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ES2697327T3 - Compuesto intermedio para la preparación de conjugados que comprenden derivados de auristatina y un enlazador - Google Patents

Compuesto intermedio para la preparación de conjugados que comprenden derivados de auristatina y un enlazador Download PDF

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ES2697327T3
ES2697327T3 ES16184693T ES16184693T ES2697327T3 ES 2697327 T3 ES2697327 T3 ES 2697327T3 ES 16184693 T ES16184693 T ES 16184693T ES 16184693 T ES16184693 T ES 16184693T ES 2697327 T3 ES2697327 T3 ES 2697327T3
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ES
Spain
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alkyl
antibody
carbocycle
heterocycle
cancer
Prior art date
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Expired - Lifetime
Application number
ES16184693T
Other languages
English (en)
Inventor
Svetlana O Doronina
Peter D Senter
Brian E Toki
Allen J Ebens
Toni Beth Kline
Paul Polakis
Mark X Sliwkowski
Susan D Spencer
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Seagen Inc
Original Assignee
Seattle Genetics Inc
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Publication date
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Application filed by Seattle Genetics Inc filed Critical Seattle Genetics Inc
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Abstract

Un conjugado que tiene la fórmula: LU-DF o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en la que: LU- es una Unidad enlazadora que comprende un grupo funcional capaz de unirse a un ligando o a un anticuerpo, y DF es un grupo que tiene la siguiente fórmula: **Fórmula** en la que: independientemente en cada localización: R2 se selecciona entre H y alquilo C1-C8; R3 se selecciona de H, alquilo C1-C8, carbociclo C3-C8, arilo, alquilarilo C1-C8, alquil C1-C8-(carbociclo C3-C8), heterociclo C3-C8 y alquil C1-C8-(heterociclo C3-C8); R4 se selecciona de H, alquilo C1-C8, carbociclo C3-C8, arilo, alquilarilo C1-C8, alquil C1-C8-(carbociclo C3-C8), heterociclo C3-C8 y alquil C1-C8-(heterociclo C3-C8); R5 se selecciona entre H y metilo; o: R4 y R5 forman conjuntamente un anillo carbocíclico que tiene la fórmula -(CRaRb)n-, en la que Ra y Rb se seleccionan de forma independiente de H, alquilo C1-C8 y carbociclo C3-C8 y n se selecciona entre 2, 3, 4, 5 y 6; R6 se selecciona entre H y alquilo C1-C8; R7 se selecciona de H, alquilo C1-C8, carbociclo C3-C8, arilo, alquilarilo C1-C8, alquil C1-C8-(carbociclo C3-C8), 3 heterociclo C3-C8 y alquil C1-C8-(heterociclo C3-C8); cada R8 se selecciona independientemente entre H, OH, alquilo C1-C8, carbociclo C3-C8 y O-(alquilo C1-C8); R9 se selecciona entre H y alquilo C1-C8; R10 se selecciona entre arilo y heterociclo C3-C8; Z es O, S, NH o NR12, en donde R12 es alquilo C1-C8; R11 se selecciona entre H, alquilo C1-C20, -(R13O)m-R14 y -(R13O)m-CH(R15)2; m es un número entero comprendido de 1 a 1000; R13 es alquilo C2-C8; R14 es H o alquilo C1-C8; cada aparición de R15 es independientemente H, COOH, -(CH2)n-N(R16)2, -(CH2)n- SO3H o -(CH2)n-SO3- alquilo C1-C8; cada aparición de R16 es independientemente H, alquilo C1-C8 o -(CH2)n-COOH; y n es un número entero comprendido entre 0 y 6.

Description

DESCRIPCIÓN
Compuesto intermedio para la preparación de conjugados que comprenden derivados de auristatina y un enlazador.
1. Campo de la invención
La presente invención se dirige a conjugados de anticuerpo-fármaco, a las composiciones que incluyen los mismos, y a los métodos para usar los mismos para tratar el cáncer, una enfermedad autoinmunitaria o una enfermedad infecciosa. También se describen en el presente documento métodos para usar compuestos conjugados de anticuerpo-fármaco para el diagnóstico o tratamiento in vitro, in situ, e in vivo de células de mamífero, o dolencias patológicas asociadas.
2. Antecedentes de la invención
La mejora de la administración de fármacos y otros agentes a células diana, tejidos y tumores para conseguir la máxima eficacia y la mínima toxicidad ha sido el centro de una considerable investigación durante muchos años. Aunque se han realizado muchos intentos para desarrollar métodos eficaces para importar moléculas biológicamente activas al interior de células, tanto in vivo como in vitro, ninguno ha demostrado se completamente satisfactorio. La optimización de la asociación del fármaco con su diana intracelular, a la vez que se minimiza la redistribución intercelular del fármaco, por ejemplo, a las células vecinas, frecuentemente es difícil o ineficaz.
La mayoría de los agentes actualmente administrados a un paciente por vía parenteral no están dirigidos, dando como resultado una administración sistémica del agente a células y tejidos del cuerpo donde no es necesario, y frecuentemente es indeseable. Esto puede dar como resultado efectos secundarios adversos del fármaco, y que frecuentemente limitan la dosis de fármaco (por ejemplo, agentes quimioterapéuticos (antineoplásicos), citotóxicos, agentes inhibidores de enzimas y fármacos antivíricos o antimicrobianos) que se puede administrar. En comparación, aunque la administración oral de fármacos se considera una forma cómoda y económica de administración, comparte los mismos problemas de toxicidad no específica a células no afectadas una vez que el fármaco se ha absorbido en la circulación sistémica. Otras complicaciones implican problemas de biodisponibilidad oral y de residencia del fármaco en el intestino, lo que produce una exposición adicional del intestino al fármaco y, por tanto, un riesgo de toxicidad intestinal. En consecuencia, una meta importante ha sido desarrollar métodos para dirigir específicamente agentes a células y tejidos. Los beneficios de dicho tratamiento incluyen evitar los efectos fisiológicos generales de la administración inadecuada de dichos agentes a otras células y tejidos, tales como células no infectadas. El direccionamiento intracelular se puede conseguir con métodos, compuestos y formulaciones que permiten la acumulación o la retención de agentes biológicamente activos, i.e. metabolitos activos, dentro de las células.
La terapia con anticuerpo monoclonal se ha establecido para el tratamiento dirigido de pacientes con cáncer, trastornos inmunitarios y angiogénicos.
El uso de conjugados de anticuerpo-fármaco para la administración local de agentes citotóxicos o citostáticos, por ejemplo, fármacos para destruir o inhibir células tumorales en el tratamiento del cáncer (Syrigos y Epenetos (1999) Anticancer Research 19:605-614; Niculescu-Duvaz y Springer (1997) Adv. Drg. Del. Rev. 26: 151-172; patente de Estados Unidos n.° 4.975.278) permite teóricamente la administración dirigida de restos de fármaco a tumores, y la acumulación intracelular de los mismos, mientras que la administración sistémica de estos agentes farmacológicos no conjugados pueden dar como resultado niveles inaceptables de toxicidad para las células normales, así como para las células que se desea eliminar (Baldwin et al., 1986, Lancet pp. (Mar. 15, 1986):603-05; Thorpe, 1985, "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cáncer Therapy: A Review," en Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications, A. Pinchera et al. (ed.s), págs. 475-506). De esta forma se busca la máxima eficacia con la mínima toxicidad. Para estas estrategias, se han notificado como útiles tanto anticuerpos policlonales como anticuerpos monoclonales (Rowland et al., 1986, Cancer Immunol. Immunother. 21:183-87). Los fármacos usados en estos métodos incluyen daunomicina, doxorrubicina, metotrexato, y vindesina (Rowland et al., 1986, anteriormente citados). Las toxinas utilizadas en los conjugados de anticuerpo-fármaco incluyen toxinas bacterianas tales como la toxina diftérica, toxinas vegetales tales como ricino, toxinas de molécula pequeña tales como geldanamicina (Kerr et al., 1997, Bioconjugate Chem. 8(6):781-784; Mandler et al. (2000) Jour. of the Nat. Cancer Inst. 92(19): 1573-1581; Mandler et al. (2000) Bioorganic & Med. Chem. Letters 10:1025-1028; Mandler et al. (2002) Bioconjugate Chem.
13:786-791), maitansinoides (documento EP 1391213; Liu et al., (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:8618-8623), y caliqueamicina (Lode et al. (1998) Cancer Res. 58:2928; Hinman et al. (1993) Cancer Res. 53:3336-3342). Las toxinas pueden alterar sus efectos citotóxicos y citostáticos por mecanismos que incluyen la unión a tubulina, unión al ADN, o inhibición de la topoisomerasa (Meyer, D.L. y Senter, P.D. "Recent Advances in Antibody Drug Conjugates for Cancer Therapy" in Annual Reports in Medicinal Chemistry, Vol 38 (2003) Capítulo 23, 229-237). Algunos fármacos citotóxicos tienden a ser inactivos o menos activos cuando se conjugan con anticuerpos grades o ligandos de receptores de proteínas.
ZEVALIN® (ibritumomab tiuxetan, Biogen/Idec) es un conjugado de anticuerpo-radioisótopo compuesto por un anticuerpo monoclonal de IgG1 kappa de murino dirigido contra el antígeno CD20 que se encuentra en la superficie de linfocitos B normales y malignos y un radioisótopo de 111 In o 90 Y unido mediante un quelante enlazador de tiourea (Wiseman et al. (2000) Eur. Jour. Nucl. Med. 27(7):766-77; Wiseman et al. (2002) Blood 99(12):4336-42; Witzig et al. (2002) J. Clin. Oncol. 20(10):2453-63; Witzig et al. (2002) J. Clin. Oncol. 20(15):3262-69). Aunque ZEVALIN tiene actividad contra el linfoma no de Hodgkin (LNH) de linfocitos B, la administración da como resultado citopenias graves y prolongadas en la mayoría de los pacientes. MYLOTARG™ (gemtuzumab ozogamicina, Wyeth Pharmaceuticals), un conjugado de anticuerpo-fármaco compuesto de un anticuerpo de CD33 humano unido a la caliqueamicina, fue autorizado en 2000 para el tratamiento de la leucemia mieloide aguda mediante inyección (Drugs of the Future (2000) 25(7):686; patentes de Estados Unidos n.° 4970198; 5079233; 5585089; 5606040; 5693762; 5739116; 5767285; 5773001). Cantuzumab mertansina (Immunogen, Inc.), un conjugado de anticuerpo-fármaco compuesto del anticuerpo de huC242 unido mediante en enlazador de disulfuro SPP con el resto de fármaco maitansinoide, DM1, ha pasado a los ensayos clínicos en Fase II para el tratamiento de cánceres que expresan CanAg, tales como de colon, pancreático, gástrico, y otros. MLN-2704 (Millennium Pharm., bZl Biologies, Immunogen Inc.), un conjugado de anticuerpo y fármaco compuesto del anticuerpo monoclonal contra el antígeno específico de la membrana de la próstata (PSMA) unido al resto de fármaco maitansinoide, DM1, está en desarrollo para el tratamiento potencial de tumores de próstata. El mismo resto de fármaco maitansinoide, DM1, se enlazó mediante un enlazador no de disulfuro, SMCC, a un anticuerpo monoclonal de murino, TA.1 (Chari et al. (1992) Cancer Research 52:127-131). Se ha informado de que este conjugado es 200 veces menos potente que el correspondiente conjugado con el enlazador de disulfuro. El enlazador SMCC se consideró en dicho documento como "no escindible".
Varios compuestos peptídicos cortos se han aislado a partir del molusco marino Dolabella auricularia y se ha descubierto que tiene actividad biológica (Pettit et al. (1993) Tetrahedron 49:9151; Nakamura et al. (1995) Tetrahedron Letters 36:5059-5062; Sone et al. (1995) Jour. Org Chem. 60:4474). También se han preparado análogos de estos compuestos, y se ha descubierto que algunos tienen actividad biológica (para una revisión, véase Pettit et al. (1998) Anti-Cancer Drug Design 13:243-277). Por ejemplo, auristatina E (patente de Estados Unidos n.° 5635483) es un análogo sintético del producto marino natural Dolastatina 10, un agente que inhibe la polimerización de la tubulina mediante la unión al mismo dominio de la tubulina que el fármaco anticanceroso vincristina (G. R. Pettit, (1997) Prog. Chem. Org. Nat. Prod. 70:1-79). Dolastatina 10, auristatina PE, y auristatina E son péptidos lineales que tienen cuatro aminoácidos, tres de los cuales son únicos para la clase de dolastatina de los compuestos, y una amida en el extremo C.
Los péptidos de auristatina, auristatina E (AE) y monometilauristatina (MMAE), análogos sintéticos de dolastatina, se conjugaron con: (i) anticuerpos monoclonales quiméricos cBR96 (específicos de los carcinomas de Lewis Y); (ii) cAC10 que es específico de CD30 en neoplasias malignas hematológicas (Klussman, et al. (2004), Bioconjugate Chemistry 15(4)765-773; Doronina et al. (2003) Nature Biotechnology 21(7):778-784; "Monomethylvaline Compounds Capable of Conjugation to Ligands"; Francisco et al. (2003) Blood 102(4):1458-1465; publicación de Estados Unidos 2004/0018194; (iii) anticuerpos dirigidos contra CD20 tales como RITUXAN® (documento WO 04/032828) para el tratamiento de cánceres y trastornos inmunitarios que expresan CD20; (iv) anticuerpos 2H9 dirigidos contra EphB2 y contra IL-8 para el tratamiento del cáncer colorrectal (Mao, et al. (2004) Cancer Research 64(3):781-788); (v) anticuerpo de E-selectina (Bhaskar et al. (2003) Cancer Res. 63:6387-6394); y (vi) otros anticuerpos dirigidos contra CD30 (documento WO 03/043583).
La auristatina E conjugada con anticuerpos monoclonales se divulga en Senter et al, Proceedings of the American Association for Cancer Research, Volumen 45, Resumen número 623, presentado el 28 de marzo de 2004.
A pesar de los datos in vitro para los compuestos de la clase de la dolastatina y sus análogos, las significativas toxicidades generales a las dosis necesarias para conseguir un efecto terapéutico comprometen su eficacia en estudios clínicos. En consecuencia, existe una clara necesidad en la técnica de derivados de dolastatina/auristatina que tengan una toxicidad significativamente menor, pero útil eficacia terapéutica. Estas y otras limitaciones y problemas del pasado se abordan mediante la presente invención.
La familia ErbB de receptores de tirosina quinasas son mediadores importantes del crecimiento, la diferenciación y la supervivencia celular. La familia de receptores incluye cuatro miembros diferentes, incluyendo el receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR, ErbB1, HER1), HER2 (ErbB2 o p185neu), HER3 (ErbB3) y HER4 (ErbB4 o tyro2). Se ha caracterizado un panel de anticuerpos dirigidos contra ErbB2 usando la línea de células del tumor de mama humano SKBR3 (Hudziak et al., (1989) Mol. Cell. Biol. 9(3): 1165-1172. Se obtuvo la inhibición máxima con el anticuerpo llamado 4D5 que inhibía la proliferación celular en un 56 %. Otros anticuerpos del panel reducían la proliferación celular en menor extensión en este ensayo. Se ha descubierto además que el anticuerpo 4D5 sensibilizaba las líneas celulares de tumor de mama que expresaban en exceso ErbB2 a los efectos citotóxicos del TNF-a. (patente de Estados Unidos n.° 5677171). Los anticuerpos dirigidos contra ErbB2 estudiados en Hudziak et al. se caracterizaron adicionalmente en Fendly et at. (1990) Cancer Research 50:1550-1558; Kotts et al. (1990) In vitro 26(3):59A; Sarup et al. (1991) Growth Regulation 1:72-82; Shepard et al. J. (1991) Clin. Immunol. 11 (3):117-127; Kumar et al. (1991) Mol. Cell. Biol. 11(2):979-986; Lewis et al. (1993) Cancer Immunol. Immunother. 37:255-263; Pietras et al. (1994) Oncogene 9:1829-1838; Vitetta et al. (1994) Cancer Research 54:5301-5309; Sliwkowski et al. (1994) J. Biol. Chem. 269(20):14661-14665; Scott et al. (1991) J. Biol. Chem. 266:14300-5; D'souza et al. Proc. Natl. Acad. Sci. (1994) 91:7202-7206; Lewis et al. (1996) Cancer Research 56:1457-1465; y Schaefer et al. (1997) Oncogene 15:1385-1394.
Se han descrito otros anticuerpos dirigidos contra ErbB2 con diferentes propiedades en Tagliabue et al. Int. J. Cáncer 47:933-937 (1991); McKenzie y col. Oncogene 4:543-548 (1989); Maier y col. Cancer Res. 51:5361-5369 (1991); Bacus y col. Molecular Carcinogenesis 3:350-362 (1990); Stancovski et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:8691-8695 (1991); Bacus y col. Cancer Research 52:2580-2589 (1992); Xu y col. Int. J. Cancer 53:401-408 (1993); documento WO94/00136; Kasprzyk et al. Cancer Research 52:2771-2776 (1992); Hancock et al. (1991) Cancer Res. 51:4575-4580; Shawver et al. (1994) Cancer Res. 54:1367-1373; Arteaga et al. (1994) Cancer Res.
54:3758-3765; Harwerth et al. (1992) J. Biol. Chem. 267:15160-15167; patente de Estados Unidos n.° 5783186; y Klapper et al. (1997) Oncogene 14:2099-2109.
El cribado por homología ha dado como resultado la identificación de otros dos miembros de la familia de receptores ErbB; ErbB3 (patente de los Estados Unidos n.° 5,183,884; patente de Estados Unidos n.° 5.480.968; KraU.S. et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:9193-9197) y ErbB4 (documento EP 599274; Plowman et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:1746-1750; y Plowman et al. (1993) Nature 366:473-475). Ambos receptores presentan una mayor expresión en al menos algunas líneas celulares de cáncer de mama.
HERCEPTIN® (Trastuzumab) es un anticuerpo monoclonal humanizado derivado de ADN recombinante que se une selectivamente con alta afinidad en un ensayo de cultivo celular (Kd = 5 nM) al dominio extracelular de la proteína del receptor 2 del factor de crecimiento epidérmico humano, HER2 (ErbB2) (patente de los Estados Unidos n.° 5821337; patente de Estados Unidos n.° 6054297; patente de Estados Unidos n.° 6407213; patente de Estados Unidos n.° 6639055; Coussens L, et al. (1985) Science 230:1132-9; Slamon DJ, et al. (1989) Science 244:707-12). Trastuzumab es un anticuerpo de IgG1 kappa que contiene regiones marco humanas con las regiones determinantes de la complementariedad de un anticuerpo murino (4D5) que se une a HER2. Trastuzumab se une al antígeno HER2 y, de esta forma, inhibe el crecimiento de las células cancerosas. Como Trastuzumab es un anticuerpo humanizado, minimiza las posibles respuestas HAMA en pacientes. El anticuerpo humanizado dirigido contra HER2 se produce mediante un cultivo en suspensión de células de mamífero (ovario de hámster chino, CHO). El proto-oncogén HER2 (o c-erbB2) codifica una proteína de un receptor transmembrana de 185 kDa, que está estructuralmente relacionada con el receptor del factor de crecimiento epidérmico. Se ha observado la expresión en exceso de la proteína HER2 en 25 %-30 % de los cánceres de mama primarios, y se puede determinar usando una evaluación inmunohistoquímica de bloques de tumores fijados (Press MF, et al. (1993) Cancer Res 53:4960-70. Trastuzumab ha demostrado, tanto en ensayos realizados in vitro como en animales, que inhibe la proliferación de células tumorales humanas que expresan h ER2 en exceso (Hudziak RM, et al. (1989) Mol Cell Biol 9:1165-72; Lewis GD, et al. (1993) Cancer Immunol Immunother; 37:255-63; Baselga J, et al. (1998) Cancer Res. 58:2825-2831). Trastuzumab es un mediador de la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo, ADCC (Hotaling TE, et al. (1996) [resumen]. Proc. Annual Meeting Am Assoc Cancer Res; 37:471; Pegram m D, et al. (1997) [resumen]. Proc Am Assoc Cancer Res; 38:602). In vitro, la ADCC mediada por Trastuzumab ha mostrado ejercerse principalmente sobre las células cancerosas que expresan HER2 en exceso, en comparación con las células cancerosas que no expresan HER2 en exceso. HERCEPTIN® como monoagente está indicado para el tratamiento de pacientes con cáncer de mama metastásico cuyos tumores expresan en exceso la proteína HER2, y que han recibido uno o más regímenes de quimioterapia contra su enfermedad metastásica. HERCEPTIN® en combinación con paclitaxel está indicado para el tratamiento de pacientes con cáncer de mama metastásico cuyos tumores expresan en exceso la proteína HER2, y que no han recibido uno o más regímenes de quimioterapia contra su enfermedad metastásica. HERCEPTIN® es clínicamente activa en pacientes con cáncer de mama metastásico que expresan ErbB2 en exceso que ya han recibido una amplia terapia contra el cáncer anterior (Baselga et al, (1996) J. Clin. Oncol. 14:737-744).
El anticuerpo monoclonal de murino dirigido contra HER2 inhibe el crecimiento de las líneas celulares de cáncer de mama que expresan HER2 en exceso en el nivel 2+ y 3+ (1-2 x 106 receptores de HER2 por célula), pero no tiene actividad sobre células que expresan niveles menores de HER2 (Lewis et al., (1993) Cancer Immunol. Immunother.
37:255-263). Basándose en esta observación, el anticuerpo 4D5 se humanizó (huMAb4D5-8, rhuMAb HER2, patente de Estados Unidos n.° 5821337; Carter et al., (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 4285-4289) y se sometió a ensayo en pacientes con cáncer de mama cuyos tumores expresan HER2 en exceso pero que evolucionaron después de quimioterapia convencional (Cobleigh et al., (1999) J. Clin. Oncol. 17: 2639-2648).
Aunque HERCEPTIN es un paso adelante para el tratamiento de pacientes con cáncer de mama que expresan ErbB2 que ya han recibido una amplia terapia contra el cáncer anterior, algunos pacientes de esta población no responden o responden muy poco al tratamiento con HERCEPTIN.
Por lo tanto, existe una necesidad clínica significativa para desarrollar otras terapias contra el cáncer dirigidas contra HER2 para aquellos pacientes con tumores que expresan HER2 en exceso o para otras enfermedades asociadas con la expresión de HER2 que no responden, o responden poco, al tratamiento con HERCEPTIN.
La cita de cualquier referencia en esta solicitud no es una admisión de que la referencia es el estado de la técnica de esta solicitud.
3. Sumario de la invención
La presente invención proporciona un conjugado que tiene la fórmula:
LU-Df
o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en la que:
LU- es una Unidad enlazadora que comprende un grupo funcional capaz de unirse a un ligando o a un anticuerpo, y
Df es un grupo que tiene la siguiente fórmula:
Figure imgf000005_0001
en la que:
independientemente en cada localización:
R2 se selecciona entre H y alquilo C1-C8;
R3 se selecciona de H, alquilo C1-C8, carbociclo C3-C8, arilo, alquilarilo C1-C8, alquil C1-C8-(carbociclo C3-C8), heterociclo C3-C8, y alquil C1-C8-(heterociclo C3-C8);
R4 se selecciona de H, alquilo C1-C8, carbociclo C3-C8, arilo, alquilarilo C1-C8, alquil C1-C8-(carbociclo C3-C8), heterociclo C3-C8, y alquil C1-C8-(heterociclo C3-C8);
R5 se selecciona entre H y metilo;
o:
R4 y R5 forman conjuntamente un anillo carbocíclico que tiene la fórmula -(CRaRb)n-, en la que Ra y Rb se seleccionan de forma independiente de H, alquilo C1-C8, y carbociclo C3-C8 y n se selecciona entre 2, 3, 4, 5 y 6;
R6 se selecciona entre H y alquilo C1-C8;
R7 se selecciona de H, alquilo C1-C8, carbociclo C3-C8, arilo, alquilarilo C1-C8, alquil C1-C8-(carbociclo C3-C8), heterociclo C3-C8, y alquil C1-C8-(heterociclo C3-C8);
cada R8 se selecciona independientemente entre H, OH, alquilo C1-C8, carbociclo C3-C8 y O-(alquilo C1-C8); R9 se selecciona entre H y alquilo C1-C8;
R10 se selecciona entre arilo y heterociclo C3-C8;
Z es O, S, NH, o NR12, en la que R12 es alquilo C1-C8;
R11 se selecciona de H, alquilo C1-C20, -(R13O)m-R14, y -(R13O)m-CH(R15)2;
m es un número entero comprendido de 1 a 1000;
R13 es alquilo C2-C8;
R14 es H o alquilo C1-C8;
cada aparición de R15 es independientemente H, COOH, -(CH2)-N(R16)2, -(CH2)n-SO3H, o -(CH2)n-SO3-alquilo C1-C8;
cada aparición de R16 es independientemente H, alquilo C1-C8, o -(CH2)n-COOH; y n es un número entero de 0 a 6.
También se describe en el presente documento una composición farmacéutica que comprende una cantidad eficaz del compuesto conjugado de anticuerpo-fármaco que se ha definido anteriormente o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, y un diluyente, transportador o excipiente farmacéuticamente aceptable.
También se describe en el presente documento un compuesto conjugado de anticuerpo-fármaco como se ha definido anteriormente para su uso en el tratamiento de un cáncer seleccionado entre el grupo que consiste en cáncer de mama, cáncer de ovarios, cáncer de estómago, cáncer de endometrio, cáncer de las glándulas salivales, cáncer de pulmón, cáncer de riñón, cáncer de colon, cáncer colorrectal, cáncer de tiroides, cáncer pancreático, cáncer de próstata y cáncer de vejiga.
También se describe en el presente documento un compuesto conjugado de anticuerpo-fármaco como se ha definido anteriormente para su uso junto con una cantidad eficaz de un agente adicional seleccionado entre el grupo que consiste de un agente contra el cáncer, un agente inmunosupresor, y un agente antiinfeccioso para su uso en el tratamiento de un cáncer seleccionado entre el grupo que consiste en cáncer de mama, cáncer de ovarios, cáncer de estómago, cáncer de endometrio, cáncer de las glándulas salivales, cáncer de pulmón, cáncer de riñón, cáncer de colon, cáncer colorrectal, cáncer de tiroides, cáncer pancreático, cáncer de próstata y cáncer de vejiga.
Breve descripción de los dibujos
La Figura 1 muestra un ensayo de eficacia in vivo de una sola dosis de cAC10-mcMMAF en xenoinjertos subcutáneos de Karpas-299 ALCL.
La Figura 2 muestra un ensayo de eficacia in vivo de una sola dosis de cAC10-mcMMAF en L540cy subcutáneo. Para este estudio, se usaron 4 ratones en el grupo no tratado y 10 en cada grupo de tratamiento.
Las Figuras 3a y 3b muestran la eficacia in vivo de cBR96-mcMMAF en L2987 subcutáneo. Los triángulos rellenos de la Figura 3a y las flechas de la Figura 3b indican los días de la terapia.
Las Figuras 4a y 4b muestran la actividad in vitro de conjugados de anticuerpo-fármaco cAC10 contra líneas de células CD30+.
Las Figuras 5a y 5b muestran la actividad in vitro de conjugados de anticuerpo-fármaco cBR96 contra líneas de células Ley+.
Las Figuras 6a y 6b muestran la actividad in vitro de conjugados de anticuerpo-fármaco c1F6 contra líneas de células de carcinoma de células renales CD70+.
La Figura 7 muestra un ensayo de proliferación celular in vitro, con células SK-BR-3 tratadas con conjugados de anticuerpo-fármaco (ADC): -•- Trastuzumab-MC-vc-PAB-MMAF, 3,8 MMAF/Ab, -o- Trastuzumab-MC-MMAF, 4,1 MMAF/Ab, y -A-Trastuzumab-MC-MMAF, 4,8 MMAF/Ab, medido en unidades relativas de fluorescencia (URF) versus la concentración de ADC en pg/ml. H = Trastuzumab donde H está unido mediante una cisteína [cys]. La Figura 8 muestra un ensayos de proliferación celular in vitro con células BT-474 tratadas con ADC: -•-Trastuzumab-MC-vc-PAB-MMAF, 3,8 MMAF/Ab, -o-Trastuzumab-MC-MMAF, 4,1 MMAF/Ab, y -A-Trastuzumab-MC-MMAF, 4,8 MMAF/Ab.
La Figura 9 muestra un ensayos de proliferación celular in vitro con células MCF-7 tratadas con ADC: -•-Trastuzumab-MC-vc-PAB-MMAF, 3,8 MMAF/Ab, -o-Trastuzumab-MC-(N-Me)vc-PAB-MMAF, 3,9 MMAF/Ab, y -A-Trastuzumab-MC-MMAF, 4,1 MMAF/Ab.
La Figura 10 muestra un ensayos de proliferación celular in vitro con células MDA-MB-468 tratadas con ADC: -•-Trastuzumab-MC-vc-PAB-MMAE, 4,1 MMAE/Ab, -o-Trastuzumab-MC-vc-PAB-MMAE, 3,3 MMAE/Ab, y -A-Trastuzumab-MC-vc-PAB-MMAF, 3,7 MMAF/Ab.
La Figura 11 muestra un estudio de aclaramiento de la concentración en plasma después de la administración de H-MC-vc-PAB-MMAF-TEG y H-MC-vc-PAB-MMAF a ratas Sprague Dawley: La dosis administrada fue de 2 mg de ADC por kg de rata. Las concentraciones de anticuerpo total y ADC se midieron con el tiempo. (H = Trastuzumab).
La Figura 12 muestra un estudio de aclaramiento de la concentración en plasma después de la administración de H-MC-vc-MMAE a macacos a diferentes dosis: 0,5, 1,5, 2,5, y 3,0 mg/kg administrado el día 1 y el día 21. Las concentraciones de anticuerpo total y ADC se midieron con el tiempo. (H = Trastuzumab).
La Figura 13 muestra el cambio promedio de volumen tumoral con el tiempo en ratones lampiños atímicos con aloinjertos del tumor mamario MMTV-HER2 Fo5 que recibieron dosis el Día 0 con: Vehículo, Trastuzumab-MC-vc-PAB-MMAE (1250 pg/m2) y Trastuzumab-MC-vc-PAB-MMAF (555 pg/m2), (H = Trastuzumab).
La Figura 14 muestra el cambio promedio de volumen tumoral con el tiempo en ratones lampiños atímicos con aloinjertos del tumor mamario MMTV-HER2 Fo5 que recibieron dosis el Día 0 con 10 mg/kg de (660 pg/m2) de Trastuzumab-MC-MMAE y 1250 pg/m2 de Trastuzumab-MC-vc-PAB-MMAE.
La Figura 15 muestra el cambio promedio de volumen tumoral con el tiempo en ratones lampiños atímicos con aloinjertos del tumor mamario MMTV-HER2 Fo5 que recibieron dosis el Día 0 con Vehículo y 650 pg/m2 de trastuzumab-MC-MMAF.
La Figura 16 muestra el cambio promedio de volumen tumoral con el tiempo en ratones lampiños atímicos con aloinjertos del tumor mamario MMTV-HER2 Fo5 que recibieron dosis el Día 0 con Vehículo y 350 pg/m2 de cuatro conjugados de trastuzumab-MC-MMAF donde la relación de MMAF/trastuzumab (H) es 2, 4, 5,9 y 6. La Figura 17 muestra el cambio promedio del grupo, con barras de error, en los pesos corporales del animal (rata) (promedio ± SD) tras la administración de Vehículo, trastuzumab-MC-val-cit-MMAF, trastuzumab-MC(Me)-val-cit-PAB-MMAF, trastuzumab-MC-MMAF y trastuzumab-MC-val-cit-PAB-MMAF.
La Figura 18 muestra el cambio promedio del grupo en los pesos corporales del animal (rata) (promedio ± SD) tras la administración de 9,94 mg/kg de H-MC-vc-MMAF, 24,90 mg/kg de H-MC-vc-MmAf , 10,69 mg/kg de H-MC(Me)-vc-PAB-MMAF, 26,78 mg/kg de H- MC(Me)-vc-PAB-MMAF, 10,17 mg/kg de H-MC-MMAF, 25,50 mg/kg de H-MC-MMAF, y 21.85 mg/kg de H-MC-vc-PAB- MMAF. H = trastuzumab. El enlazador MC está unido mediante una cisteína del trastuzumab a cada conjugado.
La Figura 19 muestra el cambio promedio del grupo, con barras de error, en los pesos corporales de ratas Sprague Dawley (promedio ± SD) después de la administración de trastuzumab (H)-MC-MMAF a dosis de 2105, 3158, y 4210 pg/m2. El enlazador MC está unido mediante una cisteína del trastuzumab a cada conjugado.
4. DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LAS REALIZACIONES ILUSTRATIVAS
4.1 DEFINICIONES Y ABREVIATURAS
A menos que se indique otra cosa, los siguientes términos y frases se usan en el presente documento están destinados a tener los siguientes significados:
Cuando se usan nombres comerciales en el presente documento, los solicitantes pretenden incluir independientemente el nombre comercial de la formulación del producto, el fármaco genérico, y el(los) principio(s) farmacéutico(s) activo(s) del producto del nombre comercial.
El término "anticuerpo" se utiliza en el presente documento en el sentido más amplio y específicamente abarca anticuerpos monoclonales intactos, anticuerpos policlonales, anticuerpos multiespecíficos (por ejemplo, anticuerpos biespecíficos) formados por al menos dos anticuerpos intactos, y fragmentos de anticuerpo, siempre que muestren la actividad biológica deseada. Un anticuerpo es una proteína generada por el sistema inmunitario que es capaz de reconocer y unirse a un antígeno específico. Descrito en términos de su estructura, un anticuerpo tiene normalmente una proteína en forma de Y que consiste en cuatro cadenas de aminoácidos, dos pesadas y dos ligeras. Cada anticuerpo tiene principalmente dos regiones: una región variable y una región constante. La región variable, situada en los extremos de los brazos de la Y, se unen e interactúan con el antígeno diana. Esta región variable incluye una región determinante de la complementariedad (CDR) que reconoce y se une a un sitio de unión específico de un antígeno concreto. La región constante, situada en la cola de la Y, se reconoce por e interactúa con el sistema inmunitario (Janeway, C., Travers, P., Walport, M., Shlomchik (2001) Immuno Biology, 5a edición, Garland Publishing, Nueva York). Un antígeno diana tiene generalmente numerosos sitios de unión, también denominados epítopos, reconocidos por las CDR en múltiples anticuerpos. Cada anticuerpo que se une específicamente a un epítopo diferente tiene una estructura diferente. Por tanto, un antígeno puede tener más de un anticuerpo correspondiente.
El término "anticuerpo", como se usa en el presente documento, también se refiere a una molécula de inmunoglobulina de longitud completa o una porción inmunitariamente activa de una molécula de inmunoglobulina de longitud completa, es decir, una molécula que contiene un sitio de unión a antígeno que se une de forma inmunoespecífica a un antígeno de una diana de interés o parte de la misma, incluyendo dichas dianas, aunque no de forma limitativa, una célula o células cancerosas que producen anticuerpos autoinmunitarios asociados con una enfermedad autoinmunitaria. La inmunoglobulina divulgada en el presente documento puede ser de cualquier tipo (por ejemplo, IgG, IgE, IgM, IgD, e IgA), clase (por ejemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 e IgA2) o subclase de molécula de inmunoglobulina. Las inmunoglobulinas pueden derivarse de cualquier especie. En un aspecto, sin embargo, la inmunoglobulina es de origen humano, de murino, o conejo. En otro aspecto, los anticuerpos son anticuerpos policlonales, monoclonales, biespecíficos, humanos, humanizados o quiméricos, anticuerpos monocatenarios, Fv, fragmentos Fab, fragmentos F(ab'), fragmentos F(ab')2, fragmentos producidos mediante una biblioteca de expresión de Fab, anticuerpos anti-idiotípicos (anti-Id), CDR, y fragmentos de unión a epítopos de cualquiera de los anteriores que se unen inmunoespecíficamente a antígenos de células cancerosas, antígenos víricos, o antígenos microbianos.
La expresión "anticuerpo monoclonal" tal como se usa en el presente documento, se refiere a un anticuerpo obtenido a partir de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos, es decir, los anticuerpos individuales que comprenden la población son idénticos salvo por posibles mutaciones que se producen naturalmente que pueden estar presentes en cantidades poco importantes. Los anticuerpos monoclonales son muy específicos, dirigiéndose contra un único sitio antigénico. Asimismo, a diferencia de las preparaciones de anticuerpos policlonales que incluyen anticuerpos diferentes dirigidos contra determinantes diferentes (epítopos), cada anticuerpo monoclonal se dirige contra un único determinante del antígeno. Además de su especificidad, los anticuerpos monoclonales son ventajosos porque pueden sintetizarse sin estar contaminados por otros anticuerpos. El modificador "monoclonal" indica la naturaleza del anticuerpo como obtenido de una población sustancialmente homogénea y no debe interpretarse como que requiere la producción del anticuerpo mediante cualquier procedimiento concreto. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales para su uso de acuerdo con la presente invención pueden prepararse mediante el método del hibridoma descrito por primera vez en Kohler et al. (1975) Nature 256:495, o se pueden preparar mediante métodos de ADN recombinante (véase, la patente de Estados Unidos n.°. 4816567). Los anticuerpos monoclonales también se pueden aislar a partir de fagotecas de anticuerpos usando las técnicas descritas en Clackson et al. (1991) Nature, 352:624-628 y Marks et al. (1991) J. Mol. Biol., 222: 581-597, por ejemplo.
Los anticuerpos monoclonales del presente documento incluyen específicamente anticuerpos “quiméricos" en los que una porción de la cadena pesada y/o ligera es idéntica u homóloga a las correspondientes secuencias en los anticuerpos derivados de una especie concreta o pertenecientes a una clase o subclase de anticuerpo concreto, mientras que la cadena (o las cadenas) restante es idéntica u homóloga a secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de otras especies o que pertenecen a otra clase o subclase de anticuerpos, así como fragmentos de dichos anticuerpos, siempre que muestren la actividad biológica deseada (patente de Estados Unidos mp/4816567; y Morrison et al. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855).
Se han utilizado varios métodos para producir anticuerpos monoclonales (MAb). La tecnología del hibridoma, que se refiere a una línea de células clonada que produce un único tipo de anticuerpo, usa las células de varias especies, incluidos ratones (murino), hámsteres, ratas y seres humanos. Otro método para preparar los Mab usa ingeniería genética que incluye técnicas de ADN recombinante. Los anticuerpos monoclonales fabricados mediante estas técnicas incluyen, entre otros, anticuerpos quiméricos y anticuerpos humanos. Un anticuerpo quimérico combina regiones que codifican ADN procedentes de más de un tipo de especie. Por ejemplo, un anticuerpo quimérico puede derivar la región variable de un ratón y la región constante de un ser humano. Un anticuerpo humanizado procede predominantemente de un ser humano, aunque contenga partes no humanas. Como un anticuerpo quimérico, un anticuerpo humanizado puede contener una región constante completamente humana. Pero a diferencia de un anticuerpo quimérico, la región variable puede estar parcialmente derivada de un ser humano. Las porciones sintéticas no humanas de un anticuerpo humanizado proceden frecuentemente de las CDR de anticuerpos murinos. En cualquier caso, estas regiones son fundamentales para permitir que el anticuerpo reconozca y se una a un antígeno específico.
Como se ha indicado, se pueden usar anticuerpos murinos. Aunque útiles para el diagnóstico y terapias a corto plazo, los anticuerpos murinos no se pueden administrar a las personas durante mucho tiempo sin aumentar el riesgo de una respuesta inmunogénica perjudicial. Esta respuesta, denominada anticuerpo de ratón contra ser humano (HAMA), se produce cuando un sistema inmunitario humano reconoce el anticuerpo murino como extraño y lo ataca. Una respuesta HAMA puede producir choque tóxico o incluso la muerte.
Los anticuerpos quiméricos y humanizados reducen la posibilidad de una respuesta HAMA al minimizar las porciones no humanas de los anticuerpos administrados. Asimismo, los anticuerpos quiméricos y humanizados tienen el beneficio adicional de activar las respuestas inmunitarias humanas secundarias, tal como la toxicidad celular dependiente de anticuerpo.
Los "fragmentos de anticuerpos" comprenden una porción de un anticuerpo intacto, que comprende preferentemente la región de unión a antígeno o variable del mismo. Los ejemplos de fragmentos de anticuerpo incluyen fragmentos Fab, Fab', F(ab')2 y Fv; diacuerpos; anticuerpos lineales; moléculas de anticuerpo monocatenarias; y anticuerpos multiespecíficos formados a partir de fragmento(s) de anticuerpo.
Un "anticuerpo intacto" es uno que comprende una región variable de unión a antígeno así como un dominio constante de la cadena ligera (CL) y dominios constantes de la cadena pesada, CHI, CH2 y CH3. Los dominios constantes pueden ser dominios constantes de la secuencia natural (por ejemplo dominios constantes de la secuencia natural humana) o variantes de secuencia de aminoácidos de los mismos.
Un anticuerpo intacto puede tener una o más "funciones efectoras" que se refieren a aquellas actividades biológicas atribuibles a la región Fc (una región Fc de la secuencia natural o una región Fc de la secuencia variante) de un anticuerpos. Los ejemplos de funciones efectoras de anticuerpos incluyen unión con C1q; citotoxicidad dependiente del complemento; unión al receptor Fc; citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpo (ADCC); fagocitosis; regulación por defecto de los receptores de la superficie celular (por ejemplo, receptor de linfocitos B; BCR), etc.
En función de la secuencia de aminoácidos del dominio constante de sus cadenas pesadas, los anticuerpos intactos se pueden asignar a diferentes "clases". Hay cinco clases principales de anticuerpos intactos: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, y varios de éstas pueden además dividirse en “subclases" (isotipos), por ejemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA e IgA2. Los dominios constantes de la cadena pesada que corresponden a las diferentes clases de anticuerpos se denominan a, ó, £, y y H, respectivamente. Las estructuras de las subunidades y las configuraciones tridimensionales de las diferentes clases de inmunoglobulinas son bien conocidas.
Las expresiones “ErbB2” y “HER2” se usan de forma intercambiable en el presente documento y se refieren a proteína de HER2 humana descrita, por ejemplo, en Semba y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82:6497-6501 (1985) y Yamamoto et al., (1986) Nature, 319:230-234 (número de registro Genebank X03363). El término “erbB2” se refiere al gen que codifica ErbB2 humano y “neu” se refiere al gen que codifica p185neu de rata. El ErbB2 preferido es ErbB2 humano de secuencia natural.
Los anticuerpos contra los receptores de ErbB están comercialmente disponibles de numerosas fuentes, incluyendo, por ejemplo, Santa Cruz Biotechnology, Inc., California, EE.UU.
Por "ligando de ErbB" se entiende un polipéptido que se une a y/o activa un receptor ErbB. El ligando de ErbB puede ser un ligando ErbB humano de secuencia natural tal como el factor de crecimiento epidérmico (EGF) (Savage et al. (1972) J. Biol. Chem., 247:7612-7621); factor de crecimiento transformante alfa (TGF-a) (Marquardt et al.(1984) Science 223:1079-1082); anfiregulina también conocida como factor de crecimiento autocrino de queratinocitos o schwanoma (Shoyab et al. (1989) Science 243:1074-1076; Kimura et al., Nature, 348:257-260 (1990); y Cook et al., Mol. Cell. Biol., 11:2547-2557 (1991)); betacelulina (Shing et al., Science, 259:1604-1607 (1993); y Sasada et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 190:1173 (1993)); factor de crecimiento epidérmico de unión a heparina (HB-EGF) (Higashiyama et al., Science, 251:936-939 (1991)); epiregulina (Toyoda y col., J. Biol. Chem., 270:7495-7500 (1995); y Komurasaki et al., Oncogene, 15:2841-2848 (1997)); una heregulina (véase posteriormente); neurregulina-2 (NRG-2) (Carraway et al., Nature, 387:512-516 (1997)); neurregulina-3 (NRG-3) (Zhang y col., Proc. Natl. Acad. Sci., 94:9562-9567 (1997)); neurregulina-4 (NRG-4) (Harari et al., Oncogene, 18:2681-89 (1999)) o cripto (CR-1) (Kannan et al., J. Biol. Chem., 272(6):3330-3335 (1997)). Los ligandos de ErbB que se unen a EGFR incluyen EGF, TGF-a, anfirregulina, betacelulina, HB-EGF y epiregulina. Los ligandos de ErbB que se unen a ErbB3 incluyen herregulinas. Los ligandos de ErbB capaces de unirse a ErbB4 incluyen betacelulina, epiregulina, HB-EGF, NRG-2, NRG-3, NRG-4 y herregulinas. El ligando de ErbB también puede ser un ligando de ErbB sintético. El ligando sintético puede ser específico de un receptor ErbB concreto, o puede reconocer complejos del receptor ErbB concretos. Un ejemplo de un ligando sintético es la quimera sintética herregulina/EGF, birregulina (véase, por ejemplo, Jones et al., (1999) FEBS Letters, 447: 227-231, que se ha incorporado por referencia).
“Herregulma” (HRG) se refiere a un polipéptido codificado por el producto génico de herregulina que se divulga en la patente de Estados Unidos n.° 5641869) o en Marchionni y col., Nature, 362:312-318 (1993). Los ejemplos de herregulinas incluyen herregulina-a, herregulina-p1, herregulina-p2 y herregulina-p3 (Holmes et al., Science, 256:1205-1210 (1992); y la patente de Estados Unidos n.° 5641869); factor de diferenciación neu (NDF) (Peles et al. Cell 69: 205-216 (1992)); actividad inductora de receptor de acetilcolina (ARIA) (Falls et al. (1993) Cell 72:801-815); factores de crecimiento gliales (GGF) (Marchionni y col., Nature, 362:312-318 (1993)); factor derivado de neuronas sensoriales y motoras (SMDF) (Ho et al. J. Biol. Chem., 270:14523-14532 (1995)); Y-herregulina (Schaefer et al., Oncogene, 15:1385-1394 (1997)). El término incluye fragmentos biológicamente activos y/o variantes de secuencia de aminoácidos de un polipéptido de HRG de secuencia natural, tal como un fragmento de dominio de tipo EGF del mismo (por ejemplo, HRGpll77-244).
Un “heterooligómero de HER” es un oligómero asociado de forma no covalente que comprende al menos dos receptores ErbB diferentes. Un “dímero de ErbB” es un oligómero asociado de forma no covalente que comprende dos receptores de ErbB diferentes. Dichos complejos se pueden formar cuando una célula que expresa dos o más receptores de ErbB se expone a un ligando de ErbB. Los oligómeros de ErbB, tales como los dímeros de ErbB, se pueden aislar mediante inmunoprecipitación y analizarse por SDS-PAGE como se describe en Sliwkowski et al., J. Biol. Chem., 269(20): 14661-14665 (1994), por ejemplo. Los ejemplos de dichos heterooligómeros de ErbB incluyen los complejos EGFR-ErbB2 (también denominado como HER1/HER2), ErbB2-ErbB3 (HER2/HER3) y ErbB3-ErbB4 (HER3/He R4). Por otra parte, el heterooligómero de ErbB puede comprender dos o más receptores de ErbB2 combinados con un receptor de ErbB diferente, tales como ErbB3, ErbB4 o EGFR (ErbB 1). Otras proteínas, tales como una subunidad del receptor de citoquinas (por ejemplo, gp130) pueden asociarse con el heterooligómero.
Un polipéptido de "secuencia natural" es aquel que tiene la misma secuencia de aminoácidos que un polipéptido, por ejemplo, receptor de antígeno asociado a tumor, derivado de la naturaleza. Dichos polipéptidos de secuencia natural se pueden aislar de la naturaleza o se pueden producir por medios recombinantes o sintéticos. Por tanto, un polipéptido de secuencia natural puede tener la secuencia de aminoácidos de un polipéptido humano, polipéptido murino o polipéptido procedente de cualquier otra especie de mamífero que se produce naturalmente.
La expresión "variante de secuencia de aminoácido" se refiere a polipéptidos que tienen secuencias de aminoácidos que se diferencian en cierto grado de un polipéptido de secuencia natural. Generalmente, las variantes de secuencia de aminoácidos tendrán al menos un 70 % de homología con al menos un dominio de unión a receptor de un ligando natural, o con al menos un dominio de unión a ligando de un receptor natural, tal como un antígeno asociado a un tumor y, preferentemente, será de al menos aproximadamente un 80 %, más preferentemente, al menos aproximadamente un 90 % de homología con dicho receptor o dominios de unión a ligando. Las variantes de secuencia de aminoácidos tienen sustituciones, deleciones y/o inserciones en determinadas posiciones dentro de la secuencia de aminoácidos de la secuencia de aminoácidos natural.
“ Identidad de secuencia” se define como el porcentaje de restos en la variante de secuencia de aminoácidos que son idénticos después de alinear las secuencias e introducir huecos, si es necesario, para lograr el máximo porcentaje de identidad de secuencia. Los métodos y los programas de ordenador para alineación son bien conocidos en la técnica. Uno de dichos programas informáticos es “Align 2”, creado por Genentech, Inc., que se presentó con la documentación de usuario en la Oficina de Derechos de Autor de los Estados Unidos, Washington, De 20559, el 10 de diciembre de 1991.
"Citotoxicidad mediada por célula dependiente de anticuerpo" y "ADCC" se refieren a una reacción mediada por células en la que células citotóxicas no específicas que expresan receptores de Fc (FcR) (por ejemplo, linfocitos citolíticos naturales (NK), neutrófilos y macrófagos) reconocen anticuerpos unidos a una célula diana y posteriormente provocan la lisis de la célula diana. Las células principales para mediar la ADCC, los linfocitos NK, expresan solamente FcyRIII, mientras que los monocitos expresan FcyRI, FcyRII y FcyRIII. La expresión de Fc R en células hematopoyéticas se resumen en la Tabla 3 de la página 464 de Ravetch y Kinet, (1991) Annu. Rev. Immunol, 9:457-92. Para evaluar la actividad de ADCC de una molécula de interés, se puede llevar a cabo un ensayo ADCC in vitro, tal como se describe en las patentes de Estados Unidos números 5500362 o 5821337. Las células efectoras útiles para dichos ensayos incluyen células mononucleares de sangre periférica (PBMC) y linfocitos citolíticos naturales (NK). De forma alternativa o adicional, la actividad ADCC de la molécula de interés puede determinarse in vivo, por ejemplo, en un modelo animal tal como el divulgado en Clynes et al., Prco. Natl. Acad. Sci. USA, 95:652-656 (1998).
Los términos “receptor de Fc” o “FcR” se usan para describir un receptor que se une con la región Fc de un anticuerpo. El FcR preferido es un FcR humano de secuencia natural. Por otra parte, un FcR preferido es uno que se une a un anticuerpo IgG (un receptor gamma) e incluye receptores de las subclases FcyRI, FcyRII, y FcyRIII, incluyendo las variantes alélicas y las formas de corte y empalme alternativo de estos receptores. Los receptores de FcyRII incluyen FcyRIIA (un "receptor activante") y FcyRIIB (un "receptor inhibidor"), que tienen secuencias de aminoácidos similares que difieren principalmente en los dominios citoplasmáticos de los mismos. El receptor activador FcyRIIA contiene un motivo de activación basado en tirosina inmunorreceptor (ITAM) en su dominio citoplasmático. El receptor inhibidor FcyRIIB contiene un motivo de inhibición basado en tirosina inmunorreceptor (ITIM) en su dominio citoplasmático. (Véase revisión M. en Daeron, Annu. Rev. Immunol., 15:203-234 (1997)). Los FcR se revisan en Ravetch y Kinet, Annu. Rev. Immunol., 9:457-92 (1991); Capel et al., Immunomethods, 4:25-34 (1994); y de Haas y col., J. Lab. Clin. Med., 126:330-41 (1995). Otros FcR, incluyendo los que se identifiquen en el futuro, están abarcados por el término “FcR” en el presente documento. El término también incluye el receptor neonatal, FcRn, que es responsable de la transferencia de IgG maternas al feto. (Guyer et al., J. Immunol., 117:587 (1976) y Kim et al., J. Immunol., 24:249 (1994)).
La “citotoxicidad dependiente de complemento” o “CDC” se refiere a la capacidad de una molécula para lisar una diana en presencia del complemento. La ruta de activación del complemento se inicia por la unión del primer componente del sistema del complemento (C1q) con una molécula (por ejemplo un anticuerpo) que forma un complejo con un antígeno análogo. Para evaluar la activación de complemento, puede realizarse un ensayo CDC, por ejemplo, como se describe en Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods, 202:163 (1996).
El término "variable" se refiere al hecho de que ciertas porciones de los dominios variables difieren extensamente en secuencia entre los anticuerpos y se usan en la unión y especificidad de cada anticuerpo concreto a su antígeno concreto. Sin embargo, la variabilidad no está distribuida uniformemente en todos los dominios variables de los anticuerpos. Está concentrada en tres segmentos denominados regiones hipervariables en los dominios variables tanto de cadena ligera como de cadena pesada. Las porciones más conservadas de los dominios variables se denominan “regiones estructurales” (FR). Los dominios variables de las cadenas pesadas y ligeras nativas comprenden cada uno cuatro regiones FR, que adoptan en gran medida una configuración en lámina p, conectada por tres regiones hipervariables, que forman bucles que conectan, y en algunos casos forman parte de, la estructura de lámina p. La regiones hipervariables en cada cadena se mantienen juntas en proximidad estrecha por las FR y, con las regiones hipervariables de la otra cadena, contribuyen a la formación del sitio de unión a antígeno de los anticuerpos (véase Kabat et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD). Los dominios constantes no están implicados directamente en la unión de un anticuerpo con un antígeno, pero muestran varias funciones efectoras, tales como participación del anticuerpo en la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo (ADCC).
El término “región hipervariable” cuando se usa en el presente documento se refiere a los restos de aminoácidos de un anticuerpo que son responsables de la unión a antígeno. La región hipervariable generalmente comprende restos de aminoácidos de una región determinante de complementariedad o “CDR” (por ejemplo, los restos 24-34 (LI), 50­ 56 (L2) y 89-97 (L3) en el dominio variable de cadena ligera y 31-35 (H1), 50-65 (H2) y 95-102 (H3) en el dominio variable de cadena pesada; Kabat et al. más arriba) y/o dichos restos de un "bucle hipervariable" (por ejemplo, los restos 26-32 (L1), 50-52 (L2) y 91-96 (L3) en el dominio variable de cadena ligera y 26-32 (H1), 53-55 (H2) y 96-101 (H3) en el dominio variable de cadena pesada; Chothia y Lesk (1987) J. Mol. Biol., 196:901-917). Los restos de “región de marco conservado” o “FR” son los restos de dominio variable distintos de los restos de región hipervariable como se define en el presente documento.
La digestión con papaína de los anticuerpos produce dos fragmentos de unión a antígeno idénticos, llamados fragmentos "Fab", cada uno con un solo sitio de unión a antígeno y un fragmento "Fc" residual, cuyo nombre refleja su capacidad para cristalizar con facilidad. El tratamiento con pepsina produce un fragmento F(ab')2 que tiene dos sitios de unión con antígeno y sigue siendo capaz de reticularse con el antígeno.
“Fv” es el fragmento de anticuerpo mínimo que contiene un sitio de reconocimiento de antígeno y unión a antígeno completo. Esta región consiste en un dímero de una cadena pesada y un dominio variable de cadena ligera en asociación estrecha, no covalente. Es en esta configuración en la que las tres regiones hipervariables de cada dominio variable interaccionan para definir un sitio de unión a antígeno en la superficie del dímero VH-VL. En conjunto, las seis regiones hipervariables confieren especificidad de unión a antígeno al anticuerpo. Sin embargo, incluso un único dominio variable (o la mitad de un Fv que comprende solamente tres regiones hipervariables específicas para un antígeno) tiene la capacidad de reconocer y unirse con el antígeno, aunque con una afinidad menor que el sitio de unión completo.
El fragmento Fab también contiene el dominio constante de la cadena ligera y el primer dominio constante (CH1) de la cadena pesada. Los fragmentos Fab' difieren de los fragmentos Fab en la adición de unos pocos restos en el extremo carboxilo del dominio CH1 de cadena pesada incluyendo una o más cisteínas de la región bisagra del anticuerpo. Fab'-SH es la designación en el presente documento para Fab' en el que el resto o los restos de cisteína de los dominios constantes portan al menos un grupo tiol libre. Los fragmentos de anticuerpos F(ab')2 originalmente se produjeron como pares de fragmentos Fab' que tienen cisteínas bisagra entre ellos. También se conocen otros acoplamientos químicos de fragmentos de anticuerpos.
Las “cadenas ligeras” de anticuerpos de cualquier especie de vertebrado pueden asignarse a uno de dos tipos claramente distintos, denominados kappa (k) y lambda (A), basándose en las secuencias de aminoácidos de sus dominios constantes.
Los fragmentos de anticuerpos "Fv monocatenarios" o "scFv" comprenden los dominios VH y VL de un anticuerpo, en el que estos dominios están presentes en una sola cadena polipeptídica. Preferentemente, el polipéptido Fv comprende además un enlazador polipeptídico entre los dominios Vh y VL que permite al scFv para formar la estructura deseada para la unión del antígeno. Para una revisión de scFv, véase Pluckthun en The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg y Moore eds., Springer-Verlag, Nueva York, págs. 269-315 (1994).
El término "diacuerpos" se refiere a fragmentos de anticuerpos pequeños con dos sitios de unión a antígeno, cuyos fragmentos comprenden un dominio variable de cadena pesada (Vh ) conectado a un dominio variable de cadena ligera (VL) en la misma cadena polipeptídica(VH-VL). Utilizando un enlazador que sea demasiado corto para permitir el emparejamiento entre los dos dominios de la misma cadena, se fuerza a los dominios a emparejarse con los dominios complementarios de otra cadena y crear dos sitios de unión a antígeno. Se describen los diacuerpos más completamente en, por ejemplo, EP 404.097; WO 93/11161; y Hollinger et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448.
Las formas "humanizadas" de anticuerpos no humanos (por ejemplo, roedores) son anticuerpos quiméricos que contienen una secuencia mínima derivada de inmunoglobulina no humana. En su mayoría, los anticuerpos humanizados son inmunoglobulinas humanas (anticuerpo receptor) en la que los residuos de una región hipervariable del receptor son sustituidos por residuos de una región hipervariable de una especie no humana (anticuerpo donante), tal como ratón, rata, conejo o primate no humano que tiene la especificidad, afinidad y capacidad deseadas. En algunos casos, os residuos de la región estructural (FR) de la inmunoglobulina humana están sustituidos por los correspondientes residuos no humanos. Asimismo, los anticuerpos humanizados pueden comprender restos que no se encuentran en el anticuerpo receptor o en el anticuerpo donante. Estas modificaciones se efectúan para refinar adicionalmente el funcionamiento del anticuerpo. En general, el anticuerpo humanizado comprenderá sustancialmente la totalidad de al menos uno, y normalmente dos, dominios variables, en los que todos o sustancialmente todos los bucles hipervariables corresponden a los de una inmunoglobulina no humana o todas o sustancialmente todas las regiones FR son las de una secuencia de inmunoglobulina humana. El anticuerpo humanizado comprenderá también opcionalmente al menos una parte de una región constante de la inmunoglobulina (Fc), normalmente la de una inmunoglobulina humana. Para más detalles, véase Jones et al. (1986) Nature, 321:522-525; Riechmann et al. (1988) Nature 332:323-329; y Presta, (1992) Curr. Op. Struct. Biol., 2:593-596.
Los anticuerpos humanizados dirigidos contra ErbB2 incluyen huMAb4D5-1, huMAb4D5-2, huMAb4D5-3, huMAb4D5-4, huMAb4D5-5, huMAb4D5-6, huMAb4D5-7 y huMAb4D5-8 (HERCEPTIN®) como se describe en la Tabla 3 de la patente de Estados Unidos N° 5821337 que se ha incorporado por referencia en el presente documento de forma expresa; los anticuerpos 520C9 humanizados (documento WO 93/21319) y 2C4 humanizados como se describe más adelante en el presente documento.
Un anticuerpo "aislado" es uno que se ha identificado y separado y/o recuperado a partir de un componente de su entorno natural. Los componentes contaminantes de su ambiente natural son materiales que podrían interferir con los usos diagnósticos o terapéuticos del anticuerpo, y pueden incluir enzimas, hormonas y otros solutos proteicos o no proteicos. En las realizaciones preferidas, el anticuerpo se purificará (1) en más de un 95 % en peso de anticuerpo, según se determina mediante el método de Lowry y, lo más preferentemente, en más de un 99 % en peso, (2) hasta un grado suficiente para obtener al menos 15 restos de secuencia N-terminal o interna mediante el uso de un secuenciador de copa giratoria o (3) hasta homogeneidad mediante SDS-PAGE en condiciones reductoras o no reductoras usando azul de Coomassie o, preferentemente, tinción de plata. El anticuerpo aislado incluye el anticuerpo in situ en el interior de células recombinantes ya que al menos un componente del entorno natural del anticuerpo no estará presente. Generalmente, sin embargo, el anticuerpo aislado se preparará mediante al menos una etapa de purificación.
