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JP7384801B2 - Ｃａｓ９変異体及び使用方法 - Google Patents

Ｃａｓ９変異体及び使用方法 Download PDF

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Description

本願は、２０１７年１２月１５日出願の米国仮特許出願第６２／５９９，１７６号の利益を主張するものであり、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
本開示は分子生物学の分野に関し、特に、細胞のゲノムを改変するためのガイドポリヌクレオチド／Ｃａｓエンドヌクレアーゼシステムの組成物、並びにその組成物及びその方法に関する。
電子的に提出された配列表の参照
配列表の正式な写しは、２０１８年１１月２９日作成の２０１８１１２９＿ＮＢ４１３１７ＰＣＴ＿ＳＴ２５．ｔｘｔのファイル名を備え、４７６キロバイトのサイズを有するＡＳＣＩＩフォーマットの配列表としてＥＦＳ－Ｗｅｂを介して電子的に提出され、本明細書と同時に提出されている。このＡＳＣＩＩフォーマット文献に含まれる配列表は、本明細書の一部であり、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
組み換えＤＮＡ技術により、標的ゲノム位置にＤＮＡ配列を挿入すること、及び／又は特定の内因性染色体配列を改変することが可能になった。部位特異的組み換えシステムを使用する部位特異的組み込み技術は、他の組み換え技術と同様、様々な生命体における目的遺伝子の標的挿入の生成に使用されてきた。Ｃａｓシステムの部位特異的性質を前提して、例えば、哺乳動物細胞中での、このシステムに基づくゲノム改変／操作技術が説明されている（例えば、Ｈｓｕ ｅｔ ａｌ．，２０１４を参照されたい）。Ｃａｓベースのゲノム操作は、意図したとおりに機能する場合、ｃｒＲＮＡのＤＮＡターゲティング領域（すなわち、可変ターゲティングドメイン）がゲノム中の所望の標的部位に対して相同である組み換えｃｒＲＮＡ（又は同等に機能するガイドポリヌクレオチド）を設計し、この組み換えｃｒＲＮＡとＣａｓエンドヌクレアーゼとを宿主細胞中で（任意の好都合な従来の手段によって）機能的複合体へと組み合わせることにより、複雑なゲノム内の任意の特定の位置を事実上標的とする能力を付与する。
Ｃａｓベースのゲノム操作技術は多くの様々な宿主細胞種に適用されてきたが、これらの技術には限界があることが知られている。例えば、特定の宿主細胞（例えば、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種が挙げられるが、これに限定されない）を形質転換する効率は低く、費用もかかるままである。
したがって、原核細胞又は真核細胞のゲノム標的部位を変更／改変するための、より効果的で、効率がよく、或いは、より強力であるか、又は柔軟性に富むＣａｓベースのゲノム改変方法、及びその組成物を開発することが依然要望されている。
変異体（多様体）Ｃａｓシステム及びそのようなシステムを含むエレメント、例えば、以下に限定されないが、Ｃａｓエンドヌクレアーゼ変異体、ガイドポリヌクレオチド、ガイドポリヌクレオチド／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ複合体、ガイドＲＮＡ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼシステム、特に、そのＨＮＨ及びＲｕｖＣドメインの外側に位置する少なくとも１つのアミノ酸改変を含むＣａｓ９エンドヌクレアーゼ変異体のための組成物及び方法、並びに、場合により、そのＣａｓ９エンドヌクレアーゼ変異体が、少なくとも１つのアミノ酸改変を有さないその親Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼと比較して、少なくとも１つの特性が改善されている組成物及び方法が提供される。
Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼ変異体、ガイドポリヌクレオチド、並びに少なくとも１つのＣａｓ９エンドヌクレアーゼ変異体及び少なくとも１つのガイドＲＮＡを含むガイドポリヌクレオチド／Ｃａｓエンドヌクレアーゼシステムを直接送達するための組成物及び方法も、原核細胞又は真核細胞のゲノムにおける標的配列のゲノム改変、遺伝子の編集、及び生命体のゲノムへ又は生命体のゲノムから目的ポリヌクレオチドを挿入又は欠失させるための組成物及び方法もまた提供される。
本開示の一実施形態では、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼ変異体は、配列番号２に記載の親Ｃａｓ９ポリペプチドと少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有し、且つ８６位、９８位、１５５位、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される位置に少なくとも１つのアミノ酸置換を有する、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼ変異体又はその活性断片である（ここで、変異体のアミノ酸位置は、前記親Ｃａｓ９ポリペプチドのアミノ酸配列と対応させて番号付けされ、前記Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼ変異体はエンドヌクレアーゼ活性を有する）。前記Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼ変異体は、Ｙ１５５Ｈ、Ｙ１５５Ｎ、Ｙ１５５Ｅ、Ｙ１５５Ｆ（１５５位において）、Ｆ８６Ａ（８６位において）及びＦ９８Ａ（９８位において）からなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸置換を有し得る。Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼ変異体は、その親Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼと比較して、形質転換効率の改善及び編集効率の改善からなる群から選択される少なくとも１つの特性の改善を有し得る。Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼ変異体又はその活性断片は、その親Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼと比較した場合、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個のアミノ酸置換を有し得る。
本開示の一実施形態では、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼ変異体は、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼ変異体、又はその活性断片であり、前記変異体は配列番号２のアミノ酸配列に対し７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
本開示の一実施形態では、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼ変異体は、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼ変異体であり、その特性の改善は形質転換効率の改善であり、前記変異体又はその活性断片はまた編集効率の改善を有する。
本開示の一実施形態では、組成物は、本明細書に開示されるＣａｓ９エンドヌクレアーゼ変異体、又はその機能的断片を含む組成物である。組成物は、ガイドポリヌクレオチド／Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼ複合体、ガイドＲＮＡ／Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼ複合体、及び前記Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼ変異体を含む融合タンパク質からなる群から選択することができる。
本開示の一実施形態では、ポリヌクレオチドは、本明細書に開示される任意の１つのＣａｓ９エンドヌクレアーゼ変異体をコードする核酸配列を含むポリヌクレオチドである。
本開示の一実施形態では、ガイドポリヌクレオチド／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ複合体（ＰＧＥＮ）は、少なくとも１つのガイドポリヌクレオチドと本明細書に記載の少なくとも１つのＣａｓ９エンドヌクレアーゼ変異体とを含むＰＧＥＮであり、ここで、前記ガイドポリヌクレオチドは天然に存在しないキメラガイドポリヌクレオチドであり、前記ガイドポリヌクレオチド／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ複合体は標的配列の全部又は一部を認識し、結合し、場合によりニッキング、ほどき、又は切断を行うことができる。
本開示の１つの実施形態では、方法は、細胞のゲノム中の標的部位を改変する方法であって、少なくとも１つのガイドポリヌクレオチドと本明細書に記載の少なくとも１つのＣａｓ９エンドヌクレアーゼ変異体とを含む少なくとも１つのＰＧＥＮを細胞に導入すること、及び前記標的に改変を有する少なくとも１つの細胞を同定することを含み、前記標的部位の改変は、（ｉ）少なくとも１つのヌクレオチドの置換、（ｉｉ）少なくとも１つのヌクレオチドの欠失、（ｉｉｉ）少なくとも１つのヌクレオチドの挿入、及び（ｉｖ）（ｉ）～（ｉｉｉ）の任意の組み合わせからなる群から選択される方法を含む。
本開示の一実施形態では、方法は、細胞のゲノム中のヌクレオチド配列を編集する方法であって、少なくとも１つのガイドポリヌクレオチドと本明細書に記載の少なくとも１つのＣａｓ９エンドヌクレアーゼ変異体とを含む少なくとも１つのＰＧＥＮ、及びポリヌクレオチド改変テンプレートに導入することを含み、前記ポリヌクレオチド改変テンプレートは前記ヌクレオチド配列の少なくとも１つのヌクレオチド改変を含む方法を含む。
本開示の一実施形態では、方法は、細胞のゲノム中の標的部位を改変する方法であって、少なくとも１つのガイドポリヌクレオチドと本明細書に記載の少なくとも１つのＣａｓ９エンドヌクレアーゼ変異体とを含む少なくとも１つのＰＧＥＮ、及び少なくとも１つのドナーＤＮＡを細胞に導入することを含み、前記ドナーＤＮＡは目的ポリヌクレオチドを含む方法を含む。
本開示の一実施形態では、方法は、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼ変異体の少なくとも１つの特性を改善する方法であって、親Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼに少なくとも１つのアミノ酸改変を導入し（ここで、前記少なくとも１つのアミノ酸改変は親Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼのＲｕｖＣ及びＨＮＨドメインの外側に位置する）、それによって、前記Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼ変異体を作製する（ここで、前記Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼ変異体は前記親Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼと比較して少なくとも１つの特性の改善を示す）ことを含む方法を含む。少なくとも１つのアミノ酸改変は、８６位、９８位、１５５位、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される位置でのアミノ酸置換であり得る（ここで、変異体のアミノ酸位置は前記親Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼのアミノ酸配列と対応させて番号付けされる）。少なくとも１つのアミノ酸置換は、Ｙ１５５Ｈ、Ｙ１５５Ｎ、Ｙ１５５Ｅ、Ｙ１５５Ｆ（１５５位において）、Ｆ８６Ａ（８６位において）及びＦ９８Ａ（９８位において）からなる群から選択され得る。
また、本明細書に記載の方法によって作製される、改変標的配列を有するか、又は原核細胞及び真核細胞のゲノム中のヌクレオチド配列に改変を有する、発現カセット、組み換えＤＮＡ、核酸コンストラクト、原核細胞及び真核細胞も提供される。本開示の方法及び組成物のさらなる実施形態を本明細書で示す。
図面及び配列表の簡単な説明
本開示は、本願の一部を形成する下記の詳細な説明並びに本明細書に付随する図面及び配列表から、より十分に理解することができよう。配列の記載及び本明細書に添付した配列表は、３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．§§１．８２１－１．８２５に規定されている特許出願におけるヌクレオチド配列及びアミノ酸配列の開示に適用される規則に適合している。配列の記載は、３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．§§１．８２１－１．８２５（これは参照により本明細書に組み込まれる）で定義されるアミノ酸の３文字コードを含む。
図１は、Ｃａｓ９ポリペプチド及びそのＣａｓ９タンパク質ドメインの概略図を示す。黒塗りはＲｕｖＣヌクレアーゼドメインを示し、クロスハッチはブリッジヘリックスを示し、斜線塗りはＲＥＣ Ｉドメインを示し、中間の灰色塗りはＲＥＣ ＩＩドメインを示し、薄い灰色塗りはＨＮＨヌクレアーゼドメインを示し、ボール塗りはＰＡＭ認識ドメインを示す。（出典Ｊｉｎｅｋ Ｍ．，Ｊｉａｎｇ Ｆ．，Ｔａｙｌｏｒ Ｄ．Ｗ．ｅｔ ａｌ．２０１４，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３４３，１２４７９９７）。本明細書に記載のＣａｓ９エンドヌクレアーゼ変異体のＹ１５５改変は、ＲＥＣ１ドメインに位置する。 図２は、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼの一次アミノ酸構造上にマッピングされたドメイン構造を示す。本明細書に記載のＣａｓ９ Ｙ１５５エンドヌクレアーゼ変異体のＹ１５５改変の位置（ＲＥＣ１ドメイン中）を矢印で示す。 図３は、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼの一次アミノ酸構造上にマッピングされたドメイン構造を示す。本明細書に記載のＣａｓ９エンドヌクレアーゼＦ８６－Ｆ９８変異体のＦ８６及びＦ９８改変の位置を矢印で示す。
下記の配列は、３７ Ｃ．Ｆ．Ｒ．§§１．８２１－１．８２５（「ヌクレオチド配列及び／又はアミノ酸配列の開示を含有する特許出願のための要件－配列規則」）に適合しており、世界知的所有権機関（Ｗｏｒｌｄ Ｉｎｔｅｌｌｅｃｔｕａｌ Ｐｒｏｐｅｒｔｙ Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ）（ＷＩＰＯ）標準ＳＴ．２５（２００９）、欧州特許条約（ＥＰＣ）の配列表要件、並びに特許協力条約（ＰＣＴ）規則５．２及び４９．５（ａ－ｂｉｓ）、実施細則第２０８号及び実施細則附属書Ｃと一致している。ヌクレオチド及びアミノ酸配列データのために使用した記号及びフォーマットは、３７ Ｃ．Ｆ．Ｒ．§１．８２２に規定された規則に従っている。
配列番号１は、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９のアミノ酸配列を示す。
配列番号２は、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９の野生型Ｃａｓ９タンパク質をコードする、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）にコドンを最適化したＣａｓ９遺伝子のヌクレオチド配列を示す。
配列番号３は、Ｎ末端ＮＬＳのアミノ酸配列を示す。
配列番号４は、Ｃ末端ＮＬＳのアミノ酸配列を示す。
配列番号５は、デカ－ヒスチジンタグのアミノ酸配列を示す。
配列番号６は、６ ａｐｒＥプロモーターのヌクレオチド配列を示す。
配列番号７は、ターミネーターのヌクレオチド配列を示す。
配列番号８～９、１２～１３、３８～３９、４１～４２、５０～５１、５４～５５、５９～６０、６７～６８、７１～７２、７９～８０、８８～８９、９１～９２、１１１～１１２、１１９～１２０、１３８～１３９、１４５～１４６、１５１～１５２、１５６～１５７は、プライマーのヌクレオチド配列を示す。
配列番号１０は、ｐＫＢ３２０骨格のヌクレオチド配列を示す。
配列番号１１は、ｐＫＢ３２０のヌクレオチド配列を示す。
配列番号１４は、プラスミドＲＳＰ１のヌクレオチド配列を示す。
配列番号１５は、プラスミドＲＳＰ２のヌクレオチド配列を示す。
配列番号１６～２７は、それぞれプラスミドＦＳＰ１、ＦＳＰ２、ＦＳＰ３、ＦＳＰ４、ＦＳＰ５、ＦＳＰ６、ＦＳＰ７、ＲＳＰ３、ＦＳＰ８、ｐＲＦ６９４、ｐＲＦ８０１及びｐＲＦ８０６のヌクレオチド配列を示す。
配列番号２８は、バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）の標的部位１のヌクレオチド配列を示す。
配列番号２９は、バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）の標的部位１のヌクレオチド配列を示す。
配列番号３０は、ｓｅｒＡ１オープンリーディングフレームのヌクレオチド配列を示す。
配列番号３１は、バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）の標的部位１＋ＰＡＭのヌクレオチド配列を示す。
配列番号３２は、可変ターゲティングドメイン１をコードするＤＮＡのヌクレオチド配列を示す。
配列番号３３は、ＣＥＲドメインをコードするＤＮＡのヌクレオチド配列を示す。
配列番号３４は、標的部位１を標的とするｇＲＮＡのヌクレオチド配列を示す。
配列番号３５は、ｓｐａｃプロモーターのヌクレオチド配列を示す。
配列番号３６は、ｔ０ターミネーターのヌクレオチド配列を示す。
配列番号３７は、バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）のｓｅｒＡ１ホモロジーアーム１のヌクレオチド配列を示す。
配列番号４０は、バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）のｓｅｒＡ１ホモロジーアーム２のヌクレオチド配列を示す。
配列番号４３は、ｔｓ１ ｇＲＮＡ発現カセットをコードするＤＮＡのヌクレオチド配列を示す。
配列番号４４は、ｓｅｒＡ１欠失編集テンプレートのヌクレオチド配列を示す。
配列番号４５は、バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）のｒｇｈＲ１オープンリーディングフレームのヌクレオチド配列を示す。
配列番号４６は、バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）の標的部位２のヌクレオチド配列を示す。
配列番号４７は、バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）の標的部位２＋ＰＡＭのヌクレオチド配列を示す。
配列番号４８は、可変ターゲティングドメイン２をコードするＤＮＡのヌクレオチド配列を示す。
配列番号４９は、標的部位２を標的とするガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）のヌクレオチド配列を示す。
配列番号５０は、バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）由来のｒｇｈＲ１のホモロジーアーム１のヌクレオチド配列を示す。
配列番号５３は、バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）由来のｒｇｈＲ１のホモロジーアーム２のヌクレオチド配列を示す。
配列番号５６は、ｔｓ２発現カセットをコードするＤＮＡのヌクレオチド配列を示す。
配列番号５７は、ｒｇｈＲ１欠失編集テンプレートのヌクレオチド配列を示す。
配列番号５８は、Ｃａｓ９ Ｙ１５５Ｈ変異体のアミノ酸配列を示す。
配列番号６１は、ｐＲＦ８２７のヌクレオチド配列を示す。
配列番号６２は、Ｃａｓ９ Ｙ１５５Ｈ変異体発現カセットのヌクレオチド配列を示す。
配列番号６３は、ｐＲＦ８５６のヌクレオチド配列を示す。
配列番号６４は、ｐＢＬ．ｃｏｍＫ－ｓｙｎのヌクレオチド配列を示す。
配列番号６５は、バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）由来の標的部位１遺伝子座のヌクレオチド配列を示す。
配列番号６６は、標的部位１の編集された遺伝子座のヌクレオチド配列を示す。
配列番号６９は、バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）由来の標的部位２遺伝子座のヌクレオチド配列を示す。
配列番号７０は、標的部位２の編集された遺伝子座のヌクレオチド配列を示す。
配列番号７３は、ヤロウイア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）にコドンを最適化したＣａｓ９のヌクレオチド配列を示す。
配列番号７４は、ＳＶ４０ ＮＬＳのヌクレオチド配列を示す。
配列番号７５は、ヤロウイア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）ＦＢＡ１プロモーターのヌクレオチド配列を示す。
配列番号７６は、ヤロウイア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）Ｃａｓ９発現カセットのヌクレオチド配列を示す。
配列番号７７は、ｐＺｕｆＣａｓ９のヌクレオチド配列を示す。
配列番号７８は、Ｃａｓ９－ＳＶ４０融合体のヌクレオチド配列を示す。
配列番号８１は、Ｃａｓ９－ＳＶ４０ ＰＣＲ産物のヌクレオチド配列を示す。
配列番号８２～８３は、それぞれｐＢＡＤ／ＨｉｓＢ及びｐＲＦ４８のヌクレオチド配列を示す。
配列番号８４は、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）最適化Ｃａｓ９発現カセットのヌクレオチド配列を示す。
配列番号８５～８６は、それぞれｐＫＯ３及びｐＲＦ９７のヌクレオチド配列を示す。
配列番号８７は、合成断片をコードするＣａｓ９ Ｙ１５５Ｈのヌクレオチド配列を示す。
配列番号９０は、ｐＲＦ９７－Ｙ１５５Ｈ断片のヌクレオチド配列を示す。
配列番号９３は、ｐＲＦ８６１のヌクレオチド配列を示す。
配列番号９４は、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）由来のｎａｃ遺伝子のヌクレオチド配列を示す。
配列番号９５は、ｎａｃ標的部位１のヌクレオチド配列を示す。
配列番号９６は、ｎａｃ標的部位１＋ＰＡＭ
Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）のヌクレオチド配列を示す。
配列番号９７は、ｎａｃ標的部位１のヌクレオチド配列を示す。
配列番号９８は、ｎａｃ標的部位１＋ＰＡＭのヌクレオチド配列を示す。
配列番号９９は、Ｎ２５ファージプロモーターのヌクレオチド配列を示す。
配列番号１００は、ｎａｃ標的部位１ ｇＲＮＡ発現カセットのヌクレオチド配列を示す。
配列番号１０１は、ｎａｃ標的部位２ ｇＲＮＡ発現カセットのヌクレオチド配列を示す。
配列番号１０２は、ｎａｃ上流欠失アームのヌクレオチド配列を示す。
配列番号１０３は、ｎａｃ下流欠失アームのヌクレオチド配列を示す。
配列番号１０４は、ｎａｃ欠失編集テンプレートのヌクレオチド配列を示す。
配列番号１０５は、５’ｐＲＦ９７又はｐＲＦ８６１同一性のヌクレオチド配列を示す。
配列番号１０６は、３’ｐＲＦ９７又はｐＲＦ８６１同一性のヌクレオチド配列を示す。
配列番号１０７は、ｎａｃＥＴ部位１のヌクレオチド配列を示す。
配列番号１０８は、ｎａｃＥＴ部位２のヌクレオチド配列を示す。
配列番号１０９は、ｐＲＦ９７－カセットのヌクレオチド配列を示す。
配列番号１１０は、ｐＲＦ８６１－カセットのヌクレオチド配列を示す。
配列番号１１３は、ｐＲＦ９７－ｎａｃＥＴ部位１のヌクレオチド配列を示す。
配列番号１１４は、ｐＲＦ９７－ｎａｃＥＴ部位２のヌクレオチド配列を示す。
配列番号１１５は、ｐＲＦ８６１－ｎａｃＥＴ部位１のヌクレオチド配列を示す。
配列番号１１６は、ｐＲＦ８６１－ｎａｃＥＴ部位２のヌクレオチド配列を示す。
配列番号１１７は、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）由来の野生型（ＷＴ）ｎａｃ遺伝子座のヌクレオチド配列を示す。
配列番号１１８は、編集されたｎａｃ遺伝子座のヌクレオチド配列を示す。
配列番号１２１は、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９のヌクレオチド配列を示す。
配列番号１２２は、Ｃａｓ９ Ｙ１５５Ｈ変異体をコードするヌクレオチド配列を示す。
配列番号１２３は、Ｃａｓ９ Ｙ１５５Ｎ変異体のアミノ酸配列を示す。
配列番号１２４は、Ｃａｓ９ Ｙ１５５Ｎ変異体をコードするヌクレオチド配列を示す。
配列番号１２５は、Ｃａｓ９ Ｙ１５５Ｅ変異体のアミノ酸配列を示す。
配列番号１２６は、Ｃａｓ９ Ｙ１５５Ｅ変異体をコードするヌクレオチド配列を示す。
配列番号１２７は、Ｃａｓ９ Ｙ１５５Ｆ変異体のアミノ酸配列を示す。
配列番号１２８は、Ｃａｓ９ Ｙ１５５Ｆ変異体をコードするヌクレオチド配列を示す。
配列番号１２９は、Ｃａｓ９ Ｆ８６Ａ－Ｆ９８Ａ変異体のアミノ酸配列を示す。
配列番号１３０は、Ｆ８６Ａ－Ｆ９８Ａ合成断片のヌクレオチド配列を示す。
配列番号１３１は、Ｆ８６Ａ Ｆ９８ＡのｐＲＦ８０１骨格のヌクレオチド配列を示す。
配列番号１３２は、ｐＲＦ８０１骨格フォワードのヌクレオチド配列を示す。
配列番号１３３は、ｐＲＦ８０１骨格リバースのヌクレオチド配列を示す
配列番号１３４は、Ｆ８６Ａ－Ｆ９８Ａ合成フォワードのヌクレオチド配列を示す。
配列番号１３５は、Ｆ８６Ａ－Ｆ９８Ａ合成リバースのヌクレオチド配列を示す。
配列番号１３６は、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）Ｆ８６Ａ Ｆ９８Ａ発現カセットのヌクレオチド配列を示す。
配列番号１３７は、ｐＲＦ８６６のヌクレオチド配列を示す。
配列番号１４０は、ＲＮＲ２ｐプロモーターのヌクレオチド配列を示す。
配列番号１４１は、２ミクロン複製起点１のヌクレオチド配列を示す。
配列番号１４２は、ＫａｎＭＸ発現カセットのヌクレオチド配列を示す。
配列番号１４３は、ＳＮＲ５２ｐプロモーターのヌクレオチド配列を示す。
配列番号１４４は、ｐＳＥ０８７プラスミドのヌクレオチド配列を示す。
配列番号１４７は、ｓｇＲＮＡ＋Ｔ（６）ターミネーターを標的とするヌクレオチド配列を示す。
配列番号１４８は、５０ｂｐ上流ホモロジーアームのヌクレオチド配列を示す。
配列番号１４９は、ｓｇＲＮＡ＋Ｔ（６）ターミネーターを標的とするＵＲＡ３のヌクレオチド配列を示す。
配列番号１５０は、５０ｂｐの下流ホモロジーアームのヌクレオチド配列を示す。
配列番号１５３は、２ミクロン複製起点２のヌクレオチド配列を示す。
配列番号１５４は、１５４アンピシリン耐性遺伝子のヌクレオチド配列を示す。
配列番号１５５は、ＲＮＲ２ターミネーターのヌクレオチド配列を示す。
変異体Ｃａｓシステム及びそのようなシステムを含むエレメント、例えば、以下に限定されないが、Ｃａｓエンドヌクレアーゼ変異体、Ｃａｓエンドヌクレアーゼ変異体を含むガイドポリヌクレオチド／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ複合体、並びにＣａｓエンドヌクレアーゼ変異体と相互作用することができるガイドポリヌクレオチド及びガイドＲＮＡエレメントのための組成物及び方法が提供される。Ｃａｓエンドヌクレアーゼ変異体、ガイドＲＮＡ、及びガイドＲＮＡ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ複合体の直接送達のための組成物及び方法も提供される。本開示はさらに、細胞のゲノムにおける標的配列のゲノム改変、遺伝子編集、及び細胞のゲノムへの目的ポリヌクレオチドの挿入のための組成物及び方法を含む。
本明細書は、読み易くするために多くのセクションで編成されている。しかしながら、読者は、１つのセクションでなされた記載を他のセクションに適用できることは理解していよう。このように、本開示の異なるセクションで使用された見出しを限定的であると解釈すべきではない。
本明細書に示した見出しは、本明細書全体を参照することによって得ることができる本組成物及び方法の様々な態様又は実施形態を限定するものではない。したがって、すぐ下で定義する用語は、本明細書全体を参照することによってより十分に定義される。
他に定義されていない限り、本明細書で使用する全ての技術用語及び科学用語は、本発明の組成物及び方法が属する分野の当業者であれば一般に理解される意味と同一の意味を有する。本組成物及び本方法を実施又は試験するにあたって、本明細書に記載のものに類似した、又は同等の方法及び材料もまた使用することができるが、ここで、説明に役立つ代表的な方法及び材料を記載する。
本明細書に引用されている全ての刊行物及び特許は、個々の刊行物又は特許が、具体的且つ個別に、参照により組み込まれ、それらの刊行物が関連して引用している方法及び／又は材料を開示し記載するよう指示されているかのように、参照により本明細書に組み込まれる。
Ｃａｓ遺伝子及びタンパク質
ＣＲＩＳＰＲ（クラスターを形成し規則正しい間隔を持つ短いパリンドロームリピート）遺伝子座は、例えば、外来ＤＮＡを破壊するために細菌及び古細菌細胞によって使用される、ＤＮＡ切断システムの成分をコードする特定の遺伝子座を指す（Ｈｏｒｖａｔｈ ａｎｄ Ｂａｒｒａｎｇｏｕ，２０１０，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３２７：１６７－１７０、国際公開第２００７／０２５０９７号パンフレット（２００７年３月１日公開））。ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座は、短い可変ＤＮＡ配列（「スペーサー」と呼ばれる）によって分離された短い直列反復配列（ＣＲＩＳＰＲリピート）を含むＣＲＩＳＰＲアレイから構成され得、これは多様なＣａｓ（ＣＲＩＳＰＲ関連）遺伝子によって隣接され得る。所与のＣＲＩＳＰＲ遺伝子座におけるＣＲＩＳＰＲ関連遺伝子の数は、種によって変わり得る。マルチサブユニットエフェクター複合体（Ｉ型、ＩＩＩ型及びＩＶ型サブタイプを含む）を有するクラス１システム、並びに単一タンパク質エフェクター（Ｃａｓ９、Ｃｐｆ１、Ｃ２ｃ１、Ｃ２ｃ２、Ｃ２ｃ３などであるがこれらに限定されない、ＩＩ型及びＶ型サブタイプを含む）を有するクラス２システムを含む、複数のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムが記載されている。クラス１システム（Ｍａｋａｒｏｖａ ｅｔ ａｌ．２０１５，Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ Ｖｏｌ．１３：１－１５、Ｚｅｔｓｃｈｅ ｅｔ ａｌ．，２０１５，Ｃｅｌｌ １６３，１－１３、Ｓｈｍａｋｏｖ ｅｔ ａｌ．，２０１５，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ＿Ｃｅｌｌ ６０，１－１３、Ｈａｆｔ ｅｔ ａｌ．，２００５，Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ，ＰＬｏＳ Ｃｏｍｐｕｔ Ｂｉｏｌ １（６）：ｅ６０．ｄｏｉ：１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｃｂｉ．００１００６０及び国際公開第２０１３／１７６７７２Ａ１号パンフレット（２０１３年１１月２３日公開）（これらの文献は参照により本明細書に組み込まれる））。細菌由来のＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、ＣａｓエンドヌクレアーゼをＤＮＡ標的にガイドするために、ｃｒＲＮＡ（ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ）及びｔｒａｃｒＲＮＡ（トランス活性化ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ）を使用する。ｃｒＲＮＡは、二本鎖ＤＮＡ標的の１本鎖に相補的なスペーサー領域と、ｔｒａｃｒＲＮＡ（トランス活性化ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ）と塩基対合し、Ｃａｓエンドヌクレアーゼを導き、ＤＮＡ配列を切断させるＲＮＡ二本鎖を形成する領域とを含む。スペーサーは、Ｃａｓ１及びＣａｓ２タンパク質を伴う十分解明されていないプロセスによって得られる。全てのＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ遺伝子座は、ｃａｓ９遺伝子に加えてｃａｓ１及びｃａｓ２遺伝子を含む（Ｃｈｙｌｉｎｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，２０１３，ＲＮＡ Ｂｉｏｌｏｇｙ １０：７２６－７３７、Ｍａｋａｒｏｖａ ｅｔ ａｌ．２０１５，Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ Ｖｏｌ．１３：１－１５）。ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ遺伝子座はそれぞれのＣＲＩＳＰＲアレイ内の反復配列に部分的に相補的であるｔｒａｃｒＲＮＡをコードすることができ、Ｃｓｎ１及びＣｓｎ２などの他のタンパク質を含むことができる。Ｃａｓ１及びｃａｓ２遺伝子の近傍にｃａｓ９が存在することは、ＩＩ型遺伝子座の特徴である（Ｍａｋａｒｏｖａ ｅｔ ａｌ．２０１５，Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ Ｖｏｌ．１３：１－１５）。Ｉ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ（ＣＲＩＳＰＲ関連）システムは、カスケード（抗ウイルス防御のためのＣＲＩＳＰＲ関連複合体）と呼ばれるタンパク質の複合体からなり、単一のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）及びＣａｓ３とともに機能して、侵入ウイルスＤＮＡを防御する（Ｂｒｏｕｎｓ，Ｓ．Ｊ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ３２１：９６０－９６４）、Ｍａｋａｒｏｖａ ｅｔ ａｌ．２０１５，Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ；Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ Ｖｏｌ．１３：１－１５（これらの文献は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる））。
本明細書における用語「Ｃａｓ遺伝子」は、一般に、隣接するＣＲＩＳＰＲ遺伝子座に結合した、関連した、若しくは近接する、又は近傍にある遺伝子を指す。用語「Ｃａｓ遺伝子」、「ｃａｓ遺伝子」、「ＣＲＩＳＰＲ－関連（Ｃａｓ）遺伝子」及び「クラスターを形成し規則正しい間隔を持つ短いパリンドロームリピート関連遺伝子」は、本明細書では互換的に使用される。
用語「Ｃａｓタンパク質」又は「Ｃａｓポリペプチド」は、Ｃａｓ（ＣＲＩＳＰＲ関連）遺伝子によってコードされるポリペプチドを指す。Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓエンドヌクレアーゼを含む。
Ｃａｓタンパク質は細菌又は古細菌のタンパク質であり得る。本明細書におけるＩ～ＩＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓタンパク質は、一般に、起源が原核生物であり、例えば、Ｉ型及びＩＩＩ型Ｃａｓタンパク質は、細菌種又は古細菌種に由来し得、一方、ＩＩ型Ｃａｓタンパク質（すなわち、Ｃａｓ９）は、細菌種に由来し得る。他の態様においては、Ｃａｓタンパク質として、Ｃａｓ１、Ｃａｓ１Ｂ、Ｃａｓ２、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８、Ｃａｓ９、Ｃａｓ１０、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｃｓｅ１、Ｃｓｅ２、Ｃｓｃ１、Ｃｓｃ２、Ｃｓａ５、Ｃｓｎ２、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、Ｃｓｍ５、Ｃｓｍ６、Ｃｍｒ１、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｍｒ６、Ｃｓｂ１、Ｃｓｂ２、Ｃｓｂ３、Ｃｓｘ１７、Ｃｓｘ１４、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１６、ＣｓａＸ、Ｃｓｘ３、Ｃｓｘ１、Ｃｓｘ１５、Ｃｓｆ１、Ｃｓｆ２、Ｃｓｆ３、Ｃｓｆ４、それらの相同体、又はそれらの改変型の１つ以上が挙げられる。Ｃａｓタンパク質としては、Ｃａｓ９タンパク質、Ｃｐｆ１タンパク質、Ｃ２ｃ１タンパク質、Ｃ２ｃ２タンパク質、Ｃ２ｃ３タンパク質、Ｃａｓ３、Ｃａｓ３－ＨＤ、Ｃａｓ５、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８、Ｃａｓ１０、又はこれらの組み合わせ若しくは複合体が挙げられる。
用語「Ｃａｓエンドヌクレアーゼ」は、好適なポリヌクレオチド成分と複合体を形成している場合、特定のＤＮＡ標的配列の全て又は一部を認識し、結合し、場合によりニッキング又は切断し得る。Ｃａｓエンドヌクレアーゼは、ガイドポリヌクレオチドによりガイドされて、二本鎖ＤＮＡ中の特定の標的部位の全て又は一部を（例えば、細胞のゲノム中の標的部位で）認識し、結合し、場合によりニッキング又は切断する。本明細書に記載のＣａｓエンドヌクレアーゼは、１つ以上のヌクレアーゼドメインを含む。本明細書に記載するドナーＤＮＡ挿入方法で用いられるＣａｓエンドヌクレアーゼは、標的部位でＤＮＡに一本鎖又は二本鎖切断を導入するエンドヌクレアーゼである。或いは、Ｃａｓエンドヌクレアーゼは、好適なＲＮＡ成分と複合化した場合、ＤＮＡ切断活性又はニッキング活性を欠くことがあるが、ＤＮＡ標的配列には依然として特異的に結合することができる。
本明細書で使用される場合、「Ｃａｓ９」（以前はＣａｓ５、Ｃｓｎ１、若しくはＣｓｘ１２と称された）若しくは「Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼ」と称される、又は「Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼ活性」を有するポリペプチドは、ＤＮＡ標的配列の全部又は一部に特異的に結合し、場合によりニッキング又は切断するために、ｃｒヌクレオチド及びｔｒａｃｒヌクレオチドと、又は単一のガイドポリヌクレオチドと複合体を形成するＣａｓエンドヌクレアーゼを指す。Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼは、ＲｕｖＣヌクレアーゼドメイン、及びＨＮＨ（Ｈ－Ｎ－Ｈ）ヌクレアーゼドメインを含み、これらはそれぞれ、標的配列にて一本鎖ＤＮＡを切断する（両ドメインが協調して作用すると、ＤＮＡ二本鎖が切断されるが、一方のドメインの活性ではニッキングに至る）。一般に、ＲｕｖＣドメインは、サブドメインＩ、ＩＩ、及びＩＩＩを含み、ドメインＩは、Ｃａｓ９のＮ末端の近くに位置し、サブドメインＩＩ及びＩＩＩは、ＨＮＨドメインに隣接してタンパク質の中央に位置する（Ｍａｋａｒｏｖａ ｅｔ ａｌ．２０１５，Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ Ｖｏｌ．１３：１－１５、Ｈｓｕ ｅｔ ａｌ，２０１３，Ｃｅｌｌ １５７：１２６２－１２７８）。Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼは、通常、少なくとも１つのポリヌクレオチド成分と複合体を形成するＣａｓ９エンドヌクレアーゼを利用するＤＮＡ切断システムを含むＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステムに由来する。例えば、Ｃａｓ９は、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）及びトランス活性化ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）と複合化させることができる。別の例では、Ｃａｓ９は、シングルガイドＲＮＡと複合化させることができる（Ｍａｋａｒｏｖａ ｅｔ ａｌ．２０１５，Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ Ｖｏｌ．１３：１－１５）。
Ｃａｓエンドヌクレアーゼの「機能的断片」、「機能的に等価である断片」及び「機能的に等価な断片」は本明細書では互換的に使用され、標的部位を認識し、結合し、そして場合によりほどき、ニッキングし、又は切断する（一本鎖切断又は二本鎖切断を入れる）能力を保持しているＣａｓエンドヌクレアーゼ配列の一部分又はサブ配列を指す。
本開示のＣａｓエンドヌクレアーゼの「機能的変異体」、「機能的に等価である変異体」及び「機能的に等価な変異体」という用語は本明細書では互換的に使用され、標的配列の全部又は一部を認識し、結合し、場合によりほどき、ニッキングし、又は切断する能力を保持している本開示のＣａｓエンドヌクレアーゼの変異体を指す。
特定の標的ＤＮＡ配列に向かう本明細書のＣａｓタンパク質の結合活性及び／又はエンドヌクレオチド鎖切断活性の決定は、米国特許第８６９７３５９号明細書（参照により本明細書に開示される）に開示されるような、当該技術分野で知られている任意の好適なアッセイによって評価することができる。例えば、宿主細胞／生命体中でＣａｓタンパク質及び好適なＲＮＡ成分を発現させ、その後、インデルの存在について予測ＤＮＡ標的部位を試験することによって決定することができる（この特定のアッセイにおけるＣａｓタンパク質は、エンドヌクレオチド鎖切断活性［一本鎖又は二本鎖切断活性］を有するであろう）。予測標的部位でのインデルの存在についての試験は、例えば、ＤＮＡシークエンシング法を介して、又は標的配列の機能の消失についてアッセイすることによるインデル形成を推測することによって実施することができよう。別の例では、Ｃａｓタンパク質活性は、標的部位中の配列、又はその近くの配列に相同である配列を含むドナーＤＮＡが提供された宿主細胞／生命体において、Ｃａｓタンパク質及び好適なＲＮＡ成分を発現させることによって決定され得る。標的部位でのドナーＤＮＡ配列（例えば、ドナーと標的配列との上首尾のＨＲによって予測されるであろう配列）の存在は、ターゲティングが発生したことを示すであろう。
「Ｃａｓエンドヌクレアーゼ変異体」とも呼ばれるＣａｓエンドヌクレアーゼの変異体は、親Ｃａｓエンドヌクレアーゼの変異体を指し、このＣａｓエンドヌクレアーゼ変異体は、ｃｒヌクレオチド及びｔｒａｃｒヌクレオチド、又はシングルガイドポリヌクレオチド（本明細書に記載のガイドポリヌクレオチドなど）と関連した場合に、ＤＮＡ標的配列の全部又は一部を認識し、結合し、場合により、ほどき、ニッキングし、又は切断する能力を保持している。Ｃａｓエンドヌクレアーゼ変異体は、本明細書に記載のＣａｓエンドヌクレアーゼ変異体を含み、このＣａｓエンドヌクレアーゼ変異体は親Ｃａｓエンドヌクレアーゼとは異なっており、Ｃａｓエンドヌクレアーゼ変異体は（ガイドポリヌクレオチドと複合化して、標的部位を改変することができるポリヌクレオチドガイドエンドヌクレアーゼ複合体を形成した場合）、（同じガイドポリヌクレオチドと複合化して、同じ標的部位を改変することができるポリヌクレオチドガイドエンドヌクレアーゼ複合体を形成した）親Ｃａｓエンドヌクレアーゼと比較して、形質転換効率の上昇、ＤＮＡ編集効率の上昇、オフターゲット切断の減少、又はそれらの任意の組合せなど（これらに限定されない）の少なくとも１つの特性の改善を有する。
本明細書で使用される場合、用語「形質転換効率」は、Ｃａｓ９変異体が、標的部位を改変し得るポリヌクレオチドガイドエンドヌクレアーゼＰＧＥＮ複合体を形成するために、ガイドポリヌクレオチドと組み合わせて使用された場合に得られる形質転換細胞の数を、親（野生型）Ｃａｓ９が、同じ標的部位を改変し得るＰＧＥＮのＣａｓエンドヌクレアーゼ成分としてＰＧＥＮ複合体を形成するために、同じガイドポリヌクレオチドと組み合わせて使用された場合に得られる形質転換細胞の数で除すことによって定義される。この数に１００を乗じることにより、％で表すことができる。
Figure 0007384801000001
１（又は１００％）の形質転換効率は、Ｃａｓ９変異体が使用された場合に得られる形質転換細胞の数が、ＷＴ Ｃａｓ９変異体の場合に得られる形質転換細胞の数とほぼ同じか又は同一であることを示す。この場合、Ｃａｓ９変異体は、その親Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼと比較して、改善された特性を有さない。対照的に、１より大きい形質転換効率は、Ｃａｓ９変異体が使用された場合に得られる形質転換細胞の数が、ＷＴ Ｃａｓ９変異体の場合に得られる形質転換細胞の数より大きいことを示す。この場合、Ｃａｓ９変異体は、親Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼと比較して、改善された特性、例えば、改善された形質転換効率を有する。
