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JP2022513159A - Rnaを調節する方法 - Google Patents

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Abstract

本開示は、一般に、例えばPumilio相同性ドメインを含むポリペプチドを使用してRNAを調節するための方法及び組成物に関する。

Description

関連出願
本願は、2018年11月29日に出願された米国特許出願第62/772,907号明細書、2018年12月12日に出願された米国特許出願第62/778,361号明細書、及び2018年12月17日に出願された米国特許出願第62/780,442号明細書に対する優先権を主張し、それらの内容はそれら全体が参照により本明細書中に各々援用される。
生物学的過程を調節するため、RNAの構造及び機能を変更するための組成物及び方法が本明細書に記載される。
一次ヌクレオチド配列は、RNAの二次及び三次構造を決定する。ヌクレオチドの塩基対合により、タンパク質などのRNAリガンドの結合に必要なステム、ループ及び組み合わせが形成される。そのようなことから、一次配列の編集とそれによるRNAの二次及び/又は三次構造は、そのリガンド結合特性を変更し、リガンド(例えばRNA結合ポリペプチド)の機能を変更することなく下流プロセスを調節する方法を提供し得る。RNAの一次、二次、及び三次構造と機能、並びに/又はスプライシングを調節し、RNA-リガンド相互作用によってもたらされるプロセス、及び/又はRNAコード産物の発現に影響するための組成物及び関連方法が本明細書に記載される。
したがって、一態様では、本開示は、(a)複数(例えば、2~50、10~30、又は16~21)のRNA塩基結合モチーフであって、それらの各々がRNA塩基に結合し、且つ標的RNA配列内の番号順のRNA塩基に結合するようにRNA結合ドメイン内で規則正しい、RNA塩基結合モチーフを含むRNA結合ドメインを、(b)異種RNA編集ドメインに連結されて含むポリペプチドを対象とする。
別の態様では、本開示は、(a)複数(例えば、2~50、10~30、又は16~21)のRNA塩基結合モチーフであって、それらの各々がRNA塩基に結合し、且つ標的RNA配列内の番号順のRNA塩基に結合するようにRNA結合ドメイン内で規則正しい、RNA塩基結合モチーフを含むRNA結合ドメインを、(b)異種RNA編集ドメインに連結されて含むポリペプチドを対象とし、ここでポリペプチドはヌクレアーゼ又はその機能断片を含まない。
別の態様では、本開示は、(a)複数(例えば、2~50、10~30、又は16~21)のRNA塩基結合モチーフであって、それらの各々がRNA塩基に結合し、且つ標的RNA配列内の番号順のRNA塩基に結合するようにRNA結合ドメイン内で規則正しい、RNA塩基結合モチーフを含むRNA結合ドメインを、(b)デアミナーゼ又はその機能断片若しくは変異体の触媒ドメインを含む異種RNA編集ドメインに連結されて含むポリペプチドを対象とする。
別の態様では、本開示は、(a)複数(例えば、2~50、10~30、又は16~21)のRNA塩基結合モチーフであって、それらの各々がRNA塩基に結合し、且つ標的RNA配列内の番号順のRNA塩基に結合するようにRNA結合ドメイン内で規則正しい、RNA塩基結合モチーフを含むRNA結合ドメインを、(b)スプライシング因子を含む異種RNAエフェクターに連結されて含むポリペプチドを対象とする。
いくつかの実施形態では、複数のRNA塩基結合モチーフは、少なくとも3(例えば、少なくとも4、少なくとも5、少なくとも6、少なくとも7、少なくとも8、少なくとも9、14~24の間、15~23の間、16~22の間、16~21の間、2~20の間、2~15の間、2~10の間、2~8の間、3~20の間、3~15の間、3~10の間、3~8の間、4~8の間、最大25、最大30)のPUM RNA結合モチーフを含む。
いくつかの実施形態では、RNA結合ドメインは、2~50の間のヌクレオチド(例えば、14~30の間、15~26の間、16~21の間、2~40の間、2~30の間、2~25の間、2~20の間、5~50の間、5~40の間、5~30の間、5~25の間、5~20の間、5~15の間、2~18の間、2~15の間、2~12の間、2~10の間、2~9の間、2~8の間、3~20の間、3~15の間、3~10の間、3~9の間、3~8の間、4~12の間、4~10の間、4~9の間、4~8の間、5~10の間、5~9の間、5~8の間のヌクレオチド)のRNA配列に結合する。
いくつかの実施形態では、RNA結合ドメインは、90~500の間のアミノ酸残基、例えば、90~450の間のアミノ酸残基、90~400の間のアミノ酸残基、90~350の間のアミノ酸残基、90~300の間のアミノ酸残基、120~400の間のアミノ酸残基である。
いくつかの実施形態では、RNA結合ドメインは、野生型PUM-HD、例えば野生型ヒトPUM1-HDの対応するアミノ酸配列に対して、少なくとも80%の同一性(例えば、少なくとも85%の同一性、少なくとも87%の同一性、少なくとも90%の同一性、少なくとも92%の同一性、少なくとも95%の同一性、少なくとも97%の同一性、少なくとも98%の同一性、又は99%の同一性)及び100%未満の同一性を有する。
いくつかの実施形態では、RNA結合ドメインは、疾患関連突然変異を含むRNA配列に結合する。
いくつかの実施形態では、RNA結合ドメインは、疾患関連突然変異を含むRNA配列に結合し、RNA編集ドメインは、疾患関連突然変異を編集する(例えば修正する)。
いくつかの実施形態では、RNA編集ドメインは、RNAデアミナーゼ(例えば、アデノシンデアミナーゼ又はシチジンデアミナーゼ)又はその機能断片若しくは変異体の触媒ドメインを含むポリペプチドを含む。
いくつかの実施形態では、RNA編集ドメインは、RNA上で作用するアデノシンデアミナーゼ(ADAR)(例えば、ヒトADARl、ヒトADAR2、ヒトADAR3、又はヒトADAR4);tRNA上で作用するアデノシンデアミナーゼ(ADAT);RNA上で作用するシトシンデアミナーゼ(CDAR);又はその機能断片若しくは変異体の触媒ドメインを含む。
いくつかの実施形態では、デアミナーゼの触媒ドメインは、表Bに示される配列に対して少なくとも80%同一(例えば、少なくとも85%、87%、90%、92%、95%、98%、99%、100%同一)である。
いくつかの実施形態では、RNA編集ドメインは、標的RNA配列又は標的配列を含むRNAの少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、又は10(例えば、1~10、1~9、1~8、1~7、1~6、1~5、1~4、1~3、1~2、2~10、2~9、2~8、2~7、2~6、2~5、2~4、2~3、3~10、3~9、3~8、3~7、3~6、3~5、3~4、4~10、4~9、4~8、4~7、4~6、4~5、5~10、5~9、5~8、5~7、5~6、6~10、6~9、6~8、6~7、7~10、7~9、7~8、8~10、8~9、又は9~10)のヌクレオチドを修飾する。
いくつかの実施形態では、RNA編集ドメインは、標的RNA配列又は標的配列を含むRNAの単一ヌクレオチドを修飾する。
いくつかの実施形態では、RNA編集ドメインは、ある塩基を別の塩基に変化させる、例えば、シトシンをウラシルに;アデノシンをイノシンに;又はグアノシンをアデノシンに変化させる。
いくつかの実施形態では、RNA編集ドメインは、標的RNA配列のアミノ酸コード配列を修飾する。
いくつかの実施形態では、標的RNA配列のアミノ酸コード配列に対する修飾により、標的RNA配列によってコードされる産物ポリペプチドのアミノ酸配列が変更される。
いくつかの実施形態では、RNA編集ドメインは、標的RNA配列の少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、又は10(例えば、1~10、1~9、1~8、1~7、1~6、1~5、1~4、1~3、1~2、2~10、2~9、2~8、2~7、2~6、2~5、2~4、2~3、3~10、3~9、3~8、3~7、3~6、3~5、3~4、4~10、4~9、4~8、4~7、4~6、4~5、5~10、5~9、5~8、5~7、5~6、6~10、6~9、6~8、6~7、7~10、7~9、7~8、8~10、8~9、又は9~10)のヌクレオチド、及び任意選択的には標的RNA配列の1、2、3、4、5、6、7、8、9、又は10以下のヌクレオチドを修飾する。
いくつかの実施形態では、RNA結合ドメインは、RNAの二次構造に結合する。
いくつかの実施形態では、RNA結合ドメインは、プレmRNA、例えばプレmRNAのイントロン-エクソン接合部に結合する。
いくつかの実施形態では、該ポリペプチドは、標的RNA配列又は標的RNA配列を含むRNAの二次構造を(例えばその形成を)阻害し、不安定化し、及び/又は除去する。
いくつかの実施形態では、該ポリペプチドは、標的RNA配列又は標的RNA配列を含むRNAのスプライシングを変更する。
いくつかの実施形態では、該ポリペプチドは、標的RNA配列又は標的RNA配列を含むRNAのスプライシングをスプライス部位(例えば標的スプライス部位)で阻害し、例えば除去し、また任意選択的には標的RNA配列又は標的RNA配列を含むRNAのスプライシングを1以上の他のスプライス部位(例えば1以上の非標的スプライス部位)で阻害しない。
いくつかの実施形態では、該ポリペプチドは、遺伝子、例えば標的RNA配列をコードする遺伝子の発現を減少させる。
いくつかの実施形態では、該ポリペプチドは、標的RNA配列によってコードされる産物ポリペプチドのレベルを低下させる。
いくつかの実施形態では、該ポリペプチドは、標的RNA配列又は標的RNA配列を含むRNAにおける停止コドン、例えば未成熟停止コドンを除去する。
いくつかの実施形態では、該ポリペプチドは、標的RNA配列又は標的RNA配列を含むRNAにおける停止コドン、例えば未成熟停止コドンを作出する。
いくつかの実施形態では、RNA結合ドメインの複数のRNA塩基結合モチーフの少なくとも2(例えば、3、4、5、6、7、8、9又はそれ以上)は、リンカー、例えばアミノ酸リンカーによって連結される。
いくつかの実施形態では、RNA結合ドメイン及びRNA編集ドメインは、リンカー、例えばアミノ酸リンカーによって連結される。
いくつかの実施形態では、該ポリペプチドは、スプライシング因子をさらに含む。
別の態様では、本開示は、本明細書に記載のポリペプチド、及び標的RNA配列に相補的な配列を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む組成物を対象とする。
別の態様では、本開示は、本明細書に記載のポリペプチドをコードする核酸を対象とする。
いくつかの実施形態では、該核酸は、RNA、例えばmRNAである。
別の態様では、本開示は、本明細書に記載の核酸、及び標的RNA配列に相補的な配列を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む組成物を対象とする。
別の態様では、本開示は、本明細書に記載の核酸、及び標的RNA配列に相補的な配列を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドをコードする核酸を含む組成物を対象とする。
別の態様では、本開示は、本明細書に記載の核酸を含む発現ベクター(例えば、プラスミドベクター、ウイルスベクター)を対象とする。
別の態様では、本開示は、本明細書に記載のポリペプチド、核酸、組成物、又はベクターを含む宿主細胞(例えば、細菌宿主細胞、哺乳動物宿主細胞)を対象とする。
別の態様では、本開示は、本明細書に記載のポリペプチド、核酸、ベクター、組成物、又は宿主細胞、及び薬学的に許容できる賦形剤を含むGMPグレードの医薬組成物を対象とする。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のポリペプチド、核酸、ベクター、組成物、医薬組成物、又は宿主細胞は、薬学的担体(例えば、小胞、リポソーム、LNP)中にカプセル封入又は製剤化される。
別の態様では、本開示は、標的RNAを修飾する(例えば、その配列を変化させる)方法であって、細胞、組織又は対象を、本明細書に記載のポリペプチド、核酸、ベクター、組成物、宿主細胞、又はGMPグレードの医薬組成物と、ポリペプチドのRNA結合ドメインが細胞、組織又は対象における標的RNAに結合し、且つポリペプチドのRNA編集ドメインが標的RNAを編集するのに十分な量及び時間で接触させることを含む方法を対象とする。
いくつかの実施形態では、標的RNAは、二次及び/又は三次構造を有するプレmRNA又はmRNAである。
いくつかの実施形態では、標的RNAは、プレmRNA、例えばプレmRNAのイントロン-エクソン接合部である。
いくつかの実施形態では、該ポリペプチドは、標的RNAのヌクレオチド配列を変更する。
いくつかの実施形態では、変更することは、標的RNA配列又は標的配列を含むRNAの少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、又は10(例えば、1~10、1~9、1~8、1~7、1~6、1~5、1~4、1~3、1~2、2~10、2~9、2~8、2~7、2~6、2~5、2~4、2~3、3~10、3~9、3~8、3~7、3~6、3~5、3~4、4~10、4~9、4~8、4~7、4~6、4~5、5~10、5~9、5~8、5~7、5~6、6~10、6~9、6~8、6~7、7~10、7~9、7~8、8~10、8~9、又は9~10)のヌクレオチドを修飾することを含む。
いくつかの実施形態では、変更することは、標的RNA配列又は標的配列を含むRNAの単一ヌクレオチドを修飾することを含む。
いくつかの実施形態では、変更することは、ある塩基を別の塩基に変化させること、例えば、シトシンをウラシルに;アデノシンをイノシンに;又はグアノシンをアデノシンに変化させることを含む。
いくつかの実施形態では、変更することは、標的RNA配列のアミノ酸コード配列を修飾することを含む。
いくつかの実施形態では、標的RNA配列のアミノ酸コード配列に対する修飾により、標的RNA配列によってコードされる産物ポリペプチドのアミノ酸配列が変更される。
いくつかの実施形態では、標的RNAは、細胞、組織又は対象においてプレmRNA又はmRNAを含み、該ポリペプチドは、プレmRNA又はmRNAの二次又は三次構造を変更する(例えば、増強又は低減する)。
いくつかの実施形態では、標的RNAは、細胞、組織又は対象においてプレmRNA又はmRNAを含み、該ポリペプチドは、プレmRNA又はmRNAのスプライシングを変更する。
いくつかの実施形態では、該ポリペプチドは、プレmRNA又はmRNAのスプライシングをスプライス部位(例えば標的スプライス部位)で阻害し、例えば除去し、任意選択的には、プレmRNA又はmRNAのスプライシングを1以上の他のスプライス部位(例えば、1以上の非標的スプライス部位)で阻害しない。
いくつかの実施形態では、標的RNAは、エプスタイン・バーウイルス(Epstein-Barr virus)(EBV)mRNA、例えばEBV核抗原1(EBNA1)mRNAを含む。
いくつかの実施形態では、標的RNAは、棘筋ニューロン2(spinal muscle neuron 2)(SMN2)mRNAを含む。
いくつかの実施形態では、標的RNAは、GluA2 mRNAを含む。
いくつかの実施形態では、該ポリペプチドは、配列番号13~21から選択されるアミノ酸配列、又はそれらに対して少なくとも80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、若しくは99%の同一性を有する、若しくはそれらと比較して、1、2、3、4、5、6、7、8、9、若しくは10以下の塩基改変(例えば、置換、欠失、又は挿入)を有するアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、RNA結合ドメインは、配列番号22~25から選択される、又はそれらと比較して1、2、3、4、5、6、7、8、9、若しくは10以下の塩基改変を有するRNA配列を含む標的RNA配列に結合する。
別の態様では、本開示は、対象、例えばヒト対象における疾患又は障害を治療する方法であって、本明細書に記載のポリペプチド、医薬組成物、核酸、ベクター、組成物、又は宿主細胞を有効量で対象に投与し、それにより疾患又は障害を治療することを含み、ここで疾患又は障害が、マイヤー・ゴーリン症候群、ゼッケル症候群4、ジュベール症候群5、レーバー先天黒内障10;シャルコー・マリー・トゥース病、2型;シャルコー・マリー・トゥース病、2型;アッシャー症候群、2C型;脊髄小脳失調28;脊髄小脳失調28;脊髄小脳失調28;QT延長症候群2;シェーグレン・ラルソン症候群;遺伝性フルクトース尿症;遺伝性フルクトース尿症;神経芽細胞腫;神経芽細胞腫;カルマン症候群1;カルマン症候群1;カルマン症候群1;異調染色性白血球栄養症、レット症候群、筋萎縮性側索硬化症タイプ10、リー・フラウメニ症候群、嚢胞性線維症、ハーラー症候群、α-1-アンチトリプシン(A1AT)欠乏、パーキンソン病、アルツハイマー病、白化現象、筋萎縮性側索硬化症、喘息、b-サラセミア、カダシル症候群、シャルコー・マリー・トゥース病、慢性閉塞性肺疾患(COPD)、遠位脊髄性筋萎縮(DSMA)、デュシェンヌ型/ベッカー型筋ジストロフィー、栄養障害型表皮水疱症、表皮水疱症、ファブリー病、第V因子ライデン関連障害、家族性腺腫性ポリポーシス、ガラクトース血症、ゴーシェ病、グルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼ、血友病、遺伝性ヘマトクロマトーシス(Hereditary Hematochromatosis)、ハンター症候群、ハンチントン病、炎症性腸疾患(IBD)、遺伝性多凝集反応症候群、レーバー先天黒内障、レッシュ・ナイハン症候群、リンチ症候群、マルファン症候群、ムコ多糖症、筋ジストロフィー、筋緊張性ジストロフィーI型及びII型、神経線維腫症、ニーマン・ピック病A型、B型及びC型、NY-eso1関連がん、ポイツ・ジェガース症候群、フェニルケトン尿症、ポンペ病、原発性毛様体病(Primary Ciliary Disease)、プロトロンビン変異関連障害、例えばプロトロンビンG20210A突然変異、肺高血圧症、網膜色素変性症、サンドホフ病、重症複合免疫不全症候群(SCID)、鎌状赤血球貧血、脊髄性筋萎縮、シュタルガルト病、テイ・サックス病、アッシャー症候群、X連鎖性免疫不全、スタージ・ウェーバー症候群、及びがんから選択される、方法を対象とする。
別の態様では、本開示は、エプスタイン・バーウイルス(Epstein-Barr virus)(EBV)によって感染された、又はそれによる感染が疑われる対象(例えばヒト対象)を治療する方法であって、本明細書に記載のポリペプチド、医薬組成物、核酸、ベクター、組成物、又は宿主細胞を有効量で対象に投与し、それによりエプスタイン・バーウイルス(Epstein-Barr virus)(EBV)によって感染された、又はそれによる感染が疑われる対象を治療することを含む方法を対象とする。
いくつかの実施形態では、対象は、単核球症又はがん(例えば、バーキットリンパ腫、ホジキンリンパ腫、及び上咽頭がん)を有する。
