JP7518620B2 - 操作されたcas9ヌクレアーゼ - Google Patents
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Description
本出願は、2017年6月9日出願の米国仮特許出願第62/517,811号明細書、及び2018年5月1日出願の米国仮特許出願第62/665,388号明細書の優先権を主張する。これらの双方の内容は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
本明細書は、配列リスト(「2011271-0077_SL.txt」の名前の.txtファイルとして2018年6月8日に電子提出した)を参照する。.txtファイルは2018年6月4日に作成し、サイズは41,513バイトである。配列リストは、その内容全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
この明細書全体を通して、以下の段落で定義されるいくつかの用語が用いられる。この明細書の本文内では、他の定義も参照する。
本開示は、部分的に、DNA配列を標的とするための、例えば野生型ヌクレアーゼに対する特異性の向上を示すRNAガイド型ヌクレアーゼの発見を包含する。本明細書中で提供されるのは、そのようなヌクレアーゼ変異体を含むそのようなRNAガイド型ヌクレアーゼ変異体、組成物、及び系、並びに、例えば1つ以上の標的核酸を編集するように、そのようなヌクレアーゼ変異体を生成する方法及び用いる方法である。
本開示によるRNAガイド型ヌクレアーゼには、限定はされないが、天然起源のクラス2 CRISPRヌクレアーゼ、例えばCas9、及びCpf1、並びにそれに由来する又はそこから得られる他のヌクレアーゼが含まれる。例えば、それに由来する、又はそこから得られる他のヌクレアーゼとして、変異ヌクレアーゼが挙げられる。一部の実施形態において、変異ヌクレアーゼは、(天然に存在する、又は他の参照ヌクレアーゼ分子(既に操作又は変更されたヌクレアーゼ分子を含む)と比較して)1つ以上の酵素特性の変更、例えば、ヌクレアーゼ活性の変更又はヘリカーゼ活性の変更を含む。一部の実施形態において、変異ヌクレアーゼは、ニッカーゼ活性を、又は非切断活性(二本鎖ヌクレアーゼ活性と対立するもの)を有し得る。別の実施形態において、変異ヌクレアーゼは、そのサイズを変更する変更、例えば、そのサイズを引き下げるアミノ酸配列の欠失を有するが、例えば、1つ以上の、又はあらゆるヌクレアーゼ活性に及ぼす作用が大きくても大きくなくてもよい。別の実施形態において、変異ヌクレアーゼは、異なるPAM配列を認識することができる。一部の実施形態において、異なるPAM配列は、参照ヌクレアーゼの内因性の野生型PIドメインによって認識されるもの以外のPAM配列、例えば非正規配列(non-canonical sequence)である。
化膿レンサ球菌(S.pyogenes)Cas9について(Jinek et al.,Science 343(6176),1247997,2014(“Jinek 2014”)、また、単分子ガイドRNAと標的DNAとの複合体の黄色ブドウ球菌(S.aureus)Cas9について(Nishimasu 2014;Anders et al.,Nature.2014 Sep 25;513(7519):569-73(“Anders 2014”);及びNishimasu 2015)、結晶構造が決定されている。
本開示は、例えば野生型ヌクレアーゼに対して、標的に対する特異性のレベルが増大した変異RNAガイド型ヌクレアーゼを含む。例えば、本開示の変異RNAガイド型ヌクレアーゼは、野生型ヌクレアーゼと比較した、オンターゲット結合、編集、及び/又は切断活性のレベルの増大を示す。加えて、又は代わりに、本開示の変異RNAガイド型ヌクレアーゼは、野生型ヌクレアーゼと比較した、オフターゲット結合、編集、及び/又は切断活性のレベルの低下を示す。
crRNAと二本鎖(ds)DNA標的(TTTN PAM配列を含む)との複合体のアシダミノコッカス(Acidaminococcus)種Cpf1の結晶構造は、Yamanoらによって解明されている(参照により本明細書に組み込まれるCell.2016 May 5;165(4):949-962(“Yamano”))。Cpf1は、Cas9のように、2つのローブ:REC(認識)ローブ、及びNUC(ヌクレアーゼ)ローブを有する。RECローブは、あらゆる公知のタンパク質構造との類似性がないREC1及びREC2ドメインを含む。一方、NUCローブは、3つのRuvCドメイン(RuvC-I、-II、及び-III)、並びにBHドメインを含む。しかし、Cas9とは対照的に、Cpf1 RECローブは、HNHドメインがなく、やはり公知のタンパク質構造との類似性がない他のドメイン:構造的に固有のPIドメイン、3つのくさび(Wedge)(WED)ドメイン(WED-I、-II、及び-III)、並びにヌクレアーゼ(Nuc)ドメインを含む。
RNAガイド型ヌクレアーゼ、例えば、Cas9、Cpf1、又はその機能性断片をコードする核酸は、本明細書で提供される。RNAガイド型ヌクレアーゼをコードする例示的な核酸は、以前に記載されている(例えば、Cong et al.,Science.2013 Feb 15;339(6121):819-23(“Cong 2013”);Wang et al.,PLoS One.2013 Dec 31;8(12):e85650(“Wang 2013”);Mali 2013;Jinek 2012を参照のこと)。
