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ES2960803T3 - Métodos y composiciones para la modificación de ADN diana dirigida por RNA y para la modulación de la transcripción dirigida por RNA - Google Patents

Métodos y composiciones para la modificación de ADN diana dirigida por RNA y para la modulación de la transcripción dirigida por RNA Download PDF

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ES2960803T3 ES19157590T ES19157590T ES2960803T3 ES 2960803 T3 ES2960803 T3 ES 2960803T3 ES 19157590 T ES19157590 T ES 19157590T ES 19157590 T ES19157590 T ES 19157590T ES 2960803 T3 ES2960803 T3 ES 2960803T3
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rna
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ES19157590T
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English (en)
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Emmanuelle Charpentier
Martin Jinek
Cate James Harrison Doudna
Wendell Lim
Lei Qi
Krzysztof Chylinski
Jennifer A Doudna
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Universitaet Wien
University of California
Original Assignee
Universitaet Wien
University of California
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Abstract

La presente divulgación proporciona un ARN dirigido a ADN que comprende una secuencia dirigida y, junto con un polipéptido modificador, proporciona una modificación específica de sitio de un ADN objetivo y/o un polipéptido asociado con el ADN objetivo. La presente divulgación proporciona además polipéptidos modificadores específicos de sitio. La presente divulgación proporciona además métodos de modificación específica de sitio de un ADN diana y/o un polipéptido asociado con el ADN diana. La presente divulgación proporciona métodos para modular la transcripción de un ácido nucleico diana en una célula diana, que generalmente implica poner en contacto el ácido nucleico diana. con un polipéptido Cas9 enzimáticamente inactivo y un ARN dirigido al ADN. También se proporcionan kits y composiciones para llevar a cabo los métodos. La presente divulgación proporciona células genéticamente modificadas que producen Cas9; y organismos multicelulares no humanos transgénicos Cas9. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Métodos y composiciones para la modificación de ADN diana dirigida por RNA y para la modulación de la transcripción dirigida por RNA
Antecedentes
Aproximadamente el 60 % de las bacterias y el 90 % de las arqueas poseen sistemas CRISPR (grupos de repeticiones palindrómicas cortas en intervalos regulares)/sistema asociado a CRISPR (Cas) para conferir resistencia a elementos de ADN extraños. El sistema CRISPR de tipo II deStreptococcus pyogenesimplica solamente un único gen que codifica la proteína Cas9 y dos ARN, un ARN de CRISPR maduro (ARNcr) y un ARN de acción trans parcialmente complementario (ARNcrtra), que son necesarios y suficientes para el silenciamiento guiado por ARN de ADN extraños. Deltcheva(Nature471, 2011) se refiere a la maduración de ARN de CRSPR mediante ARN pequeño codificado en trans y RNasa III de factor hospedador.
En los últimos años, las enzimas nucleasa modificadas por ingeniería genética diseñadas para localizar específicamente secuencias de ADN específicas han atraído una atención considerable como herramientas potentes para la manipulación genética de células y organismos completos, lo que permite la deleción, el reemplazo y la reparación del gen localizado específicamente, así como la inserción de secuencias exógenas (transgenes) en el genoma. Han surgido dos tecnologías principales para modificar por ingeniería genética nucleasas de ADN específicas de sitio, ambas basadas en el constructo de enzimas endonucleasas quiméricas en las que un dominio de endonucleasa de ADN no específico de secuencia se fusiona con un dominio de unión a ADN modificado por ingeniería genética. Sin embargo, la localización específica de cada nuevo locus genómico requiere el diseño de una enzima nucleasa novedosa, lo que hace que estos enfoques tarden mucho y sean caros. Además, ambas tecnologías sufren una precisión limitada, lo que puede conducir a efectos inespecíficos impredecibles. El documento WO 2011/072246 se refiere la localización específica de genes con nucleasas de tipo activador de la transcripción.
La interrogación sistemática de genomas y la reprogramación genética de células implica la localización específica de conjuntos de genes para la expresión o represión. Actualmente, el enfoque más común para la localización específica de genes arbitrarios para la regulación es usar interferencia por ARN (ARNi). Este enfoque tiene limitaciones. Por ejemplo, el ARNi puede presentar efectos inespecíficos y toxicidad significativos.
Existe la necesidad en el campo de una tecnología que permita una localización específica precisa de la actividad nucleasa (u otras actividades proteicas) a diferentes ubicaciones dentro de un ADN diana de una manera que no requiera el diseño de una nueva proteína para cada nueva secuencia diana. Además, existe una necesidad en la técnica de métodos para controlar la expresión génica con efectos inespecíficos mínimos.
Resumen
Cualquier referencia a la modificación genética de las células no abarca la modificación de la línea germinal de seres humanos. Las composiciones de la invención no comprenden células germinales humanas, embriones humanos o células germinales embrionarias humanas. Los métodos de la invención no comprenden el uso de embriones humanos de células germinales embrionarias humanas.
La invención proporciona un método para guiar un polipéptido Cas9 a un ADN diana, comprendiendo el método poner en contacto el ADN diana en un organismo eucariota unicelular, una célula animal, una célula vegetal, una célula de un mamífero o una célula de un ser humano en donde la célula esin vitroo exvivo,con un complejo que comprende:
(a) un polipéptido Cas9 y
(b) un ARN de localización específica de ADN que comprende
(i) un segmento de localización específica de ADN que comprende una secuencia de nucleótidos que es complementaria a una secuencia en el ADN diana, y
(ii) un segmento de unión a proteínas que interactúa con dicho polipéptido Cas9,
en donde el segmento de unión a proteínas comprende dos tramos complementarios de nucleótidos que se hibridan para formar un dúplex de ARN bicatenario (ARNbc) y en donde dicho método no es un proceso para modificar la identidad genética de la línea germinal de seres humanos.
La invención proporciona una composición que comprende:
(a) un polipéptido Cas9, o un polinucleótido que codifica dicho polipéptido Cas9, y
(b) un ARN de localización específica de ADN que comprende
(i) un segmento de localización específica de ADN que comprende una secuencia de nucleótidos que es complementaria a una secuencia en un ADN diana, y
(ii) un segmento de unión a proteínas que interactúa con dicho polipéptido Cas9, en donde el segmento de unión a proteínas comprende dos tramos complementarios de nucleótidos que se hibridan para formar un dúplex de ARN bicatenario (ARNbc),
en donde un dominio de transducción de proteínas se une covalentemente (A) al extremo amino o (B) al extremo carboxilo del polipéptido Cas9, en donde el dominio de transducción de proteínas facilita el recorrido del polipéptido Cas9 desde el citosol hasta el interior de un orgánulo.
La invención proporciona el uso de un ARN de localización específica de ADN para guiar un polipéptido Cas9 a un ADN diana,
en donde el ARN de localización específica de ADN comprende
(i) un segmento de localización específica de ADN que comprende una secuencia de nucleótidos que es complementaria a una secuencia en el ADN diana, y
(ii) un segmento de unión a proteínas que interactúa con dicho polipéptido Cas9, en donde el segmento de unión a proteínas comprende dos tramos complementarios de nucleótidos que se hibridan para formar un dúplex de ARN bicatenario (ARNbc)
en donde:
dicho uso es en un organismo eucariota unicelular, una célula animal, una célula vegetal, una célula de un mamífero o una célula de un ser humano, que esin vitroo exvivo,y en donde dicho uso no es en un proceso para modificar la identidad genética de la línea germinal de seres humanos.
La invención proporciona el uso de un ARN activador en un ARN de localización específica de ADN para guiar un polipéptido Cas9 a un ADN diana,
en donde el ARN de localización específica de ADN comprende
(i) un segmento de localización específica de ADN que comprende una secuencia de nucleótidos que es complementaria a una secuencia en el ADN diana, y
(ii) un segmento de unión a proteínas que interactúa con dicho polipéptido Cas9, en donde el segmento de unión a proteínas comprende dos tramos complementarios de nucleótidos que se hibridan para formar un dúplex de ARN bicatenario (ARNbc)
en donde el ARN activador forma una mitad del dúplex de ARNbc del segmento de unión a proteínas del ARN de localización específica de ADN, y un ARN localizador específico forma la otra mitad del dúplex de ARNbc del segmento de unión a proteínas del ARN de localización específica de ADN
y en donde:
dicho uso es en un organismo eucariota unicelular, una célula animal, una célula vegetal, una célula de un mamífero o una célula de un ser humano, que esin vitroo exvivo,y en donde dicho uso no es en un proceso para modificar la identidad genética de la línea germinal de seres humanos.
La invención proporciona un ARN de localización específica de ADN, o un polinucleótido que codifica dicho ARN de localización específica de ADN, para su uso en un método de tratamiento de un paciente,
en donde, en el método, el ARN de localización específica de ADN forma un complejo con un polipéptido Cas9 y en donde el ARN de localización específica de ADN comprende
(i) un segmento de localización específica de ADN que comprende una secuencia de nucleótidos que es complementaria a una secuencia en un ADN diana, y
(ii) un segmento de unión a proteínas que interactúa con el polipéptido Cas9, en donde el segmento de unión a proteínas comprende dos tramos complementarios de nucleótidos que se hibridan para formar un dúplex de ARN bicatenario (ARNbc).
La invención proporciona un polipéptido Cas9, o un polinucleótido que codifica dicho polipéptido Cas9, para su uso en un método de tratamiento de un paciente,
en donde, en el método, el Cas9 forma un complejo con un ARN de localización específica de ADN
y en donde el ARN de localización específica de ADN comprende
(i) un segmento de localización específica de ADN que comprende una secuencia de nucleótidos que es complementaria a una secuencia en un ADN diana, y
(ii) un segmento de unión a proteínas que interactúa con el polipéptido Cas9, en donde el segmento de unión a proteínas comprende dos tramos complementarios de nucleótidos que se hibridan para formar un dúplex de ARN bicatenario (ARNbc).
La invención proporciona un ARN activador, o polinucleótido que codifica dicho ARN activador, para su uso en un método de tratamiento de un paciente,
en donde, en el método, el ARN activador forma una mitad de un dúplex de ARNbc de un segmento de unión a proteínas de un ARN de localización específica de ADN, y un ARN localizador específico forma la otra mitad del dúplex de ARNbc de un segmento de unión a proteínas de un ARN de localización específica de ADN,
en donde el ARN de localización específica de ADN comprende
(i) un segmento de localización específica de ADN que comprende una secuencia de nucleótidos que es complementaria a una secuencia en un ADN diana, y
(ii) un segmento de unión a proteínas que interactúa con un polipéptido Cas9, en donde el segmento de unión a proteínas comprende dos tramos complementarios de nucleótidos que se hibridan para formar un dúplex de ARN bicatenario (ARNbc)
y en donde, en el método, el ARN de localización específica de ADN forma un complejo con el polipéptido Cas9.
La presente descripción proporciona un ARN de localización específica de ADN para el uso que comprende una secuencia de localización específica y, junto con un polipéptido modificador, proporciona una modificación específica de sitio de un ADN diana y/o un polipéptido asociado al ADN diana. La presente descripción proporciona además polipéptidos modificadores específicos de sitio para su uso. La presente descripción proporciona además métodos de modificación específica de sitio de un ADN diana. También se proporcionan composiciones para realizar los métodos.
Las características de la presente descripción incluyen un ARN de localización específica de ADN que comprende: (i) un primer segmento que comprende una secuencia de nucleótidos que es complementaria a una secuencia en un ADN diana; y (ii) un segundo segmento que interactúa con un polipéptido modificador dirigido al sitio. En algunos casos, el primer segmento comprende 8 nucleótidos que tienen el 100 % de complementariedad con una secuencia en el ADN diana. En algunos casos, el segundo segmento comprende una secuencia de nucleótidos con al menos el 60 % de identidad sobre un tramo de al menos 8 nucleótidos contiguos con una cualquiera de las secuencias de nucleótidos expuestas en las Id. de sec. n.° 431-682 (p. ej., 431-562). En algunos casos, el segundo segmento comprende una secuencia de nucleótidos con al menos el 60 % de identidad sobre un tramo de al menos 8 nucleótidos contiguos con una cualquiera de las secuencias de nucleótidos expuestas en las Id. de sec. n.° 563-682. En algunos casos, el polipéptido modificador dirigido al sitio comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente el 75 % de identidad de secuencia de aminoácidos con los aminoácidos 7-166 o 731-1003 de la secuencia de aminoácidos de Cas9/Csn1 representada en la Figura 3, o con las porciones correspondientes en cualquiera de las secuencias de aminoácidos expuestas como Id. de sec. n.° 1-256 y 795-1346.
Las características de la presente descripción incluyen un polinucleótido de ADN que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica el ARN de localización específica de ADN. En algunos casos, un vector de expresión recombinante comprende el polinucleótido de ADN. En algunos casos, la secuencia de nucleótidos que codifica el ARN de localización específica de ADN está unida operativamente a un promotor. En algunos casos, el promotor es un promotor inducible. En algunos casos, la secuencia de nucleótidos que codifica el ARN de localización específica de ADN comprende además un sitio de clonación múltiple.
Las características de la presente descripción incluyen un vector de expresión recombinante que comprende: (i) una secuencia de nucleótidos que codifica un ARN de localización específica de ADN, en donde el ARN de localización específica de ADN comprende: (a) un primer segmento que comprende una secuencia de nucleótidos que es complementaria a una secuencia en un ADN diana; y (b) un segundo segmento que interactúa con un polipéptido modificador dirigido al sitio; y (ii) una secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido modificador dirigido al sitio que comprende: (a) una porción de unión a ARN que interactúa con el ARN de localización específica de ADN; y (b) una porción de actividad que presenta actividad enzimática dirigida al sitio, en donde el sitio de actividad enzimática está determinado por el ARN de localización específica de ADN.
Las características de la presente descripción incluyen un vector de expresión recombinante que comprende: (i) una secuencia de nucleótidos que codifica un ARN de localización específica de ADN, en donde el ARN de localización específica de ADN comprende: (a) un primer segmento que comprende una secuencia de nucleótidos que es complementaria a una secuencia en un ADN diana; y (b) un segundo segmento que interactúa con un polipéptido modificador dirigido al sitio; y (ii) una secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido modificador dirigido al sitio, donde el polipéptido modificador dirigido al sitio comprende: (a) una porción de unión a ARN que interactúa con el ARN de localización específica de ADN; y (b) una porción de actividad que modula la transcripción dentro del ADN diana, en donde el sitio de transcripción modulada dentro del ADN diana está determinado por el ARN de localización específica de ADN.
Las características de la presente descripción incluyen un polipéptido modificador dirigido al sitio variante que comprende: (i) una porción de unión a ARN que interactúa con un a Rn de localización específica de ADN, en donde el ARN de localización específica de ADN comprende una secuencia de nucleótidos que es complementaria a una secuencia en un ADN diana; y (ii) una porción de actividad que presenta actividad enzimática dirigida al sitio reducida, en donde el sitio de actividad enzimática está determinado por el ARN de localización específica de ADN. En algunos casos, el polipéptido modificador dirigido al sitio variante comprende una mutación H840A de la secuencia de S.pyogenesId. de sec. n.° 8 o la mutación correspondiente en cualquiera de las secuencias de aminoácidos expuestas como Id. de sec. n.° 1-256 y 795-1346. En algunos casos, el polipéptido modificador dirigido al sitio variante comprende una mutación D10A de la secuencia de S.pyogenesId. de sec. n.° 8 o la mutación correspondiente en cualquiera de las secuencias de aminoácidos expuestas como Id. de sec. n.° 1-256 y 795-1346. En algunos casos, el polipéptido modificador dirigido al sitio variante comprende ambas: (i) una mutación D10A de la secuencia de S.pyogenesId. de sec. n.° 8 o la mutación correspondiente en cualquiera de las secuencias de aminoácidos expuestas como Id. de sec. n.° 1-256 y 795-1346; y (ii) una mutación H840A de la secuencia de S.pyogenesId. de sec. n.° 8 o la mutación correspondiente en cualquiera de las secuencias de aminoácidos expuestas como Id. de sec. n.° 1-256 y 795-1346.
Las características de la presente descripción incluyen una composición que comprende: (i) un ARN de localización específica de ADN, comprendiendo el ARN de localización específica de a DN: (a) un primer segmento que comprende una secuencia de nucleótidos que es complementaria a una secuencia en un ADN diana; y (b) un segundo segmento que interactúa con un polipéptido modificador dirigido al sitio; y (ii) el polipéptido modificador dirigido al sitio, o un polinucleótido que codifica el mismo, comprendiendo el polipéptido modificador dirigido al sitio: (a) una porción de unión a ARN que interactúa con el ARN de localización específica de ADN; y (b) una porción de actividad que presenta actividad enzimática dirigida al sitio, en donde el sitio de actividad enzimática está determinado por el ARN de localización específica de ADN y en donde un dominio de transducción de proteínas se une covalentemente (A) al extremo amino o (B) al extremo carboxilo del polipéptido Cas9, en donde el dominio de transducción de proteínas facilita el recorrido del polipéptido Cas9 desde el citosol hasta el interior de un orgánulo. En algunos casos, el primer segmento del ARN de localización específica de ADN comprende 8 nucleótidos que tienen al menos el 100 % de complementariedad con una secuencia en el ADN diana. En algunos casos, el segundo segmento del ARN de localización específica de ADN comprende una secuencia de nucleótidos con al menos el 60 % de identidad sobre un tramo de al menos 8 nucleótidos contiguos con una cualquiera de las secuencias de nucleótidos expuestas en las Id. de sec. n.° 431-682 (p. ej., Id. de sec. n.° 563-682). En algunos casos, el segundo segmento del ARN de localización específica de ADN comprende una secuencia de nucleótidos con al menos el 60 % de identidad sobre un tramo de al menos 8 nucleótidos contiguos con una cualquiera de las secuencias de nucleótidos expuestas en las Id. de sec. n.° 431-562. En algunos casos, el polipéptido modificador dirigido al sitio comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente el 75 % de identidad de secuencia de aminoácidos con los aminoácidos 7-166 o 731-1003 de la secuencia de aminoácidos de Cas9/Csn1 representada en la Figura 3, o con las porciones correspondientes en cualquiera de las secuencias de aminoácidos expuestas como Id. de sec. n.° 1-256 y 795-1346. En algunos casos, la actividad enzimática modifica el ADN diana. En algunos casos, la actividad enzimática es la actividad nucleasa. En algunos casos, el ARN de localización específica de ADN es un ARN de localización específica de ADN de molécula doble y la composición comprende tanto un ARN localizador específico como un ARN activador, cuyos segmentos formadores de dúplex son complementarios y se hibridan para formar el segundo segmento del ARN de localización específica de ADN. En algunos casos, el segmento formador de dúplex del ARN activador comprende una secuencia de nucleótidos con al menos el 60 % de identidad sobre un tramo de al menos 8 nucleótidos contiguos con una cualquiera de las secuencias de nucleótidos expuestas en las Id. de sec. n.° 431-682.
Las características de la presente descripción incluyen una composición que comprende: (i) un ARN de localización específica de ADN de la presente descripción; y (ii) un tampón para estabilizar ácidos nucleicos. Las características de la presente descripción incluyen una composición que comprende: (i) un polipéptido modificador dirigido al sitio de la presente descripción, o un polinucleótido que codifica el mismo; y (ii) un tampón para estabilizar ácidos nucleicos y/o proteínas. Las características de la presente descripción incluyen una composición que comprende: (i) un polipéptido modificador dirigido al sitio, o un polinucleótido que codifica el mismo; y (ii) un tampón para estabilizar ácidos nucleicos y/o proteínas.
Las características de la presente descripción incluyen un método de modificación específica de sitio de un ADN diana en un organismo eucariota unicelular, una célula animal, una célula vegetal, una célula de un mamífero o una célula de un ser humano, en donde la célula esin vitroo exvivo,comprendiendo el método: poner en contacto el ADN diana con: (i) un ARN de localización específica de ADN, en donde el ARN de localización específica de ADN comprende: (a) un primer segmento que comprende una secuencia de nucleótidos que es complementaria a una secuencia en el ADN diana; y (b) un segundo segmento que interactúa con un polipéptido modificador dirigido al sitio; y (ii) un polipéptido modificador dirigido al sitio, o un polinucleótido que codifica el mismo, en donde el polipéptido modificador dirigido al sitio comprende: (a) una porción de unión a ARN que interactúa con el ARN de localización específica de ADN; y (b) una porción de actividad que presenta actividad enzimática dirigida al sitio. En algunos casos, el ADN diana es extracromosómico. En algunos casos, el ADN diana comprende una secuencia de PAM de la cadena complementaria que es 5-CCY-3', en donde Y es cualquier nucleótido de ADN e Y está inmediatamente en 5' de la secuencia diana de la cadena complementaria del ADN diana. En algunos casos, el ADN diana es parte de un cromosoma en una célula. En algunos casos, la célula se selecciona del grupo que consiste en: un organismo unicelular eucariota, una célula somática, una célula germinal, una célula madre, una célula vegetal, una célula de alga, una célula animal, una célula de invertebrado, una célula de vertebrado, una célula de pescado, una célula de rana, una célula de ave, una célula de mamífero, una célula de cerdo, una célula de vaca, una célula de cabra, una célula de oveja, una célula de roedor, una célula de rata, una célula de ratón, una célula de primate no humano y una célula humana. En algunos casos, el ARN de localización específica de ADN comprende una secuencia de nucleótidos con al menos el 60 % de identidad sobre un tramo de al menos 8 nucleótidos contiguos con una cualquiera de las secuencias de nucleótidos expuestas en las Id. de sec. n.° 431-682 (p. ej., Id. de sec. n.° 563-682). En algunos casos, el ARN de localización específica de ADN comprende una secuencia de nucleótidos con al menos el 60 % de identidad sobre un tramo de al menos 8 nucleótidos contiguos con una cualquiera de las secuencias de nucleótidos expuestas en las Id. de sec. n.° 431-562. En algunos casos, el polipéptido modificador de ADN comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente el 75 % de identidad de secuencia de aminoácidos con los aminoácidos 7-166 o 731-1003 de la secuencia de aminoácidos de Cas9/Csn1 representada en la Figura 3, o con las porciones correspondientes en cualquiera de las secuencias de aminoácidos expuestas como Id. de sec. n.° 1-256 y 795-1346. En algunos casos, la actividad enzimática modifica el ADN diana. En algunos casos, la actividad enzimática modificadora de ADN es la actividad nucleasa. En algunos casos, la actividad nucleasa introduce una rotura bicatenaria en el ADN diana. En algunos casos, el contacto se produce en condiciones que son permisivas para la unión de extremos no homólogos o la reparación dirigida por homología. En algunos casos, el método comprende además poner en contacto el ADN diana con un polinucleótido donante, en donde el polinucleótido donante, una porción del polinucleótido donante, una copia del polinucleótido donante o una porción de una copia del polinucleótido donante se integra en el ADN diana. En algunos casos, el método no comprende poner en contacto la célula con un polinucleótido donante, en donde el ADN diana se modifica de manera que los nucleótidos dentro del ADN diana se delecionan. En algunos casos, la actividad enzimática modifica un polipéptido diana asociado al ADN diana. En algunos casos, el complejo comprende además un ARN activador. En algunos casos, el ARN activador comprende una secuencia de nucleótidos con al menos el 60 % de identidad sobre un tramo de al menos 8 nucleótidos contiguos con una cualquiera de las secuencias de nucleótidos expuestas en las Id. de sec. n.° 431-682.
Las características de la presente descripción incluyen un método para promover la escisión específica de sitio y la modificación de un ADN diana en un organismo eucariota unicelular, una célula animal, una célula vegetal, una célula de un mamífero o una célula de un ser humano, en donde la célula esin vitroo ex vivo, comprendiendo el método introducir en la célula: (i) un ARN de localización específica de ADN, o un polinucleótido de ADN que codifica el mismo, en donde el ARN de localización específica de ADN comprende: (a) un primer segmento que comprende una secuencia de nucleótidos que es complementaria a una secuencia en el ADN diana; y (b) un segundo segmento que interactúa con un polipéptido modificador dirigido al sitio; y (ii) un polipéptido modificador dirigido al sitio, o un polinucleótido que codifica el mismo, en donde el polipéptido modificador dirigido al sitio comprende: (a) una porción de unión a ARN que interactúa con el ARN de localización específica de ADN; y (b) una porción de actividad que presenta actividad nucleasa que crea una rotura bicatenaria en el ADN diana; en donde el sitio de la rotura bicatenaria está determinado por el ARN de localización específica de ADN, el contacto se produce en condiciones que son permisivas para la unión de extremos no homólogos o la reparación dirigida por homología, y el ADN diana se escinde y se vuelve a unir para producir una secuencia de ADN modificada. En algunos casos, el método comprende además poner en contacto el ADN diana con un polinucleótido donante, en donde el polinucleótido donante, una porción del polinucleótido donante, una copia del polinucleótido donante o una porción de una copia del polinucleótido donante se integra en el ADN diana. En algunos casos, el método no comprende poner en contacto la célula con un polinucleótido donante, en donde el ADN diana se modifica de manera que los nucleótidos dentro del ADN diana se delecionan. En algunos casos, la célula se selecciona del grupo que consiste en: un organismo unicelular eucariota, una célula somática, una célula germinal, una célula madre, una célula vegetal, una célula de alga, una célula animal, una célula de invertebrado, una célula de vertebrado, una célula de pescado, una célula de rana, una célula de ave, una célula de mamífero, una célula de cerdo, una célula de vaca, una célula de cabra, una célula de oveja, una célula de roedor, una célula de rata, una célula de ratón, una célula de primate no humano y una célula humana. En algunos casos, la célula es invitro.En algunos casos, la célula esin vivo.
Breve descripción de los dibujos
LasFiguras 1A-Bproporcionan un dibujo esquemático de dos ARN de localización específica de ADN en cuestión ilustrativos, cada uno asociado a un polipéptido modificador dirigido al sitio y con un ADN diana.
LaFigura 2representa la edición de ADN diana a través de roturas de ADN bicatenario introducidas usando un polipéptido modificador dirigido al sitio Cas9/Csn1 y un ARN de localización específica de ADN.
LasFiguras 3A-Brepresentan la secuencia de aminoácidos de una proteína Cas9/Csn1 deStreptococcus pyogenes(Id. de sec. n.° 8). Cas9 tiene dominios homólogos a ambas endonucleasas HNH y RuvC. (A) Los Motivos 1-4 tienen una línea superior (B) Los Dominios 1 y 2 tienen una línea superior.
LasFiguras 4A-Brepresentan el porcentaje de identidad entre las proteínas Cas9/Csn1 de múltiples especies. (A) Identidad de secuencia con respecto aStreptococcus pyogenes.Por ejemplo, el Dominio 1 es los aminoácidos 7-166 y el Dominio 2 es los aminoácidos 731-1003 de Cas9/Csn1 deStreptococcus pyogenescomo se representa en la Figura 3B. (B) Identidad de secuencia con respecto aNeisseria meningitidis.Por ejemplo, el Dominio 1 es los aminoácidos 13 139 y el Dominio 2 es los aminoácidos 475-750 de Cas9/Csn1 deNeisseria meningitidis(Id. de sec. n.° 79).
LaFigura 5representa una alineación de secuencia múltiple de motivos 1-4 de proteínas Cas9/Csn1 de diversas especies diversas seleccionadas de la tabla filogenética de la Figura 32 (véanse la Figura 32, la Figura 3A y la Tabla 1)(Streptococcus pyogenes(Id. de sec. n.° 8),Legionella pneumophila(Id. de sec. n.° 17),Gamma proteobacterium(Id. de sec. n.° 107),Listeria innocua(Id. de sec. n.° 3),Lactobacillus gasseri(Id. de sec. n.° 152),Eubacterium rectale(Id. de sec. n.° 99),Staphylococcus lugdunensis(Id. de sec. n.° 185),Mycoplasma synoviae(Id. de sec. n.° 22),Mycoplasma mobile(Id. de sec. n.° 16),Wolinella succinogenes(Id. de sec. n.° 10),Flavobacterium columnare(Id. de sec. n.° 235),Fibrobacter succinogenes(Id. de sec. n.° 121),Bacteroides fragilis(Id. de sec. n.° 21),Acidothermus cellulolyticus(Id. de sec. n.° 42) yBfdobacterium dentium(Id. de sec. n.° 131).
LasFiguras 6A-Bproporcionan alineaciones de secuencias de ARNcrtra de origen natural (“ARN activador” ) de diversas especies(L. innocua(Id. de sec. n.° 268); S.pyogenes(Id. de sec. n.° 267); S.mutans(Id. de sec. n.° 269); S.thermophilus1(Id. de sec. n.° 270);M. mobile(Id. de sec. n.° 274);N. meningitides(Id. de sec. n.° 272);P. multocida(Id. de sec. n.° 273); S.thermophilus2(Id. de sec. n.° 271); y S.pyogenes(Id. de sec. n.° 267). (A) alineación de secuencia múltiple de ortólogos de ARNcrtra seleccionados (AlignX, paquete de VectorNTI, Invitrogen) asociados a loci de CRISPR/Cas de arquitectura similar y secuencias de Cas9/Csn1 muy similares. Las cajas de color negro representan nucleótidos compartidos (B) alineación de secuencia múltiple de ortólogos de ARNcrtra seleccionados (AlignX, paquete de VectorNTI, Invitrogen) asociado a loci de CRISPR/Cas de arquitectura diferente y secuencias de Cas9/Csn1 no relacionadas estrechamente. Nótese la similitud de secuencia de los ortólogos de ARNcrtra deN. meningitidisyP. multocida. Las cajas de color negro representan nucleótidos compartidos. Para consultar más secuencias de ARN-activador ilustrativas, véanse las Id. de sec. n.° 431-562.
LasFiguras 7A-Bproporcionan alineaciones de segmentos formadores de dúplex de origen natural de secuencias de ARNcr (“ARN localizador específico” ) de diversas especies(L. innocua(Id. de sec. n.° //); S.pyogenes(Id. de sec. n.° //); S.mutans(Id. de sec. n.° //); S.thermophilus1(Id. de sec. n.° //);C. jejuni(Id. de sec. n.° //); S.pyogenes(Id. de sec. n.° //);F. novicida(Id. de sec. n.° //);M. mobile(Id. de sec. n.° //);N. meningitides(Id. de sec. n.° //);P. multocida(Id. de sec. n.° //); y S.thermophilus2(Id. de sec. n.° //). (A) múltiples alineaciones de secuencia del segmento formador de dúplex ilustrativo de secuencias de ARN localizador específico (AlignX, paquete de VectorNTI, Invitrogen) asociados a los loci de arquitectura similar y secuencias de Cas9/Csn1 muy similares. (A) múltiples alineaciones de secuencia del segmento formador de dúplex ilustrativo de secuencias de ARN localizador específico (AlignX, paquete de VectorNTI, Invitrogen) asociados a los loci de arquitectura diferente y secuencias de Cas9 diversas. Las cajas de color negro representan nucleótidos compartidos. Para consultar más secuencias de ARN localizador específico de segmentos formadores de dúplex ilustrativas, véanse las Id. de sec. n.° 563-679.
LaFigura 8proporciona un esquema de hibridación para segmentos formadores de dúplex de origen natural del ARNcr (“ARN localizados específico” ) con el segmento formador de dúplex del ortólogo de ARNcrtra correspondiente (“ARN activador” ). Secuencia superior, ARN localizador específico; secuencia inferior, segmento formador de dúplex del ARN activador correspondiente. Los loci de CRISPR pertenecen al sistema CRISPR/Cas de Tipo II (Nmeni/CASS4). La Nomenclatura es según la base de datos de CRISPR (CRISPR DB). S.pyogenes(Id. de sec. n.° // y //); S.mutans(Id. de sec. n.° // y //); S.thermophilus1(Id. de sec. n.° // y //); S.thermophilus2(Id. de sec. n.° // y //);L. innocua(Id. de sec. n.° // y //);T. denticola(Id. de sec. n.° // y //);N. meningitides(Id. de sec. n.° // y //); S.gordonii(Id. de sec. n.° // y //);B. bifídum(Id. de sec. n.° // y //);L. salivarius(Id. de sec. n.° // y //);F. tularensis(Id. de sec. n.° // y //); yL. pneumophila(Id. de sec. n.° // y //). Nótese que algunas especies contienen cada uno de los dos loci de CRISPR de Tipo II. Para consultar más secuencias de ARN-activador ilustrativas, véanse las Id. de sec. n.° 431-562. Para consultar más secuencias de ARN localizador específico de segmentos formadores de dúplex ilustrativas, véanse las Id. de sec. n.° 563-679.
LaFigura 9representa secuencias de ARNcrtra (ARN activador) y ARNcr (ARN localizador específico) de ejemplo de dos especies. Existe un grado de intercambiabilidad; por ejemplo, la proteína Cas9/Csn1 de S.pyogeneses funcional con ARNcrtra y ARNcr derivados deL. innocua.(|) indica un par de bases de Watson-Crick canónicas mientras (•) indica un par de bases con oscilación de G-U. “ 20nt variables” o “ 20nt” representa el segmento de localización específica de ADN que es complementario a un ADN diana (esta región puede tener hasta aproximadamente 100nt de longitud). También se muestra el diseño de ARN de localización específica de ADN de una única molécula que incorpora características del ARN localizador específico y el a Rn activador. (Las secuencias de la proteína Cas9/Csn1 de una amplia diversidad de especies se representan en la Figura 3 y se exponen como Id. de sec. n.° 1-256 y 795-1346 )Streptococcus pyogenes:de arriba a abajo: (Id. de sec. n.° //, //, //); deListeria innocua:de arriba a abajo: (Id. de sec. n.° //, //, //). Las secuencias proporcionadas son ejemplos no limitativos y tienen por objeto ilustrar cómo los ARN de localización específica de ADN de molécula única y ARN de localización específica de ADN de dos moléculas pueden diseñarse basándose en secuencias existentes de forma natural de una amplia diversidad de especies. Se exponen diversos ejemplos de secuencias adecuadas de una amplia diversidad de especies se exponen de la siguiente manera (proteína Cas9: Id. de sec. n.° 1-259; ARNcrtra: Id. de sec. n.° 431-562, o los complementos de las mismas; ARNcr: Id. de sec. n.° 563-679, o los complementos de las mismas; y ARN de localización específica de ADN de molécula única de ejemplo: Id. de sec. n.° 680-682). LasFiguras 10A-Emuestran que Cas9 es una endonucleasa de ADN guiada por dos moléculas de ARN. Figura E (de arriba a abajo, Id. de sec. n.° 278-280 y //).
LasFiguras 11A-Bdemuestran que Cas9 usa dos dominios nucleasa para escindir las dos cadenas en el ADN diana. LasFiguras 12A-Eilustran que la escisión catalizada por Cas9 de ADN diana requiere un dominio de activación en el ARNcrtra y se rige por una secuencia semilla en el ARNcr. Figura 12C (de arriba a abajo, Id. de sec. n.° 278-280 y //); Figura 12D (de arriba a abajo, Id. de sec. n.° 281-290); y la Figura 12E (de arriba a abajo, Id. de sec. n.° 291-292, 283, 293-298). LasFiguras 13A-Cmuestran que se requiere un PAM para la escisión de la escisión de ADN diana por el complejo Cas9-ARNcrtra:ARNcr.
LasFiguras 14A-Cilustran que Cas9 puede programarse usando una única molécula de ARN modificada por ingeniería genética que combina las características de ARNcrtra y ARNcr. Quimera A (Id. de sec. n.° 299); Quimera B (Id. de sec. n.° 300).
LaFigura 15representa la vía inmunitaria de CRISPR/Cas mediada por ARN de tipo II.
LasFiguras 16A-Brepresentan la purificación de nucleasas de Cas9.
LasFiguras 17A-Cmuestran que Cas9 guiada por ARNcrtra:ARNcr dual escinde el plásmido protoespaciador y el ADN de oligonucleótido. La Figura 17B (de arriba a abajo, Id. de sec. n.° 301-303 y //); y la Figura 17C (de arriba a abajo, Id. de sec. n.° 304-306 y //).
LasFiguras 18A-Bmuestran que Cas9 es una endonucleasa dependiente de Mg2+ con actividad de exonucleasa 3'-5'. LasFiguras 19A-Cilustran que la escisión por Cas9 dirigida por ARNcrtra:ARNcr dual del ADN diana es específica de sitio. La Figura 19C (de arriba a abajo, Id. de sec. n.° 307-309, //, 337-339 y //).
LasFiguras 20A-Bmuestran que la escisión por Cas9 dirigida por ARNcrtra:ARNcr dual del ADN diana es rápida y eficiente. LasFiguras 21A-Bmuestran que los dominios similares a HNH y RuvC de la escisión directa por Cas9 de la cadena de ADN complementaria y no complementaria, respectivamente.
LaFigura 22demuestra que el ARNcrtra es necesario para el reconocimiento del ADN diana.
LasFiguras 23A-Bmuestran que una región mínima del ARNcrtra es capaz de guiar la escisión dirigida por ARNcrtra:ARNcr dual del ADN diana.
LasFiguras 24A-Ddemuestran que la escisión de ADN diana guiada por ARNcrtra:ARNcr dual por Cas9 puede ser específica de especie.
LasFiguras 25A-Cmuestran que una secuencia semilla en el ARNcr gobierna la escisión dirigida por ARNcrtra:ARNcr dual de ADN diana por Cas9. Figura 25A: sonda 1 de ADN diana (Id. de sec. n.° 310); ARNcr del espaciador 4 (1-42) (Id. de sec. n.° 311); ARNcrtra (15-89) (Id. de sec. n.° //). Figura 25<b>panel izquierdo (Id. de sec. n.° 310).
LasFiguras 26A-Cdemuestran que la secuencia de PAM es esencial para la escisión de ADN plasmídico protoespaciador mediante Cas9-ARNcrtra:ARNcr y para la interferencia de ADN plasmídico mediada por Cas9 en células bacterianas. Figura 26B (de arriba a abajo, Id. de sec. n.° 312-314); y Figura 26C (de arriba a abajo, Id. de sec. n.° 315-320).
LasFiguras 27A-Cmuestran que Cas9 guiada por un único ARN quimérico que imita ARNrARNc:ARNcr dual escinde el ADN protoespaciador. Figura 27C (de arriba a abajo, Id. de sec. n.° 321-324).
LasFiguras 28A-Drepresentan el diseñode novode ARN quiméricos que localizan específicamente la secuencia génica de la Proteína fluorescente verde (GFP). Figura 28B (de arriba a abajo, Id. de sec. n.° 325-326). Figura 28C: Secuencia diana de GFP1 (Id. de sec. n.° 327); Secuencia diana de GFP2 (Id. de sec. n.° 328); Secuencia diana de GFP3 (Id. de sec. n.° 329); Secuencia diana de GFP4 (Id. de sec. n.° 330); Secuencia diana de GFP5 (Id. de sec. n.° 331); ARN quimérico de GFP1 (Id. de sec. n.° 332); ARN quimérico de GFP2 (Id. de sec. n.° 333); ARN quimérico de GFP3 (Id. de sec. n.° 334); ARN quimérico de GFP4 (Id. de sec. n.° 335); ARN quimérico de GFP5 (Id. de sec. n.° 336).
LasFiguras 29A-Edemuestran que la coexpresión de Cas9 y ARN guía en células humanas genera roturas de ADN bicatenario en el locus diana. Figura 29C (de arriba a abajo, Id. de sec. n.° 425-428).
LasFiguras 30A-Bdemuestran que los lisados celulares contienen Cas9:ARNgu activo y respaldan la escisión de ADN específica de sitio.
LasFiguras 31A-Bdemuestran que la extensión 3' de los constructos de ARNgu potencia la mutagénesis mediada por NHEJ específica de sitio. Figura 31A (de arriba a abajo, Id. de sec. n.° 428-430).
LasFiguras 32A-Brepresentan un árbol filogenético de secuencias de Cas9 representativas de diversos organismos (A), así como arquitecturas de locus de Cas9 para los grupos principales del árbol (B).
LasFiguras 33A-Erepresentan la arquitectura de CRISPR-Cas de tipo II a partir de especies bacterianas seleccionadas. LasFiguras 34A-Brepresentan el coprocesamiento de ARNcrtra y pre-ARNcr en sistemas de CRISPR Cas de tipo II seleccionados. Figura 34A (de arriba a abajo, Id. de sec. n.° //,//,//,//,//,//,//,//); Figura 34B (de arriba a abajo, Id. de sec. n.° //,//,//,//).
LaFigura 35representa una alineación de secuencia de ortólogos de ARNcrtra que demuestran la diversidad de secuencias de ARNcrtra.
LasFiguras 36A-Frepresentan la expresión de ortólogos de ARNcrtra bacteriano y ARNcr revelados por secuenciación de ARN profundo.
LasFiguras 37A-Oenumeran todos los ortólogos de ARNcrtra y ARNcr maduros recuperados por secuenciación para las especies bacterianas estudiadas, incluyendo las coordenadas (región de interés) y las secuencias de ADNc (5' a 3') correspondientes.
LasFiguras 38 A-Bpresentan una tabla de especies bacterianas que contienen loci de CRISPR-Cas de tipo II caracterizados por la presencia del gen distintivocas9.Estas secuencias se usaron para análisis filogenéticos.
LasFiguras 39A-Bdemuestran que las secuencias artificiales que comparten aproximadamente el 50 % de identidad con ARNcrtra y ARNcr de origen natural pueden actuar con Cas9 para escindir el ADN diana siempre que la estructura del dominio de unión a proteínas del ARN de localización específica de ADN esté conservada.
Definiciones - parte I
Las expresiones “ polinucleótido” y “ ácido nucleico” utilizados indistintamente en la presente descripción, se refieren a una forma polimérica de nucleótidos de cualquier longitud, ya sea ribonucleótidos o desoxirribonucleótidos. Por lo tanto, estas expresiones incluyen, pero no se limitan a, ADN o ARN monocatenario, bicatenario o multicatenario, ADN genómico, ADNc, híbridos de ADN-ARN o un polímero que comprende bases de purina y pirimidina u otras bases de nucleótidos naturales, modificadas químicas o bioquímicamente, no naturales o derivatizadas. “ Oligonucleótido” generalmente se refiere a polinucleótidos de entre aproximadamente 5 y aproximadamente 100 nucleótidos de ADN monocatenario o bicatenario. Sin embargo, para los fines de esta descripción, no hay límite superior para la longitud de un oligonucleótido. Los oligonucleótidos también se conocen como “ oligómeros” u “ oligos” y pueden aislarse de genes o pueden sintetizarse químicamente mediante métodos conocidos en la técnica. Debe entenderse que las expresiones “ polinucleótido” y “ ácido nucleico” incluyen, según corresponda a las realizaciones que se describen, polinucleótidos monocatenarios (tales como sentido o antisentido) y bicatenarios.
Una “ estructura de tallo-bucle” se refiere a un ácido nucleico que tiene una estructura secundaria que incluye una región de nucleótidos que se sabe o se predice que forma una cadena doble (porción de tallo) que se une por un lado por una región de nucleótidos predominantemente monocatenarios (porción de bucle). Las expresiones estructuras de “ horquilla” y “ plegada hacia atrás” también se usan en la presente descripción para referirse a estructuras de tallobucle. Dichas estructuras son bien conocidas en la técnica y estas expresiones se usan de manera coherente con sus significados conocidos en la técnica. Como se sabe en la técnica, una estructura de tallo-bucle no requiere emparejamiento de bases exacto. Por lo tanto, el tallo puede incluir uno o más emparejamientos erróneos de bases. Alternativamente, el emparejamiento de bases puede ser exacto, es decir, no incluir ningún emparejamiento erróneo.
Por “ hibridable” o “ complementario” o “ sustancialmente complementario” se entiende que un ácido nucleico (p. ej., ARN) comprende una secuencia de nucleótidos que le permite unirse no covalentemente, es decir, formar pares de bases de Watson-Crick y/o pares de bases G/U, “ hibridar” o “ hibridarse” con otro ácido nucleico de una manera específica de secuencia y antiparalela (es decir, un ácido nucleico se une específicamente a un ácido nucleico complementario) en las condiciones adecuadasin vitroy/oin vivode temperatura y fuerza iónica de solución. Como se sabe en la técnica, el emparejamiento de bases de Watson-Crick estándar incluye: el emparejamiento de adenina (A) con timidina (T), el emparejamiento de adenina (A) con uracilo (U) y el emparejamiento de guanina (G) con citosina (C) [ADN, ARN]. Además, también se sabe en la técnica que para la hibridación entre dos moléculas de ARN (p. ej., ARNbc), la base guanina (G) se empareja con uracilo (U). Por ejemplo, el emparejamiento de bases G/U es parcialmente responsable de la degeneración (es decir, redundancia) del código genético en el contexto del emparejamiento de bases anti-codón de ARNt con codones en ARNm. En el contexto de esta descripción, una guanina (G) de un segmento de unión a proteínas (dúplex de ARNbc) de una molécula de ARN de localización específica de ADN en cuestión se considera complementaria a un uracilo (U) y viceversa. Como tal, cuando puede hacerse un par de bases G/U en una posición de nucleótidos dada, un segmento de unión a proteínas (dúplex de ARNbc) de una molécula de ARN de localización específica de ADN en cuestión, la posición no se considera no complementaria, sino que en cambio se considera complementaria.
Las condiciones de hibridación y lavado son bien conocidas y se ilustran en Sambrook, J., Fritsch, E. F. y Maniatis, T.Molecular Cloning: A Laboratory Manual,Segunda Edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor (1989), particularmente el Capítulo 11 y la Tabla 11.1 en el mismo; y Sambrook, J. y Russell, W.,Molecular Cloning: A Laboratory Manual,Tercera Edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor (2001). Las condiciones de temperatura y fuerza iónica determinan la “ rigurosidad” de la hibridación.
La hibridación requiere que los dos ácidos nucleicos contengan secuencias complementarias, aunque son posibles emparejamientos erróneos entre bases. Las condiciones adecuadas para la hibridación entre dos ácidos nucleicos dependen de la longitud de los ácidos nucleicos y del grado de complementación, variables bien conocidas en la técnica. Cuanto mayor es el grado de complementación entre dos secuencias de nucleótidos, mayor es el valor de la temperatura de fusión (Tf) para híbridos de ácidos nucleicos que tienen esas secuencias. Para hibridaciones entre ácidos nucleicos con tramos cortos de complementariedad (p. ej., complementariedad en más de 35 o menos, 30 o menos, 25 o menos, 22 o menos, 20 o menos, o 18 o menos nucleótidos) la posición de los emparejamientos erróneos se vuelve importante (véase Sambrook y col., citado anteriormente, 11.7-11.8). Típicamente, la longitud para un ácido nucleico hibridable es de al menos aproximadamente 10 nucleótidos. Las longitudes mínimas ilustrativas para un ácido nucleico hibridable son: al menos aproximadamente 15 nucleótidos; al menos aproximadamente 20 nucleótidos; al menos aproximadamente 22 nucleótidos; al menos aproximadamente 25 nucleótidos; y al menos aproximadamente 30 nucleótidos). Además, el experto en la técnica reconocerá que la temperatura y la concentración de sal de la solución de lavado pueden ajustarse según sea necesario según factores tales como la longitud de la región de complementación y el grado de complementación.
Se entiende en la técnica que no es necesario que la secuencia del polinucleótido sea complementaria al 100 % con la de su ácido nucleico diana para que sea específicamente hibridable o hibridable. Además, un polinucleótido puede hibridarse sobre uno o más segmentos de manera que los segmentos intermedios o adyacentes no estén implicados en el evento de hibridación (p. ej., una estructura de bucle o estructura de horquilla). Un polinucleótido puede comprender al menos el 70 %, al menos el 80 %, al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 99 % o el 100 % de complementariedad de secuencia con una región diana dentro de la secuencia de ácido nucleico diana que localiza específicamente. Por ejemplo, un ácido nucleico antisentido en el que 18 de 20 nucleótidos del compuesto antisentido son complementarios a una región diana y, por lo tanto, se hibridaría específicamente, representaría un 90 por ciento de complementariedad. En este ejemplo, los nucleótidos no complementarios restantes pueden agruparse o intercalarse con nucleótidos complementarios y no necesitan ser contiguos entre sí o a nucleótidos complementarios. El porcentaje de complementariedad entre tramos particulares de secuencias de ácido nucleico dentro de ácidos nucleicos puede determinarse rutinariamente usando programas BLAST (herramientas básicas de búsqueda de alineación local) y programas PowerBLAST conocidos en la técnica (Altschul y col.,J. Mol. Biol.,1990, 215, 403 410; Zhang y Madden,Genome Res.,1997, 7, 649-656) o usando el programa Gap (Wisconsin Sequence Analysis Package, Versión 8 para Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, Madison WI), usando las configuraciones predeterminadas, que usa el algoritmo de Smith y Waterman(Adv. Appl. Math.,1981, 2, 482-489).
Los términos “ péptido” , “ polipéptido” y “ proteína” se usan indistintamente en la presente descripción, y se refieren a una forma polimérica de aminoácidos de cualquier longitud, que puede incluir aminoácidos codificados y no codificados, aminoácidos químicamente o bioquímicamente modificados y polipéptidos que tienen cadenas principales peptídicas modificadas.
“ Unión” como se usa en la presente descripción (p. ej., con referencia a un dominio de unión a ARN de un polipéptido) se refiere a una interacción no covalente entre macromoléculas (p. ej., entre una proteína y un ácido nucleico). Mientras están en un estado de interacción no covalente, se dice que las macromoléculas están “ asociadas” o “ que interactúan” o “ que se unen” (p. ej., cuando se dice que una molécula X interactúa con una molécula Y, se entiende que la molécula X se une a la molécula Y de manera no covalente). No es necesario que todos los componentes de una interacción de unión sean específicos de secuencia (p. ej., contactos con residuos de fosfato en una cadena principal de ADN), pero algunas porciones de una interacción de unión pueden ser específicas de secuencia. Las interacciones de unión se caracterizan generalmente por una constante de disociación (Kd) inferior a 10-6 M, inferior a 10-7 M, inferior a 10-8 M, inferior a 10-9 M, inferior a 10-10 M, inferior a 10-11 M, inferior a 10-12 M, inferior a 10-13 M, inferior a 10-14 M o inferior a 10 15 “Afinidad” se refiere a la fuerza de unión, correlacionándose la afinidad de unión aumentada con una Kd más baja.
Por “ dominio de unión” se entiende un dominio de proteína que es capaz de unirse de forma no covalente a otra molécula. Un dominio de unión puede unirse, por ejemplo, a una molécula de ADN (una proteína de unión a ADN), una molécula de ARN (una proteína de unión a ARN) y/o una molécula de proteína (una proteína de unión a proteínas). En el caso de una proteína de unión a dominio de proteína, puede unirse a sí misma (para formar homodímeros, homotrímeros, etc.) y/o puede unirse a una o más moléculas de una proteína o proteínas diferentes.
La expresión “ sustitución conservadora de aminoácidos” se refiere a la intercambiabilidad en proteínas de residuos de aminoácidos que tienen cadenas laterales similares. Por ejemplo, un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales alifáticas consiste en glicina, alanina, valina, leucina y isoleucina; un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales de hidroxilo alifático consiste en serina y treonina; un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales que contienen amida consiste en asparagina y glutamina; un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales aromáticas consiste en fenilalanina, tirosina y triptófano; un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales básicas consiste en lisina, arginina e histidina; un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales ácidas consiste en glutamato y aspartato; y un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales que contienen azufre consiste en cisteína y metionina. Son grupos de sustitución conservadora de aminoácidos ilustrativos: valinaleucina-isoleucina, fenilalanina-tirosina, lisina-arginina, alanina-valina y asparagina-glutamina.