別の態様では、本開示は、棘筋萎縮(SMA)を有する対象(例えばヒト対象)を治療する方法であって、本明細書に記載のポリペプチド、医薬組成物、核酸、ベクター、組成物、又は宿主細胞を有効量で対象に投与し、それによりSMAを有する対象を治療することを含む方法を対象とする。
別の態様では、本開示は、筋萎縮性側索硬化症(ALS)を有する対象(例えばヒト対象)を治療する方法であって、本明細書に記載のポリペプチド、医薬組成物、核酸、ベクター、組成物、又は宿主細胞を有効量で対象に投与し、それによりALSを有する対象を治療することを含む方法を対象とする。
例示的なRNAエディター組成物:GluA2.RBD-hADARDDの図解(1A)及び予想として得られるGluA2 mRNA配列の編集の例示(1B)を示す。 例示的なRNAエディター組成物:GluA2.RBD-hADARDDの図解(1A)及び予想として得られるGluA2 mRNA配列の編集の例示(1B)を示す。 棘筋萎縮患者におけるヒトSMN2スプライシングの例示を示す。 例示的なRNAエディター組成物:SMN2.RBD-hADARDD及びSMN2 mRNA配列の予想として得られる修正編集の例示を示す。 MFOLDによって予測された二次構造による、宿主における免疫応答を誘導するためにウイルス mRNAの二次構造を増強するためのEBNA1の配列の編集を示す例示を示す。
本発明は、RNA編集組成物(RNA-editing composition)及び関連方法を説明する。本明細書に記載の組成物(例えば医薬組成物)は、複数(例えば、2~50、2~30、15~30、16~21、5~20、5~15、5~10)のRNA塩基結合モチーフであって、それらの各々がRNA塩基に結合し、且つ標的RNA配列内の番号順のRNA塩基に結合するようにRNA結合ドメイン内で規則正しい、RNA塩基結合モチーフを含むRNA結合ドメインを、異種RNA編集ドメイン、例えばデアミナーゼ、例えばアデノシンデアミナーゼ又はシチジンデアミナーゼに連結されて含むポリペプチドを含む。本明細書に記載の組成物及び方法は、RNA配列を修飾するため、例えば、RNAの二次及び/又は三次構造;スプライシング;コードポリペプチドのアミノ酸配列;若しくはコードポリペプチドの発現のレベルの1以上を変更する、又は停止コドン(例えば未成熟停止コドン)を付加若しくは除去するため、使用されてもよい。実施形態では、RNA結合ドメインは、RNAに結合し、RNA編集ドメインは、RNAの二次及び/又は三次構造を増強若しくは低減し、且つ/又はRNAのスプライシングを変更するため、RNAを編集する。いくつかの実施形態では、該組成物は、例えばRNAに対する免疫応答を低減するため、二本鎖RNA構造の量を低減する。いくつかの実施形態では、該組成物は、例えばRNAに対する免疫応答を増強するため、二本鎖RNA構造の量を増強する。いくつかの実施形態では、該組成物は、病理学的なスプライス産物を生じさせる疾患関連突然変異を修正する。
定義
本明細書で用いられるとき、用語「ドメイン」は、生体分子の特定の機能に寄与する生体分子の構造を指す。ドメインは、生体分子の隣接領域(例えば隣接配列)又は異なる非隣接領域(例えば非隣接配列)を含んでもよい。タンパク質ドメインの例として、限定はされないが、RNA結合ドメイン、エフェクタードメイン、RNA編集ドメインが挙げられる。
本明細書で用いられるとき、用語「外因性」は、生体分子(核酸配列又はポリペプチドなど)を参照して使用されるとき、生体分子がヒト介入により宿主ゲノム、細胞又は生物に導入されたことを意味する。例えば、組換えDNA技術又は他の方法を用いて、既存のゲノム、細胞、組織又は対象に添加される核酸は、既存の核酸配列、細胞、組織又は対象に対して外因性である。
本明細書で用いられるとき、用語「異種」は、第1の要素を第2の要素との関連で説明するために用いられるとき、第1の要素及び第2の要素が、前述のように処理され、天然に存在しないことを意味する。例えば、異種ポリペプチド、核酸分子、構築物又は配列は、(a)発現される場合の細胞にとって天然でない、ポリペプチド、核酸分子、又はポリペプチド若しくは核酸分子配列の一部、(b)天然状態と比べて改変又は突然変異されている、ポリペプチド又は核酸分子、又はポリペプチド若しくは核酸分子の一部、或いは(c)類似条件下での天然発現レベルと比べて変更された発現を有するポリペプチド又は核酸分子、を指す。例えば、遺伝子又は核酸分子の発現を通常は天然に発現される遺伝子又は核酸分子とは異なる方法で調節するため、異種制御配列(例えば、プロモーター、エンハンサー)が使用されてもよい。別の例では、ポリペプチド又は核酸配列の異種ドメイン(例えば、ポリペプチドのRNA結合ドメイン又はポリペプチドのRNA結合ドメインをコードする核酸)は、他のドメインに対して処理されてもよい、又はポリペプチド又はそのコード核酸の他のドメイン若しくは部分に対して、異なる配列であってもよいか若しくは異なる供給源に由来してもよい。特定の実施形態では、異種核酸分子は、天然の宿主細胞ゲノム内に存在してもよいが、改変された発現レベルを有するか又は異なる配列若しくは双方を有してもよい。他の実施形態では、異種核酸分子は、宿主細胞又は宿主ゲノムに対して内因性でなくてもよいが、その代わりに形質転換(例えば、トランスフェクション、エレクトロポレーション)により宿主細胞内に導入されていてもよく、ここで添加された分子は、宿主ゲノムに組み込まれてもよい、又は一過性に(例えばmRNA)若しくは2世代以上にわたり準安定性に(例えば、エピソームウイルスベクター、プラスミド又は他の自己複製ベクター)、染色体外遺伝子材料として存在し得る。
本明細書で用いられるとき、用語「突然変異される」、「突然変異」及び同根語は、核酸配列に適用されるとき、核酸配列内のヌクレオチドが、参照核酸配列(例えば、天然、野生型又は非病理学的核酸配列)と比べて、挿入、欠失又は改変(例えば点突然変異)されてもよいことを意味する。
本明細書で用いられるとき、「核酸」は、限定はされないが、cDNA、ゲノムDNA、mRNA、tRNAを含むRNA及びDNA分子の双方を指し、合成核酸分子、例えば化学合成されるか又は組換え生成されるもの、例えば本明細書に記載のヌクレオチド配列も含む。核酸分子は、二本鎖又は一本鎖、それらの組み合わせ、環状又は線状であり得る。一本鎖の場合、核酸分子は、センス鎖又はアンチセンス鎖であり得る。核酸配列は、当業者によって容易に理解されるように、化学的に若しくは生化学的に修飾されてもよく、又は非天然若しくは誘導体化ヌクレオチド塩基を有してもよい。かかる修飾は、例えば、標識、メチル化、1以上の天然に存在するヌクレオチドの類似体との置換、非荷電結合などのヌクレオチド間修飾(例えば、メチルホスホネート、ホスホトリエステル、ホスホロアミド酸、カルバミン酸など)、荷電結合(例えば、ホスホロチオエート、ジチオリン酸など)、懸垂部分、(例えば、ポリペプチド)、介入物(例えば、アクリジン、ソラレンなど)、キレート剤、アルキル化剤、及び修飾結合(例えばαアノマー核酸など)を含む。ポリヌクレオチドを、水素結合及び他の化学的相互作用を介して指定配列に結合するその能力において模倣する合成分子も含まれる。かかる分子は、当該技術分野で公知であり、例えば、分子の骨格においてペプチド結合がリン酸塩結合の代替である場合のものを含む。他の修飾は、例えば、リボース環が架橋部分又は「ロックド」核酸中に見出される修飾などの他の構造を有する場合の類似体を含み得る。
本明細書で用いられるとき、ポリペプチドの「RNA結合ドメイン」は、標的RNA配列に特異的に結合するポリペプチドのドメインである。RNA結合ドメインは、複数のRNA塩基結合モチーフを含んでもよく、それらの各々は、RNA塩基に特異的に結合する能力があり、且つ標的RNA配列内の番号順のRNA塩基に結合するようにRNA結合ドメイン内で規則正しい。本明細書で用いられるとき、「PUM RNA結合モチーフ」は、Pumilio相同性ドメイン(PUM-HD)のRNA塩基結合リピートに対して相同性であるか又はそれに由来するモチーフである。実施形態では、PUM RNA結合モチーフは、PUM-HDのRNA塩基結合リピートに対して、少なくとも80%(例えば、85%、87%、90%、92%、95%、97%、98%、99%又は100%)同一であり、特定のRNA塩基に対する結合特異性を有する。いくつかの実施形態では、PUM RNA結合モチーフは、モジュラー単位を有する。いくつかの実施形態では、モジュラー単位は、RNA塩基アデニンに結合し、ここでモジュラー単位のアミノ酸1はシステインであり、モジュラー単位のアミノ酸2はチロシンであり、及びモジュラー単位のアミノ酸5はグルタミンである。いくつかの実施形態では、モジュラー単位は、RNA塩基ウラシルに結合し、ここでモジュラー単位のアミノ酸1はアスパラギンであり、モジュラー単位のアミノ酸2はチロシンであり、及びモジュラー単位のアミノ酸5はグルタミンである。いくつかの実施形態では、モジュラー単位は、RNA塩基グアニンに結合し、ここでモジュラー単位のアミノ酸1はセリンであり、モジュラー単位のアミノ酸2はチロシンであり、及びモジュラー単位のアミノ酸5はグルタミン酸である。いくつかの実施形態では、モジュラー単位は、RNA塩基シトシンに結合し、ここでモジュラー単位のアミノ酸1はセリンであり、モジュラー単位のアミノ酸2はチロシンであり、及びモジュラー単位のアミノ酸5はアルギニンである。いくつかの実施形態では、モジュラー単位は、シトシンに結合し、ここでモジュラー単位のアミノ酸1はセリンであり、モジュラー単位のアミノ酸2はチロシンであり、及びモジュラー単位のアミノ酸5はアルギニンである。かかるモジュラー単位、並びにRNA結合モチーフ及びドメインを設計し、作成する方法は、例えば、Adamala et al.2016.PNAS 113(19):E2579-E2588及び米国特許出願公開第2016/0238593号明細書にて見出される。
本明細書で用いられるとき、「RNAエフェクター」は、RNA上で、その構造及び/又は機能を調節する、例えば標的RNAのヌクレオチド配列を編集するように作用する部分である。RNAエフェクターの例が、標的RNA配列の1以上の塩基を編集する酵素の触媒ドメイン(「RNA編集」ドメイン)、例えば、デアミナーゼ、例えばシトシンをウラシルに編集するシチジンデアミナーゼ、アデノシンをイノシンに編集するアデノシンデアミナーゼの触媒ドメイン、又はGをAに変換する能力を有することが報告されているAPOBEC3Aの触媒ドメインである(例えば、Ahmadreza et al.2015.PloS one 10.3:e0120089などの場合)。かかる酵素は、RNA上で作用するアデノシンデアミナーゼ(ADAR)(例えば、ヒトADARl、ヒトADAR2、ヒトADAR3、又はヒトADAR4);tRNA上で作用するアデノシンデアミナーゼ(ADAT)、RNA上で作用するシトシンデアミナーゼ(CDAR)、APOBEC、APOBEC3A A3A、TadA又はCDAを含む。
本明細書で用いられるとき、用語「宿主」細胞は、本明細書で用いられるとき、中にタンパク質及び/又は遺伝子材料が導入されている細胞及び/又はそのゲノムを指す。該用語は、特定の対象細胞及び/又はゲノムを指すだけでなく、かかる細胞の子孫及び/又はかかる細胞の子孫のゲノムを指すことが意図される。突然変異又は環境的影響のいずれかに起因し、特定の修飾が続く世代に生じることがあるため、かかる子孫は、実際には親細胞と同一でなくてもよいとしても、本明細書で用いられるような用語「宿主細胞」の範囲内に含まれる。宿主ゲノム又は宿主細胞は、培養下で成長した単離された細胞若しくは細胞株、又はかかる細胞若しくは細胞株から単離されたゲノム材料であってもよい、又は生体組織若しくは生物を含む宿主細胞若しくは宿主ゲノムであってもよい。
本明細書で用いられるとき、本明細書に記載の組成物の用語「有効な」又は「十分な」量及び/又は時間は、細胞、組織又は対象、例えば哺乳動物(例えばヒト)に投与されるとき、所望される結果、例えば、細胞レベル、組織レベル、又は臨床結果での効果をもたらすのに十分である質及び/又は時間を指し、それ故、「有効な」又は「十分な」又はそれに対する同義語は、それが適用されている文脈に依存する。例えば、RNA構造を調節する文脈では、それは組成物(例えば、ポリペプチド、核酸、ベクターなど)の投与を伴わずに得られる応答と比べての、RNA構造への変化を達成するのに十分な組成物の量である。かかる量に対応することになる所与の本明細書に記載の組成物の量は、様々な要素、例えば、所与の薬剤、医薬製剤、投与経路、疾患又は障害のタイプ、細胞、組織若しくは対象の同一性(例えば、年齢、性別、体重)、又は処置されている宿主などに応じて変動することになるにもかかわらず、当業者によりルーチン的に決定され得る。さらに、本明細書で用いられるとき、本開示の組成物の「治療有効量」は、対照と比べて、対象において有利であるか又は所望される結果をもたらす量である。本明細書で定義される通り、本開示の組成物の治療有効量は、当該技術分野で公知の通常の方法により、当業者により容易に決定されてもよい。投与計画は、最適な治療応答をもたらすように調節されてもよい。
本明細書で用いられるとき、用語「増強する」及び「低減する」は、参照と比べて、測定対象の機能、発現、又は活性を各々、結果的により大きい量又はより小さい量に調節することを指す。例えば、本明細書に記載の組成物の投与後、本明細書に記載のようなRNAの機能及び/又は構造(例えば、発現又は制御活性)は、細胞、組織又は対象において、投与前の量と比べて、少なくとも5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%又は98%又はそれ以上、増強又は低減されてもよい。一般に、測定対象は、投与後、投与が列挙された効果を、例えば、数時間、数日、少なくとも1週、1か月、3か月、若しくは6か月にわたり有している時点で、又は治療計画が対象の状況下で開始している上で測定される。
本明細書で用いられるとき、「医薬組成物」又は「製剤」は、疾患の緩和、治療、若しくは予防において薬理学的活性若しくは他の直接的効果を有する組成物若しくは調製物、及び/又はヒト使用が指示されるその最終剤形又は製剤である。医薬組成物は、典型的にはGMPグレードである、即ち、それはヒトに使用されるべき組成物としての米国規制当局(FDA)の規格を満たす。例えば、GMPグレードの組成物は、典型的には内毒素について試験され、内毒素を特定量未満で有するリリース基準を満たす。
「治療」及び「治療する」は、本明細書で用いられるとき、疾患、病態、又は障害に対する改善、寛解、安定化(即ち、悪化しないこと)、予防又は治癒が意図される、対象の医学的管理を指す。この用語は、積極的治療(疾患、病態、又は障害を改善することを対象とする治療)、原因療法(関連する疾患、病態、又は障害の原因を対象とする治療)、対症療法(症状の軽減を意図して設計された治療)、予防的治療(関連する疾患、病態、又は障害の発生を最小化するか又は部分的若しくは完全に阻害することを対象とする治療);並びに支持療法(別の治療法を補うために用いられる治療)を含む。治療はまた、疾患又は病態の程度の低減;疾患又は病態の伝播を予防すること;疾患又は病態の進行の遅延又は緩徐化;疾患又は病態の寛解又は緩和;及び検出可能又は検出不能である寛解(部分的又は全体的のいずれか)を含む。疾患又は病態を「寛解」又は「緩和」することは、治療の不在下での程度又は時間経過と比べて、疾患、障害、又は病態の程度及び/若しくは望ましくない臨床症状が低減され、且つ/又は進行の時間経過が緩徐化若しくは延長されることを意味する。「治療」はまた、治療を受けていない場合、生存を想定される生存と比べて延長することを意味し得る。治療を必要とする者は、病態若しくは障害を既に有する者、並びに病態若しくは障害を有する傾向がある者又は病態若しくは障害が予防されるべきである者を含む。
RNA結合ドメイン
本明細書に記載のポリペプチドのRNA結合ドメインは、標的RNA配列に特異的に結合する。RNA結合ドメインは、複数のRNA塩基結合モチーフを含んでもよく、それらの各々は、RNA塩基に特異的に結合する能力があり、且つモチーフは、例えば標的RNA配列内の番号順のRNA塩基に結合するようにRNA結合ドメイン内で規則正しい。RNA結合モチーフは、Pumilio相同性ドメイン(PUM-HD)のRNA塩基結合リピートに対して相同性であるか又はそれに由来する配列に基づいてもよい(「PUM RNA結合モチーフ」)。実施形態では、PUM RNA結合モチーフは、PUM-HDのRNA塩基結合モチーフに対して、少なくとも80%(例えば、85%、87%、90%、92%、95%、97%、98%、99%又は100%)同一であり、特定のRNA塩基に対する結合特異性を有する。PUM RNA結合モチーフでは、標的RNA塩基に対する特異性は、核酸のワトソン・クリックエッジに結合する、水素結合又はファンデルワールス相互作用によって支配される、トポロジカルに等価なタンパク質表面上の保存された位置に基づいて改変される。これらのトポロジーは、グアニンを認識するため、1番目及び5番目の位置でグルタミン酸及びセリン;アデニンを認識するため、グルタミン及びシステイン/セリン;及びウラシルを認識するため、グルタミン及びアスパラギンを用いて、RNAに標的化される。かかるモジュラー単位、並びにRNA結合モチーフ及びドメインを設計し、作成する方法は、例えば、Lu et al.2009.Curr Opin Struct Biol.19(1):110-115;Adamala et al.2016.PNAS 113(19):E2579-E2588;及び米国特許出願公開第2016/0238593号明細書にて見出される。
実施形態では、RNA結合ドメインは、野生型PUM-HD、例えば野生型ヒトPUM1-HDの対応するアミノ酸配列に対して、少なくとも80%の同一性(例えば、少なくとも85%の同一性、少なくとも87%の同一性、少なくとも90%の同一性、少なくとも92%の同一性、少なくとも95%の同一性、少なくとも97%の同一性、少なくとも98%の同一性、又は99%の同一性)及び100%未満の同一性を有する。一例では、突然変異誘発について標的にするためのHsPUM1-HD RNA結合モチーフ及びそれに相関する認識されたヌクレオチドが表Aに示される(Wang et al.2002.Cell 110(4):501-12)。
Figure 2022513159000001
例えば、リピート7内のグアニン(G)でなくウラシル(U)に結合するため、例えば、Cheong and Tanaka.2006.PNAS vol.103,37:13635-9に記載の通り、アミノ酸残基変化:E1083Q、S1079N及びN1080Yが設けられる。
