JPH0746104B2

JPH0746104B2 - Ｆｄｐの測定法

Info

Publication number: JPH0746104B2
Application number: JP61222176A
Authority: JP
Inventors: 吉夫徐; 功河野; 美千代本島; 真人斉藤; 恵美子舘野; 文夫野内
Original assignee: Mitsubishi Kagaku Iatron Inc
Current assignee: Mitsubishi Kagaku Iatron Inc
Priority date: 1986-09-22
Filing date: 1986-09-22
Publication date: 1995-05-17
Anticipated expiration: 2010-05-17
Also published as: JPS6378066A

Description

【発明の詳細な説明】「産業上の利用分野」本発明は、１種類のモノクローナル抗体を利用したフィ
ブリン分解産物（以下FDPと記す）中のＤダイマーもし
くはＤダイマーの立体構造を保持する分画の測定法に関
するものである。さらに詳細にはヒトフィブリノーゲン
又はフィブリンのプラスミン分解物中のＤモノマーもし
くはＤダイマーあるいはＤモノマーもしくはＤダイマー
の立体構造を保持する分画と抗原抗体反応するモノクロ
ーナル抗体をポリスチレンラテックスに固定化すること
により検体中のフィブリノーゲン,X分画およびＹ分画と
は反応せず、Ｄモノマー又はＤモノマーの立体構造を保
持する分画とは反応しても凝集せず、Ｄダイマーもしく
はＤダイマーの立体構造を保持する分画とだけさせるこ
とによるフィブリノーゲン量,X分画量,Y分画量に影響さ
れない定量法であり、検体中のＤダイマーおよびＤダイ
マーの立体構造を保持する分画の定量のための診断試薬
として有用である。

「従来の技術」近年、血栓・塞栓により死亡する基礎疾患が増加する傾
向にある。血栓形成の操作にはいまだに不明なことが多
いけれども、血栓形成の臨床診断法は血栓症の増加につ
れて進歩している。現在、FDP中のＤダイマー等の定量
的測定に抗ヒトフィブリノーゲンポリクローナル抗体を
感作したポリスチレンラテックス粒子を用いた凝集法が
一般的に用いられている。しかし、この方法は、検体中
にフィブリノーゲン、Ｘ分画およびＹ分画の混在がある
と疑似的にFDPが陽性となる。このような疑似陽性反応
をなくすため、検体は完全に脱フィブリノーゲン脱Ｘ分
画，脱Ｙ分画されることが要求される。けれども、この
ような操作は非常に煩雑であり、緊急性を要する臨床診
断薬として適当でない。一方、臨床的にはフィブリノー
ゲンの存在下でもFDP中のＤダイマー等を特異的にかつ
簡便に測定する方法ならびにその試薬の開発が期待され
ていた。この諸問題を克服する目的で本発明者らは鋭意
研究し本発明を完成するに至った。

「問題点を解決するための手段」すなわち、本発明はモノクローナル抗体を用いてFDPを
測定する方法において、ヒトフィブリノーゲンのプラス
ミン分解物中のＤモノマーおよびヒトフィブリンのプラ
スミン分解物中Ｄダイマー又はＤモノマーあるいはＤダ
イマーの立体構造を保持する分画と特異的に反応するが
フィブリノーゲン、Ｘ分画、Ｙ分画および_earlyDとは反
応しない性質を有する１種類の抗Ｄダイマー・Ｄモノマ
ーモノクローナル抗体を固定化したポリスチレンラテッ
クス粒子と検体とを接触させ、該モノクローナル抗体固
定化粒子と検体中のＤダイマー又はＤダイマーの立体構
造を保持する分画を選択的に凝集させ、該凝集物を目視
あるいは分光学的に測定し、検体中のＤダイマー又はＤ
ダイマーの立体構造をもつ分画を半定量あるいは定量的
に検出することを特徴とするFDPの測定方法に関する。

近年各方面で応用されている細胞融合法により、後述す
る「モノクローナル抗体の製造」に記載した如くしてフ
ィブリノーゲン、Ｘ分画およびＹ分画と反応しない新規
な抗Ｄダイマー,Dモノマーモノクローナル抗体を得、こ
れをラテックス凝集法に適用することにより、フィブリ
ノーゲン,X分画およびＹ分画の存在下でも正確に検体中
のFDP中のＤダイマー等の量を測定することを可能にし
た。