Un anticuerpo "que se une" a un antígeno de interés es uno capaz de unirse al antígeno con afinidad suficiente de tal manera que el anticuerpo es útil al dirigirse a una célula que expresa el antígeno.
Un anticuerpo que “induce apoptosis” es uno que induce la muerte celular programada como se determina por la unión de anexina V, fragmentación de a Dn , encogimiento celular, dilatación del retículo endoplásmico, fragmentación celular y/o formación de vesículas de membrana (denominados cuerpos apoptóticos). La célula es una célula tumoral, por ejemplo, una célula de mama, ovario, estómago, endometrio, glándula salival, pulmón, riñón, colon, tiroides, páncreas o vejiga. Están disponibles diversos métodos para evaluar los acontecimientos celulares asociados con la apoptosis. Por ejemplo, la translocación de fosfatidil serina (PS) puede medirse por unión de anexina; la fragmentación de ADN puede evaluarse mediante comparación con marcadores de ADN; y la condensación nuclear/de cromatina junto con fragmentación a lo largo del ADN puede evaluarse por cualquier aumento en células hipodiploides.
Un “trastorno" es cualquier dolencia que se beneficiaría del tratamiento de la presente invención. Esto incluye trastornos crónicos y agudos o enfermedades que incluyen dichas patologías que predisponen al mamífero al trastorno en cuestión. Los ejemplos no limitativos de trastornos que se van a tratar en el presente documento incluyen tumores benignos y malignos; leucemia y neoplasias malignas, en particular cáncer de mama, ovario, estómago, endometrio, glándula salival, pulmón, riñón, colon, tiroides, páncreas, próstata o vejiga; trastornos neuronales, gliales, astrocitales, hipotalámicos y otros trastornos glandulares, macrofágicos, estromales y blastocélicos; y trastornos inflamatorios, angiogénicos e inmunitarios.
La expresión "cantidad terapéuticamente eficaz" se refiere a una cantidad de un fármaco eficaz para tratar una enfermedad o trastorno en un mamífero. En el caso del cáncer, la cantidad terapéuticamente eficaz del fármaco puede reducir el número de células cancerosas; reducir el tamaño del tumor; inhibir (es decir, ralentizar hasta cierto punto y preferentemente detener) la infiltración de células cancerosas en los órganos periféricos; inhibir (es decir, ralentizar hasta cierto punto y preferentemente detener) la metástasis tumoral; inhibir, hasta cierto punto, el crecimiento tumoral; y/o aliviar hasta cierto punto uno o más de los síntomas asociados con el cáncer. En la medida que el fármaco puede evitar el crecimiento y/o destruir las células cancerosas existentes, este puede ser citostático y/o citotóxico. Para la terapia contra el cáncer, la eficacia se puede medir, por ejemplo, evaluando el tiempo hasta la progresión de la enfermedad (TTP) y/o determinando la tasa de respuesta (RR).
La expresión "cantidad sustancial" se refiere a una mayoría, es decir >50 % de una población, de una recogida o una muestra.
La expresión "metabolito intracelular" se refiere a un compuesto resultante de un proceso o reacción metabólica en el interior de una célula en un conjugado de anticuerpo y fármaco (ADC). El proceso o reacción metabólica puede ser un proceso enzimático tal como una escisión proteolítica de un enlazador peptídico del ADC, o la hidrólisis de un grupo funcional tal como una hidrazona, éster o amida. Los metabolitos intracelulares incluyen, aunque no de forma limitativa, anticuerpos y fármacos libres que han experimentado escisión intracelular después de la entrada, difusión, captación o transporte al interior de una célula.
Las expresiones "escindido intracelularmente" y "escisión intracelular" se refieren a un proceso o reacción metabólica en el interior de una célula sobre un conjugado fármaco-ligando, conjugado fármaco-enlazador-ligando, un conjugado de anticuerpo y fármaco (ADC) o similar en donde la unión covalente, por ejemplo, el enlazador, entre el resto de fármaco (D) y el anticuerpo (Ab) se rompe, dando como resultado el fármaco libre disociado del anticuerpo en el interior de la célula. Los restos escindidos del conjugado fármaco-ligando, un conjugado fármacoenlazador-ligando o ADC son por tanto metabolitos intracelulares.
El término "biodisponibilidad" se refiere a la disponibilidad sistémica (es decir, los niveles en sangre/plasma) de una cantidad dada de fármaco administrado a un paciente. La biodisponibilidad es un término absoluto que indica la medición tanto del tiempo (tasa) como la cantidad total (extensión) de fármaco que alcanza la circulación general de una forma de dosificación administrada.
El término "actividad citotóxica" se refiere la destrucción de células, efecto citostático o antiproliferativo de un conjugado de anticuerpo y fármaco o de un metabolito intracelular de un compuesto conjugado de anticuerpo y fármaco. La actividad citotóxica se puede expresar como el valor de la CI50, que es la concentración (molar o másica) por unidad de volumen a la que sobrevive la mitad de las células.
Los términos "cáncer" y "canceroso" se refieren o describen la afección fisiológica en mamíferos que se caracteriza normalmente por un crecimiento celular no regulado. Un "tumor" comprende una o mas células cancerosas. Los ejemplos de cáncer incluyen, aunque no de forma limitativa, carcinoma, linfoma, blastoma, sarcoma y leucemia o tumores malignos linfoides. Ejemplos más particulares de dichos cánceres incluyen cáncer de células escamosas (por ejemplo cáncer de células escamosas epiteliales), cáncer de pulmón, incluyendo cáncer de pulmón microcítico, cáncer de pulmón no microcítico ("CPNM"), adenocarcinoma de pulmón y carcinoma escamoso de pulmón, cáncer de peritoneo, cáncer hepatocelular, cáncer gástrico o de estómago, incluyendo cáncer gastrointestinal, cáncer pancreático, glioblastoma, cáncer de cuello uterino, cáncer de ovarios, cáncer de hígado, cáncer de vejiga, hepatoma, cáncer de mama, cáncer de colon, cáncer rectal, cáncer colorrectal, carcinoma de endometrio o uterino, carcinoma de las glándulas salivales, cáncer de riñón o renal, cáncer de próstata, cáncer de vulva, cáncer de tiroides, carcinoma hepático, carcinoma anal, carcinoma del pene, así como cáncer de cabeza y cuello.
Un "cáncer que expresa ErbB2" es uno que produce niveles suficientes de ErbB2 en la superficie de las células del mismo, de tal forma que un anticuerpo dirigido contra ErbB2 se puede unir a las mismas y tener un efecto terapéutico con respecto al cáncer.
Un cáncer "caracterizado por la activación excesiva" de un receptor de ErbB2 es uno en el que el grado de activación del receptor de ErbB2 en las células cancerosas supera significativamente el nivel de activación de dicho receptor en las células no cancerosas del mismo tipo de tejido. Dicha activación excesiva puede ser el resultado de una expresión en exceso del receptor de ErbB2 y/o de niveles superiores a los normales de un ligando de ErbB2 disponible para activar el receptor de ErbB2 en las células cancerosas. Dicha activación excesiva puede producir y/o estar causada por el estado maligno de una célula cancerosa. En algunas realizaciones, el cáncer se someterá a un ensayo de diagnóstico o pronóstico para determinar si la amplificación y/o la expresión en exceso de un receptor de ErbB2 se está produciendo y da como resultado dicha activación excesiva del receptor de ErbB2. De forma alternativa o adicional, el cáncer se puede someter a un ensayo de diagnóstico o pronóstico para determinar si la amplificación y/o la expresión en exceso de un ligando de ErbB2 se está produciendo en el cáncer, lo que se atribuye a una activación excesiva del receptor. En un subconjunto de dichos cánceres, una activación excesiva del receptor puede ser el resultado de una ruta de estimulación autocrina.
Un cáncer que "expresa en exceso" un receptor de ErbB2 es uno que tiene niveles significativamente más elevados de un receptor de ErbB2 en la superficial celular de la misma, en comparación con una célula no cancerosa del mismo tipo tisular. Dicha expresión en exceso puede estar provocada por la amplificación génica o por transcripción o traducción aumentadas. La expresión en exceso del receptor de ErbB2 se puede determinar en un ensayo de diagnóstico o pronóstico mediante la evaluación de los niveles aumentados de la proteína ErbB2 presente en la superficie de una célula (por ejemplo, mediante un ensayo de inmunohistoquímica; IHC). De forma alternativa, o adicional, se pueden medir los niveles del ácido nucleico que codifica ErbB2 en la célula, por ejemplo, mediante hibridación fluorescente in situ (FISH; véase el documento WO 98/45479), transferencia Southern o técnicas de reacción en cadena de la polimerasa (PCR), tales como PCR cuantitativa en tiempo real (RT-PCR). La expresión en exceso del ligando de ErbB2, puede determinarse de forma diagnóstica evaluando los niveles del ligando (o ácido nucleico que lo codifica) en el paciente, por ejemplo, en una biopsia tumoral o por diversos ensayos de diagnóstico tales como los ensayos IHC, FISH, transferencia Southern, p Cr o los ensayos in vivo descritos anteriormente. También se puede estudiar la expresión en exceso de receptor de ErbB2 midiendo el antígeno desprendido (por ejemplo, dominio extracelular de ErbB2) en un fluido biológico tal como suero (véase, por ejemplo, patente de Estados Unidos n.° 4933294; WO 91/05264; patente de Estados Unidos n.° 5401638; y Sias et al., (1990) J. Immunol Methods, 132: 73-80). Además de los anteriores ensayos, están disponibles otros ensayos in vivo para el especialista experto. Por ejemplo, se pueden exponer células dentro del cuerpo del paciente a un anticuerpo que está marcado opcionalmente con un marcador detectable, por ejemplo, por ejemplo un isotopo radioactivo, y puede evaluarse la unión del anticuerpo con células en el paciente, por ejemplo, mediante barrido externo de la radioactividad o analizando una biopsia tomada de un paciente anteriormente expuesto al anticuerpo.
Los tumores que expresan HER2 en exceso reciben puntuaciones inmunohistoquímicas correspondientes al número de copias de moléculas HER2 expresadas por célula, y se puede determinar por vía bioquímica: 0 = 0-10.000 copias/célula, 1+ = al menos aproximadamente 200.000 copias/célula, 2+ = al menos aproximadamente 500.000 copias/célula, 3+ = aproximadamente 1-2 x 106 copias/célula. La expresión de BER2 en exceso en el nivel 3+, que conduce a la activación independiente del ligando de la tirosina quinasa (Hudziak et al., (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84:7159-7163), se produce en aproximadamente un 30 % de los cánceres de mama y, en estas pacientes, la supervivencia sin recidiva y la supervivencia global está disminuida (Slamon et al., (1989) Science, 244:707-712; Slamon y col., (1987) Science, 235:177-182).
Por el contrario, un cáncer que "no está caracterizado por la expresión en exceso del receptor de ErbB2" es uno en el que, en un ensayo diagnóstico, no expresa niveles del receptor de ErbB2 superiores a los normales, en comparación con una célula no cancerosa del mismo tipo tisular.
La expresión "agente citotóxico", tal como se usa en el presente documento, se refiere a una sustancia que inhibe o evita la función de las células y/o produce la destrucción de las células. Se pretende que el término incluya isótopos radiactivos (por ejemplo, 211At, 11I, 125I, 90Y, 186Re, 188Re, 153Sm, 212Bi, 2P, 60C, e isótopos radiactivos de Lu), agentes quimioterapéuticos y toxinas tales como toxinas de moléculas pequeñas o toxinas enzimáticamente activas de origen bacteriano, fúngico, vegetal o animal, incluidos los análogos sintéticos y sus derivados. En un aspecto, el término no pretende incluir isótopos radiactivos.
Un "agente quimioterapéutico" es un compuesto químico útil en el tratamiento del cáncer. Los ejemplos de agentes quimioterapéuticos incluyen agentes alquilantes tales como tiotepa y CYTOXAN® ciclofosfamida; alquilsulfonatos tales como busulfán, improsulfán y piposulfán; aziridinas tales como benzodopa, carbocuona, meturedopa, y uredopa; etileniminas y metilmelaminas incluyendo altretamina, trietilenmelamina, trietilenfosforamida, trietilentiofosforamida y trimetilolmelamina; TLK 286 (TELCYTA™); acetogeninas (especialmente bullatacina y bullatacinona); delta-9-tetrahidrocannabinol (dronabinol, MARINOL®); beta-lapachona; lapachol; colchicinas; ácido betulínico; una camptotecina incluyendo el análogo sintético de topotecan (HYCAMTIN®), CPT-11 (irinotecan, CAMPTOSAR®), acetilcamptotecina, escopolectina y 9-aminocamptotecina); briostatina; calistatina; CC-1065 (incluyendo sus análogos sintéticos adozelesina, carzelesina y bizelesina); podofilotoxina; ácido podofilínico; tenipósido; criptoficinas (particularmente criptoficina 1 y criptoficina 8); dolastatina; duocarmicina (incluyendo los análogos sintéticos, KW-2189 y CB1-TM1); eleuterobina; pancratistatina; una sarcodictina; espongistatina; mostazas de nitrógeno tales como clorambucilo, clornafazina, ciclofosfamida, estramustina, ifosfamida, mecloretamina, clorhidrato de óxido de mecloretamina, melfalán, novembiquina, fenesterina, prednimustina, trofosfamida, mostaza de uracilo; nitrosoureas, tales como carmustina, clorozotocina, fotemustina, lomustina, nimustina y ranimnustina; bisfosfonatos, tal como clodronato; antibióticos tales como los antibióticos de enediina (por ejemplo, caliqueamicina, especialmente calicamicina gamma 1I y calicamicina omega I1 (véase, por ejemplo, Agnew, Chem Intl. Ed. Engl., 33:183-186 (1994)) y antraciclinas tales como annamicina, AD 32, alcarrubicina, daunorubicina, dexrazoxano, DX-52-1, epirubicina, GPX-100, idarubicina, KRN5500, menogaril, dinemicina, incluyendo dinemicina A, una esperamicina, cromóforos de neocarzinostatina y cromóforos del antibiótico enediina de la cromoproteína relacionada, aclacinomisinas, actinomicina, autramicina, azaserina, bleomicinas, cactinomicina, carabicina, carminomicina, carcinofilina, cromomicinas, dactinomicina, detorrubicina, 6-diazo-5-oxo-L-norleucina, ADRIAMYCIN® doxorubicina (incluyendo morfolino-doxorubicina, cianomorfolino-doxorrubicina, 2-pirrolinodoxorrubicina, doxorrubicina liposómica, y desoxidoxorrubicina), esorrubicina, marcelomicina, mitomicinas tales como mitomicina C, ácido micofenólico, nogalamicina, olivomicinas, peplomicina, potfiromicina, puromicina, quelamicina, rodorrubicina, estreptonigrina, estreptozocina, tubercidina, ubenimex, zinostatina, y zorrubicina; análogos del ácido fólico tales como denopterina, pteropterina, y trimetrexato; análogos de purina tales como fludarabina, 6-mercaptopurina, tiamiprina, y tioguanina; análogos de pirimidina tales como ancitabina, azacitidina, 6-azauridina, carmofur, citarabina, didesoxiuridina, doxifluridina, enocitabina, y floxuridina; andrógenos, tales como calusterona, propionato de dromostanolona, epitiostanol, mepitiostana, y testolactona; anti-adrenales tales como aminoglutetimida, mitotano, y trilostano; rellenador de ácido fólico tal como ácido folínico (leucovorina); aceglatona; agentes antineoplásicos dirigidos contra folato tales como ALIMTA®, LY231514 pemetrexed, inhibidores de la dihidrofolato reductasa tales como metotrexato, antimetabolitos tales como 5-fluorouracilo (5-FU) y sus profármacos tales como UFT, S-1 y capecitabina, e inhibidores de la timidilato sintasa e inhibidores de la glicinamida ribonucleótido formiltransferasa tales como raltitrexed (TOMUDEXrm, TDX); inhibidores de la dihidropirimidina deshidrogenasa tal como eniluracilo; glucósido de aldofosfamida; ácido aminolevulínico; amsacrina; bestrabucilo; bisantreno; edatraxato; defofamina; demecolcina; diazicuona; elfornitina; acetato de eliptinio; una epotilona; etoglúcido; nitrato de galio; hidroxiurea; lentinan; lonidainina; maitansinoides tales como maitansina y ansamitocinas; mitoguazona; mitoxantrona; mopidanmol; nitraerina; pentostatina; fenamet; pirarrubicina; losoxantrona; 2-etilhidrazida; procarbazina; complejo de polisacárido PSK® (JHS Natural Products, Eugene, OR); razoxana; rizoxina; sizofiran; espirogermanio; ácido tenuazónico; triazicuona; 2,2',2"-triclorotrietilamina; tricotecenos (especialmente toxina T-2, verracurina A, roridina A y anguidina); uretano; vindesina (ELDISINE®, FILDESIN®); dacarbazina; manomustina; mitobronitol; mitolactol; pipobromano; gacitosina; arabinósido ("Ara-C"); ciclofosfamida; tiotepa; taxoides y taxanos, por ejemplo, TAXOL® paclitaxel (Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, N.J.), ABRAXANE™ exento de cremóforo, formulación de nanopartículas de paclitaxel diseñadas con albúmina (American Pharmaceutical Partners, Schaumberg, Illinois), y TAXOTERE® doxetaxel (Rhóne-Poulenc Rorer, Antony, Francia); clorambucilo; gemcitabina (GEMZAR®); 6-tioguanina; mercaptopurina; platino; análogos de platino o análogos basados en platino tales como cisplatino, oxaliplatino y carboplatino; vinblastina (VELBAN®); etopósido (VP-16); ifosfamida; mitoxantrona; vincristina (ONCOVIN®); alcaloide de la vinca; vinorelbina (NAVELBINE®); novantrona; edatrexato; daunomicina; aminopterina; xeloda; ibandronato; inhibidor de la topoisomerasa RFS 2000; difluorometilornitina (DMFO); retinoides tales como ácido retinoico; sales farmacéuticamente aceptables, ácidos o derivados de cualquiera de los anteriores; así como combinaciones de dos o más de los anteriores tales como CHOP, una abreviatura de una terapia combinada de ciclofosfamida, doxorrubicina, vincristina, y prednisolona, y FOLFOX, una abreviatura para un régimen de tratamiento con oxiplatino (ELOXATIN™) combinado con 5-FU y leucovorina.
Incluidos también en esta definición están los agentes antihormonales que actúan para regular o inhibir la acción hormonal sobre los tumores tales como antiestrógenos y moduladores selectivos de los receptores de estrógenos (SERM), incluyendo, por ejemplo, tamoxifeno (incluyendo tamoxifeno NOLVADEX®), raloxifeno, droloxifeno, 4-hidroxitamoxifeno, trioxifeno, keoxifeno, LY117018, onapristona, y FARESTON® toremifeno; inhibidores de la aromatasa que inhiben la enzima aromatasa, que regula la producción de estrógeno en las grándulas suprarrenales, tales como, por ejemplo, 4(5)-imidazoles, aminoglutetimida, MEGASE® megestrol acetato, AROMASIN® exemestano, Pfizer), formestanio, fadrozol, RIVISOR® vorozol, FEMARA® letrozol, y ARIMIDEX® anastrozol; y antiandrógenos tales como flutamida, nilutamida, bicalutamida, leuprolida, y goserelina; así como troxacitabina (un análogo nucleosídico de 1,3-dioxolano citosina; oligonucleótidos de sentido contrario, especialquier aquellos que inhiben la expresión de genes en las rutas de señalización implicadas en la proliferación celular anómala, tales como, por ejemplo, PKC-alfa, Raf, H-Ras, y el receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGF-R); vacunas tales como vacunas para terapia génica, por ejemplo, vacuna ALLOVECTIN®, vacuna LEUVECTIN® y vacuna VAXID®; PROLEUKIN® rIL-2; el inhibidor de la topoisomerasa 1 LURTOTECAN®; ABARELIX® rmRH; y las sales, ácidos o derivados farmacéuticamente aceptables de cualquiera de los anteriores.
Como se usa en el presente documento, “fármaco dirigido a EGFR” se refiere a un agente terapéutico que se une con EGFR y, opcionalmente, inhibe la activación de EGFR. Los ejemplos de dichos agentes incluyen anticuerpos y moléculas pequeñas que se unen a EGFR. Los ejemplos de anticuerpos que se unen a EGFR incluyen MAb 579 (ATCC CRL HB 8506), MAb 455 (ATCC CRL HB8507), MAb 225 (ATCC CRL 8508), MAb 528 (ATCC CRL 8509) (véase, patente de EE.UU. n.° 4943533, Mendelsohn et al.) y variantes de los mismos, tales como 225 quimerizado (C225 o Cetuximab; ERBITUX®) y 225 humano remodelado (H225) (véase, documento WO 96/40210, Imclone Systems Inc.); anticuerpos que se unen con EGFR mutante de tipo II (patente de Estados Unidos n.° 5.212.290); anticuerpos humanizados y quiméricos que se unen a EGFR como se describen en la patente de Estados Unidos n.° 5891996; y anticuerpos humanos que se unen a EGFR, tales como ABX-EGF (véase el documento WO 98/50433, Abgenix). El anticuerpo dirigido contra EGFR puede conjugarse con un agente citotóxico, generando de este modo un inmunoconjugado (véase,por ejemplo, el documento EP 659.439A2), Merck Patent GmbH). Los ejemplos de moléculas pequeñas que se unen a EGFR incluyen ZD1839 o Gefitinib (IRESSA™; Astra Zeneca), Erlotinib HCl (CP-358774, TARCEVA™; Genentech/OSI) y AG1478, AG1571 (SU 5271; Sugen).
Un “inhibidor de tirosina quinasa” es una molécula que inhibe en cierta medida la actividad tirosina quinasa de una tirosina quinasa tal como un receptor de ErbB. Los ejemplos de dichos inhibidores incluyen los fármacos dirigidos a EGFR indicados en los párrafos anteriores, así como las quinazolinas tales como PD 153035,4-(3-cloroanilino) quinazolina, piridopirimidinas, pirimidopirimidinas, pirrolopirimidinas, tales como CGP 59326, CGP 60261 y CGP 62706, y pirazolopirimidinas, 4-(fenilamino)-7H-pirrolo[2,3-d] pirimidinas, curcumina (diferuloil metano, 4,5-bis (4-fluoroanilino)ftalimida), tirfostinas que contienen restos de nitrotiofeno; PD-0183805 (Warner-Lambert); moléculas de sentido contrario (por ejemplo las que se unen con ácido nucleico que codifica ErbB); quinoxalinas (patente de Estados Unidos n.° 5,804,396); trifostinas (patente de Estados Unidos n.° 5804396); ZD6474 (Astra Zeneca); PTK-787 (Novartis/Schering AG); pan-inhibidores de ErbB tales como CI-1033 (Pfizer); Affinitac (ISIS 3521; Isis/lilly); Imatinib mesilato (Gleevac; Novartis); PKI 166 (Novartis); GW2016 (Glaxo SmithKline); CI-1033 (Pfizer); EKB-569 (Wyeth); Semaxanib (Sugen); ZD6474 (AstraZeneca); Pt K-787 (Novartis/Schering AG); INC-1C11 (Imclone); o como se ha descrito en cualquiera de las siguientes publicaciones de patente: patente de Estados Unidos n.° 5804396; WO 99/09016 (American Cyanamid); WO 98/43960 (American Cyanamid); WO 97/38983 (Warner Lambert); WO 99/06378 (Warner Lambert); WO 99/06396 (Warner Lambert); WO 96/30347 (Pfizer, Inc); WO 96/33978 (Zeneca); WO 96/3397 (Zeneca); y WO 96/33980 (Zeneca).
Un “agente anti-angiogénico” se refiere a un compuesto que bloquea, o interfiere en algún grado con el desarrollo de vasos sanguíneos. El factor anti-angiogénico puede, por ejemplo, ser una molécula pequeña o anticuerpo que se une a un factor de crecimiento o receptor del factor de crecimiento implicado en la promoción de angiogénesis. En una realización, el factor anti-angiogénico es un anticuerpo que se une al factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF).
El término “citoquina” es un término genérico para proteínas liberadas por una población celular que actúan en otra célula como mediadores intercelulares. Ejemplos de tales citoquinas son linfocinas, monocinas y hormonas polipeptídicas tradicionales. Entre las citoquinas se incluyen hormonas del crecimiento, tal como hormona de crecimiento humana, la hormona de crecimiento humana con N-metionilo y la hormona de crecimiento bovina; hormona paratiroidea; tiroxina; insulina; proinsulina; relaxina; prorelaxina; hormonas glucoproteicas, tales como la hormona folículo estimulante (FSH), hormona estimulante de la tiroides (TSH) y hormona luteinizante (LH); el factor de crecimiento hepático; factor de crecimiento de fibroblastos; prolactina; lactógeno placentario; factores a y p de necrosis tumoral; sustancia inhibidora mulleriana; péptido asociado a gonadotropina de ratón; inhibina; activina; factor de crecimiento endotelial vascular; integrina; trombopoyetina (TPO); factores de crecimiento neural, tal como NGF-p; factor de crecimiento derivado de plaquetas; factores de crecimiento transformantes (TGF), tales como TGF-a y TGF-p; factor de crecimiento similar a la insulina-I y -II; eritropoyetina (EPO); factores osteoinductivos; interferones tales como interferón-a, -p y -y; factores estimulantes de colonias (CSF), tales como CSF de macrófagos (M-CSF); granulocito-macrófago-CSF (Gm-CSF); y granulocito-CSF (G-CSF); interleuquinas (IL) tales como IL-1, IL-1a, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12; un factor de necrosis tumoral, tal como TNF-a o TNF-p; y otros factores polipeptídicos que incluyen LIF y ligando de kit (KL). Como se usa en el presente documento, el término citoquina incluye proteínas de fuentes naturales o de cultivo de células recombinantes y equivalentes biológicamente activos de las citoquinas de secuencia nativa.
El término "profármaco", tal como se usa en esta solicitud se refiere a una forma precursora o derivada de una sustancia farmacéuticamente activa que es menos citotóxica para las células tumorales en comparación con el fármaco progenitor y es capaz de activarse enzima o hidrolíticamente o convertirse en una forma progenitora más activa. Véase, por ejemplo, Wilman, "Prodrugs in Cancer Chemotherapy" Biochemical Society Transactions, 14, pp.
375-382, 615th Meeting Belfast (1986) y Stella et al., "Prodrugs: A Chemical Approach to Targeted Drug Delivery," Directed Drug Delivery, Borchardt et al., (ed.), págs. 247-267, Humana Press (1985). Los profármacos de la presente invención incluyen, aunque no de forma limitativa, profármacos que contienen fosfato, profármacos que contienen tiofosfato, profármacos que contienen sulfato, profármacos que contienen péptidos, profármacos modificados por D-aminoácidos, profármacos glicosilados, profármacos que contienen p-lactama, profármacos que contienen fenoxiacetamida opcionalmente sustituida o profármacos que contienen fenilacetamida opcionalmente sustituida, 5-fluorocitosina y otros profármacos de 5-fluorouridina que se pueden convertir en el fármaco exento de citotoxicidad más activo. Los ejemplos de fármacos citotóxicos que se pueden derivatizar en una forma de profármaco para el uso en la presente invención incluyen, aunque no de forma limitativa, dichos agentes quimioterapéuticos descritos anteriormente.
Un "liposoma" es una pequeña vesícula compuesta por varios tipos de lípidos, fosfolípidos y/o tensioactivos que es útil para la administración de un fármaco (tal como para la inclusión de anticuerpos dirigidos contra CD30, CD40, CD70 o Lewis Y, y, opcionalmente, un agente quimioterapéutico) a un mamífero. Los componentes del liposoma habitualmente están dispuestos en una formación de bicapa, similar a la disposición lipídica de las membranas biológicas. El término "prospecto" se usa para referirse a instrucciones habitualmente incluidas en los envases comerciales de productos terapéuticos, que contienen información sobre las indicaciones, el uso, la dosificación, administración, las contraindicaciones y/o las advertencias en referencia al uso de tales productos terapéuticos.
Una molécula de ácido nucleico "aislada" es una molécula de ácido nucleico que se identifica y separa de al menos una molécula de ácido nucleico contaminante con la que normalmente está asociada en la fuente natural del ácido nucleico del anticuerpo. Una molécula de ácido nucleico aislado es diferente en la forma o configuración de la que se encuentra en la naturaleza. Por lo tanto, las moléculas de ácido nucleico aisladas se distinguen de la molécula de ácido nucleico tal como existe en las células naturales. Sin embargo, una molécula de ácido nucleico aislada incluye una molécula de ácido nucleico contenida en células que expresan normalmente el anticuerpo donde, por ejemplo, la molécula de ácido nucleico se encuentra en una localización cromosómica distinta de la de las células naturales.
La expresión "secuencias de control" se refieren a las secuencias de ADN necesarias para la expresión de una secuencia de codificación unida de manera operativa a un organismo hospedador particular. Las secuencias de control que son adecuadas para procariotas, por ejemplo, incluyen un promotor, opcionalmente una secuencia de operador, y un sitio de unión al ribosoma. Se sabe que las células eucariotas utilizan promotores, señales de poliadenilación, y potenciadores.
Un ácido nucleico está "unido de manera operativa" cuando se coloca en una relación funcional con otra secuencia de ácido nucleico. Por ejemplo, el ADN de una presecuencia o líder de secreción está operativamente unido al ADN de un polipéptido si se expresa en forma de una preproteína que participa en la secreción del polipéptido; un promotor o potenciador está operablemente unido a una secuencia de codificación si altera la transcripción de la secuencia; o un sitio de unión al ribosoma está operativamente unido a una secuencia de codificación si está colocado de manera que facilite la traducción. En general, "unido de manera operativa" significa que las secuencias de ADN que están unidas son contiguas, y, en el caso de un líder de secreción, contiguas y en fase de lectura. Sin embargo, los potenciadores no tienen por qué ser contiguos. La unión se puede llevar a cabo mediante ligadura en sitios de restricción convenientes. Si dichos sitios no existen, se pueden utilizar adaptadores o enlazadores de oligonucleótidos sintéticos de acuerdo con la práctica convencional.
Como se usa en el presente documento, las expresiones "célula", "línea de células," y "cultivo celular' pueden usarse de forma indistinta y todas estas denominaciones incluyen la descendencia. Por tanto, las palabras "transformantes" y "células transformadas", incluyen la célula primaria sujeto y los cultivos derivados de los anteriores sin tener en cuenta el número de transferencias. Se entiende también que toda la progenie puede no ser precisamente idéntica en el contenido de ADN, debido a mutaciones deliberadas o inadvertidas. Se incluye la progenie mutante que tiene la misma función o actividad biológica que la cribada para la célula originalmente transformada. Cuando se propongan designaciones distintas, esto será evidente según el contexto.
En el presente documento, una "enfermedad autoinmunitaria" es una enfermedad o trastorno que procede y se dirige contra los propios tejidos de un individuo o un segregado simultáneo o manifestación del mismo o dolencia resultante del anterior. Los ejemplos de enfermedades o trastornos autoinmunitarios incluyen, aunque no de forma limitativa, artritis (artritis reumatoide, artritis reumatoide juvenil, artrosis, artritis psoriásica y espondilitis anquilosante), psoriasis, dermatitis incluida la dermatitis atópica; urticaria idiopática crónica, incluida la urticaria crónica autoinmunitaria, polimiositis/dermatomiositis, necrolisis epidérmica tóxica, escleroderma sistémico y esclerosis, respuestas asociadas con la enfermedad inflamatoria del intestino (IBD) (enfermedad de Crohn, colitis ulcerosa), y enfermedad inflamatoria del intestino (EII) con cosegregados de pioderma gangrenoso, eritema nudoso, colangitis esclerosante primaria, y/o episcleritis), síndrome de dificultad respiratoria, incluido síndrome de dificultad respiratoria en el adulto (SDRA), meningitis, enfermedades mediadas por IgE tales como la anafilaxia y rinitis alérgica, encefalitis tales como la encefalitis de Rasmussen, uveítis, colitis tales como colitis microscópica y colitis colagenosa, glomerulonefritis (GN) tales como GN membranosa, GN membranosa idiopática, GN membranosa proliferativa (MPGN), incluidos el Tipo I y el Tipo II, y la GN rápidamente progresiva, dolencias alérgicas, eccema, asma, dolencias que implican la infiltración de linfocitos T y respuestas inflamatorias crónicas, ateroesclerosis, miocarditis autoinmunitaria, deficiencia de adhesión de leucocitos, lupus sistémico eritematoso (LSE) tal como LSE cutáneo, lupus (que incluye nefritis, cerebritis, pediátrico, no renal, discoide, alopecia), diabetes de inicio juvenil, esclerosis múltiple (EM) tal como la EM espinodorsal, encefalomielitis alérgica, respuestas inmunitarias asociadas con una hipersensibilidad aguda y retrasada mediada por las citoquinas y linfocitos T, tuberculosis, sarcoidosis, granulomatosis, incluida la granulomatosis de Wegener, agranulocitosis, vasculitis (incluida vasculitis de vasos grandes (incluida la polimialgia reumática y la arteritis de células gigantes (de Takayasu)), vasculitis de vasos intermedios (incluyendo la enfermedad de Kawasaki y la poliarteritis nodosa), vasculitis del SNC, y vasculitis asociadas con ANCA, tal como la vasculitis o síndrome de Churg-Strauss (CSS)), anemia aplásica, anemia positiva de Coombs, eritroblastopenia congénita de Blackfan-Diamond, anemia hemolítica inmunitaria que incluye la anemia hemolítica autoinmunitaria (AIHA), anemia perniciosa, aplasia pura de glóbulos rojos (PRCA), deficiencia en factor VIII, hemofilia A, neutropenia autoinmunitaria, pancitopenia, leucopenia, enfermedades que implican la diapedesis leucocitaria, trastornos inflamatorios del SNC, síndrome de lesión multiorgánica, miastenia grave, enfermedades mediadas por el complejo antígeno-anticuerpo, enfermedad de la membrana basal antiglomerular, síndrome de anticuerpos antifosfolípidos, neuritis alérgica, enfermedad de Bechet, síndrome de Castleman, síndrome de Goodpasture, síndrome miasténico de Lambert-Eaton, síndrome de Raynaud, síndrome de Sjorgen, síndrome de Stevens-Johnson, rechazo al trasplante de órgano sólido (incluido el pretratamiento de los títulos elevados de anticuerpos reactivos del panel, depósitos de IgA en tejidos, y rechazo que procede del trasplante renal, trasplante de hígado, trasplante intestinal, trasplante cardíaco, etc.), enfermedad de injerto contra hospedador (EICH), penfigoide ampolloso, pénfigo (incluidos pénfigo vulgar, foliáceo, y pénfigo mucoso-penfigoide de la membrana), poliendocrinopatías autoinmunitarias, enfermedad de Reiter, síndrome del hombre rígido, nefritis del complejo inmunitario, polineuropatías por IgM o polineuropatías mediadas por IgM, púrpura trombocitopénica idiopática (ITP), púrpura trombocitopénica trombótica (Tt P), trombocitopenia (tal como la desarrollada por pacientes con infarto de miocardio, por ejemplo), incluida la trombocitopenia autoinmunitarias, enfermedad autoinmunitaria del testículo y ovario incluidas la orquitis autoinmunitaria y la ooforitis, hipotiroidismo primario; enfermedades endocrinas autoinmunitarias incluida la tiroiditis autoinmunitaria, tiroiditis crónica (tiroiditis de Hashimoto), tiroiditis subaguda, hipotiroidismo idiopático, enfermedad de Addison, enfermedad de Grave, síndromes poliglandulares autoinmunitarios (o síndromes poliglandulares endocrinopáticos), diabetes Tipo I, también denominada como diabetes mellitus dependiente de insulina (IDDM), incluida la IDDM pediátrica y el síndrome de Sheehan; hepatitis autoinmunitaria, neumonitis intersticial linfoide (VIH), bronquiolitis obliterante (sin trasplante) frente a NSIP, síndrome de Guillain-Barre, enfermedad de Berger (nefropatía por IgA), cirrosis biliar primaria, celiaquía (enteropatía por gluten), esprúe resistente al tratamiento con un cosegregado de dermatitis herpetiforme, crioglobulinemia, esclerosis lateral amiotrófica (ELA; enfermedad de Lou Gehrig), enfermedad de las arterias coronarias, enfermedad del oído interno autoinmunitaria (AIED), pérdida de la audición autoinmunitaria, síndrome de opsoclonía-mioclonía (OMS), policondritis tal policondritis resistente al tratamiento, proteinosis pulmonar alveolar, amiloidosis, hepatitis de células gigantes, escleritis, gammopatía monoclonal de significación indeterminada/desconocida (MGUS), neuropatía periférica, síndrome paraneoplásico, canelopatías tales como epilepsia, migraña, arritmias, trastornos musculares, sordera, ceguera, parálisis periódica, y canalopatías del SNC; autismo, miopatía inflamatoria, y glomeruloesclerosis focal segmental (FSGS).
"Alquilo" es un hidrocarburo C1-C18 que contiene átomos de carbono normales, secundarios, terciarios o cíclicos. Los ejemplos son, metilo (Me, -CH3), etilo (Et, -CH2CH3), 1 -propilo (n-Pr, n-propilo, -CH2CH2CH3), 2-propilo (i-Pr, ipropilo, -CH(CH3)2), 1 -butilo (n-Bu, n-butilo, -CH2CH2CH2CH3), 2-metil-1-propilo (i-Bu, i-butilo, -CH2CH(CH3)2), 2-butilo (s-Bu, s-butilo, -CH(CH3)CH2CH3), 2-metil-2-propilo (t-Bu, t-butilo, -C(CH3)3), 1 -pentilo (n-pentilo, -CH2CH2CH2CH2CH3), 2-pentilo (-CH(CH3)CH2CH2CH3), 3-pentilo (-CH(CH2CH3)2), 2-metil-2-butilo (-C(CH3)2CH2CH3), 3-metil-2-butilo (-CH(CH3)CH(CH3)2), 3-metil-1-butilo (-CH2CH2CH(CH3)2), 2-metil-1-butil(-CH2CH(CH3)CH2CH3), 1-hexilo (-CH2CH2CH2CH2CH2CH3), 2-hexilo (-CH(CH3)CH2CH2CH2CH3), 3-hexilo (-CH(CH2CH3)(CH2CH2CH3)), 2-metil-2-pentilo (-C(CH3)2CH2CH2CH3), 3-metil-2-pentilo (-CH(CH3)CH(CH3)CH2CH3), 4-metil-2-pentilo (-CH(CH3)CH2CH(CH3)2), 3-metil-3-pentilo (-C(CH3)(CH2CH3)2), 2-metil-3-pentilo (-CH(CH2CH3)CH(CH3)2), 2,3-dimetil-2-butilo (-C(CH3)2CH(CH3)2), 3,3-dimetil-2-butilo (-CH(CH3)C(CH3)3.
"Alquenilo" es un hidrocarburo C2-C18 que contiene átomos de carbono normales, secundarios, terciarios o cíclicos, con al menos un sitio de insaturación, es decir un doble enlace carbono-carbono, sp2. Los ejemplos incluyen, aunque no de forma limitativa: etileno o vinilo (-CH=CH2), alilo (-CH2CH=CH2), ciclopentenilo (-C5H7) y 5-hexenilo (-CH2CH2CH2CH2CH=CH2).
"Alquinilo" es un hidrocarburo C2-C18 que contiene átomos de carbono normales, secundarios, terciarios o cíclicos, con al menos un sitio de insaturación, es decir un triple enlace carbono-carbono sp. Los ejemplos incluyen, aunque no de forma limitativa: acetilénico (-CECH) y propargilo (-CH2CECH).
Alquileno se refiere a un radical hidrocarburo de cadena lineal o ramificada o cíclico de 1-18 átomos de carbono, y que tiene dos centros radicales monovalentes derivado mediante la retirada de dos átomos de hidrógeno de los mismos o dos átomos de carbono diferentes de un alcano precursor. Los radicales alquileno típicos incluyen, aunque no de forma limitativa: metileno (-CH2-) 1,2-etilo (-CH2CH2-), 1,3-propilo (-CH2CH2CH2-), 1,4-butilo (-CH2CH2CH2CH2-) y similares.
"Alquileno" se refiere a un radical hidrocarburo insaturado, de cadena lineal o ramificada o cíclico de 2-18 átomos de carbono, y que tiene dos centros radicales monovalentes derivado mediante la retirada de dos átomos de hidrógeno del mismo o dos átomos de carbono diferentes de un alqueno precursor. Los radicales alquenileno típicos incluyen, aunque no de forma limitativa: 1,2-etileno (-CH=CH-).
"Alquinileno" se refiere a un radical hidrocarburo insaturado,de cadena lineal o ramificada o cíclico de 2-18 átomos de carbono, y que tiene dos centros radicales monovalentes derivado mediante la retirada de dos átomos de hidrógeno del mismo o dos átomos de carbono diferentes de un alquino precursor. Los radicales alquinileno típicos incluyen, aunque no de forma limitativa: acetileno (-C=C-), propargilo (-CH2C=C-), y 4-pentinilo (-CH2CH2CH2C=CH-).
"Arilo" se refiere a un radical hidrocarburo aromático monovalente de 6-20 átomos de carbono obtenido por la retirada de un átomo de hidrógeno de un solo átomo de carbono de un sistema de anillo aromático precursor. Algunos grupos arilo se representan en las estructuras a modo de ejemplo como "Ar". Los grupos arilo típicos incluyen, aunque no de forma limitativa, los radicales se derivan a partir de benceno, benceno sustituido, naftaleno, antraceno, bifenilo y similares.
"Arilalquilo" se refiere a un radical alquilo acíclico en el que uno de los átomos de hidrógeno enlazados a un átomo de carbono, normalmente un átomo de carbono terminal o sp3, está sustituido por un radical arilo. Los grupos arilalquilo típicos incluyen, aunque no de forma limitativa, bencilo, 2-feniletan-1-ilo, 2-fenileten-1-ilo, naftilmetilo, 2-naftiletan-1-ilo, 2-naftileten-1-ilo, naftobencilo, 2-naftofeniletan-1-ilo y similares. El grupo arilalquilo comprende 6 a 20 átomos de carbono, por ejemplo, el resto alquilo, incluyendo los grupos alcanilo, alquenilo o alquinilo, del resto arilalquilo tiene de 1 a 6 átomos de carbono y el resto arilo tiene de 5 a 14 átomos de carbono.
"Heteroarilalquilo" se refiere a un radical alquilo acíclico en el que uno de los átomos de hidrógeno enlazados a un átomo de carbono, normalmente un átomo de carbono terminal o sp3, está sustituido por un radical heteroarilo. Los grupos heteroarilalquilo típicos incluyen, aunque no de forma limitativa, 2-bencimidazolilmetilo, 2-furiletilo, y similares. El grupo heteroarilalquilo comprende 6 a 20 átomos de carbono, por ejemplo, el resto alquilo, incluyendo los grupos alcanilo, alquenilo o alquinilo, del grupo heteroarilalquilo tiene 1 a 6 átomos de carbono, y el resto heteroarilo tiene 5 a 14 átomos de carbono y 1 a 3 heteroátomos seleccionados de N, O, P, y S. El resto heteroarilo del grupo heteroarilalquilo puede ser un monociclo que tiene de 3 a 7 miembros del anillo (2 a 6 átomos de carbono) 0 un biciclo que tiene 7 a 10 miembros del anillo (4 a 9 átomos de carbono) y 1 a 3 heteroátomos seleccionados entre N, O, P, y S), por ejemplo: un sistema biciclo [4,5], [5,5], [5,6], o [6,6].
"Alquilo sustituido", "arilo sustituido", y "arilalquilo sustituido" significan alquilo, arilo, y arilalquilo, respectivamente, en el que uno o más átomos de hidrógeno se sustituyen, cada uno independientemente, con un sustituyente. Los sustituyentes típicos incluyen, aunque no de forma limitativa, -X, -R, -O", -OR, -SR, -S", -NR2, -NR3, =NR, -CX3, -CN, -OCN, -SCN, -N=C=O, -NCS, -NO, -NO2, =N2, -N3, NC(=O)R, -C(=O)R, -C(=O)NR2, -SOT, -SO3H, -S(=O)2R, -OS(=O)2OR, -S(=O)2NR, -S(=O)R, -OP(=O)(OR)2, -P(=O)(OR)2, -PO-3, -PO3H2, -C(=O)R, -C(=O)X, -C(S)R, -CO2R, -CO2- , -C(=S)OR, -C(=O)SR, -C(=S)SR, -C(=O)NR2, -C(=S)NR2, -C(=NR)NR2, donde cada X es independientemente un halógeno: F, Cl, Br o I; y cada R es independientemente -H, alquilo C2-C18, arilo C6-C20, heterociclo C3-C14, un grupo protector o resto profármaco. Los grupos alquileno, alquenileno y alquinileno tal como se han descrito anteriormente también se pueden sustituir de forma similar.
"Heteroarilo" y "heterociclo" se refieren a un sistema de anillo en el que uno o más átomos del anillo es un heteroátomo, por ejemplo, nitrógeno, oxígeno y azufre. El radical heterociclo comprende 1 a 20 átomos de carbono y 1 a 3 heteroátomos seleccionados entre N, O, P, y S. Un heterociclo puede ser un monociclo que tiene 3 a 7 miembros del anillo (2 a 6 átomos de carbono y 1 a 3 heteroátomos seleccionados entre N, O, P, y S) o un biciclo que tiene de 7 a 10 miembros del anillo (de 4 a 9 átomos de carbono y de 1 a 3 heteroátomos seleccionados entre N, O, P, y S), por ejemplo: un sistema biciclo [4,5], [5,5], [5,6], o [6,6].
Se describen heterociclos en Paquette, Leo A.; "Principles of Modern Heterocyclic Chemistry" (W.A. Benjamin, Nueva York, 1968), particularmente los Capítulos 1, 3, 4, 6, 7, y 9; "The Chemistry of Heterocyclic Compounds, A Series of Monographs" (John Wiley & Sons, Nueva York, 1950 hasta la actualidad), en particular los Volúmenes 13, 14, 16, 19 y 28; y J. Am. Chem. Soc. (1960) 82:5566.
Los ejemplos de heterociclos incluyen a modo de ejemplo y no de limitación piridilo, dihidropiridilo, tetrahidropiridilo (piperidilo), tiazolilo, tetrahidrotiofenilo, tetrahidrotiofenilo oxidado con azufre, pirimidinilo, furanilo, tienilo, pirrolilo, pirazolilo, imidazolilo, tetrazolilo, benzofuranilo, tianaftalenilo, indolilo, indolenilo, quinolinilo, isoquinolinilo, benzimidazolilo, piperidinilo, 4-piperidonilo, pirrolidinilo, 2-pirrolidonilo, pirrolinilo, tetrahidrofuranilo, bistetrahidrofuranilo, tetrahidropiranilo, bis-tetrahidropiranilo, tetrahidroquinolinilo, tetrahidroisoquinolinilo, decahidroquinolinilo, octahidroisoquinolinilo, azocinilo, triazinilo, 6H-1,2,5-tiadiazinilo, 2H,6H-1,5,2-ditiazinilo, tienilo, tiantrenilo, piranilo, isobenzofuranilo, cromenilo, xantenilo, fenoxatinilo, 2H-pirrolilo, isotiazolilo, isoxazolilo, pirazinilo, piridazinilo, indolizinilo, isoindolilo, 3H-indolilo, 1 H-indazolilo, purinilo, 4H-quinolizinilo, ftalazinilo, naftiridinilo, quinoxalinilo, quinazolinilo, cinolinilo, pteridinilo, 4aH-carbazolilo, carbazolilo, p-carbolinilo, fenantridinilo, acridinilo, pirimidinilo, fenantrolinilo, fenazinilo, fenotiazinilo, furazanilo, fenoxazinilo, isocromanilo, cromanilo, imidazolidinilo, imidazolinilo, pirazolidinilo, pirazolinilo, piperazinilo, indolinilo, isoindolinilo, quinuclidinilo, morfolinilo, oxazolidinilo, benzotriazolilo, benzoisoxazolilo, oxindolilo, benzoxazolinilo, e isatinoílo.
A modo de ejemplo y no de limitación, los heterociclos unidos a carbono están unidos en la posición 2, 3, 4, 5, o 6 de una aziridina, posición 3, 4, 5, o 6 de una piridazina, posición 2, 4, 5, o 6 de una pirimidina, posición 2, 3, 5, o 6 de una pirazina, posición 2, 3, 4, o 5 de un furano, tetrahidrofurano, tiofurano, tiofeno, pirrol o tetrahidropirrol, posición 2, 4, o 5 de un oxazol, imidazol o tiazol, posición 3, 4, o 5 de un isooxazol, pirazol, o isotiazol, posición 2 o 3 de una aziridina, posición 2, 3, o 4 de una acetidina, posición 2, 3, 4, 5, 6, 7, u 8 de una quinolina o posición 1, 3, 4, 5, 6, 7, u 8 de una isoquinolina. De forma aún más típica, los heterociclos unidos a carbono incluyen 2-piridilo, 3-piridilo, 4-piridilo, 5-piridilo, 6-piridilo, 3-piridazinilo, 4-piridazinilo, 5-piridazinilo, 6-piridazinilo, 2-pirimidinilo, 4-pirimidinilo, 5-pirimidinilo, 6-pirimidinilo, 2-pirazinilo, 3-pirazinilo, 5-pirazinilo, 6-pirazinilo, 2-tiazolilo, 4-tiazolilo o 5-tiazolilo.
A modo de ejemplo y no de limitación, los heterociclos unidos a nitrógeno están unidos en la posición 1 de una aziridina, azetidina, pirrol, pirrolidina, 2-pirrolina, 3-pirrolina, imidazol, imidazolidina, 2-imidazolina, 3-imidazolina, pirazol, pirazolina, 2-pirazolina, 3-pirazolina, piperidina, piperazina, indol, indolina, 1H-indazol, posición 2 de un isoindol o isoindolina, posición 4 de una morfolina, y posición 9 de un carbazol o p -carbolina. De forma aún más típica, los heterociclos unidos a nitrógeno incluyen 1 -aziridilo, 1-azetedilo, 1 -pirrolilo, 1 -imidazolilo, 1 -pirazolilo y 1-piperidinilo.
"Carbociclo" significa un anillo saturado o insaturado que tiene 3 a 7 átomos de carbono como un monociclo o 7 a 12 átomos de carbono como un biciclo. Los carbociclos monocíclicos tienen de 3 a 6 átomos de anillo, aún más normalmente 5 o 6 átomos de anillo. Los carbociclos bicíclicos tienen de 7 a 12 átomos de anillo, por ejemplo, dispuestos como un sistema biciclo [4,5], [5,5], [5,6] o [6,6], o 9 o 10 átomos del anillo dispuestos como un sistema biciclo [5,6] o [6,6]. Los ejemplos de carbociclos monocíclicos incluyen ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo, 1ciclopent-1-enilo, 1-ciclopent-2-enilo, 1-ciclopent-3-enilo, ciclohexilo, 1-ciclohex-1-enilo, 1-ciclohex-2-enilo, 1-ciclohex-3-enilo, cicloheptilo y ciclooctilo.
"Enlazador", "Unidad enlazadora", o "engarce" significa un resto químico que comprende un enlace covalente o una cadena de átomos que unen covalentemente un anticuerpo a un resto de fármaco. En diversas realizaciones, un enlazador se especifica como LU. Los enlazadores incluyen una radical divalente tal como un alquildiilo, un arildiilo, un heteroarildiilo, restos tales como: -(CR2)nO(CR2)n-, unidades de repetición de alquiloxi (por ejemplo, polietiloxi, PEG, polimetilenoxi) y alquilamino (por ejemplo, polietilenamino, Jeffamine™); y éster diácido y amidas que incluyen succinato, succinamida, diglicolato, malonato, y caproamida.
El término "quiral" se refiere a moléculas que tienen la propiedad de no superposición del compañero de imagen especular, mientras que el término "aquiral" se refiere a moléculas que pueden superponerse sobre sus compañeros de imagen especular.
El término "estereoisómeros" se refiere a compuestos que tienen una constitución química idéntica, pero se diferencian con respecto a la disposición de los átomos o grupos en el espacio.
"Diastereómero" se refiere a un estereoisómero con dos o más centros de quiralidad y cuyas moléculas no son imágenes especulares entre sí. Los diastereómeros tienen propiedades físicas diferentes, por ejemplo, puntos de fusión, puntos de ebullición, propiedades espectrales y reactividades. Las mezclas de diastereómeros pueden separarse mediante procedimientos analíticos de alta resolución, tales como electroforesis y cromatografía.
"Enantiómeros" se refiere a estereoisómeros de un compuesto que no son imágenes especulares superponibles entre sí.
Las convenciones y definiciones estereoquímicas usadas en el presente documento siguen generalmente a S. P. Parker, Ed., McGraw-Hill Dictionary of Chemical Terms (1984) McGraw-Hill Book Company, Nueva York; y Eliel, E. y Wilen, S., Stereochemistry of Organic Compounds (1994) John Wiley & Sons, Inc., Nueva York. Muchos de los compuestos orgánicos existen en formas ópticamente activas, es decir, tienen la capacidad de rotar el plano de luz polarizada. En la descripción de un compuesto ópticamente activo, los prefijos D y L o R y S, se usan para indicar la configuración absoluta de la molécula en torno a su centro o centros quirales. Los prefijos d y 1 o (+) y (-) se emplean para designar el sentido de rotación del plano de luz polarizada por el compuesto, significando (-) o 1 que el compuesto es levógiro. Un compuesto con el prefijo (+) o d es dextrógiro. Para una estructura química dada, estos estereoisómeros son idénticos salvo por que son imágenes especulares entre sí. Un estereoisómero específico puede denominarse también enantiómero y una mezcla de dichos isómeros se denomina a menudo una mezcla enantiomérica. Una mezcla 50:50 de enantiómeros se denomina mezcla racémica o racemato, que puede aparecer cuando no ha habido estereoselección ni estereoespecificidad en un proceso o reacción química. Las expresiones "mezcla racémica" y "racemato" se refieren a una mezcla equimolar de dos especies enantioméricas, desprovista de actividad óptica.
Los ejemplos de un "paciente" incluyen, aunque no de forma limitativa, un ser humano, rata, ratón, cobaya, mono, cerdo, cabra, vaca, caballo, perro, gato, pájaros y aves. En una realización ilustrativa, el paciente es un ser humano.
"Arilo" se refiere a un grupo aromático carbocíclico. Los ejemplos de grupos arilo incluyen, aunque no de forma limitativa, fenilo, naftilo y antracenilo. Un grupo carbocíclico aromático o un grupo heterocíclico aromático puede estar no sustituido o sustituido con uno o más grupos entre los que se incluyen, aunque no de forma limitativa, -alquilo C1-C8, -O-(alquilo C1-C8), -arilo, -C(O)R', -OC(O)R', -C(O)OR', -C(O)NH2, -C(O)NHR', -C(O)N(R> -NHC(O)R', -S(O)2R', - S(O)R', -OH, -halógeno, -N3 , -NH2, -NH(R'), -N(R')2 y -CN; en el que cada R' se selecciona de forma independiente entre H, alquilo C1-C8 y arilo.
El término "alquilo C1-C8", tal como se usa en el presente documento, se refiere a un hidrocarburo de cadena lineal o ramificada, saturado o insaturado, que tiene de 1 a 8 átomos de carbono. Los grupos "alquilo C1-C8" representativos incluyen, aunque no de forma limitativa, -metilo, -etilo, -n-propilo, -n-butilo, -n-pentilo, -n-hexilo, -n-heptilo, -n-octilo, -n-nonilo y -n-decilo; mientras que los alquilos C1-C8 ramificados incluyen, aunque no de forma limitativa, -isopropilo, -sec-butilo, -isobutilo, - ferc-butilo), -isopentilo, 2-metilbutilo], los alquilos C1-C8 insaturados incluyen, aunque no de forma limitativa, -vinilo, -alilo, -1 -butenilo, -2-butenilo, -isobutilenilo, -1-pentenilo, -2-pentenilo, -3-metil-1-butenilo, -2-metil-2-butenilo, -2,3-dimetil-2-butenilo, 1-hexilo, 2-hexilo, 3-hexilo, -acetilenilo, -propinilo, -1 -butinilo, -2-butinilo, -1-pentinilo, -2-pentinilo, -3-metil-1 butinil metilo, etilo, propilo, isopropilo, n-butilo, isobutilo, sec-butilo, ferc-butilo, npentilo, isopentilo, neopentilo, n-hexilo, isohexilo, 2-metilpentilo, 3-metilpentilo, 2,2-dimetilbutilo, 2,3-dimetil-butilo, 2,2-dimetilpentilo, 2,3-dimetilpentilo, 3,3-dimetilpentilo, 2,3,4-trimetilpentilo, 3-metilhexilo, 2,2-dimetilhexilo, 2,4-dimetilhexilo, 2,5-dimetilhexilo, 3,5-dimetilhexilo, 2,4-dimetilpentilo, 2-metilheptilo, 3-metilheptilo, n-heptilo, isoheptilo, n-octilo, e isooctilo. Un grupo "alquilo C1-C8" puede estar sustituido o no sustituido con uno o más grupos que incluyen, aunque no de forma limitativa, -alquilo C1-C8, -O-(alquilo C1-C8), -arilo, -C(O)R', -OC(O)R', -C(O)OR', -C(O)NH2, -C(O)NHR', -C(O)N(R')2 -NHC(O)R' -SO3R', -S(O)2R', -S(O)R', -OH, -halógeno, -N3, -NH2, -NH(R'), -N(R')2 y -CN; donde cada R' se selecciona de forma independiente entre H, alquilo C1-C8 y arilo.
Un "carbociclo C3-C8" es un anillo carbocíclico de 3, 4, 5, 6, 7 u 8 miembros, saturado o insaturado, no aromático. Los carbociclos C3-C8 representativos incluyen, aunque no de forma limitativa, -ciclopropilo, -ciclobutilo, -ciclopentilo, -ciclopentadienilo, -ciclohexilo, -ciclohexenilo, -1,3-ciclohexadienilo, -1,4-ciclohexadienilo, -cicloheptilo,-1,3-cicloheptadienilo, -1,3,5-cicloheptatrienilo, -ciclooctilo y -ciclooctadienilo. Un grupo "carbociclo C3-C8" puede estar sustituido o no sustituido con uno o más grupos que incluyen, aunque no de forma limitativa, -alquilo C1-C8, -O-(alquilo C1-C8), -arilo, -C(O)R', -OC(O)R', -C(O)OR', -C(O)NH2, -C(O)NHR', -C(O)N(R')2 -NHC(O)R', -S(O)2R', -S(O)R', - OH, -halógeno, -N3, -NH2, -NH(R'), -N(R')2 y -CN; donde cada R' se selecciona de forma independiente entre H, alquilo C1-C8 y arilo.
Un "carbociclo C3-C8" se refiere a un grupo carbociclo C3-C8 definido anteriormente en el que uno de los átomos de hidrógeno del grupo carbociclo está sustituido con un enlace.
Un "alquileno C1-C10" es un grupo hidrocarburo saturado de cadena lineal, de fórmula -(CH2)1-10-. Los ejemplos de alquileno -C1-C10- incluyen metileno, etileno, propileno, butileno, pentileno, hexileno, heptileno, octileno, nonileno y decaleno.
Un "arileno" es un grupo arilo que tiene dos enlaces covalentes y puede estar en las configuraciones orto, meta, o para como se muestra en las siguientes estructuras:
Figure imgf000020_0001
en las que el grupo fenilo puede estar sustituido o no sustituido o sustituido con hasta cuatro grupos que incluyen, aunque no de forma limitativa, alquilo C1-C8, -O-(alquilo C1-C8), -arilo, -C(O)R', -OC(O)R', -C(O)OR', -C(O)n H2, -C(O)NHR', -C(O)N(R')2 -NHC(O)R', -S(O)2R', -S(O)R', - OH, -halógeno, -N3, -NH2, -NH(R'), -N(R')2 y -CN; en el que cada R' se selecciona de forma independiente entre H, alquilo C1-C8 y arilo.
Un "heterociclo C3-C8" se refiere a un carbociclo C3-C8 aromático o no aromático en el que uno a cuatro de los átomos de carbono del anillo están sustituidos de forma independiente con un heteroátomo del grupo que consiste en O, S y N. Los ejemplos representativos de un heterociclo C3-C8 incluyen, aunque no de forma limitativa, benzofuranilo, benzotiofeno, indolilo, benzopirazolilo, cumarinilo, isoquinolinilo, pirrolilo, tiofenilo, furanilo, tiazolilo, imidazolilo, pirazolilo, triazolilo, quinolinilo, pirimidinilo, piridinilo, piridonilo, pirazinilo, piridazinilo, isotiazolilo, isoxazolilo y tetrazolilo. Un heterociclo C3-C8 puede estar sustituido o no sustituido con hasta siete grupos que incluyen, aunque no de forma limitativa, -alquilo C1-C3, -O-(alquilo C1-C8), -arilo, -C(O)R', -OC(O)R', -C(O)OR', -C(O)NH2, -C(O)NHR', -C(O)N(R')2 -NHC(O)R', -S(O)2R', -S(O)R', -OH, -halógeno, -N3 , -NH2, -NH(R'),-N(R')2 y -CN; en el que cada R' se selecciona de forma independiente entre H, alquilo C1-C8 y arilo.