用語「ガイドRNA」及び「gRNA」は、Cas9又はCpf1などのRNAガイド型ヌクレアーゼの、細胞内のゲノム又はエピソーム配列などの標的配列に対する特異的な結合(又は「ターゲティング」)を促進するあらゆる核酸を指す。gRNAは、単分子(単一のRNA分子を含み、あるいはキメラとも呼ばれる)又はモジュール式(2つ以上、典型的には2つの別のRNA分子(crRNA及びtracrRNAなど)を含み、これらは通常、例えば二本鎖化によって互いに結合されている)であり得る。gRNA及びその構成部分は、文献を通して、例えば、Briner et al.(参照により組み込まれるMolecular Cell 56(2),333-339,October 23,2014(“Briner”))に、また(and)Cotta-Ramusinoに記載されている。
本開示はまた、一セットの条件において適応度(fitness)が(例えば、変異体/突然変異体のライブラリ間で)最も大きい変異体を選択するであろう競合ベースの選択戦略を提供する。本発明の選択方法は、例えば、指向性進化戦略、例えば、1ラウンド以上の突然変異誘発に続く選択を包含する戦略において、有用である。特定の実施形態において、本開示の方法は、現行のポリペプチド及び/又はポリペプチドの進化戦略で典型的に観察されるよりも高いスループット指向性進化戦略を可能にする。
一態様において、本開示は、注目するポリペプチド又はポリヌクレオチドのバージョンを、DNA標的部位に結合するかに基づいて選択する方法を提供する。当該方法は通常、(a)ポリヌクレオチドのライブラリを用意するステップであって、ライブラリ内の様々なポリヌクレオチドは、様々なバージョンの注目するポリペプチドをコードし、又は様々なバージョンの注目するポリヌクレオチド用の鋳型として機能する、ステップと;(b)ポリヌクレオチドのライブラリを宿主細胞中に導入するステップであって、これにより、形質転換された各宿主細胞が、注目するポリペプチドの一バージョンをコードし、又は注目するポリヌクレオチドの一バージョン用の鋳型として機能するポリヌクレオチドを含む、ステップと;(c)第1の選択剤をコードし、且つDNA標的部位を含むファージミドを含む複数のバクテリオファージを用意するステップと;(d)ステップ(b)由来の形質転換された宿主細胞を、複数のバクテリオファージと一緒に、複数のバクテリオファージが、形質転換された宿主細胞に感染するような培養条件下でインキュベートするステップであって、第1の選択剤の発現が、感染した宿主細胞に生存の利益又は不利益を付与する、ステップと;(e)(d)において生存の利益(例えば、本明細書中に記載される生存の利益)を示す宿主細胞を選択するステップとを含む。例えば、ステップ(d)の生存は、以下で概説されるように、種々のスキームに基づく。
特定の実施形態において、選択剤は、宿主細胞に生存の不利(例えば、細胞増殖カイネティクスの低下(例えば増殖遅延)及び/又は細胞分裂の阻害)を付与し、且つ/又は宿主細胞を死滅させ、そしてDNA標的部位での結合は、選択剤の発現を低下させる。次に、生存は、DNA標的部位での結合に基づく:注目するポリペプチドのバージョンをコードし、又は、DNA標的部位に結合する、注目するポリヌクレオチドのバージョンの鋳型として機能する、ライブラリ由来のポリヌクレオチドで形質転換された宿主細胞は、細胞増殖カイネティクスの維持、細胞増殖カイネティクスの増大(例えば、細胞分裂の増大)、及び/又は細胞増殖カイネティクスの低下の逆転(例えば、細胞増殖カイネティクスの低下からの少なくとも部分的な救出)を示す。一方、注目するポリペプチドのバージョンをコードし、又は、DNA標的部位に結合しない、注目するポリヌクレオチドのバージョンの鋳型として機能する、ライブラリ由来のポリヌクレオチドで形質転換された宿主細胞は、生存の不利益(例えば、細胞増殖カイネティクスの低下(例えば、増殖遅延)、及び/又は細胞分裂の阻害)を示し、生き残らず、且つ/又は死滅する。
特定の実施形態において、選択剤は、宿主細胞に、生存の利益(例えば、細胞増殖カイネティクスの維持、細胞増殖カイネティクスの増大(例えば、細胞分裂の増大)、及び/又は細胞増殖カイネティクスの低下の逆転(例えば、細胞増殖カイネティクスの低下からの少なくとも部分的な救出)を付与し、そしてDNA標的部位での結合は、選択剤の発現を低下させる。生存は、DNA標的部位での結合の欠如に基づく:注目するポリペプチドのバージョンをコードし、又は、DNA標的部位に結合しない、注目するポリヌクレオチドのバージョンの鋳型として機能する、ライブラリ由来のポリヌクレオチドで形質転換された宿主細胞は、細胞増殖カイネティクスの維持、細胞増殖カイネティクスの増大(例えば、細胞分裂の増大)、及び/又は細胞増殖カイネティクスの低下の逆転(例えば、細胞増殖カイネティクスの低下からの少なくとも部分的な救出)を示す。一方、注目するポリペプチドのバージョンをコードする、又は、DNA標的部位に結合する、注目するポリヌクレオチドのバージョンの鋳型として機能する、ライブラリ由来のポリヌクレオチドで形質転換された宿主細胞は、生存の不利益(例えば、細胞増殖カイネティクスの低下(例えば、増殖遅延)、細胞分裂の阻害)を示し、生き残らず、且つ/又は死滅する。