改変されたRNA結合ドメインは、標的RNA配列に結合するように設計される。典型的には、RNA結合ドメインは、2~50RNAヌクレオチド(例えば、2~50ヌクレオチド(例えば、2~50、2~40、2~30、2~25、2~24、2~23、2~22、2~21、2~20、2~19、2~18、2~17、2~16、2~15、2~14、2~13、2~12、2~11、2~10、2~9、2~8、5~50、5~40、5~30、5~25、5~24、5~23、5~22、5~21、5~20、5~19、5~18、5~17、5~16、5~15、5~14、5~13、5~12、5~11、5~10、5~9、5~8、10~50、10~40、10~30、10~25、10~24、10~23、10~22、10~21、10~20、10~19、10~18、10~17、10~16、10~15、10~14、10~13、10~12、10~11、15~50、15~40、15~30、15~25、15~24、15~23、15~22、15~21、15~20、15~19、15~18、15~17、15~16、16~50、16~40、16~30、16~25、16~24、16~23、16~22、16~21、16~20、16~19、16~18、16~17、17~50、17~40、17~30、17~25、17~24、17~23、17~22、17~21、17~20、17~19、17~18、18~50、18~40、18~30、18~25、18~24、18~23、18~22、18~21、18~20、18~19、19~50、19~40、19~30、19~25、19~24、19~23、19~22、19~21、19~20、20~50、20~40、20~30、20~25、20~24、20~23、20~22、20~21、21~50、21~40、21~30、21~25、21~24、21~23、21~22、25~50、25~40、25~30、30~50、30~40、又は40~50、3~20、3~15、3~10、3~9、3~8、4~12、4~10、4~9、4~8、5~10、5~9、5~8ヌクレオチド)の標的配列に結合する。いくつかの実施形態では、RNA結合ドメインは、16~21RNAヌクレオチドの標的配列に結合する。いくつかの実施形態では、RNA結合ドメインは、少なくとも16のRNAヌクレオチド(及び任意選択的には、30以下、29、28、27、26、25、24、23、22、又は21のRNAヌクレオチド)に結合する。複数のRNA塩基結合モチーフは、少なくとも3(例えば、少なくとも4、少なくとも5、少なくとも6、少なくとも7、少なくとも8、少なくとも9、2~20の間、2~15の間、2~10の間、2~8の間、3~20の間、3~15の間、3~10の間、3~8の間、4~8の間、最大25、最大30)のPUM RNA結合モチーフを含んでもよい。いくつかの実施形態では、RNA結合ドメインは、2~50、2~40、2~30、2~25、2~24、2~23、2~22、2~21、2~20、2~19、2~18、2~17、2~16、2~15、2~14、2~13、2~12、2~11、2~10、2~9、2~8、5~50、5~40、5~30、5~25、5~24、5~23、5~22、5~21、5~20、5~19、5~18、5~17、5~16、5~15、5~14、5~13、5~12、5~11、5~10、5~9、5~8、10~50、10~40、10~30、10~25、10~24、10~23、10~22、10~21、10~20、10~19、10~18、10~17、10~16、10~15、10~14、10~13、10~12、10~11、15~50、15~40、15~30、15~25、15~24、15~23、15~22、15~21、15~20、15~19、15~18、15~17、15~16、16~50、16~40、16~30、16~25、16~24、16~23、16~22、16~21、16~20、16~19、16~18、16~17、17~50、17~40、17~30、17~25、17~24、17~23、17~22、17~21、17~20、17~19、17~18、18~50、18~40、18~30、18~25、18~24、18~23、18~22、18~21、18~20、18~19、19~50、19~40、19~30、19~25、19~24、19~23、19~22、19~21、19~20、20~50、20~40、20~30、20~25、20~24、20~23、20~22、20~21、21~50、21~40、21~30、21~25、21~24、21~23、21~22、25~50、25~40、25~30、30~50、30~40、又は40~50のPUM RNA結合モチーフ、例えば、結合されたRNAヌクレオチドの数(例えば標的RNA配列の長さ)に対応するある数のPUM RNA結合モチーフを含む。
いくつかの実施形態では、RNA結合ドメインは、GluA2(例えばヒトGluA2)遺伝子によってコードされるmRNA内の標的RNA配列に結合する。いくつかの実施形態では、RNA結合ドメインは、ヒトGluA2遺伝子の1537~1552に対応するヌクレオチドを含む標的RNA配列、又は参照配列NM_000826内のヌクレオチド1537~1552の50塩基内の核酸配列に結合する。
いくつかの実施形態では、RNA結合ドメインは、SMN2(例えばヒトSMN2)遺伝子によってコードされるmRNA内の標的RNA配列に結合する。いくつかの実施形態では、RNA結合ドメインは、ヒトSMN2遺伝子の31,995~32,010に対応するヌクレオチドを含む標的RNA配列、又は参照配列NM-022876内のヌクレオチド31,995~32,010の50塩基内の核酸配列に結合する。
本明細書に記載のRNA結合ドメインは、90~500の間のアミノ酸残基、例えば、90~450の間のアミノ酸残基、90~400の間のアミノ酸残基、90~350の間のアミノ酸残基、90~300の間のアミノ酸残基、120~400の間のアミノ酸残基であってもよい。RNA結合ドメインは、RNA配列、例えばmRNA配列、例えば二次又は三次構造に折り畳まれたmRNA配列、例えば二本鎖RNA配列に結合してもよい。RNA結合ドメインは、RNA配列、例えばmRNA配列、例えば疾患関連突然変異、例えば点突然変異を含むmRNA配列に結合してもよい。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のPUM RNA結合モチーフは、シトシンに結合する。より詳細には、PUM RNA結合モチーフは、例えば米国特許第10233218B2号明細書(本明細書で参照により援用される)の方法により、シトシンに結合するように改変されてもよい。いくつかの実施形態では、RNA結合ドメインは、シトシンに結合する1以上のPUM RNA結合モチーフを含む。例えば、シトシンに結合するPUM RNA結合モチーフは、式X1011(式中、
はグルタミン(Q)であり、Xはヒスチジン(H)であり;Xはグリシン(G)であり;Xはグリシン(G)、アラニン(A)、セリン(S)、トレオニン(T)及びシステイン(C)を含む群から選択され;Xはアルギニン(R)であり;Xはフェニルアラニン(F)であり;Xはイソロイシン(I)であり;Xはアルギニン(R)であり;Xはロイシン(L)であり;X10はリジン(K)であり;且つX11はロイシン(L)であるか;又は
はバリン(V)であり;Xはフェニルアラニン(F)であり;Xはグリシン(G)であり;Xはグリシン(G)、アラニン(A)、セリン(S)、トレオニン(T)及びシステイン(C)を含む群から選択され;Xはチロシン(Y)であり;Xはバリン(V)であり;Xはイソロイシン(I)であり;Xはアルギニン(R)であり;Xはリジン(K)であり;X10はフェニルアラニン(F)であり;且つX11はフェニルアラニン(F)であるか;又は
はメチオニン(M)であり;Xはチロシン(Y)であり;Xはグリシン(G)であり;Xはグリシン(G)、アラニン(A)、セリン(S)、トレオニン(T)及びシステイン(C)を含む群から選択され;Xはアルギニン(R)であり;Xはバリン(V)であり;Xはイソロイシン(I)であり;Xはアルギニン(R)であり;Xはリジン(K)であり;X10はアラニン(A)であり;且つX11はロイシン(L)であるか;又は
はグルタミン(Q)であり;Xはアスパラギン(N)であり;Xはグリシン(G)であり;Xはグリシン(G)、アラニン(A)、セリン(S)、トレオニン(T)及びシステイン(C)を含む群から選択され;Xはヒスチジン(H)であり;Xはバリン(V)であり;Xはバリン(V)であり;Xはアルギニン(R)であり;Xはリジン(K)であり;X10はシステイン(C)であり;且つX11はイソロイシン(I)であるか;又は
はプロリン(P)であり;Xはチロシン(Y)であり;Xはグリシン(G)であり;Xはグリシン(G)、アラニン(A)、セリン(S)、トレオニン(T)及びシステイン(C)を含む群から選択され;Xはアルギニン(R)であり;Xはバリン(V)であり;Xはイソロイシン(I)であり;Xはアルギニン(R)であり;Xはアルギニン(R)であり;X10はイソロイシン(I)であり;且つX11はロイシン(L)であるか;又は
はグルタミン(Q)であり;Xはチロシン(Y)であり;Xはグリシン(G)であり;Xはグリシン(G)、アラニン(A)、セリン(S)、トレオニン(T)及びシステイン(C)を含む群から選択され;Xはチロシン(Y)であり;Xはバリン(V)であり;Xはイソロイシン(I)であり;Xはアルギニン(R)であり;Xはヒスチジン(H)であり;X10はバリン(V)であり;且つX11はロイシン(L)であるか;又は
はリジン(K)であり;Xはフェニルアラニン(F)であり;Xはアラニン(A)であり;Xはグリシン(G)、アラニン(A)、セリン(S)、トレオニン(T)及びシステイン(C)を含む群から選択され;Xはアスパラギン(N)であり;Xはバリン(V)であり;Xはバリン(V)であり;Xはアルギニン(R)であり;Xはリジン(K)であり;X10はシステイン(C)であり;且つX11はバリン(V)であるか;又は
はグルタミン(Q)であり;Xはチロシン(Y)であり;Xはアラニン(A)であり;Xはグリシン(G)、アラニン(A)、セリン(S)、トレオニン(T)及びシステイン(C)を含む群から選択され;Xはチロシン(Y)であり;Xはバリン(V)であり;Xはバリン(V)であり;Xはアルギニン(R)であり;Xはリジン(K)であり;X10はメチオニン(M)であり;且つX11はイソロイシン(I)である)
を有する配列を含んでもよい。
例えば、シトシンに結合するRNA結合モチーフは、アミノ酸配列QYGGYVIRHVL(配列番号100)を含んでもよい。いくつかの実施形態では、シトシンに結合するRNA結合モチーフを含むRNA結合ドメインは、アミノ酸配列:
Figure 2022513159000002
を含んでもよい。
例示的なRNA結合ドメイン
例えば複数のRNA結合モチーフ(例えば、PUM-HDに相同であるか又は由来する複数のPUM RNA結合モチーフ又は配列)を含む例示的なRNA結合ドメインは、配列番号13若しくは15~21のRNA結合ドメイン、又は配列番号4若しくは6~12によってコードされるものを含む。いくつかの実施形態では、RNA結合ドメインは、配列番号13若しくは15~21のRNA結合ドメインに対して、少なくとも80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、若しくは99%の同一性を有する(又はそれらと比較して、1、2、3、4、5、6、7、8、9、又は10以下の塩基改変を含む)か、又は配列番号4若しくは6~12のRNA結合ドメインをコードする配列に対して、少なくとも80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、若しくは99%の同一性を有する核酸配列によってコードされるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、RNA結合ドメインは、第1の例示的なRNA結合ドメインからの1以上のRNA結合モチーフ及び第2の例示的なRNA結合ドメインからの1以上のRNA結合モチーフを含む。
(G4S)3リンカーを伴う二重PUF設計(野生型PUF標的化配列)
mRNA配列:
Figure 2022513159000003
タンパク質配列:
Figure 2022513159000004
E488Q突然変異を有するADAR2DDのドメイン(アミノ酸299~701)
mRNA配列:
Figure 2022513159000005
タンパク質配列:
Figure 2022513159000006
ADAR2DDに融合された二重PUF設計の融合ポリペプチド(野生型PUF標的化配列)
mRNA配列:
Figure 2022513159000007
Figure 2022513159000008
タンパク質配列:
Figure 2022513159000009
ヒトGluA2(参照配列NM_000826)のヌクレオチド1537~1552のヌクレオチド配列(aucaugaucaagaagc(配列番号22))に対して標的化される(G4S)3リンカーを伴う二重PUF設計
mRNA配列:
Figure 2022513159000010
タンパク質配列:
Figure 2022513159000011
ADAR2DD(ヒトGluA2(参照配列NM_000826)のヌクレオチド1537~1552のヌクレオチド配列[aucaugaucaagaagc](配列番号22)に対して標的化されたPUF)に融合された二重PUF設計の融合ポリペプチド
mRNA配列:
Figure 2022513159000012
Figure 2022513159000013
タンパク質配列:
Figure 2022513159000014
ヒトSMN2(参照配列NM-022876)のヌクレオチド31,995~32,010のヌクレオチド配列(ACAGGGUUUUAGACAA(配列番号24))に対して標的化される(G4S)3リンカーを伴う二重PUF設計
mRNA配列:
Figure 2022513159000015
タンパク質配列:
Figure 2022513159000016
ADAR2DD(ヒトSMN2(参照配列NM-022876)のヌクレオチド31,995~32,010のヌクレオチド配列[ACAGGGUUUUAGACAA](配列番号25)に対して標的化されるPUF)に融合された二重PUF設計の融合ポリペプチド
mRNA配列:
Figure 2022513159000017
Figure 2022513159000018
タンパク質配列:
Figure 2022513159000019
スプライシングモジュレーターhTRA2-β1
mRNA配列(下線太字領域[BbsIカセット]内のPUF挿入部位(例えば欠失部位)):
Figure 2022513159000020
タンパク質配列(下線太字領域[BbsIカセット]内に挿入されたPUF):
Figure 2022513159000021
二重PUF設計によるhTRA2-β1の融合ポリペプチド
mRNA配列:
Figure 2022513159000022
タンパク質配列:
Figure 2022513159000023
RNAエフェクター
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のポリペプチドは、RNAエフェクターを含む。
いくつかの実施形態では、RNAエフェクターは、ヌクレアーゼ(例えば、エンドヌクレアーゼ及び/又はエキソヌクレアーゼ)活性を含まない。いくつかの実施形態では、RNAエフェクターは、ヌクレアーゼ(例えば、エンドヌクレアーゼ及び/又はエキソヌクレアーゼ)を含まない。いくつかの実施形態では、RNAエフェクターは、ヌクレアーゼ又はその機能断片を含まない。いくつかの実施形態では、RNAエフェクターは、リン酸ジエステル結合を破壊しない。
RNAエフェクターのさらなる例が、スプライシングモジュレーター、例えばスプライシング因子である。スプライシングモジュレーターは、細胞スプライシング機構の1以上の成分を動員する薬剤を含み得る。スプライシングモジュレーターはまた、細胞スプライシング機構の1以上の成分の(例えば、標的RNA配列又は標的RNA配列を含むRNAへの)結合を阻害又は遮断する薬剤を包含し得る。いくつかの実施形態では、スプライシング因子は、細胞スプライシング機構の天然に存在する成分又はその機能断片若しくは変異体を含む。いくつかの実施形態では、スプライシング因子は、細胞スプライシング機構の組換え及び/若しくは合成成分又はその機能断片若しくは変異体を含む。いくつかの実施形態では、スプライシングモジュレーター(例えばスプライシング因子)は、Sam68、hnRNP G、SRSF1、hnRNP A1/A2、TDP-43、SRp-30c、PSF、又はhnRNP Mを含む。
いくつかの実施形態では、RNAエフェクターは、例えば下記の通り、RNA編集ドメインを含む。
RNA編集ドメイン
本明細書に記載の特定のポリペプチドは、RNA編集ドメインを含む。
いくつかの実施形態では、RNA編集ドメインは、RNAにおける置換を生成する。
いくつかの実施形態では、RNA編集ドメインは、RNAにおける挿入又は欠失を生成する。いくつかの実施形態では、RNA編集ドメインは、RNAにおける5未満、4、3、2、又は1のヌクレオチドの挿入を生成する。いくつかの実施形態では、RNA編集ドメインは、RNAにおける5未満、4、3、2、又は1のヌクレオチドの欠失を生成する。いくつかの実施形態では、RNA編集ドメインは、(a)リン酸ジエステル結合を破壊し、RNAの第1部分とRNAの第2部分とを生成し、(b)任意選択的には第1又は第2部分からヌクレオチドを付加又は除去し、且つ(c)第1部分を第2部分と再結合する。いくつかの実施形態では、このRNA編集は、RNAにおける1以上のヌクレオチドの挿入、欠失、又は置換をもたらす。挿入及び欠失を生成するためのRNA編集は、例えば、Benne “RNA editing in trypanosomes” European Journal of Biochemistry 221:1(1994)pages9-23(その全体が参照により本明細書中に援用される)に記載されている。
いくつかの実施形態では、RNA編集ドメインは、標的RNA配列、その機能断片若しくは変異体(例えば、シチジン又はアデノシンデアミナーゼの機能断片又は変異体)の1以上の塩基を編集する酵素の触媒ドメインを含む。RNA編集ドメインは、RNAデアミナーゼ、例えば、アデノシンデアミナーゼ、シチジンデアミナーゼの触媒ドメインを含むポリペプチド配列であってもよい。例えば、RNA編集ドメインは、RNA上で作用するアデノシンデアミナーゼ(ADAR)(例えば、ヒトADARl、ヒトADAR2、ヒトADAR3、又はヒトADAR4);tRNA上で作用するアデノシンデアミナーゼ(ADAT);RNA上で作用するシトシンデアミナーゼ(CDAR)の触媒ドメインである。実施形態では、デアミナーゼの触媒ドメインは、表B中の同定されたジェンバンク受入番号を有する配列に対して、少なくとも80%同一(例えば、少なくとも85%、87%、90%、92%、95%、98%、99%、100%同一)である配列を含む。実施形態では、デアミナーゼの触媒ドメインは、表B中に示される触媒コアドメイン配列に対して、少なくとも80%同一(例えば、少なくとも85%、87%、90%、92%、95%、98%、99%、100%同一)である配列を含む。
Figure 2022513159000024
いくつかの実施形態では、RNA編集ドメインは、一本鎖RNA(ssRNA)を標的にするデアミナーゼを含む。いくつかの実施形態では、RNA編集ドメインは、二本鎖RNA(dsRNA)を標的にするデアミナーゼを含む。理論によって拘束されることを望まないが、mRNAが典型的には一本鎖RNAであるが、mRNAは、dsRNAを標的にするデアミナーゼによって編集されてもよいdsRNAを形成する二次構成要素を含んでもよい。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組成物は、標的RNA配列に対する相補性を有し、且つ標的RNA配列にハイブリダイズする能力がある核酸(例えばアンチセンスオリゴヌクレオチド)をさらに含んでもよい。理論によって拘束されることを望まないが、dsRNAは標的RNA配列に対する相補性を有する核酸、例えばアンチセンスオリゴヌクレオチドによって形成され、標的RNA配列は、例えばdsRNAを形成するmRNA二次構造の不在下で、dsRNAを標的にするデアミナーゼによって標的化されることを許容してもよい。いくつかの実施形態では、標的RNA配列に対する相補性を有する核酸は、DNAを含む。いくつかの実施形態では、標的RNA配列に対する相補性を有する核酸は、RNAを含む。いくつかの実施形態では、標的RNA配列に対する相補性を有する核酸は、1以上の修飾又は合成ヌクレオチドを含む。
