DE19816186A1 - GDNF-kodierende DNA, Teile davon und GDNF-Varianten - Google Patents
GDNF-kodierende DNA, Teile davon und GDNF-VariantenInfo
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Abstract
Die vorliegende Erfindung betrifft eine GDNF-kodierende DNA, Teile davon und GDNF-Varianten sowie gegen sie gerichtete Antikörper. Ferner betrifft die Erfindung die Verwendung der GDNF-kodierenden DNA, Teile davon und der GDNF-Varianten.
Description
Die vorliegende Erfindung betrifft eine GDNF-kodierende DNA, Teile davon und
GDNF-Varianten sowie gegen sie gerichtete Antikörper. Ferner betrifft die
Erfindung die Verwendung der GDNF-kodierenden DNA, Teile davon und der
GDNF-Varianten.
Neurotrophe Faktoren sind Proteine, die im Nervensystem oder in durch das
Nervensystem innervierten Geweben vorliegen. Ihre Aufgabe liegt in der Ver
sorgung von Glia- und Nervenzellen. Ferner fördern sie die Differenzierung von
Neuronen. Ein von Gliazellen stammender neurotropher Faktor ist GDNF ("glial
cell line- derived neurotrophic factor"). Dieser gehört zur TGF-β ("transforming
growth factor-β") Superfamilie. GDNF ist ein etwa 30 kd großer
Differenzierungs-Faktor für die verschiedensten Neuronen. Dies sind z. B.
dopaminerge Neuronen des Mittelhirns, spinal-motorische, kranial-sensorische
und sympathische Neuronen wie auch noradrenerge Neuronen des Hinterhirns.
Ferner fördert GDNF die Aufnahme von Dopamin durch das Mittelhirn. Des
weiteren haben Versuche mit Parkinson aufweisenden Rhesusaffen gezeigt, daß
eine intrazerebrale Verabreichung von GDNF eine funktionelle Wiederherstellung
bewirken kann.
Dies läßt vermuten, daß über GDNF in neurodegenerative Erkrankungen, wie
Parkinson, amyotrophische Lateralsklerose und Alzheimer, eingegriffen werden
kann. Ein solches Eingreifen könnte auf mehreren Ebenen, z. B. auf der Ebene der
Expression des GDNF-Gens und der Prozessierung von GDNF, erfolgen. Bisher
liegen allerdings über diese Ebene keine ausreichenden Erkenntnisse vor.
Der vorliegenden Erfindung liegt somit die Aufgabe zugrunde, ein Mittel bereitzu
stellen, mit dem die Regulation von GDNF auf molekularer Ebene untersucht und
ggfs. Wege aufgezeigt werden können, mit denen in diese Regulation eingegrif
fen werden kann.
Erfindungsgemäß wird dies durch die Gegenstände in den Patentansprüchen
erreicht.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind somit Mittel, mit denen kodierende
und regulatorische Bereiche einer genomischen GDNF-DNA und ihre gegen
seitigen Einflüsse untersucht werden können. Ferner sind es Mittel, mit denen
die Expression, insbesondere verschiedene Expressionsformen, einer solchen
DNA, bestimmt werden können. Desweiteren sind es Mittel, die ein gezieltes
Eingreifen in die Regulation dieser DNA ermöglichen können.
Die vorliegende Erfindung beruht auf den Erkenntnissen des Anmelders über die
Struktur und die transkriptionelle Regulation einer genomischen GDNF-DNA. Der
Anmelder hat eine solche DNA im humanen Genom am Genlocus 5p 12-p13.1
identifiziert. Er hat diese DNA auf dem PAC Klon 24B12 isoliert und
charakterisiert (vgl. Fig. 1). Ferner hat er die Sequenz für die kodierenden und
für die transkriptionelle Regulation wichtigen Bereiche der GDNF-DNA aufgeklärt
(vgl. Fig. 2). Die DNA enthält drei Exons, die für eine 3.6 kb große cDNA
kodieren, sowie große 5'- und 3'-untranslatierte Regionen (UTRs). Die 3'-UTR
enthält ein polymorphes AGG-"repeat", das allerdings in Patienten mit
neurodegenerativen Erkrankungen, wie Parkinson, idiopathisches
Parkinson-Syndrom, ALS, Alzheimer, spinozerebellare Ataxie oder dopa-responsive
Dystonie, nicht in klinisch relevanter Häufung vorliegt. Die Transkription der
GDNF-DNA wird durch einen eine TATA-Box enthaltenden Promotor bewirkt, der
vor Exon 1 liegt. Ein zweiter Promotor befindet sich vor Exon 2. Der erste
Promotor kann durch verschiedene Substanzen in seiner Promotoraktivität
verstärkt werden. Solche Substanzen sind z. B. der Entzündungsmediator
Tetradecanoyl-12-phorbol-acetat (TPA), der Fibroblasten-Wachstumsfaktor 2
(FGF2bFGFf), cAMP wie auch das Differenzierungsmittel Retinoesäure (RA).
