JP2022513159A - Rnaを調節する方法 - Google Patents
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Abstract
Description
本願は、2018年11月29日に出願された米国特許出願第62/772,907号明細書、2018年12月12日に出願された米国特許出願第62/778,361号明細書、及び2018年12月17日に出願された米国特許出願第62/780,442号明細書に対する優先権を主張し、それらの内容はそれら全体が参照により本明細書中に各々援用される。
本明細書で用いられるとき、用語「ドメイン」は、生体分子の特定の機能に寄与する生体分子の構造を指す。ドメインは、生体分子の隣接領域(例えば隣接配列)又は異なる非隣接領域(例えば非隣接配列)を含んでもよい。タンパク質ドメインの例として、限定はされないが、RNA結合ドメイン、エフェクタードメイン、RNA編集ドメインが挙げられる。
本明細書に記載のポリペプチドのRNA結合ドメインは、標的RNA配列に特異的に結合する。RNA結合ドメインは、複数のRNA塩基結合モチーフを含んでもよく、それらの各々は、RNA塩基に特異的に結合する能力があり、且つモチーフは、例えば標的RNA配列内の番号順のRNA塩基に結合するようにRNA結合ドメイン内で規則正しい。RNA結合モチーフは、Pumilio相同性ドメイン(PUM-HD)のRNA塩基結合リピートに対して相同性であるか又はそれに由来する配列に基づいてもよい(「PUM RNA結合モチーフ」)。実施形態では、PUM RNA結合モチーフは、PUM-HDのRNA塩基結合モチーフに対して、少なくとも80%(例えば、85%、87%、90%、92%、95%、97%、98%、99%又は100%)同一であり、特定のRNA塩基に対する結合特異性を有する。PUM RNA結合モチーフでは、標的RNA塩基に対する特異性は、核酸のワトソン・クリックエッジに結合する、水素結合又はファンデルワールス相互作用によって支配される、トポロジカルに等価なタンパク質表面上の保存された位置に基づいて改変される。これらのトポロジーは、グアニンを認識するため、1番目及び5番目の位置でグルタミン酸及びセリン;アデニンを認識するため、グルタミン及びシステイン/セリン;及びウラシルを認識するため、グルタミン及びアスパラギンを用いて、RNAに標的化される。かかるモジュラー単位、並びにRNA結合モチーフ及びドメインを設計し、作成する方法は、例えば、Lu et al.2009.Curr Opin Struct Biol.19(1):110-115;Adamala et al.2016.PNAS 113(19):E2579-E2588;及び米国特許出願公開第2016/0238593号明細書にて見出される。
X1はグルタミン(Q)であり、X2はヒスチジン(H)であり;X3はグリシン(G)であり;X4はグリシン(G)、アラニン(A)、セリン(S)、トレオニン(T)及びシステイン(C)を含む群から選択され;X5はアルギニン(R)であり;X6はフェニルアラニン(F)であり;X7はイソロイシン(I)であり;X8はアルギニン(R)であり;X9はロイシン(L)であり;X10はリジン(K)であり;且つX11はロイシン(L)であるか;又は
X1はバリン(V)であり;X2はフェニルアラニン(F)であり;X3はグリシン(G)であり;X4はグリシン(G)、アラニン(A)、セリン(S)、トレオニン(T)及びシステイン(C)を含む群から選択され;X5はチロシン(Y)であり;X6はバリン(V)であり;X7はイソロイシン(I)であり;X8はアルギニン(R)であり;X9はリジン(K)であり;X10はフェニルアラニン(F)であり;且つX11はフェニルアラニン(F)であるか;又は
X1はメチオニン(M)であり;X2はチロシン(Y)であり;X3はグリシン(G)であり;X4はグリシン(G)、アラニン(A)、セリン(S)、トレオニン(T)及びシステイン(C)を含む群から選択され;X5はアルギニン(R)であり;X6はバリン(V)であり;X7はイソロイシン(I)であり;X8はアルギニン(R)であり;X9はリジン(K)であり;X10はアラニン(A)であり;且つX11はロイシン(L)であるか;又は
X1はグルタミン(Q)であり;X2はアスパラギン(N)であり;X3はグリシン(G)であり;X4はグリシン(G)、アラニン(A)、セリン(S)、トレオニン(T)及びシステイン(C)を含む群から選択され;X5はヒスチジン(H)であり;X6はバリン(V)であり;X7はバリン(V)であり;X8はアルギニン(R)であり;X9はリジン(K)であり;X10はシステイン(C)であり;且つX11はイソロイシン(I)であるか;又は
X1はプロリン(P)であり;X2はチロシン(Y)であり;X3はグリシン(G)であり;X4はグリシン(G)、アラニン(A)、セリン(S)、トレオニン(T)及びシステイン(C)を含む群から選択され;X5はアルギニン(R)であり;X6はバリン(V)であり;X7はイソロイシン(I)であり;X8はアルギニン(R)であり;X9はアルギニン(R)であり;X10はイソロイシン(I)であり;且つX11はロイシン(L)であるか;又は
X1はグルタミン(Q)であり;X2はチロシン(Y)であり;X3はグリシン(G)であり;X4はグリシン(G)、アラニン(A)、セリン(S)、トレオニン(T)及びシステイン(C)を含む群から選択され;X5はチロシン(Y)であり;X6はバリン(V)であり;X7はイソロイシン(I)であり;X8はアルギニン(R)であり;X9はヒスチジン(H)であり;X10はバリン(V)であり;且つX11はロイシン(L)であるか;又は