標的RNA配列、例えばGluA2 mRNA又はSMN2 mRNAに対する相補性を有する例示的な核酸(例えばアンチセンスオリゴヌクレオチド)として、限定はされないが、配列番号26~29が挙げられる。
GLUA2に対する70ntの標的化配列
mRNA配列(太字/下線で修飾される残基):
Figure 2022513159000025
SMN2に対する66ntの標的化配列(太字/下線におけるPUF標的化):
Figure 2022513159000026
GLUA2に対するアンチセンスオリゴヌクレオチド標的化配列
Figure 2022513159000027
SMN2に対するアンチセンスオリゴヌクレオチド標的化配列
5’-TCACTTTCATAATGCTGG-3’(配列番号29)
例示的なRNA編集ドメインとして、限定はされないが、配列番号14~21の、又は配列番号5~12によってコードされる、RNA編集ドメインが挙げられる。いくつかの実施形態では、RNA編集ドメインは、配列番号14~21のRNA編集ドメインに対して、少なくとも80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、若しくは99%の同一性を有する(又はそれらと比較して1、2、3、4、5、6、7、8、9、若しくは10以下の変更を含む)か、又は配列番号5~12のRNA編集ドメインのコード配列に対して、少なくとも80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、若しくは99%の同一性を有する核酸配列によってコードされるアミノ酸配列を含む。
リンカー
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のポリペプチドは、1以上のリンカーを含んでもよい。いくつかの実施形態では、RNA結合ドメイン内のRNA塩基結合モチーフは、リンカーによって連結される。いくつかの実施形態では、RNBA結合ドメイン及びRNA編集ドメインは、それらの間にリンカーを有する。リンカーは、化学結合、例えば1以上の共有結合又は非共有結合であってもよい。いくつかの実施形態では、結合は共有結合である。いくつかの実施形態では、結合は非共有結合である。いくつかの実施形態では、リンカーは、ペプチドリンカーである。かかるリンカーは、2~30の間、又はそれ以上のアミノ酸であってもよい。いくつかの実施形態では、例えば二次及び三次構造の分子柔軟性をもたらすため、又はドメイン若しくはモチーフが機能する(例えば標的に結合する)ために分離する一方で、立体障害を最小化することを可能にするため、リンカーが使用される。リンカーは、本明細書に記載のフレキシブル、リジッド、及び/又は切断可能リンカーを含んでもよい。いくつかの実施形態では、柔軟性をもたらすため、リンカーは、少なくとも1つのグリシン、アラニン、及びセリンアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、リンカーは、例えば負に帯電したスルホン酸基、ポリエチレングリコール(PEG)基、又はピロリン酸ジエステル基を含む、疎水性リンカーである。いくつかの実施形態では、リンカーは、ある部分(例えばドメイン)を別の部分から選択的に放出するために切断可能であるが、未成熟切断を阻止するために十分に安定である。
一般に使用されるフレキシブルリンカーは、主にGly及びSer残基のストレッチからなる配列(「GS」リンカー)を有する。フレキシブルリンカーは、ある程度の運動又は相互作用を必要とするドメインを連結するのに有用であってもよく、小さい非極性(例えばGly)又は極性(例えば、Ser又はThr)アミノ酸を含んでもよい。さらに、Ser又はThrを包含することで、水分子と水素結合を形成することにより、水溶液中でのリンカーの安定性が維持され得、ひいてはリンカーとタンパク質部分との間の好ましくない相互作用が低減され得る。
リジッドリンカーは、ドメイン間の固定距離を保持し、それらの独立した機能を維持するために有用である。リジッドリンカーはまた、融合における1以上の成分の安定性又は生物活性を保存するのにドメインの空間的分離がクリティカルであるとき、有用であってもよい。リジッドリンカーは、αヘリックス構造又はProリッチ配列(XP)n(ここでXは、任意のアミノ酸、好ましくはAla、Lys、又はGluを指す)を有してもよい。
切断可能リンカーは、遊離機能ドメインをインビボで放出してもよい。いくつかの実施形態では、リンカーは、還元試薬又はプロテアーゼの存在などの特定条件下で切断されてもよい。インビボでの切断可能リンカーでは、ジスルフィド結合の可逆性が利用されてもよい。一例として、2つのCys残基間のトロンビン感受性配列(例えばPRS)が挙げられる。CPRSCのインビトロでのトロンビン処理により、トロンビン感受性配列の切断がもたらされる一方で、可逆的ジスルフィド結合は、未変化のままである。かかるリンカーは、公知であり、例えば、Chen et al.2013.Fusion Protein Linkers:Property,Design and Functionality.Adv Drug Deliv Rev.65(10):1357-1369に記載されている。融合中でのリンカーのインビボ切断はまた、特定の細胞若しくは組織内、特定条件下、インビボで発現される、又は特定の細胞区画内に制限されるプロテアーゼにより実施されてもよい。多数のプロテアーゼの特異性により、制限された区画内でのリンカーのより緩徐な切断がもたらされる。
連結分子の例として、疎水性リンカー、例えば負に帯電したスルホン酸基;脂質、例えばポリ(--CH--)炭化水素鎖、例えば、ポリエチレングリコール(PEG)基、その不飽和変異体、そのヒドロキシル化変異体、そのアミド化若しくはそれ以外のN含有変異体、非炭素リンカー;炭水化物リンカー;リン酸ジエステルリンカー、又は破壊剤の2以上の成分(例えば2つのポリペプチド)に共有結合する能力がある他の分子が挙げられる。非共有結合リンカーも含まれ、例えばポリペプチドの疎水性領域又はポリペプチドの疎水性延長部、例えばロイシン、イソロイシン、バリン、又はおそらくはさらにアラニン、フェニルアラニン、又はさらにチロシン、メチオニン、グリシン又は他の疎水性残基が豊富に存在する一連の残基を通じてポリペプチドが連結される疎水性脂質小球などが挙げられる。破壊剤の成分が電荷に基づく化学を用いて連結されてもよいことで、破壊剤の正に帯電した成分が負に帯電した別の成分又は核酸に連結される。
組成物を作成する方法
組換えタンパク質又はポリペプチド(例えば本明細書に記載のポリペプチド)を作成する方法は、当該技術分野ではルーチン的である。一般に、Smales&James(Eds.),Therapeutic Proteins:Methods and Protocols(Methods in Molecular Biology),Humana Press(2005);and Crommelin,Sindelar&Meibohm(Eds.),Pharmaceutical Biotechnology:Fundamentals and Applications,Springer(2013)を参照されたし。
本開示の組成物のタンパク質又はポリペプチドは、例えば標準の固相技術を利用することにより、生化学的に合成可能である。かかる方法は、排他的固相合成、部分的固相合成法、断片縮合、古典的溶液合成を含む。これらの方法は、ペプチドが比較的短い(即ち10kDa)とき、且つ/又はそれが組換え技術により生成できず(例えば核酸配列によってコードされない)、ひいては異なる化学に関わるとき、用いることができる。固相合成手順は、当該技術分野で周知であり、さらに、John Morrow Stewart and Janis Dillaha Young,Solid Phase Peptide Syntheses,2nd Ed.,Pierce Chemical Company,1984;及びCoin,I.,et al.,Nature Protocols,2:3247-3256,2007によって記載されている。
より長いポリペプチドの場合、組換え方法が用いられてもよい。組換え治療用ポリペプチドを作成する方法は、当該技術分野ではルーチン的である。一般に、Smales&James (Eds.),Therapeutic Proteins:Methods and Protocols(Methods in Molecular Biology),Humana Press(2005);及びCrommelin,Sindelar&Meibohm(Eds.),Pharmaceutical Biotechnology:Fundamentals and Applications,Springer(2013)を参照されたし。治療用の医薬タンパク質又はポリペプチドを作成するための例示的方法は、哺乳動物細胞における発現を含むが、組換えタンパク質は、昆虫細胞、酵母、細菌、又は他の細胞を適切なプロモーターの制御下で使用しても生成することができる。哺乳動物発現ベクターは、複製起点などの非転写配列、好適なプロモーター、並びに他の5’又は3’隣接非転写配列、並びに5’又は3’非翻訳配列、例えば、必要なリボソーム結合部位、ポリアデニル化部位、スプライスドナー及びアクセプター部位、及び終結配列を含んでもよい。異種DNA配列の発現に必要とされる他の遺伝要素を提供するため、SV40ウイルスゲノム由来のDNA配列、例えばSV40起点、初期プロモーター、スプライス、及びポリアデニル化部位が使用されてもよい。細菌、真菌、酵母、及び哺乳動物細胞宿主での使用に適したクローニング及び発現ベクターは、Green&Sambrook,Molecular Cloning:A Laboratory Manual(Fourth Edition),Cold Spring Harbor Laboratory Press(2012)に記載されている。
大量のポリペプチドが所望される場合、例えば、Brian Bray,Nature Reviews Drug Discovery,2:587-593,2003;及びWeissbach&Weissbach,1988,Methods for Plant Molecular Biology,Academic Press,NY,Section VIII,pp421-463によって記載される技術を用いて、それは作成可能である。組換えタンパク質を発現させ、作成するため、様々な哺乳動物細胞培養系を利用することができる。哺乳動物発現系の例として、CHO細胞、COS細胞、HeLA及びBHK細胞株が挙げられる。タンパク質治療薬を作成するための宿主細胞培養方法は、Zhou and Kantardjieff(Eds.),Mammalian Cell Cultures for Biologics Manufacturing(Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology),Springer(2014)に記載されている。本明細書に記載の組成物は、組換えタンパク質をコードするベクター、例えばウイルスベクター、例えばレンチウイルスベクターを含んでもよい。いくつかの実施形態では、ベクター、例えばウイルスベクターは、組換えタンパク質をコードする核酸を含んでもよい。ウイルス及びバクテリオファージ発現ベクターは、伝統的な遺伝子操作により作成される。分裂及び非分裂細胞への遺伝子導入の場合、ウイルス発現ベクターは、レンチウイルス又はアデノウイルス(AAV)を含んでもよい。中枢神経系(CNS)への遺伝子導入の場合、AAVベクター又はM13バクテリオファージベクターのいずれかが使用されてもよい。
タンパク質治療薬の精製については、Franks,Protein Biotechnology:Isolation,Characterization,and Stabilization,Humana Press(2013);及びCutler,Protein Purification Protocols(Methods in Molecular Biology),Humana Press(2010)に記載されている。
本明細書に記載のような核酸又は本明細書に記載のタンパク質をコードする核酸は、ベクター中に組み込まれてもよい。ベクター、例えばレンチウイルスなどのレトロウイルス由来のものは、導入遺伝子の長期の安定な組込み及び娘細胞におけるその増殖を可能にすることから、長期遺伝子導入を達成するために好適なツールである。ベクターの例として、発現ベクター、複製ベクター、プローブ生成ベクター、及び配列決定ベクターが挙げられる。発現ベクターは、ウイルスベクターの形態で細胞に提供されてもよい。ウイルスベクター技術は、当該技術分野で周知であり、種々のウイルス学及び分子生物学のマニュアルに説明されている。ベクターとして有用であるウイルスとして、限定はされないが、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、及びレンチウイルスが挙げられる。一般に、好適なベクターは、少なくとも1つの生物において機能的な複製起点、プロモーター配列、便宜的な制限エンドヌクレアーゼ部位、及び1以上の選択可能マーカーを有する。
天然又は合成核酸の発現は、典型的には目的の遺伝子をコードする核酸をプロモーターに作動可能に連結し、構築物を発現ベクターに組み込むことにより達成される。ベクターは、真核生物における複製及び組み込みに適し得る。典型的なクローニングベクターは、所望される核酸配列の発現にとって有用な転写及び翻訳ターミネーター、開始配列、並びにプロモーターを有する。
追加的なプロモーター領域、例えば増強配列は、転写開始の頻度を調節してもよい。典型的には、これらの配列は転写開始部位の30~110bp上流の領域内に位置するが、近年、いくつかのプロモーターが同様に転写開始部位の下流に機能的要素を有することが示されている。プロモーター領域間のスペーシングはフレキシブルであることが多いことから、プロモーター機能は、領域が互いに対して反転又は移動されるとき、保存される。チミジンキナーゼ(tk)プロモーターでは、プロモーター領域間のスペーシングは、活性が低下し始める前に50bp離れるまで増加し得る。プロモーターに応じて、転写を活性化するため、各領域が協同的又は非依存的に機能し得るように思われる。
好適なプロモーターの一例が、最初期サイトメガロウイルス(CMV)プロモーター配列である。このプロモーター配列は、それに作動可能に連結された任意のポリヌクレオチド配列の発現を高レベルで駆動する能力がある強力な構成的プロモーター配列である。いくつかの実施形態では、好適なプロモーターが伸長成長因子-1α(EF-1α)である。しかし、他の構成的プロモーター配列、例えば限定はされないが、サルウイルス40(SV40)初期プロモーター、マウス乳腺腫瘍ウイルス(MMTV)、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)長末端リピート(LTR)プロモーター、MoMuLVプロモーター、トリ白血病ウイルスプロモーター、エプスタイン・バーウイルス最初期プロモーター、ラウス肉腫ウイルスプロモーター、並びにヒト遺伝子プロモーター、例えば限定はされないが、アクチンプロモーター、ミオシンプロモーター、ヘモグロビンプロモーター、及びクレアチンキナーゼプロモーターも使用されてもよい。
本開示は、任意の特定のプロモーター又はプロモーターのカテゴリー(例えば構成的プロモーター)の使用に限定されるように解釈されるべきではない。例えば、いくつかの実施形態では、誘導性プロモーターが本開示の一部として検討される。いくつかの実施形態では、誘導性プロモーターの使用により、それが作動可能に連結される対象のポリヌクレオチド配列の発現を、かかる発現が所望されるときに活性化する能力がある分子スイッチが提供される。いくつかの実施形態では、誘導性プロモーターの使用により、発現を、所望されないときに不活性化する能力がある分子スイッチが提供される。誘導性プロモーターの例として、限定はされないが、メタロチオニンプロモーター、グルココルチコイドプロモーター、プロゲステロンプロモーター、及びテトラサイクリンプロモーターが挙げられる。
いくつかの実施形態では、導入されるべき発現ベクターはまた、ウイルスベクターを介してトランスフェクト又は感染されることが探求された細胞の集団から細胞を発現する同定及び選択を促進するため、選択可能マーカー遺伝子若しくはレポーター遺伝子のいずれか又は双方を有し得る。いくつかの態様では、選択可能マーカーは、DNAの分離片に対して実施され、同時トランスフェクション法において使用されてもよい。宿主細胞内での発現を可能にするため、選択可能マーカーとレポーター遺伝子の双方は、適切な発現調節配列と隣接されてもよい。有用な選択可能マーカーは、例えば抗生物質耐性遺伝子、例えばneoなどを含んでもよい。
いくつかの実施形態では、潜在的にトランスフェクトされた細胞を同定するため、且つ/又は発現調節配列の機能性を評価するため、レポーター遺伝子が使用されてもよい。一般に、レポーター遺伝子は、(レポーター遺伝子の)レシピエント供給源中に存在しないか又はそれによって発現され、且ついくつかの容易に検出可能な特性、例えば酵素活性又は可視化可能な蛍光により発現が明らかにされるようなポリペプチドをコードする遺伝子である。レポーター遺伝子の発現は、DNAがレシピエント細胞に導入されてからの好適な時点でアッセイされる。好適なレポーター遺伝子は、ルシフェラーゼ、βガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、分泌されたアルカリホスファターゼをコードする遺伝子、又は緑色蛍光タンパク質遺伝子(例えば、Ui-Tei et al.,2000 FEBS Letters 479:79-82)を含んでもよい。好適な発現系は、周知であり、公知の技術を用いて調製されるか又は商業的に得られてもよい。一般に、レポーター遺伝子の最高レベルでの発現を示す最小の5’隣接領域を有する構築物は、プロモーターとして同定される。かかるプロモーター領域は、レポーター遺伝子に連結され、薬剤のプロモーター駆動転写を調節する能力について評価するため、使用されてもよい。
適用
RNA編集組成物(例えば、本明細書に記載のポリペプチド、核酸、ベクター及び宿主細胞)は、例えば、細胞、組織又は対象におけるRNA中の機能欠失変異(例えば1以上の点突然変異)を修正することにより、治療的ニーズに対処し得る。例えば、遺伝子中の突然変異、例えば1以上の点突然変異に関連する疾患を治療するため、RNA編集組成物(例えば、本明細書に記載のポリペプチド、核酸、ベクター及び宿主細胞)が使用されてもよい。