Diese Substanzen spielen eine wichtige Rolle in Entwicklungsprozessen der Zelle
wie auch in anti-apoptotischen, durch Verletzungen induzierten Signalwegen.
Des weiteren hat der Anmelder DNAs gefunden, die für GDNF-Varianten
kodieren. Eine dieser DNAs umfaßt die Exons 1, 2 und 3. Eine andere DNA
umfaßt die Exons 1, 2 und 3, wobei Exon 2 eine 78 bp große Deletion aufweist.
Eine weitere DNA umfaßt die Exons 1 und 3. Die Sequenzen dieser DNAs und
der entsprechenden GDNF-Varianten sind in Fig. 3 angegeben. Der Anmelder hat
erkannt, daß Exon 2 für eine sekretierbare Form von GDNF notwendig ist,
während Exon 3 für eine intrazelluläre Form ausreicht. Auch hat er erkannt, daß
Exon 1 nicht translatiert wird.
Erfindungsgemäß werden die Erkenntnisse des Anmelders genutzt, eine
GDNF-kodierende DNA bereitzustellen, umfassend die Sequenz von Fig. 2 oder eine
hiervon durch ein oder mehrere Basenpaare unterschiedliche Sequenz, wobei
letztere Sequenz mit der DNA von Fig. 2 hybridisiert und keine GDNF-cDNA ist.
Die DNA von Fig. 2 wurde als E.coli 24B1 2 bei der DSMZ (Deutsche Sammlung
von Mikroorganismen und Zellkulturen) am 20. März 1998 unter DSM 12063
hinterlegt.
Der Ausdruck "eine durch ein oder mehrere Basenpaare unterschiedliche Se
quenz" umfaßt jegliche für GDNF-kodierende Sequenz, die mit der DNA von Fig.
2 hybridisiert und keine GDNF-cDNA ist. Die Sequenz kann sich von der DNA
von Fig. 2 durch Additionen, Deletionen, Substitutionen und/oder Inversionen
von ein oder mehreren Basenpaaren unterscheiden. Der Ausdruck
"Hybridisierung" weist auf eine Hybridisierung unter üblichen Bedingungen,
insbesondere bei 20°C unter dem Schmelzpunkt der Sequenz hin. Der Ausdruck
"keine GDNF-cDNA" weist darauf hin, daß die Sequenz Elemente umfaßt, die in
einer cDNA fehlen. Solche Elemente sind z. B. Intron- oder transkriptionelle
Regulations-Sequenzen.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist eine DNA mit Pro
motor-Aktivität, umfassend die in Fig. 2 als Promotorfragment 1 angegebene Sequenz
oder eine hiervon durch ein oder mehrere Basenpaare unterschiedliche Sequenz,
wobei letztere Sequenz mit der ersteren hybridisiert.
Der Ausdruck "eine durch ein oder mehrere Basenpaare unterschiedliche Se
quenz" umfaßt jegliche Sequenz, die mit der in Fig. 2 als Promotorfragment
angegebenen Sequenz hybridisiert und eine Promotor-Aktivität aufweist. Die
Sequenz kann sich von der in Fig. 2 als Promotorfragment angegebenen
Sequenz durch Additionen, Deletionen, Substitutionen und/oder Inversionen von
ein oder mehreren Basenpaaren unterscheiden. Hinsichtlich des Ausdrucks
"Hybridisierung" wird auf vorstehende Ausführungen entsprechend verwiesen.
Der Ausdruck "Promotor-Aktivität" weist darauf hin, daß übliche Verfahren zum
Nachweis einer Promotor-Aktivität verwendet werden können. Beispielsweise
kann ein Reporter-Gen, z. B. ein Luciferase-Gen, an das 3'-Ende der auf ihre
Promotor-Aktivität hin zu testenden Sequenz ligiert werden. Das erhaltene
DNA-Molekül kann in Zellen transfiziert und die Expression des Luciferase-Gens
bestimmt werden, wodurch die Promotor-Aktivität nachgewiesen wird.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist eine DNA, die sich zum
Nachweis von GDNF-Sequenzen eignet. Insbesondere eignet sich die DNA als
Primer bzw. Primer-Paar für ein PCR-Verfahren. Eine solche DNA umfaßt eine der
in Fig. 4 angegebenen Sequenzen oder eine hiervon durch ein oder mehrere
Basen unterschiedliche Sequenz, wobei letztere mit der komplementären
Sequenz der in Fig. 4 angegebenen DNA hybridisiert.