"Heterociclo C3-C8" se refiere a un grupo heterociclo C3-C8 definido anteriormente en el que uno de los átomos de hidrógeno del grupo carbociclo está sustituido con un enlace. Un heterociclo -C3-C8 puede estar sustituido o no sustituido con hasta seis grupos que incluyen, aunque no de forma limitativa, -alquilo C1-C8, -O-(alquilo C1-C8), -arilo, -C(O)R', -OC(O)R', -C(O)OR', -C(O)NH2, -C(O)NHR', -C(O)N(R')2 -NHC(O)R', -S(O)2R', -S(O)R', -OH, -halógeno, -N 3, -NH2, -NH(R'), -N(R')2 y -CN; en el que cada R' se selecciona de forma independiente entre H, alquilo C1-C8 y arilo. Un "Compuesto ilustrativo" es un Compuesto de fármaco o un Compuesto de fármaco-enlazador.
Un "Conjugado ilustrativo" es un Conjugado fármaco-ligando que tiene una unidad de fármaco escindible del Conjugado fármaco-ligando o un Conjugado fármaco-enlazador-ligando.
En algunas realizaciones, los Compuestos ilustrativos y los Conjugados ilustrativos están en forma aislada o purificada. Como se usa en el presente documento, "aislado" significa separado de otros componentes de (a) una fuente natural, tal como una célula vegetal o una célula animal o cultivo de células, o (b) una mezcla de reacción química orgánica sintética. Como se usa en el presente documento, "purificado" significa que cuando se aísla, el aislado contiene al menos un 95 %, y en otro aspecto al menos un 98 %, del Compuesto ilustrativo o el Conjugado ilustrativo por peso del aislado.
Los ejemplos de "grupo protector de hidroxilo" incluyen, aunque no de forma limitativa, éter de metoximetilo, éter de 2-metoxietoximetilo, éteres de tetrahidropiranilo, éter de bencilo, éter de p-metoxibencilo, éter de trimetilsililo, éter de trietilsililo, éter de triisopropilsililo, éter de t-butildimetilsililo, éter de trifenilmetilsililo, éster de acetato, ésteres de acetato sustituidos, pivaloato, benzoato, metanosulfonato y p-toluenosulfonato.
"Grupo saliente" se refiere a un grupo funcional que puede estar sustituido por otro grupo funcional. DIchos grupos salientes son bien conocidos en la técnica y los ejemplos incluyen, aunque no de forma limitativa, un haluro (por ejemplo, cloruro, bromuro, yoduro), metanosulfonilo (mesilo), p-toluensulfonilo (tosilo), trifluorometilsulfonilo (trifl ato), y trifluorometilsulfonato.
La expresión "sal farmacéuticamente aceptable", como se usa en el presente documento, se refiere a sales orgánicas o inorgánicas farmacéuticamente aceptables de un Compuesto ilustrativo o Conjugado ilustrativo, Los Compuestos ilustrativo y Conjugados ilustrativos pueden contener al menos un grupo amino, y, de acuerdo con ello, se pueden formar sales de adición de ácidos con este grupo amino. Las sales ilustrativas incluyen, aunque no de forma limitativa, sales de sulfato, citrato, acetato, oxalato, cloruro, bromuro, yoduro, nitrato, bisulfato, fosfato, fosfato de ácido, isonicotinato, lactato, salicilato, citrato de ácido, tartrato, oleato, tanato, pantotenato, bitartrato, ascorbato, succinato, maleato, gentisinato, fumarato, gluconato, glucuronato, sacarato, formiato, benzoato, glutamato, metanosulfonato, etanosulfonato, bencenosulfonato, p-toluenosulfonato y pamoato (es decir, 1,1'-metilen-bis-(2-hidroxi-3-naftoato)). Una sal farmacéuticamente aceptable puede implicar la inclusión de otra molécula tal como un ion acetato, un ion succinato u otro contraion. El contraión puede ser cualquier resto orgánico o inorgánico que estabilice la carga del compuesto precursor. Asimismo, una sal farmacéuticamente aceptable puede tener más de un átomo cargado en su estructura. Los casos en los que múltiples átomos cargados son parte de la sal farmacéuticamente aceptable pueden tener múltiples contraiones. Por tanto, una sal farmacéuticamente aceptable puede tener uno o más átomos cargados y/ uno o más contraiones.
"Solvato farmacéuticamente aceptable" o "solvato" se refiere a una asociación de una o más moléculas de disolvente y un compuesto de la invención, por ejemplo, un Compuesto ilustrativo o Conjugado ilustrativo. Los ejemplos de disolventes que forman solvatos farmacéuticamente aceptables incluyen, aunque no de forma limitativa, agua, isopropanol, etanol, metanol, DMSO, acetato de etilo, ácido acético y etanolamina.
Las siguientes abreviaturas se usan en el presente documento y tienen las definiciones indicadas: AE es auristatina E, Boc es W-(t-butoxicarbonilo), cit es citrulina, dap es dolaproína, DCC es 1,3-diciclohexilcarbodiimida, DCM es diclorometano, DEA es dietilamina, DEAD es dietilazodicarboxilato, DEPC es dietilfosforilcianidato, DIAD es diisopropilazodicarboxilato, DIEA es W,W-diisopropiletilamina, dil es dolaisoleuina, DMAP es 4-dimetilaminopiridina, DME es etilenglicol dimetil éter (o 1,2-dimetoxietano), DMF es N,N-metilformamida, DMSO es dimetilsulfóxido, doe es dolafenina, dov es W,W-dimetilvalma, DTNB es 5,5'-ditiobis(ácido 2-nitrobenzoico), DTPA es ácido dietilentriaminopentaacético, DTT es ditiotreitol, EDCI es clorhidrato de 1-(3-dimetilaminopropil)-3-etilcarbodiimida, EEDQ es 2-etoxi-1-etoxicarbonil-1,2-dihidroquinolina, ES-MS es espectrometría de masas con electropulverización, EtOAc es acetato de etilo, Fmoc es N-(9-fluorenilmetoxicarbonilo), gly es glicina, HATU es hexafluorofosfato de 0-(7-azabenzotriazol-1-il)-W,W,W,W-tetrametiluronio, HOBt es 1-hidroxibenzotriazol, HPLC es cromatografía líquida de alta presión, ile es isoleucina, lys es lisina, MeCN (CH3CN) es acetonitrilo, MeOH es metanol, tris 4-anisildifenilmetilo (o 4-metoxitritilo), no es (1S, 2^)-(+)-norefedrina, PAB es p-aminobencilo, PBS es solución salina tamponada con fosfato (pH 7,4), PEG es polietilenglicol, Ph es fenilo, Pnp es p-nitrofenilo, MC es 6-maleimidocaproilo, phe es L-fenilalanina, PyBrop es hexafluorofosfato de bromo tris-pirrolidinfosfonio, SEC es cromatografía de exclusión molecular, Su es succinimida, TBTU es tetrafluoroborato de 0-benzotriazol-1-il-N,N,N,N-tetrametiluronio, TFA es ácido trifluoroacético, TLC es cromatografía en capa fina, UV es ultravioleta, y val es valina.
Las siguientes abreviaturas de enlazadores se usan en el presente documento y tienen las definiciones indicadas: Val Cit es un sitio dipéptido de valina-citrulina en el enlazador de la proteasa escindible; PAB es paminobencilcarbamoilo; (Me)vc es N-metil-valina citrulina, donde el enlace peptídico del enlazador se ha modificado para evitar su escisión por la catepsina B; MC(PEG)6-OH es maleimidocaproilpolietilenglicol; SPP es 4-(2-piridilditio)pentanoato de N-succinimidilo; y SMCC es 4-(N-maleimidornetil) ciclohexano-1-carboxilato de N-succinimidilo.
Los términos "tratar" o "tratamiento", a no ser que el contexto indique otra cosa, se refieren tanto a un tratamiento terapéutico y profiláctico como a medidas preventivas, cuyo objeto es prevenir o ralentizar (disminuir) un cambio o trastorno fisiológico indeseado, como el desarrollo o proliferación del cáncer. Para los fines de la presente invención, los resultados clínicos beneficiosos o deseados incluyen, aunque no de forma limitativa, alivio de los síntomas, disminución del grado de la enfermedad, patología estabilizada (es decir, sin empeoramiento), retraso o ralentización de la progresión de la enfermedad, mejora o paliación del estado de la enfermedad, y remisión (ya sea parcial o total), ya sea detectable o indetectable. "Tratamiento" también puede significar prolongar la supervivencia en comparación con la supervivencia esperada si no se recibe tratamiento. Aquellos que necesitan tratamiento incluyen aquellos que ya padecen la afección o trastorno así como aquellos propensos a tener la afección o trastorno o aquellos en los que se quiera prevenir la afección o trastorno.
En el contexto del cáncer, el término "tratamiento" incluye cualquiera o todos de: evitar el crecimiento de células tumorales, células cancerosas, o de un tumor; evitar la replicación de las células tumorales o las células cancerosas, disminuir la carga tumoral total o disminuir el número de células cancerosas, y mejorar uno o más de los síntomas asociados con la enfermedad.
En el contexto de una enfermedad autoinmunitaria, el término "tratamiento" incluye cualquiera o todos de: evitar la replicación de las células asociadas con una patología autoinmunitaria incluyendo, aunque no de forma limitativa, las células que producen un anticuerpo autoinmunitario, disminuir la carga de anticuerpo autoinmunitario y mejorar uno o más síntomas de una enfermedad autoinmunitaria.
En el contexto de una enfermedad infecciosa, el término "tratamiento" incluye cualquiera o todos de: evitar el crecimiento, la multiplicación o la replicación del patógeno que produce la enfermedad infecciosa y mejorar uno o más síntomas de una enfermedad infecciosa.
Las siguientes abreviaturas de fármacos citotóxicos se usan en el presente documento y tienen las definiciones indicadas: MMAE es monometil auristatina E (PM 718); MMAF es N-metilvalina-valina-dolaisoleucina-dolaproínafenilalanina (PM 731,5); MMAF-DMAEA es MMAF con DMAEA (dimetilaminoetilamina) en un enlace amida con la fenilalanina del extremo C (PM 801,5); MMAF-TEG es MMAF con tetraetilenglicol esterificado con fenilalanina; MMAF-NtBu es N-t-butilo, unido como amida al extremo C de MMAF; AEVB es auristatina E valeril bencilhidrazona, un enlazador lábil a ácido a través del extremo C de AE (PM 732); y AFP es Monoamida de p-fenilendiamina con fenilalanina en el extremo C de Auristatina F (MW 732).
4.2 COMPUESTOS
4.2.1 LOS COMPUESTOS DE FÓRMULA (Ia)
Se describen en el presente documento Conjugados de fármaco-enlazador-ligando que tienen la Fórmula Ia:
L(-Aa-Ww-Yy-D)p Ia
o una sal o solvato farmacéuticamente aceptable del mismo
en la que,
L- es una Unidad de ligando;
-Aa-Ww-Yy- es una Unidad de enlazador (LU), en la que la Unidad de enlazador incluye:
-A- es una Unidad ensanchadora,
a es 0 o 1,
cada -W- es independientemente una unidad de aminoácido, w es un número entero comprendido entre 0 y 12, -Y- es una Unidad separadora, y
y es 0, 1 o 2;
p está comprendido de 1 a aproximadamente 20; y
-D es una Unidad de fármaco que tiene las Fórmulas De y Df:
Figure imgf000022_0001
en la que, independientemente en cada localización:
R2 se selecciona entre H y alquilo C1-C8;
R3 se selecciona de H, alquilo C1-C8, carbociclo C3-C8, arilo, alquilarilo C1-C8, alquil C1-C8-(carbociclo C3-C8), heterociclo C3-C8 y alquil C1-C8-(heterociclo C3-C8);
R4 se selecciona de H, alquilo C1-C8, carbociclo C3-C8, arilo, alquilarilo C1-C8, alquil C1-C8-(carbociclo C3-C8), heterociclo C3-C8 y alquil C1-C8-(heterociclo C3-C8);
R5 se selecciona entre H y metilo;
o R4 y R5 forman conjuntamente un anillo carbocíclico y tienen la fórmula -(CRaRb)n- en la que Ra y Rb se seleccionan de forma independiente entre H, alquilo C1-C8 y carbociclo C3-C8 y n se selecciona entre 2, 3, 4, 5 y 6;
R6 se selecciona entre H y alquilo Ci -Cs;
R7 se selecciona de H, alquilo Ci -Cs, carbociclo C3-C8, arilo, alquilarilo Ci -Cs, alquil Ci -Cs-(carbociclo C3-C8), heterociclo C3-CS y alquil Ci -Cs-(heterociclo C3-Cs);
cada Rs se selecciona independientemente entre H, OH, alquilo Ci -Cs, carbociclo C3-C8 y -O-(alquilo Ci -Cs); R9 se selecciona entre H y alquilo Ci -Cs;
Ri0 se selecciona entre arilo o heterociclo C3-Cs;
Z es O, S, NH, o NRi2 , en la que Ri2 es alquilo Ci -Cs;
Ri i se selecciona de H, alquilo Ci -C20, arilo, heterociclo C3-Cs, -(Ri3 O)m-Ri4 , o -(Ri3 O)m-CH(Ri5 )2;
m es un número entero comprendido de i - i 000;
Ri3 es alquilo C2-Cs;
Ri4 es H o alquilo Ci -Cs;
cada aparición de Ri5 es independientemente H, COOH, -(CH2)n-N(Ri6 )2, -(CH2)n-SO3H, o -(CH2)n-SO3-alquilo Ci -Cs;
cada aparición de Ri6 es independientemente H, alquilo Ci -Cs, o -(CH2)n-COOH;
Ris se selecciona entre -C(Rs)2-C(Rs)2-arilo, -C(Rs)2-C(Rs)2-(heterociclo C3-Cs), y-C(Rs)2-C(Rs)2-(carbociclo C3-Cs); y
n es un número entero comprendido entre 0 y 6.
También se describen en el presente documento Compuestos de fármaco que tienen la Fórmula Ib:
Figure imgf000023_0001
o sales o solvatos farmacéuticamente aceptables de los mismos,
en la que:
R se selecciona entre hidrógeno y alquilo -Ci -Cs;
R3 se selecciona entre hidrógeno, -alquilo Ci -Cs, carbociclo C3-Cs, arilo, alquilarilo Ci -Cs, -alquil Ci -Csl-(carbociclo C3-Cs), - heterociclo C3-Cs y -alquil Ci -Cs-(heterociclo C3-Cs);
R4 se selecciona entre hidrógeno, -alquilo Ci -Cs, carbociclo C3-Cs, -arilo, alquilarilo Ci -Cs, -alquil Ci -Csl-(carbociclo C3-Cs), -heterociclo C3-Cs y alquil -Ci -Cs-(heterociclo C3-Cs) en la que R5 se selecciona entre H y metilo; o R4 y R5 conjuntamente, tienen la fórmula -(CRaRb)n- en la que Ra y Rb se selecciona independientemente entre -H, -alquilo Ci -Cs y carbociclo -C3-Cs y n se selecciona entre 2, 3, 4, 5 y 6 y forman un anillo con el átomo de carbono al que están unidos;
R6 se selecciona entre H y -alquilo Ci -Cs
R7 se selecciona de H, -alquilo Ci -Cs, carbociclo C3-Cs, arilo, alquilarilo Ci -Cs, -alquil Ci -Csl-(carbociclo C3-Cs), -heterociclo C3-Cs y -alquilo Ci -Cs-(heterociclo Ci -Cs);
cada Rs se selecciona independientemente entre H, -OH, -alquilo Ci -Cs, -carbociclo C3-Cs y -O-(alquilo Ci -Cs); R9 se selecciona entre H y -alquilo Ci -Cs;
Ri0 se selecciona entre ^ gr -ui opos arilo o het 1e 9rociclo-C3-Cs;
Z es -O-, -S-, -NH-, o -NR- , en la que R es alquilo Ci -Cs;
R11 se selecciona de H, alquilo Ci -C20, arilo, heterociclo C3-Cs, -(Ri3O)m-Ri4, o -(R13O)m-CH(R15)2;
m es un número entero comprendido de 1-1000;
R13 es -alquilo C2-Cs;
R14 es H o -alquilo Ci -Cs;
cada aparición de R15 es independientemente H, -COOH, -(CH2)n-N(R16)2,-(CH2)n-SO3H, o -(CH2)n-SO3-alquilo Ci -Cs;
cada aparición de R16 es independientemente H, -alquilo Ci -Cs, o -(CH2)n-COOH; y
n es un número entero comprendido entre 0 y 6.
También se describen Conjugados de fármaco-enlazador-ligando que tienen la Fórmula Ia':
Ab(-Aa-Ww-Yy-D)p Fórmula Ia'
o sales o solvatos farmacéuticamente aceptables de los mismos,
en la que:
Ab es un anticuerpo,
A es una unidad ensanchadora,
a es 0 o 1,
cada W es independientemente una unidad de aminoácido,
w es un número entero comprendido entre 0 y 12,
Y es una Unidad separadora, e y es 0, 1 o 2,
p está comprendido de 1 a aproximadamente 20, y
D es un Resto de fármaco seleccionado entre las Fórmulas De y Df:
Figure imgf000024_0001
en la que, independientemente en cada localización:
R2 se selecciona entre H y alquilo C1-C8;
R3 se selecciona de H, alquilo C1-C8, carbociclo C3-C8, arilo, alquilarilo C1-C8, alquil C1-C8-(carbociclo C3-C8), heterociclo C3-C8 y alquil C1-C8-(heterociclo C3-C8);
R4 se selecciona de H, alquilo C1-C8, carbociclo C3-C8, arilo, alquilarilo C1-C8, alquil C1-C8-(carbociclo C3-C8), heterociclo C3-C8 y alquil C1-C8-(heterociclo C3-C8);
R5 se selecciona entre H y metilo;
o R4 y R3 forman conjuntamente un anillo carbocíclico y tienen la fórmula -(CRaRb)n- en la que Ra y Rb se seleccionan de forma independiente entre H, alquilo C1-C8 y carbociclo C3-C8 y n se selecciona entre 2, 3, 4, 5 y 6;
R6 se selecciona entre H y alquilo C1-C8;
R7 se selecciona de H, alquilo C1-C8, carbociclo C3-C8, arilo, alquilarilo C1-C8, alquil C1-C8-(carbociclo C3-C8), heterociclo C3-C8 y alquil C1-C8-(heterociclo C3-C8);
cada R8 se selecciona independientemente entre H, OH, alquilo C1-C8, carbociclo C3-C8 y -O-(alquilo C1-C8); R9 se selecciona entre H y alquilo C1-C8;
R10 se selecciona entre arilo o heterociclo C3-C8;
Z es O, S, NH, o NR12, en la que R12 es alquilo C1-C8;
R11 se selecciona de H, alquilo C1-C20, arilo, heterociclo C3-C8, -(R13O)m-R14, o -(R13O)m-CH(R15)2;
m es un número entero comprendido de 1-1000;
R13 es alquilo C2-C8;
R14 es H o alquilo C1-C8;
cada aparición de R15 es independientemente H, COOH, -(CH2)n-N(R16)2, -(CH2)n-SO3H, o -(CH2)n-SO3-alquilo C1-C8;
cada aparición de R16 es independientemente H, alquilo C1-C8, o -(CH2)n-COOH;
R18 se selecciona entre -C(R8)2-C(R8)2-arilo, -C(R8)2-C(R8)2-(heterociclo C3-C8), y-C(R8)2-C(R8)2-(carbociclo C3-C8); y
n es un número entero comprendido entre 0 y 6.
Ab es cualquier anticuerpo unido covalentemente a una o más unidades de fármaco. Ab incluye un anticuerpo que se une a CD30, CD40, CD70, antígeno Lewis Y. En otra realización, Ab no incluye un anticuerpo que se une a un receptor ErbB o a uno o más de los receptores
(1 )-(35);
(1) BMPR1B (receptor de la proteína morfogenética ósea - tipo IB, n.° de registro GenBank NM_001203);
(2) E16 (LAT1, SLC7A5, n.° de registro GenBank NM_003486);
(3) STEAP1 (antígeno epitelial seis transmembrana de la próstata, n.° de registro GenBank NM_012449);
(4) 0772P (CA125, MUC16, n.° de registro GenBank AF361486);
(5) MPF (MPF, MSLN, SMR, factor potenciador de megacariocitos, mesotelina, n.° de registro GenBank NM_005823);
(6) Napi3b (NAPI-3B, NPTIIb, SLC34A2, familia 34 del transportador de soluto (fosfato de sodio), miembro 2, transportador 3b de fosfato dependiente del sodio de tipo II, n.° de registro GenBank NM_006424);
(7) Sema 5b (FLJ10372, KIAA1445, Mm.42015, SEMA5B, SEMAG, Semaforina 5b Hlog, dominio sema, siete repeticiones de tromboespondina (tipo 1 y análogo al tipo 1), dominio transmembrana (TM) y dominio citoplásmico corto, (semaforina) 5B, n.° de registro GenBank AB040878);
(8) PSCA hlg (2700050C12Rik, C530008O16Rik, RIKEN ADNc 2700050C12, RIKEN ADNc 2700050C12 gen, n.° de registro GenBank AY358628);
(9) ETBR (Receptores de tipo B de la endotelina, n.° de registro GenBank AY275463);
(10) MSG783 (RNF124, proteína teórica FLJ20315, n.° de registro GenBank NM_017763);
(11) STEAP2 (HGNC_8639, IPCA-1, PCANAP1, STAMP1, STEAP2, STMP, gen 1 asociado al cáncer de próstata, proteína 1 asociada al cáncer de próstata, antígeno epitelial seis transmembrana de la próstata 2, proteína seis transmembrana de la próstata, n.° de registro GenBank AF455138);
(12) TrpM4 (BR22450, FLJ20041, TRPM4, TRPM4B, receptor potencial transitorio del canal de cationes, subfamilia M, miembro 4, n.° de registro GenBank NM_017636);
(13) CRIPTO (CR, CR1, CRGF, CRIPTO, TDGF1, factor de crecimiento derivado de teratocarcinoma, n.° de registro GenBank NP_003203 o NK_003212);
(14) CD21 (CR2 (Receptor del complemento 2) o C3DR (C3d/receptor del virus de Epstein-Barr) o Hs.73792, n.° de registro GenBank M26004);
(15) CD79b (IGb (inmunoglobulina beta-asociada), B29, n.° de registro GenBank NM_000626);
(16) FcRH2 (IFGP4, IRTA4, SPAP1A (dominio s H2 que contiene la proteína de anclaje a fosfatasa 1a), SPAP1B, SPAP1C, n.° de registro GenBank NM_030764);
(17) HER2 (n.° de registro GenBank M11730);
(18) NCA (n.° de registro GenBank M18728);
(19) MDP (n.° de registro GenBank BC017023);
(20) IL20Ra (n.° de registro GenBank AF184971);
(21) Brevican (n.° de registro GenBank AF229053);
(22) Ephb2R (n.° de registro GenBank NM_004442);
(23) ASLG659 (n.° de registro GenBank AX092328);
(24) PSCA (n.° de registro GenBank AJ297436);
(25) GEDA (n.° de registro GenBank AY260763);
(26) BAFF-R (n.° de registro GenBank NP_443177.1);
(27) CD22 (n.° de registro GenBank NP-001762.1);
(28) CD79a (CD79A, CD79a, inmunoglobulina alfa-asociada, una proteína específica de linfocitos B que interactúa covalentemente con la Ig beta (CD79B) y forma un complejo sobre la superficie con moléculas de Ig M, transduce una señal implicada en la diferenciación de linfocitos B, n.° de registro GenBank NP_001774.1);
(29) CXCR5 (receptor 1 del linfoma de Burkitt, un receptor acoplados a la proteína G que se activa mediante la quimioquina CXCL13, actúa en la migración de linfocitos y en la defensa humoral, tiene un papel en la infección por VIH-2 y quizás en el desarrollo de SIDA, linfoma, mieloma, y leucemia, n.° de registro GenBank NP_001707.1);
(30) HLA-DOB (Subunidad beta de la molécula de clase II de MHC (antígeno Ia) que se une a péptidos y los presenta a linfocitos T CD4+, n.° de registro GenBank NP_002111.1);
(31) P2X5 (Receptor purinérgico P2X del canal de iones controlado por ligando 5, un canal de iones controlado por el ATP extracelular, puede estar implicado en la transmisión sináptica y en la neurogénesis, la deficiencia puede contribuir a la patofisiología de la inestabilidad idiopática del detrusor, n.° de registro GenBank NP_002552.2);
(32) CD72 (antígeno CD72 de diferenciación de linfocitos B, Lyb-2, n.° de registro GenBank NP_001773.1);
(33) LY64 (Antígeno linfocitario 64 (RP105), proteína de membrana de tipo I de la familia de repeticiones ricas en leucina (LRR), regula la activación de linfocitos B y la apoptosis, la pérdida de función está asociada con un aumento en la actividad de la enfermedad en pacientes con lupus sistémico eritematoso, n.° de registro GenBank NP_005573.1);
(34) FCRH1 (proteína 1 análoga al receptor Fc, un receptor posible del dominio Fc de inmunoglobulinas que contiene los dominio de tipo C2 e ITAM análogo a Ig, puede tener un papel en la diferenciación de linfocitos B, n.° de registro GenBank NP_443170.1); y/o
(35) IRTA2 (superfamilia del receptor de translocación 2 asociado a inmunoglobulina, un inmunorreceptor posible con teóricos papeles en el desarrollo de linfocitos B y en la linfomagénesis; la desregulación del gen por translocación se produce en algunas neoplasias malignas de linfocitos B, n.° de registro GenBank NP_112571.1).
En una realización -Ww- es -Val-Cit-.
R3, R4 y R7 pueden ser, independientemente, isopropilo o sec-butilo, y R5 es -H. En una realización ilustrativa, R3 y R4 son cada uno isopropilo, R5 es -H, y R7 es sec-butilo. En otra realización más, R2 y R6 son cada uno metilo, y R9 es -H.
En otro ejemplo más, cada aparición de R8 es -OCR3.
En un ejemplo, R3 y R4 son cada uno isopropilo, R2 y R6 son cada uno metilo, R5 aparición de R8 es -OCH3, y R9 es -H.
En un ejemplo, Z es -O- o -NH-.
En un ejemplo, R10 es arilo.
En un ejemplo particular, R10 es fenilo.
En un ejemplo particular, cuando Z es -O-, R11 es -H, metilo o t-butilo.
En un ejemplo, cuando Z es -NH, R11 es -CH(R15)2, en la que R15 es -(CH2)n-N(R16)2, y R16 es -alquilo C1-C8 o -(CH2)n-COOH.
En otro ejemplo, cuando Z es -NH, R11 es -CH(R15)2, en la que R15 es -(CH2)n-SO3H.
Ab puede ser cAC10, cBR96, cS2C6, c1F6, c2F2, hAC10, hBR96, hS2C6, h1F6 e h2F2.
Los conjugados ilustrativos de Fórmula Ia tienen las siguientes estructuras:
Figure imgf000026_0001
cuando L es un anticuerpo, Val es valina, y Cit es citrulina.
La carga del fármaco está representada por p, el número promedio de moléculas de fármacos por anticuerpo en una molécula (por ejemplo,de Fórmula la, Ia' y Ic). La carga del fármaco puede estar comprendida de 1 a 20 fármacos (D) por Ligando (por ejemplo Ab o mAb). Las composiciones de Fórmula la y Fórmula Ia' incluyen colecciones de anticuerpos conjugados con una gama de fármacos, de 1 a 20. El número promedio de fármacos por anticuerpo en preparación de reacciones de conjugación se puede caracterizar por medios convencionales tales como espectroscopía de masas, ensayo ELISA y HPLC. También se puede determinar la distribución cuantitativa de los Conjugados Ligando-Fármaco en términos de p. En algunos casos, la separación, purificación, y caracterización de los Conjugados Ligando-Fármaco homogéneos donde p es un valor determinado de Conjugados Ligando-Fármaco con otras cargas de fármaco se puede conseguir por medios tales como HPLC en fase invertida o electroforesis. 4.2.2 LOS COMPUESTOS DE FÁRMACO DE FÓRMULA (Ib)
También se describen en el presente documento Compuestos de fármaco que tienen la Fórmula (Ib):
Figure imgf000027_0001
o una sal o solvato farmacéuticamente aceptable del mismo,
en la que:
R2 se selecciona entre -hidrógeno y alquilo -C1-C8;
R3 se selecciona entre hidrógeno, -alquilo C1-C8, carbociclo C3-C8, arilo, alquilarilo C1-C8, -alquil CrCal-(carbociclo C3-C8), - heterociclo C3-C8 y -alquil C1-C8-(heterociclo C3-C8);
R4 se selecciona entre hidrógeno, -alquilo C1-C8, carbociclo C3-C8, -arilo, alquilarilo C1-C8, -alquil C1-C8l-(carbociclo C3-C8), -heterociclo C3-C8 y alquil -C1-C8-(heterociclo C3-C8) en la que R5 se selecciona entre H y metilo; o R4 y R5 conjuntamente, tienen la fórmula -(CRaRb)n- en la que Ra y Rb se selecciona independientemente entre -H, -alquilo C1-C8 y carbociclo -C3-C8 y n se selecciona entre 2, 3, 4, 5 y 6 y forman un anillo con el átomo de carbono al que están unidos;
R6 se selecciona entre H y alquilo C1-C8;
R7 se selecciona entre H, -alquilo C1-C8, carbociclo C3-C8, arilo, alquilarilo C1-C8, -alquil C1-C8l-(carbociclo C3-C8), - heterociclo C3-C8 y -alquil C1-C8-(heterociclo C3-C8);
cada R8 se selecciona de forma independiente entre H, -OH, -alquilo C1-C8, -carbociclo C3-C8 y -O-(alquilo C1-C8);
R9 se selecciona entre H y alquilo C1-C8;
R10 se selecciona entre grupos arilo o heterociclo-C3-C8;
Z es -O-, -S-, -NH-, o -NR- , en la que R es alquilo C1-C8;
R se selecciona entre H, alquilo C1-C20, arilo, heterociclo C3-C8, -(R O)m-R , o -(R13O)m-CH(R15)2; m es un número entero comprendido de 1-1000;
R13 es alquilo C2-C8;
R14 es H o alquilo C1-C8;
cada aparición de R es independientemente -H, -COOH, -(CH2) -N(R16)2, (CH2)n-SO3H,(CH2)n-SO3-alquilo C1-C8;
cada aparición de R16 es independientemente -H, -alquilo C1-C8, o -(CH2)n-COOH; y
n es un número entero comprendido entre 0 y 6.
En un ejemplo, R3, R4 y R7 son, de forma independiente, isopropilo o sec-butilo y R5 es -H. En un ejemplo particular, R3 y R4 son cada uno isopropilo, R5 es -H, y R7 es sec-butilo.
En otro ejemplo, R2 y R6 son cada uno metilo, y R9 es -H.
En otro ejemplo más, cada aparición de R8 es -OCR3.
En un ejemplo particular, R3 y R4 son cada uno isopropilo, R2 y R6 son cada uno metilo, R5 es -H, R7 es sec-butilo, cada aparición de R8 es -OCH3, y R9 es -H.
En un ejemplo, Z es -O- o -NH-.
En un ejemplo, R10 es arilo.
En un ejemplo particular, R10 es fenilo.
En un ejemplo particular, cuando Z es -O-, R es -H, metilo o t-butilo.
En el ejemplo, cuando Z es -NH, R11 es -CH(R15)2, en la que R15 es -(CH2)n-N(R16)2, y R16 es -alquilo C1-C8 o -(CH2)n-COOH.
En otro ejemplo, cuando Z es -NH, R11 es -CH(R15)2, en la que R15 es -(CH2)n-SO3H.
Los Compuestos ilustrativos de Fórmula (Ib), cada uno de los cuales se puede usar como restos de fármaco (D) en el ADC, incluye compuestos que tienen las siguientes estructuras:
Figure imgf000029_0001
Figure imgf000030_0001
una de sus sales o solvatos farmacéuticamente aceptables.
LOS COMPUESTOS DE FÓRMULA (Ic)
También se describen en el presente documento compuestos de conjugado de anticuerpo-fármaco que tienen la Fórmula Ic:
Ab(-Aa-Ww-Yy-D)p Ic
que comprenden un anticuerpo unido covalentemente a una o más unidades de fármaco (restos). Los compuestos de conjugado de anticuerpo-fármaco incluyen sales o solvatos farmacéuticamente aceptables de los mismos.
Se definen compuestos de Fórmula Ic en los que:
Ab es un anticuerpo que se une a uno o más receptores de antígenos asociados a tumores (1 )-(35):
(1) BMPR1B (receptor de la proteína morfogenética ósea - tipo IB, n.° de registro GenBank NM_001203);
(2) E16 (LAT1, SLC7A5, n.° de registro GenBank NM_003486);
(3) STEAP1 (antígeno epitelial seis transmembrana de la próstata, n.° de registro GenBank NM_012449);
(4) 0772P (CA125, MUC16, n.° de registro GenBank AF361486);
(5) MPF (MPF, MSLN, SMR, factor potenciador de megacariocitos, mesotelina, n.° de registro GenBank NM_005823);
(6) Napi3b (NAPI-3B, NPTIIb, SLC34A2, familia 34 del transportador de soluto (fosfato de sodio), miembro 2, transportador 3b de fosfato dependiente del sodio de tipo II, n.° de registro GenBank NM_006424);
(7) Sema 5b (FLJ10372, KIAA1445, Mm.42015, SEMA5B, SEMAG, Semaforina 5b Hlog, dominio sema, siete repeticiones de tromboespondina (tipo 1 y análogo al tipo 1), dominio transmembrana (TM) y dominio citoplásmico corto, (semaforina) 5B, n.° de registro GenBank AB040878);
(8) PSCA hlg (2700050C12Rik, C530008O16Rik, RIKEN ADNc 2700050C12, RIKEN ADNc 2700050C12 gen, n.° de registro GenBank AY358628);
(9) ETBR (Receptores de tipo B de la endotelina, n.° de registro GenBank AY275463);
(10) MSG783 (RNF124, proteína teórica FLJ20315, n.° de registro GenBank NM_017763);
(11) STEAP2 (HGNC_8639, IPCA-1, PCANAP1, STAMP1, STEAP2, STMP, gen 1 asociado al cáncer de próstata, proteína 1 asociada al cáncer de próstata, antígeno epitelial seis transmembrana de la próstata 2, proteína seis transmembrana de la próstata, n.° de registro GenBank AF455138);
(12) TipM4 (BR22450, FLJ20041, TRPM4, TRPM4B, receptor potencial transitorio del canal de cationes, subfamilia M, miembro 4, n.° de registro GenBank NM_017636);
(13) CRIPTO (CR, CR1, CRGF, CRIPTO, TDGP1, factor de crecimiento derivado de teratocarcinoma, n.° de registro GenBank NP_003203 o NM_003212);
(14) CD21 (CR2 (Receptor del complemento 2) o C3DR (C3d/receptor del virus de Epstein-Barr) o Hs.73792 n.° de registro GenBank M26004);
(15) CD79b (CD79B, CD79p, IGb (inmunoglobulina beta-asociada), B29, n.° de registro GenBank NM_000626);
(16) FcRH2 (lFGP4, IRTA4, SPAP1A (dominio SH2 que contiene la proteína de anclaje a fosfatasa 1a), SPAP1B, SPAP1C, n.° de registro GenBank NM_030764);
(17) HER2 (n.° de registro GenBank M11730);
(18) NCA (n.° de registro GenBank M18728);
(19) MDP (n.° de registro GenBank BC017023);
(20) IL20Ra (n.° de registro GenBank AF184971);
(21) Brevican (n.° de registro GenBank AF229053);
(22) Ephb2R (n.° de registro GenBank NM_004442);
(23) ASLG659 (n.° de registro GenBank AX092328);
(24) PSCA (n.° de registro GenBank AJ297436);
(25) GEDA (n.° de registro GenBank AY260763;
(26) BAFF-R (receptor del factor de activación de linfocitos B, BLyS receptor 3, BR3, NP_443177.1);
(27) CD22 (isoforma CD22-B del receptor de linfocitos B, NP-001762.1);
(28) CD79a (CD79A, CD79a, inmunoglobulina alfa-asociada, una proteína específica de linfocitos B que interactúa covalentemente con la Ig beta (CD79B) y forma un complejo sobre la superficie con moléculas de Ig M, transduce una señal implicada en la diferenciación de linfocitos B, n.° de registro GenBank NP_001774.1);
(29) CXCR5 (receptor 1 del linfoma de Burkitt, un receptor acoplados a la proteína G que se activa mediante la quimioquina CXCL13, actúa en la migración de linfocitos y en la defensa humoral, tiene un papel en la infección por VIH-2 y quizás en el desarrollo de SIDA, linfoma, mieloma, y leucemia, n.° de registro GenBank NP_001707.1);
(30) HLA-DOB (Subunidad beta de la molécula de clase II de MHC (antígeno Ia) que se une a péptidos y los presenta a linfocitos T CD4+, n.° de registro GenBank NP_002111.1);
(31) P2X5 (Receptor purinérgico P2X del canal de iones controlado por ligando 5, un canal de iones controlado por el ATP extracelular, puede estar implicado en la transmisión sináptica y en la neurogénesis, la deficiencia puede contribuir a la patofisiología de la inestabilidad idiopática del detrusor, n.° de registro GenBank NP_002552.2);
(32) CD72 (antígeno CD72 de diferenciación de linfocitos B, Lyb-2, n.° de registro GenBank NP_001773.1);
(33) LY64 (Antígeno linfocitario 64 (RP105), proteína de membrana de tipo I de la familia de repeticiones ricas en leucina (LRR), regula la activación de linfocitos B y la apoptosis, la pérdida de función está asociada con un aumento en la actividad de la enfermedad en pacientes con lupus sistémico eritematoso, n.° de registro GenBank NP_005573.1);
(34) FCRH1 (proteína 1 análoga al receptor Fc, un receptor posible del dominio Fc de inmunoglobulinas que contiene los dominio de tipo C2 e ITAM análogo a Ig, puede tener un papel en la diferenciación de linfocitos B, n.° de registro GenBank NP_443170.1); y
(35) IRTA2 (superfamilia del receptor de translocación 2 asociado a inmunoglobulina, un inmunorreceptor posible con teóricos papeles en el desarrollo de linfocitos B y en la linfomagénesis; la desregulación del gen por translocación se produce en algunas neoplasias malignas de linfocitos B, n.° de registro GenBank NP_112571.1).
A es una unidad ensanchadora,
a es 0 o 1,
cada W es independientemente una unidad de aminoácido,
w es un número entero comprendido entre 0 y 12,
Y es una Unidad separadora, e y es 0, 1 o 2,
p está comprendido de 1 a aproximadamente 8, y
D es un Resto de fármaco seleccionado entre las Fórmulas De y Df:
Figure imgf000031_0001
Figure imgf000032_0001
en la que la línea ondulada de De y Df indica el sitio de unión covalente con A, W, o Y, e independientemente en cada localización:
R2 se selecciona entre H y alquilo C1-C8;
R3 se selecciona de H, alquilo C1-C8, carbociclo C3-C8, arilo, alquilarilo C1-C8, alquil C1-C8-(carbociclo C3-C8), heterociclo C3-C8 y alquil C1-C8-(heterociclo C3-C8);
R4 se selecciona de H, alquilo C1-C8, carbociclo C3-C8, arilo, alquilarilo C1-C8, alquil C1-C8-(carbociclo C3-C8), heterociclo C3-C8 y alquil C1-C8-(heterociclo C3-C8);
R5 se selecciona entre H y metilo;
o R4 y R5 forman conjuntamente un anillo carbocíclico y tienen la fórmula -(CRaRb)n- en la que Ra y Rb se seleccionan de forma independiente entre H, alquilo C1-C8 y carbociclo C3-C8 y n se selecciona entre 2, 3, 4, 5 y 6;
R6 se selecciona entre H y alquilo C1-C8;
R7 se selecciona de H, alquilo C1-C8, carbociclo C3-C8, arilo, alquilarilo C1-C8, alquil C1-C8-(carbociclo C3-C8), heterociclo C3-C8 y alquil C1-C8-(heterociclo C3-C8);
cada R8 se selecciona independientemente entre H, OH, alquilo C1-C8, carbociclo C3-C8 y -O-(alquilo C1-C8); R9 se selecciona entre H y alquilo C1-C8;
R10 se selecciona entre arilo o heterociclo C3-C8;
Z es O, S, NH, o NR12, en la que R12 es alquilo C1-C8;
R11 se selecciona de H, alquilo C1-C20, arilo, heterociclo C3-C8, -(R13O)m-R14, o -(R13O)m-CH(R15)2;
m es un número entero comprendido de 1-1000;
R13 es alquilo C2-C8;
R14 es H o alquilo C1-C8;
cada aparición de R15 es independientemente H, COOH, -(CH2)n-N(R16)2, -(CH2)n-SO3H, o -(CH2)n-SO3-alquilo C1-C8;
cada aparición de R16 es independientemente H, alquilo C1-C8, o -(CH2)n-COOH;
R18 se selecciona entre -C(R8)2-C(R8)2-arilo, -C(R8)2-C(R8)2-(heterociclo C3-C8), y-C(R8)2-C(R8)2-(carbociclo C3-C8); y
n es un número entero comprendido entre 0 y 6.
En un ejemplo, -Ww- es -Val-Cit-.
En otro ejemplo, R3, R4 y R7 son, de forma independiente, isopropilo o sec-butilo y R5 es -H. En un ejemplo particular, R3 y R4 son cada uno isopropilo, R5 es -H, y R7 es sec-butilo.
En otro ejemplo más, R2 y R6 son cada uno metilo, y R9 es -H.
En otro ejemplo más, cada aparición de R8 es -OCR3.
En un ejemplo particular, R3 y R4 son cada uno isopropilo, R2 y R6 son cada uno metilo, R5 es -H, R7 es sec-butilo, cada aparición de R8 es -OCH3, y R9 es -H.
En un ejemplo, Z es -O- o -NH-.
En un ejemplo, R10 es arilo.
En un ejemplo particular, R10 es fenilo.
En un ejemplo particular, cuando Z es -O-, R11 es -H, metilo o t-butilo.
En un ejemplo, cuando Z es -NH, R11 es -CH(R)2, en la que R15 es -(CH2)n-N(R16)2, y R16 es -alquilo C1-C8 o -(CH2)n-COOH.
En otro ejemplo, cuando Z es -NH, R11 es -CH(R15)2, en la que R15 es -(CH2)n-SO3H.
Los conjugados ilustrativos de Fórmula Ia ADC tienen las siguientes estructuras:
Figure imgf000033_0001
en la que Ab es un anticuerpo que se une a uno o más receptores de antígenos asociados a tumores (1 )-(35); Val es valina; y Cit es citrulina.
La carga del fármaco está representada por p, el número promedio de fármacos por anticuerpo en una molécula de Fórmula I. La carga del fármaco puede variar de 1 a 20 fármacos (D) por anticuerpo (Ab o mAb). Las composiciones del ADC de Fórmula I incluyen colecciones de anticuerpos conjugados con una gama de fármacos, de 1 a 20. El número promedio de fármacos por anticuerpo en preparaciones de ADC derivado de reacciones de conjugación se puede caracterizar por medios convencionales tales como espectroscopía de UV/visible, espectrometría de masas, ensayo ELISA y HPLC. También se puede determinar la distribución cuantitativa de los a Dc en función de p. En algunos casos, la separación, purificación, y caracterización de los ADC homogéneos donde p es un determinado valor derivado de ADC con otras cargas de fármaco se puede conseguir por medios tales como HPLC en fase inversa o electroforesis.
Para algunos conjugados de fármaco-anticuerpo, p puede estar limitado por el número de sitios de unión en el anticuerpo. Por ejemplo, cuando la unión se realiza en un tiol de la cisteína, como en las realizaciones ilustrativas anteriores, un anticuerpo puede tener solo uno o algunos grupos tiol de la cisteína, o puede tener solo uno o varios grupos tiol suficientemente reactivos a través de los cuales se puede unir un enlazador.
Normalmente, se conjugan menos que el máximo teórico de restos de fármaco con un anticuerpo durante una reacción de conjugación. Un anticuerpo puede contener, por ejemplo, muchos restos lisina que no reaccionan con el intermedio fármaco-enlazador o el reactivo enlazador. Solo los grupos lisina más reactivos pueden reaccionar con un reactivo enlazador que reacciona con aminas. En general, los anticuerpos no contienen muchos, en su caso, grupos tioles de cisteína libres y reactivos que se puedan unir al resto de fármaco. La mayoría de restos tiol de la cisteína en los anticuerpos de los compuestos de la invención se encuentran como puentes disulfuro y deben reducirse con un agente reductor tal como ditiotreitol (DTT). Adicionalmente, el anticuerpo debe someterse a condiciones de desnaturalización para revelar grupos nucleófilos reactivos tales como lisina o cisteína. La carga (relación fármaco/anticuerpo) de un ADC puede controlarse de varias maneras diferentes, incluyendo: (i) limitar el exceso molar del intermedio fármaco-enlazador o reactivo enlazador con respecto al anticuerpo, (ii) limitar el tiempo de la reacción de conjugación o la temperatura, y (iii) limitar de forma parcial o limitar las condiciones reductoras para la modificación del tiol de la cisteína.
Se deberá entender que cuando más de un grupo nucleófilo reacciona con un intermedio de fármaco-enlazador, o reactivo enlazador seguido por el reactivo del resto de fármaco, a continuación el producto resultante es una mezcla de compuestos ADC con una distribución de uno o más restos de fármaco unidos a un anticuerpo. El número promedio de fármacos por anticuerpo se puede calcular a partir de la mezcla mediante un ensayo de anticuerpos ELISA doble, específico para anticuerpos y específico para el fármaco. Las moléculas ADC individuales pueden identificarse en la mezcla mediante espectroscopía de masas, y separarse mediante HPLC, por ejemplo, cromatografía de interacción hidrófoba ("Effect of drug loading on the pharmacology, pharmacokinetics, and toxicity of an anti-CD30 antibody-drug conjugate", Hamblett, K.J., et al, Resumen N.° 624, American Association for Cancer Research; Reunión Anual de 2004, 27-31 de marzo de 2004, Proceedings of the AACR, Volumen 45, marzo de 2004; "Controlling the Location of Drug Attachment in Antibody-Drug Conjugates", Alley, S.C., et al, Resumen N.° 627, American Association for Cancer Research; Reunión Anual de 2004, 27-31 de marzo de 2004, Proceedings of the AACR, Volumen 45, marzo de 2004). Por tanto, se puede aislar un ADC homogéneo con un único valor de carga de la mezcla de conjugación mediante electroforesis o cromatografía.
4.3 LA UNIDAD ENLAZADORA
Una "Unidad enlazadora" (LU) es un compuesto bifuncional que se puede usar para unir una Unidad de fármaco y una Unidad de ligando para formar Conjugados de fármaco-enlazador-ligando, o que es útil en la formación de inmunoconjugados dirigidos contra antígenos asociados a tumores. Dichos inmunoconjugados permiten la administración selectiva de fármacos tóxicos a las células tumorales.
En algunos ejemplos, la Unidad enlazadora del Compuesto fármaco-enlazador y el Conjugado de fármacoenlazador-ligando tiene la fórmula:
-Aa-Ww-Yy-
en la que:
-A- es una Unidad ensanchadora;
a es 0 o 1;
cada -W- es independientemente una unidad de aminoácido;
w es un número entero comprendido entre 0 y 12;
-Y- es una Unidad separadora; y
y es 0, 1 o 2.
En el Conjugado de fármaco-enlazador-ligando, el Enlazdor puede unir el Resto de fármaco y la Unidad de ligando.
4.3.1 LA UNIDAD ENSANCHADORA
La unidad ensanchadora (-A-), cuando está presente, puede unir una Unidad de ligando con una unidad un aminoácido (-W-). A este respecto, una Unidad de ligando (L) tiene un grupo funcional que puede formar un enlace con un grupo funcional de una Ensanchadora. Los grupos funcionales útiles que pueden estar presentes en un ligando, tanto naturalmente como mediante manipulación química incluyen, aunque no de forma limitativa, sulfhidrilo (-SH), amino, hidroxilo, carboxi, el grupo hidroxilo anómero e de un hidrato de carbono, y carboxilo. Los grupos funcionales del ligando pueden ser sulfhidrilo y amino. Se pueden generar grupos sulfhidrilo mediante reducción de un enlace disulfuro intramolecular de un ligando. Como alternativa, se pueden generar grupos sulfhidrilo mediante la reacción de un grupo amino de un resto de lisina de un ligando utilizando 2-iminotiolano (reactivo de Traut) u otro reactivo generador de sulfhidrilos.
La Unidad ensanchadora puede formar un enlace con un átomo de azufre de la Unidad de ligando. Se puede derivar el átomo de azufre de un grupo sulfhidrilo de un ligando. Las Unidades ensanchadoras representativas de esta realización se representan gráficamente en los corchetes de las fórmulas Illa y IlIb, en las que L-, -W-, -Y-, -D, w e y son como se ha definido anteriormente, y R17 se selecciona de alquileno C1-C10, -carbociclo C3-C8, -O-(alquilo C1-Ca), -arileno-,alquileno-C1-C10-arileno-, -arileno-C1-C10 alquileno-, -alquilen C1-C10-(carbociclo C3-C8 )-, -(carbociclo C3-C8)-alquileno C1-C10-, -heterociclo C3-C8, -alquileno C1-C10-(heterociclo C3-C8)-, -(heterociclo C3-Ca)-alquileno C1-C10-, -(CH2CH2OX-, y -(CH2CH2OV-CH2-; y r es un entero comprendido de 1-10. Debe entenderse a partir de todas los conjugados ilustrativos de Fórmula Ia, tales como III-VI, que incluso no se han denotado de forma expresa, que de 1 a 20 restos de fármacos se unen a una unidad de ligando (p = 1-20).
Figure imgf000035_0001
L[-CH2-CONH-R17-C(O)]-Ww-Yy-D IlIb
Una unidad ensanchadora ilustrativa es la de la Fórmula Illa en la que R17 es -(CH2)5-:
Figure imgf000035_0002
Otra unidad ensanchadora ilustrativa es la de la Fórmula Illa en la que R17 es -(CH2CH2O)r-CH2-; y r es 2:
Figure imgf000035_0003
Otra unidad ensanchadora adicional en la de la Fórmula lllb en la que R17 es -(CH2)5-:
Figure imgf000035_0004
En otro ejemplo, La unidad ensanchadora está unida al ligando mediante un enlace disulfuro entre un átomo de azufre de la unidad de ligando y un átomo de azufre de la unidad ensanchadora. Una unidad ensanchadora representativa de esta realización se representa entre los corchetes de la Fórmula IV, en la que R17, L-, -W-, -Y-, -D, w e y son tal como se ha definido anteriormente.
L[-S-R17-C(O)-]-Ww-Yy-D IV
En otro ejemplo más, el grupo reactivo de la unidad ensanchadora contiene un sitio reactivo que puede formar un enlace con un grupo amino primario o secundario de un ligando. Los ejemplos de estos sitios reactivos incluyen, aunque no de forma limitativa, ésteres activados tales como ésteres de succinimida, ésteres de 4-nitrofenilo, ésteres de pentafluorofenilo, ésteres de tetrafluorofenilo, anhídridos, cloruros ácidos, cloruros de sulfonilo, isocianatos e isotiocianatos. Las Unidades ensanchadoras representativas se representan gráficamente entre los corchetes de las fórmulas Va y Vb, en la que -R17-, L-, -W-, -Y-, -D, w e y son tal como se ha definido anteriormente;
L[-C(O)NH-R17-C(O)]-Ww-Yy-D Va
Figure imgf000036_0001
Vb
El grupo reactivo de la Unidad ensanchadora puede contener un sitio reactivo que es reactivo con un grupo de hidratos de carbono modificado (-CHO) que puede estar presente en un ligando. Por ejemplo, un hidrato de carbono se puede oxidar suavemente utilizando un reactivo como peryodato de sodio y la unidad (-CHO) resultante del hidrato de carbono oxidado se puede condensar con una unidad ensanchadora de forma que contenga una funcionalidad como una hidrazida, una oxima, una amina primaria o secundaria, una hidrazina, una tiosemicarbazona, un carboxilato de hidrazina, y una arilhidrazida tal como las descritas por Kaneko, T. et al. (1991) Bioconjugate Chem 2:133-41. Las Unidades ensanchadoras representativas se representan gráficamente entre los corchetes de las fórmulas Via, Vlb, y VIc, en la que -R17-, L-, -W-, -Y-, -D, w e y son tal como se ha definido anteriormente.
Figure imgf000036_0002
4.3.2 LA UNIDAD DE AMINOÁCIDO
La unidad de aminoácido (-W-), cuando está presente, une la Unidad ensanchadora con la Unidad separadora si la Unidad separadora está presente, enlaza la Unidad ensanchadora con el Resto del fármaco si está ausente la Unidad separadora, y enlaza la Unidad del ligando con la Unidad del fármaco si están ausentes las Unidades ensanchadora y separadora.
-Ww- es un dipéptido, tripéptido, tetrapéptido, pentapéptido, hexapéptido, heptapéptido, octapéptido, nonapéptido, decapéptido, undecapéptido o dodecapéptido. Cada unidad -W- independientemente tiene la fórmula denotada a continuación en los corchetes, y w es un número entero comprendido entre 0 y 12:
Figure imgf000037_0001
en la que R19 es hidrógeno, metilo, isopropilo, isobutilo, sec-butilo, bencilo, p-hidroxibencilo, -CH2OH, -CH(OH)CH3, -CH2CH2SCH3, -CH2CONH2, -CH2COOH, -CH2CH2CONH2,-CH2CH2COOH, -(CH2),NHC(=NH)NH2, -(CH2)3NH2, -(CH2)3NHCOCH3,-(CH2)3NHCHO, -(CH2)4NHC(-NH)NH2, -(CH2)4NH2, -(CH2)4NHCOCH3,-(CH2)4NHCHO, -(CH2)3NHCONH2, -(CH2)4NHCONH2, -CH2CH2CH(OH)CH2NH2, 2-piridilmetilo-, 3-piridilmetilo-, 4-piridilmetilo-, fenilo, ciclohexilo,
Figure imgf000037_0002
La Unidad de aminoácido se puede escindir enzimáticamente mediante una o más enzimas, incluida una proteasa asociada a tumor, para liberar la Unidad de fármaco (-D), que en una realización se protona in vivo tras la liberación para proporcionar un fármaco (D). Las unidades Ww ilustrativas se representan mediante las fórmulas (VII)-(IX):
Figure imgf000037_0003
en las que R20 y R21 son los siguientes:
R20 R21
bencilo (CH2)4NH2;
metilo (CH2)4NH2;
isopropilo (CH2)4NH2;
isopropilo (CH2)3NHCONH2;
bencilo (CH2)3NHCONH2;
isobutilo (CH2)3NHCONH2;
sec-butilo (CH2)3NHCONH2;
Figure imgf000038_0001
en la que R 20 , R 21 y R 22 son los siguientes:
R20 R21 R22
bencilo bencilo (CH2)4NH2;
isopropilo bencilo (CH2)4NH2; y
H bencilo (CH2)4NH2;
Figure imgf000038_0002
en la que R20, R21, R22 y R23 son los siguientes:
R20 R21 R22 R23
H bencilo isobutilo H; y
metilo isobutilo metilo isobutilo.
Las unidades de aminoácido ilustrativas incluyen, aunque no de forma limitativa, unidades de fórmula (VII) donde: R20 es bencilo y R21 es -(CH2)4NH2; R20 es isopropilo y R21 es -(CH2)4NH2; R20 es isopropilo y R21 es -(CH2)3NHCONH2. Otra Unidad de aminoácido ilustrativa es una unidad de fórmula (VIII) en la que R20 es bencilo, R21 es bencilo, y R22 es -(CH2)4NH2.
Las unidades -Ww- útiles se pueden diseñar y optimizar en su selectividad para la escisión enzimática mediante enzimas concretas, por ejemplo, una proteasa asociada a tumor. En un ejemplo, una unidad -Ww- es aquella cuya escisión está catalizada por la catepsina B, C y D, o una proteasa de plasmina.
En un ejemplo, -Ww- es un dipéptido, tripéptido, tetrapéptido o pentapéptido.
Cuando R19, R20, R21, R22 o R23 es diferente de hidrógeno, el átomo de carbono al que R19, R20, R21 R22 o R23 está unido es quiral.
Cada átomo de carbono al que R19, R20, R21 R22 o R23 está unido está independientemente en la configuración (S) o (R).
En un ejemplo de la Unidad de aminoácido, la Unidad de aminoácido es valina-citrulina. En otro aspecto, la Unidad de aminoácido es fenilalanina-lisina (es decir, fk). En otro ejemplo adicional de la Unidad de aminoácido, la Unidad de aminoácido es N-metilvalina-citrulina. En otro aspecto más, la Unidad de aminoácido es ácido 5-aminovalérico, homofenilalanina-lisina, tetraisoquinolinecarboxilato-lisina, ciclohexilalanina-lisina, ácido isonepecótico-lisina, betaalanina lisina, glicina serina valina glutamina y ácido isonepecótico.
En determinados casos, la Unidad de aminoácido puede comprender aminoácidos naturales. En otros casos, la Unidad de aminoácido puede comprender aminoácidos no naturales.
4.3.3 LA UNIDAD SEPARADORA
La Unidad separadora (-Y-), cuando está presente, une una unidad de Aminoácido con el Resto de fármaco cuando está presente una Unidad de aminoácido. Como alternativa, la Unidad separadora une la Unidad ensanchadora con el Resto de fármaco cuando la Unidad de aminoácido está ausente. La Unidad separadora también une el Resto de fármaco con la Unidad de ligando cuando están ausentes tanto la Unidad de aminoácido como la Unidad ensanchadora.
Las unidades separadoras son de dos tipos generales: autoinmolables y no autoinmolables. Una Unidad separadora no autoinmolable es una en la que todo o parte de la Unidad separadora permanece unida al Resto de fármaco tras la escisión, especialmente enzimática, de una Unidad de aminoácido desde el Conjugado de fármaco-enlazadorligando o el Compuesto fármaco-enlazador. Los ejemplos de una Unidad separadora no autoinmolable incluyen, aunque no de forma limitativa, una Unidad separadora (glicina-glicina) y una Unidad separadora de glicina (ambas representadas gráficamente en el Esquema 1) (infra). Cuando un Compuesto ilustrativo que contiene una Unidad separadora de glicina-glicina o una Unidad separadora de glicina experimenta escisión enzimática mediante una proteasa asociada a una célula tumoral, una proteasa asociada a una célula cancerosa o una proteasa asociada a linfocito, Un glicina-glicina-Resto de fármaco o un glicina-Resto de fármaco se escinden de L-Aa-Ww-. En una realización, tiene lugar una reacción de hidrólisis independiente dentro de la célula diana, escindiendo el glicina-Resto de fármaco unido y liberando el Fármaco,
En otro ejemplo, -Yy- es una unidad de un alcohol p-aminobencilo (PAB) (véanse los Esquemas 2 y 3) cuya porción de fenileno se ha sustituido con Qm en la que Q es alquilo -C1-C8, -O-(alquilo C1-C8), halógeno, nitro o ciano; y m es un número entero que varía entre 0-4.
Esquema 1
Figure imgf000039_0001
En un ejemplo, una Unidad separadora no autoinmolable (-Y-) es -Gly-Gly-. En otro ejemplo, una Unidad separadora no autoinmolable (-Y-) es -Gly-.
En un ejemplo, un Compuesto fármaco-enlazador o un Conjugado de fármaco-enlazador-ligando se proporciona en el que la Unidad separadora está ausente (y=0), o una sal o solvato farmacéuticamente aceptable del mismo.
Como alternativa, un Compuesto ilustrativo que contiene una Unidad separadora autoinmolable puede liberar -D sin necesidad de una etapa de hidrólisis independiente. En esta realización, -Y- es un grupo PAB que está unido a -Wwmediante el átomo de nitrógeno del amino del grupo PAB, y conectado directamente a -D mediante un carbonato, carbamato o éter. Sin pretender quedar vinculado a teoría o mecanismo alguno, el Esquema 2 representa gráficamente un posible mecanismo para la liberación del Fármaco desde un grupo PAB que está unido directamente a -D mediante un grupo carbamato o carbonato, según establecieron Toki et al. (2002) J Org. Chem.
67:1866-1872.
Figure imgf000040_0001
en la que Q es alquilo C1-C8, -O-(alquilo C1-C8), -halógeno, -nitro o -ciano; m es un número entero comprendido de 0-4; y p está comprendido de 1 a aproximadamente 20.
Sin pretender quedar vinculado a teoría o mecanismo alguno, el Esquema 3 representa gráficamente un posible mecanismo para la liberación del Fármaco desde un grupo PAB que está unido directamente a -D mediante un enlace éter o amina.