本明細書で使用される場合、用語「編集効率」又は「ＤＮＡ編集効率」は、本明細書では互換的に使用され、Ｃａｓ９変異体が、標的部位を改変し得るポリヌクレオチドガイドエンドヌクレアーゼＰＧＥＮ複合体を形成するために、ガイドポリヌクレオチドと組み合わせて使用された場合に得られるＤＮＡ編集を含む細胞（編集された細胞）の数を、親（野生型）Ｃａｓ９が、同じ標的部位を改変し得るＰＧＥＮのＣａｓエンドヌクレアーゼ成分としてＰＧＥＮ複合体を形成するために、同じガイドポリヌクレオチドと組み合わせて使用された場合に得られる編集された細胞の数で除すことによって定義される。この数に１００を乗じることにより、％で表すことができる。
Figure 0007384801000002
１（又は１００％）のＤＮＡ編集効率は、Ｃａｓ９変異体が使用された場合に得られる編集された細胞の数が、ＷＴ Ｃａｓ９変異体が使用された場合に得られる編集された細胞の数とほぼ同じは又は同一であることを示す。この場合、Ｃａｓ９変異体は、その親Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼと比較して、改善された特性を有さない。対照的に、１より大きいＤＮＡ編集効率は、Ｃａｓ９変異体が使用された場合に得られる形質転換細胞の数が、（ＷＴ）Ｃａｓ９変異体が使用された場合に得られる形質転換細胞の数より大きいことを示す。この場合、Ｃａｓ９変異体は、親Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼと比較して、改善された特性、例えば、改善された編集効率を有する。
Ｃａｓエンドヌクレアーゼ変異体は、親Ｃａｓエンドヌクレアーゼのアミノ酸配列と少なくとも約７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるアミノ酸配列を含み得る。
変異体Ｃａｓエンドヌクレアーゼ遺伝子（変異体ｃａｓ遺伝子）は、親Ｃａｓエンドヌクレアーゼのヌクレオチド配列と少なくとも約７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるヌクレオチド配列を含み得る。
本明細書中の親Ｃａｓエンドヌクレアーゼの非限定的な例は、以下の属のいずれかに由来するＣａｓエンドヌクレアーゼであり得る：アエロピルム（Ａｅｒｏｐｙｒｕｍ）、ピロバクルム（Ｐｙｒｏｂａｃｕｌｕｍ）、スルホロブス（Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ）、アーキオグロブス（Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ）、ハロアーキュラ（Ｈａｌｏａｒｃｕｌａ）、メタノバクテリウム（Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｎ）、メタノコッカス（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ）、メタノサルシナ（Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ）、メタノパイラス（Ｍｅｔｈａｎｏｐｙｒｕｓ）、ピロコッカス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ）、ピクロフィルス（Ｐｉｃｒｏｐｈｉｌｕｓ）、テルモプラズマ（Ｔｈｅｒｎｉｏｐｌａｓｎｉａ）、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、マイコバクテリウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、アクウィフェクス（Ａｑｕｉｆｒｘ）、ポルフィロモナス（Ｐｏｒｐｈｖｒｏｍｏｎａｓ）、クロロビウム（Ｃｈｌｏｒｏｂｉｕｍ）、サーマス（Ｔｈｅｒｍｕｓ）、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、リステリア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）、スタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、サーモアナエロバクター（Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ）、マイコプラズマ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ）、フソバクテリウム（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、アゾアルカス（Ａｚａｒｃｕｓ）、クロモバクテリウム（Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ナイセリア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）、ニトロソモナス（Ｎｉｔｒｏｓｏｍｏｎａｓ）、デスルホビブリオ（Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ）、ゲオバクター（Ｇｅｏｂａｃｔｅｒ）、ミロコッカス（Ｍｙｒｏｃｏｃｃｕｓ）、キャンピロバクター（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）、ウォリネラ（Ｗｏｌｉｎｅｌｌａ）、アシネトバクター（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）、エルウィニア（Ｅｒｗｉｎｉａ）、エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、レジオネラ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ）、メチロコッカス（Ｍｅｔｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、パスツレラ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ）、フォトバクテリウム（Ｐｈｏｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、キサントモナス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ）、エルシニア（Ｙｅｒｓｉｎｉａ）、ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、トレポネーマ（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ）、フランシセラ（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ）又はサーモトガ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ）。これ以外にも、本明細書中のＣａｓエンドヌクレアーゼは、例えば、米国特許出願公開第２０１０／００９３６１７号明細書（この文献は参照により本明細書に組み込まれる）に開示されている配列番号４６２～４６５、４６７～４７２、４７４～４７７、４７９～４８７、４８９～４９２、４９４～４９７、４９９～５０３、５０５～５０８、５１０～５１６、又は５１７～５２１のいずれかによってコードされ得る。
さらに、本明細書に記載した親Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼは、例えば、ストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）（例えば、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、Ｓ．ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、Ｓ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、Ｓ．アガラクティエ（Ｓ．ａｇａｌａｃｔｉａｅ）、Ｓ．パラサングイニス（Ｓ．ｐａｒａｓａｎｇｕｉｎｉｓ）、Ｓ．オラリス（Ｓ．ｏｒａｌｉｓ）、Ｓ．サリバリウス（Ｓ．ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ）、Ｓ．マカカエ（Ｓ．ｍａｃａｃａｅ）、Ｓ．ディスガラクティエ（Ｓ．ｄｙｓｇａｌａｃｔｉａｅ）、Ｓ．アンギノサス（Ｓ．ａｎｇｉｎｏｓｕｓ）、Ｓ．コンステラトゥス（Ｓ．ｃｏｎｓｔｅｌｌａｔｕｓ）、Ｓ．シュードポルシヌス（Ｓ．ｐｓｅｕｄｏｐｏｒｃｉｎｕｓ）、Ｓ．ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ））、リステリア属（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）（例えば、Ｌ．イノキュア（Ｌ．ｉｎｎｏｃｕａ））、スピロプラズマ属（Ｓｐｉｒｏｐｌａｓｍａ）（例えば、Ｓ．アピス（Ｓ．ａｐｉｓ）、Ｓ．シルフィディコーラ（Ｓ．ｓｙｒｐｈｉｄｉｃｏｌａ））、ペプトストレプトコッカス科（Ｐｅｐｔｏｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃａｃｅａｅ）、アトポビウム属（Ａｔｏｐｏｂｉｕｍ）、ポルフィロモナス属（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ）（例えば、Ｐ．カトニエ（Ｐ．ｃａｔｏｎｉａｅ））、プレボテーラ属（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ）（例えば、Ｐ．インターメディア（Ｐ．ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ）、ベイロネラ属（Ｖｅｉｌｌｏｎｅｌｌａ）、トレポネーマ属（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ）（例えば、Ｔ．ソクランスキィ（Ｔ．ｓｏｃｒａｎｓｋｉｉ）、Ｔ．デンティコーラ（Ｔ．ｄｅｎｔｉｃｏｌａ））、カプノシトファガ属（Ｃａｐｎｏｃｙｔｏｐｈａｇａ）、フィネゴルディア属（Ｆｉｎｅｇｏｌｄｉａ）（例えば、Ｆ．マグナ（Ｆ．ｍａｇｎａ））、コリオバクテリア科（Ｃｏｒｉｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）（例えば、Ｃ．バクテリウム（Ｃ．ｂａｃｔｅｒｉｕｍ））、オルセネラ属（Ｏｌｓｅｎｅｌｌａ）（例えば、Ｏ．プロフューザ（Ｏ．ｐｒｏｆｕｓａ））、ヘモフィルス属（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ）（例えば、Ｈ．スプトルム（Ｈ．ｓｐｕｔｏｒｕｍ）、Ｈ．ピットマニエ（Ｈ．ｐｉｔｔｍａｎｉａｅ））、パスツレラ属（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ）（例えば、Ｐ．ベッティエ（Ｐ．ｂｅｔｔｙａｅ））、オリビバクター属（Ｏｌｉｖｉｂａｃｔｅｒ）（例えば、Ｏ．シティエンシス（Ｏ．ｓｉｔｉｅｎｓｉｓ））、エピリソニモナス属（Ｅｐｉｌｉｔｈｏｎｉｍｏｎａｓ）（例えば、Ｅ．テナックス（Ｅ．ｔｅｎａｘ））、メソニア（Ｍｅｓｏｎｉａ）属（例えば、Ｍ．モビリス（Ｍ．ｍｏｂｉｌｉｓ））、ラクトバチルス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）（例えば、Ｌ．プランタルム（Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ））、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）（例えば、Ｂ．セレウス（Ｂ．ｃｅｒｅｕｓ））、アクイマリーナ属（Ａｑｕｉｍａｒｉｎａ）（例えば、Ａ．ムエレリ（Ａ．ｍｕｅｌｌｅｒｉ））、クリセオバクテリウム属（Ｃｈｒｙｓｅｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）（例えば、Ｃ．パルストレ（Ｃ．ｐａｌｕｓｔｒｅ））、バクテロイデス属（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）（例えば、Ｂ．グラミニソルベンス（Ｂ．ｇｒａｍｉｎｉｓｏｌｖｅｎｓ））、ナイセリア属（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）（例えば、Ｎ．メニンジティディス（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ））、フランシセラ属（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ）（例えば、Ｆ．ノビシダ（Ｆ．ｎｏｖｉｃｉｄａ））、又はフラボバクテリウム属（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）（例えば、Ｆ．フリギダリウム（Ｆ．ｆｒｉｇｉｄａｒｉｕｍ）、Ｆ．ソリ（Ｆ．ｓｏｌｉ））の種に由来し得る。一態様では、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）親Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼが本明細書に記載されている。別の例として、親Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼは、Ｃｈｙｌｉｎｓｋｉ ｅｔ ａｌ．（ＲＮＡ Ｂｉｏｌｏｇｙ １０：７２６－７３７）（この文献は参照により本明細書に組み込まれる）に開示されたＣａｓ９タンパク質のいずれかであり得る。
本明細書中の親Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼの配列は、例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｇ３ＥＣＲ１（Ｓ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ））、ＷＰ＿０２６７０９４２２、ＷＰ＿０２７２０２６５５、ＷＰ＿０２７３１８１７９、ＷＰ＿０２７３４７５０４、ＷＰ＿０２７３７６８１５、ＷＰ＿０２７４１４３０２、ＷＰ＿０２７８２１５８８、ＷＰ＿０２７８８６３１４、ＷＰ＿０２７９６３５８３、ＷＰ＿０２８１２３８４８、ＷＰ＿０２８２９８９３５、Ｑ０３ＪＩ６（Ｓ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ））、ＥＧＰ６６７２３、ＥＧＳ３８９６９、ＥＧＶ０５０９２、ＥＨＩ６５５７８（Ｓ．シュードポルシヌス（Ｓ．ｐｓｅｕｄｏｐｏｒｃｉｎｕｓ））、ＥＩＣ７５６１４（Ｓ．オラリス（Ｓ．ｏｒａｌｉｓ））、ＥＩＤ２２０２７（Ｓ．コンステラツス（Ｓ．ｃｏｎｓｔｅｌｌａｔｕｓ））、ＥＩＪ６９７１１、ＥＪＰ２２３３１（Ｓ．オラリス（Ｓ．ｏｒａｌｉｓ））、ＥＪＰ２６００４（Ｓ．アンギノサス（Ｓ．ａｎｇｉｎｏｓｕｓ））、ＥＪＰ３０３２１、ＥＰＺ４４００１（Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ））、ＥＰＺ４６０２８（Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ））、ＥＱＬ７８０４３（Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ））、ＥＱＬ７８５４８（Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ））、ＥＲＬ１０５１１、ＥＲＬ１２３４５、ＥＲＬ１９０８８（Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ））、ＥＳＡ５７８０７（Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ））、ＥＳＡ５９２５４（Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ））、ＥＳＵ８５３０３（Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ））、ＥＴＳ９６８０４、ＵＣ７５５２２、ＥＧＲ８７３１６（Ｓ．ディスガラクトシエ（Ｓ．ｄｙｓｇａｌａｃｔｉａｅ））、ＥＧＳ３３７３２、ＥＧＶ０１４６８（Ｓ．オラリス（Ｓ．ｏｒａｌｉｓ））、ＥＨＪ５２０６３（Ｓ．マカカエ（Ｓ．ｍａｃａｃａｅ））、ＥＩＤ２６２０７（Ｓ．オラリス（Ｓ．ｏｒａｌｉｓ））、ＥＩＤ３３３６４、ＥＩＧ２７０１３（Ｓ．パラサングイニス（Ｓ．ｐａｒａｓａｎｇｕｉｎｉｓ））、ＥＪＦ３７４７６、ＥＪＯ１９１６６（ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）種ＢＳ３５ｂ）、ＥＪＵ１６０４９、ＥＪＵ３２４８１、ＹＰ＿００６２９８２４９、ＥＲＦ６１３０４、ＥＲＫ０４５４６、ＥＴＪ９５５６８（Ｓ．アガラクティエ（Ｓ．ａｇａｌａｃｔｉａｅ））、ＴＳ８９８７５、ＥＴＳ９０９６７（ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）種ＳＲ４）、ＥＴＳ９２４３９、ＥＵＢ２７８４４（ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）種ＢＳ２１）、ＡＦＪ０８６１６、ＥＵＣ８２７３５（ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）種ＣＭ６）、ＥＷＣ９２０８８、ＥＷＣ９４３９０、ＥＪＰ２５６９１、ＹＰ＿００８０２７０３８、ＹＰ＿００８８６８５７３、ＡＧＭ２６５２７、ＡＨＫ２２３９１、ＡＨＢ３６２７３、Ｑ９２７Ｐ４、Ｇ３ＥＣＲ１、又はＱ９９ＺＷ２（Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ））に開示されているＣａｓ９アミノ酸配列のいずれかを含み得る。これらの文献は参照により組み込まれる。或いは、本明細書中のＣａｓ９タンパク質は、例えば、米国特許出願公開第２０１０／００９３６１７号明細書（参照により本明細書に組み込まれる）に開示された、配列番号４６２（Ｓ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ））、４７４（Ｓ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ））、４８９（Ｓ．アガラクティエ（Ｓ．ａｇａｌａｃｔｉａｅ））、４９４（Ｓ．アガラクティエ（Ｓ．ａｇａｌａｃｔｉａｅ））、４９９（Ｓ．ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ））、５０５（Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ））又は５１８（Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ））のいずれかによってコードされ得る。
ある特定のアミノ酸が互いに類似した構造的特徴及び／又は電荷の特徴を共有する（すなわち、保存されている）ならば、Ｃａｓ９中の各位置のアミノ酸は、開示される配列に与えられるそのものであってもよいし、以下のように、保存アミノ酸残基で置換されてもよい（「保存的アミノ酸置換」）：
１．次の小さい脂肪族の非極性又は弱極性の残基は、相互に置換することができる：Ａｌａ（Ａ）、Ｓｅｒ（Ｓ）、Ｔｈｒ（Ｔ）、Ｐｒｏ（Ｐ）、Ｇｌｙ（Ｇ）；
２．次の極性の負荷電残基及びそれらのアミドは、相互に置換することができる：Ａｓｐ（Ｄ）、Ａｓｎ（Ｎ）、Ｇｌｕ（Ｅ）、Ｇｌｎ（Ｑ）；
３．次の極性の正荷電残基は、相互に置換することができる：Ｈｉｓ（Ｈ）、Ａｒｇ（Ｒ）、Ｌｙｓ（Ｋ）；
４．次の脂肪族の非極性残基は、相互に置換することができる：Ａｌａ（Ａ）、Ｌｅｕ（Ｌ）、Ｉｌｅ（Ｉ）、Ｖａｌ（Ｖ）、Ｃｙｓ（Ｃ）、Ｍｅｔ（Ｍ）；及び
５．次の大きい芳香族残基は、相互に置換することができる：Ｐｈｅ（Ｆ）、Ｔｙｒ（Ｙ）、Ｔｒｐ（Ｗ）。
断片及び変異体は、部位特異的変異誘発法及び合成構築法により得ることができる。エンドヌクレアーゼ活性を測定する方法は、例えば、２０１３年５月１日に出願された国際出願ＰＣＴ／ＵＳ１３／３９０１１号明細書、２０１６年５月１２日に出願された国際出願ＰＣＴ／ＵＳ１６／３２０７３号明細書、２０１６年５月１２日に出願された国際出願ＰＣＴ／ＵＳ１６／３２０２８号明細書（参照により本明細書に組み込まれる）など（これらに限定されない）、当該技術分野でよく知られている。
一実施形態では、Ｃａｓエンドヌクレアーゼ変異体は、本明細書に記載のＣａｓ９エンドヌクレアーゼ変異体である。本明細書で使用される場合、「Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼ変異体」又は「Ｃａｓ９変異体」は、親Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼの変異体を指し、このＣａｓ９エンドヌクレアーゼ変異体は、ｃｒヌクレオチド及びｔｒａｃｒヌクレオチド、又はシングルガイドポリヌクレオチド（本明細書に記載のガイドポリヌクレオチドなど）と関連した場合に、ＤＮＡ標的配列の全部又は一部を認識し、結合し、場合により、ほどき、ニッキングし、又は切断する能力を保持している。Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼ変異体は、本明細書に記載のＣａｓ９エンドヌクレアーゼ変異体を含み、このＣａｓエンドヌクレアーゼ変異体は親９Ｃａｓエンドヌクレアーゼとは異なっており、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼ変異体は（ガイドポリヌクレオチドと複合化して、標的部位を修飾することができるポリヌクレオチドガイドエンドヌクレアーゼ複合体を形成した場合）、（同じガイドポリヌクレオチドと複合化して、同じ標的部位を改変することができるポリヌクレオチドガイドエンドヌクレアーゼ複合体を形成した）親Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼと比較して、形質転換効率の上昇、ＤＮＡ編集効率の上昇、オフターゲット切断の減少、又はそれらの任意の組合せなど（これらに限定されない）の少なくとも１つの特性の改善を有する。
本明細書に記載のＣａｓ９エンドヌクレアーゼ変異体はｃｒヌクレオチド及びｔｒａｃｒヌクレオチド、又はシングルガイドポリヌクレオチドと関連した場合に、二本鎖ＤＮＡ標的部位に結合し、それをニッキングすることができる変異体を含み、一方、親Ｃａｓエンドヌクレアーゼはｃｒヌクレオチド及びｔｒａｃｒヌクレオチド、又はシングルガイドポリヌクレオチドと関連した場合に、標的部位に結合し、標的部位で二本鎖切断（切断）をすることができる。
本明細書に記載のように、驚くべきことに、また、予期しなかったことに、ＨＮＨ及びＲｕｖＣドメインの外側に少なくとも１つのアミノ酸修飾を有するＣａｓ９エンドヌクレアーゼ変異体が（ガイドポリヌクレオチドと複合化して、標的部位を改変することができるポリヌクレオチドガイドエンドヌクレアーゼ複合体を形成した場合）、（同じガイドポリヌクレオチドと複合化して、同じ標的部位を改変することができるポリヌクレオチドガイドエンドヌクレアーゼ複合体を形成した）その親Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼと比較して、形質転換効率の上昇、ＤＮＡ編集効率の上昇、又はそれらの任意の組合せなど（これらに限定されない）の少なくとも１つの特性の改善を有し得ることがわかった。
一態様では、本明細書に記載のＣａｓ９エンドヌクレアーゼ変異体は、ＲｕｖＣヌクレアーゼドメイン及びＨＮＨ（Ｈ－Ｎ－Ｈ）ヌクレアーゼドメイン、並びにＨＮＨ及びＲｕｖＣドメインの外側に位置する少なくとも１つのアミノ酸改変（少なくとも１つのアミノ酸の欠失、置換又は挿入）を含む。
一態様では、本明細書に記載のＣａｓ９エンドヌクレアーゼ変異体又はその活性断片は、親Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼと比較した場合、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個のアミノ酸置換を含む。
一態様では、本明細書に記載のＣａｓ９エンドヌクレアーゼ変異体は、そのＨＮＨ及びＲｕｖＣドメインの外側にアミノ酸改変を有し、前記Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼは、前記アミノ酸改変を含まない親Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼと比較して、形質転換効率及び／又はＤＮＡ編集効率が上昇し、前記ガイドポリヌクレオチド及びＣａｓ９エンドヌクレアーゼ変異体は前記標的配列の全て又は一部を認識し、結合し、場合によりニッキングし、ほどき、又は切断し得る複合体を形成することができる。
一態様では、本明細書に記載のＣａｓ９エンドヌクレアーゼ変異体は、配列番号１に記載の親Ｃａｓ９ポリペプチドと少なくとも７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％のアミノ酸同一性を有し、且つ少なくとも１つの１５５位におけるアミノ酸置換を有する（ここで、変異体のアミノ酸位置は、親Ｃａｓ９ポリペプチドのアミノ酸配列と対応させて番号付けされ、前記Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼ変異体はエンドヌクレアーゼ活性を有する）。
１５５位におけるＣａｓ９エンドヌクレアーゼ変異体置換は、Ｙ１５５Ｈ、Ｙ１５５Ｎ、Ｙ１５５Ｅ、Ｙ１５５Ｆからなる群から選択され得、それぞれＣａｓ９ Ｙ１５５Ｈ変異体（配列番号５８）、Ｃａｓ９ Ｙ１５５Ｎ変異体（配列番号１２３）、Ｃａｓ９ Ｙ１５５Ｅ変異体（配列番号１２５及びＣａｓ９ Ｙ１５５Ｆ変異体（配列番号１２７）を生じる。Ｃａｓ９ Ｙ１５５変異体をコードするＤＮＡ配列は当該技術分野でよく知られているように、特定の宿主生命体における発現のために最適化することができる。Ｃａｓ９ Ｙ１５５変異体タンパク質をコードするＤＮＡ配列の例を配列番号１２２、１２４、１２６及び１２８に記載する。
一態様では、本明細書に記載のＣａｓ９エンドヌクレアーゼ変異体は、配列番号１に記載の親Ｃａｓ９ポリペプチドと少なくとも７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％のアミノ酸同一性を有し、且つ少なくとも２つのアミノ酸置換、１つは８６位の、もう１つは９８位のアミノ酸置換を有する（ここで、変異体のアミノ酸位置は、親Ｃａｓ９ポリペプチドのアミノ酸配列と対応させて番号付けされ、前記Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼ変異体はエンドヌクレアーゼ活性を有する）
８６位のＣａｓ９エンドヌクレアーゼ変異体置換は、Ｆ８６Ａ置換であり得、Ｃａｓ９ Ｆ８６Ａ変異体を生じる。
８９位のにおけるＣａｓ９エンドヌクレアーゼ変異体置換は、Ｆ９８Ａ置換であり得、Ｃａｓ９ Ｆ９８Ａ変異体を生じる。
Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼ変異体は少なくとも２つの置換、すなわち、Ｆ８６Ａ置換などの８６位での第１の置換、及びＦ９８Ａ置換などの９８位での第２の置換を含むことができ、配列番号１２９に示されるＣａｓ９ Ｆ８６Ａ－Ｆ９８Ａ変異体を生じる。
Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼ変異体は少なくとも３つの置換を含むことができ、この少なくとも３つの置換は、Ｆ８６Ａ置換などの８６位における第１の置換、Ｆ９８Ａ置換などの９８位における第２の置換、及びＹ１５５Ｈ、Ｙ１５５Ｎ、Ｙ１５５Ｅ、Ｙ１５５Ｆからなる群から選択される第３の置換を含む。
Ｃａｓ９ Ｙ１５５変異体をコードするＤＮＡ配列は当該技術分野でよく知られているように、特定の宿主生命体における発現のために最適化することができる。Ｃａｓ９ Ｙ１５５変異体タンパク質をコードするＤＮＡ配列の例を配列番号１２２、１２４、１２６及び１２８に記載する。Ｃａｓ９ Ｆ８６Ａ－Ｆ９８Ａ変異体タンパク質をコードするＤＮＡ配列の例を配列番号１３０に記載する。
８６位、９８位及び１５５位、又はそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される少なくとも１つ、少なくとも２つ、又は少なくとも３つの置換を含むＣａｓ９エンドヌクレアーゼ変異体は（ガイドポリヌクレオチドと複合化して、標的部位を改変することができるポリヌクレオチドガイドエンドヌクレアーゼ複合体を形成した場合）、（同じガイドポリヌクレオチドと複合化して、同じ標的部位を改変することができるポリヌクレオチドガイドエンドヌクレアーゼ複合体を形成した）親Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼと比較して、形質転換効率の上昇、ＤＮＡ編集効率の上昇、又はそれらの任意の組合せなど（これらに限定されない）の少なくとも１つの特性の改善を有することができる。
８６位、９８位及び１５５位（又はそれらの任意の組み合わせ）からなる群から選択される少なくとも１つ、少なくとも２つ、又は少なくとも３つの置換は、当業者に知られた任意の他のアミノ酸改変と組み合わせることができる。一態様では、本明細書に記載の８６位、９８位及び１５５位からなる群から選択される置換のいずれか１つ（又はそれらの任意の組み合わせ）は、当業者に知られたＨＮＨ及びＲｕｖＣドメインに位置する任意のアミノ酸置換と組み合わせて、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼをニッカーゼとして作用させ得る（Ｔｒｅｖｉｎｏ Ａ．Ｅ．ａｎｄ Ｆｅｎｇ Ｚｈａｎｇ，２０１４，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，ｖｏｌｕｍｅ ５４６ ｐｇ１６１－１７４）。「ニッカーゼ」Ｃａｓ９（Ｃａｓ９ｎ）は、ＨＮＨ又はＲｕｖＣドメイン内の重要な触媒残基でのアラニン置換によって生成することができ、ＳｐＣａｓ９ Ｄ１０ＡはＲｕｖＣを不活性化し（Ｊｉｎｅｋ，Ｍ，ｅｔ ａｌ，２０１２，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３３７（６０９６）、８１６－８２１）、一方、Ｎ８６３ＡはＨＮＨを不活性化することが見出されている（Ｎｉｓｈｉｍａｓｕ ｅｔ ａｌ，２０１４；Ｓｈｅｎ ｅｔ ａｌ ２０１４ Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ１１，３９９－４０２）。Ｈ８４０Ａ変異（Ｓｈｅｎ ｅｔ ａｌ ２０１４ Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ １１、３９９－４０２）もまた、Ｃａｓ９をニッキング酵素に変換することが報告されたが、この変異体は、Ｎ８６３Ａと比較して哺乳動物細胞における活性レベルが低下していた（Ｎｉｓｈｉｍａｓｕ ｅｔ ａｌ．２０１４，Ｃｅｌｌ，１５６（５），９３５－９４９）。
一態様では、Ｃａｓ９（Ｎ８６３Ａ）、Ｃａｓ９（Ｄ１０Ａ）及び／又はＣａｓ９（Ｈ８４０Ａ）を、本明細書に記載の８６位、９８位及び１５５位（又は、任意の組み合わせ）からなる群から選択される少なくとも１つの置換を含むようにさらに改変し、場合により、それぞれ、改変されたＣａｓ９（Ｎ８６３Ａ）、Ｃａｓ９（Ｄ１０Ａ）及び／又はＣａｓ９（Ｈ８４０Ａ）の特性の改善をもたらすことができる。
一態様では、本明細書に記載の８６位、９８位及び１５５位（又は、それらの任意の組み合わせ）からなる群から選択される置換のいずれか１つを、Ｄ１０Ａ、Ｈ８４０Ａ又はＮ８６３Ａ及びＨ８４０Ａからなる群から選択されるアミノ酸置換と組み合わせることができる。
一態様では、１５５位に少なくとも１つのアミノ酸置換を有するＣａｓ９エンドヌクレアーゼ変異体（ここで、変異体のアミノ酸位置は、親Ｃａｓ９ポリペプチドのアミノ酸配列と対応させて番号付けされている）は、前記親Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼと比較して、形質転換効率の上昇、ＤＮＡ編集効率の上昇、又はそれらの任意の組合せから選択される少なくとも１つの特性の改善を有する。
一態様では、１５５位にＹ１５５Ｈ置換を有するＣａｓ９エンドヌクレアーゼ変異体（ここで、変異体のアミノ酸位置は、親Ｃａｓ９ポリペプチドのアミノ酸配列と対応させて番号付けされている）は、前記親Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼと比較して、高い形質転換効率を有する。一態様では、この高い形質転換効率は、以下に限定されないが、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種又はエシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）（Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）の宿主細胞などの原核生物宿主細胞において観察される。
一態様では、１５５位にＹ１５５Ｈ置換を有するＣａｓ９エンドヌクレアーゼ変異体（ここで、変異体のアミノ酸位置は、親Ｃａｓ９ポリペプチドのアミノ酸配列と対応させて番号付けされている）は、前記親Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼと比較して、高いＤＮＡ編集効率を有する。一態様では、この高いＤＮＡ編集効率は、以下に限定されないが、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種又はエシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）（Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）の宿主細胞などの原核生物宿主細胞において観察される。
本明細書に記載のＣａｓ９変異体の特性の改善には、形質転換効率の上昇が含まれ、親Ｃａｓエンドヌクレアーゼと比較した形質転換効率は、親Ｃａｓエンドヌクレアーゼと比較して、少なくとも２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１１倍、１２倍、１３倍、１４倍、１５倍、１６倍、１７倍、１８倍、１９倍、２０倍、２１倍、２２倍、２３倍、２４倍、２５倍、２６倍、２７倍、２８倍、２９倍、３０倍、３１倍、３２倍、３３倍、３４倍、３５倍、３６倍、３７倍、３８倍、３９倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、１００倍、１１０倍、１２０倍、１３０倍、１４０倍、１５０倍、１６０倍、１７０倍、１８０倍、１９０倍、２００倍、２１０倍、２２０倍、２３０倍、２４０倍、２５０倍、２６０倍、２７０倍、２８０倍、２９０倍、３００倍、３１０倍、３２０倍、３３０倍、３４０倍、３５０倍、３６０倍、３７０倍、３８０倍、３９０倍、４００倍、４１０倍、４２０倍、４３０倍、４４０倍、４４０倍、４５０倍、４６０倍、４７０倍、４８０倍、４９０倍、又は最大５００倍まで上昇する。
本明細書に記載のＣａｓ９変異体の特性の改善には、ＤＮＡ編集効率の上昇が含まれ、親Ｃａｓエンドヌクレアーゼと比較したＤＮＡ編集効率は、親Ｃａｓエンドヌクレアーゼと比較して、少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、１００％、１１０％、１２０％、１３０％、１４０％、１５０％、１６０％、１７０％、１８０％、１９０％、２００％、２１０％、２２０％、２３０％、若しくは２５０％、又は少なくとも約２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、最大１０倍まで上昇する。
本明細書に記載のＣａｓエンドヌクレアーゼ変異体は、原核細胞及び真核細胞、並びに本明細書にさらに記載するような生命体のゲノム改変のために使用することができる。
開示の方法で使用するためのＣａｓエンドヌクレアーゼ、又はその機能的断片若しくは変異体は、遺伝子改変宿主細胞（例えば、細菌細胞、昆虫細胞、真菌細胞、酵母細胞、又はヒト由来細胞株）が、Ｃａｓタンパク質をコードする核酸配列を発現するように改変される組み換え源から単離することができる。或いは、Ｃａｓタンパク質は、無細胞タンパク質発現システムを使用して生成、又は合成的に生成することができる。
本明細書に記載のＣａｓ９ Ｙ１５５エンドヌクレアーゼ変異体を含むＣａｓエンドヌクレアーゼは、改変された形態のＣａｓポリペプチドを含み得る。Ｃａｓポリペプチドの改変形態としては、Ｃａｓタンパク質の天然に存在するヌクレアーゼ活性を低下させるアミノ酸の変化（例えば、欠失、挿入又は置換）を挙げることができる。例えば、いくつかの例では、本明細書に記載のＣａｓ９ Ｙ１５５エンドヌクレアーゼ変異体を含むＣａｓタンパク質の改変形態は、対応する野生型Ｃａｓポリペプチドの５０％未満、４０％未満、３０％未満、２０％未満、１０％未満、５％未満又は１％未満のヌクレアーゼ活性を有する（米国特許出願公開第２０１４／００６８７９７Ａ１号明細書（２０１４年３月６日公開））。いくつかの例では、Ｃａｓポリペプチドの改変形態は、ヌクレアーゼ活性を実質的に有さず、触媒的に「不活化されたＣａｓ」又は「失活したｃａｓ（ｄＣａｓ）」と呼ばれる。不活化Ｃａｓ／失活Ｃａｓは、不活化Ｃａｓエンドヌクレアーゼ（ｄＣａｓ）を含む。本明細書に記載のＣａｓ９ Ｙ１５５エンドヌクレアーゼ変異体に由来するものを含む触媒的に不活性なＣａｓを、本明細書に記載するような異種配列に融合させることができる。
本明細書に記載のＣａｓエンドヌクレアーゼ及びガイドポリヌクレオチドを発現する組み換えＤＮＡコンストラクト（その機能的断片、又は細菌、真菌、植物、微生物若しくは哺乳動物のコドン最適化Ｃａｓタンパク質を含む）は、生命体のゲノムに安定に組み込まれ得る。例えば、微生物のゲノムに安定に組み込まれたＣａｓ遺伝子を含む微生物を作製することができる。
本明細書に記載のＣａｓエンドヌクレアーゼ（例えば、以下に限定されないが、本明細書に記載のＣａｓ９エンドヌクレアーゼＹ１５５変異体）は当該分野で知られた方法（例えば、２０１６年１１月２４日に公開され、参照により本明細書に組み込まれる、国際公開第２０１６／１８６９４６号パンフレットの実施例２に記載される方法）によって発現され、精製され得る。
Ｃａｓタンパク質の融合
Ｃａｓエンドヌクレアーゼ、又は本明細書に記載のＣａｓエンドヌクレアーゼ変異体は、１つ以上の異種タンパク質ドメイン（例えば、Ｃａｓポリペプチドに加えて１、２、３又はそれ以上のドメイン）を含む融合タンパク質の一部であり得る。このような融合タンパク質は、任意のさらなるタンパク質配列を、また、場合により、任意の２つのドメイン間、例えばＣａｓポリペプチドと第１の異種ドメインとの間に、リンカー配列を含み得る。Ｃａｓポリペプチドに融合し得るタンパク質ドメインの例として、限定はされないが、エピトープタグ（例えば、ヒスチジン［Ｈｉｓ］、Ｖ５、ＦＬＡＧ、インフルエンザヘマグルチニン［ＨＡ］、ｍｙｃ、ＶＳＶ－Ｇ、チオレドキシン［Ｔｒｘ］）、レポーター（例えば、グルタチオン－５－トランスフェラーゼ［ＧＳＴ］、ホースラディッシュペルオキシダーゼ［ＨＲＰ］、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ［ＣＡＴ］、ベータ－ガラクトシダーゼ、ベータ－グルクロニダーゼ［ＧＵＳ］、ルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質［ＧＦＰ］、ＨｃＲｅｄ、ＤｓＲｅｄ、シアン色蛍光タンパク質［ＣＦＰ］、黄色蛍光タンパク質［ＹＦＰ］、青色蛍光タンパク質［ＢＦＰ］）、及び以下の活性の１つ以上を有するドメインが挙げられる：メチラーゼ活性、デメチラーゼ活性、転写活性化活性（例えば、ＶＰ１６又はＶＰ６４）、転写抑制活性、転写終止因子活性、ヒストン修飾活性、ＲＮＡ切断活性、及び核酸結合活性。Ｃａｓエンドヌクレアーゼはまた、ＤＮＡ分子又は他の分子、例えばマルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、Ｓ－タグ、Ｌｅｘ Ａ ＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）、ＧＡＬ４Ａ ＤＮＡ結合ドメイン、及び単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）ＶＰ１６と結合するタンパク質と融合し得る。
Ｃａｓエンドヌクレアーゼは、核局在化配列（ＮＬＳ）などの異種調節エレメントを含み得る。異種ＮＬＳアミノ酸配列は、本明細書中の細胞の核内で検出可能な量のＣａｓエンドヌクレアーゼの蓄積を駆動するのに十分な強度を有し得る。ＮＬＳは、塩基性の、正に帯電する残基（例えば、リシン及び／又はアルギニン）の１つ（一分節）又は複数（例えば、二分節）の短い配列（例えば、２～２０残基）を含み得、そして、タンパク質表面上に曝されなければ、Ｃａｓアミノ酸配列のどこに位置してもよい。ＮＬＳは、例えば、本明細書中のＣａｓタンパク質のＮ末端又はＣ末端に作動可能に結合し得る。２つ以上のＮＬＳ配列は、例えば、Ｃａｓタンパク質に、例えば、Ｃａｓタンパク質のＮ末端及びＣ末端の両方に結合し得る。Ｃａｓ遺伝子は、Ｃａｓコドン領域のＳＶ４０核標的シグナル上流、及びＣａｓコドン領域の二分ＶｉｒＤ２核局在化シグナル（Ｔｉｎｌａｎｄ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：７４４２－６）下流に作動可能に結合することができる。本明細書中の好適なＮＬＳ配列の非限定的な例には、米国特許第６６６０８３０号明細書及び同第７３０９５７６号明細書に開示されるものが含まれる。これらの両文献は参照により本明細書に組み込まれる。異種ＮＬＳアミノ酸配列としては、植物、ウイルス及び哺乳動物の核局在化シグナルが挙げられる。
触媒的に活性及び／又は不活性なＣａｓエンドヌクレアーゼは、異種配列に融合することができる（２０１４年３月６日に公開された米国特許出願公開第２０１４／００６８７９７Ａ１号明細書）。好適な融合パートナーとしては、以下に限定はされないが、標的ＤＮＡ、又は標的ＤＮＡに関連するポリペプチド（例えば、ヒストン又は他のＤＮＡ結合性タンパク質）に直接作用することによって、転写を間接的に増加させる活性を提供するポリペプチドが挙げられる。さらなる好適な融合パートナーとしては、以下に限定はされないが、メチルトランスフェラーゼ活性、デメチラーゼ活性、アセチルトランスフェラーゼ活性、デアセチラーゼ活性、キナーゼ活性、ホフファターゼ活性、ユビキチンリガーゼ活性、脱ユビキチン化活性、アデニル化活性、脱アデニル化活性、ＳＵＭＯ化活性、脱ＳＵＭＯ化活性、リボシル化活性、脱リボシル化活性、ミリストイル化活性又は脱ミリストイル化活性を提供するポリペプチドが挙げられる。さらに他の好適な融合パートナーとしては、以下に限定はされないが、標的核酸の転写増加を直接引き起こすポリペプチド（例えば、転写活性化因子又はその断片、転写活性化因子、小分子／薬剤反応性転写調節因子などをガイドするタンパク質又はその断片）が挙げられる。触媒的に不活性なＣａｓ９エンドヌクレアーゼはまた、二本鎖切断を生成するＦｏｋＩヌクレアーゼに融合することができる（Ｇｕｉｌｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ｖｏｌｕｍｅ ３２，ｎｕｍｂｅｒ ６，Ｊｕｎｅ ２０１４）。
ガイドポリヌクレオチド
本明細書で使用する場合、用語「ガイドポリヌクレオチド」は、Ｃａｓエンドヌクレアーゼと複合体を形成することができ、ＣａｓエンドヌクレアーゼがＤＮＡ標的部位を認識し、結合し、場合によりニッキング又は切断することを可能にするポリヌクレオチド配列を指す。このガイドポリヌクレオチドは一本鎖分子であっても二本鎖分子であってもよい。ガイドポリヌクレオチド配列は、ＲＮＡ配列、ＤＮＡ配列、又はこれらの組み合わせ（ＲＮＡ－ＤＮＡ組み合わせ配列）であってよい。場合により、ガイドポリヌクレオチドは、以下に限定はされないが、ロックド核酸（ＬＮＡ）、５－メチルｄＣ、２，６－ジアミノプリン、２’－フルオロＡ、２’－フルオロＵ、２’－Ｏ－メチルＲＮＡ、ホスホロチオエート結合、コレステロール分子との結合、ポリエチレングリコール分子との結合、スペーサー１８（ヘキサエチレングリコール鎖）分子との結合、又は環化をもたらす５’から３’への共有結合などの、少なくとも１つのヌクレオチド、ホスホジエステル結合又は結合改変を含むことができる。リボ核酸だけを含むガイドポリヌクレオチドは、「ガイドＲＮＡ」若しくは「ｇＲＮＡ」とも呼ばれる。
ガイドポリヌクレオチドは、ｃｒヌクレオチド配列及びｔｒａｃｒヌクレオチド配列を含む二本鎖分子（二本鎖ガイドポリヌクレオチドとも呼ばれる）であり得る。ｃｒヌクレオチドには、標的ＤＮＡのヌクレオチド配列にハイブリダイズすることができる第１ヌクレオチド配列ドメイン（可変ターゲティングドメイン若しくはＶＴドメインと呼ばれる）及びＣａｓエンドヌクレアーゼ認識（ＣＥＲ）ドメインの一部である第２ヌクレオチド配列（また、ｔｒａｃｒメイト配列とも呼ばれる）が含まれる。ｔｒａｃｒメイト配列は、相補性領域に沿ってｔｒａｃｒヌクレオチドにハイブリダイズすることができ、Ｃａｓエンドヌクレアーゼ認識ドメイン又はＣＥＲドメインを一緒に形成することができる。ＣＥＲドメインは、Ｃａｓエンドヌクレアーゼポリペプチドと相互作用することができる。二本鎖ガイドポリヌクレオチドのｃｒヌクレオチド及びｔｒａｃｒヌクレオチドは、ＲＮＡ、ＤＮＡ、及び／又はＲＮＡ－ＤＮＡ組み合わせ配列であり得る。（米国特許出願第２０１５／００８２４７８号明細書（２０１５年３月１９日公開）及び同第２０１５／００５９０１０号明細書（２０１５年２月２６日公開）（両文献は参照により本明細書に組み込まれる））。いくつかの実施形態では、二本鎖ガイドポリヌクレオチドのｃｒヌクレオチド分子は、「ｃｒＤＮＡ」（ＤＮＡヌクレオチドの連続ストレッチで構成される場合）、又は「ｃｒＲＮＡ」（ＲＮＡヌクレオチドの連続ストレッチで構成される場合）、又は「ｃｒＤＮＡ－ＲＮＡ」（ＤＮＡヌクレオチドとＲＮＡヌクレオチドとの組み合わせで構成される場合）と呼ばれる。ｃｒヌクレオチドは、細菌及び古細菌中に天然に存在するｃｒＲＮＡの断片を含むことができる。本明細書で開示するｃｒヌクレオチド中に存在することができる、細菌及び古細菌中に天然に存在するｃｒＲＮＡの断片のサイズは、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個又はそれ以上（これらに限定されない）からの範囲であり得る。いくつかの実施形態では、ｔｒａｃｒヌクレオチドは、「ｔｒａｃｒＲＮＡ」（ＲＮＡヌクレオチドの連続ストレッチで構成される場合）、又は「ｔｒａｃｒＤＮＡ」（ＤＮＡヌクレオチドの連続ストレッチで構成される場合）、又は「ｔｒａｃｒＤＮＡ－ＲＮＡ」（ＤＮＡヌクレオチドとＲＮＡヌクレオチドとの組み合わせで構成される場合）と呼ばれる。特定の実施形態では、ＲＮＡ／Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼ複合体をガイドするＲＮＡは、二本鎖ｃｒＲＮＡ－ｔｒａｃｒＲＮＡを含む二本鎖ＲＮＡである。