X1はリジン(K)であり;X2はフェニルアラニン(F)であり;X3はアラニン(A)であり;X4はグリシン(G)、アラニン(A)、セリン(S)、トレオニン(T)及びシステイン(C)を含む群から選択され;X5はアスパラギン(N)であり;X6はバリン(V)であり;X7はバリン(V)であり;X8はアルギニン(R)であり;X9はリジン(K)であり;X10はシステイン(C)であり;且つX11はバリン(V)であるか;又は
X1はグルタミン(Q)であり;X2はチロシン(Y)であり;X3はアラニン(A)であり;X4はグリシン(G)、アラニン(A)、セリン(S)、トレオニン(T)及びシステイン(C)を含む群から選択され;X5はチロシン(Y)であり;X6はバリン(V)であり;X7はバリン(V)であり;X8はアルギニン(R)であり;X9はリジン(K)であり;X10はメチオニン(M)であり;且つX11はイソロイシン(I)である)
を有する配列を含んでもよい。
例えば複数のRNA結合モチーフ(例えば、PUM-HDに相同であるか又は由来する複数のPUM RNA結合モチーフ又は配列)を含む例示的なRNA結合ドメインは、配列番号13若しくは15~21のRNA結合ドメイン、又は配列番号4若しくは6~12によってコードされるものを含む。いくつかの実施形態では、RNA結合ドメインは、配列番号13若しくは15~21のRNA結合ドメインに対して、少なくとも80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、若しくは99%の同一性を有する(又はそれらと比較して、1、2、3、4、5、6、7、8、9、又は10以下の塩基改変を含む)か、又は配列番号4若しくは6~12のRNA結合ドメインをコードする配列に対して、少なくとも80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、若しくは99%の同一性を有する核酸配列によってコードされるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、RNA結合ドメインは、第1の例示的なRNA結合ドメインからの1以上のRNA結合モチーフ及び第2の例示的なRNA結合ドメインからの1以上のRNA結合モチーフを含む。
mRNA配列:
mRNA配列:
mRNA配列:
mRNA配列:
mRNA配列(下線太字領域[BbsIカセット]内のPUF挿入部位(例えば欠失部位)):
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のポリペプチドは、RNAエフェクターを含む。
本明細書に記載の特定のポリペプチドは、RNA編集ドメインを含む。
mRNA配列(太字/下線で修飾される残基):
5’-TCACTTTCATAATGCTGG-3’(配列番号29)
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のポリペプチドは、1以上のリンカーを含んでもよい。いくつかの実施形態では、RNA結合ドメイン内のRNA塩基結合モチーフは、リンカーによって連結される。いくつかの実施形態では、RNBA結合ドメイン及びRNA編集ドメインは、それらの間にリンカーを有する。リンカーは、化学結合、例えば1以上の共有結合又は非共有結合であってもよい。いくつかの実施形態では、結合は共有結合である。いくつかの実施形態では、結合は非共有結合である。いくつかの実施形態では、リンカーは、ペプチドリンカーである。かかるリンカーは、2~30の間、又はそれ以上のアミノ酸であってもよい。いくつかの実施形態では、例えば二次及び三次構造の分子柔軟性をもたらすため、又はドメイン若しくはモチーフが機能する(例えば標的に結合する)ために分離する一方で、立体障害を最小化することを可能にするため、リンカーが使用される。リンカーは、本明細書に記載のフレキシブル、リジッド、及び/又は切断可能リンカーを含んでもよい。いくつかの実施形態では、柔軟性をもたらすため、リンカーは、少なくとも1つのグリシン、アラニン、及びセリンアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、リンカーは、例えば負に帯電したスルホン酸基、ポリエチレングリコール(PEG)基、又はピロリン酸ジエステル基を含む、疎水性リンカーである。いくつかの実施形態では、リンカーは、ある部分(例えばドメイン)を別の部分から選択的に放出するために切断可能であるが、未成熟切断を阻止するために十分に安定である。
組換えタンパク質又はポリペプチド(例えば本明細書に記載のポリペプチド)を作成する方法は、当該技術分野ではルーチン的である。一般に、Smales&James(Eds.),Therapeutic Proteins:Methods and Protocols(Methods in Molecular Biology),Humana Press(2005);and Crommelin,Sindelar&Meibohm(Eds.),Pharmaceutical Biotechnology:Fundamentals and Applications,Springer(2013)を参照されたし。
RNA編集組成物(例えば、本明細書に記載のポリペプチド、核酸、ベクター及び宿主細胞)は、例えば、細胞、組織又は対象におけるRNA中の機能欠失変異(例えば1以上の点突然変異)を修正することにより、治療的ニーズに対処し得る。例えば、遺伝子中の突然変異、例えば1以上の点突然変異に関連する疾患を治療するため、RNA編集組成物(例えば、本明細書に記載のポリペプチド、核酸、ベクター及び宿主細胞)が使用されてもよい。