Un polinucleótido o polipéptido tiene un determinado porcentaje de “ identidad de secuencia” con otro polinucleótido o polipéptido, lo que significa que, cuando se alinean, ese porcentaje de bases o aminoácidos son iguales, y están en la misma posición relativa, cuando se comparan las dos secuencias. La identidad de secuencia puede determinarse de varias maneras diferentes. Para determinar la identidad de secuencia, las secuencias pueden alinearse usando diversos métodos y programas informáticos (p. ej., BLAST, T-COFFEE, MUSCLE, MAFFT, etc.), disponibles en la web mundial en sitios que incluyen ncbi.nlm.nili.gov/BLAST, ebi.ac.uk/Tools/msa/tcoffee/, ebi.ac.uk/Tools/msa/muscle/, mafft.cbrc.jp/alignment/software/. Véase, p. ej., Altschul y col. (1990),J. Mol. Biol.215:403-10.
Una secuencia de ADN que “ codifica” un ARN particular es una secuencia de ácido nucleico de ADN que se transcribe en ARN. Un polinucleótido de ADN puede codificar un ARN (ARNm) que se traduce en proteína, o un polinucleótido de ADN puede codificar un ARN que no se traduce en proteína (p. ej., ARNt, ARNr o un ARN de localización específica de ADN; también llamado ARN “ no codificante” o “ARNnc” ).
Una “secuencia codificante de proteína” o una secuencia que codifica una proteína o polipéptido particular, es una secuencia de ácido nucleico que se transcribe en ARNm (en el caso del ADN) y se traduce (en el caso de ARNm) en un kpolipéptido invitrooin vivocuando se pone bajo el control de secuencias reguladoras adecuadas. Los límites de la secuencia codificante están determinados por un codón de inicio en el extremo 5' (N-terminal) y un codón sin sentido de terminación de la traducción en el extremo 3' (C-terminal). Una secuencia codificante puede incluir, pero no se limita a, ADNc a partir de ARNm procariota o eucariota, secuencias de ADN genómico a partir de ADN procariota o eucariota y ácidos nucleicos sintéticos. Una secuencia de terminación de la transcripción usualmente se ubicará en 3' con respecto a la secuencia codificante.
Como se usa en la presente descripción, una “secuencia promotora” es una región reguladora de ADN capaz de unirse a la ARN polimerasa e iniciar la transcripción de una secuencia codificante o no codificante corriente abajo (en dirección 3'). Para los fines de definir la presente invención, la secuencia promotora está limitada en su extremo 3' por el sitio de inicio de la transcripción y se extiende corriente arriba (dirección 5') para incluir el número mínimo de bases o elementos necesarios para iniciar la transcripción a niveles detectables por encima del fondo. Dentro de la secuencia promotora se encontrará un sitio de inicio de la transcripción, así como también dominios de unión a proteínas responsables de la unión de la ARN polimerasa. Los promotores eucariotas frecuentemente, pero no siempre, contienen cajas “TATA” y cajas “ CAT” . Pueden usarse diversos promotores, incluyendo promotores inducibles, para impulsar los diversos vectores de la presente invención.
Un promotor puede ser un promotor activo constitutivamente (es decir, un promotor que está constitutivamente en un estado activo/“ Encendido” ), puede ser un promotor inducible (es decir, un promotor cuyo estado, activo/“ Encendido” o inactivo/“Apagado” , es controlado por un estímulo externo, p. ej., la presencia de una temperatura particular, compuesto o proteína), puede ser un promotor restringido espacialmente (es decir, un elemento de control de la transcripción, un potenciador, etc.) (p. ej., un promotor específico de tejido, un promotor específico de tipo celular, etc.) y puede ser un promotor restringido temporalmente (es decir, el promotor está en el estado “ Encendido” o en el estado “Apagado” durante las etapas específicas del desarrollo embrionario o durante las etapas específicas de un proceso biológico, p. ej., el ciclo del folículo piloso en ratones).
Los promotores adecuados pueden derivar de virus y, por lo tanto, pueden denominarse promotores víricos, o pueden derivar de cualquier organismo, incluyendo organismos procariotas o eucariotas. Pueden usarse promotores adecuados para impulsar la expresión por cualquier ARN polimerasa (p. ej., pol I, pol II, pol III). Los promotores ilustrativos incluyen, pero no se limitan a, el promotor temprano de SV40, promotor de repetición terminal larga (LTR) de virus de tumor mamario de ratón; promotor tardío principal de adenovirus (Ad MLP); un promotor del virus del herpes simple (VHS), un promotor de citomegalovirus (CMV) tal como la región promotora temprana inmediata de CMV (CMVIE), un promotor del virus del sarcoma de Rous (RSV), un promotor nuclear pequeño U6 humano (U6) (Miyagishi y col.,Nature Biotechnology20, 497-500 (2002), un promotor U6 potenciado (p. ej., Xia y col.,Nucleic Acids Res.1 de septiembre de 2003;31(17)), un promotor H1 humano (H1) y similares.
Los ejemplos de promotores inducibles incluyen, pero no se limitan a, el promotor de ARN polimerasa T7, el promotor de ARN polimerasa T3, el promotor regulado por Isopropil-beta-D-tiogalactopiranósido (IPTG), el promotor inducido por lactosa, el promotor de choque térmico, el promotor regulado por tetraciclina, el promotor regulado por esteroides, el promotor regulado por metales, el promotor regulado por receptor de estrógeno, etc. Los promotores inducibles pueden regularse, por lo tanto, por moléculas que incluyen, pero no se limitan a, doxiciclina; ARN polimerasa, p. ej., ARN polimerasa T7; un receptor de estrógeno; una fusión del receptor de estrógeno; etc.
En algunas realizaciones, el promotor es un promotor restringido espacialmente (es decir, promotor específico de tipo celular, promotor específico de tejido, etc.) de manera que en un organismo multicelular, el promotor está activo (es decir, “ Encendido” ) en un subconjunto de células específicas. Los promotores restringidos espacialmente también se pueden denominar potenciadores, elementos de control de la transcripción, secuencias de control, etc. Puede usarse cualquier promotor restringido espacialmente conveniente y la elección del promotor adecuado (p. ej., un promotor específico del cerebro, un promotor que impulsa la expresión en un subconjunto de neuronas, un promotor que impulsa la expresión en un subconjunto de neuronas, un promotor que impulsa la expresión en la línea germinal, un promotor que impulsa la expresión en los pulmones, un promotor que impulsa la expresión en los músculos, un promotor que impulsa la expresión en células de los islotes del páncreas, etc.) dependerá del organismo. Por ejemplo, se conocen diversos promotores restringidos espacialmente para plantas, moscas, gusanos, mamíferos, ratones, etc. Por lo tanto, un promotor restringido espacialmente puede usarse para regular la expresión de un ácido nucleico que codifica un polipéptido modificador dirigido al sitio en cuestión en una amplia diversidad de tejidos y tipos celulares diferentes, dependiendo del organismo. Algunos promotores restringidos espacialmente también están restringidos temporalmente de manera que el promotor está en el estado “ Encendido” o el estado “Apagado” durante las etapas específicas del desarrollo embrionario o durante las etapas específicas de un proceso biológico (p. ej., ciclo del folículo piloso en ratones).
Con fines ilustrativos, los ejemplos de promotores restringidos espacialmente incluyen, pero no se limitan a, promotores específicos de neuronas, promotores específicos de adipocitos, promotores específicos de cardiomiocitos, promotores específicos de músculo liso, promotores específicos de fotorreceptores, etc. Los promotores restringidos espacialmente específicos de neuronas incluyen, pero no se limitan a, un promotor de enolasa (NSE) específico de neuronas (véase, p. ej., EMBL HSENO2, X51956); un promotor de aminoácido aromático descarboxilasa (AADC); un promotor de neurofilamentos (véase, p. ej., GenBank Hu m Nf L, L04147); un promotor de sinapsina (véase, p. ej., GenBank HUMSYNIB, M55301); un promotor de thy-1 (véase, p. ej., Chen y col. (1987) Cell 51:7 -19; y Llewlyn y col. (2010) Nat. Med. 16(10): 1161-1166); un promotor del receptor de serotonina (véase, p. ej., GenBank S62283); un promotor de tirosina hidroxilasa (TH) (véase, p. ej., Oh y col. (2009) Gene Ther 16:437; Sasaoka y col. (1992)Mol. Brain Res.16:274; Boundy y col. (1998)J. Neurosa.18:9989; y Kaneda y col. (1991)Neuron6:583-594); un promotor de GnRH (véase, p. ej., Radovik y col. (1991)Proc. Natl. Acad. Sci. USA88:3402-3406); un promotor de L7 (véase, p. ej., Oberdick y col. (1990)Science248:223-226); un promotor de DNMT (véase, p. ej., Bartge y col. (1988)Proc. Natl. Acad. Sci. USA85:3648-3652); un promotor de encefalina (véase, p. ej., Cob y col. (1988)EMBO J.17:3793-3805); un promotor de proteína básica de mielina (MBP); un promotor de proteína quinasa II-alfa dependiente de Ca2+-calmodulina (CamKIIa) (véase, p. ej., Mayford y col. (1996)Proc. Natl. Acad. Sci. USA93: 13250; y Casanova y col. (2001)Genesis31:37); un potenciador de CMV/promotor de factor de crecimiento-p derivado de plaquetas (véase, p. ej., Liu y col. (2004)Gene Therapy11:52-60); y similares.
Los promotores restringidos espacialmente específicos de adipocitos incluyen, pero no se limitan a, promotor/potenciador del gen aP2, p. ej., una región de -5,4 kb a 21 pb de un gen aP2 humano (véase, p. ej., Tozzo y col. (1997)Endocrinol.138: 1604; Ross y col. (1990)Proc. Natl. Acad. Sci. USA87:9590; y Pavjani y col. (2005)Nat. Med.11:797); un promotor del transportador de glucosa-4 (GLUS4) (véase, p. ej., Knight y col. (2003)Proc. Natl. Acad. Sci. USA100:14725); un promotor de translocasa de ácido graso (FAT/CD36) (véase, p. ej., Kuriki y col. (2002)Biol. Pharm. Bull.25: 1476; y Sato y col. (2002)J. Biol. Chem.277: 15703); un promotor de estearoil-CoA desaturasa-1 (SCD1) (Tabor y col. (1999)J. Biol. Chem.274:20603); un promotor de leptina (véase, p. ej., Mason y col. (1998)Endocrinol.139:1013; y Chen y col. (1999)Biochem. Biophys. Res. Comm.262: 187); un promotor de adiponectina (véase, p. ej., Kita y col. (2005)Biochem. Biophys. Res. Comm.331:484; y Chakrabarti (2010)Endocrinol.151:2408); un promotor de adipisina (véase, p. ej., Platt y col. (1989)Proc. Natl. Acad. Sci. USA86:7490); un promotor de resistina (véase, p. ej., Seo y col. (2003)Molec. Endocrinol.17: 1522); y similares.
Los promotores restringidos espacialmente específicos de cardiomiocitos incluyen, pero no se limitan a, secuencias de control derivadas de los siguientes genes: cadena ligera de miosina 2, cadena pesada de a-miosina, AE3, troponina C cardíaca, actina cardíaca y similares. Franz y col. (1997)Cardiovasc. Res.35:560-566; Robbins y col. (1995)Ann. N. Y. Acad. Sci.752:492-505; Linn y col. (1995)Circ. Res.76:584-591; Pemaek y col. (1994)Mol. Cell. Biol.14:1870-1885; Hunter y col. (1993)Hypertension22:608-617; y Sartorelli y col. (1992)Proc. Natl. Acad. Sci. USA89:4047-4051.
Los promotores restringidos espacialmente específicos del músculo liso incluyen, pero no se limitan a, un promotor de SM22a (véase, p. ej., Akyürek y col. (2000)Mol. Med.6:983; y la patente US-7.169.874); un promotor de smoothelina (véase, p. ej., el documento WO 2001/018048); un promotor de actina de músculo liso a; y similares. Por ejemplo, se ha demostrado que una región de 0,4 kb del promotor de SM22a, dentro del cual se encuentran dos elementos CArG, media en la expresión específica de células de músculo liso vascular (véase, p. ej., Kim, y col. (1997) Mol. Cell.Biol.
17, 2266-2278; Li, y col., (1996)J. Cell Biol.132, 849-859; y Moessler, y col. (1996)Development122, 2415-2425).
Los promotores restringidos espacialmente específicos de fotorreceptores incluyen, pero no se limitan a, un promotor de rodopsina; un promotor de rodopsina quinasa (Young y col. (2003)Ophthalmol. Vis. Sci.44:4076); un promotor del gen de la fosfodiesterasa beta (Nioud y col. (2007)J. Gene Med.9: 1015); un promotor del gen de la retinitis pigmentosa (Nioud y col. (2007) citado anteriormente); un potenciador del gen de la proteína de unión a retinoide interfotorreceptor (IRBP) (Nioud y col. (2007) citado anteriormente); un promotor del gen de IRBP (Yokyama y col. (1992)Exp Eye Res.55:225); y similares.
Las expresiones “ secuencias reguladoras de ADN” , “ elementos de control” y “ elementos reguladores” utilizadas indistintamente en la presente descripción, se refieren a secuencias de control de la transcripción y de la traducción, tales como promotores, potenciadores, señales de poliadenilación, terminadores, señales de degradación de proteínas y similares, que proporcionan y/o regulan la transcripción de una secuencia no codificante (p. ej., ARN de localización específica de ADN ) o una secuencia codificante (p. ej., polipéptido modificador dirigido al sitio o polipéptido Cas9/Csn1) y/o regulan la traducción de un polipéptido codificado.
La expresión “ de origen natural” o “ sin modificar” como se usa en la presente descripción como se aplica a un ácido nucleico, un polipéptido, una célula o un organismo, se refiere a un ácido nucleico, polipéptido, célula u organismo que se encuentra en la naturaleza. Por ejemplo, una secuencia polipeptídica o polinucleotídica que está presente en un organismo (que incluye virus) que puede aislarse de una fuente en la naturaleza y que no ha sido modificada intencionalmente por un ser humano en el laboratorio es de origen natural.
El término “ quimérico” , como se usa en la presente descripción, como se aplica a un ácido nucleico o polipéptido se refiere a dos componentes que se definen por estructuras derivadas de diferentes fuentes. Por ejemplo, cuando “ quimérico” se usa en el contexto de un polipéptido quimérico (p. ej., una proteína Cas9/Csn1 quimérica), el polipéptido quimérico incluye secuencias de aminoácidos que derivan de polipéptidos diferentes. Un polipéptido quimérico puede comprender secuencias polipeptídicas modificadas o de origen natural (p. ej., una primera secuencia de aminoácidos de una proteína Cas9/Csn1 modificada o sin modificar; y una segunda secuencia de aminoácidos distinta de la proteína Cas9/Csn1). Similarmente, “ quimérico” en el contexto de un polinucleótido que codifica un polipéptido quimérico incluye secuencias de nucleótidos derivadas de regiones codificantes diferentes (p. ej., una primera secuencia de nucleótidos que codifica una proteína Cas9/Csn1; y una segunda secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido distinto de una proteína Cas9/Csn1).
La expresión “ polipéptido quimérico” se refiere a un polipéptido que se prepara mediante la combinación (es decir, “ fusión” ) de dos segmentos de secuencia de aminoácidos separados de cualquier otra manera, usualmente a través de intervención humana. Un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos quimérica es un polipéptido quimérico. Algunos polipéptidos quiméricos pueden denominarse “variantes de fusión” .
“ Heterólogo” , como se usa en la presente descripción, significa una secuencia de nucleótidos o polipéptidos que no se encuentra en el ácido nucleico o proteína nativos, respectivamente. Por ejemplo, en una proteína Cas9/Csn1 quimérica, el dominio de unión a ARN de un polipéptido Cas9/Csn1 bacteriano de origen natural (o una variante del mismo) puede fusionarse con una secuencia polipeptídica heteróloga (es decir, una secuencia polipeptídica de una proteína distinta de Cas9/Csn1 o una secuencia polipeptídica de otro organismo). La secuencia polipeptídica heteróloga puede presentar una actividad (p. ej., actividad enzimática) que también será presentada por la proteína Cas9/Csn1 quimérica (p. ej., actividad metiltransferasa, actividad acetiltransferasa, actividad quinasa, actividad ubiquitinante, etc.). Una secuencia de ácido nucleico heteróloga puede unirse a una secuencia de ácido nucleico natural (o una variante de la misma) (p. ej., mediante ingeniería genética) para generar una secuencia de nucleótidos quimérica que codifica un polipéptido quimérico. Como otro ejemplo, en un polipéptido dirigido al sitio Cas9 variante de fusión, un polipéptido dirigido al sitio Cas9 variante puede fusionarse con un polipéptido heterólogo (es decir, un polipéptido distinto de Cas9), que presenta una actividad que también será presentada por el polipéptido dirigido al sitio Cas9 variante de fusión. Una secuencia de ácido nucleico heteróloga puede unirse a un polipéptido dirigido al sitio Cas9 variante (p. ej., mediante ingeniería genética) para generar una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido dirigido al sitio Cas9 variante de fusión.
“ Recombinante” , como se usa en la presente descripción, significa que un ácido nucleico particular (ADN o ARN) es el producto de diversas combinaciones de clonación, restricción, reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y/o etapas de ligadura que dan como resultado un constructo que tiene una secuencia estructural codificante o no codificante distinguible de los ácidos nucleicos endógenos que se encuentran en los sistemas naturales. Las secuencias de ADN que codifican polipéptidos pueden ensamblarse a partir de fragmentos de ADNc o a partir de una serie de oligonucleótidos sintéticos, para proporcionar un ácido nucleico sintético que es capaz de expresarse a partir de una unidad transcripcional recombinante contenida en una célula o en un sistema de transcripción y traducción exento de células. El ADN genómico que comprende las secuencias relevantes también puede usarse en la formación de un gen recombinante o una unidad transcripcional. Las secuencias de ADN no traducido pueden estar presentes en 5' o 3' del marco de lectura abierto, donde dichas secuencias no interfieren con la manipulación o expresión de las regiones codificantes, y de hecho pueden actuar para modular la producción de un producto deseado por diversos mecanismos (véanse “ secuencias reguladoras de ADN” , a continuación). Alternativamente, las secuencias de ADN que codifican ARN (p. ej., ARN de localización específica de ADN) que no se traducen también pueden considerarse recombinantes. Por lo tanto, p. ej., la expresión ácido nucleico “ recombinante” se refiere a uno que no es de origen natural, p. ej., se hace por la combinación artificial de dos segmentos de secuencia separados de cualquier otra manera a través de intervención humana. Esta combinación artificial frecuentemente se logra mediante medios de síntesis química, o mediante la manipulación artificial de segmentos aislados de ácidos nucleicos, p. ej., mediante técnicas de ingeniería genética. Esto usualmente se hace para reemplazar un codón con un codón que codifica el mismo aminoácido, un aminoácido conservador o un aminoácido no conservador. Alternativamente, se realiza para unir entre sí segmentos de ácido nucleico de las funciones deseadas para generar una combinación deseada de funciones. Esta combinación artificial frecuentemente se logra mediante medios de síntesis química, o mediante la manipulación artificial de segmentos aislados de ácidos nucleicos, p. ej., mediante técnicas de ingeniería genética. Cuando un polinucleótido recombinante codifica un polipéptido, la secuencia del polipéptido codificado puede ser de origen natural (de “tipo silvestre” ) o puede ser una variante (p. ej., un mutante) de la secuencia de origen natural. Por lo tanto, la expresión polipéptido “ recombinante” no se refiere necesariamente a un polipéptido cuya secuencia no se produce de forma natural. En cambio, un polipéptido “ recombinante” está codificado por una secuencia de ADN recombinante, pero la secuencia del polipéptido puede ser de origen natural (de “tipo silvestre” ) o de origen no natural (p. ej., una variante, un mutante, etc.). Por lo tanto, un polipéptido “ recombinante” es el resultado de la intervención humana, pero puede ser una secuencia de aminoácidos de origen natural.
Un “vector” o “vector de expresión” es un replicón, tal como un plásmido, fago, virus o cósmido, al que puede unirse otro segmento de ADN, es decir, un “ inserto” , para provocar la replicación del segmento unido en una célula.
Un “ casete de expresión” comprende una secuencia codificante de ADN unida operativamente a un promotor. “ Unido operativamente” se refiere a una yuxtaposición en donde los componentes descritos de este modo están en una relación que les permite actuar de la manera prevista. Por ejemplo, un promotor está unido operativamente a una secuencia codificante si el promotor afecta a su transcripción o expresión.
Las expresiones “vector de expresión recombinante” o “ constructo de ADN” se usan indistintamente en la presente descripción para referirse a una molécula de ADN que comprende un vector y al menos un inserto. Los vectores de expresión recombinantes usualmente se generan con el fin de expresar y/o propagar el inserto o insertos, o para la construcción de otras secuencias de nucleótidos recombinantes. El inserto o insertos pueden o no estar unidos operativamente a una secuencia promotora y pueden o no estar unidos operativamente a secuencias reguladoras de ADN.
Una célula se ha “ modificado genéticamente” o “ transformado” o “ transfectado” por ADN exógeno, p. ej., un vector de expresión recombinante, cuando dicho ADN se ha introducido dentro de la célula. La presencia de a Dn exógeno da como resultado un cambio genético permanente o transitorio. El ADN transformante puede o no estar integrado (unido covalentemente) en el genoma de la célula. En células procariotas, de levadura y de mamífero, por ejemplo, el ADN transformante puede mantenerse en un elemento episómico tal como un plásmido. Con respecto a las células eucariotas, una célula transformada de manera estable es una en la que el ADN transformante se ha integrado en un cromosoma de manera que las células hijas lo hereden a través de la replicación cromosómica. Esta estabilidad se demuestra por la capacidad de la célula eucariota para establecer líneas celulares o clones que comprenden una población de células hijas que contienen el ADN transformante. Un “ clon” es una población de células derivadas de una única célula o ancestro común por mitosis. Una “ línea celular” es un clon de una célula primaria que es capaz de crecer establein vitrodurante muchas generaciones.
Los métodos adecuados de modificación genética (también denominados “transformación” ) incluyen, p. ej., infección vírica o por bacteriófagos, transfección, conjugación, fusión de protoplastos, lipofección, electroporación, precipitación con fosfato de calcio, transfección mediada por polietilenimina (PEI), transfección mediada por DEAE-dextrano, transfección mediada por liposomas, tecnología de cañón de partículas, precipitación con fosfato de calcio, microinyección directa, administración de ácido nucleico mediada por nanopartículas (véase, p. ej., Panyam y col.,Adv Drug Deliv Rev.13 de septiembre de 2012. piii: S0169-409X(12)00283-9. doi: 10.1016/j.addr.2012.09.023) y similares.
La elección del método de modificación genética depende generalmente del tipo de célula que se transforma y las circunstancias en las que se tiene lugar la transformación (p. ej.,in vitro, ex vivooin vivo).Un análisis general de estos métodos puede encontrarse en Ausubel, y col.,Short Protocols in Molecular Biology,3ra ed., Wiley&Sons, 1995.
Un “ADN diana” , como se usa en la presente descripción, es un polinucleótido de ADN que comprende un “ sitio diana” o “ secuencia diana” Las expresiones “ sitio diana” o “ secuencia diana” o “ADN protoespaciador diana” se usan indistintamente en la presente descripción para referirse a una secuencia de ácido nucleico presente en un ADN diana al que se unirá un segmento de localización específica de ADN de un ARN de localización específica de ADN en cuestión (véase la Figura 1 y la Figura 39), siempre que existan condiciones suficientes para la unión. Por ejemplo, el sitio diana (o secuencia diana) 5-GAGCATATC-3' (Id. de sec. n.° //) dentro de un ADN diana se localiza específicamente por (o se une por, o se hibrida con, o es complementario a) la secuencia de ARN 5-GAUAUGCUC-3' (Id. de sec. n.° //). Las condiciones de unión a ADN/ARN adecuadas incluyen condiciones fisiológicas normalmente presentes en una célula. Se conocen en la técnica otras condiciones de unión ADN/ARN adecuadas (p. ej., afecciones en un sistema exento de células); véase, p. ej., Sambrook, citado anteriormente. La cadena del ADN diana que es complementaria y se hibrida con el ARN de localización específica de ADN se denomina “ cadena complementaria” y la cadena del ADN diana que es complementaria a la “ cadena complementaria” (y, por lo tanto, no es complementaria al ARN de localización específica de ADN) se denomina “ cadena no complementaria” o “ cadena no-complementaria” (véase la Figura 12 ).
Por “ polipéptido modificador dirigido al sitio” o “ polipéptido dirigido al sitio de unión a ARN” o “ polipéptido modificador dirigido al sitio de unión a ARN” o “ polipéptido dirigido al sitio” se entiende un polipéptido que se une a ARN y se localiza específicamente a una secuencia de ADN específica. Un polipéptido modificador dirigido al sitio como se describe en la presente descripción se localiza específicamente a una secuencia de ADN específica por la molécula de ARN a la que está unido. La molécula de ARN comprende una secuencia que es complementaria a una secuencia diana dentro del ADN diana, localizando específicamente de este modo el polipéptido unido a una ubicación específica dentro del ADN diana (la secuencia diana).
Por “ escisión” se entiende la rotura de la cadena principal covalente de una molécula de ADN. La escisión puede iniciarse mediante una diversidad de métodos que incluyen, pero no se limitan a, hidrólisis enzimática o química de un enlace fosfodiéster. Tanto la escisión monocatenaria como la escisión bicatenaria son posibles, y la escisión bicatenaria puede producirse como resultado de dos eventos de escisión monocatenarios distintos. La escisión de ADN puede dar como resultado la producción de extremos romos o extremos escalonados. En determinadas realizaciones, se usa un complejo que comprende un ARN de localización específica de ADN y un polipéptido modificador dirigido al sitio para la escisión de ADN bicatenario localizada específicamente.
“ Nucleasa” y “ endonucleasa” se usan indistintamente en la presente descripción con el significado de una enzima que posee actividad catalítica para la escisión de ADN.
Por “ dominio de escisión” o “ dominio activo” o “ dominio nucleasa” de una nucleasa se entiende la secuencia polipeptídica o dominio dentro de la nucleasa que posee la actividad catalítica para la escisión de ADN. Un dominio de escisión puede estar contenido en una única cadena polipeptídica o la actividad de escisión puede ser el resultado de la asociación de dos (o más) polipéptidos. Un dominio nucleasa único puede consistir en más de un tramo aislado de aminoácidos dentro de un polipéptido dado.
La molécula de ARN que se une al polipéptido modificador dirigido al sitio y localiza específicamente el polipéptido a una ubicación específica dentro del ADN diana se denomina en la presente descripción “ARN de localización específica de ADN” o “ polinucleótido de ARN de localización específica de ADN” (también denominado en la presente descripción “ARN guía” o “ARNg” ). Un ARN de localización específica de ADN en cuestión comprende dos segmentos, un “ segmento de localización específica de ADN” y un “ segmento de unión a proteínas” . Por “ segmento” se entiende un segmento/sección/región de una molécula, p. ej., un tramo contiguo de nucleótidos en un ARN. Un segmento también puede significar una región/sección de un complejo de manera que un segmento puede comprender regiones de más de una molécula. Por ejemplo, en algunos casos, el segmento de unión a proteínas (que se describe a continuación) de un ARN de localización específica de ADN es una molécula de ARN y el segmento de unión a proteínas comprende, por lo tanto, una región de esa molécula de ARN. En otros casos, el segmento de unión a proteínas (que se describe a continuación) de un ARN de localización específica de ADN comprende dos moléculas separadas que se hibridan a lo largo de una región de complementariedad. Como ejemplo ilustrativo, no limitativo, un segmento de unión a proteínas de un ARN de localización específica de ADN que comprende dos moléculas separadas puede comprender (i) los pares de bases 40-75 de una primera molécula de a Rn que tiene 100 pares de bases de longitud; y (ii) los pares de bases 10-25 de una segunda molécula de ARN que tiene 50 pares de bases de longitud. La definición de “ segmento” , a menos que se defina específicamente de otra manera en un contexto particular, no se limita a un número específico de pares de bases totales, no se limita a ningún número particular de pares de bases de una molécula de ARN dada, no se limita a un número particular de moléculas separadas dentro de un complejo, y puede incluir regiones de moléculas de ARN que tienen cualquier longitud total y pueden no incluir regiones con complementariedad con otras moléculas.
El segmento de localización específica de ADN (o “ secuencia de localización específica de ADN” ) comprende una secuencia de nucleótidos que es complementaria a una secuencia específica dentro de un ADN diana (la cadena complementaria del ADN diana). El segmento de unión a proteínas (o “ secuencia de unión a proteínas” ) interactúa con un polipéptido modificador dirigido al sitio. Cuando el polipéptido modificador dirigido al sitio es un polipéptido relacionado con Cas9 o Cas9 (que se describe con más detalle a continuación), la escisión específica de sitio del ADN diana se produce en ubicaciones determinadas por (i) la complementariedad de emparejamiento de bases entre el ARN de localización específica de ADN y el ADN diana; y (ii) un motivo corto (denominado motivo adyacente protoespaciador (PAM)) en el ADN diana.
El segmento de unión a proteínas de un ARN de localización específica de ADN en cuestión comprende dos tramos complementarios de nucleótidos que se hibridan entre sí para formar un dúplex de ARN bicatenario (dúplex de ARNbc).
En algunas realizaciones, un ácido nucleico en cuestión (p. ej., un ARN de localización específica de ADN, un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un ARN de localización específica de ADN; un ácido nucleico que codifica un polipéptido dirigido al sitio; etc.) comprende una modificación o secuencia que proporciona una característica deseable adicional (p. ej., estabilidad modificada o regulada; localización específica subcelular; seguimiento, p. ej., un marcador fluorescente; un sitio de unión para una proteína o complejo de proteínas; etc.). Los ejemplos no limitativos incluyen: una caperuza 5' (p. ej., una caperuza de 7-metilguanilato (m7G)); una cola poliadenilada en 3' (es decir, una cola de poli(A) 3'; una secuencia de ribointerruptor (p. ej., para permitir la estabilidad regulada y/o la accesibilidad regulada por proteínas y/o complejos de proteínas); una secuencia de control de estabilidad; una secuencia que forma un dúplex de ARNbc (es decir, una horquilla)); una modificación o secuencia que localiza específicamente el ARN a una ubicación subcelular (p. ej., núcleo, mitocondrias, cloroplastos y similares); una modificación o secuencia que proporciona el seguimiento (p. ej., conjugación directa con una molécula fluorescente, conjugación con un resto que facilita la detección fluorescente, una secuencia que permite la detección fluorescente, etc.); una modificación o secuencia que proporciona un sitio de unión para proteínas (p. ej., proteínas que actúan sobre ADN, que incluyen activadores de la transcripción, represores de la transcripción, ADN metiltransferasas, ADN desmetilasas, histona acetiltransferasas, histona desacetilasas y similares); y combinaciones de los mismos.
En algunas realizaciones, un ARN de localización específica de ADN comprende un segmento adicional en el extremo 5' o 3' que proporciona cualquiera de las características descritas anteriormente. Por ejemplo, un tercer segmento adecuado puede comprender una caperuza 5' (p. ej., una caperuza de 7-metilguanilato (m7G)); una cola poliadenilada en 3' (es decir, una cola de poli(A) 3'; una secuencia de ribointerruptor (p. ej., para permitir la estabilidad regulada y/o la accesibilidad regulada por proteínas y complejos de proteínas); una secuencia de control de estabilidad; una secuencia que forma un dúplex de ARNbc (es decir, una horquilla)); una secuencia que localiza específicamente el ARN a una ubicación subcelular (p. ej., núcleo, mitocondrias, cloroplastos y similares); una modificación o secuencia que proporciona el seguimiento (p. ej., conjugación directa con una molécula fluorescente, conjugación con un resto que facilita la detección fluorescente, una secuencia que permite la detección fluorescente, etc.); una modificación o secuencia que proporciona un sitio de unión para proteínas (p. ej., proteínas que actúan sobre ADN, que incluyen activadores de la transcripción, represores de la transcripción, ADN metiltransferasas, ADN desmetilasas, histona acetiltransferasas, histona desacetilasas y similares); y combinaciones de los mismos.
Un ARN de localización específica de ADN en cuestión y un polipéptido modificador dirigido al sitio en cuestión (es decir, polipéptido dirigido al sitio) forman un complejo (es decir, se unen a través de interacciones no covalentes). El ARN de localización específica de ADN proporciona una especificidad diana al complejo al comprender una secuencia de nucleótidos que es complementaria a una secuencia de un ADN diana. El polipéptido modificador dirigido al sitio del complejo proporciona la actividad específica de sitio. En otras palabras, el polipéptido modificador dirigido al sitio se guía a una secuencia de ADN diana (p. ej., una secuencia diana en un ácido nucleico cromosómico; una secuencia diana en un ácido nucleico extracromosómico, p. ej., un ácido nucleico episómico, un minicírculo, etc.; una secuencia diana en un ácido nucleico mitocondrial; una secuencia diana en un ácido nucleico de cloroplasto; una secuencia diana en un plásmido; etc.) en virtud de su asociación con el segmento de unión a proteínas del ARN de localización específica de ADN.
En algunas realizaciones, un ARN de localización específica de ADN en cuestión comprende dos moléculas de ARN separadas (polinucleótidos de ARN: un “ARN activador” y un “ARN localizador específico” , véase a continuación) y se denomina en la presente descripción “ARN de localización específica de ADN de molécula doble” o un “ARN de localización específica de ADN de dos moléculas” . En otras realizaciones, el ARN de localización específica de ADN en cuestión es una molécula de ARN única (polinucleótido de ARN único) y se denomina en la presente descripción un “ARN de localización específica de ADN de molécula única” , un “ARN de guía único” o un “ARNgu” . La expresión “ARN de localización específica de ADN” o “ARNg” incluye, con referencia tanto a ARN de localización específica de ADN de molécula doble como a ARN de localización específica de ADN de molécula única (es decir, ARNgu).
Un ARN de localización específica de ADN de dos moléculas ilustrativo comprende una molécula similar a ARNcr (“ARN de CRISPR” o “ARN localizador específico” o “ARNcr” o “ repetición de ARNcr” ) y una molécula similar a ARNcrtra (“ARN de CRISPR de acción trans” o “ARN activador” o “ARNcrtra” ) correspondiente. Una molécula similar a ARNcr (ARN localizador específico) comprende tanto el segmento de localización específica de ADN (monocatenario) del ARN de localización específica de ADN como un tramo (“ segmento formador de dúplex” ) de nucleótidos que forma una mitad del dúplex de ARNbc del segmento de unión a proteínas del ARN de localización específica de ADN. Una molécula similar a ARNcrtra (ARN activador) correspondiente comprende un tramo de nucleótidos (segmento formador de dúplex) que forma la otra mitad del dúplex de ARNbc del segmento de unión a proteínas del ARN de localización específica de ADN. En otras palabras, un tramo de nucleótidos de una molécula similar a ARNcr es complementario y se hibrida con un tramo de nucleótidos de una molécula similar a ARNcrtra para formar el dúplex de ARNbc del dominio de unión a proteínas del ARN de localización específica de ADN. Como tal, se puede decir que cada molécula similar a ARNcr tiene una molécula similar a ARNcrtra correspondiente. La molécula similar a ARNcr proporciona de forma adicional el segmento de localización específica de ADN monocatenario. Por lo tanto, una molécula similar a ARNcr y una molécula similar a ARNcrtra (en forma de un par correspondiente) se hibridan para formar un ARN de localización específica de ADN. La secuencia exacta de una molécula de ARNcr o ARNcrtra dada es característica de la especie en la que se encuentran las moléculas de ARN. Se representan diversos ARNcr y ARNcrtra en pares complementarios correspondientes en las Figuras 8. Un ARN de localización específica de ADN de molécula doble en cuestión puede comprender cualquier par de ARNcr y ARNcrtra correspondiente. Un ARN de localización específica de ADN de molécula doble en cuestión puede comprender cualquier par de ARNcr y ARNcrtra correspondiente.
La expresión “ARN activador” se usa en la presente descripción con el significado de una molécula similar a ARNcrtra de un ARN de localización específica de ADN de molécula doble. La expresión “ARN localizador específico” se usa en la presente descripción con el significado de una molécula similar a ARNcr de un ARN de localización específica de ADN de molécula doble. La expresión “ segmento formador de dúplex” se usa en la presente descripción con el significado del tramo de nucleótidos de un ARN activador o un a Rn localizador específico que contribuye a la formación del dúplex de ARNbc mediante la hibridación con un tramo de nucleótidos de una molécula de ARN activador o ARN localizador específico correspondiente. En otras palabras, un ARN activador comprende un segmento formador de dúplex que es complementario al segmento formador de dúplex del ARN localizador específico correspondiente. Como tal, un ARN activador comprende un segmento formador de dúplex mientras que un ARN localizador específico comprende tanto un segmento formador de dúplex como el segmento de localización específica de ADN del ARN de localización específica de ADN. Por lo tanto, un ARN de localización específica de ADN de molécula doble en cuestión puede estar compuesto por cualquier par de ARN activador y de ARN localizador específico correspondiente.
La expresión “ célula madre” se usa en la presente descripción para referirse a una célula (p. ej., célula madre vegetal, célula madre de vertebrado) que tiene la capacidad de autorrenovarse y generar un tipo celular diferenciado (véase Morrison y col. (1997) Cell 88:287-298). En el contexto de la ontogenia celular, el adjetivo “ diferenciado” o “ diferenciación” es un término relativo. Una “ célula diferenciada” es una célula que ha progresado más en la vía de desarrollo que la célula con la que se está comparando. Por lo tanto, las células madre pluripotentes (que se describen a continuación) pueden diferenciarse en células progenitoras de linaje restringido (p. ej., células madre mesodérmicas), que a su vez pueden diferenciarse en células que se restringen adicionalmente (p. ej., progenitores neuronales), que pueden diferenciarse en células en fase final (es decir, células diferenciadas terminalmente, p. ej., neuronas, cardiomiocitos, etc.), que desempeñan una función característica en un determinado tipo tisular, y pueden o no conservar la capacidad de proliferar adicionalmente. Las células madre pueden caracterizarse tanto por la presencia de marcadores específicos (p. ej., proteínas, ARN, etc.) y la ausencia de marcadores específicos. Las células madre también pueden identificarse mediante ensayos funcionales tantoin vitrocomoin vivo,particularmente ensayos relacionados con la capacidad de las células madre para proporcionar lugar a una progenie diferenciada múltiple.
Las células madre de interés incluyen células madre pluripotentes (PSC, por sus siglas en inglés). La expresión “ célula madre pluripotente” o “ PSC” se usa en la presente descripción con el significado de una célula madre capaz de producir todos los tipos celulares del organismo. Por lo tanto, una PSC puede dar lugar a células de todas las capas germinales del organismo (p. ej., el endodermo, mesodermo y ectodermo de un vertebrado). Las células pluripotentes son capaces de formar teratomas y de contribuir a los tejidos del ectodermo, mesodermo o endodermo en un organismo vivo. Las células madre pluripotentes de las plantas son capaces de dar lugar a todos los tipos celulares de la planta (p. ej., células de la raíz, tallo, hojas, etc.).
Las PSC de los animales pueden derivar en un número de formas diferentes. Por ejemplo, las células madre embrionarias (ESC, por sus siglas en inglés) derivan de la masa celular interna de un embrión, mientras que las células madre pluripotentes inducidas (iPSC, por sus siglas en inglés) derivan de células somáticas (Takahashi y col.,Cell.30 de noviembre de 2007;131(5):861-72; Takahashi y col.,Nat Protoc.2007;2(12):3081-9; Yu y col.,Science.21 de diciembre de 2007;318(5858):1917-20. Epub 20 de noviembre de 2007). Debido a que el término PSC se refiere a células madre pluripotentes, independientemente de su derivación, el término PSC abarca los términos ESC e iPSC. Las PSC pueden estar en forma de una línea celular establecida, pueden obtenerse directamente del tejido embrionario primario, o pueden derivar de una célula somática. Las PSC pueden ser células diana de los métodos descritos en la presente descripción.
Por “célula madre embrionaria” (ESC) se entiende una PSC que se aisló de un embrión, típicamente de la masa celular interna del blastocisto. Las células madre de interés también incluyen células madre embrionarias de otros primates, tales como células madre de Rhesus y células madre de tamarín. Las células madre pueden obtenerse de cualquier especie de mamífero, p. ej., ser humano, equino, bovino, porcino, canino, felino, roedor, p. ej., ratones, ratas, hámster, primate, etc. (Thomson y col. (1998)Science282:1145; Thomson y col. (1995)Proc. Natl. Acad. Sci USA92:7844; Thomson y col. (1996)Biol. Reprod.55:254; Shamblott y col.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA95: 13726, 1998). En el cultivo, las ESC típicamente crecen como colonias planas con grandes relaciones nucleocitoplasmáticas, bordes definidos y nucléolos prominentes. Además, las ESC expresan SSEA-3, SSEA-4, TRA-1-60, TRA-1-81 y fosfatasa alcalina, pero no SSEA-1. Pueden encontrarse ejemplos de métodos para generar y caracterizar ESC, por ejemplo, en la patente US-7.029.913, la patente US-5.843.780 y la patente US-6.200.806. Los métodos para las hESC en proliferación en la forma indiferenciada se describen en los documentos WO 99/20741, WO 01/51616 y WO 03/020920.
Por “ célula madre germinal embrionaria” (EGSC, por sus siglas en inglés) o “célula germinal embrionaria” o “ célula EG” se entiende una PSC que deriva de células germinales y/o progenitores de células germinales, p. ej., células germinales primordiales, es decir, aquellas que se volverían esperma y óvulos. Se cree que las células germinales embrionarias (células EG) tienen propiedades similares a las células madre embrionarias como se ha descrito anteriormente. Pueden encontrarse ejemplos de métodos para generar y caracterizar células de EG, por ejemplo, en la patente US-7.153.684; Matsui, Y., Y col., (1992) Cell 70:841; Shamblott, M., y col. (2001)Proc. Nati. Acad. Sci. USA 98:113; Shamblott, M., y col. (1998)Proc. Natl. Acad. Sci. USA,95:13726; y Koshimizu, U., y col. (1996)Development,122:1235.
Por “célula madre pluripotente inducida” o “ iPSC” se entiende una PSC que deriva de una célula que no es una PSC (es decir, de una célula que está diferenciada con respecto a una PSC). Las iPSC pueden derivar de múltiples tipos de células diferentes, que incluyen las células diferenciadas terminalmente. Las iPSC tienen una morfología similar a las células ES, que crecen como colonias planas con relaciones nucleocitoplasmáticas grandes, bordes definidos y núcleos prominentes. Además, las iPSC expresan uno o más marcadores clave de pluripotencia conocidos por un experto en la técnica, que incluyen, aunque no de forma limitativa, fosfatasa alcalina, SSEA3, SSEA4, Sox2, Oct3/4, Nanog, TRA160, TRA181, TDGF 1, Dnmt3b, FoxD3, GDF3, Cyp26a1, TERT y zfp42. Pueden encontrarse ejemplos de métodos para generar y caracterizar iPSC en, por ejemplo, las publicaciones de patente de los Estados Unidos n.° US-20090047263, US-20090068742, US-20090191159, US-20090227032, US-20090246875 y US-20090304646. Generalmente, para generar iPSC, las células somáticas se proporcionan con factores de reprogramación (p. ej., Oct4, SOX2, KLF4, MYC, Nanog, Lin28, etc.) conocidos en la técnica para reprogramar las células somáticas para convertirse en células madre pluripotentes.
Por “célula somática” se entiende cualquier célula en un organismo que, en ausencia de manipulación experimental, no da lugar habitualmente a todos los tipos de células en un organismo. En otras palabras, las células somáticas son células que se han diferenciado de manera suficiente de manera que no generan de forma natural células de las tres capas germinales del cuerpo, es decir, ectodermo, mesodermo y endodermo. Por ejemplo, las células somáticas incluirían tanto neuronas como progenitores neurales, éstos últimos pueden ser capaces de dar lugar de forma natural a todos o algunos tipos celulares del sistema nervioso central, pero no pueden dar lugar a células de los linajes del mesodermo o endodermo.
Por “ célula mitótica” se entiende una célula que se somete a mitosis. La mitosis es el proceso por el cual una célula eucariota separa los cromosomas en su núcleo en dos conjuntos idénticos en dos núcleos separados. Generalmente va seguida inmediatamente de citocinesis, que divide los núcleos, el citoplasma, los orgánulos y la membrana celular en dos células que contienen partes aproximadamente iguales de estos componentes celulares.
Por “célula postmitótica” se entiende una célula que ha salido de mitosis, es decir, es “ quiescente” , es decir, ya no experimenta divisiones. Este estado de reposo puede ser temporal, es decir, reversible, o puede ser permanente.
Por “ célula meiótica” se entiende una célula que experimenta meiosis. La meiosis es el proceso mediante el cual una célula divide su material nuclear con el fin de producir gametos o esporas. A diferencia de la mitosis, en la meiosis, los cromosomas experimentan una etapa de recombinación que redistribuye el material genético entre los cromosomas. Además, el resultado de la meiosis es cuatro células haploides (genéticamente únicas), en comparación con las dos células diploides (genéticamente idénticas) producidas a partir de la mitosis.
Por “ recombinación” se entiende un proceso de intercambio de información genética entre dos polinucleótidos. Como se usa en la presente descripción, “ reparación dirigida por homología (HDR) ” se refiere a la forma especializada de reparación de ADN que tiene lugar, por ejemplo, durante la reparación de roturas bicatenarias en células. Este proceso requiere homología de secuencia de nucleótidos, usa una molécula “ donante” para la reparación de moldes de una molécula “ diana” (es decir, la que experimenta la rotura bicatenaria), y conduce a la transferencia de información genética del donante a la diana. La reparación dirigida por homología puede dar como resultado una alteración de la secuencia de la molécula diana (p. ej., inserción, deleción, mutación), si el polinucleótido donante difiere de la molécula diana y parte o la totalidad de la secuencia del polinucleótido donante se incorpora en el ADN diana. En algunas realizaciones, el polinucleótido donante, una porción del polinucleótido donante, una copia del polinucleótido donante o una porción de una copia del polinucleótido donante se integra en el ADN diana.
Por “ unión de extremos no homólogos (NHEJ, por sus siglas en inglés) ” se entiende la reparación de roturas bicatenarias en el ADN mediante ligadura directa de los extremos de rotura entre sí sin la necesidad de un molde homólogo (a diferencia de la reparación dirigida por homología, que requiere una secuencia homóloga para guiar la reparación). La NHEJ frecuentemente da como resultado la pérdida (deleción) de la secuencia de nucleótidos cerca del sitio de la rotura bicatenaria.
Los términos “tratamiento” , “tratar” y similares se usan en la presente descripción generalmente con el significado de obtener un efecto farmacológico y/o fisiológico deseado. El efecto puede ser profiláctico en términos de prevenir total o parcialmente una enfermedad o síntoma de la misma y/o puede ser terapéutico en términos de una cura parcial o completa para una enfermedad y/o efecto adverso atribuible a la enfermedad. “Tratamiento” , como se usa en la presente descripción, cubre cualquier tratamiento de una enfermedad o síntoma en un mamífero, e incluye: (a) prevenir que la enfermedad o síntoma se produzca en un sujeto que puede estar predispuesto a adquirir la enfermedad o síntoma, pero al que aún no se le ha diagnosticado como que la tiene; (b) inhibir la enfermedad o síntoma, es decir, detener su desarrollo; o (c) aliviar la enfermedad, es decir, provocar la regresión de la enfermedad. El agente terapéutico puede administrarse antes, durante o después del inicio de la enfermedad o lesión. El tratamiento de la enfermedad en curso, donde el tratamiento estabiliza o reduce los síntomas clínicos indeseables del paciente, es de particular interés. Dicho tratamiento se realiza deseablemente antes de completar la pérdida de función en los tejidos afectados. La terapia en la que su usa el ARN de localización específica de ADN, el polinucleótido que codifica dicho ARN de localización específica de ADN, el polipéptido Cas9 o el polinucleótido que codifica dicho polipéptido Cas9 se administrará convenientemente durante la etapa sintomática de la enfermedad y, en algunos casos, después de la etapa sintomática de la enfermedad.
Los términos “ individuo” , “ sujeto” , “ hospedador” y “ paciente” se usan indistintamente en la presente descripción y se refieren a cualquier sujeto mamífero para el que se desea diagnóstico, tratamiento o terapia, particularmente seres humanos.
Pueden encontrarse métodos generales en bioquímica molecular y celular en dichos libros de texto estándar comoMolecular Cloning: A Laboratory Manual,3a Ed. (Sambrook y col., HaRBor Laboratory Press 2001);Short Protocols in Molecular Biology,4a Ed. (Ausubel y col., eds., John Wiley & Sons 1999);Protein Methods(Bollag y col., John Wiley & Sons 1996);Nonviral Vectors for Gene Therapy(Wagner y col. eds., Academic Press 1999);Viral Vectors(Kaplift & Loewy eds., Academic Press 1995);Immunology Methods Manual(I. Lefkovits ed., Academic Press 1997); yCell and Tissue Culture: Laboratory Procedures in Biotechnology(Doyle & Griffiths, John Wiley & Sons 1998).
Antes de que se describa de forma adicional la presente invención, debe entenderse que esta invención no se limita a realizaciones particulares descritas, ya que, por supuesto, pueden variar. También debe entenderse que la terminología utilizada en la presente descripción tiene el fin de describir solamente realizaciones particulares, y no pretende ser limitativa, ya que el alcance de la presente invención estará limitado únicamente por las reivindicaciones adjuntas.
Cuando se proporciona un intervalo de valores, se entiende que cada valor intermedio, hasta la décima parte de la unidad del límite inferior, a menos que el contexto indique claramente cualquier otra cosa, entre el límite superior e inferior de ese intervalo y cualquier otro valor indicado o intermedio en ese intervalo indicado, está abarcado por la invención. Los límites superior e inferior de estos intervalos más pequeños pueden incluirse independientemente en los intervalos más pequeños y también están abarcados por la invención, sujeto a cualquier límite específicamente excluido en el intervalo indicado. Cuando el intervalo indicado incluye uno o ambos límites, los intervalos que excluyen cualquiera o ambos de esos límites incluidos también se incluyen en la invención.
En la presente memoria se presentan determinados intervalos con valores numéricos antecedidos por el término “ aproximadamente” . El término “ aproximadamente” se usa en la presente descripción para proporcionar respaldo literal para el número exacto que antecede, así como un número que está cerca o es aproximadamente el número que el término antecede. Al determinar si un número está cerca o es aproximadamente un número específicamente mencionado, el número no mencionado cercano o aproximado puede ser un número que, en el contexto en el que se presenta, proporciona el equivalente sustancial del número mencionado específicamente.
A menos que se defina de cualquier otra manera, todos los términos técnicos y científicos utilizados en la presente descripción tienen el mismo significado que entiende habitualmente un experto en la técnica a la que pertenece esta invención. Aunque cualquier método y material similar o equivalente a los descritos en la presente descripción también puede usarse en la práctica o ensayo de la presente invención, ahora se describen los métodos y materiales preferidos.
La mención de cualquier publicación es para su descripción antes de la fecha de presentación y no debe interpretarse como una admisión de que la presente invención no tiene derecho a anteceder dicha publicación en virtud de la invención anterior. Además, las fechas de publicación proporcionadas pueden ser diferentes de las fechas de publicación reales que pueden necesitar ser confirmadas independientemente.
Se observa que, como se usa en la presente descripción y en las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares “ un” , “ una” y “ el/la” incluyen referentes en plural a menos que el contexto indique claramente cualquier otra cosa. Por lo tanto, por ejemplo, la referencia a “ un polinucleótido” incluye una pluralidad de dichos polinucleótidos y la referencia a “ el polipéptido” incluye la referencia a uno o más polipéptidos y equivalentes de los mismos conocidos por los expertos en la técnica, y así sucesivamente. Se observa además que las reivindicaciones pueden redactarse para excluir cualquier elemento opcional. Como tal, esta declaración pretende servir como base antecedente para el uso de terminología exclusiva como “ únicamente” , “ solamente” y similares en relación con la mención de elementos de reivindicación, o el uso de una limitación “ negativa” .