特定の実施形態において、選択剤は、宿主細胞に、生存の利益(例えば、細胞増殖カイネティクスの維持、細胞増殖カイネティクスの増大(例えば、細胞分裂の増大)、及び/又は細胞増殖カイネティクスの低下の逆転(例えば、細胞増殖カイネティクスの低下からの少なくとも部分的な救出)を付与し、そしてDNA標的部位での結合は、選択剤の発現を増大させる。生存は、DNA標的部位での結合に基づく:注目するポリペプチドのバージョンをコードし、又は、DNA標的部位に結合する、注目するポリヌクレオチドのバージョンの鋳型として機能するライブラリ由来のポリヌクレオチドで形質転換された宿主細胞は、細胞増殖カイネティクスの維持、細胞増殖カイネティクスの増大(例えば、細胞分裂の増大)、及び/又は細胞増殖カイネティクスの低下の逆転(例えば、細胞増殖カイネティクスの低下からの少なくとも部分的な救出)を示す。一方、注目するポリペプチドのバージョンをコードし、又は、DNA標的部位に結合しない、注目するポリヌクレオチドのバージョンの鋳型として機能する、ライブラリに由来するポリヌクレオチドで形質転換された宿主細胞は、生存の不利益(例えば、細胞増殖カイネティクスの低下(例えば、増殖遅延)、細胞分裂の阻害)を示し、生き残らず、且つ/又は死滅する。
特定の実施形態において、選択剤は、宿主細胞に、生存の不利益(例えば、細胞増殖カイネティクスの低下(例えば、増殖遅延)及び/又は細胞分裂の阻害)を付与し、且つ/又は宿主細胞を死滅させ、そしてDNA標的部位での結合は、選択剤の発現を増大させる。生存は、DNA標的部位での結合の欠如に基づく:注目するポリペプチドのバージョンをコードし、又は、DNA標的部位に結合しない、注目するポリヌクレオチドのバージョンの鋳型として機能する、ライブラリ由来のポリヌクレオチドで形質転換された宿主細胞は、細胞増殖カイネティクスの維持、細胞増殖カイネティクスの増大(例えば、細胞分裂の増大)、及び/又は細胞増殖カイネティクスの低下の逆転(例えば、細胞増殖カイネティクスの低下からの少なくとも部分的な救出)を示す。一方、注目するポリペプチドのバージョンをコードし、又は、DNA標的部位に結合する、注目するポリヌクレオチドのバージョンの鋳型として機能する、ライブラリに由来するポリヌクレオチドで形質転換された宿主細胞は、生存の不利益(例えば、細胞増殖カイネティクスの低下(例えば、増殖遅延)、細胞分裂の阻害)を示し、生き残らず、且つ/又は死滅する。
一態様において、本開示は、注目するポリペプチド又はポリヌクレオチドのバージョンを、選択剤の存在下でDNA標的部位に結合するかに基づいて選択する方法を提供する。
特定の実施形態において、選択剤(ポリヌクレオチドである)の存在下での宿主細胞内のDNA標的部位での結合は、不利である(例えば、DNA標的部位での結合が、宿主細胞内の必須の生存遺伝子の破壊もたらすからである)。生存は、DNA標的部位での結合の欠如に基づく:注目するポリペプチドのバージョンをコードし、又は、DNA標的部位に結合しない、注目するポリヌクレオチドのバージョンの鋳型として機能する、ライブラリ由来のポリヌクレオチドで形質転換された宿主細胞は、生き残る。一方、注目するポリペプチドのバージョンをコードし、又は、DNA標的部位に結合する、注目するポリヌクレオチドのバージョンの鋳型として機能する、ライブラリ由来のポリヌクレオチドで形質転換された宿主細胞は、生き残らない。
特定の実施形態において、選択剤(ポリヌクレオチドである)の存在下での宿主細胞内のDNA標的部位での結合は、有利である(例えば、DNA標的部位での結合が、宿主細胞内の生存遺伝子の発現をもたらすからである)。生存は、DNA標的部位での結合に基づく:注目するポリペプチドのバージョンをコードし、又は、DNA標的部位に結合する、注目するポリヌクレオチドのバージョンの鋳型として機能する、ライブラリ由来のポリヌクレオチドで形質転換された宿主細胞は、生き残る。一方、注目するポリペプチドのバージョンをコードし、又は、DNA標的部位に結合しない、注目するポリヌクレオチドのバージョンの鋳型として機能する、ライブラリに由来するポリヌクレオチドで形質転換された宿主細胞は、生き残らない。
一態様において、本開示は、ポリペプチドの発現の調節又は制御に基づいて、注目するポリペプチド又はポリヌクレオチドのバージョンを選択する方法を提供する。
本開示の方法は、例えば、ポリヌクレオチドのライブラリ(例えばプラスミドライブラリ)を提供するステップから始めることができ、そこでは、ライブラリ内の様々なポリヌクレオチドが、注目するポリペプチドの様々なバージョンをコードしている(又は、注目するポリヌクレオチドの場合、ライブラリは、注目するポリヌクレオチドの様々なバージョン、及び/又は、注目するポリヌクレオチドの様々なバージョンの鋳型として機能する、注目するポリヌクレオチドの様々なバージョンを含む)。
本開示の方法は、ポリヌクレオチドのライブラリを用意するステップの後に、形質転換された各宿主細胞が、注目するポリペプチドのバージョンをコードするポリヌクレオチドを含むように、又は注目するポリヌクレオチドのバージョンの鋳型として機能するように、ポリヌクレオチドのライブラリを宿主細胞中に導入するステップを含んでよい。
本開示の方法は、ポリヌクレオチドのライブラリを宿主細胞中に導入するステップの後に、第1の選択剤をコードし、且つDNA標的部位を含むファージミドを含む複数のバクテリオファージを用意するステップを含んでよい。