Esquema 3
en la que Q es alquilo Ci-Cs, -O-(alquilo C1-C8), halógeno, nitro o ciano; m es un número entero comprendido de 0-4; y p está comprendido de 1 a aproximadamente 20.
Otros ejemplos de separadores autoinmolables incluyen, aunque no de forma limitativa, compuestos aromáticos que son electrónicamente similares al grupo PAB, tales como derivados de 2-aminoimidazol-5-metanol (Hay et al. (1999) Bioorg. Med. Chem. Lett. 9:2237) y orto o para-aminobencilacetales. Pueden usarse separadores que experimentan ciclación tras la hidrólisis del enlace amida, tales como amidas de ácido 4-aminobutírico sustituidas y no sustituidas (Rodrigues et al., Chemistry Biology, 1995, 2, 223), sistemas de anillos biciclo[2.2.1 ] y biciclo[2.2.2] adecuadamente sustituidos (Storm, et al., J. Amer. Chem. Soc., 1972,94,5815) y amidas de ácido 2-aminofenilpripiónico (Amsberry, et al., J. Org. Chem., 1990,55,5867). La eliminación de fármacos que contienen amina que están sustituidos en la posición a de la glicina (Kingsbury, et al., J. Med. Chem., 1984, 27, 1447) son también ejemplos de un separador autoinmolable de utilidad en los Compuestos ilustrativos.
En un ejemplo, la unidad separadora es una unidad de bis(hidroximetil)estireno ramificada (BHMS) ecomo se representa en el Esquema 4, que se puede usar para incorporar y liberar múltiples fármacos.
Esquema 4
Figure imgf000041_0001
2 fármacos
en la que Q es alquilo C1-C8, -O-(alquilo C1-C8), -halógeno, -nitro o -ciano; m es un número entero comprendido de 0-4; n es 0 o 1; y p varía entre 1 y a aproximadamente 20.
En un ejemplo los restos D son iguales. En otra realización más, los restos D son diferentes.
En un ejemplo, las Unidades separadoras (-Yy-) están representadas por las Fórmulas (X)-(XII):
Figure imgf000041_0002
en la que Q es alquilo C1-C8, -O-(alquilo C1-C8), -halógeno, -nitro o -ciano; y m es un número entero comprendido de 0-4;
Figure imgf000041_0003
los ejemplos de compuestos de conjugado de anticuerpo-fármaco de Fórmula Ia' y Ic incluyen:
Figure imgf000042_0001
y,
Figure imgf000042_0002
en la que cada uno de w e y son 0,
Figure imgf000042_0003
Figure imgf000043_0001
4.4 -LA UNIDAD DE FARMACO (RESTO)
El resto de fármaco (D) de los conjugados de anticuerpo y fármaco (ADC) son del tipo auristatina/dolastatina (patentes de Estados Unidos con números 5635483; 5780588) que han mostrado interferir con la dinámica de microtúbulos, hidrólisis de GTP, y la división nuclear y celular (Woyke et al. (2001) Antimicrob. Agents and Chemother. 45(12):3580-3584) y tienen actividad antineoplásica (patente de Estados Unidos n.° 5663149) y antifúngica (Pettit et al. (1998) Antimicrob. Agents Chemother. 42:2961-2965).15*20
D es una Unidad de fármaco (resto) que tiene un átomo que puede formar un enlace con la Unidad separadora cuando y= 1 o 2, con el grupo carboxilo del extremo C de un aminoácido cuando y=0, con el grupo carboxilo de una Unidad ensanchadora cuando w e y=0, y con el grupo carboxilo de una Unidad de fármaco cuando a, w, e y=0. Debe entenderse que las expresiones "unidad de fármaco" y "resto de fármaco" son sinónimas y se usan de forma indistinta en el presente documento.
En un ejemplo, -D es cualquier fórmula De o Df:
Figure imgf000044_0001
R2 se selecciona entre H y alquilo Ci-Cs;
R3 se selecciona de H, alquilo Ci-Cs, carbociclo C3-C8, arilo, alquilarilo Ci-Cs, alquil Ci-Cs-(carbociclo C3-C8), heterociclo C3-CS y alquil Ci-Cs-(heterociclo C3-Cs);
R4 se selecciona de H, alquilo Ci-Cs, carbociclo C3-C8, arilo, alquilarilo Ci-Cs, alquil Ci-Cs-(carbociclo C3-C8), heterociclo C3-Cs y alquil Ci-Cs-(heterociclo C3-Cs);
R5 se selecciona entre H y metilo;
o R4 y R5 forman conjuntamente un anillo carbocíclico y tienen la fórmula -(CRaRb)n- en la que Ra y Rb se seleccionan de forma independiente entre H, alquilo Ci-Cs y carbociclo C3-Cs y n se selecciona entre 2, 3, 4, 5 y 6;
R6 se selecciona entre H y alquilo Ci-Cs;
R7 se selecciona de H, alquilo Ci-Cs, carbociclo C3-Cs, arilo, alquilarilo Ci-Cs, alquil Ci-Cs-(carbociclo C3-Cs), heterociclo C3-Cs y alquil Ci-Cs-(heterociclo C3-Cs);
cada Rs se selecciona independientemente entre H, OH, alquilo Ci-Cs, carbociclo C3-Cs y -O-(alquilo Ci-Cs); R9 se selecciona entre H y alquilo Ci-Cs;
Ri0 se selecciona entre arilo o heterociclo C3-Cs;
Z es O, S, NH, o NRi2, en la que Ri2 es alquilo Ci-Cs;
R11 se selecciona de H, alquilo Ci-C20, arilo, heterociclo C3-Cs, -(Ri3O)m-Ri4, o -(Ri3O)m-CH(Ri5)2;
m es un número entero comprendido de 1-1000;
R13 es alquilo C2-C3;
R14 es H o alquilo Ci-Cs;
cada aparición de R15 es independientemente H, COOH, -(CH2)n-N(R16)2, -(CH2)n-SO3H, o -(CH2)n-SO3-alquilo Ci-Cs;
cada aparición de R16 es independientemente H, alquilo Ci-Cs, o -(CH2)n-COOH;
Ris se selecciona entre -C(Rs)2-C(Rs)2-arilo, -C(Rs)2-C(Rs)2-(heterociclo C3-Cs), y-C(Rs)2-C(Rs)2-(carbociclo C3-Cs); y
n es un número entero comprendido entre 0 y 6.
En un ejemplo, R3, R4 y R7 son, de forma independiente, isopropilo o sec-butilo y R5 es -H. En un ejemplo particular, R3 y R4 son cada uno isopropilo, R5 es H, y R7 es sec-butilo.
En otro ejemplo, R2 y R6 son cada uno metilo, y R9 es H.
En otro ejemplo más, cada aparición de Rs es -OCR3.
En un ejemplo particular, R3 y R4 son cada uno isopropilo, R2 y R6 son cada uno metilo, R5 es H, R7 es sec-butilo, cada aparición de Rs es -OCH3, y R9 es H.
En un ejemplo, Z es -O- o -NH-.
En un ejemplo, R10 es arilo.
En un ejemplo particular, R10 es fenilo.
En un ejemplo particular, cuando Z es -O-, R11 es H, metilo o t-butilo.
En un ejemplo, cuando Z es -NH, R11 es -CH(R15)2, en la que R15 es -(CH2)n-N(R16)2, y R16 es -alquilo Ci-Cs o -(CH2)n-COOH.
En otro ejemplo, cuando Z es -NH, R11 es -CH(R15)2, en la que R15 es -(CH2)n-SO3H.
Las unidades de fármaco ilustrativas (-D) incluyen las unidades de fármaco que tienen las siguientes estructuras:
Figure imgf000045_0001
Ċ
Figure imgf000046_0001
y
Figure imgf000047_0001
una de sus sales o solvatos farmacéuticamente aceptables.
Los grupos hidrófilos, tales como, aunque no de forma limitativa, los ésteres de trietilenglicol (TEG), como se muestra anteriormente, pueden unirse a la Unidad de fármaco en R11. Sin pretender quedar vinculado por teoría alguna, los grupos hidrófilos ayudan a la internalización y a la no aglomeración de la unidad de fármaco.
4.5 LA UNIDAD DE LIGANDO
La unidad de ligando (L-) incluye en su alcance cualquier unidad de un ligando (L) que se une o se asocia o compleja de forma reactiva con un receptor, antígeno u otro resto receptor asociado con una población de células diana dada. Un Ligando es una molécula que se une, forma complejo con o reacciona con una fracción de una población de células que se busca modificar terapéuticamente o, por otro lado, biológicamente. En un aspecto, la unidad de ligando actúa para administrar la unidad de fármaco a la población de células diana concreta con la cual la unidad de ligando reacciona. Dichos Ligandos incluyen, aunque no de forma limitativa, proteínas de peso molecular grande tales como, por ejemplo, anticuerpos de longitud completa, fragmentos de anticuerpos, proteínas, polipéptidos o péptidos de bajo peso molecular, lectinas, glucoproteínas, no péptidos, vitaminas, moléculas transportadoras de nutrientes (tales como, aunque no de forma limitativa, transferrina) o cualquier otra molécula o sustancia de unión a célula.
Una Unidad de ligando puede formar un enlace con una Unidad ensanchadora, una Unidad de aminoácido, una Unidad separadora o una Unidad de fármaco. Una Unidad de ligando puede formar un enlace con una Unidad enlazadora mediante un heteroátomo del ligando, Los heteroátomos que pueden estar presentes en una unidad de ligando incluyen azufre (en una realización, desde un grupo sulfhidrilo de un ligando), oxígeno (en una realización, desde un grupo carbonilo, carboxilo o hidroxilo de un ligando) y nitrógeno (en una realización, desde un grupo amino primario o secundario de un ligando). Estos heteroátomos pueden estar presentes en el ligando en el estado natural del ligando, por ejemplo un anticuerpo de origen natural, o pueden introducirse en el ligando mediante una modificación química.
En un ejemplo, un Ligando tiene un grupo sulfhidrilo y la unidad ligando se une a la unidad enlazadora mediante el átomo de azufre del grupo sulfhidrilo.
En otro ejemplo más, el ligando tiene uno o más restos lisina que pueden estar modificados químicamente para introducir uno o más grupos sulfhidrilo. La unidad de ligando se une a la unidad enlazadora mediante el átomo de azufre del grupo sulfhidrilo. Los reactivos que se pueden usar para modificar las lisinas incluyen, aunque no de forma limitativa, S-acetiltioacetato de N-succinimidilo (SATA) y clorhidrato de 2-iminotiolano (Reactivo de Traut).
En otro ejemplo, el ligando puede tener uno o más grupos de hidratos de carbono que pueden estar modificados químicamente para tener uno o más grupos sulfhidrilo. La Unidad de ligando se une a la Unidad enlazadora, tal como la Unidad ensanchadora, mediante el átomo de azufre del grupo sulfhidrilo.
En otro ejemplo más, el ligando puede tener uno o más grupos hidrato de carbono que se pueden oxidar para proporcionar un grupo aldehído (-CHO) (véase,por ejemplo, Laguzza, et al., J. Med. Chem. 1989, 32(3), 548-55). El correspondiente aldehído puede formar un enlace con un Sitio reactivo de una Unidad ensanchadora. Los sitios reactivos de una Unidad ensanchadora que pueden reaccionar con un grupo carbonilo de un Ligando incluyen, aunque no de forma limitativa, hidrazina e hidroxilamina. Otros protocolos para la modificación de proteínas para la unión o asociación de las unidades del fármaco en Coligan et al., Current Protocols in Protein Science, vol. 2, John Wiley & Sons (2002), incorporado en el presente documento por referencia.
La proteína, polipéptido, y o ligandos peptídicos no inmunorreactivos útiles incluyen, aunque no de forma limitativa, transferrina, factores de crecimiento epidérmico ("EGF"), bombesina, gastrina, péptido liberador de gastrina, factor de crecimiento derivado de plaquetas, IL-2, IL-6, factores de crecimiento transformantes ("TGF"), tales como TGF-a y TGF-p, factor de crecimiento de vaccinia ("VGF"), insulina y factores de crecimiento I y II de tipo insulina, lectinas y apoproteína procedente de una lipoproteína de baja densidad.
Los anticuerpos policlonales útiles son poblaciones heterogéneas de moléculas de anticuerpos derivadas de los sueros de animales inmunizados. Para la producción de anticuerpos policlonales contra un antígeno de interés pueden utilizarse diversos procedimientos bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, para la producción de anticuerpos policlonales, se pueden inmunizar diversos hospedadores animales mediante inyección con un antígeno de interés o uno de sus derivados, incluyendo, aunque no de forma limitativa, conejos, ratones, ratas, y cobayas. Se pueden utilizar diversos adyuvantes para aumentar la respuesta inmunológica, dependiendo de la especie hospedadora, e incluyen, aunque no de forma limitativa adyuvante de Freund (completo e incompleto), geles minerales tales como hidróxido de aluminio, sustancias tensioactivas tales como lisolecitina, polioles plurónicos, polianiones, péptidos, emulsiones oleosas, hemocianinas de lapa californiana, dinitrofenol, y adyuvantes humanos potencialmente útiles tales como BCG (bacilo de Calmette-Guerin) y corynebacterium parvum. Son bien conocidos también en la materia dichos adyuvantes.
Los anticuerpos monoclonales útiles son poblaciones homogéneas de anticuerpos para un determinante antigénico concreto (por ejemplo, un antígeno de células cancerosas, un antígeno vírico, un antígeno microbiano, una proteína, un péptido, un hidrato de carbono, un producto químico, ácido nucleico, o fragmentos de los mismos). Se puede preparar un anticuerpo monoclonal (mAb) para un antígeno de interés utilizando cualquier técnica conocida en la materia que proporcione la producción de moléculas de anticuerpo mediante líneas celulares continuas en el cultivo. Estos incluyen, aunque no de forma limitativa, la técnica del hibridoma descrita originalmente por Kohler y Milstein (1975, Nature 256, 495-497), la técnica de hibridoma de linfocitos B humanos (Kozbor et al., 1983, Immunology Today 4:72), y la técnica del hibridoma del VEB (Cole et al., 1985, Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., págs. 77-96). Dichos anticuerpos pueden ser de cualquier clase de inmunoglobulina incluyendo IgG, IgM, IgE, IgA, e IgD y cualquiera de sus subclases. el hibridoma que produce los mAb de uso en la presente invención puede cultivarse in vitro o in vivo.
Los anticuerpos monoclonales útiles incluyen, aunque no de forma limitativa, anticuerpos monoclonales humanos, anticuerpos monoclonales humanizados, fragmentos de anticuerpos, o anticuerpos monoclonales quiméricos de ser humano-ratón (u otras especies). Se pueden preparar anticuerpos monoclonales humanos mediante cualquiera de numerosas técnicas conocidas en la materia (por ejemplo, Teng y col., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 80,7308­ 7312; Kozbor et al., 1983, Immunology Today 4,72-79; y Olsson et al., 1982, Meth. Enzymol. 92, 3-16).
El anticuerpo puede ser también un anticuerpo biespecífico. Se conocen en la técnica métodos para preparar anticuerpos biespecíficos. La producción tradicional de anticuerpos biespecíficos de longitud completa se basa en la expresión simultánea de dos parejas de cadena pesada-cadena ligera de la inmunoglobulina, donde las dos cadenas tienen diferentes especificidades (Milstein co., 1983, Nature 305:537-539). Debido a la mezcla aleatoria de las cadenas pesada y ligera de la inmunoglobulina, estos hibridomas (cuadromas) producen una mezcla potencial de 10 diferentes moléculas de anticuerpos, de las cuales solo una tiene la estructura biespecífica correcta. Se divulgan procedimientos similares en la publicación internacional n.° WO 93/08829 y en Traunecker et al., EMBO J. 10:3655-3659 (1991).
De acuerdo con un enfoque diferente, los dominios variables de anticuerpos con las especificidades de unión deseadas (sitios de combinación de anticuerpo-antígeno) se fusionan con secuencias de dominio constante de la inmunoglobulina. La fusión es preferentemente con un dominio constante de cadena pesada de inmunoglobulina, que comprende al menos una parte de las regiones bisagra, Ch2, y Ch3. Se prefiere tener la primera región constante de la cadena pesada (Ch1) que contiene el sitio necesario para la unión con la cadena ligera, presente en al menos una de las fusiones. Los ácidos nucleicos con secuencias que codifican las fusiones de la cadena pesada de la inmunoglobulina y, si se desea, la cadena ligera de la inmunoglobulina, se insertan en vectores de expresión separados, y se transfectan simultáneamente en un organismo hospedador adecuado. Esto proporciona gran flexibilidad para ajustar las proporciones mutuas de los tres fragmentos de polipéptido en realizaciones en las que proporciones desiguales de las tres cadenas polipeptídicas usadas en la construcción proporcionan los rendimientos óptimos. Es, sin embargo, posible insertar las secuencias codificantes para dos o las tres cadenas polipeptídicas en un vector de expresión cuando la expresión de al menos dos cadenas polipeptídicas en proporciones iguales da como resultado rendimientos elevados o cuando las proporciones no son de significancia particular.
En un ejemplo de este enfoque, los anticuerpos biespecíficos tienen una cadena pesada de la inmunoglobulina híbrida con una primera especificidad de unión en un brazo, y una pareja de cadena pesada-cadena ligera de la inmunoglobulina híbrida (que proporciona una segunda especificidad de unión) en el otro brazo. Esta estructura asimétrica facilita la separación del compuesto biespecífico deseado de combinaciones de cadena de inmunoglobulina no deseadas, ya que la presencia de una cadena ligera de inmunoglobulina en solo una mitad de la molécula biespecífica proporciona una forma fácil de separación (publicación internacional n.° WO 94/04690) que se ha incorporado por referencia en el presente documento.
Para detalles adicionales acerca de la generación de anticuerpos biespecíficos véanse, por ejemplo, Suresh et al., Methods in Enzymology, 1986, 121:210; Rodrigues et al., 1993, J. of Immunology 151:6954-6961; Carter et al., 1992, Bio/Technology 10:163-167; Carter et al., 1995, J. of Hematotherapy 4:463-470; Merchant et al., 1998, Nature Biotechnology 16:677-681. Utilizando dichas técnicas, se pueden preparar anticuerpos biespecíficos para uso en el tratamiento o la prevención de la enfermedad como se define en el presente documento.
Los anticuerpos bifuncionales también se describen en la publicación de patente europea n.° EPA 0105360. Como se divulga en esta referencia, los anticuerpos híbridos o bifuncionales pueden derivarse ya sea biológicamente, es decir, mediante técnicas de fusión celular, o químicamente, especialmente con agentes de reticulación o reactivos formadores de puentes disulfuro, y pueden comprender anticuerpos completos o sus fragmentos. Los métodos para obtener dichos anticuerpos híbridos se divulgan, por ejemplo, en la publicación internacional WO 83/03679, y en la publicación de patente europea n.° EPA 0217577.
El anticuerpo puede ser un fragmento, derivado o análogo de un anticuerpo funcionalmente activo que se une inmunoespecíficamente a antígenos de células cancerosas, antígenos víricos, o antígenos microbianos u otros anticuerpos unidos a células tumorales o matriz. A este respecto, "funcionalmente activo" significa que el fragmento, derivado o análogo es capaz de estimular anticuerpos anti-anti-idiotipo que reconocen el mismo antígeno que el anticuerpo del cual se deriva el fragmento, derivado o análogo reconocido. Específicamente, en una realización ilustrativa, se puede potenciar la antigenicidad del idiotipo de la molécula de inmunoglobulina mediante la deleción de las secuencias marco y de las CDR que están en el extremo C de la secuencia de la CDR que reconoce específicamente el antígeno. Para determinar qué secuencias de las CDR se unen al antígeno, se pueden usar péptidos sintéticos que contienen las secuencias de las CDR en los ensayos de unión con el antígeno mediante cualquier procedimiento de ensayo de unión conocido en la materia (por ejemplo, el ensayo BIA core) (véanse, por ejemplo, Kabat y col., 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, Quinta edición, National Institutes of Health, Bethesda, Md; Kabat E et al., 1980, J. of Immunology 125(3):961-969).
Otros anticuerpos útiles incluyen fragmentos de anticuerpos tales como, aunque no de forma limitativa, fragmentos F(ab')2, que contienen la región variable, la región constante de cadena ligera y el dominio CH1 de la cadena pesada se pueden producir mediante digestión de la molécula de anticuerpo con pepsina, y los fragmentos Fab, que pueden generarse reduciendo los puentes disulfuro de los fragmentos F(ab')2. Otros anticuerpos útiles son los dímeros de cadena pesada y la cadena ligera de anticuerpos, o cualquier fragmento mínimo de los mismos tales como los Fv o los anticuerpos monocatenarios (SCA) (por ejemplo, como se describe en la patente de Estados Unidos n.° 4946778; Bird, 1988, Science 242:423-42; Huston et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883; y Ward et al., 1989, Nature 334:544-54), o cualquier otra molécula con la misma especificidad que el anticuerpo.
Adicionalmente, los anticuerpos recombinantes, tales como anticuerpos monoclonales quiméricos y humanizados, que comprenden tanto porciones humanas como no humanas, que pueden fabricarse utilizando técnicas de ADN recombinante convencionales, son anticuerpos útiles. Un anticuerpo quimérico es una molécula en la que las distintas porciones se obtienen de distintas especies animales, tales como las que tienen una región variable obtenida de un monoclonal murino y regiones constantes de inmunoglobulina humana. (Véase, por ejemplo, Cabilly et al., patente de Estados Unidos n.° 4816567; y Boss et al., patente de Estados Unidos n.° 4816397). Los anticuerpos humanizados son moléculas de- ser humano procedentes de especies no humanas que tienen una o más regiones determinantes de la complementariedad (CDR) procedentes de especies no humanas y una región marco procedente de una molécula de inmunoglobulina humana. (Véase, por ejemplo, Queen, patente de Estados Unidos n.° 5.585.089.) Dichos anticuerpos monoclonales quiméricos y humanizados se pueden producir mediante técnicas de ADN recombinante conocidas en la materia, por ejemplo, utilizando los métodos descritos en la publicación internacional N.° WO 87/02671; publicación de patente europea n.° 184.187; publicación de patente europea n.° 171496; publicación de patente europea n.° 173494; publicación internacional N.° WO 86/01533; patente de Estados Unidos n.° 4816567; publicación de patente europea n.° 12.023; Berter et al., 1988, Science 240:1041-1043; Liu et al., 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:3439-3443; Liu et al., 1987, J. Immunol. 139:3521-3526; Sun et al., 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:214-218; Nishimura et al., 1987, Cancer. Res. 47:999-1005; Wood et al., 1985, Nature 314:446-449; y Shaw et al., 1988, J. Natl. Cancer Inst. 80:1553-1559; Morrison, 1985, Science 229:1202-1207; Oi et al, 1986, BioTechniques 4:214; patente de Estados Unidos n.° 5225539; Jones et al., 1986, Nature 321:552-525; Verhoeyan et al. (1988) Science 239: 1534; y Beidler et al., 1988, J. Immunol. 141:4053-4060.
Son particularmente deseables los anticuerpos completamente humanos y se pueden producir utilizando ratones transgénicos que son incapaces de expresar los genes de las cadenas pesada y ligera de la inmunoglobulina endógena, pero que pueden expresar los genes de la cadena pesada y ligera humana. Los ratones transgénicos se inmunizan de la manera normal con un antígeno seleccionado, por ejemplo, todo o parte de un polipéptido de la invención. Se pueden obtener anticuerpos monoclonales dirigidos contra el antígeno utilizando la tecnología del hibridoma convencional. Los transgenes de la inmunoglobulina humana hospedados por los ratones transgénicos se redisponen durante la diferenciación de los linfocitos B y experimentan posteriormente cambio de clase y mutación somática. Por tanto, usando dicha técnica, es posible producir anticuerpos de IgG, IgA, IgM e IgE terapéuticamente útiles. Para una visión general de esta tecnología para producir anticuerpos humanos, véanse Lonberg y Huszar (1995, Int. Rev. Immunol. 13:65-93). Para una descripción detallada de esta tecnología para producir anticuerpos humanos y anticuerpos monoclonales humanos y los protocolos para producir dichos anticuerpos. Véase, por ejemplo, patentes de Estados Unidos n.° 5625126; 5633425; 5569825; 5661016; 5545806. Se pueden obtener otros anticuerpos humanos comercialmente de, por ejemplo, Abgenix, Inc. (Freemont, CA) y Genpharm (San Jose, CA).
Se pueden generar anticuerpos completamente humanos que reconozcan un epítopo seleccionado utilizando una técnica denominada "selección guiada". En esta solución, un anticuerpo monoclonal no humano seleccionado, por ejemplo, un anticuerpo de ratón, se usa para guiar la selección de un anticuerpo completamente humano que reconoce el mismo epítopo. (Jespers et al. (1994) Biotechnology 12:899-903). Los anticuerpos humanos se pueden producir usando varias técnicas conocidas en la materia, incluyendo las fagotecas de expresión (Hoogenboom y Winter, J. Mol. Biol., 227:381 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581 (1991); Quan, M. P. y Carter, P. 2002. The rise of monoclonal antibodies as therapeutics. En Anti-IgE and Allergic Disease, Jardieu, P. M. y Fick Jr., R. B, ed., Marcel Dekker, Nueva York, NY, Capítulo 20, págs. 427-469).
En otros ejemplos, el anticuerpo es una proteína de fusión de un anticuerpo, o uno de sus fragmentos funcionalmente activos, por ejemplo, en el que el anticuerpo se fusiona mediante un enlace covalente (por ejemplo, un enlace peptídico), bien en el extremo N o en el extremo C de una secuencia de aminoácidos de otra proteína (o parte de la misma, preferentemente al menos una porción de 10, 20 o 50 aminoácidos de la proteína) que no es el anticuerpo. Preferentemente, el anticuerpo o fragmento del mismo está unido covalentemente a la otra proteína en el extremo N del dominio constante.
Los anticuerpos incluyen análogos y derivados que bien pueden estar modificados, es decir, mediante el enlace covalente de cualquier tipo de molécula siempre que dicho enlace covalente permita al anticuerpo retener su inmunoespecificidad de unión a antígeno. Por ejemplo, aunque no de forma limitativa, los derivados y análogos de los anticuerpos incluyen aquellos que se han modificado adicionalmente, por ejemplo, mediante glucosilación, acetilación, pegilación, fosforilación, amidación, derivatización mediante grupos protectores/bloqueantes, escisión proteolítica, unión a una unidad de anticuerpo celular u otra proteína, etc. Se pueden llevar a cabo cualquiera de numerosas modificaciones químicas mediante técnicas conocidas, incluyendo, aunque no de forma limitativa, escisión química específica, acetilación, formilación, síntesis metabólica en presencia de tunicamicina, etc. Adicionalmente, el análogo o derivado puede contener uno o más aminoácidos no naturales.
Los anticuerpos incluyen anticuerpos que tienen modificaciones (por ejemplo, sustituciones, deleciones o adiciones) en restos de aminoácidos que interactúan con receptores Fc. En particular, los anticuerpos incluyen anticuerpos que tienen modificaciones en restos de aminoácidos identificados como implicados en la interacción entre el dominio dirigido contra Fc y el receptor de FcRn (véase,por ejemplo, la publicación internacional n.° WO 97/34631. Los anticuerpos inmunoespecíficos de un antígeno de células cancerosas se pueden obtener comercialmente anticuerpos inmunoespecíficos para un antígeno de células cancerosas, por ejemplo de Genentech (San Francisco, CA) o producirse mediante cualquier método conocido por un experto en la materia tal como, por ejemplo, síntesis química o técnicas de expresión recombinante. Pueden obtenerse anticuerpos inmunoespecíficos que codifican la secuencia de nucleótidos de un antígeno de célula cancerosa, por ejemplo, de la base de datos GenBank o de una base de datos del tipo de ésta, publicaciones de bibliografía, o por clonación y secuenciación rutinarias.
En un ejemplo específico, se pueden usar anticuerpos conocidos para el tratamiento o la prevención del cáncer. Se pueden obtener anticuerpos inmunoespecíficos para un antígeno de célula cancerosa comercialmente o producirse mediante cualquier método conocido por un experto en la materia tal como, por ejemplo, técnicas de expresión recombinante. Pueden obtenerse anticuerpos inmunoespecíficos que codifican la secuencia de nucleótidos de un antígeno de célula cancerosa, por ejemplo, de la base de datos GenBank o de una base de datos del tipo de ésta, publicaciones de bibliografía, o por clonación y secuenciación rutinarias. Los ejemplos de anticuerpos disponibles para el tratamiento del cáncer incluyen, aunque no de forma limitativa, anticuerpo monoclonal anti-HER2 humanizado, HERCEPTIN® (trastuzumab; Genentech) para el tratamiento de pacientes con cáncer de mama metastásico; RITUXAN® (rituximab; Genentech) que es un anticuerpo monoclonal quimérico dirigido contra CD20 para el tratamiento de pacientes con linfoma no de Hodgkin; OvaRex (AltaRex Corporation, MA) que es un anticuerpo de murino para el tratamiento del cáncer de ovario; Panorex (Glaxo Wellcome, NC) que es un anticuerpo IgG2a de murino para el tratamiento del cáncer colorrectal; Cetuximab Erbitux (Imclone Systems Inc., NY) que es un anticuerpo quimérico dirigido contra EGFR IgG para el tratamiento de cánceres positivos para el factor de crecimiento epidérmico, tales como cáncer de cabeza y cuello; Vitaxin (MedImmune, Inc., MD) que es un anticuerpo humanizado para el tratamiento del sarcoma; Campath I/H (Leukosite, MA) que es un anticuerpo IgG1 humanizado para el tratamiento de la leucemia linfocítica crónica (LLC); SMART MI95 (Protein Design Labs, Inc., CA) que es un anticuerpo IgG humanizado dirigido contra CD33 para el tratamiento de la leucemia mieloide aguda (LMA); LymphoCide (Immunomedics, Inc., NJ) que es un anticuerpo de tipo IgG humanizado dirigido contra CD22 para el tratamiento del linfoma no de Hodgkin; SMART ID10 (Protein Design Labs, Inc., CA) que es un anticuerpo humanizado dirigido contra HLA-DR para el tratamiento del linfoma no de Hodgkin; Oncolym (Techniclone, Inc., CA) que es un anticuerpo de murino radiomarcado dirigido contra HLA-Dr10 para el tratamiento del linfoma no de Hodgkin; Allomune (BioTransplant, CA) que es un mAb humanizado dirigido contra CD2 para el tratamiento de la enfermedad de Hodgkin o del linfoma no de Hodgkin; Avastina (Genentech, Inc., CA) que es un anticuerpo humanizado anti-MHCII para el tratamiento de los cánceres de pulmón y colorrectal; Epratuzamab (Immunomedics, Inc., NJ y Amgen, CA) que es un anticuerpo dirigido contra CD22 para el tratamiento del linfoma no de Hodgkin; y CEAcide (Immunomedics, NJ) que es un anticuerpo humanizado dirigido contra CEA para el tratamiento del cáncer colorrectal.
Otros anticuerpos útiles en el tratamiento del cáncer incluyen, aunque no de forma limitativa, anticuerpos frente a los siguientes antígenos: CA125 (ovario), CA15-3 (carcinomas), CA19-9 (carcinomas), L6 (carcinomas), Lewis Y (carcinomas), Lewis X (carcinomas), alfa fetoproteína (carcinomas), CA 242 (colorrectal), fosfatasa alcalina placentaria (carcinomas), antígeno específico de próstata (próstata), fosfatasa ácida prostática (próstata), factor de crecimiento epidérmico (carcinomas), MAGE-1 (carcinomas), MAGE-2 (carcinomas), MAGE-3 (carcinomas), MAGE-4 (carcinomas), receptor anti-transferrina (carcinomas), p97 (melanoma), MUC1-KLH (cáncer de mama), CEA (colorrectal), gp100 (melanoma), MARTI (melanoma), PSA (próstata), receptor de IL-2 (leucemia de linfocitos T y linfomas), CD20 (linfoma no de Hodgkin), CD52 (leucemia), CD33 (leucemia), CD22 (linfoma), gonadotropina coriónica humana (carcinoma), CD38 (mieloma múltiple), CD40 (linfoma), mucina (carcinomas), P21 (carcinomas), MPG (melanoma), y el producto del oncogén Neu (carcinomas). Algunos anticuerpos específicos útiles incluyen, aunque no de forma limitativa, mAb BR96 (Trail, P. A., Willner, D., Lasch, S. J., Henderson, A. J., Hofstead, S. J., Casazza, A. M., Firestone, R. A., Hellstrom, I., Hellstrom, K. E., "Cure of Xenografted Human Carcinomas by BR96-Doxorubicin Immunoconjugates" Science 1993, 261,212-215), BR64 (Trail, PA, Willner, D, Knipe, J., Henderson, A. J. , Lasch, S. J., Zoeckler, M. E., Trailsmith, M. D., Doyle, T. W., King, H. D., Casazza, A. M., Braslawsky, G. R., Brown, J. P., Hofstead, S. J., (Greenfield, R. S., Firestone, R. A., Mosure, K., Kadow, D. F., Yang, M. B., Hellstrom, K. E., y Hellstrom, I. "Effect of Linker Variation on the Stability, Potency, and Efficacy of Carcinoma-reactive BR64-Doxorubicin Immunoconjugates" Cancer Research 1997, 57, 100-105, mAb contra el antígeno CD40, tal como el MAb S2C6 (Francisco, J. A., Donaldson, K. L., Chace, D., Siegall, C. B., y Wahl, A. F. "Agonistic properties and in vivo antitumor activity of the anti-CD-40 antibody, SGN-14" Cancer Res. 2000, 60, 3225-3231), los mAb contra el antígeno CD70, tales como el mAb 1F6 y el mAb 2F2, y los mAb contra el antígeno CD30, tal como AC10 (Bowen, M. A., Olsen, K. J., Cheng, L., Avila, D., y Podack, E. R. "Functional effects of CD30 on a large granular lymphoma cell line YT" J. Immunol., 151,5896-5906, 1993: Wahl et al., 2002 Cancer Res. 62(13):3736-42). Se pueden usar otros muchos anticuerpos internalizadores que se unen a antígenos asociados a tumores y se han revisado (Franke, A. E., Sievers, E. L., y Scheinberg, D. A., "Cell surface receptor-targeted therapy of acute myeloid leukemia: a review" Cancer Biother Radiopharm. 2000,15, 459-76; Murray, J. L., "Monoclonal antibody treatment of solid tumors: a coming of age" Semin Oncol. 2000, 27, 64-70; Breitling, F. y Dubel, S., Recombinant Antibodies, John Wiley, and Sons, Nueva York, 1998).
En algunos ejemplos, el anticuerpo no es Trastuzumab (anticuerpo dirigido contra HER2 humanizado de longitud completa (MW 145167)), HerceptinF(ab')2 (derivado enzimáticamente del anticuerpo dirigido contra HER2 (MW 100000)), 4D5 (anticuerpo dirigido contra HER2 murino, de longitud completa, derivado de hibridoma), rhu4D5 (anticuerpo humanizado de longitud completa, expresado transitoriamente), rhuFab4D5 (Fab recombinante humanizado (MW 47738)), 4D5Fc8 (anticuerpo dirigido contra HER2 murino, de longitud completa, con dominio de unión a FcRn mutado), o Hg (4D5 humanizado de longitud completa "sin bisagra", donde las cisteínas de la cadena pesada están mutadas a serinas. Expresados en E. coli (por tanto, no glicosilados)).
En otro ejemplo específico, los anticuerpos conocidos para el tratamiento o la prevención de una enfermedad autoinmunitaria. se utilizan de acuerdo con las composiciones y métodos de la invención. Los anticuerpos inmunoespecíficos de un antígeno de una célula que es responsable de producir anticuerpos autoinmunitarios se puede obtener de cualquier organización (por ejemplo, un científico de una universidad o una compañía) o producirse mediante cualquier método conocido por un experto en la materia tal como, por ejemplo, síntesis química o técnicas de expresión recombinante. En otra realización, los anticuerpos útiles que son inmunoespecíficos para el tratamiento de las enfermedades autoinmunitarias incluyen, aunque no de forma limitativa, anticuerpo antinuclear; anticuerpo dirigido contra el ADNds; anticuerpo dirigido contra el ADNss, IgM de anticuerpo dirigido contra cardiolipina, IgG; IgM de anticuerpo dirigido contra fosfolípido, IgG; anticuerpo dirigido contra SM; anticuerpo dirigido contra mitocondrias; anticuerpo tiroideo; anticuerpo microsomal; anticuerpo de tiroglobulina; anticuerpo dirigido contra SCL-70; anticuerpo dirigido contra Jo; anticuerpo dirigido contra U.|RNP; anticuerpo dirigido contra La/SSB; anticuerpo dirigido contra SSA; anticuerpo dirigido contra SSB; anticuerpo dirigido contra células peritales; anticuerpo dirigido contra histonas; anticuerpo dirigido contra RNP; C-ANCA; P-ANCA; Anticentrómero; anticuerpo antifibrilarina y anticuerpo dirigido contra GBM.
En determinados casos, los anticuerpos útiles pueden unirse tanto a un receptor como a un complejo receptor expresado en un linfocito activado. El receptor o el complejo receptor puede comprender un miembro de la superfamilia de los genes de las inmunoglobulinas, un miembro de la superfamilia de receptores de TNF, una integrina, un receptor de citoquina, un receptor de la quimioquina, una proteína de histocompatibilidad mayor, una lectina, o una proteína control del complemento. Los ejemplos no limitantes de miembros adecuados de la superfamilia de las inmunoglobulinas son CD2, CD3, CD4, CD8, CD19, CD22, CD28, CD79, CD90, CD152/CTLA-4, PD-1, e ICOS. Los ejemplos no limitantes de miembros adecuados de la superfamilia de receptores de TNF son CD27, CD40, CD95/Fas, CD134/OX40, CD137/4-1BB, TNF-R1, TNFR-2, RANK, TACI, al BCMA, osteoprotegerina, Apo2/TRAIL-R1, TRAIL-R2, TRAIL-R3, TRAIL-R4 e APO-3. Los ejemplos no limitantes de integrinas adecuadas son CD11a, CD11b, CD11c, CD18, CD29, CD41, CD49a, CD49b, CD49c, CD49d, CD49e, CD49f, CD103 e CD104. Los ejemplos no limitantes de lectinas adecuadas son las lectinas del tipo C, lectina de tipo S, y lectina de tipo I.
En un ejemplo, el Ligando se une a un linfocito activado que se asocia con una enfermedad autoinmunitaria.
En otro ejemplo específico, los Ligandos inmunoespecíficos útiles para un antígeno vírico o microbiano son anticuerpos monoclonales. Los anticuerpos pueden ser anticuerpos quiméricos, humanizados o monoclonales humanos. Como se usa en el presente documento, el término "antígeno vírico" incluye, pero sin limitación, cualquier péptido vírico, proteína polipeptídica (por ejemplo, gp120 del VIH, VIH nef, glicoproteína F del VSR, neuraminidasa del virus de la gripe, hemaglutinina del virus de la gripe, HTLV tax, glicoproteína del virus del herpes simple (por ejemplo, gB, gC, gD y gE) y el antígeno superficial de la hepatitis B) que es capaz de estimular una respuesta inmunitaria. Como se usa en el presente documento, la expresión "antígeno microbiano" incluye, pero sin limitación, cualquier péptido microbiano, polipéptido, proteína, sacárido, polisacárido, o molécula de lípido (por ejemplo, una bacteria, hongos, protozoo patógeno o polipéptido de levadura incluyendo, por ejemplo, LPS y un polisacárido capsular 5/8) que es capaz de estimular una respuesta inmune.
Se pueden obtener anticuerpos inmunoespecíficos de un antígeno vírico o microbiano comercialmente, por ejemplo, de BD Biosciences (San Francisco, CA), Chemicon International, Inc. (Temecula, CA), o Vector Laboratories, Inc. (Burlingame, CA) o producirse mediante cualquier método conocido por un experto en la materia tal como, por ejemplo, síntesis química o técnicas de expresión recombinante. se puede obtener la secuencia de nucleótidos que codifica anticuerpos que son inmunoespecíficos de un antígeno vírico o microbiano, por ejemplo, de la base de datos GenBank o de una base de datos del tipo de ésta, publicaciones de bibliografía, o por clonación y secuenciación rutinarias.
En un ejemplo específico, los Ligandos útiles son aquellos que son útiles para el tratamiento de una infección vírica o microbiana de acuerdo con los métodos divulgados en el presente documento. Los ejemplos de anticuerpos útiles para el tratamiento de una infección vírica o una infección microbiana incluyen, aunque no de forma limitativa, SYNAGIS (MedImmune, Inc., MD) que es un anticuerpo monoclonal humanizado dirigido contra el virus sincitial respiratorio (VSR) para el tratamiento de pacientes con infección por VSR; PRO542 (Progenies) que es un anticuerpo de fusión con CD4 útil para el tratamiento de la infección por VIH; OSTAVIR (Protein Design Labs, Inc., CA) que es un anticuerpo humano útil para el tratamiento del virus de la hepatitis B; PROTOVIR (Protein Design Labs, Inc., CA) que es un anticuerpo de IgG1 humanizado útil para el tratamiento del citomegalovirus (CMV); y anticuerpos dirigidos contra LPS.
Otros anticuerpos útiles en el tratamiento de las enfermedades infecciosas incluyen, aunque no de forma limitativa, anticuerpos contra los antígenos procedentes de cepas patógenas de bacterias (Streptococcus pyogenes, Streptococcus pneumoniae, Neisseria gonorrheae, Neisseria meningitidis, Corynebacterium diphtheriae, Clostridium botulinum, Clostridium perfringens, Clostridium tetani, Hemophilus influenzae, Klebsiella pneumoniae, Klebsiella ozaenas, Klebsiella rhinoscleromotis, Staphylococc aureus, Vibrio colerae, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Campylobacter (Vibrio) fetus, Aeromonas hidrophila, Bacillus cereus, Edwardsiella tarda, Yersinia enterocolitica, Yersinia pestis, Yersinia pseudotuberculosis, Shigella dysenteriae, Shigella flexneri, Shigella sonnei, Salmonella typhimurium, Treponema pallidum, Treponema pertenue, Treponema carateneum, Borrelia vincentii, Borrelia burgdorferi, Leptospira icterohemorrhagiae, Mycobacterium tuberculosis, Pneumocystis carinii, Francisella tularensis, Brucella abortus, Brucella suis, Brucella melitensis, Mycoplasma spp., Rickettsia prowazeki, Rickettsia tsutsugumushi, Chlamydia spp.); pathogenic fungi (Coccidioides immitis, Aspergillus fumigatus, Candida albicans, Blastomyces dermatitidis, Cryptococcus neoformans, Histoplasma capsulatum); protozoos (Entomoeba histolytica, Toxoplasma gondii, Trichomonas tenas, Trichomonas hominis, Trichomonas vaginalis, Trypanosoma gambiense, Trypanosoma rhodesiense, Trypanosoma cruzi, Leishmania donovani, Leishmania tropica, Leishmania braziliensis, Pneumocystis pneumonia, Plasmodium vivax, Plasmodium falciparum, Plasmodium malaria); o Helmintos (Enterobius vermicularis, Trichuris trichiura, Ascaris lumbricoides, Trichinella spiralis, Strongyloides stercoralis, Schistosoma japonicum, Schistosoma mansoni, SSchistosoma haematobium, y anquilostomas).
Otros anticuerpos para el tratamiento de enfermedades víricas incluyen, aunque no de forma limitativa, anticuerpos contra antígenos de virus patógenos, que incluyen como ejemplos y no como limitación: Poxviridae, Herpesviridae, Virus del Herpes Simple 1, Virus del Herpes Simple 2, Adenoviridae, Papovaviridae, Enteroviridae, Picornaviridae, Parvoviridae, Reoviridae, Retroviridae, los virus de la gripe, los virus de la paragripe, paperas, sarampión, virus sincitial respiratorio, rubeola, Arboviridae, Rhabdoviridae, Arenaviridae, virus de la hepatitis A, virus de la hepatitis B, virus de la hepatitis C, virus de la hepatitis E, virus de la hepatitis no A/no B, Rhinoviridae, Coronaviridae, Rotoviridae, y el virus de la inmunodeficiencia humana.
En los intentos para descubrir las dianas celulares eficaces para el diagnóstico y el tratamiento del cáncer, los investigadores han deseado identificar polipéptidos transmembrana o asociados de otra forma a tumores que se expresan específicamente sobre la superficie de uno o más tipo(s) concreto(s) de células cancerosas en comparación con una o más célula(s) no cancerosas normales. A menudo, dichos polipéptidos asociados a tumores se expresan más abundantemente sobre la superficie de células cancerosas en comparación a sobre la superficie de células no cancerosas. la identificación de dichos polipéptidos de antígenos superficiales celulares asociados a tumores ha proporcionado una sensibilización a la capacidad de las células cancerosas para dirigirse de manera específica para los tratamientos basados en anticuerpos mediante la destrucción.
Los anticuerpos que comprenden Ab en los conjugados de anticuerpo y fármaco de Fórmula Ic (ADC) y que pueden ser útiles en el tratamiento del cáncer incluyen, aunque no de forma limitativa, anticuerpos contra antígenos asociados a tumores(TAA). Dichos antígenos asociados a tumores son bien conocidos en la técnica, y se pueden preparar para su uso en la generación de anticuerpos uando métodos e información que son bien conocidos en la materia. Los ejemplos de TAA incluyen (1)-(35), aunque no de forma limitativa los TAA (1)-(35) listados a continuación. Por comodidad, la información relativa a dichos antígenos, todos los cuales son conocidos en la técnica, se relacionan a continuación e incluyen nombres, nombres alternativos, números de registro de GenBank y referencia(s) primaria(s). Los antígenos asociados a tumores que son diana de anticuerpos incluyen todas las variantes de secuencia de aminoácidos y las isoformas que tienen al menos aproximadamente 70 %, 80 %, 85 %, 90 %, o 95 % de identidad de secuencia con respecto a las secuencias identificadas en las correspondientes secuencias relacionadas (SEQ ID NOS: 1-35) o las secuencias identificadas en las referencias citadas. En algunos ejemplos, los TAA que tienen variantes de secuencia de aminoácidos que presentan sustancialmente las mismas propiedades o características biológicas que un TAA que tiene la secuencia que aparece en las correspondientes secuencias relacionadas (SEQ ID NOS: 1-35). Por ejemplo, un TAA que tiene una variante de secuencia generalmente es capaz de unirse específicamente a un anticuerpo que se une específicamente al TAA de la correspondiente secuencia relacionada. Las secuencias y la divulgación específicamente citada en el presente documento se han incorporado expresamente por referencia.
ANTÍGENOS ASOCIADOS A TUMORES (1)-(35):
(1) BMPR1B (receptor de la proteína morfogenética ósea - tipo IB, n.° de registro GenBank NM_001203, ten Dijke,P., et al. Science 264 (5155): 101-104 (1994), Oncogene 14 (11 ):1377-1382 (1997)); documento WO2004063362 (Reivindicación 2); documento WO2003042661 (Reivindicación 12); documento US2003134790-A1 (Página 38-39); documento WO2002102235 (Reivindicación 13; página 296); documento WO2003055443 (Página 91-92); documento WO200299122 (Ejemplo 2; Página 528-530); documento WO2003029421 (Reivindicación 6); documento WO2003024392 (Reivindicación 2; Fig 112); documento WO200298358 (Reivindicación 1; página 183); documento WO200254940 (Página 100-101); documento WO200259377(página 349-350); documento WO200230268 (Reivindicación 27; página 376); documento WO200148204 (Ejemplo; Fig. 4) NP_001194 receptor de la proteína morfogenética ósea, tipo IB /pid=NP_001194.1-Referencias cruzadas: MIM:603248; NP_001194.1; NM_001203_1 502 aa
MLLRSAGKLNVGTKKEDGESTAPTPRPKVLRCKCHHHCPEDSVNNICSTDGYCFTMIEED
DSGLPWTSGCLGLEGSDFQCRDTPIPHQRRSIECCTERNECNKDLHPTtiPPLKNRDFVD GPIHHRALLISVTVCSLLLVLIILFCYFRYKRQETRPRYSIGIiEQDETYIPPGESLRDLI
EQSQSSGSGSGLPIíLVQRTIAKQ IQMVKQIGKGRYGEVWMGKWRGEKVAVKVFFTTEEAS
WFRETEIYQTVLMRHENILGFIAADIKGTGSWTQLYLITDYHENGSLYDYLKSTTLDAKS
MLKLAYSSVSGLCHLfíTEXFSTQGKPAXAHRDIiKSKNILVKKNGTCCIADLGIiAVKFISD
TNEVDIPPNTRVGTKRYMPPEVLDESLNRNHFQSYIMADMYSFGLILWEVARRCVSGGIV
EEYQLPYHDLVPSDPSYEDMREXVCIKKLRPSFPNRWSSDECLRQMGKLMTECWAHNPAS
RLTALRVKKTTiAKMSESQDIKti
(SEQ ID NO: 1)
(2) E16 (LAT1, SLC7A5, n.° de registro GenBank NM_003486); Biochem. Biophys. Res. Commun. 255 (2), 283-288 (1999), Nature 395 (6699):283-291 (1998), Gaugitsch,H.W., et al. (1992) J. Biol. Chem. 267 (16):11267-11273); documento WO2004048938 (Ejemplo 2); documento WO2004032842 (Ejemplo IV); documento WO2003042661 (Reivindicación 12); documento WO2003016475 (Reivindicación 1); documento WO200278524 (Ejemplo 2); documento WO200299074 (Reivindicación 19; Página 127-129); documento WO200286443 (Reivindicación 27; Páginas 222,393); documento WO2003003906 (Reivindicación 10; página 293); documento WO200264798 (Reivindicación 33; Página 93-95); documento WO200014228 (Reivindicación 5; Página 133-136); documento US2003224454 (Fig 3); documento WO2003025138 (Reivindicación 12; página 150); NP_003477 familia del transportador de soluto 7 (transportador de aminoácidos catiónicos, sistema y+), miembro 5 /pid=NP_003477.3 -Homo sapiens Referencias cruzadas: MIM:600182; NP_003477.3; NM_015923; NM_003486_1
507 aa
MAGAGPKRRALAAP AAEE KEEAREKMLAAKSADGSAPAGEGEGVTIiQRN ITLLNG VA IIV
GTIIGSGIPVTPTGVLKEAGSPGLALWWAACGVFSI VGALCYAELGTTIS KSGGDYAYM
LEVYGSLPAFLKLWIELLIIRPSSQYIVALVFATYLLKPLFPTCPVPEEAAKLVACLCVL
LLTAVNCY SVKAATRVQD AFAAAKLLAIjALI ILLGFVQIGKGWSNLDPNFS FEGTKLDV
GNIVLALYSGLFAYGGWNYLNFVTEEMINPYRNLPLAIIISLPIVTLVYVLTNIAYFTTL
STEQMLSSEAVAVDFGNYHLGVMSVÍIIPVFVGLSCFGSVNGSliFTSSRLFFVGSREGHLP
SILSMIHPQLLTPVPSLVFTCVMTLLYAFSKDIFSVINFFSFFNWLCVALAIIGMIWLRH
RKPELERPIKVNLALPVFFILACLFLIAVSFWKTPVECGIGFTIILSGLPVYFFGVWWKN
KPKWLLQGIFSTTVLCQKLMQWPQET
(SEQ ID NO: 2)
(3) STEAP1 (antígeno epitelial seis transmembrana de la próstata, n.° de registro GenBank NM_012449 Cáncer Res.