Se aprecia que determinadas características de la invención, que, para mayor claridad, se describen en el contexto de realizaciones separadas, también pueden proporcionarse en combinación en una única realización. Por el contrario, diversas características de la invención, que, por brevedad, se describen en el contexto de una única realización, también pueden proporcionarse por separado o en cualquier subcombinación adecuada. Todas las combinaciones de las realizaciones que pertenecen a la invención se incluyen específicamente por la presente invención y se describen en la presente descripción como si cada una de las combinaciones se describiese individual y explícitamente. Además, todas las subcombinaciones de las diversas realizaciones y elementos de las mismas también se incluyen específicamente en la presente invención y se describen en la presente descripción como si cada una de dichas subcombinaciones se describiese individual y explícitamente en la presente descripción.
Las publicaciones analizadas en la presente descripción se proporcionan únicamente para su descripción antes de la fecha de presentación de la presente solicitud. Nada en la presente descripción debe interpretarse como una admisión de que la presente invención no tiene derecho a anteceder dicha publicación en virtud de la invención anterior. Además, las fechas de publicación proporcionadas pueden ser diferentes de las fechas de publicación reales que pueden necesitar ser confirmadas independientemente.
Descripción detallada - parte I
La presente descripción proporciona un ARN de localización específica de ADN para el uso que comprende una secuencia de localización específica y, junto con un polipéptido modificador, proporciona una modificación específica de sitio de un ADN diana y/o un polipéptido asociado al ADN diana. La presente descripción proporciona además polipéptidos modificadores específicos de sitio para su uso. La presente descripción proporciona además métodos de modificación específica de sitio de un ADN diana. También se proporcionan composiciones para realizar los métodos.
Ácidos nucleicos
ARN de localización específica de ADN
La presente descripción proporciona un ARN de localización específica de ADN para su el uso que dirige las actividades de un polipéptido asociado (p. ej., un polipéptido modificador dirigido al sitio) a una secuencia diana específica dentro de un ADN diana. Un ARN de localización específica de ADN en cuestión comprende: un primer segmento (también denominado en la presente descripción “ segmento de localización específica de ADN” o una “ secuencia de localización específica de ADN” ) y un segundo segmento (también denominado en la presente descripción “ segmento de unión a proteínas” o una “ secuencia de unión a proteínas” ).
Segmento de localización específica de ADN de un ARN de localización específica de ADN
El segmento de localización específica de ADN de un ARN de localización específica de ADN en cuestión para el uso comprende una secuencia de nucleótidos que es complementaria a una secuencia en un ADN diana. En otras palabras, el segmento de localización específica de ADN de un ARN de localización específica de ADN en cuestión interactúa con un ADN diana de una manera específica de secuencia a través de hibridación (es decir, emparejamiento de bases). Como tal, la secuencia de nucleótidos del segmento de localización específica de ADN puede variar y determina la ubicación dentro del ADN diana donde interactuará el ARN de localización específica de ADN y el ADN diana. El segmento de localización específica de ADN de un ARN de localización específica de ADN en cuestión puede modificarse (p. ej., mediante ingeniería genética) para hibridarse con cualquier secuencia deseada dentro de un ADN diana.
El segmento de localización específica de ADN puede tener una longitud de aproximadamente 12 nucleótidos a aproximadamente 100 nucleótidos. Por ejemplo, el segmento de localización específica de ADN puede tener una longitud de aproximadamente 12 nucleótidos (nt) a aproximadamente 80 nt, de aproximadamente 12 nt a aproximadamente 50 nt, de aproximadamente 12 nt a aproximadamente 40 nt, de aproximadamente 12 nt a aproximadamente 30 nt, de aproximadamente 12 nt a aproximadamente 25 nt, de aproximadamente 12 nt a aproximadamente 20 nt o de aproximadamente 12 nt a aproximadamente 19 nt. Por ejemplo, el segmento de localización específica de ADN puede tener una longitud de aproximadamente 19 nt a aproximadamente 20 nt, de aproximadamente 19 nt a aproximadamente 25 nt, de aproximadamente 19 nt a aproximadamente 30 nt, de aproximadamente 19 nt a aproximadamente 35 nt, de aproximadamente 19 nt a aproximadamente 40 nt, de aproximadamente 19 nt a aproximadamente 45 nt, de aproximadamente 19 nt a aproximadamente 50 nt, de aproximadamente 19 nt a aproximadamente 60 nt, de aproximadamente 19 nt a aproximadamente 70 nt, de aproximadamente 19 nt a aproximadamente 80 nt, de aproximadamente 19 nt a aproximadamente 90 nt, de aproximadamente 19 nt a aproximadamente 100 nt, de aproximadamente 20 nt a aproximadamente 25 nt, de aproximadamente 20 nt a aproximadamente 30 nt, de aproximadamente 20 nt a aproximadamente 35 nt, de aproximadamente 20 nt a aproximadamente 40 nt, de aproximadamente 20 nt a aproximadamente 45 nt, de aproximadamente 20 nt a aproximadamente 50 nt, de aproximadamente 20 nt a aproximadamente 60 nt, de aproximadamente 20 nt a aproximadamente 70 nt, de aproximadamente 20 nt a aproximadamente 80 nt, de aproximadamente 20 nt a aproximadamente 90 nt, de aproximadamente 20 nt a aproximadamente 100 nt. La secuencia de nucleótidos (la secuencia de localización específica de ADN) del segmento de localización específica de ADN que es complementaria a una secuencia de nucleótidos (secuencia diana) del ADN diana puede tener una longitud de al menos aproximadamente 12 nt. Por ejemplo, la secuencia de localización específica de ADN del segmento de localización específica de ADN que es complementaria a una secuencia diana del ADN diana puede tener una longitud de al menos aproximadamente 12 nt, al menos aproximadamente 15 nt, al menos aproximadamente 18 nt, al menos aproximadamente 19 nt, al menos aproximadamente 20 nt, al menos aproximadamente 25 nt, al menos aproximadamente 30 nt, al menos aproximadamente 35 nt o al menos aproximadamente 40 nt. Por ejemplo, la secuencia de localización específica de ADN del segmento de localización específica de ADN que es complementaria a una secuencia diana del ADN diana puede tener una longitud de aproximadamente 12 nucleótidos (nt) a aproximadamente 80 nt, de aproximadamente 12 nt a aproximadamente 50 nt, de aproximadamente 12 nt a aproximadamente 45 nt, de aproximadamente 12 nt a aproximadamente 40 nt, de aproximadamente 12 nt a aproximadamente 35 nt, de aproximadamente 12 nt a aproximadamente 30 nt, de aproximadamente 12 nt a aproximadamente 25 nt, de aproximadamente 12 nt a aproximadamente 20 nt, de aproximadamente 12 nt a aproximadamente 19 nt, de aproximadamente 19 nt a aproximadamente 20 nt, de aproximadamente 19 nt a aproximadamente 25 nt, de aproximadamente 19 nt a aproximadamente 30 nt, de aproximadamente 19 nt a aproximadamente 35 nt, de aproximadamente 19 nt a aproximadamente 40 nt, de aproximadamente 19 nt a aproximadamente 45 nt, de aproximadamente 19 nt a aproximadamente 50 nt, de aproximadamente 19 nt a aproximadamente 60 nt, de aproximadamente 20 nt a aproximadamente 25 nt, de aproximadamente 20 nt a aproximadamente 30 nt, de aproximadamente 20 nt a aproximadamente 35 nt, de aproximadamente 20 nt a aproximadamente 40 nt, de aproximadamente 20 nt a aproximadamente 45 nt, de aproximadamente 20 nt a aproximadamente 50 nt o de aproximadamente 20 nt a aproximadamente 60 nt. La secuencia de nucleótidos (la secuencia de localización específica de ADN) del segmento de localización específica de ADN que es complementaria a una secuencia de nucleótidos (secuencia diana) del ADN diana puede tener una longitud de al menos aproximadamente 12 nt.
En algunos casos, la secuencia de localización específica de ADN del segmento de localización específica de ADN que es complementaria a una secuencia diana del ADN diana tiene 20 nucleótidos de longitud. En algunos casos, la secuencia de localización específica de ADN del segmento de localización específica de ADN que es complementaria a una secuencia diana del ADN diana tiene 19 nucleótidos de longitud.
El porcentaje de complementariedad entre la secuencia de localización específica de ADN del segmento de localización específica de ADN y la secuencia diana del ADN diana puede ser al menos de al menos el 60 % (p. ej., al menos el 65 %, al menos el 70 %, al menos el 75 %, al menos el 80 %, al menos el 85 %, al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 97 %, al menos el 98 %, al menos el 99 % o el 100 %). En algunos casos, el porcentaje de complementariedad entre la secuencia de localización específica de ADN del segmento de localización específica de ADN y la secuencia diana del ADN diana es del 100 % sobre los siete nucleótidos más 5' contiguos de la secuencia diana de la cadena complementaria del ADN diana. En algunos casos, el porcentaje de complementariedad entre la secuencia de localización específica de ADN del segmento de localización específica de ADN y la secuencia diana del ADN diana es al menos el 60 % sobre aproximadamente 20 nucleótidos contiguos. En algunos casos, el porcentaje de complementariedad entre la secuencia de localización específica de ADN del segmento de localización específica de ADN y la secuencia diana del ADN diana es del 100 % sobre los catorce nucleótidos más 5' contiguos de la secuencia diana de la cadena complementaria del ADN diana y tan bajo como del 0 % en el resto. En un caso de este tipo, la secuencia de localización específica de ADN puede considerarse como de 14 nucleótidos de longitud (véase la Figura 12D-E). En algunos casos, el porcentaje de complementariedad entre la secuencia de localización específica de ADN del segmento de localización específica de ADN y la secuencia diana del ADN diana es del 100 % sobre los siete nucleótidos más 5' contiguos de la secuencia diana de la cadena complementaria del ADN diana y tan bajo como del 0 % en el resto. En un caso de este tipo, la secuencia de localización específica de ADN puede considerarse como de 7 nucleótidos de longitud.
Segmento de unión a proteínas de un ARN de localización específica de ADN
El segmento de unión a proteínas de un ARN de localización específica de ADN en cuestión para el uso interactúa con un polipéptido modificador dirigido al sitio. El ARN de localización específica de ADN en cuestión guía el polipéptido unido a una secuencia de nucleótidos específica dentro del ADN diana a través del segmento de localización específica de ADN mencionado anteriormente. El segmento de unión a proteínas de un ARN de localización específica de ADN en cuestión comprende dos tramos de nucleótidos que son complementarios entre sí. Los nucleótidos complementarios del segmento de unión a proteínas se hibridan para formar un dúplex de ARN bicatenario (ARNbc) (véanse las Figuras 1A y 1B).
Un ARN de localización específica de ADN de molécula doble en cuestión para el uso comprende dos moléculas de ARN separadas. Cada una de las dos moléculas de ARN de un ARN de localización específica de ADN de molécula doble en cuestión comprende un tramo de nucleótidos que son complementarios entre sí de manera que los nucleótidos complementarios de las dos moléculas de ARN se hibridan para formar el dúplex de ARN bicatenario del segmento de unión a proteínas (Figura 1A).
En algunas realizaciones, el segmento formador de dúplex del ARN activador es al menos aproximadamente el 60 % idéntico a una de las moléculas de ARN activador (ARNcrtra) expuestas en las Id. de sec. n.° 431-562, o un complemento de las mismas, sobre un tramo de al menos 8 nucleótidos contiguos. Por ejemplo, el segmento formador de dúplex del ARN activador (o el ADN que codifica el segmento formador de dúplex del ARN activador) es al menos aproximadamente el 60 % idéntico, al menos aproximadamente el 65 % idéntico, al menos aproximadamente el 70 % idéntico, al menos aproximadamente el 75 % idéntico, al menos aproximadamente el 80 % idéntico, al menos aproximadamente el 85 % idéntico, al menos aproximadamente el 90 % idéntico, al menos aproximadamente el 95 % idéntico, al menos aproximadamente el 98 % idéntico, al menos aproximadamente el 99 % idéntico o el 100 % idéntico, a una de las secuencias de ARNcrtra expuestas en las Id. de sec. n.° 431-562, o un complemento de las mismas, sobre un tramo de al menos 8 nucleótidos contiguos.
En algunas realizaciones, el segmento formador de dúplex del ARN localizador específico es al menos aproximadamente el 60 % idéntico a una de las secuencias de ARN localizador específico (ARNcr) expuestas en las Id. de sec. n.° 563-679, o un complemento de las mismas, sobre un tramo de al menos 8 nucleótidos contiguos. Por ejemplo, el segmento formador de dúplex del ARN localizador específico (o el ADN que codifica el segmento formador de dúplex del ARN localizador específico) es al menos aproximadamente el 65 % idéntico, al menos aproximadamente el 70 % idéntico, al menos aproximadamente el 75 % idéntico, al menos aproximadamente el 80 % idéntico, al menos aproximadamente el 85 % idéntico, al menos aproximadamente el 90 % idéntico, al menos aproximadamente el 95%idéntico, al menos aproximadamente el 98%idéntico, al menos aproximadamente el 99 % idéntico o el 100 % idéntico a una de las secuencias de ARNcr expuestas en las Id. de sec. n.° 563-679, o un complemento de las mismas, sobre un tramo de al menos 8 nucleótidos contiguos.
Un ARN de localización específica de ADN de dos moléculas puede diseñarse para permitir la unión controlada (es decir, condicional) de un ARN localizador específico con un ARN activador. Debido a que un ARN de localización específica de ADN de dos moléculas no es funcional a menos que tanto el ARN activador como el ARN localizador específico estén unidos en un complejo funcional con dCas9, un ARN de localización específica de ADN de dos moléculas puede ser inducible (p. ej., inducible por fármacos) haciendo que la unión entre el ARN activador y el ARN localizador específico sea inducible. Como ejemplo no limitativo, pueden usarse aptámeros de ARN para regular (es decir, controlar) la unión del ARN activador con el ARN localizador específico. En consecuencia, el ARN activador y/o el ARN localizador específico pueden comprender una secuencia de aptámero de ARN.
Los aptámeros de ARN son conocidos en la técnica y son generalmente una versión sintética de un ribointerruptor. Las expresiones “aptámero de ARN” y “ ribointerruptor” se usan indistintamente en la presente descripción para abarcar secuencias de ácido nucleico tanto sintéticas como naturales que proporcionan la regulación inducible de la estructura (y por lo tanto la disponibilidad de secuencias específicas) de la molécula de ARN de la que son parte. Los aptámeros de ARN generalmente comprenden una secuencia que se pliega en una estructura particular (p. ej., una horquilla), que se une específicamente a un fármaco particular (p. ej., una molécula pequeña). La unión del fármaco provoca un cambio estructural en el plegamiento del ARN, que cambia una característica del ácido nucleico del cual el aptámero es una parte. Como ejemplos no limitativos: (i) un ARN activador con un aptámero puede no ser capaz para unirse al ARN localizador específico afín a menos que el aptámero esté unido por el fármaco adecuado; (ii) un ARN localizador específico con un aptámero puede no ser capaz para unirse al ARN activador afín a menos que el aptámero esté unido por el fármaco adecuado; y (iii) un ARN localizador específico y un ARN activador, cada uno de los cuales comprende un aptámero diferente que se une a un fármaco diferente, puede no ser capaz de unirse entre sí a menos que ambos fármacos estén presentes. Como se ilustra por estos ejemplos, puede diseñarse un ARN de localización específica de ADN de dos moléculas para que sea inducible.
Pueden encontrarse ejemplos de aptámeros y ribointerruptores, por ejemplo, en: Nakamura y col., GenesCells.Mayo de 2012;17(5):344-64; Vavalina y col.,Future Cardiol.Mayo de 2012;8(3):371-82; Citartan y col.,Biosens Bioelectron.
15 de abril de 2012;34(1):1-11; y Liberman y col.,Wiley Interdisp Rev RNA.Mayo-Junio de 2012;3(3):369-84.
Los ejemplos no limitativos de secuencias de nucleótidos que pueden incluirse en un ARN de localización específica de ADN de dos moléculas incluyen cualquiera de las secuencias expuestas en las Id. de sec. n.° 431-562, o complementos de las mismas que se emparejan con cualquier secuencia expuesta en las Id. de sec. n.° 563-679, o complementos de las mismas que pueden hibridarse para formar un segmento de unión a proteínas.
Un ARN de localización específica de ADN de molécula única en cuestión para el uso comprende dos tramos de nucleótidos (un ARN localizador específico y un ARN activador) que son complementarios entre sí, están unidos covalentemente por nucleótidos intermedios (“enlazadores” o “ nucleótidos enlazadores” ) y se hibridan para formar el dúplex de ARN bicatenario (dúplex de ARNbc) del segmento de unión a proteínas, dando como resultado una estructura de tallo-bucle (Figura 1B). El ARN localizador específico y el ARN activador pueden unirse covalentemente a través del extremo 3' del ARN localizador específico y el extremo 5' del ARN activador. Alternativamente, el ARN localizador específico y el ARN activador pueden unirse covalentemente a través del extremo 5' del ARN localizador específico y el extremo 3' del ARN activador.
El enlazador de un ARN de localización específica de ADN de molécula única puede tener una longitud de aproximadamente 3 nucleótidos a aproximadamente 100 nucleótidos. Por ejemplo, el enlazador puede tener una longitud de aproximadamente 3 nucleótidos (nt) a aproximadamente 90 nt, de aproximadamente 3 nucleótidos (nt) a aproximadamente 80 nt, de aproximadamente 3 nucleótidos (nt) a aproximadamente 70 nt, de aproximadamente 3 nucleótidos (nt) a aproximadamente 60 nt, de aproximadamente 3 nucleótidos (nt) a aproximadamente 50 nt, de aproximadamente 3 nucleótidos (nt) a aproximadamente 40 nt, de aproximadamente 3 nucleótidos (nt) a aproximadamente 30 nt, de aproximadamente 3 nucleótidos (nt) a aproximadamente 20 nt o de aproximadamente 3 nucleótidos (nt) a aproximadamente 10 nt. Por ejemplo, el enlazador puede tener una longitud de aproximadamente 3 nt a aproximadamente 5 nt, de aproximadamente 5 nt a aproximadamente 10 nt, de aproximadamente 10 nt a aproximadamente 15 nt, de aproximadamente 15 nt a aproximadamente 20 nt, de aproximadamente 20 nt a aproximadamente 25 nt, de aproximadamente 25 nt a aproximadamente 30 nt, de aproximadamente 30 nt a aproximadamente 35 nt, de aproximadamente 35 nt a aproximadamente 40 nt, de aproximadamente 40 nt a aproximadamente 50 nt, de aproximadamente 50 nt a aproximadamente 60 nt, de aproximadamente 60 nt a aproximadamente 70 nt, de aproximadamente 70 nt a aproximadamente 80 nt, de aproximadamente 80 nt a aproximadamente 90 nt o de aproximadamente 90 nt a aproximadamente 100 nt. En algunas realizaciones, el enlazador de un ARN de localización específica de ADN de molécula única tiene 4 nt.
Un ARN de localización específica de ADN de molécula única ilustrativo comprende dos tramos complementarios de nucleótidos que se hibridan para formar un dúplex de ARNbc. En algunas realizaciones, uno de los dos tramos complementarios de nucleótidos del ARN de localización específica de ADN de molécula única (o el ADN que codifica el tramo) es al menos aproximadamente el 60 % idéntico a una de las moléculas de ARN activador (ARNcrtra) expuestas en las Id. de sec. n.° 431-562, o un complemento de las mismas, sobre un tramo de al menos 8 nucleótidos contiguos. Por ejemplo, uno de los dos tramos complementarios de nucleótidos del ARN de localización específica de ADN de molécula única (o el ADN que codifica el tramo) es al menos aproximadamente el 65 % idéntico, al menos aproximadamente el 70 % idéntico, al menos aproximadamente el 75 % idéntico, al menos aproximadamente el 80 % idéntico, al menos aproximadamente el 85 % idéntico, al menos aproximadamente el 90 % idéntico, al menos aproximadamente el 95 % idéntico, al menos aproximadamente el 98 % idéntico, al menos aproximadamente el 99 % idéntico o el 100 % idéntico a una de las secuencias de ARNcrtra expuestas en las Id. de sec. n.° 431-562, o un complemento de las mismas, sobre un tramo de al menos 8 nucleótidos contiguos.
En algunas realizaciones, uno de los dos tramos complementarios de nucleótidos del ARN de localización específica de ADN de molécula única (o el ADN que codifica el tramo) es al menos aproximadamente el 60 % idéntico a una de las secuencias de ARN localizador específico (ARNcr) expuestas en las Id. de sec. n.° 563-679, o un complemento de las mismas, sobre un tramo de al menos 8 nucleótidos contiguos. Por ejemplo, uno de los dos tramos complementarios de nucleótidos del ARN de localización específica de ADN de molécula única (o el ADN que codifica el tramo) es al menos aproximadamente el 65 % idéntico, al menos aproximadamente el 70 % idéntico, al menos aproximadamente el 75 % idéntico, al menos aproximadamente el 80 % idéntico, al menos aproximadamente el 85 % idéntico, al menos aproximadamente el 90 % idéntico, al menos aproximadamente el 95 % idéntico, al menos aproximadamente el 98 % idéntico, al menos aproximadamente el 99 % idéntico o el 100 % idéntico a una de las secuencias de ARNcr expuestas en las Id. de sec. n.° 563-679, o un complemento de las mismas, sobre un tramo de al menos 8 nucleótidos contiguos.
Los pares afines adecuados de ARNcr y ARNcrtra de origen natural pueden determinarse rutinariamente para las Id. de sec. n.° 431-679 teniendo en cuenta el nombre de especie y el emparejamiento de bases (para el dúplex de ARNbc del dominio de unión a proteínas) cuando se determinan pares afines adecuados (véase la Figura 8 como ejemplo no limitativo).
Con respecto tanto a un ARN de localización específica de ADN de molécula única en cuestión como a un ARN de localización específica de ADN de molécula doble en cuestión para el uso, la Figura 57 demuestra que secuencias artificiales que comparten muy poca (aproximadamente el 50 % de identidad) con ARNcrtra y ARNcr de origen natural pueden actuar con Cas9 para escindir el ADN diana siempre que la estructura del dominio de unión a proteínas del ARN de localización específica de ADN esté conservada. Por lo tanto, la estructura de plegamiento de ARN de un dominio de unión a proteínas de origen natural de un ARN de localización específica de ADN puede tenerse en cuenta con el fin de diseñar dominios de unión a proteínas artificiales (versiones de dos moléculas o de molécula única). Como ejemplo no limitativo, el ARN de localización específica de ADN artificial funcional de la Figura 57 se diseñó basándose en la estructura del segmento de unión a proteínas del ARN de localización específica de ADN de origen natural (p. ej., que incluye el mismo número de pares de bases a lo largo del dúplex de ARN e incluye la misma región “ abultada” que está presente en el ARN de origen natural). Como las estructuras pueden ser producidas fácilmente por un experto en la técnica para cualquier par de ARNcr:ARNcrtra de origen natural de cualquier especie (véanse las Id. de sec. n.° 431-679 para consultar secuencias de ARNcr y ARNcrtra de una amplia diversidad de especies), puede diseñarse un ARN de localización específica de ADN artificial para imitar la estructura natural para una especie dada cuando se usa la Cas9 (o una Cas9 relacionada, véase la Figura 32A) de esa especie. (véase la Figura 24D y detalles relacionados en el Ejemplo 1). Por lo tanto, un ARN de localización específica de ADN adecuado puede ser un ARN diseñado artificialmente (de origen no natural) que comprende un dominio de unión a proteínas que se diseñó para imitar la estructura de un dominio de unión a proteínas de un ARN de localización específica de ADN de origen natural. (véanse las Id. de sec. n.° 431-679, teniendo en cuenta el nombre de la especie cuando se determinan pares afines adecuados).
El segmento de unión a proteínas puede tener una longitud de aproximadamente 10 nucleótidos a aproximadamente 100 nucleótidos. Por ejemplo, el segmento de unión a proteínas puede tener una longitud de aproximadamente 15 nucleótidos (nt) a aproximadamente 80 nt, de aproximadamente 15 nt a aproximadamente 50 nt, de aproximadamente 15 nt a aproximadamente 40 nt, de aproximadamente 15 nt a aproximadamente 30 nt o de aproximadamente 15 nt a aproximadamente 25 nt.
También con respecto a un ARN de localización específica de ADN de molécula única en cuestión para el uso y a un ARN de localización específica de ADN de molécula doble en cuestión para el uso, el dúplex de ARNbc del segmento de unión a proteínas puede tener una longitud de aproximadamente 6 pares de bases (pb) a aproximadamente 50 pb. Por ejemplo, el dúplex de ARNbc del segmento de unión a proteínas puede tener una longitud de aproximadamente 6 pb a aproximadamente 40 pb, de aproximadamente 6 pb a aproximadamente 30 pb, de aproximadamente 6 pb a aproximadamente 25 pb, de aproximadamente 6 pb a aproximadamente 20 pb, de aproximadamente 6 pb a aproximadamente 15 pb, de aproximadamente 8 pb a aproximadamente 40 pb, de aproximadamente 8 pb a aproximadamente 30 pb, de aproximadamente 8 pb a aproximadamente 25 pb, de aproximadamente 8 pb a aproximadamente 20 pb o de aproximadamente 8 pb a aproximadamente 15 pb. Por ejemplo, el dúplex de ARNbc del segmento de unión a proteínas puede tener una longitud de aproximadamente 8 pb a aproximadamente 10 pb, de aproximadamente 10 pb a aproximadamente 15 pb, de aproximadamente 15 pb a aproximadamente 18 pb, de aproximadamente 18 pb a aproximadamente 20 pb, de aproximadamente 20 pb a aproximadamente 25 pb, de aproximadamente 25 pb a aproximadamente 30 pb, de aproximadamente 30 pb a aproximadamente 35 pb, de aproximadamente 35 pb a aproximadamente 40 pb o de aproximadamente 40 pb a aproximadamente 50 pb. En algunas realizaciones, el dúplex de ARNbc del segmento de unión a proteínas tiene una longitud de 36 pares de bases. El porcentaje de complementariedad entre las secuencias de nucleótidos que se hibridan para formar el dúplex de ARNbc del segmento de unión a proteínas puede ser de al menos aproximadamente el 60 %. Por ejemplo, el porcentaje de complementariedad entre las secuencias de nucleótidos que se hibridan para formar el dúplex de ARNbc del segmento de unión a proteínas puede ser de al menos aproximadamente el 65 %, al menos aproximadamente el 70 %, al menos aproximadamente el 75 %, al menos aproximadamente el 80 %, al menos aproximadamente el 85 %, al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 95 %, al menos aproximadamente el 98 % o al menos aproximadamente el 99 %. En algunos casos, el porcentaje de complementariedad entre las secuencias de nucleótidos que se hibridan para formar el dúplex de ARNbc del segmento de unión a proteínas es del 100 %.
Polipéptido modificador dirigido al sitio
Un ARN de localización específica de ADN en cuestión para el uso y un polipéptido modificador dirigido al sitio en cuestión para el uso forman un complejo. El ARN de localización específica de ADN proporciona una especificidad diana al complejo al comprender una secuencia de nucleótidos que es complementaria a una secuencia de un ADN diana (como se ha indicado anteriormente). El polipéptido modificador dirigido al sitio del complejo proporciona la actividad específica de sitio. En otras palabras, el polipéptido modificador dirigido al sitio es guiado a una secuencia de ADN (p. ej., una secuencia cromosómica o una secuencia extracromosómica, p. ej., una secuencia episómica, una secuencia de minicírculo, una secuencia mitocondrial, una secuencia del cloroplasto, etc.) en virtud de su asociación con al menos el segmento de unión a proteínas del ARN de localización específica de ADN (descrito anteriormente).
Un polipéptido modificador dirigido al sitio en cuestión para el uso modifica el ADN diana (p. ej., escisión). Un polipéptido modificador dirigido al sitio también se denomina en la presente descripción un “ polipéptido dirigido al sitio” o un “ polipéptido modificador dirigido al sitio de unión a ARN”
En algunos casos, el polipéptido modificador dirigido al sitio es un polipéptido modificador de origen natural. En otros casos, el polipéptido modificador dirigido al sitio no es un polipéptido de origen natural (p. ej., un polipéptido de origen natural que se modifica, p. ej., mutación, deleción, inserción).
Se exponen polipéptidos modificadores dirigidos al sitio de origen natural ilustrativos en las Id. de sec. n.° 1-255 como una lista no limitativa y no exhaustiva de endonucleasas Cas9/Csn1 de origen natural. Estos polipéptidos de origen natural, como se describe en la presente descripción, se unen a un ARN de localización específica de ADN, por lo tanto se dirigen a una secuencia específica dentro de un ADN diana y escinden el ADN diana para generar una rotura bicatenaria. Un polipéptido modificador dirigido al sitio en cuestión para el uso comprende dos porciones, una porción de unión a ARN y una porción de actividad. En algunas realizaciones, un polipéptido modificador dirigido al sitio en cuestión comprende: (i) una porción de unión a ARN que interactúa con un ARN de localización específica de ADN, en donde el ARN de localización específica de ADN comprende una secuencia de nucleótidos que es complementaria a una secuencia en un ADN diana; y (ii) una porción de actividad que presenta actividad enzimática dirigida al sitio (p. ej., actividad para la metilación de ADN, actividad para la escisión de ADN, actividad para la acetilación de histonas, actividad para la metilación de histonas, etc.), en donde el sitio de actividad enzimática está determinado por el ARN de localización específica de ADN.
En algunos casos, un polipéptido modificador dirigido al sitio en cuestión para el uso tiene una actividad enzimática que modifica el ADN diana por actividad nucleasa.
Polipéptidos modificadores dirigidos al sitio ilustrativos
En algunos casos, el polipéptido modificador dirigido al sitio comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente el 75 %, al menos aproximadamente el 80 %, al menos aproximadamente el 85 %, al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 95 %, al menos aproximadamente el 99 % o el 100 % de identidad de secuencia de aminoácidos con los aminoácidos con los aminoácidos 7-166 o 731-1003 de la secuencia de aminoácidos de Cas9/Csn1 representada en la Figura 3, o con las porciones correspondientes en cualquiera de las secuencias de aminoácidos expuestas como Id. de sec. n.° 1-256 y 795-1346.
Modificaciones de ácido nucleico
En algunas realizaciones, un ARN de localización específica de ADN en cuestión para el uso comprende una o más modificaciones, p. ej., una modificación de bases, una modificación de la cadena principal, etc., para proporcionar el ácido nucleico con una característica nueva o potenciada (p. ej., estabilidad mejorada). Como se sabe en la técnica, un nucleósido es una combinación de base-azúcar. La porción de base del nucleósido es normalmente una base heterocíclica. Las dos clases más comunes de dichas bases heterocíclicas son las purinas y las pirimidinas. Los nucleótidos son nucleósidos que incluyen además un grupo fosfato unido covalentemente a la porción de azúcar del nucleósido. Para aquellos nucleósidos que incluyen un azúcar pentofuranosilo, el grupo fosfato se puede unir al resto hidroxilo 2', 3' o 5' del azúcar. En la formación de oligonucleótidos, los grupos fosfato unen covalentemente los nucleósidos adyacentes entre sí para formar un compuesto polimérico lineal. A su vez, los extremos respectivos de este compuesto polimérico lineal pueden unirse adicionalmente para formar un compuesto circular, sin embargo, los compuestos lineales son generalmente adecuados. Además, los compuestos lineales pueden tener una complementariedad interna de bases de nucleótidos y, por lo tanto, pueden plegarse de manera que produzcan un compuesto total o parcialmente bicatenario. Dentro de los oligonucleótidos, los grupos fosfato se denominan habitualmente como la formación de la cadena principal internucleosídica del oligonucleótido. El enlace o cadena principal normal de ARN y ADN es un enlace fosfodiéster 3' a 5'.
Cadenas principales modificadas y enlaces internucleosídicos modificados
Los ejemplos de ARN de localización específica de ADN adecuados que contienen modificaciones incluyen ARN de localización específica de ADN que contienen cadenas principales modificadas o enlaces internucleósidos no naturales. Los ARN de localización específica de ADN que tienen cadenas principales modificadas incluyen aquellos que conservan un átomo de fósforo en la cadena principal y aquellos que no tienen un átomo de fósforo en la cadena principal.
Las cadenas principales oligonucleotídicas modificadas adecuadas que contienen un átomo de fósforo en la misma incluyen, por ejemplo, fosforotioatos, fosforotioatos quirales, fosforoditioatos, fosfotriésteres, aminoalquilfosfotriésteres, fosfonatos de metil y otros alquilos que incluyen fosfonatos de 3'-alquileno, fosfonatos de 5'-alquileno y fosfonatos quirales, fosfinatos, fosforamidatos que incluyen 3'-amino fosforamidato y aminoalquilfosforamidatos, fosforodiamidatos, tionfosforamidatos, tionoalquilfosfonatos, tionoalquilfosfotriésteres, selenofosfatos y boranofosfatos que tienen enlaces 3'-5'normales, análogos unidos a 2'-5' de estos, y aquellos que tienen polaridad invertida en donde uno o más enlaces internucleotídicos es un enlace 3' a 3', 5' a 5' o 2' a 2'. Los ARN de localización específica de ADN adecuados que tienen polaridad invertida comprenden un único enlace 3' a 3' en el enlace internucleotídico más 3', es decir, un único residuo de nucleósido invertido que puede ser básico (la nucleobase falta o tiene un grupo hidroxilo en lugar de la misma). También se incluyen diversas sales (tales como, por ejemplo, potasio o sodio), sales mixtas y formas de ácido libre.
En algunas realizaciones, un ARN de localización específica de ADN en cuestión para el uso comprende uno O más enlaces internucleosídicos de fosforotioato y/o heteroátomo, en particular -CH<2>-NH-O-CH<2>-, CH2-N(CH3)-O-CH<2>- (conocido como metileno (metilimino) o cadena principal de MMI), -CH2-O-N(CH3)-CH2-, -CH2-N(CH3)-N(CH3)-CH<2>- y -O-N(CH3)-CH2-CH2- (en donde el enlace internucleotídico de fosfodiéster nativo se representa como -O-P(=O)(OH)-O-CH<2>-). Se describen enlaces internucleosídicos de tipo MMI en la patente US-5.489.677. Se describen enlaces internucleosídicos de amida adecuados en la patente US-5.602.240.
También son adecuados ARN de localización específica de ADN que tienen estructuras de cadena principal de morfolino como se describen, p. ej., en la patente US-5.034.506. Por ejemplo, en algunas realizaciones, un ARN de localización específica de ADN en cuestión comprende un anillo de morfolino de 6 miembros en lugar de un anillo de ribosa. En algunas de estas realizaciones, un fosforodiamidato u otro enlace internucleosídico no fosfodiéster reemplaza un enlace fosfodiéster.
Las cadenas principales de polinucleótidos modificados adecuados que no incluyen un átomo de fósforo en los mismos tienen cadenas principales que están formadas por enlaces internucleosídicos de alquilo o cicloalquilo de cadena corta, enlaces internucleosídicos mixtos de heteroátomo y alquilo o cicloalquilo, o uno o más enlaces internucleosídicos heteroatómicos o heterocíclicos de cadena corta. Estos incluyen aquellos que tienen enlaces morfolino (formados en parte de la porción de azúcar de un nucleósido); cadenas principales de siloxano; cadenas principales de sulfuro, sulfóxido y sulfona; cadenas principales de formacetilo y tioformacetilo; cadenas principales de metileno formacetilo y tioformacetilo; cadenas principales de riboacetilo; cadenas principales que contienen alqueno; cadenas principales de sulfamato; cadenas principales de metilenimino y metilenhidrazino; cadenas principales de sulfonato y sulfonamida; cadenas principales de amida; y otros que tienen partes componentes mixtas de N, O, S y CH<2>.
Miméticos
Un ARN de localización específica de ADN en cuestión puede ser un mimético de ácido nucleico. El término “ mimético” como se aplica a los polinucleótidos tiene por objeto incluir polinucleótidos en donde solamente el anillo de furanosa o tanto el anillo de furanosa como el enlace internucleotídico se reemplazan con grupos no furanosos, el reemplazo de solamente el anillo de furanosa también se denomina en la técnica como que es un sustituto de azúcar. El resto de base heterocíclica o un resto de base heterocíclica modificado se mantiene para la hibridación con un ácido nucleico diana adecuado. Uno de dichos ácidos nucleicos, un polinucleótido mimético que ha demostrado tener excelentes propiedades de hibridación, se denomina ácido nucleico peptídico (PNA). En el PNA, la cadena principal de azúcar de un polinucleótido se reemplaza con una cadena principal que contiene amida, en particular una cadena principal de aminoetilglicina. Los nucleótidos se conservan y se unen directa o indirectamente a átomos de nitrógeno aza de la porción amida de la cadena principal.
Un polinucleótido mimético que se ha publicado que tiene excelentes propiedades de hibridación es un ácido nucleico peptídico (PNA). La cadena principal en los compuestos de PNA es dos o más unidades de aminoetilglicina unidas que proporcionan PNA a una cadena principal que contiene amida. Los restos de base heterocíclica se unen directa o indirectamente a átomos de nitrógeno aza de la porción amida de la cadena principal. Las patentes representativas de Estados Unidos que describen la preparación de compuestos de PNA incluyen, pero no se limitan a: patente US-5.539.082; US-5.714.331; y US-5.719.262.
Otra clase de mimético de polinucleótido que se ha estudiado se basa en unidades de morfolino unidas (ácido nucleico de morfolino) que tienen bases heterocíclicas unidas al anillo de morfolino. Se ha publicado un número de grupos de unión que unen las unidades monoméricas de morfolino en un ácido nucleico de morfolino. Se ha seleccionado una clase de grupos de unión para proporcionar un compuesto oligomérico no iónico. Los compuestos oligoméricos a base de morfolino no iónicos son menos propensos a tener interacciones no deseadas con proteínas celulares. Los polinucleótidos basados en morfolino son miméticos no iónicos de oligonucleótidos que son menos propensos a formar interacciones no deseadas con proteínas celulares (Dwaine A. Braasch y David R. Corey,Biochemistry,2002, 41(14), 4503-4510). Se describen polinucleótidos a base de morfolino en la patente US-5.034.506. Se ha preparado una diversidad de compuestos dentro de la clase morfolino de polinucleótidos, que tiene una diversidad de diferentes grupos de unión que unen las subunidades monoméricas.
Una clase adicional de mimético de polinucleótido se denomina ácidos nucleicos de ciclohexenilo (CeNA). El anillo de furanosa normalmente presente en una molécula de ADN/ARN se reemplaza con un anillo de ciclohexenilo. Se han preparado y utilizado monómeros de protegidos por DMT de CeNA para la síntesis de compuestos oligoméricos después de la química clásica de fosforamidita. Se han preparado y estudiado compuestos oligoméricos de CeNA totalmente modificados y oligonucleótidos que tienen posiciones específicas modificadas con CeNA (véase Wang y col.,J. Am. Chem. Soc.,2000, 122, 8595-8602). En general, la incorporación de monómeros de CeNA en una cadena de ADN aumenta su estabilidad de un híbrido de ADN/ARN. Los oligoadenilatos de CeNA formaron complejos con complementos de ARN y ADN con una estabilidad similar a los complejos nativos. El estudio de incorporación de estructuras de CeNA en estructuras de ácido nucleico natural se mostró mediante RMN y dicroísmo circular para proceder con una adaptación conformacional fácil.
Una modificación adicional incluye ácidos nucleicos bloqueados (LNA) en los que el grupo 2'-hidroxilo está unido al átomo de carbono 4' del anillo de azúcar, formando de este modo un enlace 2'-C,4'-C-oximetileno formando de este modo un resto de azúcar bicíclico. El enlace puede ser un grupo metileno (-CH (-CH<2>-) que une el átomo de oxígeno 2' y el átomo de carbono 4' en donde n es 1 o 2 (Singh y col., Chem.Commun.,1998, 4, 455-456). Los LNA y análogos de LNA muestran estabilidades térmicas dúplex muy altas con ADN y ARN complementarios (Tf = 3 a 10 °C), estabilidad hacia la degradación 3' exonucleolítica y buenas propiedades de solubilidad. Se han descrito oligonucleótidos antisentido potentes y no tóxicos que contienen LNA (Wahlestedt y col.,Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A.,2000, 97, 5633-5638).
La síntesis y preparación de los monómeros de LNA adenina, citosina, guanina, 5-metilcitosina, timina y uracilo, junto con su oligomerización y propiedades de reconocimiento de ácido nucleico se han descrito (Koshkin y col.,Tetrahedron,1998, 54, 3607-3630). También se describen LNA y la preparación de los mismos en los documentos WO 98/39352 y WO 99/14226.
Restos de azúcar modificados
Un ARN de localización específica de ADN en cuestión para el uso también puede incluir uno o más restos de azúcar sustituidos. Los polinucleótidos adecuados comprenden un grupo sustituyente de azúcar seleccionado de: OH; F; O-, S- o N-alquilo; O-, S- o N-alquenilo; O-, S- o N-alquinilo; u O-alquil-O-alquilo, en donde el alquilo, alquenilo y alquinilo pueden ser alquilo C<1>a C<10>o alquenilo y alquinilo C<2>a C<10>sustituidos o sin sustituir. Son particularmente adecuados O((CH<2>)<n>O)<m>CH<3>, O(CH<2>)<n>OCH<3>, O(CH<2>)<n>NH<2>, O(CH<2>)<n>CH<3>, O(CH<2>)<n>ONH<2>y O(CH<2>)<n>ON((CH<2>)<n>CH<3>)<2>, donde n y m son de 1 a aproximadamente 10. Otros polinucleótidos adecuados comprenden un grupo sustituyente de azúcar seleccionado de: alquilo inferior C<1>a C<10>, alquilo inferior sustituido, alquenilo, alquinilo, alcarilo, aralquilo, O-alcarilo u O-aralquilo, SH, SCH<3>, OCN, Cl, Br,<c>N, CF<3>, OCF<3>, SOCH<3>, SO<2>CH<3>, ONO<2>, NO<2>, N<3>, NH<2>, heterocicloalquilo, heterocicloalcarilo, aminoalquilamino, polialquilamino, sililo sustituido, un grupo de escisión de ARN, un grupo indicador, un intercalador, un grupo para mejorar las propiedades farmacocinéticas de un oligonucleótido o un grupo para mejorar las propiedades farmacodinámicas de un oligonucleótido, y otros sustituyentes que tienen propiedades similares. Una modificación adecuada incluye 2'-metoxietoxi (2 '-O-CH<2>CH<2>OCH<3>, también conocido como 2'-O-(2-metoxietilo) O 2'-MOE) (Martin y col.,Helv. Chim. Acta,1995, 78, 486-504) es decir, un grupo alcoxialcoxi. Una modificación adecuada adicional incluye 2'-dimetilaminooxietoxi, es decir, un grupo O(CH<2>)<2>ON(CH<3>)<2>, también conocido como 2'-DMAOE, como se describe en los ejemplos a continuación en la presente descripción, y 2 '-dimetilaminoetoxietoxi (también conocido en la técnica como 2'-O-dimetil-amino-etoxi-etilo o 2'-DMAEOE), es decir, 2 '-O-CH<2>-O-CH<2>-N(CH<3>)<2>.
Otros grupos sustituyentes de azúcar adecuados incluyen metoxi (-O-CH<3>), aminopropoxi (--O CH<2>CH<2>CH<2>NH<2>), alilo (-CH<2>-CH=CH<2>), -O-alilo (--O--CH<2>-CH=CH<2>) y fluoro (F). Los grupos sustituyentes de 2'-azúcar pueden estar en la posición arabino (u) o la posición ribo (abajo). Una modificación de 2'-arabino adecuada es 2'-F. También pueden hacerse modificaciones similares en otras posiciones del compuesto oligomérico, particularmente la posición 3' del azúcar en el nucleósido terminal 3' o en oligonucleótidos unidos 2'-5' y la posición 5' del nucleótido terminal 5'. Los compuestos oligoméricos también pueden tener miméticos de azúcar tales como restos ciclobutilo en lugar del azúcar pentofuranosilo.
Modificaciones y sustituciones de bases
Un ARN de localización específica de ADN en cuestión para el uso también puede incluir modificaciones o sustituciones de nucleobases (frecuentemente denominadas en la técnica simplemente “ bases” ). Como se usa en la presente descripción, las nucleobases “ sin modificar” o “ naturales” incluyen las bases de purina adenina (A) y guanina (G), y las bases de pirimidina timina (T), citosina (C) y uracilo (U). Las nucleobases modificadas incluyen otras nucleobases sintéticas y naturales tales como 5-metilcitosina (5-me-C), 5-hidroximetil citosina, xantina, hipoxantina, 2-aminoadenina, derivados de 6-metilo y otros alquilos de adenina y guanina, derivados de 2-propilo y otros alquilos de adenina y guanina, 2-tiouracilo, 2-tiotimina y 2-tiocitosina, 5-halodiacilo y citosina, 5-propinilo (-C=C-CH3) uracilo y citosina y otros derivados de alquinilo de bases de pirimidina, 6-azo uracilo, citosina y timina, 5-uracilo (pseudouracilo), 4-tiouracilo, 8-halo, 8-amino, 8-tiol, 8-tioalquil, 8-hidroxil adeninas y guaninas y otras 8-sustituidas, 5-halo particularmente 5-bromo, 5-trifl u o rometi l uracilos y citosinas y otros 5-sustituidos, 7-metilguanina y 7-metiladenina, 2-F-adenina, 2-aminoadenina, 8-azaguanina y 8-azaadenina, 7-desazaguanina y 7-desazaadenina y 3-desazaguanina y 3-desazaadenina. Las nucleobases modificadas adicionales incluyen pirimidinas tricíclicas tales como fenoxazina citidina (1 H-pirimido(5,4-b)(1,4)benzoxazin-2(3H)-ona), fenotiazina citidina (1H-pirimido(5,4-b)(1,4)benzotiazin-2(3H)-ona), abrazaderas G tales como fenoxazina citidina sustituida (p. ej., 9-(2-aminoetoxi)-H-pirimido(5,4-(b) (1,4)benzoxazin-2(3H)-ona), carbazol citidina (2H-pirimido (4,5-b)indol-2-ona), piridoindol citidina (H-pirido(3',2':4,5)pirrolo(2,3-d)pirimidin-2-ona).
Los restos de base heterocíclicos también pueden incluir aquellos en los que la base de purina o pirimidina se reemplaza con otros heterociclos, por ejemplo 7-desaza-adenina, 7-desazaguanosina, 2-aminopiridina y 2-piridona. Otras nucleobases incluyen aquellas descritas en la patente US-3.687.808, aquellas descritas enThe Consese Encyclopedia Of Polymer Science and Engineering,páginas 858-859, Kroschwitz, J. I., ed. John Wiley & Sons, 1990, aquellas descritas en Inglsch y col.,Angewandte Chemie,Edición internacional, 1991, 30, 613, y aquellas descritas por Sanghvi, Y. S., Capítulo 15,Antisense Research and Applications,páginas 289-302, Crooke, S. T. y Lebleu, B., ed.,<c>R<c>Press, 1993. Algunas de estas nucleobases son útiles para aumentar la afinidad de unión de un compuesto oligomérico. Estas incluyen pirimidinas 5-sustituidas, 6-azapirimidinas y purinas N-2, N-6 y O-6 sustituidas, que incluyen 2-aminopropiladenina, 5-propiniluracilo y 5-propinilcitosina. Se ha demostrado que las sustituciones de 5-metilcitosina aumentan la estabilidad del dúplex de ácido nucleico en 0,6-1,2 °C. (Sanghvi y col., eds.,Antisense Research and Applications,CRC Press, Boca Ratón, 1993, págs.
276-278) y son sustituciones de bases adecuadas, p. ej., cuando se combinan con modificaciones de 2'-O-metoxietil azúcar.
Conjugados
Otra posible modificación de un ARN de localización específica de ADN en cuestión para el uso implica unir químicamente al polinucleótido uno o más restos o conjugados que potencian la actividad, distribución celular o captación celular del oligonucleótido. Estos restos o conjugados pueden incluir grupos conjugados unidos covalentemente a grupos funcionales tales como grupos hidroxilo primarios o secundarios. Los grupos conjugados incluyen, pero no se limitan a, intercaladores, moléculas indicadoras, poliaminas, poliamidas, polietilenglicoles, poliéteres, grupos que potencian las propiedades farmacodinámicas de los oligómeros y grupos que potencian las propiedades farmacocinéticas de los oligómeros. Los grupos conjugados adecuados incluyen, pero no se limitan a, colesteroles, lípidos, fosfolípidos, biotina, fenazina, folato, fenantridina, antraquinona, acridina, fluoresceínas, rodaminas, cumarinas y colorantes. Los grupos que potencian las propiedades farmacodinámicas incluyen grupos que potencian la absorción, potencian la resistencia a la degradación y/o refuerzan la hibridación específica de secuencia con el ácido nucleico diana. Los grupos que potencian las propiedades farmacocinéticas incluyen grupos que mejoran la absorción, distribución, metabolismo o excreción de un ácido nucleico en cuestión.