本発明の原理は、ＤダイマーおよびＤダイマーの立体構
造を保持する分画あるいはＤモノマーおよびＤモノマー
の立体構造を保持する分画と反応する“１種類”の抗Ｄ
ダイマー,Dモノマーモノクローナル抗体を感作したポリ
スチレンラテックス粒子を用いて、検体中のＤダイマー
およびＤダイマーの立体構造を保持する分画を定量する
逆受身凝集反応である。すなわち、後述の「モノクロー
ナル抗体の製造」に記載のDD/D−１のモノクローナル抗
体をポリスチレンラテックス粒子の懸濁溶液（pH8.0）
に添加し、DD/D−1,抗Ｄダイマー,Dモノマーモノクロー
ナル抗体感作ポリスチレンラテックス粒子を調製する。
この抗体感作ラテックス粒子はＤダイマーおよびＤダイ
マーの立体構造を保持する分画あるいはＤモノマーおよ
びＤモノマーの立体構造を保持する分画の両方と抗原抗
体反応を起すが、凝集はＤダイマーおよびＤダイマーの
立体構造を保持する分画との間の反応にのみ生ずるとい
う特異な性質を有している。従って前記感作ラテックス
の一定量と検体の一定量をスライド板あるいはマイクロ
タイタープレート上で一定時間混和した後、凝集像の有
無あるいは強弱を観察し検体中のＤダイマーおよびＤダ
イマーの立体構造を保持する分画の量を判定することが
できる。あるいは、感作ラテックスの一定量と検体の一
定量を混合し、一定時間後の吸光度の増大を適当な波長
で分光学的に測定することにより検体中のＤダイマーお
よびＤダイマーの立体構造を保持する分画の量を定量す
ることができる。本発明に使用するポリスチレンラテッ
クス粒子は市販のものが使用でき、その粒径は0.1〜0.8
μｍを使用するのが望ましい。なお、本発明に使用でき
る被検体としては血漿，血清，尿等が使用可能である。

本発明に用いられるフィブリノーゲン、Ｘ分画およびＹ
分画と反応しない新規な抗ダイマー,Dモノマーモノクロ
ーナル抗体は以下のようにして得られる。

モノクローナル抗体の製造抗ＤダイマーＤモノマーモノクローナル抗体は新規なマ
ウス・ハイブリドーマをそれぞれ培地またはマウスの腹
腔内で培養することによって製造できる。ここで用いる
マウス・ハイブリドーマは一般的にはＤダイマーで免疫
したマウスの脾臓細胞とマウス骨髄腫細胞とを、Ｋhl
erおよびMilsteinの細胞融合の基本方法〔nature第256
巻495頁（1975年）参照〕により細胞融合して製造する
ことが可能である。詳細には、下記製造例に述べる如く
である。

また、上記のハイブリドーマを培養する培地としては、
ハイブリドーマの培養に適した培地であればよく、好適
にはダルベッコ氏変法イーグル氏最小必須培地（Dulbec
co′s modified Eeagle′s minimum essential medium
以下DMEと記す。）にウシ胎児血清,L−グルタミン,L−
ピルビン酸および抗性物質（ペニシリンＧとストレプト
マイシン）を含む培地が用いられる。

上記のハイブリドーマの培養は、培地中で行なう場合に
は５％CO₂濃度、37℃で約３日間、またマウスの腹腔内
で培養する場合には約14日間で行なわれる。

このようにして製造された培養液またはマウスの腹水か
ら、蛋白質の単離、精製に一般的に用いられる方法によ
り、前述のモノクローナル抗体を分離、精製することが
可能である。

そのような方法としては、硫安塩析，イオン交換セルロ
ースを用いるイオン交換カラムクロマトグラフィー，分
子篩ゲルを用いる分子篩カラムクロマトグラフィー，プ
ロテインＡ結合多糖類を用いる親和性カラムクロマトグ
ラフィー，透析，凍結乾燥等がある。