ファージミドは、f1ファージからのf1複製起点を有する環状のプラスミドであるので、プラスミドとして複製することができ、そしてバクテリオファージによって、一本鎖DNAとしてパッケージングすることができる。ファージミドはまた、二本鎖複製用の複製起点を(例えば、宿主細胞の内側にありながら)含有する。
本開示の方法は、第1の選択剤をコードし、且つDNA標的部位を含むファージミドを含む複数のバクテリオファージを用意するステップの後に、形質転換された宿主細胞(ポリヌクレオチドのライブラリが導入された)を、複数のバクテリオファージと共に、複数のバクテリオファージが、形質転換された宿主細胞に感染するような培養条件下でインキュベートするステップを含んでよい。通常、当該条件は、第1の選択剤の発現が、実施形態に応じて、生存の不利益又は生存の利益を付与する条件である。
本明細書中に記載される方法は、選択剤をコードする、又は選択剤の鋳型として機能するファージミドを含む複数のバクテリオファージを提供するステップを含んでよい。実施形態に応じて、選択剤は、生存の利益又は生存の不利益を、宿主細胞に、宿主細胞がバクテリオファージとインキュベートされる条件で付与し得る。選択剤は、細胞増殖カイネティクスの増大、又は宿主細胞への細胞増殖カイネティクスの低下を、宿主細胞がバクテリオファージとインキュベートされる条件で付与し得る。
本明細書中に記載される方法は、ポリヌクレオチドのライブラリを用意するステップを含んでよく、ライブラリ内の様々なポリヌクレオチドは、注目するポリペプチドの様々なバージョンをコードしている(又は、注目するポリヌクレオチドの場合、注目するポリヌクレオチドの様々なバージョンの鋳型として機能する)。ポリヌクレオチドは、例えば、調節要素、例えば、プロモータを含んでよく、これは、ポリペプチドの発現を制御することができる。調節要素は、誘導性プロモータであってよく、そして発現は、誘導剤によって誘導することができる。そのような誘導剤及び/又は誘導される発現は、選択の効率を増大又は向上させることができる。
一部の実施形態において、本発明の方法及び組成物は、Cas9分子又はCas9ポリペプチドの様々なバージョンをコードするポリヌクレオチドのライブラリ(例えば、Cas9分子又はCas9ポリペプチドの全体又は一部にまたがるCas9突然変異体の包括的且つ不偏のライブラリ)と共に用いられてよい。特定の実施形態において、本発明の方法及び組成物は、特定の特性に基づいて、ライブラリの1つ以上のメンバーを選択するのに用いることができる。典型的な実施形態において、Cas9分子又はCas9ポリペプチドは、gRNA分子と相互作用し、そして、gRNA分子と協働して、核酸内部位に局在する能力を有する。他の活性、例えば、PAM特異性、切断活性、又はヘリカーゼ活性は、Cas9分子及びCas9ポリペプチドにおいて、より広く変動し得る。
一部の実施形態において、本開示の方法及び組成物は、ガイドRNA分子及び/又はガイドRNA分子をコードするポリヌクレオチドのライブラリと共に用いられてよい。例えば、(i)本明細書中に記載される異なる標的化ドメイン;(ii)本明細書中に記載される異なる第1の相補性ドメイン及び/若しくは第2の相補性ドメイン;並びに/又は(iii)本明細書中に記載される異なるステムループを有するガイドRNAをそれぞれコードするDNA分子を含むライブラリを提供且つ/又は生成することができる。本明細書中に記載されるように、ライブラリを宿主細胞中に導入することができる。一部の実施形態において、RNAガイド型ヌクレアーゼ、例えば、Cas9分子又はCas9ポリペプチドをコードする核酸もまた、宿主細胞中に導入される。
一般に、特定の本発明の方法のためのDNA標的部位は、DNA標的部位の物理的位置(例えば、一部の態様において、DNA標的部位は、ファージミド上に位置決めされてよい一方、他の態様において、DNA標的部位は、宿主細胞ゲノム内に位置決めされてよい)、注目するポリペプチド若しくはポリヌクレオチドの性質、選択プロセスの性質、及び/又は選択プロセスの所望の成果に依存してよい。DNA標的部位は、種々のタイプのヌクレオチド配列内に位置決めされてよい。例えば、一部の実施形態において、DNA標的部位は、転写されない要素内に、ポリペプチドをコードする、又はポリヌクレオチドの鋳型(例えば非コードRNA)として機能する要素内に、ポリペプチドの発現を制御する調節要素内その他に位置決めされてよい。
特定の実施形態において、ライブラリ及び/又はファージミド内のプラスミドは、抗生物質耐性遺伝子を含む。一部の実施形態において、抗生物質耐性遺伝子は、細菌、例えば大腸菌(E.coli)を死滅させ、又はその増殖を阻害する抗生物質に対する耐性を付与する。そのような抗生物質の非限定的な例として、アンピシリン、ブレオマイシン、カルベニシリン、クロラムフェニコール、エリスロマイシン、カナマイシン、ペニシリン、ポリミキシンB、スペクチノマイシン、ストレプトマイシン、及びテトラサイクリンが挙げられる。種々の抗生物質耐性遺伝子カセットが知られており、そして、例えばプラスミド内の要素として、当該技術において利用可能であり、且つ/又は市販されている。例えば、ampR(アンピシリン耐性)、bleR(ブレオマイシン耐性)、carR(カルベニシリン耐性)、cmR(クロラムフェニコール耐性)、kanR(カナマイシン耐性)、及び/又はtetR(テトラサイクリン耐性)を有するいくつかの市販のプラスミド、又は遺伝子要素がある。抗生物質耐性遺伝子の追加の例として、ベータラクタマーゼがある。