61 (15), 5857-5860 (2001), Hubert,R.S., et al. (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 96 (25):14523-14528); documento WO2004065577 (Reivindicación 6); documento WO2004027049 (Fig 1L); documento EP1394274 (Ejemplo 11); documento WO2004016225 (Reivindicación 2); documento w O2003042661 (Reivindicación 12); documento US2003157089 (Ejemplo 5); documento US2003185830 (Ejemplo 5); documento US2003064397 (Fig 2); documento WO200289747 (Ejemplo 5; Página 618-619); documento WO2003022995 (Ejemplo 9; Fig 13A, Ejemplo 53; Página 173, Ejemplo 2; Fig 2A);
NP_036581 antígeno epitelial seis transmembrana de la próstata
Referencias cruzadas: MIM:604415; NP_036581.1; NM_012449_1
339 aa
MESRKDITNQEELWKMKPRRNLEEDDYLHKDTGETSMLKRPVLLHLHQTAHADEFDCPSE
LQHTQELFPQWHLPIKIAAIIASLTFLYTLLREVIHPLATSHQQYFYKIPILVINKVLPM
VSITLLALVYLPGVIAAIVQLHNGTICYKKFPHWLDKWI4LTRKQFGLLSFFFAVLHAIYSL
SYPMRRS YRYKLLNWAYQQVQQNKEDAWIEHDWJRMEIYVSLGI VGLAIIíALLlAVTSI PS VSDSLTWREFHYIQSKLGIVSLLLGTIHALIFAWNKWIDIKQFVWYTPPTFMIAVFIiPIV VLIFKSILFLPCLRKKILKIRHGWEDVTKINKTEICSQL
(SEQ ID NO 3)
(4) 0772P (CA125, MUC16, n.° de registro GenBank AF361486 J. Biol. Chem. 276 (29):27371-27375 (2001)); documento WO2004045553 (Reivindicación 14); documento WO200292836 (Reivindicación 6; Fig 12); documento WO200283866 (Reivindicación 15; Página 116-121); documento US2003124140 (Ejemplo 16); documento US2003091580 (Reivindicación 6); documento WO200206317 (Reivindicación 6; Página 400-408);
Referencias cruzadas: GI:34501467; AAK74120.3; AF361486_1
6995 aa
PVTSLIiTPGLVITTDRMGISREPGTSSTSNLSSTSHERIiTTLEDTVDTEAMQPSTHTAVT NVRTSISGHESQSSVLSDSETPKATSPMGTTYTMGETSVSISTSDFFETSRIQIEPTSSE TSGLRETS SSERISSATEGSTVLSEVPSGATTEVSRTE V X S SRGTSMSGPDQFTIS PDIS TEAITRIiSTSPIMTESAESAITIETGSPGATSEGTLTLDTSTTTFWSGTHSTASPGFSHS EMTTLMSRTPGDVPWPSLPSVEEASSVSSSLSSPAMTSTSFFSTLPESISSSPHPVTALL TLGPVKTTDMLRTSSEPETSSPPNLSSTSAEILATSEVTKDREKIHPSSNTPWNVGTVI YKHLSPSSVLADLVTTKPTSPMATTSTLGNTSVSTSTPAFPETMMTQPTSSLTSGLREIS TSQETSSATBRSASLSGMPTGATTKVSRTEALSLGRTSTPGPAQSTISPEISTETITRIS TPLTTTGSAEMTITPKTGHSGASSQGTFTLDTSSRASWPGTHSAATHRSPHSGMTTPMSR GPEDVSWPSRPSVEKTSPPSSLVSLSAVTSPSPLYSTPSESSHSSPLRVTSLFTPVMMKT TDMLDTSLEPVTTSPPSMNITSDESLATSKATMETEAIQLSENTAVTQMGTISARQEFYS SYPGLPEPSKVTSPWTSSTIKDIVSTTIPASSEITRIEMESTSTLTPTPRETSTSQEIH SATKPSTVPYKAIiTSATIEDSMTQVMSSSRGPSPDQSTMSQDISTEVITRLSTSPIKTES TEMTITTQTGSPGATSRGTLTLDTSTTFMSGTHSTASQGFSHSQMTALMSRTPGEVPWLS HPSVEEAS SAS FSLSS P VMTSSSPVSSTLPDSIHSSSLPVTSLLTSGLVKTTELLGTS SE PETSSPPNLSSTSAEILATTEVTTDTEKLEMTNWTSGYTHESPSSVLADSVTTKATSSM GITYPTGDTNVLTSTPAFSDTSRIQTfCSfCLSLTPGLMETSrSEETSSATEKSTVLSSVPT GATTEVSRTEAISSSRTSIPGPAQSTMSSDTSMETITRISTPLTRKESTDMAITPKTGPS GATSQGTFTLDSSSTASWPGTHSATTQRFPRSWTTPMSRGPEDVSWPSPLSVEKNSPPS SLVSSSSVTSPSPLYSTPSGSSHSSPVPVTSLFTSIMMKATDMLDASIíEPETTSAPNMNI TSDESIiAASKATTETEAIHVFENTAASHVETTSATEELYSSSPGFSEPTKVISPWTSSS IRDNMVSTTMPGSSGITRIEIESMSSIiTPGLRETRTSQDXTSSTETSTVLYKMPSGATPE VSRTEVMPSSRTSIPGPAQSTMSLDISDEWTRLSTSPIMTESAEITITTQTGYSLATSQ VTLPLGTSMTFLSGTHSTMSQGIiSHSEMTNLMSRGPESIiSWTSPRFVETTRSSSSLTSLP LTTSLSPVSSTLLDSSPSSPLPVTSLILPGLVKTTEVIíDTSSEPKTSSSPNLSSTSVEIP ATSEIMTDTEKIHPSSNTAVAKVRTSSSVHESHSSVLADSETTITIPSMGITSAVEDTTV P TEN PA FS BTRRIP'TE PTFS LTPG FB STSTS F-E'iTTBI TETSAVL ra V PTSATTEVSMTEI tfSSH R T K IFD B D Q Sm B PD IIT E V IT K L SSSSM H S BSTQMTI TTQKS$PGATAQSIT.TIA TTTAPLARTH STVP PH FlíHSETlTTLM SaSPEHpaW KaSPPiníKTS SSSSL ÍiS líPV T T S P S V H E T L FQ S IPS SSFSV TSIiliTPG W '/iírTD TSTEPG TSIjS PlíLSGTSVBT UIA3BVTTOTB KXJÍP3SS MAVTKVGTTS5GHELYS SV S1H SE PSKATÍFV GTpSSM AETSl STSIí FANFET TGFEAE P FS ¡rlLTSGLRKmTS LD T5SV TPTN TFSS PlXSTHLLQESKTDFTSSAKTSS PDW PPASQYTK X PVBÍf 1 T P F N A SF SIT E ST G IT 3 FPESRFTMSVTESTHHLSTDL L PSA E T IS TGTVT'1 P Blí& eAjíTS pATTGVPRAI 3GSG5 ÍPE H T E aqP G D A T L S T IñE S I-P gS T F V P F E S S T FT T TD SST IFA LH E1 T5SSATPYRVDTSLGTES5TTE í j RLV>TV5TIi[JT£SQ PG R ~5£S PI (XDrRMTESVeLaTVTSAYQVFaLSTRLTCTDG.ÍFIEHITKIPMEAAHRGTIEPVKGFQT STGFAE PKBLHTÍjGTKEMEITTTñliTÍTPTTALKTrS ftATLTTSV¥TPTLGTLT?LHft£ MQ M A StlPTEJÍM lTTPYVFPl>VPETrSSLAT5LGAETSTALPRTTPEVFHHBEETTAELVSR SGABfíS P V I Í TLDVSSSE PUTXA&MVI H F ^ E T I P T V S U rrf tJF FHSELDTVSETATEIIG A DVSS A i PT IÍ13 P3 ELDALTPIiVTI SGTDTSTT F PTIXTKS PHETET RTI7WLTHF A E T S 5 T I F R T I p n p e h h b s u a í 'p s IA T S P G A E Ís s a i p i m t v s p g a e d l v t s í j v t s s g t d r n n t i p t LTLS Ft3 EPK TIA 5LV TH PEÍATE S A IP T S T IS PñV S RLVTSMVTSLAAF7TS TOÍRALTNS FGBFATTV'S IjVTHSñjQTS PT V P W rrS I FFhSKEDrTPSM TTSUGAFSSEAVPTPTVSTE V PG W T PL V T SSEA V I5T TIPTL T LSPG E PE T TPSH A TSH G E SA SSA I PTPTVS PG V FO W TSL.VTSE RAVTSTT IP 1 L T F EDGEFKTTP SKATSHGTEAGSAVPTVLiPE VPGMVTSIiVAS S RAV TSTTIiPTLTLS PGE PETTlPSHftTSKGAEAS&WPTVS PEV PGW TSLVTSSSGVNS T S IP T L IL S PGELETTP5MAT3HGAEA3SAVPT p r v s p g v s o w t p l v t s s r a v t s t t i p I L T I jSSSEPSTTFSM A T5HGVEASSAVLTVSPBVPGM VTFLVTSERAVTSTTIPTLTISS DEFETTTSLVTHSEAKMLBAIPTIiGVBFTVQGttVTSIiVTSSGSETSAÍ’StílrTVAfiSQFET I DSKVAErGTEAS SW PTLTV STG EP EFEISLV TH PA ESEETLPH TT5 RFSHSELDTMP3 TVTS PEAES B S A lS T T rS P G I PGVliTS LírTS SGRD rS A T F PTVPFS PHESEATASlíVTHP A V TSTTVPkTTPW YSHSEPDTTPSIATSPGASATSD FPTXTVS PDVPDMVtSOVTS SGTD T 31 T I PTUTI-350® PETTTá F lT Y S E T H T S S A I PTLPVBPDASEM LTELVJSSGTDSI'TT FPTL T ET F YEP ETTAIQIi 1H FAETTfmVPRTT PKFSH BÍCEUTTLPV'AI TSFGP EABSAVS T T T IE PDMEOLVySLVPS &GTDTSTTF PT LE E T P Y BPKTTATHLTU PAET ST T V aG T l PN ESHRG3DTAPSM VTSPGVDTRSGVPTTTIPPEIPGVUTSQVTSEATDTSTAJPTI,TPSPG E p tír tA S E A T H PGTQTG PTVPIRTVPS S'HPDTMAñWVTHPPQTSTPVSRTTSSFSESÍ PD ATFVM AT5PRTEAS5AVLTTI3PGAPEM VT3QITS 3GAATSTTVP7LTHS FGHPETTALL STH P B T E T S C r F PASTVR P 0V3 K T ?A £liT IK PQAETS TALFTQTTSS LFTL1VTOTSRVD L SPT A S PGV ñA K TA PLiTliPG TETSTK I PTSTLSLG LEH TTG LIA TSSSA ETSTSTLTLT VSPAVSGLSSASITTDKPQTVTSVOTBTS PSVTSVGPPEFSRTVTGT'TW TLI PSEM PTPP KTSEGIG V SPTlII.R TTM V EA Tm A TTG SSPTV A ETTTTffH TIA G SLFTPLTTPG K STIiA 3 ESVTSRTSYHHRSWISTTSSVHRRYVJTPATST P V T S T F S P G IS T S 5 IP S STAATVP FHV PF T L H F T I TÍTLQYEEDMRHPGSEKraATERELQGIjiLK.PEFRNSEJLEYLYEGCRlASL RPE KD S 3A T A v m r CTHRPDPEDEGLDRERLYHEL BNLTNSIQE LG p y t l d r h s l y v l k jf t h r 3 SM PrTSTPGTSTUDVGTSGTPS B S PE PTTAGPLÍiMP ('TLWFTlTNLGYBEDMftRTG SRK FHTWESVLÜGL1KPL PÍCBTSVGFLÍSGCiiliTLLR P EKÜGAATGUrtAI CTIÍRí DPKSFGLH REOLYWEL3 KLTNDI Eli L S PYTlEDfilíS I iW mGPt HQSS'V£fT fiT TC TSTV D U lT3& r P 35 LSEPFIM AAG PLLV P FT ! .y FTITULQYGEDMGHPG3 REPtTTTERVLQGLLG ? 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Figure imgf000057_0001
(SEQ ID NO:4)
(5) MPF (MPF, MSLN, SMR, factor potenciador de megacariocitos, mesotelina, n.° de registro GenBank NM_005823 Yamaguchi,N., et al. Biol. Chem. 269 (2), 805-808 (1994), Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 96 (20):11531 -11536 (1999), Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 93 (1 ):136-140 (1996), J. Biol. Chem. 270 (37):21984-21990 (1995)); documento WO2003101283 (Reivindicación 14); (documento WO2002102235 (Reivindicación 13; Página 287-288); documento WO2002101075 (Reivindicación 4; Página 308-309); documento WO200271928 (Página 320-321); documento WO9410312 (Página 52-57);
Referencias cruzadas: MIM:601051; NP_005814.2; NM_005823_1
622 aa
MALPTARPLLGSCGTPALGSLLFLLFSLGWVQPSRTLAGETGQEAAPLDGVLANPPNISS
LSPRQLLGFPCAEVSGLSTERVREIiAVALAQKNVKLSTEQLRCLAHRLSEPPEDLDALPL
DLLLFLNPDAFSGPQACTRFFSRITKANVDLLPRGAPERQRLLPAALACWGVRGSLLSEA
DVRALGGLACDLPGRFVAESAEVLLPRLVSCPGPLDQDQQEAARAALQGGGPPYGPPSTW
SVSTMDALRGLLPVLGQPIIRSIPQGIVAAWRQRSSRDPSWRQPERTILRPRPRREVEKT
ACPSGKKAREIDESLIFYKKWELEACVDAALIATQMDRVNA1PFTYEQLDVLKHKLDELY
PQGYPESVIQHLGYLFLKMSPEDIRKWNVTSLETLKALLEVNKGHEMSPQVATTiIDRFVK
GRGQLDKDTLDTLTAFYPGYLCSLSPEELSSVPPSSIWAVRPQDLDTCDPRQLDVLYPKA
RLAFQNMNGSEYFVKIQSFLGGAPTEDLKALSQQNVSMDLATFMKLRTDAVLPLTVAEVQ
KLLGPHVEGLKAEERHRPVRDWILRQRQDDLDTLGLGLQGGIPNGYLVLDLSMQEALSGT
PCLLGPGPVLTVLALLLASTLA
(SEQ ID NO:5)
(6) Napi3b (NAPI-3B, NPTIIb, SLC34A2, familia 34 del transportador de soluto (fosfato de sodio), miembro 2, transportador 3b de fosfato dependiente del sodio de tipo II, n.° de registro GenBank NM_006424, J. Biol. Chem. 277 (22):19665-19672 (2002), Genomics 62 (2):281-284 (1999), Feild, J.A., et al. (1999) Biochem. Biophys. Res. Commun. 258 (3):578-582); documento WO2004022778 (Reivindicación 2); documento EP1394274 (Ejemplo 11); documento WO2002102235 (Reivindicación 13; página 326); documento EP875569 (Reivindicación 1; Página 17­ 19); documento WO200157188 (Reivindicación 20; página 329); documento WO2004032842 (Ejemplo IV); documento WO200175177 (Reivindicación 24; Página 139-140);
Referencias cruzadas: MIM:604217; NP_006415.1; NM_006424_1
690 aa
MAPWPELGDAQPNPDKYLEGAAGQQPTAPDKSKETNKTDNTEAPVTKIELLPSYSTATLI
DEPTEVDDPWNLPTLQDSGIKWSERDTKGKILCFFQGIGRLILLLGFLYFFVCSLDILSS
AFQLVGGKMAGQFFSNSSIMSNPLLGLVIGVLVTVLVQSSSTSTSIWSMVSSSLLTVRA
AIPIIMGANIGTSITNTIVALMQVGDRSEFRRAFAGATVHDFFNWLSVLVLLPVEVATHY
LEIITQLIVESFHFKNGEDAPDLLKVITKPFTKLIVQLDKKVISQIAMNDEKAKNKSLVK
IWCKT FTNKTQINVTVPSTANCTS PSLCWTDGIQNWTMKNVTYKEWIAKCQHIFVNFHLP
DLAVGTILLILSLLVLCGCLIMIVKILGSVLKGQVATVIKKTINTDFPFPFAWLTGYLAI
LVGAGMTFIVQSSS V FTSA LTPLIG IG V I T I E RAYPLTLGSNIGTTTTAI IiAALASPGNA
LRSSLQIALCHFFFNISGILLW YPIPFTRLPIRM AKGLGNISAKYRW FAVFYLIIFFFLI
PLTVFGLSLAGWRVLVGVGVPWFIIILVLCLRLLQSRCPRVLPKKLQNWNFLPLWMRSL
KPWDAWSKFTGCFQMRCCYCCRVCCRACCLLCGCPKCCRCSKCCEDLEEAQEGQDVPVK
APETFDNITISREAQGEVPASDSKTECTAL
(SEQ ID NO:6)
(7) Sema 5b (FLJ10372, KIAA1445, Mm.42015, SEMA5B, SEMAG, Semaforina 5b Hlog, dominio sema, siete repeticiones de tromboespondina (tipo 1 y análogo al tipo 1), dominio transmembrana (TM) y dominio citoplásmico corto, (semaforina) 5B, n.° de registro GenBank AB040878,
Nagase T., et al. (2000) DNA Res. 7 (2): 143-150); documento WO2004000997 (Reivindicación 1); documento WO2003003984 (Reivindicación 1); documento WO200206339 (Reivindicación 1; página 50); documento WO200188133 (Reivindicación 1; Página 41-43, 48-58); documento WO2003054152 (Reivindicación 20); documento WO2003101400 (Reivindicación 11); Registro: Q9P283; EMBL; ABO40878; BAA95969.1. Genew; HGNC: 10737; 1093 aa
MVLAGPLAVSLLLPSLTLLVSHLSSSQDVSSEPSSEQQLCAIiSKHPTVAFEDLQPWVSNF
TYPGARDFSQLALDP SGNQLIVGARNYLPRL SLANV SLLQATEWAS SEDTRRSCQSKGKT
EEECQNYVRVLIVAGRKVFMCGTNAFSPMCTSRQVGNLSRTTEKINGVARCPYDPRHNST
AVISSQGELYAATVIDFSGRDPAIYRSLGSGPPLRTAQYNSKWLNEPNFVAAYDIGLFAY
FFXiRENAVEHDCGRTVYSRVARVCKNDVGGRFIíLEDTWTTFMKARIiNCSRPGEVPFYYWE
LQSAFHLPEQDLIYGVFTTNVNSIAASAVCAFNLSAISQAFNGPFRYQENPRAAWLPIAN
PIPNFQCGTLPETGPNENIíTERSIíQDAQRLFLMSEAVQPVTPEPCVTQDSVRFSHLWDL
VQAKDTLYHVLYIGTESGTILKALSTASRSLHGCYLEELHVLPPGRREPLRSLRILHSAR
ALFVGLRDGVLRVPLERCAAYRSQGACLGARDPYCGWDGKQQRCSTLEDSSNMSLWTQNI
TACPVRNVTRDGGFGPWSPWQPCEHLDGDNSGSCLCRARSCDSPRPRCGGLDCLGPAIHI
ANCSRNGAWTPWSSWALCSTSCGIGFQVRQRSCSNPAPRHGGRICVGKSREERFCNENTP
CPVPIFWASWGSWSKCSSNCGGGMQSRRRACENGNSCLGCGVEFKTCNPEGCPEVRRNTP
WTPWLPVNVTQGGARQEQRFRFTCRAPLADPHGLQFGRRRTETRTCPAjDGSGSCDTDALV
EDLLRSGSTSPHTVSGGWAAWGPWSSCSRDCELGFRVRKRTCTNPEPRNGGI.PCVGDAAE
YQDCNPQACPVRGAWSCWTSWSPCSASCGGGHYQRTRSCTSPAPSPGEDICLGLHTEEAL
CATQACPEGWSPWSEWSKCTDDGAQSRSRHCEELLPGSSACAGNSSQSRPCPYSEIPVIL
PAS S MEE ATGCAG FNLIHLVATGI SC FLG S GLLTLAVYL SCQHCQRQSQESTLVHPAT PN
HLHYKGGGTPKNEKYTPMEFKTLNKNNLIPDDRANFYPLQQTNVYTTTYYPSPLNKHSFR
PEASPGQRCFPNS
(SEQ ID NO:7)
(8) PSCA hlg (2700050C12Rik, C530008O16Rik, RIKEN ADNc 2100050C12, RIKEN ADNc 2700050C12 gen, n.° de registro GenBank AY358628);
documento US2003129192 (Reivindicación 2); documento US2004044180 (Reivindicación 12); documento US2004044179 (Reivindicación 11); documento US2003096961 (Reivindicación 11); documento US2003232056 (Ejemplo 5); documento WO2003105758 (Reivindicación 12); documento US2003206918 (Ejemplo 5); documento e P1347046 (Reivindicación 1); documento WO2003025148 (Reivindicación 20); Referencias cruzadas: GI:37182378; AAQ88991.1; AY358628_1
141 aa
mwvlgiaatfcglfllpgfalqiqcyqceefqlnndcsspefivnctvwvqdmcqkevme
QSAGIMYRKSCASSAACLIASAGYQSFCSPGKIíNSVCISCCNTPLCNGPRPKKRGSSASA
IiRPGLRTTILFLKLALFSAHC
(SEQ ID NO:8)
(9) ETBR (Receptores de tipo B de la endotelina, n.° de registro GenBank AY275463);
Nakamuta M., et al. Biochem. Biophys. Res. Commun. 177, 34-39, 1991; Ogawa Y., et al. Biochem. Biophys. Res. Commun. 178, 248-255, 1991; Arai H., et al. Jpn. Circ. J. 56, 1303-1307, 1992; Arai H., et al. J. Biol. Chem. 268, 3463-3470, 1993; Sakamoto A., Yanagisawa M., et al. Biochem. Biophys. Res. Commun. 178, 656-663, 1991; Elshourbagy N. A., et al. J. Biol. Chem. 268, 3873-3879, 1993; Haendler B., et al. J. Cardiovasc. Pharmacol. 20, s1-S4, 1992; Tsutsumi M., et al. Gene 228, 43-49, 1999; Strausberg R.L., et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 99, 16899­ 16903, 2002; Bourgeois C., et al. J. Clin. Endocrinol. Metab. 82, 3116-3123, 1997; Okamoto Y., et al. Biol. Chem.
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442 aa
MQPPPSLCGRALVALVIiACGLSRIWGEERGFPPDRATPIiLQTAEIMTPPTKTLWPKGSNA
SLARSLAPAEVPKGDRTAGSPPRTISPPPCQGPIEIKETFKYINTWSCLVFVLGIIGNS
TLLRIIYKNKCMRNGPNILIASLALGDLLHIVIDIPINVYKLLAEDWPFGAEMCKLVPFI
QKASVGITVLSLCALSIDRYRAVASWSRIKGIGVPKWTAVEIVLIWWSWLAVPEAIGF
DIITMDYKGSYLRICLLHPVQKTAFMQFYKTAKDWWLFSFYFCLPLAITAFFYTLMTCEM
LRKKSGMQIALNDHLKQRREVAKTVFCLVLVFALCWLPLHLSRILKLTLYNQNDPNRCEL
LSFLLVLDYIGINMASLNSCINPIALYDVSKRFKNCFKSCLCCWCQSFEEKQSLEEKQSC
LKFKANDHGYDNFRSSNKYSSS
(SEQ ID NO:9)
(10) MSG783 (RNF124, proteína teórica FLJ20315, n.° de registro GenBank NM_017763);
documento WO2003104275 (Reivindicación 1); documento WO2004046342 (Ejemplo 2); documento WO2003042661 (Reivindicación 12); documento WO2003083074 (Reivindicación Página 61); documento WO2003018621 (Reivindicación 1); documento WO2003024392 (Reivindicación 2; Fig 93); documento WO200166689 (Ejemplo 6); Referencias cruzadas: LocusID:54894; NP_060233.2; NM_017763_1
783 aa
MSGGHQLQLAALWPWLLHATLQAGFGRTGLVLAAAVESERSAEQKAXIRVIPLKMDPTGK
UJLTLEGVFAGVAEITPAEGKLMQSHPLYLCNASDDDNLEPGFISIVKLESPRRAPRPCL
SLASKARMAGERGASAVLFDXTEDRAAAEQLQQPLGLTWPWLIWGNDAEKLMERVYKKQ
KAHVRIELKEPPAWPDYDVWILMTWGTIFVIIIASVLRIRCRPRHSRPDPLQQRTAWAI
SQLATRRYQASCRQARGEWPDSGSSCSSAPVCAICI.EEFSEGQELRVISCLHEFHRNCVD
PWLHQHRTCPLCVFNITEGDSFSQSLGPSRSYQEPGRRLHLIRQHPGHAHYHLPAAYLLG
PSRSAVARPPRPGPFLPSQEPGMGPRHHRFPRAAHPRAPGEQQRLAGAQHPYAQGWGMSH
LQSTSQHPAACPVPIiRRARPPDSSGSGESYCTERSGYLADGPASDSSSGPCHGSSSDSW
NCTDISLQGVHGSSSTFCSSLSSDPDPLVYCSPKGDPQRVDMQPSVTSRPRSLDSWPTG
ETQVSSHVHYHRHRHHHYKKRFQWHGRKPGPETGVPQSRPPIPRTQPQPEPPSPDQQVTG
SNSAAPSGRLSNPQCPRAI.PEPAPGPVDASSICPSTSSLFNLQKSSLSARHPQRKRRGGP
SEPTPGSRPQDATVHPACQIFPHYTPSVAYPWSPEAHPLICGPPGLDKRLLPETPGPCYS
NSQPVWLCLTPRQPLEPHPPGEGPSEWSSDTAEGRPCPYPHCQVLSAQPGSEEELEEXiCE QAV
(SEQ ID NO:10)
(11) STEAP2 (HGNC_8639, IPCA-1, PCANAP1, STAMP1, STEAP2, STMP, gen 1 asociado al cáncer de próstata, proteína 1 asociada al cáncer de próstata, antígeno epitelial seis transmembrana de la próstata 2, proteína seis transmembrana de la próstata, n.° de registro GenBank AF455138,
Lab. Invest. 82 (11 ):1573-1582 (2002)); WO2003087306; documento US2003064397 (Reivindicación 1; Fig 1); documento WO200272596 (Reivindicación 13; Página 54-55); documento WO200172962 (Reivindicación 1; Fig. 4B); documento WO2003104270 (Reivindicación 11); documento WO2003104270 (Reivindicación 16); documento US2004005598 (Reivindicación 22); documento WO2003042661 (Reivindicación 12); documento US2003060612 (Reivindicación 12; Fig 10); documento WO200226822 (Reivindicación 23; Fig 2); documento WO200216429 (Reivindicación 12; Fig 10);
Referencias cruzadas: GI:22655488; AAN04080.1; AF455138_1
490 aa
MESISMMGSPKSLSETVLPNGINGIKDARKVTVGVIGSGDFAKSLTIRLIRCGYHWIGS
RNPKFASEFFPHWDVTHHEDALTKTNIIFVAIHREHYTSLWDLRHLLVGKILIDVSNNM
RINQYPESNAEYLASLFPDSLIVKGFNWSAWALQLGPKDASRQVYICSNNIQARQQVIE
LARQLNFIPIDLGSLSSAREIENLPLRLFTLWRGPVWAISLATFFFLYSFVRDVIHPYA
RNQQSDFYKIPIEIVNKTLPIVAITLLSLVYLAGLLAAAYQLYYGTKYRRFPPWLETWLQ
CRKQLGLLSFFFAMVHVAYSLCLPMRRSERYLFLNMAYQQVHANIENSWNEEEVWRIEMY
ISFGIMSLGLLSLLAVTSIPSVSNALNWREFSFIQSTLGYVALLISTFHVLIYGWKRAFE
EEYYRFYTPPNFVLALVLPSIVILGKIILFLPCISQKLKRIKKGWEKSQFLEEGIGGTIP
HVSPERVTVM
(SEQ ID NO:11)
(12) TrpM4 (BR22450, FLJ20041, TRPM4, TRPM4B, receptor potencial transitorio del canal de cationes, subfamilia M, miembro 4, n.° de registro GenBank NM_017636
Xu,X.Z., et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 98 (19):10692-10697 (2001), Cell 109 (3):397-407 (2002), J. Biol. Chem.
278 (33):30813-30820 (2003)); documento US2003143557 (Reivindicación 4); documento WO200040614 (Reivindicación 14; Página 100-103); documento WO200210382 (Reivindicación 1; Fig 9A); documento WO2003042661 (Reivindicación 12); documento WO200230268 (Reivindicación 27; página 391); documento US2003219806 (Reivindicación 4); documento WO200162794 (Reivindicación 14; Fig 1A-D);
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1214 aa
MWPEKEQSWIPKIFKKKTCTTFIVDSTDPGGTLCQCGRPRTAHPAVAMEDAFGAAWTV
WDSDAHTTEKPTDAYGELDFTGAGRKHSNFLRLSDRTDPAAVYSLVTRTWGFRAPNLWS
vlg g sg g pvlq tw lq dllrrg lvraaq stg aw ivtg g lh tg ig rh vg vavrdh q m astg g
TKWAMGVAPWGWRNRDTLINPKGSFPARYRWRGDPEDGVQFPLDYNYSAFFLVDDGTH
GCLiGGENRFRLRLESYISQQKTGVGGTGIDIPVLLLLIDGDEKMLTRIENATQAQLPCLL
VAGSGGAADCLAETLEDTLAPGSGGARQGEARDRIRRFFPKGDLEVLQAQVERIMTRKEL
LTVYSSEDGSEEFETIVLKALVKACGSSEASAYLDELRLAVAWNRVDIAQSELFRGDIQW
RSFHLEASLMDALLNDRPEFVRLLISHGLSIiGHFLTPMRLAOLYSAAPSNSLIRNLLDQA
SHSAGTKAPALKGGAAELRPPDVGHVLRMLLGKMCAPRYPSGGAWDPHPGQGFGESMYLL
SDKATSPLSLDAGLGQAPWSDLLLWAI*LLNRAQMAMYFWEMGSNAVSSALGACLLIiRVMA
RLEPDAEEAARRKDLAFKFEGMGVDLFGECYRSSEVRAARLLLRRCPLWGDATCLQLAMQ
ADARAFFAQDGVQSLLTQKWWGDMASTTPIWALVLAFFCPPL>IYTELITFRKSEEEPTRE
ELEFDMDSVINGEGPVGTADPAEKTPLGVPRQSGRPGCCGGRCGGRRCLRRWFHFWGAPV
TIFMGNWSYLLFLLLFSRVLLVDFQPAPPGSLELLLYFWAFTLLCEELRQGLSGGGGSL
ASGGPGPGHASLSQRLRLYLADSWNQCDLVALTCFLLGVGCRLTPGLYHLGRTVLCIDFM
VFTVRLLHIFTVNKQLGPKIVIVSKHMKDVFFFLFFLGVWLVAYGVATEGLLRPRDSDFP
SILRRVFYRPYLQIFGQIPQEDMDVALMEHSNCSSEPGFWAHPPGAQAGTCVSQYANWLV
VLLLVIFLLVANILLVNELIAMFSYTFGKVQGNSDLYWKAQRYRLIREFHSRPALAPPFI
VISHLRL.LLRQLCRRPRSPQPSSPALEHFRVYLSKEAERKLLTWESVHKENFLLARARDK
RESDSERLKRTSQKVDLALKQLGHIREYEQRLKVLEREVQQCSRVLGWVAEALSRSALLP
PGGPPPPDLPGSKD
(SEQ ID NO:12)
(13) CRIPTO (CR, CR1, CRGF, CRIPTO, TDGF1, factor de crecimiento derivado de teratocarcinoma, n.° de registro GenBank NP_003203 o NM_003212,
Ciccodicola,A., et al. EMBO J. 8 (7):1987-1991 (1989), Am. J. Hum. Genet. 49 (3):555-565 (1991)); documento US2003224411 (Reivindicación 1); documento WO2003083041 (Ejemplo 1); documento WO2003034984 (Reivindicación 12); documento WO200288170 (Reivindicación 2; Página 52-53) documento WO2003024392 (Reivindicación 2; Fig 58); documento WO200216413 (Reivindicación 1; Página 94-95, 105); documento WO200222808 (Reivindicación 2; Fig 1) documento US5854399 (Ejemplo 2; Col 17-18); documento US5792616 (Fig 2);
Referencias cruzadas: MIM: 187395; NP_003203.1; NM_003212_1
188 aa
MDCRKMARFSYSVIWIMAISKVFELGLVAGLGHQEFARPSRGYLAFRDDSIWPQEEPAIR
PRSSQRVPPMGIQHSKELNRTCCLNGGTCMLGSFCACPPSFYGRNCEHDVRKENCGSVPH
DTWLPKKCSLCKCWHGQLRCFPQAFLPGCDGLVMDEHLVASRTPELPPSARTTTFMLVGI
CLSIQSYY
(SEQ ID NO:13)
(14) CD21 (CR2 (Receptor del complemento 2) o C3DR (C3d/receptor del virus de Epstein Barr) o Hs.73792 n.° de registro GenBank M26004,
Fujisaku et al. (1989) J. Biol. Chem. 264 (4):2118-2125); Weis J.J., et al. J.Exp. Med. 167, 1047-1066, 1988; Moore M., et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 84, 9194-9198, 1987; Barel M., et al. Mol. Immunol. 35, 1025-1031, 1998; Weis J.J., et al Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 83, 5639-5643, 1986; Sinha S. K., et al. (1993) J. Immunol. 150, 5311-5320; documento WO2004045520 (Ejemplo 4); documento US2004005538 (Ejemplo 1); documento WO2003062401 (Reivindicación 9); documento WO2004045520 (Ejemplo 4); documento WO9102536 (Fig 9.1-9.9); documento WO2004020595 (Reivindicación 1); Registro: P20023; Q13866; Q14212; EMBL; M26004; AAA35786.1.
1033 aa
MGAAGLLGVFLALVAPGVLGISCGSPPPILNGRISYYSTPIAVGTVIRYSCSGTFRLIGE
KSLLCXTKDKVDGTWDKPAPKCEYFNKYSSCPEPIVPGGYKIRGSTPYRHGDSVTFACKT
NFSMNGNKSWCQANNMWGPTRLPTCVSVFPLECPALPMIHNGHHTSENVGSIAPGLSVT
YSCESGYIiLVGEKIINCLSSGKWSAVPPTCEEARCKSLGRFPNGKVKEPPILRVGVTANF
FCDEGYRLQGPPSSRCVIAGQGVAWTKMPVCEEIFCPSPPPILNGRHIGNSLANVSYGSI
VTYTCDPDPEEGVNFILIGESTLRCTVDSQKTGTWSGPAPRCELSTSAVQCPHPQILRGR
MVSGQKDRYTYNDTVIFACMFGFTLKGSKQIRCNAQGTWEPSAPVCEKECQAPPNILNGQ
KEDRHMVRFDPGTSIKYSCNPGYVLVGEESIQCTSEGVWTPPVPQCJCVAACEATGRQLLT
KPQHQFVRPDVNSSCGEGYKLSGSVYQECQGTIPWFMEIRLCKEITCPPPPVIYNGAHTG
SSLEDFPYGTTVTYTCNPGPERGVEFSLIGESTIRCTSNDQERGTWSGPAPLCKLSLLAV
QCSHVHIANGYKISGKEAPYFYNDTVTFKCYSGFTLKGSSQIRCKADNTWDPEIPVCEKE
TCQHVRQSLQELPAGSRVELVNTSCQDGYQLTGHAYQMCQDAENGIWFKKIPLCKVIHCH
PPPVIVNGKHTGMMAENFLYGNEVSYECDQGFYLLGEKKLQCRSDSKGHGSWSGPSPQCL
RSPPVTRCPNPEVKHGYKLNKTHSAYSHNDIVYVDCMPGFIMNGSRVIRCHTDNTWVPGV
PTCIKKAPIGCPPPPKTPNGNHTGGNIARFSPGMSILYSCDQGYLLVGEALLLCTHEGTW
SQPAPHCKEVNCSSPADMDGIQKGLEPRKMYQYGAWTLECEDGYMLEGSPQSQCQSDHQ
WNPPLAVCRSRSLAPVLCGIAAGLILLTFLIVITLYVISKHRERNYYTDTSQKEAFHLEA
REVY S VDPYNPAS
(SEQ ID NO:14)
(15) CD79b (CD79B, CD79p, IGb (inmunoglobulina beta-asociada), B29, n.° de registro GenBank NM_000626 o 11038674, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. (2003) 100 (7):4126-4131, Blood (2002) 100 (9):3068-3076, Muller et al. (1992) Eur. J. Immunol. 22 (6):1621-1625); documento WO2004016225 (reivindicación 2, Fig 140); WO2003087768, documento US2004101874 (reivindicación 1, página 102); documento WO2003062401 (reivindicación 9); documento WO200278524 (Ejemplo 2); documento US2002150573 (reivindicación 5, página 15); US5644033; documento WO2003048202 (reivindicación 1, páginas 306 y 309); documento WO 99/558658, documento US6534482 (reivindicación 13, Fig 17A/B); documento WO200055351 (reivindicación 11, páginas 1145-1146);
Referencias cruzadas: MIM: 147245; NP_000617.1; NM_000626_1
229 aa
MARLALSPVPSHWMVALLLLLSAEPVPAARSBDRYRNPKGSACSRIWQSPRFIARKRGFT
VKMHCYMNSASGNVSWLWKQEMDENPQQI.KLEKGRMEESQNESLATLTIQGIRFEDNGIY
FCQQKCNNTSEVYQGCGTELRVMGFSTLAQXiKQRNTLKDGI IMIQTLLIILFIIVPI FL.L LDKDDSKAGMEEDHTYEGIjDIDQTATYEDIVTLRTGEVKWSVGEHPGQE
(SEQ ID NO:15)
(16) FcRH2 (IFGP4, IRTA4, SPAP1A (dominio SH2 que contiene la proteína de anclaje a fosfatasa 1a), SPAP1B, SPAP1C, n.° de registro GenBank NM_030764,
Genome Res. 13 (10):2265-2270 (2003), Immunogenetics 54 (2):87-95 (2002), Blood 99 (8):2662-2669 (2002), Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 98 (17):9772-9777 (2001), Xu,M.J., et al. (2001) Biochem. Biophys. Res. Commun. 280 (3):768-775; documento WO2004016225 (Reivindicación 2); WO2003077836; documento WO200138490 (Reivindicación 5; Fig 18D-1-18D-2); documento WO2003097803 (Reivindicación 12); documento WO2003089624 (Reivindicación 25);
Referencias cruzadas: MIM:606509; NP_110391.2; NM_030764_1
508 aa
m llw sllvifdavteqadsltlvapssvfegdsivlkcqgeqnw kiqkm ayhkdnkelsv FKKFSDFLIQSAVLSDSGNYFCSTKGQIjFLWDKTSNIVKIKVQELFQRPVXiTASSFQPIE
GGPVSLKCETRLSPQRLDVQLQFCFFRENQVLGSGWSSSPELQISAVWSEDTGSYWCKAE
TVTHRIRKQSLQSQIHVQRIPISNVSLEIRAPGGQVTEGQKLILIiCSVAGGTGNVTFSWY REATGTSMGKKTQRSIiSAELEIPAVKESDAGKYYCRADNGHVPIQSKWNIPVRIPVSRP
VX.TLRSPGAQAAVGDLLELHCEALRGSPPILYQFYHEDVTLGNSSAPSGGGASFNLSLTA
EHSGNYSCEANNGLGAQCSEAVPVSISGPDGYRRDLMTAGVLWGLFGVLGFTGVALLLYA
LFHKISGESSATNEPRGASRPNPQEFTYSSPTPDMEELQPVYVNVGSVDVDWYSQVWSM
QQPESSANIRTLLENXDSQVIYSSVKKS
(SEQ ID NO:16)
(17) HER2 (ErbB2, n.° de registro GenBank M11730, Coussens L., et al. Science (1985) 230(4730):1132-1139); Yamamoto T., et al. Nature 319, 230-234, 1986; Semba K., et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 82, 6497-6501, 1985; Swiercz J. M., et al. J. Cell Biol. 165, 869-880, 2004; Kuhns J. J., et al. J. Biol. Chem. 274, 36422-36427, 1999; Cho H.-S., et al. Nature 421,756-760, 2003; Ehsani A., et al. (1993) Genomics 15, 426-429; documento WO2004048938 (Ejemplo 2); documento WO2004027049 (Fig 1I); WO2004009622; WO2003081210; documento WO2003089904 (Reivindicación 9); documento WO2003016475 (Reivindicación 1); US2003118592; documento WO2003008537 (Reivindicación 1); documento WO2003055439 (Reivindicación 29; Fig 1A-B); documento WO2003025228 (Reivindicación 37; Fig 5C); documento WO200222636 (Ejemplo 13; Página 95-107); documento WO200212341 (Reivindicación 68; Fig 7); documento WO200213847 (Página 71-74); documento WO200214503 (Página 114-117); documento WO200153463 (Reivindicación 2; Página 41-46); documento WO200141787 (Página 15); documento WO200044899 (Reivindicación 52; Fig 7); documento WO200020579 (Reivindicación 3; Fig 2); documento US5869445 (Reivindicación 3; Col 31-38); documento WO9630514 (Reivindicación 2; Página 56-61); documento EP1439393 (Reivindicación 7); documento WO2004043361 (Reivindicación 7); WO2004022709; documento WO200100244 (Ejemplo 3; Fig 4); Registro: P04626; EMBL; M11767; AAA35808.1. EMBL; M11761;
AAA35808.1.
1255 aa
MELAALCRWGLLLALLPPGAASTQVCTGTDMKLRLPASPETHLDMLRHLYQGCQWQGNL
EIiTYL PTNASLSFLQDIQEVQG YVLIAHNQVRQVPLQRLRIVRGTQLFEDNYALAVLDNG
DPLNNTTPVTGAS PGGLRELQLRSLTEILKGGVLIQRNPQLCYQDTZ LWKDIFHKNNQLA
LTLIDTNRSRACHPCSPMCKGSRCWGESSEDCQSLTRTVCAGGCARCKGPLPTDCCHEQC
AAGCTGPKHSDCLACLHFNHSGICELHCPALVTYNTOTFESMPNPEGRYTFGASCVTACP
YNYIíSTDVGSCTLVCPLHNQBVTAEDGTQRCEKCSKPCARVCYGLGMEHLREVRAVTSAN
IQEFAGCKKIFGS1AFLPESFDGDPASNTAPLQPEQLQVFETLEEITGYLYISAWPDSLP
DIjSVFQNLQ VIRGRX LHNGAYSLTLQGLGISWLGLRSLRELGSGIiALI HHNTHLCFVHTV PWDQLFRNPHQALLHTANRPEDECVGEGLACHQIjCARGHCWGPGPTQCVNCSQFLRGQEC veecrvlqglpreyvnarhclpchpecqpqngsvtcfgpeadqcvacahykdppfcvarc psg v k pd l sy m piw k fpd e e g a c q pc pin c t h sc v d l d d k g c pa e q r a spl t siisa w g
II.LWVLGWFGILIKRRQQKIRKYTMRRLI.QETEIíVEPGTPSGAMPNQAGMRILKETEL
RKVKVLGSGAFGTVYKGIWIPDGENVKIPVAIKVLRENTSPKANKEILDEAYVMAGVGSP
YVSRLLGICLTSTVQLVTQLMPYGCLLDHVREMRGRLGSQDLLNWCMQIAKGMSYLEDVR
LVHRDLAARNVLVKS PNHVKITDFGLARLLDIDETEYHADGGKVPIKWMAL2SILRRR FT
HQSDVWSYGVTVWELMTFGAKPYDGIPAREIPDLLEKGERI.PQPPICTIDVYMIMVKCWM
IDSECRPRFRELVSEFSRMARJDPQRFWIQNEDI.GPASPLDSTFYRSLLEDDDMGDLVDA
EEYLVPQQGFFCPDPAPGAGGMVHHRHRSSSTRSGGGDLTLGIjEPSEEEAPRSPIiAPSEG
AGSDVPDGDLGMGAAKGLQSLPTHDPSPI.QRYSEDPTVPLPSETDGYVAPLTCSPQPEYV
NQPDVRPQPPSPREGPLPAARPAGATLERPKTLSPGKNGWKDVFAFGGAVENPEYLTPQ
GGAAPQPHPPPAFSPAFDNLYYV7DQDPPERGAPPSTFKGTPTAEKPEYLGLDVPV
(SEQ ID NO:17)
(18) NCA (CEACAM6, n.° de registro GenBank M18728);
Barnett T., et al Genomics 3, 59-66, 1988; Tawaragi Y., et al. Biochem. Biophys. Res. Commun. 150, 89-96, 1988; Strausberg R.L., et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 99:16899-16903,2002; WO2004063709; documento EP1439393 (Reivindicación 7); documento WO2004044178 (Ejemplo 4); WO2004031238; documento WO2003042661 (Reivindicación 12); documento WO200278524 (Ejemplo 2); documento WO200286443 (Reivindicación 27; página 427); documento WO200260317 (Reivindicación 2); Registro: P40199; Q14920; EMBL; M29541; AAA59915.1. EMBL; M18728;
344 aa
MGPPSAPPCRLHVPWKEVLLTASLLTFWNPPTTAKLTIESTPPNVAEGKEVLLLAHNLPQ
NRIGYSWYKGERVDGNSLIVGYVIGTQQATPGPAYSGRETIYPNASLLIQNVTQNDTGPY
tlqviksdlvneeatgqfhvypelpkpsissnnsnpvedkdavaftcepevqnttylwva;
NGQSLPVSPRLQLSNGNMTLTLLSVKRNDAGSYECEIQMPASANRSDPVTLNVLYGPDVP
TISPSKANYRPGENLNLSCHAASHPPAOYSWFINGTFQQSTQELFIPNITVNNSGSYMCQ
AHNSATGLNRTTVTMITVSGSAPVLSAVATVGITIGVLARVALI
(SEQ ID NO:1B)
(19) MDP (DPEP1, n.° de registro GenBank BC01 7023,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 99 (26):16899-16903 (2002)); documento WO2003016475 (Reivindicación 1); documento WO200264798 (Reivindicación 33; Página 85-87); documento JP05003790 (Fig 6-8); documento WO9946284 (Fig 9);
Referencias cruzadas: MIM: 179780; AAH17023.1; BC017023_1
411 aa
MWSGVíWLWPLVAVCTADFFRDEAERIMRDSPVIDGHNDIiPWQLLDMFNNRLQDERANLTT
LAGTHTNIPKLRAGFVGGQFWSVYTPCDTQNKDAVRRTLEQMDVVHRMCRMYPETFLYVT
SSAGIRQAFREGKVASLIGVEGGHSIDSSLGVLRALYQLGMRYLTLTHSCNTPWADNWDV
DTGDSEPQSQGLSPFGQRVVKELNRLGVLIDLAHVSVATMKATLQLSRAPVIFSHSSAYS
VCASRRNVPDDVLRLVKQTDSLVMVMFYNNYISCTNKANLSQVADHLDHIKEVAGARAVG
FGGDFDGVPRVPEGLEDVSKYPDLIAELLRKNWTEAEVKGALADNLLRVFEAVEQASNLT
QAPEEEPIPLDQLGGSCRTHYGYSSGASSLHRHWGLLLASLAPLVLCLSLL
(SEQ ID NO:19)
(20) IL20Ra (IL20Ra, ZCYTOR7, n.° de registro GenBank AF184971); Clark H. F., et al. Genome Res. 13, 2265­ 2270, 2003; Mungall A. J., et al. Nature 425, 805-811,2003; Blumberg H., et al. Cell 104, 9-19, 2001; Dumoutier L., et al. J. Immunol. 167, 3545-3549, 2001; Parrish-Novak J., et al. J. Biol. Chem. 277, 47517-47523, 2002; Pletnev S., et al. (2003) Biochemistry 42:12617-12624; Sheikh F., et al. (2004) J. Immunol. 172, 2006-2010; documento EP1394274 (Ejemplo 11); documento US2004005320 (Ejemplo 5); documento WO2003029262 (Página 74-75); documento WO2003002717 (Reivindicación 2; página 63); documento WO200222153 (Página 45-47); documento US2002042366 (Página 20-21); documento WO200146261 (Página 57-59); documento WO200146232 (Página 63­ 65); documento WO9837193 (Reivindicación 1; Página 55-59); Registro: Q9UHF4; Q6UWA9; Q96SH8; EMBL; AF184971;
AAF01320.1.553 aa
MRAPGRPALRPLPLPPLLLLLLAAPWGRAVPCVSGGLPKPANITFLSINMKNVLQWTPPE
GLQGVKVTYTVQYB’IYGQKKWLWKSECRNINRTYCDLSAETSDYEHQYYAKVKAIWGTKC
SKWAESGRFYPFLETQIGPPEVAIjTTDEKSISWLTAPEKWKRNPEDLPVSMQQIYSNLK
YNVSVLNTKSNRTWSQCVTMHTLVLTWLEPNTLYCVHVESFVPGPPRRAQPSEKQCARTL
k d q sse f k a k iif w y v l p isit v f l f sv m g y siy r y ih v g k e k h p a n l il iy g n e f d k r f
FVPAEKIVINFITIíNISDDSKISHQDMSLLGKSSDVSSLNDPQPSGNLRPPQEEEEVKHL
g y a sh l m e if c d se e n t e g t sf t q q e sl sr t ip p d k t v ie y e y d v r t t d ic a g p e e q e l s lq eev stq g tllesq a ala vlg pq tlq y sy tpq lq d ld pla q eh td seeg peeepsttlv d w d pq tg r lc ipslssfd q d seg c epseg d g lg eeg llsr ly eepapd r ppg en etylm q fmeewglyvqmen
(SEQ ID NO:20)
(21) Brevican (BCAN, BEHAB, n.° de registro GenBank AF229053) Gary S.C., et al. Gene 256, 139-147, 2000; Clark H. F., et al. Genome Res. 13, 2265-2270,2003; Strausberg R.L., et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 99, 16899-16903, 2002; documento US2003186372 (Reivindicación 11); documento US2003186373 (Reivindicación 11); documento US2003119131 (Reivindicación 1; Fig 52); documento US2003119122 (Reivindicación 1; Fig 52); documento US2003119126 (Reivindicación 1); documento US2003119121 (Reivindicación 1; Fig 52); documento US2003119129 (Reivindicación 1); documento US2003119130 (Reivindicación 1); documento US2003119128 (Reivindicación 1; Fig 52); documento US2003119125 (Reivindicación 1); documento WO2003016475 (Reivindicación 1); documento WO200202634 (Reivindicación 1);
911 aa
^QLFLPLLAALVLAQAPAALADVLEGDSSEDRAFRVRIAGDAPLQGVLGGALTIPCHVH
YLRPPPSRRAVLGSPRVKWTFLSRGREAEVLVARGVRVKVNEAYRFRVALPAYPASLTDV
s l a l s e l r p n d sg iy r c e v q h g id d s sd a v e v k v k g w f l y r e g sa r y a f s f sg a q e a c a
RIGAHIATPEQLYAAYLGGYEQCDAGWLSDQTVRYPIQTPREACYGDMDGFPGVRNYGW
DPDDLYDVYCYAEDLNGELFLGDPPEKLTLEEARAYCQERGAEIATTGQLYAAWDGGLDH
c spg w l a d g sv r y piv t psq r c g g g l pg v k t l pl fpn q t g fpn k h sr fn v y c fr d sa q ps
AIPEASNPASNPASDGLEAIVTVTETLEELQLPQEATESESRGAIYSIPIMEDGGGGSST
PEDPAEAPRTLLEFETQSMVPPTGFSEEEGKALEEEEKYEDEEEKEEEEEEEEVEDEALW
AWPSELSSPGPEASLPTEPAAQEKSLSQAPARAVLQPGASPLPDGESEASRPPRVHGPPT
ETLPTPRERNLASPSPSTLVEAREVGEATGGPELSGVPRGESEETGSSEGAPSLLPATRA
PEGTRELEAPSEDNSGRTAPAGTSVQAQPVLPTDSASRGGVAWPASGDCVPSPCHNGGT
CLEEEEGVRCLCLPGYGGDLCDVGLRFCNPGWDAFQGACYKHFSTRRSWEEAETQCRMYG
AHLASISTPEEQDFINNRYREYQWIGLNDRTIEGDFLWSDGVPIiLYENWNPGQPDSYFLS
GENCWMWíHDQGQWSDVPCNYHLSYTCKMGLVSCGPPPELPLAQVFGRPRLRYEVDTVL
RYRCREGLAQRNLPLIRCQENGRWEAPQISCVPRRPARALH PEEDPEGRQGRLLGRWKAL
LIPPSSPMPGP
(SEQ ID NO:21)
(22) EphB2R (DRT, ERK, Hek5, EPHT3, Tyro5, n.° de registro GenBank NM_004442) Chan,J. y Watt, V.M., Oncogene 6 (6), 1057-1061 (1991) Oncogene 10 (5):897-905 (1995), Annu. Rev. Neurosci. 21:309-345 (1998), Int. Rev. Cytol. 196:177-244 (2000)); documento WO2003042661 (Reivindicación 12); documento WO200053216 (Reivindicación 1; página 41); documento WO2004065576 (Reivindicación 1); documento WO2004020583 (Reivindicación 9); documento WO2003004529 (Página 128-132); documento WO200053216 (Reivindicación 1; página 42); Referencias cruzadas: MIM:600997; NP_004433.2; NM_004442_1
987 aa
MALRRIiGAALLIiLPLLAAVEETLMDSTTATAELGWMVHPPSGWEEVSGYDENMNTIRTYQ
VCNVFESSQNNWLRTKFIRRRGAHRIHVEMKFSVRDCSSIPSVPGSCKETFNLYYYEADF
DSATKTFPNWMENPWVKVDTIAADESFSQVDLGGR'VMKINTEVRSFGPVSRSGFYLAFQD
YGGCMSLIAVRVFYRKCPRIIQNGAIFQETLSGAESTSLVAARGSCIANAEEVDVPIKLY
CNGDGEWLVPIGRCMCKAGFEAVENGTVCRGCPSGTFKANQGDEACTHCPINSRTTSEGA
TNCVCRNGYYRADLDPLDMPCrTIPSAPQAVISSVNETSLMLEWTPPRDSGGREDLVYNI
ICKSCGSGRGACTRCGDNVQYAPRQLGLTEPRIYISDLLAHTQYTFEIQAVNGVTDQSPF
SPQPASVNITTNQAAPSAVSIMHQVSRTVDSITLSWSQPDQPKGVILDYELQYYEKEIiSE
YNATAIKSPTNTVTVQGLKAGAIYVFQVRARTVAGYGRYSGKMYFQTMTEAEYQTSIQEK
LPLIIGSSAAGLVFLIAVWIAIVCNRRRGFERADSEYTDKLQHYTSGHMTPGMKIYIDP
FTYEDPNEAVREFAKEIDISCVKIEQVIGAGEFGEVCSGHLKLPGKREIFVAIKTIiKSGY
TEKQRRDFLSEASIMGQFDHPNVIHLEGWTKSTPVMIITEFMENGSLDSFLRQNDGQFT
VIQLVGMLRGIAAGMKYIADMNYVHRDLAARNILVNSNIiVCKVSDFGLSRFLEDDTSDPT
YTSALGGKIPIRWTAPEAIQYRKFTSASDVWSYGIVMWEVMSYGERPYWDMTNQDVINAI
EQDYRLPPPMDCPSALHQLMLDCWQKDRNHRPKFGQIVNTLDKMIRNPNSLKAMAPLSSG
INLPLLDRTIPDYTSFNTVDEWLEAIKMGQYKESFANAGFTSFDWSQMMMEDILRVGVT
LAGHQKKILNS3QVMRAQMNQIQSVEV
(SEQ ID NO:22)
(23) ASLG659 (B7 h, n.° de registro GenBank AX092328)
documento US20040101899 (Reivindicación 2); documento WO2003104399 (Reivindicación 11); documento WO2004000221 (Fig 3); documento US2003165504 (Reivindicación 1); documento US2003124140 (Ejemplo 2); documento US2003065143 (Fig 60); documento WO2002102235 (Reivindicación 13; página 299); documento US2003091580 (Ejemplo 2); documento WO200210187 (Reivindicación 6; Fig 10); documento WO200194641 (Reivindicación 12; Fig 7b); documento WO200202624 (Reivindicación 13; Fig 1A-1B); documento US2002034749 (Reivindicación 54; Página 45-46); documento WO200206317 (Ejemplo 2; Página 320-321, Reivindicación 34; Página 321-322); documento WO200271928 (Página 468-469); documento WO200202587 (Ejemplo 1; Fig 1); documento WO200140269 (Ejemplo 3; Páginas 190-192); documento WO200036107 (Ejemplo 2; Página 205-207); documento WO2004053079 (Reivindicación 12); documento WO2003004989 (Reivindicación 1); documento WO200271928 (Página 233-234, 452-453); documento WO 0116318;
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MASLGQILFWS11SIXIILAGAIALIIGFGISGRHSITVTTVASAGNIGEDGILS CTFE P
DIKLSDIVIQWLKEGVLGLVHEFKEGKDELSEQDEMFRGRTAVFADQVIVGNASLRLKNV
QLTDAGT YKC Y11TSKGKKNANLEYKTGAFSMPEVNVDYNASSETLRCEAPRWFPQPTW
WASQVDQGANFSEVSNTSFEIjNSENVTMICWSVLYNVTINNTYSCMIENDIAKATGDIKV TESEIKRRSHLQLLNSKASLCVSSFFAISWALLPIiSPYLMLK
(SEQ ID NO:23)
(24) PSCA (precursor del antígeno de citoblastos, n.° de registro GenBank AJ297436) Reiter R.E., et al. Proc. Natl. Acad. Sci. Us a . 95, 1735-1740, 1998; Gu Z., et al. Oncogene 19, 1288-1296,2000; Biochem. Biophys. Res. Commun. (2000) 275(3):783-788; WO2004022709; documento EP1394274 (Ejemplo 11); documento US2004018553 (Reivindicación 17); documento WO2003008537 (Reivindicación 1); documento WO200281646 (Reivindicación 1; página 164); documento WO2003003906 (Reivindicación 10; página 288); documento WO200140309 (Ejemplo 1; Fig 17); documento US2001055751 (Ejemplo 1; Fig 1b); documento WO200032752 (Reivindicación 18; Fig 1); documento WO9851805 (Reivindicación 17; página 97); documento WO9851824 (Reivindicación 10; página 94); documento WO9840403 (Reivindicación 2; Fig. 1B);
Registro: O43653; EMBL; AF043498; AAC39607.1.
123 aa
MKAVLIiALLMAGXALQPGTALLCYSCKAQVSNEDCLQVENCTQLGEQCWTARIRAVGLLT
VISKGCSLNCVDDSQDYYVGKKKITCCDTDLCNASGAHALQPAAAILALLPALGLLLWGP
GQL
(SEQ ID NO:24)
(25) GEDA (n.° de registro GenBank AY260763);
AAP14954 lipoma HMGIC proteínas de tipo fusión /pid=AAP14954.1 - Homo sapiens
Especie: Homo sapiens (ser humano)
documento WO2003054152 (Reivindicación 20); documento WO2003000842 (Reivindicación 1); documento WO2003023013 (Ejemplo 3, Reivindicación 20); documento US2003194704 (Reivindicación 45);
Referencias cruzadas: GI:30102449; AAP14954.1; AY260763_1
236 aa
MPGAAAAAAAAAAAMLPAQEAAKLYHTNYVRNSRAIGVLWAIFTICFAIVNWCFIQPYW
IGDGVDTPQAGYFGLFHYCIGNGFSRELTCRGSFTDFSTLPSGAFKAASFFIGliSMMIiIX
ACIICFTL FF FCNTATVYKICAWMQLTSAACL VLGCMIFPDGWDSDEVKRMCGEKTDKYT
LGACSVRWAYILAIIGILDALILSFLAFVLGNRQDSLKAEEIiKAENKVIíLSQYSLE
(SEQ ID NO:25)
(26) BAFF-R (receptor del factor de activación de linfocitos B, BLyS receptor 3, BR3, n.° de registro GenBank NP_443177.1); NP_443177 BAFF receptor /pid=NP_443177.1 - Homo sapiens Thompson,J.S., et al. Science 293 (5537), 2108-2111 (2001); WO2004058309; WO2004011611; documento WO2003045422 (Ejemplo; Página 32-33); documento WO2003014294 (Reivindicación 35; Fig. 6B); documento WO2003035846 (Reivindicación 70; Página 615-616); documento WO200294852 (Col 136-137); documento WO200238766 (Reivindicación 3; página 133); documento WO200224909 (Ejemplo 3; Fig 3); Referencias cruzadas: MIM:606269; NP_443177.1; NM_052945_1
184 aa
MRRGPRSLRGRDAPAPTPCVPAECFDLLVRHCVACGLLRTPRPKPAGASSPAPRTALQPQ
ESVGAGAGEAALPLPGLLFGAPALLGLALVLALVLVGL.VSWRRRQRRLRGASSAEAPDGD
KDAPEPLDKVIILSPGISDATAPAWPPPGEDPGTTPPGHSVPVPATELGSTELVTTKTAG
PE QQ
(SEQ ID NO:26)
(27) CD22 (isoforma CD22-B del receptor de linfocitos B, n.° de registro GenBank NP-001762.1); Stamenkovic,I. y Seed,B., Nature 345 (6270), 74-77 (1990); US2003157113; US2003118592; documento WO2003062401 (Reivindicación 9); documento WO2003072036 (Reivindicación 1; Fig 1); documento WO200278524 (Ejemplo 2); Referencias cruzadas: MIM: 107266; NP_001762.1; NM_001771_1
847 aa
MHLLGPWLLLLVLEYLAFSDSSKWVFEHPETLYAWEGACVWIPCTYRALDGDLESFILFH
NPEYNKNTSKFDGTRLYBSTKDGICVPSEQKRVQFLGDKNKNCTLSIHPVHLNDSGQLGLR
MESKTEKWMERIHLNVSERPFPPHIQLPPEIQESQEVTLTCLLNFSCYGYPIQLQWLLEG
VPMRQAAVTSTSLTIKSVFTRSELKFSPQMSHHGKIVTCQLQDADGKFLSNDTVQLNVKH
TPKLEIKVTPSDAIVREGDSVTMTCEVSSSNPEYTTVSWLKDGTSLKKQNTFTLNLREVT
KDQSGKYCCQVSNDVGPGRSEEVFLQVQYAPEPSTVQILHSPAVEGSQVEFLCMSLANPL
PTNYTWYHNGKEMQGRTEEKVHIPKILFWHAGTYSCVAENILGTGQRGPGAELDVQYPPK
KVTTVIQNPMPIREGDTVTLSCNYNSSNPSVTRYEWKPHGAWEEPSLGVLKIQNVGWDNT
TIACARCNSWCSWASPVALNVQYAPRDVRVRK1KPLSEIHSGNSVSLQCDFSSSHPKEVQ
FFWEKNGRLLGKESQLMFDSISPEDAGSYSCWVNNSIGQTASKAWTI.EVLYAPRRt.RVSM SPGDQVMEGKSAnrCESDANPPVSKYTWFDWNNQSLPHHSQKLRLEPVKVQHSGAYWCQ GTNSVGKGRSPLSnTVYYSPETIGRRVAVGLGSCLAILILAICGLKLQRRWKRTQSQQG
LQENSSGQSFFVRNKKVRRAPLSEGPHSLGCYNPMMEDGISYTTLRFPEMNIPRTGDAES
SEMQRPPRTCDDTVTYSALHKRQVGDYENVIPDFPEDEGIHYSELIQFGVGERPQAQENV
DYVXLKH
(SEQ ID NO:27)
(28) CD79a (CD79A, CD79a, inmunoglobulina alfa-asociada, una proteína específica de linfocitos B que interactúa covalentemente con la Ig beta (CD79B) y forma un complejo sobre la superficie con moléculas de Ig M, transduce una señal implicada en la diferenciación de linfocitos B) SECUENCIA DE PROTEÍNA Completa mpggpgv...dvqlekp (1 ..226; 226 aa), pI: 4,84, MW: 25028 TM: 2 [P] Cromosoma génico: 19q13.2, n.° de registro GenBank NP_001774.1;
WO2003088808, US20030228319; documento WO2003062401 (reivindicación 9); documento US2002150573 (reivindicación 4, páginas 13-14); documento WO9958658 (reivindicación 13, Fig 16); documento WO9207574 (Fig 1); US5644033; Ha et al. (1992) J. Immunol. 148(5):1526-1531; Mueller et al. (1992) Eur. J. Biochem. 22:1621-1625; Hashimoto et al. (1994) Immunogenetics 40(4):287-295; Preud'homme et al. (1992) Clin. Exp. Immunol. 90(1): 141 -146; Yu et al. (1992) J. Immunol. 148(2) 633-637; Sakaguchi et al. (1988) EMBO J. 7(11):3457-3464;
226 aa
MPGGPGVLQALPATIFLLFLLSAVYLGPGCQALWMHKVPASLMVSLGEDAHFQCPHNSSN
NANVTWWRVLHGNYTWPPEFLGPGBDPNGTLIIQNVNKSHGGIYVCRVQEGNESYQQSCG
TYLRVRQPPPRPFLDMGEGTKNRIITAEGIILLFCAWPGTLLLFRKRWQNEKLGLDAGD
EYEDENLYEGLNLDDCSMYEDISRGLQGTYQDVGSLNIGDVQLEKP
(SEQ ID NO:28)
(29) CXCR5 (receptor 1 del linfoma de Burkitt, un receptor acoplados a la proteína G que se activa mediante la quimioquina CXCL13, actúa en la migración de linfocitos y en la defensa humoral, tiene un papel en la infección por VIH-2 y quizás en el desarrollo de SIDA, linfoma, mieloma, y leucemia) SECUENCIA DE PROTEÍNA Completa mnypltl...atslttf (1..372; 372 aa), pI: 8.54 MW: 41959 TM: 7 [P] Cromosoma génico: 11q23.3, n.° de registro GenBank NP_001707.1;
WO2004040000; WO2004015426; documento US2003105292 (Ejemplo 2); documento US6555339 (Ejemplo 2); documento WO200261087 (Fig 1); documento WO200157188 (Reivindicación 20, página 269); documento WO200172830 (páginas 12-13); documento WO200022129 (Ejemplo 1, páginas 152-153, Ejemplo 2, páginas 254­ 256); documento WO9928468 (reivindicación 1, página 38); documento US5440021 (Ejemplo 2, col 49-52); documento WO9428931 (páginas 56-58); documento WO9217497 (reivindicación 7, Fig 5); Dobner et al. (1992) Eur. J. Immunol. 22:2795-2799; Barella et al. (1995) Biochem. J. 309:773-779;
372 aa
MNYPLTLEMDLENLEDLFWELDRLDNYNDTSLVENHLCPATEGPLMASFKAVFVPVAYSIj
IFLLGVIGNVLVLVILERHRQTRSSTETFLFHLAVADLLLVFILPFAVAEGSVGWVLGTF
LCKTVIALHKVNFYCSSLLLACIAVDRYLAIVHAVHAYRHRRLLSIHITCGTIWLVGFLL
ALPEILFAKVSQGHHNNSLPRCTFSQENQAETHAWFTSRFLYHVAGFLLPMLVMGWCYVG
WHRLRQAQRR PQRQKAVRVAILVTSIFFLCWS PYHIVIFLDTLARLKAVDNTCKLNGSL
PVAITMCEFLGLAHCCLNPMLYTFAGVKFRSDLSRLLTKLGCTGPASLCQLFPSWRRSSL
SESENATSLTTF
(SEQ ID NO:29)
(30) HLA-DOB (Subunidad beta de la molécula de clase II de MHC (antígeno la) que se une a péptidos y los presenta a linfocitos T CD4+) SECUENCIA DE PROTEÍNA Completa mgsgwvp...vllpqsc (1..273; 273 aa, pI: 6.56 MW: 30820 TM: 1 [P] Cromosoma génico: 6p21.3, n.° de registro GenBank NP_002111.1;
Tonnelle et al. (1985) EMBO J. 4(11):2839-2847; Jonsson et al. (1989) Immunogenetics 29(6):411-413; Beck et al. (1992) J. Mol. Biol. 228:433-441; Strausberg et al. (2002) Proc. Natl. Acad. Sci USA 99:16899-16903; Servenius et al. (1987) J. Biol. Chem. 262:8759-8766; Beck et al. (1996) J. Mol. Biol. 255:1-13; Naruse et al. (2002) Tissue Antigens 59:512-519; documento WO9958658 (reivindicación 13, Fig 15); documento US6153408 (Col 35-38); documento US5976551 (col 168-170); documento US6011146 (col 145-146); Kasahara et al. (1989) Immunogenetics 30(1):66-68; Larhammar et al. (1985) J. Biol. Chem. 260(26):14111-14119;
273 aa
MGSGWVPWWALLVNLTRLDSSMTQGTDS PEDFVIQAKADC YFTNGTEKVQFWRFIFNL
EEYVRFDSDVGMFVALTKLGQPDAEQWNSRLDLLERSRQAVDGVCRHNYRLGAPFTVGRK
VQPEVTVYPERTPLLHQHNLLHCSVTGFYPGDIKIKWFLNGQEERAGVMSTGPIRNGDWT
FQTWMLEMTPELGHVYTCLVDHSSLLSPVSVEWRAQSEYSWRKMLSGIAAFLLGLIFLL
V G IV IQLRAQKGYVRTQMSGNEVSRAVLLPQSC
(SEQ ID NO:30)
(31) P2X5 (Receptor purinérgico P2X del canal de iones controlado por ligando 5, un canal de iones controlado por el ATP extracelular, puede estar implicado en la transmisión sináptica y en la neurogénesis, la deficiencia puede contribuir a la patofisiología de la inestabilidad idiopática del detrusor) SECUENCIA DE PROTEÍNA Completa mgqagck...lephrst (1 ..422; 422 aa), pI: 7,63, MW: 47206 TM: 1 [P] Cromosoma génico: 17p13.3, n.° de registro GenBank NP_002552,2;
Le et al. (1997) FEBS Lett. 418(1-2): 195-199; WO2004047749; documento WO2003072035 (reivindicación 10); Touchman et al. (2000) Genome Res. 10:165-173; documento WO200222660 (reivindicación 20); documento WO2003093444 (reivindicación 1); documento WO2003087768 (reivindicación 1); documento WO2003029277 (página 82);
422 aa
MGQAGCKGLCLSLFDYKTEKYVIAKNKKVGLLYRLLQASILAYLWWVFLIKKGYQDVDT
s l q s a v it k v k g v a f t n t s d l g q r iw d v a d y v ip a q g e n v f f w t n l iv t p n q r q n v c a e
NEGIPDGACSKDSDCHAGEAVTAGNGVKTGRCLRRENLARGTCEIFAWCPLETSSRPEEP
FLKEAEDFTIFIKNHIRFPKFNFSKSNVMDVKDRSFLKSCHFGPKNHYCPIFRLGSVIRW
AGSDFQDIALEGGVIGINIEWNCDLDKAASECHPHYSFSRLDNKLSKSVSSGYNFRFARY
YRDAAGVEFRTLMKAYGIRFDVMVNGKGAFFCDLVLIYLIKKREFYRDKKYEEVRGLEDS
SQEAEDEASGLGLSEQLTSGPGIiLGMPEQQELQEPPEAKRGSSSQKGNGSVCPQLLEPHR
ST
(SEQ ID NO:31)
(32) CD72 (antígeno CD72 de diferenciación de linfocitos B, Lyb-2) SECUENCIA DE PROTEÍNA Completa maeaity...tafrfpd (1..359; 359 aa), pI: 8,66, MW: 40225 TM: 1 [P] Cromosoma génico: 9p13.3, n.° de registro GenBank NP_001773.1; documento WO2004042346 (reivindicación 65); documento WO2003026493 (páginas 51­ 52, 57-58); documento WO200075655 (páginas 105-106); Von Hoegen et al. (1990) J. Immunol. 144(12):4870-4877; Strausberg et al. (2002) Proc. Natl. Acad. Sci USA 99:16899-16903;
359 aa
MAEAITYADLRFVKAPLKKSISSRLGQDPGADDDGEITYENVQVPAVLGVPSSLASSVL.G
DKAAVKSEQPTASWRAVTSPAVGRILPCRTTCLRYLLLGLLLTCLLLGVTAICLGVRYLQ
VSQQLQQTNRVLEVTNSSLRQQLRLKITQLGQSAEDLQGSRRELAQSQEALQVEQRAHQA
AEGQLQACQADRQKTKETLQSEEQQRRALEQKLSNMENRLftPFFTCGSADTCCPSGWIMH
QKSCFYISLTSKNWQESQKQCETLSSKLATFSEIYPQSHSYYFLNSLLPNGGSGNSYWTG
LSSNKDWKLTDDTQRTRTYAQSSKCNKVHKTWSWWTLESESCRSSLPYICEMTAFRFPD
(SEQ ID NO:32)
(33) LY64 (Antígeno linfocitario 64 (RP105), proteína de membrana de tipo I de la familia de repeticiones ricas en leucina (LRR), regula la activación de linfocitos B y la apoptosis, la pérdida de función está asociada con un aumento de la actividad de la enfermedad en pacientes con lupus sistémico eritematoso) SECUENCIA DE PROTEÍNA Completa mafdvsc...rwkyqhi (1..661; 661 aa), pI: 6,20, MW: 74147 TM: 1 [P] Cromosoma génico: 5q12, n.° de registro GenBank NP_005573.1; US2002193567; documento WO9707198 (reivindicación 11, páginas 39-42); Miura et al. (1996) Genomics 38(3):299-304; Miura et al. (1998) Blood 92:2815-2822; WO2003083047; documento WO9744452 (reivindicación 8, páginas 57-61); documento WO200012130 (páginas 24-26);
661 aa
MAFDVSCFF’WWLFSAGCKVITSWDQMCIEKEANKTYNCENLGLSEIPDTLPNTTEFLEP
S FNFLPTIHNRTFSRLMNLTFLDLTRCQINWIHEDTFQSHHQLSTLVLTGNPLIFMAETS
LNGPKSLKHIiFLIQTG ISNLEFIPVHNLENLESLYLGSNHISSIKFPKDFPARNLKVLDF
QNNAIHYISREDMRSLEQAINLSLNFNGNNVKGIELGAFDSTVFQSLNFGGTPNLSVIFN
GLQNSTTQSLWLGTFEDIDDEDISSAMLKGLCEMSVESLNLQEHRFSDISSTTFQCFTQL
QELDLTATHLKGLPSGMKGLNLLKKLVLSVNHFDQLCQISAANFPSLTHLYIRGNVKKLH
LGVGCLEKLGNLQTLDLSHNDIEASDCCSLQLKNLSHLQTLNLSHNEPLGLQSQAFKECP
QLELLDLAFTRLHINAPQSPFQNLHFLQVLNLTYCFLDTSNQHLLAGLPVLRHLNLKGNH
FQDGTITKTNLLQTVGSLEVIíILSSCGLLSIDQQAFHSLGKMSHVDLSHNSLTCDSIDSL
SHLKGIYLNLAANSINIISPRLLPILSQQSTINLSHNPLDCTCSNIHFLTWYKENLHKLE
GSEETTCANPPSLRGVKLSDVKLSCGITAIGIFPLIVFLLLIiAILLFFAVKYLLRWKYQH
I
(SEQ ID NO:33)
(34) FCRH1 (proteína 1 análoga al receptor Fc, un receptor posible del dominio Fc de inmunoglobulinas que contiene los dominio de tipo C2 e ITAM análogo a Ig, puede tener un papel en la diferenciación de linfocitos B) SECUENCIA DE PROTEÍNA Completa mlprllL.vdyedam (1..429; 429 aa), pI: 5,28, MW: 46925 TM: 1 [P] Cromosoma génico: 1q21-1q22, n.° de registro GenBank NP_443170.1;
WO2003077836; documento WO200138490 (reivindicación 6, Fig 18E-1-18-E-2); Davis et al. (2001) Proc. Natl. Acad. Sci USA 98(17):9772-9777; documento WO2003089624 (reivindicación 8); documento EP1347046 (reivindicación 1); documento WO2003089624 (reivindicación 7);
429 aa
MLPRLLLLICAPLCEPAELFLIASPSHPTEGSPVTLTCKMPFLQSSDAQFQFCFFRDTRA
LGPGWSSSPKLQIAAMWKEDTGSYWCEAQTMASKVLRSRRSQINVHRVPVADVSLETQPP
GGQVMEGDRLVLICSVAMGTGDITFLWYKGAVGLNLQSKTQRSLTAEYEIPSVRESDAEQ
YYCVAENGYGPSPSGLVSITVRIPVSRPIL,MLRAPRAQAAVEDVLEI.HCEAIiRGSPPILY
WFYHEDITLGSRSAPSGGGASFNLSLTEEHSGNYSCEANNGLGAQRSEAVTLNFTVPTGA
r s n h l t s g v ie g l l s t l g p a t v a l l f c y g l k r k ig r r s a r d p l r s l p s p l p q e f t y l n s p
TPGQLQPIYENVNWSGDEVYSLAYYNQPEQESVAAETLGTHMEDKVSLDJYSRLRKANI
TDVDYEDAM
(SEQ ID NO:34)
(35) IRTA2 (superfamilia del receptor de translocación 2 asociado a inmunoglobulina, un inmunorreceptor posible con teóricos papeles en el desarrollo de linfocitos B y en la linfomagénesis; la desregulación del gen por translocación se produce en algunas neoplasias malignas de linfocitos B) SECUENCIA DE PROTEÍNA Completa mllwviL.assaphr (1..977; 977 aa), pI: 6.88 MW: 106468 TM: 1 [P] Cromosoma génico: 1q21, n.° de registro GenBank NP_112571.1;
documento WO2003024392 (reivindicación 2, Fig 97); Nakayama et al. (2000) Biochem. Biophys. Res. Commun.
