℃で２４時間静置した。次いで、細胞を新鮮な培地と共に２時間インキュベートし、５０ｎｇ／ｍｌのＮＧＦ、ＧＤＮＦ、またはニューチュリンで３７℃で５分間処理し、０．５ｍＭＮａＶＯ₄を含む１５０μｌの２×ＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプル緩衝液中に直接溶解した。細胞溶解物を、１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分画し、ニトロセルロースフィルターに移行した。フィルターを、５％無脂肪乾燥ミルクを用いて４℃で一晩遮断し、次いで、同緩衝液中１：１０００希釈の抗−リン酸化ＭＡＰキナーゼ抗体と共に一晩４℃でインキュベートした（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ）。バンドを、セイヨウワサビペルオキシダーゼコンジュゲート抗−ウサギ抗体およびＬｕｍｉＧＬＯ化学蛍光試薬を用いて、製造業者の薦めに従って検出した。Ｘ線フィルムにあてた後、フィルターを剥がし抗−ＭＡＰＫ抗体により再プローブした。図２５（パネルＡおよびＢ）ニューチュリンおよびＧＤＮＦはＬＡ−Ｎ−５およびＮＧＲ−３８細胞においてＭＡＰキナーゼ活性化を誘導する２５ＡＬＡ−Ｎ−５細胞を、記載のように種々の濃度のＧＤＮＦまたはニューチュリンで処理した。細胞を、０．５ｍＭＮａＶＯ₄を含む２×ＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプル緩衝液中で直接溶解し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分画し、リン酸化ＭＡＰキナーゼ（ＭＡＰＫ−Ｐ）に対する抗体でブロッティングした。膜を剥がし、各レーンにのせたＭＡＰキナーゼタンパク質の量について（ＭＡＰＫ）抗−ＭＡＰキナーゼ抗体て再プローブした。実施例１１ＧＲＲ２およびＧＲＲ３のクローニングおよび発現グリア細胞系由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）によるシグナリングは２つのレセプター成分により仲介される。ＧＤＮＦレセプター−α（ＧＤＮＦＲ−α）はＧＤＮＦに特異的に結合し、ＧＤＮＦはＲｅｔと結合しＲｅｔキナーゼは活性化される。同様に、ニューチュリンは、ＧＤＮＦＲ−α−関連レセプターであるＧＲＲ２との結合によりＲｅｔ活性化を誘導する。ＧＤＮＦＲ−αおよびＧＲＲ２の両方共、ＧＤＮＦまたはニューチュリンのいずれかに結合できるが、各々その同種のリガンドに顕著な選択性を示す。３番目の分子がクローン化され、ＧＤＮＦＲ−αおよびＧＲＲ２に対して構造および一次アミノ酸配列において関連性がある。この分子はＧＤＮＦＲ−α−関連レセプター３（ＧＲＲ３）と呼ばれる。ｍＲＮＡブロットおよびインサイトハイブリダイゼーションによるＧＤＮＦＲ−α、ＧＲＲ２、ＧＲＲ３、およびＲｅｔの組織分布解析により、複重しているが別個の型の発現であることが判明する。ＧＤＮＦ機能におけるその役割と一致して、ＧＤＮＦＲ−αおよびｒｅｔは公知のＧＤＮＦ作用部位において共発現されている。ＧＲＲ２およびＧＲＲ３転写物はまた、ある場合においてｒｅｔのそれと共に局在し、このことはＧＲＲ３もまたＧＤＮＦまたは関連リガンドによるＲｅｔ活性化を仲介し得ることを示唆する。序論グリア細胞系由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）は、中脳ドーパミン作動性ニューロン、運動ニューロン、および他の数種類のニューロン細胞における強力な生存因子である。マウスにおけるＧＤＮＦ遺伝子の標的破壊により、完全な腎非形成および腸ニューロンの欠失が引き起こされ（Ｍｏｏｒｅら、Ｎａｔｕｒｅ、３８２、７６−７９、１９９６；Ｐｉｃｈｅｌら、Ｎａｔｕｒｅ、３８２、７３−７６、１９９６；Ｓａｎｃｈｅｚら、Ｎａｔｕｒｅ、３８２、７０−７３、１９９６；およびＨｕｄｓｏｎら、ＢｒａｉｎＲｅｓｅａｒｃｈＢｕｌ１ｅｔｉｎ、３６、４２５−３２、１９９５）、このことは腎および腸神経系の発達においてＧＤＮＦが不可欠な役割を担っていることを示唆する。ＧＤＮＦレセプターは、新規リガンド結合成分であるＧＤＮＦＲ −αおよびシグナリング成分であるＲｅｔレセプタータンパク質チロシンキナーゼからなることが発見された。ＧＤＮＦＲ−αはグリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）結合により細胞膜に結合しているが、全く細胞質ドメインをもたない。それはＧＤＮＦに特異的におよび高い親和性でＲｅｔの存在の如何にかかわらず結合する。Ｒｅｔは、元来ｒｅｔ癌原遺伝子における大きいオープンリーディングフレームとして発見されたレセプタータンパク質チロシンキナーゼ（ＰＴＫ）である。シグナルペプチド、カドヘリン様モチーフ、およびシステインに富む領域を含む、その特異な細胞外ドメイン構造は、他の公知のレセプターＰＴＫサブファミリーとは逸脱している。Ｒｅｔは単独ではＧＤＮＦに結合しないが、ＧＤＮＦおよびＧＤＮＦＲ−αと複合体を形成し、Ｒｅｔを活性化することが判明した。Ｒｅｔキナーゼの活性化はＧＤＮＦの生物学的効果と関連しているようである。ＲｅｔＰＫＴ遺伝子の標的破壊により、ＧＤＮＦ破壊から生じたものとほぼ同一の表現型が得られる（Ｓｃｈｕｃｈａｒｄｔら、Ｎａｔｕｒｅ、３６７、３８０−３８３、１９９４）。インサイトハイブリダイゼーションおよび免疫組織学的解析により、発達中中枢および末梢神経系およびマウス胚の排泄系において、ｒｅｔｍＲＮＡおよびタンパク質の高レベルの発現が検出される。この発現パターンはＧＤＮＦのそれと類似しており、ＧＤＮＦシグナリングにおけるＲｅｔの役割と一致する。ＧＤＮＦＲ−αの発現パターンはまた、ＧＤＮＦシグナリングにおけるその関与に一致する。ＧＤＮＦＲ−αｍＲＮＡは、神経系の多くのＧＤＮＦ−応答性細胞型および構造において見られ、しばしばｒｅｔと共に局在する。