様々な実施形態では、本開示は、薬学的に許容できる賦形剤とともに製剤化された、本明細書に記載のポリペプチド、核酸、ベクター及び宿主細胞の医薬組成物を提供する。薬学的に許容できる賦形剤は、一般に安全、非毒性で望ましい医薬組成物を調製するのに有用な賦形剤を含み、且つ動物使用とともにヒト医薬品使用にとって許容できる賦形剤を含む。かかる賦形剤は、水性であっても又は非水性であってもよい。適切な賦形剤は、組成物の、例えば、安定性、溶解度、緩衝化に寄与してもよい。タンパク質治療薬の製剤化は、Meyer(Ed.),Therapeutic Protein Drug Products:Practical Approaches to formulation in the Laboratory,Manufacturing,and the Clinic,Woodhead Publishing Series(2012)に記載されている。
本明細書に記載のポリペプチド、医薬組成物、核酸、ベクター、組成物、又は宿主細胞の送達用の媒体又は担体として好適な例示的製剤は、マイクロエマルション、単層、ミセル、二重層、小胞又は脂質粒子を含む。これらの製剤は、本明細書に記載のポリペプチド、医薬組成物、核酸、ベクター、組成物、又は宿主細胞における生体適合性及び生分解性送達系を提供する。
本実施例は、RNA編集ドメインに融合されたRNA結合ドメインを含む融合タンパク質の設計及び生成について説明する。
本実施例は、本明細書に記載のように調製した融合タンパク質の編集効率を評価するためのアッセイについて説明する。
本実施例は、本発明の融合ポリペプチドがORF mRNAを編集する能力を示す。
RNA結合ドメイン:PUM1-HDの配列を、編集対象の標的コドン上流の8ヌクレオチド配列(ヒトGluA2ヌクレオチド配列のアミノ酸1545~1552:caagaagc)に結合するように変更し、次のようなGluA2.RBDを作出する:
リピート1:突然変異S863C及びQ867R
野生型:HIMEFSQDQHGSRFIQLKLERATPAERQLVFNEILQ
GluA2認識のための突然変異体:HIMEFSQDQHGCRFIRLKLERATPAERQLVFNEILQ
リピート2:突然変異N899S及びY867R
野生型:AAYQLMVDVFGNYVIQKFFEFGSLEQKLALAERIRG
GluA2認識のための突然変異体:AAYQLMVDVFGSRVIQKFFEFGSLEQKLALAERIRG
リピート3:突然変異C935S、R936N及びQ939E
野生型:HVLSLALQMYGCRVIQKALEFIPSDQQNEMVRELDG
GluA2認識のための突然変異体:AAYQLMVDVFGSNVIEKFFEFGSLEQKLALAERIRG
リピート4:突然変異N971S及びH972R
野生型:HVLKCVKDQNGNHVVQKCIECVQPQSLQFIIDAFKG
GluA2認識のための突然変異体:HVLKCVKDQNGSRVVQKCIECVQPQSLQFIIDAFKG
リピート5:突然変異なし
野生型:QVFALSTHPYGCRVIQRILEHCLPDQTLPILEELHQ
GluA2認識のための突然変異体:QVFALSTHPYGCRVIQRILEHCLPDQTLPILEELHQ
リピート6:N1043S、Y1044N及びQ1047E
野生型:HTEQLVQDQYGNYVIQHVLEHGRPEDKSKIVAEIRG
GluA2認識のための突然変異体:HTEQLVQDQYGSNVIEHVLEHGRPEDKSKIVAEIRG
リピート7:突然変異なし
野生型:NVLVLSQHKFASNVVEKCVTHASRTERAVLIDEVCTMNDGPHS
GluA2認識のための突然変異体:NVLVLSQHKFASNVVEKCVTHASRTERAVLIDEVCTMNDGPHS
リピート8:N1122C及びQ1126R
野生型:
幼児死亡率の主な遺伝的原因である脊髄性筋萎縮(SMA)では、SMN1遺伝子の突然変異又は不在に起因し、SMNタンパク質が欠如している(Hua et al.2007.PLoS biology vol.5,4:e73.)。ヒトは、SMNタンパク質を生成する能力があるSMN1とほぼ同一のSMN2遺伝子(ヒト(Homo sapiens)の生存運動ニューロン2、セントロメア(SMN2)、染色体5上のRefSeqGene、NCBI参照配列:NG_008728.1)を有するが、エクソン7の6番目の位置での重要なシトシン(C)のチミジン(T)への突然変異(転写物内のC6U変異)及びイントロン7の100番目の位置でのアデノシン(A)のグアノシン(G)への変異(A100G)により、スプライス部位の認識が低減され、プレmRNAのスプライシング事象におけるエクソン7のスキッピングが生じる(Singh et al.2012.PLoS One 7.11:e49595)。スキップされたエクソンに起因し、続いて生じるSMNタンパク質は、不安定で且つ部分的に機能的であり、SMA表現型をもたらす。本実施例は、SMN2のプレmRNAにおけるエクソン7の「スプライシングアウト」を低減し、それによりSMNの生成を救出し、疾患表現型を抑制し得る、例示的な本明細書に記載の組成物の設計及び作成について説明する。
RNA結合ドメイン:SMN2プレmRNAを修飾し、SMN2 RNA結合hADARDD融合構築物を伴うエクソン7の封入を駆動する。エクソン7の封入を増強するSMN2の標的配列は、Hua et al.2007.PLoS biology vol.5,4:e73に記載されている。SMN2のエクソン7を標的にするため、PUM1-HDの部位特異的突然変異誘発を実施し、8ヌクレオチド配列:UUAGACAA(ヒトSMN2 NCBI参照配列NG_008728.1の27003~27010位)を標的にする。
リピート1:突然変異S863N及びR864Y
野生型:HIMEFSQDQHGSRFIQLKLERATPAERQLVFNEILQ
SMN2認識のための突然変異体:
野生型:AAYQLMVDVFGNYVIQKFFEFGSLEQKLALAERIRG
SMN2認識のための突然変異体:AAYQLMVDVFGNYVIQKFFEFGSLEQKLALAERIRG
リピート3:突然変異なし
野生型:HVLSLALQMYGCRVIQKALEFIPSDQQNEMVRELDG
SMN2認識のための突然変異体:AAYQLMVDVFGCRVIQKFFEFGSLEQKLALAERIRG
リピート4:N971S、H972N及びQ975E
野生型:HVLKCVKDQNGNHVVQKCIECVQPQSLQFIIDAFKG
SMN2認識のための突然変異体:
野生型:QVFALSTHPYGCRVIQRILEHCLPDQTLPILEELHQ
SMN2認識のための突然変異体:QVFALSTHPYGCRVIQRILEHCLPDQTLPILEELHQ
リピート6:N1043C及びQ1047R
野生型:HTEQLVQDQYGNYVIQHVLEHGRPEDKSKIVAEIRG
SMN2認識のための突然変異体:
野生型:NVLVLSQHKFASNVVEKCVTHASRTERAVLIDEVCTMNDGPHS
SMN2認識のための突然変異体:
野生型:
ヒトSMAタイプI線維芽細胞(Coriell Repositories)細胞をトランスフェクションの24時間前に蒔き、37℃、5%CO2の10%の非不活化FBSを添加したDMEM中で維持する。約50%のコンフルエンスで、細胞に0.5μgのSMN2.RBD-hADARDDプラスミドを一過性にトランスフェクトする。4時間後、培地を新しい培地と交換する。48時間のトランスフェクション後、全RNAを抽出する。
Cho et al.2014.Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Gene Regulatory Mechanism 1839.6:517-525において以前に記載された通り、上記の試験細胞に対し、SMN2のエクソン7スプライシングを検出するためのRT-PCR分析を実施する。対照細胞に、RNA結合融合を伴わずにhADARDDを発現するプラスミドをトランスフェクトする。
エプスタイン・バーウイルス(Epstein-Barr virus)(EBV)は、単核球症を引き起こし、バーキットリンパ腫、ホジキンリンパ腫、及び上咽頭がんを含む多くのヒトがんに関連する(Tellam et al.2008.PNAS 105.27:9319-9324)。初期溶菌感染後、EBVは、免疫監視を回避し、潜在的感染下で存続することが示されている。潜在的感染中、抗ウイルス性細胞傷害性T応答を制限するため、EBVコード核抗原1(EBNA1)は、コード化タンパク質配列を維持するが、結果的な二次構造が抗ウイルス応答及び下流の抗原提示にとって必要な二本鎖ステムの特徴を含まないように、mRNAで使用されるコドンにバイアスをかける。EBNA中のグリシン-アラニンリピートドメイン(GAr)は、翻訳効率及び増強された免疫認識に関与する。このドメインでは、GArドメイン内のグリシン残基の99%及びアラニン残基の100%(UniprotKB P03211の87~352位)は、グリシン及びアラニンプリンコドンのヒト平均の各々、49.3%及び33.3%よりも有意に多いプリンコドン(GGG、GGA、及びGCA)からなる(Tellam)。本実施例は、抗ウイルス応答を誘導するため、EBNA1の配列を編集し、ウイルスmRNAの二次構造を増強するための例示的な本明細書に記載の組成物の設計及び作成について説明する。
RNA結合ドメイン:EBV E1-GArの配列は、Tellam et al.2008.PNAS 105.27:9319-9324(Table 1)中で参照される。本実施例では、EBV E1-Gar二次構造を標的にするため、Tellam et alのTable 1に見出される天然EBNA1 GArの105-merヌクレオチド配列の20~27位に見出される、8ヌクレオチド配列:GCGGGAGGで、PUM1-HDの部位特異的突然変異誘発を実施する。
リピート1:R864N及びQ867E
野生型:HIMEFSQDQHGSRFIQLKLERATPAERQLVFNEILQ
突然変異体:
野生型:AAYQLMVDVFGNYVIQKFFEFGSLEQKLALAERIRG
突然変異体:
野生型:HVLSLALQMYGCRVIQKALEFIPSDQQNEMVRELDG
突然変異体:
野生型:HVLKCVKDQNGNHVVQKCIECVQPQSLQFIIDAFKG
突然変異体:
野生型:QVFALSTHPYGCRVIQRILEHCLPDQTLPILEELHQ
突然変異体:
野生型:HTEQLVQDQYGNYVIQHVLEHGRPEDKSKIVAEIRG
突然変異体:
野生型:NVLVLSQHKFASNVVEKCVTHASRTERAVLIDEVCTMNDGPHS
リピート8:N1122S、Y1123N及びQ1126E
野生型:
EBNA1発現構築物を作成するため、完全長EBVコードEBNA1(E1)及びEBNA1 GAr配列(EBNA1-GA)の102-nt増加分を発現ベクターpcDNA3(Invitrogen)にクローン化する。次に、Tellamに記載のように、発現ベクターにGFPをコードする配列(pEGFP-N1;Clontech)をインフレームでサブクローニングする。
DG75(ATCC)又はHEK293細胞を、Tellam,J.et al PNAS 2008において以前に記載のように、2mMのL-グルタミン、100単位/mlのペニシリン、及び100μg/mlのストレプトマイシン+10%FCSを添加したRPMI培地1640中で維持する。