Los restos conjugados incluyen, pero no se limitan a, restos lipídicos tales como un resto de colesterol (Letsinger y col.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA,1989, 86, 6553-6556), ácido cólico (Manoharan y col.,Bioorg. Med. Chem. Let.,1994, 4, 1053-1060), un tioéter, p. ej., hexil-S-tritiltiol (Manoharan y col.,Ann. N.Y. Acad. Sci.,1992, 660, 306-309; Manoharan y col.,Bioorg. Med. Chem. Let.,1993, 3, 2765-2770), un tiocolesterol (Oberhauser y col.,Nucl. Acids Res.,1992, 20, 533-538), una cadena alifática, p. ej., restos dodecanodiol o undecilo (Saison-Behmoaras y col.,EMBO J.,1991, 10, 1111-1118; Kabanov y col.,FEBS Lett.,1990, 259, 327-330; Svinarchuk y col.,Biochimie,1993, 75, 49-54), un fosfolípido, p. ej., di-hexadecil-rac-glicerol O trietilamonio 1,2-di-O-hexadecil-rac-glicero-3-H-fosfonato (Manoharan y col.,Tetrahedron Lett.,1995, 36, 3651 3654; Shea y col.,Nucl. Acids Res.,1990, 18, 3777-3783), una poliamina o una cadena de polietilenglicol (Manoharan y col.,Nucleosides & Nucleotides,1995, 14, 969-973) o ácido adamantano acético (Manoharan y col.,Tetrahedron Lett.,1995, 36, 3651-3654), un resto palmitilo (Mishra y col.,Biochim. Biophys. Acta,1995, 1264, 229-237) o una porción de octadecilamina o hexilamino-carbonil-oxicolesterol (Crooke y col.,J. Pharmacol. Exp. Ther.,1996, 277, 923-937.\
Un conjugado puede incluir un “ dominio de transducción de proteínas” o PTD (también conocido como un péptido de penetración de células CPP), que puede referirse a un polipéptido, polinucleótido, carbohidrato o compuesto orgánico o inorgánico que facilita atravesar una bicapa lipídica, micela, membrana celular, membrana de orgánulo, o membrana de vesícula. Un PTD unido a otra molécula, que puede variar desde una pequeña molécula polar a una macromolécula grande y/o una nanopartícula, facilita que la molécula atraviese una membrana, por ejemplo, que va desde el espacio extracelular hasta el espacio intracelular, o del citosol hacia dentro de un orgánulo. En algunas realizaciones, un PTD se une covalentemente al extremo amino de un polipéptido Cas9 exógeno o se une covalentemente al extremo carboxilo de un polipéptido Cas9 exógeno. En algunas realizaciones, un PTD se une covalentemente a un ácido nucleico (p. ej., un ARN de localización específica de ADN, un polinucleótido que codifica un ARN de localización específica de ADN, un polinucleótido que codifica un polipéptido Cas9, etc.). Los PTD ilustrativos incluyen, pero no se limitan a, un dominio de transducción de proteínas de undecapéptido mínimo (correspondiente a los residuos 47-57 de TAT de VIH-1 que comprende YGRKKRRQRRR; Id. de sec. n.° 264); una secuencia de poliarginina que comprende un número de argininas suficientes para dirigir la entrada en una célula (p. ej., 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o 10-50 argininas); un dominio VP22 (Zender y col. (2002)Cáncer Gene Ther.9(6):489-96); un dominio de transducción de proteínasDrosophila Antennapedia(Noguchi y col. (2003)Diabetes52(7): 1732 1737); un péptido de calcitonina humana truncada (Trehin y col. (2004)Pharm. Research21: 1248-1256); polilisina (Wender y col. (2000)Proc. Nati. Acad. Sci. USA97: 13003-13008); RRQRRTSKLMKR (Id. de sec. n.° 265);
Transportano GWTLNSAGYLLGKINLKALAALAKKIL (Id. de sec. n.° 266);
KALAWEAKLAKALAKALAKHLAKALAKALKCEA (Id. de sec. n.° 267); y RQIKIWFQNRRMKWKK (Id. de sec. n.° 268). Los PTD ilustrativos incluyen, pero no se limitan a, YGRKKRRQr Rr (Id. de sec. n.° 264), RKKRRQRRR (Id.
de sec. n.° 269); un homopolímero de arginina de 3 residuos de arginina a 50 residuos de arginina; las secuencias de aminoácidos del dominio PTD ilustrativas incluyen, pero no se limitan a, cualquiera de las siguientes:
YGRKKRRQRRR (Id. de sec. n.° 264); RKKRRQRR (Id. de sec. n.° 270); YARAAARQARA (Id. de sec. n.° 271);
THRLPRRRRRR (Id. de sec. n.° 272); y GGRRARRRRRR (Id. de sec. n.° 273). En algunas realizaciones, el P<t>D es un CPP activable (ACPP) (Aguileray coi.(2009)Integr Biol (Camb)Junio; 1(5-6): 371-381). Los ACPP comprenden un CPP policatiónico (p. ej., Arg9 o “ R9” ) conectado a través de un enlazador escindible a un polianión coincidente (p. ej., Glu9 o “ E9” ), lo que reduce la carga neta a casi cero y, por lo tanto, inhibe la adhesión y absorción en las células. Tras la escisión del enlazador, el polianión se libera, desenmascarando localmente la poliarginina y su capacidad de adhesión inherente, por lo tanto “ activando” el ACPP para atravesar la membrana.
ARN de localización específica de ADN ilustrativos
En algunas realizaciones, un ARN de localización específica de ADN adecuado comprende dos moléculas de polinucleótidos de ARN separadas. La primera de las dos moléculas de polinucleótidos de ARN separadas (el ARN activador) comprende una secuencia de nucleótidos que tiene al menos aproximadamente el 60 %, al menos aproximadamente el 65 %, al menos aproximadamente el 70 %, al menos aproximadamente el 75 %, al menos aproximadamente el 80 %, al menos aproximadamente el 85 %, al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 95 %, al menos aproximadamente el 98 %, al menos aproximadamente el 99 % o el 100 % de identidad de secuencia de nucleótidos sobre un tramo de al menos 8 nucleótidos contiguos con una cualquiera de las secuencias de nucleótidos expuestas en las Id. de sec. n.° 431-562, o complementos de las mismas. La segunda de las dos moléculas de polinucleótidos de ARN separadas (el ARN localizador específico) comprende una secuencia de nucleótidos que tiene al menos aproximadamente el 60 %, al menos aproximadamente el 65 %, al menos aproximadamente el 70 %, al menos aproximadamente el 75 %, al menos aproximadamente el 80 %, al menos aproximadamente el 85 %, al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 95 %, al menos aproximadamente el 98 %, al menos aproximadamente el 99 % o el 100 % de identidad de secuencia de nucleótidos sobre un tramo de al menos 8 nucleótidos contiguos con una cualquiera de las secuencias de nucleótidos expuestas en las Id. de sec. n.° 563-679, o complementos de las mismas.
En algunas realizaciones, un ARN de localización específica de ADN adecuado es un polinucleótido de ARN único y comprende una primera secuencia de nucleótidos que tiene al menos aproximadamente el 60 %, al menos aproximadamente el 65 %, al menos aproximadamente el 70 %, al menos aproximadamente el 75 %, al menos aproximadamente el 80 %, al menos aproximadamente el 85 %, al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 95 %, al menos aproximadamente el 98 %, al menos aproximadamente el 99 % o el 100 % de identidad de secuencia de nucleótidos sobre un tramo de al menos 8 nucleótidos contiguos con una cualquiera de las secuencias de nucleótidos expuestas en las Id. de sec. n.° 431-562 y una segunda secuencia de nucleótidos que tiene al menos aproximadamente el 60 %, al menos aproximadamente el 65 %, al menos aproximadamente el 70 %, al menos aproximadamente el 75 %, al menos aproximadamente el 80 %, al menos aproximadamente el 85 %, al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 95 %, al menos aproximadamente el 98 %, al menos aproximadamente el 99 % o el 100 % de identidad de secuencia de nucleótidos en un tramo de al menos 8 nucleótidos contiguos con una cualquiera de las secuencias de nucleótidos expuestas en las Id. de sec. n.° 463-679.
En algunas realizaciones, el ARN de localización específica de ADN es un ARN de localización específica de ADN de molécula doble y el ARN localizador específico comprende la secuencia 5'GUUUUAGAGCUA-3' (Id. de sec. n.° 679) unida en su extremo 5' a un tramo de nucleótidos que son complementarios a un ADN diana. En algunas realizaciones, el ARN de localización específica de ADN es un ARN de localización específica de ADN de molécula doble y el ARN activador comprende la secuencia 5' UAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCG-3' (Id. de sec. n.° //).
En algunas realizaciones, el ARN de localización específica de ADN es un ARN de localización específica de ADN de molécula única y comprende la secuencia 5'-GUUUUAGAGCUA-enlazador-UAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCG-3' unido en su extremo 5' a un tramo de nucleótidos que son complementarios a un ADN diana (donde “ enlazador” indica cualquier secuencia de nucleótidos enlazadora que puede comprender cualquier secuencia de nucleótidos) (Id. de sec. n.° //). Otros ARN de localización específica de ADN de molécula única ilustrativos incluyen los expuestos en las Id. de sec. n.° 680-682.
Ácidos nucleicos que codifican un ARN de localización específica de ADN en cuestión y/o un polipéptido modificador dirigido al sitio en cuestión
La presente descripción proporciona un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un ARN de localización específica de ADN en cuestión y/o un polipéptido modificador dirigido al sitio en cuestión para el uso. En algunas realizaciones, un ácido nucleico que codifica ARN de localización específica de ADN en cuestión para el uso es un vector de expresión, p. ej., un vector de expresión recombinante.
En algunas realizaciones, un método en cuestión implica poner en contacto un ADN diana o introducir en una célula (o una población de células) uno o más ácidos nucleicos que comprenden secuencias de nucleótidos que codifican un ARN de localización específica de ADN y/o un polipéptido Cas9. En algunas realizaciones, una célula que comprende un ADN diana está¡n vitro.Los ácidos nucleicos adecuados que comprenden secuencias de nucleótidos que codifican un ARN de localización específica de ADN y/o un polipéptido modificador dirigido al sitio incluyen vectores de expresión, donde un vector de expresión que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un ARN de localización específica de ADN y/o un polipéptido modificador dirigido al sitio es un “vector de expresión recombinante” .
El vector de expresión recombinante puede ser un constructo vírico, p. ej., un constructo de virus adenoasociado recombinante (véase, p. ej., la patente estadounidense n.° 7.078.387), un constructo adenovírico recombinante, un constructo lentivírico recombinante, un constructo retrovírico recombinante, etc.
Los vectores de expresión adecuados incluyen, pero no se limitan a, vectores víricos (p. ej., vectores víricos basados en virus vaccinia; poliovirus; adenovirus (véase, p. ej., Li y col.,Invest Optalmol Vis Sci35:25432549, 1994; Borras y col.,Gene Ther6:515 524, 1999; Li y Davidson,PNAS92:7700 7704, 1995; Sakamoto y col.,H Gene Ther5:1088 1097, 1999; los documentos WO 94/12649, WO 93/03769; WO 93/19191; WO 94/28938; WO 95/11984 y WO 95/00655); virus adenoasociado (véase, p. ej., Ali y col.,Hum Gene Ther9:81 86, 1998, Flannnery y col.,PNAS94:69166921, 1997; Bennett y col.,Invest Optalmol Vis Sci38:28572863, 1997; Jomary y col.,Gene Ther4:683690, 1997, Rolling y col.,Hum Gene Ther10:641 648, 1999; Ali y col.,Hum Mol Genet5:591 594, 1996; Srivastava en el documento WO 93/09239, Samulski y col.,J. Vir.(1989) 63:3822-3828; Mendelson y col.,Virol.(1988) 166:154-165; y Flotte y col.,PNAS(1993) 90:10613-10617); SV40; virus del herpes simple; virus de inmunodeficiencia humana (véase, p. ej., Miyoshi y col.,PNAS94:10319 23, 1997; Takahashi y col.,J Virol73:7812 7816, 1999); un vector retrovírico (p. ej., virus de la leucemia murina, virus de necrosis del bazo y vectores derivados de retrovirus tales como virus del sarcoma de Rous, virus del sarcoma de Harvey, virus de la leucosis aviar, un lentivirus, virus de inmunodeficiencia humana, virus del sarcoma mieloproliferativo y virus tumoral mamario); y similares.
Los expertos en la técnica conocen numerosos vectores de expresión adecuados, y muchos están disponibles en el mercado. Los siguientes vectores se proporcionan a modo de ejemplo; para células hospedadoras eucariotas, pXT1, pSG5 (Stratagene), pSVK3, pBPV, pMSG y pSVLSV40 (Pharmacia). Sin embargo, puede usarse cualquier otro vector siempre que sea compatible con la célula hospedadora.
Dependiendo del sistema hospedador/vector utilizado, puede usarse cualquiera de un número de elementos de control de transcripción y traducción adecuados, incluyendo promotores constitutivos e inducibles, elementos potenciadores de la transcripción, terminadores de la transcripción, etc., en el vector de expresión (véase, p. ej., Bitter y col. (1987)Methods in Enzymology,153:516-544).
Una secuencia de nucleótidos que codifica un ARN de localización específica de ADN y/o un polipéptido modificador dirigido al sitio puede unirse operativamente a un elemento de control, p. ej., un elemento de control de la transcripción, tal como un promotor. El elemento de control de la transcripción puede ser funcional en una célula eucariota, p. ej., una célula de mamífero; o una célula procariota (p. ej., célula bacteriana o de arquea). En algunas realizaciones, una secuencia de nucleótidos que codifica un ARN de localización específica de ADN y/o un polipéptido modificador dirigido al sitio se une operativamente a múltiples elementos de control que permiten la expresión de la secuencia de nucleótidos que codifica un ARN de localización específica de ADN y/o un polipéptido modificador dirigido al sitio tanto en células procariotas como eucariotas.
Los ejemplos no limitativos de promotores eucariotas adecuados (promotores funcionales en una célula eucariota) incluyen aquellos del citomegalovirus (CMV) inmediato temprano, la timidina quinasa del virus del herpes simple (VHS), el SV40 temprano y tardío, las repeticiones terminales largas (LTR) de retrovirus y la metalotioneína-I de ratón. La selección del vector y promotor adecuados está dentro del nivel de experiencia ordinaria en la técnica. El vector de expresión también puede contener un sitio de unión al ribosoma para el inicio de la traducción y un terminador de la transcripción. El vector de expresión también puede incluir secuencias adecuadas para amplificar la expresión. El vector de expresión también puede incluir secuencias de nucleótidos que codifican marcadores de proteínas (p. ej., marcador 6xHis, marcador de hemaglutinina, proteína fluorescente verde, etc.) que se fusionan con el polipéptido modificador dirigido al sitio, dando como resultado un polipéptido quimérico.
Una secuencia de nucleótidos que codifica un ARN de localización específica de ADN y/o un polipéptido modificador dirigido al sitio puede unirse operativamente a un promotor inducible. Una secuencia de nucleótidos que codifica un ARN de localización específica de ADN y/o un polipéptido modificador dirigido al sitio puede unirse operativamente a un promotor constitutivo.
Se conocen en la técnica métodos para introducir un ácido nucleico en una célula hospedadora, y puede usarse cualquier método conocido para introducir un ácido nucleico (p. ej., un constructo de expresión) en una célula. Los métodos adecuados incluyen, p. ej., infección vírica o por bacteriófagos, transfección, conjugación, fusión de protoplastos, lipofección, electroporación, precipitación con fosfato de calcio, transfección mediada por polietilenimina (PEI), transfección mediada por DEAE-dextrano, transfección mediada por liposomas, tecnología de cañón de partículas, precipitación con fosfato de calcio, microinyección directa, administración de ácido nucleico mediada por nanopartículas (véase, p. ej., Panyam y col.,Adv Drug Deliv Rev.13 de septiembre de 2012. piii: S0169-409X(12)00283-9. doi: 10.1016/j.addr.2012.09.023) y similares.
Métodos
La presente descripción proporciona métodos para modificar un ADN diana. Un método en cuestión implica poner en contacto un ADN diana con un complejo (un “ complejo de localización específica” ), complejo que comprende un ARN de localización específica de ADN y un polipéptido Cas9.
Como se ha analizado anteriormente, un ARN de localización específica de ADN en cuestión y un polipéptido Cas9 forman un complejo. El ARN de localización específica de ADN proporciona una especificidad diana al complejo al comprender una secuencia de nucleótidos que es complementaria a una secuencia de un ADN diana. El polipéptido Cas9 del complejo proporciona la actividad específica de sitio. En algunas realizaciones, un complejo sujeto modifica un ADN diana, lo que conduce, por ejemplo, a la escisión de ADN, el daño de ADN, la reparación de ADN, etc. El ADN diana puede ser, por ejemplo, ADN cromosómico en células invitro,etc.
En algunos casos, el polipéptido modificador dirigido al sitio presenta actividad nucleasa que escinde el ADN diana en una secuencia de ADN diana definida por la región de complementariedad entre el ARN de localización específica de ADN y el ADN diana. El polipéptido modificador dirigido al sitio es un polipéptido Cas9, y la escisión específica de sitio del ADN diana se produce en ubicaciones determinadas por (i) la complementariedad de emparejamiento de bases entre el ARN de localización específica de ADN y el ADN diana; y (ii) un motivo corto [denominado motivo adyacente protoespaciador (PAM)] en el ADN diana. En algunas realizaciones (p. ej., cuando se usa Cas9 de S.pyogenes,o un Cas9 estrechamente relacionado (véanse las Id. de sec. n.° 1-256 y 795-1346), la secuencia de PAM de la cadena no complementaria es 5'-XGG-3', donde X es cualquier nucleótido de ADN y X está inmediatamente en 3' de la secuencia diana de la cadena no complementaria del ADN diana (véase la Figura 10). Como tal, la secuencia de PAM de la cadena complementaria es 5'-CCY-3', donde Y es cualquier nucleótido de ADN e Y está inmediatamente en 5' de la secuencia diana de la cadena complementaria del ADN diana (véase la Figura 10 donde el PAM de la cadena no complementaria es 5'-GGG-3' y el PAM de la cadena complementaria es 5'-CCC-3'). En algunas de dichas realizaciones, X e Y pueden ser complementarios y el par de bases X-Y puede ser cualquier par de bases (p. ej., X=C e Y=G; X=G e Y=C; X=A e Y=T, X=T e Y=A).
En algunos casos, diferentes proteínas Cas9 (es decir, proteínas Cas9 de diversas especies) pueden ser ventajosas para su uso en los diversos métodos proporcionados para capitalizar diversas características enzimáticas de las diferentes proteínas Cas9 (p. ej., para diferentes preferencias de secuencia de PAM; para una actividad enzimática aumentada o disminuida; para un nivel aumentado o disminuido de toxicidad celular; para cambiar el equilibrio entre NHEJ, la reparación dirigida por homología, las roturas monocatenarias, las roturas bicatenarias, etc.). Las proteínas Cas9 de diversas especies (véanse las Id. de sec. n.° 1-256 y 795-1346) pueden requerir diferentes secuencias de PAM en el ADN diana. Por lo tanto, para una proteína Cas9 particular de elección, el requisito de secuencia de PAM puede ser diferente de la secuencia 5'-XGG-3' descrita anteriormente.
En la presente descripción se han identificado muchos ortólogos de Cas9 de una amplia diversidad de especies y las proteínas comparten solamente unos pocos aminoácidos idénticos. Todos los ortólogos de Cas9 identificados tienen la misma arquitectura de dominio con un dominio de endonucleasa HNH central y un dominio RuvC/RNasaH dividido (véanse las Figuras 3A, 3B, Figura 5 y Tabla 1). Las proteínas Cas9 comparten 4 motivos clave con una arquitectura conservada. Los motivos 1, 2 y 4 son motivos similares a RuvC, mientras que el motivo 3 es un motivo HNH. En algunos casos, un polipéptido modificador dirigido al sitio adecuado comprende una secuencia de aminoácidos que tiene 4 motivos, teniendo cada uno de los motivos 1-4 al menos aproximadamente el 75 %, al menos aproximadamente el 80 %, al menos aproximadamente el 85 %, al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 95 %, al menos aproximadamente el 99 % o el 100 % de identidad de secuencia de aminoácidos con los motivos 1-4 de la secuencia de aminoácidos Cas9/Csn1 representada en la Figura 3A (Id. de sec. n.° 260-263, respectivamente, como se representa en la Tabla 1), o a las porciones correspondientes en cualquiera de las secuencias de aminoácidos expuestas en las Id. de sec. n.° 1-256 y 795-1346 (véase la Figura 5 para consultar una alineación de los motivos 1-4 de secuencias de Cas9 divergentes). En algunos casos, un polipéptido modificador dirigido al sitio adecuado comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente el 75 %, al menos aproximadamente el 80 %, al menos aproximadamente el 85 %, al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 95 %, al menos aproximadamente el 99 % o el 100 % de identidad de secuencia de aminoácidos con los aminoácidos 7-166 o 731-1003 de la secuencia de aminoácidos Cas9/Csn1 representada en la Figura 3, o con las porciones correspondientes en cualquiera de las secuencias de aminoácidos expuestas como Id. de sec. n.° 1-256 y 795-1346. Cualquier proteína Cas9 como se definió anteriormente puede usarse como un polipéptido modificador dirigido al sitio de los métodos en cuestión.
La actividad nucleasa escinde el ADN diana para producir roturas bicatenarias. Después, estas roturas son reparadas por la célula en una de dos formas: unión de extremos no homólogos y reparación dirigida por homología (Figura 2). En la unión de extremos no homólogos (NHEJ), las roturas bicatenarias se reparan mediante ligadura directa de los extremos de rotura entre sí. Como tal, no se inserta ningún nuevo material de ácido nucleico en el sitio, aunque puede perderse algo de material de ácido nucleico, dando como resultado una deleción. En la reparación dirigida por homología, se usa un polinucleótido donante con homología con la secuencia de ADN diana escindida como molde para la reparación de la secuencia de ADN diana escindida, dando como resultado la transferencia de información genética del polinucleótido donante al ADN diana. Como tal, puede insertarse/copiarse nuevo material de ácido nucleico en el sitio. En algunos casos, un ADN diana se pone en contacto con un polinucleótido donante en cuestión. En algunos casos, un polinucleótido donante en cuestión se introduce en una célula en cuestión. Las modificaciones del ADN diana debidas a NHEJ y/o la reparación dirigida por homología conducen, por ejemplo, a la corrección génica, el reemplazo génico, el marcaje de genes, la inserción transgénica, la deleción de nucleótidos, la alteración génica, la mutación génica, etc.
En consecuencia, la escisión de ADN por un polipéptido Cas9 puede usarse para delecionar el material ácido nucleico de una secuencia de ADN diana (p. ej., para alterar un gen que hace que las células sean susceptibles a la infección (p. ej., el gen CCRS o CXCR4, que hace que los linfocitos T sean susceptibles a la infección por VIH), para eliminar las secuencias de repetición de trinucleótidos que provocan enfermedad en las neuronas, para crear inactivaciones de genes y mutaciones como modelos de enfermedad en investigación, etc.) escindiendo la secuencia de ADN diana y permitiendo que la célula repare la secuencia en ausencia de un polinucleótido donante proporcionado exógenamente. Por lo tanto, los métodos en cuestión pueden usarse para inactivar un gen (dando como resultado una falta completa de transcripción o transcripción alterada) o para activar material genético en un locus de elección en el ADN diana.
Alternativamente, si se coadministra un ARN de localización específica de ADN y un polipéptido Cas9 a células con una secuencia de polinucleótidos donante que incluye al menos un segmento con homología con la secuencia de ADN diana, los métodos en cuestión pueden usarse para añadir, es decir, insertar o reemplazar el material de ácido nucleico a una secuencia de ADN diana (p. ej., para “ activar” un ácido nucleico que codifica una proteína, un ARNip, un miARN, etc.), para añadir un marcador (p. ej., 6xHis, una proteína fluorescente (p. ej., una proteína fluorescente verde; una proteína fluorescente amarilla, etc.), hemaglutinina (HA), FLAG, etc.), para añadir una secuencia reguladora a un gen (p. ej., promotor, señal de poliadenilación, secuencia interna de entrada al ribosoma (IRES), péptido 2A, codón de inicio, codón de terminación, señal de corte y empalme, señal de localización, etc.), para modificar una secuencia de ácido nucleico (p. ej., introducir una mutación) y similares. Como tal, un complejo que comprende un ARN de localización específica de ADN y un polipéptido modificador dirigido al sitio es útil en cualquier aplicación¡n vitroo¡n vivoen la que es deseable modificar el ADN de manera específica de sitio, es decir, “ localizada específicamente” , por ejemplo, la inactivación génica, la activación génica, la edición génica, el marcaje génico, etc., como se usa, p. ej., en terapia génica, p. ej., para tratar una enfermedad o como un agente terapéutico antivírico, antipatógeno o antineoplásico, la producción de organismos modificados genéticamente en agricultura, la producción a gran escala de proteínas por células con fines terapéuticos, de diagnóstico o de investigación, la inducción de células iPS, la investigación biológica, la localización específica de genes de patógenos para la deleción o el reemplazo, etc.
En algunas realizaciones, el polipéptido Cas9 comprende una secuencia heteróloga (p. ej., una fusión). En algunas realizaciones, una secuencia heteróloga puede proporcionar la localización subcelular del polipéptido modificador dirigido al sitio (p. ej., una señal de localización nuclear (n Ls ) para la localización específica al núcleo; una señal de localización mitocondrial para la localización específica a la mitocondria; una señal de localización de cloroplasto para la localización específica a un cloroplasto; una señal de retención de ER; y similares). En algunas realizaciones, una secuencia heteróloga puede proporcionar un marcador para facilitar el seguimiento o purificación (p. ej., una proteína fluorescente, p. ej., proteína fluorescente verde (GFP), YFP, RFP, CFP, mCherry, tdTomato y similares; un marcador de his, p. ej., un marcador 6XHis; un marcador de hemaglutinina (HA); un marcador FLAG; un marcador Myc; y similares). En algunas realizaciones, la secuencia heteróloga puede proporcionar una estabilidad aumentada o disminuida.
En algunas realizaciones, un polipéptido Cas9 sujeto puede estar optimizado por codones. Este tipo de optimización es conocido en la técnica e implica la mutación de ADN derivado de extraño para imitar las preferencias de codones del organismo o la célula hospedadores previstos mientras que codifica la misma proteína. Por lo tanto, los codones se cambian, pero la proteína codificada permanece sin cambios. Por ejemplo, si la célula diana prevista era una célula humana, un Cas9 con codones optimizados (o variante, p. ej., variante enzimáticamente inactiva) sería un polipéptido modificador dirigido al sitio adecuado (véase la Id. de sec. n.° 256 para consultar un ejemplo). Cualquier polipéptido modificador dirigido al sitio adecuado (p. ej., cualquier Cas9 tal como cualquiera de las secuencias expuestas en las Id. de sec. n.° 1-256 y 795-1346) puede optimizarse con codones. Como otro ejemplo no limitativo, si la célula hospedadora prevista era una célula de ratón, entonces un Cas9 (o variante, p. ej., variante inactiva enzimáticamente) con codones optimizados sería un polipéptido modificador dirigido al sitio adecuado. Aunque no se requiere optimización de codones, es aceptable y puede ser preferible en determinados casos.
Los métodos de la presente descripción también encuentran uso en el daño intencionado y controlado de ADN en cualquier ubicación deseada dentro del ADN diana. Los métodos de la presente descripción también encuentran uso en la reparación de ADN específica de secuencia y controlada en cualquier ubicación deseada dentro del ADN diana. Los métodos para dirigir las actividades enzimáticas modificadoras de ADN a ubicaciones específicas en el ADN diana encuentran uso en aplicaciones tanto de investigación como clínicas.
En algunas realizaciones, se usan simultáneamente múltiples ARN de localización específica de ADN para modificar simultáneamente diferentes ubicaciones en el mismo ADN diana o en diferentes ADN diana. En algunas realizaciones, dos o más ARN de localización específica de ADN se dirigen al mismo gen o transcrito o locus. En algunas realizaciones, dos o más ARN de localización específica de ADN se dirigen a diferentes loci no relacionados. En algunas realizaciones, dos o más ARN de localización específica de ADN se dirigen a loci diferentes, pero relacionados.
En algunos casos, el polipéptido Cas9 se proporciona directamente en forma de una proteína. Como ejemplo no limitativo, pueden transformarse hongos (p. ej., levadura) con proteína y/o ácido nucleico exógeno usando transformación con esferoplasto (véase Kawai y col.,Bioeng Bugs.Noviembre-diciembre de 2010;1(6):395-403:“ Transformaron of Saccharomyces cerevisiae and other fungí: methods and possible underlying mechanism” ; y Tanka y col.,Nature.18 de marzo de 2004;428(6980):323-8:
“Conformational variations in an infectious protein determine prion strain differences” . Por lo tanto, puede incorporarse un polipéptido Cas9 en un esferoplasto (con o sin ácido nucleico que codifica un ARN de localización específica de ADN y con o sin un polinucleótido donante) y el esferoplasto puede usarse para introducir el contenido en una célula de levadura. Puede introducirse un polipéptido modificador dirigido al sitio en una célula (puede proporcionarse a la célula) mediante cualquier método convencional; dichos métodos son conocidos por los expertos en la técnica. Como otro ejemplo no limitativo, puede inyectarse un polipéptido modificador dirigido al sitio directamente en una célula (p. ej., con o sin ácido nucleico que codifica un ARN de localización específica de ADN y con o sin un polinucleótido donante), p. ej., una célula de un embrión de pez cebra, el pronúcleo de un ovocito de ratón fertilizado, etc.
Células diana de interés
En algunas de las aplicaciones anteriores, los métodos en cuestión pueden emplearse para inducir la escisión de ADN en células mitóticas o postmitóticasex vivoy/oin vitro(p. ej., para producir células modificadas genéticamente que pueden reintroducirse en un individuo). El ARN de localización específica de ADN proporciona especificidad al hibridarse con el ADN diana. Una célula mitótica y/o postmitótica de interés en los métodos descritos es una célula de un organismo eucariota unicelular, una célula vegetal, una célula de algas, p. ej.,Botryococcus braunii, Chlamydomonas reinhardtii, Nannochloropsis gaditana, Chlorella pyrenoidosa, Sargassum patens C. Agardh,y similares, una célula fúngica de un único organismo (p. ej., una célula de levadura), una célula animal, una célula de un animal invertebrado (p. ej., mosca de la fruta, cnidario, equinodermo, nematodo, etc.), una célula de un animal vertebrado (p. ej., pez, anfibio, reptil, pájaro, mamífero), una célula de un mamífero, una célula de un roedor, una célula de un ser humano, etc.).
Cualquier tipo de célula puede ser de interés (p. ej., una célula madre, p. ej., una célula madre embrionaria (ES), una célula madre pluripotente inducida (iPS), una célula germinal en donde las células germinales humanas no son parte de las composiciones de la invención reivindicada; una célula somática, p. ej., un fibroblasto, una célula hematopoyética, una neurona, una célula muscular, una célula ósea, un hepatocito, una célula pancreática; una célula embrionaria no humanain vitrode un embrión no humano en cualquier etapa, p. ej., un embrión de pez cebra de 1 célula, 2 células, 4 células, 8 células; etc.). Las células pueden ser de líneas celulares establecidas o pueden ser células primarias, donde “células primarias” , “ líneas celulares primarias” y “cultivos primarios” se usan indistintamente en la presente descripción para referirse a células y cultivos de células que han derivado de un sujeto y se dejaron crecerin vitrodurante un número limitado de pases, es decir, divisiones, del cultivo. Por ejemplo, los cultivos primarios son cultivos que pueden haber experimentado pases 0 veces, 1 vez, 2 veces, 4 veces, 5 veces, 10 veces o 15 veces, pero que no han pasado suficientes veces por la etapa de crisis. Típicamente, las líneas celulares primarias de la presente invención se mantienen durante menos de 10 pasesin vitro.En muchas realizaciones, las células diana son de organismos eucariotas unicelulares, o se cultivan en cultivo.
Si las células son células primarias, pueden recogerse de un individuo mediante cualquier método no reivindicado conveniente. Por ejemplo, los leucocitos pueden recogerse convenientemente por aféresis, leucocitopenia, separación en gradiente de densidad, etc., mientras que las células de tejidos tales como piel, músculo, médula ósea, bazo, hígado, páncreas, pulmón, intestino, estómago, etc. se recogen más convenientemente mediante biopsia. Puede usarse una solución adecuada para la dispersión o suspensión de las células recogidas. Dicha solución generalmente será una solución salina equilibrada, p. ej., solución salina normal, solución salina tamponada con fosfato (PBS), solución salina equilibrada de Hank, etc., suplementada convenientemente con suero fetal de ternero u otros factores de origen natural, junto con un tampón aceptable a baja concentración, generalmente de 5-25 mM. Los tampones convenientes incluyen HEPES, tampones de fosfato, tampones de lactato, etc. Las células pueden usarse inmediatamente, o pueden almacenarse, congelarse, durante largos períodos de tiempo, descongelándose y siendo susceptibles de reutilizarse. En dichos casos, las células usualmente se congelarán en DMSO al 10 %, suero al 50 %, medio tamponado al 40 % o alguna otra solución como se usa habitualmente en la técnica para conservar células a dichas temperaturas de congelación y se descongelarán de una manera conocida habitualmente en la técnica para descongelar células cultivadas congeladas.
Ácidos nucleicos que codifican un ARN de localización específica de ADN en cuestión y/o un polipéptido modificador dirigido al sitio en cuestión
En algunas realizaciones, un método en cuestión implica poner en contacto un ADN diana o introducir en una célula (o una población de células) uno o más ácidos nucleicos que comprenden secuencias de nucleótidos que codifican un ARN de localización específica de ADN y/o un polipéptido Cas9 y/o un polinucleótido donante. Los ácidos nucleicos adecuados que comprenden secuencias de nucleótidos que codifican un ARN de localización específica de ADN y/o un polipéptido Cas9 incluyen vectores de expresión, donde un vector de expresión que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un ARN de localización específica de ADN y/o un polipéptido modificador dirigido al sitio es un “vector de expresión recombinante” .
El vector de expresión recombinante puede ser un constructo vírico, p. ej., un constructo de virus adenoasociado recombinante (véase, p. ej., la patente estadounidense n.° 7.078.387), un constructo adenovírico recombinante, un constructo lentivírico recombinante, etc.
Los vectores de expresión adecuados incluyen, pero no se limitan a, vectores víricos (p. ej., vectores víricos basados en virus vaccinia; poliovirus; adenovirus (véase, p. ej., Li y col.,Invest Optalmol Vis Sci35:25432549, 1994; Borras y col., Gene Ther 6:515 524, 1999; Li y Davidson,PNAS92:7700 7704, 1995; Sakamoto y col., H Gene Ther 5:1088 1097, 1999; los documentos WO 94/12649, WO 93/03769; WO 93/19191; WO 94/28938; WO 95/11984 y WO 95/00655); virus adenoasociado (véase, p. ej., Ali y col.,Hum Gene Ther9:81 86, 1998, Flannnery y col.,PNAS94:69166921, 1997; Bennett y col.,Invest Optalmol Vis Sci38:28572863, 1997; Jomary y col.,Gene Ther4:683690, 1997, Rolling y col.,Hum Gene Ther10:641 648, 1999; Ali y col.,Hum Mol Genet5:591 594, 1996; Srivastava en el documento WO 93/09239, Samulski y col.,J. Vir.(1989) 63:3822-3828; Mendelson y col.,Virol.(1988) 166:154-165; y Flotte y col.,PNAS(1993) 90:10613-10617); SV40; virus del herpes simple; virus de inmunodeficiencia humana (véase, p. ej., Miyoshi y col.,PNAS94: 10319 23, 1997; Takahashi y col.,J Virol73:7812 7816, 1999); un vector retrovírico (p. ej., virus de la leucemia murina, virus de necrosis del bazo y vectores derivados de retrovirus tales como virus del sarcoma de Rous, virus del sarcoma de Harvey, virus de la leucosis aviar, un lentivirus, virus de inmunodeficiencia humana, virus del sarcoma mieloproliferativo y virus tumoral mamario); y similares.
Los expertos en la técnica conocen numerosos vectores de expresión adecuados, y muchos están disponibles en el mercado. Los siguientes vectores se proporcionan a modo de ejemplo; para células hospedadoras eucariotas, pXT1, pSG5 (Stratagene), pSVK3, pBPV, pMSG y pSVLSV40 (Pharmacia). Sin embargo, puede usarse cualquier otro vector siempre que sea compatible con la célula hospedadora.
Una secuencia de nucleótidos que codifica un ARN de localización específica de ADN y/o un polipéptido modificador dirigido al sitio puede unirse operativamente a un elemento de control, p. ej., un elemento de control de la transcripción, tal como un promotor. El elemento de control transcripcional puede ser funcional en una célula eucariota, p. ej., una célula de mamífero o una célula procariota (p. ej., célula bacteriana o de arquea). En algunas realizaciones, una secuencia de nucleótidos que codifica un ARN de localización específica de ADN y/o un polipéptido modificador dirigido al sitio se une operativamente a múltiples elementos de control que permiten la expresión de la secuencia de nucleótidos que codifica un ARN de localización específica de ADN y/o un polipéptido modificador dirigido al sitio tanto en células procariotas como eucariotas.
Dependiendo del sistema hospedador/vector utilizado, puede usarse cualquiera de un número de elementos de control de transcripción y traducción adecuados, incluyendo promotores constitutivos e inducibles, elementos potenciadores de la transcripción, terminadores de la transcripción, etc., en el vector de expresión (p. ej., promotor U6, promotor H1, etc.; véase anteriormente) (véase, p. ej., Bitter y col. (1987)Methods in Enzymology,153:516-544).
Puede proporcionarse un ARN de localización específica de ADN y/o un polipéptido Cas9 como ARN. En dichos casos, el ARN de localización específica de ADN y/o el ARN que codifica el polipéptido Cas9 pueden producirse mediante síntesis química directa o pueden transcribirsein vitroa partir de un ADN que codifica el ARN de localización específica de ADN. Se conocen bien en la técnica métodos para sintetizar<a>R<n>a partir de un molde de ADN. En algunos casos, el ARN de localización específica de ADN y/o el ARN que codifica el polipéptido modificador dirigido al sitio se sintetizaránin vitrousando una enzima ARN polimerasa (p. ej., polimerasa T7, polimerasa T3, polimerasa SP6, etc.). Una vez sintetizado, el ARN puede contactar directamente con un ADN diana o puede introducirse en una célula mediante cualquiera de las técnicas bien conocidas para introducir ácidos nucleicos en células (p. ej., microinyección, electroporación, transfección, etc.).
Pueden proporcionarse a las células nucleótidos que codifican un ARN de localización específica de ADN (introducido como ADN o ARN) y/o un polipéptido Cas9 (introducido como ADN o ARN) y/o un polinucleótido donante usando técnicas de transfección bien desarrolladas; véase, p. ej., Angel y Yanik (2010)PLoS ONE5(7): e11756, y los reactivos TransMessenger® de Qiagen, el Kit de transfección de ARN Stemfect™ de Stemgent y el Kit de transfección de ARNm-TransIT® de Mirus Bio LLC. Véase también Beumer y col. (2008)Efficient gene targeting in Drosophila by direct embryo injection with zinc-finger nucleases. PNAS105(50): 19821-19826. Alternativamente, pueden proporcionarse ácidos nucleicos que codifican un ARN de localización específica de ADN y/o un polipéptido modificador dirigido al sitio y/o un polipéptido modificador dirigido al sitio quimérico y/o un polinucleótido donante, en vectores de ADN. Hay disponibles muchos vectores, p. ej., plásmidos, cósmidos, minicírculos, fagos, virus, etc., útiles para transferir ácidos nucleicos a células diana. Los vectores que comprenden el ácido nucleico o ácidos nucleicos pueden mantenerse episómicamente, p. ej., como plásmidos, ADN en minicírculo, virus tales como citomegalovirus, adenovirus, etc., o pueden integrarse en el genoma de la célula diana, a través de recombinación homóloga o integración aleatoria, por ejemplo vectores derivados de retrovirus tales como MMLV, VIH-1, ALV, etc.
Los vectores pueden proporcionarse directamente a las células en cuestión. En otras palabras, las células se ponen en contacto con vectores que comprenden el ácido nucleico que codifica el ARN de localización específica de ADN y/o un polipéptido modificador dirigido al sitio y/o un polipéptido modificador dirigido al sitio quimérico y/o un polinucleótido donante de manera que los vectores son captados por las células. Se conocen bien en la técnica métodos para poner en contacto células con vectores de ácido nucleico que son plásmidos, que incluyen electroporación, transfección con cloruro de calcio, microinyección y lipofección. Para el suministro de vectores víricos, las células se ponen en contacto con partículas víricas que comprenden el ácido nucleico que codifica un ARN de localización específica de ADN y/o un polipéptido modificador dirigido al sitio y/o un polipéptido modificador dirigido al sitio quimérico y/o un polinucleótido donante. Los retrovirus, por ejemplo, los lentivirus, son particularmente adecuados para el método de la invención. Los vectores retrovíricos utilizados habitualmente son “defectuosos” , es decir, incapaces de producir proteínas víricas requeridas para una infección productiva. Más bien, la replicación del vector requiere el crecimiento en una línea celular de empaquetamiento. Para generar partículas víricas que comprenden ácidos nucleicos de interés, los ácidos nucleicos retrovíricos que comprenden el ácido nucleico se empaquetan en cápsides víricas mediante una línea celular de empaquetamiento. Diferentes líneas celulares de empaquetamiento proporcionan una proteína de envoltura diferente (ecotrópica, anfotrópica o xenotrópica) que ha de incorporarse en la cápside, determinando esta proteína de envoltura la especificidad de la partícula vírica para las células (ecotrópica para murino y rata; anfotrópica para la mayoría de los tipos celulares de mamíferos, incluyendo ser humano, perro y ratón; y xenotrópica para la mayoría de los tipos celulares de mamífero, excepto las células de murino). La línea celular de empaquetamiento adecuada puede usarse para garantizar que las células sean localizadas específicamente por las partículas víricas empaquetadas. Se conocen bien en la técnica métodos para introducir los vectores retrovíricos que comprenden el ácido nucleico que codifica los factores de reprogramación en las líneas celulares de empaquetamiento y para recoger las partículas víricas que son generadas por las líneas de empaquetamiento. Los ácidos nucleicos también pueden introducirse mediante microinyección directa (p. ej., inyección de ARN en un embrión de pez cebra).
Los vectores utilizados para proporcionar los ácidos nucleicos que codifican ARN de localización específica de ADN y/o un polipéptido modificador dirigido al sitio y/o un polipéptido modificador dirigido al sitio quimérico y/o un polinucleótido donante a las células en cuestión comprenderán típicamente promotores adecuados para impulsar la expresión, es decir, la activación de la transcripción, del ácido nucleico de interés. En otras palabras, el ácido nucleico de interés estará unido operativamente a un promotor. Esto puede incluir promotores que actúan de forma ubicua, por ejemplo, el promotor de CMV-p-actina, o promotores inducibles, tales como promotores que son activos en poblaciones celulares particulares o que responden a la presencia de fármacos tales como tetraciclina. Mediante la activación de la transcripción, se prevé que la transcripción aumentará por encima de los niveles basales en la célula diana al menos aproximadamente 10 veces, al menos aproximadamente 100 veces, más usualmente al menos aproximadamente 1000 veces. Además, los vectores utilizados para proporcionar un ARN de localización específica de a Dn y/o un polipéptido modificador dirigido al sitio y/o un polipéptido modificador dirigido al sitio quimérico y/o un polinucleótido donante a las células en cuestión pueden incluir secuencias de ácido nucleico que codifican marcadores seleccionables en las células diana, para identificar células que han captado el ARN de localización específica de ADN y/o un polipéptido modificador dirigido al sitio y/o un polipéptido modificador dirigido al sitio quimérico y/o un polinucleótido donante.
Pueden usarse en su lugar un ARN de localización específica de ADN en cuestión y/o un polipéptido Cas9 y/o un polipéptido modificador dirigido al sitio quimérico para poner en contacto el ADN o introducirse en las células como ARN. Se conocen en la técnica métodos para introducir ARN en células y pueden incluir, por ejemplo, inyección directa, transfección o cualquier otro método utilizado para la introducción de ADN.
En su lugar, un polipéptido modificador dirigido al sitio en cuestión puede proporcionarse a las células como un polipéptido. Un polipéptido de este tipo puede fusionarse opcionalmente con un dominio polipeptídico que aumenta la solubilidad del producto. El dominio puede unirse al polipéptido a través de un sitio de escisión de proteasa definido, p. ej., una secuencia de TEV, que es escindida por la proteasa TEV. El enlazador también puede incluir una o más secuencias flexibles, p. ej., de 1 a 10 residuos de glicina. En algunas realizaciones, la escisión de la proteína de fusión se realiza en un tampón que mantiene la solubilidad del producto, p. ej., en presencia de urea de 0,5 a 2 M, en presencia de polipéptidos y/o polinucleótidos que aumentan la solubilidad, y similares. Los dominios de interés incluyen dominios endosomolíticos, p. ej., dominio HA de la gripe; y otros polipéptidos que ayudan en la producción, p. ej., dominio IF2, dominio GST, dominio GRPE y similares. El polipéptido puede formularse para una estabilidad mejorada. Por ejemplo, los péptidos pueden estar PEGilados, donde el grupo polietilenoxi proporciona una vida útil potenciada en el torrente sanguíneo.
De forma adicional o alternativamente, el polipéptido Cas9 sujeto puede fusionarse con un dominio que penetra en el polipéptido para promover la absorción por la célula. Se conoce en la técnica un número de dominios permeantes y pueden usarse en los polipéptidos no integradores de la presente invención, incluyendo péptidos, peptidomiméticos y portadores no peptídicos. Por ejemplo, un péptido permeante puede derivar de la tercera hélice alfa del factor de transcripción Antennapaedia deDrosophila melanogaster,denominado penetratina, que comprende la secuencia de aminoácidos RQIKIWFQNRRMKWKK (Id. de sec. n.° //). Como otro ejemplo, el péptido permeante comprende la secuencia de aminoácidos de la región básica tat del VIH-1, que puede incluir, por ejemplo, los aminoácidos 49-57 de la proteína tat de origen natural. Otros dominios perneantes incluyen motivos de poliarginina, por ejemplo, la región de los aminoácidos 34-56 de la proteína rev del VIH-1, nona-arginina, octa-arginina y similares. (Véase, por ejemplo, Futaki y col. (2003)Curr Protein Pept Sci.Abril de 2003; 4(2): 87-9 y 446; y Wender y col. (2000)Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A21 de noviembre de 2000; 97(24): 13003-8; las solicitudes de patente estadounidenses publicadas 20030220334; 20030083256; 20030032593; y 20030022831). La secuencia de nona-arginina (R9) es uno de los PTD más eficientes que se han caracterizado (Wender y col. 2000; Uemura y col. 2002). El sitio en el que se realiza la fusión puede seleccionarse para optimizar la actividad biológica, la secreción o las características de unión del polipéptido. El sitio óptimo se determinará mediante experimentación rutinaria.
Puede producirse un polipéptido Cas9 en cuestiónin vitroo por células eucariotas o por células procariotas, y puede procesarse adicionalmente mediante desplegamiento, p. ej., desnaturalización por calor, reducción por DTT, etc. y pueden volverse a plegar adicionalmente, usando métodos conocidos en la técnica.
Las modificaciones de interés que no alteran la secuencia primaria incluyen la derivatización química de los polipéptidos, p. ej., acilación, acetilación, carboxilación, amidación, etc. También se incluyen modificaciones de la glucosilación, p. ej., aquellas realizadas modificando los patrones de glucosilación de un polipéptido durante su síntesis y procesamiento o en etapas de procesamiento adicionales; p. ej., exponiendo el polipéptido a enzimas que afectan a la glucosilación, tales como enzimas glucosilantes o desglucosilantes de mamíferos. También se incluyen secuencias que tienen restos de aminoácidos fosforilados, p. ej., fosfotirosina, fosfoserina o fosfotreonina.
En la presente invención también se incluyen ARN de localización específica de ADN y polipéptidos Cas9 que se han modificado usando técnicas de biología molecular ordinarias y química de síntesis para mejorar su resistencia a la degradación proteolítica, para cambiar la especificidad de secuencia diana, para optimizar las propiedades de solubilidad, para alterar la actividad de proteínas o para hacerlas más adecuadas como agente terapéutico. Los análogos de dichos polipéptidos incluyen aquellos que contienen residuos distintos de los L-aminoácidos de origen natural, p. ej., D-aminoácidos o aminoácidos sintéticos de origen no natural. Los aminoácidos D pueden sustituirse por algunos o todos los residuos de aminoácidos.
Los polipéptidos modificadores dirigidos al sitio pueden prepararse mediante síntesisin vitro,usando métodos convencionales como es conocido en la técnica. Hay disponibles diversos aparatos comerciales de síntesis, por ejemplo, sintetizadores automatizados en Applied Biosystems, Inc., Beckman, etc. Mediante el uso de sintetizadores, los aminoácidos de origen natural pueden sustituirse con aminoácidos no naturales. La secuencia particular y la manera de preparación se determinarán por comodidad de uso, economía, pureza requerida y similares.
Si se desea, pueden introducirse diversos grupos en el péptido durante la síntesis o durante la expresión, lo que permite la unión a otras moléculas o a una superficie. Por lo tanto, pueden usarse cisteínas para preparar tioéteres, histidinas para unirse a un complejo de iones de metal, grupos carboxilo para formar amidas o ésteres, grupos amino para formar amidas y similares.
Los polipéptidos modificadores dirigidos al sitio también pueden aislarse y purificarse según métodos convencionales de síntesis recombinante. Puede prepararse un lisado del hospedador de expresión y el lisado se purifica usando HPLC, cromatografía de exclusión, electroforesis en gel, cromatografía de afinidad u otra técnica de purificación. En la mayoría de los casos, las composiciones que se usan comprenderán al menos el 20 % en peso del producto deseado, más usualmente al menos aproximadamente el 75 % en peso, preferiblemente al menos aproximadamente el 95 % en peso, y con fines terapéuticos, usualmente al menos aproximadamente el 99,5 % en peso, con respecto a los contaminantes relacionados con el método de preparación del producto y su purificación. Usualmente, los porcentajes se basarán en la proteína total.
Para inducir la escisión y recombinación de ADN, o cualquier modificación deseada a un ADN diana, o cualquier modificación deseada de un polipéptido asociado al ADN diana, el ARN de localización específica de ADN y/o el polipéptido modificador dirigido al sitio y/o el polinucleótido donante, ya sea que se introduzcan como ácidos nucleicos o polipéptidos, se proporcionan a las células durante aproximadamente 30 minutos a aproximadamente 24 horas, p. ej., 1 hora, 1,5 horas, 2 horas, 2,5 horas, 3 horas, 3,5 horas, 4 horas, 5 horas, 6 horas, 7 horas, 8 horas, 12 horas, 16 horas, 18 horas, 20 horas, o cualquier otro período de aproximadamente 30 minutos a aproximadamente 24 horas, que puede repetirse con una frecuencia de aproximadamente cada día a aproximadamente cada 4 días, p. ej., cada 1,5 días, cada 2 días, cada 3 días, o cualquier otra frecuencia de aproximadamente cada día a aproximadamente cada cuatro días. El agente o agentes pueden proporcionarse a las células una o más veces, p. ej., una vez, dos veces, tres veces o más de tres veces, y las células se dejan incubar con el agente o agentes durante una cantidad de tiempo después de cada evento de contacto, p. ej., 16-24 horas, tiempo después del cual el medio se reemplaza por medio fresco y las células se cultivan adicionalmente.
En los casos en los que se proporcionan dos o más complejos de localización específica diferentes a la célula (p. ej., dos ARN de localización específica de ADN diferentes que son complementarios a diferentes secuencias dentro del mismo o diferente ADN diana), los complejos pueden proporcionarse simultáneamente (p. ej., como dos polipéptidos y/o ácidos nucleicos), o suministrarse simultáneamente. Alternativamente, pueden proporcionarse consecutivamente, p. ej., proporcionándose en primer lugar el complejo de localización específica, seguido del segundo complejo de localización específica, etc. o viceversa.
Típicamente, se proporciona una cantidad eficaz del ARN de localización específica de ADN y/o polipéptido modificador dirigido al sitio y/o polinucleótido donante al ADN o células diana para inducir la escisión. Una cantidad eficaz del ARN de localización específica de ADN y/o el polipéptido modificador dirigido al sitio y/o el polinucleótido donante es la cantidad para inducir un aumento de 2 veces o más en la cantidad de modificación diana observada entre dos secuencias homólogas con respecto a un control negativo, p. ej., una célula en contacto con un vector vacío o polipéptido irrelevante. Es decir, una cantidad o dosis eficaz del ARN de localización específica de ADN y/o el polipéptido modificador dirigido al sitio y/o el polinucleótido donante inducirán un aumento de 2 veces, un aumento de 3 veces, un aumento de 4 veces o más en la cantidad de modificación de diana observada en una región de ADN diana, en algunos casos, un aumento de 5 veces, un aumento de 6 veces o más, en ocasiones un aumento de 7 veces u 8 veces o más en la cantidad de recombinación observada, p. ej., un aumento de 10 veces, 50 veces o 100 veces o más, en algunos casos, un aumento de 200 veces, 500 veces, 700 veces o 1000 veces o más, p. ej., un aumento de 5000 veces o 10.000 veces en la cantidad de recombinación observada. La cantidad de modificación diana puede medirse mediante cualquier método conveniente. Por ejemplo, un constructo indicador silencioso que comprende una secuencia complementaria al segmento de localización específica (secuencia de localización específica) del ARN de localización específica de ADN flanqueado por secuencias repetidas que, cuando se recombinan, reconstituirán un ácido nucleico que codifica un indicador activo puede cotransfectarse en las células, y la cantidad de proteína indicadora evaluada después del contacto con el<a>R<n>de localización específica de ADN y/o polipéptido modificador dirigido al sitio y/o polinucleótido donante, p. ej., 2 horas, 4 horas, 8 horas, 12 horas, 24 horas, 36 horas, 48 horas, 72 horas o más después del contacto con el a Rn de localización específica de ADN y/o polipéptido modificador dirigido al sitio y/o polinucleótido donante. Como otro ensayo de sensibilidad más, p. ej., el grado de recombinación en una región de ADN genómico de interés que comprende secuencias de ADN diana puede evaluarse mediante PCR o hibridación Southern de la región después del contacto con un ARN de localización específica de ADN y/o polipéptido modificador dirigido al sitio y/o polinucleótido donante, p. ej., 2 horas, 4 horas, 8 horas, 12 horas, 24 horas, 36 horas, 48 horas, 72 horas o más después del contacto con el ARN de localización específica de ADN y/o polipéptido modificador dirigido al sitio y/o polinucleótido donante.