製造例１Ｄダイマーおよび（DD）Ｅの調製方法Ｄダイマーの調製法は、主にStephanie A.OlexaとAndre
i Z.Budzynskiの方法，（1978）Circulation,Suppl.58,
119,Olexa et al.の方法，（1979）Biochim.Biophys.Ac
ta 576,39〜50に準じて行った。フィブリノーゲン（カ
ビ社，スウェーデン）20mg（10mg/ml）に、ヒトトロン
ビンおよび塩化カルシウムをぞれぞれ終濃度10単位/ml,
10mMとなるように加え、37℃２時間反応させフィブリノ
ーゲンをフィブリンに変換させた。18000×g,30分遠心
しフィブリンを非凝固性物質から分離した。フィブリン
は20mlの0.15Mトリス−塩酸緩衝液（pH7.8）−5mM塩化
カルシウム−0.02％NaN₃液に浮遊させる。浮遊液にヒト
プラスミン（１単位/ml,ミドリ十字社）を１時間毎に0.
5ml添加した。10時間後、アプロチニン（Mobay Chemica
l Corp.）を200単位加えて分解反応を停止させた。容量
10mlのリジンセファロースカラムに通過させプラスミン
を除去した。

次に、通過液を前もって50mMトリス塩酸緩衝液（pH7.
5）−0.15M塩化ナトリウム−5mM塩化カルシウム溶液で
平衡化したセファロースCL6B（ファルマシヤ社，スウェ
ーデン）のカラム（直径2.6cm長さ90cm）に充てんし
た。前記の溶液で展開する分子ふるいクロマトグラフィ
ーを行った。分子量マーカーおよび抗D,抗Ｅ抗血清（ヘ
キスト社，ドイツ）を用いるオクテロニー法により（D
D）Ｅ複合体の分画を同定、分離した。このようにして
得られた（DD）Ｅ複合体を3M尿素−50mMクエン酸（pH5.
5）溶液中で37℃４時間保温する。次に50mMトリス−塩
酸緩衝液（PH7.4）−28mMクエン酸ナトリウム−0.1M塩
化ナトリウム溶液で平衡化したセファロースCL−6Bのカ
ラム（直径2.6cm,長さ90cm）に充てんし、上記の溶液で
展開した。分子量マーカーと抗D,抗Ｅ抗血清を用いたオ
クテロニー法により、Ｄダイマー（DD）分画とE,（Ｅ）
分画を同定、分離した。A280nm＝2.0のＤダイマー10ml
を得た。このようにして調製したＤダイマーは免疫原と
して、また抗Ｄダイマーモノクローナル抗体産生性ハイ
ブリドーマを選別するためのエンザイムイムノアッセイ
（ELISA）用抗原として使用する。

製造例２（ａ）免疫化した脾臓細胞の調製：上記のＤダイマー免疫原溶液（A280nm＝2.0）を等量の
フロインド氏完全アジュバントと乳化するまで混合し、
その混合液100μをマウス腹腔内に投与することによ
り免疫を行なった（第１回免疫）。30日経過後、該マウ
スに上記の同様の方法でマウス腹腔内に投与した（第２
回免疫）。第２回免疫から21日経過後、Ｄダイマー免疫
原溶液（A280nm＝2.0）を等量の生理食塩水で希釈し、
その希釈液100μを、該マウスの静脈内に投与した
（最終免疫）。最終免疫から３日経過後、脾臓細胞をマ
ウスから取り出し、細胞融合に使用した。

（ｂ）細胞融合：無菌的に摘出した上記の脾臓を、10〜15％ウシ胎児血清
を含むDME培地5mlを入れたシャーレに入れる。次に、脾
臓を10〜15％ウシ胎児血清を含むDME培地約15mlで還流
して脾細胞を流出させた後、この脾細胞懸濁液をナイロ
ンメッシュに通す。この脾細胞を50ml遠心チューブに集
めて500×g,10分間遠心する。こうして得たペレットに
３〜5mlのヘモライジング溶液（155mM NHaCl,10mM KHCO
₃,1mM Na₂EDTA pH7.0）を加え、懸濁させる。０℃で５
〜10分間放置すると懸濁液中の赤血球は破壊される。10
〜20mlの10〜15％ウシ胎児血清を含むDME培地を加えて
から遠心分離する。このようにして得た細胞ペレットを
DME培地で遠心法によって洗浄し、生きている脾細胞数
を測定する。