Der Ausdruck "eine durch ein oder mehrere Basen unterschiedliche Sequenz"
umfaßt jegliche Sequenz, die mit der komplementären Sequenz der in Fig. 4
angegebenen DNA hybridisiert. Die Sequenz kann sich von der DNA von Fig. 4
durch Additionen, Deletionen, Substitutionen und/oder Inversionen von ein oder
mehreren Basen unterscheiden. Hinsichtlich des Ausdrucks "Hybridisierung" wird
auf vorstehende Ausführungen entsprechend verwiesen.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist eine Nukleinsäure, die für
eine GDNF-Variante kodiert. Die Nukleinsäure kann eine RNA oder eine DNA,
z. B. eine cDNA, sein. Bevorzugt ist eine DNA, die folgendes umfaßt:
- (a) Die DNA von Fig. 3 oder eine hiervon durch ein oder mehrere Basenpaare unterschiedliche DNA, wobei letztere DNA mit der DNA von Fig. 3 hybridisiert und Exon-1 und/oder Exon 2-Sequenzen von GDNF aufweist, oder
- (b) eine mit der DNA von (a) über den degenerierten genetischen Code verwandte DNA.
Der Ausdruck "eine durch ein oder mehrere Basenpaare unterschiedliche DNA"
umfaßt jegliche für GDNF-kodierende DNA, die mit der DNA von Fig. 3
hybridisiert und Exon-1 und/oder Exon 2-Sequenzen von GDNF aufweist. Die
DNA kann sich von der DNA von Fig. 3 durch Additionen, Deletionen,
Substitutionen und/oder Inversionen von ein oder mehreren Basenpaaren
unterscheiden. Hinsichtlich des Ausdrucks "Hybridisierung" wird auf
vorstehende Ausführungen entsprechend verwiesen.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist eine GDNF-Variante. Eine
solche umfaßt durch Exon 2 und Exon 3 kodierte Aminosäuren. Insbesondere
umfaßt eine erfindungsgemäße GDNF-Variante die Aminosäuresequenz von Fig.
3(a) bzw. (b) oder eine hiervon durch ein oder mehrere Aminosäuren
unterschiedliche Aminosäuresequenz, wobei die DNA-Sequenz der letzteren
Aminosäuresequenz mit der DNA von Fig. 3(a) bzw. (b) hybridisiert und Exon
2- und Exon 3-Sequenzen aufweist.
Der Ausdruck "eine durch ein oder mehrere Aminosäuren unterschiedliche
Aminosäuresequenz" umfaßt jegliche GDNF-Aminosäuresequenz, deren
DNA-Sequenz mit der DNA von Fig. 3(a) bzw. (b) hybridisiert und Exon 2 und Exon
3-Sequenzen aufweist. Die DNA-Sequenz kann sich von der DNA von Fig. 3(a)
bzw. (b) durch Additionen, Deletionen, Substitutionen und/oder Inversionen von
ein oder mehreren Basenpaaren unterscheiden. Hinsichtlich des Ausdrucks
"Hybridisierung" wird auf vorstehende Ausführungen entsprechend verwiesen.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist eine Kombination aus
einer GDNF-Variante und einem Rezeptor, an den die GDNF-Variante bindet. Der
Ausdruck "GDNF-Variante" umfaßt eine vorstehende GDNF-Variante. Ferner
umfaßt er eine GDNF-Variante, die keine durch Exon 2 kodierten Aminosäuren
aufweist.