一態様では、ガイドポリヌクレオチドは、少なくとも１つのガイドポリヌクレオチド及び本明細書に記載の少なくとも１つのＣａｓ９エンドヌクレアーゼ変異体を含むＰＧＥＮを形成し得るガイドポリヌクレオチドであり、前記ガイドポリヌクレオチドは、標的ＤＮＡ中のヌクレオチド配列に相補的である第１のヌクレオチド配列ドメイン（ＶＴドメイン）、及び前記Ｃａｓエンドヌクレアーゼポリペプチドと相互作用する第２のヌクレオチド配列ドメインを含む。
一態様では、ガイドポリヌクレオチドは本明細書に記載のガイドポリヌクレオチドであり、第１のヌクレオチド配列ドメイン（ＶＴドメイン）及び第２のヌクレオチド配列ドメインは、ＤＮＡ配列、ＲＮＡ配列、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される。
一態様では、ガイドポリヌクレオチドは本明細書に記載のガイドポリヌクレオチドであり、第１のヌクレオチド配列及び第２のヌクレオチド配列ドメインは、安定性を高めるＲＮＡ骨格改変、安定性を高めるＤＮＡ骨格改変、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される（Ｋａｎａｓｔｙ ｅｔ ａｌ．，２０１３，Ｃｏｍｍｏｎ ＲＮＡ－ｂａｃｋｂｏｎｅ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｎａｔｕｒｅ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ １２：９７６－９７７を参照されたい）。
ガイドポリヌクレオチドは、少なくとも１つのｔｒａｃｒＲＮＡに（非共有結合的に）連結されたキメラ非天然ｃｒＲＮＡを含む二重ＲＮＡ分子を含む。キメラ非天然ｃｒＲＮＡは、天然には一緒に見出されることがない領域（すなわち、それらは互いに異種である）を含むｃｒＲＮＡを含む。例えば、非天然ｃｒＲＮＡは、天然に存在するスペーサー配列が異種可変ターゲティングドメインと交換されているｃｒＲＮＡである。非天然ｃｒＲＮＡは、第１のヌクレオチド配列ドメイン（可変ターゲティングドメイン又はＶＴドメインと呼ばれる）を含み、これは、標的ＤＮＡ中のヌクレオチド配列にハイブリダイズすることができ、第２のヌクレオチド配列（ｔｒａｃｒメイト配列とも呼ばれる）に連結されており、第１及び第２の配列は天然では一緒に連結されて見出されない。
ガイドポリヌクレオチドはまた、ｔｒａｃｒヌクレオチド配列に連結したｃｒヌクレオチド配列を含む単一分子（シングルガイドポリヌクレオチドとも呼ばれる）であり得る。シングルガイドポリヌクレオチドは、標的ＤＮＡ中のヌクレオチド配列にハイブリダイズすることができる第１のヌクレオチド配列ドメイン（可変ターゲティングドメイン若しくはＶＴドメインと呼ばれる）及びＣａｓエンドヌクレアーゼポリペプチドと相互作用するＣａｓエンドヌクレアーゼ認識ドメイン（ＣＥＲドメイン）を含む。「ドメイン」は、ヌクレオチドの連続ストレッチを意味し、これはＲＮＡ、ＤＮＡ及び／又はＲＮＡ－ＤＮＡ組み合わせ配列であり得る。シングルガイドポリヌクレオチドのＶＴドメイン及び／又はＣＥＲドメインは、ＲＮＡ配列、ＤＮＡ配列、又はＲＮＡ－ＤＮＡ組み合わせ配列を含み得る。ｃｒヌクレオチド及びｔｒａｃｒヌクレオチド由来の配列で構成されているシングルガイドポリヌクレオチドは、「シングルガイドＲＮＡ」（ＲＮＡヌクレオチドの連続ストレッチで構成される場合）、又は「シングルガイドＤＮＡ」（ＤＮＡヌクレオチドの連続ストレッチで構成される場合）、又は「シングルガイドＲＮＡ－ＤＮＡ」（ＲＮＡ及びＤＮＡヌクレオチドの組み合わせで構成される場合）と呼ぶことができる。シングルガイドポリヌクレオチドは、Ｃａｓエンドヌクレアーゼと複合体を形成することができ、前記ガイドポリヌクレオチド／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ複合体（ガイドポリヌクレオチド／Ｃａｓエンドヌクレアーゼシステムとも呼ばれる）は、Ｃａｓエンドヌクレアーゼをゲノム標的部位にガイドし、Ｃａｓエンドヌクレアーゼが標的部位を認識し、結合し、場合によりニッキング又は切断する（一本鎖切断又は二本鎖切断を導入する）ことを可能にする。
「可変ターゲティングドメイン」又は「ＶＴドメイン」という用語は、本明細書では互換的に使用され、二本鎖ＤＮＡ標的部位の１本の鎖（ヌクレオチド配列）にハイブリダイズすることができる（相補的である）ヌクレオチド配列を含む。第１のヌクレオチド配列ドメイン（ＶＴドメイン）と標的配列との間の相補性％は、少なくとも５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６３％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％であり得る。可変ターゲティングドメインの長さは、少なくとも１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９又は３０ヌクレオチドであり得る。
可変ターゲティングドメインは、１２～３０、１２～２９、１２～２８、１２～２７、１２～２６、１２～２５、１２～２６、１２～２５、１２～２４、１２～２３、１２～２２、１２～２１、１２～２０、１２～１９、１２～１８、１２～１７、１２～１６、１２～１５、１２～１４、１２～１３、１３～３０、１３～２９、１３～２８、１３～２７、１３～２６、１３～２５、１３～２６、１３～２５、１３～２４、１３～２３、１３～２２、１３～２１、１３～２０、１３～１９、１３～１８、１３～１７、１３～１６、１３～１５、１３～１４、１４～３０、１４～２９、１４～２８、１４～２７、１４～２６、１４～２５、１４～２６、１４～２５、１４～２４、１４～２３、１４～２２、１４～２１、１４～２０、１４～１９、１４～１８、１４～１７、１４～１６、１４～１５、１５～３０、１５～２９、１５～２８、１５～２７、１５～２６、１５～２５、１５～２６、１５～２５、１５～２４、１５～２３、１５～２２、１５～２１、１５～２０、１５～１９、１５～１８、１５～１７、１５～１６、１６～３０、１６～２９、１６～２８、１６～２７、１６～２６、１６～２５、１６～２４、１６～２３、１６～２２、１６～２１、１６～２０、１６～１９、１６～１８、１６～１７、１７～３０、１７～２９、１７～２８、１７～２７、１７～２６、１７～２５、１７～２４、１７～２３、１７～２２、１７～２１、１７～２０、１７～１９、１７～１８、１８～３０、１８～２９、１８～２８、１８～２７、１８～２６、１８～２５、１８～２４、１８～２３、１８～２２、１８～２１、１８～２０、１８～１９、１９～３０、１９～２９、１９～２８、１９～２７、１９～２６、１９～２５、１９～２４、１９～２３、１９～２２、１９～２１、１９～２０、２０～３０、２０～２９、２０～２８、２０～２７、２０～２６、２０～２５、２０～２４、２０～２３、２０～２２、２０～２１、２１～３０、２１～２９、２１～２８、２１～２７、２１～２６、２１～２５、２１～２４、２１～２３、２１～２２、２２～３０、２２～２９、２２～２８、２２～２７、２２～２６、２２～２５、２２～２４、２２～２３、２３～３０、２３～２９、２３～２８、２３～２７、２３～２６、２３～２５、２３～２４、２４～３０、２４～２９、２４～２８、２４～２７、２４～２６、２４～２５、２５～３０、２５～２９、２５～２８、２５～２７、２５～２６、２６～３０、２６～２９、２６～２８、２６～２７、２７～３０、２７～２９、２７～２８、２８～３０、２８～２９、又は２９～３０ヌクレオチドからなる連続ストレッチを含み得る。
可変ターゲティングドメインは、ＤＮＡ配列、ＲＮＡ配列、改変ＤＮＡ配列、改変ＲＮＡ配列、又はこれらの任意の組み合わせで構成され得る。ＶＴドメインは、原核生物又は真核生物ＤＮＡに由来する標的配列に相補的であり得る。
（ガイドポリヌクレオチドの）「Ｃａｓエンドヌクレアーゼ認識ドメイン」又は「ＣＥＲドメイン」という用語は、本明細書では互換的に使用され、Ｃａｓエンドヌクレアーゼポリペプチドと相互作用するヌクレオチド配列を含む。ＣＥＲドメインは、ｔｒａｃｒヌクレオチドメイト配列を含み、その後にｔｒａｃｒヌクレオチド配列が続く。ＣＥＲドメインは、ＤＮＡ配列、ＲＮＡ配列、改変ＤＮＡ配列、改変ＲＮＡ配列（例えば、米国特許出願公開第２０１５／００５９０１０Ａ１（２０１５年２月２６日公開）（この文献は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）を参照されたい）、又はこれらの任意の組み合わせで構成され得る。
シングルガイドポリヌクレオチドのｃｒヌクレオチドとｔｒａｃｒヌクレオチドとを連結するヌクレオチド配列は、ＲＮＡ配列、ＤＮＡ配列、又はＲＮＡ－ＤＮＡ組み合わせ配列を含み得る。一実施形態では、シングルガイドポリヌクレオチドのｃｒヌクレオチドとｔｒａｃｒヌクレオチドとを連結するヌクレオチド配列（「ループ」とも呼ぶ）の長さは、少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９又は１００ヌクレオチドであり得る。ループの長さは、３～４、３～５、３～６、３～７、３～８、３～９、３～１０、３～１１、３～１２、３～１３、３～１４、３～１５、３～２０、３～３０、３～４０、３～５０、３～６０、３～７０、３～８０、３～９０、３～１００、４～５、４～６、４～７、４～８、４～９、４～１０、４～１１、４～１２、４～１３、４～１４、４～１５、４～２０、４～３０、４～４０、４～５０、４～６０、４～７０、４～８０、４～９０、４～１００、５～６、５～７、５～８、５～９、５～１０、５～１１、５～１２、５～１３、５～１４、５～１５、５～２０、５～３０、５～４０、５～５０、５～６０、５～７０、５～８０、５～９０、５～１００、６～７、６～８、６～９、６～１０、６～１１、６～１２、６～１３、６～１４、６～１５、６～２０、６～３０、６～４０、６～５０、６～６０、６～７０、６～８０、６～９０、６～１００、７～８、７～９、７～１０、７～１１、７～１２、７～１３、７～１４、７～１５、７～２０、７～３０、７～４０、７～５０、７～６０、７～７０、７～８０、７～９０、７～１００、８～９、８～１０、８～１１、８～１２、８～１３、８～１４、８～１５、８～２０、８～３０、８～４０、８～５０、８～６０、８～７０、８～８０、８～９０、８～１００、９～１０、９～１１、９～１２、９～１３、９～１４、９～１５、９～２０、９～３０、９～４０、９～５０、９～６０、９～７０、９～８０、９～９０、９～１００、１０～２０、２０～３０、３０～４０、４０～５０、５０～６０、７０～８０、８０～９０又は９０～１００ヌクレオチドであり得る。
他の態様では、シングルガイドポリヌクレオチドのｃｒヌクレオチドとｔｒａｃｒヌクレオチドとを連結するヌクレオチド配列は、限定はされないが、ＧＡＡＡテトラループ配列などのテトラループ配列を含み得る。
シングルガイドポリヌクレオチドは、キメラ非天然シングルガイドＲＮＡを含む。「シングルガイドＲＮＡ」及び「ｓｇＲＮＡ」という用語は、本明細書では互換的に使用され、（ｔｒａｃｒＲＮＡにハイブリダイズするｔｒａｃｒメイト配列に連結した）可変ターゲティングドメインを含むｃｒＲＮＡ（ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ）がｔｒａｃｒＲＮＡ（トランス活性化ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ）に融合した、２つのＲＮＡ分子の合成融合体に関する。天然では一緒に見出されない領域（すなわち、それらは互いに異種である）を含むキメラ非天然ガイドＲＮＡ。例えば、Ｃａｓエンドヌクレアーゼを認識することができる第２のヌクレオチド配列に連結された、標的ＤＮＡ中のヌクレオチド配列にハイブリダイズすることができる第１のヌクレオチド配列ドメイン（可変ターゲティングドメイン又はＶＴドメインと呼ばれる）を含み、第１及び第２のヌクレオチド配列は天然では一緒に連結されて見出されない、キメラ非天然ガイドＲＮＡ。
キメラ非天然ガイドＲＮＡは、本明細書に記載されるＣａｓ９エンドヌクレアーゼ変異体などのＩＩ型Ｃａｓエンドヌクレアーゼと複合体を形成することができるＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓシステムのｃｒＲＮＡ又は／及びｔｒａｃｒＲＮＡを含むことができ、前記ガイドＲＮＡ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ複合体はＣａｓエンドヌクレアーゼをＤＮＡ標的部位に導き、ＣａｓエンドヌクレアーゼがＤＮＡ標的部位を認識し、結合し、場合によりニッキング又は切断する（一本鎖切断又は二本鎖切断を導入する）ことを可能にすることができる。
ガイドポリヌクレオチドの製造及び安定化
ガイドポリヌクレオチドは、当該技術分野で知られている任意の方法、例えば、ガイドポリヌクレオチドを化学的に合成する方法（限定されないが、Ｈｅｎｄｅｌ ｅｔ ａｌ．２０１５，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ３３，９８５－９８９など）、インビトロでガイドポリヌクレオチドを生成する方法、及び／又はガイドＲＮＡを自己スプライシングする方法（限定されないが、Ｘｉｅ ｅｔ ａｌ．２０１５，ＰＮＡＳ １１２：３５７０－３５７５など）によって製造することができる。
Ｃａｓ９媒介ＤＮＡターゲティングを行うために真核細胞中でガイドＲＮＡなどのＲＮＡ成分を発現させる方法は、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ（Ｐｏｌ ＩＩＩ）プロモーターを使用することであり、これは、正確に規定された、改変されていない５’末端及び３’末端を有するＲＮＡの転写を可能にする（ＤｉＣａｒｌｏ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．４１：４３３６－４３４３、Ｍａ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ ３：ｅ１６１）。この戦略は、トウモロコシ及びダイズを含むいくつかの異なる種の細胞に首尾よく適用されている（米国特許出願公開第２０１５／００８２４７８号明細書（２０１５年３月１９日公開））。５’キャップを有さないＲＮＡ成分を発現させる方法が記載されている（国際公開第２０１６／０２５１３１号パンフレット（２０１６年２月１８日公開））。
いくつかの態様では、対象核酸（例えば、ガイドポリヌクレオチド、ガイドポリヌクレオチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸、Ｃａｓタンパク質をコードする核酸、ｃｒＲＮＡ又はｃｒＲＮＡをコードするヌクレオチド、ｔｒａｃｒＲＮＡ又はｔｒａｃｒＲＮＡをコードするヌクレオチド、ＶＴドメインをコードするヌクレオチド、ＣＰＲドメインをコードするヌクレオチドなど）は、さらなる望ましい特徴（例えば、安定性の改変又は調節、細胞内ターゲティング、トラッキング（例えば、蛍光標識）、タンパク質又はタンパク質複合体の結合部位など）を提供する修飾又は配列を含む。ガイドポリヌクレオチド、ＶＴドメイン及び／又はＣＥＲドメインのヌクレオチド配列修飾は、５’キャップ、３’ポリアデニル化テイル、リボスイッチ配列、安定性制御配列、ｄｓＲＮＡ二本鎖を形成する配列、ガイドポリヌクレオチドを細胞内位置にターゲティングする改変若しくは配列、トラッキングを提供する改変若しくは配列、タンパク質のための結合部位を提供する改変若しくは配列、ロックド核酸（ＬＮＡ）、５－メチルｄＣヌクレオチド、２，６－ジアミノプリンヌクレオチド、２’－フルオロＡヌクレオチド、２’－フルオロＵヌクレオチド；２’－Ｏ－メチルＲＮＡヌクレオチド、ホスホロチオエート結合、コレステロール分子への結合、ポリエチレングリコール分子への結合、スペーサー１８分子への結合、５’から３’への共有結合、又はこれらの任意の組み合わせからなる群から選択することができるがこれらに限定されない。これらの修飾は、少なくとも１つの追加の有益な特徴をもたらすことができるが、この追加の有益な特徴は、安定性の改変若しくは調節、細胞内ターゲティング、トラッキング、蛍光標識、タンパク質若しくはタンパク質複合体のための結合部位、相補的標的配列に対する結合親和性の改変、細胞分解に対する耐性の改変、及び細胞透過性の増大からなる群から選択される。
用語「５’キャップ」及び「７－メチルグアニル酸（ｍ７Ｇ）キャップ」は、本明細書中で互換的に用いられる。７－メチルグアニル酸残基は、真核細胞のメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の５’末端に位置する。ＲＮＡポリメラーゼＩＩ（Ｐｏｌ ＩＩ）は、真核細胞のｍＲＮＡを転写する。メッセンジャーＲＮＡキャッピングは、一般に次のように発生する：ｍＲＮＡ転写産物の最末端５’リン酸基は、ＲＮＡ末端ホスファターゼによって除去され、２つの末端リン酸基が残る。グアノシン一リン酸（ＧＭＰ）は、グアニリルトランスフェラーゼによって転写物の末端リン酸基に加えられ、転写物末端に５’－５’三リン酸結合グアニンが残る。最後に、この末端グアニンの７－窒素が、メチルトランスフェラーゼによってメチル化される。
ガイド型Ｃａｓシステム
本明細書で使用される場合、用語「ガイドポリヌクレオチド／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ複合体」、「ガイドポリヌクレオチド／Ｃａｓエンドヌクレアーゼシステム」、「ガイドポリヌクレオチド／Ｃａｓ複合体」、「ガイドポリヌクレオチド／Ｃａｓシステム」、「ガイド型Ｃａｓシステム」、「ポリヌクレオチドガイドエンドヌクレアーゼ」及び「ＰＧＥＮ」は、本明細書では互換的に使用され、複合体を形成することができる少なくとも１つのガイドポリヌクレオチド及び少なくとも１つのＣａｓエンドヌクレアーゼを指し、前記ガイドポリヌクレオチド／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ複合体は、ＣａｓエンドヌクレアーゼをＤＮＡ標的部位にガイドして、ＣａｓエンドヌクレアーゼがＤＮＡ標的部位を認識し、結合し、場合によってニッキング又は切断する（一本鎖切断又は二本鎖切断を導入する）ことを可能にすることができる。本明細書中のガイドポリヌクレオチド／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ複合体は、Ｃａｓタンパク質、又はその断片及び変異体、並びに知られているＣＲＩＳＰＲシステム（Ｈｏｒｖａｔｈ ａｎｄ Ｂａｒｒａｎｇｏｕ，２０１０，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３２７：１６７－１７０、Ｍａｋａｒｏｖａ ｅｔ ａｌ．２０１５，Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ Ｖｏｌ．１３：１－１５、Ｚｅｔｓｃｈｅ ｅｔ ａｌ．，２０１５，Ｃｅｌｌ １６３，１－１３、Ｓｈｍａｋｏｖ ｅｔ ａｌ．，２０１５，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ＿Ｃｅｌｌ ６０，１－１３）のいずれかの好適なポリヌクレオチド成分を含み得る。Ｃａｓエンドヌクレアーゼは、ＣＡＳタンパク質と複合化したポリヌクレオチド（例えば、限定はされないが、ｃｒＲＮＡ又はガイドＲＮＡ）により標的配列を認識することにより媒介し、標的配列でＤＮＡ二本鎖をほどき、場合により、少なくとも１本のＤＮＡ鎖を切断する。正確なプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）が、ＤＮＡ標的配列の３’末端に位置するか、又は隣接するなら、そのようなＣａｓエンドヌクレアーゼによる標的配列の認識及び切断が、通常、起こる。或いは、本明細書に記載のＣａｓタンパク質は、好適なＲＮＡ成分と複合化した場合、ＤＮＡ切断活性又はニッキング活性を欠くことがあるが、ＤＮＡ標的配列には依然として特異的に結合することができる。
ＤＮＡ標的配列の両方の鎖を切断することができるガイドポリヌクレオチド／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ複合体は、通常、エンドヌクレアーゼドメインの全てを機能的な状態で有するＣａｓタンパク質（例えば、各エンドヌクレアーゼドメインの一部又は全ての活性を保持する野生型エンドヌクレアーゼドメイン又はその変異体）を含む。ゆえに、Ｃａｓタンパク質の各エンドヌクレアーゼドメインの一部又は全ての活性を保持する野生型Ｃａｓタンパク質（例えば、本明細書中に開示されるＣａｓタンパク質）又はその変異体は、ＤＮＡ標的配列の両方の鎖を切断することができるＣａｓエンドヌクレアーゼの好適な例である。
ＤＮＡ標的配列の１本の鎖を切断することができるガイドポリヌクレオチド／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ複合体は、本明細書において、ニッカーゼ活性（例えば、部分的切断能力）を有すると特徴付けられ得る。Ｃａｓニッカーゼは、通常、ＣａｓがＤＮＡ標的配列の１本の鎖のみを切断する（すなわち、ニックを入れる）ことを可能にする１つの機能的エンドヌクレアーゼドメインを含む。例えば、Ｃａｓ９ニッカーゼは、（ｉ）変異した、機能不全ＲｕｖＣドメイン、及び（ｉｉ）機能的ＨＮＨドメイン（例えば、野生型ＨＮＨドメイン）を含み得る。別の例として、Ｃａｓ９ニッカーゼは、（ｉ）機能的ＲｕｖＣドメイン（例えば、野生型ＲｕｖＣドメイン）、及び（ｉｉ）変異した、機能不全ＨＮＨドメインを含み得る。別の例として、Ｃａｓ９ニッカーゼは、（ｉ）機能的ＲｕｖＣドメイン（例えば、野生型ＲｕｖＣドメイン）、及び（ｉｉ）変異した、機能不全ＨＮＨドメインを含み得る。
本明細書での使用に好適なＣａｓ９ニッカーゼの非限定的な例は、Ｇａｓｉｕｎａｓ ｅｔ ａｌ．（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１０９：Ｅ２５７９－Ｅ２５８６）、Ｊｉｎｅｋ ｅｔ ａｌ．（Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３７：８１６－８２１）、Ｓａｐｒａｎａｕｓｋａｓ ｅｔ ａｌ．（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３９：９２７５－９２８２）及び米国特許出願公開第２０１４／０１８９８９６号明細書に開示されており、これらの文献は参照により本明細書に組み込まれる。
例えば、本明細書におけるＣａｓ９ニッカーゼは、Ａｓｐ－３１置換（例えば、Ａｓｐ－３１－Ａｌａ）（変異ＲｕｖＣドメインの例）、又はＨｉｓ－８６５置換（例えば、Ｈｉｓ－８６５－Ａｌａ）、Ａｓｎ－８８２置換（例えば、Ａｓｎ－８８２－Ａｌａ）、若しくはＡｓｎ－８９１置換（例えばＡｓｎ－８９１－Ａｌａ）（変異ＨＮＨドメインの例）を有するＳ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）Ｃａｓ９を含み得る。また、例えば、本明細書におけるＣａｓ９ニッカーゼは、Ａｓｐ－１０置換（例えば、Ａｓｐ－１０－Ａｌａ）、Ｇｌｕ－７６２置換（例えば、Ｇｌｕ－７６２－Ａｌａ）、若しくはＡｓｐ－９８６置換（例えば、Ａｓｐ－９８６－Ａｌａ）（変異ＲｕｖＣドメインの例）、又はＨｉｓ－８４０置換（例えば、Ｈｉｓ－８４０－Ａｌａ）、Ａｓｎ－８５４置換（例えば、Ａｓｎ－８５４－Ａｌａ）、若しくはＡｓｎ－８６３置換（例えば、Ａｓｎ－８６３－Ａｌａ）（変異ＨＮＨドメインの例）を有するＳ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９を含み得る。Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９に関して、３つのＲｕｖＣサブドメインは、一般に、アミノ酸残基１～５９、７１８～７６９、及び９０９～１０９８にそれぞれ位置し、ＨＮＨドメインは、アミノ酸残基７７５～９０８に位置している（Ｎｉｓｈｉｍａｓｕ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ １５６：９３５－９４９）。
本明細書中のＣａｓ９ニッカーゼは、開示する本発明の宿主細胞において様々な目的のために使用され得る。例えば、Ｃａｓ９ニッカーゼは、好適なドナーポリヌクレオチドとの、ＤＮＡ標的部位配列での、又はその近くでのＨＲを誘発するのに使用され得る。ニッキングされたＤＮＡは、ＮＨＥＪプロセスのための基質ではなく、ＨＲプロセスによって認識されるので、特定の標的部位でのＤＮＡのニッキングにより、部位は、好適なドナーポリヌクレオチドとのＨＲをより受け入れ易くなる。
ＤＮＡターゲティングの特異性を高めるために、一対のＣａｓニッカーゼを使用することができる。一般に、これは、異なるガイド配列を有するＲＮＡ成分と結び付けられることによって、所望のターゲティングのためにその領域内の逆鎖上のＤＮＡ配列を標的とし、そのすぐ近くをニッキングする２つのＣａｓニッカーゼを提供することによって実施することができる。このような各ＤＮＡ鎖の近くの切断は、二本鎖切断（すなわち、一本鎖オーバーハングを有するＤＳＢ）を引き起こし、これは、その後、非相同性末端結合ＮＨＥＪ（変異につながる不完全な修復になりやすい）、又は相同組み換えＨＲの基質として認識される。これらの実施形態における各ニックは、例えば、互いと少なくとも約５、１０、１５、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、若しくは１００（又は、５～１００の任意の整数）塩基離すことができる。本明細書中の１つ又は２つのＣａｓニッカーゼタンパク質を、Ｃａｓニッカーゼ対に使用することができる。例えば、変異ＲｕｖＣドメインを有するが、機能するＨＮＨドメインは有するＣａｓ９ニッカーゼ（すなわち、Ｃａｓ９ ＨＮＨ＋／ＲｕｖＣ－）を使用することができる（例えば、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９ ＨＮＨ＋／ＲｕｖＣ－）。各Ｃａｓ９ニッカーゼ（例えば、Ｃａｓ９ ＨＮＨ＋／ＲｕｖＣ－）は、各ニッカーゼをそれぞれの特定のＤＮＡ部位に標的として向けるガイドＲＮＡ配列を有する本明細書に記載の好適なＲＮＡ成分を用いることによって、互いに近い（最大で１００塩基対離れている）特定のＤＮＡ部位に導かれ得る。
特定の実施形態におけるガイドポリヌクレオチド／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ複合体は、ＤＮＡ標的部位配列に結合することができるが、標的部位配列のいかなる鎖も切断しない。このような複合体は、そのヌクレアーゼドメインの全部が変異し機能不全であるＣａｓタンパク質を含み得る。例えば、ＤＮＡ標的部位配列に結合することができるが、標的部位配列のいかなる鎖も切断しない本明細書に記載のＣａｓ９タンパク質は、変異し機能不全であるＲｕｖＣドメイン、及び変異し機能不全であるＨＮＨドメインの両方を含み得る。このようなＣａｓ９タンパク質の非限定的な例は、先に開示したＲｕｖＣヌクレアーゼドメイン変異及びＨＮＨヌクレアーゼドメイン変異のいずれかを含む（例えば、Ａｓｐ－１０置換、例えばＡｓｐ－１０－Ａｌａ、及びＨｉｓ－８４０置換、例えばＨｉｓ－８４０－Ａｌａを有するＳ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９）。標的ＤＮＡ配列に結合するがこれを切断しない本明細書中のＣａｓタンパク質は、遺伝子発現を調整するために用いることができ、例えば、この場合、Ｃａｓタンパク質は、転写因子（又はその一部）（例えば、リプレッサ又は活性化因子、例えば本明細書に開示されるもののいずれか）と融合し得る。例えば、Ａｓｐ－１０置換（例えば、Ａｓｐ－１０－Ａｌａ）及びＨｉｓ－８４０置換（例えば、Ｈｉｓ－８４０－Ａｌａ）を有するＳ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９を含むＣａｓ９は、ＶＰ１６転写活性化因子ドメイン又はＶＰ６４転写活性化因子ドメインに融合し得る。
ガイドポリヌクレオチド／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ複合体は、本明細書に記載されるＣａｓエンドヌクレアーゼ変異体又はその活性断片を含むことができ、ここで、前記ガイドポリヌクレオチドはキメラ非天然ガイドポリヌクレオチドであり、前記ガイドポリヌクレオチド／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ複合体は標的配列の全部又は一部を認識し、結合し、場合により、ニッキングし、ほどき、又は切断することができる。
一態様では、ガイドポリヌクレオチド／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ複合体は、本明細書に記載のガイドポリヌクレオチドとＣａｓ９エンドヌクレアーゼ変異体との複合体であり、ここで、前記ガイドポリヌクレオチドはキメラ非天然ガイドポリヌクレオチドであり、前記Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼ変異体は、（同じガイドポリヌクレオチドと複合化して、同じ標的部位を改変することができるポリヌクレオチドガイドエンドヌクレアーゼ複合体を形成した）その親Ｃａｓエンドヌクレアーゼと比較して、形質転換効率の上昇、ＤＮＡ編集効率の上昇、オフターゲット切断の減少、又はそれらの任意の組合せなど（これらに限定されない）の少なくとも１つの特性の改善を有する。
ガイドポリヌクレオチド／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ複合体は、ガイドポリヌクレオチドと本明細書に記載のＣａｓ９エンドヌクレアーゼ変異体との複合体であり得、ここで、前記ガイドポリヌクレオチドはキメラ非天然ガイドポリヌクレオチドであり、前記Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼ変異体又はその活性断片は、本明細書に記載の親Ｃａｓ９ポリペプチドと少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有し、そのＨＮＨ及びＲｕＶＣドメインの外側の位置に少なくとも１つのアミノ酸置換を有する（ここで、変異体のアミノ酸位置は、親Ｃａｓ９ポリペプチドのアミノ酸配列と対応させて番号付けられ、前記Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼ変異体はエンドヌクレアーゼ活性を有する）。
ガイドポリヌクレオチド／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ複合体は、ガイドポリヌクレオチドと本明細書に記載のＣａｓ９エンドヌクレアーゼ変異体との複合体であり得、ここで、前記ガイドポリヌクレオチドはキメラ非天然型ガイドポリヌクレオチドであり、前記Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼ変異体又はその活性断片は、配列番号１に記載の親Ｃａｓ９ポリペプチドと少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有し、少なくとも１つの１５５位におけるアミノ酸置換を有する（ここで、変異体のアミノ酸位置は、親Ｃａｓ９ポリペプチドのアミノ酸配列と対応させて番号付けされ、前記Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼ変異体はエンドヌクレアーゼ活性を有する）。
ガイドポリヌクレオチド／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ複合体は、ガイドポリヌクレオチドと本明細書に記載のＣａｓ９エンドヌクレアーゼ変異体との複合体であり得、ここで、前記ガイドポリヌクレオチドはキメラ非天然型ガイドポリヌクレオチドであり、前記Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼ変異体又はその活性断片は、配列番号１に記載の親Ｃａｓ９ポリペプチドと少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有し、少なくとも２つのアミノ酸置換、第１の置換は８６位の、第２の置換は９８位のアミノ酸置換を有する（ここで、変異体のアミノ酸位置は、前記親Ｃａｓ９ポリペプチドのアミノ酸配列と対応させて番号付けされ、前記Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼ変異体はエンドヌクレアーゼ活性を有する）。
用語「ガイドＲＮＡ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ複合体」、「ガイドＲＮＡ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼシステム」、「ガイドＲＮＡ／Ｃａｓ複合体」、「ガイドＲＮＡ／Ｃａｓシステム」、「ｇＲＮＡ／Ｃａｓ複合体」、「ｇＲＮＡ／Ｃａｓシステム」、「ＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼ」、「ＲＧＥＮ」は、本明細書では互換的に使用され、複合体を形成することができる少なくとも１つのＲＮＡ成分及び少なくとも１つのＣａｓエンドヌクレアーゼを指し、前記ガイドＲＮＡ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ複合体は、ＣａｓエンドヌクレアーゼをＤＮＡ標的部位にガイドして、ＣａｓエンドヌクレアーゼがＤＮＡ標的部位を認識し、結合し、場合によってニッキング又は切断する（一本鎖切断又は二本鎖切断を導入する）ことを可能にすることができる。
本明細書に記載のガイド型Ｃａｓシステムは、１つ以上の発現コンストラクトから宿主細胞において発現され得る。いくつかの態様では、本明細書に記載のＣａｓエンドヌクレアーゼ変異体は原核細胞又は真核細胞においてＣａｓタンパク質の発現を指令する発現カセットから発現され得、また、ガイドポリヌクレオチドは原核細胞又は真核細胞においてガイドポリヌクレオチドの発現を指令する第２の発現カセットから発現され得る。
本開示はさらに、標的配列の全部又は一部を認識し、結合し、場合によりニッキングし、ほどき、又は切断することができるガイドＲＮＡ／Ｃａｓシステムを原核細胞又は真核細胞／生命体において発現させるための発現コンストラクトを提供する。
発現カセット及び組み換えＤＮＡコンストラクト
本明細書に開示のポリヌクレオチドは、目的の生命体で発現させるための発現カセット（ＤＮＡコンストラクトとも呼ばれる）中に提供され得る。用語「発現」は、本明細書において使用する場合、前駆体又は成熟形での機能的最終産物（例えば、ｃｒＲＮＡ、ｔｒａｃｒＲＮＡ，ｍＲＮＡ、ガイドＲＮＡ又はポリペプチド（タンパク質）の生成を指す。用語「発現」には、例えば、限定はされないが、転写、転写後改変、翻訳、翻訳後改変、及び分泌を含むポリペプチドの産生に関与する任意の工程が含まれる。
発現カセットは、本明細書に開示されるように、ポリヌクレオチドに作動可能に連結された５’調節配列及び３’調節配列を含み得る。
「作動可能に連結される」は、２つ以上のエレメント間の機能的連結を意味するものとする。例えば、目的ポリヌクレオチドと調節配列（例えば、プロモーター）との間の作動可能な連結は、目的ポリヌクレオチドの発現を可能にする機能的連結である（すなわち、目的ポリヌクレオチドは、プロモーターの転写制御下にある）。作動可能に連結したエレメントは、隣接していても隣接していなくてもよい。２つのタンパク質コード領域の連結を指すために使用する場合、作動可能に連結されるとは、コード領域が同じリーディングフレームにあることが意図されている。
本明細書に開示の発現カセットは、転写の５’－３’方向に、宿主細胞（例えば、真核細胞）において機能的な、転写及び翻訳開始領域（すなわち、プロモーター）、目的ポリヌクレオチド、並びに転写及び翻訳終結領域（すなわち、終結領域）を含み得る。発現カセットはまた、本明細書中の他の箇所に記載される調節領域の転写調節下にあるべきポリヌクレオチドの挿入のための複数の制限部位及び／又は組み換え部位を備える。調節領域（すなわち、プロモーター、転写調節領域及び翻訳終結領域）、及び／又は目的ポリヌクレオチドは、宿主細胞に対し、又は相互に天然／類似であり得る。或いは、調節領域及び／又は目的ポリヌクレオチドは、宿主細胞に対し、又は相互に異種であり得る。本明細書で使用する場合、ポリヌクレオチド配列又はポリペプチド配列に関連した「異種の」は、外来種を起源とする配列であるか、又は同一種からのものであれば、組成及び／又はゲノム遺伝子座が意図的な人的介入によって天然の形態から実質的に改変された配列である。例えば、異種ポリヌクレオチドに作動可能に連結したプロモーターは、そのポリヌクレオチドが由来する種と異なる種からのものであるか、又は、同一／類似種からのものであれば、一方若しくは両方が元の形態及び／若しくはゲノム遺伝子座から実質的に改変されており、或いは、そのプロモーターは、作動可能に連結しているポリヌクレオチドに対し天然のプロモーターではない。本明細書で使用する場合、他に規定されていない限り、キメラポリヌクレオチドは、転写開始領域に作動可能に連結したコード配列を含む（転写開始領域はコード配列に対して異種である）。
特定の実施形態では、本明細書に開示されるポリヌクレオチドは、本明細書中の他の箇所に開示されるか、又は当該技術分野で知られているように、目的ポリヌクレオチド配列又は発現カセットの任意の組み合わせとスタックすることができる。スタックポリヌクレオチドは、最初のポリヌクレオチドと同じプロモーターに作動可能に連結され得るか、又は別のプロモーターポリヌクレオチドに作動可能に連結され得る。
発現カセットは、対応する終結領域と共に、目的ポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーターを含み得る。終結領域は転写開始領域に対して天然であっても、目的の作動可能に連結されたポリヌクレオチドに対して、若しくはプロモーター配列に対して天然であっても、宿主生命体に対して天然であっても、又は別の供給源（すなわち、外来又は異種の）由来であってもよい。適切な終結領域は、ファージ配列、例えば、ラムダファージｔ０終結領域、又は原核生物リボソームＲＮＡオペロン由来の強力なターミネーターから入手可能である。適切な終結領域は、オクトピンシンターゼ終結領域及びノパリンシンターゼ終結領域などのＡ．ツメファシェンス（Ａ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）のＴｉプラスミドから入手可能である。また、Ｇｕｅｒｉｎｅａｕ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２６２：１４１－１４４、Ｐｒｏｕｄｆｏｏｔ（１９９１）Ｃｅｌｌ ６４：６７１－６７４、Ｓａｎｆａｃｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．１４１－１４９、Ｍｏｇｅｎ ｅｔ ａｌ．５：（１９９０）Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ ２：１２６１－１２７２；Ｍｕｎｒｏｅ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｇｅｎｅ ９１：１５１－１５８、Ｂａｌｌａｓ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１７：７８９１－７９０３、及びＪｏｓｈｉ ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１５：９６２７－９６３９を参照されたい。
適切であれば、目的ポリヌクレオチドは、形質転換された又はターゲティングされた生命体における発現を増加させるために最適化し得る。例えば、ポリヌクレオチドは、発現の改善のために生命体に好ましいコドンを使用するように合成又は改変することができる。
細胞宿主中での遺伝子発現を増大させるためのさらなる配列の改変が知られている。このような改変には、疑似ポリアデニル化シグナルをコードする配列、エクソン－イントロンスプライス部位シグナルをコードする配列、トランスポゾン様リピートをコードする配列、及び遺伝子の発現に有害であり得る他のそのようなよく特徴付けられた配列の除去が含まれる。配列のＧ－Ｃ含有量は、宿主細胞中で発現する既知の遺伝子を参照することによって算出される、所与の細胞宿主の平均的なレベルに調節することができる。可能であれば、予想されるヘアピン二次ｍＲＮＡ構造を避けるよう配列を改変する。
発現カセットはさらに、５’リーダー配列を含むことができる。そのようなリーダー配列は翻訳を促進するよう作用し得る。５’非翻訳領域と互換的に使用される５’リーダー配列は、バチルス・サブティルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ａｐｒＥ遺伝子、又はバチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）ａｍｙｌ遺伝子、又は任意の細菌リボソームタンパク質遺伝子由来のものなど、よく知られ、よく特徴付けられた細菌ＵＴＲから得られ得る。翻訳リーダーは当該技術分野では知られており、以下のものが挙げられる：ピコルナウイルスリーダー、例えばＥＭＣＶリーダー（脳心筋炎５’非コード領域）（Ｅｌｒｏｙ－Ｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：６１２６－６１３０）、ポティウイルスリーダー、例えば、ＴＥＶリーダー（タバコエッチウイルス（Ｔｏｂａｃｃｏ Ｅｔｃｈ Ｖｉｒｕｓ））（Ｇａｌｌｉｅ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｇｅｎｅ １６５（２）：２３３－２３８）、ＭＤＭＶリーダー（トウモロコシ矮性モザイクウイルス（Ｍａｉｚｅ Ｄｗａｒｆ Ｍｏｓａｉｃ Ｖｉｒｕｓ）（Ｊｏｈｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９８６）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １５４：９－２０、及びヒト免疫グロブリン重鎖結合タンパク質（ＢｉＰ）（Ｍａｃｅｊａｋ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ ３５３：９０－９４）、アルファルファモザイクウイルス（ａｌｆａｌｆａ ｍｏｓａｉｃ ｖｉｒｕｓ）のコートタンパク質ｍＲＮＡ由来の非翻訳リーダー（ＡＭＶ ＲＮＡ４）（Ｊｏｂｌｉｎｇ ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｎａｔｕｒｅ ３２５：６２２－６２５）；タバコモザイクウイルス（ｔｏｂａｃｃｏ ｍｏｓａｉｃ ｖｉｒｕｓ）リーダー（ＴＭＶ）（Ｇａｌｌｉｅ ｅｔ ａｌ．（１９８９）ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ＲＮＡ、ｅｄ．Ｃｅｃｈ（Ｌｉｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）、ｐｐ．２３７－２５６）；並びにトウモロコシクロロティックモットルウイルスリーダー（ＭＣＭＶ）（Ｌｏｍｍｅｌ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ８１：３８２－３８５）。また、Ｄｅｌｌａ－Ｃｉｏｐｐａ ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．８４：９６５－９６８も参照されたい。翻訳を促進することが知られている他の方法、例えば、イントロンなども使用することができる。
発現カセットの調製には、各種ＤＮＡ断片が、適当な配向で、必要ならば、適当なリーディングフレームにおけるＤＮＡ配列を提供するように操作され得る。この終わり近くに、アダプター又はリンカーがＤＮＡ断片の結合に使用され得、或いは、適当な制限酵素認識部位、不要なＤＮＡの除去、制限酵素認識部位の除去などを提供する他の操作が行われ得る。この目的のために、インビトロの変異誘発、プライマー修復、制限、アニーリング、再置換、例えば、移行及びトランスバージョンを関与させることができる。
いくつかの実施形態では、ガイドヌクレオチド及び／又はＣａｓタンパク質をコードするヌクレオチド配列は制御エレメント（例えば、プロモーターなどの転写制御エレメント）に作動可能に連結される。転写制御エレメントは、真核細胞、例えば植物、哺乳動物細胞若しくは真菌細胞；又は原核細胞（例えば、細菌又は古細菌細胞）において機能し得る。いくつかの実施形態では、ガイドヌクレオチド及び／又はＣａｓタンパク質をコードするヌクレオチド配列は、原核細胞及び真核細胞の両方において、ガイドヌクレオチド及び／又はＣａｓタンパク質をコードするヌクレオチド配列の発現を可能にする複数の制御エレメントに作動可能に連結される。
好適な真核生物プロモーター（真核細胞において機能的なプロモーター）の非限定的な例としては、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）前初期、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）チミジンキナーゼ、初期及び後期ＳＶ４０、レトロウイルスの長末端反復（ＬＴＲ）、及びマウスメタロチオネイン－Ｉ由来のものが挙げられる。発現カセットはまた、翻訳開始のためのリボソーム結合部位及び転写ターミネーターを含み得る。発現カセットはまた、真核細胞においてガイドヌクレオチド及び／又はＣａｓタンパク質を核に導くために、１つ以上の核局在配列（ＮＬＳ配列）を含み得る。発現カセットはまた、発現を増幅するための適切な配列を含み得る。発現カセットはまた、Ｃａｓタンパク質に融合され、したがってキメラポリペプチドを生じる、タンパク質タグ（例えば、６×Ｈｉｓタグ、赤血球凝集素タグ、緑色蛍光タンパク質など）をコードするヌクレオチド配列を含み得る。