特定の実施形態において、遺伝子要素(例えば、選択剤、抗生物質耐性遺伝子、ポリペプチド、ポリヌクレオチドをコードするもの)が、調節要素に作動可能に連結されて、1つ以上の他の要素、例えば、選択剤、抗生物質耐性遺伝子、ポリペプチド、ポリヌクレオチドの発現を可能にする。
1ラウンド以上の選択の後、ポリペプチド及び/又はポリヌクレオチドの選択されたバージョンを、選択を生き残った宿主細胞から回収して分析することができる。複数サイクルの進化(突然変異誘発に続く、1ラウンド以上の選択)を用いる概略において、当該分析を、サイクル毎の終わりに行ってもよいし、一部のサイクル内でのみ行ってもよい。
D=N×L/G(式1)
(式中、Nは、読み取りの数であり、Lは、実際のゲノムの長さであり、Gは、配列決定されるポリヌクレオチドの長さである)として算出される。
一部の実施形態において、本発明の選択方法は、プラスミドのライブラリを生成する突然変異誘発方法と一緒に用いられる。あらゆる突然変異誘発方法を、本発明の選択方法と一緒に用いることができる。
先で考察されるように、本開示のゲノム編集系は、適切なあらゆる様式で実行することができ、このことは、以下に限定されないが、RNAガイド型ヌクレアーゼ(例えば、本明細書中に記載されるRNAガイド型ヌクレアーゼ変異体)、gRNA、及び任意選択のドナー鋳型核酸が挙げられる、そのような系の構成要素が、ゲノム編集系の形質導入、発現、若しくは導入をもたらし、且つ/又は細胞、組織、若しくは対象内で所望の回復成果を(例えば、イクスビボ且つ/又はインビボで)引き起こす適切なあらゆる形態又は形態の組合せで送達、製剤化、又は投与され得ることを意味する。表2及び表3は、ゲノム編集系の実施のいくつかの非限定的な例を示す。しかしながら、当業者であれば、これらのリストが包括的でないこと、そして他の実施が考えられ得ることを理解するであろう。一部の実施形態において、本明細書中に記載される1つ以上の構成要素は、インビボ送達/投与される。一部の実施形態において、本明細書中に記載される1つ以上の構成要素は、エクスビボ送達/投与される。例えば、一部の実施形態において、本明細書中に記載されるRNAガイド型ヌクレアーゼ変異体をコードするRNA(例えばmRNA)は、細胞にインビボ又はエクスビボ送達/投与される。一部の実施形態において、本明細書中に記載されるRNAガイド型ヌクレアーゼ変異体は、gRNAとのリボ核タンパク質(RNP)複合体として、又はgRNAなしで、細胞にインビボ又はエクスビボ送達/投与される。特に表2に関して、表は、単一のgRNA及び任意選択のドナー鋳型を含むゲノム編集系のいくつかの例示的な実施を一覧にする。しかしながら、本開示に従うゲノム編集系は、複数のgRNA、複数のRNAガイド型ヌクレアーゼ(例えば、本明細書中に記載される複数のRNAガイド型ヌクレアーゼ変異体)、及び他の構成要素、例えばタンパク質を組み込んでよく、種々の実施が、表2に示される原理に基づいて、当業者に明らかであろう。表2において、「[N/A]」は、ゲノム編集系が、示される構成要素を含まないことを示す。
本開示に従うゲノム編集系の種々の要素をコードする核酸は、当該技術において知られている方法によって、又は本明細書中に記載されるように、対象に投与することができ、又は細胞中に送達することができる。例えば、RNAガイド型ヌクレアーゼ(例えば、本明細書中に記載されるRNAガイド型ヌクレアーゼ変異体)をコードし、且つ/又はgRNAをコードするDNA、並びにドナー鋳型核酸は、例えば、ベクター(例えば、ウイルスベクター又は非ウイルスベクター)、非ベクターベースの方法(例えば、裸のDNA又はDNA複合体を用いる)、又はそれらの組合せによって送達することができる。
RNP(gRNA及びRNAガイド型ヌクレアーゼ(例えば、本明細書中に記載されるRNAガイド型ヌクレアーゼ変異体)の複合体)、並びに/又はRNAガイド型ヌクレアーゼ(例えば、本明細書中に記載されるRNAガイド型ヌクレアーゼ変異体)及び/若しくはgRNAをコードするRNA(例えばmRNA)を、一部がCotta-Ramusinoに記載されている、当該技術において知られている方法によって、細胞中に送達することができ、又は対象に投与することができる。インビトロで、RNAガイド型ヌクレアーゼ(例えば、本明細書中に記載されるRNAガイド型ヌクレアーゼ変異体)及び/又はgRNAをコードするRNA(例えばmRNA)を、例えば、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、一過性の細胞コンプレッション又はスクイージング(例えば、Lee 2012参照)によって、送達することができる。また、脂質媒介形質移入、ペプチド媒介送達、GalNAc-又は他のコンジュゲート媒介送達、及びそれらの組合せが、インビトロ、そしてインビボでの送達に用いられてもよい。
ゲノム編集系、又はそのような系を用いて変更若しくは操作された細胞は、局所的か全身的かに拘わらず、適切なあらゆるモード又は経路によって対象に投与することができる。全身投与モードとして、経口経路及び非経口経路が挙げられる。非経口経路として、一例として、静脈内、骨髄内、動脈内、筋肉内、皮内、皮下、鼻腔内、腹腔内経路が挙げられる。全身投与される構成要素は、例えば、HSC、造血幹/前駆体細胞、又は赤血球前駆体若しくは前駆体細胞を標的とするように変更又は製剤化されてもよい。