中枢神経系において、ＧＤＮＦＲ−αｍＲＮＡは、発達中および成人の両方のラット下部中脳、顔面神経および下部脊髄において観察された。さらに、プルキンエ細胞に隣接する土丘、側隔膜、小脳の分子層における特定の細胞、および大脳皮質および背中線覆蓋における核は、ＧＤＮＦＲ−αを発現することが示された。末梢神経系において、ＧＤＮＦＲ−αｍＲＮＡ発現は、後根神経節のニューロンの亜集合において、腸ニューロンにおいて、および交換神経節のニューロンにおいて見られた。高レベルのＧＤＮＦＲ−αｍＲＮＡ発現がまた、網膜、視床、橋、および延髄を含む神経系の他の領域にも観察された。発現はまた、例えば発達中のネフロン、下垂体、尿生殖管および膵原基などの非ニューロン組織においても見られた。ニューチュリンは、アミノ酸配列および生物学的活性の両方においてＧＤＮＦと類似性を示す分子である。ＧＲＲ２タンパク質（ＧＤＮＦＲ−α−ＲｅｌａｔｅｄＲｅｃｅｐｔｏｒ２（ＧＤＮＦＲ−α−関連レセプター２））は、アミノ酸配列がＧＤＮＦＲ−αに関連した新規なタンパク質である。ＧＲＲ２はＧＤＮＦおよびニューチュリンの両方に結合でき、ＧＤＮＦＲ−αのように、これらのリガンドに応答してＲｅｔＰＴＫの活性化を仲介する。ＧＤＮＦおよびニューチュリンの両方共、ＧＤＮＦＲ−αおよびＧＲＲ２の両方に結合できるが、ＧＤＮＦはＧＤＮＦＲ−αに顕著な選択性を示すが、ニューチュリンはＧＲＲ２とより強く相互作用する。このレセプターファミリーの３番目のメンバーであるＧＤＮＦＲ−α−ＲｅｌａｔｅｄＲｅｃｅｐｔｏｒ３（ＧＤＮＦＲ−α−関連レセプター３）（ＧＲＲ３）もまた認められた。本研究は、ＧＤＮＦＲ−α、ＧＲＲ２、ＧＲＲ３、およびｒｅｔの組織および細胞−特異的ｍＲＮＡ発現を検証する。結果ＧＲＲ２およびＧＤＮＦＲ−αを用いたＧＲＲ３の分子クローニングおよび配列比較公的に人手できる配列データベースの検証により、ＧＤＮＦＲ−αおよびＧＲＲ２ｃＤＮＡクローンに相同的な配列を有する短い発現配列タグ（ＥＳＴ）の存在が判明した（ＷａｓｈＵ−ＨＨＭＩマウスＥＳＴプロジェクト）。このＥＳＴの末端に対応するオリゴヌクレオチドを、逆転写−複製連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）におけるプライマーとして、鋳型である全ラット肝ＲＮＡと共にとして用いた。２２５ヌクレオチド（ｎｔ）フラグメントを増幅し、プラスミドベクターにクローン化し、配列決定してそれが元のＧＤＮＦＲ−α／ＧＲＲ２−関連ＥＳＴに対応することを確認した。Ｅ１５ラット胚ｃＤＮＡライブラリーのプールから単離したプラスミドＤＮＡをＰＣＲによりスクリーニングし、単一の陽性プールを発見した。このプールのクローンを、放射標識２２５ｎｔＰＣＲフラグメントにハイブリダイゼーションしてスクリーニングし、単一の陽性クローンを単離した。このクローン由来の１．８ｋｂインサートの配列解析により、ＧＤＮＦＲ−αおよびＧＲＲ２の両方に関連する３９７アミノ酸ペプチドをコードするオープンリーディングフレームが判明した。このタンパク質をＧＤＮＦＲ−α− 関連レセプター３（ＧＲＲ３）と呼んだ。ラットＧＤＮＦＲ−α、ＧＲＲ２、およびＧＲＲ３のアミノ酸配列のアラインメントを図２６に示す。３つのレセプター間での全アミノ酸配列同一性は３０％ −５０％の範囲である。ＧＤＮＦＲ−αおよびＧＲＲ２は互いに、ＧＲＲ３（それぞれ３５％および３３％同一性）に対するよりも、より密接に関連している（４８％同一性）。ＧＲＲ２のアミノ末端以外は、疎水性領域が全３つの分子のアミノおよびカルボキシ末端両方において認められる（下線、図２６）。ＧＤＮＦＲ−αおよびＧＲＲ３の両方のアミノ末端領域は、シグナルペプチド配列に期待される特徴を有する。ＧＲＲ２Ｎ−末端配列は古典的シグナルペプチドの範疇には適合していないが、ＧＲＲ２が分泌されている証拠がある。ＧＤＮＦＲ−αのカルボキシ末端疎水性領域は、細胞膜へのＧＰＩ−結合に関与することが知られており、ＧＲＲ２およびＧＲＲ３における対応する領域は同目的に機能しているようである。配列アラインメントの最も驚くべき特徴は、全３つのレセプター間での２８システイン残基の保存であり（図２６に記載）、このことはこれらのタンパク質はおそらく類似の三次元構造を有することを示唆する。数個の潜在的なＮ−グリコシル化部位がレセプターに存在するが（太文字で示す、図２６）、全３つのレセプターにおいて同じ部位では全く見られなかった。ＧＤＮＦＲ−αおよびＧＲＲ２は、ＧＲＲ３において見られない３６５および４２７位において部位を共有し、ＧＲＲ２は３２２−３２３位においてＧＲＲ３と可能な部位を共有する（図２６）。成人ラットにおけるＧＤＮＦＲ−α、ＧＲＲ２、およびＧＲＲ３の発現成人ラット組織におけるＧＤＮＦＲ−α、ＧＲＲ２、およびＧＲＲ３ｍＲＮＡの発現は、ブロットハイブリダイゼーション解析により検証した。ＧＤＮＦＲ− αｍＲＮＡは広範に、肺、脳、肝臓、腎臓および脾臓において高いレベルで発現されている。発現はまた、心臓においても検出可能であり、試験した組織の中で筋肉および精巣のみに欠失している。２つの異なるサイズの転写物が観察され、その相対量は組織によって変化する。３．６ｋｂ転写物は肝臓、肺、心臓および脾臓において優勢であるが、３．６ｋｂおよび８．５ｋｂ転写物の同等量が脳および腎臓に存在する。ＧＲＲ２ｍＲＮＡの組織分布はＧＤＮＦＲ−αのそれと類似している。ＧＲＲ２発現は肺、脾臓および脳において最も高く、腎臓および心臓ではより低い。１つの差異は、肝臓におけるＧＲＲ２発現の欠失である。ＧＲＲ２転写物のサイズは、約３．６ｋｂであり、２つのＧＤＮＦＲ−α転写物の小さい方に類似している。ＧＲＲ３ｍＲＮＡの発現は腎臓で最も高く、脳では欠失している。ＧＲＲ３の検出可能な発現はまた脾臓、肺、肝臓および心臓においても存在する。ＧＲＲ３の転写物のサイズは、ＧＤＮＦＲ−αおよびＧＲＲ２で観察されたものよりも幾分小さい（〜２．１ｋｂ）。マウス胚におけるＧＤＮＦＲ−α、ＧＲＲ２およびＧＲＲ３の発現ＧＤＮＦＲ−α、ＧＲＲ２およびＧＲＲ３ｍＲＮＡの発達性発現を、胚７、１１、１５、および１７日目にマウスにおいて検証した。