真菌宿主中での転写のため、有用なプロモーターの非限定的な例としては、アスペルギルス・オリザエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）ＴＡＫＡアミラーゼ、リゾムコル・ミエヘイ（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉ）アスパラギン酸プロテイナーゼ、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）中性α－アミラーゼ、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）酸安定性α－アミラーゼ、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）グルコアミラーゼ、リゾムコル・ミエヘイ（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉ）リパーゼ、アスペルギルス・オリザエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）アルカリプロテアーゼ、アスペルギルス・オリザエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）トリオースリン酸イソメラーゼ、アスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ）アセトアミダーゼなどをコードする遺伝子に由来するものが挙げられる。Ｃａｓエンドヌクレアーゼをコードする遺伝子が細菌種、例えば、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）中で発現される場合、好適なプロモーターは、例えば、Ｔ７プロモーター及びファージラムダプロモーターを含むバクテリオファージプロモーターから選択することができる。この方針に沿って、酵母種中での発現に好適なプロモーターの例として、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のＧａｌ １及びＧａｌ １０プロモーター、並びにピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＡＯＸ１又はＡＯＸ２プロモーターが挙げられるが、これらに限定されない。糸状菌宿主細胞中での発現は、多くは、Ｔ．レーセイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）由来の内因性ガイド性プロモーターであるｃｂｈ１、又は構成的糖分解プロモーター（例えば、ｐｋｉ）を含む。例えば、Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．２００８を参照されたい。
細菌宿主中でＤＮＡ配列（限定はされないが、本明細書に記載のＣａｓエンドヌクレアーゼ変異体をコードするＤＮＡ配列など）の転写を指示するプロモーターの非限定的な例としては、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）のｌａｃオペロンのプロモーター、ストレプトマイセス・セリカラー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）アガラーゼ遺伝子ｄａｇＡ又はｃｅｌＡプロモーター、バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）アミラーゼ遺伝子（ａｍｙＬ）のプロモーター、バチルス・ステアロサーモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）マルトジェニックアミラーゼ遺伝子（ａｍｙＭ）のプロモーター、バチルス・アミロリケファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）アミラーゼ（ａｍｙＱ）のプロモーター、バチルス・サブティルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ｘｙｌＡ及びｘｙｌＢ遺伝子のプロモーターなどが挙げられる。
発現カセットは、直鎖状ＤＮＡ、環状ＤＮＡ、組み換えＤＮＡ、プラスミド又はベクター中に含まれ得る。
本明細書で使用する場合、「組み換え」は、例えば、化学合成によって、又は遺伝子工学技術による核酸の単離セグメントの操作によって、２つのさもなければ分離している配列セグメントの人工的組み合わせを意味する。「組み換え体」という用語は、生物学的構成要素又は組成物（例えば、細胞、核酸、ポリペプチド／酵素、ベクターなど）に関連して使用される場合、それらの生物学的構成要素又は組成物が天然では見られない状態のものであることを示す。言い換えれば、生物学的構成要素又は組成物は、人の介入によって天然状態から変えられている。例えば、組み換え細胞には、天然の親（すなわち、非組み換え）細胞中で見出されない１つ以上の遺伝子を発現する細胞、天然の親細胞とは異なる量で１つ以上の天然遺伝子を発現する細胞、及び／又は天然の親細胞とは異なる条件下で１つ以上の天然遺伝子を発現する細胞が包含される。組み換え核酸は、天然配列と１つ以上のヌクレオチドが異なっている、異種配列（例えば、異種プロモーター、非天然又は変異シグナル配列をコードする配列など）に作動可能に連結している、イントロンを欠いている、及び／又は単離された形態にあり得る。組み換えポリペプチド／酵素は、天然配列と１つ以上のアミノ酸が異なっている、異種配列に融合している、トランケートされるか、若しくはアミノ酸の内部欠失を有する、天然細胞に見られない態様で（例えば、ポリペプチドをコードする発現ベクターが細胞中に存在することにより、ポリペプチドを過剰発現する組み換え細胞から）発現する、及び／又は単離された形態にあり得る。いくつかの実施形態では、組み換えポリヌクレオチド、又はポリペプチド／酵素が、その野生型の相手と同一の配列を有するが、非天然形態（例えば、単離、又は富化された形態）であることが強調されている。
本明細書で使用される場合、「組み換えＤＮＡコンストラクト」又は「組み換えＤＮＡ」は、核酸断片の人工的な組み合わせを含む発現カセットを指す。
組み換えＤＮＡコンストラクトは、本明細書に開示されるように、ポリヌクレオチドに作動可能に連結された５’調節配列及び３’調節配列を含み得る。
例えば、組み換えＤＮＡコンストラクトは、異なる供給源に由来する調節配列及びコード配列を含み得る。このようなコンストラクトは、それ自体で、又はベクターと共に使用され得る。ベクターが使用される場合、ベクターの選択は、当業者によく知られているように、宿主細胞にベクターを導入するために使用する方法に依存する。例えば、プラスミドベクターを使用することができる。熟練した技術者は、宿主細胞を成功裡に形質転換し、選択し、そして増殖させるために、ベクター上に存在しなければならない遺伝要素をよく知っている。熟練した技術者はまた、異なる独立した形質転換イベントが、異なる発現レベル及びパターンをもたらし（Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，（１９８５）ＥＭＢＯ Ｊ ４：２４１１－２４１８、Ｄｅ Ａｌｍｅｉｄａ ｅｔ ａｌ．，（１９８９）Ｍｏｌ Ｇｅｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ２１８：７８－８６）、したがって、所望の発現レベル及びパターンを示す菌株を得るために、通常多くのイベントがスクリーニングされることも認識していよう。そのようなスクリーニングは、ＤＮＡのサザン分析、ｍＲＮＡ発現のノーザン分析、ＰＣＲ、実時間定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）、逆転写ＰＣＲ（ＲＴ－ＰＣＲ）、タンパク質発現の免疫ブロッティング、酵素若しくは活性分析、及び／又は表現型分析を含む、標準の分子生物学的、生化学的及び他の分析法により行い得る。
本明細書で使用される、標準の遺伝子組み換えＤＮＡ及び分子クローニング技術は、当該技術分野ではよく知られており、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８９）に、より詳しく説明されている。
一態様では、組み換えＤＮＡコンストラクトは、本明細書に開示されるように、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼ変異体に作動可能に連結された異種５’及び３’調節配列を含む。これらの調節配列としては、限定はされないが、宿主細胞（例えば、細菌又は真菌細胞）において機能する、転写及び翻訳開始領域（すなわち、プロモーター）、核局在化シグナル、並びに転写及び翻訳終結領域（すなわち、終結領域）を含む。
一態様では、組み換えＤＮＡコンストラクトは、本明細書に記載のＣａｓ９エンドヌクレアーゼ変異体をコードするＤＮＡを含み、ここで、前記Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼ変異体は、核局在化配列（ＮＬＳ）などの異種調節エレメントに作動可能に連結されるか、又はそれを含む。
一態様では、本明細書中の発現カセット又は組み換えＤＮＡは、本明細書に記載のＣａｓ９エンドヌクレアーゼ変異体をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結したプロモーター、及び本開示のガイドＲＮＡに作動可能に連結したプロモーターを含む。プロモーターは、原核又は真核細胞／生命体において作動可能に連結したヌクレオチド配列の発現を駆動することができる。
用語「プラスミド」又は「ベクター」は、細胞の中央代謝の一部でない遺伝子をしばしば運ぶ、追加の直鎖状又は環状の染色体エレメントを指し、通常、二本鎖ＤＮＡの形態をとる。このようなエレメントは、直鎖又は環状形態の、一本鎖又は二本鎖のポリヌクレオチドの、任意の起源に由来する、自律的に複製する配列、ゲノム組み込み配列、ファージ又はヌクレオチド配列であり得、これらの中では、多くのヌクレオチド配列が、目的ポリヌクレオチドを細胞に導入することができる固有のコンストラクトに連結しているか、組み換えられている。
標的部位
用語「標的部位」、「標的配列」、「標的部位配列」、「標的ＤＮＡ」、「標的遺伝子座」、「ゲノム標的部位」、「ゲノム標的配列」、「ゲノム標的遺伝子座」及び「プロトスペーサー」が本明細書において互換的に使用され、限定はされないが、ガイドポリヌクレオチド／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ複合体が認識し、結合し、場合によりニッキング又は切断することができる、染色体、エピソーム、トランスジェニック遺伝子座、又は、細胞のゲノム内のあらゆる他のＤＮＡ分子（染色体ＤＮＡ、葉緑体ＤＮＡ、ミトコンドリアＤＮＡ、プラスミドＤＮＡを含む）などのポリヌクレオチド配列を指す。
標的部位は細胞のゲノム中の内因性部位であり得、又は、標的部位は細胞に対して異種であり、そのため細胞のゲノム中に天然には存在していない部位であり得、又は標的部位は天然で生じる場所と比較して異種のゲノム位置に見出すことができる。本明細書で使用される場合、用語「内因性標的配列」及び「天然標的配列」は本明細書において互換的に使用され、細胞のゲノムに対し内因性であるか又は天然であり、細胞のゲノム中のその標的配列の内因性又は天然の位置に存在する標的配列を指す。「人工標的部位」又は「人工標的配列」は本明細書中で互換的に使用され、細胞のゲノム中に導入された標的配列を指す。そのような人工標的配列は、細胞のゲノム中の内因性又は天然の標的配列と配列は同一であるが、細胞のゲノム中の異なる位置（すなわち、非内因性位置又は非天然位置）に位置し得る。
「変更標的部位」、「変更標的配列」、「改変標的部位」、「改変標的配列」は、本明細書中で互換的に使用され、非変更標的配列と比較して少なくとも１つの変更を含む、本明細書に開示の標的配列を指す。そのような「変更」としては、例えば、（ｉ）少なくとも１つのヌクレオチドの置換、（ｉｉ）少なくとも１つのヌクレオチドの欠失、（ｉｉｉ）少なくとも１つのヌクレオチドの挿入、又は（ｉｖ）（ｉ）～（ｉｉｉ）の任意の組み合わせが挙げられる。
Ｃａｓエンドヌクレアーゼの標的部位は非常に特異的であり得、正確なヌクレオチド位置に定義され得ることが多いが、ある場合には、所望のゲノム改変のための標的部位は、ＤＮＡ切断が起こる部位のみと比べて広く定義され得る（例えば、ゲノムから欠失されるゲノム遺伝子座又は領域）。そのため、特定の場合（Ｃａｓ／ガイドＲＮＡの活性により起こるゲノム改変）には、ＤＮＡ切断は「標的部位又は標的部位近くで」起こると説明される。
「標的部位を改変する」及び「標的部位を変更する」方法は、本明細書中で互換的に使用され、変更標的部位を作る方法を指す。
スクリーニング可能マーカー表現型を使用せずに、標的部位又は標的部位の近くで変更ゲノムを有するそれらの細胞を同定するためには、様々な方法を利用することができる。そのような方法は、標的配列内の何らかの変化を検出するために標的配列を直接分析するものであると見なすことができ、例えば、限定はされないが、ＰＣＲ法、シークエンシング法、ヌクレアーゼ消化法、サザンブロット法、及びそれらの任意の組み合わせが挙げられる。
標的ＤＮＡ配列（標的部位）の長さは変動する可能性があり、例えば、長さが少なくとも１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０ヌクレオチド又はそれ以上である標的部位が含まれる。さらに、標的部位は回文構造、すなわち、一方の鎖上の配列が相補鎖上で反対方向に同一配列を読み取れる構造であり得る可能性もある。ニック／切断部位は標的配列内に存在する可能性がある、又はニック／切断部位は標的配列の外側に存在する可能性がある。別のバージョンでは、切断が互いに直接向かい合ったヌクレオチド位置で起きて平滑末端切断が起きる可能性があり、その他の場合では、切り込みが千鳥足状で、５’オーバーハング又は３’オーバーハングであり得る一本鎖オーバーハング（「粘着末端」とも呼ばれる）を生じさせる可能性がある。ゲノム標的部位の活性変異体も使用することができる。そのような活性変異体は、所与の標的部位に対して少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上の配列同一性を含むことができ、この活性変異体は生物学的活性を保持しており、したがって、Ｃａｓエンドヌクレアーゼにより認識されて切断され得る。
エンドヌクレアーゼによる標的部位の一本鎖又は二本鎖切断を測定するためのアッセイは当該技術分野で知られており、一般には、認識部位を含有するＤＮＡ基質への作用物質の全体的活性及び特異性を測定する。
プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）
本明細書中の「プロトスペーサー隣接モチーフ」（ＰＡＭ）は、ガイドポリヌクレオチド／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ（ＰＧＥＮ）システムによって認識（標的化）される標的配列（プロトスペーサー）に隣接する短いヌクレオチド配列を指す。ＰＡＭ配列が標的ＤＮＡ配列の後に続いていないなら、標的ＤＮＡ配列を首尾よく認識することはできない。本明細書中のＰＡＭの配列及び長さは、使用するＣａｓタンパク質又はＣａｓタンパク質複合体によって異なり得る。ＰＡＭ配列の長さは任意であり得るが、一般的には、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９又はヌクレオチド長である。
本明細書中のＰＡＭは、通常、利用するＰＧＥＮのタイプを考慮して選択される。本明細書中のＰＡＭ配列は、例えば、Ｃａｓが由来し得る本明細書に開示のあらゆる種に由来する、本明細書に記載のＣａｓ９変異体などのＣａｓを含むＰＧＥＮによって認識されるものであり得る。特定の実施形態では、ＰＡＭ配列は、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、Ｓ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、Ｓ．アガラクティエ（Ｓ．ａｇａｌａｃｔｉａｅ）、Ｎ．メニンジティディス（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、Ｔ．デンティコーラ（Ｔ．ｄｅｎｔｉｃｏｌａ）、又はＦ．ノビシダ（Ｆ．ｎｏｖｉｃｉｄａ）に由来するＣａｓ９を含むＲＧＥＮによって認識されるものであり得る。例えば、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）由来の好適なＣａｓ９、例えば、本明細書に記載のＣａｓ９ Ｙ１５５変異体は、ＮＧＧのＰＡＭ配列を有するゲノム配列を標的とするために使用され得る；ＮはＡ、Ｃ、Ｔ、又はＧであり得る）。他の例として、以下のＰＡＭ配列を有するＤＮＡ配列を標的とする場合、好適なＣａｓ９は以下の種のいずれかに由来し得る：Ｓ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）（ＮＮＡＧＡＡ）、Ｓ．アガラクティエ（Ｓ．ａｇａｌａｃｔｉａｅ）（ＮＧＧ、ＮＮＡＧＡＡＷ［ＷはＡ又はＴである］、ＮＧＧＮＧ）、Ｎ．メニンジティディス（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）（ＮＮＮＮＧＡＴＴ）、Ｔ．デンティコーラ（Ｔ．ｄｅｎｔｉｃｏｌａ）（ＮＡＡＡＡＣ）、又はＦ．ノビシダ（Ｆ．ｎｏｖｉｃｉｄａ）（ＮＧ）（ここで、これらの特定のＰＡＭ配列の全てにおけるＮは、Ａ、Ｃ、Ｔ、又はＧである）。本明細書で有用なＣａｓ９／ＰＡＭの他の例としては、Ｓｈａｈ ｅｔ ａｌ．（ＲＮＡ Ｂｉｏｌｏｇｙ １０：８９１－８９９）及びＥｓｖｅｌｔ ｅｔ ａｌ．（Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ １０：１１１６－１１２１）（これらの文献は参照により本明細書に組み込まれる）に開示されているものが挙げられる。
ガイド型Ｃａｓタンパク質システム
本明細書で提供される組成物及び方法は、多種多様な宿主細胞において使用される。本明細書中で使用される場合、「宿主細胞」は、核酸又はゲノム改変システム（本明細書に記載のガイドポリヌクレオチド／Ｃａｓエンドヌクレアーゼシステムなど）のレシピエントとして使用される任意の細胞型（限定されないが、インビボ若しくはインビトロ細胞、真核細胞、原核細胞、又は単細胞実体として培養された多細胞生命体由来の細胞（例えば、細胞株）など）を指す。用語「宿主細胞」には、本明細書に記載の核酸又はガイドポリヌクレオチド／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ複合体によって形質転換、トランスフェクション又は形質導入された起源細胞の子孫が含まれる。「組み換え宿主細胞」（「遺伝子改変宿主細胞」とも呼ばれる）は、異種核酸、例えば組み換えＤＮＡコンストラクトが導入されているか、又は導入されており、且つ本明細書に記載のガイドポリヌクレオチド／Ｃａｓエンドヌクレアーゼシステムなどのゲノム改変システムを含む宿主細胞である。例えば、対象細菌宿主細胞は、外因性核酸（例えば、プラスミド又は組み換えＤＮＡコンストラクト）の好適な細菌宿主細胞への導入による遺伝子改変細菌宿主細胞を含み、対象真核宿主細胞は、外因性核酸の好適な真核宿主細胞への導入による遺伝子改変真核宿主細胞（例えば、真菌、哺乳動物生殖細胞又は植物細胞）を含む。
いくつかの実施形態では、宿主細胞は、古細菌細胞、細菌細胞、真核細胞、真核単細胞生物、体細胞、生殖細胞、幹細胞、植物細胞、藻類細胞、動物細胞、無脊椎動物細胞、脊椎動物細胞、魚細胞、カエル細胞、鳥類細胞、昆虫細胞、哺乳動物細胞、ブタ細胞、ウシ細胞、ヤギ細胞、ヒツジ細胞、げっ歯類細胞、ラット細胞、マウス細胞、非ヒト霊長類細胞、及びヒト細胞からなる群より選択される。いくつかの例では、細胞はインビトロである。いくつかの例では、細胞はインビボである。
本明細書に記載のガイドポリヌクレオチド／Ｃａｓシステムは、遺伝子ターゲティングのために使用され得る。
用語「遺伝子ターゲティング」、「ターゲティング」及び「ＤＮＡターゲティング」は、本明細書では互換的に使用される。本明細書中のＤＮＡターゲティングは、細胞の染色体又はプラスミドなどにおける、特定のＤＮＡ配列でのノックアウト、編集、又はノックインの特異的な導入であり得る。一般に、ＤＮＡターゲティングは、本明細書中で、Ｃａｓエンドヌクレアーゼが好適なポリヌクレオチド成分と関連して、細胞中の特定のＤＮＡ配列にて一方の鎖又は双方の鎖を切断することによって、実行され得る。ＤＮＡに一本鎖又は二本鎖切断がガイドされると、細胞のＤＮＡ修復機構が活性化され、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）又は相同組み換え修復（ＨＤＲ）プロセスによって切断を修復し、標的部位での改変につながり得る。
用語「ノックアウト」、「遺伝子ノックアウト」及び「遺伝的ノックアウト」は、本明細書では互換的に使用される。ノックアウトは、本明細書に記載のＣａｓ９エンドヌクレアーゼ変異体などのＣａｓエンドヌクレアーゼによるターゲティングによって部分的に又は完全に無効とされた、細胞のＤＮＡ配列を表す。ノックアウト前のそのようなＤＮＡ配列は、例えば、アミノ酸配列をコードしていたり、調節機能（例えばプロモータ）を有していたであろう。
本明細書に記載のように、ガイドされたＣａｓエンドヌクレアーゼは、ＤＮＡ標的配列を認識し、それに結合し、そして一本鎖（ニック）又は二本鎖切断を導入し得る。一本鎖又は二本鎖切断がＤＮＡ内に導入されると、細胞のＤＮＡ修復機構は、切断を修復するように活性化される。エラープローンＤＮＡ修復機構は、二本鎖切断部位で変異を作り出すことができる。切断された末端を１つに結合させるための最も一般的な修復機構は、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）経路である（Ｂｌｅｕｙａｒｄ ｅｔ ａｌ．，（２００６）ＤＮＡ Ｒｅｐａｉｒ ５：１－１２）。染色体の構造的完全性は、通常、修復により維持されるが、欠失、挿入又はその他の再配列（染色体転座など）もあり得る（Ｓｉｅｂｅｒｔ ａｎｄ Ｐｕｃｈｔａ，２００２，Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ １４：１１２１－３１、Ｐａｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００７，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １７５：２１－９）。
ノックアウトは、インデル（ＮＨＥＪによる標的ＤＮＡ配列中のヌクレオチド塩基の挿入若しくは欠失）、又は標的部位の、又は標的部位近くの配列の機能を低下させる、若しくは完全に破壊する配列の特異的除去によって作られ得る。本明細書中の用語「インデル」は、染色体又はエピソーム中の標的ＤＮＡ配列のヌクレオチド塩基の挿入又は欠失を指す。このような挿入又は欠失は、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個又はそれ以上の塩基であり得る。特定の実施形態では、インデルはさらに大きく、少なくとも約２０、３０、４０、５０、６０、７０ｐ、８０、９０、又は１００塩基であり得る。インデルは、遺伝子のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）内に導入される場合、フレームシフト変異を作り出すことによって、ＯＲＦによってコードされるタンパク質の野生型発現をしばしば破壊する。
一実施形態では、本開示は、細胞のゲノム中の標的部位を改変する方法であって、少なくとも１つのガイドポリヌクレオチド、及び少なくとも１つの本明細書に記載のＣａｓ９エンドヌクレアーゼ変異体を細胞に導入すること（ここで、前記ガイドポリヌクレオチドはキメラ非天然ガイドポリヌクレオチドであり、前記ガイドポリヌクレオチド及びＣａｓ９エンドヌクレアーゼ変異体は標的配列の全部又は一部を認識し、結合し、場合により、ニッキング、ほどき、又は切断することができる複合体（ＰＧＥＮ）を形成することができる）、並びに前記標的で改変を有する少なくとも１つの細胞を同定すること（ここで、前記標的部位における改変は（ｉ）少なくとも１つのヌクレオチドの置換、（ｉｉ）少なくとも１つのヌクレオチドの欠失、（ｉｉｉ）少なくとも１つのヌクレオチドの挿入、及び（ｉｖ）（ｉ）～（ｉｉｉ）の任意の組み合わせからなる群から選択される）を含む方法を記載する。
ガイドポリヌクレオチド／Ｃａｓエンドヌクレアーゼシステムは、目的のゲノムヌクレオチド配列の編集（改変）を可能にする少なくとも１つのポリヌクレオチド改変テンプレートと組み合わせて使用することができる。
「改変ヌクレオチド」又は「編集ヌクレオチド」は、それの非改変ヌクレオチド配列と比較した場合に少なくとも１つの改変を含む目的ヌクレオチド配列を指す。そのような「変更」としては、例えば、（ｉ）少なくとも１つのヌクレオチドの置換、（ｉｉ）少なくとも１つのヌクレオチドの欠失、（ｉｉｉ）少なくとも１つのヌクレオチドの挿入、又は（ｉｖ）（ｉ）～（ｉｉｉ）の任意の組み合わせが挙げられる。
用語「ポリヌクレオチド改変テンプレート」には、編集すべきヌクレオチド配列と比較して少なくとも１つのヌクレオチド改変を含むポリヌクレオチドが含まれる。ヌクレオチド改変は、少なくとも１つのヌクレオチドの置換、付加又は欠失であり得る。場合により、ポリヌクレオチド改変テンプレートは、さらに、少なくとも１つのヌクレオチド改変に隣接する相同ヌクレオチド配列を含み、その隣接する相同ヌクレオチド配列は、所望の編集すべきヌクレオチド配列に対し十分な相同性を示す。
一実施形態では、本開示は、細胞のゲノム中のヌクレオチド配列を編集する方法であって、細胞中に、少なくとも１つのガイドポリヌクレオチド、少なくとも１つの本明細書に記載のＣａｓ９エンドヌクレアーゼ変異体、及びポリヌクレオチド改変テンプレートを導入すること（ここで、前記ガイドポリヌクレオチドはキメラ非天然ガイドポリヌクレオチドであり、前記ガイドポリヌクレオチド及びＣａｓ９エンドヌクレアーゼ変異体は標的配列の全部又は一部を認識し、結合し、場合により、ニッキング、ほどき、又は切断することができる複合体（ＰＧＥＮ）を形成することができ、前記ポリヌクレオチド改変テンプレートは前記ヌクレオチド配列の少なくとも１つのヌクレオチドの改変を含む）を含み、任意選択により、編集されたヌクレオチド配列を含む少なくとも１つの細胞を選択することをさらに含む方法を含む。
編集されるヌクレオチドは、Ｃａｓエンドヌクレアーゼによって認識され、切断される標的部位の内又は外に位置し得る。一実施形態では、少なくとも１つのヌクレオチドの改変は、本明細書に記載のＣａｓ９エンドヌクレアーゼ変異体などのＣａｓエンドヌクレアーゼによって認識され、切断される標的部位での改変ではない。別の実施形態では、編集される少なくとも１つのヌクレオチドとゲノム標的部位との間に、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、３０、４０、５０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、９００又は１０００個のヌクレオチドがある。
細胞のゲノム中のヌクレオチド配列を編集する方法は、２０１７年４月２７日に公開された国際公開第２０１７／０７００２９号パンフレット、及び２０１７年４月２７日に公開された国際公開第２０１７／０７００３２号パンフレットに記載されているように、非機能性遺伝子産物に機能を回復させることによって、外因性選択マーカーを使用しない方法であり得る。
用語「ノックイン」、「遺伝子ノックイン」、「遺伝子挿入」及び「遺伝的ノックイン」は、本明細書では互換的に使用される。ノックインは、Ｃａｓタンパク質を用いたターゲティングによる（例えば、相同組み換え（ＨＲ）による（この場合、好適なドナーＤＮＡポリヌクレオチドもまた使用される））、細胞内の特定のＤＮＡ配列でのＤＮＡ配列の置換又は挿入を示す。ノックインの例としては、遺伝子のコード領域中の異種アミノ酸コード配列の特異的な挿入、又は遺伝子座中への転写調節エレメントの特異的な挿入がある。
Ｃａｓエンドヌクレアーゼの標的部位に挿入された目的ポリヌクレオチドを有する細胞又は生命体を得るために、様々な方法及び組成物を利用することができる。このような方法では、標的部位での目的ポリヌクレオチドの組み込みを提供するために相同組み換えを利用し得る。本明細書に記載の１つの方法では、目的ポリヌクレオチドを、ドナーＤＮＡコンストラクトによって生命体細胞に導入する。本明細書で使用される場合、「ドナーＤＮＡ」は、Ｃａｓエンドヌクレアーゼの標的部位内に挿入する目的ポリヌクレオチドを含むＤＮＡコンストラクトである。ドナーＤＮＡコンストラクトは、目的ポリヌクレオチドに隣接する第１及び第２の相同領域をさらに含む。ドナーＤＮＡの第１及び第２の相同領域はそれぞれ、細胞又は生命体ゲノムの標的部位中に存在する、又はこの標的部位に隣接する第１及び第２のゲノム領域に対する相同性を共有する。
ドナーＤＮＡは、ガイドポリヌクレオチドに連結され得る。連結されたドナーＤＮＡは、ゲノム編集、遺伝子挿入及び標的化ゲノム調節に有用な、標的ＤＮＡとドナーＤＮＡの共局在化を可能にし、また、内因性ＨＲ機構の機能が大きく低下していると予想される分裂後細胞のターゲティングに有用であり得る（Ｍａｌｉ ｅｔ ａｌ．，２０１３，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｖｏｌ．１０：９５７－９６３）。
エピソームＤＮＡ分子はまた、二本鎖切断内にライゲーションする、例えば、染色体二本鎖切断内へＴ－ＤＮＡを組み込むことができる（Ｃｈｉｌｔｏｎ ａｎｄ Ｑｕｅ，（２００３）Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ １３３：９５６－６５、Ｓａｌｏｍｏｎ ａｎｄ Ｐｕｃｈｔａ，（１９９８）ＥＭＢＯ Ｊ １７：６０８６－９５）。二本鎖切断近傍の配列が、例えば、二本鎖切断の成熟に関与しているエクソヌクレアーゼにより改変されると、遺伝子変換経路は、非分裂体細胞の相同染色体又はＤＮＡ複製後の姉妹染色分体など、相同配列が利用できれば、元の構造を回復することができる（Ｍｏｌｉｎｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，（２００４）Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ１６：３４２－５２）。異所性及び／又はエピジェネティックなＤＮＡ配列もまた、相同組み換えのＤＮＡ修復テンプレートとして働き得る（Ｐｕｃｈｔａ，（１９９９）Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １５２：１１７３－８１）。
相同組み換え修復（ＨＤＲ）は、細胞内の二本鎖及び一本鎖ＤＮＡ切断を修復する機構である。相同組み換え修復としては、相同組み換え（ＨＲ）及び一本鎖アニーリング（ＳＳＡ）が挙げられる（Ｌｉｅｂｅｒ．２０１０ Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．７９：１８１－２１１）。ＨＤＲの最も一般的な形態は相同組み換え（ＨＲ）と呼ばれ、これはドナーＤＮＡとアクセプターＤＮＡとの間の最長配列相同性要件を有する。ＨＤＲの他の形態としては、一本鎖アニーリング（ＳＳＡ）及び切断ガイド性複製が挙げられ、これらはＨＲに比較してより短い配列相同性を必要とする。ニック（一本鎖切断）での相同組み換え修復は、二本鎖切断でのＨＤＲとは異なる機構によって起こり得る（Ｄａｖｉｓ ａｎｄ Ｍａｉｚｅｌｓ．ＰＮＡＳ（００２７－８４２４），１１１（１０），ｐ．Ｅ９２４－Ｅ９３２）。
「相同」は、類似するＤＮＡ配列を意味する。例えば、ドナーＤＮＡ上で見出される「ゲノム領域に対する相同領域」は、細胞又は生命体のゲノムの所与の「ゲノム領域」と類似する配列を有するＤＮＡ領域である。相同領域は、切断される標的部位での相同組み換えを促進するのに十分であれば任意の長さであってよい。例えば、相同領域は、この相同領域が、対応するゲノム領域との相同組み換えを受けるのに十分な相同性を有するように、少なくとも５～１０、５～１５、５～２０、５～２５、５～３０、５～３５、５～４０、５～４５、５～５０、５～５５、５～６０、５～６５、５～７０、５～７５、５～８０、５～８５、５～９０、５～９５、５～１００、５～２００、５～３００、５～４００、５～５００、５～６００、５～７００、５～８００、５～９００、５～１０００、５～１１００、５～１２００、５～１３００、５～１４００、５～１５００、５～１６００、５～１７００、５～１８００、５～１９００、５～２０００、５～２１００、５～２２００、５～２３００、５～２４００、５～２５００、５～２６００、５～２７００、５～２８００、５～２９００、５～３０００、５～３１００以上の塩基の長さを含み得る。「十分な相同性」とは、２つのポリヌクレオチド配列が相同組み換え反応の基質として作用するのに十分な構造的類似性を有することを示す。この構造的類似性には、各ポリヌクレオチド断片の全長とポリヌクレオチドの配列類似性とが含まれる。配列類似性は、配列の全長にわたる配列同一性パーセント、並びに／又は１００％配列同一性を有する連続ヌクレオチドなどの局在化した類似性を含む保存領域及び配列の長さの一部にわたる配列同一性パーセントで説明することができる。
標的ポリヌクレオチド及びドナーポリヌクレオチドにより共有される相同性又は配列同一性の量は多様であり得、約１～２０ｂｐ、２０～５０ｂｐ、５０～１００ｂｐ、７５～１５０ｂｐ、１００～２５０ｂｐ、１５０～３００ｂｐ、２００～４００ｂｐ、２５０～５００ｂｐ、３００～６００ｂｐ、３５０～７５０ｂｐ、４００～８００ｂｐ、４５０～９００ｂｐ、５００～１０００ｂｐ、６００～１２５０ｂｐ、７００～１５００ｂｐ、８００～１７５０ｂｐ、９００～２０００ｂｐ、１～２．５ｋｂ、１．５～３ｋｂ、２～４ｋｂ、２．５～５ｋｂ、３～６ｋｂ、３．５～７ｋｂ、４～８ｋｂ、５～１０ｋｂ、又は最大で標的部位の全長まで（標的部位の全長を含む）の範囲の単位整数値を有する全長及び／又は全領域を含む。これらの範囲にはこの範囲内の全ての整数が含まれ、例えば１～２０ｂｐの範囲には、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９及び２０ｂｐが含まれる。相同性の量はまた、少なくとも約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性パーセントを含む、２つのポリヌクレオチドを完全にアラインした長さ全体にわたる配列同一性パーセントで説明することもできる。十分な相同性は、ポリヌクレオチドの長さと、全体的な配列同一性パーセントと、任意選択で連続ヌクレオチドの保存領域又は局所的な配列同一性パーセントとの任意の組み合わせを含み、例えば、十分な相同性は、標的遺伝子座の領域に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する７５～１５０ｂｐの領域と説明することができる。十分な相同性はまた、高ストレンジェンシー条件下で特異的にハイブリダイズする２つのポリヌクレオチドの予測能力によって説明することができ、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ）、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｅｄｓ（１９９４）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，（Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．ａｎｄ Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．）、及びＴｉｊｓｓｅｎ（１９９３）Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ－－Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｐｒｏｂｅｓ，（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）を参照されたい。
本明細書で使用される場合、「ゲノム領域」とは、標的部位のいずれかの側上に存在する、細胞のゲノム中の染色体のセグメントのことであるか、又は標的部位の一部も含むセグメントのことである。このゲノム領域は、このゲノム領域が、対応する相同領域との相同組み換えを受けるのに十分な相同性を有するように、少なくとも５～１０、５～１５、５～２０、５～２５、５～３０、５～３５、５～４０、５～４５、５～５０、５～５５、５～６０、５～６５、５～７０、５～７５、５～８０、５～８５、５～９０、５～９５、５～１００、５～２００、５～３００、５～４００、５～５００、５～６００、５～７００、５～８００、５～９００、５～１０００、５～１１００、５～１２００、５～１３００、５～１４００、５～１５００、５～１６００、５～１７００、５～１８００、５～１９００、５～２０００、５～２１００、５～２２００、５～２３００、５～２４００、５～２５００、５～２６００、５～２７００、５～２８００、５－２９００、５－３０００、５－３１００以上の塩基を含み得る。
所与のゲノム領域とドナーＤＮＡ上で見出される対応する相同領域との間の構造的類似性は、相同組み換えの発生を可能にする、任意の程度の配列同一性であってよい。例えば、ドナーＤＮＡの「相同領域」及び生命体ゲノムの「ゲノム領域」によって共有される相同性又は配列同一性の量は、それらの配列が相同組み換えを受けるように、少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性であり得る。
ドナーＤＮＡ上の相同領域は、標的部位に隣接する任意の配列に対して相同性を有する可能性がある。いくつかの例では、相同領域は、標的部位に直接隣接するゲノム配列に対して高い配列相同性を共有するが、この相同領域を、標的部位に対してさらに５’又は３’であり得る領域に対して十分な相同性を有するように設計することができることは認識される。相同領域はまた、下流のゲノム領域に加えて標的部位の断片とも相同性を有し得る。
一実施形態では、第１の相同領域は標的部位の第１の断片をさらに含み、第２の相同領域は標的部位の第２の断片を含み、これらの第１の断片と第２の断片とは異なっている。
本明細書で使用される場合、「相同組み換え」には、相同性部位での２つのＤＮＡ分子間のＤＮＡ断片の交換が含まれる。相同組み換えの頻度は、多数の因子によって影響を受ける。様々な生命体は、相同組み換えの量、及び相同組み換え対非相同組み換えの相対比率に関して変動する。一般に、相同領域の長さは、相同組み換え事象の頻度に影響を及ぼす：相同領域が長いほど頻度は高くなる。相同組み換えを観察するために必要とされる相同領域の長さもまた、種により変動する。多くの例で、少なくとも５ｋｂの相同が使用されるが、相同組み換えは、僅かに２５－５０ｂｐの相同で観察されている。例えば、Ｓｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，（１９８２）Ｃｅｌｌ ３１：２５－３３、Ｓｈｅｎ ａｎｄ Ｈｕａｎｇ，（１９８６）Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １１２：４４１－５７、Ｗａｔｔ ｅｔ ａｌ．，（１９８５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２：４７６８－７２、Ｓｕｇａｗａｒａ ａｎｄ Ｈａｂｅｒ，（１９９２）Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １２：５６３－７５、Ｒｕｂｎｉｔｚ ａｎｄ Ｓｕｂｒａｍａｎｉ，（１９８４）Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ４：２２５３－８、Ａｙａｒｅｓ ｅｔ ａｌ．，（１９８６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８３：５１９９－２０３、Ｌｉｓｋａｙ ｅｔ ａｌ．，（１９８７）Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １１５：１６１－７を参照されたい。
例えば、相同組み換え（ＨＲ）による原核細胞及び真核細胞又は生命体細胞のゲノムの変更は、遺伝子工学にとって強力なツールである。相同組み換えは、植物（Ｈａｌｆｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，（１９９２）Ｍｏｌ Ｇｅｎ Ｇｅｎｅｔ ２３１：１８６－９３）及び昆虫（Ｄｒａｙ ａｎｄ Ｇｌｏｏｒ，１９９７，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １４７：６８９－９９）において実証されている。相同組み換えはまた、他の生命体においても達成されてきた。例えば、寄生原虫であるリーシュマニア属（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ）における相同組み換えのためには、少なくとも１５０～２００ｂｐの相同性が必要とされた（Ｐａｐａｄｏｐｏｕｌｏｕ ａｎｄ Ｄｕｍａｓ，（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ２５：４２７８－８６）。糸状菌のアスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ）では、遺伝子置換は僅か５０ｂｐの隣接相同性によって達成されている（Ｃｈａｖｅｒｏｃｈｅ ｅｔ ａｌ．，（２０００）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ２８：ｅ９７）。標的化遺伝子置換はまた、繊毛虫類であるテトラヒメナ・サーモフィラ（Ｔｅｔｒａｈｙｍｅｎａ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）においても実証されている（Ｇａｅｒｔｉｇ ｅｔ ａｌ．，（１９９４）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ２２：５３９１－８）。哺乳動物では、相同組み換えは、培養で増殖され、形質転換され、選択され、そしてマウス胚に導入され得る多能性胚性幹細胞株（ＥＳ）を使用して、マウスにおいて最も成功している（Ｗａｔｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮＡ，２ｎｄ Ｅｄ．，（Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｂｏｏｋｓ：ＷＨ Ｆｒｅｅｍａｎ ＆ Ｃｏ．により配刊））。
ＤＮＡ二本鎖切断は、相同組み換え経路の促進に有効な因子であると思われる（Ｐｕｃｈｔａ ｅｔ ａｌ．，（１９９５）Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２８：２８１－９２、Ｔｚｆｉｒａ ａｎｄ Ｗｈｉｔｅ，（２００５）Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２３：５６７－９、Ｐｕｃｈｔａ，（２００５）Ｊ Ｅｘｐ Ｂｏｔ ５６：１－１４）。植物では、ＤＮＡ切断剤を使用すると、人工的に構築された相同ＤＮＡ反復配列間で相同組み換えが２～９倍増加したことが観察された（Ｐｕｃｈｔａ ｅｔ ａｌ．，（１９９５）Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２８：２８１－９２）。トウモロコシプロトプラストでは、線状ＤＮＡ分子を用いた実験で、プラスミド間の相同組み換えが増強されたことが示された（Ｌｙｚｎｉｋ ｅｔ ａｌ．，（１９９１）Ｍｏｌ Ｇｅｎ Ｇｅｎｅｔ ２３０：２０９－１８）。
一態様では、本開示は、細胞のゲノム中の標的部位を改変する方法であって、細胞中に、少なくとも１つのガイドポリヌクレオチド、少なくとも１つの本明細書に記載のＣａｓ９エンドヌクレアーゼ変異体、及び少なくとも１つのドナーＤＮＡを導入すること（ここで、前記ガイドポリヌクレオチドはキメラ非天然ガイドポリヌクレオチドであり、前記ガイドポリヌクレオチド及びＣａｓ９エンドヌクレアーゼ変異体は標的配列の全部又は一部を認識し、結合し、場合により、ニッキング、ほどき、又は切断することができる複合体（ＰＧＥＮ）を形成することができ、前記ドナーＤＮＡは目的ポリヌクレオチドを含む）を含み、任意選択により、前記目的ポリヌクレオチドが前記標的部位に、又は前記標的部位近くに組み込まれた少なくとも１つの細胞を同定することをさらに含む方法を含む。
一態様では、本開示は、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞のゲノムを改変する方法であって、
改変されるべき少なくとも１つの標的配列を含むバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞に、少なくとも１つの非天然ガイドＲＮＡ、及び少なくとも１つの本明細書に記載のＣａｓ９エンドヌクレアーゼ変異体を提供すること（ここで、ガイドＲＮＡ及びＣａｓ９エンドヌクレアーゼ変異体は複合体（ＰＧＥＮ）を形成することができ、前記複合体は前記少なくとも１つの標的配列の全部又は一部を認識し、結合し、場合により、ニッキング、ほどき、又は切断することができる）、並びに
少なくとも１つのバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞を同定すること（ここで、少なくとも１つのゲノム標的配列は改変されている）
を含む方法を含む。前記標的配列の改変は、（ｉ）少なくとも１つのヌクレオチドの置換、（ｉｉ）少なくとも１つのヌクレオチドの欠失、（ｉｉｉ）少なくとも１つのヌクレオチドの挿入、及び（ｉｖ）（ｉ）～（ｉｉｉ）の任意の組み合わせからなる群から選択することができる。
一態様では、本開示は、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）宿主細胞のゲノムを改変する方法であって、