当業者であれば、ゲノム編集系の様々な構成要素が一緒又は別個に、そして同時又は非同時に送達されてよいと理解するであろう。ゲノム編集系構成要素の別個且つ/又は非同期の送達が、特に、ゲノム編集系の機能に対する時間的制御又は空間的制御を実現するのに、そしてその活性によって生じる特定の作用を制限するのに、所望されてよい。
本実施例は、本発明の選択方法を進化戦略に用いて、野生型の非疾患対立遺伝子と比較して、点突然変異(単一の塩基変化)によってのみ異なる疾患対立遺伝子について特異性がある部位特異的ヌクレアーゼを進化させることができることを実証する。
本実施例は、本発明の選択方法を如何に、部位特異的DNA結合酵素のオフターゲット活性を低下させる進化戦略に用いることができるかを記載する。
本実施例は、本発明の選択方法を進化戦略に用いて、野生型の非疾患対立遺伝子と比較して、点突然変異(単一の塩基変化)によってのみ異なる疾患対立遺伝子について特異性がある部位特異的ヌクレアーゼを進化させることができることを実証する。しかしながら、本発明の選択方法を用いて、別の対立遺伝子(例えば、野生型又は非疾患の対立遺伝子)と比較して、単一の塩基変化よりも大きく異なる対立遺伝子(例えば、突然変異又は疾患の対立遺伝子)について特異性がある部位特異的ヌクレアーゼを進化させることもできる。
Cas9タンパク質、及び標的配列を標的とするgRNAをコードするプラスミド、pEvol_CASを構築した。Cas9タンパク質、及び非標的化gRNAをコードするプラスミド、pEvol_NONTARGETINGもまた構築した。双方のプラスミドは、構成的に、アンピシリンに対する耐性(AmpR)を付与するベータラクタマーゼ、及びCas9の発現を制御する誘導性アラビノースプロモータ(Ara)を発現する。ファージミド(ファージ起源f1要素を含有するプラスミド)、pSelect_MUT及びpSelect_WTもまた構築した。これらは各々、潜在的標的部位を含有する。ファージミドはまた、構成的に発現されるクロラムフェニコール耐性遺伝子(CmR)及びtse2(細菌毒素)を、lacプロモータの制御下で含有し、これは、IPTG(イソプロピルβ-D-1-チオガラクトピラノシド)によるtse2発現の誘導を可能とする。pSelect_MUT及びpSelect_WTを各々別個に、ヘルパーバクテリオファージ中にパッケージングした。
突然変異誘発用の最初の鋳型としてpEvol_WTCASプラスミド、そして全てのコドンを標的とし、且つ突然変異率の調整を可能にする包括的且つ不偏の突然変異誘発方法を用いて、プラスミドライブラリ、pEvol_CASLIBRARYを生成した。プラスミドは、Cas9タンパク質、及び標的配列を標的とするgRNAをコードする。野生型Cas9タンパク質及び標的化gRNAをコードするプラスミドpEvol_WTCASも構築した。双方のプラスミドは、構成的に、アンピシリンに対する耐性(AmpR)を付与するベータラクタマーゼ、及びCas9の発現を制御する誘導性アラビノースプロモータ(Ara)を発現する。先に述べたように、ファージミド(ファージ起源f1要素を含有するプラスミド)、pSelect_MUT及びpSelect_WTもまた構築した。これらは、潜在的標的部位を含有する。
ライブラリ進化の連続ラウンドは、標的を切断する選択性のレベルが高いCas9突然変異体を生成した。これは、培養体がtse2を発現するように誘導された場合の増殖遅延の連続低下によって実証される。図7は、tse2の誘導なしで野生型Cas9を発現する培養体(WTcas-tse2)の増殖と比較した場合、tse2が誘導された場合の野生型Cas9培養体(WTcas+tse2)について顕著な増殖遅延、そして顕著なネガティブデルタを示す。細胞増殖のデルタは、1ラウンドの突然変異誘発後に低下する(例えば、Round 1+tse2対Round 1-tse2)。3ラウンドの突然変異誘発の後、細胞増殖曲線は、tse2を発現するように誘導した培養体及びtse2を発現するように誘導しなかった培養体について、ほぼ同一である。これらのデータは、tse2の使用、及び突然変異誘発の選択的ラウンドが、オンターゲット切断について高度に選択的である突然変異Cas9を生成することができることを示す。
本開示の系及び方法を使用して、以下の実施例によってさらに例示するように、種々のヌクレアーゼ特性を選択することができる。本明細書中で開示される選択方法を用いて、化膿レンサ球菌(S.pyogenes)cas9変異体を、オンターゲット切断効率を維持しているが、オフターゲット遺伝子座での切断を引き下げている、突然変異を起こしたライブラリから同定したことで、治療に用いられる、雑然としたガイドを潜在的に救出する手段が提供された。ランダムな標的でのスキャニング突然変異誘発(SMART)を用いて、突然変異化膿レンサ球菌(S.pyogenes)Cas9ライブラリを生成した。次に、ライブラリを、大腸菌(E.coli)中に形質転換して、ポジティブ選択及びネガティブ選択の双方の3ラウンドについて、ファージで感作誘発した。ポジティブ選択ステップは、表6に示すように、GUIDE-Seqによって決定される、複数の知られているオフターゲットを有するヒトゲノム遺伝子座に向けられるガイドRNA用のオンターゲット配列(配列番号4)を含む切断カセットを含むポジティブ選択プラスミドを利用した:
本開示の系及び方法を使用して、以下の実施例によってさらに例示するように、種々のヌクレアーゼ特性を選択することができる。本明細書中で開示される選択方法を用いて、化膿レンサ球菌(S.pyogenes)cas9変異体を、オンターゲット切断効率を維持しているが、オフターゲット遺伝子座での切断を引き下げている、突然変異を起こしたライブラリから同定したことで、治療に用いられる、雑然としたガイドを潜在的に救出する手段が提供された。ランダムな標的でのスキャニング突然変異誘発(SMART)を用いて、突然変異化膿レンサ球菌(S.pyogenes)Cas9ライブラリを生成した。次に、ライブラリを、大腸菌(E.coli)中に形質転換して、ポジティブ選択及びネガティブ選択の双方の3ラウンドについて、ファージで感作誘発した(図1及び図2)。ポジティブ選択ステップ及びネガティブ選択ステップの後、クローンを選択して、次世代シーケンシング(NGS)によって配列決定して、リードをアラインして、非突然変異化膿レンサ球菌(S.pyogenes)Cas9(配列番号13)と比較して、最も一般的に突然変異したアミノ酸残基を同定した。コドンの位置による、そしてアミノ酸置換に従う、同定した突然変異の頻度を求めた(図11)。突然変異を、RuvCドメイン(例えばD23A)、RECドメイン(例えば、T67L、Y128V)、及びPAM相互作用ドメイン(PI)(例えばD1251G)内で同定した。4つの異なる突然変異(D23A、T67L、Y128V、及びD1251G)の組合せを含む発現構築体を調製して、ヒトT細胞におけるオンターゲット及びオフターゲットの編集効率について、インビトロで試験した。この実施例では、突然変異D23A、Y128V、D1251G、及びT67Lを含む構築体を、「Mut6」又は「SpartaCas」と呼んだ。
野生型Cas9、eCas、及びSpartaCasによるオフターゲット切断を、GUIDE-Seqを用いて、以下の方法を用いて評価した。
RNPを、Integrated DNA Technologiesによって合成した2部のgRNAと複合体形成した。全てのガイドをアニールして200μMの最終濃度にした。crRNA対tracrRNAの比率は1:1である。RNPを、1:2の酵素対ガイド比を達成するように複合体形成した。100μMの酵素及び200μMのgRNAの1:1容量比を用いて、50μMの最終RNP濃度を達成した。RNPを、室温にて30分間、複合体形成させた。次に、RNPを、8つの濃度にわたって連続的に2倍に希釈した。RNPを、ヌクレオフェクション(nucleofection)まで-80℃にて凍結した。
T細胞を、Lonza X-Vivo 15培地で培養した。細胞を解凍して、T Cell Expansion及びActivation用のDynabeads Human T-Activator CD3/CD28で培養した。解凍後2日目に、細胞をビーズから除去した。細胞を4日目まで培養し続けて、その日に、ヌクレオフェクション用にスピンダウンした。ヌクレオフェクション後2日目に、細胞容量を新しいプレート中に半分に分けて、室温にて増殖させ続けた。
細胞を、BioRad T-20細胞カウンターを用いて数えた。細胞を、トリパンブルーと1:1で混合して数えた。必要な(ウェルあたり500k細胞に十分な)細胞の総量を、別個のチューブに分注してから、1500RPMにて5分間スピンダウンした。次に、細胞を、Lonza P2ヌクレオフェクション溶液中に再懸濁させた。次に、細胞を、Lonza 96ウェルヌクレオフェクションプレート内に、ウェルあたり20μLにて入れた。次に、細胞及びRNPプレートを、BioMek FXロボットに引き渡した。96ウェルヘッドを用いて、各RNPの2μLをヌクレオフェクションプレート中に移して混合した。次に、ヌクレオフェクションプレートを直ちに、Lonzaシャトルシステムに引き渡して、そこでDS-130パルスコードによりヌクレオフェクトした。次に、細胞を直ちに、BioMek FXに引き戻して、そこで、予め温めた96ウェル未処理培地プレートに移して混合した。次に、細胞プレートを、インキュベーションのために37℃にて置いた。
4日目に、細胞を、2000RPMにて5分間、プレート内にスピンダウンした。次に、培地をデカントした。次に、細胞ペレットを、Agencourt DNAdvance溶解溶液中に再懸濁させた。gDNAを、BioMek FXに関するDNAdvanceプロトコルを用いて抽出した。
GUIDE-seqを、Tsai et al.(Nat.Biotechnol.33:187-197(2015))のプロトコルに基づいて実行して、以下の通りにT細胞に適合させた。10μLの4.4μM RNPを、4μLの100μM dsODN、及び6μLの1×H150バッファと組み合わせて、総容量を20μLにした。RNPを、ヌクレオフェクションまで氷上に置いた。T細胞を、BioRad T-20細胞カウンターを用いて数えた。細胞を、トリパンブルーと1:1で混合して数えた。必要な(キュベットあたり200万細胞に十分な)細胞の総量を、別個のチューブに分注してから、1500RPMにて5分間スピンダウンした。次に、細胞を、Lonza P2溶液の80μL中に再懸濁させた。次に、細胞を、それぞれのキュベット中にピペットで移して、RNP/dsODNの20μLを、各キュベットに加えて、溶液全体を穏やかに混合した。次に、細胞を、CA-137パルスコードを用いてヌクレオフェクトした。次に、細胞を直ちに、予め温めた非コーティング培地プレート中にピペットで移した。次に、細胞プレートを、インキュベーションのために37℃にて置いた。gDNAを抽出して、Tsai et al.(Nat.Biotechnol.33:187-197(2015))のプロトコルを用いて、双方向のリードのみを用いて分析した。