ＧＤＮＦＲ−αの３．６ｋｂ転写物の発現は最初に胚１１日目に出現し、胚１５日目で幾分減少したが、胚１７日目に劇的に増加した。８．５ｋｂＧＤＮＦＲ−αｍＲＮＡの少量が胚１１日目に検出できたが、その後この転写物の発現は検出されない。３．６ｋｂＧＲＲ２転写物の発現は、胚１１目目にはほとんど検出できないが、次第に胚１７日目に増加する。２．１ｋｂＧＲＲ３ｍＲＮＡの発現は胚７日目には検出されないが、胚１１日目には極めて強力である。胚１１日目以後、発現は減少し、胚１５−胚１７では一定である。ＧＤＮＦＲ−α、ＧＲＲ２およびＧＲＲ３の発現のインサイトハイブリダイゼーション解析ＧＤＮＦＲ−α、ＧＲＲ２およびＧＲＲ３の潜在的役割および機能部位の糸口を提供するために、その発現を、ＧＤＮＦの生物学的効果が実証される領域において検証した。胚１８日目のラット胚において、ＧＤＮＦは、腎臓の成長尿管芽および成熟ネフロン並びに腸の腸ニューロンにおいて高度に発現されている。ＧＤＮＦＲ−αはＧＤＮＦと同じ腎臓および腸の領域において認められるが、それはまた背側および腹側脊髄の両方において中低度のレベルで発現される。ｒｅｔは同様に腎臓および腸において発現されるが、その腎臓における発現は尿管芽に限られるようである。ｒｅｔの発現は腹側運動ニューロンにおいて高いが、脊髄の背側には低い。ｒｅｔのように、ＧＲＲ２の腎臓における発現は尿管芽に限られる。ＧＲＲ２は、脊髄の背側および腹側の領域両方において発現される。弱く広範なハイブリダイゼーションシグナルがＧＤＮＦ、ｒｅｔ、およびＧＤＮＦＲ−αについて肝臓で検出された。生後７日目のラットにおいて、ｒｅｔ発現は黒質、三叉神経節においてかなりのレベルで、およびより低いレベルで網様体視床核において検出できた。ＧＤＮＦＲ−α発現は、網様体および腹側正中視床核並びに内側手綱核において高い。ＧＤＮＦＲ−αの中程度の発現が黒質において観察され、低いが検出可能なレベルで海馬において認められる。ＧＲＲ２は中程度で網膜視床核、腹側正中視床核、大脳皮質（特に帯皮質）および黒質において中程度で発現される。我々は、Ｐ７ラット脳においてＧＲＲ３の発現を全く検出できなかったが、三叉神経節においては有意な発現が検出できた。議論本研究は、ＧＤＮＦＲ−αおよびＧＲＲ２に関連した新規な分子であるＧＲＲ３の単離を記載し、ｒｅｔの組織発現をＧＤＮＦＲレセプターファミリーの全３つのメンバーと比較する。ＧＲＲ２はＧＤＮＦＲ−αに対してアミノ酸配列が４８％同一性であるが、ＧＲＲ３は３５％同一性で幾分関連性が低い。２８システイン残基の位置が全３つの分子において保存されている。ＧＤＮＦＲ−αのように、ＧＲＲ２およびＧＲＲ３の両方共細胞膜へのＧＰＩ結合に関与し得る疎水性Ｃ− 末端を有し、両方共細胞質ドメインをもたない。この強い配列および構造特徴の保存により、ＧＤＮＦＲ−α、ＧＲＲ２、およびＧＲＲ３はＧＤＮＦおよび関連リガンドの新規なファミリーのレセプターを規定することが示される。ＧＤＮＦシグナリングはＧＤＮＦＲ−αへの結合により開始され、ＲｅｔＰＴＫの結合および続く活性化により達成される。ＧＤＮＦＲ−αおよびＧＲＲ２とのその配列および構造類似性に基づいて、ＧＲＲ３は、ＧＤＮＦ、ニューチュリンおよび／またはこのリガンドファミリーのまだ発見されていないメンバーであるその他に対する結合対として機能するようである。成人ラット組織におけるＧＤＮＦＲ−α、ＧＲＲ２およびＧＲＲ３の発現パターンは、類似しているが異なる。全３つのｍＲＮＡが、肺、脾臓、心臓および腎臓において見られるが、３つのどれも筋肉または精巣において有意な発現を示さなかった。成人脳は、ＧＤＮＦＲ−αおよびＧＲＲ２ｍＲＮＡの高発現を示すが、ほとんどまたは全くＧＲＲ３は検出されない。ＧＤＮＦＲ−αｍＲＮＡの発現は肝臓において高いが、ＧＲＲ２ｍＲＮＡはほとんど存在しない。もしＧＤＮＦ、ニューチュリンおよびまだ発見されていないＧＤＮＦ−様リガンドであるその他が専らＲｅｔを介してシグナルを出すのであれば、リガンド−特異的結合レセプターの発現パターンにおける差異により、リガンド組織特異性の機構が提供できる。ｃ−ｒｅｔの発現は胚８．５から胚１６．５の期間検出できるので、レセプタータンパク質の経時的発現における差異はまた発達中のリガンド特異性を規定できる。全レセプターおよびｃ−ｒｅｔの発現は、Ｒｅｔノックアウト動物において見られるほとんどの重度の傷害部位である成人腎臓において高い。インサイトハイブリダイゼーション解析により、ｒｅｔ、ＧＤＮＦＲ−α、ＧＲＲ２およびＧＲＲ３は数個の組織に共局在し、これによりＧＲＲ２およびＧＲＲ３はまたＲｅｔとの相互作用を介してそのインビボ効果を奏効し得ることが示される（表５）。＊高レベルの発現が成人腎臓において検出された。ＧＤＮＦＲ−αおよびＧＲＲ２は両方共、腎臓および腸、黒質、視床、および腹側脊髄運動ニューロンにおいてｒｅｔと共に転写される。この発見は、ＧＤＮＦがドーパミン作動性および運動ニューロンの生存を宜進できること、およびＲｅｔおよびＧＤＮＦノッタアウト動物の表現型と一致する。脳ではほとんどＧＲＲ３の発現が認められなかったが、胚１８およびＰ７ラットの三叉神経節においてｒｅｔおよびＧＤＮＦＲ−αと共に共発現されている。これらの観察により、ＧＤＮＦ作用は、常にＲｅｔを介してシグナルを出しているが、組織および発達段階に依存して異なる結合成分との結合により調節され得ることが示される。ｒｅｔの発現はしばしばＧＤＮＦＲ−α、ＧＲＲ２およびＧＲＲ３の発現と共に局在しているが、ｒｅｔ発現は検出不可能であるが、高レベルで１つ以上の結合レセプターを発現する数個の部位がある。脾臓または肺においてほとんどまたは全くｒｅｔは発現されないが、全３つのレセプターは高レベルで発現される。高レベルのＧＤＮＦＲ−αｍＲＮＡは、肝臓、内側手綱核、および海馬に見られるが、ＧＲＲ２発現は皮質において著しい。これらの領域のいずれにおいてもｒｅｔ発現はほとんど観察されなかった。高いＧＤＮＦＲ発現の部位におけるｒｅｔ発現の欠失は、Ｒｅｔ以外のシグナリング対が、これらの組織においてＧＤＮＦＲにより使用され得るかまたはレセプターは別の作用機構を有することを示唆する。