改変されるべき少なくとも１つの標的配列を含むＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）宿主細胞に、少なくとも１つの非天然ガイドＲＮＡ、及び少なくとも１つの本明細書に記載のＣａｓ９エンドヌクレアーゼ変異体を提供すること（ここで、ガイドＲＮＡ及びＣａｓ９エンドヌクレアーゼ変異体は複合体（ＰＧＥＮ）を形成することができ、前記複合体は前記少なくとも１つの標的配列の全部又は一部を認識し、結合し、場合により、ニッキング、ほどき、又は切断することができる）、並びに
少なくとも１つのＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）宿主細胞を同定すること（ここで、少なくとも１つのゲノム標的配列は改変されている）
を含む方法を含む。
一態様では、本開示は、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）宿主細胞のゲノムを改変する方法であって、
改変されるべき少なくとも１つの標的配列を含むサッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）宿主細胞に、少なくとも１つの非天然ガイドＲＮＡ、及び少なくとも１つの本明細書に記載のＣａｓ９エンドヌクレアーゼ変異体を提供すること（ここで、ガイドＲＮＡ及びＣａｓ９エンドヌクレアーゼ変異体は複合体（ＰＧＥＮ）を形成することができ、前記複合体は前記少なくとも１つの標的配列の全部又は一部を認識し、結合し、場合により、ニッキング、ほどき、又は切断することができる）、並びに
少なくとも１つのサッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）宿主細胞を同定すること（ここで、少なくとも１つのゲノム標的配列は改変されている）
を含む方法を含む。
ガイドＲＮＡ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼシステムのさらなる使用が報告されており（米国特許出願公開第２０１５／００８２４７８Ａ１号明細書（２０１５年３月１９日公開）、国際公開第２０１５／０２６８８６Ａ１号パンフレット（２０１５年２月２６日公開）、米国特許出願公開第２０１５／００５９０１０Ａ１号明細書（２０１５年２月２６日公開）、米国特許出願第６２／０２３２４６号明細書（２０１４年７月７日出願）、及び米国特許出願第６２／０３６，６５２号明細書（２０１４年８月１３日出願）を参照されたい（これらの文献は全て参照により本明細書に組み込まれる））、限定はされないが、目的ヌクレオチド配列（調節エレメントなど）の改変又は置換、目的ポリヌクレオチドの挿入、遺伝子ノックアウト、遺伝子ノックイン、スプライシング部位の改変及び／又は選択的スプライシング部位の導入、目的タンパク質をコードするヌクレオチド配列の改変、アミノ酸及び／又はタンパク質の融合、並びに目的遺伝子へ逆方向反復配列を発現させることによる遺伝子サイレンシングが挙げられる。
多重化
本明細書中のターゲティング法は、例えば、この方法で２つ以上のＤＮＡ標的部位が標的にされるような方法で行われ得る。このような方法は、任意選択により、多重法として特徴づけることができる。特定の実施形態では、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又はそれ以上の標的部位が同時に標的にされえる。多重法は、通常、複数の異なるＲＮＡ成分（各々がガイドポリヌクレオチド／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ複合体を固有のＤＮＡ標的部位に導くように設計されている）が提供される、本明細書中のターゲティング法により行われる。
本明細書に記載のＣａｓ９エンドヌクレアーゼ変異体は、標的ゲノム編集（単一及び多重の二本鎖切断及びニックにより）、及び標的ゲノム調節（Ｃａｓ９又はｓｇＲＮＡにエピジェネティックエフェクタードメインを結合することにより）に使用することができる。本明細書に記載のＣａｓ９エンドヌクレアーゼ変異体はまた、ＲＮＡガイド型リコンビナーゼとして機能するように設計することができ、また、ＲＮＡ結合により、多タンパク質及び核酸複合体のアセンブリー用足場として機能し得る（Ｍａｌｉ ｅｔ ａｌ．２０１３ Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｖｏｌ．１０：９５７－９６３）。
複合形質遺伝子座
目的の、及び／又は形質のポリヌクレオチドは、国際公開第２０１２／１２９３７３号パンフレット（２０１３年３月１４日公開）及び国際出願ＰＣＴ／ＵＳ１３／２２８９１号明細書（２０１３年１月２４日公開）（両文献は参照により本明細書に組み込まれる）に記載されているように複合形質遺伝子座に一緒にスタックすることができる。本明細書に記載のＣａｓ９エンドヌクレアーゼ変異体を含むシステムなどの、ガイドポリヌクレオチド／Ｃａｓエンドヌクレアーゼシステムは、一本鎖又は二本鎖切断を生成するための効率的なシステムを提供し、形質が複合形質遺伝子座にスタックすることを可能にする。
ポリヌクレオチド、ポリペプチド、発現カセット、組み換えＤＮＡ、又はガイド型Ｃａｓタンパク質システムの任意の１つの成分の導入
本明細書に開示されるポリヌクレオチド、ポリペプチド、発現カセット又は組み換えＤＮＡは、当該技術分野で知られた任意の方法を使用して生命体に導入され得る。ガイドポリヌクレオチド／Ｃａｓシステムの任意の１つの成分、ガイドポリヌクレオチド／Ｃａｓ複合体自体、並びにポリヌクレオチド改変テンプレート及び／又はドナーＤＮＡは、当該技術分野で知られた任意の方法によって細胞に導入することができる。
「導入する」は、細胞又は生命体などの生命体に、ポリヌクレオチド又はポリペプチド又はポリヌクレオチド－タンパク質複合体（例えば、ＲＧＥＮ又はＰＧＥＮ）を、それらの成分が生命体の細胞内、又は細胞自体へ侵入するように提示することを意味するものとする。本方法及び本組成物は、生命体又は細胞に配列を導入する特定の方法に依存することはなく、生命体の少なくとも１つの細胞の内部にポリヌクレオチド又はポリペプチドを単に侵入させるだけである。導入する、には、核酸の真核細胞若しくは原核細胞内への組み込みであって、核酸を細胞のゲノム内に組み込むことができる組み込みについての言及、及び核酸、タンパク質若しくはポリヌクレオチド－タンパク質複合体（ＰＧＥＮ、ＲＧＥＮ）の細胞への一過性（直接）の提供についての言及が含まれる。
ポリヌクレオチド、ポリペプチド、発現カセット、組み換えＤＮＡ又はポリヌクレオチド－タンパク質複合体（ＰＧＥＮ、ＲＧＥＮ）を細胞又は生命体に導入する方法は、当該技術分野では知られており、例えば、限定はされないが、（国際公開第２０１７／０７５１９５号パンフレット、国際公開第２００２／１４４９０号パンフレット及び国際公開第２００８／７９８９号パンフレットに記載されているような）天然コンピテンス、マイクロインジェクション（Ｃｒｏｓｓｗａｙ ｅｔ ａｌ．，（１９８６）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ４：３２０－３４及び米国特許第６，３００，５４３号明細書、分裂組織形質転換（米国特許第５，７３６，３６９号明細書）、エレクトロポレーション（Ｒｉｇｇｓ ｅｔ ａｌ．，（１９８６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８３：５６０２－６）、安定な形質転換、一過性形質転換、弾道粒子加速法（微粒子銃法）（米国特許第４，９４５，０５０号明細書、同第５，８７９，９１８号明細書、同第５，８８６，２４４号明細書、同第５，９３２，７８２号明細書）、ウィスカー媒介形質転換法（Ａｉｎｌｅｙ ｅｔ ａｌ．２０１３，Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｊｏｕｒｎａｌ １１：１１２６－１１３４、Ｓｈａｈｅｅｎ Ａ．ａｎｄ Ｍ．Ａｒｓｈａｄ ２０１１ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｓｉｌｉｃｏｎ Ｃａｒｂｉｄｅ（２０１１），３４５－３５８ Ｅｄｉｔｏｒ（ｓ）：Ｇｅｒｈａｒｄｔ，Ｒｏｓａｒｉｏ．Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒ：ＩｎＴｅｃｈ，Ｒｉｊｅｋａ，Ｃｒｏａｔｉａ．ＣＯＤＥＮ：６９ＰＱＢＰ；ＩＳＢＮ：９７８－９５３－３０７－２０１－２）、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）媒介形質転換法（米国特許第５，５６３，０５５号明細書及び同第５，９８１，８４０号明細書）、遺伝子直接導入法（Ｐａｓｚｋｏｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，（１９８４）ＥＭＢＯ Ｊ ３：２７１７－２２）、ウイルス媒介導入法（米国特許第５，８８９，１９１号明細書、同第５，８８９，１９０号明細書、同第５，８６６，７８５号明細書、同第５，５８９，３６７号明細書及び同第５，３１６，９３１号明細書）、トランスフェクション法、形質導入法、細胞膜透過ペプチド法、メソポーラスシリカナノ粒子（ＭＳＮ）媒介タンパク質直接送達法、局所投与法、性増殖法（ｓｅｘｕａｌ ｂｒｅｅｄｉｎｇ）、及びこれらの任意の組み合わせが挙げられる。安定な形質転換は、生命体に導入されたヌクレオチドコンストラクトが生命体のゲノムに組み込まれ、その子孫によって受け継がれ得ることを意味するものとする。一過性形質転換は、ポリヌクレオチドが生命体に（直接的又は間接的に）導入され、生命体のゲノムには組み込まれないか、又はポリペプチドが生命体に導入されることを意味するものとする。一過性形質転換は、導入された組成物が生命体において一時的にのみ発現又は存在することを意味する。
ガイドポリヌクレオチド（ガイドＲＮＡ、ｃｒヌクレオチド＋ｔｒａｃｒヌクレオチド、ガイドＤＮＡ及び／又はガイドＲＮＡ－ＤＮＡ分子）は、一本鎖又は二本鎖ポリヌクレオチド分子として細胞に直接（一時的に）導入することができる。ガイドＲＮＡ（又はｃｒＲＮＡ＋ｔｒａｃｒＲＮＡ）はまた、ガイドＲＮＡ（又はｃｒＲＮＡ＋ｔｒａｃｒＲＮＡ）をコードする異種核酸断片を含む組み換えＤＮＡ分子を導入することによって間接的に細胞に導入することができ、異種核酸断片は前記細胞内でガイドＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ＋ｔｒａｃｒＲＮＡ分子）を転写することができる特定のプロモーターに作動可能に連結される。特定のプロモーターは、限定はされないが、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターであり得、このプロモーターは正確に定義され改変されていない５’末端及び３’末端を有するＲＮＡの転写を可能にする（Ｍａ ｅｔ ａｌ．，２０１４，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ ３：ｅ１６１、ＤｉＣａｒｌｏ ｅｔ ａｌ．，２０１３，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．４１：４３３６－４３４３、国際公開第２０１５／０２６８８７号パンフレット（２０１５年２月２６日公開））。細胞内でガイドＲＮＡを転写することができる任意のプロモーターを使用することができ、例えば、ガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結された熱ショック／熱ガイド性プロモーターが挙げられる。
本明細書中のＣａｓエンドヌクレアーゼは、当該技術分野で知られている任意の方法を使用して、Ｃａｓポリペプチド自体（Ｃａｓエンドヌクレアーゼの直接送達と呼ばれる）、Ｃａｓタンパク質をコードするｍＲＮＡ、及び／又はガイドポリヌクレオチド／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ複合体自体を直接導入することによって、細胞に導入され得る。Ｃａｓエンドヌクレアーゼはまた、Ｃａｓエンドヌクレアーゼをコードする組み換えＤＮＡ分子を導入することによって間接的に細胞に導入することができる。エンドヌクレアーゼは当該技術分野で知られている任意の方法を使用して、細胞に一過性に導入することができ、又は宿主細胞のゲノムに組み込むことができる。エンドヌクレアーゼ及び／又はガイドポリヌクレオチドの細胞への取り込みは、国際公開第２０１６／０７３４３３号パンフレット（２０１６年５月１２日公開）に記載されているように、細胞膜透過ペプチド（ＣＰＰ）を用いて促進することができる。本明細書中のＣａｓエンドヌクレアーゼ変異体を細胞で発現させることができる任意のプロモーターを使用することができ、例えば、Ｃａｓエンドヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結された熱ショック／熱ガイド性プロモーターが挙げられる。
ポリヌクレオチド改変テンプレートの細胞への直接送達は、粒子媒介送達によって達成することができ、他の任意の直接送達法、例えば、限定はされないが、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）媒介性のプロトプラストへのトランスフェクション、ウィスカー媒介形質転換、エレクトロポレーション、微粒子銃法、細胞膜透過ペプチド法、又はメソポーラスシリカナノ粒子（ＭＳＮ）媒介タンパク質直接送達法などは、真核細胞などの細胞にポリヌクレオチド改変テンプレートを送達するために首尾よく使用することができる。
ドナーＤＮＡは、当該技術分野で知られている任意の手段によって導入することができる。ドナーＤＮＡは、例えば、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）媒介形質転換又はバイオリスティック微粒子銃法を含む当該技術分野で知られている任意の形質転換法によって提供することができる。ドナーＤＮＡは、細胞内に一過性で存在させることができ、又はウイルスレプリコンによって導入することができよう。Ｃａｓエンドヌクレアーゼ及び標的部位の存在下で、ドナーＤＮＡは植物などの生命体の形質転換ゲノムに挿入される。
本明細書に記載のガイド型Ｃａｓシステム成分のいずれか１つの直接送達は、ガイドポリヌクレオチド／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ複合体成分を受容する細胞の濃縮及び／又は可視化を促進し得る他のｍＲＮＡの直接送達（共送達）を伴い得る。例えば、ガイドポリヌクレオチド／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ成分（及び／又はガイドポリヌクレオチド／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ複合体自体）を、表現型マーカー（限定されないが、ＣＲＣなどの転写アクチベーターなど（Ｂｒｕｃｅ ｅｔ ａｌ．２０００ Ｔｈｅ Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ １２：６５－７９）をコードするｍＲＮＡと一緒に直接共送達することにより、国際公開第２０１７／０７００２９号パンフレット（２０１７年４月２７日公開）及び国際公開第２０１７／０７００３２号パンフレット（２０１７年４月２７日公開）に記載されているように、機能を持たない遺伝子産物の機能を回復させ、これにより、外因性選択マーカーを使用せずに、細胞を選択し濃縮することを可能にすることができる。
本明細書に記載のガイドＲＮＡ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ複合体（ＲＧＥＮ）の細胞への導入は、リボヌクレオチド－タンパク質としてガイドＲＮＡ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ複合体を細胞へ導入することを含む。リボヌクレオチド－タンパク質は、本明細書に記載のように、細胞に導入する前に組み立てることができる。ガイドＲＮＡ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼリボヌクレオチドタンパク質を含む成分は、（本明細書に記載されるようなゲノム改変の標的とされた）細胞に導入される前に、当該技術分野で知られた任意の手段によって、インビトロで組み立てられ得るか、又は組み立てられる。
植物、真菌及び細菌細胞は、ヒト及び動物細胞とは、植物、真菌及び細菌細胞が、ＲＧＥＮリボヌクレオタンパク質の直接送達及び／又はＲＧＥＮ成分の直接送達に障壁として作用する細胞壁を有する点で異なる。
植物、真菌及び細菌細胞へのＲＧＥＮリボヌクレオタンパク質の直接送達は、粒子媒介送達（微粒子銃法）によって達成され得る。本明細書に記載の実験に基づき、熟練した技術者は今では、ＲＧＥＮリボヌクレオタンパク質の真菌及び細菌細胞への送達に、他の任意の直接送達法、例えば、限定はされないが、プロトプラストへのポリエチレングリコール（ＰＥＧ）媒介トランスフェクション、エレクトロポレーション法、細胞膜透過ペプチド法、又はメソポーラスシリカナノ粒子（ＭＳＮ）媒介タンパク質直接送達法などを首尾よく使用できると想像することができる。
ＲＧＥＮリボヌクレオタンパク質の直接送達は、その後、複合体が急速に分解し、細胞内での複合体の存在が一時的となるような形での、細胞ゲノムの標的部位におけるゲノム編集を可能にする。このＲＧＥＮ複合体の一時的存在は、オフターゲットになる結果を減少させることに繋がり得る。対照的に、プラスミドＤＮＡ配列によるＲＧＥＮ成分（ガイドＲＮＡ、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼ）の送達は、これらのプラスミドからのＲＧＥＮのコンスタントな発現をもたらし、これはオフターゲットになる結果を増強し得る（Ｃｒａｄｉｃｋ，Ｔ．Ｊ．ｅｔ ａｌ（２０１３）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ４１：９５８４－９５９２、Ｆｕ，Ｙ ｅｔ ａｌ（２０１４）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３１：８２２－８２６）。
直接送達は、本明細書に記載のガイドＲＮＡ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ複合体（ＲＧＥＮ）の任意の１つの成分（少なくとも１つのガイドＲＮＡ、少なくとも１つのＣａｓ９エンドヌクレアーゼ変異体など）を、金粒子、タングステン粒子、及び炭化ケイ素ウィスカー粒子など（これらに限定されない）の微粒子を含む粒子送達マトリックスと組み合わせることによって達成することができる（国際公開第２０１７／０７００２９号パンフレット（２０１７年４月２７日公開）及び国際公開第２０１７／０７００３２号パンフレット（２０１７年４月２７日公開）（これらの文献は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）も参照されたい）。
一態様では、ガイドポリヌクレオチド／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ複合体（ＲＧＥＮ）は、ガイドＲＮＡ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ複合体を形成する本明細書に記載のガイドＲＮＡ及びＣａｓ９エンドヌクレアーゼ変異体がそれぞれＲＮＡ及びタンパク質として細胞に導入される複合体である。
一態様では、ガイドポリヌクレオチド／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ複合体は、ガイドＲＮＡ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ複合体を形成する本明細書に記載のガイドＲＮＡ及びＣａｓ９エンドヌクレアーゼ変異体がリボヌクレオチド－タンパク質複合体としてインビトロで予め組み立てられて、細胞に導入される複合体である。
核酸及びタンパク質は、ガイド型Ｃａｓシステムのいずれかの成分又は全成分（タンパク質及び／又は核酸）の取り込みを容易にする分子、例えば、細胞膜透過ペプチド及びナノキャリアを使用する方法を含む任意の方法で、細胞に提供することができる（米国特許出願公開第２０１１／００３５８３６号明細書（２０１１年２月２０日公開）（この文献は参照により本明細書に組み込まれる））。
細胞、生命体
本開示のＣａｓエンドヌクレアーゼ変異体、ポリヌクレオチド、ペプチド、ガイドポリヌクレオチド、Ｃａｓエンドヌクレアーゼ、ポリヌクレオチド改変テンプレート、ドナーＤＮＡ、ガイドポリヌクレオチド／Ｃａｓエンドヌクレアーゼシステム、及びこれらの任意の１つの組み合わせを細胞に導入することができる。
細胞としては、限定はされないが、ヒト、非ヒト、動物、細菌、真菌、昆虫、酵母、非従来型酵母、微生物及び植物細胞、並びに本明細書に記載の方法で作製された植物及び種子が挙げられる。
本明細書に開示される方法及び組成物において使用される微生物細胞は、任意の真菌宿主細胞、糸状菌細胞及び細菌細胞であり得る。本明細書で使用される用語「真菌細胞」、「真菌」、「真菌宿主細胞」などは、本明細書で使用する場合、子嚢菌（Ａｓｃｏｍｙｃｏｔａ）門、担子菌（Ｂａｓｉｄｉｏｍｙｃｏｔａ）門、ツボカビ（Ｃｈｙｔｒｉｄｉｏｍｙｃｏｔａ）門及び接合菌（Ｚｙｇｏｍｙｃｏｔａ）門（Ｈａｗｋｓｗｏｒｔｈ ｅｔ ａｌ．，１９９５により定義される）、並びに卵菌門（Ｏｏｍｙｃｏｔａ）（Ｈａｗｋｓｗｏｒｔｈ ｅｔ ａｌ．，１９９５）及び全ての栄養胞子形成菌（Ｈａｗｋｓｗｏｒｔｈ ｅｔ ａｌ．，１９９５）を含む。特定の実施形態では、真菌宿主細胞は酵母細胞であり、用語「酵母」は、子嚢菌酵母（エンドミケス目（Ｅｎｄｏｍｙｃｅｔａｌｅｓ））、担子菌酵母、及び不完全菌（ブラストミセス属（Ｂｌａｓｔｏｍｙｃｅｔｅｓ））に属する酵母を意味する。したがって、酵母宿主細胞としては、カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）、ハンゼヌラ属（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、クルイベロマイセス属（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、ピキア属（Ｐｉｃｈｉａ）、サッカロマイセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、シゾサッカロマイセス属（ＳｃｈｉｚｏＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）又はヤロウイア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）の細胞が挙げられる。酵母の種としては、サッカロマイセス・カールスベルゲンシス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃａｒｌｓｂｅｒｇｅｎｓｉｓ）、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、サッカロマイセス・ジアスタティクス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｄｉａｓｔａｔｉｃｕｓ）、サッカロマイセス・ドウグラシイ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｄｏｕｇｌａｓｉｉ）、サッカロマイセス・クルイベリ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｋｌｕｙｖｅｒｉ）、サッカロマイセス・ノルベンシス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｎｏｒｂｅｎｓｉｓ）、サッカロマイセス・オビフォルミス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｏｖｉｆｏｒｍｉｓ）、クルイベロミセス・ラクチス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ）及びヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）が挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書中の用語「非従来型酵母」は、サッカロマイセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）（例えば、Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ））の酵母種でもシゾサッカロマイセス属（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）の酵母種でもない任意の酵母を指す。Ｎｏｎ－Ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌ Ｙｅａｓｔｓ ｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｋ．Ｗｏｌｆ，Ｋ．Ｄ．Ｂｒｅｕｎｉｇ，Ｇ．Ｂａｒｔｈ，Ｅｄｓ．，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ－Ｖｅｒｌａｇ，Ｂｅｒｌｉｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ，２００３）を参照されたい。非従来型酵母としては、ヤロウィア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）、ピキア属（Ｐｉｃｈｉａ）、シュワニオマイセス属（Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ）、クルイベロマイセス属（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、アークスラ属（Ａｒｘｕｌａ）、トリコスポロン属（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ）、カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）、ウスティラゴ属（Ｕｓｔｉｌａｇｏ）、トルロプシス属（Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ）、チゴサッカロマイセス属（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、トリゴノプシス属（Ｔｒｉｇｏｎｏｐｓｉｓ）、クリプトコッカス属（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、ロドトルラ属（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）、ファフィア属（Ｐｈａｆｆｉａ）、スポロボロマイセス属（Ｓｐｏｒｏｂｏｌｏｍｙｃｅｓ）及びパチソレン属（Ｐａｃｈｙｓｏｌｅｎ）からなる群から選択される属のメンバーが挙げられる。非従来型酵母としては、相同組み換え（ＨＲ）によって媒介される修復プロセスよりも非相同末端結合（ＮＨＥＪ）ＤＮＡ修復プロセスに有利な酵母が挙げられる。これらの線―ＨＲよりもＮＨＥＪを好む―に沿った非従来型酵母の定義はさらにＣｈｅｎ ｅｔ ａｌ．（ＰＬｏＳ ＯＮＥ８：ｅ５７９５２）により開示されている（この文献は参照により本明細書に組み込まれる）。本明細書中の用語「酵母」は、主に単細胞の形態で存在する真菌種を指す。或いは、酵母は、本明細書では、「酵母細胞」と呼ばれることもある。ヤロウイア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）種の好適な例は、Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）である。ピキア属（Ｐｉｃｈｉａ）種の好適な例としては、Ｐ．パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）、Ｐ．メタノリカ（Ｐ．ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ）、Ｐ．スティピティス（Ｐ．ｓｔｉｐｉｔｉｓ）、Ｐ．アノマーラ（Ｐ．ａｎｏｍａｌａ）及びＰ．アングスタ（Ｐ．ａｎｇｕｓｔａ）が挙げられる。シュワニオマイセス（Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ）属種の好適な例には、Ｓ．カステリイ（Ｓ．ｃａｓｔｅｌｌｉｉ）、Ｓ．アルビウス（Ｓ．ａｌｌｕｖｉｕｓ）、Ｓ．ホミニス（Ｓ．ｈｏｍｉｎｉｓ）、Ｓ．オキシデンタリス（Ｓ．ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓ）、Ｓ．カプリオッティ（Ｓ．ｃａｐｒｉｏｔｔｉｉ）、Ｓ．エチェルシィ（Ｓ．ｅｔｃｈｅｌｌｓｉｉ）、Ｓ．ポリモルファス（Ｓ．ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｕｓ）、Ｓ．シュードポリモルファス（Ｓ．ｐｓｅｕｄｏｐｏｌｙｍｏｒｐｈｕｓ）、Ｓ．バンリジアエ（Ｓ．ｖａｎｒｉｊｉａｅ）及びＳ．ヤマダエ（Ｓ．ｙａｍａｄａｅ）が挙げられる。クルイベロマイセス属（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）種の好適な例としては、Ｋ．ラクティス（Ｋ．ｌａｃｔｉｓ）、Ｋ．マルキシアヌス（Ｋ．ｍａｒｘｉａｎｕｓ）、Ｋ．フラギリス（Ｋ．ｆｒａｇｉｌｉｓ）、Ｋ．ドロソフィラルム（Ｋ．ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａｒｕｍ）、Ｋ．サーモトレランス（Ｋ．ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ）、Ｋ．ファゼオロスポラス（Ｋ．ｐｈａｓｅｏｌｏｓｐｏｒｕｓ）、Ｋ．バヌデニイ（Ｋ．ｖａｎｕｄｅｎｉｉ）、Ｋ．ワルティ（Ｋ．ｗａｌｔｉｉ）、Ｋ．アフリカヌス（Ｋ．ａｆｒｉｃａｎｕｓ）及びＫ．ポリスポラス（Ｋ．ｐｏｌｙｓｐｏｒｕｓ）が挙げられる。アルクスラ属（Ａｒｘｕｌａ）種の好適な例としては、Ａ．アデニニボランス（Ａ．ａｄｅｎｉｎｉｖｏｒａｎｓ）及びＡ．テレストレ（Ａ．ｔｅｒｒｅｓｔｒｅ）が挙げられる。トリコスポロン属（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ）種の好適な例としては、Ｔ．クタネウム（Ｔ．ｃｕｔａｎｅｕｍ）、Ｔ．カピタタム（Ｔ．ｃａｐｉｔａｔｕｍ）、Ｔ．インキン（Ｔ．ｉｎｋｉｎ）及びＴ．ビーメリ（Ｔ．ｂｅｅｍｅｒｉ）が挙げられる。カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）種の好適な例としては、Ｃ．アルビカンス（Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ）、Ｃ．アスカラフィダルム（Ｃ．ａｓｃａｌａｐｈｉｄａｒｕｍ）、Ｃ．アンフィクシアエ（Ｃ．ａｍｐｈｉｘｉａｅ）、Ｃ．アンタークティカ（Ｃ．ａｎｔａｒｃｔｉｃａ）、Ｃ．アルゲンティア（Ｃ．ａｒｇｅｎｔｅａ）、Ｃ．アトランティカ（Ｃ．ａｔｌａｎｔｉｃａ）、Ｃ．アトモスファェリカ（Ｃ．ａｔｍｏｓｐｈａｅｒｉｃａ）、Ｃ．ブラッテ（Ｃ．ｂｌａｔｔａｅ）、Ｃ．ブロメリアセアルム（Ｃ．ｂｒｏｍｅｌｉａｃｅａｒｕｍ）、Ｃ．カルポフィラ（Ｃ．ｃａｒｐｏｐｈｉｌａ）、Ｃ．カルバジャリス（Ｃ．ｃａｒｖａｊａｌｉｓ）、Ｃ．セラムビシダルム（Ｃ．ｃｅｒａｍｂｙｃｉｄａｒｕｍ）、Ｃ．チャウリオデス（Ｃ．ｃｈａｕｌｉｏｄｅｓ）、Ｃ．コリダリ（Ｃ．ｃｏｒｙｄａｌｉ）、Ｃ．ドッセイ（Ｃ．ｄｏｓｓｅｙｉ）、Ｃ．デュブリニエンシス（Ｃ．ｄｕｂｌｉｎｉｅｎｓｉｓ）、Ｃ．エルガテンシス（Ｃ．ｅｒｇａｔｅｎｓｉｓ）、Ｃ．フルクツス（Ｃ．ｆｒｕｃｔｕｓ）、Ｃ．グラブラータ（Ｃ．ｇｌａｂｒａｔａ）、Ｃ．フェルメンタティ（Ｃ．ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉ）、Ｃ．ギリエルモンディ（Ｃ．ｇｕｉｌｌｉｅｒｍｏｎｄｉｉ）、Ｃ．ハエムロニィ（Ｃ．ｈａｅｍｕｌｏｎｉｉ）、Ｃ．インセクタメンス（Ｃ．ｉｎｓｅｃｔａｍｅｎｓ）、Ｃ．インセクトルム（Ｃ．ｉｎｓｅｃｔｏｒｕｍ）、Ｃ．インテルメディア（Ｃ．ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ）、Ｃ．イェフレシィ（Ｃ．ｊｅｆｆｒｅｓｉｉ）、Ｃ．ケフィア（Ｃ．ｋｅｆｙｒ）、Ｃ．ケロセニエ（Ｃ．ｋｅｒｏｓｅｎｅａｅ）、Ｃ．クルセイ（Ｃ．ｋｒｕｓｅｉ）、Ｃ．ルシタニエ（Ｃ．ｌｕｓｉｔａｎｉａｅ）、Ｃ．リキソソフィラ（Ｃ．ｌｙｘｏｓｏｐｈｉｌａ）、Ｃ．マルトーサ（Ｃ．ｍａｌｔｏｓａ）、Ｃ．マリーナ（Ｃ．ｍａｒｉｎａ）、Ｃ．メンブラニファシエンス（Ｃ．ｍｅｍｂｒａｎｉｆａｃｉｅｎｓ）、Ｃ．ミレリ（Ｃ．ｍｉｌｌｅｒｉ）、Ｃ．モギイ（Ｃ．ｍｏｇｉｉ）、Ｃ．オレオフィラ（Ｃ．ｏｌｅｏｐｈｉｌａ）、Ｃ．オレゴネンシス（Ｃ．ｏｒｅｇｏｎｅｎｓｉｓ）、Ｃ．パラプシローシス（Ｃ．ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓ）、Ｃ．クエルシトルーサ（Ｃ．ｑｕｅｒｃｉｔｒｕｓａ）、Ｃ．ルゴサ（Ｃ．ｒｕｇｏｓａ）、Ｃ．サケ（Ｃ．ｓａｋｅ）、Ｃ．シャハテア（Ｃ．ｓｈｅｈａｔｅａ）、Ｃ．テムノキラエ（Ｃ．ｔｅｍｎｏｃｈｉｌａｅ）、Ｃ．テヌイス（Ｃ．ｔｅｎｕｉｓ）、Ｃ．テアエ（Ｃ．ｔｈｅａｅ）、Ｃ．トレランス（Ｃ．ｔｏｌｅｒａｎｓ）、Ｃ．トロピカリス（Ｃ．ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）、Ｃ．ツチヤエ（Ｃ．ｔｓｕｃｈｉｙａｅ）、Ｃ．シノラボランティウム（Ｃ．ｓｉｎｏｌａｂｏｒａｎｔｉｕｍ）、Ｃ．ソーヤ（Ｃ．ｓｏｊａｅ）、Ｃ．サブハシィ（Ｃ．ｓｕｂｈａｓｈｉｉ）、Ｃ．ビスワナチイ（Ｃ．ｖｉｓｗａｎａｔｈｉｉ）、Ｃ．ユティリス（Ｃ．ｕｔｉｌｉｓ）、Ｃ．ウバツベンシス（Ｃ．ｕｂａｔｕｂｅｎｓｉｓ）及びＣ．ゼンプリニナ（Ｃ．ｚｅｍｐｌｉｎｉｎａ）が挙げられる。ウスティラゴ属（Ｕｓｔｉｌａｇｏ）種の好適な例としては、Ｕ．アベナエ（Ｕ．ａｖｅｎａｅ）、Ｕ．エスクレンタ（Ｕ．ｅｓｃｕｌｅｎｔａ）、Ｕ．ホルデイ（Ｕ．ｈｏｒｄｅｉ）、Ｕ．マイジス（Ｕ．ｍａｙｄｉｓ）、Ｕ．ヌーダ（Ｕ．ｎｕｄａ）及びＵ．トリチシ（Ｕ．ｔｒｉｔｉｃｉ）が挙げられる。トルロプシス属（Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ）種の好適な例としては、Ｔ．ゲオチャレス（Ｔ．ｇｅｏｃｈａｒｅｓ）、Ｔ．アジマ（Ｔ．ａｚｙｍａ）、Ｔ．グラブラータ（Ｔ．ｇｌａｂｒａｔａ）及びＴ．カンジダ（Ｔ．ｃａｎｄｉｄａ）が挙げられる。チゴサッカロマイセス属（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）種の好適な例としては、Ｚ．バイリイ（Ｚ．ｂａｉｌｉｉ）、Ｚ．ビスポラス（Ｚ．ｂｉｓｐｏｒｕｓ）、Ｚ．シドリ（Ｚ．ｃｉｄｒｉ）、Ｚ．フェルメンタティ（Ｚ．ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉ）、Ｚ．フロレンティヌス（Ｚ．ｆｌｏｒｅｎｔｉｎｕｓ）、Ｚ．コンブチャエンシス（Ｚ．ｋｏｍｂｕｃｈａｅｎｓｉｓ）、Ｚ．レンツス（Ｚ．ｌｅｎｔｕｓ）、Ｚ．メリス（Ｚ．ｍｅｌｌｉｓ）、Ｚ．ミクロエリプソイデス（Ｚ．ｍｉｃｒｏｅｌｌｉｐｓｏｉｄｅｓ）、Ｚ．ムラキイ（Ｚ．ｍｒａｋｉｉ）、Ｚ．シュードロウキシイ（Ｚ．ｐｓｅｕｄｏｒｏｕｘｉｉ）、及びＺ．ロウキシィ（Ｚ．ｒｏｕｘｉｉ）が挙げられる。トリゴノプシス属（Ｔｒｉｇｏｎｏｐｓｉｓ）種の好適な例としては、Ｔ．バリアビリス（Ｔ．ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ）が挙げられる。クリプトコッカス属（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）種の好適な例としては、Ｃ．ローレンティ（Ｃ．ｌａｕｒｅｎｔｉｉ）、Ｃ．アルビダス（Ｃ．ａｌｂｉｄｕｓ）、Ｃ．ネオフォルマンス（Ｃ．ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ）、Ｃ．ガッティ（Ｃ．ｇａｔｔｉｉ）、Ｃ．ユニグトゥラツス（Ｃ．ｕｎｉｇｕｔｔｕｌａｔｕｓ）、Ｃ．アデリエンシス（Ｃ．ａｄｅｌｉｅｎｓｉｓ）、Ｃ．アエリウス（Ｃ．ａｅｒｉｕｓ）、Ｃ．アルビドシミリス（Ｃ．ａｌｂｉｄｏｓｉｍｉｌｉｓ）、Ｃ．アンタルクティカス（Ｃ．ａｎｔａｒｃｔｉｃｕｓ）、Ｃ．アクアティカス（Ｃ．ａｑｕａｔｉｃｕｓ）、Ｃ．アーテル（Ｃ．ａｔｅｒ）、Ｃ．ブータネンシス（Ｃ．ｂｈｕｔａｎｅｎｓｉｓ）、Ｃ．コンソルティオニス（Ｃ．ｃｏｎｓｏｒｔｉｏｎｉｓ）、Ｃ．カルバツス（Ｃ．ｃｕｒｖａｔｕｓ）、Ｃ．フェノリカス（Ｃ．ｐｈｅｎｏｌｉｃｕｓ）、Ｃ．スキンネリ（Ｃ．ｓｋｉｎｎｅｒｉ）、Ｃ．テレウス（Ｃ．ｔｅｒｒｅｕｓ）及びＣ．ビシュニアッシ（Ｃ．ｖｉｓｈｎｉａｃｃｉ）が挙げられる。ロドトルラ属（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）種の好適な例としては、Ｒ．アケニオルム（Ｒ．ａｃｈｅｎｉｏｒｕｍ）、Ｒ．トゥラ（Ｒ．ｔｕｌａ）、Ｒ．アクタ（Ｒ．ａｃｕｔａ）、Ｒ．アメリカーナ（Ｒ．ａｍｅｒｉｃａｎａ）、Ｒ．アラウカリアエ（Ｒ．ａｒａｕｃａｒｉａｅ）、Ｒ．アークティカ（Ｒ．ａｒｃｔｉｃａ）、Ｒ．アルメニアカ（Ｒ．ａｒｍｅｎｉａｃａ）、Ｒ．アウランティアカ（Ｒ．ａｕｒａｎｔｉａｃａ）、Ｒ．アウリクラリエ（Ｒ．ａｕｒｉｃｕｌａｒｉａｅ）、Ｒ．バカルム（Ｒ．ｂａｃａｒｕｍ）、Ｒ．ベンチカ（Ｒ．ｂｅｎｔｈｉｃａ）、Ｒ．ビオウルゲイ（Ｒ．ｂｉｏｕｒｇｅｉ）、Ｒ．ボゴリエンシス（Ｒ．ｂｏｇｏｒｉｅｎｓｉｓ）、Ｒ．ブロンキアリス（Ｒ．ｂｒｏｎｃｈｉａｌｉｓ）、Ｒ．ブフォニィ（Ｒ．ｂｕｆｆｏｎｉｉ）、Ｒ．カリプトゲナエ（Ｒ．ｃａｌｙｐｔｏｇｅｎａｅ）、Ｒ．チュングナメンシス（Ｒ．ｃｈｕｎｇｎａｍｅｎｓｉｓ）、Ｒ．クラディエンシス（Ｒ．ｃｌａｄｉｅｎｓｉｓ）、Ｒ．コラリナ（Ｒ．ｃｏｒａｌｌｉｎａ）、Ｒ．クレゾリカ（Ｒ．ｃｒｅｓｏｌｉｃａ）、Ｒ．クロセア（Ｒ．ｃｒｏｃｅａ）、Ｒ．シクロクラスティカ（Ｒ．ｃｙｃｌｏｃｌａｓｔｉｃａ）、Ｒ．ダイレネンシス（Ｒ．ｄａｉｒｅｎｅｎｓｉｓ）、Ｒ．ディフルエンス（Ｒ．ｄｉｆｆｌｕｅｎｓ）、Ｒ．エバーグラディエンシス（Ｒ．ｅｖｅｒｇｌａｄｉｅｎｓｉｓ）、Ｒ．フェルリカ（Ｒ．ｆｅｒｕｌｉｃａ）、Ｒ．フォリオルム（Ｒ．ｆｏｌｉｏｒｕｍ）、Ｒ．フラガリア（Ｒ．ｆｒａｇａｒｉａ）、Ｒ．フジサネンシス（Ｒ．ｆｕｊｉｓａｎｅｎｓｉｓ）、Ｒ．フトロネンシス（Ｒ．ｆｕｔｒｏｎｅｎｓｉｓ）、Ｒ．ゲラティノーサ（Ｒ．ｇｅｌａｔｉｎｏｓａ）、Ｒ．グラシアリス（Ｒ．ｇｌａｃｉａｌｉｓ）、Ｒ．グルティニス（Ｒ．ｇｌｕｔｉｎｉｓ）、Ｒ．グラシリス（Ｒ．ｇｒａｃｉｌｉｓ）、Ｒ．グラミニス（Ｒ．ｇｒａｍｉｎｉｓ）、Ｒ．グリンベルグシィ（Ｒ．ｇｒｉｎｂｅｒｇｓｉｉ）、Ｒ．ヒマライエンシス（Ｒ．ｈｉｍａｌａｙｅｎｓｉｓ）、Ｒ．ヒヌレア（Ｒ．ｈｉｎｎｕｌｅａ）、Ｒ．ヒストリティカ（Ｒ．ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃａ）、Ｒ．ヒロフィラ（Ｒ．ｈｙｌｏｐｈｉｌａ）、Ｒ．インカルナタ（
Ｒ．ｉｎｃａｒｎａｔａ）、Ｒ．インゲニオサ（Ｒ．ｉｎｇｅｎｉｏｓａ）、Ｒ．ジャバニカ（Ｒ．ｊａｖａｎｉｃａ）、Ｒ．コイシカウェンシス（Ｒ．ｋｏｉｓｈｉｋａｗｅｎｓｉｓ）、Ｒ．ラクトーサ（Ｒ．ｌａｃｔｏｓａ）、Ｒ．ラメリブラキエ（Ｒ．ｌａｍｅｌｌｉｂｒａｃｈｉａｅ）、Ｒ．ラリンギス（Ｒ．ｌａｒｙｎｇｉｓ）、Ｒ．リグノフィラ（Ｒ．ｌｉｇｎｏｐｈｉｌａ）、Ｒ．リニ（Ｒ．ｌｉｎｉ）、Ｒ．ロンギッシマ（Ｒ．ｌｏｎｇｉｓｓｉｍａ）、Ｒ．ルドウィギィ（Ｒ．ｌｕｄｗｉｇｉｉ）、Ｒ．リシノフィラ（Ｒ．ｌｙｓｉｎｏｐｈｉｌａ）、Ｒ．マリーナ（Ｒ．ｍａｒｉｎａ）、Ｒ．マルチニエ－フラガンティス（Ｒ．ｍａｒｔｙｎｉａｅ－ｆｒａｇａｎｔｉｓ）、Ｒ．マトリテンシス（Ｒ．ｍａｔｒｉｔｅｎｓｉｓ）、Ｒ．メリ（Ｒ．ｍｅｌｉ）、Ｒ．ミヌータ（Ｒ．ｍｉｎｕｔａ）、Ｒ．ムシラギノーサ（Ｒ．ｍｕｃｉｌａｇｉｎｏｓａ）、Ｒ．ニテンス（Ｒ．ｎｉｔｅｎｓ）、Ｒ．ノトファギ（Ｒ．ｎｏｔｈｏｆａｇｉ）、Ｒ．オリザエ（Ｒ．ｏｒｙｚａｅ）、Ｒ．パシフィカ（Ｒ．ｐａｃｉｆｉｃａ）、Ｒ．パリダ（Ｒ．ｐａｌｌｉｄａ）、Ｒ．ペネアウス（Ｒ．ｐｅｎｅａｕｓ）、Ｒ．フィリラ（Ｒ．ｐｈｉｌｙｌａ）、Ｒ．フィロプラナ（Ｒ．ｐｈｙｌｌｏｐｌａｎａ）、Ｒ．ピラティ（Ｒ．ｐｉｌａｔｉｉ）、Ｒ．ピリマナエ（Ｒ．ｐｉｌｉｍａｎａｅ）、Ｒ．ピニコラ（Ｒ．ｐｉｎｉｃｏｌａ）、Ｒ．ピリカータ（Ｒ．ｐｌｉｃａｔａ）、Ｒ．ポリモルファ（Ｒ．ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）、Ｒ．サイクロフェノリカ（Ｒ．ｐｓｙｃｈｒｏｐｈｅｎｏｌｉｃａ）、Ｒ．サイクロフィラ（Ｒ．ｐｓｙｃｈｒｏｐｈｉｌａ）、Ｒ．パストゥラ（Ｒ．ｐｕｓｔｕｌａ）、Ｒ．レティノフィラ（Ｒ．ｒｅｔｉｎｏｐｈｉｌａ）、Ｒ．ロザケア（Ｒ．ｒｏｓａｃｅａ）、Ｒ．ロスラータ（Ｒ．ｒｏｓｕｌａｔａ）、Ｒ．ルベファシエンス（Ｒ．ｒｕｂｅｆａｃｉｅｎｓ）、Ｒ．ルベラ（Ｒ．ｒｕｂｅｌｌａ）、Ｒ．ルベスセンス（Ｒ．ｒｕｂｅｓｃｅｎｓ）、Ｒ．ルブラ（Ｒ．ｒｕｂｒａ）、Ｒ．ルブロルゴサ（Ｒ．ｒｕｂｒｏｒｕｇｏｓａ）、Ｒ．ルフラ（Ｒ．ｒｕｆｕｌａ）、Ｒ．ルティラ（Ｒ．ｒｕｔｉｌａ）、Ｒ．サングイネア（Ｒ．ｓａｎｇｕｉｎｅａ）、Ｒ．サニエイ（Ｒ．ｓａｎｎｉｅｉ）、Ｒ．サルトリィ（Ｒ．ｓａｒｔｏｒｙｉ）、Ｒ．シルベストリス（Ｒ．ｓｉｌｖｅｓｔｒｉｓ）、Ｒ．シンプレックス（Ｒ．ｓｉｍｐｌｅｘ）、Ｒ．シネンシス（Ｒ．ｓｉｎｅｎｓｉｓ）、Ｒ．スルーフィアエ（Ｒ．ｓｌｏｏｆｆｉａｅ）、Ｒ．ソンクキィ（Ｒ．ｓｏｎｃｋｉｉ）、Ｒ．ストラミネア（Ｒ．ｓｔｒａｍｉｎｅａ）、Ｒ．スベリコラ（Ｒ．ｓｕｂｅｒｉｃｏｌａ）、Ｒ．スガニィ（Ｒ．ｓｕｇａｎｉｉ）、Ｒ．タイワネンシス（Ｒ．ｔａｉｗａｎｅｎｓｉｓ）、Ｒ．タイワニアナ（Ｒ．ｔａｉｗａｎｉａｎａ）、Ｒ．テルペノイダリス（Ｒ．ｔｅｒｐｅｎｏｉｄａｌｉｓ）、Ｒ．テッレア（Ｒ．ｔｅｒｒｅａ）、Ｒ．テキセンシス（Ｒ．ｔｅｘｅｎｓｉｓ）、Ｒ．トキョエンシス（Ｒ．ｔｏｋｙｏｅｎｓｉｓ）、Ｒ．ウルザマエ（Ｒ．ｕｌｚａｍａｅ）、Ｒ．バニリカ（Ｒ．ｖａｎｉｌｌｉｃａ）、Ｒ．ブイレミニィ（Ｒ．ｖｕｉｌｌｅｍｉｎｉｉ）、Ｒ．ヤロウィ（Ｒ．ｙａｒｒｏｗｉｉ）、Ｒ．ユナネンシス（Ｒ．ｙｕｎｎａｎｅｎｓｉｓ）及びＲ．ゾルティ（Ｒ．ｚｓｏｌｔｉｉ）が挙げられる。ファフィア属（Ｐｈａｆｆｉａ）種の好適な例としては、Ｐ．ロドジマ（Ｐ．ｒｈｏｄｏｚｙｍａ）が挙げられる。スポロボロマイセス属（Ｓｐｏｒｏｂｏｌｏｍｙｃｅｓ）種の好適な例としては、Ｓ．アルボルベスセンス（Ｓ．ａｌｂｏｒｕｂｅｓｃｅｎｓ）、Ｓ．バナエンシス（Ｓ．ｂａｎｎａｅｎｓｉｓ）、Ｓ．ベイジンゲンシス（Ｓ．ｂｅｉｊｉｎｇｅｎｓｉｓ）、Ｓ．ビスコフィエ（Ｓ．ｂｉｓｃｈｏｆｉａｅ）、Ｓ．クラバツス（Ｓ．ｃｌａｖａｔｕｓ）、Ｓ．コプロスマエ（Ｓ．ｃｏｐｒｏｓｍａｅ）、Ｓ．コプロスミコーラ（Ｓ．ｃｏｐｒｏｓｍｉｃｏｌａ）、Ｓ．コラリヌス（Ｓ．ｃｏｒａｌｌｉｎｕｓ）、Ｓ．ディメナエ（Ｓ．ｄｉｍｍｅｎａｅ）、Ｓ．ドラコフィリィ（Ｓ．ｄｒａｃｏｐｈｙｌｌｉ）、Ｓ．エロンガツス（Ｓ．ｅｌｏｎｇａｔｕｓ）、Ｓ．グラシリス（Ｓ．ｇｒａｃｉｌｉｓ）、Ｓ．イノシトフィルス（Ｓ．ｉｎｏｓｉｔｏｐｈｉｌｕｓ）、Ｓ．ジョンソニィ（Ｓ．ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ）、Ｓ．コアラエ（Ｓ．ｋｏａｌａｅ）、Ｓ．マグニスポラス（Ｓ．ｍａｇｎｉｓｐｏｒｕｓ）、Ｓ．ノボゼアランディカス（Ｓ．ｎｏｖｏｚｅａｌａｎｄｉｃｕｓ）、Ｓ．オドラス（Ｓ．ｏｄｏｒｕｓ）、Ｓ．パタゴニカス（Ｓ．ｐａｔａｇｏｎｉｃｕｓ）、Ｓ．プロダクツス（Ｓ．ｐｒｏｄｕｃｔｕｓ）、Ｓ．ロセウス（Ｓ．ｒｏｓｅｕｓ）、Ｓ．サシコーラ（Ｓ．ｓａｓｉｃｏｌａ）、Ｓ．シバタヌス（Ｓ．ｓｈｉｂａｔａｎｕｓ）、Ｓ．シンギュラリス（Ｓ．ｓｉｎｇｕｌａｒｉｓ）、Ｓ．スブルンネウス（Ｓ．ｓｕｂｂｒｕｎｎｅｕｓ）、Ｓ．シンメトリカス（Ｓ．ｓｙｍｍｅｔｒｉｃｕｓ）、Ｓ．シジギィ（Ｓ．ｓｙｚｙｇｉｉ）、Ｓ．タウポエンシス（Ｓ．ｔａｕｐｏｅｎｓｉｓ）、Ｓ．ツガエ（Ｓ．ｔｓｕｇａｅ）、Ｓ．キサンツス（Ｓ．ｘａｎｔｈｕｓ）、及びＳ．ユナネンシス（Ｓ．ｙｕｎｎａｎｅｎｓｉｓ）が挙げられる。パチソレン属（Ｐａｃｈｙｓｏｌｅｎ）種の好適な例としては、Ｐ．タノフィルス（Ｐ．ｔａｎｎｏｐｈｉｌｕｓ）が挙げられる。