図18A及び図18Bはそれぞれ、「SiteG」及び「SiteH」についてのオフターゲット切断を示す。図18A及び図18Bに示すように、SpartaCas及びeCasは双方とも、野生型Cas9と比較して、オフターゲットの総数を引き下げた。さらに、残ったオフターゲットのほとんどは、リードカウントを引き下げた(シアンで示す)。
本発明を、その詳細な説明と共に記載してきたが、前述の説明は、添付の特許請求の範囲の範囲によって定義される本発明の範囲を例示することが意図され、本発明の範囲を限定しないことが理解されよう。他の態様、利点、及び改変は、以下の特許請求の範囲の範囲内である。
化膿レンサ球菌(S.pyogenes)のCas9分子をコードする、例示的なコドン最適化核酸配列(配列番号9)。
Claims (19)
- 配列番号13に対して少なくとも90%の同一性を有するアミノ酸配列を含む、ヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドであって、
前記ポリペプチドは、配列番号13に対する以下のアミノ酸置換:D23A及びY128V、を有し、
前記ポリペプチドは、配列番号13のポリペプチドと比較して低下されたオフターゲット切断活性を有する、
ポリペプチド。 - 請求項1のポリペプチドであって、
配列番号13に対して少なくとも95%の同一性を有するアミノ酸配列を含む、
ポリペプチド。 - 請求項1のポリペプチドであって、
配列番号13に対して少なくとも99%の同一性を有するアミノ酸配列を含む、
ポリペプチド。 - 請求項1のポリペプチドであって、
前記ポリペプチドが配列番号13の以下の位置:T67及びD1251、の1つ以上においてさらなるアミノ酸置換を有する、
ポリペプチド。 - 請求項1のポリペプチドであって、
前記ポリペプチドが配列番号13の以下の位置:T67及びD1251、のにおいてさらなるアミノ酸置換を有する、
ポリペプチド。 - 請求項1のポリペプチドであって、
前記ポリペプチドが配列番号13に対する以下のアミノ酸置換:T67L及びD1251G、の1つ以上をさらに有する、
ポリペプチド。 - ヌクレアーゼ活性を有し、配列番号13に対して少なくとも90%の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸であって、
前記ポリペプチドが少なくとも配列番号13に対する以下のアミノ酸置換:D23A及びY128Vを有し、配列番号13のポリペプチドと比較して低下されたオフターゲット切断活性を有する、
核酸。 - 請求項7の核酸であって、
前記ポリペプチドが配列番号13に対する以下のアミノ酸置換:T67L及びD1251G、の1つ以上をさらに有する、
核酸。 - 請求項7の核酸であって、
前記ポリペプチドが配列番号13に対する以下のアミノ酸置換:T67L及びD1251G、をさらに有する、
核酸。 - 請求項7の核酸を含む、ベクター。
- ゲノム編集系であって、
(i)ヌクレアーゼ活性を有し、配列番号13に対して少なくとも90%の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、配列番号13に対する以下のアミノ酸置換:D23A及びY128V、を有し、配列番号13のポリペプチドと比較して低下されたオフターゲット切断活性を有する、ポリペプチド;および、
(ii)ガイド核酸、
を含む、ゲノム編集系。 - 請求項11のゲノム編集系であって、
前記ガイド核酸がガイドRNAである、
ゲノム編集系。 - 請求項11のゲノム編集系であって、
前記ポリペプチドが配列番号13の以下の位置:T67及びD1251、の1つ以上においてさらなるアミノ酸置換を有する、
ゲノム編集系。 - 請求項11のゲノム編集系であって、
前記ポリペプチドが配列番号13の以下の位置:T67及びD1251、においてさらなるアミノ酸置換を有する、
ゲノム編集系。 - 請求項11~14のいずれかのゲノム編集系であって、
前記ゲノム編集系を標的(target)配列および非標的(off-target)配列を含む標的細胞に投与した場合に、前記ゲノム編集系による前記非標的配列のオフターゲット編集率が、前記標的細胞に対照ゲノム編集系を投与した場合に観察される前記非標的配列のオフターゲット編集率よりも低く、
ここで、前記対照ゲノム編集系が、
ヌクレアーゼ活性を有し、配列番号13を含むポリペプチド、及び、
前記ガイド核酸、を含む、
ゲノム編集系。 - 請求項15のゲノム編集系であって、
前記ゲノム編集系の前記オフターゲット編集率が、前記対照ゲノム編集系の前記オフターゲット編集率よりも少なくとも5%低い、
ゲノム編集系。 - 請求項15のゲノム編集系であって、
前記オフターゲット編集率は、前記非標的配列におけるインデルのレベルを評価することによって測定される、
ゲノム編集系。 - 請求項11~14のいずれかのゲノム編集系であって、
前記ポリペプチド及び前記ガイド核酸を含むリボ核タンパク質(RNP)複合体を含む、
ゲノム編集系。 - 請求項1のポリペプチド及びガイド核酸を含む、単離されたリボ核タンパク質(RNP)複合体。
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