レセプターは、ＧＤＮＦファミリーのリガンドを隔離するように作用し得るかまたは膜結合レセプターの画分が放出され可溶性レセプターとしてリガンド機能を仲介するという２つの可能性がある。実験方法ＧＲＲ３のクローニングゲンバンクデータベースを、ウイスコンシン配列解析パッケージを用いてＧＤＮＦＲ−αおよびＧＲＲ２に関連した配列について検索した（ＷｉｓｃｏｎｓｉｎＰａｃｋａｇｅＶｅｒｓｉｏｎ９．０、ＧｅｎｅｔｉｃｓＣｏｍｐｕｔｅｒＧｒｏｕｐ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）。ＥＳＴＡＡ２３８７４８．Ｇｂ＿Ｎｅｗ２の末端付近の領域に対応するオリゴヌクレオチドプライマーを合成した。ＡＡ２３８７４８．Ｇｂ＿Ｎｅｗ２に対応するプライマーを、各々ラットＥ１５胚ｃＤＮＡライブラリー由来の１０００クローンの８３プールのＰＣＲスクリーニングに用いた。単一の陽性プールをこの方法により同定した。このプールから増幅したＤＮＡフラグメントを、プラスミドペクターにサブクローニングし、インサートを、Ｔａｑダイデオキシ・ターミネーター・サイクル・配列決定キットと共にアプライド・バイオシステムズ３７３Ａ自動ＤＮＡシークエンサーを用いて配列決定した（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、ＦｏｓｔｅｒＣｉｔｙ、ＣＡ）。次いで、インサートをランダム・プライムドＤＮＡ標識キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、ＬａＪｏｌｌａ、ＣＡ）を用いて製造業者の指示に従って［³²Ｐ］−ｄＣＴＰで標識した。ＰＣＲにより陽性と同定されたｃＤＮＡライブラリープール由来のクローンを、１５ｃｍアガロースプレート土にまき、放射標識インサートへのハイブリダイゼーションによりスクリーニングするために二重セルロースフィルター上に複製した。フィルターを、５５℃で３．５時間２００ｍｌの６×ＳＳＣ、１×デンハード、０．５％ＳＤＳ、および５０μｇ／ｍｌサケ精子ＤＮＡ中プレハイブリダイゼーションした。２×１０⁸ｃｐｍの放射標識プローブを添加後、ハイブリダイゼーションを１８時間続けた。次いで、フィルターを２回３０分間各５５℃で０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中で洗浄し、強化スクリーンと共に一晩Ｘ線にあてた。ＤＮＡ配列決定および配列解析ハイブリダイゼーションにより陽性とスクリーニングされたクローン由来のＤＮＡを調製し、自動アプライド・バイオシステムズ３７３Ａ自動ＤＮＡシークエンサーおよびＴａｑダイデオキシ・ターミネーター・サイクル・配列決定キット（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、ＦｏｓｔｅｒＣｉｔｙ、ＣＡ）を用いて配列決定した。ＧＤＮＦＲ−α、ＧＲＲ２およびＧＲＲ３のペプチド配列を、ラインアッププログラムを用いてアラインした（ＷｉｓｃｏｎｓｉｎＰａｃｋａｇｅＶｅｒｓｉｏｎ９．０、ＧｅｎｅｔｉｃｓＣｏｍｐｕｔｅｒＧｒｏｕｐ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）。ブロットハイブリダイゼーション解析ブロットハイブリダイゼーション解析用に、製造業者の指示に従ってクローン化ラットＧＲＲ３ｃＤＮＡをランダム・プライムドＤＮＡ標識キット（ＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒＭａｎｎｈｅｉｍ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）を用いて標識した。ラットおよびマウスＲＮＡブロット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）をプローブとハイブリダイズし、高ストリンジェント下でエクスプレスＨｙｂキット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、ＰａｌｏＡｌｔｏ、ＣＡ）の試薬を用いて製造業者の指示に従って洗浄した。Ｘ線フィルムにあてた後、フィルターを、０．５％ＳＤＳ中１０分間煮沸し、プローブを剥がし全ＲＮＡ負荷量の対照としてβ−アクチンプローブ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、ＰａｌｏＡｌｔｏ、ＣＡ）と再度ハイブリダイズした。インサイトハイブリダイゼーションＧＤＮＦ、ｒｅｔ、ＧＤＮＦＲ−α、ＧＲＲ２、およびＧＲＲ３のアンチセンスリボプローブを用いたインサイトハイブリダイゼーションは、Ｚｈｏｕら（ＪｏｕｒｎａｌＯｆＮｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅＲｅｓｅａｒｃｈ、３７、１２９−１４３、１９９４）に従って実施した。ｒｅｔプローブは、ラットｒｅｔｃＤＮＡの細胞外ドメインから誘導した３１６ｎｔフラグメントである。ＧＤＮＦｍＲＮＡは、ラットＧＤＮＦｃＤＮＡクローンの３０３ｎｔフラグメント（ヌクレオチド＃５０−３５２、Ｌｉｎら、１９９３）を用いて検出した。ＧＤＮＦＲ−α転写物は、アミノ酸３３９−４１３に対応する２０５ｎｔアンチセンスリボプローブで検出した（図２６）。ＧＲＲ３転写物はアミノ酸２３９−３１５に対応する２２５ｎｔアンチセンスリホプローブで検出した（図２６）。本発明は、好ましい実施形態および核酸およびアミノ酸の例に関して記載したが、当業者により変形および修飾を施し得ることを理解されたい。ゆえに、添付の請求の範囲は請求した本発明の範囲内のかかる全ての等価な変化を包含する。