BioRad Gene Pulser(960μF、250V、0.4cmのギャップ電極、300μlのアッセイ体積、25℃)を使用することにより、細胞に10μgの発現構築物をトランスフェクトする。EBVのトランスフェクションの2時間後、細胞に0.5μgのEBVE1-GAr.RBD-ADAR2DD遺伝子プラスミドを一過性にトランスフェクトし、次に4時間後、培地を新しい培地と交換する。Tellam,J.et al PNAS 2008に記載のように、最終トランスフェクションの24時間後、細胞を収集し、SDS/PAGEにかけ、抗GFP(1:2,000)又はアクチンmAb(1:1,000)のいずれかで免疫ブロットする。
EBNA1/pcDNA3発現構築物をXbaIで直線化し、1μgの鋳型を、50μCiの[α-32P]UTP(Amersham Biosciences)を加えたRiboprobeインビトロ転写システム(Promega)を使用することにより、T7 RNAポリメラーゼで転写させる。翻訳アッセイにおいては、EBNA1/pcDNA3ベクターを、250μCiの35[S]メチオニン(Amersham Biosciences)を加えた共役された転写/翻訳の網状赤血球可溶化液システム(Promega)を使用することにより、T7 RNAポリメラーゼでインビトロ転写及び翻訳する。Tellam,J.et al PNAS 2008に記載のように、可溶化液にSDS/PAGE及びオートラジオグラフィーを施す。配列決定により編集を確認する。
Zuker,M.et al Nucleic Acid Res 2003に記載のように、編集された配列の最低エネルギーの確証をMFOLDによって予測する。
MMLV SuperScript III逆転写酵素(Invitrogen)及びランダム六量体と組み合わせた固定されたオリゴ(T)18プライマーを使用することによる、EBNA1及び1サンプルあたり1μgの単離されたRNAのcDNA合成。Sybr Greenに基づく蛍光検出システム及びABI Prism 7900配列検出システム(Applied Biosystems)を使用するqRT-PCRを用いて、mRNA存在量を測定する。Tellam,J.et al PNAS 2008に記載のように、リボソームタンパク質P0(RPLP0;ジェンバンク受入番号NM_053275)をすべてのサンプルにおける参照遺伝子として使用する。
HEK293細胞に、EBVE1-GAr.RBD-ADAR2DDとともにEBNA1-GFP発現構築物をトランスフェクトする。トランスフェクションの24時間後、細胞を、20μCi/mlの3[H]メチオニン(Amersham Biosciences)を含有する成長培地中、37℃で12~14時間標識する。細胞をPBSで洗浄し、メチオニンを含まない成長培地中、37℃で30分間インキュベートし、100μCiの35[S]メチオニンで30分間パルスする。パルス後、細胞を、1%トリトンX100及びプロテアーゼ阻害剤を有するトリス緩衝生理食塩水で溶解し、プロテインAセファロースで予備清澄化し、可溶化液を抗GFP又はmAbからβチューブリン(Sigma)で免疫沈降させる。免疫沈降サンプルを10mlのシンチラント液Ultima Gold(PerkinElmer Life and Analytical Sciences)に添加し、Packard液体シンチレーションアナライザーTri-carb 2100TRでカウントする。
Claims (62)
- (a)複数(例えば、2~50、10~30、又は16~21)のRNA塩基結合モチーフであって、それらの各々がRNA塩基に結合し、且つ標的RNA配列内の番号順の前記RNA塩基に結合するようにRNA結合ドメイン内で規則正しい、RNA塩基結合モチーフを含む前記RNA結合ドメインを、(b)異種RNA編集ドメインに連結されて含むポリペプチド。
- (a)複数(例えば、2~50、10~30、又は16~21)のRNA塩基結合モチーフであって、それらの各々がRNA塩基に結合し、且つ標的RNA配列内の番号順の前記RNA塩基に結合するようにRNA結合ドメイン内で規則正しい、RNA塩基結合モチーフを含む前記RNA結合ドメインを、(b)異種RNA編集ドメインに連結されて含み、ヌクレアーゼ又はその機能断片を含まない、ポリペプチド。
- (a)複数(例えば、2~50、10~30、又は16~21)のRNA塩基結合モチーフであって、それらの各々がRNA塩基に結合し、且つ標的RNA配列内の番号順の前記RNA塩基に結合するようにRNA結合ドメイン内で規則正しい、RNA塩基結合モチーフを含む前記RNA結合ドメインを、(b)デアミナーゼ又はその機能断片若しくは変異体の触媒ドメインを含む異種RNA編集ドメインに連結されて含むポリペプチド。
- (a)複数(例えば、2~50、10~30、又は16~21)のRNA塩基結合モチーフであって、それらの各々がRNA塩基に結合し、且つ標的RNA配列内の番号順の前記RNA塩基に結合するようにRNA結合ドメイン内で規則正しい、RNA塩基結合モチーフを含む前記RNA結合ドメインを、(b)スプライシング因子を含む異種RNAエフェクターに連結されて含むポリペプチド。
- 前記複数のRNA塩基結合モチーフが、少なくとも3(例えば、少なくとも4、少なくとも5、少なくとも6、少なくとも7、少なくとも8、少なくとも9、14~24の間、15~23の間、16~22の間、16~21の間、2~20の間、2~15の間、2~10の間、2~8の間、3~20の間、3~15の間、3~10の間、3~8の間、4~8の間、最大25、最大30)のPUM RNA結合モチーフを含む、請求項1~4のいずれか一項に記載のポリペプチド。