一方、予め培養しておいたマウス骨髄腫細胞（ミエロー
マ細胞）SP2/0−Ag14約２×10⁷個に１×10⁸個の上記脾
細胞を加え、EME培地中でよく混合し、遠心分離を行な
った（500×g,10分間）。その上清を吸引し、ペレット
をよく解きほぐし、38℃に保温しておいて40％ポリエチ
レングリコール4000溶液0.5mlを滴下し、遠心チューブ
を手で、１分間穏やかに回転することによってポリエチ
レングリコール溶液と細胞ペレットを混合させた。次
に、38℃に保温しておいたDME培地を、30秒間に1ml加え
てチューブを穏やかに回転させる。この操作を10回繰り
返した後、20〜30mlの10〜15％ウシ胎児血清を含むDME
培地を加えて、遠心分離（500×g,10分間）を行なっ
た、上清を除去した後、細胞ペレットを10〜15％ウシ胎
児血清を含むHAT培地（DME培地にアミノプテリン４×10
^-7M,チミジン1.6×10^-5M,ヒポキサンチン１×10^-4Mにな
るように添加したもの）で、遠心法によって２回洗浄
後、40mlの上記HAT培地に懸濁する。この細胞懸濁液を9
6ウエル細胞培養プレートの各ウエルに200μずつ分注
し、37℃,5％炭酸ガスを含む炭酸ガス培養器で培養を開
始した。培養中、２〜３日間隔で各ウエルの培地を約10
0μ除き、新たに上記のHAT培地を100μ加えること
によりHAT培地中で増殖するハイブリドーマを選択し
た。８日目頃から10〜15％ウシ胎児血清を含むHT培地
（DME培地にチミジン1.6×10^-5M,ヒポキサンチン１×10
^-4Mになるように添加したもの）に交換し、ハイブリド
ーマの増殖を観察するとともに、約10日目に、下述のEL
ISA法により、抗ＤモノマーかつＤダイマー抗体産生ハ
イブリドーマをスクリーニングした。

（ｃ）ハイブリドーマの樹立ハイブリドーマ培養上清中の産生抗体の有無はELISA法
により測定した。96ウエルELISA用プレート（Immulon I
I,日本ダイナテック株式会社）の各ウエルに、前述の精
製Ｄダイマー溶液（A280nm＝0.05,生理食塩水で希釈し
た。）を50μずつ分注し、25℃で２時間放置した。次
に0.05％Tween20−生理食塩水で３回洗浄した後、各ウ
エルに培養上清を50μ加え、25℃で１時間反応させ
た。

次にTween20−生理食塩水で200倍希釈したペルオキシタ
ーゼ結合抗マウス抗体（ダコ社，デンマーク）50μを
各ウエルに加えた。反応終了後、0.05％Tween20−生理
食塩水で各ウエルを３回洗浄し、0.5mMアミノアンチピ
リン,10mMフェノールおよび0.005％過酸化水素水を含む
溶液250μを各ウエルに加え、25℃で30分間反応させ
各ウエルの490nmにおける吸光度を測定した。その結
果、192ウエル中12ウエルに抗体産生が認められた。

上記のELISA法によって認められた培養上清中の抗Ｄダ
イマー抗体が、Ｄモノマー，フラグメントX,フラグメン
トY,フラグメントＥおよびフィブリノーゲンと反応する
か否かを上記の抗原を感作した96ウエルELISA用プレー
トを用いて上記と同様の方法で測定した。その結果Ｄダ
イマーと反応して12ウエルの培養上清中、１ウエルの培
養上清がＤモノマーと反応した。他の11ウエルの培養上
清はＤモノマー，フラグメントX,フラグメントＹおよび
フィブリノーゲンのすべてに反応した。

Ｄダイマー,Dモノマーに特異的に反応するウエル中のハ
イブリドーマ24ウエルプレートに移し、10〜15％ウシ胎
児血清を含むHT培地で４〜５日間培養した。その後、再
度ELISA法によって抗Ｄダイマー,Dモノマー抗体の産生
の有無を確認してから限界希釈法によりクローニングし
た。限界希釈法はHT培地でハイブリドーマが５個/mlと
なるように希釈した細胞浮遊液を、予め正常BALB/C系マ
ウスの腹腔細胞がウエルあたり２×10⁴個分注してある9
6ウエルプレートの各ウエルに100μずつ分注した。約
10日後、ELISA法によって抗Ｄダイマー,Dモノマー抗体
を産生するハイブリドーマのクローンをスクリーニング
した。その結果、20個の抗体産生クローンが得られた。
これらのクローンの中から、増殖のよい、抗体分泌能の
高い、しかも安定なクローンを選び、前述と同様の方法
で再クローン化を行い、抗Ｄダイマー,Dモノマー特異的
抗体産生ハイブリドーマDD/D−１を樹立した。