【手続補正書】特許法第１８４条の４第４項【提出日】平成１０年１２月２２日（１９９８．１２．２２）【補正内容】請求の範囲１．（ａ）配列番号３６のアミノ酸配列、（ｂ）配列番号３８のアミノ酸配列、（ｃ）配列番号４０のアミノ酸配列、（ｄ）配列番号４２のアミノ酸配列、（ｅ）配列番号４３のアミノ酸配列、および（ｆ）配列番号４４のアミノ酸配列からなる群から選択されたアミノ酸配列を含む単離され精製されたタンパク質。２．（ａ）配列番号３６のＣｙｓ⁴⁰からＣｙｓ⁴²¹を含むアミノ酸配列、（ｂ）配列番号３８のＣｙｓ⁴⁴からＣｙｓ³⁸⁹を含むアミノ酸配列、（ｃ）配列番号４０のＣｙｓ³⁶からＣｙｓ⁴¹⁷を含むアミノ酸配列、（ｄ）配列番号４２のＣｙｓ⁴¹からＣｙｓ³³⁷を含むアミノ酸配列、（ｅ）配列番号４３のＣｙｓ⁴⁶からＣｙｓ⁴⁴⁶を含むアミノ酸配列、および（ｆ）配列番号４４のＣｙｓ⁴¹からＣｙｓ⁴³⁵を含むアミノ酸配列からなる群から選択されたアミノ酸配列を含む単離され精製されたタンパク質。３．タンパク質は神経栄養因子と複合体を形成し、よって該神経栄養因子への細胞応答を仲介できる、請求項１または２のアミノ酸配列の置換、欠失または付加類似体を含む単離され精製されたタンパク質。４．グリコシル化されている請求項１−３のいずれかのタンパク質。５．グリコシル化されていない請求項１−３のいずれかのタンパク質。６．組換え技術または化学合成により生産される請求項１−５いずれかのタンパク質。７．請求項１−６のいずれか一項で記載したタンパク質を、医薬的に許容される担体と組合せて含む医薬組成物。８．（ａ）配列番号３６のアミノ酸配列、（ｂ）配列番号３８のアミノ酸配列、（ｃ）配列番号４０のアミノ酸配列、（ｄ）配列番号４２のアミノ酸配列、（ｅ）配列番号４３のアミノ酸配列、および（ｆ）配列番号４４のアミノ酸配列からなる群から選択されたアミノ酸配列を含む神経栄養因子レセプタータンパク質をコードする単離されたポリ核酸分子。９．（ａ）配列番号３６のＣｙｓ⁴⁰からＣｙｓ⁴²¹を含むアミノ酸配列、（ｂ）配列番号３８のＣｙｓ⁴⁴からＣｙｓ³⁸⁹を含むアミノ酸配列、（ｃ）配列番号４０のＣｙｓ³⁶からＣｙｓ⁴¹⁷を含むアミノ酸配列、（ｄ）配列番号４２のＣｙｓ⁴¹からＣｙｓ³³⁷を含むアミノ酸配列、（ｅ）配列番号４３のＣｙｓ⁴⁶からＣｙｓ⁴⁴⁶を含むアミノ酸配列、および（ｆ）配列番号４４のＣｙｓ⁴¹からＣｙｓ⁴³⁵を含むアミノ酸配列からなる群から選択されたアミノ酸配列を含む神経栄養因子レセプタータンパク質をコードする単離されたポリ核酸分子。１０．タンパク質は、神経栄養因子と複合体を形成し、よって細胞応答を該神経栄養因子に仲介できる、詰求項８または９のアミノ酸配列の置換、欠失または付加類似体を含む神経栄養因子レセプタータンパク質をコードする単離されたポリ核酸分子。１１．神経栄養因子と複合体を形成する神経栄養因子レセプタータンパク質をコードする単離されたポリ核酸分子であって、該ポリ核酸分子は、（ａ）Ｍｅｔ¹からＬｅｕ⁴⁶⁴をコードするヌクレオチドを含む配列番号３５またはＭｅｔ¹からＴｒｐ⁴⁰⁰をコードするヌクレオチドを含む配列番号３７またはヌクレオチドＭｅｔ¹からＬｅｕ⁴⁶⁰を含む配列番号３９またはヌクレオチドＭｅｔ¹ からＴｒｐ³⁹⁷を含む配列番号４１の分子；（ｂ）（１）（ａ）の相補的配列またはその縮退配列にハイブリダイズし、（２）ハイブリダイゼーション条件は４×ＳＳＣで４５−５５℃または３０−４０％ホルムアミドで４０−５５℃でのハイブリダイゼーション、またはストリンジェントなハイブリダイゼーション条件を使用するポリ核酸分子からなる群から選択するものである、単離されたポリ核酸分子。１２．請求項８−１１のいずれかのポリ核酸分子を含むベクター。１３．請求項１２のベクターで形質転換またはトランスフェクトした宿主細胞。１４．請求項８−１１のいずれかのポリ核酸分子で形質転換またはトランスフェクトした宿主細胞。１５．（ａ）配列番号３６のＣｙｓ⁴⁰からＣｙｓ⁴²¹を含むアミノ酸配列、（ｂ）配列番号３８のＣｙｓ⁴⁴からＣｙｓ³⁸⁹を含むアミノ酸配列、（ｃ）配列番号４０のＣｙｓ³⁶からＣｙｓ⁴¹⁷を含むアミノ酸配列、（ｄ）配列番号４２のＣｙｓ⁴¹からＣｙｓ³³⁷を含むアミノ酸配列、（ｅ）配列番号４３のＣｙｓ⁴⁶からＣｙｓ⁴⁴⁶を含むアミノ酸配列、および（ｆ）配列番号４４のＣｙｓ⁴¹からＣｙｓ⁴³⁵を含むアミノ酸配列からなる群から選択されたアミノ酸配列を含む、神経栄養因子レセプタータンパク質をコードするポリ核酸分子を発現するように形質転換またはトランスフェクトした宿主細胞。１６．該細胞はヒト移植に適当であり、該細胞は該神経栄養因子レセプターを発現および分泌する、請求項１３−１５のいずれかの宿主細胞。１７．該細胞は生体外で形質転換またはトランスフェクトされる請求項１３−１５のいずれかの宿主細胞。１８．該細胞はヒト移植に適当な半透膜に封入されている請求項１３−１５のいずれかの宿主細胞。１９．神経栄養因子タンパク質と複合体を形成する神経栄養因子レセプタータンパク質の産生法であって、該方法は、（ａ）（ｉ）配列番号３６のアミノ酸配列、（ｉｉ）配列番号３８のアミノ酸配列、（ｉｉｉ）配列番号４０のアミノ酸配列、（ｉｖ）配列番号４２のアミノ酸配列、（ｖ）配列番号４３のアミノ酸配列、および（ｖｉ）配列番号４４のアミノ酸配列からなる群から選択されたアミノ酸配列を含む神経栄養因子レセプタータンパク質をコードするポリ核酸分子を含む宿主細胞を該宿主細胞による該神経栄養因子レセプタータンパク質の発現に適当な条件下で培養し；および（ｂ）任意に、該宿主細胞により発現される該神経栄養因子レセプタータンパク質を単離する段階を含む方法。２０．神経栄養因子タンパク質と複合体を形成する神経栄養因子レセプタータンパク質の産生法であって、該方法は、（ａ）（ｉ）配列番号３６のＣｙｓ⁴⁰からＣｙｓ⁴²¹を含むアミノ酸配列、（ｉｉ）配列番号３８のＣｙｓ⁴⁴からＣｙｓ³⁸⁹を含むアミノ酸配列、（ｉｉｉ）配列番号４０のＣｙｓ³⁶からＣｙｓ⁴¹⁷を含むアミノ酸配列、（ｉｖ）配列番号４２のＣｙｓ⁴¹からＣｙｓ³³⁷を含むアミノ酸配列、（ｖ）配列番号４３のＣｙｓ⁴⁶からＣｙｓ⁴⁴⁶を含むアミノ酸配列、および（ｖｉ）配列番号４４のＣｙｓ⁴¹からＣｙｓ⁴³⁵を含むアミノ酸配列からなる群から選択されたアミノ酸配列を含む神経栄養因子レセプタータンパク質をコードするポリ核酸分子を含む宿主細胞を、該宿主細胞による該神経栄養因子レセプタータンパク質の発現に適当な条件下で培養し；および（ｂ）任意に、該宿主細胞により発現される該神経栄養因子レセプタータンパク質を単離する段階を含む方法。