Eine erfindungsgemäße DNA kann als solche oder in Kombination mit jeglicher
anderen DNA vorliegen. Beispielsweise kann eine erfindungsgemäße, eine
Promotor-Aktivität aufweisende DNA in Kombination mit einer zu
transkribierenden DNA, z. B. einem Reporter-Gen oder einem Struktur-Gen,
vorliegen. Eine solche Kombination kann in üblichen Vektoren erfolgen. Für eine
Kombination mit einem Reporter-Gen, z. B. einem Luciferase-Gen, bieten sich
Vektoren, wie pXP1 und pAH1409, an. Diese können dann zur Transfektion von
Zellen, wie NIH3T3 und 293-Zellen, verwendet werden. Mit der Kombination aus
einer erfindungsgemäßen, eine Promotor-Aktivität aufweisenden DNA und einem
Reporter-Gen ist es möglich, die Promotor-Aktivität unter den verschiedensten
Bedingungen zu testen. Damit können Substanzen gefunden werden, mit denen
die Promotor-Aktivität und somit die Regulation der Expression einer GDNF-DNA
beeinflußt werden können. Solche Substanzen können aktivierend bzw.
inhibierend sein.
Ferner kann eine erfindungsgemäße, für eine GDNF-Variante kodierende DNA in
einem Expressionsvektor vorliegen. Beispiele solcher sind dem Fachmann
bekannt. Im Falle eines Expressionsvektors für E. coli sind dies z. B. pGEMEX,
pUC-Derivate, pGEX-2T, pET3b und pQE-8. Für die Expression in Hefe sind z. B.
pY100 und Ycpad1 zu nennen, während für die Expression in tierischen Zellen
z. B. pKCR, pEFBOS, cDM8, pCEV4, pBC140 und Rep 7 anzugeben sind. Für die
Expression in Insektenzellen eignet sich besonders der Bacculovirus-Expressions
vektor pAcSGHisNT-A.
Der Fachmann kennt geeignete Zellen, um die erfindungsgemäße, in einem
Expressionsvektor vorliegende DNA zu exprimieren. Beispiele solcher Zellen
umfassen die E.coli-Stämme HB101, DH1, x1776, JM101, JM109, BL21 und
SG 13009, den Hefe-Stamm Saccharomyces cerevisiae und die tierischen Zellen
L, NIH 3T3, FM3A, CHO, COS, Vero, HeLa und HEK293 sowie die
Insektenzellen sf9.
Der Fachmann weiß, in welcher Weise die erfindungsgemäße DNA in einen
Expressionsvektor inseriert werden muß. Ihm ist auch bekannt, daß diese DNA
in Verbindung mit einer für ein anderes Protein bzw. Peptid kodierenden DNA
inseriert werden kann, so daß die erfindungsgemäße DNA in Form eines Fu
sionsproteins exprimiert werden kann.
Des weiteren kennt der Fachmann Bedingungen, transformierte bzw. trans
fizierte Zellen zu kultivieren. Auch sind ihm Verfahren bekannt, das durch die
erfindungsgemäße DNA exprimierte Protein bzw. Fusionsprotein zu isolieren und
zu reinigen.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein gegen ein vorstehen
des Protein bzw. Fusionsprotein gerichteter Antikörper. Ein solcher Antikörper
kann durch übliche Verfahren hergestellt werden. Er kann polyklonal bzw.
monoklonal sein. Zu seiner Herstellung ist es günstig, Tiere, insbesondere
Kaninchen, Hühner oder Ratten für einen polyklonalen und Mäuse oder Ratten
für einen monoklonalen Antikörper, mit einem vorstehenden (Fusions)protein
oder Fragmenten davon zu immunisieren. Weitere "Booster" der Tiere können
mit dem gleichen (Fusions)protein oder Fragmenten davon erfolgen. Der
polyklonale Antikörper kann dann aus dem Serum bzw. Eigelb der Tiere erhalten
werden. Für den monoklonalen Antikörper werden Milzzellen der Tiere mit
Myelomzellen fusioniert.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Kit. Ein solcher
umfaßt eine oder mehrere der folgenden Komponenten:
- (a) eine erfindungsgemäße DNA,
- (b) eine erfindungsgemäße GDNF-Variante,
- (c) ein erfindungsgemäßer Antikörper, sowie
- (d) übliche Hilfsstoffe, wie Träger, Puffer, Lösungsmittel, Kontrollen, etc.
Von den einzelnen Komponenten können jeweils ein oder mehrere Vertreter
vorliegen. Hinsichtlich der einzelnen Ausdrücke wird auf vorstehende
Ausführungen verwiesen. Diese gelten hier entsprechend.