製造例３（モノクローナル抗体の製造）（インビトロ
法）マウスハイブリドーマDD/D−１を15％ウシ胎児血清を含
むDME培地で37℃,5％二酸化炭素雰囲気中72〜96時間培
養した。培養物を遠心分離後（10000×g,10分）後、上
清に固形の硫酸アンモニウムを50％最終濃度となるよう
に徐々に加えた。混合物を氷冷下30分間撹拌した後60分
間放置し、遠心分離（10000×g,10分）後、得られた沈
渣を少量の10mMのリン酸緩衝液（pH8.0）に溶解し、100
0倍量の10mMのリン酸緩衝液に対して透析した。これ
を、10mMリン酸緩衝液ですでに平衡化したDEAE−セルロ
ースのカラムに充填した。モノクローナル抗体の溶出は
10mMリン酸緩衝液（pH8.0）と0.2MNaClを含む10mMリン
酸緩衝液（pH8.0）の間で濃度勾配法により行なった。
溶出されたモノクローナル抗体を限外過法で濃縮し、
0.1Mリン酸緩衝液（pH8.0）に対して透析した。ウシ血
清1gGを除くために、透析物をやぎ抗ウシ血清1gG−セフ
ァロース4Bのカラムに通した。次に通過液を0.1Mリン酸
緩衝液（pH8.0）で平衡化したプロテインＡ−セファロ
ース4Bのカラムに充填した。カラムをpH3.5の緩衝液で
溶出して、精製した抗Ｄダイマー,Dモノマー特異抵抗,D
D/D−１を得た。

（イン・ビボ法）プリスタン（2,6,10,14−テトラメチルペンタデカン）
0.5mlを10〜12週齢のBALB/C系マウスの腹腔内に投与後1
4〜20日目のマウス腹腔内にインビトロで増殖させたハ
イブリドーマDD/D−１をマウス一匹あたり２×10⁶細胞
となるように接種した。

一匹のマウスから約10〜15mlの腹水が得られた。その抗
体濃度は、５〜10mg/mlであった。腹水中のモノクロー
ナル抗体の精製は、（但し、ヤギ抗ウシ血清1gG−セフ
ァロース4Bのカラムを通す操作を除く。）上記のインビ
トロ精製法と同様の方法で行なった。

製造例４（モノクローナル抗体の免疫グロブリンクラス
および特異性の同定）抗Ｄダイマー,Dモノマー特異モノクローナル抗体DD/D−
１の免疫ブロブリン・クラスをオクテロニー免疫拡散法
により行った。結果は表１にしめす通りである。

製造例５（モノクローナル抗体の認識部位の同定）モノクローナル抗体,DD/D−１の認識部位の同定はウェ
スターンブロッティング法によって行なった。実験操作
は主に、バイオ・ラッド社，アメリカZeta−Probe Blot
ting Membranes Instruction Mannualにより行なった。
実験操作の概要は次のようである。

フィブリノーゲンをCa²⁺あるいはEGTAの存在下でプラス
ミン処理を行ない、30分,60分,24時間反応後のフィブリ
ノーゲンの分解物を、DTT（ジチオスレイトール）存在
および非存在下でSDSポリアクリルアミド電気泳動を行
なった。上記の方法でブロッティング，エンザイムイム
ノアッセイを行ない、この結果とSDSポリアクリルアミ
ドゲルのクマジー・ブリリアント・ブルーＧ−250によ
る蛋白染色の結果から、モノクローナル抗体DD/D−１の
認識部位の同定を行なった。フィブリノーゲンおよび精
製Ｄダイマー，（DD）Ｅに対しても上記と同様の方法で
行なった。結果は表２に示すとおりである。

「実施例」以下、実施例により本発明を更に説明する。

実験例1:感作ポリスチレンラテックス粒子の調製平均粒径0.22μｍのポリスチレンラテックス粒子（日本
合成ゴム製）の10％懸濁液をトリス緩衝液（20mMトリス
塩酸緩衝液−50mM塩化ナトリウム）を用いて遠心分離法
（30000×g,30分間）によって２回洗浄した後、同緩衝
液で１％懸濁液になるよう希釈した。前記の製造例３に
よって得られた抗ヒトＤダイマー,Dモノマーモノクロー
ナル抗体DD/D−１を上記のトリス緩衝液に透析した後、
同緩衝液で0.6mg/mlの濃度にした。１％ポリスチレンラ
テックス粒子の懸濁液と上記抗ヒトＤダイマー,Dモノマ
ーモノクローナル（DD/D−１）溶液を1:1の容量比で混
合した後、25℃で３時間放置することにより感作ポリス
チレンラテックス粒子を調製した。ポリスチレンラテッ
クス粒子に吸着されなかった未反応のモノクローナル抗
体は遠心分離法（30000×g,30分間）によって除去し
た。感作ポリスチレンラテックスは遠心分離法（30000
×g,30分間）によって上記のトリス緩衝液で２回洗浄し
た後、0.1％中血清アルブミンおよび0.01％ツィーン20
を含むトリス緩衝液に懸濁し１％懸濁液とした。この１
％懸濁液をラテックス凝集用試薬とした。