277(1 ):124-127; WO2003077836; documento WO200138490 (reivindicación 3, Fig 18B-1-18B-2);
977 aa
MX.LWVILLVLAPVSGQPARTPRPIIFLQPPWTTVFQGERVTLTCKGFRFYSPQKTKWYHR
YLGKEILRETPDNILEVQESGEYRCQAQGSPLSSPVHLDFSSASLILQAPLSVFEGDSW
LRCRAKAEVTLNNTIYKNDNVLAFLNKRTDFHIPHACLiKDNGAYRCTGYKESCCPVSSNT
VKIQVQEPFTRPVLRASSFQPISGNPVTLTCETQLSLERSDVPLRFRFFRDDQTLGLGWS
LSPNFQITAMWSKDSGFYWCKAATMPHSVISDSPRSWIQVQIPASHPVLTLSPEKALNFE
GTKVTLHCETQEDS LRTLYRFYHEGVPIjRHKSVRCERGASIS FSLTTENSGNYYCTADNG LGAKPSKAVSLSVTVPVSHPVLNLSSPEDLI FEGAiCVTLHCEAQRGSLPILYQFHHEDAA IiERRSANSAGGVAISFSLTAEHSGNYYCTADNGFGPQRSKAVSLSITVPVSHPVLTLSSA
EALTFEGATVTLHCEVQRGSPQILYQPYHEDMPLWSSSTPSVGRVSFSFSLTEGHSGNYY
CTADNGFGPQRSEWSLFVTVPVSRPILTLRVPRAQAWGDLLELHCEAPRGSPPILYWF
YHEDVTLGSSSAPSGGEASFNLSLTAEHSGNYSCEANNGLVAQHSDTISLSVIVPVSRP3
LTFRAPRAQAWGDLLELHCEALRGSSPILYWFYHEDVTLGKISAPSGGGASFNLSLTTE
HSGIYSCEADNGPEAQRSEMVTLKVAVPVSRPVLTLRAPGTHAAVGDLLELHCEALRGSP
LILYRFFHEDVTLGNRSSPSGGASLNLSLTAEHSGNYSCEADNGLGAQRSETVTLYITGL
TANRSGPFATGVAGGLLSIAGLAAGALLLYCWLSRKAGRKPASDPARSPPDSDSQEPTYH
NVPAWEELQPVYTNANPRGENVVYSEVRIIQBKKKHAVASDPRHLRNKGSPIIYSEVKVA
STPVSGSLFLASSAPHR
(SEQ ID NO:35)
Véanse también: WO04/045516 (03 Jun 2004); WO03/000113 (03 Jan 2003); WO02/016429 (28 Feb 2002); WO02/16581 (28 Feb 2002); WO03/024392 (27 Mar 2003); WO04/016225 (26 Feb 2004); WO01/40309 (07 Jun 2001), y la solicitud de patente provisional de los Estados Unidos con número de serie 60/520842 "COMPOSITIONS AND METHODS FOR THE TREATMENT OF TUMOR OF HEMATOPOIETIC ORIGIN", presentada el 17 de nov de 2003.
En un ejemplo, el Conjugado de ligando-enlazador-fármaco tienen la Fórmula IlIa, donde el Ligando es un anticuerpo Ab incluido uno que se une a al menos uno de CD30, CD40, CD70, antígeno Lewis Y, w=0, y=0, y D tiene la Fórmula Ib. Los Conjugados ilustrativos de Fórmula Illa incluyen donde R17 es -(CH2)5-. También se incluyen tales Conjugados de Fórmula Illa en la que D tiene la estructura del Compuesto 2 del Ejemplo 3 y ésteres de los mismos. También se incluyen tales Conjugados de Fórmula Illa que contienen de aproximadamente 3 a aproximadamente 8, en un aspecto, de aproximadamente 3 a aproximadamente 5 Restos de fármaco D, es decir, Conjugados de Fórmula Ia en la que p tiene un valor en el intervalo de aproximadamente 3-8, por ejemplo aproximadamente 3-5. Los conjugados que contienen combinaciones de rasgos estructurales indicados en este párrafo también se describen.
En otro ejemplo, el Conjugado de ligando-enlazador-fármaco tiene la Fórmula IlIa, donde el Ligando es un anticuerpo Ab que se une a uno de CD30, CD40, CD70, antígeno Lewis Y, w=1, y=0, y D tiene la Fórmula Ib. Están incluidos dichos Conjugados de Fórmula Illa en los que R17 es -(CH2)5-. También se incluyen dichos Conjugados de Fórmula IIIa en la que W es -Val-Cit-, y/o donde D tiene la estructura del Compuesto 2 del Ejemplo 3 y ésteres de los mismos. También se incluyen tales Conjugados de Fórmula IlIa que contienen de aproximadamente 3 a aproximadamente 8, preferentemente de aproximadamente 3 a aproximadamente 5 Restos de fármaco D, es decir, Conjugados de Fórmula Ia en la que p tiene un valor en el intervalo de aproximadamente 3-8, preferentemente aproximadamente 3­ 5. Los conjugados que contienen combinaciones de rasgos estructurales indicados en este párrafo también son ilustrativos.
En un ejemplo, el Conjugado de ligando-enlazador-fármaco tienen la Fórmula Illa, donde el Ligando es un anticuerpo Ab que se une a uno de CD30, CD40, CD70, antígeno Lewis Y, w=1, y=1, y D tiene la Fórmula Ib. Están incluidos los Conjugados de Fórmula Illa en los que R17 es -(CH2)5-. También se incluyen dichos Conjugados de Fórmula IIIa en la que: W es - Val-Cit-; Y tiene la Fórmula X; D tiene la estructura del Compuesto 2 del Ejemplo 3 y ésteres de los mismos; p es de aproximadamente 3 a aproximadamente 8, preferentemente de aproximadamente 3 a aproximadamente 5 Restos de fármaco D. Los conjugados que contienen combinaciones de rasgos estructurales indicados en este párrafo también se contemplan.
Un ejemplo adicional es un conjugado de anticuerpo y fármaco (ADC), o una sal o solvato farmacéuticamente aceptables del mismo, en el que Ab es un anticuerpo que se une a uno de los antígenos asociados a tumores (1)-(35) anteriomente indicados (el "compuesto TAA").
Un ejemplo es el Compuesto TAA o sales o solvatos farmacéuticamente aceptables del mismo que está en forma aislada o purificada.
Se describen también métodos para destruir o inhibir la multiplicación de una célula tumoral o una célula cancerosa que comprenden administrar a un paciente, por ejemplo, un ser humano con un trastorno hiperproliferativo, una cantidad de un Compuesto TAA o una sal o solvato farmacéuticamente aceptables del mismo, siendo dicha cantidad eficaz para destruir o inhibir la multiplicación de una célula tumoral o de una célula cancerosa.
Se describe también un método para tratar un cáncer que comprende administrar a un paciente, por ejemplo, un ser humano con un trastorno hiperproliferativo, una cantidad de un Compuesto TAA o una sal o solvato farmacéuticamente aceptables del mismo, siendo dicha cantidad eficaz para tratar el cáncer, en solitario o de forma conjunta con una cantidad eficaz de un agente anticanceroso adicional. Se describe también un método para tratar una enfermedad autoinmunitaria, que comprende administrar a un paciente, por ejemplo, un ser humano con un trastorno hiperproliferativo, una cantidad de un Compuesto TAA o una sal o solvato farmacéuticamente aceptables del mismo, siendo dicha cantidad eficaz para tratar una enfermedad autoinmunitaria.
Los anticuerpos adecuados para su uso en la invención se pueden producir por cualquier método conocido en la materia para la síntesis de anticuerpos, en particular, por síntesis química o mediante expresión recombinante, y se producen preferentemente mediante técnicas de expresión recombinante.
4.5.1 PRODUCCIÓN DE ANTICUERPOS RECOMBINANTES
Se pueden producir anticuerpos utilizando cualquier método conocido en la técnica que sea útil para la síntesis de anticuerpos, en particular, mediante síntesis química o mediante expresión recombinante.
La expresión recombinante de anticuerpos, o fragmentos, derivados o análogos de los mismos, requiere la construcción de un ácido nucleico que codifica el anticuerpo. Si se conoce la secuencia de nucleótidos del anticuerpo, se puede ensamblar un ácido nucleico que codifica el anticuerpo a partir de oligonucleótidos químicamente sintetizados (por ejemplo, como se describe en Kutmeier et al., 1994, BioTechniques 17:242), que implica la síntesis de solapamiento de oligonucleótidos que contienen porciones de la secuencia que codifica el anticuerpo, la hibridación y la ligadura de aquellos oligonucleótidos, y a continuación la amplificación de los oligonucleótidos ligados, por ejemplo, mediante PCR.
Como alternativa, se puede generar una molécula de ácido nucleico que codifica un anticuerpo a partir de una fuente adecuada. Si no está disponible un clon que contiene el ácido nucleico que codifica el anticuerpo concreto, pero se conoce la secuencia del anticuerpo, se puede obtener un ácido nucleico que codifica el anticuerpo a partir de una fuente adecuada (por ejemplo, una biblioteca de ADNc de anticuerpos, o una biblioteca de ADNc generada a partir de cualquier tejido o células que expresan la inmunoglobulina) mediante, por ejemplo, amplificación de la PCR utilizando cebadores sintéticos hibridables en los extremos 3' y 5' de la secuencia o mediante clonación usando una sonda de oligonucleótidos específica de la secuencia génica concreta.
Si un anticuerpo que reconoce específicamente un antígeno concreto no está comercialmente disponible (o una fuente de una biblioteca de ADNc para la clonación de un ácido nucleico que codifica dicha inmunoglobulina), se pueden generar anticuerpos específicos para un antígeno concreto mediante cualquier método conocido en la técnica, por ejemplo, inmunizando a un paciente, o un modelo animal adecuado tal como un conejo o ratón, para generar anticuerpos policlonales o, más preferentemente, generando anticuerpos monoclonales, por ejemplo, como se describe por Kohler y Milstein (1975, Nature 256:495-497) o, como se describe por Kozbor et al. (1983, Immunology Today 4:72) o Cole et al. (1985 en Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., págs.
77-96). Como alternativa, puede obtenerse un clon que codifica al menos la porción Fab del anticuerpo cribando bibliotecas de expresión de Fab (por ejemplo, como se describe en Huse et al., 1989, Science 246:1275-1281) para clones de fragmentos Fab que se unen al antígeno específico o cribando bibliotecas de anticuerpos (Véase, porejemplo, Clackson et al., 1991, Nature 352:624; Hane et al., 1997 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:4937).
Una vez que se obtiene una secuencia de ácido nucleico que codifica al menos el dominio variable del anticuerpo, se puede introducir en un vector que contiene la secuencia de nucleótidos que codifica las regiones constantes del anticuerpo (véase, porejemplo, la publicación internacional n.° WO 86/05807; WO 89/01036; y la Patente de Estados Unidos n.° 5122464). Están disponibles vectores que contienen la cadena ligera o pesada completa que permiten la expresión de una molécula de anticuerpo completa. Después, la molécula de ácido nucleico que codifica el anticuerpo se puede usar para introducir las sustituciones o deleciones de nucleótidos necesarias para sustituir (o
eliminar) los uno o más restos de cisteína de la región variable que participan en un enlace disulfuro intracadena con un resto aminoácido que no contiene un grupo sulfhidrilo. Se pueden llevar a cabo dichas modificaciones mediante cualquier método conocido en la técnica para la introducción de mutaciones o deleciones específicas en una secuencia de nucleótidos, por ejemplo, aunque no de forma limitativa,, mutagénesis química y mutagénesis dirigida a sitio in vitro (Hutchinson et al., 1978, J. Biol. Chem. 253:6551).
Además, se pueden usar técnicas desarrolladas para la producción de "anticuerpos quiméricos" (Morrison et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. 81:851-855; Neuberger et al., 1984, Nature 312:604-608; Takeda et al., 1985, Nature 314:452-454) cortando y empalmando genes de una molécula de anticuerpo de ratón de una especificidad por el antígeno adecuada junto con genes de una molécula de anticuerpo humano de actividad biológica adecuada. Un anticuerpo quimérico es una molécula en la que las distintas porciones se obtienen de distintas especies animales, tales como las que tienen una región variable obtenida de un anticuerpo monoclonal murino y una región constante de inmunoglobulina humana, por ejemplo, anticuerpos humanizados.
Como alternativa, las técnicas descritas para la producción de anticuerpos monocatenarios (patente de Estados Unidos 4.694.778; Bird, 1988, Science 242:423-42; Huston et al., 1988, Proc. Natl Acad. Sci. USA 85:5879-5883; y Ward et al., 1989, Nature 334:544-54) se pueden adaptar para producir anticuerpos monocatenarios. los anticuerpos monocatenarios se forman uniendo los fragmentos de la cadena pesada y ligera de la región Fv mediante un puente de aminoácidos, dando como resultado un polipéptido monocatenario. Se pueden usar también técnicas para el ensamblaje de fragmentos Fv funcionales en E. coli (Skerra et al., 1988, Science 242:1038-1041).
Se pueden generar fragmentos de anticuerpos que reconocen epítopos específicos mediante técnicas conocidas. Por ejemplo, dichos fragmentos incluyen, aunque no de forma limitativa, fragmentos F(ab')2 que se pueden producir mediante digestión con pepsina de la molécula de anticuerpo y los fragmentos Fab que se pueden generar reduciendo los puentes disulfuro de los fragmentos F(ab')2.
Una vez que se ha obtenido una secuencia de ácido nucleico que codifica un anticuerpo, el vector para la producción del anticuerpo se puede producir mediante tecnología de ADN recombinante utilizando técnicas bien conocidas en la materia. Pueden usarse métodos bien conocidos por los expertos en la materia para construir vectores de expresión que contienen las secuencias codificantes del anticuerpo y las señales de control de la transcripción y la traducción adecuadas. Estos métodos incluyen, por ejemplo, técnicas de ADN recombinante in vitro, técnicas sintéticas y recombinación genética in vivo. Véanse, por ejemplo, las técnicas descritas en Sambrook et al. (1990, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2a Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY) y Ausubel et al. (eds., 1998, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, nY).
Un vector de expresión que comprende la secuencia de nucleótidos de un anticuerpo o la secuencia de nucleótidos de un anticuerpo se puede transferir a una célula hospedadora mediante técnicas convencionales (por ejemplo, electroporación, transfección liposomal, y precipitación con fosfato de calcio), y las células transfectadas se cultivan a continuación mediante técnicas convencionales para producir el anticuerpo. En realizaciones específicas, la expresión del anticuerpo se regula por un promotor constitutivo, un promotor inducible o un promotor específico de tejido.
Las células hospedadoras usadas para expresar el anticuerpo recombinante pueden ser tanto células bacterianas tales como Escherichia coli, como, preferentemente, células eucariotas, especialmente para la expresión de la molécula de inmunoglobulina recombinante completa. En particular, las células de mamífero tales como células de ovario de hámster chino (CHO), junto con un vector tal como un elemento promotor mayor del gen temprano intermedio procedente del citomegalovirus humano son un sistema de expresión eficaz para las inmunoglobulinas (Foecking et al., 198, Gene 45:101; Cockett et al., 1990, BioTechnology 8:2).
Se puede utilizar varios sistemas vectoriales de expresión en el hospedador para expresar los anticuerpos de la inmunoglobulina. Dichos sistemas de expresión en el hospedador representan vehículos mediante los cuales se pueden producir secuencias del anticuerpo y posteriormente purificarse, pero también representan células que pueden, cuando se transforman o transfectan con las secuencias que codifican los nucleótidos adecuados, expresar una molécula de inmunoglobulina anticuerpo in situ. Estos incluyen, aunque no de forma limitativa, microorganismos tales como bacterias (por ejemplo, E. coli y B. subtilis) transformados con ADN de bacteriófago recombinante,, vectores de expresión de ADN plásmido o ADN cósmido que contienen secuencias de codificación de la inmunoglobulina; levaduras (por ejemplo, Saccharomyces Pichia) transformadas con vectores de expresión de levaduras recombinantes que contienen secuencias de codificación de la inmunoglobulina; sistemas de células de insectos con vectores de expresión de virus recombinantes (por ejemplo, baculovirus) que contienen las secuencias de codificación de la inmunoglobulina; sistemas de células vegetales infectadas con vectores de expresión de virus recombinantes (por ejemplo, el virus del mosaico de la coliflor (CaMV) y el virus del mosaico del tabaco (TMV) o transformarse con vectores de expresión de plásmidos recombinantes (por ejemplo, plásmido Ti ) que contienen secuencias de codificación de la inmunoglobulina; o sistemas de células de mamíferos (por ejemplo, células COS, CHO, BH, 293, 293T, 3T3) que transportan promotores que contienen construcciones de expresión recombinantes obtenidas del genoma de células de mamíferos (por ejemplo, el promotor de la metalotioneína) o de virus de mamíferos (por ejemplo, el promotor tardío del adenovirus; el promotor 7.5K del virus vaccinia).
En sistemas bacterianos, se pueden seleccionar de forma ventajosa dependiendo del uso previsto del anticuerpo que se expresa. Por ejemplo, cuando se va a producir una gran cantidad de dicha proteína, pueden ser deseables vectores que dirijan la expresión de elevados niveles de productos de proteínas de fusión que se purifiquen fácilmente. Dichos vectores incluyen, aunque no de forma limitativa, el vector de expresión pUR278 de E. coli (Ruther et al., 1983, EMBO J. 2:1791), en el que la secuencia que codifica el anticuerpo puede ligarse individualmente en el vector en marco con la región que codifica lac Z de tal manera que se produce una proteína de fusión; vectores pIN (Inouye & Inouye, 1985, Nucleic Acids Res. 13:3101-3109; Van Heeke & Schuster, 1989, J. Biol. Chem. 24:5503-5509); y similares. Se pueden usar también vectores pGEX para expresar los polipéptido extraños como proteínas de fusión con glutatión S-transferasa (GST). En general, dichas proteínas de fusión son solubles y pueden purificarse fácilmente a partir de células lisadas mediante adsorción y unión a perlas de una matriz de glutatión-agarosa seguido por elución en presencia de glutatión libre. Los vectores pGEX se diseñan para incluir sitios de escisión de la proteasa de la trombina o de la proteasa del factor Xa de tal manera que el producto del gen diana clonado puede liberarse del resto GST.
En un sistema de insecto, se usa el virus de la polihedrosis nuclear de Autographa californica (AcNPV) o el virus análogo de Drosophila Melanogaster como un vector para expresar genes extraños. El virus crece en células de Spodoptera frugiperda. La secuencia que codifica el anticuerpo puede clonarse individualmente en regiones no esenciales (por ejemplo, el gen de la polihedrina) del virus y colocarse bajo el control de un promotor AcNPV (por ejemplo, el promotor de la polihedrina).
en células hospedadoras de mamífero, se pueden utilizar numerosos sistemas de expresión basados en virus. En los casos donde se usa un adenovirus como un vector de expresión, la secuencia que codifica el anticuerpo de interés a un complejo de control de la transcripción/traducción adenovírico, por ejemplo, el promotor tardío y la secuencia líder tripartita. Este gen quimérico puede insertarse a continuación en el genoma del adenovirus mediante recombinación in vitro o in vivo. La inserción en una región no esencial del genoma vírico (por ejemplo, la región E1 o E3) da como resultado un virus recombinante que es viable y capaz de expresar la molécula de inmunoglobulina en hospedadores infectados. (por ejemplo, véase Logan y Shenk, 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:355-359). se pueden requerir también señales de inicio específicas para una traducción eficaz de las secuencias que codifican el anticuerpo insertado. Estas señales incluyen el codón de inicio ATG y las secuencias adyacentes. Además, el codón de inicio debe estar en fase con el marco de lectura de la secuencia de codificación deseada para asegurar la traducción de la inserción completa. Estas señales exógenas de control de la traducción y los codones de inicio pueden ser de varios orígenes, tanto naturales como sintéticos. Se puede potenciar la eficacia de la expresión mediante la inclusión de elementos potenciadores de la transcripción adecuados, terminadores de la transcripción, etc. (véase Bittner et al., 1987, Methods in Enzymol. 153:51-544).
Además, se puede seleccionar una cepa de célula hospedadora que module la expresión de las secuencias insertadas y procese el producto génico en la forma específica deseada. Dichas modificaciones (por ejemplo, glicosilación) y procesamiento (por ejemplo, escisión) de los productos de la proteína pueden ser importantes para la función de la proteína. Diferentes células hospedadoras tienen características y mecanismos específicos para el procesamiento y la modificación posterior a la traducción de las proteínas y productos génicos. Se pueden seleccionar líneas de células adecuadas o sistemas hospedadores para asegurar la modificación y el procesamiento correctos de la proteína extraña expresada. Con este fin, se pueden usar células hospedadoras eucariotas que posean la maquinaria celular para el procesamiento adecuado del transcrito primario, la glicosilación, y la fosforilación del producto génico. Dichas células hospedadoras de mamífero incluyen, aunque no de forma limitativa, CHO, VERY, BH, Hela, COS, MDCK, 293, 293T, 3T3, WI38, BT483, Hs578T, HTB2, BT20 y T47D, CRL7030 y Hs578Bst.
A largo plazo, se prefiere la expresión estable de la producción de alto rendimiento de las proteínas recombinantes. Por ejemplo, se pueden diseñar mediante ingeniería genética líneas de células que expresen de forma estable un anticuerpo. Más bien que utilizar vectores de expresión que contengan orígenes de replicación víricos, las células hospedadoras pueden transformarse con ADN controlado por elementos de control de la expresión adecuados (por ejemplo, promotores, potenciadores, secuencias, terminadores de la transcripción, sitios de poliadenilación, etc.), y un marcador seleccionable. Tras la introducción del ADN extraño, pueden dejarse crecer las células diseñadas mediante ingeniería genética durante 1-2 días en un medio enriquecido, y a continuación se cambian a un medio selectivo. El marcador seleccionable en el plásmido recombinante confiere resistencia a la selección y permite a las células integrar de forma estable el plásmido en sus cromosomas y crecer para formar foci que a la vez pueden clonarse y expandirse en líneas de células. Este método puede utilizarse de forma ventajosa para diseñar mediante ingeniería genética líneas de células que expresan el anticuerpo. Dichas líneas de células diseñadas mediante ingeniería genética pueden ser particularmente útiles en el cribado y la evaluación de antígenos tumorales que interactúan directa o indirectamente con el anticuerpo.
Se pueden usar numerosos sistemas de selección, incluyendo, aunque no de forma limitativa la timidina quinasa del virus del herpes simple (Wigler et al., 1977, Cell 11:223), hipoxantina-guanina fosforibosiltransferasa (Szybalska y Szybalski, 192, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 48:202), y adenina fosforibosiltransferasa (Lowy et al., 1980, Cell 22:817) genes que se pueden emplear en células tk-, hgprt o aprt, respectivamente. También, se puede usar la resistencia antimetabolitos como la base de selección de los siguientes genes: DHFR, que confiere resistencia a metotrexato (Wigler et al., 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:357; O'Hare et al., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:1527); gpt, que confiere resistencia al ácido micofenólico (Mulligan y Berg, 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:2072); neo, que confiere resistencia al aminoglucósido G- 418 (Clinical Pharmacy 12: 488-505; Wu y Wu, 1991, Biotherapy 3:87-95; Tolstoshev, 1993, Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 32:573-596; Mulligan, 1993, Science 260:926-932; y Morgan y Anderson, 1993, Ann. Rev. Biochem. 62:191-217; mayo de 1993, TIB TECH 11(5): 155-215) e hygro, que confiere resistencia a la higromicina (Santerre et al., 1984, Gene 30:147). Los métodos comúnmente conocidos en la técnica de la tecnología de ADN recombinante que se pueden usar se describen en Ausubel et al. (eds., 1993, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY; Kriegler, 1990, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY; y en los Capítulos 12 y 13, Dracopoli et al. (eds), 1994, Current Protocols in Human Genetics, John Wiley & Sons, NY.; Colberre-Garapin et al., 1981, J. Mol. Biol. 150:1).
Se pueden aumentar los niveles de expresión de un anticuerpo mediante la amplificación del vector (para una revisión, véase Bebbington y Hentschel, The use of vectors based on gene amplification for the expression of cloned genes in mammalian cells in DNA cloning, Vol.3. (Academic Press, Nueva York, 1987)). Cuando un marcador en el sistema de vectores que expresa un anticuerpo es amplificable, un aumento en el nivel del inhibidor presente en el cultivo de la célula hospedadora aumentará el número de copias del gen marcador. Debido a que la región amplificada está asociada con la secuencia de nucleótidos del anticuerpo, aumentará también la producción del anticuerpo (Crouse et al., 1983, Mol. Cell. Biol. 3:257).
La célula hospedadora puede transfectarse simultáneamente con dos vectores de expresión, el primer vector codifica un polipéptido derivado de la cadena pesada y el segundo vector codifica un polipéptido derivado de la cadena ligera. Los dos vectores pueden contener marcadores seleccionables idénticos que permiten la expresión igual de polipéptidos de la cadena pesada y ligera. Como alternativa, se puede usar un único vector para codificar los polipéptidos de la cadena pesada y ligera. En dichas situaciones, la cadena ligera debe colocarse antes de la cadena pesada para evitar un exceso de cadena pesad libre tóxica (Proudfoot, 1986, Nature 322:52; Kohler, 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:2197). Las secuencias de codificación de las cadenas pesada y ligera pueden comprender ADNc o ADN genómico.
Una vez que el anticuerpo se ha expresado de manera recombinante, puede purificarse usando un método conocido en la técnica para la purificación de un anticuerpo, por ejemplo, mediante cromatografía (por ejemplo, de intercambio de iones, de afinidad, particularmente mediante afinidad por el antígeno específico después de la proteína A, y cromatografía de exclusión molecular), centrifugación, solubilidad diferencial, o mediante cualquier otra técnica normalizada para la purificación de proteínas.
En un ejemplo concreto, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.
En cualquier caso, los anticuerpos híbridos tienen una doble especificidad, preferentemente con uno o más sitios de unión específicos para el hapteno de elección o uno o más sitios de unión específicos para un antígeno diana, por ejemplo, un antígeno asociado con un tumor, una enfermedad autoinmunitaria, un organismo infeccioso, u otra patología.
4.5.2 PRODUCCIÓN DE ANTICUERPOS
Se ilustrará la producción de anticuerpos con referencia a anticuerpos dirigidos contra CD30, pero será evidente para los expertos en la materia que los anticuerpos contra otros miembros de la familia del receptor TNF pueden producirse y modificarse de una manera similar. El uso de CD30 para la producción de anticuerpos es solo ilustrativo y no se pretende que sea limitante.
El antígeno de CD30 a usar para producción de anticuerpos puede ser, por ejemplo, una forma soluble del dominio extracelular de CD30 o una parte del mismo, que contiene el epítopo deseado. Como alternativa, las células que expresan CD30 en su superficie celular (por ejemplo, L540 (linfoma de Hodgkin derivado de una línea de células con un fenotipo de linfocitos T) y L428 (linfoma de Hodgkin derivado de una línea de células con un fenotipo de linfocitos B)) se pueden usar para generar anticuerpos. Serán evidentes para los expertos en la materia otras formas de CD30 útiles para generar anticuerpos.
En otro ejemplo, el antígeno ErbB2 que se va a usar para la producción de anticuerpos puede ser, por ejemplo, una forma soluble del dominio extracelular de ErbB2 o una parte del mismo, que contiene el epítopo deseado. Como alternativa, pueden usarse células que expresan ErbB2 en su superficie celular (por ejemplo células, NIH-3T3 transformadas para expresar en exceso ErbB2; o una línea de células de carcinoma tal como células SK-BR3, véase Stancovski et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:8691-8695 (1991)) para generar anticuerpos. Otras formas de ErbB2 útiles para generar anticuerpos resultarán evidentes para los expertos en la materia.
(i) Anticuerpos policlonales
Los anticuerpos policlonales se hacen aumentar preferentemente en animales mediante múltiples inyecciones subcutáneas (sc) o intraperitoneales (ip) del antígeno relevante y un adyuvante. Puede ser útil conjugar el antígeno relevante con una proteína que es inmunógena en la especie que se va a inmunizar, por ejemplo, hemocianina de lapa californiana, albúmina sérica, tiroglobulina de bovino, o un inhibidor de la tripsina de soja utilizando un agente bifuncional o derivatizante, por ejemplo, éster de maleimidobenzoil sulfosuccinimida (conjugación a través de restos de cisteína), N-hidroxisuccinimida (a través de restos de lisina), glutaraldehído, anhídrido succínico, SOCh, o R1N=C=NR, donde R y R1 son grupos alquilo diferentes.
Los animales se inmunizan frente al antígeno, conjugados inmunógenos, o derivados combinando, por ejemplo, 100 pg o 5 pg de la proteína o conjugado (de conejos o ratones, respectivamente) con 3 volúmenes de adyuvante completo de Freund e inyectando la solución intradérmicamente en múltiples sitios. Un mes después se reforzó a los animales con 1/5 a 1/10 de la cantidad original del péptido o conjugado en adyuvante completo de Freund mediante inyección subcutánea en múltiples sitios. Siete a 14 días después se sangraron los animales y se evaluó el suero para el título de anticuerpos. Los animales se reforzaron hasta la meseta del título. Preferentemente, el animal se reforzó con el conjugado del mismo antígeno, pero se conjugó con una proteína diferente y/o a través de un reactivo de reticulación diferente. Pueden prepararse también conjugados en un cultivo de células recombinantes como proteínas de fusión. También, se usan de forma adecuada agentes de agregación tales como alum para potenciar la respuesta inmunitaria.
(ii) Anticuerpos monoclonales
Se obtienen anticuerpos monoclonales a partir de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos, es decir, los anticuerpos individuales que comprenden la población son idénticos excepto para posibles mutaciones que se producen naturalmente que pueden estar presentes en cantidades menores. Por tanto, el modificador "monoclonal" indica que la naturaleza del anticuerpo no es una mezcla de anticuerpos pequeños.
Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales pueden prepararse usando el método de hibridoma descrito por primera vez por Kohler y col., Nature, 256: 495 (1975), o pueden prepararse mediante métodos de ADN recombinante (Patente de Estados Unidos n.° 4816567).
En el método del hibridoma, se inmuniza un ratón u otro animal hospedador adecuado, tal como un hámster, se inmuniza como se ha descrito anteriormente en el presente documento para estimular a los linfocitos que producen o son capaces de producir anticuerpos que se unirán específicamente a la proteína usada para la inmunización. Como alternativa, los linfocitos pueden inmunizarse in vitro. Después se fusionan los linfocitos con células de mieloma usando un agente de fusión adecuado, tal como polietilenglicol, para formar una célula de hibridoma (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, páginas 59-103 (Academic Press, 1986)).
Las células de hibridoma preparadas de esta forma se siembran y crecen en un medio de cultivo adecuado que contiene preferentemente una o más sustancias que inhiben el crecimiento o la supervivencia de las células de mieloma precursoras no fusionadas. Por ejemplo, si las células de mieloma precursoras carecen de la enzima hipoxantina guanina fosforibosil transferasa (HGPRT o HPRT), el medio de cultivo para los hibridomas normalmente incluirá hipoxantina, aminopterina y timidina (medio HAT), cuyas sustancias evitan el crecimiento de células deficientes en HGPRT.
Las células de mieloma preferidas son aquellas que se fusionan eficazmente, apoyan la producción estable de altos niveles del anticuerpo por las células productoras de anticuerpos seleccionadas, y son sensibles a un medio tal como un medio HAT. Entre estas, las líneas de células de mieloma preferidas son las líneas de mieloma murino, tales como las derivadas de tumores de ratón MOPC-21 y MPC-11 disponibles del Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, California, Estados Unidos y células SP-2 o X63-Ag8-653 disponibles de la American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, Estados Unidos. Se han descrito también las líneas de células de mieloma humano y heteromieloma de ratón-humano para la producción de anticuerpos monoclonales humanos (Kozbor, J. Immunol., 133:3001 (1984); y Brodeur y col., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pág. 51­ 63 (Marcel Dekker, Inc., Nueva York, 1987)).
El medio de cultivo en el que crecen las células de hibridoma se ensaya con respecto a la producción de anticuerpos monoclonales dirigidos contra el antígeno. Preferentemente, la especificidad de unión de los anticuerpos monoclonales producidos por células de hibridoma se determina por inmunoprecipitación o mediante un ensayo de unión in vitro, tal como radioinmunoensayo (RIA) o un enzimoinmunoanálisis de absorción (ELISA). Se puede determinar la afinidad de unión del anticuerpo monoclonal, por ejemplo, determinarse mediante el análisis Scatchard de Munson et al., Anal. Biochem., 107:220 (1980).
Tras identificarse las células de hibridoma que producen anticuerpos con la especificidad, afinidad y/o actividad deseadas, los clones pueden subclonarse mediante procedimientos de dilución limitante y cultivarse mediante métodos convencionales (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, páginas 59-103 (Academic Press, 1986)). Los medios de cultivo adecuados para este fin incluyen, por ejemplo, medio D-MEM o RPMI-1640. Además, las células de hibridoma pueden hacerse crecer in vivo como tumores de líquido ascítico en un animal.
Los anticuerpos monoclonales secretados por los subclones se separan convenientemente del medio de cultivo, fluido ascítico o suero por procedimientos de purificación de anticuerpos convencionales tales como, por ejemplo, proteína A-Sefarosa, cromatografía de hidroxilapatita, electroforesis en gel, diálisis o cromatografía de afinidad.
El ADN que codifica los anticuerpos monoclonales se aísla y secuencia fácilmente utilizando procedimientos convencionales (por ejemplo, utilizando sondas de oligonucleótidos que sean capaces de unirse específicamente a genes que codifica las cadenas pesada y ligera de los anticuerpos de murino). Las células de hibridoma sirven como una fuente preferida de dicho ADN. Una vez aislado, el ADN puede colocarse en vectores de expresión, que se transfectan a continuación en células hospedadoras tales como células de E. coli, células COS de simio, células de ovario de hámster chino (CHO) o células de mieloma que de otro modo no producen proteína de anticuerpo, para obtener la síntesis de anticuerpos monoclonales en las células hospedadoras recombinantes. Los artículos de revisión sobre la expresión recombinante en bacterias de ADN que codifica el anticuerpo incluyen Skerra y col., Curr. Opinion in Immunol., 5:256-262 (1993) y Pluckthun, Immunol. Revs., 130:151-188 (1992).
los anticuerpos monoclonales o fragmentos de anticuerpo pueden aislarse de bibliotecas de fagos de anticuerpo generadas usando las técnicas descritas en McCafferty y col., Nature, 348:552-554 (1990). Clackson y col., Nature, 352:624-628 (1991) y Marks y col., J. Mol. Biol., 222: 581-597 (1991) describen el aislamiento de anticuerpos murinos y humanos, respectivamente, usando bibliotecas de fagos. Las publicaciones posteriores describen la producción de anticuerpos humanos de alta afinidad (intervalo nM) por intercambio de cadenas (Marks y col., Bio/Technology, 10:779-783 (1992)), así como infección combinatoria y recombinación in vivo como una estrategia para construir bibliotecas de fagos muy grandes (Waterhouse y col., Nuc. Acids. Res., 21:2265-2266 (1993)). Por tanto, estas técnicas son alternativas viables a las técnicas de hibridoma de anticuerpos monoclonales tradicionales para aislamiento de anticuerpos monoclonales.
El ADN también puede modificarse, por ejemplo, sustituyendo la secuencia codificante para los dominios constantes de cadena pesada y cadena ligera humana en el lugar de las secuencias murinas homólogas (patente de Estados Unidos n.° 4816567; y Morrison, et al. (1984) Proc. Natl Acad. Sci. USA 81:6851), o mediante la unión covalente a la secuencia de codificación de la inmunoglobulina de toda o parte de la secuencia de codificación para un polipéptido no de inmunoglobulina.
Normalmente dichos polipéptidos no de inmunoglobulina se sustituyen por los dominios constantes de un anticuerpo, o se sustituyen por los dominios variables de un sitio de combinación de antígeno de un anticuerpo para crear un anticuerpo bivalente quimérico que comprende un sitio de combinación de antígeno que tiene especificidad por un antígeno y otro sitio de combinación de antígeno que tiene especificidad por un antígeno diferente.
(iii) Anticuerpos humanizados
Un anticuerpo humanizado puede tener uno o más restos de aminoácidos introducidos en este a partir de una fuente que no es humana. Estos restos de aminoácidos no humanos se citan a menudo como restos "importados", que se toman normalmente de un dominio variable "importado". La humanización se puede realizar esencialmente siguiendo el método de Winter y colaboradores (Jones et al., Nature 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332:323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science 239:1534-1536 (1988)), sustituyendo las secuencias de la región hipervariable por las secuencias correspondientes de un anticuerpo humano. En consecuencia, dichos anticuerpos "humanizados" son anticuerpos quiméricos (patente de Estados Unidos n.° 4.816.567) en los que sustancialmente menos que un dominio variable humano intacto ha sido sustituido por la secuencia correspondiente de una especie no humana. En la práctica, los anticuerpos humanizados son normalmente anticuerpos humanos en los que algunos restos de la región hipervariable y, posiblemente algunos restos de la FR, están sustituidos por restos procedentes de sitios análogos en anticuerpos de roedor.
La elección de dominios variables humanos, tanto ligeros como pesados, para usar en la preparación de los anticuerpos humanizados es muy importante para reducir la antigenicidad. De acuerdo con el procedimiento denominado de “mejor ajuste”, la secuencia del dominio variable de un anticuerpo de roedor se examina respecto toda la biblioteca de secuencias de dominio variable humano conocidas. La secuencia humana que es más cercana a la del roedor se acepta entonces como la región marco conservada humana (FR) para el anticuerpo humanizado (Sims y col., J. Immunol., 151:2296 (1993); Chothia y col., J. Mol. Biol., 196:901 (1987)). Otro procedimiento usa una región marco concreta derivada de la secuencia consenso de todos los anticuerpos humanos de un subgrupo concreto de cadenas ligera o pesada. El mismo marco se puede usar para varios anticuerpos humanizados diferentes (Carter y col.Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992); Presta y col., J. Immunol., 151:2623 (1993)).
Los anticuerpos pueden estar humanizados con la retención de alta afinidad para el antígeno y otras propiedades biológicas favorables. Se pueden preparar anticuerpos humanizados mediante un proceso de análisis de las secuencias precursoras y varios productos humanizados conceptuales usando modelos tridimensionales de las secuencias precursoras y humanizadas. Los modelos tridimensionales de inmunoglobulinas están disponibles habitualmente y son familiares para los expertos en la materia. Se dispone de programas informáticos que ilustran y exponen posibles estructuras conformacionales tridimensionales de secuencias seleccionadas de la inmunoglobulina candidata. La inspección de estas presentaciones permite el análisis del papel probable de los restos en el funcionamiento de la secuencia de inmunoglobulina candidata, es decir, el análisis de los restos que influyen en la capacidad de la inmunoglobulina candidata para unirse a su antígeno. De esta manera, los restos de fR pueden seleccionarse y combinarse a partir de las secuencias receptoras e importadas de tal forma que se logra la característica deseada del anticuerpo, de tal manera que se consigue una afinidad aumentada por el antígeno (o los antígenos) diana. En general, los restos de la región hipervariable están directamente, y más sustancialmente, implicados en la influencia de la unión a antígeno.
Se contemplan diversas formas del anticuerpo humanizado. Por ejemplo, el anticuerpo humanizado puede ser una fragmento de anticuerpo, tal como un Fab. Como alternativa, el anticuerpo humanizado puede ser un anticuerpo intacto, tal como un anticuerpo IgG1 intacto.
Los Ejemplos describen la producción de un anticuerpo humanizado dirigido contra ErbB2 ilustrativo. El anticuerpo humanizado puede, por ejemplo, comprender restos de región hipervariable no humana incorporados en un dominio pesado variable humano y puede comprender además una sustitución de la región marco (FR) en una posición seleccionada del grupo que consiste en 69H, 71H y 73H utilizando el sistema de numeración de dominio variable expuesto en Kabat y col., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991). En una realización, el anticuerpo humanizado comprende sustituciones de FR en dos o todas las posiciones 69H, 71H y 73H. Otros Ejemplo describe la preparación de anticuerpo trastuzumab purificado a partir de la formulación de HERCEPTIN®.
(iv) Anticuerpos humanos
Como una alternativa a la humanización, pueden generarse anticuerpos humanos. Por ejemplo, es ahora posible producir animales transgénicos (por ejemplo, ratones) que son capaces, tras la inmunización, de producir un repertorio completo de anticuerpos humanos en ausencia de producción de inmunoglobulina endógena. Por ejemplo, se ha descrito que la deleción homocigótica del gen de la región de unión de la cadena pesada del anticuerpo (JH) en ratones mutantes quiméricos y de línea germinal da como resultado la inhibición completa de la producción de anticuerpo endógeno. La transferencia de la matriz génica de inmunoglobulina de la línea germinal humana en dichos ratones mutantes de la línea germinal tendrá como resultado la producción de anticuerpos humanos tras la exposición al antígeno. Véanse, por ejemplo, Jakobovits y col., Proc. Natl. Acad. Sci. uSa , 90:2551 (1993); Jakobovits y col., Nature, 362:255-258 (1993); Bruggermann y col., Year in Immuno., 7:33 (1993); y las patentes de Estados Unidos números 5.591.669, 5.589.369 y 5.545.807.
Como alternativa, se puede usar tecnología de expresión en fagos (McCafferty y col., Nature 348: 552-553 (1990)) para producir anticuerpos y fragmentos de anticuerpos humanos in vitro, de repertorios de genes de dominio variable de inmunoglobulina (V) de donantes no inmunizados. De acuerdo con esta técnica, se clonan genes de dominio V de anticuerpo en el marco de un gen de proteína recubierta mayor o menor de un bacteriófago filamentoso, tal como M13 o fd, y se expresan como fragmentos de anticuerpo funcionales en la superficie de la partícula de fago. Debido a que la partícula filamentosa contiene una copia de ADN monocatenario del genoma del fago, las selecciones basadas en las propiedades funcionales del anticuerpo también dan como resultado la selección del gen que codifica el anticuerpo que muestra esas propiedades. Por tanto, el fago imita algunas de las propiedades del linfocito B. La presentación de fagos puede realizarse en diversos formatos; para su revisión véase, por ejemplo, Johnson, Kevin S. y Chiswell, David J., Current Opinion in Structural Biology 3: 564-571 (1993). Pueden usarse varias fuentes de segmentos de genes V para la expresión en fagos. Clackson y col., Nature, 352: 624-628 (1991) aislaron una serie de diversos anticuerpos dirigidos contra oxazolona a partir de una biblioteca combinatoria aleatoria pequeña de genes V derivados de los bazos de ratones inmunizados. Puede construirse un repertorio de genes V de donantes humanos no inmunizados y pueden aislarse anticuerpos para una serie diversa de antígenos (incluyendo auto antígenos) esencialmente siguiendo las técnicas descritas en Marks y col., J. Mol. Biol. 222: 581-597 (1991), o Griffith y col., EMBO J. 12:725-734 (1993). Véanse, también, patentes de Estados Unidos n.° 5565332 y 5573905. Tal como se ha analizado anteriormente, se pueden generar también anticuerpos humanos mediante linfocitos B activados in vitro (véanse las patentes de Estados Unidos números 5567610 y 5229275). Se describen anticuerpo humanos dirigidos contra CD30 en solicitud de patente estadounidense con número de serie 10/338.366.
(v) Fragmentos de anticuerpos
Se han desarrollado diversas técnicas para la producción de fragmentos de anticuerpos. Tradicionalmente, estos fragmentos se obtuvieron mediante digestión proteolítica de anticuerpos intactos (véase, porejemplo, Morimoto et al, Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24: 107-117 (1992); y Brennan et al, Science, 229: 81 (1985)). Sin embargo, estos fragmentos pueden producirse ahora directamente por células hospedadoras recombinantes. Por ejemplo, los fragmentos de anticuerpo pueden aislarse de las bibliotecas de fagos de anticuerpo analizadas anteriormente. Como alternativa, pueden recuperarse fragmentos Fab'-SH recuperados directamente de E. coli y acoplados químicamente para formar fragmentos F(ab')2 (Carter et al., Bio/Technology 10:163-167 (1992)). De acuerdo con otro enfoque, pueden aislarse directamente fragmentos F(ab')2 de cultivo de células hospedadoras recombinantes. Otras técnicas para la producción de fragmentos de anticuerpos serán evidentes para los expertos en la materia. En otras realizaciones, el anticuerpo elegido es un fragmento Fv monocatenario (scFv). Véase el documento WO 93/16185; patente de Estados Unidos n.° 5.571.894; y la patente de Estados Unidos n.° 5.587.458. El fragmento de anticuerpo también puede ser un "anticuerpo lineal", por ejemplo, como se describe en la patente de Estados Unidos N.° 5.641.870, por ejemplo. Dichos fragmentos de anticuerpo lineales pueden ser monoespecíficos o biespecíficos.
(vi) Anticuerpos biespecíficos
Los anticuerpos biespecíficos son anticuerpos que tienen especificidades de unión por al menos dos epítopos diferentes. Los anticuerpos biespecíficos ilustrativos pueden unirse a dos epítopos diferentes de la proteína CD30. Como alternativa, el brazo dirigido contra CD30 puede combinarse con un brazo que se une a los receptores Fc de IgG (FcyR), tales como FcyRI (CD64), FcyRII (CD32) y FcyRIII (CD16) con el fin de centrar los mecanismos de defensa celular en la célula que expresa CD30. También pueden usarse anticuerpos biespecíficos para localizar agentes citotóxicos en células que expresan CD30.
La producción tradicional de anticuerpos biespecíficos de longitud completa se basa en la expresión simultánea de dos parejas de cadena pesada-cadena ligera de la inmunoglobulina, donde las dos cadenas tienen diferentes especificidades (Millstein y co., Nature, 305:537-539 (1983)). Debido a la mezcla aleatoria de las cadenas pesada y ligera de la inmunoglobulina, estos hibridomas (cuadromas) producen una mezcla potencial de 10 diferentes moléculas de anticuerpos, de las cuales solo una tiene la estructura biespecífica correcta. La purificación de la molécula correcta, que normalmente se realiza mediante etapas de cromatografía de afinidad, es demasiado complicada y los rendimientos del producto son bajos. Procedimientos similares están descritos en el documento WO 93/08829 y en Traunecker et al., EMBO J., 10:3655-3659 (1991). De acuerdo con un enfoque diferente, los dominios variables de anticuerpos con las especificidades de unión deseadas (sitios de combinación de anticuerpoantígeno) se fusionan con secuencias de dominio constante de la inmunoglobulina. La fusión es preferentemente con un dominio constante de cadena pesada de la inmunoglobulina, que comprende al menos una parte de las regiones bisagra, CH2 y CH3. Se prefiere tener la primera región constante de la cadena pesada (CH1) que contiene el sitio necesario para la unión con la cadena ligera, presente en al menos una de las fusiones. Los ADN que codifican las fusiones de la cadena pesada de la inmunoglobulina y, si se desea, la cadena ligera de la inmunoglobulina, se inserta en vectores de expresión separados, y se transfecta simultáneamente en un organismo hospedador adecuado. Esto proporciona gran flexibilidad para ajustar las proporciones mutuas de los tres fragmentos de polipéptido en realizaciones en las que proporciones desiguales de las tres cadenas polipeptídicas usadas en la construcción proporcionan los rendimientos óptimos. Es, sin embargo, posible insertar las secuencias codificantes para dos o las tres cadenas polipeptídicas en un vector de expresión cuando la expresión de al menos dos cadenas polipeptídicas en proporciones iguales da como resultado rendimientos elevados o cuando las proporciones no son de significancia particular.
En un ejemplo de este enfoque, los anticuerpos biespecíficos están compuestos por una cadena pesada de la inmunoglobulina híbrida con una primera especificidad de unión en un brazo, y una pareja de cadena pesadacadena ligera de la inmunoglobulina híbrida (que proporciona una segunda especificidad de unión) en el otro brazo. Se ha descubierto que esta estructura asimétrica facilita la separación del compuesto biespecífico deseado de combinaciones de cadena de inmunoglobulina no deseadas, ya que la presencia de una cadena ligera de inmunoglobulina en solo una mitad de la molécula biespecífica proporciona una forma fácil de separación. Este enfoque se divulga en el documento WO/94/04690. Para detalles adicionales acerca de la generación de anticuerpos biespecíficos, véanse, por ejemplo, Suresh et al., Methods in Enzymology, 121:210 (1986).
De acuerdo con otro enfoque descrito en la patente de Estados Unidos n.° 5.731.168, la interfase entre un par de moléculas de anticuerpo se puede diseñar para maximizar el porcentaje de heterodímeros que se recuperan del cultivo de células recombinantes. La interfase preferida comprende al menos una parte del dominio CH3 de un dominio constante de anticuerpo. En este método, una o más cadenas secundarias de aminoácidos pequeños procedentes de la interfase de la primera molécula de anticuerpo se sustituyen con cadenas secundarias más grandes (por ejemplo, tirosina o triptófano). Se crean "cavidades" compensatorias de tamaño idéntico o similar a la(s) gran(des) cadena(s) sobre la interfase de la segunda molécula de anticuerpo sustituyendo secundarias de aminoácidos grandes con unas pequeñas (por ejemplo, alanina o treonina). Esto proporciona un mecanismo para aumentar el rendimiento del heterodímero sobre los productos finales no deseados tales como los homodímeros.
Se han descrito también en la bibliografía las técnicas para generar anticuerpos biespecíficos a partir de fragmentos de anticuerpos. Por ejemplo, los anticuerpos biespecíficos se pueden preparar usando unión química. Brennan y col., Science, 229: 81 (1985) describen un procedimiento en el que los anticuerpos intactos se escinden proteolíticamente para generar fragmentos F(ab')2. Estos fragmentos se reducen en presencia del agente de formación de complejos de ditiol, arsenito sódico, para estabilizar los ditioles vecinales y evitar la formación de disulfuros intermoleculares. Los fragmentos Fab' generados se convierten a continuación en derivados de tionitrobenzoato (TNB). Uno de los derivados de Fab'-TNB se reconvierte a continuación en Fab'-tiol por reducción con mercaptoetilamina y se mezcla con una cantidad equimolar del otro derivado de Fab'-TNB para formar el anticuerpo biespecífico. Los anticuerpos biespecíficos producidos pueden usarse como agentes para la inmovilización selectiva de enzimas.
El progreso reciente ha facilitado la recuperación directa de los fragmentos Fab'-SH de E. coli, que puede estar químicamente acoplado para formar anticuerpos biespecíficos. Shalaby et al., J. Exp. Med, 175:217-225 (1992) describen la producción de una molécula de anticuerpo F(ab')2 específico completamente humanizado. Cada fragmento Fab' se secretó por separado de E. coli y se sometió a acoplamiento químico dirigido in vitro para formar el anticuerpo biespecífico.
También se han descrito diversas técnicas para preparar y aislar fragmentos de anticuerpos biespecíficos directamente del cultivo de células recombinantes. Por ejemplo, se han producido anticuerpos biespecíficos usando cremalleras de leucina. Kostelny et al., J. Immunol., 148(5): 1547-1553 (1992). Los péptidos de la cremallera de leucina de las proteínas Fos y Jun se unieron a las porciones Fab' de dos anticuerpos diferentes mediante fusión génica. Los anticuerpos homodiméricos se redujeron en la región bisagra para formar monómeros y a continuación se volvieron a oxidar para formar los heterodímeros de anticuerpos. Este procedimiento también puede utilizarse para la producción de homodímeros de anticuerpos. La tecnología del "diacuerpo" descrita por Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993) ha proporcionado un mecanismo alternativo para fabricar fragmentos de anticuerpos biespecíficos. Los fragmentos comprenden un dominio variable de cadena pesada (Vh) vinculado a un dominio variable de cadena ligera (Vl) por un enlazador que es demasiado corto para permitir el emparejamiento entre los dos dominios en la misma cadena. En consecuencia, los dominios Vh y Vl de un fragmento se fuerzan a emparejarse con los dominios Vl y Vh complementarios de otro fragmento, formando así dos sitios de unión a antígeno. También se ha notificado otra estrategia para fabricar fragmentos de anticuerpos biespecíficos mediante el uso de dímeros de Fv monocatenarios (sFv). Véase Gruber et al., J. Immunol., 152:5368 (1994).
Se contemplan anticuerpos con más de dos valencias. Por ejemplo, se pueden preparar anticuerpos triespecíficos. Tutt et al. J. Immunol. 147: 60 (1991).
(vii) Otras modificaciones de la secuencia de aminoácidos
Se contemplan la modificación o modificaciones de los anticuerpos descritos en el presente documento. Por ejemplo, puede ser deseable mejorar la afinidad de unión y/u otras propiedades biológicas del anticuerpo. Se preparan variantes de las secuencias de aminoácidos de los anticuerpos introduciendo los cambios de nucleótidos adecuados en el ácido nucleico del anticuerpo, o mediante síntesis peptídica. Tales modificaciones incluyen, por ejemplo, deleciones de, y/o inserciones en y/o sustituciones de, restos en las secuencias de aminoácidos del anticuerpo. Cualquier combinación de deleción, inserción, y sustitución se realiza para llegar a la construcción final, con la condición de que la construcción final posea las características deseadas. Los cambios de aminoácidos pueden alterar también los procesos posteriores a la traducción del anticuerpo, tales como cambiar el número o la posición de los sitios de glicosilación.