本明細書で使用される場合、用語「糸状菌細胞」は、ユウミコチニア（Ｅｕｍｙｃｏｔｉｎａ）亜門の全ての糸状形態を含む。糸状菌属の好適な細胞として、アクレモニウム属（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、アウレオバシジウム属（Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ）、ビィエルカンデラ属（Ｂｊｅｒｋａｎｄｅｒａ）、ケリポリオプシシ属（Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ）、クリソポリウム属（Ｃｈｒｙｓｏｐｏｒｉｕｍ）、コプリヌス属（Ｃｏｐｒｉｎｕｓ）、コリオルス属（Ｃｏｒｉｏｌｕｓ）、コリナスクス属（Ｃｏｒｙｎａｓｃｕｓ）、カエルトミウム属（Ｃｈａｅｒｔｏｍｉｕｍ）、クリプトコックス属（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、フィロバシジウム属（Ｆｉｌｏｂａｓｉｄｉｕｍ）、フザリウム属（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）、ギベレラ属（Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ）、フミコラ属（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）、マグナポルテ属（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ）、ムコール属（Ｍｕｃｏｒ）、ミケリオフトラ属（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ）、ムコール属（Ｍｕｃｏｒ）、ネオカリマスティックス属（Ｎｅｏｃａｌｌｉｍａｓｔｉｘ）、ネイロスポラ属（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）、パエキロミケス属（Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ）、ペニシリウム属（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）、ファネロカエテ属（Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ）、フレビア属（Ｐｈｌｅｂｉａ）、ピロミセス属（Ｐｉｒｏｍｙｃｅｓ）、プレウロツス属（Ｐｌｅｕｒｏｔｕｓ）、スキタルジウム属（Ｓｃｙｔａｌｄｉｕｍ）、スキゾフィルム属（Ｓｃｈｉｚｏｐｈｙｌｌｕｍ）、スポロトリクム属（Ｓｐｏｒｏｔｒｉｃｈｕｍ）、タラロミケス属（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ）、テルモアスクス属（Ｔｈｅｒｍｏａｓｃｕｓ）、チエラビア属（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ）、トリポクラジウム属（Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ）、トラメテス属（Ｔｒａｍｅｔｅｓ）及びトリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）の細胞が挙げられるが、これらに限定されない。
糸状菌種の適切な細胞として、アスペルギルス・アワモリ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ａｗａｍｏｒｉ）、アスペルギルス・フミガーツス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）、アスペルギルス・フォエティダス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｏｅｔｉｄｕｓ）、アスペルギルス・ジャポニクス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｊａｐｏｎｉｃｕｓ）、アスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ）、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）、クリソスポリウム・ルクノウェンス（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ ｌｕｃｋｎｏｗｅｎｓｅ）、フザリウム・バクトリジオイデス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｂａｃｔｒｉｄｉｏｉｄｅｓ）、フザリウム・セレアリス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｃｅｒｅａｌｉｓ）、フザリウム・クロークウェレンス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｃｒｏｏｋｗｅｌｌｅｎｓｅ）、フザリウム・クルモルム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｃｕｌｍｏｒｕｍ）、フザリウム・グラミネアルム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍ）、フザリウム・グラミナム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｇｒａｍｉｎｕｍ）、フザリウム・ヘテロスポルム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｈｅｔｅｒｏｓｐｏｒｕｍ）、フザリウム・ネグンジ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｎｅｇｕｎｄｉ）、フザリウム・オキシスポルム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）、フザリウム・レチキュラツム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｒｅｔｉｃｕｌａｔｕｍ）、フザリウム・ロゼウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｒｏｓｅｕｍ）、フザリウム・サムブシヌム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓａｍｂｕｃｉｎｕｍ）、フザリウム・サルコクロウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓａｒｃｏｃｈｒｏｕｍ）、フザリウム・スポロトリキオイデス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｐｏｒｏｔｒｉｃｈｉｏｉｄｅｓ）、フザリウム・スルフレウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｕｌｐｈｕｒｅｕｍ）、フザリウム・トルロスム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｔｏｒｕｌｏｓｕｍ）、フザリウム・トリコテシオイデス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｔｒｉｃｈｏｔｈｅｃｉｏｉｄｅｓ）、フザリウム・ベネナツム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｖｅｎｅｎａｔｕｍ）、ブエルカンデラ・アデュスタ（Ｂｊｅｒｋａｎｄｅｒａ ａｄｕｓｔａ）、セリポリオプシス・アネイリナ（Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ ａｎｅｉｒｉｎａ）、セリポリオプシス・アネイリナ（Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ ａｎｅｉｒｉｎａ）、セリポリオプシス・カレギエア（Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ ｃａｒｅｇｉｅａ）、セリポリオプシス・ギルベスセンス（Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ ｇｉｌｖｅｓｃｅｎｓ）、セリポリオプシス・パノシンタ（Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ ｐａｎｎｏｃｉｎｔａ）、セリポリオプシス・リブロサ（Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ ｒｉｖｕｌｏｓａ）、セリポリオプシス・スブルファ（Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ ｓｕｂｒｕｆａ）、セリポリオプシス・スブベルミスポラ（Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ ｓｕｂｖｅｒｍｉｓｐｏｒａ）、コプリヌス・キネレウス（Ｃｏｐｒｉｎｕｓ ｃｉｎｅｒｅｕｓ）、コリオルス・ヒルスツス（Ｃｏｒｉｏｌｕｓ ｈｉｒｓｕｔｕｓ）、フミコラ・インソレンス（Ｈｕｍｉｃｏｌａ ｉｎｓｏｌｅｎｓ）、フミコラ・ラヌギノサ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ ｌａｎｕｇｉｎｏｓａ）、ムコール・ミエヘイ（Ｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉ）、ミセリオフトーラ・サーモフィラ（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）、ネウロスポラ・クラッサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ）、ネウロスポラ・インテルメディア（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ）、ペニシリウム・プルプロゲヌム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｐｕｒｐｕｒｏｇｅｎｕｍ）、ペニシリウム・カネセンス（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃａｎｅｓｃｅｎｓ）、ペニシリウム・ソリツム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｓｏｌｉｔｕｍ）、ペニシリウム・フニクロスム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｆｕｎｉｃｕｌｏｓｕｍ）、ファネロカエテ・クリソスポリウム（Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ）、フレビア・ラジアーテ（Ｐｈｌｅｂｉａ ｒａｄｉａｔｅ）、プレウロツス・エリンギイ（Ｐｌｅｕｒｏｔｕｓ ｅｒｙｎｇｉｉ）、タラロマイセス・フラブス（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ ｆｌａｖｕｓ）、チエラビア・テレストリス（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ ｔｅｒｒｅｓｔｒｉｓ）、トラメテス・ビロサ（Ｔｒａｍｅｔｅｓ ｖｉｌｌｏｓａ）、トラメテス・ベルシコロル（Ｔｒａｍｅｔｅｓ ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒ）、トリコデルマ・ハルジアヌム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｈａｒｚｉａｎｕｍ）、トリコデルマ・コニンギイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｋｏｎｉｎｇｉｉ）、トリコデルマ・ロンギブラキアツム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｌｏｎｇｉｂｒａｃｈｉａｔｕｍ）、トリコデルマ・レーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）及びトリコデルマ・ビリデ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｖｉｒｉｄｅ）の細胞が挙げられるが、これらに限定されない。
特定の実施形態では、微生物宿主細胞は、細菌細胞、例えば、バチルス・アルカロフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｌｋａｌｏｐｈｉｌｕｓ）、バチルス・アミロリケファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、バチルス・ブレビス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ）、バチルス・サークランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）、バチルス・コアグランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏａｇｕｌａｎｓ）、バチルス・ラウツス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌａｕｔｕｓ）、バチルス・レンツス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｅｎｔｕｓ）、バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、バチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）、バチルス・ステアロサーモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、バチルス・サブティルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）若しくはバチルス・チューリンギエンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）、又はストレプトマイセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、例えば、ストレプトマイセス・リビダンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｌｉｖｉｄａｎｓ）若しくはストレプトマイセス・ムリヌス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｍｕｒｉｎｕｓ）、又はグラム陰性細菌、例えば、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）若しくはシュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）種である。
上記種について、本開示及び資源種は、このような生命体の完全及び不完全状態の両方、並びに種名が知られているか否かにかかわらず、これらの他の分類学上等価物、例えば、アナモルフを包含するであろうことは理解される。当業者は、このような資源種の適切な等価物の同一性を容易に認識するであろう。
上記種の株は、多くの菌株保存機関、例えば、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）、Ｄｅｕｔｓｃｈｅ Ｓａｍｍｌｕｎｇ ｖｏｎ Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ ｕｎｄ Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ ＧｍｂＨ（ＤＳＭ）、Ｃｅｎｔｒａａｌｂｕｒｅａｕ Ｖｏｏｒ Ｓｃｈｉｍｍｅｌｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＣＢＳ）、及びＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ Ｐａｔｅｎｔ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、Ｎｏｒｔｈｅｒｎ Ｒｅｇｉｏｎａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ（ＮＲＲＬ）で容易に入手可能である。
本明細書に記載のＣａｓ９エンドヌクレアーゼ変異体は、微生物細胞における相同組み換えのための方法において、及び／又は微生物細胞におけるゲノム編集のための方法において使用され得る。微生物細胞（例えば、糸状菌細胞）のゲノム中の標的部位に１つ以上の短い相同アームを有するドナーＤＮＡを挿入するためのガイドＲＮＡ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼシステムを使用する方法が開示されている（国際公開第２０１７／０１９８６７号パンフレット（２０１７年２月２日公開））。微生物細胞のゲノムの改変により表現型効果が生じる場合、表現型マーカーである（又は表現型マーカーをコードする）目的ポリヌクレオチドを含むドナーＤＮＡを用いることが多い。あらゆる好都合な表現型マーカーを使用することができ、この表現型マーカーとして、多くの場合は特定の培養条件下で、任意の選択可能な又はスクリーニング可能なマーカーが挙げられ、このマーカーは、これを含む真菌細胞を同定する、又はこの真菌細胞を有利に若しくは不利に選択することを可能にする。したがって、本発明のいくつかの態様では、所望のゲノム改変を有する微生物細胞の同定は、標的部位で改変を有する細胞を選択するための条件下で、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼ変異体及びガイドポリヌクレオチド（及び、任意選択でドナーＤＮＡ）が与えられている微生物細胞集団を培養することを含む。真菌細胞中の酵素活性（選択マーカーとも呼ばれる）の獲得又は喪失（例えば、抗生物質耐性の取得、又は栄養要求性マーカーの獲得／喪失）に関して評価することを含む、任意のタイプの選択システムを用いることができる。
本明細書で使用される場合、植物という用語には、植物細胞、植物プロトプラスト、植物を再生できる植物細胞組織培養物、植物カルス、植物塊、及び植物又は植物部分の中で損傷を受けていない、胚、花粉、胚珠、種子、葉、花、枝、果実、仁、穂、穂軸、さや、柄、根、根端、葯、穀粒などの植物細胞が含まれる。本明細書で使用される場合、「穀粒」は、種を成長又は繁殖させること以外の目的で栽培業者が生産する成熟種子を意味する。再生された植物の子孫、変異体、及び変異体もまた、これらの部分が形質転換又はゲノム編集により生じたものなどの再生植物のゲノム改変を含む限り、本開示の範囲に含まれる。
単子葉植物及び双子葉植物、又は植物部分など、任意の植物又は植物部分を使用することができる。
使用可能な単子葉植物の例としては、限定はされないがトウモロコシ（ゼア・マイス（Ｚｅａ ｍａｙｓ））、イネ（オリザ・サティバ（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ））、ライムギ（セカレ・セレアレ（Ｓｅｃａｌｅ ｃｅｒｅａｌｅ））、ソルガム（ソルガム・ビカラー（Ｓｏｒｇｈｕｍ ｂｉｃｏｌｏｒ）、ソルガム・ブルガレ（Ｓｏｒｇｈｕｍ ｖｕｌｇａｒｅ））、キビ（例えば、トウジンビエ（ペニセツム・グラウクム（Ｐｅｎｎｉｓｅｔｕｍ ｇｌａｕｃｕｍ））、キビ（パニカム・ミリアセウム（Ｐａｎｉｃｕｍ ｍｉｌｉａｃｅｕｍ））、アワ（セタリア・イタリカ（Ｓｅｔａｒｉａ ｉｔａｌｉｃａ））、シコクビエ（エレウシネ・コラカナ（Ｅｌｅｕｓｉｎｅ ｃｏｒａｃａｎａ））、コムギ（トリティクム属（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ）の種、トリティクム・アエスティバム（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ａｅｓｔｉｖｕｍ）、トリティクム・モノコクム（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ｍｏｎｏｃｏｃｃｕｍ））、サトウキビ（サッカルム属（Ｓａｃｃｈａｒｕｍ）の種）、カラスムギ（アヴィーナ属（Ａｖｅｎａ））、オオムギ（ホルデウム属（Ｈｏｒｄｅｕｍ））、スイッチグラス（パニカム・ヴィルガツム（Ｐａｎｉｃｕｍ ｖｉｒｇａｔｕｍ））、パイナップル（アナナス・コモスス（Ａｎａｎａｓ ｃｏｍｏｓｕｓ））、バナナ（ムサ属（Ｍｕｓａ）の種）、ヤシ、観賞植物、芝草、及びその他の草類が挙げられる。
用語「双子葉植物の」又は「双子葉植物」は、「双子葉植物網（ｄｉｃｏｔｙｌｅｄｏｎｅａｅ）」としても知られる被子植物の亜綱を指し、植物全体、植物器官（例えば、葉、幹、根など）、種子、植物細胞、及びそれらの子孫に対する言及が含まれる。使用することができる双子葉植物の例としては、限定はされないが、大豆（グリシン マックス（Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ））、アブラナ属（Ｂｒａｓｓｉｃａ）の種（キャノーラ）（ブラシカ・ナプス（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ）、Ｂ．カムペストリス（Ｂ．ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ）、ブラシカ・ラパ（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｒａｐａ）、ブラシカ・ジュンケア（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｊｕｎｃｅａ）、アルファルファ（メディカゴ・サティバ（Ｍｅｄｉｃａｇｏ ｓａｔｉｖａ））、アルファルファ（メディカゴ・サティバ（Ｍｅｄｉｃａｇｏ ｓａｔｉｖａ））、タバコ（ニコチアナ・タバカム（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ））、シロイヌナズナ属（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）（アラビドプシス・タリアナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ））、ヒマワリ（ヘリアンサス・アヌス（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ ａｎｎｕｕｓ））、ワタ（ゴシピウム・アルボレウム（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ ａｒｂｏｒｅｕｍ）、ゴシピウム・バルバデンセ（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ ｂａｒｂａｄｅｎｓｅ））、及び落花生（アラキス・ヒポゲア（Ａｒａｃｈｉｓ ｈｙｐｏｇａｅａ））、トマト（ソラヌム・リコペルシカム（Ｓｏｌａｎｕｍ ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ））、ジャガイモ（ソラヌム・ツベロスム（Ｓｏｌａｎｕｍ ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ））が挙げられる。
使用することができる植物としては、ベニバナ（カルタムス・ティンクトリウス（Ｃａｒｔｈａｍｕｓ ｔｉｎｃｔｏｒｉｕｓ））、サツマイモ（イポモエアバタタス（Ｉｐｏｍｏｅａ ｂａｔａｔｕｓ））、キャッサバ（マニホット・エスクレンタ（Ｍａｎｉｈｏｔ ｅｓｃｕｌｅｎｔａ））、コーヒー（コーヒーノキ属（Ｃｏｆｆｅａ）の種）、ココナッツ（ココス・ヌシフェラ（Ｃｏｃｏｓ ｎｕｃｉｆｅｒａ））、カンキツ樹（ミカン属（Ｃｉｔｒｕｓ）の種）、ココア（テオブロマ・カカオ（Ｔｈｅｏｂｒｏｍａ ｃａｃａｏ））、茶（カメリア・シネンシス（Ｃａｍｅｌｌｉａ ｓｉｎｅｎｓｉｓ））、バナナ（ムサ属（Ｍｕｓａ）の種）、アボカド（ペルセア・アメリカナ（Ｐｅｒｓｅａ ａｍｅｒｉｃａｎａ））、イチジク（フィクスカシカ（Ｆｉｃｕｓ ｃａｓｉｃａ））、グァバ（プシディウム・グアジャバ（Ｐｓｉｄｉｕｍ ｇｕａｊａｖａ））、マンゴー（マンギフェラ・インディカ（Ｍａｎｇｉｆｅｒａ ｉｎｄｉｃａ））、オリーブ（オレア・ユーロパエア（Ｏｌｅａ ｅｕｒｏｐａｅａ））、パパイヤ（カリカ・パパヤ（Ｃａｒｉｃａ ｐａｐａｙａ））、カシュー（アナカルデイウム・オクシデンタレ（Ａｎａｃａｒｄｉｕｍ ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｅ））、マカダミア（マカダミア・インテルグリフォリア（Ｍａｃａｄａｍｉａ ｉｎｔｅｇｒｉｆｏｌｉａ））、アーモンド（プルヌス・アミグダルス（Ｐｒｕｎｕｓ ａｍｙｇｄａｌｕｓ））、テンサイ（ベータ・ブルガリス（Ｂｅｔａ ｖｕｌｇａｒｉｓ））、野菜類、観賞植物及び球果植物が挙げられる。
野菜類としては、トマト（リコペルシコン・エスキュレントゥム（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ））、レタス（例えば、ラクツカ・サティバ（Ｌａｃｔｕｃａ ｓａｔｉｖａ））、サヤマメ（ファセオルス・ブルガリス（Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ ｖｕｌｇａｒｉｓ））、ライマメ（ファセオルス・リメンシス（Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ ｌｉｍｅｎｓｉｓ））、エンドウマメ（レンリソウ属（Ｌａｔｈｙｒｕｓ）の種）、並びに、キュウリ（Ｃ．サティバス（Ｃ．ｓａｔｉｖｕｓ））、カンタロープ（Ｃ．カンタルペンシス（Ｃ．ｃａｎｔａｌｕｐｅｎｓｉｓ））、及びマスクメロン（Ｃ．メロ（Ｃ．ｍｅｌｏ））などのキュウリ属（Ｃｕｃｕｍｉｓ）に属するものが挙げられる。観賞植物としては、アザレア（ロードデンドロン属（Ｒｈｏｄｏｄｅｎｄｒｏｎ）種）、アジサイ（マクロフィラ・ハイドランジア（Ｍａｃｒｏｐｈｙｌｌａ ｈｙｄｒａｎｇｅａ））、ハイビスカス（ハイビスカス・ローザシネンシス（Ｈｉｂｉｓｃｕｓ ｒｏｓａｓａｎｅｎｓｉｓ））、バラ（ロサ（Ｒｏｓａ）種）、チューリップ（チューリパ（Ｔｕｌｉｐａ）種）、ラッパズイセン（ナルキスス（Ｎａｒｃｉｓｓｕｓ）種）、ペチュニア（ペチュニア・ハイブリダ（Ｐｅｔｕｎｉａ ｈｙｂｒｉｄａ））、カーネーション（ジアンサス・カリオフィルス（Ｄｉａｎｔｈｕｓ ｃａｒｙｏｐｈｙｌｌｕｓ））、ポインセチア（ユーフォルビア・プルケリマ（Ｅｕｐｈｏｒｂｉａ ｐｕｌｃｈｅｒｒｉｍａ））及びキクが挙げられる。
本開示を実施するにあたり使用可能な球果植物としては、例えば、テーダマツ（ピヌス・タエダ（Ｐｉｎｕｓ ｔａｅｄａ））、スラッシュパイン（ピヌス・エリオッティ（Ｐｉｎｕｓ ｅｌｌｉｏｔｉｉ））、ポンデローサマツ（ピヌス・ポンデローサ（Ｐｉｎｕｓ ｐｏｎｄｅｒｏｓａ））、ロッジポールパイン（ピヌス・コントルタ（Ｐｉｎｕｓ ｃｏｎｔｏｒｔａ））、及びモントレーパイン（ピヌス・ラジアータ（Ｐｉｎｕｓ ｒａｄｉａｔａ））などのマツ類、ダクラスファー（シュードツガ メンジエシイ（Ｐｓｅｕｄｏｔｓｕｇａ ｍｅｎｚｉｅｓｉｉ））、アメリカツガ（ツガ カナデンシス（Ｔｓｕｇａ ｃａｎａｄｅｎｓｉｓ））、ベイトウヒ（ピセア・グラウカ（Ｐｉｃｅａ ｇｌａｕｃａ））、セコイア（セコイア・センペルビレンス（Ｓｅｑｕｏｉａ ｓｅｍｐｅｒｖｉｒｅｎｓ））、ヨーロッパモミ（アビエス・アマビリス（Ａｂｉｅｓ ａｍａｂｉｌｉｓ））及びバルサムモミ（アビエス・バルサメア（Ａｂｉｅｓ ｂａｌｓａｍｅａ））などのトゥルーモミ類、並びにベイスギ（スージャ・プリカタ（Ｔｈｕｊａ ｐｌｉｃａｔａ））及びイエローシーダー（カマエシパリス・ヌートカテンシス（Ｃｈａｍａｅｃｙｐａｒｉｓ ｎｏｏｔｋａｔｅｎｓｉｓ））などのシーダー類が挙げられる。
用語「植物」には、植物全体、植物器官、植物組織、種子、植物細胞、種子、及びそれらの子孫が含まれる。植物細胞としては、限定はされないが、種子、懸濁培養物、胚、分裂組織領域、カルス組織、葉、根、シュート、配偶体、胞子体、花粉及び小胞子由来の細胞が挙げられる。植物体の部分には、分化組織及び未分化組織が含まれ、それらの組織としては、限定はされないが、根、茎、シュート、葉、花粉、種子、腫瘍組織、及び様々な形態の細胞及び培養物（例えば、単細胞、プロトプラスト、胚及びカルス組織）が挙げられる。植物組織は、植物体中に、又は植物の器官、組織、若しくは細胞培養物中に存在し得る。用語「植物器官」は、形態的にも機能的にも区別された植物体の部分を構成する、植物組織又は組織群を指す。用語「ゲノム」は、生命体の各細胞、又はウイルス若しくは細胞小器官に存在する遺伝物質（遺伝子及び非コード配列）の相補体の全体；並びに／或いは１つの親から１つの（ハプロイド）単位として受け継いだ一式の染色体を指す。「子孫」は、植物体のその後の世代を含む。
本明細書で使用される場合、用語「植物部分」は、植物細胞、植物プロトプラスト、植物を再生できる植物細胞組織培養物、植物カルス、植物塊、及び植物又は植物部分の中で損傷を受けていない、胚、花粉、胚珠、種子、葉、花、枝、果実、仁、穂、穂軸、さや、柄、根、根端、葯、穀粒などの植物細胞、並びに部分自体を指す。穀粒は、それらの種を成長又は繁殖させること以外の目的で栽培業者が生産する成熟種子を意味するものとする。再生植物の子孫、変異体、及び変異体もまた、これらの部分が導入ポリヌクレオチドを含むなら、本開示の範囲に含まれる
トランスジェニック植物には、例えば、形質転換工程によって導入された異種ポリヌクレオチドをゲノム内に含む植物が含まれる。異種ポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドが後に続く世代に受け継がれるように、ゲノム内に安定に組み込むことができる。異種ポリヌクレオチドは、ゲノム内に単独で、又は組み換えＤＮＡコンストラクトの一部として組み込むことができる。トランスジェニック植物はまた、そのゲノム内に２つ以上の異種ポリヌクレオチドを含むことができる。各異種ポリヌクレオチドは、トランスジェニック植物に異なる形質を付与することができる。異種ポリヌクレオチドとしては、例えば、外来種を起源とする配列を含むことができ、又は異種ポリヌクレオチドが同種由来である場合は、その天然形態から実質的に改変される可能性がある。トランスジェニック体としては、その遺伝子型を異種核酸を存在させることによって変化させたあらゆる細胞、細胞株、カルス、組織、植物部又は植物体（初期にそのように改変されたトランスジェニック体、及び初期のトランスジェニック体から有性交配又は無性増殖によって作られたものを含む）を挙げることができる。従来の植物育種方法、外来ポリヌクレオチドが挿入されない本明細書に記載のゲノム編集手順、又はランダム交配、非組み換えウイルス感染、非組み換え細菌形質転換、非組み換え置換若しくは自然突然変異などの自然に発生する事象による植物ゲノム（染色体又は染色体外の）の変化は、トランスジェニックと見なさないものとする。
稔性植物は、生存可能な雄性配偶子及び雌性配偶子を生成する植物であり、自家稔性である。このような自家稔性植物は、任意の他の植物からの寄与を伴わずに配偶子及びその中に含有される遺伝物質の子孫植物を生成することができる。
定義
「対立遺伝子」又は「対立遺伝子変異体」は、染色体上の所与の遺伝子座を占有する遺伝子の数種の代替形の１つである。染色体上の所予の遺伝子座に存在する対立遺伝子全部が同一である場合は、その生命体はその遺伝子座ではホモ接合性である。染色体上の所定の遺伝子座に存在する対立遺伝子が異なる場合は、その生命体はその遺伝子座ではヘテロ接合性である。ポリペプチドの対立遺伝子変異体は、遺伝子の対立遺伝子変異体によってコードされるポリペプチドである。
「コード配列」は、特定のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列を指す。コード配列の境界は一般に、開始コドン（例えば、ＡＴＧ、ＧＴＧ、又はＴＴＧ）で始まり、終止コドン（例えば、ＴＡＡ、ＴＡＧ、又はＴＧＡ）で終わるオープンリーディングフレームによって決定される。コード配列は、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成ＤＮＡ、又はそれらの組み合わせであり得る。
「調節配列」は、コード配列の上流（５’－非コード配列）、コード配列内、又はコード配列の下流（３’－非コード配列）に位置するヌクレオチド配列を指し、それは関連するコード配列の転写、ＲＮＡプロセシング若しくは安定性、又は翻訳に影響を及ぼす。調節配列としては、限定はされないが、プロモーター、翻訳リーダー配列、５’非翻訳配列、３’非翻訳配列、イントロン、ポリアデニル化標的配列、ＲＮＡプロセシング部位、エフェクター結合部位及びステムループ構造が挙げられる。
「コドン改変遺伝子」又は「コドン優先遺伝子」又は「コドン最適化遺伝子」は、宿主細胞の好ましいコドン使用頻度を模倣するように設計されているコドン使用頻度を有する遺伝子である。遺伝子をコドン最適化するために行われる核酸変更は、親遺伝子のコードされるポリペプチドのアミノ酸配列を変更しないことを意味する「同義」である。しかしながら、天然遺伝子及び変異遺伝子の両方を特定の宿主細胞用にコドン最適化することができ、したがって、これに関して制限は意図されていない。コドン優先遺伝子を合成する方法は、当該技術分野で利用可能である。例えば、米国特許第５，３８０，８３１号明細書及び同第５，４３６，３９１号明細書、並びにＭｕｒｒａｙ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１７：４７７－４９８を参照されたい。これらの文献は参照により本明細書に組み込まれる。
宿主生命体中での遺伝子発現を増大させるためのさらなる配列の改変が知られている。このような改変としては、例えば、疑似のポリアデ二ル化シグナルをコードする１つ以上の配列、１つ以上のエクソン－イントロンスプライス部位シグナル、１つ以上のトランスポゾン様反復配列、及び遺伝子発現に有害なおそれがあるまでに十分に特徴付けられた他の配列の除去が挙げられる。配列のＧ－Ｃ含有量は、宿主細胞中で発現する既知の遺伝子を参照することによって算出される、所与の宿主生命体（例えば、植物）の平均的なレベルに調節することができる。可能であれば、１つ以上のｍＲＮＡの予測されるヘアピン二次構造を避けるために配列を改変する。
用語「保存ドメイン」又は「モチーフ」は、進化的に関連するタンパク質のアラインされた配列に沿って特定位置で保存された一連のアミノ酸を意味する。他の位置でのアミノ酸が相同タンパク質間で変動する可能性があるが、特定位置で高度に保存されているアミノ酸は、タンパク質の構造、安定性又は活性にとって必須であるアミノ酸であることを示す。それらは１ファミリーのタンパク質ホモログのアラインされた配列内のそれらの高い保存度によって同定されるため、新しく決定された配列を有するタンパク質が以前に同定されたタンパク質ファミリーに属するかどうかを決定する識別子又は「シグネチャー」として使用することができる。
本明細書で使用される場合、「核酸」は、ポリヌクレオチドを意味しており、デオキシリボヌクレオチド塩基又はリボヌクレオチド塩基の一本鎖又は二本鎖のポリマーを含む。核酸はまた、断片及び修飾ヌクレオチドを含み得る。そのため、用語「ポリヌクレオチド」、「核酸配列」、「ヌクレオチド配列」及び「核酸断片」は互換的に使用され、一本鎖又は二本鎖であり、場合により、合成ヌクレオチド塩基、非天然ヌクレオチド塩基又は改変ヌクレオチド塩基を含む、ＲＮＡ及び／又はＤＮＡ及び／又はＲＮＡ－ＤＮＡのポリマーを示す。ヌクレオチド（通常、５’－一リン酸塩形で見出される）は、単一文字表示により、以下のように称される：（それぞれＲＮＡ又はＤＮＡの）アデノシン又はデオキシアデノシンに対して「Ａ」、シトシン又はデオキシシトシンに対して「Ｃ」、グアノシン又はデオキシグアノシンに対して「Ｇ」、ウリジンに対しては「Ｕ」、デオキシチミジンに対して「Ｔ」、プリン（Ａ又はＧ）に対して「Ｒ」、ピリミジン（Ｃ又はＴ）に対して「Ｙ」、Ｇ又はＴに対して「Ｋ」、Ａ又はＣ又はＴに対して「Ｈ」、イノシンに対して「Ｉ」、及び任意のヌクレオチドに対して「Ｎ」（ヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ配列について言及する場合、Ｎは、Ａ、Ｃ、Ｔ又はＧであり得、ＲＮＡ配列について言及する場合、Ｎは、Ａ、Ｃ、Ｕ又はＧであり得る）。
本明細書で使用される「増加した」という用語は、増加した量又は活性を比較する対象の量又は活性より、少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、１００％、又は少なくとも約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３１０、３２０、３３０、３４０、３５０、３６０、３７０、３８０、３９０、４００、４１０、４２０、４３０、４４０、４４０、４５０、４６０、４７０、４８０、４９０、若しくは５００倍多い量又は活性を指し得る。用語「増加した」、「～より多い」及び「改善された」は、本明細書では互換的に使用される。用語「増加した」は、本明細書に記載のＣａｓ９エンドヌクレアーゼ変異体などのタンパク質の形質転換効率又は遺伝子編集効率を特徴付けるために使用され得る。
一態様では、増加は、本明細書に記載のＣａｓ９変異体（限定されないが、Ｃａｓ９ Ｙ１５５変異体又はＣａｓ９ Ｆ８６Ａ＋Ｆ９８Ａ変異体など）をＰＧＥＮの一部として使用した場合の、親（野生型）Ｃａｓ９を代わりに含む以外は同じＰＧＥＮと比較した、原核細胞又は真核細胞の形質転換効率の増加であり、形質転換効率の増加は、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３１０、３２０、３３０、３４０、３５０、３６０、３７０、３８０、３９０、４００、４１０、４２０、４３０、４４０、４４０、４５０、４６０、４７０、４８０、４９０、又は５００倍である。
一態様では、増加は、本明細書に記載のＣａｓ９変異体（限定されないが、Ｃａｓ９ Ｙ１５５変異体又はＣａｓ９ Ｆ８６Ａ＋Ｆ９８Ａ変異体など）をＰＧＥＮの一部として使用した場合の、親（野生型）Ｃａｓ９を代わりに含む以外は同じＰＧＥＮと比較した、原核細胞又は真核細胞のＤＮＡ編集効率の増加であり、遺伝子編集効率の増加は、少なくとも１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％である。
「オープンリーディングフレーム」は、ＯＲＦと略記する。
「遺伝子」には、コード配列に先行する調節配列（５’非コード配列）及び後続する調節配列（３’非コーディング配列）を含む、限定はされないが、特異的タンパク質などの機能的分子を発現する核酸断片が含まれる。「天然遺伝子」は、それ自身の調節配列を有する、天然で見出される遺伝子を指す。
「変異遺伝子」は、ヒトが介入して改変されている遺伝子である。このような「変異遺伝子」は、少なくとも１つのヌクレオチドの付加、欠失又は置換によって、対応する非変異遺伝子の配列とは異なる配列を有する。本開示の特定の実施形態では、この変異遺伝子は、本明細書で開示するガイドポリヌクレオチド／Ｃａｓタンパク質システムにより生じる変更を含む。変異細胞又は変異生命体は、変異遺伝子を含む細胞又は生命体である。
用語「ゲノム」は、原核細胞及び真菌細胞、又は生命体細胞に適用する場合、核内で見出される染色体ＤＮＡだけでなく、細胞の細胞内成分（例えば、ミトコンドリア又はプラスチド）内で見出される細胞小器官ＤＮＡも包含する。
目的ポリヌクレオチドが本明細書中にさらに記載されており、それには、酵素の生成（例えば、限定はされないが、酵素を生成する細菌又は真菌の発酵による、又は酵素を生成する植物による）及び作物の開発に関与するそれらの商業市場及び利益を反映するポリヌクレオチドが含まれる。
目的の作物及び市場は変化し、開発途上国が世界市場に進出するにつれ、新しい作物及び技術もまた出現してくるであろう。さらに、収量及びヘテロシスなどの農業形質及び特性の理解が増すにつれ、それに応じて、遺伝子組み換え技術のための遺伝子の選択は変わってくるであろう。目的ポリヌクレオチドとしては、限定はされないが、農学、除草剤耐性、殺虫剤耐性、病気抵抗性、線虫抵抗性、除草剤耐性、微生物耐性、真菌耐性、ウイルス耐性、稔性又は不稔性、穀粒特性、及び商業製品に重要な形質をコードするポリヌクレオチドが挙げられる。
目的ポリヌクレオチドの一般的なカテゴリーとしては、例えば、ジンクフィンガーなどの情報に関与する目的遺伝子、キナーゼなどの伝達に関与する目的遺伝子、及び熱ショックタンパク質などのハウスキーピングに関与する目的遺伝子が挙げられる。より具体的な目的ポリヌクレオチドとしては、限定はされないが、作物収量、穀粒品質、作物栄養素含有量、デンプン及び炭水化物の品質及び量に関与する遺伝子、並びに仁サイズ、ショ糖負荷、タンパク質の品質及び量、窒素固定及び／又は窒素利用、脂肪酸及び油組成に影響する遺伝子、非生物的ストレス（干ばつ、窒素、温度、塩分、毒性金属若しくは微量元素など）に対する耐性を付与するタンパク質をコードする遺伝子、殺虫剤及び除草剤などの毒素に対する耐性を付与するタンパク質をコードする遺伝子、生物的ストレス（真菌、ウイルス、細菌、昆虫及び線虫による攻撃、並びにこれらの生命体に関連する病気の発生など）に対する耐性を付与するタンパク質をコードする遺伝子が挙げられる。
さらに、目的ポリヌクレオチドが目的の標的遺伝子配列のためのメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の少なくとも一部に対して相補的なアンチセンス配列も含み得ることが確認されている。アンチセンスヌクレオチドは、対応するｍＲＮＡとハイブリダイズするように構築される。アンチセンス配列は、その配列が対応するｍＲＮＡとハイブリダイズして対応するｍＲＮＡの発現を妨害する限り、改変することができる。このように、対応するアンチセンス配列に対して７０％、８０％又は８５％の配列同一性を有するアンチセンスコンストラクトを使用することができる。さらに、標的遺伝子の発現を阻害するためにアンチセンスヌクレオチドの部分を使用することができる。一般に、少なくとも５０ヌクレオチド、１００ヌクレオチド、２００ヌクレオチド又はそれ以上の配列を使用することができる。
さらに、目的ポリヌクレオチドはまた、生命体の内因性遺伝子の発現を抑制するセンス配向で使用することができる。センス配向のポリヌクレオチドによって生命体の遺伝子の発現を抑制する方法は、当該技術分野で知られている。この方法には、一般に、内因性の遺伝子の転写に対応するヌクレオチド配列の少なくとも一部に作動可能に連結した、生命体内での発現を駆動するプロモーターを含むＤＮＡコンストラクトで生命体を形質転換することが含まれる。通常、このようなヌクレオチド配列は、内因性遺伝子の転写配列に対し相当の配列同一性を、一般に、約６５％を超える配列同一性を、約８５％を超える配列同一性を、又は約９５％を超える配列同一性を有する。米国特許第５，２８３，１８４号明細書及び同第５，０３４，３２３号明細書（参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい。
目的ポリヌクレオチドはまた、表現型マーカーであり得る。表現型マーカーは、ポジティブ選択マーカーであるかネガティブ選択マーカーであるかにかかわらず、視覚マーカー及び選択マーカーを含むスクリーニングマーカー又は選択マーカーである。任意の表現型マーカーを使用することができる。詳細には、選択又はスクリーニングマーカーは、多くの場合は特定の条件下で、１つの分子若しくはこの分子を含有する細胞を同定する、又はこの分子若しくは細胞に有利若しくは不利に選択することを可能にするＤＮＡセグメントを含む。これらのマーカーは、以下に限定されないが、ＲＮＡ、ペプチド若しくはタンパク質の産生などの活性をコードすることができるか、又はＲＮＡ、ペプチド、タンパク質、無機化及び有機の化合物又は組成物などのための結合部位を提供することができる。
選択マーカーの例としては、以下に限定されないが、制限酵素部位を含むＤＮＡセグメント；スペクチノマイシン、アンピシリン、カナマイシン、テトラサイクリン、Ｂａｓｔａ、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼＩＩ（ＮＥＯ）及びハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ（ＨＰＴ）などの抗生物質を含む、他の点では毒性の化合物に対する耐性を提供する産物をコードするＤＮＡセグメント；レシピエント細胞において他の点では欠失している産物をコードするＤＮＡセグメント（例えば、ｔＲＮＡ遺伝子、栄養要求性マーカー）；容易に同定できる産物をコードするＤＮＡセグメント（例えば、β－ガラクトシダーゼ、ＧＵＳなどの表現型マーカー；緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）などの蛍光タンパク質、及び細胞表面タンパク質）；ＰＣＲにとっての新規のプライマー部位（例えば、以前には並置されていなかった２つのＤＮＡ配列の並列）の生成、制限エンドヌクレアーゼ若しくは他のＤＮＡ修飾酵素、化学物質などの作用を受けていない、又は作用を受けたＤＮＡ配列の含有、並びにその同定を可能にする特異的修飾（例えば、メチル化）に必要なＤＮＡ配列の包含が挙げられる。
追加の選択マーカーには、スルホニル尿素、グルホシネートアンモニウム、ブロモキシニル、イミダゾリノン及び２，４－ジクロロフェノキシアセテート（２，４－Ｄ）などの除草性化合物に対する耐性を付与する遺伝子が含まれる。例えば、スルホニル尿素、イミダゾリノン、トリアゾロピリミジンスルホンアミド、ピリミジニルサリチラート及びスルホニルアミノカルボニル－トリアゾリノンに対する耐性のためのアセト酪酸シンターゼ（ＡＬＳ）（Ｓｈａｎｅｒ ａｎｄ Ｓｉｎｇｈ，１９９７，Ｈｅｒｂｉｃｉｄｅ Ａｃｔｉｖｉｔｙ：Ｔｏｘｉｃｏｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ６９－１１０）、グリホサート耐性５－エノールピルビルシキミ酸－３－リン酸（ＥＰＳＰＳ）（Ｓａｒｏｈａ ｅｔ ａｌ．１９９８，Ｊ．ＰｌａｎｔＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ＆ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｖｏｌ７：６５－７２）を参照されたい。
目的ポリヌクレオチドは、他の形質（例えば、限定はされないが、除草剤に対する耐性若しくは本明細書に記載のいずれかの他の形質）と組み合わせてスタック又は使用することができる遺伝子を含む。目的ポリヌクレオチド及び／又は形質は、米国特許出願公開第２０１３－０２６３３２４－Ａ１号明細書（２０１３年１０月３日公開）及び国際出願ＰＣＴ／ＵＳ１３／２２８９１号明細書（２０１３年１月２４日公開）（両出願は参照により本明細書に組み込まれる）に記載されるように、複合形質遺伝子座に一緒にスタックすることができる。
標的部位又は標的部位の近くでゲノム内への挿入を含むそれらの細胞を同定するために、様々な方法を利用することができる。このような方法は、標的配列内の何らかの変化を検出するために標的配列を直接分析するものであると見なすことができ、例えば、限定はされないが、ＰＣＲ法、シークエンシング法、ヌクレアーゼ消化法、サザンブロット法、及びそれらの任意の組み合わせが挙げられる。例えば、米国特許出願第１２／１４７，８３４号明細書を参照されたい。この文献は、本明細書に記載の方法に必要な範囲まで参照によって本明細書に組み込まれる。この方法はまた、ゲノムに組み込まれた目的ポリヌクレオチドを含む細胞由来の生命体を回収することを含む。