El contacto de las células con un ARN de localización específica de ADN y/o un polipéptido modificador dirigido al sitio y/o un polinucleótido donante puede producirse en cualquier medio de cultivo y en cualquier condición de cultivo que promueva la supervivencia de las células. Por ejemplo, las células pueden suspenderse en cualquier medio nutriente adecuado que sea conveniente, tal como DMEM modificado de Iscove o RPMI 1640, suplementado con suero fetal de ternero o suero de cabra inactivado por calor (aproximadamente al 5-10 %), L-glutamina, un tiol, particularmente 2-mercaptoetanol, y antibióticos, p. ej., penicilina y estreptomicina. El cultivo puede contener factores de crecimiento a los que responden las células. Los factores de crecimiento, como se definen en la presente descripción, son moléculas capaces de promover la supervivencia, el crecimiento y/o la diferenciación de las células, ya sea en cultivo o en el tejido intacto, a través de efectos específicos sobre un receptor transmembrana. Los factores de crecimiento incluyen polipéptidos y factores no polipeptídicos. Las condiciones que promueven la supervivencia de las células son típicamente permisivas de la unión de extremos no homólogos y la reparación dirigida por homología.
En aplicaciones en las que es deseable insertar una secuencia polinucleotídica en una secuencia de ADN diana, también se proporciona a la célula un polinucleótido que comprende una secuencia donante que ha de insertarse. Por una “ secuencia donante” o “ polinucleótido donante” se entiende una secuencia de ácido nucleico que se inserta en el sitio de escisión inducido por un polipéptido modificador dirigido al sitio. El polinucleótido donante contendrá suficiente homología con una secuencia genómica en el sitio de escisión, p. ej., el 70 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % o 100 % de homología con las secuencias de nucleótidos que flanquean el sitio de escisión, p. ej., dentro de aproximadamente 50 bases o menos del sitio de escisión, p. ej., dentro de aproximadamente 30 bases, dentro de aproximadamente 15 bases, dentro de aproximadamente 10 bases, dentro de aproximadamente 5 bases, o que flaquean inmediatamente el sitio de escisión, para respaldar la reparación dirigida por homología entre ella y la secuencia genómica que porta homología. Aproximadamente 25, 50, 100 o 200 nucleótidos, o más de 200 nucleótidos, de homología de secuencia entre un donante y una secuencia genómica (o cualquier valor integral entre 10 y 200 nucleótidos, o más) respaldarán la reparación dirigida por homología. Las secuencias donantes pueden tener cualquier longitud, p. ej., 10 nucleótidos o más, 50 nucleótidos o más, 100 nucleótidos o más, 250 nucleótidos o más, 500 nucleótidos o más, 1000 nucleótidos o más, 5000 nucleótidos o más, etc.
La secuencia donante típicamente no es idéntica a la secuencia genómica que reemplaza. Más bien, la secuencia donante puede contener al menos uno o más cambios, inserciones, deleciones, inversiones o reordenamientos de base única con respecto a la secuencia genómica, siempre que haya presente suficiente homología para respaldar la reparación dirigida por homología. En algunas realizaciones, la secuencia donante comprende una secuencia no homóloga flanqueada por dos regiones de homología, de manera que la reparación dirigida por homología entre la región de ADN diana y las dos secuencias flanqueantes da como resultado la inserción de la secuencia no homóloga en la región diana. Las secuencias donantes también pueden comprender una cadena principal de vector que contiene secuencias que no son homólogas con la región de ADN de interés y que no están destinadas a la inserción en la región de ADN de interés. Generalmente, la región o regiones homólogas de una secuencia donante tendrán al menos el 50 % de identidad de secuencia con una secuencia genómica con la que se desea la recombinación. En determinadas realizaciones, hay presente un 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 98 %, 99%o 99,9%de identidad de secuencia. Puede haber presente cualquier valor entre el 1%y el 100%de identidad de secuencia, dependiendo de la longitud del polinucleótido donante.
La secuencia donante puede comprender determinadas diferencias de secuencia en comparación con la secuencia genómica, p. ej., sitios de restricción, polimorfismos de nucleótidos, marcadores seleccionables (p. ej., genes de resistencia a fármacos, proteínas fluorescentes, enzimas, etc.), etc., que pueden usarse para evaluar la inserción exitosa de la secuencia donante en el sitio de escisión o en algunos casos pueden usarse para otros fines (p. ej., para indicar la expresión en el locus genómico diana). En algunos casos, si se ubican en una región codificante, dichas diferencias de secuencia de nucleótidos no cambiarán la secuencia de aminoácidos, o harán cambios de aminoácidos silenciosos (es decir, cambios que no afectan a la estructura o función de la proteína). Alternativamente, estas diferencias de secuencias pueden incluir secuencias de recombinación flanqueantes tales como FLP, secuencias loxP, o similares, que pueden activarse en un momento posterior para la eliminación de la secuencia marcadora.
La secuencia donante puede proporcionarse a la célula como ADN monocatenario, ARN monocatenario, ADN bicatenario o ARN bicatenario. Puede introducirse en una célula en forma lineal o circular. Si se introduce en forma lineal, los extremos de la secuencia donante pueden protegerse (p. ej., de la degradación exonucleolítica) mediante métodos conocidos por los expertos en la técnica. Por ejemplo, se añaden uno o más residuos de didesoxinucleótido al extremo 3' de una molécula lineal y/o se ligan oligonucleótidos autocomplementarios a uno o ambos extremos. Véase, por ejemplo, Chang y col. (1987)Proc. Natl. Acad Sci USA84:4959-4963; Nehls y col. (1996)Science272:886-889. Los métodos adicionales para proteger polinucleótidos exógenos de la degradación incluyen, pero no se limitan a, la adición de uno o más grupos amino terminales y el uso de enlaces internucleotídicos modificados tales como, por ejemplo, fosforotioatos, fosforamidatos y residuos de O-metil ribosa O desoxirribosa. Como alternativa a proteger los extremos de una secuencia donante lineal, pueden incluirse longitudes adicionales de secuencia fuera de las regiones de homología que pueden degradarse sin repercutir en la recombinación. Puede introducirse una secuencia donante en una célula como parte de una molécula de vector que tiene secuencias adicionales tales como, por ejemplo, orígenes de replicación, promotores y genes que codifican resistencia a antibióticos. Además, las secuencias donantes pueden introducirse como ácido nucleico desnudo, como ácido nucleico complejado con un agente tal como un liposoma o poloxámero, o pueden suministrarse mediante virus (p. ej., adenovirus, a Av ), como se ha descrito anteriormente para ácidos nucleicos que codifican un ARN de localización específica de ADN y/o polipéptido modificador dirigido al sitio y/o polinucleótido donante.
Siguiendo los métodos descritos anteriormente, una región de ADN de interés puede escindirse y modificarse, es decir “ modificarse genéticamente” ,ex vivo.En algunas realizaciones, como cuando se ha insertado un marcador seleccionable en la región de ADN de interés, la población de células puede enriquecerse para aquellas que comprenden la modificación genética separando las células modificadas genéticamente de la población restante. Antes del enriquecimiento, las células “ modificadas genéticamente” pueden constituir solamente aproximadamente el 1 % o más (p. ej., el 2 % o más, el 3 % o más, el 4 % o más, el 5 % o más, el 6 % o más, el 7 % o más, el 8 % o más, el 9 % o más, el 10 % o más, el 15 % o más o el 20 % o más) de la población celular. La separación de las células “ modificadas genéticamente” puede lograrse mediante cualquier técnica de separación conveniente adecuada para el marcador de selección utilizado. Por ejemplo, si se ha insertado un marcador fluorescente, las células pueden separarse mediante clasificación de células activada por fluorescencia, mientras que si se ha insertado un marcador de superficie celular, las células pueden separarse de la población heterogénea mediante técnicas de separación por afinidad, p. ej., separación magnética, cromatografía de afinidad, “ barrido” con un reactivo de afinidad unido a una matriz sólida u otra técnica conveniente. Las técnicas que proporcionan una separación precisa incluyen clasificadores de células activadas por fluorescencia, que pueden tener grados variables de sofisticación, tales como múltiples canales de color, canales de detección de dispersión de luz de ángulo bajo y de luz obtusa, canales de impedancia, etc. Las células pueden seleccionarse contra células muertas empleando colorantes asociados con células muertas (p. ej., yoduro de propidio). Puede emplearse cualquier técnica que no sea indebidamente perjudicial para la viabilidad de las células modificadas genéticamente. De esta manera se logran composiciones celulares que están altamente enriquecidas para células que comprenden ADN modificado. Por “ altamente enriquecidas” , se entiende que las células modificadas genéticamente serán el 70 % o más, el 75 % o más, el 80 % o más, el 85 % o más, el 90 % o más de la composición celular, por ejemplo, aproximadamente el 95 % o más, o el 98 % o más de la composición celular. En otras palabras, la composición puede ser una composición sustancialmente pura de células modificadas genéticamente.
Las células modificadas genéticamente producidas mediante los métodos descritos en la presente descripción pueden usarse inmediatamente. Alternativamente, las células pueden congelarse a temperaturas de nitrógeno líquido y almacenarse durante largos períodos de tiempo, descongelándose y siendo susceptibles de reutilizarse. En dichos casos, las células usualmente se congelarán en dimetilsulfóxido (DMSO) al 10 %, suero al 50 %, medio tamponado al 40 % o alguna otra solución como se usa habitualmente en la técnica para conservar células a dichas temperaturas de congelación y se descongelarán de una manera conocida habitualmente en la técnica para descongelar células cultivadas congeladas.
Las células modificadas genéticamente pueden cultivarsein vitroen diversas condiciones de cultivo. Las células pueden expandirse en cultivo, es decir, crecer en condiciones que promueven su proliferación. El medio de cultivo puede ser líquido o semisólido, p. ej., que contiene agar, metilcelulosa, etc. La población celular puede suspenderse en un medio nutriente adecuado, tal como DMEM modificado de Iscove o RPMI 1640, normalmente suplementado con suero fetal de ternero (aproximadamente al 5-10 %), L-glutamina, un tiol, particularmente 2-mercaptoetanol, y antibióticos, p. ej., penicilina y estreptomicina. El cultivo puede contener factores de crecimiento a los que responden los linfocitos T reguladores. Los factores de crecimiento, como se definen en la presente descripción, son moléculas capaces de promover la supervivencia, el crecimiento y/o la diferenciación de las células, ya sea en cultivo o en el tejido intacto, a través de efectos específicos sobre un receptor transmembrana. Los factores de crecimiento incluyen polipéptidos y factores no polipeptídicos.
Las células que se han modificado genéticamente de esta manera pueden trasplantarse a un sujeto con fines tales como terapia génica, p. ej., para tratar una enfermedad o como un agente terapéutico antivírico, antipatógeno o antineoplásico, para la producción de organismos modificados genéticamente en agricultura, o para investigación biológica. El sujeto puede ser un neonato, un joven o un adulto. Son de particular interés los sujetos mamíferos. Las especies de mamífero que pueden tratarse con los presentes métodos incluyen cánidos y félidos; équidos; bóvidos; óvidos; etc. y primates, particularmente seres humanos. Pueden usarse modelos en animales, particularmente mamíferos pequeños (p. ej., ratón, rata, cobaya, hámster, lagomorfos (p. ej., conejo), etc.) para investigaciones experimentales.
Las células pueden proporcionarse al sujeto solas o con un sustrato o una matriz adecuados, p. ej., para respaldar su crecimiento y/u organización en el tejido al que se trasplantan. Por lo general, se administrarán al menos 1 x 103 células, por ejemplo 5 x 103 células, 1 x 104 células, 5 x 104 células, 1 x 105 células, 1 x 106 células o más. Las células pueden introducirse en el sujeto a través de cualquiera de las siguientes vías: parenteral, subcutánea, intravenosa, intracraneal, intraespinal, intraocular o en el fluido espinal. Las células pueden introducirse mediante inyección, catéter o similares. Los ejemplos de métodos para el suministro local, es decir, el suministro al sitio de la lesión, incluyen, p. ej., a través de un depósito Ommaya, p. ej., para el suministro intratecal (véanse, p. ej., las patentes estadounidenses 5.222.982 y 5385582); mediante inyección en embolada, p. ej., mediante una jeringa, p. ej., en una articulación; por infusión continua, p. ej., por canulación, p. ej., con convección (véase, p. ej., la solicitud estadounidense n.° 20070254842); o implantando un dispositivo sobre el cual se han fijado las células de manera reversible (véanse, p. ej., las solicitudes estadounidenses 20080081064 y 20090196903). También pueden introducirse células no humanas en un embrión no humano (p. ej., un blastocisto) con el fin de generar un animal transgénico no humano (p. ej., un ratón transgénico).
El número de administraciones de tratamiento a un sujeto puede variar. La introducción de las células modificadas genéticamente en el sujeto puede ser un evento de un tiempo; pero en determinadas situaciones, dicho tratamiento puede provocar una mejora durante un período de tiempo limitado y requerir una serie continua de tratamientos repetidos. En otras situaciones, pueden requerirse múltiples administraciones de las células modificadas genéticamente antes de que se observe un efecto. Los protocolos exactos dependen de la enfermedad o afección, el estadio de la enfermedad y los parámetros del sujeto individual que se está tratando.
El ARN de localización específica de ADN y/o el polipéptido Cas9 y/o el polinucleótido donante son para su uso en la modificación del ADN celularin vivocon fines de terapia génica, p. ej., para tratar una enfermedad o como un agente antivírico, antipatógeno o antineoplásico. En estas realizaciones, un ARN de localización específica de ADN y/o polipéptido modificador dirigido al sitio y/o polinucleótido donante para su uso se administran directamente al individuo. Un ARN de localización específica de Ad N y/o un polipéptido modificador dirigido al sitio y/o un polinucleótido donante pueden administrarse mediante cualquiera de un número de métodos bien conocidos en la técnica para la administración de péptidos, moléculas pequeñas y ácidos nucleicos a un sujeto. Puede incorporarse un ARN de localización específica de ADN y/o un polipéptido modificador dirigido al sitio y/o un polinucleótido donante en una diversidad de formulaciones. Más particularmente, un ARN de localización específica de ADN y/o polipéptido modificador dirigido al sitio y/o polinucleótido donante de la presente invención pueden formularse en composiciones farmacéuticas mediante combinación con portadores o diluyentes farmacéuticamente aceptables adecuados.
Las preparaciones farmacéuticas son composiciones que incluyen uno o más ARN de localización específica de ADN y/o polipéptido modificador dirigido al sitio y/o polinucleótido donante presentes en un vehículo farmacéuticamente aceptable. Los “vehículos farmacéuticamente aceptables” pueden ser vehículos aprobados por una agencia reguladora del gobierno Federal o estatal o enumerados en la Farmacopea de los EE.UU. u otra farmacopea generalmente reconocida para su uso en mamíferos, tales como seres humanos. El término “vehículo” se refiere a un diluyente, adyuvante, excipiente o portados con el que se formula un compuesto de la invención para su administración a un mamífero. Dichos vehículos farmacéuticos pueden ser lípidos, p. ej., liposomas, p. ej., dendrímeros de liposomas; líquidos, tales como agua y aceites, incluyendo aquellos de origen petrolífero, animal, vegetal o sintético, tales como aceite de cacahuete, aceite de soja, aceite mineral, aceite de sésamo y similares, solución salina; goma arábiga, gelatina, pasta de almidón, talco, queratina, sílice coloidal, urea y similares. Además, pueden usarse agentes auxiliares, estabilizantes, espesantes, lubricantes y colorantes. Las composiciones farmacéuticas pueden formularse en preparaciones en formas sólidas, semisólidas, líquidas o gaseosas, tales como comprimidos, cápsulas, polvos, gránulos, pomadas, soluciones, supositorios, inyecciones, inhaladores, geles, microesferas y aerosoles. Como tal, la administración de un ARN de localización específica de ADN y/o polipéptido modificador dirigido al sitio y/o polinucleótido donante puede lograrse de diversas maneras, incluyendo la administración oral, bucal, rectal, parenteral, intraperitoneal, intradérmica, transdérmica, intratraqueal, intraocular, etc. El agente activo puede ser sistémico después de la administración o puede localizarse usando administración regional, administración intramural o uso de un implante que actúa reteniendo la dosis activa en el sitio de implantación. El agente activo puede formularse para actividad inmediata o puede formularse para liberación sostenida.
Para algunas afecciones, particularmente las condiciones del sistema nervioso central, puede ser necesario formular agentes para cruzar la barrera hematoencefálica (BHE). Una estrategia para el suministro de fármacos a través de la barrera hematoencefálica (BHE) implica la alteración de la BHE, ya sea por medios osmóticos tales como manitol o leucotrienos, o bioquímicamente mediante el uso de sustancias vasoactivas tales como bradicinina. El potencial para usar la abertura de BHE para localizar específicamente agentes específicos en tumores cerebrales también es una opción. Un agente de alteración de la BHE puede coadministrarse con las composiciones terapéuticas de la invención cuando las composiciones se administran mediante inyección intravascular. Otras estrategias para pasar a través de la BHE pueden implicar el uso de sistemas de transporte endógenos, incluyendo la transcitosis mediada por Caveolina-1, transportadores mediados por portadores tales como portadores de glucosa y aminoácidos, transcitosis mediada por receptor para insulina o transferrina, y transportadores de flujo activo tales como p-glucoproteína. Los restos de transporte activo también pueden conjugarse con los compuestos terapéuticos para su uso en la invención para facilitar el transporte a través de la pared endotelial del vaso sanguíneo. Alternativamente, el suministro de fármacos de agentes terapéuticos detrás de la BHE puede ser mediante suministro local, por ejemplo, mediante suministro intratecal, p. ej., a través de un depósito Ommaya (véanse, p. ej., las patentes estadounidenses n.° 5.222.982 y 5385582); mediante inyección en embolada, p. ej., mediante una jeringa, p. ej., por vía intravítrea o por vía intracraneal; por infusión continua, p. ej., por canulación, p. ej., con convección (véase, p. ej., la solicitud estadounidense n.° 20070254842); o implantando un dispositivo sobre el cual se ha fijado el agente de manera reversible (véanse, p. ej., las solicitudes estadounidenses 20080081064 y 20090196903).
Típicamente, se proporciona una cantidad eficaz de un ARN de localización específica de ADN y/o polipéptido modificador dirigido al sitio y/o polinucleótido donante. Como se ha analizado anteriormente con respecto a métodos exvivo,una cantidad eficaz o dosis eficaz de un ARN de localización específica de ADN y/o polipéptido modificador dirigido al sitio y/o polinucleótido donantein vivoes la cantidad para inducir un aumento de 2 veces o más en la cantidad de recombinación observada entre dos secuencias homólogas con respecto a un control negativo, p. ej., una célula en contacto con un vector vacío o polipéptido irrelevante. La cantidad de recombinación puede medirse mediante cualquier método conveniente, p. ej., como se ha descrito anteriormente y se conoce en la técnica. El cálculo de la cantidad eficaz o dosis eficaz de un ARN de localización específica de ADN y/o polipéptido modificador dirigido al sitio y/o polinucleótido donante que ha de administrarse está dentro de la habilidad de un experto en la técnica, y será rutinario para los expertos en la técnica. La cantidad final que ha de administrarse dependerá de la vía de administración y de la naturaleza del trastorno o afección que ha de tratarse.
La cantidad eficaz proporcionada a un paciente particular dependerá de una diversidad de factores, varios de los cuales diferirán de un paciente a otro. Un médico competente podrá determinar una cantidad eficaz de un agente terapéutico para administrar a un paciente para detener o revertir la progresión de la afección de la enfermedad según sea necesario. Utilizando datos de animales DL50, y otra información disponible para el agente, un médico puede determinar la dosis segura máxima para un individuo, dependiendo de la vía de administración. Por ejemplo, una dosis administrada por vía intravenosa puede ser más que una dosis administrada por vía intratecal, dado el mayor cuerpo de fluido en el que se está administrando la composición terapéutica. Similarmente, pueden administrarse composiciones que se aclaran rápidamente del cuerpo a dosis más altas, o en dosis repetidas, para mantener una concentración terapéutica. Utilizando habilidades ordinarias, el médico competente será capaz de optimizar la dosificación de un terapéutico particular en el curso de ensayos clínicos de rutina.
Para su inclusión en un medicamento, puede obtenerse un ARN de localización específica de ADN y/o un polipéptido modificador dirigido al sitio y/o un polinucleótido donante de una fuente comercial adecuada. Como una proposición general, la cantidad total farmacéuticamente eficaz del ARN de localización específica de ADN y/o polipéptido modificador dirigido al sitio y/o polinucleótido donante administrado por vía parenteral por dosis estará en un intervalo que puede medirse mediante una curva de respuesta a la dosis.
Las terapias basadas en un ARN de localización específica de ADN y/o polipéptido modificador dirigido al sitio y/o polinucleótidos donantes, es decir, preparaciones de un ARN de localización específica de ADN y/o polipéptido modificador dirigido al sitio y/o polinucleótido donante que ha de usarse para la administración terapéutica, deben ser estériles. La esterilidad se logra fácilmente mediante filtración a través de membranas de filtración estériles (p. ej., membranas de 0,2 pm). Las composiciones terapéuticas generalmente se colocan en un recipiente que tiene un puerto de acceso estéril, por ejemplo, una bolsa o vial de solución intravenosa que tiene un tapón perforable mediante una aguja de inyección hipodérmica. Las terapias basadas en un ARN de localización específica de ADN y/o polipéptido modificador dirigido al sitio y/o polinucleótido donante pueden almacenarse en recipientes unitarios o multidosis, por ejemplo, ampollas o viales sellados, en forma de una solución acuosa o en forma de una formulación liofilizada para su reconstitución. Como ejemplo de una formulación liofilizada, se cargan viales de 10 ml con 5 ml de solución acuosa estéril al 1 % (p/v) de compuesto, y la mezcla resultante se liofiliza. La solución de infusión se prepara reconstituyendo el compuesto liofilizado usando agua bacteriostática para inyección.
Las composiciones farmacéuticas pueden incluir, dependiendo de la formulación deseada, portadores no tóxicos farmacéuticamente aceptables de diluyentes, que se definen como vehículos utilizados habitualmente para formular composiciones farmacéuticas para la administración a animales o seres humanos. El diluyente se selecciona para no afectar a la actividad biológica de la combinación. Son ejemplos de dichos diluyentes agua destilada, agua tamponada, solución salina fisiológica, PBS, solución de Ringer, solución de dextrosa y solución de Hank. Además, la composición farmacéutica o formulación puede incluir otros portadores, adyuvantes, o estabilizadores no tóxicos, no terapéuticos, no inmunogénicos, excipientes y similares. Las composiciones también pueden incluir sustancias adicionales para aproximar las condiciones fisiológicas, tales como agentes de ajuste y tamponamiento del pH, agentes de ajuste de la toxicidad, agentes humectantes y detergentes.
La composición también puede incluir cualquiera de una diversidad de agentes estabilizantes, tales como un antioxidante, por ejemplo. Cuando la composición farmacéutica incluye un polipéptido, el polipéptido puede complejarse con diversos compuestos bien conocidos que potencian la estabilidadin vivodel polipéptido, o potenciar de cualquier otra manera sus propiedades farmacológicas (p. ej., aumentar la semivida del polipéptido, reducir su toxicidad, potenciar la solubilidad o absorción). Los ejemplos de dichas modificaciones o agentes formadores de complejos incluyen sulfato, gluconato, citrato y fosfato. Los ácidos nucleicos o polipéptidos de una composición también pueden complejarse con moléculas que potencian sus atributos invivo.Dichas moléculas incluyen, por ejemplo, carbohidratos, poliaminas, aminoácidos, otros péptidos, iones (p. ej., sodio, potasio, calcio, magnesio, manganeso) y lípidos.
Pueden encontrarse directrices adicionales con respecto a las formulaciones que son adecuadas para diversos tipos de administración enRemington's Pharmaceutical Sciences,Mace Publishing Company, Filadelfia, Pa., 17a ed. (1985). Para una revisión breve de métodos para el suministro de fármacos, véase, Langer,Science249:1527-1533 (1990).
Las composiciones farmacéuticas pueden administrarse para tratamientos profilácticos y/o terapéuticos. La toxicidad y la eficacia terapéutica del ingrediente activo pueden determinarse según procedimientos farmacéuticos estándar en cultivos celulares y/o animales experimentales, incluyendo, por ejemplo, determinar la DL50 (la dosis letal para el 50 % de la población) y la DE50 (la dosis terapéuticamente eficaz en el 50 % de la población). La relación de dosis entre los efectos tóxicos y terapéuticos es el índice terapéutico y puede expresarse como la relación DL50/DE50. Se prefieren las terapias que presentan índices terapéuticos grandes.
Los datos obtenidos del cultivo celular y/o los estudios en animales pueden usarse en la formulación de un intervalo de dosificaciones para seres humanos. La dosificación del ingrediente activo típicamente se alinea dentro de un intervalo de concentraciones circulantes que incluyen la DE50 con baja toxicidad. La dosificación puede variar dentro de este intervalo dependiendo de la forma de dosificación empleada y la vía de administración utilizada.
Los componentes utilizados para formular las composiciones farmacéuticas son preferiblemente de alta pureza y están prácticamente exentos de contaminantes potencialmente nocivos (p. ej., al menos el grado Nacional de Alimentos (NF, por sus siglas en inglés), generalmente al menos de grado analítico, y de forma más típica al menos el grado farmacéutico). Además, las composiciones destinadas al usoin vivousualmente son estériles. En la medida en que deba sintetizarse un compuesto dado antes de su uso, el producto resultante típicamente está prácticamente exento de cualquier agente potencialmente tóxico, particularmente cualquier endotoxina, que pueda estar presente durante el proceso de síntesis o purificación. Las composiciones para administración parental también son estériles, sustancialmente isotónicas y se preparan en condiciones de GMP.
La cantidad eficaz de una composición terapéutica que ha de proporcionarse a un paciente particular dependerá de una diversidad de factores, varios de los cuales diferirán de un paciente a otro. Un médico competente podrá determinar una cantidad eficaz de un agente terapéutico para administrar a un paciente para detener o revertir la progresión de la afección de la enfermedad según sea necesario. Utilizando datos de animales DL50, y otra información disponible para el agente, un médico puede determinar la dosis segura máxima para un individuo, dependiendo de la vía de administración. Por ejemplo, una dosis administrada por vía intravenosa puede ser más que una dosis administrada por vía intratecal, dado el mayor cuerpo de fluido en el que se está administrando la composición terapéutica. Similarmente, pueden administrarse composiciones que se aclaran rápidamente del cuerpo a dosis más altas, o en dosis repetidas, para mantener una concentración terapéutica. Utilizando habilidades ordinarias, el médico competente será capaz de optimizar la dosificación de un terapéutico particular en el curso de ensayos clínicos de rutina.
Composiciones
La presente invención proporciona una composición que comprende un ARN de localización específica de ADN en cuestión y un polipéptido Cas9 en donde un dominio de transducción de proteínas se une covalentemente (A) al extremo amino o (B) al extremo carboxilo del polipéptido Cas9, en donde el dominio de transducción de proteínas facilita el recorrido del polipéptido Cas9 desde el citosol hasta el interior de un orgánulo. Una composición en cuestión es útil para realizar un método de la presente descripción, p. ej., un método para la modificación específica de sitio de un ADN diana; etc.
Composiciones que comprenden un ARN de localización específica de ADN
La presente invención proporciona una composición que comprende un ARN de localización específica de ADN en cuestión. La composición puede comprender, además del ARN de localización específica de ADN, uno o más de: una sal, p. ej., NaCl, MgCb, KCl, MgSO4, etc.; un agente tamponador, p. ej., un tampón tris, ácido N-(2-hidroxietil)piperazina-N'-(ácido 2-etanosulfónico) (HEPES), ácido 2-(N-morfolino)etanosulfónico (MES), sal de sodio de MES, ácido 3-(N-morfolino)propanosulfónico (MOPS), ácido N-tris [hidroximetil]metil-3-aminopropanosulfónico (TAPS), etc.; un agente solubilizante; un detergente, p. ej., un detergente no iónico tal como Tween-20, etc.; un inhibidor de nucleasas; y similares. Por ejemplo, en algunos casos, una composición en cuestión comprende un ARN de localización específica de ADN en cuestión y un tampón para estabilizar ácidos nucleicos.
En algunas realizaciones, un ARN de localización específica de ADN presente en una composición en cuestión es puro, p. ej., al menos aproximadamente el 75 %, al menos aproximadamente el 80 %, al menos aproximadamente el 85 %, al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 95 %, al menos aproximadamente el 98 %, al menos aproximadamente el 99 % o más del 99 % puro, donde “ % de pureza” significa que el ARN de localización específica de ADN es el porcentaje mencionado exento de otras macromoléculas, o contaminantes que pueden estar presentes durante la producción del ARN de localización específica de ADN.
Composiciones que comprenden un ARN de localización específica de ADN y un polipéptido modificador dirigido al sitio
La presente invención proporciona una composición que comprende: (i) un ARN de localización específica de ADN o un polinucleótido de ADN que codifica el mismo; y ii) un polipéptido Cas9, o un polinucleótido que codifica el mismo. En algunos casos, el polipéptido Cas9 es un polipéptido Cas9 de origen natural.
La presente invención proporciona una composición que comprende: (i) un ARN de localización específica de ADN, como se ha descrito anteriormente, comprendiendo el ARN de localización específica de ADN: (a) un primer segmento que comprende una secuencia de nucleótidos que es complementaria a una secuencia en un ADN diana; y (b) un segundo segmento que interactúa con un polipéptido modificador dirigido al sitio; y (ii) el polipéptido modificador dirigido al sitio, o un polinucleótido que codifica el mismo, comprendiendo el polipéptido modificador dirigido al sitio: (a) una porción de unión a ARN que interactúa con el ARN de localización específica de ADN; y (b) una porción de actividad que presenta actividad enzimática dirigida al sitio, en donde el sitio de actividad enzimática está determinado por el ARN de localización específica de ADN.
En algunos casos, una composición en cuestión comprende: una composición que comprende: (i) un ARN de localización específica de ADN en cuestión, comprendiendo el ARN de localización específica de ADN: (a) un primer segmento que comprende una secuencia de nucleótidos que es complementaria a una secuencia en un ADN diana; y (b) un segundo segmento que interactúa con un polipéptido Cas9; y (ii) el polipéptido Cas9-de sitio, comprendiendo el polipéptido Cas9: (a) una porción de unión a ARN que interactúa con el ARN de localización específica de ADN; y (b) una porción de actividad que presenta actividad enzimática dirigida al sitio, en donde el sitio de actividad enzimática está determinado por el ARN de localización específica de ADN.
En algunas realizaciones, una composición en cuestión incluye ambas moléculas de ARN de un ARN de localización específica de ADN de molécula doble. Como tal, en algunas realizaciones, una composición en cuestión incluye un ARN activador que comprende un segmento formador de dúplex que es complementario al segmento formador de dúplex de un ARN localizador específico (véase la Figura 1A). Los segmentos formadores de dúplex del ARN activador y el ARN localizador específico se hibridan para formar el dúplex de ARNbc del segmento de unión a proteínas del ARN de localización específica de ADN. El ARN localizador específico proporciona además el segmento de localización específica de ADN (monocatenario) del ARN de localización específica de ADN y, por lo tanto, dirige el ARN de localización específica de ADN a una secuencia específica dentro del ADN diana. Como un ejemplo no limitativo, el segmento formador de dúplex del ARN activador comprende una secuencia de nucleótidos que tiene al menos aproximadamente el 70 %, al menos aproximadamente el 80 %, al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 95 %, al menos aproximadamente el 98 % o el 100 % de identidad con la secuencia 5-UAGCAAGUUAAAAU-3' (Id. de sec. n.° 562). Como otro ejemplo no limitativo, el segmento formador de dúplex del ARN localizador específico comprende una secuencia de nucleótidos que tiene al menos aproximadamente el 70 %, al menos aproximadamente el 80 %, al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 95 %, al menos aproximadamente el 98 % o el 100 % de identidad con la secuencia 5'-GUUUU<a>G<a>GCUA-3' (Id. de sec. n.° 679).
Una composición en cuestión puede comprender, además de i) un ARN de localización específica de ADN en cuestión; y ii) un polipéptido modificador dirigido al sitio, o un polinucleótido que codifica el mismo, uno o más de: una sal, p. ej., NaCl, MgCb, KCl, MgSO4, etc.; un agente tamponador, p. ej., un tampón Tris, HEPES, MES, sal de sodio de MES, MOPS, TAPS, etc.; un agente solubilizante; un detergente, p. ej., un detergente no iónico tal como Tween-20, etc.; un inhibidor de proteasas; un agente reductor (p. ej., ditiotreitol); y similares.
En algunos casos, los componentes de la composición son individualmente puros, p. ej., cada uno de los componentes es al menos aproximadamente el 75 %, al menos aproximadamente el 80 %, al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 95 %, al menos aproximadamente el 98 %, al menos aproximadamente el 99 %, o al menos el 99 %, puro. En algunos casos, los componentes individuales de una composición en cuestión son puros antes de añadirlos a la composición.
Por ejemplo, en algunas realizaciones, un polipéptido modificador dirigido al sitio presente en una composición en cuestión es puro, p. ej., al menos aproximadamente el 75 %, al menos aproximadamente el 80 %, al menos aproximadamente el 85 %, al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 95 %, al menos aproximadamente el 98 %, al menos aproximadamente el 99 % o más del 99 % puro, donde el “ % de pureza” significa que el polipéptido modificador dirigido al sitio está en el porcentaje mencionado exento de otras proteínas (p. ej., proteínas distintas del polipéptido modificador dirigido al sitio), otras macromoléculas o contaminantes que pueden estar presentes durante la producción del polipéptido modificador dirigido al sitio.
Definiciones - parte II
La expresión “ de origen natural” o “ sin modificar” como se usa en la presente descripción como se aplica a un ácido nucleico, un polipéptido, una célula o un organismo, se refiere a un ácido nucleico, polipéptido, célula u organismo que se encuentra en la naturaleza. Por ejemplo, una secuencia polipeptídica o polinucleotídica que está presente en un organismo (que incluye virus) que puede aislarse de una fuente en la naturaleza y que no ha sido modificada intencionalmente por un ser humano en el laboratorio es de origen natural.
“ Heterólogo” , como se usa en la presente descripción, significa una secuencia de nucleótidos o polipéptidos que no se encuentra en el ácido nucleico o proteína nativos, respectivamente. Por ejemplo, en un polipéptido dirigido al sitio Cas9 variante de fusión, un polipéptido dirigido al sitio Cas9 variante puede fusionarse con un polipéptido heterólogo (es decir, un polipéptido distinto de Cas9). El polipéptido heterólogo puede presentar una actividad (p. ej., actividad enzimática) que también presentará el polipéptido dirigido al sitio Cas9 variante de fusión. Una secuencia de ácido nucleico heteróloga puede unirse a un polipéptido dirigido al sitio Cas9 variante (p. ej., mediante ingeniería genética) para generar una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido dirigido al sitio Cas9 variante de fusión.
La expresión “ polipéptido quimérico” se refiere a un polipéptido que no es de origen natural, p. ej., se produce mediante la combinación artificial de dos segmentos de secuencia de aminoácidos separados de cualquier otra manera a través de intervención humana. Por lo tanto, un polipéptido quimérico también es el resultado de la intervención humana. Por lo tanto, un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos quimérica es un polipéptido quimérico.
Por “ polipéptido dirigido al sitio” o “ polipéptido dirigido al sitio de unión a ARN” o “ polipéptido dirigido al sitio de unión a ARN” se entiende un polipéptido que se une a ARN y se localiza específicamente a una secuencia de ADN específica. Un polipéptido dirigido al sitio como se describe en la presente descripción se localiza específicamente a una secuencia de ADN específica por la molécula de ARN a la que está unido. La molécula de ARN comprende una secuencia que es complementaria a una secuencia diana dentro del ADN diana, localizando específicamente de este modo el polipéptido unido a una ubicación específica dentro del ADN diana (la secuencia diana).
En algunas realizaciones, un ácido nucleico en cuestión para el uso (p. ej., un ARN de localización específica de ADN, un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un ARN de localización específica de ADN; un ácido nucleico que codifica un polipéptido Cas9; etc.) comprende una modificación o secuencia que proporciona una característica deseable adicional (p. ej., estabilidad modificada o regulada; localización específica subcelular; seguimiento, p. ej., un marcador fluorescente; un sitio de unión para una proteína o complejo de proteínas; etc.). Los ejemplos no limitativos incluyen: una caperuza 5' (p. ej., una caperuza de 7-metilguanilato (m7G)); una cola poliadenilada en 3' (es decir, una cola de poli(A) 3'; una secuencia de ribointerruptor (p. ej., para permitir la estabilidad regulada y/o la accesibilidad regulada por proteínas y/o complejos de proteínas); una modificación o secuencia que localiza específicamente el ARN a una ubicación subcelular (p. ej., núcleo, mitocondrias, cloroplastos y similares); una modificación o secuencia que proporciona el seguimiento (p. ej., conjugación directa con una molécula fluorescente, conjugación con un resto que facilita la detección fluorescente, una secuencia que permite la detección fluorescente, etc.); una modificación o secuencia que proporciona un sitio de unión para proteínas (p. ej., proteínas que actúan sobre ADN, que incluyen activadores de la transcripción, represores de la transcripción, ADN metiltransferasas, ADN desmetilasas, histona acetiltransferasas, histona desacetilasas y similares); y combinaciones de los mismos.
En algunas realizaciones, un ARN de localización específica de ADN comprende un segmento adicional en el extremo 5' o 3' que proporciona cualquiera de las características descritas anteriormente. Por ejemplo, un tercer segmento adecuado puede comprender una caperuza 5' (p. ej., una caperuza de 7-metilguanilato (m7G)); una cola poliadenilada en 3' (es decir, una cola de poli(A) 3'; una secuencia de ribointerruptor (p. ej., para permitir la estabilidad regulada y/o la accesibilidad regulada por proteínas y complejos de proteínas); una secuencia que localiza específicamente el<a>R<n>a una ubicación subcelular (p. ej., núcleo, mitocondrias, cloroplastos y similares); una modificación o secuencia que proporciona el seguimiento (p. ej., conjugación directa con una molécula fluorescente, conjugación con un resto que facilita la detección fluorescente, una secuencia que permite la detección fluorescente, etc.); una modificación o secuencia que proporciona un sitio de unión para proteínas (p. ej., proteínas que actúan sobre ADN, que incluyen activadores de la transcripción, represores de la transcripción, ADN metiltransferasas, ADN desmetilasas, histona acetiltransferasas, histona desacetilasas y similares); y combinaciones de los mismos.
Un ARN de localización específica de ADN en cuestión y un polipéptido dirigido al sitio en cuestión para el uso forman un complejo (es decir, se unen a través de interacciones no covalentes). El ARN de localización específica de ADN proporciona una especificidad diana al complejo al comprender una secuencia de nucleótidos que es complementaria a una secuencia de un ADN diana. El polipéptido dirigido al sitio del complejo proporciona la actividad específica de sitio. En otras palabras, el polipéptido dirigido al sitio se guía a una secuencia de ADN diana (p. ej., una secuencia diana en un ácido nucleico cromosómico; una secuencia diana en un ácido nucleico extracromosómico, p. ej., un ácido nucleico episómico, un minicírculo, etc.; una secuencia diana en un ácido nucleico mitocondrial; una secuencia diana en un ácido nucleico de cloroplasto; una secuencia diana en un plásmido; etc.) en virtud de su asociación con el segmento de unión a proteínas del ARN de localización específica de ADN.
En algunas realizaciones, un ARN de localización específica de ADN en cuestión para el uso comprende dos moléculas de ARN separadas (polinucleótidos de ARN) y se denomina en la presente descripción “ARN de localización específica de ADN de molécula doble” o un “ARN de localización específica de ADN de dos moléculas” . En otras realizaciones, un ARN de localización específica de ADN en cuestión para el uso es una molécula de ARN única (polinucleótido de ARN único) y se denomina en la presente descripción un “ARN de localización específica de ADN de molécula única” . Si no se especifica de cualquier otra manera, la expresión “ARN de localización específica de ADN” es inclusivo, con referencia tanto a ARN de localización específica de ADN de molécula única como a ARN de localización específica de ADN de molécula doble.
Un ARN de localización específica de ADN de dos moléculas en cuestión para el uso comprende dos moléculas de ARN separadas (un “ARN localizador específico” y un “ARN activador” ). Cada una de las dos moléculas de ARN de un ARN de localización específica de ADN de dos moléculas en cuestión comprende un tramo de nucleótidos que son complementarios entre sí de manera que los nucleótidos complementarios de las dos moléculas de ARN se hibridan para formar el dúplex de ARN bicatenario del segmento de unión a proteínas.
Un ARN de localización específica de ADN de molécula única en cuestión para el uso comprende dos tramos de nucleótidos (un ARN localizador específico y un ARN activador) que son complementarios entre sí, están unidos covalentemente por nucleótidos intermedios (“enlazadores” o “ nucleótidos enlazadores” ) y se hibridan para formar el dúplex de ARN bicatenario (dúplex de ARNbc) del segmento de unión a proteínas, dando como resultado una estructura de tallo-bucle. El ARN localizador específico y el ARN activador pueden unirse covalentemente a través del extremo 3' del ARN localizador específico y el extremo 5' del ARN activador. Alternativamente, el ARN localizador específico y el ARN activador pueden unirse covalentemente a través del extremo 5' del ARN localizador específico y el extremo 3' del ARN activador.
Un ARN de localización específica de ADN de dos moléculas ilustrativo comprende una molécula similar a ARNcr (“ARN de CRISPR” o “ARN localizador específico” o “ARNcr” o “ repetición de ARNcr” ) y una molécula similar a ARNcrtra (“ARN de CRISPR de acción trans” o “ARN activador” o “ARNcrtra” ) correspondiente. Una molécula similar a ARNcr (ARN localizador específico) comprende tanto el segmento de localización específica de ADN (monocatenario) del ARN de localización específica de ADN como un tramo (“ segmento formador de dúplex” ) de nucleótidos que forma una mitad del dúplex de ARNbc del segmento de unión a proteínas del ARN de localización específica de ADN. Una molécula similar a ARNcrtra (ARN activador) correspondiente comprende un tramo de nucleótidos (segmento formador de dúplex) que forma la otra mitad del dúplex de ARNbc del segmento de unión a proteínas del ARN de localización específica de ADN. En otras palabras, un tramo de nucleótidos de una molécula similar a ARNcr es complementario y se hibrida con un tramo de nucleótidos de una molécula similar a ARNcrtra para formar el dúplex de ARNbc del dominio de unión a proteínas del ARN de localización específica de ADN. Como tal, se puede decir que cada molécula similar a ARNcr tiene una molécula similar a ARNcrtra correspondiente. La molécula similar a ARNcr proporciona de forma adicional el segmento de localización específica de ADN monocatenario. Por lo tanto, una molécula similar a ARNcr y una molécula similar a ARNcrtra (en forma de un par correspondiente) se hibridan para formar un ARN de localización específica de ADN. La secuencia exacta de una molécula de ARNcr o ARNcrtra dada es característica de la especie en la que se encuentran las moléculas de ARN.
La expresión “ARN activador” se usa en la presente descripción con el significado de una molécula similar a ARNcrtra de un ARN de localización específica de ADN de molécula doble. La expresión “ARN localizador específico” se usa en la presente descripción con el significado de una molécula similar a ARNcr de un ARN de localización específica de ADN de molécula doble. La expresión “ segmento formador de dúplex” se usa en la presente descripción con el significado del tramo de nucleótidos de un ARN activador o un ARN localizador específico que contribuye a la formación del dúplex de ARNbc mediante la hibridación con un tramo de nucleótidos de una molécula de ARN activador o ARN localizador específico correspondiente. En otras palabras, un ARN activador comprende un segmento formador de dúplex que es complementario al segmento formador de dúplex del ARN localizador específico correspondiente. Como tal, un ARN activador comprende un segmento formador de dúplex mientras que un a Rn localizador específico comprende tanto un segmento formador de dúplex como el segmento de localización específica de ADN del ARN de localización específica de ADN. Por lo tanto, un ARN de localización específica de ADN de molécula doble en cuestión para el uso puede estar compuesto por cualquier par de ARN activador y de ARN localizador específico correspondiente.
Un ARN de localización específica de ADN de dos moléculas puede diseñarse para permitir la unión controlada (es decir, condicional) de un ARN localizador específico con un ARN activador. Debido a que un ARN de localización específica de ADN de dos moléculas no es funcional a menos que tanto el ARN activador como el ARN localizador específico estén unidos en un complejo funcional con dCas9, un ARN de localización específica de ADN de dos moléculas puede ser inducible (p. ej., inducible por fármacos) haciendo que la unión entre el ARN activador y el ARN localizador específico sea inducible. Como ejemplo no limitativo, pueden usarse aptámeros de ARN para regular (es decir, controlar) la unión del ARN activador con el ARN localizador específico. En consecuencia, el ARN activador y/o el ARN localizador específico pueden comprender una secuencia de aptámero de ARN.
Los aptámeros de ARN son conocidos en la técnica y son generalmente una versión sintética de un ribointerruptor. Las expresiones “aptámero de ARN” y “ ribointerruptor” se usan indistintamente en la presente descripción para abarcar secuencias de ácido nucleico tanto sintéticas como naturales que proporcionan la regulación inducible de la estructura (y por lo tanto la disponibilidad de secuencias específicas) de la molécula de ARN de la que son parte. Los aptámeros de ARN generalmente comprenden una secuencia que se pliega en una estructura particular (p. ej., una horquilla), que se une específicamente a un fármaco particular (p. ej., una molécula pequeña). La unión del fármaco provoca un cambio estructural en el plegamiento del ARN, que cambia una característica del ácido nucleico del cual el aptámero es una parte. Como ejemplos no limitativos: (i) un ARN activador con un aptámero puede no ser capaz para unirse al ARN localizador específico afín a menos que el aptámero esté unido por el fármaco adecuado; (ii) un ARN localizador específico con un aptámero puede no ser capaz para unirse al ARN activador afín a menos que el aptámero esté unido por el fármaco adecuado; y (iii) un ARN localizador específico y un ARN activador, cada uno de los cuales comprende un aptámero diferente que se une a un fármaco diferente, puede no ser capaz de unirse entre sí a menos que ambos fármacos estén presentes. Como se ilustra por estos ejemplos, puede diseñarse un ARN de localización específica de ADN de dos moléculas para que sea inducible.
Pueden encontrarse ejemplos de aptámeros y ribointerruptores, por ejemplo, en: Nakamura y col., GenesCells.Mayo de 2012;17(5):344-64; Vavalina y col.,Future Cardiol.Mayo de 2012;8(3):371-82; Citartan y col.,Biosens Bioelectron.
15 de abril de 2012;34(1):1-11; y Liberman y col.,Wiley Interdisp Rev RNA.Mayo-Junio de 2012;3(3):369-84.
Los ejemplos no limitativos de secuencias de nucleótidos que pueden incluirse en un ARN de localización específica de ADN de dos moléculas incluyen ARN localizador específico (p. ej., Id. de sec. n.° 566-567) que pueden emparejarse con el segmento formador de dúplex de uno cualquiera de los ARN activadores expuestos en las Id. de sec. n.° 671-678.
Un ARN de localización específica de ADN de molécula única ilustrativo comprende dos tramos complementarios de nucleótidos que se hibridan para formar un dúplex de ARNbc. En algunas realizaciones, uno de los dos tramos complementarios de nucleótidos del ARN de localización específica de ADN de molécula única (o el ADN que codifica el tramo) es al menos aproximadamente el 60 % idéntico a una de las secuencias de ARN activador (ARNcrtra) expuestas en las Id. de sec. n.° 431-562 sobre un tramo de al menos 8 nucleótidos contiguos. Por ejemplo, uno de los dos tramos complementarios de nucleótidos del ARN de localización específica de ADN de molécula única (o el ADN que codifica el tramo) es al menos aproximadamente el 65 % idéntico, al menos aproximadamente el 70 % idéntico, al menos aproximadamente el 75 % idéntico, al menos aproximadamente el 80 % idéntico, al menos aproximadamente el 85 % idéntico, al menos aproximadamente el 90 % idéntico, al menos aproximadamente el 95 % idéntico, al menos aproximadamente el 98 % idéntico, al menos aproximadamente el 99 % idéntico o el 100 % idéntico a una de las secuencias de ARNcrtra expuestas en las Id. de sec. n.° 431-562 sobre un tramo de al menos 8 nucleótidos contiguos.
En algunas realizaciones, uno de los dos tramos complementarios de nucleótidos del ARN de localización específica de ADN de molécula única (o el ADN que codifica el tramo) es al menos aproximadamente el 60 % idéntico a una de las secuencias de ARN localizador específico (ARNcr) expuestas en las Id. de sec. n.° 563-679 sobre un tramo de al menos 8 nucleótidos contiguos. Por ejemplo, uno de los dos tramos complementarios de nucleótidos del ARN de localización específica de ADN de molécula única (o el ADN que codifica el tramo) es al menos aproximadamente el 65 % idéntico, al menos aproximadamente el 70 % idéntico, al menos aproximadamente el 75 % idéntico, al menos aproximadamente el 80 % idéntico, al menos aproximadamente el 85 % idéntico, al menos aproximadamente el 90 % idéntico, al menos aproximadamente el 95 % idéntico, al menos aproximadamente el 98 % idéntico, al menos aproximadamente el 99 % idéntico o el 100 % idéntico a una de las secuencias de ARNcr expuestas en las Id. de sec. n.° 563-679 sobre un tramo de al menos 8 nucleótidos contiguos.
Las definiciones proporcionadas en “ Definiciones - Parte I” también son aplicables a la presente sección; véase “ Definiciones - Parte I” para la clarificación adicional de términos.
Antes de que se describa de forma adicional la presente invención, debe entenderse que esta invención no se limita a realizaciones particulares descritas, ya que, por supuesto, pueden variar. También debe entenderse que la terminología utilizada en la presente descripción tiene el fin de describir solamente realizaciones particulares, y no pretende ser limitativa, ya que el alcance de la presente invención estará limitado únicamente por las reivindicaciones adjuntas.
Cuando se proporciona un intervalo de valores, se entiende que cada valor intermedio, hasta la décima parte de la unidad del límite inferior, a menos que el contexto indique claramente cualquier otra cosa, entre el límite superior e inferior de ese intervalo y cualquier otro valor indicado o intermedio en ese intervalo indicado, está abarcado por la invención. Los límites superior e inferior de estos intervalos más pequeños pueden incluirse independientemente en los intervalos más pequeños y también están abarcados por la invención, sujeto a cualquier límite específicamente excluido en el intervalo indicado. Cuando el intervalo indicado incluye uno o ambos límites, los intervalos que excluyen cualquiera o ambos de esos límites incluidos también se incluyen en la invención.
A menos que se defina de cualquier otra manera, todos los términos técnicos y científicos utilizados en la presente descripción tienen el mismo significado que entiende habitualmente un experto en la técnica a la que pertenece esta invención. Aunque cualquier método y material similar o equivalente a los descritos en la presente descripción también puede usarse en la práctica o ensayo de la presente invención, ahora se describen los métodos y materiales preferidos.