本明細書に記載の組成物(例えば、本明細書に記載のポリペプチド、核酸、ベクター及び宿主細胞)は、疾患又は状態を治療するため、使用されてもよい。いくつかの実施形態では、疾患は、マイヤー・ゴーリン症候群、ゼッケル症候群4、ジュベール症候群5、レーバー先天黒内障10;シャルコー・マリー・トゥース病、2型;シャルコー・マリー・トゥース病、2型;アッシャー症候群、2C型;脊髄小脳失調28;脊髄小脳失調28;脊髄小脳失調28;QT延長症候群2;シェーグレン・ラルソン症候群;遺伝性フルクトース尿症;遺伝性フルクトース尿症;神経芽細胞腫;神経芽細胞腫;カルマン症候群1;カルマン症候群1;カルマン症候群1;異調染色性白血球栄養症、レット症候群、筋萎縮性側索硬化症タイプ10、リー・フラウメニ症候群、嚢胞性線維症、ハーラー症候群、α-1-アンチトリプシン(A1AT)欠乏、パーキンソン病、アルツハイマー病、白化現象、筋萎縮性側索硬化症、喘息、b-サラセミア、カダシル症候群、シャルコー・マリー・トゥース病、慢性閉塞性肺疾患(COPD)、遠位脊髄性筋萎縮(DSMA)、デュシェンヌ型/ベッカー型筋ジストロフィー、栄養障害型表皮水疱症、表皮水疱症、ファブリー病、第V因子ライデン関連障害、家族性腺腫性ポリポーシス、ガラクトース血症、ゴーシェ病、グルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼ、血友病、遺伝性ヘマトクロマトーシス(Hereditary Hematochromatosis)、ハンター症候群、ハンチントン病、炎症性腸疾患(IBD)、遺伝性多凝集反応症候群、レーバー先天黒内障、レッシュ・ナイハン症候群、リンチ症候群、マルファン症候群、ムコ多糖症、筋ジストロフィー、筋緊張性ジストロフィーI型及びII型、神経線維腫症、ニーマン・ピック病A型、B型及びC型、NY-eso1関連がん、ポイツ・ジェガース症候群、フェニルケトン尿症、ポンペ病、原発性毛様体病(Primary Ciliary Disease)、プロトロンビン変異関連障害、例えばプロトロンビンG20210A突然変異、肺高血圧症、網膜色素変性症、サンドホフ病、重症複合免疫不全症候群(SCID)、鎌状赤血球貧血、脊髄性筋萎縮、シュタルガルト病、テイ・サックス病、アッシャー症候群、X連鎖性免疫不全、スタージ・ウェーバー症候群、及びがんから選択される。いくつかの実施形態では、本開示は、本明細書中に列挙される疾患又は障害から選択から選択される疾患又は障害(例えば遺伝性障害)を治療又は予防するための薬剤の製造における本明細書に記載の組成物(例えば、本明細書に記載のポリペプチド、核酸、ベクター、又は宿主細胞)の使用を対象とする。
製剤化、投与及び送達
様々な実施形態では、本開示は、薬学的に許容できる賦形剤とともに製剤化された、本明細書に記載のポリペプチド、核酸、ベクター及び宿主細胞の医薬組成物を提供する。薬学的に許容できる賦形剤は、一般に安全、非毒性で望ましい医薬組成物を調製するのに有用な賦形剤を含み、且つ動物使用とともにヒト医薬品使用にとって許容できる賦形剤を含む。かかる賦形剤は、水性であっても又は非水性であってもよい。適切な賦形剤は、組成物の、例えば、安定性、溶解度、緩衝化に寄与してもよい。タンパク質治療薬の製剤化は、Meyer(Ed.),Therapeutic Protein Drug Products:Practical Approaches to formulation in the Laboratory,Manufacturing,and the Clinic,Woodhead Publishing Series(2012)に記載されている。
本開示に従う医薬組成物は、治療有効量で送達されてもよい。正確な治療有効量は、対象に対して所望される治療効果を有する、組成物、例えば本明細書に記載のポリペプチド、核酸、ベクター及び宿主細胞の量である。この量は、限定はされないが、(活性、薬物動態、薬力学、及び生物学的利用率を含む)治療化合物の特徴、(年齢、性別、疾患タイプ及びステージ、全身健康状態、所与の用量に対する応答性、及び処方のタイプを含む)対象の生理的状態、製剤中の薬学的に許容できる1以上の担体の性質、及び/又は投与経路を含む種々の要素に応じて変化することになる。対象への投与様式は、全身、非経口、経腸又は局所を含んでもよい。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のポリペプチド又は核酸組成物は、ベクターを用いて、細胞、組織又は対象に送達されてもよい。ベクターは、例えばプラスミド又はウイルスであってもよい。いくつかの実施形態では、送達は、インビボ、インビトロ、エクスビボ、又はインサイチュである。いくつかの実施形態では、ウイルスは、アデノ随伴ウイルス(AAV)、レンチウイルス、アデノウイルスである。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のポリペプチド又は核酸組成物は、ウイルス様粒子又はビロソームとともに細胞に送達される。いくつかの実施形態では、送達では、2以上のウイルス、ウイルス様粒子又はビロソームが使用される。
リポソーム製剤
本明細書に記載のポリペプチド、医薬組成物、核酸、ベクター、組成物、又は宿主細胞の送達用の媒体又は担体として好適な例示的製剤は、マイクロエマルション、単層、ミセル、二重層、小胞又は脂質粒子を含む。これらの製剤は、本明細書に記載のポリペプチド、医薬組成物、核酸、ベクター、組成物、又は宿主細胞における生体適合性及び生分解性送達系を提供する。
リポソームは、球状の1以上の二重層内に配置された両親媒性脂質からなる、脂質粒子の一例を提供する。リポソームは、親油性材料及び水性内部から形成された膜を有する単層又は多重層小胞である。水性部分は、送達される対象の、本明細書に記載のポリペプチド、医薬組成物、核酸、ベクター、組成物、又は宿主細胞を含む。カチオン性リポソームは、細胞壁に融合可能であるという利点を有する。非カチオン性リポソームは、細胞壁と効率的には融合可能でないが、インビボでマクロファージにより取り込まれる。
リポソームは、小さい直径;生体適合性及び生分解性;広範囲の内容物、例えば水及び脂質可溶性薬剤を組み込む能力を含む、いくつかの利点を有する。リポソームは、それらの内部区画内のカプセル封入剤を代謝及び分解から保護し得る(Rosoff,in Pharmaceutical Dosage Forms,Lieberman,Rieger and Banker(Eds.),1988,Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.,volume 1,p.245)。リポソーム製剤の調製における重要な検討対象が、リポソームの脂質表面電荷、小胞サイズ及び水性体積である。
リポソームは、2つの広範なクラスに属する。カチオン性リポソームは、安定な複合体を形成するため、負に帯電したDNA分子と相互作用する正に帯電したリポソームである。正に帯電したDNA/リポソーム複合体は、負に帯電した細胞表面に結合し、エンドソーム内に内部移行される。エンドソーム内の酸性pHに起因し、リポソームは、破裂され、それらの内容物を細胞質内に放出する(Wang et al.,Biochem.Biophys.Res.Commun.,1987,147,980-985)。
pH感受性であるか又は負に帯電したリポソームは、DNAを有する複合体ではなくDNAを捕捉する。DNAと脂質の双方が同様に帯電されるため、複合体形成ではなく反発が生じる。にもかかわらず、一部のDNAがこれらのリポソームの水性内部内に捕捉される。チミジンキナーゼ遺伝子をコードするDNAを培養下の細胞単層に送達するため、pH感受性リポソームが使用されている。外因性遺伝子の発現が標的細胞内で検出された(Zhou et al.,Journal of Controlled Release,1992,19,269-274)。
リポソーム組成物の1つの主要タイプは、天然由来ホスファチジルコリン以外のリン脂質を含む。例えば、中性リポソーム組成物は、ジミリストイルホスファチジルコリン(DMPC)又はジパルミトイルホスファチジルコリン(DPPC)から形成され得る。アニオン性リポソーム組成物は、一般にジミリストイルホスファチジルグリセロールから形成される一方で、アニオン性膜融合リポソームは、主にジオレオイルホスファチジルエタノールアミン(DOPE)から形成される。リポソーム組成物の別のタイプは、ホスファチジルコリン(PC)、例えば、大豆PC、及び卵PCなどから形成される。別のタイプは、リン脂質及び/又はホスファチジルコリン及び/又はコレステロールの混合物から形成される。
薬剤の皮膚への送達に適した例示的な非イオン性リポソーム系は、非イオン性界面活性剤及びコレステロールを含む系を含む。シクロスポリンAをマウス皮膚の真皮内に送達するため、Novasome(商標)I(ジラウリン酸グリセリル/コレステロール/ポリオキシエチレン-10-ステアリルエーテル)及びNovasome(商標)II(ジステアリン酸グリセリル/コレステロール/ポリオキシエチレン-10-ステアリルエーテル)を含む非イオン性リポソーム製剤が使用された。結果によると、かかる非イオン性リポソーム系が、シクロスポリンAの皮膚の異なる層への沈着を促進する場合に有効であることが示された(Hu et al.S.T.P.Pharma.Sci.,1994,4,6,466)。
リポソームは、1以上の特定化された脂質であって、リポソームに組み込まれるとき、かかる特定化された脂質が欠如しているリポソームと比べて増強された循環寿命をもたらすものを含むように、立体的に安定化され得る。立体的に安定化されたリポソームの例が、リポソームの小胞形成脂質部分の一部が、(A)1以上の糖脂質、例えばモノシアロガングリオシドGM1を含むか、又は(B)1以上の親水性ポリマー、例えばポリエチレングリコール(PEG)部分で誘導体化される場合のものである(Allen et al.,FEBS Letters,1987,223,42;Wu et al.,Cancer Research,1993,53,3765)。長期循環、例えばステルスリポソームも利用することができる。かかるリポソームは、一般に米国特許第5,013,556号明細書に記載されている。本明細書で開示される化合物は、例えば、米国特許第3,845,770号明細書;米国特許第3,916,899号明細書;米国特許第3,536,809号明細書;米国特許第3,598,123号明細書;及び米国特許第4,008,719号明細書に記載の徐放手段及び/又は送達装置によっても投与することができる。
1以上の糖脂質を含む様々なリポソームは、当該技術分野で公知である。Papahadjopoulos et al.(Ann.N.Y.Acad.Sci.,1987,507,64)は、モノシアロガングリオシドGM1、硫酸ガラクトセレブロシド及びホスファチジルイノシトールがリポソームの血液半減期を改善する能力を報告した。これらの知見は、Gabizon et al.(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,1988,85,6949)により詳説された。米国特許第4,837,028号明細書及び国際公開第88/04924号パンフレット(双方ともにAllenらに交付)は、(1)スフィンゴミエリン及び(2)ガングリオシドGM1又はガラクトセレブロシド硫酸エステルを含むリポソームを開示している。米国特許第5,543,152号明細書(Webbら)は、スフィンゴミエリンを含むリポソームを開示している。1,2-sn-ジミリストイルホスファチジルコリンを含むリポソームは、国際公開第97/13499号パンフレット(Limら)で開示されている。
脂質を含むリポソームは、1以上の親水性ポリマーで誘導体化され得、その調製方法は、当該技術分野で公知である。Sunamoto et al.(Bull.Chem.Soc.Jpn.,1980,53,2778)では、PEG部分を含有する非イオン性清浄剤2C1215Gを含むリポソームが記載された。Illum et al.(FEBS Lett.,1984,167,79)では、ポリスチレン粒子の高分子グリコールでの親水性コーティングにより、有意に増加した血液半減期が得られることが記載された。ポリアルキレングリコール(例えばPEG)のカルボキシ基の結合により修飾された合成リン脂質は、Searsによって記載されている(米国特許第4,426,330号明細書及び米国特許第4,534,899号明細書)。Klibanov et al.(FEBS Lett.,1990,268,235)では、PEG又はステアリン酸PEGで誘導体化されたホスファチジルエタノールアミン(PE)を含むリポソームが血液循環半減期における有意な増加を有することを示す実験が記載された。Blume et al.(Biochimica et Biophysica Acta,1990,1029,91)では、かかる観察結果が、ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン(DSPE)及びPEGの組み合わせから形成された、他のPEGで誘導体化されたリン脂質、例えばDSPE-PEGに拡張された。外部表面上に共有結合的に結合されたPEG部分を有するリポソームは、欧州特許第0445131B1号明細書及び国際公開第90/04384号パンフレット(Fisherに交付)に記載されている。PEGで誘導体化されたPEを1~20モル百分率で含有するリポソーム組成物、及びその使用方法は、Woodleら(米国特許第5,013,556号明細書及び米国特許第5,356,633号明細書)及びMartinら(米国特許第5,213,804号明細書及び欧州特許第0496813B1号明細書)によって記載されている。いくつかの他の脂質-ポリマーコンジュゲートを含むリポソームは、国際公開第91/05545号パンフレット及び米国特許第5,225,212号明細書(双方ともMartinらに交付)並びに国際公開第94/20073号パンフレット(Zalipskyら)に開示されている。PEG修飾セラミド脂質を含むリポソームは、国際公開第96/10391号パンフレット(Choiら)に記載されている。米国特許第5,540,935号明細書(Miyazakiら)及び米国特許第5,556,948号明細書(Tagawaら)は、表面上の機能的部分でさらに誘導体化され得るPEG含有リポソームについて記載している。
核酸を含むいくつかのリポソームは、当該技術分野で公知である。Thierryらに交付された国際公開第96/40062号パンフレットは、リポソーム中に高分子量の核酸をカプセル封入するための方法を開示している。Tagawaらに交付された米国特許第5,264,221号明細書は、タンパク質結合リポソームについて開示している。Rahmanらに交付された米国特許第5,665,710号明細書は、リポソーム中にオリゴデオキシヌクレオチドをカプセル封入する特定の方法を記載している。
界面活性剤では、乳剤(マイクロエマルションを含む)及びリポソームなどの製剤に広範な用途が見出される。多くの異なるタイプの界面活性剤(天然と合成の双方)の特性を分類し、ランク付けする最も一般的な方法は、親水性/親油性バランス(HLB)の使用による。親水性基(「頭部」としても公知)の性質は、製剤中で使用される異なる界面活性剤をカテゴリー化するのに最も有用な手段を提供する。製剤、配合物及び乳剤中での界面活性剤の使用についてはレビューされている(Rieger,in Pharmaceutical Dosage Forms,Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.,1988,p.285)。
送達媒体の別の例として、SLNの特徴を保持し、薬剤安定性及び充填能力を改善し、且つ薬剤漏出を阻止する、修飾された固体脂質ナノ粒子(SLN)である、ナノ構造脂質担体(NLC)が挙げられる。ポリマーナノ粒子(PNP)は、薬物送達の重要な成分である。これらのナノ粒子は、特異的標的への薬物送達を有効に誘導し、薬剤安定性及び薬物制御放出を改善し得る。リポソームとポリマーとを組み合わせた脂質-ポリマーナノ粒子(PLN)も利用されてもよい。これらのナノ粒子は、PNP及びリポソームの相補的利点を有する。PLNは、コア-シェル構造から構成され;ポリマーコアは安定な構造をもたらし、且つリン脂質シェルは優れた生体適合性をもたらす。レビューとして、例えば、Li et al.2017,Nanomaterials 7,122;doi:10.3390/nano7060122を参照されたし。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の核酸、ベクター、又は組成物は、例えば核酸-脂質粒子を形成するため、脂質製剤中にカプセル封入され得る。核酸脂質粒子は、典型的にはカチオン性脂質、非カチオン性脂質、及び粒子(例えばPEG-脂質コンジュゲート)の凝集を阻止する脂質を含有する。これらの粒子は、静脈内(i.v.)注射後の循環寿命延長を示し、遠位部位(例えば、投与部位から物理的に離れた部位)で蓄積することから、全身適用にとって有用である。PCT公開の国際公開第00/03683号パンフレットに示されるようなカプセル封入された縮合剤-核酸複合体を含む粒子。該粒子は、典型的には、約50nm~約150nm、より典型的には約60nm~約130nm、より典型的には約70nm~約110nm、最も典型的には約70nm~約90nmの平均直径を有し、実質的に非毒性である。さらに、核酸は、本発明の核酸-脂質粒子中に存在するとき、水溶液中でヌクレアーゼによる分解に抵抗性がある。核酸-脂質粒子及びそれらの調製方法は、例えば、米国特許第5,976,567号明細書;米国特許第5,981,501号明細書;米国特許第6,534,484号明細書;米国特許第6,586,410号明細書;米国特許第6,815,432号明細書;及びPCT公開の国際公開第96/40964号パンフレットに開示されている。
一実施形態では、脂質対薬物比(質量/質量比)(例えば、脂質対dsRNA比)は、約1:1~約50:1、約1:1~約25:1、約3:1~約15:1、約4:1~約10:1、約5:1~約9:1、又は約6:1~約9:1の範囲内となる。
カチオン性脂質は、例えば、N,N-ジオレイル-N,N-ジメチル塩化アンモニウム(DODAC)、N,N-ジステアリル-N,N-ジメチル臭化アンモニウム(DDAB)、N-(I-(2,3-ジオレオイルオキシ)プロピル)-N,N,N-トリメチル塩化アンモニウム(DOTAP)、N-(I-(2,3-ジオレイルオキシ)プロピル)-N,N,N-トリメチル塩化アンモニウム(DOTMA)、N,N-ジメチル-2,3-ジオレイルオキシ)プロピルアミン(DODMA)、1,2-ジリノレイオキシ-N,N-ジメチルアミノプロパン(DLinDMA)、l,2-ジリノレニルオキシ-N,N-ジメチルアミノプロパン(DLenDMA)、1,2-ジリノレイルカルバモイルオキシ-3-ジメチルアミノプロパン(DLin-C-DAP)、1,2-ジリノレイオキシ-3-(ジメチルアミノ)アセトキシプロパン(DLin-DAC)、1,2-ジリノレイオキシ-3-モルホリノプロパン(DLin-MA)、1,2-ジリノレオイル-3-ジメチルアミノプロパン(DLinDAP)、1,2-ジリノレイルチオ-3-ジメチルアミノプロパン(DLin-S-DMA)、1-リノレオイル-2-リノレイルオキシ-3-ジメチルアミノプロパン(DLin-2-DMAP)、1,2-ジリノレイルオキシ-3-トリメチルアミノプロパン塩化物塩(DLin-TMA.Cl)、1,2-ジリノレオイル-3-トリメチルアミノプロパン塩化物塩(DLin-TAP.Cl)、1,2-ジリノレイルオキシ-3-(N-メチルピペラジノ)プロパン(DLin-MPZ)、又は3-(N,N-ジリノレイルアミノ)-1,2-プロパンジオール(DLinAP)、3-(N,N-ジオレイルアミノ)-1,2-プロパンジオ(DOAP)、1,2-ジリノレイルオキソ-3-(2-N,N-ジメチルアミノ)エトキシプロパン(DLin-EG-DMA)、l,2-ジリノレニルオキシ-N,N-ジメチルアミノプロパン(DLinDMA)、2,2-ジリノレイル-4-ジメチルアミノメチル-[1,3]-ジオキソラン(DLin-K-DMA)若しくはその類似体、(3aR,5s,6aS)-N,N-ジメチル-2,2-ジ((9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエニル)テトラヒドロ-3aH-シクロペンタ[d][1,3]ジオキソール-5-アミン、(6Z,9Z,28Z,31Z)-ヘプタトリアコンタ-6,9,28,31-テトラエン-19-イル4-(ジメチルアミノ)ブタン酸(MC3)、1,1’-(2-(4-(2-((2-(ビス(2-ヒドロキシドデシル)アミノ)エチル)(2-ヒドロキシドデシル)アミノ)エチル)ピペラジン-1-イル)エチルアザンジイル)ジドデカン-2-オール(Tech G1)、又はそれらの混合物であってもよい。カチオン性脂質は、該粒子中に存在する全脂質の約20モル%~約50モル%又は約40モル%を含んでもよい。