Die vorliegende Erfindung ermöglicht es, die Regulation von GDNF auf
molekularer Ebene zu untersuchen. Mit einem erfindungsgemäßen Antikörper
kann eine GDNF-Variante nachgewiesen werden. Es kann eine Beziehung der
GDNF-Variante zu Geweben und/oder Funktionen hergestellt werden. Ferner
kann mit einer erfindungsgemäßen GDNF-Variante ein gegen dieses Protein
gerichteter Autoantikörper nachgewiesen werden. Beide Nachweise können
durch übliche Verfahren, insbesondere einen Western Blot, einen ELISA, eine
Immunpräzipitation oder durch Immunfluoreszenz, erfolgen. Desweiteren kann
mit einer erfindungsgemäßen Nukleinsäure, insbesondere einer DNA und hiervon
abgeleiteten Primern, die Organisation und die Expression des für GDNF
kodierenden Gens nachgewiesen werden. Dieser Nachweis kann in üblicher
Weise, insbesondere in einem Southern Blot oder über "in situ" Hybridisierung,
erfolgen.
Darüberhinaus eignet sich die vorliegende Erfindung, Maßnahmen für und gegen
das Vorliegen von GDNF in Personen zu ergreifen. Mit einem erfindungsgemäßen
Antikörper kann eine GDNF-Variante inhibiert werden. Andererseits kann mit
einer erfindungsgemäßen GDNF-Variante, insbesondere nach Kopplung an ein
vom Körper nicht als fremd angesehenes Protein, z. B. Transferrin oder BSA, die
Menge der GDNF-Variante in Personen erhöht werden. Entsprechendes kann
auch mit einer erfindungsgemäßen Nukleinsäure, insbesondere einer DNA,
erreicht werden, die unter die Kontrolle eines in bestimmten Geweben, z. B.
Gehirn, induzierbaren Promotors gestellt wird und nach ihrer Expression zur
Bereitstellung einer GDNF-Variante in diesen Geweben führt. Darüberhinaus kann
eine erfindungsgemäße Nukleinsäure, insbesondere eine DNA, auch zur
Inhibierung von GDNF genutzt werden. Hierzu wird die Nukleinsäure, z. B. als
Basis für die Erstellung von Anti-Sinn-Oligonukleotiden zur Expressions-In
hibierung des für GDNF kodierenden Gens verwendet. Somit stellt die
vorliegende Erfindung Mittel dar, neurodegenerative Erkrankungen, wie
Parkinson, amyotrophische Lateralsklerose und Alzheimer, besser zu
diagnostizieren und therapeutisch eingreifen können.
Fig. 1 zeigt die Organisation einer genomischen GDNF-DNA, wobei in A)
eine grobe und in B) eine detaillierte Restriktionskarte angegeben
ist. Exons sind als Boxen angegeben, wobei ausgefüllte Teile dieser
kodierende Bereiche und nicht-ausgefüllte Teile UTRs sind. Ferner
ist die Lage des AGG-"repeat" und der Poly A-Sequenzen
angegeben.
Fig. 2 zeigt die Sequenzen der Exons 1, 2 und 3 einer genomischen
GDNF-DNA. Ferner sind Sequenzen der Introns, des
Promotorfragments 1, des AGG-"repeat" und der Poly
A-Sequenzen angegeben.
Fig. 3 zeigt die DNA- und Aminosäuresequenzen für GDNF-Varianten. In
Fig. 3(a) umfaßt die Variante auf der DNA-Ebene die Exons 1, 2
und 3, in Fig. 3(b) die Exons 1, 2 und 3, wobei Exon 2 eine 78 bp
große Deletion aufweist, und in Fig. 3(c) die Exons 1 und 3. Auf
der Proteinebene umfaßt die GDNF-Variante jeweils nicht den durch
Exon 1 kodierten Bereich.
Fig. 4 zeigt Primer-Paare, die sich für eine PCR-Reaktion zum Nachweis
von GDNF-Sequenzen eignen.
Fig. 5 zeigt die Expression einer GDNF-Variante, welche die durch die
Exon 2 und 3 kodierten Bereiche umfaßt. Die GDNF-Variante wird
in das Medium sekretiert.
Fig. 6 zeigt die Promotor-Aktivität des Promotorfragments 1 von Fig. 2
und ihre Verstärkung durch Substanzen.
Die vorliegende Erfindung wird durch die nachstehenden Beispiele erläutert.
Es wird eine erfindungsgemäße für eine GDNF-Variante kodierende DNA
exprimiert, welche die Exons 1, 2 und 3 umfaßt. Hierzu wird aus 293-Zellen
Gesamt-RNA isoliert und einem RT-PCR-Verfahren unterzogen. Als Primer-Paar
für das PCR-Verfahren werden die nachstehenden Primer verwendet, die eine
Xhol-Restriktionsstelle aufweisen:
GDL.f: 3'-ATGGCCGCCTCGAGATGAAGTTATGGGATGTCGTGG-3'
GDX.r: 5'-GAGCTCGAGTCAGATACATCCACACC-3'.