- 前記RNA結合ドメインが、2~50の間のヌクレオチド(例えば、14~30の間、15~26の間、16~21の間、2~40の間、2~30の間、2~25の間、2~20の間、5~50の間、5~40の間、5~30の間、5~25の間、5~20の間、5~15の間、2~18の間、2~15の間、2~12の間、2~10の間、2~9の間、2~8の間、3~20の間、3~15の間、3~10の間、3~9の間、3~8の間、4~12の間、4~10の間、4~9の間、4~8の間、5~10の間、5~9の間、5~8の間のヌクレオチド)のRNA配列に結合する、請求項1~5のいずれか一項に記載のポリペプチド。
- 前記RNA結合ドメインが、90~500の間のアミノ酸残基、例えば、90~450の間のアミノ酸残基、90~400の間のアミノ酸残基、90~350の間のアミノ酸残基、90~300の間のアミノ酸残基、120~400の間のアミノ酸残基である、請求項1~6のいずれか一項に記載のポリペプチド。
- 前記RNA結合ドメインが、野生型PUM-HD、例えば野生型ヒトPUM1-HDの対応するアミノ酸配列に対して、少なくとも80%の同一性(例えば、少なくとも85%の同一性、少なくとも87%の同一性、少なくとも90%の同一性、少なくとも92%の同一性、少なくとも95%の同一性、少なくとも97%の同一性、少なくとも98%の同一性、又は99%の同一性)及び100%未満の同一性を有する、請求項1~7のいずれか一項に記載のポリペプチド。
- 前記RNA結合ドメインが、疾患関連突然変異を含むRNA配列に結合する、請求項1~8のいずれか一項に記載のポリペプチド。
- 前記RNA結合ドメインが、疾患関連突然変異を含むRNA配列に結合し、且つ前記RNA編集ドメインが、前記疾患関連突然変異を編集する(例えば修正する)、請求項1~9のいずれか一項に記載のポリペプチド。
- 前記RNA編集ドメインが、RNAデアミナーゼ(例えば、アデノシンデアミナーゼ又はシチジンデアミナーゼ)又はその機能断片若しくは変異体の触媒ドメインを含むポリペプチドを含む、請求項1~10のいずれか一項に記載のポリペプチド。
- 前記RNA編集ドメインが、RNA上で作用するアデノシンデアミナーゼ(ADAR)(例えば、ヒトADARl、ヒトADAR2、ヒトADAR3、又はヒトADAR4);tRNA上で作用するアデノシンデアミナーゼ(ADAT);RNA上で作用するシトシンデアミナーゼ(CDAR);又はその機能断片若しくは変異体の前記触媒ドメインを含む、請求項1~11のいずれか一項に記載のポリペプチド。
- 前記デアミナーゼの前記触媒ドメインが、表Bに示される配列に対して少なくとも80%同一(例えば、少なくとも85%、87%、90%、92%、95%、98%、99%、100%同一)である、請求項11又は12に記載のポリペプチド。
- 前記RNA編集ドメインが、前記標的RNA配列又は前記標的配列を含むRNAの少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、又は10(例えば、1~10、1~9、1~8、1~7、1~6、1~5、1~4、1~3、1~2、2~10、2~9、2~8、2~7、2~6、2~5、2~4、2~3、3~10、3~9、3~8、3~7、3~6、3~5、3~4、4~10、4~9、4~8、4~7、4~6、4~5、5~10、5~9、5~8、5~7、5~6、6~10、6~9、6~8、6~7、7~10、7~9、7~8、8~10、8~9、又は9~10)のヌクレオチドを修飾する、請求項1~13のいずれか一項に記載のポリペプチド。
- 前記RNA編集ドメインが、前記標的RNA配列又は前記標的配列を含むRNAの単一ヌクレオチドを修飾する、請求項1~14のいずれか一項に記載のポリペプチド。
- 前記RNA編集ドメインが、ある塩基を別の塩基に変化させる、例えば、シトシンをウラシルに;アデノシンをイノシンに;又はグアノシンをアデノシンに変化させる、請求項1~15のいずれか一項に記載のポリペプチド。
- 前記RNA編集ドメインが、前記標的RNA配列のアミノ酸コード配列を修飾する、請求項1~16のいずれか一項に記載のポリペプチド。
- 前記標的RNA配列の前記アミノ酸コード配列に対する前記修飾により、前記標的RNA配列によってコードされる産物ポリペプチドのアミノ酸配列が変更される、請求項17に記載のポリペプチド。
- 前記RNA編集ドメインが、前記標的RNA配列の少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、又は10(例えば、1~10、1~9、1~8、1~7、1~6、1~5、1~4、1~3、1~2、2~10、2~9、2~8、2~7、2~6、2~5、2~4、2~3、3~10、3~9、3~8、3~7、3~6、3~5、3~4、4~10、4~9、4~8、4~7、4~6、4~5、5~10、5~9、5~8、5~7、5~6、6~10、6~9、6~8、6~7、7~10、7~9、7~8、8~10、8~9、又は9~10)のヌクレオチド、及び任意選択的には前記標的RNA配列の1、2、3、4、5、6、7、8、9、又は10以下のヌクレオチドを修飾する、請求項1~18のいずれか一項に記載のポリペプチド。
- 前記RNA結合ドメインが、RNAの二次構造に結合する、請求項1~19のいずれか一項に記載のポリペプチド。
- 前記RNA結合ドメインが、プレmRNA、例えばプレmRNAのイントロン-エクソン接合部に結合する、請求項1~20のいずれか一項に記載のポリペプチド。
- 前記標的RNA配列又は前記標的RNA配列を含むRNAの二次構造を(例えばその形成を)阻害し、不安定化し、且つ/又は除去する、請求項1~21のいずれか一項に記載のポリペプチド。
- 前記標的RNA配列又は前記標的RNA配列を含むRNAのスプライシングを変更する、請求項1~22のいずれか一項に記載のポリペプチド。