一実施形態では、脂質粒子は、40%の2,2-ジリノレイル-4-ジメチルアミノエチル-[1,3]-ジオキソラン:10%のDSPC:40%のコレステロール:10%のPEG-C-DOMG(モル百分率)を含むとともに、63.0±20nmの粒径及び0.027のsiRNA/脂質比を有する。
非カチオン性脂質は、アニオン性脂質又は中性脂質、例えば限定はされないが、ジステアロイルホスファチジルコリン(DSPC)、ジオレオイルホスファチジルコリン(DOPC)、ジパルミトイルホスファチジルコリン(DPPC)、ジオレオイルホスファチジルグリセロール(DOPG)、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール(DPPG)、ジオレオイル-ホスファチジルエタノールアミン(DOPE)、パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン(POPC)、パルミトイルオレオイルホスファチジルエタノールアミン(POPE)、ジオレオイル-ホスファチジルエタノールアミン4-(N-マレイミドメチル)-シクロヘキサン-1-カルボキシレート(DOPE-mal)、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン(DPPE)、ジミリストイルホスホエタノールアミン(DMPE)、ジステアロイル-ホスファチジル-エタノールアミン(DSPE)、16-O-モノメチルPE、16-O-ジメチルPE、18-1-トランスPE、1-ステアロイル-2-オレオイル-ホスファチジエタノールアミン(SOPE)、コレステロール、又はそれらの混合物であってもよい。非カチオン性脂質は、コレステロールが含まれる場合、該粒子中に存在する全脂質の約5モル%~約90モル%、約10モル%、又は約58モル%であってもよい。
粒子の凝集を阻害するコンジュゲート脂質は、例えば、ポリエチレングリコール(PEG)-脂質、例えば限定はされないが、PEG-ジアシルグリセロール(DAG)、PEG-ジアルキルオキシプロピル(DAA)、PEG-リン脂質、PEG-セラミド(Cer)、又はそれらの混合物であってもよい。PEG-DAAコンジュゲートは、例えば、PEG-ジラウリルオキシプロピル(Ci)、PEG-ジミリスチルオキシプロピル(Ci)、PEG-ジパルミチルオキシプロピル(Ci)、又はPEG-ジステアリルオキシプロピル(C])であってもよい。粒子の凝集を阻止するコンジュゲート脂質は、該粒子中に存在する全脂質の0モル%~約20モル%又は約2モル%であってもよい。
いくつかの実施形態では、核酸-脂質粒子は、コレステロールを、例えば該粒子中に存在する全脂質の約10モル%~約60モル%又は約48モル%でさらに含む。
一実施形態では、製剤は、例えば、2010年6月10日に出願された国際出願PCT/US10/28224号明細書(本明細書で参照により援用される)に記載のMC3を含む製剤である。MC3含有製剤の合成及び構造は、例えば、参照により援用される、国際公開第2013/155204号パンフレットの114~119頁に記載されている。いくつかの実施形態では、MC3製剤は、DLin-M-C3-DMA(即ち、(6Z,9Z,28Z,31Z)-ヘプタトリアコンタ-6,9,28,31-テトラエン-19-イル4-(ジメチルアミノ)ブタン酸)の調製物を含む。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のポリペプチド、核酸、ベクター又は宿主細胞の組成物は、リポソーム又は他の類似する小胞中で製剤化されてもよい。リポソームは、内部水性区画を囲む単層又は多重層の脂質二重層並びに比較的不透過性の外部親油性リン脂質二重層から構成された球状小胞構造である。リポソームは、アニオン性、中性又はカチオン性であってもよい。リポソームは、生体適合性、非毒性であり、親水性及び親油性薬剤分子の双方を送達し、それらのカーゴを血漿酵素により分解から保護し、それらの負荷を生物学的膜及び血液脳関門(BBB)を通じて輸送し得る(例えば、レビューとして、Spuch and Navarro,Journal of Drug Delivery,vol.2011,Article ID469679,12 pages,2011.doi:10.1155/2011/469679を参照)。
小胞は、いくつかの異なるタイプの脂質から作成され得るが、薬物担体としてのリポソームを作成するため、リン脂質が最も一般的に使用される。小胞は、限定はされないが、DOTMA、DOTAP、DOTIM、DDABを単独で含むか、又はコレステロールと一緒に含み、DOTMA及びコレステロール、DOTAP及びコレステロール、DOTIM及びコレステロール、並びにDDAB及びコレステロールを生成してもよい。多重膜小胞脂質を調製するための方法は、当該技術分野で公知である(例えば、米国特許第6,693,086号明細書を参照、多重膜小胞脂質製剤に関するその教示内容は、参照により本明細書中に援用される)。脂質膜が水溶液と混合されるとき、小胞形成は自発的であり得るが、それはまた、ホモジナイザー、ソニケーター、又は押出成形装置に使用により振盪の形態で力を加えることにより促進され得る(例えば、レビューとして、Spuch and Navarro,Journal of Drug Delivery,vol.2011,Article ID469679,12 pages,2011.doi:10.1155/2011/469679を参照)。押し出された脂質は、サイズを低減するフィルターを介して押し出すことにより調製可能であり、それはTempleton et al.,Nature Biotech,15:647-652,1997に記載の通りである(押し出された脂質製剤に関するその教示内容は、参照により本明細書中に援用される)。
脂質ナノ粒子(LNP)は、生体適合性及び生分解性送達系を本明細書に記載の医薬組成物に提供する担体の別の例である。ナノ構造脂質担体(NLC)は、SLNの特徴を保持し、薬剤安定性及び充填能力を改善し、且つ薬剤漏出を阻止する、修飾された固体脂質ナノ粒子(SLN)である。ポリマーナノ粒子(PNP)は、薬物送達の重要な成分である。これらのナノ粒子は、特異的標的への薬物送達を有効に誘導し、薬剤安定性及び薬物制御放出を改善し得る。リポソームとポリマーとを組み合わせた担体の新しいタイプである脂質-ポリマーナノ粒子(PLN)も利用されてもよい。これらのナノ粒子は、PNP及びリポソームの相補的利点を有する。PLNは、コア-シェル構造から構成され;ポリマーコアは安定な構造をもたらし、且つリン脂質シェルは優れた生体適合性をもたらす。それ故、2つの成分は、薬剤カプセル化効率を増加させ、表面修飾を促進し、水溶性薬剤の漏出を阻止する。レビューとして、例えば、Li et al.2017,Nanomaterials 7,122;doi:10.3390/nano7060122を参照されたし。
エキソソームもまた、本明細書に記載の組成物及び系のための薬物送達媒体として使用可能である。レビューとして、Ha et al.July2016.Acta Pharmaceutica Sinica B.Volume 6,Issue 4,Pages 287-296;https://doi.org/10.1016/j.apsb.2016.02.001を参照されたし。
本明細書に引用されるすべての刊行物、特許出願、特許、並びに他の出版物及び参考文献(例えば、配列データベース参照番号)は、それら全体が参照により援用される。例えば、本明細書中で参照されるすべてのジェンバンク、ユニジーン、及びEntrez配列は、例えば本明細書中のいずれかの表又は実施例において参照により援用される。特に指定されない限り、本明細書中で特定される配列受入番号は、例えば本明細書中のいずれかの表において、2018年11月29日時点で最新のデータベースエントリーを指す。1つの遺伝子又はタンパク質が複数の配列受入番号を参照するとき、配列変異体のすべてが包含される。
本発明は、以下の実施例により、さらに例示される。実施例は、あくまで例示目的で提示され、決して本発明の範囲又は内容を限定するものとして解釈されるべきではない。
実施例1:融合構築物の設計及び発現
本実施例は、RNA編集ドメインに融合されたRNA結合ドメインを含む融合タンパク質の設計及び生成について説明する。
RNA結合ドメイン:標的RNAの8ヌクレオチド配列が、上記の、またCheong and Tanaka.2006.PNAS vol.103,37:13635-9によるトポロジカルなタンパク質認識コードに変換される。このコードは、例えば、Quick Change II XL部位特異的突然変異誘発キット(Stratagene,LaJolla,CA)によるPUM1をコードするpTYB3プラスミドの部位特異的突然変異誘発を用いて、ジェンバンクのアミノ酸配列:AAG31807.1のGly828~Gly1176である、PUM1のRNA結合ドメイン(配列番号1)内に組み込まれる。
RNA編集ドメイン:Kuttan and Bass.2012.PNAS 2012及びPhelps,Kelly J et al Nucleic Acids Research 2015に記載の通り、デアミナーゼ活性の増強を意図して、E488Q突然変異を有するヒトADAR2(hADAR2DD)(配列番号2のアミノ酸276~701)の触媒活性ドメインを有するように、構築物を設計する。
Sinnamon et al.2017.PNAS 114.44(2017):E9395-E9402に記載のプライマーを用いるポリメラーゼ連鎖反応(PCR)により、上記のRNA結合及びRNA編集ドメインのORFの対応配列を上記プラスミドから合成し、増幅し、次に製造業者の使用説明書に従い、Gibson Assembly(登録商標)プロトコル(New England Biolabs)を使用し、アンピシリン耐性pcDNA-CMVベクター骨格にクローン化し、RNA結合ドメインはhADAR2DDのC末端にインフレームで融合される。DNA配列決定により、構築物を確認する。
融合タンパク質は、大腸菌(E.Coli)株BL21(DE3)細胞内で発現可能である。プラスミドは、大腸菌(E.Coli)細胞内で発現させ、37℃、Lennox LB培地(Sigma,USA)中で一晩成長させる。Wang,X.et al 2002に記載の通り、細胞を、6000gで30分間の遠心分離により収集し、次に溶解緩衝液に再懸濁し、超音波処理し、精製する。可溶化液を20,000rpmで30分間の回転により清澄化し、次に10mlのNi-NTAアガロースカラム(Qiagen,USA)に充填する。溶出物をSephedex75ゲル濾過カラムで精製し、次に10mMのトリス(pH7.4)、150mMのNaCl、及び2mMのジチオトレイトール(DTT)中で約5.5mg/mlまで濃縮する。Wang,X.et al.2002及びDawson,T.R.2003に記載の通り、一定分量を液体窒素で急速冷凍し、-80℃で貯蔵する。
タンパク質精製をSDS/PAGE及びクーマシーブルー染色により確認する。融合タンパク質のピーク画分を、100μg/mlのウシ血清アルブミン(BSA)で連続希釈し、SDS-PAGEにより分離し、標準としてのBSAの既知濃度と比較する。
実施例2:編集効率アッセイ
本実施例は、本明細書に記載のように調製した融合タンパク質の編集効率を評価するためのアッセイについて説明する。
Panoply(商標)ヒトADARノックダウンHEK293細胞(Creative Biogene,Shirley,NY)を、(3×10個/ウェル)の密度で、10%ウシ胎仔血清、1%ペニシリン-ストレプトマイシン溶液、1mMのピルビン酸ナトリウム、及び2mMのグルタミンを添加したダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)中、37℃、5%COで24時間維持した、ポリ-d-リジンでコーティングした24ウェルプレート上に播種する。製造業者のプロトコルに従い、細胞にリポフェクタミン2000を有する融合タンパク質の構築物をトランスフェクトし、トランスフェクション後72時間維持する。製造業者の使用説明書に従い、TRIZOL(Invitrogen)により、全RNAを細胞から単離し、次に1ugの全RNAに対するDNaseI処理、続いて逆転写を行うことにより、RNA編集効率を検証する。cDNAを、無作為に選択したRTプライマーを用いるiScript cDNA合成キット(BioRad,Hercules,CA)により合成し、PCR増幅にかける。Wettengel et al.2016.Nucleic Acids Research 45,5:2797-2808に記載の通り、生成物を直接的に配列決定し、対象の融合タンパク質をトランスフェクトしたADAR欠損細胞の(A)のイノシン(I)への置換をそれらの時間一致対照と比較する。
実施例3:例示的なORF点突然変異のRNA編集
本実施例は、本発明の融合ポリペプチドがORF mRNAを編集する能力を示す。
本実施例では、RNA編集を用いて、神経障害における調節不能なイオンフラックスに関する輸送タンパク質の配列及び機能を変更する。ニューロンでは、α-アミノ-3-ヒドロキシ-5-メチル-4-イソキサゾールプロピオン酸(AMPA)複合体のGluA2サブユニットのほぼ99%を、天然に存在するADAR複合体によって編集する。このGluA2の編集により、極性グルタミン(Q)に対するコドンが荷電アルギニン(R)に対するコドンに変換される。GluA2が編集されている場合、この変換は運動ニューロンにおけるCa2+の透過性低下をもたらす。筋萎縮性側索硬化症(ALS)を有する患者は、このGluA2の編集低下と、それから得られる運動ニューロンにおけるカルシウム関連興奮毒性(excitotoxity)を示す。本発明のポリペプチドを使用し、ヒトGluA2 mRNAの標的コドンを編集することで、得られたタンパク質において修正されたアミノ酸置換Q607Rを生成することができる。GluA2のアミノ酸607に対するコドンは、ヒトGluA2ヌクレオチド配列(NCBI参照配列NM_001083620.1)のヌクレオチド1555~1557を含む。それ故、本発明のエフェクターポリペプチドは、関連コドンCAG(グルタミン)をCGG(アルギニン)として解読されるCIGに編集することになるヒトADARの触媒ドメインを、ヒトGluA2ヌクレオチド配列のヌクレオチド1555~1557の上流の配列に特異的に結合することになるRNA結合(標的化)ドメインに連結されて含む(図1を参照)。特に、エフェクターポリペプチドは、次のように構築される:
RNA結合ドメイン:PUM1-HDの配列を、編集対象の標的コドン上流の8ヌクレオチド配列(ヒトGluA2ヌクレオチド配列のアミノ酸1545~1552:caagaagc)に結合するように変更し、次のようなGluA2.RBDを作出する:
リピート1:突然変異S863C及びQ867R
野生型:HIMEFSQDQHGSRFIQLKLERATPAERQLVFNEILQ
GluA2認識のための突然変異体:HIMEFSQDQHGCRFIRLKLERATPAERQLVFNEILQ
リピート2:突然変異N899S及びY867R
野生型:AAYQLMVDVFGNYVIQKFFEFGSLEQKLALAERIRG
GluA2認識のための突然変異体:AAYQLMVDVFGSRVIQKFFEFGSLEQKLALAERIRG
リピート3:突然変異C935S、R936N及びQ939E
野生型:HVLSLALQMYGCRVIQKALEFIPSDQQNEMVRELDG
GluA2認識のための突然変異体:AAYQLMVDVFGSNVIEKFFEFGSLEQKLALAERIRG
リピート4:突然変異N971S及びH972R
野生型:HVLKCVKDQNGNHVVQKCIECVQPQSLQFIIDAFKG
GluA2認識のための突然変異体:HVLKCVKDQNGSRVVQKCIECVQPQSLQFIIDAFKG
リピート5:突然変異なし
野生型:QVFALSTHPYGCRVIQRILEHCLPDQTLPILEELHQ
GluA2認識のための突然変異体:QVFALSTHPYGCRVIQRILEHCLPDQTLPILEELHQ
リピート6:N1043S、Y1044N及びQ1047E
野生型:HTEQLVQDQYGNYVIQHVLEHGRPEDKSKIVAEIRG
GluA2認識のための突然変異体:HTEQLVQDQYGSNVIEHVLEHGRPEDKSKIVAEIRG
リピート7:突然変異なし
野生型:NVLVLSQHKFASNVVEKCVTHASRTERAVLIDEVCTMNDGPHS
GluA2認識のための突然変異体:NVLVLSQHKFASNVVEKCVTHASRTERAVLIDEVCTMNDGPHS
リピート8:N1122C及びQ1126R
野生型:
Figure 2022513159000028
GluA2認識のための突然変異体:
Figure 2022513159000029
RNA編集ドメイン:RNA編集ドメインは、ヒトADAR2DDの触媒ドメインを含み、実施例1のように設計し、作成する。融合構築物GluA2.RBD-ADAR2DDのPCRライゲーション及び増幅を、Adamala,et al.2016.PNAS 113.19:E2579-E2588に記載のように実施する。本実施例の方法における使用を意図した代替的な例示的構築物は、本明細書に開示されるRNA編集ドメイン、RNAエフェクター、及び/又はポリペプチド(及び/又はそれらをコードする核酸)、例えば配列番号16又は17(及び/又は配列番号7又は8)を含む。代替的な例示的な標的RNA配列は、ヒトGluA2(参照配列NM_000826)のヌクレオチド1537~1552に対応するmRNA配列又はヒトGluA2のヌクレオチド1537~1552の50ヌクレオチド以内の配列を含む。
アッセイ:上記のGluA2.RBD-ADAR2DD構築物は、以下の試験モデルにて使用する。
マウス神経芽細胞腫(N2A)細胞を24ウェルプレート内に1×10個の細胞/ウェルの密度で播種し、10%ウシ胎仔血清、1%ペニシリン-ストレプトマイシン溶液、1mMのピルビン酸ナトリウム、及び2mMのグルタミンを添加したイーグル最小必須培地(EMEM)中、37℃、5%COで一晩維持する。24時間後、細胞に、ADAR siRNAレンチウイルス(abm cat:iV037759a)プラスミドをトランスフェクトする。ADARノックダウンを、ADAR発現レベルについてのウエスタンブロットにより確認する。