Debe observarse que, como se usa en la presente descripción y en las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares “ un” , “ una” y “ el/la” incluyen referentes en plural a menos que el contexto indique claramente cualquier otra cosa. Por lo tanto, por ejemplo, la referencia a “ un polipéptido Cas9 enzimáticamente inactivo” incluye una pluralidad de dichos polipéptidos y la referencia a “ el ácido nucleico diana” incluye la referencia a uno o más ácidos nucleicos diana y equivalentes de los mismos conocidos por los expertos en la técnica, y así sucesivamente. Se observa además que las reivindicaciones pueden redactarse para excluir cualquier elemento opcional. Como tal, esta declaración pretende servir como base antecedente para el uso de terminología exclusiva como “ únicamente” , “ solamente” y similares en relación con la mención de elementos de reivindicación, o el uso de una limitación “ negativa” .
Las publicaciones analizadas en la presente descripción se proporcionan únicamente para su descripción antes de la fecha de presentación de la presente solicitud. Nada en la presente descripción debe interpretarse como una admisión de que la presente invención no tiene derecho a anteceder dicha publicación en virtud de la invención anterior. Además, las fechas de publicación proporcionadas pueden ser diferentes de las fechas de publicación reales que pueden necesitar ser confirmadas independientemente.
Ejemplos
Los siguientes ejemplos se presentan para proporcionar a los expertos en la técnica una descripción completa y descripción de cómo preparar y usar la presente invención, y no tienen por objeto limitar el alcance de lo que los inventores consideran su invención ni pretenden representar que los experimentos siguientes son todos o los únicos experimentos realizados. Se han realizado esfuerzos para garantizar la precisión con respecto a los números utilizados (p. ej., cantidades, temperatura, etc.) pero deben tenerse en cuenta algunos errores experimentales y desviaciones. Salvo que se indique lo contrario, las partes son partes en peso, el peso molecular es el peso molecular promedio en peso, la temperatura está en grados Celsius y la presión es la atmosférica o está próxima a ella. Pueden usarse abreviaturas estándar, p. ej., pb, par(es) de bases; kb, kilobase(s); pl, picolitros(s); s o sec, segundo(s); min, minuto(s); h o h, hora(s); aa, aminoácido(s); kb, kilobase(s); pb, par(es) de bases; nt, nucleótidos(s); i.m., (por vía) intramuscular; i.p., (por vía) intraperitoneal; s.c., (por vía) subcutánea; y similares.
Ejemplo 1: Uso de Cas9 para generar modificaciones en ADN diana.
Materiales y métodos
Cepas bacterianas y condiciones de cultivo
Se incubóStreptococcus pyogenes,en medio THY (Caldo Todd Hewitt (THB, Bacto, Becton Dickinson) suplementado con extracto de levadura al 0,2 % (Oxoid) o en TSA (tripticasa de agar de soja, BBL, Becton Dickinson) suplementado con sangre de oveja al 3 %, a 37 °C en una atmósfera suplementada con CO2 al 5 % sin agitar. Se cultivóEscherichia coli,cultivado en medio Luria-Bertani (LB) y agar, se incubó a 37 °C con agitación. Cuando se requirió, se añadieron antibióticos adecuados al medio a las siguientes concentraciones finales: ampicilina, 100 pg/ml para E.coli;cloranfenicol, 33 pg/ml paraEscherichia coli;kanamicina, 25 pg/ml para E.coliy 300 pg/ml para S.pyogenes.El crecimiento de las células bacterianas se monitorizó periódicamente midiendo la densidad óptica de alícuotas de cultivo a 620 nm usando un lector de microplacas (Lector de espectros SLT).
Transformación de células bacterianas
La transformación de ADN plasmídico en células deE. colise realizó según un protocolo estándar de choque térmico. La transformación de S.pyogenesse realizó como se ha descrito anteriormente con algunas modificaciones. El ensayo de transformación realizado para monitorizar la actividad CRISPR/Casin vivoen el mantenimiento del plásmido se realizó prácticamente como se ha descrito anteriormente. Brevemente, se igualaron células electrocompetentes de S.pyogenesa la misma densidad celular y se sometieron a electroporación con 500 ng de ADN plasmídico. Cada transformación se sembró en placa en dos a tres veces y el experimento se realizó tres veces independientemente con diferentes lotes de células competentes para el análisis estadístico. Las eficiencias de transformación se calcularon como UFC (unidades formadoras de colonias) por pg de ADN. Se realizaron transformaciones de control con agua estéril y vector de cadena principal pEC85.
Manipulaciones de ADN
Las manipulaciones de ADN que incluyen la preparación, la amplificación, la digestión, la ligadura, la purificación, la electroforesis en gel de agarosa de ADN se realizaron según técnicas estándar con modificaciones menores. Se construyeron plásmidos protoespaciadores para la escisiónin vitroy se construyeron ensayos de transformación de S.pyogenescomo se ha descrito anteriormente (4). Se generaron plásmidos protoespaciadores basados en pUC19 adicionales para ensayos de escisiónin vitroligando oligonucleótidos hibridados entre sitios EcoRI y BamHI digeridos en pUC19. El plásmido que contiene el gen GFP se ha descrito anteriormente (41). Se usaron Kits (Qiagen) para la purificación de ADN y la preparación de plásmidos. La mutagénesis del plásmido se realizó usando el kit QuikChange® II XL (Stratagene) o kit de mutagénesis dirigida al sitio QuikChange (Agilent). VBC-Biotech Servicios, Sigma-Aldrich e Integrated DNA Technologies suministraron los oligonucleótidos sintéticos y los ARN.
Oligonucleótidos para moldes de transcripciónin vitro
Moldes para ARNcrtra de CRISPR de Tipo II-A transcritos in vitro y ARNcr de S. pyogenes (para ARNcrtra -PCR en ADN de cr. SF370; para ARNcr - hibridación de dos oligonucleótidos)
ARNcrtra-T7 (75 nt)
OLEC1521 (ARNcrtra 5' D): Id. de sec. n.° 340
OLEC1522 (ARNcrtra 3' I): Id. de sec. n.° 341
ARNcr-T7 (molde)
OLEC2176 (ARNcr-sp1 D): Id. de sec. n.° 342
OLEC2178 (ARNcr-sp1 I): Id. de sec. n.° 343
OLEC2177 (ARNcr-sp2 D): Id. de sec. n.° 344
OLEC2179 (ARNcr-sp2 I): Id. de sec. n.° 345
Moldes para el ARNcrtra de N. meningitidis transcrito in vitro y ARNcr-sp2 modificado por ingeniería genética (para ARNcrtra - PCR en cr. ADN Z2491; para el ARNcr - hibridación de dos oligonucleótidos)ARNcrtra-T7
OLEC2205 (5' previsto D): Id. de sec. n.° 346
OLEC2206 (3' previsto I): Id. de sec. n.° 347
ARNcr-T7 (molde)
OLEC2209 ((sp2(speM) D repetición de N.m.): Id. de sec. n.° 348
OLEC2214 ((sp2(speM) I repetición de N.m.): Id. de sec. n.° 349
Moldes para el ARNcrtra de L. innocua transcrito in vitro y ARNcr-sp2 modificado por ingeniería genética (para ARNcrtra - PCR en cr. ADN Clip11262; para el ARNcr - hibridación de dos oligonucleótidos)ARNcrtra-T7
OLEC2203 (5' previsto D): Id. de sec. n.° 350
OLEC2204 (3' previsto I): Id. de sec. n.° 351
ARNcr-T7 (molde)
OLEC2207 ((sp2(speM) D repetición de L.in.): Id. de sec. n.° 352
OLEC2212 ((sp2(speM) I repetición deL.in.):Id. de sec. n.° 353
Oligonucleótidos para construir plásmidos con protoespaciador para estudios in vitro e in vivo Plásmidos para speM (espaciador 2 (CRISPR de Tipo II-A, SF370; profagos protoespaciador 08232,3 de MGAS8232) in vitro y en S. pyogenes (molde: cr. ADN MGAS8232 o plásmidos que contienen fragmentos de speM)pEC287
OLEC1555(speMD): Id. de sec. n.° 354
OLEC1556(speMI): Id. de sec. n.° 355
pEC488
OLEC2145(speMD): Id. de sec. n.° 356
OLEC2146(speMI): Id. de sec. n.° 357
Ep C370
OLEC1593 (protoespaciador 2 A22G de pEC488 D): Id. de sec. n.° 358
OLEC1594 (protoespaciador 2 A22G de pEC488 I): Id. de sec. n.° 359
pEC371
OLEC1595 (protoespaciador 2 T10C de pEC488 D): Id. de sec. n.° 360
OLEC1596 (protoespaciador 2 T10C de pEC488 I): Id. de sec. n.° 361
pEC372
OLEC2185 (protoespaciador 2 T7A de pEC488 D): Id. de sec. n.° 362
OLEC2186 (protoespaciador 2 T7A de pEC488 I): Id. de sec. n.° 363
pEC373
OLEC2187 (protoespaciador 2 A6T de pEC488 D): Id. de sec. n.° 364
OLEC2188 (protoespaciador 2 A6T de pEC488 I): Id. de sec. n.° 365
pEC374
OLEC2235 (protoespaciador 2 A5T de pEC488 D): Id. de sec. n.° 366
OLEC2236 (protoespaciador 2 A5T de pEC488 I): Id. de sec. n.° 367
pEC375
OLEC2233 (protoespaciador 2 A4T de pEC488 D): Id. de sec. n.° 368
OLEC2234 (protoespaciador 2 A4T de pEC488 I): Id. de sec. n.° 369
pEC376
OLEC2189 (protoespaciador 2 A3T de pEC488 D): Id. de sec. n.° 370
OLEC2190 (protoespaciador 2 A3T de pEC488 I): Id. de sec. n.° 371
pEC377
OLEC2191 (protoespaciador 2 PAM G1C de pEC488 D): Id. de sec. n.° 372
OLEE2192 (protoespaciador 2 PAM G1C de pEC488 I): Id. de sec. n.° 373
pEC378
OLEC2237 (protoespaciador 2 PAM GG1, 2CC de pEC488 D): Id. de sec. n.° 374
OLEC2238 (protoespaciador 2 PAM GG1, 2CC de pEC488 I): Id. de sec. n.° 375
Plásmidos para el análisis de SPy_0700 (espaciador 1 (CRISPR de Tipo II-A, SF370; profago protoespaciador 0370.1 de SF370in v it roy en S.p y o g e n e s(molde: cr. ADN SF370 o plásmidos que contienen fragmentos de SPy_0700)pEC489
OLEC2106 (Spy_0700 D): Id. de sec. n.° 376
OLEC2107 (Spy_0700 I): Id. de sec. n.° 377
pEC573
OLEC2941 (PAM TG1, 2GG D): Id. de sec. n.° 378
OLEC2942 (PAM TG1, 2GG I): Id. de sec. n.° 379
Oligonucleótidos para la verificación de constructos plasmídicos y sitios de corte mediante análisis de secuenciación ColE1 (pEC85)
poliRN228 (secuenciación I): Id. de sec. n.° 380
speM (pEC287)
OLEC1557 (secuenciación D): Id. de sec. n.° 381
OLEC1556 (secuenciación I): Id. de sec. n.° 382
repDEG-pAMbeta1 (pEC85)
OLEC787 (secuenciación D): Id. de sec. n.° 383
Oligonucleótidos para ensayos de escisiónin vitro
ARNcr
ARNcr de espaciador 1 (1-42): Id. de sec. n.° 384
ARNcr del espaciador 2 (1-42): Id. de sec. n.° 385
ARNcr (1-42) de espaciador 4: Id. de sec. n.° 386
ARNcr del espaciador 2 (1-36): Id. de sec. n.° 387
ARNcr del espaciador 2 (1-32): Id. de sec. n.° 388
ARNcr del espaciador 2 (11-42): Id. de sec. n.° 389
ARNcrtra
(4-89): Id. de sec. n.° 390
(15-89): Id. de sec. n.° 391
(23-89): Id. de sec. n.° 392
(15-53): Id. de sec. n.° 393
(15-44): Id. de sec. n.° 394
(15-36): Id. de sec. n.° 395
(23-53): Id. de sec. n.° 396
(23-48): Id. de sec. n.° 397
(23-44): Id. de sec. n.° 398
(1-26): Id. de sec. n.° 399
ARN quiméricos
Espaciador 1 - quimera A: Id. de sec. n.° 400
Espaciador 1 - quimera B: Id. de sec. n.° 401
Espaciador 2 - quimera A: Id. de sec. n.° 402
Espaciador 2 - quimera B: Id. de sec. n.° 403
Espaciador 4 - quimera A: Id. de sec. n.° 404
Espaciador 4 - quimera B: Id. de sec. n.° 405
GFP1: Id. de sec. n.° 406
GFP2: Id. de sec. n.° 407
GFP3: Id. de sec. n.° 408
GFP4: Id. de sec. n.° 409
GFP5: Id. de sec. n.° 410
Oligonucleótidos de ADN como sustratos para ensayos de escisión (protoespaciador en negrita, PAM subrayado)protoespaciador 1 - complementario - TS: Id. de sec. n.° 411
protoespaciador 1 - no complementario - TS: Id. de sec. n.° 412
protoespaciador 2 - complementario - TS: Id. de sec. n.° 413
protoespaciador 2 - no complementario - TS: Id. de sec. n.° 414
protoespaciador 4 - complementario - TS: Id. de sec. n.° 415
protoespaciador 4 - no complementario - TS: Id. de sec. n.° 416
protoespaciador 2 - complementario - PAM1: Id. de sec. n.° 417
protoespaciador 2 - no complementario - PAM1: Id. de sec. n.° 418
protoespaciador 2 - complementario - PAM2: Id. de sec. n.° 419
protoespaciador 2 - no complementario - PAM2: Id. de sec. n.° 420
protoespaciador 4 - complementario - PAM1: Id. de sec. n.° 421
protoespaciador 4 - no complementario - PAM1: Id. de sec. n.° 422
protoespaciador 4 - complementario - PAM2: Id. de sec. n.° 423
protoespaciador 4 - no complementario - PAM2: Id. de sec. n.° 424
Transcripciónin vitroy purificación de ARN
Se transcribió ARNin vitrousando el Kit de transcripciónin vitroT7 Flash (Epicentre, Illumina company) y moldes de ADN generados por PCR que portaban una secuencia promotora T7. El ARN se purificó en gel y se verificó la calidad antes de su uso. Los cebadores utilizados para la preparación de moldes de ARN A partir de S. pyogenes SF370, Listeria innocua Clip 11262 y Neisseria meningitidis A Z2491 se han descrito anteriormente.
Purificación de proteínas
La secuencia que codifica Cas9 (residuos 1-1368) fue amplificada por PCR a partir del ADN genómico de S. pyogenes SF370 y se insertó en un vector de expresión basado en pET personalizado usando clonación independiente de ligadura (LIC). El constructo de fusión resultante contenía un marcador de proteína de unión a hexahistidina-maltosa N-terminal (His 6- MBP), seguido de una secuencia peptídica que contenía un sitio de escisión de proteasa del virus del grabado del tabaco (TEV). La proteína se expresó en la cepa de E. coli BL21 Rosetta 2 (DE3) (EMD Biosciences), cultivada en medio 2xTY a 18 °C durante 16 h después de la inducción con IPTG 0,2 mM. La proteína se purificó mediante una combinación de etapas cromatográficas de afinidad, intercambio iónico y exclusión por tamaño. Brevemente, las células se lisaron en Tris 20 mM pH 8,0, NaCl 500 mM, TCEP 1 mM (suplementado con cóctel inhibidor de proteasa (Roche)) en un homogeneizador (Avestin). El lisado clarificado se unió en lote a agarosa Ni-NTA (Qiagen). La resina se lavó exhaustivamente con Tris 20 mM pH 8,0, NaCl 500 mM y la proteína unida se eluyó en Tris 20 mM pH 8,0, NaCl 250 mM, glicerol al 10 %. El marcador de afinidad de His6-MBP se retiró por escisión con proteasa TEV, mientras que la proteína se dializó durante la noche contra HEPES 20 mM pH 7,5, KCl 150 mM, TCEP 1 mM, glicerol al 10 %. La proteína Cas9 escindida se separó del marcador de fusión mediante purificación en una columna SP Sepharose HiTrap de 5 ml (GE Life Sciences), eluyendo con un gradiente lineal de KCl 100 mM - 1 M. La proteína se purificó adicionalmente mediante cromatografía de exclusión por tamaño en una columna Superdex 200 16/60 en HEPE<s>20 mM pH 7,5, KCl 150 mM y TCEP 1 mM. La proteína eluida se concentró a ~8 mg/ml, se congeló rápidamente en nitrógeno líquido y se almacenó a -80 °C. Los mutantes puntuales Cas9 D10A, H840A y D10A/H840A se generaron usandol kit de mutagénesis dirigida al sitio QuikChange (Agilent) y se confirmaron mediante secuenciación de ADN. Las proteínas se purificaron siguiendo el mismo procedimiento que para la proteína Cas9 de tipo silvestre.
Los ortólogos de Cas9 de Streptococcus thermophilus (LMD-9,YP_820832.1), L. innocua (Clip11262, NP_472073.1), Campylobacter jejuni (subsp. jejuni NCTC 11168, YP_002344900.1) y N. meningitidis (Z2491, YP_002342100.1) se expresaron en células BL21 Rosetta (DE3) pLysS (Novagen) como proteínas de fusión His6-MBP (N. meningitidis y C. jejuni), His6-Tiorredoxina (L. innocua) y His6-GST (S. thermophilus), y se purificaron prácticamente como para Cas9 de S. pyogenes con las siguientes modificaciones. Debido a grandes cantidades de ácidos nucleicos de copurificación, las cuatro proteínas Cas9 se purificaron mediante una etapa adicional de sefarosa de heparina antes de la filtración en gel, eluyendo la proteína unida con un gradiente lineal de KCl 100 mM-2 M. Esto retiró exitosamente la contaminación de ácidos nucleicos de las proteínas de C. jejuni, N. meningitidis y L. innocua, pero no pudo retirar los ácidos nucleicos de copurificación de la preparación de Cas9 de S. thermophilus. Todas las proteínas se concentraron a 1-8 mg/ml en HEPES 20 mM pH 7,5, KCl 150 mM y TCEP 1 mM, se congelaron rápidamente en N2 líquido y se almacenaron a -80 °C.
Ensayo de escisión de ADN plasmídico
Se prehibridaron ARNcrtra y ARNcr sintéticos o transcritosin vitroantes de la reacción calentando a 95 °C y enfriando lentamente hasta temperatura ambiente. El ADN plasmídico linealizado con digestión de restricción o de restricción (300 ng (~8 nM)) se incubó durante 60 min a 37 °C con proteína Cas9 purificada (50-500 nM) y dúplex de ARNcr:ARNcr (50-500 nM, 1:1) en un tampón de escisión de plásmido de Cas9 (<h>E<p>ES 20 mM pH 7,5, KCl 150 mM, DTT 0,5 mM, EDTA 0,1 mM) con o sin MgCb 10 mM. Las reacciones se detuvieron con tampón de carga de ADN 5X que contenía EDTA 250 mM, se resolvieron mediante electroforesis en gel de agarosa al 0,8 o 1 % y se visualizaron mediante tinción con bromuro de etidio. Para los ensayos de escisión de mutantes de Cas9, las reacciones se detuvieron con tampón de carga de SDS 5X (glicerol al 30 %,<s>D<s>al 1,2 %, EDTA 250 mM) antes de la carga en el gel de agarosa.
Ensayo de escisión dependiente de metal
Se incubó ADN plasmídico protoespaciador 2 (5 nM) durante 1 h a 37 °C con Cas9 (50 nM) preincubado con ARNcrtra:ARNcr-sp2 50 nM en tampón de escisión (HEPES 20 mM pH 7,5, KCl 150 mM, D<t>T 0,5 mM, EDTA 0,1 mM) suplementado con MgCb 1, 5 o 10 mM, MnCb 1 o 10 mM, CaCbZnCbCoCb, NiSO4 o CuSO4. La reacción se detuvo añadiendo tampón de carga de SDS 5X (glicerol al 30 %, SDS al 1,2 %, EDTA 250 mM), se resolvió mediante electroforesis en gel de agarosa al 1 % y se visualizó mediante tinción con bromuro de etidio.
Ensayo de recambio único
Se preincubó Cas9 (25 nM) 15 min a 37 °C en tampón de escisión (HEPES 20 mM pH 7,5, KCl 150 mM, MgCb 10 mM, DTT 0,5 mM, EDTA 0,1 mM) con dúplex ARNcrtra:ARNcr-sp2 (25 nM, 1:1) o ambos ARN (25 nM) no prehibridados y la reacción se inició añadiendo ADN plasmídico protoespaciador 2 (5 nM). La mezcla de reacción se incubó a 37 °C. En intervalos de tiempo definidos, las muestras se extrajeron de la reacción, se añadió tampón de carga SDS 5X (glicerol al 30 %, SDS al 1,2 %, EDTA 250 mM) para detener la reacción y se monitorizó la escisión mediante electroforesis en gel de agarosa al 1 % y tinción con bromuro de etidio. Lo mismo se realizó para la cinética de recambio único sin preincubación de Cas9 y ARN, donde el ADN plasmídico protoespaciador 2 (5 nM) se mezcló en tampón de escisión con dúplex ARNcrtra:ARNcr-sp2 (25 nM) o ambos ARN (25 nM) no prehibridados, y la reacción se inició mediante la adición de Cas9 (25 nM). El porcentaje de escisión se analizó por densitometría y el promedio de tres experimentos independientes se representó frente al tiempo. Los datos se ajustaron mediante análisis de regresión no lineal y se calcularon las velocidades de escisión (kobs [min'1]).
Ensayo de recambio múltiple
Se preincubó Cas9 (1 nM) durante 15 min a 37 °C en tampón de escisión (HEPES 20 mM pH 7,5, KCl 150 mM, MgCb 10 mM, DTT 0,5 mM, e Dt A 0,1 mM) con ARNrRNA:ARNcr-sp2 prehibridados (1 nM, 1: 1). La reacción se inició mediante la adición de ADN plasmídico protoespaciador 2 (5 nM). En intervalos de tiempo definidos, se extrajeron muestras y la reacción se detuvo añadiendo tampón de carga de SDS 5X (glicerol al 30 %, SDS al 1,2 %, EDTA 250 mM). La reacción de escisión se resolvió mediante electroforesis en gel de agarosa al 1 %, se tiñó con bromuro de etidio y el porcentaje de escisión se analizó por densitometría. Los resultados de cuatro experimentos independientes se representaron frente al tiempo (min).
Ensayo de escisión de ADN de oligonucleótido
Se marcaron radiactivamente oligonucleótidos de ADN (10 pmol) incubando con 5 unidades de polinucleótido quinasa T4 (New England Biolabs) y ~3-6 pmol (-20-40 mCi) [y-32P]-ATP (Promega) en tampón de reacción de polinucleótido quinasa T4 1X a 37 °C durante 30 min, en una reacción de 50 pl. Después de la inactivación por calor (65 °C durante 20 min), las reacciones se purificaron a través de una columna Ilustra MicroSpin G-25 (GE Healthcare) para retirar el marcador no incorporado. Se generaron sustratos dúplex (100 nM) mediante hibridación de oligonucleótidos marcados con cantidades equimolares de oligonucleótido complementario sin marcar a 95 °C durante 3 min, seguido de enfriamiento lento a temperatura ambiente. Para los ensayos de escisión, se hibridaron ARNcrtra y ARNcr mediante calentamiento a 95 °C durante 30 s, seguido de enfriamiento lento a temperatura ambiente. Se preincubó Cas9 (concentración final 500 nM) con el dúplex ARNcrtra:ARNcr hibridado (500 nM) en tampón de ensayo de escisión (HEPES 20 mM pH 7,5, KCl 100 mM, MgCb 5 mM, DTT 1 mM, glicerol al 5 %) en un volumen total de 9 pl. Las reacciones se iniciaron mediante la adición de 1 pl de ADN diana (10 nM) y se incubaron durante 1 h a 37 °C. Las reacciones se inactivaron mediante la adición de 20 pl de colorante de carga (EDTA 5 mM, SDS al 0,025 %, glicerol al 5 % en formamida) y se calentaron a 95 °C durante 5 min. Los productos de escisión se resolvieron en geles de poliacrilamida desnaturalizantes al 12 % que contenían urea 7 M y se visualizaron mediante formación de imágenes por fósforo (Storm, GE Life Sciences). Se realizaron ensayos de escisión que someten a ensayo los requisitos de PAM (Figura 13B) usando sustratos dúplex de ADN que se habían prehibridado y purificado en un gel de acrilamida nativo al 8 %, y posteriormente radiomarcado en ambos extremos 5'. Las reacciones se establecieron y analizaron como anteriormente.
Ensayos de desplazamiento de movilidad electroforética
Se formaron dúplex de ADN diana mezclando cada cadena (10 nmol) en agua desionizada, calentando a 95 °C durante 3 min y enfriamiento lentamente a temperatura ambiente. Todos los ADN se purificaron en geles nativos al 8 % que contenían TBE 1X. Se visualizaron bandas de ADN mediante sombreado UV, se extrajeron y se eluyeron mediante trozos de gel de empapado en H2O tratada con DEPC. El ADN eluido se precipitó con etanol y se disolvió en H2O tratada con DEPC. Las muestras de ADN se marcaron en el extremo 5' con [<y>-32P]-ATP usando polinucleótido quinasa T4 (New England Biolabs) durante 30 min a 37 °C. Se desnaturalizó por calor PNK a 65 °C durante 20 min, y el radiomarcador no incorporado se retiró usando una columna Ilustra MicroSpin G-25 (GE Healthcare). Se realizaron en tampón que contenía HEPES 20 mM pH 7,5, KCl 100 mM, MgCb 5 mM, DTT 1 mM y glicerol al 10 % en un volumen total de 10 pl. El mutante doble D10A/H840A de Cas9 se programó con cantidades equimolares de dúplex ARNcrtra:ARNcr prehibridado y se valoró volumétricamente de 100 pM a 1 pM. Se añadió ADN radiomarcado a una concentración final de 20 pM. Las muestras se incubaron durante 1 h a 37 °C y se resolvieron a 4 °C en un gel de poliacrilamida nativo al 8 % que contenía TBE 1X y MgCb 5 mM. Los geles se secaron y el ADN se visualizó mediante formación de imágenes por fósforo.
Análisis informático de secuencias de ADN y proteínas
Se usó el paquete Vector NTI (Invitrogen) para el análisis de la secuencia de ADN (Vector NTI) y el análisis comparativo de secuencias de las proteínas (AlignX).
Modelado informático de la estructura de ARN y coplegamiento
Se realizaron predicciones informáticas usando los algoritmos del paquete de ARN Vienna (42, 43). Se predijeron estructuras secundarias de ARN y modelos de coplegamiento se predijeron con RNAfold and RNAcofold, respectivamente y se visualizaron con VARNA (44).
Resultados
Las bacterias y arqueas tienen sistemas de defensa adaptativo mediados por ARN que se denominan grupos de repeticiones palindrómicas cortas en intervalos regulares (CRISPR)/CRISPR-asociado (Cas) que protegen a los organismos de los virus y los plásmidos invasores (1-3). Se muestra que en un subconjunto de estos sistemas, el ARNcr maduro que tiene pares emparejados con el ARNcr de activación trans (ARNcrtra) forma una estructura de dos ARN que dirige la proteína Cas9 asociada a CRISPR para introducir roturas bicatenarias (bc) en el ADN diana. En sitios complementarios a la secuencia guía de ARNcr, el dominio nucleasa HNH de Cas9 escinde la cadena complementaria, mientras que el dominio similar a RuvC de Cas9 escinde la cadena no complementaria. El ARNcrtra:ARNcr dual, cuando se modifica por ingeniería genética como una única quimera de ARN, también dirige la escisión de ADNbc de Cas9 específica de secuencia. Estos estudios revelan una familia de endonucleasas que usan ARN duales para la escisión de ADN específica de sitio y destacan la capacidad de aprovechar el sistema para la edición genómica programable por ARN.
Los sistemas de defensa de CRISPR/Cas dependen de ARN pequeños para la detección específica de secuencia y el silenciamiento de ácidos nucleicos extraños. Los sistemas CRISPR/Cas se componen de genes cas organizados en un operón u operones y la matriz o matrices de CRISPR que consisten en secuencias de localización específica al genoma (denominadas espaciadores) intercaladas con repeticiones idénticas (1-3). La inmunidad mediada por CRISPR/Cas se produce en tres etapas. En la fase adaptativa, las bacterias y arqueas que albergan uno o más loci de CRISPR responden a la exposición vírica o del plásmido integrando fragmentos cortos de secuencia extraña (protoespaciadores) en el cromosoma hospedador en el extremo proximal de la matriz de CRISPR (1-3). En las fases de expresión e interferencia, la transcripción del elemento espaciador de repetición en moléculas de ARN de CRISPR (pre-ARNcr) precursoras seguido de escisión enzimática produce los ARNcr cortos que pueden emparejarse con secuencias protoespaciadoras complementarias de dianas víricas o plasmídicas invasoras (4-11). El reconocimiento objetivo por ARNcr dirige el silenciamiento de las secuencias extrañas por medio de proteínas Cas que actúan en complejo con los ARNcr (10, 12-20).
Existen tres tipos de sistemas CRISPR/Cas (21-23). Los sistemas de tipo I y III comparten algunas características generales: las endonucleasas Cas especializadas procesan los pre-ARNcr y, una vez maduro, cada ARNcr se ensambla en un complejo de múltiples proteínas Cas grande capaz de reconocer y escindir ácidos nucleicos complementarios al ARNcr. Por el contrario, los sistemas de tipo II procesan preARNcr por un mecanismo diferente en el que un ARNcr de trans-activación (ARNcrtra) complementario a las secuencias de repetición en el procesamiento de los accionadores de pre-ARNcr por la ribonucleasa RNasa III específica de ARN bicatenario (bc) en presencia de la proteína Cas9 (anteriormente Csn1) (Figura 15) (4, 24). Se cree que Cas9 es la única proteína responsable del silenciamiento guiado por ARNcr de ADN extraño (25-27).
Se muestra que en los sistemas de tipo II, las proteínas Cas9 constituyen una familia de enzimas que requieren una estructura de bases emparejadas formada entre el ARNcrtra activador y el ARNcr de localización específica para escindir el ADNbc diana. La escisión específica de sitio se produce en ubicaciones determinadas por la complementariedad de emparejamiento de bases entre el ARNcr y el ADN protoespaciador diana y un motivo corto [denominado motivo adyacente protoespaciador (PAM)] yuxtapuesto a la región complementaria en el ADN diana. El estudio de los presentes inventores demuestra además que la familia de endonucleasas Cas9 puede programarse con moléculas de ARN único para escindir sitios de ADN específicos, facilitando de este modo el desarrollo de un sistema dirigido a ARN simple y versátil para generar roturas de ADNbc para la localización específica y la edición del genoma.
Cas9 es una endonucleasa de ADN guiada por dos ARN
Se ha hipotetizado que Cas9, la proteína distintiva de los sistemas de tipo II, está implicada tanto en la maduración de ARNcr como en la interferencia de ADN guiada por ARNcr (Figura 15) (4, 25-27). Cas9 está implicada en la maduración de ARNcr (4), pero no se ha investigado su participación directa en la destrucción de ADN diana. Para probar si Cas9 podría ser capaz escindir el ADN diana y cómo, los presentes inventores usaron un sistema de sobreexpresión para purificar la proteína Cas9 derivada del patógenoStreptococcus pyogenes(Figura 16, véanse los materiales y métodos suplementarios) y probar su capacidad para escindir un ADN plasmídico o un dúplex de oligonucleótido que porta una secuencia protoespaciadora complementaria a un ARNcr maduro y un PAM auténtico. Los presentes inventores descubrieron que el ARNcr maduro solo fue incapaz de dirigir la escisión de ADN plasmídico catalizada por Cas9 (Figura 10A y Figura 17A). Sin embargo, la adición de ARNcrtra, que puede emparejarse con la secuencia de repetición de ARNcr y es esencial para la maduración de ARNcr en este sistema, accionó Cas9 para escindir el ADN plasmídico (Figura 10A y Figura 17A). La reacción de escisión requirió tanto magnesio como la presencia de una secuencia de ARNcr complementaria al ADN; un ARNcr susceptible de emparejamiento de bases de ARNcrtra, pero que contiene una secuencia de unión a ADN diana no afín, no respaldó la escisión del plásmido catalizada por Cas9 (Figura 10A; Figura 17A, comparar ARNcr-sp2 con ARNcr-sp1; y Figura 18A). Los presentes inventores obtuvieron resultados similares con un sustrato de ADNbc lineal corto (Figura 10B y Figura 17, B y C). Por lo tanto, el ARNcrtra transactivador es un ARN no codificante pequeño con dos funciones críticas: accionar el procesamiento de pre-ARNcr por la enzima RNasa III (4) y posteriormente activar la escisión de ADN guiada por ARNcr por Cas9.
La escisión tanto de plásmido como de ADNbc lineal corto por Cas9 guiada por ARNcrtra:ARNcr es específica de sitio (Figura 10, C A E y Figura 19, A y B). La escisión de ADN plasmídico produjo extremos romos en una posición tres pares de bases en dirección 5' de la secuencia de PAM (Figura 10, C y E, y Figura 19, A y C) (26). Similarmente, dentro de dúplex de ADNbc cortos, la cadena de ADN que es complementaria a la secuencia de unión a la diana en el ARNcr (la cadena complementaria) se escinde en un sitio tres pares de bases en dirección 5' del PAM (Figura 10, D y E, y Figura 19, B y C). La cadena de ADN no complementaria se escinde en uno o más sitios dentro de tres a ocho pares de bases en dirección 5' del PAM. Una investigación adicional reveló que la cadena no complementaria se escinde en primer lugar endolíticamente y posteriormente se recorta por una actividad exonucleasa 3'-5' (Figura 18B). Las velocidades de escisión por Cas9 en condiciones de recambio único variaron de 0,3 a 1 min-1, comparables a las de las endonucleasas de restricción (Figura 20A), mientras que la incubación de complejo Cas9-ARNcrtra:ARNcr de tipo silvestre (TS) con un exceso molar de cinco veces de ADN sustrato proporcionó evidencia de que la Cas9 guiada por ARN dual es una enzima de recambio múltiple (Figura 20B). En contraste con el complejo de CRISPR de tipo I Cascada (18), Cas9 escinde tanto los plásmidos linealizados como superenrollados (Figuras 10<a>y 11A). Por lo tanto, un plásmido invasor puede, en principio, ser escindido múltiples veces por las proteínas Cas9 programadas con diferentes ARNcr.
Figura 10 (A)Se programó Cas9 con un ARNcr-sp2 de 42 nucleótidos (ARNcr que contenía una secuencia espaciadora 2) en presencia o ausencia de ARNcrtra de 75 nucleótidos. El complejo se añadió a ADN plasmídico circular o linealizado con XhoI que porta una secuencia complementaria al espaciador 2 y un PAM funcional. ARNcr-sp1, control de especificidad; M, marcador de ADN; kpb, kilo par de bases. Véase la Figura 17A.(B)Se programó Cas9 con ARNcr-sp2 y ARNcrtra (nucleótidos 4 a 89). El complejo se incubó con ADN bicatenarios o monocatenarios que albergan una secuencia complementaria al espaciador 2 y un PAM funcional (4). Las cadenas complementarias o no complementarias del ADN se radiomarcaron en 5' y se hibridaron con una cadena compañera no marcada. nt, nucleótidos. Véase la Figura 17, B y C. (C) Análisis de secuenciación de los productos de escisión de la Figura 10A. La terminación de la extensión del cebador en la reacción de secuenciación indica la posición del sitio de escisión. El saliente A 3' terminal (asteriscos) es un artefacto de la reacción de secuenciación. Véase la Figura 19, A y C.(D)Los productos de escisión de la Figura 10B se analizaron junto con marcadores de tamaño marcados en el extremo 5' derivados de las cadenas complementarias y no complementarias del dúplex de ADN diana. M, marcador; P, producto de escisión. Véase la Figura 19, B y C.(E)Representación esquemática de secuencias de ADN de ARNcrtra, ARNcr-sp2 y protoespaciador 2. Se representan regiones de complementariedad de ARNcr con ADN de ARNcrtra (línea superior) y protoespaciador (línea inferior). La secuencia de PAM está etiquetada; los sitios de escisión mapeados en (C) y (D) se representan por flechas rellenas de color blanco (C), una flecha rellena de color negro [(D), cadena complementaria] y una barra de color negro [(D), cadena no complementaria].
LaFigura 15representa la vía inmunitaria de CRISPR/Cas mediada por ARN de tipo II. Las etapas de expresión e interferencia se representan en el dibujo. Los loci de CRISPR/Cas de tipo II se componen de un operón de cuatro genes que codifican las proteínas Cas9, Cas1, Cas2 y Csn2, una matriz de CRISPR que consiste en una secuencia líder seguida de repeticiones idénticas (rectángulos de color negro) intercaladas con espaciadores de localización específica de genoma únicos (diamantes) y una secuencia que codifica el ARNcrtra transactivador. En la presente descripción se representa el locus de CRISPR/Cas de tipo II de S.pyogenesSF370 (Número de registro NC_002737) (4). Se indican en este locus promotores y un terminador de la transcripción confirmados experimentalmente (4). La matriz de CRISPR se transcribe como una molécula de ARN de CRISPR precursor (pre-ARNcr) que experimenta un proceso de maduración específico para los sistemas de tipo II (4). En S.pyogenesSF370, ARNcrtra se transcribe como dos transcritos primarios de 171 y 89 nt de longitud que tienen complementariedad con cada repetición del pre-ARNcr. El primer evento de procesamiento implica el emparejamiento de ARNcrtra con pre-ARNcr, formando un ARN dúplex que es reconocido y escindido por la endorribonucleasa constitutiva RNasa III en presencia de la proteína Cas9. La escisión mediada por ARNasa III del ARN dúplex genera un ARNcrtra procesado de 75 nt y un ARNcr intermedio de 66 nt que consiste en una región central que contiene una secuencia de un espaciador, flanqueado por porciones de la secuencia de repetición. Un segundo evento de procesamiento, mediado por una o más ribonucleasas desconocidas, conduce a la formación de ARNcr maduros de 39 A 42 nt de longitud que consisten en una secuencia guía derivada del espaciador 5'-terminal y una secuencia 3'-terminal derivada de repetición. Después de los eventos de procesamiento primero y segundo, el ARNcrtra maduro permanece emparejado con los ARNcr maduros y unido a la proteína Cas9. En este complejo ternario, la estructura ARNcrtra:ARNcr dual actúa como ARN guía que dirige la endonucleasa Cas9 al ADN diana afín. El reconocimiento de diana por el complejo Cas9-ARNcra:ARNcr se inicia mediante el barrido de la molécula de ADN invasora para determinar la homología entre la secuencia protoespaciadora en el ADN diana y la secuencia derivada del espaciador en el ARNcr. Además de la complementariedad protoespaciador de ADN-espaciador de ARNcr, la localización específica de ADN requiere la presencia de un motivo corto (NGG, donde N puede ser cualquier nucleótido) adyacente al protoespaciador (motivo adyacente al protoespaciador - PAM). Después del emparejamiento entre el ARN dual y la secuencia protoespaciadora, se forma un bucle R y Cas9 posteriormente introduce una rotura bicatenaria (DSB) en el ADN. La escisión de ADN diana por Cas9 requiere dos dominios catalíticos en la proteína. En un sitio específico con respecto al PAM, el dominio HNH escinde la cadena complementaria del ADN mientras que el dominio similar a RuvC escinde la cadena no complementaria.
Figura 16 (A)Se expresó Cas9 de S.pyogenesen E.colicomo una proteína de fusión que contiene un marcador de His6-MBP N-terminal y se purificó mediante una combinación de etapas cromatográficas de afinidad, intercambio iónico y exclusión por tamaño. El marcador de afinidad se retiró por escisión de la proteasa TEV después de la etapa de purificación por afinidad. Se muestra un cromatograma de la etapa final de cromatografía de exclusión por tamaño en una columna Superdex 200 (16/60). Cas9 eluye como un único pico monomérico desprovisto de ácidos nucleicos contaminantes, según lo juzgado por la relación de absorbancias a 280 y 260 nm. Inserción; las fracciones eluidas se resolvieron mediante s DS-PAGE en un gel de poliacrilamida al 10 % y se tiñeron con SimplyBlue Safe Stain (Invitrogen).(B)Análisis por SDS-PAGE de ortólogos de Cas9 purificados. Los ortólogos de Cas9 se purificaron como se describe en Materiales suplementarios y métodos. Se analizaron 2,5 |jg de cada Cas9 purificada en un gel de poliacrilamida con gradiente del 4-20 % y se tiñeron con SimplyBlue Safe Stain.
Figura 17(véase también la Figura 10). La secuencia protoespaciadora 1 se origina a partir de SPy_0700 de S.pyogenesSF370 (M1), diana de ARNcrsp1 de S.pyogenesSF370 (4). En la presente descripción, la secuencia protoespaciadora 1 se manipuló cambiando el PAM a partir de una secuencia no funcional (TTG) a una funcional (TGG). La secuencia protoespaciadora 4 se origina a partir de MGAS10750_Spy1285 de S.pyogenesMGAS10750 (M4), diana de ARNcr-sp4 de S.pyogenesSF370 (4).(A)Escisión de ADN plasmídico protoespaciador 1 guiada por dúplex ARNcrtra:ARNcr afines. Los productos de escisión se resolvieron mediante electroforesis en gel de agarosa y se visualizaron mediante tinción con bromuro de etidio. M, marcador de ADN; se indican los tamaños de los fragmentos en pares de bases.(B)Escisión de ADN de oligonucleótido protoespaciador 1 guiada por dúplex ARNcrtra:ARNcr-sp1 afín. Los productos de escisión se resolvieron mediante electroforesis en gel de poliacrilamida desnaturalizante y se visualizaron mediante formación de imágenes por fósforo. Se indican tamaños de fragmentos en nucleótidos.(C)Escisión de ADN de oligonucleótido protoespaciador 4 guiada por dúplex ARNcrtra:ARNcr-sp4 afín. Los productos de escisión se resolvieron mediante electroforesis en gel de poliacrilamida desnaturalizante y se visualizaron mediante formación de imágenes por fósforo. Se indican tamaños de fragmentos en nucleótidos.(A, B, C)Los experimentos en (A) se realizaron como en la Figura 10A; en (B) y en (C) como en la Figura 10B.(B, C)A continuación se muestra un esquema de la interacción de ADN diana de ARNcrtra:ARNcr. Las regiones de complementariedad de ARNcr con ARNcrtra y el ADN protoespaciador tienen una línea superior y una línea inferior, respectivamente. La secuencia de PAM está etiquetada.
Figura 18(véase también la Figura 10).(A)Se incubó ADN plasmídico protoespaciador 2 con Cas9 complejada con ARNcrtra:ARNcr-sp2 en presencia de diferentes concentraciones de Mg2+, Mn2+, Ca2+, Zn2+, Co2+, Ni2+ o Cu2+. Los productos de escisión se resolvieron mediante electroforesis en gel de agarosa y se visualizaron mediante tinción con bromuro de etidio. Se indican las formas plasmídicas.(B)Un dúplex de ADN oligonucleotídico protoespaciador 4 que contiene un motivo PAM se hibridó y se purificó en gel antes del radiomarcaje en ambos extremos 5'. El dúplex (concentración final 10 nM) se incubó con Cas9 programada con ARNcrtra (nucleótidos 23-89) y ARNcrsp4 (concentración final 500 nM, 1:1). En los puntos temporales indicados (min), se inactivaron alícuotas de 10 pl de la reacción de escisión con tampón de formamida que contenía SDS al 0,025 % y EDTA 5 mM, y se analizaron mediante electroforesis en gel de poliacrilamida desnaturalizante como en la Figura 10B. Se indican los tamaños en nucleótidos.
Figura 19 (A)Mapeo de la escisión de ADN plasmídico protoespaciador 1. Los productos de escisión de la Figura 17A se analizaron mediante secuenciación como en la Figura 10c . Nótese que el saliente A terminal 3'(asterisco) es un artefacto de la reacción de secuenciación.(B)Mapeo de la escisión de ADN oligonucleotídico protoespaciador 4. Los productos de escisión de la Figura 17C se analizaron mediante electroforesis en gel de poliacrilamida desnaturalizante junto con marcadores de tamaño de oligonucleótido marcados en los extremos 5' derivados de las cadenas complementarias y no complementarias del ADN dúplex protoespaciador 4. M, marcador; P, producto de escisión. Calles 1-2: cadena complementaria. Calles 3-4: cadena no complementaria. Se indican tamaños de fragmentos en nucleótidos. (C) Representaciones esquemáticas de las secuencias de ADN de traARNcr, ARNcr-sp1 y protoespaciador 1 (parte superior) y las secuencias de ADN de traARNcr, ARNcrsp4 y protoespaciador 4 (parte inferior). traARNcr:ARNcr forma una estructura de ARN dual dirigida al ADN protoespaciador complementario a través del emparejamiento ARNcr-ADN protoespaciador. Las regiones complementarias de ARNcr con ARNcrtra y el ADN protoespaciador tienen una línea superior y una línea inferior, respectivamente. Los sitios de escisión en las cadenas de ADN complementarias y no complementarias mapeados en (a) (parte superior) y (B) (parte inferior) se representan con flechas (A y B, cadena complementaria) y una barra de color negro (B, cadena no complementaria) por encima de las secuencias, respectivamente.
Figura 20 (A)Cinética de recambio único de Cas9 en diferentes condiciones de prehibridación de ARN y preincubación de proteína-ARN. Se incubó ADN plasmídico protoespaciador 2 con Cas9 preincubada con ARNrRNA:ARNcr-sp2 prehibridado (o), Cas9 no preincubada con ARNrRNA:ARNcr-sp2 prehibridado (•), Cas9 preincubada con ARNcrtra y ARNcr-sp2 no hibridados (□) o Cas9 no preincubada con ARN no prehibridados (■). La actividad de escisión se controló de una manera dependiente del tiempo y se analizó mediante electroforesis en gel de agarosa seguida de tinción con bromuro de etidio. El porcentaje promedio de escisión de tres experimentos independientes se representa frente al tiempo (min) y se ajustó con una regresión no lineal. Las velocidades de escisión calculadas(kobs) se muestran en la tabla. Los resultados sugieren que la unión de Cas9 a los ARN no está limitada por la velocidad en las condiciones probadas. Se indican las formas plasmídicas. Los valores dekobsobtenidos son comparables a los de las endonucleasas de restricción que son típicamente del orden de 1 10 por minuto (45-47).(B)Cas9 es una endonucleasa de recambio múltiple. Cas9 cargada con ARNcrtra:ARNcrsp2 dúplex (1 nM, 1: 1: 1 - indicado con línea gris en el gráfico) se incubó con un exceso de 5 veces del ADN plasmídico protoespaciador 2 nativo. La escisión se controló extrayendo muestras de la reacción a intervalos de tiempo definidos (0 a 120 min) seguido de análisis de electroforesis en gel de agarosa (parte superior) y determinación de la cantidad del producto de escisión (nM) (parte inferior). Se indican las desviaciones estándar de tres experimentos independientes. En el intervalo de tiempo investigado, Cas9 1 nM fue capaz de escindir ADN plasmídico ~2,5 nM.Cada dominio nucleasa de Cas9 escinde una cadena de ADN
Cas9 contiene dominios homólogos a las endonucleasas HNH y RuvC (Figura 11A y Figura 3) (21-23, 27, 28). Los presentes inventores diseñaron y purificaron variantes de Cas9 que contenían mutaciones puntuales inactivadoras en los residuos catalíticos de los dominios HNH o similar a RuvC (Figura 11A y Figura 3) (23, 27). La incubación de estas variantes de proteínas Cas9 con ADN plasmídico nativo mostró que las proteínas Cas9 mutantes guiadas por ARN dual produjeron plásmidos circulares abiertos mellados, mientras que el complejo proteína Cas9 TS-ARNcra:ARNcr produjo un producto de ADN lineal (Figuras 10A y 11A y Figuras 17A y 25A). Este resultado indica que los dominios HNH y similar a RuvC de Cas9 escinden cada uno una cadena de ADN plasmídico. Para determinar qué cadena del ADN diana es escindida por cada dominio catalítico de Cas9, los presentes inventores incubaron los complejos Cas9-ARNcrtra:ARNcr mutantes con sustratos de ADNbc cortos en los que la cadena complementaria o no complementaria estaba radiomarcada en su extremo 5'. Los productos de escisión resultantes indicaron que el dominio HNH de Cas9 escinde la cadena de ADN complementaria, mientras que el dominio similar a RuvC de Cas9 escinde la cadena de ADN no complementaria (Figura 11B y Figura 21B).
Figura 11(A)(Parte superior) Representación esquemática de la estructura del dominio Cas9 que muestra las posiciones de las mutaciones del dominio. D10A, Asp10^Ala10; H840A; His840^Ala840. Se ensayaron omplejos de proteínas Cas9 TS o mutantes de nucleasa con ARNcr: ARNcr-sp2 para determinar la actividad endonucleasa como en la Figura 10A.(B)Se probaron complejos de Cas9 TS o mutantes de dominio nucleasa con ARNcrtra y ARNcr-sp2 para determinar la actividad como en la Figura 10B.
Figura 3Se representa la secuencia de aminoácidos de Cas9 de S.p y o g e n e s(Id. de sec. n.° 8). Las proteínas Cas9/Csn1 de varias especies diversas tienen 2 dominios que incluyen motivos homólogos a ambas endonucleasas HNH y RuvC.(A)Se muestran los motivos 1-4 (los números de motivo están marcados en el lado izquierdo de la secuencia) para Cas9/Csn1 de S.p y o g e n e s .Los tres motivos de similar a RuvC predichos (1, 2, 4) y el motivo de HNH (3) predicho tienen una línea superior. Los residuos Asp10 e His840, que estaban sustituidos por Ala en este estudio, se destacaron con un asterisco por encima de la secuencia. Los residuos subrayados están altamente conservados entre las proteínas Cas9 de diferentes especies. Es probable que las mutaciones en los residuos subrayados tengan consecuencias funcionales en la actividad de Cas9. Nótese que en el presente estudio se demuestra experimentalmente el acoplamiento de las dos actividades similares a nucleasas (Figura 11 y Figura 21).(B)Se representan los dominios 1 (aminoácidos 7-166) y 2 (aminoácidos 731-1003), que incluyen los motivos 1-4, para Cas9/Csn1 de S.p y o g e n e s .Refiérase a laTabla 1y laFigura 5para consultar información adicional.
Figura 21Escisión de ADN protoespaciador por mutantes de Cas9 dirigidos por ARNcrtra:ARNcr afines que contienen mutaciones en el dominio HNH o similar a RuvC.(A)Escisión de ADN plasmídico protoespaciador 1. El experimento se realizó como en la Figura 11A. Se indican las conformaciones de ADN plasmídico y los tamaños en pares de bases.(B)Clonación de ADN oligonucleotídico espaciador 4. El experimento se realizó como en la Figura 11B. Se indican los tamaños en nucleótidos.