Un método útil para la identificación de determinados restos o regiones del anticuerpo que son localizaciones preferentes para la mutagénesis se denomina "mutagénesis de barrido de alanina" como se describe en Cunningham y Wells Science, 244:1081-1085 (1989). Aquí, se identifican un resto o grupo de restos diana (por ejemplo, restos cargados tales como arg, asp, his, lys y glu) y se sustituyen por un aminoácido neutro o cargado negativamente (lo más preferente alanina o polialanina) que influye sobre la interacción de los aminoácidos con el antígeno. Aquellas localizaciones de aminoácidos que demuestran sensibilidad funcional a las sustituciones se refinan a continuación introduciendo variantes adicionales o diferentes en, o para, los sitios de sustitución. Por tanto, aunque se predetermine el sitio para introducir una variación de la secuencia de aminoácidos, la naturaleza de la mutación per se no necesita predeterminarse. Por ejemplo, para analizar el comportamiento de una mutación en un sitio dado, se llevó a cabo el barrido de Ala o la mutagénesis aleatoria en el codón o región diana y se cribaron las variantes de anticuerpos expresadas para la actividad deseada.
Las inserciones de secuencias de aminoácidos incluyen fusiones amino- y/o carboxilo-terminales que varían en longitud desde un resto a polipéptidos que contienen cien o más restos, así como inserciones intrasecuencia de restos de aminoácidos únicos o múltiples. Los ejemplos de inserciones terminales incluyen un anticuerpo con un resto metionilo N terminal o el anticuerpo fusionado a un polipéptido citotóxico. Otras variantes de inserción de la molécula de anticuerpo incluyen la fusión al extremo N o C del anticuerpo a una enzima (por ejemplo, para ADEPT) o un polipéptido que aumenta la semivida en suero del anticuerpo.
Otro tipo de variante es una variante de sustitución de aminoácido. Estas variantes tienen al menos un resto aminoácido en la molécula del anticuerpo sustituido por un resto diferente. Los sitios de mayor interés para la mutagénesis de sustitución incluyen las regiones hipervariables, pero se contemplan también alteraciones de la región FR.
Se logran modificaciones sustanciales en las propiedades biológicas del anticuerpo seleccionando sustituciones que difieren significativamente en su efecto en el mantenimiento (a) de la estructura principal del polipéptido en la zona de la sustitución, por ejemplo, como una conformación de lámina o hélice, (b) la carga o la hidrofobicidad de la molécula en el sitio diana, o (c) el volumen de la cadena lateral. Los restos de origen natural se dividen en grupos basándose en propiedades comunes de la cadena lateral:
(1) hidrófobos: norleucina, met, ala, val, leu, ile;
(2) hidrófilos neutros: cys, ser, thr;
(3) ácidos: asp, glu;
(4) básicos: asn, gln, his, lys, arg;
(5) restos que influyen en la orientación de la cadena: gly, pro; y
(6) aromáticos: trp, tyr, phe.
Las sustituciones no conservativas implicarán el intercambio de un miembro de una de estas clases por otra clase.
Un tipo particularmente preferido de variante de sustitución implica sustituir uno o más restos de la región hipervariable de un anticuerpo precursor (por ejemplo, un anticuerpo humanizado o humano). Generalmente, la(s) variante(s) seleccionada(s) para el desarrollo tendrán propiedades biológicas mejoradas con respecto al anticuerpo precursor a partir del cual se generan. Un modo conveniente de generar dichas variantes de sustitución implican maduración por afinidad utilizando la expresión en fagos. En resumen, algunos sitios de la región hipervariable (por ejemplo, sitios 6-7) están mutados para generar todas las posibles sustituciones de aminoácidos en cada sitio. las variantes de anticuerpos generadas de esta manera se expresan de una manera monovalente a partir de partículas de fagos filamentosos como fusiones con el producto del gen III de M13 empaquetado en cada partícula. Las variantes expresadas en fagos se criban a continuación para su actividad biológica (por ejemplo, afinidad de unión) como se divulga en el presente documento. A fin de identificar los sitios candidatos de la región hipervariable para la modificación, se puede llevar a cabo la mutagénesis de barrido de alanina para identificar restos de regiones hipervariables que contribuyen significativamente a la unión del antígeno. De forma alternativa o adicional, puede ser beneficioso analizar una estructura cristalina del complejo antígeno-anticuerpo para identificar puntos de contacto entre el anticuerpo y el antígeno. Dichos restos de contacto y restos adyacentes son candidatos para la sustitución de acuerdo con las técnicas elaboradas en el presente documento. Una vez que se generan dichas variantes, el panel de variantes se somete a selección como se describe en el presente documento y se pueden seleccionar los anticuerpos con propiedades superiores en uno o más ensayos relevantes para desarrollo adicional.
Puede ser deseable modificar el anticuerpo con respecto a la función efectora, por ejemplo, con el fin de potenciar la citotoxicidad mediada por célula dependiente de antígeno (ADCC) y/o la citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) del anticuerpo. Esto se puede conseguir introduciendo una o más sustituciones de aminoácidos en una región Fc del anticuerpo. De forma alternativa o adicional, pueden introducirse uno o varios restos cisteína en la región Fc, permitiendo de este modo la formación de enlaces disulfuro intercadena en esta región. El anticuerpo homodimérico generado de este modo puede tener una capacidad de internalización mejorada y/o una eliminación de células mediada por complemento y citotoxicidad dependiente de anticuerpo (ADCC) aumentadas. Véase Caron et al. J. Exp Med. 176: 1191-1195 (1992) y Shopes, B. J. Immunol. 148:2918-2922 (1992). También pueden prepararse también anticuerpos homodiméricos con actividad antitumoral potenciada utilizando reticuladores heterobifuncionales como se describe en Wolff y col. Cancer Research 53:2560-2565 (1993). Como alternativa, puede diseñarse mediante ingeniería genética un anticuerpo que tiene regiones Fc dobles y puede de este modo potenciarse la lisis por el complemento y las capacidades de ADCC. Véase Stevenson et al. Anti-Cancer Drug Design 3:219-230 (1989).
Para aumentar la semivida en suero del anticuerpo, se puede incorporar un epítopo de unión al receptor de rescate en el anticuerpo (especialmente un fragmento de anticuerpo) tal como se describe en la patente de Estados Unidos n.° 5739277, por ejemplo. Como se usa en el presente documento, la expresión "epítopo de unión al receptor de rescate" se refiere a un epítopo de la región Fc de una molécula de IgG (por ejemplo, IgG1, IgG2, IgG3, o IgG4) que es responsable de aumentar la semivida en suero de la molécula de IgG in vivo.
(viii) Variantes de glicosilación
Los anticuerpos en el ADC de la invención pueden estar glicosilados en posiciones conservadas en sus regiones constantes (Jefferis y Lund, (1997) Chem. Immunol. 65:111-128; Wright y Morrison, (1997) TibTECH 15:26-32). Las cadenas laterales de oligosacáridos de las inmunoglobulinas alteran la función de la proteína (Boyd et al.,(véanse 1996) Mol. Immunol. 32:1311-1318; Wittwe y Howard, (1990) Biochem. 29:4175-4180), y la interacción intramolecular entre porciones de la glicoproteína que pueden alterar la conformación y la superficie tridimensional presentada de la glicoproteína (Hefferis y Lund, anteriormente; Wyss y Wagner, (1996) Current Opin. Biotech. 7:409-416). Los oligosacáridos pueden servir también para dirigir una glucoproteína dada a determinadas moléculas basándose en las estructuras de reconocimiento específicas. Por ejemplo, se ha notificado que en la IgG agalactosilada, el resto de oligosacárido se 'voltea' hacia fuera del espacio inter- CH2 y los restos de N-acetilglucosamina terminales que quedan disponibles para unirse a la proteína de unión a manosa (Malhotra et al., (1995) Nature Med. 1:237-243). La eliminación por la glicopeptidasa de los oligosacáridos de CAMPATH-1H (un anticuerpo IgG1 monoclonal de murino humanizado recombinante que reconoce el antígeno CDw52 de los linfocitos humanos) producida en células de ovario de hámster chino (CHO) dio como resultado una reducción completa en la lisis mediada por el complemento (CMCL) (Boyd et al.,(1996) Mol. Immunol. 32:1311-1318), mientras que la eliminación selectiva de restos de ácido siálico utilizando neuraminidasa no dio como resultado la pérdida de CMCL. Se ha notificado también que la glicosilación de anticuerpos altera la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC). En particular, células CHO con tetraciclina regularon la expresión de la p(1,4)-N-acetilglucosaminiltransferasa III (GnTIII), se notificó que una glicosiltransferasa que cataliza la formación de GlcNAc bisectora, tenía una actividad ADCC mejorada (Umana et al. (1999) Mature Biotech. 17:176-180).
La glicosilación de anticuerpos es normalmente una unión al átomo de N o una unión al átomo de O. La unión al átomo de N se refiere a la unión del resto de carbohidrato a la cadena lateral de un resto de asparagina. Las secuencias de tripéptido asparagina-X-serina y asparagina-X-treonina, donde X es un aminoácido excepto prolina, son las secuencias de reconocimiento para la unión enzimática del resto de hidrato de carbono a la cadena lateral de asparagina. Por tanto, la presencia de una de estas secuencias de tripéptido en un polipéptido crea un sitio potencial de glucosilación. La glucosilación unida al átomo de O se refiere a la unión de uno de los azúcares N-acetilgalactosamina, galactosa, o xilosa a un hidroxiaminoácido, más comúnmente serina o treonina, aunque también pueden usarse 5-hidroxiprolina o 5-hidroxilisina.
Las variantes de glicosilación de anticuerpos son variantes en las que está alterado el modelo de glicosilación de un anticuerpo. Por alterar se entiende eliminar uno o más de los restos de hidratos de carbono que se encuentran en el anticuerpo, añadiendo uno o más restos de hidratos de carbono al anticuerpo, cambiando la composición de la glicosilación (modelo de glicosilación), la extensión de la glicosilación, etc.
La adición de sitios de glicosilación al anticuerpo se realiza convenientemente alterando la secuencia de aminoácidos de tal forma que contenga una o más de las secuencias de tripéptidos descritas anteriormente (para sitios de glicosilación unida al átomo de N). La alteración puede realizarse también mediante la adición de, o sustitución por, uno o más restos de serina o treonina a la secuencia del anticuerpo original (para sitios de glicosilación unidos a O). De manera similar, la eliminación de sitios de glicosilación puede llevarse a cabo mediante la alteración de aminoácidos en los sitios de glicosilación naturales del anticuerpo.
La secuencia de aminoácidos se altera usualmente alterando la secuencia de ácido nucleico subyacente. Estos métodos incluyen, aunque no de forma limitativa, el aislamiento de una fuente natural (en el caso de variantes de secuencias de aminoácidos que se producen naturalmente) o la preparación mediante mutagénesis mediada por oligonucleótidos (o dirigida a sitio), la mutagénesis mediante la PCR, y la mutagénesis de casete de una variante preparada inicialmente o una versión no variante del anticuerpo.
La glicosilación (incluyendo el modelo de glicosilación) de los anticuerpos puede alterarse también sin alterar la secuencia de aminoácidos o la secuencia de nucleótidos subyacente. La glicosilación depende en gran parte de la célula hospedadora utilizada para expresar el anticuerpo. Debido al tipo de célula utilizado para la expresión de glicoproteínas recombinantes, por ejemplo, anticuerpos, ya que la terapéutica potencial rara vez es la célula nativa, se pueden esperar variaciones significativas en el modelo de glicosilación de los anticuerpos. Véanse, por ejemplo, Hse et al., (1997) J. Biol. Chem. 272:9062-9070. Además de la selección de las células hospedadoras, los factores que alteran la glicosilación durante la producción de anticuerpos recombinantes incluyen el modo de crecimiento, la formulación de medios, la densidad del cultivo, la oxigenación, pH, los esquemas de purificación y similares. Se han propuesto varios métodos para alterar el modelo de glicosilación conseguido en un organismo hospedador concreto incluyendo introducir o expresar en exceso determinadas enzimas implicadas en la producción de oligosacáridos (patentes de Estados Unidos números 5047335; 5510261; 5278299). La glicosilación, o determinados tipos de glicosilación, puede ser eliminada de la glicoproteína, utilizando, por ejemplo, la endoglicosidasa H (Endo H).
Además, la célula hospedadora recombinante puede diseñarse mediante ingeniería genética, por ejemplo, haciendo defectivo el procesamiento de determinados tipos de polisacáridos. Estas técnicas, y técnicas similares son bien conocidas en la materia.
La estructura de la glicosilación de los anticuerpos puede analizarse fácilmente mediante técnicas convencionales de análisis de hidratos de carbono, incluyendo la cromatografía de lectina, RMN, Espectrometría de masas, HPLC, GPC, análisis de composición de monosacáridos, digestión enzimática secuencial, y HPAEC-PAD, que utiliza una cromatografía e intercambio aniónico a pH alto para separar los oligosacáridos basándose en la carga. Se conocen también los métodos para liberar oligosacáridos para fines analíticos, e incluyen, sin limitación, tratamiento enzimático (llevado a cabo comúnmente utilizando la péptido-N-glicosidasa F/endo-p-galactosidasa), eliminación utilizando un ambiente alcalino severo para liberar principalmente las estructuras unidas a átomo de O, y los métodos químicos utilizando hidrazina anhidra para liberar los oligosacáridos unidos a átomos de N y a átomos de O.
4.5.2a CRIBADO DE CONJUGADOS DE ANTICUERPO-FÁRMACO (ADC)
Los animales transgénicos y las líneas de células son particularmente útiles en el cribado de conjugados de anticuerpo fármaco (ADC) que tienen potencial como tratamientos profilácticos o terapéuticos de enfermedades o trastornos que implican la expresión en exceso de proteínas incluyendo Lewis Y, CD30, CD40 e CD70. Los animales transgénicos y las líneas de células son particularmente útiles en el cribado de conjugados de anticuerpo fármaco (ADC) que tienen potencial como tratamientos profilácticos o terapéuticos de enfermedades o trastornos que implican la expresión en exceso de HER2 (US6632979). El cribado de un ADC útil puede implicar administrar ADC candidato en un intervalo de dosis al animal transgénico, y la evaluación en varios puntos temporales del(delos) efecto(s) del ADC sobre la enfermedad o el trastorno que se está evaluando. De forma alternativa o adicional, el fármaco se puede administrar antes de o de manera simultánea con exposición a un inductor de la enfermedad, cuando proceda. El ADC candidato puede cribarse en serie e individualmente, o en paralelo en medio o formato de cribado de alto rendimiento. La velocidad a la cual se puede cribar el ADC para la utilidad de los tratamientos profilácticos o terapéuticos de enfermedades o trastornos está limitada solo por la velocidad de síntesis o la metodología de cribado, incluyendo la detección/medida/análisis de los datos.
Un ejemplo es un método de cribado que comprende (a) trasplantar células de una línea celular estable de cáncer de células renales en un animal no humano, (b) administrar un fármaco ADC candidato al animal no humano y (c) determinar la capacidad del candidato de inhibir la formación de tumores procedentes de la línea de células trasplantadas.
Otro ejemplo es un método de cribado que comprende (a) poner en contacto células de una línea de células de enfermedad de Hodgkin con un fármaco candidato ADC y (b) evaluar la capacidad del ADC candidato de bloquear la actividad del ligando de CD40.
Otro ejemplo es un método de cribado que comprende (a) poner en contacto células de una línea celular de enfermedad de Hodgkin estable con un fármaco candidato ADC y (b) evaluar la capacidad del candidato ADC de inducir la muerte celular. En una realización, se evalúa la capacidad del ADC candidato para inducir la apoptosis. Un ejemplo es un método de cribado que comprende (trasplantar células de una línea celular de cáncer estable a un animal no humano, (b) administrar un fármaco ADC candidato al animal no humano y (c) determinar la capacidad del candidato de inhibir la formación de tumores procedentes de la línea de células trasplantadas. La invención se refiere también a un método de cribar ADC candidatos para el tratamiento de una enfermedad o trastorno caracterizada por la expresión en exceso de HER2 que comprende (a) poner en contacto células a partir de una línea celular de cáncer de mama estable con un fármaco candidato y (b) evaluar la capacidad del ADC candidato de inhibir el crecimiento de la línea celular estable.
Otro ejemplo es un método de cribado que comprende (a) poner en contacto células de una línea de células de cáncer estable con un fármaco candidato ADC y (b) evaluar la capacidad del ADC candidato de bloquear la actividad del ligando de HER2. En una realización, se evalúa la capacidad del ADC candidato de bloquear la unión a heregulina. En otra realización, se evalúa la capacidad del a Dc candidato de bloquear la fosforilación de la tirosina estimulada por el ligando.
Se describe también un método de cribado que comprende (a) poner en contacto células de una línea celular de cáncer estable con un fármaco candidato ADC y (b) evaluar la capacidad del ADC candidato de inducir la muerte celular. En una realización, se evalúa la capacidad del ADC candidato para inducir la apoptosis.
Otro ejemplo es un método de cribado que comprende (a) administrar un fármaco candidato ADC a un mamífero no humano transgénico que expresa en exceso en sus células de las glándulas mamarias una proteína HER2 humana nativa o un fragmento de la misma, en el que dicho mamífero transgénico ha integrado de forma estable en su genoma una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína HER2 humana o un fragmento de la misma que tiene la actividad biológica de HER2 humana nativa, unida operativamente a las secuencias reguladoras de la transcripción dirigiendo su expresión a la glándula mamaria, y desarrolla un tumor de mama que no responde o responde mal al tratamiento con el anticuerpo dirigido contra HER2, o a un animal no humano que transporta un tumor trasplantado procedente de dicho mamífero no humano transgénico; y (b) evaluar el efecto del ADC candidato sobre la enfermedad o trastorno diana. Sin limitaciones, la enfermedad o trastorno puede ser un cáncer que expresa en exceso HER2, tal como cáncer de mama, ovario, estómago, endometrio, glándula salival, pulmón, riñón, colon, tiroides, páncreas y vejiga. El cáncer preferentemente es cáncer de mama que expresa HER2 en al menos aproximadamente 500.000 copias por célula, más preferentemente al menos aproximadamente 2.000.000 copias por célula. Los fármacos candidatos ADC pueden, por ejemplo, evaluarse para su capacidad de inducir la muerte celular y/o la apoptosis, utilizando métodos de ensayo bien conocidos en la técnica, y que se describen a partir de ahora en el presente documento.
En un ejemplo, se cribó el ADC candidato administrándose al animal transgénico en un intervalo de dosis, y se evaluó la respuesta fisiológica del animal a los compuestos en el tiempo. La administración puede ser oral, o mediante inyección adecuada, Dependiendo de la naturaleza química del compuesto que se está evaluando. En algunos casos, puede ser adecuado administrar el compuesto junto con cofactores que potenciarían la eficacia del compuesto. Si se usan las líneas de células derivadas de los animales transgénicos sujeto para cribar los compuestos útiles para tratar diversos trastornos, se añaden los compuestos de ensayo al medio de cultivo celular en un momento adecuado, y se evalúa la respuesta celular al compuesto en el tiempo utilizando los ensayos bioquímicos y/o histológicos adecuados. En algunos casos, puede ser adecuado aplicar el compuesto de interés al medio de cultivo junto con cofactores que potenciarían la eficacia del compuesto.
Por tanto, se proporcionan en el presente documento ensayos para identificar ADC que se dirige específicamente y se une a una proteína diana, cuya presencia está correlacionada con función celular anómala, y en la patogénesis de la proliferación y/o la diferenciación celular que está causalmente relacionada con el desarrollo de tumores.
Para identificar un ADC que bloquea la activación del ligando de un receptor ErbB (por ejemplo, ErbB2), se puede determinar la capacidad del compuesto para bloquear la unión del ligando ErbB a las células que expresan el ErbB (ErbB2) (por ejemplo, en conjugación con otro receptor ErbB con el que el receptor ErbB de interés forma un heterooligómero de ErbB). Por ejemplo, se pueden incubar células aisladas del animal transgénico que expresa en exceso HER2 y transfectarse para expresar otro receptor de ErbB (con el cual HER2 forma un heterooligómero), es decir cultivar, con el ADC y a continuación exponerse al ligando de ErbB marcado. A continuación puede evaluarse la capacidad del compuesto para bloquear la unión del ligando con el receptor de ErbB en el hetero-oligómero de ErbB puede evaluarse después.
Por ejemplo, la inhibición de la unión de la heregulina (HRG) a las líneas celulares de tumor de mama, que expresan en exceso HER2 y establecidas en el presente documento a partir de mamíferos no humanos transgénicos (por ejemplo, ratones), por el ADC candidato puede llevarse a cabo utilizando cultivos monocapa en hielo en un formato de placas de 24 pocillos. Se pueden añadir anticuerpos monoclonales dirigidos contra ErbB2 a cada pocillo e incubarse durante 30 minutos. A continuación puede añadirse rHRGpl 177-224 (25.000 cpm) marcada con 125I, y se puede continuar la incubación durante 4 a 16 horas. Se pueden preparar curvas de respuesta a la dosis y puede calcularse un valor de CI50 (actividad citotóxica) para el compuesto de interés.
De forma alternativa o adicional, Se puede evaluar la capacidad de un ADC para bloquear la fosforilación de tirosina estimulada por el ligando de ErbB de un receptor de ErbB presente en un hetero-oligómero de ErbB. Por ejemplo, se pueden incubar las líneas celulares establecidas procedentes de animales transgénicos con un ADC de ensayo y a continuación ensayarse con respecto a actividad de fosforilación de tirosina dependiente de ligando de ErbB usando un anticuerpo monoclonal (que está conjugado opcionalmente con una marca detectable). Está también disponible el ensayo de activación del receptor de la quinasa descrito en la patente de Estados Unidos n.° 5766863 para determinar la activación del receptor de ErbB y el bloqueo de esa actividad por el compuesto.
En un ejemplo, se puede explorar el ADC que inhibe la estimulación de HRG de fosforilación de tirosina en p180 en células MCF7 esencialmente como se describe a continuación. Por ejemplo, Se puede sembrar en placas una línea celular establecida a partir de un animal transgénico HER2 en placas de 24 pocillos y puede añadirse el compuesto a cada pocilio e incubarse durante 30 minutos a temperatura ambiente; después puede añadirse rHRGp 1177-244 a cada pocillo hasta una concentración final de 0,2 nM, y la incubación puede continuarse durante aproximadamente 8 minutos. Puede aspirarse el medio de cada pocillo, y pueden detenerse las reacciones mediante la adición de 100 pl de tampón de muestra SDS (SDS al 5 %, DTT 25 mM; y Tris-HCl 25 mM, pH 6,8). Cada muestra (25 pl) puede someterse a electroforesis en un gel de un gradiente 4-12 % (Novex) y después transferirse electroforéticamente a una membrana de difluoruro de polivinilideno. Pueden desarrollarse inmunotransferencias antifosfotirosina (a 1 pg/ml), y puede cuantificarse la intensidad de la banda reactiva predominante a Mr -180,000 mediante densitometría de reflectancia. Un método alternativo para evaluar la inhibición de la fosforilación del receptor es el ensayo KIRA (activación del receptor de la quinasa) de Sadick et al. (1998) Jour. of Pharm. and Biomed. Anal. Se puede usar alguno de los anticuerpos monoclonales bien establecidos contra HER2 que son conocidos por inhibir la estimulación de HRG de la fosforilación de la tirosina p180 como control positivo en este ensayo. Puede prepararse una curva de respuesta a la dosis para la inhibición de la estimulación de HRG de la fosforilación de la tirosina p180 como se determina por densitometría de reflectancia y puede calcularse una CI50 para el compuesto de interés.
Se pueden evaluar también los efectos inhibidores del crecimiento de un ensayo ADC sobre líneas de células derivadas de un animal transgénico HERR2, por ejemplo, esencialmente como se describe en Schaefer et al. (1997) Oncogene 15:1385-1394. De acuerdo con este ensayo, las células pueden tratarse con un compuesto de ensayo a varias concentraciones durante 4 días y teñirse con cristal violeta o el colorante redox azul Alamar. La incubación con el compuesto puede mostrar un efecto inhibidor del crecimiento en esta línea celular similar al presentado por el anticuerpo monoclonal 2C4 en células MDA-MB-175 (Schaefer et al., anteriormente). En una realización adicional, la HRG exógena puede no invertir significativamente esta inhibición.
Para identificar los compuestos inhibidores del crecimiento que se dirigen específicamente a un antígeno de interés, se pueden cribar compuestos que inhiben el crecimiento de células cancerosas que expresan en exceso el antígeno de interés derivado de animales transgénicos, se puede llevar a cabo el ensayo descrito en la patente de Estados Unidos n.° 5677171. De acuerdo con este ensayo, las células cancerosas que expresan en exceso el antígeno de interés se hacen crecer en una mezcla 1:1 de F12 y medio DMEM suplementado con suero de feto de bovino al 10 %, glutamina y penicilina estreptomicina. Las células se siembran en placas a 20.000 células en una placa de cultivo celular de 35 mm (placa de 2 ml/35 mm) y se añade el compuesto de ensayo a diversas concentraciones. Después de seis días, se cuenta el número de células, en comparación con las células no tratadas usando un contador de células COULTER™ electrónico. Se pueden seleccionar aquellos compuestos que inhiben el crecimiento celular en aproximadamente un 20-100 % o aproximadamente 50-100 % como compuestos inhibidores del crecimiento.
Para seleccionar los compuestos que inducen la muerte celular, se puede evaluar la pérdida de la integridad de membrana como se indica mediante, por ejemplo, PI, azul tripán o 7AAD con respecto al control. El ensayo de captación de PI utiliza células aisladas del tejido tumoral de interés de un animal transgénico. De acuerdo con este ensayo, las células se cultivan en medio Eagle modificado por Dulbecco (D-MEM):F-12 de Ham (50:50) suplementado con FBS inactivado térmicamente al 10 % (Hyclone) y L-glutamina 2 mM. Por tanto, el ensayo se lleva a cabo en ausencia de complemento y células inmunoefectoras. Se sembraron las células a una densidad de 3 x 106 por placa en placas de 100 x 20 mm y se dejó que se unieran durante la noche. A continuación se retiró el medio y se sustituyó con medio reciente solo o medio que contenía diversas concentraciones del compuesto. Se incubaron las células durante un periodo de tiempo de 3 días. Tras cada tratamiento, las monocapas se lavaron con PBS y se separaron mediante tripsinización. A continuación las células se centrifugaron a 1200 RpM durante 5 minutos a 4 °C, el aglomerado se resuspendió en 3 ml de tampón de unión a Ca2+ frío (Hepes 10 mM, pH 7,4, NaCl 140 mM, CaCh 2,5 mM) y se distribuyeron en alícuotas en tubos de 12 x 75 mm con un tapón de filtro de 35 mm (1 ml por tubo, 3 tubos por grupo de tratamiento) para la eliminación de los grupos de células. A continuación los tubos reciben IP (10 pg/ml). Las muestras se pueden analizar utilizando el citómetro de flujo FACSCAN™ y el programa informático FACSCONVERT™ CellQuest (Becton Dickinson). Aquellos compuestos que inducen niveles estadísticamente significativos de muerte celular, como se determina por la captación de IP pueden seleccionarse como anticuerpos inductores de muerte celular.
Para seleccionar los compuestos que inducen la apoptosis, se llevó a cabo un ensayo de unión a anexina utilizando células establecidas procedentes del tejido tumoral de interés del animal transgénico. Las células se cultivaron y sembraron en placas como se ha analizado en el párrafo anterior. El medio se retiró a continuación y se reemplazó con medio nuevo solo o medio que contenía 10 pg/ml del conjugado del fármaco de anticuerpo (ADC). Tras un periodo de incubación de tres días, las monocapas se lavaron con PBS y se separaron mediante tripsinización. Las células se centrifugaron a continuación, se resuspendieron en tampón de unión con Ca2+ y se distribuyeron en alícuotas en tubos como se ha analizado anteriormente para el ensayo de muerte celular. Los tubos reciben después anexina marcada (por ejemplo anexina V-FTIC) (1 pg/ml). Las muestras pueden analizarse usando un citómetro de flujo FACSAN™ y software FACSCONVERT™ CellQuest (Becton Dickinson). Los compuestos que inducen niveles estadísticamente significativos de unión a anexina en relación con el control se seleccionan como anticuerpos inductores de la apoptosis.
4.5.3 ENSAYOS DE PROLIFERACIÓN CELULAR IN VITRO
En general, la actividad citotóxica o citostática de un conjugado de anticuerpo y fármaco (ADC) se mide: exponiendo las células de mamífero que tenían proteínas receptoras al anticuerpo del ADC en un medio de cultivo celular; cultivando las células durante un periodo de aproximadamente 6 horas a aproximadamente 5 días; y midiendo la viabilidad celular. Se usaron los ensayos in vitro basados en células para medir la viabilidad (proliferación), citotoxicidad, e inducción de la apoptosis (activación de la caspasa) del ADC de la invención.
Se midió la potencia in vitro de los conjugados de fármacos de anticuerpos mediante un ensayo de proliferación celular (Ejemplo 18, Figuras 7-10). El ensayo de viabilidad celular luminiscente CellTiter-Glo® es un método de ensayo homogéneo comercialmente disponible (Promega Corp., Madison, WI), basado en la expresión recombinante de la luciferasa en Coleóptera (patente de Estados Unidos con números 5583024; 5674713 y 5700670). Este ensayo de proliferación celular determina el número de células viables en un cultivo basándose en la cuantificación del a Tp presente, un indicador de las células metabólicamente activas (Crounc et al.(1993) J. Immunol. Meth. 160: 81-88, patente de Estados Unidos n.° 6,602,677). Se llevó a cabo el ensayo CellTiter-Glo® en un formato de 96 pocillos, convirtiéndolo en adecuado para cribado automatizado de alto rendimiento (HTS) (Cree et al (1995) AntiCancer Drugs 6:398-404). El procedimiento de ensayo homogéneo implica añadir el reactivo individual (CellTiter-Glo® Reagent) directamente a células cultivadas en medio suplementado con suero. No se requiere el lavado de las células, la retirada del medio y múltiples etapas de pipeteado. El sistema detecta tan poco como 15 células/pocillo en un formato de 384 pocillos en 10 minutos después de añadir el reactivo y mezclar. Las células se pueden tratar de manera continua con ADC, o se pueden tratar y separar del ADC. En general, las células tratadas de forma breve, es decir, 3 horas, mostraron los mismos efectos de potencia que las células tratadas de forma continua.
El formato de "adición-mezcla-medida" da como resultado la lisis celular y la generación de una señal luminiscente proporcional a la cantidad de ATP presente. La cantidad de ATP es directamente proporcional al número de células presentes en el cultivo. El ensayo CellTiter-Glo® genera una señal luminiscente de "tipo brillo", producida por la reacción de la luciferasa, que tiene una vida media generalmente mayor de cinco horas, dependiendo del tipo de célula y del medio utilizados. Las células viables se reflejan en unidades de luminiscencia relativas (ULR). El sustrato, luciferina de escarabajo, se decarboxila oxidativamente por la luciferasa de luciérnaga recombinante con conversión simultánea de ATP a AMP y generación de fotones. La vida media extendida elimina la necesidad de usar inyectores de reactivos y proporciona flexibilidad para el procesamiento en modo continuo o discontinuo de múltiples placas. Se puede usar este ensayo de proliferación celular con diversos formatos multipocillo, por ejemplo, un formato de 96 o 384 pocillos. Se pueden registrar los datos mediante un luminómetro o un dispositivo de formación de imágenes de una cámara CCD. La salida de la luminiscencia se presenta como unidades de luz relativa (ULR), medida en el tiempo.
Luciferasa
ATP Luciferina 02 --------------- Oxiluciferina+ AMP PPi COz luz
Mg+2 .
Se pueden medir los efectos antiproliferativos de los conjugados de anticuerpo y fármaco mediante la proliferación celular, el ensayo de destrucción celular in vitro contra cuatro diferentes líneas de células de tumores de mama(Figuras 7-10). Se establecieron los valores de CI50 para SK-BR-3 y BT-474 que son conocidas por exprear en exceso la proteína receptora de HER2. La Tabla 2a muestra las mediciones de potencia (CI50) de conjugados de anticuerpo y fármaco ilustrativos en el ensayo de proliferación celular contra células SK-BR-3. La Tabla 2b muestra las mediciones de potencia (CI50) de conjugados de anticuerpo y fármaco ilustrativos en el ensayo de proliferación celular contra células BT-474.
Conjugados de anticuerpo y fármaco: Trastuzumab-MC-vc-PAB-MMAF, 3,8 MMAF/Ab; Trastuzumab-MC-(N-Me)vc-PAB-MMAF, 3,9 MMAF/Ab; Trastuzumab-MC-MMAF, 4,1 MMAF/Ab; Trastuzumab-MC-vc-PAB-MMAB, 4,1 MMAE/Ab; Trastuzumab-MC-vc-PAB-MMAE, 3,3 MMAE/Ab; y Trastuzumab-MC-vc-PAB-MMAF, 3,7 MMAF/Ab no inhibió la proliferación de células MCF-7 (Figura 9).
Conjugados de anticuerpo y fármaco: Trastuzumab-MC-vc-PAB-MMAE, 4,1 MMAE/Ab; Trastuzumab-MC-vc-PAB-MMAE, 3,3 MMAE/Ab; Trastuzumab-MC-vc-PAB-MMAF, 3,7 MMAF/Ab; Trastuzumab-MC-vc-PAB-MMAF, 3,8 MMAF/Ab; Trastuzumab-MC-(N-Me)vc-PAB-MMAF, 3,9 MMAF/Ab; y Trastuzumab-MC-MMAF, 4,1 MMAF/Ab no inhibió la proliferación de células MDA-MB-468 (Figura 10).
las células MCF-7 y MDA-MB-468 no expresan en expresa en exceso la proteína del receptor HER2. Los conjugados de fármaco y anticuerpo dirigido contra HER2 descritos en el presente documento muestran, por tanto, selectividad para la inhibición de las células que expresan HER2.
Tabla 2a células SK-BR-3
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Tabla 2b células BT474
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En un descubrimiento sorprendente e inesperado, la actividad de proliferación celular in vitro da como resultado el ADC en las Tablas 2a y 2b muestra generalmente que ADC con un número promedio bajo de restos de fármaco por anticuerpo mostró eficacia, por ejemplo, CI50 < 0,1 pg de ADC/ml. El resultado sugiere que al menos para el ADC de trastuzumab, la relación óptima de restos de fármaco por anticuerpo puede ser menor de 8, y puede ser aproximadamente 2 a aproximadamente 5.
4.5.4 ACLARAMIENTO Y ESTABILIDAD DEL PLASMA IN VIVO
Se investigaron la farmacocinética de aclaramiento del plasma y la estabilidad de ADC en ratas y en macacos. Se midió la concentración del plasma en el tiempo. La Tabla 2c muestra los datos farmacocinéticos de los conjugados de anticuerpo fármaco y otras muestras dosificadas en ratas. Las ratas son un modelo no específico para los anticuerpos del receptor ErbB, debido a que no se sabe que la rata exprese proteínas del receptor de HER2.
Tabla 2c Farmacocinética en ratas H = trastuzumab unido mediante una cisteína [cys] excepto donde se indica una i 2 m k x n in i
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ABC inf es el área bajo la curva de concentración-tiempo en plasma desde el momento de la dosificación hasta el infinito y es una medida de la exposición total a la entidad medida (fármaco, ADC). CL se define como el volumen de plasma aclarado de la entidad medida en tiempo unitario y se expresa normaliza a peso corporal. El término T1/2 es la semivida del fármaco en el cuerpo medida durante su fase de eliminación. El término % Conj. es la cantidad relativa de ADC en comparación con el anticuerpo total detectado, mediante ensayos de inmunoafinidad ELISA separados ("Analytical Methods for Biotechnology Products", Ferraiolo et al, págs 85-98 en Pharmacokinetics of Drugs (1994) P.G. Welling and L.P. Balant, Eds., Handbook of Experimental Pharmacology, Vol. 110, Springer-Verlag. El cálculo de % Conj. es simplemente ABCinf de ADC ABCinf de Ab total, y es un indicador general de la estabilidad del enlazador, aunque pueden tener efecto otros factores y mecanismos.
La Figura 11 muestra un gráfico de un estudio de aclaramiento de la concentración de plasma tras la administración de los conjugados de anticuerpo fármaco: H-MC-vc-PAB-MMAF-TEG y H-MC-vc-PAB-MMAF en ratas Sprague-Dawley. Las concentraciones de anticuerpo total y ADC se midieron con el tiempo.
La Figura 12 muestra un gráfico de un estudio en dos etapas de aclaramiento de la concentración en plasma donde se administró ADC en diferentes dosificaciones y se midieron las concentraciones de anticuerpo total y ADC en el tiempo.
EFICACIA IN VIVO
Se midió la eficacia in vivo del ADC de la invención mediante el modelo de ratón del explante transgénico de HER2 de alta expresión. Se propagó un aloinjerto procedente del ratón transgénico Fo5 mmtv que no responde a, o responde mal a, tratamiento con HERCEpTIN®. Se trataron los sujetos una vez con ADC y se controlaron durante 3­ 6 semanas para medir el tiempo hasta la duplicación del tumor, destrucción logarítmica de células, y acortamiento del tumor. Se llevaron a cabo el seguimiento de la respuesta a la dosis y experimentos multidosis.
Los tumores surgen fácilmente en ratones transgénicos que expresan una forma activada mutacionalmente de neu, el homólogo de rata de HER2, pero el HER2 que está expresado en exceso en cánceres de mama no está mutado y la formación del tumor es mucho menos sólida en ratones transgénicos que expresan en exceso HER2 no mutado (Webster et al. (1994) Semin. Cáncer Biol. 5:69-76).
Para mejorar la formación del tumor con HER2 no mutado, se produjeron ratones transgénicos utilizando ADNc plásmido de HER2 en el que se eliminó un ATG en la dirección 5' a fin de evitar el inicio de la traducción en dichos codones ATG en la dirección 5', que de otra forma reducirían la frecuencia del inicio de la traducción desde el codón de inicio auténtico en la dirección 3' de HER2 (por ejemplo, véase Child et al. (1999) J. Biol. Chem. 274: 24335­ 24341). Adicionalmente, se añadió un intrón quimérico al extremo 5', que debería potenciar también el nivel de expresión como se ha notificado anteriormente (Neuberger y Williams (1988) Nucleic Acids Res. 16: 6713; Buchman y Berg (1988) Mol. Cell. Biol. 8:4395; Brinster et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:836). El intrón quimérico se derivó de un vector de Promega, el vector de expresión en mamífero pCI-neo (pb 890-1022). El extremo 3' del ADNc está flanqueado por los exones 4 y 5 de la hormona de crecimiento humana y las secuencias de poliadenilación. Por otra parte, se usaron ratones FVB debido a que esta cepa es más susceptible al desarrollo del tumor. Se usó el promotor de MMTV-LTR para asegurar la expresión de HER2 específico de tejido en la glándula mamaria. Se alimentaron los animales con la dieta AIN 76A a fin de aumentar la susceptibilidad a la formación del tumor (Rao et al. (1997) Breast Cancer Res. and Treatment 45:149-158).
Tabla 2d Mediciones del tumor en un modelo de aloinjerto en ratón - Tumor de mama MMTV-HER2 Fo5, una única dosis de ratones lampiños atímicos en el día 1 (T = 0) excepto donde se indica H = trastuzumab unido mediante una
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El término Ti es el número de animales en el grupo de estudio a T =04 animales totales en el grupo. El término PR es el número de animales que consiguen una remisión parcial del tumor animales con tumor en T = 0 en el grupo. El término CR es el número de animales que alcanzan una remisión completa del tumor animales con tumor en T = 0 en el grupo. La expresión destrucción logarítmica de células es el tiempo en días para que se duplique el volumen del tumor - el tiempo en días para el volumen tumoral del control para que se divida a la mitad por 3,32 X para que se duplique el volumen tumoral en los animales del control (dosificados con vehículo). El cálculo de la destrucción logarítmica de células tiene en cuenta el retraso en el crecimiento del tumor resultante del tratamiento y el tiempo de duplicación del volumen tumoral del grupo del control. La actividad antitumoral de ADC se clasifica con valores de destrucción logarítmica de células de:
> 3,4 (muy activo)
= 2,5-3,4
+ = 1,7-2,4
= 1,0-1,6
inactivo = 0
La Figura 13 muestra el cambio promedio de volumen tumoral con el tiempo en ratones lampiños atímicos con aloinjertos del tumor mamario MMTV-HER2 Fo5 que recibieron dosis el Día 0 con: Vehículo, Trastuzumab-MC-vc-PAB-MMAE (1250 pg/m2) y Trastuzumab-MC-vc-PAB-MMAF (555 pg/m2). (H = Trastuzumab). Se retardó el crecimiento de los tumores mediante el tratamiento con ADC en comparación con el nivel de crecimiento del control (Vehículo). La Figura 14 muestra el cambio promedio de volumen tumoral con el tiempo en ratones lampiños atímicos con aloinjertos del tumor mamario MMTV-HER2 Fo5 que recibieron dosis el Día 0 con 10 mg/kg de (660 pg/m2) de Trastuzumab-MC-MMAE y 1250 pg/m2 de Trastuzumab-MC-vc-PAB-MMAE. La Figura 15 muestra el cambio promedio de volumen tumoral con el tiempo en ratones lampiños atímicos con aloinjertos del tumor mamario MMTV-HER2 Fo5 que recibieron dosis de 650 pg/m2 de trastuzumab-MC-MMAF. La Tabla 2d y las Figuras 13-15 muestran que el ADC tiene una fuerte actividad antitumoral en el aloinjerto de un tumor positivo para HERR2 (Fo5) que surge originalmente en un ratón transgénico MMTV-HER2. el anticuerpo solo (por ejemplo, Trastuzumab) no tiene una actividad antitumoral significativa en este modelo (Erickson et al. patente de Estados Unidos n.° 6632979). Como se ilustra en las Figuras 13-15, se retardó el crecimiento de los tumores mediante el tratamiento con ADC en comparación con el nivel de crecimiento del control (Vehículo).
En un descubrimiento sorprendente e inesperado, la actividad antitumoral in vivo resultante del ADC en la Tabla 2d muestra generalmente que ADC con un número promedio bajo de restos de fármaco por anticuerpo, mostró eficacia, por ejemplo, tiempo de duplicación del tumor > 15 días destrucción logarítmica de células promedio > 1,0. La Figura 16 muestra que para el conjugado de anticuerpo fármaco, trastuzumab-MC-vc-PAB- MMAF, el volumen tumoral medio disminuyó y no progresa cuando la relación MMAF:trastuzumab era 2 y 4, mientras que el tumor progresó en una relación de 5,9 y 6, pero a una velocidad inferior que la del vehículo (tampón). La velocidad de progresión en este modelo de xenoinjerto de ratón fue aproximadamente la misma, es decir, 3 días, para el vehículo y trastuzumab. El resultado sugiere que al menos para el ADC de trastuzumab, la relación óptima de restos de fármaco por anticuerpo puede ser menor de aproximadamente 8, y puede ser aproximadamente 2 a aproximadamente 4.
4.5.5 TOXICIDAD EN ROEDORES
Se evaluaron los conjugados de anticuerpo y fármaco, y un control ADC-menos, "Vehículo", en un modelo de toxicidad aguda en rata. Se investigó la toxicidad de los ADC mediante el tratamiento de ratas Sprague-Dawley macho y hembra con los ADC y la posterior inspección y análisis de los efectos sobre varios órganos. Las observaciones ordinarias incluyen cambios en los pesos corporales y signos de lesiones y sangrado. Se llevaron a cabo los parámetros de la patología clínica (química sérica y hematología), histopatología, y necropsia en animales que se habían dosificado.
Se considera que la pérdida de peso, o el cambio de peso con respecto a los animales a los que se dosificó solo con vehículo, en animales tras la dosificación con ADC es un indicador ordinario y general de toxicidad sistémica o localizada. Las Figuras 17-19 muestran los efectos de diversos ADC y el control (vehículo) tras la dosificación en el peso corporal de la rata.
Se midió la hepatotoxicidad por la elevada concentración de enzimas hepáticas, los elevados números de figuras mitóticas y apoptóticas y la necrosis de los hepatocitos. Se observó toxicidad hematolinfoide por el agotamiento de leucocitos, principalmente granulocitos (neutrófilo), y/o plaquetas, y la implicación de órganos linfoides, es decir, atrofia o actividad apoptótica. Se notificó también toxicidad debida a lesiones en el tracto gastrointestinal tales como números elevados de figuras mitóticas y apoptóticas y enterocolitis degenerativa.
Las enzimas indicadoras de lesión hepática que se estudiaron incluyen:
AST (aspartato aminotransferasa)
- Localización: citoplásmica; hígado, corazón, músculo esquelético, riñón
- Relación hígado:plasma de 7000:1
- T1/2: 17 h
ALT (alanina aminotransferasa)
- Localización: citoplásmica; hígado, riñón, corazón, músculo esquelético
- Relación hígado:plasma de 3000:1
- T1/2: 42 h; variación diurna
GGT (g-glutamil transferasa)
- Localización: membrana plasmática de células con elevada capacidad secretora o absortiva; hígado, riñón, intestino
- Mal predictor de lesión hepática; comúnmente elevado en los trastornos de los conductos biliares
Se estudiaron los perfiles de toxicidad de trastuzumab-MC-val-cit-MMAF, trastuzumab-MC(Me)-val-cit-PAB-MMAF, trastuzumab-MC-MMAF y trastuzumab-MC-val-cit-PAB-MMAF en ratas Sprague-Dawley hembras (Ejemplo 19). El anticuerpo trastuzumab humanizado no se une de forma apreciable al tejido de rata, y cualquier se consideraría no específica. Las variantes a niveles de dosis de 840 y 2105 ug/m2 de MMAF se compararon con trastuzumab-MC-valcit-PAB-MMAF a 2105 ug/m2.
Los animales en los grupos 1, 2, 3, 4, 6, y 7 (Vehículo, 9,94 y 24,90 mg/kg de trastuzumab-MC-val-cit-MMAF, 10,69 mg/kg de trastuzumab-MC(Me)-val-cit-PAB-MMAF, y 10,17 y 25,50 mg/kg de trastuzumab-MC-MMAF, respectivamente) ganaron peso durante el estudio. Los animales en los grupos 5 y 8 (26,78 mg/kg de trastuzumab-MC(Me)-val-cit-PAB-MMAF y 21,85 mg/kg de trastuzumab-MC-val-cit-PAB-MMAF, respectivamente) perdieron peso durante el estudio. En el Día del estudio 5, el cambio en los pesos corporales de los animales en los grupos 2, 6 y 7 no fueron significativamente diferentes de los animales del grupo 1. El cambio en los pesos corporales de los animales en los grupos 3, 4, 5 y 8 fueron estadísticamente diferentes de los animales del grupo 1 (Ejemplo 19).
Las ratas tratadas con trastuzumab-MC-MMAF (grupos 6 y 7) fueron indistinguibles de los animales del control tratados con vehículo en ambos niveles de dosis; es decir, este conjugado mostró un perfil de seguridad superior en este modelo. Las ratas tratadas con trastuzumab-MC-val-cit-MMAF (sin el resto PAB autoinmolable; grupos 2 y 3) mostró cambios dependientes de la dosis típicos de conjugados MMAF; la extensión de los cambios fue menor en comparación de un conjugado MC-val-cit-PAB-MMAF de longitud completa (grupo 8). Los recuentos de plaquetas en el día 5 fueron a aproximadamente el 30 % de los valores iniciales en los animales del grupo 3 (dosis alta de trastuzumab-MC-val-cit-MMAF) en comparación con el 15 % en los animales del grupo 8 (dosis alta de trastuzumab-MC-valcit-PAB-MMAF). Elevación de las enzimas hepáticas AST y ALT, de bilirrubina y la extensión de la trombocitopenia fue más evidente en animales tratados con trastuzumab-MC(Me)-val-cit-PAB-MMAF (grupos 4 y 5) de una manera dependiente de la dosis; los animales del grupo 5 (grupo de dosis alta) mostraron niveles de ALT en el día 5 de aproximadamente 10x el valor inicial y se redujeron las plaquetas en aproximadamente el 90 % en el momento de la necropsia.
Se dosificaron también ratas Sprague Dawley hembras a altos niveles (Ejemplo 19, estudio de dosis alta: Grupos 2, 3, 4) con trastuzumab-MC-MMAF, y vehículo del control (Grupo 1). Se observaron leves señales de toxicidad, incluyendo una elevación dependiente de la dosis de enzimas hepáticas ALT, AST y GOT. En el día 5, los animales en el grupo de la dosis más alta mostraron una elevación de 2 veces de ALT y una elevación de 5 veces de AST; GGT es también elevada (6U/I). Los niveles de la enzima muestran una tendencia hacia la normalización en el día 12. Hubo una granulocitosis leve en los tres grupos de dosis en el día 5, el recuento de plaquetas permaneció esencialmente sin cambiar en todos los animales. Los cambios morfológicos fueron leves; los animales tratados al nivel de dosis de 4210 pg/m2 (Grupo 2) mostraron una histología no remarcable del hígado, bazo, timo, los intestinos y la médula ósea. Se observó una actividad apoptótica y mitótica aumentada levemente en el timo y el hígado, respectivamente en animales tratados al nivel de dosis de 5500 pg/m2 (Grupo 3). La médula ósea era normocelular, pero mostró evidencias de hiperplasia granulocítica, que es consistente con la granulocitosis absoluta observada en los recuentos de sangre periférica en estos animales. Los animales a la dosis más elevada en el grupo 4 mostraron cualitativamente las mismas características; la actividad mitótica en el hígado aparece algo aumentada en comparación con los animales en el Grupo 3. También, se observó hematopoyesis extramedular en el bazo y el hígado.
EphB2R es un receptor de la tirosina quinada TM de tipo 1 con una estrecha homología entre ratón y ser humano, y se expresa en exceso en las células del cáncer colorrectal. 2H9 es un anticuerpo contra EphB2R. El anticuerpo puro no tiene efecto sobre el crecimiento del tumor, pero las células que expresan EphB2R destruyeron 2H9-val-cit-MMAE y mostraron eficacia en un modelo de xenoinjerto de ratón que utiliza tumores CXF1103 de colon humano (Mao et al (2004) Cancer Res. 64:781-788). 2H9 y 7C2 son anticuerpos de IgG 1 de ratón dirigidos contra HER2. Se compararon los perfiles de toxicidad de 2H9-MC-val-cit-PAB-MMAF (3.7 MMAF/Ab), 7C2-MC-val-cit-PAB-MMAF (4 MMAF/Ab), y trastuzumab-MC-val-cit-PAB-MMAF (5.9 MMAF/Ab). Las diferencias en la estructura de cada inmunoconjugado o la porción de fármaco del inmunoconjugados pueden alterar la farmacocinética y en última instancia, el perfil de seguridad. El anticuerpo trastuzumab humanizado no se une de forma apreciable al tejido de rata, y cualquier toxicidad se consideraría no específica.
TOXICIDAD/SEGURIDAD EN MACACOS
De forma similar a la del estudio de toxicidad/seguridad en rata, se trataron los macacos con ADC seguido por mediciones de la enzima hepática, y la inspección y el análisis de los efectos sobre varios órganos. Las observaciones ordinarias incluyen cambios en los pesos corporales y signos de lesiones y sangrado. Se llevaron a cabo los parámetros de la patología clínica (química sérica y hematología), histopatología, y necropsia en animales que se habían dosificado (Ejemplo n.° 19).
El conjugado de anticuerpo fármaco, H-MC-vc-PAB-MMAE (H = trastuzumab unido a través de cisteína) no mostró evidencias de toxicidad hepática en cualquiera de los niveles de dosis ensayados. Los granulocitos de la sangre periférica mostraron agotamiento tras una única dosis de 1100 mg/m2 con recuperación completa 14 días después de la dosis. el conjugado de anticuerpo fármaco H-MC-vc-PAB-MMAF mostró elevación de las enzimas hepáticas a un nivel de dosis de 550 (transitorio) y 880 mg/m2, no hubo evidencias de granulocitopenia y disminución transitoria (grupos 2 y 3) de plaquetas dependiente de la dosis.
4.6 SÍNTESIS DE LOS COMPUESTOS DESCRITOS EN EL PRESENTE DOCUMENTO
Los Compuestos ilustrativos y los Conjugados ilustrativos se pueden preparar usando los procedimientos sintéticos detallados a continuación en los Esquemas 5-16. Como se describe con mayor detalle a continuación, los Compuestos ilustrativos o los Conjugados ilustrativos se pueden preparar cómodamente usando un Enlazador que tiene un sitio reactivo para la unión al Fármaco y al Ligando. En un ejemplo, un Enlazador tiene un sitio reactivo que tiene un grupo electrófilo que reacciona con un grupo nucleófilo presente en una unidad de ligando, tal como aunque no de forma limitativa, a un anticuerpo. Los grupos nucleófilos útiles en un anticuerpo incluyen, pero no se limitan a, los grupos sulfhidrilo, hidroxilo y amino. El heteroátomo del grupo nucleófilo de un anticuerpo reacciona con un grupo electrófilo de un Enlazador y constituye un enlace covalente con una unidad enlazadora. Los grupos electrófilos útiles incluyen, aunque no de forma limitativa, grupos maleimida y haloacetamida. El grupo electrófilo proporciona un sitio cómodo para unión del anticuerpo.
En otro ejemplo, un Enlazador tiene un sitio reactivo que tiene un grupo nucleófilo que es reactivo con un grupo electrófilo presente en un anticuerpo. Los grupos electrófilos de un anticuerpo útiles incluyen, aunque no de forma limitativa, grupos carbonilo de aldehídos y acetonas. El heteroátomo de un grupo nucleófilo de un Enlazador puede reaccionar con un grupo electrófilo de un anticuerpo y formar un enlace covalente con el anticuerpo. Los grupos nucleófilos de un Enlazador incluyen, aunque no de forma limitativa, hidrazida, oxima, amino, hidrazina, tiosemicarbazona, hidrazina carboxilato, y arilhidrazida. El grupo electrófilo de un anticuerpo proporciona un sitio cómodo para su unión con un Enlazador.
Los grupos funcionales de ácido carboxílico y los grupos funcionales de cloroformiato son también sitios reactivos para un Enlazador ya que pueden reaccionar con grupos amino secundarios de un Fármaco para formar un enlace amida. También útil como sitio reactivo es un grupo funcional de carbonato de un Enlazador, tal como aunque no de forma limitativa carbonato de p-nitrofenilo, que puede reaccionar con un grupo amino de un Fármaco, tal como, aunque no de forma limitativa, N-metil valina, para formar un enlace carbamato. Normalmente, los fármacos basados en péptidos se pueden preparar formando un enlace peptídico entre dos o más aminoácidos y/o fragmentos de péptido. Dichos enlaces peptídicos se pueden preparar, por ejemplo, de acuerdo con el método de síntesis en fase líquida (véase E. Schrorler y K. Lubke, "The Peptides", volumen 1, págs. 76-136, 1965, Academic Press) que es bien conocido en el campo de la química de péptidos.
La síntesis de una unidad ensanchadora ilustrativa que tiene un grupo maleimida electrófilo se ilustra más adelante en los Esquemas 8-9. Los métodos sintéticos generales útiles para la síntesis de un Enlazador se describen en el Esquema 10. El Esquema 11 muestra la construcción de un Enlazador que tiene un grupo val-cit, un grupo maleimida electrófilo y un grupo Separador autoimolable de PAB. El Esquema 12 representa gráficamente la síntesis de un Enlazador que tiene un grupo phe-lys, un grupo maleimida electrófilo, con y sin el grupo Separador autoimolable de PAB. El Esquema 13 presenta un detalle general para la síntesis de un Compuesto de fármacoenlazador, mientras que el Esquema 14 presenta una ruta alternativa para preparar un Compuesto de fármacoenlazador. El Esquema 15 representa gráficamente la síntesis de un enlazador ramificado que contiene un grupo BHMS. El Esquema 16 detalla la unión de un anticuerpo con el Compuesto de fármaco-enlazador para formar un Conjugado de fármaco-enlazador-anticuerpo, y el Esquema 14 ilustra la síntesis de los Conjugados de fármacoenlazador-anticuerpo que tienen, por ejemplo, aunque no de forma limitativa, 2 o 4 fármacos por anticuerpo.
Como se describe con mayor detalle a continuación, los Conjugados ilustrativos se preparan cómodamente usando un Enlazador que tiene dos o más sitios reactivos para la unión al Fármaco y al Ligando. En un ejemplo, un Enlazador tiene un sitio reactivo que tiene un grupo electrófilo que reacciona con un grupo nucleófilo presente en una unidad de ligando, tal como un anticuerpo. Los grupos nucleófilos útiles en un anticuerpo incluyen, pero no se limitan a, los grupos sulfhidrilo, hidroxilo y amino. El heteroátomo del grupo nucleófilo de un anticuerpo reacciona con un grupo electrófilo de un Enlazador y constituye un enlace covalente con una unidad enlazadora. Los grupos electrófilos útiles incluyen, aunque no de forma limitativa, grupos maleimida y haloacetamida. El grupo electrófilo proporciona un sitio cómodo para unión del anticuerpo.
En otro ejemplo, un Enlazador tiene un sitio reactivo que tiene un grupo nucleofílico que reacciona con un grupo electrófilo presente en un Ligando, tal como un anticuerpo. Los grupos electrófilos de un anticuerpo útiles incluyen, aunque no de forma limitativa, grupos carbonilo de aldehídos y acetonas. El heteroátomo de un grupo nucleófilo de un Enlazador puede reaccionar con un grupo electrófilo de un anticuerpo y formar un enlace covalente con el anticuerpo. Los grupos nucleófilos de un Enlazador incluyen, aunque no de forma limitativa, hidrazida, oxima, amino, hidrazina, tiosemicarbazona, hidrazina carboxilato, y arilhidrazida. El grupo electrófilo de un anticuerpo proporciona un sitio cómodo para su unión con un Enlazador.
4.6.1 SÍNTESIS DE RESTOS DE FÁRMACO
Normalmente, los fármacos basados en péptidos se pueden preparar formando un enlace peptídico entre dos o más aminoácidos y/o fragmentos de péptido. Dichos enlaces peptídicos se pueden preparar, por ejemplo, de acuerdo con el método de síntesis en fase líquida (véase E. Schroder y K. Lubke,"The Peptides", volumen 1, págs. 76-136, 1965, Academic Press) que es bien conocido en el campo de la química de péptidos.
Los restos de fármaco auristatina/dolastatina se pueden preparar de acuerdo con los métodos generales de: patente de Estados Unidos n.° 5635483; patente de Estados Unidos n.° 5780588; Pettit et al. (1989) J. Am. Chem. Soc.
111:5463-5465; Pettit et al. (1998) Anti-Cancer Drug Design 13:243-277; y Pettit y col. (1996) J. Chem. Soc. Perkin Trans. 15:859-863.
En un ejemplo, un Fármaco se prepara combinando aproximadamente un equivalente estequiométrico de un dipéptido y un tripéptido, preferentemente en una reacción en un solo recipiente en condiciones de condensación adecuadas. Este enfoque se ilustra en los Esquemas 5-7, a continuación.
El Esquema 5 ilustra la síntesis de una unidad de tripéptido F en el extremo N que es un intermedio útil para la síntesis de compuestos de fármaco de Fórmula Ib.
Figure imgf000096_0001
Como se ilustra en el Esquema 5, un aminoácidos protegido A (donde PG representa un grupo protector de amina, R4 se selecciona entre hidrógeno, alquilo C1-C8, carbociclo C3-C8, -O-(alquilo C1-C8), -arilo, alquilarilo, alquilo-(carbociclo C3-C8), heterociclo C3-C8, alquil-(heterociclo C3-C8) en la que R5 se selecciona entre H y metilo; o R4 y R5 juntos, tienen la fórmula -(CRaRb)n- en la que Ra y Rb se seleccionan independientemente entre hidrógeno, alquilo C1-C8 y carbociclo C3-C8 y n se selecciona entre 2 3, 4, 5 y 6 y forma un anillo con el átomo de carbono al que están unidos) se acopla con el í-butil éster B (donde R6 se selecciona entre -H y -alquilo C1-C8; y R7 se selecciona entre hidrógeno, alquilo C1-C8, carbociclo C3-C8, -O-(alquilo C1-C8), -arilo, alquilarilo, alquilo-(carbociclo C3-C8), heterociclo C3-C8 y alquil-(heterociclo (C3-C8)) en condiciones de acoplamiento adecuadas, por ejemplo, en presencia de PyBrop y diisopropiletilamina, o mediante el uso de DCC (véase, por ejemplo, Miyazaki, K. et. al. Chem. Pharm. Bull. 1995, 43(10), 1706-1718).
Los grupos protectores PG adecuados, y los métodos sintéticos adecuados para proteger un grupo amino con un grupo protector son bien conocidos en la técnica. Véanse, por ejemplo, Greene, T.W. y Wuts, P.G.M., Protective Groups in Organic Synthesis, 2.a edición, 1991, John Wiley & Sons. Los aminoácidos protegidos ilustrativos A son PG-Ile y, particularmente, PG-Val, mientras que otros aminoácidos protegidos incluyen, aunque de forma no limitativa: PG-ciclohexilglicina, PG-ciclohexilalanina, PG-ácido aminociclopropano-1-carboxílico, PG-ácido aminoisobutírico, PG-fenilalanina, PG-fenilglicina, y PG-ferc-butilglicina. Z es un grupo protector ilustrativo. Fmoc es un grupo protector ilustrativo. Un f-butil éster B ilustrativo es dolaisoleuina f-butil éster.