24時間後、Opti-MEM還元血清培地(Thermo Fisher Scientific)中のADAR欠損N2A細胞に、リポフェクタミン2000(Thermo Fisher Scientific)及び上記の125ngのGluA2.RBD-ADAR2DDプラスミドをトランスフェクトする。72間後、製造業者のウェブサイト上のプロトコルに従い、TRIZOL(Invitrogen)を用いて全RNAを細胞から単離し、次に1ugの全RNAに対するDNaseI処理、続いて逆転写を行うことにより、RNA編集を検証する。cDNAを、GluA2 RT-プライマー(fwd:CCATCGAAAGTGCTGAGGAT及びrev:AGGGCTCTGCACTCCTCATA)を用いるiScript cDNA合成キット(BioRad,Hercules,CA)により合成し、PCR増幅にかける。Wettengel,Jacqueline et alに記載の通り、生成物を直接的に配列決定し、GluA2.RBD-ADAR2DDをトランスフェクトしたADAR欠損細胞の(A)からイノシン(I)への置換の速度を、ADAR活性を伴わないそれらの時間一致対照と比較する。
実施例4:代替的なスプライス産物を生成するためのプレmRNAの編集
幼児死亡率の主な遺伝的原因である脊髄性筋萎縮(SMA)では、SMN1遺伝子の突然変異又は不在に起因し、SMNタンパク質が欠如している(Hua et al.2007.PLoS biology vol.5,4:e73.)。ヒトは、SMNタンパク質を生成する能力があるSMN1とほぼ同一のSMN2遺伝子(ヒト(Homo sapiens)の生存運動ニューロン2、セントロメア(SMN2)、染色体5上のRefSeqGene、NCBI参照配列:NG_008728.1)を有するが、エクソン7の6番目の位置での重要なシトシン(C)のチミジン(T)への突然変異(転写物内のC6U変異)及びイントロン7の100番目の位置でのアデノシン(A)のグアノシン(G)への変異(A100G)により、スプライス部位の認識が低減され、プレmRNAのスプライシング事象におけるエクソン7のスキッピングが生じる(Singh et al.2012.PLoS One 7.11:e49595)。スキップされたエクソンに起因し、続いて生じるSMNタンパク質は、不安定で且つ部分的に機能的であり、SMA表現型をもたらす。本実施例は、SMN2のプレmRNAにおけるエクソン7の「スプライシングアウト」を低減し、それによりSMNの生成を救出し、疾患表現型を抑制し得る、例示的な本明細書に記載の組成物の設計及び作成について説明する。
プラスミドの構築
RNA結合ドメイン:SMN2プレmRNAを修飾し、SMN2 RNA結合hADARDD融合構築物を伴うエクソン7の封入を駆動する。エクソン7の封入を増強するSMN2の標的配列は、Hua et al.2007.PLoS biology vol.5,4:e73に記載されている。SMN2のエクソン7を標的にするため、PUM1-HDの部位特異的突然変異誘発を実施し、8ヌクレオチド配列:UUAGACAA(ヒトSMN2 NCBI参照配列NG_008728.1の27003~27010位)を標的にする。
PUM1に設けるべき突然変異は次の通りである:
リピート1:突然変異S863N及びR864Y
野生型:HIMEFSQDQHGSRFIQLKLERATPAERQLVFNEILQ
SMN2認識のための突然変異体:
Figure 2022513159000030
リピート2:突然変異なし
野生型:AAYQLMVDVFGNYVIQKFFEFGSLEQKLALAERIRG
SMN2認識のための突然変異体:AAYQLMVDVFGNYVIQKFFEFGSLEQKLALAERIRG
リピート3:突然変異なし
野生型:HVLSLALQMYGCRVIQKALEFIPSDQQNEMVRELDG
SMN2認識のための突然変異体:AAYQLMVDVFGCRVIQKFFEFGSLEQKLALAERIRG
リピート4:N971S、H972N及びQ975E
野生型:HVLKCVKDQNGNHVVQKCIECVQPQSLQFIIDAFKG
SMN2認識のための突然変異体:
Figure 2022513159000031
リピート5:突然変異なし
野生型:QVFALSTHPYGCRVIQRILEHCLPDQTLPILEELHQ
SMN2認識のための突然変異体:QVFALSTHPYGCRVIQRILEHCLPDQTLPILEELHQ
リピート6:N1043C及びQ1047R
野生型:HTEQLVQDQYGNYVIQHVLEHGRPEDKSKIVAEIRG
SMN2認識のための突然変異体:
Figure 2022513159000032
リピート7:S1079C、N1080R及びE1083Q
野生型:NVLVLSQHKFASNVVEKCVTHASRTERAVLIDEVCTMNDGPHS
SMN2認識のための突然変異体:
Figure 2022513159000033
リピート8:N1122C及びY1123R
野生型:
Figure 2022513159000034
SMN2認識のための突然変異体:
Figure 2022513159000035
RNA編集ドメイン:RNA編集ドメインは、ヒトADAR2DDの触媒ドメインを含み、実施例1のように設計し、作成する。
融合構築物SMN2.RBD-ADAR2DDのPCRライゲーション及び増幅を、Adamala,et al.2016.PNAS 113.19:E2579-E2588に記載のように実施する。本実施例の方法における使用を意図した代替的な例示的構築物は、本明細書で開示されるRNA編集ドメイン、RNAエフェクター、及び/又はポリペプチド(及び/又はそれらをコードする核酸)、例えば配列番号18又は19(及び/又は配列番号9又は10)を含む。代替的な例示的な標的RNA配列は、ヒトSMN2(参照配列NM-022876)のヌクレオチド31,995~32,010に対応するmRNA配列又はヒトSMN2のヌクレオチド31,995~32,010の50ヌクレオチド内の配列を含む。
細胞培養及びトランスフェクション
ヒトSMAタイプI線維芽細胞(Coriell Repositories)細胞をトランスフェクションの24時間前に蒔き、37℃、5%COの10%の非不活化FBSを添加したDMEM中で維持する。約50%のコンフルエンスで、細胞に0.5μgのSMN2.RBD-hADARDDプラスミドを一過性にトランスフェクトする。4時間後、培地を新しい培地と交換する。48時間のトランスフェクション後、全RNAを抽出する。
エクソン封入におけるRT-PCR
Cho et al.2014.Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Gene Regulatory Mechanism 1839.6:517-525において以前に記載された通り、上記の試験細胞に対し、SMN2のエクソン7スプライシングを検出するためのRT-PCR分析を実施する。対照細胞に、RNA結合融合を伴わずにhADARDDを発現するプラスミドをトランスフェクトする。
RiboEx試薬(Geneall)及びエタノール沈殿により、対照及び試験哺乳動物細胞から全RNAを抽出する。1μgのRNA、0.5μgのオリゴdT、dNTP混合物(0.5mMの各dNTP)、6mMのMgCl2、4μlの5×ImProm-II(商標)反応緩衝液及び1μlのImProm-II(商標)逆転写酵素(Promega)を含有する20μlの総体積中で逆転写を実施する。SMN+エクソン7、SMN-エクソン7及びGAPDH対照のRT-PCR増幅を実施し、(例えば、Cho et al.のエクソン6及びエクソン8PCRプライマーを使用して増幅した)PCR産物を、エチジウムブロマイド溶液(0.5μ/ml)を用いて2%アガロースゲル上で分析する。試験細胞は、エクソン7を含むより大きいSMN2 mRNAを生成する。PCR産物をDdeI(NEB)で消化し、5%天然ポリアクリルアミドゲル上に負荷し、検出する。
実施例5:エプスタイン・バーウイルス(Epstein-Barr virus)に対する抗ウイルス応答を誘導するためのEBNA1の配列の編集
エプスタイン・バーウイルス(Epstein-Barr virus)(EBV)は、単核球症を引き起こし、バーキットリンパ腫、ホジキンリンパ腫、及び上咽頭がんを含む多くのヒトがんに関連する(Tellam et al.2008.PNAS 105.27:9319-9324)。初期溶菌感染後、EBVは、免疫監視を回避し、潜在的感染下で存続することが示されている。潜在的感染中、抗ウイルス性細胞傷害性T応答を制限するため、EBVコード核抗原1(EBNA1)は、コード化タンパク質配列を維持するが、結果的な二次構造が抗ウイルス応答及び下流の抗原提示にとって必要な二本鎖ステムの特徴を含まないように、mRNAで使用されるコドンにバイアスをかける。EBNA中のグリシン-アラニンリピートドメイン(GAr)は、翻訳効率及び増強された免疫認識に関与する。このドメインでは、GArドメイン内のグリシン残基の99%及びアラニン残基の100%(UniprotKB P03211の87~352位)は、グリシン及びアラニンプリンコドンのヒト平均の各々、49.3%及び33.3%よりも有意に多いプリンコドン(GGG、GGA、及びGCA)からなる(Tellam)。本実施例は、抗ウイルス応答を誘導するため、EBNA1の配列を編集し、ウイルスmRNAの二次構造を増強するための例示的な本明細書に記載の組成物の設計及び作成について説明する。
プラスミド構築
RNA結合ドメイン:EBV E1-GArの配列は、Tellam et al.2008.PNAS 105.27:9319-9324(Table 1)中で参照される。本実施例では、EBV E1-Gar二次構造を標的にするため、Tellam et alのTable 1に見出される天然EBNA1 GArの105-merヌクレオチド配列の20~27位に見出される、8ヌクレオチド配列:GCGGGAGGで、PUM1-HDの部位特異的突然変異誘発を実施する。
Figure 2022513159000036
この配列を標的にするための、hPUM1に設けられるべき突然変異は次の通りである:
リピート1:R864N及びQ867E
野生型:HIMEFSQDQHGSRFIQLKLERATPAERQLVFNEILQ
突然変異体:
Figure 2022513159000037
リピート2:N899C及びQ903R
野生型:AAYQLMVDVFGNYVIQKFFEFGSLEQKLALAERIRG
突然変異体:
Figure 2022513159000038
リピート3:C935S、R936N及びQ939E
野生型:HVLSLALQMYGCRVIQKALEFIPSDQQNEMVRELDG
突然変異体:
Figure 2022513159000039
リピート4:N971S、H972N及びQ975E
野生型:HVLKCVKDQNGNHVVQKCIECVQPQSLQFIIDAFKG
突然変異体:
Figure 2022513159000040
リピート5:C1007S、R1008N及びQ1011E
野生型:QVFALSTHPYGCRVIQRILEHCLPDQTLPILEELHQ
突然変異体:
Figure 2022513159000041
リピート6:N1043S及びY1044R
野生型:HTEQLVQDQYGNYVIQHVLEHGRPEDKSKIVAEIRG
突然変異体:
Figure 2022513159000042
リピート7:突然変異なし
野生型:NVLVLSQHKFASNVVEKCVTHASRTERAVLIDEVCTMNDGPHS
リピート8:N1122S、Y1123N及びQ1126E
野生型:
Figure 2022513159000043
突然変異体:
Figure 2022513159000044
RNA編集ドメイン:RNA編集ドメインは、ヒトADAR2DDの触媒ドメインを含み、実施例1のように設計し、作成する。
融合構築物EBVE1-GAr.RBD-ADAR2DDのPCRライゲーション及び増幅を、Adamala,et al.2016.PNAS 113.19:E2579-E2588に記載のように実施する。
EBNA1発現構築物
EBNA1発現構築物を作成するため、完全長EBVコードEBNA1(E1)及びEBNA1 GAr配列(EBNA1-GA)の102-nt増加分を発現ベクターpcDNA3(Invitrogen)にクローン化する。次に、Tellamに記載のように、発現ベクターにGFPをコードする配列(pEGFP-N1;Clontech)をインフレームでサブクローニングする。
細胞培養及びトランスフェクション
DG75(ATCC)又はHEK293細胞を、Tellam,J.et al PNAS 2008において以前に記載のように、2mMのL-グルタミン、100単位/mlのペニシリン、及び100μg/mlのストレプトマイシン+10%FCSを添加したRPMI培地1640中で維持する。
EBNA1構築物のトランスフェクション
BioRad Gene Pulser(960μF、250V、0.4cmのギャップ電極、300μlのアッセイ体積、25℃)を使用することにより、細胞に10μgの発現構築物をトランスフェクトする。EBVのトランスフェクションの2時間後、細胞に0.5μgのEBVE1-GAr.RBD-ADAR2DD遺伝子プラスミドを一過性にトランスフェクトし、次に4時間後、培地を新しい培地と交換する。Tellam,J.et al PNAS 2008に記載のように、最終トランスフェクションの24時間後、細胞を収集し、SDS/PAGEにかけ、抗GFP(1:2,000)又はアクチンmAb(1:1,000)のいずれかで免疫ブロットする。
翻訳アッセイ
EBNA1/pcDNA3発現構築物をXbaIで直線化し、1μgの鋳型を、50μCiの[α-32P]UTP(Amersham Biosciences)を加えたRiboprobeインビトロ転写システム(Promega)を使用することにより、T7 RNAポリメラーゼで転写させる。翻訳アッセイにおいては、EBNA1/pcDNA3ベクターを、250μCiの35[S]メチオニン(Amersham Biosciences)を加えた共役された転写/翻訳の網状赤血球可溶化液システム(Promega)を使用することにより、T7 RNAポリメラーゼでインビトロ転写及び翻訳する。Tellam,J.et al PNAS 2008に記載のように、可溶化液にSDS/PAGE及びオートラジオグラフィーを施す。配列決定により編集を確認する。
SHAPE分析
Zuker,M.et al Nucleic Acid Res 2003に記載のように、編集された配列の最低エネルギーの確証をMFOLDによって予測する。
qRT-PCR
MMLV SuperScript III逆転写酵素(Invitrogen)及びランダム六量体と組み合わせた固定されたオリゴ(T)18プライマーを使用することによる、EBNA1及び1サンプルあたり1μgの単離されたRNAのcDNA合成。Sybr Greenに基づく蛍光検出システム及びABI Prism 7900配列検出システム(Applied Biosystems)を使用するqRT-PCRを用いて、mRNA存在量を測定する。Tellam,J.et al PNAS 2008に記載のように、リボソームタンパク質P0(RPLP0;ジェンバンク受入番号NM_053275)をすべてのサンプルにおける参照遺伝子として使用する。
各qRT-PCRは、2.5mlの2×Sybr Greenマスターミックス(Applied Biosystems)、500nMの最終濃度を各々与える0.25mlの各プライマー、1.0mlの水、及び1.0mlのストックcDNA鋳型の1/10希釈物を有する。循環条件は、95℃で15秒間及び60℃で1分間の40サイクルである必要がある。各実行の完了時、解離融解曲線分析を実施する。
タンパク質合成の測定
HEK293細胞に、EBVE1-GAr.RBD-ADAR2DDとともにEBNA1-GFP発現構築物をトランスフェクトする。トランスフェクションの24時間後、細胞を、20μCi/mlの3[H]メチオニン(Amersham Biosciences)を含有する成長培地中、37℃で12~14時間標識する。細胞をPBSで洗浄し、メチオニンを含まない成長培地中、37℃で30分間インキュベートし、100μCiの35[S]メチオニンで30分間パルスする。パルス後、細胞を、1%トリトンX100及びプロテアーゼ阻害剤を有するトリス緩衝生理食塩水で溶解し、プロテインAセファロースで予備清澄化し、可溶化液を抗GFP又はmAbからβチューブリン(Sigma)で免疫沈降させる。免疫沈降サンプルを10mlのシンチラント液Ultima Gold(PerkinElmer Life and Analytical Sciences)に添加し、Packard液体シンチレーションアナライザーTri-carb 2100TRでカウントする。
実施例6:配列
配列番号1
PUM1のRNA結合ドメイン;ジェンバンク:AAG31807.1のアミノ酸配列のGly828~Gly1176
Figure 2022513159000045
配列番号2
ADAR2アミノ酸配列;NCBI参照配列NG_052015.1
Figure 2022513159000046
配列番号3:GluA2のアミノ酸配列;NCBI参照配列:NM_000826.3
Figure 2022513159000047

Claims (62)

  1. (a)複数(例えば、2~50、10~30、又は16~21)のRNA塩基結合モチーフであって、それらの各々がRNA塩基に結合し、且つ標的RNA配列内の番号順の前記RNA塩基に結合するようにRNA結合ドメイン内で規則正しい、RNA塩基結合モチーフを含む前記RNA結合ドメインを、(b)異種RNA編集ドメインに連結されて含むポリペプチド。
  2. (a)複数(例えば、2~50、10~30、又は16~21)のRNA塩基結合モチーフであって、それらの各々がRNA塩基に結合し、且つ標的RNA配列内の番号順の前記RNA塩基に結合するようにRNA結合ドメイン内で規則正しい、RNA塩基結合モチーフを含む前記RNA結合ドメインを、(b)異種RNA編集ドメインに連結されて含み、ヌクレアーゼ又はその機能断片を含まない、ポリペプチド。
  3. (a)複数(例えば、2~50、10~30、又は16~21)のRNA塩基結合モチーフであって、それらの各々がRNA塩基に結合し、且つ標的RNA配列内の番号順の前記RNA塩基に結合するようにRNA結合ドメイン内で規則正しい、RNA塩基結合モチーフを含む前記RNA結合ドメインを、(b)デアミナーゼ又はその機能断片若しくは変異体の触媒ドメインを含む異種RNA編集ドメインに連結されて含むポリペプチド。
  4. (a)複数(例えば、2~50、10~30、又は16~21)のRNA塩基結合モチーフであって、それらの各々がRNA塩基に結合し、且つ標的RNA配列内の番号順の前記RNA塩基に結合するようにRNA結合ドメイン内で規則正しい、RNA塩基結合モチーフを含む前記RNA結合ドメインを、(b)スプライシング因子を含む異種RNAエフェクターに連結されて含むポリペプチド。