Requisitos de ARN Dual para la unión y escisión de ADN diana
Podría ser necesario ARNcrtra para la unión a ADN diana y/o para estimular la actividad nucleasa de Cas9 corriente abajo del reconocimiento de la diana. Para distinguir entre estas posibilidades, los presentes inventores usaron un ensayo de desplazamiento de movilidad electroforética para monitorizar la unión del ADN diana por Cas9 catalíticamente inactiva en presencia o ausencia de ARNcr y/o ARNcrtra. La adición de ARNcrtra potenció sustancialmente la unión a ADN diana por Cas9, mientras que se observó poca unión a ADN específica con Cas9 sola o Cas9- ARNcr (Figura 22). Esto indica que es necesario ARNcrtra para el reconocimiento de ADN diana, posiblemente al orientar adecuadamente el ARNcr para la interacción con la cadena complementaria del ADN diana. La estructura secundaria de ARNcrtra:ARNcr predicha incluye el emparejamiento de bases entre los 22 nucleótidos en el extremo 3' del ARNcr y un segmento cerca del extremo 5' del ARNcrtra maduro (Figura 10E). Esta interacción crea una estructura en la que los 20 nucleótidos 5'-terminales del ARNcr, que varían en su secuencia en diferentes ARNcr, están disponibles para la unión a ADN diana. La mayor parte del ARNcrtra en dirección 5' de la región de emparejamiento de bases de ARNcr está libre para formar una estructura o estructuras de ARN adicionales y/o para interactuar con Cas9 o el sitio de ADN diana. Para determinar si la longitud completa del ARNcrtra es necesaria para la escisión de ADN catalizada por Cas9 específica de sitio, los presentes inventores probaron complejos Cas9-ARNcra-ARNcr reconstituidos usando ARNcr maduro de longitud completa (42 nucleótidos) y diversas formas truncadas de ARNcrtra que carecían de secuencias en sus extremos 5' o 3'. Estos complejos se probaron para determinar la escisión usando un ADNbc diana corto. Una versión sustancialmente truncada del ARNcrtra que retiene los nucleótidos 23 a 48 de la secuencia nativa fue capaz de respaldar una escisión robusta de ADN catalizada por Cas9 guiada por ARN dual (Figura 12, A y C, y Figura 23, A y B). El truncamiento del ARNcr de cualquier extremo demostró que la escisión catalizada por Cas9 en presencia de ARNcrtra podría accionarse con ARNcr en los que faltan los 10 nucleótidos 3'-terminales (Figura 12, B y C). Por el contrario, una deleción de 10 nucleótidos del extremo 5' de ARNcr impidió la escisión de ADN por Cas9 (Figura 12B). Los presentes inventores también analizaron ortólogos de Cas9 de diversas especies bacterianas para determinar su capacidad para respaldar la escisión de ADN guiada por ARNcrtra:ARNcr de S.p y o g e n e s .A diferencia de los ortólogos de Cas9 de S.p y o g e n e sestrechamente relacionados, los ortólogos relacionados más distantes no fueron funcionales en la reacción de escisión (Figura 24). Similarmente, la Cas9 de S.p y o g e n e sguiada por dúplex ARNcrtra:ARNcr originados a partir de sistemas más distantes no fue capaz de escindir el ADN eficientemente (Figura 24). La especificidad de especie de la escisión guiada por ARN de ADN indica la evolución conjunta de Cas9, ARNcrtra y la repetición de ARNcr, así como la existencia de una estructura y/o secuencia todavía desconocida en el ARN dual que es fundamental para la formación del complejo ternario con ortólogos de Cas9 específicos.
Para investigar los requisitos de la secuencia protoespaciadora para la inmunidad de CRISPR/Cas de tipo II en células bacterianas, los presentes inventores analizaron una serie de ADN plasmídicos que contenían protoespaciador que albergaban mutaciones de nucleótido único para su mantenimiento después de la transformación en S.p y o g e n e sy su susceptibilidad para ser escindidos por Cas9in v itro .A diferencia de las mutaciones puntuales introducidas en el extremo 5' del protoespaciador, las mutaciones en la región próxima al PAM y los sitios de escisión por Cas9 no se toleraronin v ivoy dieron como resultado una disminución de la eficiencia de escisión del plásmidoin v itro(Figura 12D). Los resultados de los presentes inventores concuerdan con una publicación anterior de mutantes de escape de protoespaciador seleccionados en el sistema CRISPR de tipo II de S. thermophilusin v ivo(27, 29). Además, el mantenimiento del plásmido y los resultados de escisión indican la existencia de una región “ semilla” ubicada en el extremo 3' de la secuencia del protoespaciador que es crucial para la interacción con el ARNcr y la posterior escisión por Cas9. Respaldando esta noción, Cas9 potenció la hibridación de la cadena de ADN complementaria con el ARNcr; esta potenciación fue la más fuerte en la región 3'-terminal de la secuencia de localización específica de ARNcr (Figura 25A-C). Corroborando este descubrimiento, se requiere un tramo contiguo de al menos 13 pares de bases entre el ARNcr y el sitio de ADN diana proximal al PAM para la escisión eficiente de la diana, mientras que se toleran hasta seis emparejamientos erróneos contiguos en la región 5'-terminal del protoespaciador (Figura 12E). Estos descubrimientos recuerdan a los requisitos de secuencia de siembra observados anteriormente para el reconocimiento de ácido nucleico diana en proteínas Argonauta (30, 31) y los complejos CRISPR Cascada y Csy (13, 14).
Figura 12 (A)Se reconstituyeron complejos Cas9-ARNcrtra:ARNcr usando constructos de 42-nucleótidos de ARNcr-sp2 y ARNcrtra truncado y se ensayó su actividad de escisión como en la Figura 10B.(B)Se ensayó Cas9 programada con truncamientos de ARNcr-sp2 y ARNcrtra de longitud completa para determinar su actividad como en (A).(C)Regiones mínimas de ARNcrtra y ARNcr capaces de guiar la escisión de ADN mediada por Cas9 (región sombreada).(D)Se escindieronin v itroplásmidos que contenían secuencias de protoespaciador 2 TS o mutantes con mutaciones puntuales indicadas mediante Cas9 programada como en la Figura 10A y se usaron para ensayos de transformación de S.p y o g e n e sTS o deficiente en pre-ARNcr. La eficacia de transformación se calculó como unidades formadoras de colonias (UFC) por microgramo de ADN plasmídico. Las barras de error representan las DE para tres réplicas biológicas.(E)Se escindieron inv itroplásmidos que contenían insertos de protoespaciador 2 TS y mutantes con una extensión variable de los emparejamientos erróneos de ARNcr-ADN diana (parte inferior) mediante Cas9 programada (parte superior). Las reacciones de escisión se digirieron adicionalmente con XmnI. Los fragmentos de 1880 y 800 pb son productos de escisión generados por Cas9. M, marcador de ADN.
Figura 22Se realizaron ensayos de desplazamiento de movilidad electroforética usando dúplex de ADN diana protoespaciador 4 y Cas9 (que contenía mutaciones inactivadoras de dominio nucleasa D10A y H840) sola o en presencia de ARNcr-sp4, ARNcrtra (75 nt), o ambos. El dúplex de ADN diana estaba radiomarcado en ambos extremos 5'. Cas9 (D10/H840A) y los complejos se valoraron volumétricamente de 1 nM a 1 pM. La unión se analizó mediante electroforesis en gel de poliacrilamida nativa al 8 % y se visualizó mediante formación de imágenes por fósforo. Nótese que Cas9 sola se une a ADN diana con afinidad moderada. Esta unión no se ve afectada por la adición de ARNcr, lo que sugiere que esto representa la interacción no específica de secuencia con el ADNbc. Además, esta interacción puede ser superada por ARNcrtra solo en ausencia de ARNcr. En presencia tanto de ARNcr como de ARNcrtra, la unión a ADN diana se potencia sustancialmente y produce una especie con movilidad electroforética distinta, indicativa del reconocimiento específico de ADN diana.
Figura 23Un fragmento de ARNcrtra que abarca una parte de la región emparejada por ARNcr y una porción de la región en dirección 3' es suficiente para dirigir la escisión de ADN oligonucleotídico protoespaciador por Cas9.(A)Escisión de ADN oligonucleotídico protoespaciador 1 y(B)Escisión de ADN oligonucleotídico protoespaciador 4 por Cas9 guiada con un ARNcr maduro afín y diversos fragmentos de ARNtracr.(A, B)Se indican los tamaños en los nucleótidos.
Figura 24Como Cas9 de S.p yo g e n e s ,los ortólogos de Cas9 estrechamente relacionados de las bacterias grampositivasL. in n o c u ay S.th e rm o p h ilu sescinden el ADN protoespaciador cuando se localiza específicamente por ARNcrtra:ARNcr de S.p yo g e n e s .Sin embargo, en las mismas condiciones, no se observa escisión de ADN por los ortólogos Cas9 menos estrechamente relacionados de las bacterias gramnegativas C.je ju n iyN. m e n in g it id is .Spy S.p y o g e n e sSF370 (Número de registro NC_002737); Sth, S.th e rm o p h ilu sLMD-9 (ortólogo de Cas9 STER_1477; Número de registro NC_008532); Lin,L. in n o c u aClip11262 (Número de registro NC_003212); Cje,C. je ju n iNCTC 11168 (Número de registro NC_002163); Nme,N. m e n in g itid isA Z2491 (Número de registro NC_003116).(A)Escisión de ADN plasmídico protoespaciador. Se sometió ADN plasmídico protoespaciador 2 (300 ng) a escisión por diferentes ortólogos de Cas9 (500 nM) guiados por dúplex híbridos ARNcrtra:ARNcr-sp2 (500 nM, 1:1) de diferentes especies. Para diseñar los dúplex de ARN, los presentes inventores predijeron secuencias de ARNcrtra deL. in n o c u ayN. m e n in g itid isbasándose en datos de transferencia Northern publicados anteriormente(4).Los dúplex de ARN híbridos duales consisten en ARNcrtra específico de especie y un ARNcr heterólogo. La secuencia de ARNcr heterólogo se modificó por ingeniería genética para que contuviera la secuencia sp2 de localización específica de ADN de S.p y o g e n e sen el extremo 5' fusionado a la secuencia de repetición de unión a ARNcrtra deL. in n o cu aoN. m e n in g itid isen el extremo 3'. Los ortólogos de Cas9 de S.th e rm o p h ilu syL. in n o cu a ,pero no deN. m e n in g itid isoC. je ju n i,pueden ser guiados por ARNcrtra:ARNcr-sp2 de S.p y o g e n e spara escindir el ADN plasmídico protoespaciador 2, aunque con una eficacia ligeramente disminuida. De forma similar, el ARNcrtra:ARNcr-sp2 híbrido deL. in n o c u apuede guiar a la Cas9 de S.p y o g e n e spara escindir el ADN diana con una eficiencia alta, mientras que el ARNcrtra:ARNcr-sp2 híbrido deN. m e n in g itid isacciona solamente una ligera actividad de escisión de ADN por Cas9 de S.p y o g e n e s .Como controles, los ortólogos de Cas9 deN. m e n in g itid isyL. in n o c u aescinden el a Dn plasmídico protoespaciador 2 cuando son guiados por el ARNcrtra-ARNcr-sp2 híbrido afín. Nótese que, como se ha mencionado anteriormente, la secuencia de ARNcrtra de N.m e n in g itid issolamente se predice y aún no se ha confirmado mediante secuenciación de ARN. Por lo tanto, la eficacia de escisión baja podría ser el resultado de una actividad baja de los ortólogos de Cas9 o el uso de una secuencia de ARNcrtra no diseñada de manera óptima.(B)Escisión de ADN oligonucleotídico protoespaciador. El oligonucleótido de cadena complementaria marcado radiactivamente en el extremo 5' (10 nM) prehibridado con oligonucleótido de cadena no complementaria sin marcar (protoespaciador 1) (10 nM) (izquierda) o el oligonucleótido de cadena no complementaria marcado radiactivamente en el extremo 5' (10 nM) prehibridado con oligonucleótido de cadena complementaria sin marcar (10 nM) (derecha) (protoespaciador 1) se sometió a escisión por diversos ortólogos de Cas9 (500 nM) guiados por dúplex ARNcrtra:ARNcr-sp1 de S.p y o g e n e s(500 nM, 1:1). Los ortólogos de Cas9 de S.th e rm o p h ilu syL. in n o cu a ,pero no deN. m e n in g itid isoC. je ju n i, pueden ser guiados por ARN dual afín deS.p y o g e n e spara escindir el ADN oligonucleotídico protoespaciador, aunque con una eficiencia disminuida. Nótese que el sitio de escisión en la cadena de ADN complementaria es idéntico para los tres ortólogos. La escisión de la cadena no complementaria se produce en posiciones distintas.(C)Identidad de secuencia de aminoácidos de ortólogos de Cas9. Los ortólogos Cas9 de S.pyogenes, S. thermophilusyL. innocuacomparten un alto porcentaje de identidad de aminoácidos. Por el contrario, las proteínas Cas9 deC. jejuniyN. meningitidisdifieren en secuencia y longitud (-300-400 aminoácidos más cortas).(D)Coplegamientos de secuencias de ARNcr heterólogas específicas de especie modificadas por ingeniería genética con los ortólogos de ARNcrtra correspondientes de S.pyogenes(confirmados experimentalmente, (4)),L. innocua(predichos) oN. meningitidis(predichos). Los ARNcrtrac; los fragmentos del espaciador 2 de ARNcr; y los fragmentos de repeticiones de ARNcr están trazados y etiquetados. Los dúplex ARNcrtra:ARNcr-sp2 híbridos de L.innocuay S.pyogenescomparten características estructurales muy similares, aunque distintas de las del ARNcrtra:ARNcr híbrido deN. meningitidis.Junto con los datos de escisión descritos anteriormente en (A) y (B), las predicciones de plegamiento indicarían que la escisión con especificidad de especie del ADN diana por Cas9-ARNcrtra:ARNcr está dictada por una característica estructural aún desconocida en el dúplex ARNcrtra:ARNcr que es reconocida específicamente por un ortólogo de Cas9 afín. Se predijo que la especificidad de especie de la escisión observada en (A) y (B) se produce al nivel de unión de Cas9 a ARNcrtra:ARNcr dual. La escisión por Cas9 guiada por ARN dual del ADN diana puede ser específica de especie. Dependiendo del grado de diversidad/evolución entre las proteínas Cas9 y los dúplex ARNrARN:ARNcr, Cas9 y los ortólogos de ARN dual son parcialmente intercambiables.
Figura 25Se analizó una serie de sondas de ADN de 8 nucleótidos complementarias a las regiones en el ARNcr que abarcan la región de localización específica de ADN y la región de unión a ARNcrtra para determinar su capacidad para hibridarse con el ARNcr en el contexto de un dúplex ARNcrtra:ARNcr y el complejo ternario Cas9-ARNcrtra:ARNcr.(A)Representación esquemática de las secuencias de sondas de ADN utilizadas en el ensayo y sus sitios de unión en ARNcr-sp4.(B-C)Ensayos de desplazamiento de movilidad electroforética de sondas de ADN diana con ARNcrtra:ARNcr-sp4 o Cas9-traARNcr:ARNcr-sp4. El constructo de ARNcrtra (15-89) se usó en el experimento. La unión de los dúplex o complejos a los ADN oligonucleotídicos diana se analizó en un gel de poliacrilamida nativo al 16 % y se visualizó mediante formación de imágenes por fósforo.
Un motivo de secuencia corta dicta la formación de bucles R
En múltiples sistemas CRISPR/Cas, se ha demostrado que el reconocimiento de lo propio frente a lo no propio implica un motivo de secuencia corta que está conservado en el genoma extraño, denominado PAM (27, 29, 32-34). Los motivos PAM tienen solamente unos pocos pares de bases de longitud, y su secuencia y posición precisas varían según el tipo de sistema CRISPR/Cas (32). En el sistema de tipo II de S.pyogenes,el PAM se adapta a una secuencia consenso de NGG, que contiene dos pares de bases G: C que se producen un par de bases en dirección 3' de la secuencia de unión a ARNcr, dentro del ADN diana (4). Los ensayos de transformación demostraron que el motivo GG es esencial para la eliminación del ADN plasmídico protoespaciador por CRISPR/Cas en células bacterianas (Figura 26A), lo que es coherente con observaciones anteriores en S.thermophilus(27). El motivo también es esencial para la escisión del plásmido protoespaciadorin vitropor Cas9 guiada por ARNcrtra:ARNcr (Figura 26B). Para determinar el papel de la PAM en la escisión de ADN diana por el complejo Cas9-ARNcrtra:ARNcr, los presentes inventores probaron una serie de mutaciones que contenían dúplex de ADNbc en la secuencia de PAM en las cadenas complementarias o no complementarias, o ambas (Figura 13A). Los ensayos de escisión usando estos sustratos mostraron que la escisión de ADN catalizada por Cas 9 fue particularmente sensible a las mutaciones en la secuencia de PAM en la cadena no complementaria del ADN, a diferencia del reconocimiento de PAM de cadena complementaria por los sistemas CRISPR/Cas de tipo I (18, 34). La escisión de los ADN monocatenarios diana no se vio afectada por las mutaciones del motivo PAM. Esta observación sugiere que el motivo PAM solamente se requiere en el contexto de ADNbc diana y, por lo tanto, puede ser necesario para permitir el desenrollamiento del dúplex, la invasión de cadenas y la formación de una estructura de bucle R. Cuando los presentes inventores usaron un par ARNcr-ADN diana diferente (ARNcr-sp4 y ADN protoespaciador 4), seleccionado debido a la presencia de un<p>A<m>canónico no presente en el ADN diana protoespaciador 2, los presentes inventores descubrieron que ambos nucleótidos G del PAM fueron necesarios para la escisión eficiente de ADN catalizada por Cas9 (Figura 13B y Figura 26C). Para determinar si el PAM desempeña una función directa en el reclutamiento del complejo Cas9-ARNcrtra:ARNcr con el sitio de ADN diana correcto, los presentes inventores analizaron las afinidades de unión del complejo por las secuencias de ADN diana mediante ensayos de desplazamiento de movilidad en gel nativo (Figura 13C). La mutación de G en la secuencia de PAM redujo sustancialmente la afinidad de Cas9-ARNcrtra: ARNcr por el ADN diana. Este descubrimiento ilustra una función para la secuencia de PAM en la unión a ADN diana por Cas9.
Figura 13 (A)Se probó Cas9 programada por ARN dual para determinar su actividad como en la Figura 10B. Las secuencias de PAM t S y mutantes en el ADN diana se indican con líneas.(B)Se incubaron dúplex de ADN diana protoespaciador 4 (marcados en ambos extremos 5') que contenían motivos PAM TS y mutantes con Cas9 programada con ARNcrtra:ARNcrsp4 (nucleótidos 23 a 89). En los puntos temporales indicados (en minutos), se tomaron alícuotas de la reacción de escisión y se analizaron como en la Figura 10B. (C) Se realizaron ensayos de desplazamiento de movilidad electroforética usando dúplex de Cas9 programada por ARN (D10A/H840A) y ADN diana protoespaciador 4 [igual que en (B)] que contenían motivos PAM TS y mutados. El complejo Cas9 (D10A/H840A)-ARN se valoró volumétricamente de 100 pM a 1 mM.
Figura 26 (A)Las mutaciones de la secuencia de PAM en ADN plasmídico protoespaciador 2 impiden la interferencia del mantenimiento del plásmido por el sistema CRISPR/Cas de Tipo II en células bacterianas. Se transformaron plásmidos protoespaciadores 2 de tipo silvestre con un PAM funcional o mutado en S.pyogenesde tipo silvestre (cepa SF370, también denominada EC904) y mutante deficiente en ARNcr (EC1479 ) como en la Figura 12D. El sistema CRISPR/Cas de Tipo IIin vivonotolera mutaciones de PAM. Se muestran los valores medios y las desviaciones estándar de tres réplicas biológicas.(B)Las mutaciones de la secuencia de PAM en ADN plasmídico protoespaciador impiden la escisión por Cas9-traARNcr:ARNcr. Se sometió plásmido protoespaciador 2 de tipo silvestre con un PAM funcional o mutado a escisión por Cas9 como en la Figura 10A. Los plásmidos de PAM mutantes no son escindidos por el complejo Cas9-ARNcrtra:ARNcr.(C)Las mutaciones de la secuencia de PAM canónica impiden la interferencia del mantenimiento del plásmido por el sistema CRISPR/Cas de Tipo II en células bacterianas. Se escindieron plásmidos protoespaciadores 4 de tipo silvestre con un PAM funcional o mutado con Cas9 programada con ARNcrtra y ARNcr-sp2. Las reacciones de escisión se realizaron en presencia de la endonucleasa de restricción XmnI para visualizar los productos de escisión por Cas9 como dos fragmentos (-1880 y ~800 pb). Se indican los tamaños de los fragmentos en pares de bases.
Cas9 puede programarse con un ARN quimérico único
El examen de la estructura secundaria probable del dúplex ARNcrtra:ARNcr (Figuras 10E y 12C) sugirió la posibilidad de que las características requeridas para la escisión de ADN catalizada por Cas9 específica de sitio podrían capturarse en un ARN quimérico único. Aunque el mecanismo de selección de diana de ARNcrtra:ARNcr funciona eficientemente en la naturaleza, la posibilidad de una Cas9 guiada por ARN único es atractiva debido a su potencial utilidad para la escisión de ADN programada y la edición del genoma (Figura 1A-B). Los presentes inventores diseñaron dos versiones de un ARN quimérico que contenía una secuencia de reconocimiento diana en el extremo 5' seguida de una estructura de horquilla que retenía las interacciones de emparejamiento de bases que se producen entre el ARNcrtra y el ARNcr (Figura 14A). Este transcrito único fusiona eficazmente el extremo 3' del ARNcr con el extremo 5' del ARNcrtra, imitando de este modo la estructura de ARN dual requerida para guiar la escisión de ADN específica de sitio por Cas9. En los ensayos de escisión usando ADN plasmídico, se observó que el ARN quimérico más largo fue capaz de guiar la escisión de ADN catalizada por Cas9 de una manera similar A la observada para el dúplex ARNcrtra:ARNcr truncado (Figura 14A y Figura 27, A y C). El ARN quimérico más corto no funcionó eficientemente en este ensayo, lo que confirma que los nucleótidos que tienen de 5 a 12 posiciones más allá de la interacción de emparejamiento de bases de ARNcrtra:ARNcr son importantes para la unión eficiente de Cas9 y/o el reconocimiento de la diana. Se obtuvieron resultados similares en ensayos de escisión usando ADNbc corto como sustrato, lo que indica además que la posición del sitio de escisión en el ADN diana es idéntica a la observada usando el ARNcrtra:ARNcr dual como guía (Figura 14B y Figura 27, B y C). Por último, para establecer si el diseño del ARN quimérico podría ser universalmente aplicable, lo presentes inventores modificaron por ingeniería genética cinco ARN guía quiméricos diferentes para la localización específica en una porción del gen que codifica la proteína verde fluorescente (GFP) (Figura 28, A a C) y probaron su eficacia contra un plásmido que porta la secuencia codificante de GFP invitro.En los cinco casos, la Cas9 programada con estos ARN quiméricos escindió eficazmente el plásmido en el sitio diana correcto (Figura 14C y Figura 28D), lo que indica que el diseño racional de ARN quiméricos es robusto y podría, en principio, permitir la localización específica de cualquier secuencia de ADN de interés con pocas restricciones más allá de la presencia de un dinucleótido GG adyacente a la secuencia localizada específicamente.
Figura 1Un ARN de localización específica de ADN comprende un “ segmento de localización específica de ADN” monocatenario y un “ segmento de unión a proteínas” , que comprende un tramo de ARN bicatenario. (A) Un ARN de localización específica de ADN puede comprender dos moléculas de ARN separadas (denominadas ARN de localización específica de ADN “ de molécula doble” o “ de dos moléculas” ). Un ARN de localización específica de ADN de molécula doble comprende un “ARN localizador específico” y un “ARN activador” (B) Un ARN de localización específica de ADN puede comprender una molécula única de ARN (denominada ARN de localización específica de ADN de “ molécula única” ). Un ARN de localización específica de ADN de molécula única comprende “ nucleótidos enlazadores”
Figura 14 (A)Un plásmido que albergaba la secuencia diana del protoespaciador 4 y una PAM TS se sometió a escisión por Cas9 programada con dúplex ARNcrtra(4-89):ARNcr-sp4 o ARN quiméricos transcrito invitroconstruidos uniendo el extremo 3' del ARNcr al extremo 5' del ARNcrtra con un tetrabucle GAAA. Las reacciones de escisión se analizaron mediante mapeo de restricción con XmnI. Las secuencias de los ARN quiméricos A y B se muestran con secuencias de localización específica de ADN (línea inferior), secuencias derivadas de repeticiones ded ARNcr (línea superior) y secuencias derivadas de ARNcrtra (subrayado discontinuo). (B) Las reacciones de escisión de dúplex de ADN protoespaciador 4 se realizaron como en la Figura 10B. (C) Se usaron cinco ARN quiméricos diseñados para localizar específicamente el gen de GFP para programar Cas9 para escindir un plásmido que contenía el gen de GFP. Se realizaron reacciones de escisión de plásmidos como en la Figura 12E, excepto por que el ADN plasmídico se mapeó por restricción con Abrí después de la escisión por Cas9.
Figura 27 (A)Un ARN quimérico único guía la escisión catalizada por Cas9 de ADN plasmídico protoespaciador afín (protoespaciador 1 y protoespaciador 2). Las reacciones de escisión se realizaron en presencia de la endonucleasa de restricción XmnI para visualizar los productos de escisión por Cas9 como dos fragmentos (-1880 y ~800 pb). Se indican los tamaños de los fragmentos en pares de bases.(B)Un ARN quimérico único guía la escisión catalizada por Cas9 de ADN oligonucleotídico protoespaciador afín (protoespaciador 1 y protoespaciador 2). Se indican tamaños de fragmentos en nucleótidos.(C)Representaciones esquemáticas de los ARN quiméricos utilizados en el experimento. Las secuencias de los<a>R<n>quiméricos A y B se muestran con la secuencia de localización específica de ADN protoespaciador 5' de ARNcr (subrayado), la secuencia de unión a ARNcrtra de ARNcr (línea superior) y la secuencia derivada de ARNcrtra (subrayado discontinuo).
Figura 28 (A)Representación esquemática del plásmido de expresión de GFP pCFJ127. La porción de localización específica del marco de lectura abierto de GFP se indica con una punta de flecha de color negro.(B)Primer plano de la secuencia de la región localizada específicamente. Se muestran secuencias localizadas específicamente por los ARN quiméricos con barras de color gris. Los dinucleótidos PAM están recuadrados. Un sitio de restricción Sail único se ubica 60 pb en dirección 5' del locus diana.(C)Izquierda: Se muestran secuencias de ADN diana junto con sus motivos PAM adyacentes. Derecha: Secuencias de los ARN guía quiméricos.(D)Se escindió pCFJ127 por Cas9 programada con ARN quiméricos GFP 1-5, como se indica. El plásmido se digirió de forma adicional con Sail y las reacciones se analizaron mediante electroforesis en un gel de agarosa al 3 % y se visualizaron mediante tinción con SYBR Safe.
Conclusiones
Se identificó un mecanismo de interferencia de ADN, que implica una estructura de ARN dual que dirige una endonucleasa Cas9 para introducir roturas bicatenarias específicas de sitio en el ADN diana. La proteína Cas9 guiada por ARNcrtra:ARNcr hace uso de dominios de endonucleasa distintos (dominios HNH y similar a RuvC) para escindir las dos cadenas en el ADN diana. El reconocimiento diana por Cas9 requiere tanto una secuencia semilla en el ARNcr como una secuencia de PAM que contenga dinucleótido GG adyacente a la región de unión a ARNcr en el ADN diana. Se demuestra además que la endonucleasa Cas9 puede programarse con ARN guía modificado por ingeniería genética como un único transcrito para localizar específicamente y escindir cualquier secuencia de ADNbc de interés. El sistema es eficiente, versátil y programable cambiando la secuencia de unión al ADN diana en el ARN quimérico guía. Las nucleasas de dedos de cinc y las nucleasas efectoras similares a activador de la transcripción han atraído un interés considerable como enzimas artificiales modificadas por ingeniería genética para manipular genomas (35-38). Esto representa una metodología alternativa basada en Cas9 programada por ARN que facilita aplicaciones de localización específica de genes y edición genómica.
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Ejemplo 2: Edición del genoma programado por ARN en células humanas
Los datos proporcionados a continuación demuestran que Cas9 puede expresarse y localizarse en el núcleo de células humanas, y que se ensambla con ARN guía único (“ARNgu” ; que abarca las características requeridas para la unión de Cas9 y el reconocimiento del sitio diana de ADN) en una célula humana. Estos complejos pueden generar roturas bicatenarias y estimular la reparación de la unión de extremos no homólogos (NHEJ) en el ADN genómico en un sitio complementario a la secuencia de ARNgu, una actividad que requiere tanto Cas9 como el ARNgu. La extensión de la secuencia de ARN en su extremo 3' potencia la actividad de localización específica de ADN en células vivas. Además, los experimentos que usan extractos de células transfectadas muestran que el ensamblaje de ARNgu en Cas9 es el factor limitante para la escisión de ADN mediada por Cas9. Estos resultados demuestran que la edición genómica programada por ARN funciona en células vivas ein vivo.
Materiales y métodos
Diseño y construcción de plásmidos
La secuencia que codifica Cas9 deStreptococcus pyogenes(residuos 1-1368) fusionada con un epítopo de HA (secuencia de aminoácidos DAYPYDVPDYASL (Id. de sec. n.° 274), una señal de localización nuclear (secuencia de aminoácidos PKKKRKVEDPKKKRKVD (Id. de sec. n.° 275) con codones optimizados para la expresión humana y se sintetizó mediante GeneArt. La secuencia de ADN es la Id. de sec. n.° 276 y la secuencia de proteína es la Id. de sec. n.° 277. Se usó clonación independiente de la ligadura (LIC) para insertar esta secuencia en vectores de LIC de GFP derivado de pcDNA3.1 y de mCherry (vectores 6D y 6B, respectivamente, obtenidos de UC Berkeley MacroLab), dando como resultado fusiones Cas9-HA-NLS-GFP y Cas9-HA-NLS-mCherry expresadas con el control del promotor CMV. Se expresaron ARNgu guía usando vector de expresión pSilcer 2.1-U6 puro (Life Technologies) y pSuper (Oligomotor). Se generaron constructos de expresión de ARN mediante la hibridación de oligonucleótidos complementarios para formar la secuencia de ADN codificante de ARN y ligar el fragmento de ADN hibridado entre los sitios BamHI y HindIII en pSilencer 2.1-U6 puro y los sitios HindIII y HindIII en pSuper.
Condiciones de cultivo celular y transfecciones de ADN
Se mantuvieron células HEK293T en medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) suplementado con suero bovino fetal al 10 % (FBS) en una incubadora humidificada a 37 °C con CO2 al 5 %. Las células se transfectaron transitoriamente con ADN plasmídico usando el reactivo de transfección de ADN X-tremeGENE (Roche) o el reactivo de transfección Turbofect (Thermo Scientific) con protocolos recomendados. Brevemente, las células HEK293T se transfectaron a una confluencia del 60-80 % en placas de 6 pocillos usando 0,5 |jg del plásmido de expresión de Cas9 y 2,0 jg del plásmido de expresión de ARN. Se estimó que las eficiencias de transfección eran del 30-50 % para Tubofect (Figuras 29E y 37A-B) y del 80-90 % para X-tremex (Figura 31B), basándose en la fracción de células positivas para GFP observadas por microscopía de fluorescencia. 48 horas después de la transfección, las células se lavaron con solución salina tamponada con fosfato (PBS) y se lisaron aplicando 250 j l de tampón de lisis (Hepes 20 mM pH 7,5, cloruro de potasio 100 mM (KCl), cloruro de magnesio 5 mM (MgCb), ditiotreitol (DTT) 1 mM, glicerol al 5 %, Triton X-100 al 0,1 %, suplementado con cóctel de inhibidor de proteasa Roche) y después se agitaron durante 10 min a 4 °C. El lisado celular resultante se dividió en alícuotas para su análisis adicional. Se aisló ADN genómico de 200 j l de lisado celular usando el Kit DNeasy Blood and Tissue (Qiagen) según el protocolo del fabricante.
Análisis por transferencia Western de la expresión de Cas9
Se recogieron HEK293T, transfectadas con el plásmido de expresión Cas9-HA-NLS-GFP, y se lisaron 48 horas después de la transfección como se indicó anteriormente. Se sometieron a electroforesis 5 ul de lisado en un gel de SDS poliacrilamida al 10 %, se secaron sobre una membrana de PVDF y se sondaron con anticuerpo anti-HA conjugado con HRP (Sigma, dilución 1:1000 en PBS 1x).
Ensayo Surveyor
El ensayo Surveyor se realizó como se ha descrito anteriormente [10, 12, 13]. Brevemente, el locus de la cadena ligera A de clatrina humana (CLTA) se amplificó por PCR a partir de 200 ng de ADN genómico usando una polimerasa de alta fidelidad, ADN polimerasa de fusión Herculase II (Agilent Technologies) y cebador directo 5'-GCAGCAGAAGAAGCCTTTGT-3' (Id. de sec. n.° //) y cebador inverso 5'-TTCCTCCTCTCCCTCCTCTC-3' (Id. de sec. n.° //). Después, se desnaturalizaron 300 ng del amplicón de 360 pb por calentamiento a 95 °C y se volvieron a hibridar lentamente usando un bloque de calor para rehibridar aleatoriamente cadenas de ADN de tipo silvestre y mutantes. Después, las muestras se incubaron con nucleasa Cel-1 (Kit Surveyor, Transgenomic) durante 1 hora a 42 °C. Cel-1 reconoce y escinde hélices de ADN que contienen emparejamientos erróneos (hibridación tipo silvestre:mutante). Los productos de digestión con nucleasa Cel-1 se separaron en un gel de acrilamida al 10 % y se visualizaron mediante tinción con SYBR Safe (Life Technologies). La cuantificación de las bandas de escisión se realizó usando el software ImageLab (Bio-Rad). El porcentaje de escisión se determinó dividiendo la intensidad promedio de los productos de escisión (160-200 pb) por la suma de las intensidades del producto de PCR sin escindir (360 pb) y el producto de escisión.
Transcripción invitro
se transcribióin vitroARN guía usando ARN polimerasa T7 recombinante y un molde de ADN generada por hibridación de oligonucleótidos sintéticos complementarios como se ha descrito anteriormente [14]. Los ARN se purificaron mediante electroforesis en gel de acrilamida desnaturalizante de urea 7M, precipitaron etanol y se disolvieron en agua tratada con DEPC.
Análisis por transferencia Northern
Se purificó ARN a partir de células HEK293T usando el kit de aislamiento de ARN pequeño mirVana (Ambion). Para cada muestra, se separaron 800 ng de ARN en un gel de urea-PAGE al 10 % después de la desnaturalización durante 10 min a 70 °C en tampón de carga de ARN (TBE 0,5X (pH7,5), azul de bromofenol 0,5 mg/ml, 0,5 mg de xileno cianol y formamida al 47 %). Después de la electroforesis a 10W en tampón de TBE 0,5X hasta que el tinte azul de bromofenol alcanzó el fondo del gel, las muestras se electrosecaron sobre una membrana de Nytran a 20 Voltios durante 1,5 horas en TBE 0,5X. Los ARN transferidos se reticularon sobre la membrana de Nytran en UV-Crosslinker (Strategene) y se prehibridaron a 45 °C durante 3 horas en un tampón que contenía formamida al 40 %, SSC 5X, Dnhardt 3X (0,1 % de cada uno de ficoll, polivinilpirrolidona y BSA) y ADN de esperma de salmón 200 pg/ml. Las membranas prehibridadas se incubaron durante la noche en el tampón de prehibridación suplementado con sonda oligo de ADN antisentido marcada con 5'-32P a 1 millón de rpm/ml. Después de varios lavados en tampón de SSC (lavado final en SCC 0,2X), se tomaron imágenes mediante formación de imágenes por fósforo de las membranas.
Ensayo de escisión¡n vitro
Se prepararon lisados celulares como se ha descrito anteriormente y se incubaron con el plásmido donante CLTA-RFP [10]. Las reacciones de escisión se realizaron en un volumen total de 20 pl y contenían 10 pl de lisado, 2 pl de tampón de escisión 5X (HEPES 100 mM pH 7,5, KCl 500 mM, MgCb 25 mM, DTT 5 mM, glicerol al 25 %) y 300 ng de plásmido. Donde se indica, las reacciones se suplementaron con 10 pmol de ARNgu de CLTA1 transcritoin vitro.Las reacciones se incubaron a 37 °C durante una hora y posteriormente se digirieron con 10 U de Xhol (NEB) durante 30 min adicionales a 37 °C. Las reacciones se detuvieron mediante la adición de Proteinase K (Thermo Scientific) y se incubaron a 37 °C durante 15 min. Los productos de escisión se analizaron mediante electroforesis en un gel de agarosa al 1 % y se tiñeron con SYBR Safe. La presencia de fragmentos de -2230 y -3100 pb es indicativa de la escisión mediada por Cas9.
Resultados
Para probar si Cas9 podría programarse para escindir el ADN genómico en células vivas, se coexpresó Cas9 junto con un ARNgu diseñado para la localización específica del gen de la cadena ligera de clatrina humana (CLTA). El locus genómico de CLTA se ha localizado específicamente y editado anteriormente usando ZFN [10]. En primer lugar, los presentes inventores probaron la expresión de una versión con codones humanos optimizados de la proteína Cas9 deStreptococcus pyogenesy ARNgu en células HEK293T humanas. La proteína Cas9 de 160 kDa se expresó como una proteína de fusión que porta un epítopo de HA, una señal de localización nuclear (NLS) y una proteína fluorescente verde (GFP) unida al extremo C-terminal de Cas9 (Figura 29A). El análisis de células transfectadas con un vector que codifica la Cas9 fusionada con GFP reveló abundante expresión y localización nuclear de Cas9 (Figura 29B). La transferencia Western confirmó que la proteína Cas9 se expresa en gran medida intacta en extractos de estas células (Figura 29A). Para programar Cas9, se expresó ARNgu que portaba una secuencia de 20 nucleótidos de 5'-terminal complementaria a la secuencia de ADN diana, y una estructura de bucle de tallo 3'-terminal de 42 nucleótidos necesaria para la unión a Cas9 (Figura 29C). Esta secuencia 3'-terminal corresponde a la estructura de bucle de tallo mínima que se ha utilizado anteriormente para programar Cas9in vitro[ 8 ]. La expresión de este ARNgu fue impulsada por el promotor humano U6 (ARN polimerasa III) [11]. El análisis por transferencia Northern del ARN extraído de células transfectadas con el vector de expresión plasmídico de ARNgu impulsado por promotor U6 mostró que el ARNgu de hecho se expresa, y que su estabilidad se potencia por la presencia de Cas9 (Figura 29D).
Figura 29demuestra que la coexpresión de Cas9 y ARN guía en células humanas genera roturas de ADN bicatenario en el locus diana.(A)Parte superior; diagrama esquemático del constructo de expresión Cas9-HA-NLS-GFP. Parte inferior; el lisado de células HEK293T transfectadas con el plásmido de expresión de Cas9 se analizó mediante transferencia Western usando un anticuerpo anti-HA.(B)Microscopía de fluorescencia de células HEK293T que expresan Cas9-HA-NLS-GFP.(C)Diseño de un ARN guía único (ARNgu, es decir, un ARN de localización específica de ADN de molécula única) dirigido al locus de CLTA humano. Parte superior; diagrama esquemático del sitio diana de ARNgu en el exón 7 del gen de CLTA humano. La secuencia diana que se hibrida con el segmento guía del ARNgu de CLTA1 se indica mediante “ARNgu de CLTA1” El motivo adyacente de protoespaciador (PAM) de di-nucleótido GG está marcado por una flecha. Las líneas de color negro indican las regiones de unión a ADN de la proteína ZFN de control. El codón de terminación de la traducción del marco de lectura abierto de CLTA está marcado con una línea de puntos por referencia. Mitad; diagrama esquemático del constructo de expresión de ARNgu. El ARN se expresa con el control del promotor U6 Pol III y un tracto poli(T) que sirve como señal de terminación de la transcripción de Pol III. Parte inferior; escisión guiada por ARNgu de ADN diana por Cas9. El ARNgu consiste en un segmento guía 5'-terminal de 20 nt seguido de una estructura de tallo-bucle de 42 nt necesaria para la unión a Cas9. La escisión mediada por Cas9 de las dos cadenas de ADN diana se produce tras desenrollar el ADN diana y la formación de un dúplex entre el segmento guía del ARNgu y el ADN diana. Esto depende de la presencia de un motivo PAM (adecuado para la Cas9 que se usa, p. ej., dinucleótidoGg ,véase el Ejemplo 1 anterior) en dirección 3' de la secuencia diana en ela Dndiana. Nótese que la secuencia diana se invierte con respecto al diagrama superior.(D)Análisis por transferencia Northern de la expresión de ARNgu en células HEK239T. (E) Ensayo de nucleasa Surveyor de ADN genómico aislado de células HEK293T que expresan Cas9 y/o ARNgu de CLTA. Un constructo de ZFN utilizado anteriormente para localizar específicamente el locus de CLTA [10] se usó como un control positivo para detectar la reparación de ADN inducida por DSB por unión de extremos no homólogos.
A continuación, los presentes inventores investigaron si se generan DSB específicas de sitio en células HEK293T transfectadas con Cas9-HA-NLS-mCherry y el ARNgu de CLTA1. Para hacer esto, los presentes inventores sondearon para determinar inserciones y deleciones menores en el locus resultante de la reparación imperfecta mediante NHEJ inducida por DSB usando el ensayo de nucleasa Surveyor [12]. La región de ADN genómico localizado específicamente por Cas9:ARNgu se amplifica mediante PCR y los productos resultantes se desnaturalizan y rehibridan. Los productos de PCR rehibridados se incuban con la endonucleasa de reconocimiento de emparejamiento erróneo Cel-1 y se resuelven en un gel de acrilamida para identificar las bandas de escisión de Cel-1. Como la reparación del ADN mediante NHEJ se induce típicamente por una DSB, una señal positiva en el ensayo Surveyor indica que se ha producido la escisión de ADN genómico. Usando este ensayo, los presentes inventores detectaron la escisión del locus de CLTA en una posición localizada específicamente por el ARNgu de CLTA1 (Figura 29E). Un par de ZFN que localizan específicamente un sitio vecino en el locus de CLTA proporcionó un control positivo en estos experimentos [10].
Para determinar si la expresión de Cas9 o ARNgu es un factor limitante en las reacciones de edición genómica observadas, los lisados preparados a partir de las células transfectadas se incubaron con ADN plasmídico que albergaba un fragmento del gen de CLTA dirigido por el ARNgu de CLTA1. No se observó escisión de ADN plasmídico tras la incubación con lisado preparado a partir de células transfectadas con el vector de expresión Cas9-HA-NLS-GFP solo, lo que es coherente con los resultados del ensayo Surveyor. Sin embargo, se detectó una escisión de plásmido robusta cuando el lisado se sumplementó con ARNgu de CLTA1 transcritoin vitro(Figura 30A). Además, el lisado preparado a partir de células transfectadas con vectores de expresión de Cas9 y ARNgu respaldó la escisión de plásmidos, mientras que los lisados de células transfectadas con el vector que codifica ARNgu solo no lo hizo (Figura 30A). Estos resultados sugieren que un factor limitante para la función de Cas9 en células humanas podría ensamblarse con el ARNgu. Los presentes inventores probaron esta posibilidad directamente analizando la escisión del plásmido en lisados de células transfectadas como antes en presencia y ausencia de ARNgu exógeno añadido. En particular, cuando se añadió ARNgu exógeno a lisado de células transfectadas con los vectores de expresión de Cas9 y ARNgu, se observó un aumento sustancial en la actividad de escisión de ADN (Figura 30B). Este resultado indica que el factor limitante para la función de Cas9 en células HEK293T es la expresión del ARNgu o su carga en Cas9.
LaFigura 30demuestra que los lisados celulares contienen Cas9:ARNgu activo y respaldan la escisión de ADN específica de sitio.(A)Los lisados de células transfectadas con el plásmido o plásmidos indicados a la izquierda se incubaron con ADN plasmídico que contenía un PAM y la secuencia diana complementaria al ARNgu de CLTA1; donde se indica, la reacción se suplementó con 10 pmol de ARNgu de CLTA1 transcritoin vitro;escisión secundaria con fragmentos generados de XhoI de fragmentos de -2230 y -3100 pb indicativos de escisión mediada por Cas9. Una reacción de control usando lisado de células transfectadas con un constructo de expresión de ZFN muestra fragmentos de un tamaño ligeramente diferente que refleja el desplazamiento del sitio diana de ZFN con respecto al sitio diana de CLTA1.(B)Se incubaron lisados de células transfectadas con plásmido de expresión Cas9-GFP y, cuando se indica, el plásmido de expresión de ARNgu de CLTA1, con ADN plasmídico diana como en (A) en ausencia o presencia de ARNgu de CLTA1 transcritoin vitro.
Como medio para potenciar el ensamblaje de Cas9: ARNguen células vivas,a continuación se sometió a ensayo el efecto de prolongar la supuesta región de unión a Cas9 del ARN guía. Se diseñaron dos nuevas versiones del ARNgu de CLTA1 para incluir seis o doce pares de bases adicionales en la hélice que imita las interacciones de emparejamiento de bases entre el ARNcr y el ARNcrtra (Figura 31A). De forma adicional, el extremo 3' del ARN guía se extendió en cinco nucleótidos basándose en la secuencia nativa del ANRcrtra de S.pyogenes[9]. Los vectores que codifican estos ARNgu extendidos en 3' con el control de los promotores U6 o H1 Pol III se transfectaron en células junto con el vector de expresión Cas9-HA-NLS-GFP y se probó la escisión del genoma específico de sitio usando el ensayo Surveyor (Figura 31B). Los resultados confirmaron que la escisión requirió tanto Cas9 como el ARNgu de CLTA1, pero no se produjo cuando Cas9 o ARNgu se expresaron solos. Además, los presentes inventores observaron sustancialmente frecuencias aumentadas de NHEJ, según lo detectado por la escisión de la nucleasa Cel-1, mientras que la frecuencia de la mutagénesis de NHEJ obtenida con el par de ZFN de control no cambió en gran medida.
LaFigura 31demuestra que la extensión 3' de los constructos de ARNgu potencia la mutagénesis mediada por NHEJ específica de sitio.(A)El constructo para la expresión de ARNgu de CLTA1 (parte superior) se diseñó para generar transcritos que contenían la secuencia de unión a Cas9 original (v1,0), o dúplex de ARNbc extendidos por 4 pares de bases (v2.1) o 10 pares de bases (v2.2).(B)Ensayo de nucleasa Surveyor de ADN genómico aislado de células HEK293t que expresan Cas9 y/o ARNgu de CLt A v1.0, v2.1 o v2.2. Un constructo de ZFN utilizado anteriormente para localizar específicamente el locus de CLTA [10] se usó como un control positivo para detectar la reparación de ADN inducida por DSB por unión de extremos no homólogos.
Por lo tanto, los resultados proporcionan el marco para implementar Cas9 como una herramienta molecular fácil para diversas aplicaciones de edición genómica. Una característica potente de este sistema es el potencial de programar Cas9 con múltiples ARNgu en la misma célula, ya sea para aumentar la eficiencia de la localización específica en un locus único, o como un medio para localizar específicamente varios loci simultáneamente. Dichas estrategias encontrarían una amplia aplicación en experimentos de todo el genoma y esfuerzos de investigación a gran escala tales como el desarrollo de modelos de enfermedad multigénicos.
Ejemplo 3: Las familias de ARNcrtra y Cas9 de los sistemas de inmunidad CRISPR-Cas de tipo II
Se buscaron todos los supuestos loci de CRISPR-Cas de tipo II actualmente existentes en genomas bacterianos disponibles públicamente cribando secuencias homólogas a Cas9, la proteína distintiva del sistema de tipo II. Los presentes inventores construyeron un árbol filogenético de una alineación de secuencia múltiple de los ortólogos de Cas9 identificados. La longitud de repetición de CRISPR y la organización génica de los operones cas de los sistemas de tipo II asociados se analizaron en los diferentes sugabrupamientos de Cas9. Se propuso una subclasificación de loci de tipo II y se dividió de forma adicional en subgrupos basándose en la selección de 75 ortólogos representativos de Cas9. Después, los presentes inventores predijeron que las secuencias de ARNcrtra recuperaban las secuencias de repetición de CRISPR y el cribado de anti-repeticiones dentro o en el área adyacente a los genes cas y las matrices de CRISPR de loci de tipo II seleccionados. Se realizó un análisis comparativo de secuencias y estructuras predichas de ortólogos de ARNcrtra elegidos. Por último, los presentes inventores determinaron los perfiles de expresión y procesamiento de ARNcrtra y ARNcr de cinco especies bacterianas.
Materiales y métodos
Cepas bacterianas y condiciones de cultivo
Se usaron los siguientes medios para cultivar bacterias en placas: TSA (agar de tripticasa de soja, Tryticasa™ agar de soja (TSA II) BD BBL, Becton (Dickinson) suplementado con sangre de oveja al 3 % paraS.mutans(UA159) y BHI (infusión corazón-cerebro, BD Bacto™ Brain Heart Infusion, Becton Dickinson) agar para L. innocuba (Clip 1 1262). Cuando se cultivó en cultivos líquidos, el medio THY (Caldo Todd Hewitt (THB, Bacto, Becton Dickinson) suplementado con extracto de levadura al 0,2 % (Servabobacter®) se usó paraS.mutans,caldo BHI paraL. innocua,medio líquido BHI que contenía una mezcla de vitaminas al 1 % VX (Difco, Becton Dickinson) paraN. meningitidis(A Z2491), MH (caldo Mueller Hinton, Oxoid) que incluye 1 % de mezcla de vitaminas VX paraC.jejuni(NCTC 11168; At CC 700819) y TSB (caldo de soja tríptico, Caldo de soja BD BBL™ Tryticasa™) paraF. novicida(U112). Se incubó S.mutansa 37 °C, CO2 al 5 % sin agitar. Las cepas deL. innocua, N. meningitidisyF. novicidase cultivaron aeróbicamente a 37 °C con agitación.C. jejunise cultivó a 37 °C en condiciones microaerófilas usando una atmósfera de campígeno (Oxoide). Al crecimiento de las células bacterianas le siguió la medición de la densidad óptica de los cultivos a 620 nm (DO620 nm) a intervalos de tiempo regulares usando un lector de microplacas (BioTek PowerWave™).
Secuenciación de bibliotecas bacterianas de ARN pequeño.
Se cultivaronC. jejuniNCTC 11168 (ATCC 700819),F. novicidaU112,L. innocuaClip11262,N. meningitidisA Z2491 y S.mutansUA159 hasta la fase de crecimiento medio logarítmico y se extrajo el ARN total con TRIzol (Sigma-Aldrich). Se trataron 10 |jg de ARN total de cada cepa con DNasa TURBO™ (Ambion) para retirar cualquier ADN genómico residual. Los ARN ribosómicos se retiraron usando los kits Ribo-Zero™ rRNA Removal Kits® para bacterias grampositivas o gramnegativas (Epicentre) según las instrucciones del fabricante. Después de la purificación con el kit RNA Clean & Concentrator™-5 (Zymo Research), las bibliotecas se prepararon usando el kit ScriptMiner™ Small RNA-Seq Library Preparation Kit (Multiplex, compatible con Illumina®, compatible) siguiendo las instrucciones del fabricante. Los ARN se trataron con la Pirofosfatasa ácida del tababo (TAP) (Epicentre). Se usaron columnas de RNA Clean & Concentrador™-5 (Zymo Research) para la purificación posterior del ARN y la ADN polimerasa de alta fidelidad Phusion® (New England Biolabs) para la amplificación por PCR. Se añadieron códigos de barras definidos por el usuario específicos de cada biblioteca (cebadores de código de barras de Sec-ARN (compatibles con Illumina®-) Epicentre) y las muestras se secuenciaron en la secuenciación de próxima generación (unidad de NGS de CSF; en la web en “ csf. ” seguido de “ ac.at” ) instalaciones del Vienna Biocenter, Viena, Austria (secuenciación de un solo extremo Illumina).