- 前記標的RNA配列又は前記標的RNA配列を含むRNAのスプライシングをスプライス部位(例えば標的スプライス部位)で阻害し、例えば除去し、また任意選択的には前記標的RNA配列又は前記標的RNA配列を含むRNAのスプライシングを1以上の他のスプライス部位(例えば1以上の非標的スプライス部位)で阻害しない、請求項23に記載のポリペプチド。
- 遺伝子、例えば前記標的RNA配列をコードする遺伝子の発現を減少させる、請求項1~24のいずれか一項に記載のポリペプチド。
- 前記標的RNA配列によってコードされる産物ポリペプチドのレベルを低下させる、請求項1~25のいずれか一項に記載のポリペプチド。
- 前記標的RNA配列又は前記標的RNA配列を含むRNAにおける停止コドン、例えば未成熟停止コドンを除去する、請求項1~26のいずれか一項に記載のポリペプチド。
- 前記標的RNA配列又は前記標的RNA配列を含むRNAにおける停止コドン、例えば未成熟停止コドンを作出する、請求項1~27のいずれか一項に記載のポリペプチド。
- 前記RNA結合ドメインの前記複数のRNA塩基結合モチーフの少なくとも2(例えば、3、4、5、6、7、8、9又はそれ以上)が、リンカー、例えばアミノ酸リンカーによって連結される、請求項1~28のいずれか一項に記載のポリペプチド。
- 前記RNA結合ドメイン及び前記RNA編集ドメインが、リンカー、例えばアミノ酸リンカーによって連結される、請求項1~29のいずれか一項に記載のポリペプチド。
- スプライシング因子をさらに含む、請求項1~30のいずれか一項に記載のポリペプチド。
- 請求項1~31のいずれか一項に記載のポリペプチド、及び前記標的RNA配列に相補的な配列を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む組成物。
- 請求項1~32のいずれか一項に記載のポリペプチドをコードする核酸。
- RNA、例えばmRNAである、請求項33に記載の核酸。
- 請求項33又は34に記載の核酸、及び前記標的RNA配列に相補的な配列を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む組成物。
- 請求項33又は34に記載の核酸、及び前記標的RNA配列に相補的な配列を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドをコードする核酸を含む組成物。
- 請求項33又は34に記載の核酸を含む発現ベクター(例えば、プラスミドベクター、ウイルスベクター)。
- 請求項1~37のいずれか一項に記載の外因性ポリペプチド、請求項33若しくは34に記載の核酸、請求項35若しくは36に記載の組成物、又は請求項37に記載のベクターを含む宿主細胞(例えば、細菌宿主細胞、哺乳動物宿主細胞)。
- 請求項1~38のいずれか一項に記載のポリペプチド、核酸、ベクター、組成物、又は宿主細胞及び薬学的に許容できる賦形剤を含むGMPグレードの医薬組成物。
- 薬学的担体(例えば、小胞、リポソーム、LNP)中にカプセル封入又は製剤化された、請求項1~39のいずれか一項に記載のポリペプチド、核酸、ベクター、組成物、医薬組成物、又は宿主細胞。
- 標的RNAを修飾する(例えば、その配列を変化させる)方法であって、細胞、組織又は対象を、請求項1~40のいずれか一項に記載のポリペプチド、核酸、ベクター、組成物、又は宿主細胞、又はGMPグレードの医薬組成物と、前記ポリペプチドの前記RNA結合ドメインが前記細胞、組織又は対象における前記標的RNAに結合し、且つ前記ポリペプチドの前記RNA編集ドメインが前記標的RNAを編集するのに十分な量及び時間で接触させることを含む方法。
- 前記標的RNAが、二次及び/又は三次構造を有するプレmRNA又はmRNAである、請求項41に記載の方法。
- 前記標的RNAが、プレmRNA、例えばプレmRNAのイントロン-エクソン接合部である、請求項41又は42に記載の方法。
- 前記ポリペプチドが、前記標的RNAのヌクレオチド配列を変更する、請求項41~43のいずれか一項に記載の方法。
- 変更することが、前記標的RNA配列又は前記標的配列を含むRNAの少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、又は10(例えば、1~10、1~9、1~8、1~7、1~6、1~5、1~4、1~3、1~2、2~10、2~9、2~8、2~7、2~6、2~5、2~4、2~3、3~10、3~9、3~8、3~7、3~6、3~5、3~4、4~10、4~9、4~8、4~7、4~6、4~5、5~10、5~9、5~8、5~7、5~6、6~10、6~9、6~8、6~7、7~10、7~9、7~8、8~10、8~9、又は9~10)のヌクレオチドを修飾することを含む、請求項44に記載の方法。
- 変更することが、前記標的RNA配列又は前記標的配列を含むRNAの単一ヌクレオチドを修飾することを含む、請求項44に記載の方法。
- 変更することが、ある塩基を別の塩基に変化させること、例えば、シトシンをウラシルに;アデノシンをイノシンに;又はグアノシンをアデノシンに変化させることを含む、請求項44~46のいずれか一項に記載の方法。
- 変更することが、前記標的RNA配列のアミノ酸コード配列を修飾することを含む、請求項44~47のいずれか一項に記載の方法。
- 前記標的RNA配列の前記アミノ酸コード配列に対する前記修飾により、前記標的RNA配列によってコードされる産物ポリペプチドのアミノ酸配列が変更される、請求項48に記載の方法。
- 前記標的RNAが、細胞、組織又は対象においてプレmRNA又はmRNAを含み、且つ前記ポリペプチドが、前記プレmRNA又はmRNAの二次又は三次構造を変更する(例えば、増強又は低減する)、請求項41~49のいずれか一項に記載の方法。