２１．神経栄養因子タンパク質と複合体を形成する神経栄養因子レセプタータンパク質の産生法であって、（ａ）請求項１−３のいずれかのアミノ酸配列を含む神経栄養因子レセプタータンパク質をコードするポリ核酸分子を発現する形質転換またはトランスフェクト宿主細胞を、該宿主細胞による該神経栄養因子レセプタータンパク質の発現に適当な条件下で培養し；および（ｂ）任意に、該宿主細胞により発現される該神経栄養因子レセプタータンパク質を単離する段階を含む方法。２２．単離神経栄養因子レセプターをリホールドする段階をさらに含む請求項１９−２１のいずれかの方法。２３．該宿主細胞は原核細胞である、請求項１９−２１のいずれかの方法。２４．該宿主細胞は真核細胞である、請求項１９−２１のいずれかの方法。２５．請求項１９−２１のいずれかの方法により製造した実質的に精製した神経栄養因子レセプタータンパク質。２６．医薬組成物の製造における請求項１の神経栄養因子レセプタータンパク質の使用。．２７機能が傷害されたドーパミン作動性神経細胞、パーキンソン病、アルツハイマー病または筋萎縮側索硬化症を処置する医薬組成物の製造における請求項１の神経栄養因子レセプタータンパク質の使用。２８．請求項１−３のいずれかのアミノ酸配列を含む神経栄養因子レセプタータンパク質に結合する抗体。２９．該抗体はモノクローナル抗体である請求項４１の抗体。３０．該抗体はポリクローナル抗体である請求項４１の抗体。３１．請求項１−３のいずれかのアミノ酸配列を含む神経栄養因子レセプタータンパタ質で動物を免疫化することにより産生した抗体。３２．請求項１−３のいずれかのアミノ酸配列を含む神経栄養因子レセプタータンパク質に結合するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ。３３．（ａ）移植に適当な半透膜；および（ｂ）該膜でカプセル化した細胞（該細胞は請求項１−３のいずれかに記載の神経栄養因子レセプタータンパク質を分泌し、該膜は神経栄養因子レセプタータンパク質には透過性であるが、該細胞に有害な物質には非透過性である）を含む、神経傷害を処置する装置。３４．該細胞は該神経栄養因子レセプタータンパク質を分泌する天然に存在する細胞である、請求項３４の装置。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ａ６１Ｐ 25/00 Ａ６１Ｐ 25/28 25/18 Ｃ０７Ｋ 14/71 25/28 17/00 Ｃ０７Ｋ 14/71 Ｃ１２Ｎ 1/21 17/00 Ｃ１２Ｐ 21/02 ＣＣ１２Ｎ 1/21 21/08 5/10 Ｃ１２Ｑ 1/00 ＺＣ１２Ｐ 21/02 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ 21/08 33/50 ＺＣ１２Ｑ 1/00 33/53 ＤＧ０１Ｎ 33/15 33/577 Ｂ 33/50 Ａ６１Ｋ 35/74 Ａ 33/53 39/395 Ｄ 33/577 Ｎ // Ａ６１Ｋ 35/74 (Ｃ１２Ｎ 1/21 39/395 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/08 (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:91）Ｃ１２Ｒ 1:19）Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (Ｃ１２Ｐ 21/08 5/00 ＢＣ１２Ｒ 1:91）Ａ６１Ｋ 37/02 (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＧＷ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者チン，シユウチエンアメリカ合衆国、カリフオルニア・91362、サウザンド・オークス、ボーダロー・レイン・3254 (72)発明者ウエン，ドウアンチイアメリカ合衆国、カリフオルニア・91360、サウザンド・オークス、レインダンス・ストリート・517

Claims

【特許請求の範囲】１．タンパク質がグリア細胞系由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）と複合体を形成でき、よってＧＤＮＦへの細胞応答を仲介できる、図２または４（配列番号２または４）で示したアミノ酸配列およびその類似体を含む単離および精製タンパク質。２．図２（配列番号２）で示したアミノ酸配列を含む請求項１のタンパク質。３．図４（配列番号４）で示したアミノ酸配列を含む請求項１のタンパク質。４．図２（配列番号２）で示したアミノ酸配列Ｓｅｒ¹⁸からＰｒｏ⁴⁴⁶を含む請求項１のタンパク質。５．図２（配列番号２）で示したアミノ酸配列Ａｓｐ²⁵からＬｅｕ⁴⁴⁷を含む請求項１のタンパク質。６．図２（配列番号２）で示したアミノ酸配列Ｃｙｓ²⁹からＣｙｓ⁴⁴²を含む請求項１のタンパク質。７．図４（配列番号４）で示したアミノ酸配列Ａｌａ¹⁹からＶａｌ⁴⁵⁰を含む請求項１のタンパク質。８．図４（配列番号４）で示したアミノ酸配列Ｃｙｓ²⁹からＣｙｓ⁴⁴³を含む請求項１のタンパク質。９．グリコシル化されている請求項１のタンパク質。１０．非グリコシル化されている請求項１のタンパク質。１１．組換え技術または化学合成により産生される請求項１−１０のタンパク質。１２．請求項１−１０のいずれか一項で記載したタンパク質を、医薬的に許容される担体と組合せて含む医薬組成物。１３．請求項１−８のいずれか一項で記載したアミノ酸配列を含む、神経栄養因子レセプタータンパク質をコードする単離核酸配列。１４．