目的ポリペプチドは、本明細書に記載の目的ポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質又はポリペプチドを含む。
ポリヌクレオチド及びポリペプチドの配列、それらの変異体、並びにこれらの配列の構造的関係は、本明細書で互換的に使用される「相同」、「相同の」、「実質的に同一である」、「実質的に類似した」及び「実質的に対応する」という用語によって記載することができる。これらは、１つ以上のアミノ酸又はヌクレオチド塩基の変化が、分子の機能、例えば、遺伝子の発現を仲介する能力、又は特定の表現型を生じさせる能力に影響することのないポリペプチド又は核酸の配列を指す。これらの用語はまた、得られる核酸の機能特性が、初期の改変されていない核酸と実質的に変わらない核酸配列の改変を指す。これらの改変には、核酸断片中の１つ以上のヌクレオチドの欠失、置換及び／又は挿入が含まれる。
実質的に類似の核酸配列に包含されるものは、（中度のストリンジェンシー条件下、例えば、０．５×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６０℃で）本明細書に例示した配列と、又は本明細書に開示したヌクレオチド配列の任意の部分とハイブリダイズする能力によって規定することができ、それらは本明細書に開示した核酸配列のいずれかと機能的に等価である。ストリンジェンシー条件を調節して、中度の類似性を有する断片、例えば遠縁の生命体由来の相同配列を、高い類似性を有する断片、例えば近縁の生命体由来の機能酵素を複製する遺伝子などに対しスクリーニングすることができる。ポストハイブリダイゼーション洗浄がストリンジェンシー条件を決定する。
用語「選択的にハイブリダイズする」には、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下での、核酸配列の特定の核酸標的配列への、非標的核酸配列へのハイブリダイゼーションより高い検出度（例えば、バックグラウンドの少なくとも２倍）のハイブリダイゼーション、及び非標的核酸の実質的排除が含まれる。選択的にハイブリダイズする配列は、通常、互いに少なくとも約８０％又は９０％、最大で１００％の（すなわち、完全相補の）の配列同一性を有する。
用語「ストリンジェントな条件」又は「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」には、インビトロのハイブリダイゼーション分析において、プローブがその標的配列に選択的にハイブリダイズする条件が含まれる。ストリンジェントな条件は、配列に依存し、また、環境が変わると異なるであろう。ハイブリダイゼーション条件及び／又は洗浄条件のストリンジェンシーを制御することによって、プローブに対し１００％相補的な標的配列を特定することができる（相同プロービング）。或いは、より低い類似性が検出されるように配列の不一致を幾分認めるように、ストリンジェンシー条件を調節することができる（非相同プロービング）。一般に、プローブは長さが約１０００ヌクレオチド未満であり、場合により５００ヌクレオチド未満である。
通常、ストリンジェントな条件は、ｐＨ７．０～８．３で、短いプローブ（例えば、１０～５０ヌクレオチド）の場合、少なくとも約３０℃において、また、長いプローブ（例えば、５０超のヌクレオチド）の場合、少なくとも約６０℃の温度において、塩濃度が、約１．５Ｍ Ｎａイオン濃度、通常、約０．０１～１．０Ｍ Ｎａイオン濃度（又はその他の塩）であるものである。ストリンジェントな条件はまた、ホルムアミドなどの不安定化物質の添加により達成することができる。例示な低ストリンジェンシー条件としては、３０～３５％のホルミアミド、１Ｍ ＮａＣｌ、１％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）からなる緩衝液による３７℃でのハイブリダイゼーション、及び１×～２×ＳＳＣ（２０×ＳＳＣ＝３．０Ｍ ＮａＣｌ／０．３Ｍクエン酸三ナトリウム）中、５０～５５℃での洗浄が挙げられる。中度ストリンジェンシー条件としては、４０～４５％のホルミアミド、１Ｍ ＮａＣｌ、１％ＳＤＳ中、３７℃でのハイブリダイゼーション、及び０．５×～１×ＳＳＣ中、５５～６０℃での洗浄が挙げられる。高ストリンジェンシー条件としては、５０％のホルミアミド、１Ｍ ＮａＣｌ、１％ＳＤＳ中、３７℃でのハイブリダイゼーション、及び０．１×ＳＳＣ中、６０～６５℃での洗浄が挙げられる。
本明細書で使用する場合、「プロモーター」は、コード配列又は機能的ＲＮＡの発現を制御することができるＤＮＡ配列を指す。プロモーター配列は近位の及びより遠位の上流エレメントからなり、後者のエレメントはしばしばエンハンサーと称される。「エンハンサー」はプロモーター活性を刺激することができるＤＮＡ配列であり、プロモーター固有のエレメントであってもよいし、プロモーターのレベル又は組織特異性を増強するために挿入された異種エレメントであってもよい。プロモーターは、その全体が天然遺伝子に由来していてもよいし、天然に見出される異なるプロモーターに由来する異なるエレメントで構成され、且つ／又は合成ＤＮＡセグメントを含んでいてもよい。様々なプロモーターが、様々な組織型若しくは細胞型で、又は様々な発達段階で、又は様々な環境条件に応じて、遺伝子の発現をガイドし得ることは当業者に理解されている。さらに、殆どの場合に調節配列の正確な境界が完全には定義されていないことから、いくつかのバリエーションのＤＮＡ断片が同一のプロモーター活性を有する場合があることは認識されている。当該技術分野でよく知られているように、プロモーターを、このプロモーターの強度及び／又はこのプロモーターが活性である条件によって、例えば構成的プロモーター、強力なプロモーター、弱いプロモーター、ガイド性／抑制性プロモーター、組織特異的に／発達的に調節されるプロモーター、細胞周期依存性プロモーターなどに分類することができる。
本明細書において有用な強力なプロモーターの例としては、米国特許出願公開第２０１２／０２５２０７９号明細書（ＤＧＡＴ２）、同第２０１２／０２５２０９３号明細書（ＥＬ１）、同第２０１３／００８９９１０号明細書（ＡＬＫ２）、同第２０１３／００８９９１１号明細書（ＳＰＳ１９）、同第２００６／００１９２９７号明細書（ＧＰＤ及びＧＰＭ）、同第２０１１／００５９４９６号明細書（ＧＰＤ及びＧＰＭ）、同第２００５／０１３０２８０号明細書（ＦＢＡ、ＦＢＡＩＮ、ＦＢＡＩＮｍ）、同第２００６／００５７６９０号明細書（ＧＰＡＴ）及び同第２０１０／００６８７８９号明細書（ＹＡＴ１）に開示されているものが挙げられ、これらの文献は参照により本明細書に組み込まれる。好適な強力プロモーターの他の例としては、国際公開第２０１６／０２５１３１号パンフレット（２０１６年２月１９日公開）の表２に列挙されているものが挙げられる。この文献は参照により本明細書に組み込まれる。
核酸配列又はポリペプチド配列の文脈における「配列同一性」又は「同一性」は、特定の比較窓全体にわたり最大に対応でアラインさせた場合に同一となる２つの配列中の核酸塩基又はアミノ酸残基を意味する。
用語「配列同一性パーセンテージ」は、比較窓全体にわたり最適にアラインされた２つの配列を比較することにより決定される数値を意味しており、比較窓中のポリヌクレオチド配列又はポリペプチド配列の部分は、これら２つの配列の最適なアラインメントのために、参照配列（付加又は欠失を含まない）と比較して付加若しくは欠失（すなわち、ギャップ）を含む場合がある。パーセンテージは、両方の配列内で同一の核酸塩基又はアミノ酸残基が生じた位置の数を決定して、マッチした位置数を得、このマッチした位置数を比較窓内の位置の総数で除し、その結果に１００を掛けることによって計算され、配列同一性のパーセンテージが得られる。配列同一性率（％）の有用な例としては、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％若しくは９５％又は５０％～１００％の任意の整数パーセンテージが挙げられるが、これらに限定されない。これらの同一性は、本明細書に記載したプログラムのいずれかを使用して決定することができる。
配列アラインメント及び同一性率若しくは類似性の計算は、ＬＡＳＥＲＧＥＮＥバイオインフォマティクスコンピューティングスイート（ＤＮＡＳＴＡＲ Ｉｎｃ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）のＭｅｇＡｌｉｇｎ（商標）プログラム（これに限定されない）を含む、相同配列を検出するために設計された様々な比較方法を使用して決定することができる。本出願との関連では、配列分析ソフトウェアが分析に使用される場合は、他に規定されない限り、分析結果は、言及したプログラムの「デフォルト値」をベースとすることは理解されるだろう。本明細書で使用する場合、「デフォルト値」は、最初の初期化時にソフトウェアで最初にロードされる数値若しくはパラメータの任意のセットを意味するであろう。
「アラインメントのＣｌｕｓｔａｌ Ｖ法」は、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｖ（Ｈｉｇｇｉｎｓ ａｎｄ Ｓｈａｒｐ，（１９８９）ＣＡＢＩＯＳ ５：１５１－１５３、Ｈｉｇｇｉｎｓ ｅｔ ａｌ．，（１９９２）Ｃｏｍｐｕｔ Ａｐｐｌ Ｂｉｏｓｃｉ ８：１８９－１９１により説明されている）と表示され、ＬＡＳＥＲＧＥＮＥバイオインフォマティクスコンピューティングスイート（ＤＮＡＳＴＡＲ Ｉｎｃ．、Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）のＭｅｇＡｌｉｇｎ（商標）プログラム中で見出されるアラインメント法に対応する。多重アラインメントの場合、デフォルト値は、ＧＡＰ ＰＥＮＡＬＴＹ＝１０及びＧＡＰ ＬＥＮＧＴＨ ＰＥＮＡＬＴＹ＝１０に対応する。Ｃｌｕｓｔａｌ法を使用するタンパク質配列のペアワイズアラインメント（ｐａｉｒｗｉｓｅ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ）用の及び同一性率の算出用のデフォルトパラメータは、ＫＴＵＰＬＥ＝１、ＧＡＰ ＰＥＮＡＬＴＹ＝３、ＷＩＮＤＯＷ＝５及びＤＩＡＧＯＮＡＬＳ ＳＡＶＥＤ＝５である。核酸の場合、これらのパラメータは、ＫＴＵＰＬＥ＝２、ＧＡＰ ＰＥＮＡＬＴＹ＝５、ＷＩＮＤＯＷ＝４及びＤＩＡＧＯＮＡＬＳ ＳＡＶＥＤ＝４である。Ｃｌｕｓｔａｌ Ｖプログラムを使用した配列のアラインメントの後、同プログラム中の「配列距離」表を調べることにより、「同一性率」を得ることができる。
「アラインメントのＣｌｕｓｔａｌ Ｗ法」は、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗ（Ｈｉｇｇｉｎｓ ａｎｄ Ｓｈａｒｐ，（１９８９）ＣＡＢＩＯＳ ５：１５１－１５３、Ｈｉｇｇｉｎｓ ｅｔ ａｌ．，（１９９２）Ｃｏｍｐｕｔ Ａｐｐｌ Ｂｉｏｓｃｉ ８：１８９－１９１により説明されている）と表示され、ＬＡＳＥＲＧＥＮＥバイオインフォマティクスコンピューティングスイート（ＤＮＡＳＴＡＲ Ｉｎｃ．、Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）のＭｅｇＡｌｉｇｎ（商標）ｖ６．１プログラム中で見出されるアラインメント法に対応する。多重アラインメント用のデフォルトパラメータ（ＧＡＰ ＰＥＮＡＬＴＹ＝１０、ＧＡＰ ＬＥＮＧＴＨ ＰＥＮＡＬＴＹ＝０．２、Ｄｅｌａｙ Ｄｉｖｅｒｇｅｎ Ｓｅｑｓ（％）＝３０、ＤＮＡ Ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ Ｗｅｉｇｈｔ＝０．５、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｗｅｉｇｈｔ Ｍａｔｒｉｘ＝Ｇｏｎｎｅｔ Ｓｅｒｉｅｓ、ＤＮＡ Ｗｅｉｇｈｔ Ｍａｔｒｉｘ＝ＩＵＢ）。Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗプログラムを使用した配列のアラインメントの後、同プログラム中の「配列距離」表を調べることにより、「同一性率」を得ることができる。
別途指定しない限り、本明細書に示される配列同一性／類似性値は、以下のパラメータを用いるＧＡＰ Ｖｅｒｓｉｏｎ１０（ＧＣＧ、Ａｃｃｅｌｒｙｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を使用して得られた値を指す：ヌクレオチド配列の同一性％及び類似性％は、ギャップ生成ペナルティウエイト ５０、ギャップ長伸長ペナルティウエイト ３、及びｎｗｓｇａｐｄｎａ．ｃｍｐスコアリングマトリックスを使用；アミノ酸配列の同一性％及び類似性％は、ギャップ生成ペナルティウエイト ８、ギャップ長伸長ペナルティ ２、及びＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックスを使用（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ ａｎｄ Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：１０９１５）。ＧＡＰは、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ，（１９７０）Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ４８：４４３－５３のアルゴリズムを使用して、一致した数を最大化し、ギャップ数を最小限に抑える２つの配列全体のアラインメントを見出す。ＧＡＰは、全ての可能なアラインメント及びギャップ位置を考慮し、一致した塩基の単位でギャップ生成ペナルティ及びギャップ伸長ペナルティを使用して、一致した塩基の最大数及び最小のギャップを有するアラインメントを作成する。
「ＢＬＡＳＴ」は、国立生物工学情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）（ＮＣＢＩ）によって提供されている、生物学的配列の類似領域を見出すために使用される検索アルゴリズムである。このプログラムでは、ヌクレオチド配列又はタンパク質配列を配列データベースと比較し、一致の統計学的有意性を計算して、問い合わせ配列に十分類似した配列を、類似性がランダムに起こったと予想されないように特定する。ＢＬＡＳＴは特定された配列及びそれらの問い合わせ配列に対するローカルアライメントを報告する。
多くのレベルの配列同一性が、その他の種からの又は天然に若しくは合成により改変されているポリペプチド（そのようなポリペプチドは同一の又は類似した機能又は活性を有する）の特定に有用であることは当業者によく理解されるであろう。同一性率の有用な例としては、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％若しくは９５％又は５０％～１００％の任意の整数パーセンテージが挙げられるが、これらに限定されない。実際に、５０％～１００％の任意の整数のアミノ酸同一性、例えば、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性は、本開示の説明に有用であり得る。
「翻訳リーダー配列」は、遺伝子のプロモーター配列とコード配列との間に位置するポリヌクレオチド配列を指す。翻訳リーダー配列は、ｍＲＮＡの翻訳開始配列の上流に存在する。翻訳リーダー配列は、ｍＲＮＡへの一次転写物のプロセシング、ｍＲＮＡの安定性又は翻訳効率に影響し得る。翻訳リーダー配列の例は、報告されている（例えば、Ｔｕｒｎｅｒ ａｎｄ Ｆｏｓｔｅｒ，（１９９５）Ｍｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ３：２２５－２３６）。
「３’非コード配列」、「転写ターミネーター」又は「終止配列」は、コード配列の下流に位置するＤＮＡ配列を指し、ポリアデニル化認識配列、及びｍＲＮＡプロセシング又は遺伝子の発現に影響を及ぼすことができる、調節シグナルをコードする他の配列を含む。ポリアデニル化シグナルは、通常、ｍＲＮＡ前駆体の３’末端へのポリアデニル酸系の付加に影響することによって特徴付けられる。異なる３’非コード配列の使用は、Ｉｎｇｅｌｂｒｅｃｈｔ ｅｔ ａｌ．、（１９８９）Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ １：６７１－６８０に例示されている。
本明細書で使用する場合、「ＲＮＡ転写物」は、ＲＮＡポリメラーゼにより触媒されるＤＮＡ配列の転写により生じる産物を指す。ＲＮＡ転写物が、ＤＮＡ配列の完全に相補的なコピーである場合、これは一次転写物又はプレｍＲＡと呼ばれる。ＲＮＡ転写物は、それが一次転写物プレｍＲＮＡの転写後のプロセシングで得られたＲＮＡである場合、成熟ＲＮＡ又はｍＲＮＡと呼ばれる。「メッセンジャーＲＮＡ」又は「ｍＲＮＡ」は、イントロンを有しておらず、細胞によりタンパク質に翻訳され得るＲＮＡを指す。「ｃＤＮＡ」は、ｍＲＮＡテンプレートに相補的であって、逆転写酵素を使用してｍＲＮＡテンプレートから合成されるＤＮＡを指す。ｃＤＮＡは単鎖であるか、又はＤＮＡポリメラーゼＩのＫｌｅｎｏｗ断片を使用して、二本鎖形態に変換され得る。「センス」ＲＮＡは、ｍＲＮＡを含むＲＮＡ転写物を指し、細胞内又はインビトロでタンパク質に翻訳され得る。「アンチセンスＲＮＡ」は、標的一次転写物又はｍＲＮＡの全部又は一部に対して相補的であり、且つ標的遺伝子の発現をブロックするＲＮＡ転写物を指す（例えば、米国特許第５，１０７，０６５号明細書を参照されたい）。アンチセンスＲＮＡの相補性は、特定の遺伝子転写物の任意の部分と、すなわち５’非コード配列、３’非コード配列、イントロン又はコード配列で相補性であり得る。「機能的ＲＮＡ」は、アンチセンスＲＮＡ、リボザイムＲＮＡ、又は翻訳され得ないがそれにもかかわらず細胞内プロセスに影響を及ぼすその他のＲＮＡを指す。用語「相補体」及び「逆相補体」は、ｍＲＮＡ転写物に関して本明細書では互換的に使用され、メッセージのアンチセンスＲＮＡを定義することが意図されている。
「成熟」タンパク質は、翻訳後にプロセシングされたポリペプチド（すなわち、一次翻訳産物中に存在する任意のプレペプチド又はプロペプチドが除去されているポリペプチド）を指す。「前駆体」タンパク質は、ｍＲＮＡの翻訳の一次産物（すなわち、プレペプチド及びプロペプチドが依然として存在している）を指す。プレペプチド及びプロペプチドは細胞内局在化シグナルであり得るがこれに限定されない。
本明細書中で使用される場合、「標的変異」は、当業者に知られた任意の方法、例えばガイド型Ｃａｓタンパク質システムを含む方法を使用して標的遺伝子内の標的配列を変更することによって作製された遺伝子（標的遺伝子と呼ばれる）における変異である。ｃａｓタンパク質がＣａｓエンドヌクレアーゼである場合、ガイドポリヌクレオチド／Ｃａｓエンドヌクレアーゼガイド標的変異は、Ｃａｓエンドヌクレアーゼによって認識され、切断されるゲノム標的部位の内部又は外部に位置するヌクレオチド配列において起こり得る。
タンパク質は、アミノ酸の置換、欠失、トランケーション及び挿入を含む様々な方法で改変することができる。そのような操作のための方法は、一般に知られている。例えば、タンパク質のアミノ酸配列変異体は、ＤＮＡ内の変異によって調製することができる。変異誘発法及びヌクレオチド配列の変更法として、例えば、Ｋｕｎｋｅｌ，（１９８５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２：４８８－９２、Ｋｕｎｋｅｌ ｅｔ ａｌ．，（１９８７）Ｍｅｔｈ Ｅｎｚｙｍｏｌ １５４：３６７－８２、米国特許第４，８７３，１９２号明細書、Ｗａｌｋｅｒ ａｎｄ Ｇａａｓｔｒａ，ｅｄｓ．（１９８３）Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（ＭａｃＭｉｌｌａｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）及びそこで引用されている文献が挙げられる。タンパク質の生物学的活性に影響を与えそうにないアミノ酸置換についてのガイダンスとして、例えば、Ｄａｙｈｏｆｆ ｅｔ ａｌ．（１９７８）Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ（Ｎａｔｌ Ｂｉｏｍｅｄ Ｒｅｓ Ｆｏｕｎｄ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ、Ｄ．Ｃ．）のモデルがある。１つのアミノ酸を類似の特性を有する別のアミノ酸と交換するなどの保存的置換が好ましいかもしれない。保存的な欠失、挿入及びアミノ酸置換は、タンパク質の特性に過激な変化を引き起こさないと考えられ、置換、欠失、挿入又はこれらの組み合わせの影響は、ルーチンのスクリーニング分析で評価することができる。二本鎖切断誘発活性の分析法は知られており、一般に、標的部位を含有するＤＮＡ基質上における、試薬の全体の活性と特異性を測定する。
標準のＤＮＡ分離、精製、分子クローニング、ベクター構築、及び検証／キャラクタリゼーションの方法は十分に確立されており、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、ＮＹ）を参照されたい。ベクター及びコンストラクトとしては、環状プラスミド及び線状ポリヌクレオチドが挙げられ、これらには目的ポリヌクレオチド、及び場合により他の成分、例えば、リンカー、アダプター、調節成分又は分析成分が含まれる。いくつかの実施例では、認識部位及び／又は標的部位を、イントロン、コード配列、５’ＵＴＲ、３’ＵＴＲ及び／又は調節領域内に含有させることができる。
略語の意味は以下の通りである：「ｓｅｃ」は秒を意味し、「ｍｉｎ」は分を意味し、「ｈ」は時間を意味し、「ｄ」は日を意味し、「μＬ」はマイクロリットルを意味し、「ｍＬ」はミリリットルを意味し、「Ｌ」はリットルを意味し、「μＭ」は「マイクロモルの」を意味し、「ｍＭ」は「ミリモルの」を意味し、「Ｍ」は「モルの」を意味し、「ｍｍｏｌ」はミリモルを意味し、「μｍｏｌｅ」はマイクロモルを意味し、「ｇ」はグラムを意味し、「μｇ」はマイクログラムを意味し、「ｎｇ」はナノグラムを意味し、「Ｕ」は単位を意味し、「ｂｐ」は塩基対を意味し、及び「ｋｂ」はキロベースを意味する。
本明細書で開示する組成物及び方法の非限定的な例又は実施形態は下記の通りである。
１．配列番号１に記載の親Ｃａｓ９ポリペプチドと少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有し、且つ８６位、９８位、１５５位、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される位置に少なくとも１つのアミノ酸置換を有する、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼ変異体又はその活性断片（ここで、変異体のアミノ酸位置は、前記親Ｃａｓ９ポリペプチドのアミノ酸配列と対応させて番号付けされ、前記Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼ変異体はエンドヌクレアーゼ活性を有する）。
２．少なくとも１つのアミノ酸置換は、Ｙ１５５Ｈ、Ｙ１５５Ｎ、Ｙ１５５Ｅ、Ｙ１５５Ｆ（１５５位において）、Ｆ８６Ａ（８６位において）及びＦ９８Ａ（９８位において）からなる群から選択される、実施形態１のＣａｓ９エンドヌクレアーゼ変異体。
３．Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼ変異体は、前記親Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼと比較して、形質転換効率の改善及び編集効率の改善からなる群から選択される少なくとも１つの特性の改善を有する、実施形態１のＣａｓ９エンドヌクレアーゼ変異体。
４．前記変異体は、配列番号１のアミノ酸配列に対し７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施形態１～３のいずれかのＣａｓ９エンドヌクレアーゼ変異体又はその活性断片。１．
５．特性の改善は形質転換効率の改善であり、且つ、前記変異体又はその活性断片は編集効率の改善も有する、実施形態３のＣａｓ９エンドヌクレアーゼ変異体。
６．親Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼと比較して、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個のアミノ酸置換を含む、実施形態１～５のいずれかのＣａｓ９エンドヌクレアーゼ変異体又はその活性断片。
７．実施形態１～６のいずれかのＣａｓ９エンドヌクレアーゼ又はその機能的断片を含む組成物。
８．前記組成物は、ガイドポリヌクレオチド／Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼ複合体、ガイドＲＮＡ／Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼ複合体、及び前記Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼ変異体を含む融合タンパク質からなる群から選択される、実施形態７の組成物。
９．実施形態１～６のいずれかのＣａｓ９エンドヌクレアーゼ変異体をコードする核酸配列を含むポリヌクレオチド。
１０．少なくとも１つのガイドポリヌクレオチドと、少なくとも１つの実施形態１～６のいずれか１つのＣａｓ９エンドヌクレアーゼ変異体とを含むガイドポリヌクレオチド／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ複合体（ＰＧＥＮ）であって、前記ガイドポリヌクレオチドは天然に存在しないキメラガイドポリヌクレオチドであり、前記ガイドポリヌクレオチド／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ複合体は標的配列の全部又は一部を認識し、結合し、場合によりニッキング、ほどき、又は切断を行うことができるガイドポリヌクレオチド／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ複合体（ＰＧＥＮ）。
１１．実施形態９のポリヌクレオチドを含む組み換えＤＮＡコンストラクト。
１２．実施形態１～６のいずれか１つのＣａｓ９エンドヌクレアーゼ又はその機能的断片を含む宿主細胞。
１３．実施形態９のポリヌクレオチドを含む宿主細胞。
１４．細胞は原核細胞又は真核細胞である、実施形態１３の宿主細胞。
１５．細胞は、ヒト、非ヒト、動物、菌質、真菌、昆虫、酵母、非従来型酵母及び植物細胞からなる群から選択される、実施形態１４の宿主細胞。
１５ｂ．実施形態７のＰＧＥＮを含むキット。
１５ｃ．実施形態１、２、３、４、５、又は６に記載のＣａｓ９エンドヌクレアーゼ変異体を含む送達粒子。
１５ｄ．Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼ変異体タンパク質はガイドポリヌクレオチドと複合化されている、実施形態１５ｃの送達粒子。
１６．細胞のゲノム中の標的部位を改変する方法であって、少なくとも１つの実施形態１０のＰＧＥＮを細胞に導入すること、及び前記標的に改変を有する少なくとも１つの細胞を同定することを含み、前記標的部位の改変は、（ｉ）少なくとも１つのヌクレオチドの置換、（ｉｉ）少なくとも１つのヌクレオチドの欠失、（ｉｉｉ）少なくとも１つのヌクレオチドの挿入、及び（ｉｖ）（ｉ）～（ｉｉｉ）の任意の組み合わせからなる群から選択される方法。
１７．細胞のゲノム中のヌクレオチド配列を編集する方法であって、少なくとも１つの実施形態１０のＰＧＥＮ、及びポリヌクレオチド改変テンプレートに導入することを含み、前記ポリヌクレオチド改変テンプレートは前記ヌクレオチド配列の少なくとも１つのヌクレオチド改変を含む方法。
１８．編集されたヌクレオチド配列を含む少なくとも１つの細胞を選択することをさらに含む、実施形態１７の方法。
１９．細胞のゲノム中の標的部位を改変する方法であって、少なくとも１つの実施形態１０のＰＧＥＮ、及び少なくとも１つのドナーＤＮＡを細胞に導入することを含み、前記ドナーＤＮＡは目的ポリヌクレオチドを含む方法。
２０．前記標的部位又は前記標的部位の近傍に前記目的ポリヌクレオチドが組み込まれた少なくとも１つの細胞を同定することをさらに含む、実施形態１９の方法。
２１．細胞は、ヒト、非ヒト、動物、細菌、真菌、昆虫、酵母、非従来型酵母及び植物細胞からなる群から選択される、実施形態１６～２１のいずれか１つの方法。
２２．ＰＧＥＮは、予め組み立てられたポリヌクレオチド－タンパク質複合体として細胞に導入される、実施形態１６～２１の方法。
２３．ガイドポリヌクレオチド／ＣａｓエンドヌクレアーゼはガイドＲＮＡ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼである、実施形態１６～２１のいずれか１つの方法。
２４．ガイドＲＮＡ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ複合体は、リボヌクレオチド－タンパク質複合体として細胞に導入される前に、インビトロで組み立てられる、実施形態２２の方法。
２５．Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼ変異体の少なくとも１つの特性を改善する方法であって、親Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼに少なくとも１つのアミノ酸改変を導入し（ここで、前記少なくとも１つのアミノ酸改変は親Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼのＲｕｖＣ及びＨＮＨドメインの外側に位置する）、それによって、前記Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼ変異体を作製する（ここで、前記Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼ変異体は前記親Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼと比較して少なくとも１つの特性の改善を示す）ことを含む方法。
２６．前記少なくとも１つのアミノ酸改変は、８６位、９８位、１５５位、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される位置でのアミノ酸置換である（ここで、変異体のアミノ酸位置は前記親Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼのアミノ酸配列と対応させて番号付けされる）、実施形態２５の方法。
２７．少なくとも１つのアミノ酸置換は、Ｙ１５５Ｈ、Ｙ１５５Ｎ、Ｙ１５５Ｅ、Ｙ１５５Ｆ（１５５位において）、Ｆ８６Ａ（８６位において）及びＦ９８Ａ（９８位において）からなる群から選択される、実施形態２６の方法。
２８．Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼ変異体は、親Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼと比較して、形質転換効率の改善及び編集効率の改善からなる群から選択される少なくとも１つの特性の改善を有する、実施形態２５の方法。
２９．実施形態２４～２７のいずれかの方法によって生成されたｃａｓ９エンドヌクレアーゼ変異体。
３０．バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞のゲノムを改変する方法であって、
改変されるべき少なくとも１つの標的配列を含むバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞に、少なくとも１つの非天然ガイドＲＮＡ、及び少なくとも１つの実施形態１～６のいずれか１つのＣａｓ９エンドヌクレアーゼ変異体を提供すること（ここで、ガイドＲＮＡ及びＣａｓ９エンドヌクレアーゼ変異体は複合体（ＰＧＥＮ）を形成することができ、前記複合体は前記少なくとも１つの標的配列の全部又は一部を認識し、結合し、場合により、ニッキング、ほどき、又は切断を行うことができる）、並びに
少なくとも１つのバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞を同定すること（ここで、少なくとも１つのゲノム標的配列は改変されている）
を含む方法。
３１． 前記標的配列の改変は、（ｉ）少なくとも１つのヌクレオチドの置換、（ｉｉ）少なくとも１つのヌクレオチドの欠失、（ｉｉｉ）少なくとも１つのヌクレオチドの挿入、及び（ｉｖ）（ｉ）～（ｉｉｉ）の任意の組み合わせからなる群から選択することができる、３０の方法。
３２．バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞は、バチルス・アルカロフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｌｋａｌｏｐｈｉｌｕｓ）、バチルス・アルティチュジニス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｌｔｉｔｕｄｉｎｉｓ）、バチルス・アミロリケファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、Ｂ．アミロリケファシエンス亜種プランタラム（Ｂ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ ｓｕｂｓｐ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ）、バチルス・ブレビス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ）、バチルス・サークランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）、バチルス・クラウシー（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｌａｕｓｉｉ）、バチルス・コアグランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏａｇｕｌａｎｓ）、バチルス・フィルムス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｉｒｍｕｓ）、バチルス・ラウツス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌａｕｔｕｓ）、バチルス・レンツス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｅｎｔｕｓ）、バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、バチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）、バチスル・メチロトロフィカス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｔｈｙｌｏｔｒｏｐｈｉｃｕｓ）、バチルス・プミルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｕｍｉｌｕｓ）、バチルス・サフェンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｆｅｎｓｉｓ）、バチルス・ステアロサーモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、バチルス・サブティルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、及びバチルス・チューリンギエンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）からなるバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種の群から選択される、２９の方法。
３３．Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）宿主細胞のゲノムを改変する方法であって、
改変されるべき少なくとも１つの標的配列を含むＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）宿主細胞に、少なくとも１つの非天然ガイドＲＮＡ、及び少なくとも１つの実施形態１～６のいずれか１つのＣａｓ９エンドヌクレアーゼ変異体を提供すること（ここで、ガイドＲＮＡ及びＣａｓ９エンドヌクレアーゼ変異体は複合体（ＰＧＥＮ）を形成することができ、前記複合体は前記少なくとも１つの標的配列の全部又は一部を認識し、結合し、場合により、ニッキング、ほどき、又は切断を行うことができる）、並びに
少なくとも１つのＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）宿主細胞を同定すること（ここで、少なくとも１つのゲノム標的配列は改変されている）
を含む方法。
３４．サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）宿主細胞のゲノムを改変する方法であって、
改変されるべき少なくとも１つの標的配列を含むサッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）宿主細胞に、少なくとも１つの非天然ガイドＲＮＡ、及び少なくとも１つの実施形態１～６のいずれか１つのＣａｓ９エンドヌクレアーゼ変異体を提供すること（ここで、ガイドＲＮＡ及びＣａｓ９エンドヌクレアーゼ変異体は複合体（ＰＧＥＮ）を形成することができ、前記複合体は前記少なくとも１つの標的配列の全部又は一部を認識し、結合し、場合により、ニッキング、ほどき、又は切断を行うことができる）、並びに
少なくとも１つのサッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）宿主細胞を同定すること（ここで、少なくとも１つのゲノム標的配列は改変されている）
を含む方法。
３５．真菌宿主細胞のゲノムを改変する方法であって、
改変されるべき少なくとも１つの標的配列を含む真菌宿主細胞に、少なくとも１つの非天然ガイドＲＮＡ、及び少なくとも１つの実施形態１～６のいずれか１つのＣａｓ９エンドヌクレアーゼ変異体を提供すること（ここで、ガイドＲＮＡ及びＣａｓ９エンドヌクレアーゼ変異体は複合体（ＰＧＥＮ）を形成することができ、前記複合体は前記少なくとも１つの標的配列の全部又は一部を認識し、結合し、場合により、ニッキング、ほどき、又は切断を行うことができる）、並びに
少なくとも１つの真菌宿主細胞を同定すること（ここで、少なくとも１つのゲノム標的配列は改変されている）
を含む方法。
３６．細胞中の標的部位を改変するためのＣａｓ９エンドヌクレアーゼ変異体であって、そのＨＮＨドメイン及びＲｕＶＣドメインの外側にアミノ酸改変を含むＣａｓ９エンドヌクレアーゼ変異体（ここで、前記Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼは前記アミノ酸改変を含まない親Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼと比較して少なくとも１つの改善された特性を有し、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼ変異体は前記ガイドポリヌクレオチドと複合体を形成することができ、前記複合体は前記標的配列の全部又は一部を認識し、結合し、場合により、ニッキング、ほどき、又は切断を行うことができる）。
３７．Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼ変異体は、前記親Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼと比較して、形質転換効率の改善、折り畳み変換の改善、編集効率の改善、及び折り畳み編集の改善からなる群から選択される少なくとも１つの特性の改善を有する、実施形態３４のＣａｓ９エンドヌクレアーゼ変異体。
３８．細胞中の目的ゲノム遺伝子座における標的部位改変用のＣａｓ９エンドヌクレアーゼ変異体を使用して編集効率を増加させることによって、生命体又は非ヒト生命体を改変する方法であって、非天然ガイドポリヌクレオチド及びＣａｓ９エンドヌクレアーゼ変異体を前記細胞に提供すること（ここで、前記Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼ変異体はそのＨＮＨドメイン及びＲｕＶＣドメインの外側にアミノ酸改変を含み、前記Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼは前記アミノ酸改変を含まない親Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼと比較して増加した遺伝子編集効率を有し、前記ガイドポリヌクレオチド及びＣａｓ９エンドヌクレアーゼ変異体は前記標的配列の全部又は一部を認識し、結合し、場合により、ニッキング、ほどき、又は切断を行うことができる複合体を形成することができる）を含む方法。
３９．原核細胞又は真核細胞においてＣａｓエンドヌクレアーゼ変異体を発現させる方法であって、
（ａ）原核細胞又は真核細胞に実施形態１１の組み換えＤＮＡコンストラクトを導入すること；及び
（ｂ）前記Ｃａｓエンドヌクレアーゼ変異体の発現を可能にする条件下で、工程（ａ）の原核細胞又は真核細胞をインキュベートすること
を含む方法。
３８．配列番号５８（ＣａｓＹ１５５Ｈ変異体）、配列番号１２３（ＣａｓＹ１５５Ｎ変異体）、配列番号１２５（Ｃａｓ９Ｙ１５５Ｅ変異体）、配列番号１２７（Ｃａｓ９Ｙ１５５Ｆ変異体）、配列番号１２９（Ｃａｓ９Ｆ８６Ａ－Ｆ９８Ａ変異体）からなる群から選択されるＣａｓ９エンドヌクレアーゼ変異体。
以下の実施例では、他に特に明記しない限り、部及びパーセンテージは重量によるものであり、度は摂氏である。これらの実施例は、本開示の実施形態を示しているが、例示するためにのみ提供されていることを理解すべきである。上記の考察及びこれらの実施例から、当業者であれば様々な用法及び条件に適合させるために本開示に様々な変更及び修正を加えることができる。そのような修正もまた、添付の特許請求の範囲に含まれるものとする。
実施例１
バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）における標的部位１及び標的部位２を標的とするＣａｓ９発現カセットの構築。
ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）由来のＣａｓ９タンパク質（配列番号１）をバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）における発現用にコドン最適化し（配列番号２）、Ｎ末端核局在化配列（ＮＬＳ；「ＡＰＫＫＫＲＫＶ」；配列番号３）、Ｃ末端ＮＬＳ（「ＫＫＫＫＬＫ」；配列番号４）、デカヒスチジンタグ（「ＨＨＨＨＨＨＨＨＨＨ」；配列番号５）、Ｂ．サブティルス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）由来のａｐｒＥプロモーター（配列番号６）及び転写終結配列（配列番号７）を加え、製造業者の説明書に従ってＱ５ ＤＮＡポリメラーゼ（ＮＥＢ）を使用し、下記の表１に示すフォワード／リバースプライマー対を用いて増幅した。
Figure 0007384801000003
プラスミドｐＫＢ３２０（配列番号１１）の骨格（配列番号１０）を、製造業者の説明書に従ってＱ５ ＤＮＡポリメラーゼ（ＮＥＢ）を使用し、下記の表２に示すフォワード／リバースプライマー対を用いて増幅した。
Figure 0007384801000004
ＰＣＲ産物を、Ｚｙｍｏ ｃｌｅａｎを使用して精製し、そして製造業者の説明書に従って５カラムを濃縮した。続いて、２つの断片を等モル比で混合するＱ５ポリメラーゼ（ＮＥＢ）を用いた延長オーバーラップエクステンションＰＣＲ（ＰＯＥ－ＰＣＲ）を用いて、ＰＣＲ産物をアセンブルした。ＰＯＥ－ＰＣＲ反応サイクルを繰り返した：９８℃５秒間、６４℃１０秒間、７２℃４分１５秒間を３０サイクル。５μＬのＰＯＥ－ＰＣＲ（ＤＮＡ）を、製造業者の説明書に従ってＴｏｐ１０Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に形質転換し、５０μｇ／ｍｌの硫酸カナマイシンを含有し、１．５％寒天で固化させた溶原（Ｌ）培地（Ｍｉｌｌｅｒレシピ；１％（ｗ／ｖ）トリプトン、０．５％（ｗ／ｖ）酵母抽出物、１％（ｗ／ｖ）ＮａＣｌ）で選択した。コロニーを３７℃で１８時間増殖させた。コロニーを採取し、Ｑｉａｐｒｅｐ ＤＮＡミニプレップキットを製造業者の説明書に従って使用してプラスミドＤＮＡを調製し、５５μｌのｄｄＨ２Ｏ中に溶出した。下記の表３に示すシークエンシングプライマーを使用して、サンガー法によりプラスミドＤＮＡの配列を決定し、正しいアセンブリーを確認した。
Figure 0007384801000005
正しくアセンブルしたプラスミドｐＲＦ６９４（配列番号２５）を使用して、バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）ゲノムを下記に示すような標的部位１（配列番号２８）及び標的部位２（配列番号２９）で編集するためのプラスミドｐＲＦ８０１（配列番号２６）及びｐＲＦ８０６（配列番号２７）を構築した。
Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）のｓｅｒＡ１オープンリーディングフレーム（配列番号３０は、固有の標的部位である、リバース方向の標的部位１（配列番号２８）を含有する。標的部位は、リバース方向のプロトスペーサー隣接モチーフ（配列番号３１）に隣接して位置する：標的部位は、可変ターゲティングドメインをコードするＤＮＡ（配列番号３２）に変換することができる。ＶＴドメインをコードするＤＮＡ配列（配列番号３２）は、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼ認識ドメインをコードするＤＮＡ配列（ＣＥＲ、配列番号３３）に、細菌細胞のＲＮＡポリメラーゼにより転写される場合に標的部位１を標的とする機能的ｇＲＮＡ（配列番号３４）を生成するように、作動可能に融合する。３４）。ｇＲＮＡをコードするＤＮＡは、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種の細胞において作動可能なプロモーター（例えば、ｓｐａｃプロモーター；配列番号３５）、及びバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種の細胞において作動可能なターミネーター（例えば、ファージラムダのｔ０ターミネーター；配列番号３６）に、プロモーターがｇＲＮＡをコードするＤＮＡ（配列番号３３）の５’に位置し、ターミネーターがｇＲＮＡをコードするＤＮＡ（配列番号３３）の３’に位置するように作動可能に連結された。
Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）からの２つのホモロジーアームを増幅することにより、Ｃａｓ９／ｇＲＮＡ切断に応答してｓｅｒＡ１遺伝子を欠失させるポリヌクレオチド改変テンプレート（編集テンプレートとも呼ばれる）を作製した。第１の断片は、ｓｅｒＡ１オープンリーディングフレームのすぐ上流の５００ｂｐに対応する（配列番号３７）。この断片を、製造業者の説明書に従ってＱ５ ＤＮＡポリメラーゼを用い、下記の表４に記載したプライマーを用いて増幅した。プライマーは、第１の断片の３’末端に第２の断片の５’末端に相同の１８ｂｐを組み込み、第１の断片の５’末端にｐＲＦ６９４に相同の２０ｂｐを組み込む。
Figure 0007384801000006
第２の断片は、ｓｅｒＡ１オープンリーディングフレームの３’末端のすぐ下流の５００ｂｐに対応する（配列番号４０）。この断片を、製造業者の説明書に従ってＱ５ ＤＮＡポリメラーゼを用いて増幅し、プライマーを下記の表５に記載した。プライマーは、第２の断片の５’末端に第１の断片の３’末端に相同の２８ｂｐを組み込み、第２の断片の３’末端にｐＲＦ６９４に相同の２１ｂｐを組み込む。
Figure 0007384801000007
標的部位１ ｇＲＮＡ発現カセットをコードするＤＮＡ（配列番号４３）、第１のホモロジーアーム（配列番号３７）及び第２のホモロジーアーム（配列番号４０）を、標準の分子生物学的手法を用いて、ｐＲＦ６９４（配列番号２５）にアセンブルして、ｐＲＦ８０１（配列番号２６）の、Ｃａｓ９発現カセット（配列番号２）、ｓｅｒＡ１オープンリーディングフレーム内の標的部位１を標的とするｇＲＮＡをコードするｇＲＮＡ発現カセット（配列番号４３）、及び第１のホモロジーアーム（配列番号３７）及び第２のホモロジーアーム（配列番号４０）から構成される編集テンプレート（配列番号４４）を含有するＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）－Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）シャトルプラスミドを生成した。プラスミドを、表３に記載のオリゴを用いたサンガーシークエンシングによって検証した。
Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）のｒｇｈＲ１オープンリーディングフレーム（配列番号４５）は、リバース鎖に固有の標的部位、標的部位２（配列番号４６）を含有する。この標的部位は、リバース鎖のプロトスペーサー隣接モチーフ（配列番号４７の最後の３つの塩基）に隣接して位置する。この標的部位は、ガイドＲＮＡの可変ターゲティング（ＶＴ）ドメインをコードするＤＮＡ（配列番号４８）に変換することができる。ＶＴドメインをコードするＤＮＡ配列（配列番号４８）は、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼ認識ドメインをコードするＤＮＡ配列（ＣＥＲ、配列番号３３）に、細菌細胞のＲＮＡポリメラーゼにより転写される場合に標的部位２を標的とする機能的ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）（配列番号４９）を生成するように、作動可能に融合する。ｇＲＮＡをコードするＤＮＡは、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種の細胞において作動可能なプロモーター（例えば、Ｂ．キュティリス（Ｂ．ｃｕｔｉｌｉｓ）由来のｓｐａｃプロモーター；配列番号３５）、及びバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種の細胞において作動可能なターミネーター（例えば、ファージラムダのｔ０ターミネーター；配列番号３６）に、プロモーターがｇＲＮＡをコードするＤＮＡ（配列番号４３）の５’に位置し、ターミネーターがｇＲＮＡをコードするＤＮＡ（配列番号４３）の３’に位置するように作動可能に連結された。
Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）からの２つのホモロジーアームを増幅することにより、Ｃａｓ９／ｇＲＮＡ切断に応答してｒｇｈＲ１遺伝子を改変するポリヌクレオチド改変テンプレート（編集テンプレートとも呼ばれる）を作製した。第１の断片は、ｒｇｈＲ１オープンリーディングフレームのすぐ上流の５００ｂｐ（配列番号５０）に対応する。この断片を、製造業者の説明書に従ってＱ５ ＤＮＡポリメラーゼを用い、下記の表６に記載したプライマーを用いて増幅した。プライマーは、第１の断片の３’末端に第２の断片の５’末端に相同の２３ｂｐを組み込み、第１の断片の５’末端にｐＲＦ６９４に相同の２０ｂｐを組み込む。
Figure 0007384801000008
第２の断片は、ｒｇｈＲ１オープンリーディングフレームの３’末端のすぐ下流の５００ｂｐに対応する（配列番号５３）。この断片を、製造業者の説明書に従ってＱ５ ＤＮＡポリメラーゼを用い、下記の表７に記載したプライマーを用いて増幅した。プライマーは、第２の断片の５’末端に第１の断片の３’末端に相同の２０ｂｐを組み込み、第２の断片の３’末端にｐＲＦ６９４に相同の２１ｂｐを組み込む。
Figure 0007384801000009
標的部位２ ｇＲＮＡ発現カセット（配列番号）をコードするＤＮＡ（配列番号５６）、第１のホモロジーアーム（配列番号５０）及び第２のホモロジーアーム（配列番号５３）を、標準の分子生物学的手法を用いて、ｐＲＦ６９４（配列番号２５）にアセンブルして、ｐＲＦ８０６（配列番号２７）の、Ｃａｓ９発現カセット（配列番号２）、ｒｇｈＲ１オープンリーディングフレーム内の標的部位２を標的とするｇＲＮＡをコードするｇＲＮＡ発現カセット（配列番号５６）、及び第１のホモロジーアーム（配列番号５０）及び第２のホモロジーアーム（配列番号５３）から構成される編集テンプレート（配列番号５７）を含有するＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）－Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）シャトルプラスミドを生成した。プラスミドを、表３に記載のオリゴを用いたサンガーシークエンシングによって検証した。
実施例２
Ｃａｓ９ Ｙ１５５変異体の作製
本実施例では、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９のＹ１５５Ｈ変異体（本明細書では、Ｃａｓ９ Ｙ１５５Ｈ変異体と呼ぶ、配列番号５８）を、ｐＲＦ８０１プラスミド（配列番号２６）及びｐＲＦ８０６プラスミド（配列番号２７）において作製した。ｐＲＦ８０１プラスミド（配列番号２６）又はｐＲＦ８０６プラスミド（配列番号２７）にＣａｓ９ Ｙ１５５Ｈ変異体を導入するために、製造業者の説明書に従ってＱｕｉｋｃｈａｎｇｅ変異誘発キットを用い、また下記の表８中のオリゴを用い、テンプレートＤＮＡとしてｐＲＦ８０１（配列番号２６）又はｐＲＦ８０６（配列番号２７）を用いて、部位特異的変異誘発を実施した。
Figure 0007384801000010
反応により得られた生成物、ｐＲＦ８２７（配列番号６１）は、Ｃａｓ９ Ｙ１５５Ｈ変異体発現カセット（配列番号６２）、ｓｅｒＡ１オープンリーディングフレーム内の標的部位１を標的とするｇＲＮＡをコードするｇＲＮＡ発現カセット（配列番号４３）、並びに第１のホモロジーアーム（配列番号３７）及び第２のホモロジーアーム（配列番号４０）から構成される編集テンプレート（配列番号４４）を含有し、又はｐＲＦ８５６（配列番号６３）は、Ｃａｓ９ Ｙ１５５Ｈ変異体発現カセット（配列番号６２）、ｒｇｈＲ１オープンリーディングフレーム内の標的部位２を標的とするｇＲＮＡ発現カセット（配列番号５６）、並びに第１のホモロジーアーム（配列番号５０）及び第２のホモロジーアーム（配列番号５３）から構成される編集テンプレート（配列番号５７）を含有した。表３に示すシークエンシングプライマーを使用して、サンガー法によりプラスミドＤＮＡの配列を決定し、正しいアセンブリーを確認した。
他のＣａｓ９ Ｙ１５５変異体を、上記と同様の方法で作製した。Ｃａｓ９ Ｙ１５５Ｎ変異体を作製し、配列番号１２３（配列番号１２４によってコードされたアミノ酸配列）に示し、Ｃａｓ９ Ｙ１５５Ｅ変異体を作製し、配列番号１２５（配列番号１２６によってコードされたアミノ酸配列）に示し、Ｃａｓ９ Ｙ１５５Ｆ変異体を作製し、配列番号１２７（配列番号１２８によってコードされたアミノ酸配列）に示した。
実施例３
ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９のＹ１５５Ｈ変異体（Ｃａｓ９ Ｙ１５５Ｈ変異体）は、野生型ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９（ＷＴ Ｃａｓ９）と比較して、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞において、形質転換効率は増加し、ＤＮＡ編集効率は同等であるか又は増加する。
本実施例では、上述したプラスミドｐＲＦ６９４（配列番号２５）、ｐＲＦ８０１（配列番号２６）、ｐＲＦ８０６（配列番号２７）、ｐＲＦ８２７（配列番号６１）、及びｐＲＦ８５６（配列番号６３）を、製造業者の説明書に従って、ローリングサークル増幅（Ｓｙｇｎｉｓ）により１８時間増幅させた。このローリングサークル増幅プラスミドを、国際公開第２０１７／０７５１９５号パンフレット、国際公開第２００２／１４４９０号パンフレット及び国際公開第２００８／７９８９号パンフレットに一般的に記載されているように、ｐＢＬ．ｃｏｍＫプラスミド（配列番号６４）を含む（有する）コンピテント（親）Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞に形質転換した。細胞／ＤＮＡ形質転換混合物を、２０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含有し、１．５％寒天で固化させたＬ培地（Ｍｉｌｌｅｒレシピ）にプレーティングした。３７℃でコロニーを形成させた。カナマイシンを含むＬ寒天プレート上で増殖したコロニーを採取し、Ｌ寒天プレート上に画線し、回収した。ｐＲＦ８０１（配列番号２６）及びｐＲＦ８２７（配列番号６１）による形質転換からのコロニーを、Ｑ５ ＤＮＡポリメラーゼを製造業者の説明書に従って使用し、下記の表９に示すフォワード／リバースプライマー対を用いて、標的部位１遺伝子座（配列番号６５）を増幅することによって、編集のスクリーニングを行った。バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞におけるＷＴ及び編集された標的部位１遺伝子座は、増幅された遺伝子座の大きさに基づいて区別し得、ＷＴアンプリコン（配列番号６５）は編集されたアンプリコン（配列番号６６）より大きい。
Figure 0007384801000011
プラスミドｐＲＦ８０６（配列番号２７）又はプラスミドｐＲＦ８５６（配列番号６３）による形質転換からのコロニーを、Ｑ５ ＤＮＡポリメラーゼを製造業者の説明書に従って使用し、下記の表１０に示すフォワード／リバースプライマー対を用いて、標的部位２遺伝子座（配列番号６９）を増幅することによって、編集効率の分析を行った。ＷＴ標的部位２遺伝子座（配列番号６９）及び編集された標的部位２遺伝子座（配列番号７０）は、編集された遺伝子座（配列番号７０）の大きさに基づいて区別することができ、ＷＴアプリコン（配列番号６９）はより大きい。
Figure 0007384801000012
プラスミドに選択的な培地（２０μｇ・ｍｌ－１を含むＬ寒天培地）で得られた形質転換体の数を表１１に示す。形質転換効率は、特定のｇＲＮＡ及び編集テンプレートを有する所与のＣａｓ９変異体から得られた形質転換体の数と、同じｇＲＮＡ発現カセット及び編集テンプレートを有する親（ＷＴ）Ｃａｓ９からの形質転換体の数との比である。結果を表１１に示すが、これはＣａｓ９ Ｙ１５５Ｈ変異体がＣａｓ９変異体（プラスミドによって送達される）の形質転換効率を少なくとも８４～４０２倍増加させたことを示している。
Figure 0007384801000013
表１１に示す結果は、Ｃａｓ９ Ｙ１５５Ｈ変異体がＷＴ Ｃａｓ９のＤＮＡ編集効率と少なくとも同等であるか、又は少なくとも２．３倍（又は２３０％）大きい編集効率を有することを示している。
実施例４
Ｃａｓ９ Ｆ８６Ａ－Ｆ９８Ａ変異体の構築。
本実施例では、Ｃａｓ９ Ｆ８６Ａ－Ｆ９８Ａ変異体のＢ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）における形質転換効率及び編集頻度を試験するために、Ｃａｓ９ Ｆ８６Ａ－Ｆ９８Ａ変異体（配列番号１２９）をｐＲＦ８０１プラスミド（配列番号２６）を骨格として構築した。
Ｆ８６Ａ及びＦ９８Ａ（配列番号１３０）を含むＣａｓ９の一部を含有する合成断片を外部の供給業者から入手した。ｐＲＦ８０１の骨格（配列番号１３１）を、表１２に示すオリゴを使用し、標準のＰＳＲ手法を用いて増幅させた。
Figure 0007384801000014
合成断片（配列番号１３０）を、表１３に示すオリゴを使用し、標準のＰＣＲ手法を用いて増幅させた
Figure 0007384801000015
ｐＲＦ８０１骨格断片（配列番号１３１）を、標準の分子生物学的手法技術を用いて、Ｆ８６Ａ－Ｆ９８Ａ合成断片によりアセンブルして、プラスミドｐＲＦ８６６（配列番号１３７）を作製した。ｐＲＦ８６６は、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）のためのＦ８６Ａ Ｆ９８Ａ Ｃａｓ９発現カセット（配列番号１３６）、ｓｅｒＡ１ ｔｓ１を標的とするｇＲＮＡ用の発現カセットをコードするＤＮＡ（配列番号４３）及びｓｅｒＡ１欠失編集テンプレート（配列番号４４）を含有する。
プラスミドｐＲＦ８６６をＢ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞に形質転換した。
実施例５
Ｆ８６における第１のアミノ酸置換及びＦ９８における第２のアミノ酸置換を含むストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）のＣａｓ９変異体は、その親（野生型）ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９（ＷＴ Ｃａｓ９）と比較して、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞における形質転換効率は増加し、ＤＮＡ編集効率は同等である。
Ｆ８６における第１のアミノ酸置換（Ｆ８６Ａなど）及びＦ９８における第２のアミノ酸置換（Ｆ９８Ａなど）を含むストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）のＣａｓ９変異体（Ｃａｓ９Ｆ８６－Ｆ９８変異体と呼ぶ）（ここで、変異体のアミノ酸位置は、配列番号１に示す親Ｃａｓ９ポリペプチドのアミノ酸配列（ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）ＷＴ Ｃａｓ９）と対応させて番号付けされている）を、実施例４に記載のように作製した。形質転換効率及び編集効率を実施例３に記載のように分析し、表１４に示した。
Figure 0007384801000016
表１４は明らかに、Ｃａｓ９ Ｆ８６－Ｆ９８Ａ変異体が、ＷＴ Ｃａｓ９と比較して、形質転換効率を２４８倍（又は２４，８００％）増加させたことを示している。編集プラスミドで形質転換されたコロニーを、所望の編集を含むスクリーニングされたコロニーのパーセンテージを決定することによって、編集効率について実施例３に記載されるようにスクリーニングした。表１４に示す結果は、Ｃａｓ９ Ｆ８６Ａ－Ｆ９８Ａ変異体がＷＴ Ｃａｓ９と同等の編集効率を有することを示している。
実施例６
エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）Ｃａｓ９ベクターの構築
本実施例では、エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）（Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ））におけるゲノム編集のためのガイド性Ｃａｓ９発現ベクターを構築した。インデューサーに応答したＣａｓ９発現を確認した。
ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｍ１ ＧＡＳ ＳＦ３７０）のＣａｓ９タンパク質（配列番号１）を、当該技術分野で知られる標準の手法に従ってコドン最適化した（配列番号７３）。Ｃａｓ９タンパク質を細胞の核に局在化させるために、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）単節型（ＭＡＰＫＫＫＲＫＶ、配列番号７４）核局在化シグナルを、Ｃａｓ９オープンリーディングフレームのカルボキシ末端に組み込んだ。ヤロウイア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）コドン最適化Ｃａｓ９遺伝子を、ヤロウイア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）構成的プロモーターＦＢＡ１（配列番号７５）に、標準的な分子生物学的手法により融合させた。構成的ＦＢＡプロモーター、ヤロウイア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）コドン最適化Ｃａｓ９、及びＳＶ４０核局在化シグナルを含むヤロウイア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）コドン最適化Ｃａｓ９発現カセット（配列番号７６）の例。Ｃａｓ９発現カセットをプラスミドｐＺｕｆにクローニングし、この新しいコンストラクトをｐＺｕｆＣａｓ９（配列番号７７）と称した。
ヤロウイア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）コドン最適化Ｃａｓ９－ＳＶ４０融合遺伝子（配列番号７８）を、ｐＺｕｆＣａｓ９から、標準的な分子生物学的手法により、下記の表１５に示すプライマーを用いて増幅させた。
Figure 0007384801000017
表１２のプライマーは、融合体に５’ＥｃｏＲＩ部位及び３’ＨｉｎｄＩＩＩ部位を付加した。ＰＣＲ産物（配列番号８１）を標準的な手法を用いて精製した。精製した断片を、ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓからのｐＢＡＤ／ＨｉｓＢ（配列番号８２）のＥｃｏＲＩ部位及びＨｉｎｄＩＩＩ部位にクローニングして、ｐＲＦ４８（配列番号８３）を作製した。
Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｃａｓ９発現カセット（配列番号８４）を低コピープラスミドｐＫＯ３（配列番号８５）に挿入して、Ｃａｓ９発現カセットを含有する低コピーＥ，コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）プラスミドのｐＲＦ９７（配列番号８６）を作製した。
実施例７
Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｃａｓ９プラスミドにおけるＣａｓ９ Ｙ１５５Ｈ変異体の作製
本実施例では、Ｃａｓ９ Ｙ１５５Ｈ変異体を、ｐＲＦ９７（配列番号８６）にコードされたＣａｓ９タンパク質に導入した。
ｐＲＦ９７由来のＣａｓ９タンパク質の一部をコードするが、Ｙ１５５Ｈ変異体（配列番号８７）をコードする置換を含む合成ＤＮＡ断片を生成した。この合成断片を、標準的なＰＣＲ条件、及び表１６に記載のプライマーを使用して増幅した。
Figure 0007384801000018
Ｙ１５５Ｈ合成断片（配列番号８７）を挿入させるために、標準的なＰＣＲ手法及び下記の表１７に示したプライマーを用いてｐＲＦ９７プラスミド（配列番号８６）を増幅させて、ｐＲＦ９７－Ｙ１５５Ｈ断片（配列番号９０）を生成した。
Figure 0007384801000019
Ｙ１５５Ｈ合成断片（配列番号８７）及びｐＲＦ９７－Ｙ１５５Ｈ断片（配列番号９０）を組み合わせて、 Ｃａｓ９ Ｙ１５５Ｈ変異体のためのＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）発現カセットを含む低コピープラスミドのｐＲＦ８６１（配列番号９３）を作製した。
実施例８
ＷＴ Ｃａｓ９及びＣａｓ９ Ｙ１５５Ｈ変異体を用いたＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）の窒素同化制御遺伝子の欠失。
本実施例では、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）の窒素同化制御遺伝子をコードするｎａｃ遺伝子を、ＷＴ Ｃａｓ９又はＣａｓ９ Ｙ１５５Ｈ変異体を用いて欠失させた。
Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｎａｃ遺伝子（配列番号９４）は、２つの標的部位、すなわち、標的部位１（配列番号９５）及びＰＡＭ（配列番号９６の最後の３塩基）と、標的部位２（配列番号９７）及びＰＡＭ（配列番号９８の最後の３塩基）とを含む。実施例１に記載のように、ＣＥＲドメイン（配列番号３３）をコードするＤＮＡを、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）に活性なプロモーター（例えば、Ｎ２５ファージプロモーター（配列番号９９）を標的部位の５’末端に作動可能に融合し、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）に活性なターミネーター（例えば、ラムダファージｔ０ターミネーター（配列番号３６）をＣＥＲドメインの３’末端に作動可能に融合する標的部位をコードするＤＮＡの３’末端に付加することによって、作動可能なｇＲＮＡ発現カセットをｎａｃ部位１（配列番号１００）及びｎａｃ部位２（配列番号１０１）のために作ることができる。 Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）は主に相同組み換え修復によってＤＮＡを修復し、効率的なＣａｓ９媒介編集には編集テンプレートを必要とする。
ｎａｃ開始コドンの上流４９１ｂｐ及び最初の３つのコドン（配列番号１０２）を、ｎａｃ終止コドンの下流４９１ｂｐ及びｎａｃオープンリーディングフレームの最後の３つのコドン（配列番号１０３）に作動可能に連結して、ｎａｃオープンリーディングフレームの最初の３つのコドン及び最後の３つのコドンを除く全てを欠失する編集テンプレート（配列番号１０４）を作製した。
部位１ｇＲＮＡ発現カセット（配列番号１００）又は部位２ｇＲＮＡ発現カセット（配列番号１０２）をｎａｃ欠失編集テンプレート（配列番号１０４）に、 ５’末端でｐＲＦ９７（配列番号８６）及びｐＲＦ８６１（配列番号９３）と同一の２０ｂｐ（配列番号１０５）と共に、３’末端でｐＲＦ９７（配列番号８６）及びｐＲＦ８６１（配列番号９３）と同一の２１ｂｐ（配列番号１０６）と共に、作動可能に連結し、 ｎａｃＥＴ部位１（配列番号１０７）及びｎａｃＥＴ部位２（配列番号１０８）合成ＤＮＡ断片として入手した。
ｐＲＦ９７（配列番号８６）又はｐＲＦ８６１（配列番号９３）を、標準的な分子生物学的手法及び下記の表１８に示したプライマーを用いて増幅させて、線状断片ｐＲＦ９７カセット（配列番号１０９）又はｐＲＦ８６１カセット（配列番号１１０）を作製した。
Figure 0007384801000020
ｐＲＦ９７カセット（配列番号１０９）又はｐＲＦ８６１カセット（配列番号１１０）を、ｎａｃＥＴ部位１（配列番号１０７）又はｎａｃＥＴ部位１（配列番号１０８）と、標準的な分子生物学的手法を用いてアセンブルして、ｐＲＦ９７／ｎａｃＥＴ部位１（配列番号１１３）、ｐＲＦ９７／ｎａｃＥＴ部位２（配列番号１１４）、ｐＲＦ８６１／ｎａｃＥＴ部位１（配列番号１１５）、及びｐＲＦ８６１／ｎａｃＥＴ部位２（配列番号１１６）を作製した。
ＭＧ１６５５ Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞を、以前に記載されたようにして（分子生物学におけるショートプロトコール）エレクトロコンピテントとして、１μｌのｐＲＦ９７／ｎａｃＥＴ部位１（配列番号１１３）、ｐＲＦ９７／ｎａｃＥＴ部位２（配列番号１１４）、ｐＲＦ８６１／ｎａｃＥＴ部位１（配列番号１１５）、又はｐＲＦ８６１／ｎａｃＥＴ部位２（配列番号１１６）で形質転換した。細胞を、２５μｇ・ｍｌ－１クロラムフェニコール及び０．１％ｗ・ｖ－１Ｌ－アラビノース（Ｃａｓ９発現を誘発するため）を含む１．５％ｗ・ｖ－１寒天で固化したＬ培地にプレーティングした。形質転換からのコロニーを、３０℃で２４時間増殖させた後に計数した。
コロニーが編集された対立遺伝子を含むかどうかを決定するために、各形質転換から最大８個のコロニーを、ＷＴ ｎａｃ遺伝子座（配列番号１１７）又は編集されたｎａｃ遺伝子座（配列番号１１８）の存在についてＰＣＲにより、標準的な手法及び下記の表１９に示すプライマーを用いてＰＣＲ増幅させることによって、スクリーニングした。
Figure 0007384801000021
ＷＴ ｎａｃ遺伝子座（配列番号１１７）より小さい編集されたｎａｃ遺伝子座（配列番号１１８）に対応する増幅産物を与えたコロニーを編集されたコロニーとして計数し、編集頻度を算出した。 編集頻度は、ＰＣＲからの編集されたｎａｃ遺伝子座（配列番号１１８）の存在を示したスクリーニングされた細胞のパーセンテージである。表２０の結果は、編集頻度及び形質転換効率（形質転換体／形質転換体ＷＴ Ｃａｓ９）を示す。
Figure 0007384801000022
表２０は、Ｃａｓ９ Ｙ１５５Ｈ変異体がＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）において作動可能であることを明確に示し、ＷＴ Ｃａｓ９編集頻度と比較して、編集効率が少なくとも１５％～５９％が増加したことを示している。
実施例９
サッカロマイセス・セレビシエ（ＳＡＣＣＨＡＲＯＭＹＣＥＳ ＣＥＲＥＶＩＳＩＡＥ）染色体ＵＲＡ３遺伝子欠失を編集するＣＡＳ９－ｇＲＮＡベクターの構築
サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）染色体ＵＲＡ３遺伝子欠失を編集するＣａｓ９ Ｙ１５５Ｈ変異体対Ｃａｓ９野生型（ｗｔ）の形質転換及び編集効率を試験するために、選択マーカーとしてＧ－４１８耐性遺伝子（ＫａｎＭＸ）を有するＣａｓ９ Ｙ１５５Ｈ－ｇＲＮＡ及びＣａｓ９ｗｔ－ｇＲＮＡ発現プラスミドを以下に記載するように作製する。
Ｎ末端核局在化配列（ＮＬＳ、「ＡＰＫＫＫＲＫＶ」、配列番号３）、Ｃ末端ＮＬＳ（「ＫＫＫＫＬＫ」、配列番号４）、及びデカヒスチジンタグ（「ＨＨＨＨＨＨＨＨＨＨ」、配列番号５）を含む、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）由来のＣａｓ９野生型タンパク質（配列番号１）をコードする合成ポリヌクレオチドを含有する断片Ａ（Ｃａｓ９ ｗｔ）を、ｐＲＦ６９４プラスミド（配列番号２５）から、製造業者の説明書に従ってＱ５ ＤＮＡポリメラーゼ（ＮＥＢ）を使用し、下記の表２１に示すフォワード／リバースプライマー対を用いて増幅させる。Ｎ末端核局在化配列、Ｃ末端ＮＬＳ及びデカヒスチジンタグを含む、Ｃａｓ９ Ｙ１１５Ｈ変異体（配列番号５８）をコードする合成ポリヌクレオチドを含有する断片Ａ’（Ｃａｓ９ Ｙ１１５Ｈ）を、ｐＲＦ８２７プラスミド（配列番号 ６１）から、製造業者の説明書に従ってＱ５ ＤＮＡポリメラーゼ（ＮＥＢ）を使用し、下記の表２１に示すフォワード（配列番号１３８）／リバース（配列番号１３８）プライマー対を用いて増幅させる。
Figure 0007384801000023
ＲＮＲ２ｐプロモーター（配列番号１４０）、２－ミクロン複製起点１（配列番号１４１）、ＫａｎＭＸ発現カセット（配列番号１４２）、及びＳＮＲ５２ｐプロモーター（配列番号１４３）を含む断片Ｂ（Ｃａｓ９ ｗｔ）を、ｐＳＥ０８７プラスミド（配列番号１４４）から、製造業者の説明書に従ってＱ５ ＤＮＡポリメラーゼ（ＮＥＢ）を使用し、下記の表２２に示すフォワード（配列番号１４５）／リバース（配列番号１４６）プライマー対を用いて増幅させる。
Figure 0007384801000024
ｐＳＥ０８７プラスミドは、異種ＫａｎＭＸ発現カセットを有する２μシャトルベクターである。このプラスミドは、ＲＮＲ２プロモーターの制御下にあるＳ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）由来のｃａｓ９遺伝子、標的ｓｇＲＮＡ＋Ｔ（６）ターミネーター（配列番号１４７）を含むスタッファー断片の上流にあるＳＮＲ５２プロモーターを含む。１４７）。ｓｇＲＮＡは、ＢｓｍＢＩによるプラスミドの線状化がｓｇＲＮＡスタッファーを放出し、消化されたプラスミドに不適合なオーバーハングを残すように配向されたＢｓｍＢＩ結合部位に隣接する。
５０ｂｐ上流ホモロジーアームの合成ポリヌクレオチド（配列番号１４８）、ＵＲＡ３標的ｓｇＲＮＡ＋Ｔ（６）ターミネーター（配列番号 １４９）及び下流の５０ｂｐ（配列番号１５０）を含む断片Ｃを、製造業者の説明書に従ってＱ５ ＤＮＡポリメラーゼ（ＮＥＢ）を使用し、下記の表２３に示すフォワード（配列番号１５１）／リバース（配列番号１５２）プライマー対を用いて増幅させる。
Figure 0007384801000025
２－ミクロン複製起点２（配列番号１５３）、アンピシリン耐性遺伝子（配列番号１５４）及びＲＮＲ２ターミネーター（配列番号１５５）を含む断片Ｄを、ｐＳＥ０８７プラスミドから、製造業者の説明書に従ってＱ５ ＤＮＡポリメラーゼ（ＮＥＢ）を使用し、下記の表２４に示すフォワード（配列番号１５６）／リバース（配列番号１５７）プライマー対を用いて増幅させる。
Figure 0007384801000026
ＰＣＲ断片を、Ｑｉａｇｅｎ ＰＣＲ精製キット（ＱＩＡＧＥＮ，Ｉｎｃ）を製造業者の説明書に従って使用して精製する。続いて、ＰＣＲ断片を、以下のプロトコールに従って、酵母におけるギャップ修復によって、２ミクロンプラスミドバック骨格にアセンブルする。
Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ｕｒａ３Δコンピテント細胞を、Ｆｒｏｚｅｎ－ＥＺ Ｙｅａｓｔ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ＩＩ（商標）キット（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｉｎｃ）を製造業者の説明書に従って使用して調製する。５０μｌのＳ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ｕｒａ３Δコンピテント細胞を、断片Ａ、Ｂ、Ｃ、及びＤの各ＰＣＲ産物の０．１～０．２μｇのＤＮＡと混合して、ｐＷＳ５７２（Ｃａｓ９ ｗｔ）を作製する。５０μｌのＳ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ｕｒａ３Δコンピテント細胞を、断片Ａ’、Ｂ、Ｃ、及びＤの各ＰＣＲ産物の０．１～０．２μｇのＤＮＡと混合して、ｐＷＳ５７３（Ｃａｓ９ Ｙ１１５Ｈ）を作製する。キットから提供される５００μｌのＥＺ ３溶液を添加し、完全に混合する。混合物を３０℃で４５分間インキュベートした後、５０～１５０μｌの形質転換混合物を、２００ｕｇ／ｍｌのＧｅｎｅｔｉｃｉｎ（Ｇ４１８）抗生物質を補充したＹＰＤ培地プレート上に広げる。プレートを３０℃で２～４日間インキュベートして、形質転換体を増殖させた。
得られたプラスミドｐＷＳ５７２（Ｃａｓ９ｗｔ）及びｐＷＳ５７３（Ｃａｓ９Ｙ１５５Ｈ）を、ＣｈａｒｇｅＳｗｉｔｃｈ（登録商標）プラスミド酵母ミニキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｉｎｃ）を使用して、２００ｕｇ／ｍｌのＧｅｎｅｔｉｃｉｎ（Ｇ４１８）抗生物質を補充したＹＰＤ培地中で増殖させた１ｍｌの形質転換体から調製する。
実施例１０
ＰＷＳ５７２（ＣＡＳ９ ＷＴ）及びＰＷＳ５７３（ＣＡＳ９ Ｙ１５５Ｈ）に使用によるサッカロマイセス・セレビシエ（ＳＡＣＣＨＡＲＯＭＹＣＥＳ ＣＥＲＥＶＩＳＩＡＥ）染色体ＵＲＡ３遺伝子の欠失
本実施例では、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）染色体ＵＲＡ３遺伝子欠失に対するｐＷＳ５７３（Ｃａｓ９ Ｙ１５５Ｈ）対ｐＷＳ５７２（Ｃａｓ９ ｗｔ）の形質転換効率及び編集効率を比較する。Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）野生型コンピテント細胞を、Ｆｒｏｚｅｎ－ＥＺ Ｙｅａｓｔ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ＩＩ（商標）キット（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｉｎｃ）を製造業者の説明書に従って使用して調製し、ｐＷＳ５７３（Ｃａｓ９ Ｙ１５５Ｈ）及びｐＷＳ５７２（Ｃａｓ９ ｗｔ）のプラスミドＤＮＡ１００ｎｇで別々に形質転換する。５０～１５０μｌの形質転換混合物を、２００ｕｇ／ｍｌのＧｅｎｅｔｉｃｉｎ（Ｇ４１８）抗生物質を補充したＹＰＤ培地プレート上に広げる。プレートを３０℃で２～４日間インキュベートして、形質転換体を増殖させた。正しいｕｒａ３Δコロニーを、２ｇ／Ｌのグルコースを補充した完全合成培地（アミノ酸を含まない１×酵母窒素塩基、ウラシルを含まない１×アミノ酸混合物）に形質転換体を画線し、３０℃で２～４日間細胞をインキュベートして、形質転換体を増殖させることにより、潜伏させることにより、ウラシル要求性についてスクリーニングする。ＵＲＡ３遺伝子の欠失を、ＵＲＡ３標的領域のフランキングプライマーを用いるＰＣＲ及び配列決定によって確認する。各プラスミドの編集頻度を、ｕｒａ３Δコロニーの数を試験したコロニーの総数で除すことによって決定する。

Claims (24)

  1. 配列番号１に記載の親Ｃａｓ９ポリペプチドと少なくとも９０％のアミノ酸同一性を有し、且つ８６位、９８位、１５５位、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される位置に少なくとも１つのアミノ酸置換を有する、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼ変異体又はその活性断片であって、前記変異体のアミノ酸位置は、前記親Ｃａｓ９ポリペプチドのアミノ酸配列と対応させて番号付けされ、前記Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼ変異体はエンドヌクレアーゼ活性を有するとともに、前記少なくとも１つのアミノ酸置換はＦ８６Ａ（８６位において）及びＦ９８Ａ（９８位において）であり、前記Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼ変異体は、前記親Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼと比較して、バチルス属の微生物での改善された形質転換効率及び改善された編集効率からなる群から選択される少なくとも１つの改善された特性を有する、
    Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼ変異体又はその活性断片。
  2. 前記変異体は、配列番号１の前記アミノ酸配列に対し９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のＣａｓ９エンドヌクレアーゼ変異体又はその活性断片。
  3. 前記特性の改善はバチルス属の微生物での形質転換効率の改善であり、且つ、前記変異体又はその活性断片はバチルス属の微生物での編集効率の改善も有する、請求項１に記載のＣａｓ９エンドヌクレアーゼ変異体。
  4. 前記親Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼと比較して、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個のアミノ酸置換を含む、請求項１～３のいずれか一項に記載のＣａｓ９エンドヌクレアーゼ変異体又はその活性断片。
  5. 請求項１～４のいずれか一項に記載のＣａｓ９エンドヌクレアーゼ又はその機能的断片を含む組成物。
  6. 前記組成物は、ガイドポリヌクレオチド／Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼ複合体、ガイドＲＮＡ／Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼ複合体、及び前記Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼ変異体を含む融合タンパク質からなる群から選択される、請求項５に記載の組成物。
  7. 請求項１～４のいずれか一項に記載のＣａｓ９エンドヌクレアーゼ変異体をコードする核酸配列を含むポリヌクレオチド。
  8. 少なくとも１つのガイドポリヌクレオチドと、少なくとも１つの請求項１～４のいずれか一項に記載のＣａｓ９エンドヌクレアーゼ変異体とを含むガイドポリヌクレオチド／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ複合体（ＰＧＥＮ）であって、前記ガイドポリヌクレオチドは天然に存在しないキメラガイドポリヌクレオチドであり、前記ガイドポリヌクレオチド／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ複合体は標的配列の全部又は一部を認識し、結合し、ニッキング、ほどき、又は切断を行うことができるガイドポリヌクレオチド／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ複合体（ＰＧＥＮ）。
  9. 請求項７に記載のポリヌクレオチドを含む組み換えＤＮＡコンストラクト。
  10. 請求項１～４のいずれか一項に記載のＣａｓ９エンドヌクレアーゼ又はその機能的断片を含む宿主細胞。
  11. 請求項７に記載のポリヌクレオチドを含む宿主細胞。
  12. 前記細胞は原核細胞又は真核細胞である、請求項１１に記載の宿主細胞。
  13. 前記細胞は、ヒト、非ヒト、動物、細菌、真菌、昆虫、酵母、非従来型酵母及び植物細胞からなる群から選択される、請求項１２に記載の宿主細胞。
  14. バチルス属細胞のゲノム中の標的部位を改変する方法であって、少なくとも１つの請求項８に記載のＰＧＥＮをバチルス属細胞に導入すること、及び前記標的に改変を有する少なくとも１つのバチルス属細胞を同定することを含み、前記標的部位の改変は、（ｉ）少なくとも１つのヌクレオチドの置換、（ｉｉ）少なくとも１つのヌクレオチドの欠失、（ｉｉｉ）少なくとも１つのヌクレオチドの挿入、及び（ｉｖ）（ｉ）～（ｉｉｉ）の任意の組み合わせからなる群から選択される方法。
  15. バチルス属細胞のゲノム中のヌクレオチド配列を編集する方法であって、少なくとも１つの請求項８に記載のＰＧＥＮ、及びポリヌクレオチド改変テンプレートに導入することを含み、前記ポリヌクレオチド改変テンプレートは前記ヌクレオチド配列の少なくとも１つのヌクレオチド改変を含む方法。
  16. 前記編集されたヌクレオチド配列を含む少なくとも１つのバチルス属細胞を選択することをさらに含む、請求項１５に記載の方法。
  17. バチルス属細胞のゲノム中の標的部位を改変する方法であって、少なくとも１つの請求項８に記載のＰＧＥＮ、及び少なくとも１つのドナーＤＮＡをバチルス属細胞に導入することを含み、前記ドナーＤＮＡは目的ポリヌクレオチドを含む方法。
  18. 前記標的部位又は前記標的部位の近傍に前記目的ポリヌクレオチドが組み込まれた少なくとも１つのバチルス属細胞を同定することをさらに含む、請求項１７に記載の方法。
  19. 前記ＰＧＥＮは、予め組み立てられたポリヌクレオチド－タンパク質複合体として前記バチルス属細胞に導入される、請求項１４～１８のいずれか一項に記載の方法。
  20. 前記ガイドポリヌクレオチド／ＣａｓエンドヌクレアーゼはガイドＲＮＡ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼである、請求項１４～１８のいずれか一項に記載の方法。
  21. 前記ガイドＲＮＡ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ複合体は、リボヌクレオチド－タンパク質複合体として前記バチルス属細胞に導入される前に、インビトロで組み立てられる、請求項１９に記載の方法。
  22. バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞のゲノムを改変する方法であって、
    改変されるべき少なくとも１つの標的配列を含むバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞に、少なくとも１つの非天然ガイドＲＮＡ、及び少なくとも１つの請求項１～４のいずれか一項に記載のＣａｓ９エンドヌクレアーゼ変異体を提供すること（ここで、前記ガイドＲＮＡ及びＣａｓ９エンドヌクレアーゼ変異体は複合体（ＰＧＥＮ）を形成することができ、前記複合体は前記少なくとも１つの標的配列の全部又は一部を認識し、結合し、ニッキング、ほどき、又は切断を行うことができる）、並びに
    少なくとも１つのバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞を同定すること（ここで、前記少なくとも１つのゲノム標的配列は改変されている）
    を含む方法。
  23. 前記標的配列の改変は、（ｉ）少なくとも１つのヌクレオチドの置換、（ｉｉ）少なくとも１つのヌクレオチドの欠失、（ｉｉｉ）少なくとも１つのヌクレオチドの挿入、及び（ｉｖ）（ｉ）～（ｉｉｉ）の任意の組み合わせからなる群から選択される、請求項２２に記載の方法。
  24. 前記バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞は、バチルス・アルカロフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｌｋａｌｏｐｈｉｌｕｓ）、バチルス・アルティチュジニス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｌｔｉｔｕｄｉｎｉｓ）、バチルス・アミロリケファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、Ｂ．アミロリケファシエンス亜種プランタラム（Ｂ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ ｓｕｂｓｐ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ）、バチルス・ブレビス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ）、バチルス・サークランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）、バチルス・クラウシー（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｌａｕｓｉｉ）、バチルス・コアグランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏａｇｕｌａｎｓ）、バチルス・フィルムス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｉｒｍｕｓ）、バチルス・ラウツス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌａｕｔｕｓ）、バチルス・レンツス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｅｎｔｕｓ）、バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、バチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）、バチスル・メチロトロフィカス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｔｈｙｌｏｔｒｏｐｈｉｃｕｓ）、バチルス・プミルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｕｍｉｌｕｓ）、バチルス・サフェンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｆｅｎｓｉｓ）、バチルス・ステアロサーモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕ
    ｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、バチルス・サブティルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、及びバチルス・チューリンギエンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）からなるバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種の群から選択される、請求項２２または２３に記載の方法。

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