GDX.r: 5'-GAGCTCGAGTCAGATACATCCACACC-3'.
Die erhaltene cDNA wird einer Xhol-Spaltung unterzogen und in den mit
Xhol-geöffneten Expressionsvektor pBC140 bzw. Rep 7 inseriert. Es wird das
Expressionsplasmid pBC140-GDNF bzw. Rep 7-GDNF erhalten.
Dieses wird zur Transfektion von tierischen Zellen verwendet, wobei 2 µg des
Expressionsplasmids 1,5 × 106 Zellen zugegeben werden. Die Zellen werden in
konditioniertem Medium kultiviert. 24 Stunden bzw. 48 Stunden nach
Transfektion werden die Zellen geerntet und das Medium gesammelt. Die Zellen
werden einer Ultraschall-Behandlung unterzogen, wodurch Zellysate gewonnen
werden. Diese werden zusammen mit dem Medium und GDNF-Kontrolle einer
12%igen Polyacrylamid-Gelelektrophorese unterzogen, der anschließend ein
Blot-Verfahren folgt. Nach diesem wird die Nitrocellulosemembran über Nacht bei
4°C mit einem Kaninchen-Antikörper (Sta.Cruz) inkubiert, der den durch Exon 3
kodierten Bereich von GDNF erkennt. Die Antikörperbindung wird dann durch
2stündige Inkubation bei 4°C mit einem markierten Ziege-anti-Kaninchen-Anti
körper (Tropix) sichtbar gemacht (vgl. Fig. 5).
Es zeigt sich, daß eine erfindungsgemäße, für eine GDNF-Variante kodierende
DNA exprimiert werden kann. Ferner wird deutlich, daß eine die Exons 1, 2 und
3 umfassende GDNF-DNA für eine GDNF-Variante kodiert, die von der Zelle
sekretiert wird.
Es wird der Vektor pAH1409 verwendet. Dieser enthält ein Reporter-Gen,
nämlich ein Luciferase-Gen. Am 5'-Ende des Luciferase-Gens befindet sich ein
Polylinker, in den das 1,1 kb große EcoRI/PstI-Fragment (Promotorfragment 1
von Fig. 2) inseriert wird. Es wird das Expressionsplasmid pAH1409-GDNF
erhalten.
Dieses wird zur Transfektion von tierischen Zellen verwendet, wobei 2 µg von
pAH1409-GDNF 1,5 × 106 Zellen zugegeben werden. Ferner wird in einem
Verhältnis von 1 : 5 ein DNA-Konstrukt cotransfiziert, das für GFP ("Green
Fluorescent Protein") kodiert. Als Kontrolle wird pAH1409 in Parallelversuchen
transfiziert. Die Zellen werden unbehandelt bzw. mit TPA (100 ng/ml),
8-Brom-cAMP (1 mM), Retinoesäure (RA 10 µM), bFGF (10 ng/ml) oder IFNg (1000
Enzymeinheiten) behandelt. 44-48 Stunden nach Transfektion werden die Zellen
geerntet und es wird ein Luciferase-Nachweis durchgeführt (vgl. Fig. 6).
Es zeigt sich, daß eine erfindungsgemäße, das Promotorfragment 1 von Fig. 2
umfassende DNA eine Promotor-Aktivität aufweist und diese durch Substanzen
verstärkt werden kann.
Die amplifizierte DNA von Beispiel 1 wird mit Xhol gespalten und in den mit Xhol
gespaltenen Expressionsvektors pQE-8 (Qiagen) inseriert. Es wird das Expres
sionsplasmid pQ/GDNF erhalten. Ein solches kodiert für ein Fusionsprotein aus
6 Histidin-Resten (N-Terminuspartner) und dem erfindungsgemäßen GDNF von
Fig. 3(a) (C-Terminuspartner). pQ/GDNF wird zur Transformation von E.coli SG
13009 (vgl. Gottesman, S. et al., J. Bacteriol. 148, (1981), 265-273) verwen
det. Die Bakterien werden in einem LB-Medium mit 100 µg/ml Ampicillin und
25 µg/ml Kanamycin kultiviert und 4 h mit 60 µM Isopropyl-β-D-Thiogalactopyra
nosid (IPTG) induziert. Durch Zugabe von 6 M Guanidinhydrochlorid wird eine
Lyse der Bakterien erreicht, anschließend wird mit dem Lysat eine Chromato
graphie (Ni-NTA-Resin) in Gegenwart von 8 M Harnstoff entsprechend der
Angaben des Herstellers (Qiagen) des Chromatographie-Materials durchgeführt.