Análisis de datos de secuenciación de ARNcrtra y ARNcr
Las lecturas de secuenciación de ARN se dividieron usando la herramienta de ilumina2bam y se recortaron mediante (i) la retirada de las secuencias del adaptador Illumina (cutadapt 1.0) y (ii) la retirada de 15 nt en el extremo 3' para mejorar la calidad de las lecturas. Después de la retirada las lecturas más cortas de 15 nt, las lecturas de ADNc se alinearon con su genoma respectivo usando Bowtie al permitir 2 emparejamientos erróneos:C. jejuni(GenBank: NC_002163),F. novicida(GenBank: NC_008601),N. meningitidis(GenBank: NC_003116),L. innocua(GenBank: NC_003212) yS.mutans(GenBank: NC_004350). La cobertura de las lecturas se calculó en cada posición de nucleótidos por separado para ambas cadenas de ADN usando BEDTools-Versión-2.15.0. Se creó una cobertura normalizada que contenía una cobertura de lectura por millón (rpm) y se visualizó usando Integrative Genomics Viewer (IFV) (“www. ” seguido de“ “ broadinstitute.org/igv/” ) (Figura 36). Usando SAMTools flagstat80 se calculó la proporción de lecturas mapeadas sobre un total de 9914184 lecturas mapeadas paraC. jejuni,48205 lecturas paraF. novicida,13110087 lecturas paraN. meningitidis,161865 lecturas praL. innocuay 1542239 lecturas para S.mutans.Se creó un archivo que contenía el número de lecturas que comienzan (5') y terminan (3') en cada posición de nucleótido única y se visualizó en IGV. Para cada ortólogo de ARNcrtra y ARNcr, el número total de lecturas recuperadas se calculó usando SAMtools.
Análisis de secuencia de Cas9, alineación de múltiples secuencias y constructo de árbol guía
Se usó el programa Iterado específico de posición (PSI)-BLAST para recuperar homólogos de la familia Cas9 en la base de datos no redundante de NCBI. Se descartaron las secuencias más cortas de 800 aminoácidos. El programa BLASTClust configurado con un límite de cobertura de longitud de 0,8 y un umbral de cobertura de puntuación (puntuación de bits dividida por longitud de alineación) de 0,8 se usó para agrupar las secuencias restantes (Figura 38). Este procedimiento produjo 78 agrupamientos (48 de esos se representaron por una sola secuencia). Se seleccionó uno (o rara vez unos pocos representantes) de cada grupo y se construyó una alineación múltiple para estas secuencias usando el programa MUSCLE con parámetros predeterminados, seguido de una corrección manual sobre la base de alineaciones locales obtenidas usando los programas PSI-BLAST y HHpred. Unas pocas secuencias más eran alineables y también se excluyeron de las alineaciones finales. Se usaron los bloques alineados con seguridad con 272 posiciones informativas para la reconstrucción del árbol de máxima verosimilitud usando el programa FastT ree con los parámetros predeterminados: Modelo evolutivo JTT, modelo gamma discreto con 20 categorías de velocidad. Se usó el mismo programa para calcular los valores de arranque.
LaFigura 38representa secuencias que se agruparon según el programa de agrupamiento BLASTclust. Solamente las secuencias más largas de 800 aminoácidos se seleccionaron para el análisis por BLASTclust (véase Materiales y Métodos). Se usaron cepas representativas que albergaban genes ortólogoscas9.Algunas secuencias no se agruparon, pero se verificaron como secuencias de Cas9 debido a la presencia de motivos conservados y/u otros genes cas en su área adyacente inmediata.
Análisis de loci de CRISPR-Cas
Las secuencias de repetición CRISPR se recuperaron de la base de datos CRISPRdb o se predijo usando la herramienta CRISPRFinder (Grissa I y col.,BMC Bioinformatics2007; 8:172; Grissa I y col.,Nucleic Acids Res2007). Los genes cas se identificaron mediante el algoritmo BLASTp y/o se verificaron con la base de datos kegg (en la trama en “www.” seguido de kegg.jp/).
Predicción informática y análisis de ortólogos de ARNcrtra
Las supuestas anti-repeticiones se identificaron usando el software Vector NTI® software (Invitrogen) mediante el cribado de secuencias de repetición adicionales degeneradas que no pertenecían a la matriz de repeticiónespaciador en ambas cadenas de los genomas respectivos permitiendo hasta 15 emparejamientos erróneos. Los promotores de la transcripción y los terminadores independientes del factor rho se predijeron usando el programa de predicción del promotor de red neuronal BDGP (“www.” seguido de fruitfly.org/seq_tools/promoter.html) y el software TransTermHP, respectivamente. Las múltiples alineaciones de secuencia se realizaron usando el programa MUSCLE con parámetros predeterminados. Las alineaciones se analizaron para determinar la presencia de motivos de estructura conservada usando el algoritmo RNAalifold del paquete de ARN Vienna 2.0.
Resultados
Los sistemas CRISPR-Cas de Tipo II están extendidos en bacterias.
Además del ADN que codifica el ARNcrtra y la matriz de repetición-espaciador, los loci de CRISPR-cas de tipo II se componen típicamente de tres a cuatro genes organizados en un operón (Figura 32A-B). Cas9 es la proteína distintiva característica para el tipo II y está implicada en las etapas de expresión e interferencia. Cas1 y Cas2 son proteínas centrales que son compartidas por todos los sistemas CRISPR-Cas y están implicadas en la adquisición de espaciadores. Csn2 y Cas4 están presentes solamente en un subconjunto de sistemas de tipo II y se sugirió que desempeñan una función en la adaptación. Para recuperar un número máximo de loci de CRISPR-Cas de tipo II, que contienen ARNcrtra, en primer lugar los presentes inventores cribaron genomas disponibles públicamente para determinar secuencias homólogas a las proteínas Cas9 ya anotadas. Se identificaron 235 ortólogos de Cas9 en 203 especies bacterianas. Se seleccionó un conjunto de 75 secuencias diversas representativas de todos los ortólogos de Cas9 recuperados para su posterior análisis (Figura 32, Figura 38 y Materiales y Métodos).
LaFigura 32representa (a) un árbol filogenético de secuencias de Cas9 representativas de diversos organismos, así como (B) una arquitectura de locus de Cas9 representativa. Se indican los valores de arranque calculados para cada nodo. Las ramas del mismo color representan subgrupos seleccionados de ortólogos de Cas9 similares. Se muestra la longitud de repetición de CRISPR en nucleótidos, el tamaño promedio de la proteína Cas9 en aminoácidos (aa) y la arquitectura del locus consenso para cada subagrupamiento. *- gi| 116628213 *-gi|116627542 f - gi|34557790 f - gi|34557932. El Tipo II-A se caracteriza porcas9- csx12, casi, cas2, cas4.El tipo II-B se caracteriza porcas9, casi, cas2seguido de uncsn2variante. El tipo II-C se caracteriza por un operón decas9, casi, cas2conservado (Véase también la Figura 38).
A continuación, los presentes inventores realizaron una alineación de secuencia múltiple de los ortólogos de Cas9 seleccionados. El análisis comparativo reveló altas diversidades en la composición de aminoácidos y el tamaño de la proteína. Los ortólogos de Cas9 comparten solamente unos pocos aminoácidos idénticos y todas las secuencias recuperadas tienen la misma arquitectura de dominio con un dominio de endonucleasa HNH central y un dominio RuvC/RNasaH dividido. Las longitudes de las proteínas Cas9 varían de 984 (Campylobacter jejuni)a 1629(Francisella novicida)con tamaños típicos de ~1100 o -1400 aminoácidos. Debido a la alta diversidad de secuencias de Cas9, especialmente en la longitud de las regiones entre dominios, los presentes inventores seleccionaron solamente posiciones informativas bien alineadas de la alineación preparada para reconstruir un árbol filogenético de las secuencias analizadas (Figura 32 y Materiales y Métodos). Ortólogos de Cas9 agrupados en tres grupos monofiléticos principales con algunas secuencias atípicas. La topología observada del árbol de Cas9 concuerda bien con la clasificación actual de los loci de tipo II, en la que el tipo II-A y el tipo II-B, previamente definidos, forman agrupamientos monofiléticos separados. Para caracterizar adicionalmente los agrupamientos, los presentes inventores examinaron en detalle las composiciones del operón cas y las secuencias de repetición de CRISPR de todas las cepas enumeradas.
El subagrupamiento de Cas9 refleja la diversidad en la arquitectura de loci de CRISPR-Cas de tipo II
Un análisis más profundo de los loci de tipo II seleccionados reveló que el agrupamiento de secuencias de ortólogos de Cas9 se correlaciona con la diversidad en la longitud de repetición de CRISPR. Para la mayoría de los sistemas CRISPR-Cas de tipo II, la longitud de repetición es de 36 nucleótidos (nt) con algunas variaciones para dos de los subgrupos de árbol de Cas9. En el grupo de tipo II-A (Figura 32) que comprende loci que codifican el ortólogo de Cas9 largo, anteriormente llamado Csx12, las repeticiones de CRISPR tienen 37 nt de longitud. El subgrupo pequeño compuesto por secuencias de bacterias que pertenecen al filo Bacteroidetes (Figura 32) se caracteriza por repeticiones CRISPR inusualmente largas, de hasta 48 nt de tamaño. Además, los presentes inventores observaron que el subagrupamiento de secuencias de Cas9 se correlaciona con arquitecturas de operón cas distintas, como se representa en la Figura 32. El tercer agrupamiento principal (Figura 32) y los loci atípicos (Figura 32), consisten principalmente en el operón mínimo compuesto por los genes cas9, cas1 y cas2, con una excepción de algunos loci incompletos que se analizan más adelante. Todos los demás loci de los dos primeros agrupamientos principales están asociados con un cuarto gen, principalmente cas4, específico de tipo II-A o similar a csn2, específico de tipo II-B (Figura 32). Los presentes inventores identificaron genes que codificaban variantes más cortas de la proteína Csn2, Csn2a, dentro de los loci similares a CRISPR01 de S.pyogenesde tipo II-B y CRISPR3 de S.thermophilus(Figura 32). La variante más larga de Csn2, Csn2b, se encontró asociada con loci similares a los de CRISPR1 de S.thermophilusde tipo II-B (Figura 32). Curiosamente, los presentes inventores identificaron supuestos genes adicionales que codifican proteínas sin similitud de secuencia obvia con las variantes de Csn2 descritas anteriormente. Una de esas proteínas no caracterizadas está asociada exclusivamente con loci de tipo II-B de especies deMycoplasma(Figura 32 y Figura 33). Se descubrieron otros dos codificados en los loci de tipo II-B de especies deStaphylococcus(Figura 33). En todos los casos, la diversidad de arquitectura del operón cas es, por lo tanto, coherente con el subagrupamiento de secuencias de Cas9. Estas características junto con la topología general del árbol de Cas9 dividido en tres agrupamientos monofiléticos principales, distintos, condujeron a proponer una nueva división adicional del sistema CRISPR-Cas de tipo II en tres subtipos. El tipo II-A se asocia con Cas9 y Cas4 similares a Csx12, el tipo II-B se asocia con similar a Csn2-como y el tipo II-C solamente contiene el conjunto mínimo de los genes cas9, cas1 y cas2, como se representa en la Figura 32.
LaFigura 33representa la arquitectura de CRISPR-Cas de tipo II a partir de especies bacterianas seleccionadas. Las barras verticales agrupan los loci que codifican los ortólogos de Cas9 que pertenecen al mismo subagrupamiento de árbol (comparar con laFigura 32).Barra de color negro horizontal, secuencia líder; rectángulos y diamantes de color negro, matriz de separador de repetición. Las anti-repeticiones predichas están representadas por flechas que indican la dirección de la transcripción del supuesto ortólogo de ARNcrtra. Nótese que para los loci que no se verificaron experimentalmente, la matriz de repetición-espaciador de CRISPR se considera en la presente descripción que se transcribe a partir de la misma cadena que el operóncas.La dirección de la transcripción del supuesto ortólogo de ARNcrtra se indica en consecuencia.
Predicciones informáticas de ortólogos de ARNcrtra novedosos
Se seleccionaron loci de tipo II seleccionados antes basándose en los 75 ortólogos representativos de Cas9 para detectar la presencia de supuestos ortólogos de ARNcrtra. El análisis previo de los presentes inventores realizado en un número restringido de secuencias de ARNcrtra reveló que ni las secuencias de ARNcrtra ni su ubicación dentro de los loci de CRISPR-Cas parecían conservadas. Sin embargo, como se mencionó anteriormente, los ARNcrtra también se caracterizan por una secuencia anti-repetición susceptible de emparejamiento de bases con cada una de las repeticiones de pre-ARNcr para formar dúplex de repetición ARNcrtra:preARNcr que son escindidos por ARNasa III en presencia de Cas9. Para predecir ARNcrtra novedosos, se aprovechó esta característica y se usó el siguiente flujo de trabajo: (i) cribar para posibles anti-repeticiones (emparejamiento de bases de secuencias con repeticiones de CRISPR) dentro de los loci de CRISPR-Cas, (ii) seleccionar anti-repeticiones ubicadas en las regiones intergénicas, (iii) validar el emparejamiento de bases anti-repetición:repetición de CRISPR y (iv) predecir los promotores y terminadores de la transcripción independientes del factor Rho asociados a los ARNcrtra identificados.
Para cribar las supuestas anti-repeticiones, los presentes inventores recuperaron secuencias de repetición de la base de datos CRISPRdb o, cuando la información no estaba disponible, predijeron las secuencias de repetición usando el software CRISPRfinder. En su estudio anterior, los presentes inventores mostraron experimentalmente que la dirección de transcripción de la matriz de repetición-espaciador en comparación con la del operón cas varió entre los loci. En este caso, el análisis de secuenciación de ARN confirmó esta observación. En algunos de los loci analizados, a saber, enF. novicida, N. meningitidisyC. jejuni,la matriz de repetición-espaciador se transcribe en la dirección opuesta del operón cas (véase el párrafo “ La secuenciación de ARN profunda valida la expresión de ortólogos de ARNcrtra novedosos” y las Figuras 33 y 34) mientras que en S.pyogenes, S. mutans, S. thermophilusyL. innocua,la matriz y el operón cas se transcriben en la misma dirección. Estos son los únicos datos de expresión de la matriz de espaciadores de tipo II disponibles hasta la fecha. Para predecir la dirección de transcripción de otras matrices de repetición-espaciador, los presentes inventores consideraron la observación anterior según la cual las últimas repeticiones de las matrices usualmente están mutadas. Esta observación concuerda con el modelo actual de adquisición de espaciadores, en el que típicamente la primera repetición de la matriz se duplica tras insertar una secuencia espaciadora durante la fase de adaptación. Para las matrices espaciadoras de 37 repeticiones, los presentes inventores pudieron identificar la repetición mutada en el supuesto extremo de las matrices. Se observó que la orientación predicha de transcripción para la matriz de espaciador-espaciador deN. meningitidisyC. jejunisería opuesta a la orientación determinada experimentalmente (secuenciación de ARN y análisis por transferencia Northern). Como la orientación predicha no es coherente dentro de los agrupamientos y como en la mayoría de los casos podría detectar promotores potenciales en ambos extremos de las matrices, los presentes inventores consideraron que la transcripción de las matrices de repetición-espaciador están en la misma dirección que la transcripción del operón cas, si no se validó de cualquier otra manera.
LaFigura 34representa el coprocesamiento de ARNcrtra y pre-ARNcr en sistemas de CRISPR Cas de tipo II seleccionados. Se muestran arquitecturas de loci de CRISPR con posiciones verificadas y direcciones de transcripción de ARNcrtra y pre-ARNcr. Secuencias superiores, repeticiones de pre-ARNcr; secuencias inferiores, emparejamiento de bases de secuencias de ARNcrtra con repeticiones de ARNcr. Los supuestos sitios de procesamiento de ARN descritos por secuenciación de ARN se indican con puntas de flecha. Para cada locus, los tamaños de las puntas de flecha representan cantidades relativas de los extremos 5' y 3' recuperados (véase también laFigura 37).
LaFigura 37enumera todos los ortólogos de ARNcrtra y ARNcr maduros recuperados por secuenciación para las especies bacterianas estudiadas, incluyendo las coordenadas (región de interés) y las secuencias de ADNc (5' a 3') correspondientes. Las flechas representan la dirección de la transcripción (cadena). Se indica el número de lecturas de ADNc (calculadas usando SAMtools), números de cobertura (porcentaje de lecturas mapeadas) y extremos predominantes asociados con cada transcrito. Se muestran números de lecturas que comienzan o se detienen en cada posición de nucleótidos alrededor de los extremos 5' y 3' de cada transcrito. Se indican los tamaños de cada forma madura de ARNcr. El número asignado a cada especie de ARNcr corresponde a la posición de secuencia espaciadora en el pre-ARNcr, según CRISPRdb. El número asignado a cada especie de ARNcrtra corresponde a diferentes formas del mismo transcrito.
Después, los presentes inventores cribaron los loci de CRISPR-Cas seleccionados, incluyendo secuencias ubicadas 1 kb en dirección 5' y en dirección 3' en ambas cadenas para posibles secuencias de repetición que no pertenecían a la matriz repetición-espaciador, lo que permitió hasta 15 emparejamientos erróneos. En promedio, los presentes inventores descubrieron de una a tres secuencias de repetición degeneradas por locus que corresponderían a las anti-repeticiones de los ortólogos de ARNcrtra y seleccionaron las secuencias ubicadas dentro de las regiones intergénicas. Las supuestas anti-repeticiones se descubrieron en cuatro ubicaciones típicas, en dirección 5' del gen cas9, en la región entre cas9 y cas1, y en dirección 5' o en dirección 3' de la matriz de repetición-espaciador (Figura 33). Para cada secuencia recuperada, los presentes inventores validaron el grado de emparejamiento de bases formado entre la repetición y la anti-repetición (Figura 44) mediante la predicción de la posible interacción ARN:ARN y centrándose especialmente en candidatos con una región de complementariedad más larga y perfecta que forma una estructura bicatenaria óptima para el procesamiento de ARNasa III. Para predecir los promotores y los terminadores de la transcripción que flanquean la anti-repetición, los presentes inventores fijaron los supuestos sitios de inicio y terminación de la transcripción que se incluirán dentro de una región ubicada como máximo 200 nt en dirección 5' y 100 nt en dirección 3' de la secuencia anti repetición, respectivamente, basándose en sus observaciones anteriores26. Como se ha mencionado anteriormente, falta la información experimental sobre la dirección de la transcripción de la mayoría de las matrices de repetición-espaciador de los sistemas de tipo II. Los algoritmos informáticos de predicción de promotores frecuentemente proporcionan resultados falsos positivos y apuntan a supuestos promotores que conducirían a la transcripción de matrices de repeticiónespaciador de ambas cadenas. En algunos casos, los presentes inventores no pudieron predecir los terminadores de la transcripción, aunque la expresión del ortólogo de ARNcrtra podría validarse experimentalmente, como se ilustra por el locus deC. jejuni(véase el párrafo “ La secuenciación profunda de ARN valida la expresión de ortólogos de ARNcrtra novedosos” ). Los presentes inventores sugieren considerar las predicciones del promotor y del terminador de la transcripción solamente como una etapa de soporte, pero no esencial, de la directriz descrita anteriormente.
La Figura 44 representa el emparejamiento de bases predicho de repetición de pre-ARNcr:anti-repetición de ARNcrtra en especies bacterianas seleccionadas. bLos loci de CRISPR pertenecen al sistema CRISPR-Cas de tipo II (Nmeni/CASS4). La Nomenclatura es según la base de datos CRISPR (CSPIRdb). Nótese que S.thermophilusLMD-9 yW. succinogenescontienen dos loci de tipo II. cSecuencia superior, secuencia consenso de repetición de pre-ARNcr (5' a 3'); secuencia inferior, hibridación de la secuencia homóloga de ARNcrtra con la repetición (anti-repetición; 3” a 5'). Nótese que la secuencia de repetición proporcionada se basa en la suposición de que la matriz de repetición-espaciador de CRISPR se transcribe a partir de la misma cadena que el operón cas. Para las secuencias que se validaron experimentalmente en este estudio, se tomaron en cuenta datos de secuenciación de ARN para determinar el emparejamiento de bases. Véase la Figura 33. dSe identificaron dos posibles anti-repeticiones en los loci de tipo II-A deF. tularensis subsp. novicida, W. succinogenesy protobacteria gamma HTCC5015. Emparejamiento de secuencia superior, anti-repetición dentro de la supuesta secuencia líder; emparejamiento de secuencia inferior, anti-repetición en dirección 3' de la matriz de repetición-espaciador. Véase la Figura 33. eSe identificaron dos posibles anti-repeticiones en el locus de tipo II-A de S.wadsworthensis.Emparejamiento de secuencia superior, anti-repetición; emparejamiento de secuencia inferior, anti-repetición dentro de la supuesta secuencia líder. Véase la Figura 33. fSe identificaron dos posibles anti-repeticiones en el locus de tipo II-B deL. gaseri.Emparejamiento de secuencia superior, anti-repetición en dirección 5' de cas9; emparejamiento de secuencia inferior, anti-repetición entre los genes cas9 y cas1. Véase la Figura 33. gSe identificaron dos posibles anti-repeticiones en loci de tipo II-C de C.jejuni.Emparejamiento de secuencia superior, anti repetición en dirección 5' de cas9; emparejamiento de secuencia inferior, anti-repetición en dirección 3' de la matriz de repetición-espaciador. Véase la Figura 33. hSe identificaron dos posibles anti-repeticiones en el locus de tipo II-C deR. rubrum.Emparejamiento de secuencia superior, anti-repetición en dirección 3' de la matriz de repetición-espaciador; emparejamiento de secuencia inferior, anti-repetición en dirección 5' de cas1. Véase la Figura 33.
Una plétora de ortólogos de ARNcrtra
Los presentes inventores predijeron supuestos ortólogos de ARNcrtra para 56 de los 75 loci seleccionados anteriormente. Los resultados de las predicciones se representan en la Figura 33. Como ya se ha mencionado, la dirección de la transcripción de ARNcrtra indicada en esta figura es hipotética y se basa en la dirección indicada de transcripción de la matriz repetición-espaciador. Como se indicó anteriormente, las secuencias que codifican los supuestos ortólogos de ARNcrtra se identificaron en dirección 5', dentro y en dirección 3' del operón cas, así como en dirección 3' de las matrices espaciadoras repetidas, incluyendo las supuestas secuencias líderes, habitualmente encontradas en loci de tipo II-A (Figura 33). Sin embargo, los presentes inventores observaron que las anti-repeticiones de ubicación similar dentro de los loci de CRISPR-Cas pueden transcribirse en diferentes direcciones (como se observa cuando se comparan, p. ej.,Lactobacillus rhamnosusyEubacterium rectaleoMycoplasma mobiley S.pyogenesoN. meningitidis)(Figura 33). En particular, los loci agrupados dentro de un mismo subagrupamiento del árbol de guía de Cas9 comparten una arquitectura común con respecto a la posición del gen que codifica ARNcrtra. Los presentes inventores identificaron anti-repeticiones alrededor de la matriz de repetición-espaciador en loci de tipo II-A, y principalmente en dirección 5' del gen cas9 en los tipos II-B y II-C con varias excepciones notables para el supuesto ARNcrtra ubicado entre cas9 y cas1 en tres subagrupamientos distintos de tipo II-B.
Algunos loci de CRISPR-Cas de tipo II tienen matrices repetición-espaciador defectuosas y/u ortólogos de ARNcrtra
Para seis loci de tipo II(Fusobacterium nucleatum, Aminomonas paucivorans, Helicobacter mustelae, Azospirillum sp., Prevotella ruminicolayAkkermansia muciniphila),los presentes inventores identificaron posibles anti-repeticiones con emparejamiento de bases débil con la secuencia de repetición o ubicados dentro de los marcos de lectura abiertos. En particular, en estos loci, se identificaron una anti-repetición débil dentro del marco de lectura abierto del gen que codifica una supuesta ATPasa enA. paucivorans,una anti-repetición fuerte dentro de los primeros 100 nt del gen cas9 enAzopirillum sp.B510 y una fuerte anti-repetición fuerte con cas9 y cas1 enA. muiincilla(Figura 33). Para doce loci adicionales(Peptoniphilus duerdenii, Coprococcus catus, Acidaminococcus intestini, Catenibacterium mitsuokai, Staphylococcus pseudintermedius, Ilyobacter polytropus, Elusimicrobium minutum, Bacteroides fragilis, Acidothermus cellulolyticus, Corynebacterium diphteriae, Bifidobacterium longumandBifidobacteríum dentium),los presentes inventores no pudieron detectar ninguna supuesta anti-repetición. No hay información disponible sobre la expresión y el procesamiento de pre-ARNcr en estos loci de CRISPR-Cas. Por lo tanto, se debe abordar la funcionalidad de los sistemas de tipo II en ausencia de un ortólogo de ARNcrtra claramente definido. Para siete loci analizados, los presentes inventores no pudieron identificar ninguna matriz repetición-espaciador(Parasutterella excrementihominis, Bacillus cereus, Ruminococcus albus, Rhodopseudomonas palustris, Nitrobacter hamburgensis, Bradyrhizobium sp.yPrevotella micans)(Figura 33) y en tres de ellas(Bradyrhizobium sp.BTAi1,N. hamburgensisyB. cereus)los presentes inventores detectaron cas9 como un gen único sin otros genes cas en el área adyacente. Para estos tres loci, los presentes inventores no consiguieron predecir ninguna secuencia de ARN pequeño en dirección 5' o en dirección 3' del gen cas9. En el caso deR. albusyP. excrementihominis,el cas9 que contiene contig genómico es demasiado corto para permitir la predicción de la matriz repetición-espaciador.
La secuenciación profunda de ARN valida la expresión de ortólogos de ARNcrtra novedosos
Para verificar las predicciones de ARNcrtra informáticas y determinar los patrones de coprocesamiento de ARNcrtra:pre-ARNcr, se analizaron ARN de bacterias grampositivas(S. mutansyL. innocua)y gramnegativas(N. meningitidis, C. jejuniyF. novicida)seleccionadas mediante secuenciación profunda. Se recuperaron secuencias de ortólogos de ARNcrtra y ARNcr procesados (Figura 36 y Figura 37). De forma coherente con los datos de secuenciación de ARNcrtra diferencial publicados anteriormente en S.pyogenes26,los ortólogos de ARNcrtra estaban altamente representados en las bibliotecas, variando del 0,08 al 6,2 % de las lecturas mapeadas totales. Los ARNcrtra procesados también fueron más abundantes que los transcritos primarios, variando del 66 % a más del 95 % de la cantidad total de lecturas de ARNcrtra (Figura 36 y Figura 37).
LaFigura 36representa la expresión de ortólogos de ARNcrtra bacteriano y ARNcr revelados por secuenciación de ARN profundo. Se representan perfiles de expresión de los ortólogos de ARNcrtra y los ARNcr de cepas bacterianas seleccionadas a lo largo de los genomas correspondientes mediante gráficos de barras (imágenes capturadas a partir de la herramienta Integrative Genomics Viewer (IGV).Campylobacter jejuni(GenBank: NC_002163),Francisella novicida(GenBank: NC_008601),Neisseria meningitidis(GenBank: NC_003116),Listeria innocua(GenBank: NC_003212) yStreptococcus mutans(GenBank: NC_004350). Se proporcionan coordenadas genómicas. aCobertura de secuencia calculada usando BEDTools-Versión-2.15.0 (Escala proporcionada en lecturas por millón). bSe indica la distribución de las lecturas que comienzan (5') y terminan (3') en cada posición de nucleótidos (Escala proporcionada en números de lecturas). Los paneles superiores corresponden a transcritos de la cadena positiva y los paneles inferiores corresponden a transcritos de la cadena negativa. Los valores de cobertura negativos y los picos presentados por debajo de los ejes indican la transcripción desde la cadena negativa del genoma. Los extremos 5' y 3' predominantes de las lecturas se representan gráficamente para todos los ARN. Nótese que dada la baja calidad de la biblioteca de ADNc deL. innocua,las lecturas se acortan para los ARNcr y se observa una acumulación de las lecturas en el extremo 3' de ARNcrtra, presumiblemente debido a la degradación del ARN.
Para evaluar los extremos 5' de los transcritos primarios de ARNcrtra, los presentes inventores analizaron la abundancia de todas las lecturas de extremo 5' de ARNcrtra y recuperaron las lecturas más prominentes en dirección 5' o en el área adyacente del extremo 5' de la secuencia anti-repetición predicha. Los extremos 5' de los ortólogos de ARNcrtra se confirmaron adicionalmente usando el algoritmo de predicción de promotores. Los extremos 5' identificados de ARNcrtra deS.mutans, L. innocuayN. meningitidisse correlacionaron con las predicciones informáticas y el análisis por transferencia Northern de la expresión de ARNcrtra26. El extremo 5' más prominente del ARNcrtra deC.jejunise identificó en el medio de la secuencia anti-repetición. Se detectaron cinco nucleótidos en dirección 5', un supuesto extremo 5' adicional que se correlaciona con la predicción informática y que proporciona una secuencia más larga de interacción con la secuencia de repetición de CRISPR. Se recuperó una cantidad relativamente baja de lecturas de la biblioteca deF. novicidaque correspondía casi exclusivamente a transcritos procesados. El análisis de la cantidad muy pequeña de lecturas de transcritos primarios proporcionó un extremo 5' que correspondía a las fuertes predicciones informáticas del promotor. El sondeo por transferencia Northern de ARNcrtra deF. novicidaconfirmó además la validez de las predicciones que muestran la baja abundancia de transcritos de aproximadamente 90 nt de longitud. Los resultados se enumeran en laTabla 2.Para todas las especies examinadas, exceptoN. meningitidis,los transcritos primarios de ARNcrtra se identificaron como especies de ARN pequeño único de 75 a 100 nt de longitud. En el caso deN. meningitidis,los presentes inventores descubrieron una forma de ARNcrtra primario predominante de ~110 nt y un supuesto transcrito más largo de ~170 nt representado por una cantidad muy baja de lecturas y detectado anteriormente como una banda débil mediante análisis por transferencia Northern.
Tabla 2. Ortólogos de ARNcrtra seleccionados
Los sitios de coprocesamiento de ARNcrtra y pre-ARNcr se encuentran en la región anti-repetición:repetición.
Los presentes inventores examinaron los transcritos de ARNcrtra procesados mediante el análisis de extremos 5' de ARNcrtra abundantes dentro de la secuencia anti-repetición predicha y abundantes extremos de ARNcr 3' maduros (Figura 34 y 45). En todas las especies, los presentes inventores identificaron los extremos 5' prominentes de ortólogos de ARNcrtra que podrían ser resultado del procesamiento conjunto de los dúplex de repetición de ARNcrtra:pre-ARNcr por ARNasa III. Los presentes inventores también identificaron los extremos 5' procesados de los ARNcr que más probablemente son resultado de un segundo evento de maduración mediante el supuesto recorte, de forma coherente con observaciones anteriores. Cabe destacar que en los pares de ARN estrechamente relacionados de S.pyogenes, S. mutansyL. innocua,los presentes inventores observaron el mismo sitio de procesamiento alrededor del par de bases G:C en el medio de la secuencia anti-repetición. Tanto en S.mutanscomo enL. innocua,los presentes inventores detectaron extremos prominentes adicionales 5' de ARNcrtra y extremos de ARNcr 3' que podrían sugerir un recorte adicional del dúplex ARNcrtra:ARNcr, con el extremo 3' de ARNcr acortado de forma adicional al recorte de extremo 5' ya mencionado, siguiendo el evento de procesamiento catalizado por ARNasa III. Similarmente, enC. jejunilos presentes inventores descubrieron solamente una pequeña cantidad de extremos de ARNcr 3' que se ajustarían a los patrones de procesamiento de ARNasa III y recuperarían los extremos 5' correspondientes de ARNcrtra procesado. Por lo tanto, el supuesto recorte de dúplex ARNcrtra:ARNcr después de la escisión inicial por RNasa III daría como resultado una parte derivada de repetición más corta en ARNcr maduros, produciendo dúplex ARNcrtra:ARNcr más cortos estabilizados por un emparejamiento de bases triple G:C para la interacción con la endonucleasa Cas9 y la posterior escisión de ADN diana. El dúplex de ARN deN. meningitidisparece procesarse en dos sitios primarios más hacia el extremo 3' de la repetición de CRISPR, dando como resultado una parte derivada de repetición larga en ARNcr maduro y la interacción estable de ARN:ARN a pesar de la protuberancia central dentro del dúplex. Curiosamente, el dúplex ARNcrtra:pre-ARNcr deF. novicidaparece escindirse dentro de la región de baja complementariedad y algunos de los extremos 5' abundantes recuperados de ARNcrtra sugieren su recorte adicional sin recorte concomitante de ARNcr. Las diferencias en los tamaños de los transcritos primarios y en la ubicación de los sitios de procesamiento dan como resultado diversas longitudes de ARNcrtra procesados que varían de ~65 a 85 nt. Las coordenadas y tamaños de los transcritos de ARNcrtra procesados prominentes se muestran en laTabla 2y laFigura 37.Los patrones de procesamiento observados de ARNcrtra y ARNcr concuerdan con el modelo propuesto anteriormente de dos eventos de maduración. El supuesto recorte adicional de algunos de los extremos 5' de ARNcrtra y extremos 3' de ARNcr puede provenir del segundo evento de maduración o, alternativamente, puede ser un artefacto de la preparación de la biblioteca de ADNc o la secuenciación de ARN. Queda por investigar más a fondo la naturaleza de estos procesos.
Las secuencias de los ortólogos de ARNcrtra son muy diversas
También se determinaron similitudes de secuencias de ortólogos de ARNcrtra seleccionados. Se realizaron múltiples alineaciones de secuencias de transcritos primarios de ARNcrtra de S.pyogenes(solo forma de 89 nt), S.mutans, L. innocuayN. meningitidis(forma de 110 nt solamente), S.thermophilus, P. multocidayM. mobile(Tabla 2,Figura 35).Los presentes inventores observaron una alta diversidad en las secuencias de ARNcrtra, pero una conservación significativa de secuencias de loci de CRISPR-Cas estrechamente relacionados. Los ARNcrtra deL. innocua, S. pyogenes, S. mutansy S.thermophiluscomparten una identidad global del 77 % y los ARNcrtra deN. meningitidisyP. multocidacomparten una identidad del 82 % según alineaciones por pares. La identidad promedio de las secuencias de ARNcrtra analizadas es del 56 %, comparable a la identidad de las secuencias de ARN aleatorias. Esta observación confirma además que la predicción de ortólogos de ARNcrtra basándose en la similitud de secuencia puede realizarse solamente en el caso de loci estrechamente relacionados. Los presentes inventores también buscaron una posible conservación de la estructura de ARNcrtra, pero no pudieron encontrar ninguna similitud significativa, excepto una covariación y la estructura conservada del terminador de la transcripción(Figura 35).
LaFigura 35representa la diversidad de secuencias de ortólogos de ARNcrtra. Alineación múltiple de secuencias de ARNcrtra. ARNcrtra de S.thermophilusy S.thermophilus2,asociado con ortólogos de Cas9 de Id. de sec. n.° 41 y Id. de sec. n.° 40, en consecuencia. Color negro, altamente conservado; color gris oscuro, conservado; color gris claro, débilmente conservado. La estructura consenso predicha se representa en la parte superior de la alineación. Las flechas indican las variaciones de nucleótidos. Los ARNcrtra de S.pyogenesSF370, S.mutansUA159,L. innocuaClip11262, C.jejuniNCTC 11168, F.novicidaU112 yN. meningitidis AZ2491 se validaron mediante secuenciación de ARN y análisis por transferencia Northern. El ARNcrtra de S.thermophilasLMD-9 se validó mediante análisis por transferencia Northern. El ARNcrtra deP. multocidaPm70 se predijo a partir de la alta similitud del locus de CRISPR-Cas con el deN. meningitidisA Z2491. El ARNcrtra deM. mobile163K se predijo informáticamente a partir de fuertes predicciones de promotor y terminador de la transcripción.
Ejemplo 4: Cas9 puede usar ARN guía artificiales, no existentes en la naturaleza, para realizar la escisión de ADN diana
Se diseñó un ARNcr artificial y un ARNcrtra artificial basándose en el segmento de unión a proteínas de transcritos de origen natural de ARNcr y ARNcrtra de S.pyogenes,modificados para imitar la protuberancia asimétrica dentro de dúplex ARNcr:ARNcrtra de S.pyogenesnatural (véase la protuberancia en el dominio de unión a proteínas de las moléculas de ARN artificiales (parte superior) y naturales (parte inferior) representadas en la Figura 39A). La secuencia artificial de ARNcrtra comparte menos del 50 % de identidad con el ARNcrtra natural. La estructura secundaria predicha del dúplex de unión a proteínas ARNcr-ARNcrtra es la misma para ambos pares de ARN, pero la estructura predicha del resto de los ARN es muy diferente.
La Figura 39 demuestra que las secuencias artificiales que muy poca (aproximadamente el 50 %) identidad con ARNcrtra y ARNcr de origen natural pueden actuar con Cas9 para escindir el ADN diana siempre que la estructura del dominio de unión a proteínas del ARN de localización específica de ADN esté conservada. (A) Coplegamiento de ARNcrtra y ARNcr de S.pyogenesy de ARNcrtra y ARNcr artificiales. (B) Se usaron combinaciones de ortólogos de Cas9 de S.pyogenesy tracrRNA:crRNA para realizar ensayos de escisión de ADN plasmídico. Spy - S.pyogenes,Lin -L. innocua,Nme -N. meningitidis,Pmu -P. multocida.Algunos ortólogos de ARNcrtra:ARNcr que se producen de forma natural en especies bacterianas seleccionadas, pero no todos, pueden guiar a Cas9 de S.pyogenes.Notablemente, Cas9 de S.pyogenespuede ser guiada por el par ARNcrtra:ARNcr artificial, que se diseñó basándose en la estructura del segmento de unión a proteínas del ARN de localización específica de ADN de origen natural usando una secuencia totalmente no relacionada con el sistema CRISPR.
El “ARNcrtra” artificial (ARN activador) utilizado fue 5'-GUUUUCCCUUUUCAAAGAAAUCUCCUGGGCACCUAUCUUCUUAGGUGCCCUCCCU UGUUUAAACCUGACCAGUUAACCGGCUGGUUAGGUUUUU-3' (Id. de sec. n.° 1347).
El “ARNcr” artificial (ARN localizador específico) utilizado fue: 5'- GAGAUUUAUGAAAAGGGAAAAC-3' (Id. de sec. n.° 1348).
Ejemplo 5: Generación de organismos transgénicos no humanos
Un ratón transgénico que expresa Cas9 (ya sea sin modificar, modificada para tener una actividad enzimática reducida, modificada como una proteína de fusión para cualquiera de los fines generales) se genera usando un método conveniente conocido por un experto en la técnica (p. ej., (i) la inactivación génica en un locus localizado específicamente (p. ej., ROSA 26) de una célula madre embrionaria de ratón (célula ES) seguida de inyección de blastocistos y la generación de ratones quiméricos; (ii) inyección de un transgén de integración aleatoria en el pronúcleo de un ovocito de ratón fertilizado seguido de la implantación del óvulo en una hembra pseudopreñada; etc.). La proteína Cas9 está bajo el control de un promotor que se expresa al menos en células madre embrionarias, y puede estar de forma adicional bajo el control temporal o específico de tejido (p. ej., inducible por fármacos, controlado por un sistema promotor basado en Cre/Lox, etc.). Una vez que se genera una línea de ratones transgénicos que expresan Cas9, las células madre embrionarias se aíslan y cultivan y, en algunos casos, las células ES se congelan para su uso futuro. Debido a que las células ES aisladas expresan Cas9 (y en algunos casos la expresión está bajo control temporal (p. ej., inducible por fármacos), se generan rápidamente nuevas células con inactivación o activación génica (y, por lo tanto, ratones) en cualquier locus deseado en el genoma mediante la introducción de un ARN de localización específica de ADN diseñado adecuadamente que localiza específicamente la Cas9 a un locus particular de elección. Un sistema de este tipo y muchas variaciones de los mismos se usan para generar nuevos organismos modificados genéticamente en cualquier locus de elección. Cuando se usa Cas9 modificada para modular la transcripción y/o modificar el ADN y/o modificar los polipéptidos asociados con el ADN, las propias células ES (o cualesquier células diferenciadas derivadas de las células ES (p. ej., un ratón completo, una línea celular diferenciada, etc.) se usan para estudiar las propiedades de cualquier gen de elección (o cualquier producto de expresión de elección, o cualquier locus genómico de elección) simplemente introduciendo un<a>R<n>de localización específica de ADN adecuado en una célula que expresa Cas9 deseada.

Claims (17)

  1. REIVINDICACIONES
    i. Un método para guiar un polipéptido Cas9 a un ADN diana, comprendiendo el método poner en contacto el ADN diana en un organismo eucariota unicelular, una célula animal, una célula vegetal, una célula de un mamífero o una célula de un ser humano, en donde la célula esin vitroo exvivo,con un complejo que comprende:
    (a) un polipéptido Cas9 y
    (b) un ARN de localización específica de ADN que comprende
    (i) un segmento de localización específica de ADN que comprende una secuencia de nucleótidos que es complementaria a una secuencia en el ADN diana, y
    (ii) un segmento de unión a proteínas que interactúa con dicho polipéptido Cas9, en donde el segmento de unión a proteínas comprende dos tramos complementarios de nucleótidos que se hibridan para formar un dúplex de ARN bicatenario (ARNbc),
    en donde dicho método no es un proceso para modificar la identidad genética de la línea germinal de seres humanos.
  2. 2. Una composición que comprende:
    (a) un polipéptido Cas9, o un polinucleótido que codifica dicho polipéptido Cas9, y (b) un ARN de localización específica de ADN que comprende
    (i) un segmento de localización específica de ADN que comprende una secuencia de nucleótidos que es complementaria a una secuencia en un ADN diana, y
    (ii) un segmento de unión a proteínas que interactúa con dicho polipéptido Cas9, en donde el segmento de unión a proteínas comprende dos tramos complementarios de nucleótidos que se hibridan para formar un dúplex de ARN bicatenario (ARNbc),
    en donde un dominio de transducción de proteínas se une covalentemente (A) al extremo amino o (B) al extremo carboxilo del polipéptido Cas9, en donde el dominio de transducción de proteínas facilita el recorrido del polipéptido Cas9 desde el citosol hasta el interior de un orgánulo.
  3. 3. La composición según la reivindicación 2, en donde la composición es una composición farmacéutica.
  4. 4. Uso de un ARN de localización específica de ADN para guiar un polipéptido Cas9 a un ADN diana,
    en donde el ARN de localización específica de ADN comprende
    (i) un segmento de localización específica de ADN que comprende una secuencia de nucleótidos que es complementaria a una secuencia en el ADN diana, y
    (ii) un segmento de unión a proteínas que interactúa con dicho polipéptido Cas9, en donde el segmento de unión a proteínas comprende dos tramos complementarios de nucleótidos que se hibridan para formar un dúplex de a Rn bicatenario (ARNbc)
    en donde:
    dicho uso es en un organismo eucariota unicelular, una célula animal, una célula vegetal, una célula de un mamífero o una célula de un ser humano, que esin vitroo ex vivo, y en donde dicho uso no es en un proceso para modificar la identidad genética de la línea germinal de seres humanos.
  5. 5. Uso de un ARN activador en un ARN de localización específica de ADN para guiar un polipéptido Cas9 a un ADN diana,
    en donde el ARN de localización específica de ADN comprende
    (i) un segmento de localización específica de ADN que comprende una secuencia de nucleótidos que es complementaria a una secuencia en el ADN diana, y
    (ii) un segmento de unión a proteínas que interactúa con dicho polipéptido Cas9, en donde el segmento de unión a proteínas comprende dos tramos complementarios de nucleótidos que se hibridan para formar un dúplex de<a>R<n>bicatenario (ARNbc)
    en donde el ARN activador forma una mitad del dúplex de ARNbc del segmento de unión a proteínas del ARN de localización específica de ADN, y un ARN localizador específico forma la otra mitad del dúplex de ARNbc del segmento de unión a proteínas del ARN de localización específica de ADN
    en donde:
    dicho uso es en un organismo eucariota unicelular, una célula animal, una célula vegetal, una célula de un mamífero o una célula de un ser humano, que es invitroo exvivo,y en donde dicho uso no es en un proceso para modificar la identidad genética de la línea germinal de seres humanos.
  6. 6. Un ARN de localización específica de ADN, o un polinucleótido que codifica dicho ARN de localización específica de ADN, para su uso en un método de tratamiento de un paciente,
    en donde, en el método, el ARN de localización específica de ADN forma un complejo con un polipéptido Cas9 y en donde el ARN de localización específica de ADN comprende
    (i) un segmento de localización específica de ADN que comprende una secuencia de nucleótidos que es complementaria a una secuencia en un ADN diana, y
    (ii) un segmento de unión a proteínas que interactúa con el polipéptido Cas9, en donde el segmento de unión a proteínas comprende dos tramos complementarios de nucleótidos que se hibridan para formar un dúplex de ARN bicatenario (ARNbc).
  7. 7. Un polipéptido Cas9, o un polinucleótido que codifica dicho polipéptido Cas9, para su uso en un método de tratamiento de un paciente,
    en donde, en el método, el Cas9 forma un complejo con un ARN de localización específica de ADN y en donde el ARN de localización específica de ADN comprende
    (i) un segmento de localización específica de ADN que comprende una secuencia de nucleótidos que es complementaria a una secuencia en un ADN diana, y
    (ii) un segmento de unión a proteínas que interactúa con el polipéptido Cas9, en donde el segmento de unión a proteínas comprende dos tramos complementarios de nucleótidos que se hibridan para formar un dúplex de a Rn bicatenario (ARNbc).
  8. 8. Un ARN activador, o polinucleótido que codifica dicho ARN activador, para su uso en un método de tratamiento de un paciente,
    en donde, en el método, el ARN activador forma una mitad de un dúplex de ARNbc de un segmento de unión a proteínas de un ARN de localización específica de ADN, y un ARN localizador específico forma la otra mitad del dúplex de ARNbc de un segmento de unión a proteínas de un ARN de localización específica de ADN,
    en donde el a Rn de localización específica de ADN comprende
    (i) un segmento de localización específica de ADN que comprende una secuencia de nucleótidos que es complementaria a una secuencia en un ADN diana, y
    (ii) un segmento de unión a proteínas que interactúa con un polipéptido Cas9, en donde el segmento de unión a proteínas comprende dos tramos complementarios de nucleótidos que se hibridan para formar un dúplex de ARN bicatenario (ARNbc)
    y en donde, en el método, el ARN de localización específica de ADN forma un complejo con el polipéptido Cas9.
  9. 9. El ARN de localización específica de ADN, polinucleótido que codifica dicho ARN de localización específica de ADN, polipéptido Cas9, o polinucleótido que codifica dicho polipéptido Cas9 para su uso según la reivindicación 6 o 7, en donde en el método
    (a) el ARN de localización específica de ADN, o polinucleótido que codifica dicho ARN de localización específica de ADN, y
    (b) el polipéptido Cas9, o polinucleótido que codifica dicho polipéptido Cas9, se administran directamente al paciente.
  10. 10. El método, composición o uso, o el ARN de localización específica de ADN, polipéptido Cas9, polinucleótido que codifica dicho polipéptido Cas9, ARN activador o polinucleótido que codifica dicho ARN activador para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9,
    en donde el ARN de localización específica de ADN comprende una o más de una nucleobase modificada, una cadena principal modificada o un enlace internucleosídico no natural, o un resto de azúcar modificado.
  11. 11. El método, composición o uso, o el ARN de localización específica de ADN, polipéptido Cas9, polinucleótido que codifica dicho polipéptido Cas9, ARN activador o polinucleótido que codifica dicho ARN activador para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 ,
    en donde el ARN de localización específica de ADN comprende uno o más de un ácido nucleico bloqueado, un ácido nucleico peptídico, un ácido nucleico de morfolino o un ácido nucleico de ciclohexenilo (CeNA).
  12. 12. El método, o uso, o el ARN de localización específica de ADN, polinucleótido que codifica dicho ARN de localización específica de ADN, polipéptido Cas9, polinucleótido que codifica dicho polipéptido Cas9, ARN activador o polinucleótido que codifica dicho ARN activador para su uso, según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en donde el ARN de localización específica de ADN es un ARN de localización específica de ADN de dos moléculas que comprende dos moléculas de ARN separadas, cada una de las cuales comprende uno de los dos tramos complementarios de nucleótidos que se hibridan para formar el dúplex de ARNbc.
  13. 13. El método, uso, ARN de localización específica de ADN, polinucleótido que codifica dicho ARN de localización específica de ADN, polipéptido Cas9, polinucleótido que codifica dicho polipéptido Cas9, ARN activador o polinucleótido que codifica dicho ARN activador para su uso, según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 en donde el ARN de localización específica de ADN es un ARN de localización específica de ADN de molécula única en donde en el segmento de unión a proteínas los dos tramos complementarios de nucleótidos están unidos covalentemente por nucleótidos intermedios.
  14. 14. El método, composición, o uso, o el ARN de localización específica de ADN, polinucleótido que codifica dicho ARN de localización específica de ADN, polipéptido Cas9, polinucleótido que codifica dicho polipéptido Cas9, ARN activador o polinucleótido que codifica dicho ARN activador para su uso, según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, en donde dicho dúplex de ARNbc tiene:
    I. una longitud de 8 pares de bases (pb) a 15 pb;
    II. una longitud de 8 pares de bases (pb) a 30 pb; o
    III. una longitud de 15 pares de bases (pb) a 18 pb.
  15. 15. El método, o uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1, 4, 5 o 10 a 14 en donde el contacto o uso comprende introducir en una célula (a) el polipéptido Cas9, o un polinucleótido que codifica el polipéptido Cas9, y (B) el ARN de localización específica de ADN, o uno o más polinucleótidos de ADN que codifican el ARN de localización específica de ADN; opcionalmente en donde el método comprende además introducir en la célula un polinucleótido donante;
    o
    el ARN de localización específica de ADN, polinucleótido que codifica dicho ARN de localización específica de ADN, polipéptido Cas9, polinucleótido que codifica dicho polipéptido Cas9, ARN activador o polinucleótido que codifica dicho ARN activador para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 14, en donde en el método dicho ARN de localización específica de ADN, polinucleótido que codifica dicho ARN de localización específica de ADN, polipéptido Cas9, polinucleótido que codifica dicho polipéptido Cas9, ARN activador o polinucleótido que codifica dicho ARN activador se coadministra con una secuencia polinucleotídica donante que comprende homología con la secuencia de ADN diana.
  16. 16. El método, composición, o uso, o el ARN de localización específica de ADN, polinucleótido que codifica dicho ARN de localización específica de ADN, polipéptido Cas9, polinucleótido que codifica dicho polipéptido Cas9, ARN activador o polinucleótido que codifica dicho ARN activador para su uso, según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15,
    en donde la secuencia de nucleótidos que es complementaria a una secuencia en el ADN diana tiene de 18 a 20 nt de longitud, o de 20 a 25 nt de longitud.
  17. 17. El método, o uso, o el ARN de localización específica de ADN, polinucleótido que codifica dicho ARN de localización específica de ADN, polipéptido Cas9, polinucleótido que codifica dicho polipéptido Cas9, ARN activador o polinucleótido que codifica dicho ARN activador para su uso, según cualquiera de las reivindicaciones 1 o 4 a 16, en donde un dominio de transducción de proteínas se une covalentemente (A) al extremo amino del polipéptido Cas9 o (B) al extremo carboxilo del polipéptido Cas9, en donde el dominio de transducción de proteínas facilita el recorrido del polipéptido Cas9 desde el citosol hasta el interior de un orgánulo de una célula.
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