タンパク質がグリア細胞系由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）と複合体を形成でき、よってＧＤＮＦへの細胞応答を仲介できる、図２または４（配列番号２または４）で示したアミノ酸配列およびその類似体を含む神経栄養因子レセプタータンパク質をコードする単離核酸配列。１５．図２（配列番号２）で示したアミノ酸配列を含む神経栄養因子レセプタータンパク質をコードする請求項１４の核酸配列。１６．図４（配列番号４）で示したアミノ酸配列を含む神経栄養因子レセプタータンパク質をコードする請求項１４の核酸配列。１７．（ａ）Ｍｅｔ¹からＳｅｒ⁴⁶⁵をコードするヌクレオチドを含む図１（配列番号１）、またはＭｅｔ¹からＳｅｒ⁴⁶⁸をコードするヌクレオチドを含む図３（配列番号３）に示した配列（ただし、該配列は、グリア細胞系由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）と複合体を形成でき、よってＧＤＮＦへの細胞応答を仲介できる、神経栄養因子レセプタータンパク質（ＧＤＮＦＲ）をコードする）；（ｂ）（１）（ａ）の相補的配列とハイブリタイズし、（２）ＧＤＮＦＲ活性を有するアミノ酸配列をコードする核酸配列；および（ｃ）遺伝子コード縮重がなければ（ａ）の相補的配列にハイブリダイズし、（２）ＧＤＮＦＲ活性を有するアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む単離核酸配列。１８．該核酸配列の増幅または発現を奏効できる１つ以上の機能エレメントに機能的に結合させた請求項１４−１７のいずれかに記載の核酸配列を含むベクター。１９．該核酸配列の増幅または発現を奏効できる１つ以上の機能エレメントに機能的に結合させた図２または４（配列番号２または４）に示したアミノ酸配列を含む神経栄養因子レセプタータンパク質をコードする核酸配列を含むベクター。２０．請求項１８のベクターで形質転換またはトランスフェクトさせた宿主細胞。２１．請求項１９のベクターで形質転換またはトランスフェクトさせた宿主細胞。２２．哺乳動物細胞および細菌細胞からなる群から選択した請求項２０の宿主細胞。２３．ＣＯＳ−７細胞または大腸菌である請求項２２の宿主細胞。２４．該細胞はヒト移植に適当であり、該細胞は該神経栄養因子レセプターを発現および分泌する、請求項２０の宿主細胞。２５．該細胞はヒト移植に適当であり、該細胞は該神経栄養因子レセプターを発現および分泌する、請求項２１の宿主細胞。２６．該細胞は生体外で形質転換またはトランスフェクトさせる、請求項２０の宿主細胞。２７．該細胞をヒト移植に適当な半透膜に封入する、請求項２０の宿主細胞。２８．（ａ）図２または４（配列番号２または４）で示したアミノ酸配列およびその類似体を含む神経栄養因子レセプタータンパク質をコードする核酸配列を含む宿主細胞を培養し（ここでタンパク質は、該宿主細胞による該神経栄養因子レセプタータンパク質の発現に適当な条件下で、グリア細胞系由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）と複合体を形成し、よってＧＤＮＦへの細胞応答を仲介できる）；および（ｂ）任意に、該宿主細胞により発現される該神経栄養因子レセプタータンパク質を単離する段階を含む、神経栄養因子レセプタータンパク質の産生法。２９．該核酸配列は、図２（配列番号２）に示したアミノ酸配列を含む神経栄養因子レセプタータンパク質をコードする請求項２８の方法。３０．該核酸配列は、図４（配列番号４）に示したアミノ酸配列を含む神経栄養因子レセプタータンパク質をコードする請求項２８の方法。３１．（ａ）該宿主細胞による該神経栄養因子レセプタータンパク質の発現に適当な条件下で、請求項１７に記載の核酸配列で形質転換またはトランスフェクトした宿主細胞を培養し；および（ｂ）任意に該宿主細胞により発現される該神経栄養因子レセプタータンパク質を単離する段階を含む、神経栄養因子レセプタータンパク質の産生法。３２．単離神経栄養因子レセプターをリホールドする段階をさらに含む、請求項２８または３１の方法。３３．該宿主細胞は原核細胞である、請求項２８または３１の方法。３４．該宿主細胞は真核細胞である、請求項２８または３１の方法。３５．請求項２８−３１のいずれかの方法により製造した実質的に精製された神経栄養因子レセプタータンパク質。３６．医薬組成物の製造における請求項１の神経栄養因子レセプタータンパク質の使用。３７請求項１の神経栄養因子レセプタータンパク質を投与することによる、機能が傷害されたドーパミン神経細胞の処置法。３８．請求項１の神経栄養因子レセプタータンパク質の投与によるパーキンソン病の処置法。３９．請求項１の神経栄養因子レセプタータンパク質の投与によるアルツハイマー病の処置法。４０．請求項１の神経栄養タンパク質の投与による筋萎縮性側索硬化症の処置法。４１．配列番号２または４のアミノ酸配列を含む神経栄養因子レセプタータンパク質に結合する抗体。４２．該抗体はモノクローナル抗体である請求項４１の抗体。４３．該抗体はポリクローナル抗体である請求項４１の抗体。４４．配列番号２または配列番号４のアミノ酸配列を含む神経栄養因子レセプタータンパク質で動物を免疫化することにより産生された抗体。４５．配列番号２または配列番号４のアミノ酸配列を含む神経栄養因子レセプタータンパク質に結合するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ。４６．（ａ）移植に適当な半透膜；および（ｂ）該膜でカプセル化した細胞（該細胞は請求項１に記載の神経栄養因子レセプタータンパク質を分泌し、該膜は神経栄養因子レセプタータンパク質に透過性であり、該細胞に有害な物質には不透過性である）を含む、神経障害の処置装置。４７．該細胞は、該神経栄養因子レセプタータンパク質を分泌する、天然に存在する細胞である請求項４６の装置。４８．