Das gebundene Fusionsprotein wird in einem Puffer mit pH 3,5 eluiert. Nach
seiner Neutralisierung wird das Fusionsprotein einer 18% SDS-Polyacrylamid-Ge
lelektrophorese unterworfen und mit Coomassie-Blau angefärbt (vgl. Thomas,
J.O. und Kornberg, R.D., J. Mol. Biol. 149 (1975), 709-733).
Es zeigt sich, daß ein erfindungsgemäßes (Fusions)protein in hochreiner Form
hergestellt werden kann.
Ein erfindungsgemäßes Fusionsprotein von Beispiel 3 wird einer 18%
SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese unterzogen. Nach Anfärbung des Gels mit 4 M
Natriumacetat wird eine ca. 30 kD Bande aus dem Gel herausgeschnitten und in
Phosphat gepufferter Kochsalzlösung inkubiert. Gel-Stücke werden sedimentiert,
bevor die Proteinkonzentration des Überstandes durch eine SDS-Polyacrylamid-Ge
lelektrophorese, der eine Coomassie-Blau-Färbung folgt, bestimmt wird. Mit
dem Gel-gereinigten Fusionsprotein werden Tiere wie folgt immunisiert:
Pro Immunisierung werden 35 µg Gel-gereinigtes Fusionsprotein in 0,7 ml PBS
und 0,7 ml komplettem bzw. inkomplettem Freund's Adjuvans eingesetzt.
Tag 0: 1. Immunisierung (komplettes Freund's Adjuvans)
Tag 14: 2. Immunisierung (inkomplettes Freund's Adjuvans; icFA)
Tag 28: 3. Immunisierung (icFA)
Tag 56: 4. Immunisierung (icFA)
Tag 80: Ausbluten.
Tag 0: 1. Immunisierung (komplettes Freund's Adjuvans)
Tag 14: 2. Immunisierung (inkomplettes Freund's Adjuvans; icFA)
Tag 28: 3. Immunisierung (icFA)
Tag 56: 4. Immunisierung (icFA)
Tag 80: Ausbluten.
Das Serum des Kaninchens wird im Immunoblot getestet. Hierzu wird ein
erfindungsgemäßes Fusionsprotein von Beispiel 1 einer SDS-Polyacrylamid-Ge
lelektrophorese unterzogen und auf ein Nitrocellulosefilter übertragen (vgl.
Khyse-Andersen, J., J. Biochem. Biophys. Meth. 10, (1984), 203-209). Die
Western Blot-Analyse wurde wie in Bock, C.-T. et al., Virus Genes 8, (1994),
215-229, beschrieben, durchgeführt. Hierzu wird das Nitrocellulosefilter eine
Stunde bei 37°C mit einem ersten Antikörper inkubiert. Dieser Antikörper ist das
Serum des Kaninchens (1 : 10000 in PBS). Nach mehreren Waschschritten mit
PBS wird das Nitrocellulosefilter mit einem zweiten Antikörper inkubiert. Dieser
Antikörper ist ein mit alkalischer Phosphatase gekoppelter monoklonaler Ziege
Anti-Kaninchen-IgG-Antikörper (Dianova) (1 : 5000) in PBS. Nach 30-minütiger
Inkubation bei 37°C folgen mehrere Waschschritte mit PBS und anschließend
die alkalische Phosphatase-Nachweisreaktion mit Entwicklerlösung (36 µM 5'
Bromo-4-chloro-3-indolylphosphat, 400 µM Nitroblau-tetrazolium, 100 mM
Tris-HCl, pH 9.5, 100 mM NaCl, 5 mM MgCl2) bei Raumtemperatur, bis Banden
sichtbar werden.
Es zeigt sich, daß erfindungsgemäße, polyklonale Antikörper hergestellt werden
können.
Pro Immunisierung werden 40 µg Gel-gereinigtes Fusionsprotein in 0,8 ml PBS
und 0,8 ml komplettem bzw. inkomplettem Freund's Adjuvans eingesetzt.
Tag 0: 1. Immunisierung (komplettes Freund's Adjuvans)
Tag 28: 2. Immunisierung (inkomplettes Freund's Adjuvans; icFA)
Tag 50: 3. Immunisierung (icFA).