  5. 前記複数のRNA塩基結合モチーフが、少なくとも3(例えば、少なくとも4、少なくとも5、少なくとも6、少なくとも7、少なくとも8、少なくとも9、14~24の間、15~23の間、16~22の間、16~21の間、2~20の間、2~15の間、2~10の間、2~8の間、3~20の間、3~15の間、3~10の間、3~8の間、4~8の間、最大25、最大30)のPUM RNA結合モチーフを含む、請求項1~4のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  6. 前記RNA結合ドメインが、2~50の間のヌクレオチド(例えば、14~30の間、15~26の間、16~21の間、2~40の間、2~30の間、2~25の間、2~20の間、5~50の間、5~40の間、5~30の間、5~25の間、5~20の間、5~15の間、2~18の間、2~15の間、2~12の間、2~10の間、2~9の間、2~8の間、3~20の間、3~15の間、3~10の間、3~9の間、3~8の間、4~12の間、4~10の間、4~9の間、4~8の間、5~10の間、5~9の間、5~8の間のヌクレオチド)のRNA配列に結合する、請求項1~5のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  7. 前記RNA結合ドメインが、90~500の間のアミノ酸残基、例えば、90~450の間のアミノ酸残基、90~400の間のアミノ酸残基、90~350の間のアミノ酸残基、90~300の間のアミノ酸残基、120~400の間のアミノ酸残基である、請求項1~6のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  8. 前記RNA結合ドメインが、野生型PUM-HD、例えば野生型ヒトPUM1-HDの対応するアミノ酸配列に対して、少なくとも80%の同一性(例えば、少なくとも85%の同一性、少なくとも87%の同一性、少なくとも90%の同一性、少なくとも92%の同一性、少なくとも95%の同一性、少なくとも97%の同一性、少なくとも98%の同一性、又は99%の同一性)及び100%未満の同一性を有する、請求項1~7のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  9. 前記RNA結合ドメインが、疾患関連突然変異を含むRNA配列に結合する、請求項1~8のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  10. 前記RNA結合ドメインが、疾患関連突然変異を含むRNA配列に結合し、且つ前記RNA編集ドメインが、前記疾患関連突然変異を編集する(例えば修正する)、請求項1~9のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  11. 前記RNA編集ドメインが、RNAデアミナーゼ(例えば、アデノシンデアミナーゼ又はシチジンデアミナーゼ)又はその機能断片若しくは変異体の触媒ドメインを含むポリペプチドを含む、請求項1~10のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  12. 前記RNA編集ドメインが、RNA上で作用するアデノシンデアミナーゼ(ADAR)(例えば、ヒトADARl、ヒトADAR2、ヒトADAR3、又はヒトADAR4);tRNA上で作用するアデノシンデアミナーゼ(ADAT);RNA上で作用するシトシンデアミナーゼ(CDAR);又はその機能断片若しくは変異体の前記触媒ドメインを含む、請求項1~11のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  13. 前記デアミナーゼの前記触媒ドメインが、表Bに示される配列に対して少なくとも80%同一(例えば、少なくとも85%、87%、90%、92%、95%、98%、99%、100%同一)である、請求項11又は12に記載のポリペプチド。
  14. 前記RNA編集ドメインが、前記標的RNA配列又は前記標的配列を含むRNAの少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、又は10(例えば、1~10、1~9、1~8、1~7、1~6、1~5、1~4、1~3、1~2、2~10、2~9、2~8、2~7、2~6、2~5、2~4、2~3、3~10、3~9、3~8、3~7、3~6、3~5、3~4、4~10、4~9、4~8、4~7、4~6、4~5、5~10、5~9、5~8、5~7、5~6、6~10、6~9、6~8、6~7、7~10、7~9、7~8、8~10、8~9、又は9~10)のヌクレオチドを修飾する、請求項1~13のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  15. 前記RNA編集ドメインが、前記標的RNA配列又は前記標的配列を含むRNAの単一ヌクレオチドを修飾する、請求項1~14のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  16. 前記RNA編集ドメインが、ある塩基を別の塩基に変化させる、例えば、シトシンをウラシルに;アデノシンをイノシンに;又はグアノシンをアデノシンに変化させる、請求項1~15のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  17. 前記RNA編集ドメインが、前記標的RNA配列のアミノ酸コード配列を修飾する、請求項1~16のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  18. 前記標的RNA配列の前記アミノ酸コード配列に対する前記修飾により、前記標的RNA配列によってコードされる産物ポリペプチドのアミノ酸配列が変更される、請求項17に記載のポリペプチド。
  19. 前記RNA編集ドメインが、前記標的RNA配列の少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、又は10(例えば、1~10、1~9、1~8、1~7、1~6、1~5、1~4、1~3、1~2、2~10、2~9、2~8、2~7、2~6、2~5、2~4、2~3、3~10、3~9、3~8、3~7、3~6、3~5、3~4、4~10、4~9、4~8、4~7、4~6、4~5、5~10、5~9、5~8、5~7、5~6、6~10、6~9、6~8、6~7、7~10、7~9、7~8、8~10、8~9、又は9~10)のヌクレオチド、及び任意選択的には前記標的RNA配列の1、2、3、4、5、6、7、8、9、又は10以下のヌクレオチドを修飾する、請求項1~18のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  20. 前記RNA結合ドメインが、RNAの二次構造に結合する、請求項1~19のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  21. 前記RNA結合ドメインが、プレmRNA、例えばプレmRNAのイントロン-エクソン接合部に結合する、請求項1~20のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  22. 前記標的RNA配列又は前記標的RNA配列を含むRNAの二次構造を(例えばその形成を)阻害し、不安定化し、且つ/又は除去する、請求項1~21のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  23. 前記標的RNA配列又は前記標的RNA配列を含むRNAのスプライシングを変更する、請求項1~22のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  24. 前記標的RNA配列又は前記標的RNA配列を含むRNAのスプライシングをスプライス部位(例えば標的スプライス部位)で阻害し、例えば除去し、また任意選択的には前記標的RNA配列又は前記標的RNA配列を含むRNAのスプライシングを1以上の他のスプライス部位(例えば1以上の非標的スプライス部位)で阻害しない、請求項23に記載のポリペプチド。
  25. 遺伝子、例えば前記標的RNA配列をコードする遺伝子の発現を減少させる、請求項1~24のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  26. 前記標的RNA配列によってコードされる産物ポリペプチドのレベルを低下させる、請求項1~25のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  27. 前記標的RNA配列又は前記標的RNA配列を含むRNAにおける停止コドン、例えば未成熟停止コドンを除去する、請求項1~26のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  28. 前記標的RNA配列又は前記標的RNA配列を含むRNAにおける停止コドン、例えば未成熟停止コドンを作出する、請求項1~27のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  29. 前記RNA結合ドメインの前記複数のRNA塩基結合モチーフの少なくとも2(例えば、3、4、5、6、7、8、9又はそれ以上)が、リンカー、例えばアミノ酸リンカーによって連結される、請求項1~28のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  30. 前記RNA結合ドメイン及び前記RNA編集ドメインが、リンカー、例えばアミノ酸リンカーによって連結される、請求項1~29のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  31. スプライシング因子をさらに含む、請求項1~30のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  32. 請求項1~31のいずれか一項に記載のポリペプチド、及び前記標的RNA配列に相補的な配列を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む組成物。
  33. 請求項1~32のいずれか一項に記載のポリペプチドをコードする核酸。
  34. RNA、例えばmRNAである、請求項33に記載の核酸。
  35. 請求項33又は34に記載の核酸、及び前記標的RNA配列に相補的な配列を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む組成物。
  36. 請求項33又は34に記載の核酸、及び前記標的RNA配列に相補的な配列を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドをコードする核酸を含む組成物。
  37. 請求項33又は34に記載の核酸を含む発現ベクター(例えば、プラスミドベクター、ウイルスベクター)。
  38. 請求項1~37のいずれか一項に記載の外因性ポリペプチド、請求項33若しくは34に記載の核酸、請求項35若しくは36に記載の組成物、又は請求項37に記載のベクターを含む宿主細胞(例えば、細菌宿主細胞、哺乳動物宿主細胞)。
  39. 請求項1~38のいずれか一項に記載のポリペプチド、核酸、ベクター、組成物、又は宿主細胞及び薬学的に許容できる賦形剤を含むGMPグレードの医薬組成物。
  40. 薬学的担体(例えば、小胞、リポソーム、LNP)中にカプセル封入又は製剤化された、請求項1~39のいずれか一項に記載のポリペプチド、核酸、ベクター、組成物、医薬組成物、又は宿主細胞。
  41. 標的RNAを修飾する(例えば、その配列を変化させる)方法であって、細胞、組織又は対象を、請求項1~40のいずれか一項に記載のポリペプチド、核酸、ベクター、組成物、又は宿主細胞、又はGMPグレードの医薬組成物と、前記ポリペプチドの前記RNA結合ドメインが前記細胞、組織又は対象における前記標的RNAに結合し、且つ前記ポリペプチドの前記RNA編集ドメインが前記標的RNAを編集するのに十分な量及び時間で接触させることを含む方法。
  42. 前記標的RNAが、二次及び/又は三次構造を有するプレmRNA又はmRNAである、請求項41に記載の方法。
  43. 前記標的RNAが、プレmRNA、例えばプレmRNAのイントロン-エクソン接合部である、請求項41又は42に記載の方法。
  44. 前記ポリペプチドが、前記標的RNAのヌクレオチド配列を変更する、請求項41~43のいずれか一項に記載の方法。
  45. 変更することが、前記標的RNA配列又は前記標的配列を含むRNAの少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、又は10(例えば、1~10、1~9、1~8、1~7、1~6、1~5、1~4、1~3、1~2、2~10、2~9、2~8、2~7、2~6、2~5、2~4、2~3、3~10、3~9、3~8、3~7、3~6、3~5、3~4、4~10、4~9、4~8、4~7、4~6、4~5、5~10、5~9、5~8、5~7、5~6、6~10、6~9、6~8、6~7、7~10、7~9、7~8、8~10、8~9、又は9~10)のヌクレオチドを修飾することを含む、請求項44に記載の方法。
  46. 変更することが、前記標的RNA配列又は前記標的配列を含むRNAの単一ヌクレオチドを修飾することを含む、請求項44に記載の方法。
  47. 変更することが、ある塩基を別の塩基に変化させること、例えば、シトシンをウラシルに;アデノシンをイノシンに;又はグアノシンをアデノシンに変化させることを含む、請求項44~46のいずれか一項に記載の方法。
  48. 変更することが、前記標的RNA配列のアミノ酸コード配列を修飾することを含む、請求項44~47のいずれか一項に記載の方法。
  49. 前記標的RNA配列の前記アミノ酸コード配列に対する前記修飾により、前記標的RNA配列によってコードされる産物ポリペプチドのアミノ酸配列が変更される、請求項48に記載の方法。
  50. 前記標的RNAが、細胞、組織又は対象においてプレmRNA又はmRNAを含み、且つ前記ポリペプチドが、前記プレmRNA又はmRNAの二次又は三次構造を変更する(例えば、増強又は低減する)、請求項41~49のいずれか一項に記載の方法。
  51. 前記標的RNAが、細胞、組織又は対象においてプレmRNA又はmRNAを含み、且つ前記ポリペプチドが、前記プレmRNA又はmRNAのスプライシングを変更する、請求項41~50のいずれか一項に記載の方法。
  52. 前記ポリペプチドが、前記プレmRNA又はmRNAのスプライシングをスプライス部位(例えば標的スプライス部位)で阻害し、例えば除去し、且つ任意選択的には、前記プレmRNA又はmRNAのスプライシングを1以上の他のスプライス部位(例えば、1以上の非標的スプライス部位)で阻害しない、請求項51に記載のポリペプチド。
  53. 前記標的RNAが、エプスタイン・バーウイルス(EBV)mRNA、例えばEBV核抗原1(EBNA1)mRNAを含む、請求項1~52のいずれか一項に記載の医薬組成物、ポリペプチド、核酸、ベクター、組成物、宿主細胞、又は方法。
  54. 前記標的RNAが、棘筋ニューロン2(SMN2)mRNAを含む、請求項1~53のいずれか一項に記載の医薬組成物、ポリペプチド、核酸、ベクター、組成物、宿主細胞、又は方法。
  55. 前記標的RNAが、GluA2 mRNAを含む、請求項1~54のいずれか一項に記載の医薬組成物、ポリペプチド、核酸、ベクター、組成物、宿主細胞、又は方法。
  56. 前記ポリペプチドが、配列番号13~21から選択されるアミノ酸配列、又はそれらに対して少なくとも80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、若しくは99%の同一性を有する、若しくはそれらと比較して、1、2、3、4、5、6、7、8、9、若しくは10以下の塩基改変(例えば、置換、欠失、又は挿入)を有するアミノ酸配列を含む、請求項1~55のいずれか一項に記載の医薬組成物、ポリペプチド、核酸、ベクター、組成物、宿主細胞、又は方法。
  57. 前記RNA結合ドメインが、配列番号22~25から選択される、又はそれらと比較して1、2、3、4、5、6、7、8、9、若しくは10以下の塩基改変を有するRNA配列を含む標的RNA配列に結合する、請求項1~56のいずれか一項に記載の医薬組成物、ポリペプチド、核酸、ベクター、組成物、宿主細胞、又は方法。
  58. 対象、例えばヒト対象における疾患又は障害を治療する方法であって、請求項1~57のいずれか一項に記載のポリペプチド、医薬組成物、核酸、ベクター、組成物、又は宿主細胞を有効量で前記対象に投与し、それにより前記疾患又は障害を治療することを含み、
    ここで前記疾患又は障害が、マイヤー・ゴーリン症候群、ゼッケル症候群4、ジュベール症候群5、レーバー先天黒内障10;シャルコー・マリー・トゥース病、2型;シャルコー・マリー・トゥース病、2型;アッシャー症候群、2C型;脊髄小脳失調28;脊髄小脳失調28;脊髄小脳失調28;QT延長症候群2;シェーグレン・ラルソン症候群;遺伝性フルクトース尿症;遺伝性フルクトース尿症;神経芽細胞腫;神経芽細胞腫;カルマン症候群1;カルマン症候群1;カルマン症候群1;異調染色性白血球栄養症、レット症候群、筋萎縮性側索硬化症タイプ10、リー・フラウメニ症候群、嚢胞性線維症、ハーラー症候群、α-1-アンチトリプシン(A1AT)欠乏、パーキンソン病、アルツハイマー病、白化現象、筋萎縮性側索硬化症、喘息、b-サラセミア、カダシル症候群、シャルコー・マリー・トゥース病、慢性閉塞性肺疾患(COPD)、遠位脊髄性筋萎縮(DSMA)、デュシェンヌ型/ベッカー型筋ジストロフィー、栄養障害型表皮水疱症、表皮水疱症、ファブリー病、第V因子ライデン関連障害、家族性腺腫性ポリポーシス、ガラクトース血症、ゴーシェ病、グルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼ、血友病、遺伝性ヘマトクロマトーシス、ハンター症候群、ハンチントン病、炎症性腸疾患(IBD)、遺伝性多凝集反応症候群、レーバー先天黒内障、レッシュ・ナイハン症候群、リンチ症候群、マルファン症候群、ムコ多糖症、筋ジストロフィー、筋緊張性ジストロフィーI型及びII型、神経線維腫症、ニーマン・ピック病A型、B型及びC型、NY-eso1関連がん、ポイツ・ジェガース症候群、フェニルケトン尿症、ポンペ病、原発性毛様体病、プロトロンビン変異関連障害、例えばプロトロンビンG20210A突然変異、肺高血圧症、網膜色素変性症、サンドホフ病、重症複合免疫不全症候群(SCID)、鎌状赤血球貧血、脊髄性筋萎縮、シュタルガルト病、テイ・サックス病、アッシャー症候群、X連鎖性免疫不全、スタージ・ウェーバー症候群、及びがんから選択される、方法。
  59. エプスタイン・バーウイルス(EBV)によって感染された、又はそれによる感染が疑われる対象(例えばヒト対象)を治療する方法であって、請求項1~58のいずれか一項に記載のポリペプチド、医薬組成物、核酸、ベクター、組成物、又は宿主細胞を有効量で前記対象に投与し、それによりエプスタイン・バーウイルス(EBV)によって感染された、又はそれによる感染が疑われる前記対象を治療することを含む方法。
  60. 前記対象が、単核球症又はがん(例えば、バーキットリンパ腫、ホジキンリンパ腫、及び上咽頭がん)を有する、請求項59に記載の方法。
  61. 棘筋萎縮(SMA)を有する対象(例えばヒト対象)を治療する方法であって、請求項1~60のいずれか一項に記載のポリペプチド、医薬組成物、核酸、ベクター、組成物、又は宿主細胞を有効量で前記対象に投与し、それによりSMAを有する前記対象を治療することを含む方法。
  62. 筋萎縮性側索硬化症(ALS)を有する対象(例えばヒト対象)を治療する方法であって、請求項1~61のいずれか一項に記載のポリペプチド、医薬組成物、核酸、ベクター、組成物、又は宿主細胞を有効量で前記対象に投与し、それによりALSを有する前記対象を治療することを含む方法。
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