該細胞は（ａ）グリア細胞系由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）と複合体を形成し、ＧＤＮＦへの細胞応答を仲介できる神経栄養因子レセプタータンパク質（ＧＤＮＦＲ）をコードする、Ｍｅｔ¹からＳｅｒ⁴⁶⁵をコードするヌクレオチドを含む図１（配列番号１）、またはＭｅｔ¹からＳｅｒ⁴⁶⁸をコードするヌクレオチドを含む図３（配列番号３）に示した配列；（ｂ）（１）（ａ）の相補的配列にハイブリタイズし、（２）ＧＤＮＦＲ活性を有するアミノ酸配列をコードする核酸配列；および（ｃ）遺伝子コードの縮重がなければ（ａ）の相補的配列にハイブリダイズし、（２）ＧＤＮＦＲ活性を有するアミノ酸配列をコードする核酸配列、を含む核酸配列により該神経栄養因子レセプタータンパク質を分泌するように修飾されている請求項４６の装置。４９．ＧＤＮＦＲタンパク質を含むまたはそれで被覆された固体相を含む（ここで該ＧＤＮＦＲタンパク質は試験サンプル中に存在するＧＤＮＦと反応し、ＧＤＮＦの存在を示す検出可能な反応産物を産生する）、グリア細胞系由来神経栄養因子の存在について試験サンプルを分析するアッセイ装置。５０．サンプルをＧＤＮＦＲタンパク質を含むアッセイ試薬と接触させることを含む（ここで該ＧＤＮＦＲタンパク質は試験サンプル中に存在するＧＤＮＦと反応し、ＧＤＮＦの存在を示す検出可能な反応産物を産生する）、グリア細胞系由来神経栄養因子の存在について試験サンプルを分析する方法。５１．タンパク質は、グリア細胞系由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）またはニューチュリン神経栄養因子と複合体を形成し、よって該神経栄養因子に細胞応答を仲介する、図１４、１５、１６、１７、１８、１９または２６に示したＧＤＮＦＲ −α、ＧＲＲ２、ＧＲＲ３またはＧＤＮＦＲ共通配列のアミノ酸配列を含む、単離および精製タンパク質。５２．医薬的に許容される担体と組合せて請求項５１に記載したタンパク質を含む医薬組成物。５３．請求項５１のアミノ酸配列を含む神経栄養因子レセプタータンパク質をコードする単離核酸配列。５４．（ａ）該配列は、グリア細胞系由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）またはニューチュリン神経栄養因子と複合体を形成し、よって細胞応答を該神経栄養因子に仲介できる、神経栄養因子レセプタータンパク質（ＧＤＮＦＲ）をコードする図１９または２６に示した配列；（ｂ）（１）（ａ）の相補的配列にハイブリタイズし、（２）ＧＤＮＦＲ活性を有するアミノ酸配列をコードする核酸配列；および（ｃ）遺伝子コードの縮重がなければ（ａ）の相補的配列にハイブリダイズし、（２）ＧＤＮＦＲ活性を有するアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む、単離核酸配列。５５．該核酸配列の増幅または発現を奏効できる１つ以上の機能エレメントに機能的に結合させた請求項５３または５４に記載の核酸配列を含むベクター。５６．請求項５５のベクターで形質転換またはトランスフェクトさせた宿主細胞。５７．該細胞はヒト移植に適当であり、該細胞は該神経栄養因子レセプターを発現および分泌する請求項５６の宿主細胞。５８．該細胞は生体外で形質転換またはトランスフェクトさせる請求項５６の宿主細胞。５９．該細胞はヒト移植に適当な半透膜に封入される、請求項５６の宿主細胞。６０．（ａ）請求項５１のアミノ酸配列を含む神経栄養因子レセプタータンパク質をコードする核酸配列を含む宿主細胞を培養し（ここで、該宿主細胞による該神経栄養因子レセプタータンパク質の発現に適当な条件下、タンパク質は、グリア細胞系由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）またはニューチュリン神経栄養因子と複合体を形成し、よって細胞応答を該神経栄養因子に仲介できる）；および（ｂ）任意に、該宿主細胞により発現される該神経栄養因子レセプタータンパク質を単離する段階を含む神経栄養因子レセプタータンパク質の産生法。６１．請求項５１の神経栄養因子レセプタータンパク質の投与による機能が傷害されたドーパミン作動性神経細胞の処置法。６２．請求項５１のアミノ酸配列を含む神経栄養因子レセプタータンパク質に結合する抗体。６３．請求項５１のアミノ酸配列を含む神経栄養因子レセプタータンパク質に結合するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ。６４．（ａ）移植に適当な半透膜；および（ｂ）該膜でカプセル化した細胞（該細胞は請求項５１に記載の神経栄養因子レセプタータンパク質を分泌し、該膜は神経栄養因子レセプタータンパク質には透過性であるが、該細胞に有害な物質には非透過性である）を含む、神経傷害を処置する装置。６５．ＧＤＮＦＲタンパク質を含むまたはそれで被覆された固体相を含む（ここで該ＧＤＮＦＲタンパク質は試験サンプル中に存在する神経栄養因子と反応し、神経栄養因子の存在を示す検出可能な反応産物を産生する）、神経栄養因子の存在について試験サンプルを分析するアッセイ装置。６６．サンプルをＧＤＮＦＲタンパク質を含むアッセイ試薬と接触させることを含む（ここで該ＧＤＮＦＲタンパク質は試験サンプル中に存在する神経栄養因子と反応し、神経栄養因子の存在を示す検出可能な反応産物を産生する）、神経栄養因子の存在について試験サンプルを分析する方法。６７．サンプルを、ＧＤＮＦＲタンパク質を含むアッセイ試薬と接触させ（ここで該ＧＤＮＦＲタンパク質は該リガンドと反応してＧＤＮＦＲタンパク質／リガンド複合体を形成し、該複合体は該レセプターチロシンキナーゼの細胞外リガンド結合ドメインに結合する）、キナーゼドメインの活性化および細胞内シグナリングを仲介する特異的基質のリン酸化を検出することを含む、リガンドがレセプターチロシンキナーゼを活性化するか否かを決定する方法。６８．該レセプターチロシンキナーゼはｃ−ｒｅｔ癌原遺伝子である、請求項６７の方法。６９．細胞は、細胞内シグナリングを検出する触媒的タンパク質−チロシンキナーゼドメインを含む細胞外リガンド結合ドメイン、トランスメンブランドメインおよび細胞質セグメントを含むように修飾された、請求項６７の方法。