Tag 0: 1. Immunisierung (komplettes Freund's Adjuvans)
Tag 28: 2. Immunisierung (inkomplettes Freund's Adjuvans; icFA)
Tag 50: 3. Immunisierung (icFA).
Aus Eigelb werden Antikörper extrahiert und im Western Blot getestet. Es
werden erfindungsgemäße, polyklonale Antikörper nachgewiesen.
Pro Immunisierung werden 12 µg Gel-gereinigtes Fusionsprotein in 0,25 ml PBS
und 0,25 ml komplettem bzw. inkomplettem Freund's Adjuvans eingesetzt; bei
der 4. Immunisierung ist das Fusionsprotein in 0,5 ml (ohne Adjuvans) gelöst.
Tag 0: 1. Immunisierung (komplettes Freund's Adjuvans)
Tag 28: 2. Immunisierung (inkomplettes Freund's Adjuvans; icFA)
Tag 56: 3. Immunisierung (icFA)
Tag 84: 4. Immunisierung (PBS)
Tag 87: Fusion.
Tag 0: 1. Immunisierung (komplettes Freund's Adjuvans)
Tag 28: 2. Immunisierung (inkomplettes Freund's Adjuvans; icFA)
Tag 56: 3. Immunisierung (icFA)
Tag 84: 4. Immunisierung (PBS)
Tag 87: Fusion.
Überstände von Hybridomen werden im Western Blot getestet. Erfindungs
gemäße, monoklonale Antikörper werden nachgewiesen.
Es zeigt sich, daß eine erfindungsgemäße DNA eine Promotor-Aktivität aufweist
und diese durch Substanzen verstärkt werden kann.
Claims (13)
1. GDNF-kodierende DNA, umfassend die Sequenz von Fig. 2 oder eine
hiervon durch ein oder mehrere Basenpaare unterschiedliche Sequenz,
wobei letztere Sequenz mit der DNA von Fig. 2 hybridisiert und keine
GDNF-cDNA ist.
2. DNA mit Promotor-Aktivität, umfassend die in Fig. 2 als Promotorfrag
ment 1 angegebene Sequenz oder eine hiervon durch ein oder mehrere
Basenpaare unterschiedliche Sequenz, wobei letztere Sequenz mit der
ersteren hybridisiert.
3. DNA nach Anspruch 2, wobei die DNA in Kombination mit einer zu trans
kribierenden DNA vorliegt.
4. DNA nach Anspruch 3, wobei die zu transkribierende DNA ein
Reporter-Gen ist.
5. DNA, geeignet zum Nachweis von GDNF-Sequenzen, umfassend eine der
in Fig. 4 angegebenen Sequenzen oder eine hiervon durch ein oder mehre
re Basen unterschiedliche Sequenz, wobei letztere mit der komplementä
ren Sequenz der in Fig. 4 angegebenen DNA hybridisiert.
6. DNA, kodierend für eine GDNF-Variante, umfassend:
- (a) Die DNA von Fig. 3 oder eine hiervon durch ein oder mehrere Ba senpaare unterschiedliche DNA, wobei letztere DNA mit der DNA von Fig. 3 hybridisiert und Exon-1 und/oder Exon 2-Sequenzen von GDNF aufweist, oder
- (b) eine mit der DNA von (a) über den degenerierten genetischen Code verwandte DNA.
7. Expressionsplasmid, umfassend die DNA nach Anspruch 6.
8. Transformante, enthaltend das Expressionsplasmid nach Anspruch 7.
9. GDNF-Variante, umfassend die Aminosäuresequenz von Fig. 3(a) bzw.
(b) oder eine hiervon durch ein oder mehrere Aminosäuren unterschiedli
che Aminosäuresequenz, wobei die DNA-Sequenz der letzteren Aminosäu
resequenz mit der DNA von Fig. 3(a) bzw. (b) hybridisiert und Exon
2- und Exon 3-Sequenzen aufweist.
10. Antikörper, gerichtet gegen die GDNF-Variante nach Anspruch 9.
11. Verwendung der DNA nach einem der Ansprüche 1-6 oder der
GDNF-Variante nach Anspruch 9 zur Untersuchung der Regulation von GDNF.
12. Verwendung der DNA nach einem der Ansprüche 1-6 oder der
GDNF-Variante nach Anspruch 9 zur Diagnose und/oder Therapie von neurode
generativen Erkrankungen.
13. Verwendung nach Anspruch 12, wobei die neurodegenerativen Erkrankun
gen Parkinson, amyothrophische Lateralsklerose und Alzheimer umfassen.
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