実験例2:スライド凝集法による測定ラテックス凝集用試薬20μ，被検体40μをガラス製
スライド上で混和し２分間揺動した後凝集の有無を判定
した。結果は表３に示した。

実験例3:分光学的方法による測定 LPIAL−１（三菱化成社，日本）を用いて正常人、DIC患
者の同一人由来の血漿および血清検体中のＤダイマーも
しくはＤダイマーの立体構造を保持する分画の量を測定
し、血漿検体および血清検体中のＤダイマー等の測定値
の相関を調べた。スタンダードはDDEを使用した。

検体（血清あるいは血漿）50μを含む反応容器に１％
ラテックス50μ，トリス緩衝液（pH8.0）200μを注
入後、１分間の吸光度変化を700nmで測定し、その吸光
度変化の測定値から検体中のDDEを定量した。結果は表
４、第１図にしめした。相関係数ｒ＝0.9944という非常
に良好な相関をしめした。なお、第１図においてＮ＝3
3,回帰式ｙ＝−33.5＋0.9473x 「発明の効果」以上から明らかな如く、本発明によればフィブリノーゲ
ン,X分画およびＹ分画を含む検体においても前記のフィ
ブリノーゲン,X分画,Y分画の含量に関係なく検体FDP中
のＤダイマー又はＤダイマーの立体構造を保持する分画
を正確且つ簡便に定量測定することが可能となった。

【図面の簡単な説明】

第１図は血漿中Ｄダイマー等の濃度と血清中Ｄダイマー
等の濃度との相関を示すグラフ図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献特開昭59−183696（ＪＰ，Ａ) ＣｈｅｍｉｃａｌＡｂｓｔｒａｃｔｓ，99（15），（10ｔｈＯｃｔ. 1983），Ｐ．321−322 ＴｈｒｏｍｂＨａｅｍａｓｔａｓｉｓ，50（２），（1983），Ｐ．591−594 ＴｈｒｏｍｂＲｅｓ．，31（６）, （1983），Ｐ．767−778

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】モノクローナル抗体を用いてFDPを測定す
る方法において、ヒトフィブリノーゲンのプラスミン分
解物中のＤモノマーおよびヒトフィブリンのプラスミン
分解物中Ｄダイマー又はＤモノマーおよびＤダイマーの
立体構造を保持する分画と特異的に反応するがフィブリ
ノーゲン、Ｘ分画、Ｙ分画および_earlyDとは反応しない
性質を有する１種類の抗Ｄダイマー・Ｄモノマーモノク
ローナル抗体を固定化したポリスチレンラテックス粒子
と検体とを接触させ、該モノクローナル抗体固定化粒子
と検体中のＤダイマー又はＤダイマーの立体構造を保持
する分画を選択的に凝集させ、該凝集物を目視あるいは
分光学的に測定し、検体中のＤダイマー又はＤダイマー
の立体構造をもつ分画を半定量あるいは定量的に検出す
ることを特徴とするFDPの測定方法。
【請求項２】上記のモノクローナル抗体が抗原決定基を
１つだけもつＤモノマーもしくはＤモノマー立体構造を
もつ分画とは凝集することなく抗原抗体反応し、抗原決
定基を２つもつＤダイマーもしくはＤダイマーの立体構
造をもつ分画と選択的に凝集を生じる抗原抗体反応をす
るモノクローナル抗体であることを特徴とする特許請求
の範囲第１項記載の測定方法。
【請求項３】前記凝集物の生成速度を分光学的に測定
し、前記検体中における前記ＤダイマーもしくはＤダイ
マーの立体構造をもつ分画を定量的に検出することを特
徴とする特許請求の範囲第１項又は第２項記載の測定方
法。