- 前記標的RNAが、細胞、組織又は対象においてプレmRNA又はmRNAを含み、且つ前記ポリペプチドが、前記プレmRNA又はmRNAのスプライシングを変更する、請求項41~50のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ポリペプチドが、前記プレmRNA又はmRNAのスプライシングをスプライス部位(例えば標的スプライス部位)で阻害し、例えば除去し、且つ任意選択的には、前記プレmRNA又はmRNAのスプライシングを1以上の他のスプライス部位(例えば、1以上の非標的スプライス部位)で阻害しない、請求項51に記載のポリペプチド。
- 前記標的RNAが、エプスタイン・バーウイルス(EBV)mRNA、例えばEBV核抗原1(EBNA1)mRNAを含む、請求項1~52のいずれか一項に記載の医薬組成物、ポリペプチド、核酸、ベクター、組成物、宿主細胞、又は方法。
- 前記標的RNAが、棘筋ニューロン2(SMN2)mRNAを含む、請求項1~53のいずれか一項に記載の医薬組成物、ポリペプチド、核酸、ベクター、組成物、宿主細胞、又は方法。
- 前記標的RNAが、GluA2 mRNAを含む、請求項1~54のいずれか一項に記載の医薬組成物、ポリペプチド、核酸、ベクター、組成物、宿主細胞、又は方法。
- 前記ポリペプチドが、配列番号13~21から選択されるアミノ酸配列、又はそれらに対して少なくとも80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、若しくは99%の同一性を有する、若しくはそれらと比較して、1、2、3、4、5、6、7、8、9、若しくは10以下の塩基改変(例えば、置換、欠失、又は挿入)を有するアミノ酸配列を含む、請求項1~55のいずれか一項に記載の医薬組成物、ポリペプチド、核酸、ベクター、組成物、宿主細胞、又は方法。
- 前記RNA結合ドメインが、配列番号22~25から選択される、又はそれらと比較して1、2、3、4、5、6、7、8、9、若しくは10以下の塩基改変を有するRNA配列を含む標的RNA配列に結合する、請求項1~56のいずれか一項に記載の医薬組成物、ポリペプチド、核酸、ベクター、組成物、宿主細胞、又は方法。
- 対象、例えばヒト対象における疾患又は障害を治療する方法であって、請求項1~57のいずれか一項に記載のポリペプチド、医薬組成物、核酸、ベクター、組成物、又は宿主細胞を有効量で前記対象に投与し、それにより前記疾患又は障害を治療することを含み、
ここで前記疾患又は障害が、マイヤー・ゴーリン症候群、ゼッケル症候群4、ジュベール症候群5、レーバー先天黒内障10;シャルコー・マリー・トゥース病、2型;シャルコー・マリー・トゥース病、2型;アッシャー症候群、2C型;脊髄小脳失調28;脊髄小脳失調28;脊髄小脳失調28;QT延長症候群2;シェーグレン・ラルソン症候群;遺伝性フルクトース尿症;遺伝性フルクトース尿症;神経芽細胞腫;神経芽細胞腫;カルマン症候群1;カルマン症候群1;カルマン症候群1;異調染色性白血球栄養症、レット症候群、筋萎縮性側索硬化症タイプ10、リー・フラウメニ症候群、嚢胞性線維症、ハーラー症候群、α-1-アンチトリプシン(A1AT)欠乏、パーキンソン病、アルツハイマー病、白化現象、筋萎縮性側索硬化症、喘息、b-サラセミア、カダシル症候群、シャルコー・マリー・トゥース病、慢性閉塞性肺疾患(COPD)、遠位脊髄性筋萎縮(DSMA)、デュシェンヌ型/ベッカー型筋ジストロフィー、栄養障害型表皮水疱症、表皮水疱症、ファブリー病、第V因子ライデン関連障害、家族性腺腫性ポリポーシス、ガラクトース血症、ゴーシェ病、グルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼ、血友病、遺伝性ヘマトクロマトーシス、ハンター症候群、ハンチントン病、炎症性腸疾患(IBD)、遺伝性多凝集反応症候群、レーバー先天黒内障、レッシュ・ナイハン症候群、リンチ症候群、マルファン症候群、ムコ多糖症、筋ジストロフィー、筋緊張性ジストロフィーI型及びII型、神経線維腫症、ニーマン・ピック病A型、B型及びC型、NY-eso1関連がん、ポイツ・ジェガース症候群、フェニルケトン尿症、ポンペ病、原発性毛様体病、プロトロンビン変異関連障害、例えばプロトロンビンG20210A突然変異、肺高血圧症、網膜色素変性症、サンドホフ病、重症複合免疫不全症候群(SCID)、鎌状赤血球貧血、脊髄性筋萎縮、シュタルガルト病、テイ・サックス病、アッシャー症候群、X連鎖性免疫不全、スタージ・ウェーバー症候群、及びがんから選択される、方法。 - エプスタイン・バーウイルス(EBV)によって感染された、又はそれによる感染が疑われる対象(例えばヒト対象)を治療する方法であって、請求項1~58のいずれか一項に記載のポリペプチド、医薬組成物、核酸、ベクター、組成物、又は宿主細胞を有効量で前記対象に投与し、それによりエプスタイン・バーウイルス(EBV)によって感染された、又はそれによる感染が疑われる前記対象を治療することを含む方法。
- 前記対象が、単核球症又はがん(例えば、バーキットリンパ腫、ホジキンリンパ腫、及び上咽頭がん)を有する、請求項59に記載の方法。
- 棘筋萎縮(SMA)を有する対象(例えばヒト対象)を治療する方法であって、請求項1~60のいずれか一項に記載のポリペプチド、医薬組成物、核酸、ベクター、組成物、又は宿主細胞を有効量で前記対象に投与し、それによりSMAを有する前記対象を治療することを含む方法。
- 筋萎縮性側索硬化症(ALS)を有する対象(例えばヒト対象)を治療する方法であって、請求項1~61のいずれか一項に記載のポリペプチド、医薬組成物、核酸、ベクター、組成物、又は宿主細胞を有効量で前記対象に投与し、それによりALSを有する前記対象を治療することを含む方法。
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