El dipéptido C se puede purificar, por ejemplo, usando cromatografía, y posteriormente desprotegerse, por ejemplo, usando H2 y Pd al 10 % en C en etanol cuando PG es benciloxicarbonilo, o usando dietilamina para la eliminación de un grupo protector de Fmoc. La amina resultante D forma rápidamente un enlace peptídico con un aminoácido BB (el que R1 se selecciona entre -H, alquilo C1-C8 y carbociclilo C3-C8; y R2 se selecciona entre -H y -alquilo C1-C8; o R1 y R2 juntos, tienen la fórmula -(CRaRb)n- en la que Ra y Rb se selecciona independientemente entre -H, -alquilo C1-C8 y carbociclo -C3-C8 y n se selecciona entre 2, 3, 4, 5 y 6 y forman un anillo con el átomo de nitrógeno al que están unidos; y R3 se selecciona entre hidrógeno, alquilo C1-C8, carbociclo C3-C8, -O-(alquilo C1-C8), -arilo, alquilarilo, alquilo-(carbociclo C3-C8), heterociclo C3-C8 y -alquil-(heterociclo C3-C8). W,W-Dialquil aminoácidos son aminoácidos ilustrativos para BB, tal como la W,W-dimetilvalina comercialmente disponible. Otros W,W-dialquilaminoácidos se pueden preparar mediante bis-alquilación reductora usando procedimientos conocidos (véase, por ejemplo, Bowman, R.E, Stroud, H.H J. Chem. Soc., 1950, 1342-1340). Fmoc-Me-L-Val y Fmoc-Me-L-glicina son dos aminoácidos ilustrativos BB útiles para la síntesis de N-monoalquil derivados. La amina D y el aminoácido BB reaccionan para proporcionar el tripéptido E usando el reactivo de acoplamiento DEPC con trietilamina como base. El grupo protector del extremo C de E se desprotegerse a continuación usando HCl para proporcionar el compuesto tripéptido de fórmula F.
La metodología de acoplamiento con DEPC ilustrativa y la metodología de acoplamiento con PyBrop mostradas en el Esquema 5 se detallan a continuación en el Procedimiento General A y el Procedimiento General B, respectivamente. La metodología ilustrativa para la desprotección de una amina Z-protegida mediante hidrogenación catalítico se detalla a continuación en el Procedimiento general C.
Procedimiento General A: Síntesis de péptidos usando DEPC. El aminoácido W-protegido o W,W-disustituido o péptido D (1,0 eq.) y una amina BB (1,1 eq.) se diluyeron con un disolvente orgánico aprótico, tal como diclorometano(0,1 a 0,5 M). A continuación se añadió una base orgánica tal como trietilamina o diisopropiletilamina (1,5 eq.), seguido por DEPC (1,1 eq.). La solución resultante se agitó, preferentemente bajo atmósfera de argón, durante hasta 12 mientras se controlaba por HPLC o TLC. El disolvente se retiró al vacío a temperatura ambiente, y el producto en bruto se purificó usando, por ejemplo, HPLC o cromatografía en columna ultrarrápida (columna de gel de sílice). Las fracciones relevantes se combinaron y se concentraron al vacío para proporcionar el tripéptido E que se secó a vacío durante la noche.
Procedimiento General B: Síntesis de péptidos usando PyBrop. El aminoácido B (1,0 eq ), que tiene opcionalmente un grupo protector de carboxilo, se diluyó con un disolvente orgánico aprótico tal como diclorometano o DME para proporcionar una solución con una concentración entre 0,5 y 1,0 mM, a continuación se añadió diisopropiletilamina (1,5 eq.). Se añadió el aminoácido protegido con Fmoc o Z A (1,1 eq.) en forma sólida en una porción, a continuación se añadió PyBrop (1,2 eq.) a la mezcla resultante. La reacción se siguió mediante TLC o HPLC, seguido por un procedimiento de elaboración similar al descrito en el Procedimiento general A.
Procedimiento General C: Eliminación de Z mediante hidrogenación catalítica. El aminoácido o péptido C protegido con Z se diluyó con etanol para proporcionar una solución de una concentración comprendida entre 0,5 y 1,0 mM en un recipiente adecuado, tal como un matraz de fondo redondo de paredes gruesas. Se añadió paladio al 10 % sobre carbono (5-10 % p/p) y la mezcla de reacción se puso bajo una atmósfera de hidrógeno. El progreso de la reacción se controló mediante HPLC y por lo general se completó en 1-2 h. La mezcla de reacción se filtró a través de un lecho prelavado de celite, y el celite se volvió a lavar con un disolvente orgánico polar, tal como metanol después de la filtración. La solución de eluyente se concentró al vacío para proporcionar un residuo que se diluyó con un disolvente orgánico, preferentemente tolueno. A continuación, el disolvente orgánico se eliminó al vacío para proporcionar la amina desprotegida C.
El Esquema 6 muestra un método útil para fabricar un dipéptido en el extremo C de fórmula K y un método para acoplar el dipéptido de fórmula K con el tripéptido de fórmula F para fabricar compuestos de Fórmula Ib.
Figure imgf000098_0001
El dipéptido K se puede preparar fácilmente por condensación del aminoácido modificado Boc-Dolaproína G (véase, por ejemplo, Pettit, G.R., et al. Synthesis, 1996, 719-725), con una amina de fórmula H usando agentes de condensación bien conocidos para la química de péptidos, tal como, por ejemplo, DEPC en presencia de trietilamina, como se muestra en el Esquema 5.
El dipéptido de fórmula K se puede acoplar a continuación con un tripéptido de fórmula F usando el Procedimiento general D para preparar los compuestos de fármaco protegidos con Fmoc de fórmula L que posteriormente se pueden desproteger usando el Procedimiento general E para proporcionar compuestos de fármaco de fórmula (Ib).
Procedimiento General D: Síntesis de fármaco. Una mezcla del dipéptido K (1,0 eq.) y el tripéptido F (1 eq.) se diluye con un disolvente orgánico aprótico, tal como diclorometano, para formar una solución 0,1 M, después un ácido fuerte, tal como ácido trifluoroacético (1/2 v/v) se añadió a lo anterior y la mezcla resultante se agitó bajo atmósfera de nitrógeno durante dos horas a 0 °C. La reacción se puede controlar usando TLC o, preferentemente, HPLC. El disolvente se retiró al vacío y el residuo resultante se secó azeotrópicamente dos veces, preferentemente usando tolueno. El residuo resultante se secó con alto vacío durante 12 h y después se diluyó con un disolvente orgánico aprótico, tal como diclorometano. A continuación se añadió una base orgánica tal como trietilamina o diisopropiletilamina (1,5 eq.), seguido por bien PyBrop (1,2 eq.) o DEPC (1,2 eq.) dependiendo de la funcionalidad química del resto. La mezcla de reacción se controló mediante TLC o HPLC y tras su finalización, la reacción se sometió a un procedimiento de elaboración similar o idéntico al descrito en el Procedimiento General A.
Procedimiento General E: Eliminación de Fmoc usando dietilamina. Un Fármaco L protegido con Fmoc se diluyó con un disolvente orgánico aprótico tal como diclorometano y a la solución resultante se añadió dietilamina (1/2 v/v). El progreso de la reacción se controló mediante TLC o HPLC y normalmente se completa en unas 2 h. La mezcla de reacción se concentró al vacío y el residuo resultante se secó azeotrópicamente, preferentemente usando tolueno, después se secó con alto vacío para proporcionar el Fármaco Ib que tiene un grupo amino desprotegido.
El Esquema 7 muestra un método útil para preparar derivados de MMAF de Fórmula (Ib).
Figure imgf000099_0001
El dipéptido O puede preparar fácilmente por condensación del aminoácido modificado Boc-Dolaproina G (véase, por ejemplo, Pettit, G.R., et al. Synthesis, 1996, 719-725), con un aminoácido protegido de fórmula M usando agentes de condensación bien conocidos para la química de péptidos, tal como, por ejemplo, DEPC en presencia de trietilamina, como se muestra en los Esquemas 5 y 6.
El dipéptido de fórmula O se puede acoplar a continuación con un tripéptido de fórmula F usando el Procedimiento general D para preparar los compuestos de MMAF protegidos con Fmoc de fórmula P que posteriormente se pueden desproteger usando el Procedimiento general E para proporcionar compuestos de fármaco MMAF de fórmula (Ib).
Por tanto, los métodos anteriores son útiles para preparar Fármacos como se describe en el presente documento.
Para preparar un Compuesto de fármaco-enlazador, el Fármaco se hace reaccionar con un sitio reactivo del Enlazador. En general, el Enlazador puede tener la estructura:
donde están presentes tanto una Unidad separadora (-Y-) como una Unidad ensanchadora (-A-). Como alternativa, el Enlazador puede tener la estructura:
Figure imgf000100_0001
en la que la Unidad separadora (-Y-) está ausente.
El Enlazador puede también tener la estructura:
Figure imgf000100_0006
en la que tanto la unidad ensanchadora (-A-) como la Unidad separadora (-Y-) están ausentes.
El Enlazador puede también tener la estructura:
Figure imgf000100_0002
en la que tanto la unidad de Aminoácido (W) como la Unidad separadora (Y) están ausentes.
En general, un Enlazador adecuado tiene una Unidad de aminoácido unida a una Unidad ensanchadora opcional y una Unidad separadora opcional. El Sitio reactivo 1 está presente en el extremo de la Unidad separadora y el Sitio reactivo 2 está presente en el extremo de la Unidad ensanchadora. Si no hay Unidad separadora, entonces el Sitio reactivo 1 está presente en el extremo C de la Unidad de aminoácido.
En un ejemplo, el Sitio reactivo n.° 1 es reactivo con un átomo de nitrógeno del Fármaco, mientras que el Sitio reactivo n.° 2 es reactivo con un grupo sulfhidrilo del Ligando. Los Sitios reactivos 1 y 2 pueden ser reactivos con diferentes grupos funcionales.
En un ejemplo, el Sitio reactivo n.° 1 es.
Figure imgf000100_0003
En otro ejemplo, el Sitio reactivo n.° 1 es
Figure imgf000100_0004
En otro ejemplo más, el Sitio reactivo n.° 1 es un carbonato de p-nitrofenilo que tiene la fórmula
Figure imgf000100_0005
En un ejemplo, el Sitio reactivo n.° 2 es un grupo aceptor de tiol. Los grupos aceptores de tiol adecuados incluyen grupos haloacetamida que tienen la fórmula
Figure imgf000101_0001
en la que X representa un grupo saliente, preferiblemente -O-mesilo, O-tosilo, -Cl, -Br, o -I; o un grupo maleimida que tiene la formula
Figure imgf000101_0002
Los Enlazadores útiles se pueden obtener de fuentes comerciales, tales como Molecular Biosciences Inc. (Boulder, CO), o prepararse como se resume en los Esquemas 8-10 siguientes.
Esquema 8
Figure imgf000101_0003
en la que X es CH2 o CH2OCH2-; y n es un número entero comprendido entre cualquiera de 0-10 cuando X es CH2-; o 1-10 cuando X es -CH2OCH2-.
El método que se muestra en el Esquema 9 combina maleimida con glicol en condiciones de Mitsunobu para preparar una Unidad ensanchadora de polietilenglicol (véase por ejemplo, Walker, M.A. J. Org. Chem. 1995, 60, 5352-5), seguido por la instalación de un grupo Sitio reactivo de carbonato de p-nitrofenilo.
Esquema 9
Figure imgf000102_0001
en la que E es CH2 o CH2OCH2-; y e es un número entero comprendido de 0-8;
Como alternativa, las unidades ensanchadoras PEG-maleimida y PEG-haloacetamida se pueden preparar como se describe en Frisch, et al, Bioconjugate Chem. 1996, 7, 180-186. El Esquema 10 ilustra una síntesis general de una Unidad enlazadora ilustrativa que contiene un Grupo ensanchador de maleimida y opcionalmente un Separador autoinmolable de p-aminobencilo.
Esquema 10
Figure imgf000102_0002
.
nitrofenil)carbonato
1. NaHCOa. DME/H^O DIEA, CH2CI2
2. dietilamina, CH2CI2
3. compuesto R, DMF,
Figure imgf000102_0003
Figure imgf000102_0004
R=bencilo; R2^ CH^NHMtr (U)
R1i= isopropilo; R ^ C ^ N H C O N ^ (V)
Figure imgf000102_0005
en la que Q es alquilo C1-C8, -O-(alquilo C1-C8), halógeno, nitro o ciano; m es un número entero comprendido de 0-4; y n es un entero comprendido de 0-10.
Las Unidades ensanchadoras se pueden incorporar al Enlazador usando los intermedios comerciales de Molecular Biosciences (Boulder, CO) descritos a continuación usando técnicas conocidas de síntesis orgánica. Las Unidades ensanchadoras de fórmula (Va) se pueden introducir en un Enlazador por reacción de los siguientes intermedios con el extremo N de una Unidad de aminoácido, como se representa gráficamente en los Esquemas 11 y 12:
Figure imgf000103_0001
donde n es un número entero comprendido entre 1-10 y T es -H o -SO3Na;
Figure imgf000103_0002
donde n es un número entero comprendido entre 0-3;
Figure imgf000103_0003
Las Unidades ensanchadoras de formula (IlIb) se pueden introducir en un Enlazador por reacción de los siguientes compuestos intermedios con el extremo N de la unidad de aminoácido:
Figure imgf000104_0001
donde X es -Br o -I; y
Figure imgf000104_0002
Las Unidades ensanchadoras de formula (IV) se pueden introducir en un Enlazador por reacción de los siguientes compuestos intermedios con el extremo N de la unidad de aminoácido:
Figure imgf000104_0003
las Unidades ensanchadoras de formula (Va) se pueden introducir en un Enlazador por reacción de los siguientes compuestos intermedios con extremo N de la unidad de aminoácido:
Figure imgf000105_0003
Otras Unidades ensanchadoras útiles se pueden sintetizar de acuerdo con procedimientos conocidos. Las Unidades ensanchadoras de aminooxi de la fórmula que se muestra a continuación se pueden preparar tratando haluros de alquilo con N-Boc-hidroxilamina de acuerdo con los procedimientos descritos en Jones, D.S. et al., Tetrahedron Letters, 2000,41 (10), 1531-1533; y Gilon, C. et al., Tetrahedron, 1967, 23(11), 4441-4447.
Figure imgf000105_0001
en la que -R17- se selecciona entre -alquileno -C1-C10 -carbociclo -C3-C8-O-(alquilo C1-C8)-, -arileno-, -alquilenoarileno C1-C10-, -arileno-C1-C10 alquileno-, -alquileno C1-C10-(carbociclo C3-C8)-, -(carbociclo C3-C8)-alquileno C1-C10-, -heterociclo C3-C8, -alquileno C1-C10-(heterociclo C3-C8)-, -(heterociclo C3-C8)-alquileno C1-C10-, -(CH2CH2OX-, -(CH2CH2OV-CH2-, y r es un número entero comprendido de 1-10;
Las Unidades ensanchadoras de isotiocianato de la fórmula que se muestra a continuación se pueden preparar a partir de cloruros del ácido isotiocianatocarboxílico como se describe en Angew. Chem., 1975, 87(14):517.
Figure imgf000105_0002
en la que -R17- es como se describe en el presente documento.
El Esquema 11 muestra un método para obtener un Enlazador dipéptido val-cit que tiene una Unidad ensanchadora de maleimida y opcionalmente una Unidad separadora autoinmolable de p-aminobencilo.
Figure imgf000106_0001
El Esquema 12 ilustra la síntesis de una Unidad enlazadora del dipéptido phe-lys(Mtr) que tiene una Unidad ensanchadora de maleimida y una Unidad separadora autoinmolable de p-aminobencilo. El material de partida AD (lys(Mtr)) está comercialmente disponible (Bachem, Torrance, CA) o se puede preparar de acuerdo con Dubowchik, et al. Tetrahedron Letters (1997) 38:5257-60.
Esquema 12
Figure imgf000107_0001
- ,
p -n itro fen il-O C C O -p -n itro fen il (2 ,0 eq.)
Figure imgf000107_0002
en la que Q es -alquilo Ci-Cs, -O-(alquilo Ci-Cs), -halógeno, -nitro o -ciano; y m es un numero entero comprendido de 0-4.
Como se muestra en el Esquema 13, un Enlazador se puede hacer reaccionar con un grupo amino de un Compuesto de fármaco de Fórmula (Ib) para formar un Compuesto de fármaco-enlazador que contiene un grupo amida o carbamato, que une la Unidad de fármaco a la Unidad enlazadora. Cuando el Sitio reactivo n.° 1 es un grupo ácido carboxílico, como en el Enlazador AJ, la reacción de acoplamiento se puede llevar a cabo usando HATU o PyBrop y una base de amina adecuada, dando como resultado un Compuesto de fármaco-enlazador AK, que contiene un enlace amida entre la Unidad de fármaco y la Unidad enlazadora. Cuando el Sitio reactivo n.° 1 es un carbonato, como en el Enlazador AL, el Enlazador se puede acoplar al Fármaco usando HOBt en una mezcla de DMF/piridina para proporcionan un Compuesto de fármaco-enlazador AM, que contiene un enlace carbamato entre la Unidad de fármaco y la Unidad enlazadora.
Como alternativa, cuando el Sitio reactivo n.° 1 es un buen grupo saliente, tal como en el Enlazador AN, el Enlazador se puede acoplar con un grupos amina de un Fármaco mediante un proceso de sustitución nucleófila para proporcionan un a Compuesto de fármaco-enlazador que tiene un enlace amina (AO) entre la Unidad de fármaco y la Unidad enlazadora.
Los métodos ilustrativos Utiles para unir un Fármaco a un Ligando para formar un Compuesto de fármaco-enlazador se representan gráficamente en el Esquema 13 y se detallan en los Procedimientos generales G-H.
Esquema 13
H A T U
Fármaco Enlazador-COOH
Figure imgf000108_0001
Fármaco -NH-C(O)-Enlazador
Figure imgf000108_0002
Figure imgf000108_0004
base
Fármaco Enlazador-X Fármaco — N - Enlazador
Figure imgf000108_0003
AC)
Procedimiento General G: Formación de la amida usando HATU. Un Fármaco (Ib) (1,0 eq.) y un Enlazador N-protegido que contiene un Sitio reactivo de ácido carboxílico (1,0 eq.) se diluyen con un disolvente orgánico adecuado, tal como diclorometano, y la solución resultante se trató con HATU (1,5 eq.) y una base orgánica, preferentemente piridinina (1,5 eq.). La mezcla de reacción se dejó en agitación bajo atmósfera inerte, preferentemente argón, durante 6 h, tiempo durante el cual la mezcla de reacción se controló mediante HPLC. La mezcla de reacción se concentró y el residuo resultante se purificó mediante HPLC para proporcionar la amida de fórmula AK.
Procedimiento H: Formación de carbamato usando HOBt. Una mezcla de un Enlazador AL que tiene un Sitio reactivo de carbonato de p-nitrofenilo (1,1 eq.) y Fármaco (Ib) (1,0 eq.) se diluyó con un disolvente orgánico aprótico, tal como DMF, para proporcionar una solución que tiene una concentración de 50-100 mM, y la solución resultante se trató con HOBt (2,0 eq.) y se puso bajo atmósfera inerte, preferentemente argón. La mezcla de reacción se dejó agitando durante 15 min, a continuación una base orgánica, tal como piridinina (1/4 v/v), se añadió a lo anterior y el progreso de la reacción se controló mediante HPLC. El Enlazador se consumió normalmente en unas 16 h. A continuación, la mezcla de reacción se concentró al vacío, y el residuo resultante se purificó usando, por ejemplo, HPLC para producir el carbamato AM.
Un método alternativo para preparar el Compuesto de fármaco-enlazador se detalla en el Esquema 14. Usando el método del Esquema 14, el Fármaco se une a una Unidad enlazadora parcial (ZA, por ejemplo), que no tiene una Unidad ensanchadora unida. Esto proporciona el intermedio AP, que tiene una Unidad de aminoácido que tiene un extremo N protegido con Fmoc. A continuación, el grupo Fmoc se elimina y el intermedio de amina resultante AQ se une a continuación a una Unidad ensanchadora mediante una reacción de acoplamiento catalizada usando PyBrop o DEPC. La construcción de Compuestos de fármaco-enlazador que contienen bien una Unidad ensanchadora de bromoacetamida AR o una Unidad ensanchadora de PEG maleimida AS se ilustra en el Esquema 14.
Esquema 14
Figure imgf000109_0001
Figure imgf000109_0003
Figure imgf000109_0002
en la que Q es alquilo Ci-Cs, -O-(alquilo C1-C8), -halógeno, -nitro o -ciano; y m es un número entero comprendido de 0-4.
La metodología útil para preparar una Unidad enlazadora que contiene una unidad separadora ramificada se muestra en el Esquema i5.
Esquema 15
Figure imgf000110_0002
Figure imgf000110_0003
Figure imgf000110_0001
El Esquema 15 ilustra la síntesis de un enlazador dipéptido val-cit que tiene una Unidad ensanchadora de maleimida y una unidad de bis(4-hidroximetil)estireno (BHMS). La síntesis del intermedio BHMS (AW) se ha mejorado a partir de los procedimientos anteriores de la bibliografía (véase la publicación internacional n.° WO 9813059 de Firestone et al., y Crozet, M.P.; Archaimbault, G.; Vanelle, P.; Nouguier, R. Tetrahedron Lett. (1985) 26:5133-5134) y utiliza como materiales de partida, el (4-nitrobencil)fosfonato de dietilo (AT) comercial y la 2,2-dimetil-1,3-dioxan-5-ona (AU) comercial. Los enlazadores AY y BA se pueden preparar a partir del intermedio AW usando la metodología descrita en el Esquema 9.
4.6.3 ENLAZADORES DENDRÍTICOS
El enlazador puede ser un enlazador de tipo dendrítico para la unión covalente de más de un resto de fármaco mediante un resto enlazador ramificado multifuncional con un Ligando, tal como aunque no de forma limitativa, a un anticuerpo (Sun et al. (2002) Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 12:2213-2215; Sun et al. (2003) Bioorganic & Medicinal Chemistry 11:1761-1768). Los enlazadores dendríticos pueden aumentar la relación molar de fármaco a anticuerpo, es decir la carga, que se relaciona con la potencia del Conjugado de fármaco-enlazador-ligando. Por tanto, cuando un anticuerpo que tiene una cisteína diseñada mediante ingeniería genética tiene solamente un grupo tiol reactivo en la cisteína, gran cantidad de restos de fármaco se pueden unir mediante un enlazador dendrítico. Las siguientes realizaciones ilustrativas de reactivos enlazadores dendríticos permiten que hasta nueve reactivos nucleófilos de restos de fármaco se conjuguen por reacción con los grupos funcionales de mostaza de cloroetilnitrógeno:
Figure imgf000111_0001
o
: f í
C H pC H £CH2CN HCH3CY3
4.6.4 CONJUGACIÓN DE RESTOS DE FÁRMACOS A ANTICUERPOS
El Esquema 16 ilustra metodología útil para preparar conjugados de fármaco-enlazador que tienen de aproximadamente 2 a aproximadamente 4 fármacos por anticuerpo. Un anticuerpo se trata con un agente reductor, tal como ditiotreitol (DTT) para reducir todo o parte de los restos disulfuro de cisteína para formar grupos tiol de cisteína fuertemente nucleófilos (-CH2SH). El anticuerpo parcialmente reducido puede seguidamente reaccionar con compuestos de fármaco-enlazador, o reactivos enlazadores, con grupos funcionales electrófilos tales como maleimida o a-halocarbonilo, de acuerdo con el procedimiento de conjugación de la página 766 de Klussman et al. (2004), Bioconjugate Chemistry 15(4):765-773.
Esquema 16
Compuesto fármaco-
A «n at-icuerpo ---- D--T--T----► Anticuerpo parc .ia .lmente reduc .ido----- e--n-l-a-z--a-d--o--r--► C "o un"Jiuuqaaaduou F raármaco- Enlazador-Ligando con carga de fármaco reducida
Por ejemplo, un anticuerpo, por ejemplo, AC10, disuelto en una solución de borato de sodio 500 mM y cloruro de sodio 500 mM a pH 8,0, se trata con un exceso de ditiotreitol 100 mM (DTT). Tras una incubación a 37°C durante aproximadamente 30 minutos, el tampón se intercambió por elución en resina Sephadex G25 y se eluyó con PBS con DTPA 1 mM. El valor tiol/Ab se comprobó determinando la concentración de anticuerpo reducido a partir de la absorbancia de la solución medida a 280 nm y de la concentración de tiol determinada por reacción con DTNB (Aldrich, Milwaukee, WI) y determinación de la absorbancia a 412 nm. El anticuerpo reducido disuelto en PBS se enfrió sobre hielo. El enlazador de fármaco, por ejemplo, MC-val-cit-PAB-MMAE en DMSO, disuelto en acetonitrilo y agua a concentración conocida, se añadió al anticuerpo reducido enfriado en PBS. Después de aproximadamente una hora, se añadió un exceso de maleimida para desactivar la reacción y proteger todos los grupos tiol del anticuerpo sin reaccionar. La mezcla de reacción se concentró mediante ultrafiltración centrífuga y el ADC, por ejemplo, AC10-MC-vc-PAB-MMAE, se purificó y desaló por elución a través de resina G25 en PBS, se filtró a través de filtros de 0,2 pm en condiciones estériles, y se congeló para su almacenamiento.
Se preparó varios conjugados de anticuerpo y fármaco (ADC), con varios enlazadores, y los restos de fármaco, MMAE y MMAF. La siguiente tabla es un grupo ilustrativo de ADC que se preparó según el protocolo del Ejemplo 27, y se caracterizó mediante HPLC y ensayo de carga de fármaco.
Diana (Antígeno) ADC cantidad aislada (mg) relación fármaco/Ab 0772P 16E12-MC-vc-PAB-MMAE 1,75 4
0772P 11D10-MC-vc-PAB-MMAE 46,8 4,4
0772P 11D10-MC-vc-PAB-MMAF 54,5 3,8 Brevican Brevican-MC-MMAF 2 6
Brevican Brevican-MC-vc-MMAF 2 6
Brevican Brevican-MC-vc-PAB-MMAF 1,4 6
CD21 CD21-MC-vc-PAB-MMAE 38,1 4,3
CD21 CD21-MC-vc-PAB-MMAF 43 4,1 CRIPTO 11 F4-MC-vc-PAB-MMAF 6 4,8 CRIPTO 25G8-MC-vc-PAB-MMAF 7,4 4,7
E16 12G12-MC-vc-PAB-MMAE 2,3 4,6
E16 3B5-MC-vc-PAB-MMAE 2,9 4,6
E16 12B9-MC-vc-PAB-MMAE 1,4 3,8
E16 12B9-MC-vc-PAB-MMAE 5,1 4
E16 12G12-MC-vc-PAB-MMAE 3 4,6
E16 3B5-MC-vc-PAB-MMAE 4,8 4,1
E16 3B5-MC-vc-PAB-MMAF 24,7 4,4 EphB2R 2H9-MC-vc-PAB-MMAE 29,9 7,1 EphB2R 2H9-MC-fk-PAB-MMAE 25 7,5 EphB2R 2H9-MC-vc-PAB-MMAE 175 4,1 EphB2R 2H9-MC-vc-PAB-MMAF 150 3,8 EphB2R 2H9-MC-vc-PAB-MMAF 120 3,7 EphB2R 2H9-MC-vc-PAB-MMAE 10,7 4,4
IL-20Ra IL20Ra-fk-MMAE 26 6,7
IL-20Ra IL20Ra-vc-MMAE 27 7,3
EphB2 IL8-MC-vc-PAB-MMAE 251 3,7
MDP MDP-vc-MMAE 32
MPF 19C3-vc-MMAE 1,44 6,5
MPF 7D9-vc-MMAE 4,3 3,8
MPF 19C3-vc-MMAE 7,9 3
MPF 7D9-MC-vc-PAB-MMAF 5 4,3
Napi3b 10H1-vc-MMAE 4,5 4,6
Napi3b 4C9-vc-MMAE 3,0 5,4
Napi3b 10H1-vc-MMAE 4,5 4,8
Napi3b 10H1-vc-MMAF 6,5 4
NCA 3E6-MC-fk-PAB-MMAE 49,6 5,4
NCA 3E6-MC-vc-PAB-MMAE 56,2 6,4
PSCA PSCA-fk-MMAE 51,7 8,9
PSCA PSCA-vc-MMAE 61,1 8,6
Napi3b 10H1 -MC-vc-PAB-MMAE 75 4,2
Napi3b 10H1 -MC-vc-PAB-MMAF 95 4,4
Napi3b 10H1-MC-MMAF 92 4
EphB2R 2H9-MC-vc-PAB-MMAE 79 5
EphB2R 2H9-MC-MMAF 92 4,9
0772P 11 D10(Fc quimera)-MC-vc-PAB-MMAE 79 4,3
0772P 11D10(quimera) MC-vc-PAB- MMAF 70 4,5
0772P HD10(Fc quimera)-MC-MMAF 23 4,5 Brevican 6D2-MC-vc-PAB-MMAF 0,3 4,5 Brevican 6D2-MC-MMAF 0,36 4,5 EphB2R 2H9(Fc quimera)-MC-vc-PAB-MMAE 1983 4,3
E16 12B9-MC-vc-PAB-MMAE 14,1 4,6
E16 12B9-MC-vc-PAB-MMAF 16,4 4,5
E16 12G12-MC-vc-PAB-MMAE 10,5 4,1
E16 12G12-MC-vc-PAB-MMAF 10,2 3,8
E16 3B5-MC-vc-PAB-MMAE 58,6 3,8
E16 3B5-MC-vc-PAB-MMAF 8 3,1
0772P 11 D10(Fc quimera)-MC-vc-PAB-MMAE 340 3,9
Steap1 (Steap1 -92)-MC-vc-PAB-MMAE 3,5 4
Steap1 (Steap1 -92)-MC-vc-PAB-MMAF 4,7 4
Steap1 (Steapl-120)-MC-vc-PAB-MMAE 2 4
Steap1 (Steapl-120)-MC-vc-PAB-MMAF 2,3 4
E16 3B5-MC-vc-PAB-MMAF 52,2 4,5
4.7 COMPOSICIONES Y MÉTODOS DE ADMINISTRACIÓN
También se describe una composición que incluye una cantidad eficaz de un Compuesto Ilustrativo y/o Conjugado ilustrativo y un transportador o vehículo farmacéuticamente aceptable. Por comodidad, las Unidades de fármaco y los Compuestos de fármaco-enlazador se pueden denominar como Compuestos ilustrativos, mientras que los Conjugados de fármaco-ligando y los Conjugados de fármaco-enlazador-ligando se pueden denominar como Compuestos ilustrativos. Las composiciones son adecuadas para su administración veterinaria o humana.
Las actuales composiciones farmacéuticas pueden estar en cualquier forma que permita que la composición se administre a un paciente. Por ejemplo, la composición puede estar en la forma de un sólido, líquido o gas (aerosol). Las rutas de administración típicas incluyen, sin limitación, oral, tópica, administración parenteral, sublingual, rectal, vaginal, ocular, intratumoral, e intranasal. La administración parenteral incluye inyecciones subcutáneas, intravenosa, intramuscular, inyección intraesternal o técnicas de infusión. Las composiciones pueden administrarse por vía parenteral. Como alternativa, los Compuestos ilustrativos y/o los Conjugados ilustrativos o composiciones se pueden administrar por vía intravenosa.
Las composiciones farmacéuticas pueden formularse de tal manera que permitan a un Compuesto ilustrativo y/o Conjugado ilustrativo estar biodisponible tras la administración de la composición a un paciente. Las composiciones pueden tener la forma de una o más dosis unitarias, donde por ejemplo, un comprimido puede ser un dosis unitaria simple, y un recipiente de un Compuesto ilustrativo y/o Conjugado ilustrativo en forma de aerosol puede tener una pluralidad de dosis unitarias.
Los materiales utilizados en la preparación de las composiciones farmacéuticas pueden no ser tóxicos en las cantidades usadas. Será evidente para una persona normalmente experta en la materia que la dosificación óptima del principio o principios activos en las composición farmacéutica dependerá de varios factores. Los factores relevantes incluyen, sin limitación, el tipo de animal (por ejemplo,ser humano), la forma concreta del Compuesto ilustrativo o Conjugado ilustrativo, la manera de administración, y la composición empleada.
El transportador o vehículo farmacéuticamente aceptable puede estar en forma de partículas, de forma que las composiciones están, por ejemplo, en forma de comprimidos o polvo. El(Los) transportador(es) puede ser líquido, siendo las composiciones, por ejemplo, un jarabe oral o un líquido inyectable. Además, el(los) transportador(es) puede ser gaseoso o particulado, con el fin de proporcionar una composición en aerosol útil en, por ejemplo, administración inhalatoria.
Cuando se pretende para la administración oral, la composición está preferentemente en forma sida o líquida, donde las formas semisólidas, semilíquidas, en suspensión y en gel se incluyen en las formas consideradas en el presente documento ya sea como sólido o como líquido.
Como una composición sólida para la administración oral, la composición puede formularse en un polvo, gránulos, comprimido formado por compresión, píldora, una cápsula, gomas de mascar, oblea o las formas similares. Dicha composición sólida contiene normalmente uno o más diluyentes inertes. Además, pueden estar presentes uno o más de los siguientes: aglutinantes tales como carboximetilcelulosa, etilcelulosa, celulosa microcristalina, o gelatina; excipientes tales como almidón, lactosa o dextrinas, agentes disgregantes tales como ácido algínico, alginato de sodio, Primogel, almidón de maíz y similares; lubricantes tales como estearato de magnesio o Sterotex; agente deslizantes tales como dióxido de silicio coloidal; agente edulcorantes tales como sacarosa o sacarina, un agente aromatizante tal como menta, salicilato de metilo o aroma de naranja, y un agente colorante.
Cuando la composición está en la forma de una cápsula, por ejemplo, una cápsula de gelatina, esta puede contener, además de los materiales del tipo anterior, un transportador líquido tal como polietilenglicol, ciclodextrina o un aceite graso.
La composición puede estar en la forma de o un líquido, por ejemplo, un elixir, jarabe, solución, emulsión o suspensión. El líquido puede ser útil para la administración oral o para la administración mediante inyección. Cuando se pretende para la administración oral, una composición puede comprender uno o más de un agente edulcorante, conservantes, tinte/colorante y un potenciador del aroma. En una composición para su administración mediante inyección se puede incluir, uno o más de un tensioactivo, conservante, agente humectante, agente dispersante, agente de suspensión, un tampón, estabilizante y agente isotónico.
Las composiciones liquidas, ya sean soluciones, suspensiones u otra forma similar, pueden incluir también uno o más de los siguientes: diluyentes estériles tales como agua para inyección, solución salina, preferentemente suero salino fisiológico, solución de Ringer, cloruro de sodio isotónico, aceites fijos tales como monoglicéridos o diglicéridos sintéticos que pueden servir como medio disolvente o de suspensión, polietilenglicoles, glicerina, ciclodextrina, propilenglicol u otros disolventes; agentes antibacterianos tales como alcohol bencílico o metil parabeno; antioxidantes, tales como ácido ascórbico o bisulfito sódico; agentes quelantes, tales como ácido etilendiaminatetraacético; tampones, tales como acetatos, citratos o fosfatos y agentes para el ajuste de la tonicidad tales como cloruro de sodio o dextrosa. La composición parenteral se pueden introducir en una ampolla, una jeringa desechable o un vial multidosis hecho de vidrio, plástico u otro material. El suero salino fisiológico es un adyuvante ilustrativo. Una composición inyectable es, preferentemente, estéril.
La cantidad de Compuesto ilustrativo y/o Conjugado ilustrativo que es eficaz en el tratamiento de un trastorno o dolencia concreto dependerá de la naturaleza del trastorno o dolencia, y se puede determinar mediante técnicas clínicas normalizadas. Además, se pueden utilizar de manera opcional ensayos in vitro o in vivo para ayudar a identificar los intervalos de dosificación óptimos. La dosis precisa que se empleará en las composiciones dependerá también de la ruta de administración, y la gravedad de la enfermedad o trastorno, y deberá decidirse de acuerdo con el criterio del especialista a cargo del tratamiento y de las circunstancias del paciente.
Las composiciones comprenden una cantidad eficaz de un Compuesto ilustrativo y/o Conjugado ilustrativo de tal manera que se obtenga una dosificación adecuada. Normalmente, esta cantidad es al menos aproximadamente un 0,01 % de un Compuesto ilustrativo y/o Conjugado ilustrativo en peso de la composición. Cuando se pretende para la administración oral, esta cantidad puede variarse para comprender de aproximadamente 0,1 % a aproximadamente 80 % en peso de la composición. Las composiciones orales pueden comprender de aproximadamente 4 % a aproximadamente 50 % del Compuesto ilustrativo y/o Conjugado ilustrativo en peso de la composición. Asimismo, las presentes composiciones se pueden preparar de forma que una dosis unitaria parenteral contiene de aproximadamente 0,01 % a aproximadamente 2 % en peso del Compuesto ilustrativo y/o Conjugado ilustrativo.
Para administración intravenosa, la composición puede comprender de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 100 mg de Compuesto ilustrativo y/o Conjugado ilustrativo por kg de peso corporal del animal. La composición puede incluir de aproximadamente 1 a aproximadamente 100 mg de un Compuesto ilustrativo y/o Conjugado ilustrativo por kg de peso corporal del animal. La cantidad administrada puede estar en el intervalo de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 25 mg/kg de peso corporal del Compuesto ilustrativo y/o Conjugado ilustrativo.
En general, la dosificación de un Compuesto ilustrativo y/o Conjugado ilustrativo administrada a un paciente suele estar entre aproximadamente 0,01 mg/kg y aproximadamente 2000 mg/kg de peso corporal del animal. La dosificación administrada a un paciente puede estar está entre aproximadamente 0,01 mg/kg y aproximadamente 10 mg/kg del peso corporal del animal, o la dosificación administrada a un paciente está entre aproximadamente 0,1 mg/kg y aproximadamente 250 mg/kg del peso corporal del animal, o la dosificación administrada a un paciente está entre aproximadamente 0,1 mg/kg y aproximadamente 20 mg/kg del peso corporal del animal, o la dosificación administrada está entre aproximadamente 0,1 mg/kg y aproximadamente 10 mg/kg del peso corporal del animal, o la dosificación administrada está entre aproximadamente 1 mg/kg y aproximadamente 10 mg/kg del peso corporal del animal.
Los Compuestos ilustrativos y/o Conjugados ilustrativos o las composiciones pueden administrarse mediante cualquier ruta conveniente, por ejemplo, mediante infusión o inyección en bolo, mediante absorción a través de revestimientos epiteliales o mucocutáneos (por ejemplo, mucosa oral, mucosa rectal e intestinal, etc.). La administración puede ser sistémica o local. Se conocen varios sistemas de administración, por ejemplo, encapsulación en liposomas, micropartículas, microcápsulas, cápsulas, etc., y se pueden usar para administrar un Compuesto ilustrativo y/o Conjugado ilustrativo o composición. En determinados casos, se administra más de un Compuesto ilustrativo y/o Conjugado ilustrativo o composición a un paciente.
En ejemplos específicos, puede ser deseable administrar uno o más Compuesto ilustrativo y/o Conjugado ilustrativo o composiciones localmente en el área en necesidad de tratamiento. Esto puede lograrse, por ejemplo, y no a modo de limitación, por infusión local durante una cirugía; aplicación tópica, por ejemplo, junto con un apósito para heridas después de la cirugía; mediante inyección; mediante un catéter; mediante un supositorio; o mediante un implante, siendo el implante un material poroso, no poroso, o gelatinoso, incluyendo membranas, tales como membranas sialásticas, o fibras. En un ejemplo, la administración puede ser mediante inyección directa en el sitio (o sitio anterior) de un cáncer, tumor o tejido neoplásico o preneoplásico. En otro ejemplo, la administración puede ser mediante inyección directa en el sitio (o sitio anterior) de una manifestación de una enfermedad autoinmunitaria. En determinados casos, puede ser deseable introducir uno o más Compuestos ilustrativos y/o Conjugados ilustrativos o composiciones en el sistema nervioso central mediante cualquier ruta adecuada, incluyendo inyección intraventricular e intratecal. La inyección intraventricular puede facilitarse mediante un catéter intraventricular, por ejemplo, unido a un depósito, tal como un depósito Ommaya.
Se puede emplear también la administración pulmonar, por ejemplo, mediante el uso de un inhalador o nebulizador, y formulación con un agente aerosolizante, o mediante perfusión en un tensioactivo pulmonar de fluorocarbono o sintético.
En otro ejemplo más, los Compuestos ilustrativos y/o Conjugados ilustrativos o composiciones pueden administrarse en un sistema de liberación controlada, tales como aunque no de forma limitativa, una bomba o bien se pueden utilizar diferentes materiales poliméricos. En otro ejemplo más, se puede colocar un sistema de liberación controlada cerca de la diana del Compuesto ilustrativo y/o Conjugado ilustrativo o composiciones, por ejemplo, el cerebro, requiriendo de esta manera solo una fracción de la dosis sistémica (véase, por ejemplo, Goodson, en Medical Applications of Controlled Release, citada anteriormente, vol. 2, págs. 115-138 (1984)). Se pueden utilizar otros sistemas de liberación controlada descritos en la revisión de Langer (Science 249:1527-1533 (1990)).
El término "transportador" se refiere a un diluyente, adyuvante o excipiente, en el que se administra el Compuesto ilustrativo y/o Conjugado ilustrativo. Dichos transportadores farmacéuticos pueden ser líquidos, tales como agua y aceites, incluidos aquellos de origen en el petróleo, animal, vegetal o sintético, tales como aceite de cacahuete, aceite de soja, aceite mineral, aceite de sésamo y similares. Los portadores pueden ser suero salino, goma de acacia, gelatina, pasta de almidón, talco, queratina, sílice coloidal, urea y similares. Además, se pueden usar agentes auxiliares, estabilizantes, espesantes, lubricantes y colorantes. En un ejemplo, cuando se administran a un paciente, el Compuesto ilustrativo y/o Conjugado ilustrativo o composiciones y los transportadores farmacéuticamente aceptables son estériles. El agua es un transportador ilustrativo cuando los Compuestos ilustrativos y/o Conjugados ilustrativos se administran por vía intravenosa. Se pueden emplear también soluciones salinas y soluciones acuosas de dextrosa y glicerol como transportadores líquidos, particularmente para soluciones inyectables. Los transportadores farmacéuticos adecuados también incluyen excipientes, tales como almidón, glucosa, lactosa, sacarosa, gelatina, malta, arroz, harina, creta, gel de sílice, estearato de sodio, monoestearato de glicerol, talco, cloruro de sodio, leche desnatada en polvo, glicerol, propileno, glicol, agua, etanol y similares. Las presentes composiciones, si se desea, también puede contener cantidades menores de agentes humectantes o emulsionantes, o agentes tamponadores del pH.
Las presentes composiciones pueden tener la forma de soluciones, suspensiones, emulsión, comprimidos, píldoras, aglomerados, cápsulas, cápsulas que contienen líquidos, polvos, formulaciones de liberación continua, supositorios, emulsiones, aerosoles, pulverizados, suspensiones, o cualquier otra forma adecuada para su uso. Otros ejemplos de portadores farmacéuticos adecuados se describen en "Remington's Pharmaceutical Sciences" de E.W. Martin. Los Compuestos ilustrativos y/o Conjugados ilustrativos se pueden formular de acuerdo con los procedimientos rutinarios como una composición farmacéutica adaptada para la administración intravenosa a animales, especialmente seres humanos. Normalmente, los portadores o vehículos para administración intravenosa son soluciones acuosas estériles tamponadas. Si es necesario, las composiciones también pueden incluir un agente solubilizante. Las composiciones para administración intravenosa pueden comprender opcionalmente un anestésico local tal como lignocaína para disminuir el dolor en el sitio de la inyección. En general, los ingredientes se suministran tanto por separado o se mezclan conjuntamente en forma de dosis unitaria, por ejemplo, como un polvo liofilizado seco o concentrado exento de agua en un recipiente herméticamente cerrado tal como una ampolla o sobrecillo que indica la cantidad de principio activo. Cuando el Compuesto ilustrativo y/o Conjugado ilustrativo se va a administrar mediante infusión, se puede dispensar, por ejemplo, con un frasco para infusión que contiene agua estéril de calidad farmacéutica o suero salino. Cuando el Compuesto ilustrativo y/o Conjugado ilustrativo se va a administrar mediante inyección, se puede proporcionar una ampolla de agua estéril o suero salino para que los componentes se mezclen antes de la administración.
Las composiciones para la administración oral pueden estar en la forma de comprimidos, pastillas, suspensiones acuosas u oleosas, gránulos, polvos, emulsiones, cápsulas, jarabes o elixires, por ejemplo. Las composiciones administradas por vía oral pueden contener opcionalmente uno o más agentes, por ejemplo, agentes edulcorantes tales como fructosa, aspartame o sacarina; agentes aromatizantes tales como menta piperita, aceite de gaulteria o cereza; agentes colorantes; y agentes conservantes, para proporcionar una preparación farmacéutica agradable al paladar. Por otra parte, cuando están en forma de comprimido o píldora, las composiciones pueden revestirse para retrasar la disgregación y la absorción en el tracto gastrointestinal proporcionando por tanto una acción sostenida durante un periodo prolongado de tiempo. Las membranas selectivamente permeables que rodean un compuesto impulsor osmóticamente activo también son adecuadas para compuestos de la invención administrados por vía oral. En estas últimas plataformas, el fluido del entorno que rodea la cápsula se absorbe por el compuesto impulsor, que se hincha para desplazar el agente o composición de agente a través de una apertura. Estas plataformas de suministro pueden proporcionar un perfil de liberación de orden prácticamente cero en oposición a los perfiles enriquecidos de las formulaciones de liberación inmediata. Se puede usar también un material de retraso en el tiempo tal como monoestearato de glicerol o estearato de glicerol.
Se pueden pretender las composiciones para la administración tópica, en cuyo caso, el transportador puede estar en la forma de una solución, emulsión, pomada o base de gel. Si se pretenden para administración transdérmica, la composición puede estar en la forma de un parche transdérmico o un dispositivo de iontoforesis. Las formulaciones tópicas pueden comprender una concentración de un Compuesto ilustrativo y/o Conjugado ilustrativo de aproximadamente 0,05 % a aproximadamente 50 % p/v (peso por unidad de volumen de la composición), en otro aspecto, de 0,1 % a 10 % p/v.
Se puede pretender la composición para la administración rectal, en la forma, por ejemplo, de un supositorio que se funde en el recto y libera ilustrativo el Compuesto ilustrativo y/o Conjugado ilustrativo.
La composición puede incluir varios materiales que modifican la forma fisiológica de una forma farmacéutica sólida o líquida. Por ejemplo, la composición puede incluir materiales que constituyen una envoltura de revestimiento alrededor de los principios activos. Los materiales forman la envoltura de revestimiento son normalmente inertes, y se pueden seleccionar entre, por ejemplo, azúcar, laca, y otros agentes de revestimiento entéricos. Como alternativa, los principios activos se pueden incluir en una cápsula de gelatina.
Las composiciones pueden consistir en dosis unitarias gaseosas, por ejemplo, pueden estar en la forma de un aerosol. El término aerosol se utiliza para indicar diversos sistemas que varían desde aquellos de naturaleza coloidal a sistemas que consisten en envases presurizados. La administración puede ser mediante un gas licuado o comprimido o mediante un sistema de bomba adecuado que dispense los principios activos.
Tanto si están en forma sólida, líquida o gaseosa, las presentes composiciones pueden incluir un agente farmacológico utilizado en el tratamiento del cáncer, una enfermedad autoinmune o una enfermedad infecciosa. 4.8 USOS TERAPÉUTICOS DE LOS CONJUGADOS ILUSTRATIVOS
Los Compuestos ilustrativos y los Conjugados ilustrativos son útiles para tratar el cáncer, una enfermedad autoinmunitaria o una enfermedad infecciosa en un paciente.
4.8.1 TRATAMIENTO DEL CÁNCER
Los Compuestos ilustrativos y/o Conjugados ilustrativos son útiles para inhibir la multiplicación de una célula tumoral o una célula cancerosa, produciendo la apoptosis en una célula tumoral o cancerosa, o para tratar el cáncer en un paciente. Los Compuestos ilustrativos y/o Conjugados ilustrativos se pueden usar de acuerdo con ello en varios escenarios para el tratamiento de cánceres animales. Los Conjugados de fármaco-enlazador-ligando se pueden utilizar para suministrar un fármaco o unidad de fármaco a una célula tumoral o célula cancerosa. Sin pretender quedar vinculado por teoría alguna, en una realización, la Unidad de ligando de un Conjugado ilustrativo se une a o se asocia con una célula cancerosa o un antígeno asociado a una célula tumoral, y el Conjugado ilustrativo se puede capturar (internalizar) en el interior de una célula tumoral o una célula cancerosa mediante endocitosis mediada por receptor. El antígeno puede unirse a una célula tumoral o célula cancerosa o puede ser una proteína de la matriz extracelular asociada con la célula tumoral o célula cancerosa. Una vez dentro de la célula, una o más secuencias específicas de péptido dentro de la Unidad enlazadora se escinden hidrolíticamente mediante una o más proteasas asociadas a una célula tumoral o célula cancerosa, dando como resultado la liberación de un Fármaco o Compuesto de fármaco-enlazador. El Fármaco o Compuesto de fármaco-enlazador liberado queda libre, a continuación, para migrar al interior de la célula e inducir actividades citotóxicas o citostáticas. Como alternativa, el Fármaco o Unidad de fármaco se escinde del Compuesto ilustrativo fuera de la célula tumoral o célula cancerosa, y el Fármaco o Compuesto de fármaco-enlazador posteriormente penetra en la célula.
En un ejemplo, la unidad de ligando se une a la célula tumoral o célula cancerosa.
En otro ejemplo, la unidad de ligando se une a un antígeno de una célula tumoral o célula cancerosa que se encuentra en la superficie de la célula tumoral o célula cancerosa.
En otro ejemplo, La unidad de ligando se une a un antígeno de una célula tumoral o célula cancerosa que es una proteína de la matriz extracelular asociada con la célula tumoral o célula cancerosa.
La especificidad de la unidad de ligando por una célula tumoral o célula cancerosa concreta puede ser importante para determinar los tumores o cánceres que se tratan de la manera más eficaz. Por ejemplo, los Conjugados ilustrativos que tienen una Unidad de ligando BR96 pueden ser útiles para tratar carcinomas positivos para antígenos entre los que se incluyen los de pulmón, mama, colon, ovario, y páncreas. Los Conjugados ilustrativos que tienen una Unidad de ligando contra CD30 o CD40 pueden ser útiles para tratar neoplasias hematológicas.
Otros tipos de cánceres particulares que se pueden tratar con los Conjugados ilustrativos incluyen, aunque no de forma limitativa, los descritos en la Tabla 3.
TABLA 3
Tumores sólidos, incluyendo, pero sin limitación:
fibrosarcoma
mixosarcoma
Tumores sólidos, incluyendo, pero sin limitación:
liposarcoma
condrosarcoma
sarcoma osteogénico
cordoma
angiosarcoma
endoteliosarcoma
linfangiosarcoma
linfangioendoteliosarcoma
sinovioma
mesotelioma
tumor de Ewing
leiomiosarcoma
rabdomiosarcoma
cáncer de colon
cáncer colorrectal
cáncer de riñón
cáncer de páncreas
cáncer de hueso
cáncer de mama
cáncer de ovario
cáncer de próstata
cáncer de esófago
cáncer de estómago
cáncer oral
cáncer nasal
cáncer de garganta
carcinoma de células escamosas
carcinoma de células basales
adenocarcinoma
carcinoma de las glándulas sudoríparas
carcinoma de las glándulas sebáceas
carcinoma papilar
adenocarcinomas papilares
cistadenocarcinoma
carcinoma medular
carcinoma broncogénico
carcinoma de células renales
hepatoma
carcinoma del conducto biliar
coriocarcinoma
seminoma
carcinoma embriónico
tumor de Wilms
cáncer de cuello de útero
cáncer de útero
cáncer de testículos
carcinoma de pulmón microcítico
carcinoma de vejiga
cáncer de pulmón
carcinoma epitelial
Tumores sólidos, incluyendo, pero sin limitación:
glioma
glioblastoma multiforme
astrocitoma
meduloblastoma
craneofaringioma
ependimoma
pinealoma
hemangioblastoma
neuroma acústico
oligodendroglioma
meningioma
cáncer de piel
melanoma
neuroblastoma
retinoblastoma
cánceres transmitidos por la sangre, incluyendo, pero sin limitación:
leucemia linfoblástica aguda "LLA"
leucemia linfoblástica aguda de linfocitos B
leucemia linfoblástica aguda de linfocitos T
leucemia mielobástica aguda "LMA"
leucemia promielocítica aguda "LPA"
leucemia monoblástica aguda aguda
leucemia eritroleucémica
leucemia megacarioblástica aguda
leucemia mielomonocítica aguda
leucemia no linfocítica aguda
leucemia aguda no diferenciada
leucemia mielocítica crónica "LMC"
leucemia linfocítica crónica "LLC"
mieloma múltiple con leucemia de células pilosas
leucemias aguda y crónica:
leucemias linfoblásticas mielógenas linfocíticas mielocíticas
Linfomas:
enfermedad de Hodgkin y no de Hodgkin
Linfoma
mieloma múltiple
macroglobulinemia de Waldenstrom
enfermedad de la cadena pesada
policitemia vera
Los Conjugados ilustrativos proporcionan direccionamiento al tumor o al cáncer específico de la conjugación, reduciendo de esta manera la toxicidad general de este compuesto. Las Unidades enlazadoras estabilizan los Conjugados ilustrativos en la sangre, pero se pueden escindir por las proteasas específicas de tumor en el interior de la célula, liberando el fármaco.
4.8.2 TERAPIA MULTIMODAL PARA EL CÁNCER
Los cánceres, incluyendo, aunque no de forma limitativa, un tumor, metástasis, u otra enfermedad o trastorno caracterizado por un crecimiento celular incontrolado, se pueden tratar o prevenir mediante la administración de un Conjugado ilustrativo y/o un Compuesto ilustrativo.
En el presente documento se describen métodos para tratar o prevenir el cáncer, que incluyen administrar a un paciente que lo necesita una cantidad eficaz de un Conjugado ilustrativo y un agente quimioterapéutico. En un ejemplo, el agente quimioterapéutico es uno para el que se ha descubierto que, como tratamiento contra el cáncer, no genera resistencia. En otro ejemplo, el agente quimioterapéutico es uno para el que se ha descubierto que, como tratamiento contra el cáncer, genera resistencia. Los Conjugados ilustrativos pueden administrarse a un paciente que ha experimentado también cirugía como tratamiento para el cáncer.
En un ejemplo, el método de tratamiento adicional es la radioterapia.
En un ejemplo específico, el Conjugado ilustrativo se administra concurrentemente con el agente quimioterapéutico o con radioterapia. En otro ejemplo específico, el agente quimioterapéutico o la radioterapia se administra antes o posteriormente a la administración de un Conjugado ilustrativo, por ejemplo al menos un hora, cinco horas, 12 horas, un día, una semana, un mes, o varios meses (por ejemplo, hasta tres meses) ante o después de la administración de un Conjugado ilustrativo.
Se puede administrar un agente quimioterapéutico durante una serie de sesiones. Se puede administrar una cualquiera de una combinación de agentes quimioterapéuticos relacionados en la Tabla 4. Con respecto a la radiación, se puede usar cualquier protocolo de radioterapia dependiendo del cáncer que se va a tratar. Por ejemplo, aunque no de forma limitativa, se puede administrar radiación de rayos x; en particular, Se pueden usar megatensiones de alta energía (radiación de más de 1 MeV de energía) para los tumores profundos, y se pueden usar haces de electrones y ortotensiones de radiación de rayos X para los cánceres de piel. Los radioisótopos que emiten rayos gama, tales como los isótopos radiactivos de radio, cobalto, y otros elementos, también se pueden administrar.
Adicionalmente, los métodos para el tratamiento del cáncer con un Compuesto ilustrativo y/o Conjugado ilustrativo se describen como alternativa a la quimioterapia o radioterapia, donde la quimioterapia o la radioterapia se ha demostrado que es, o que puede ser, tóxica, por ejemplo, da como resultado efectos secundarios inaceptables o insoportables, para el sujeto que se está tratando. El animal que se está tratando puede, opcionalmente, tratarse con otro tratamiento contra el cáncer como la cirugía, radioterapia o quimioterapia, dependiendo de qué tratamiento se considera aceptable o soportable.
Los Compuestos ilustrativos y/o Conjugados ilustrativos también se pueden usar de forma in vitro o ex vivo, tal como en el tratamiento de determinados cánceres, incluyendo, pero sin limitación, leucemias y linfomas, implicando dicho tratamiento trasplantes de citoblastos autólogos. Esto puede implicar un procedimiento multietapa en el que citoblastos hematopoyéticos autólogos del animal se recogen y limpian de todas las células cancerosas, a continuación se erradica la población de células de médula ósea restante del animal mediante la administración de una dosis elevada de un Compuesto ilustrativo y/o Conjugado ilustrativo con o sin radioterapia de dosis elevadas acompañante y el injerto de citoblastos se infunde posteriormente en el animal. A continuación, se proporciona tratamiento de soporte mientras se restaura la función de la médula ósea y se recupera el animal.
4.8.3 TERAPIA MULTIFÁRMACO PARA EL CÁNCER
Se divulgan métodos para tratar el cáncer que incluyen administrar a un paciente que lo necesita una cantidad eficaz de un Conjugado ilustrativo y otro agente terapéutico que es un agente anticanceroso. Los agentes antineoplásicos adecuados incluyen, aunque no de forma limitativa, metotrexato, taxol, L-asparaginasa, mercaptopurina, tioguanina, hidroxiurea, citarabina, ciclofosfamida, ifosfamida, nitrosoureas, cisplatino, carboplatino, mitomicina, dacarbazina, procarbazina, topotecán, mostazas nitrogenadas, cytoxan, etopósido, 5-fluorouracilo, BCNU, irinotecán, camptotecinas, bleomicina, doxorrubicina, idarubicina, daunorubicina, dactinomicina, plicamicina, mitoxantrona, asparaginasa, vinblastina, vincristina, vinorelbina, paclitaxel y docetaxel. En un aspecto, el agente antineoplásico incluye, aunque no de forma limitativa, un fármaco relacionado en la Tabla 4.
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4.8.4 TRATAMIENTO DE ENFERMEDADES AUTOINMUNITARIAS
Los Conjugados ilustrativos son útiles para destruir o inhibir la replicación de una célula que produce una enfermedad autoinmunitaria o para tratar una enfermedad autoinmunitaria. Los Conjugados ilustrativos se pueden usar de acuerdo con ello en varios escenarios para el tratamiento de una enfermedad autoinmunitaria en un paciente. Los Conjugados de fármaco-enlazador-ligando se pueden utilizar para administrar un fármaco a una célula diana. Sin pretender quedar vinculado por teoría alguna, el Conjugado de fármaco-enlazador-ligando se pueden asociar con el antígeno en la superficie de una célula diana, y el Conjugado ilustrativo se captura posteriormente al interior de la célula diana mediante endocitosis mediada por receptor. Una vez dentro de la célula, una o más secuencias específicas de péptido de la Unidad enlazadora se escinden hidrolítica o enzimáticamente, dando como resultado la liberación de un Fármaco. El Fármaco liberado queda libre para migrar al citosol e inducir actividades citotóxicas o citostáticas. En un ejemplo alternativo, el Fármaco o se escinde del Compuesto ilustrativo fuera de la célula diana, y el Fármaco posteriormente penetra en la célula.
En un ejemplo, la Unidad de ligando se une a un antígeno autoinmunitario. En un aspecto, el antígeno se encuentra en la superficie de una célula implicada en una dolencia autoinmunitaria.
En otro ejemplo, la unidad de ligando se une a un antígeno autoinmune que se encuentra en la superficie de una célula.
En un ejemplo, el Ligando se une a linfocitos activados que están asociados con la patología autoinmune.
En un ejemplo adicional, los Conjugados ilustrativos destruyen o inhiben la multiplicación de células que producen un anticuerpo autoinmunitario asociado con una enfermedad autoinmunitaria concreta.
Los tipos concretos de enfermedades autoinmunitarias que se pueden tratar con los Conjugados ilustrativos incluyen, aunque no de forma limitativa, trastornos relacionados con linfocitos Th2 (por ejemplo, dermatitis atópica, asma atópica, rinoconjuntivitis, rinitis alérgica, síndrome de Omenn, esclerosis sistémica, y enfermedad de injerto frente a hospedador); trastornos relacionados con linfocitos Th1 (por ejemplo, artritis reumatoide, esclerosis múltiple, psoriasis, síndrome de Sjogren, tiroiditis de Hashimoto, enfermedad de Grave, cirrosis biliar primaria, granulomatosis de Wegener, y tuberculosis); trastornos relacionados con linfocitos B activados (por ejemplo, lupus eritematoso sistémico, síndrome de Goodpasture, artritis reumatoide, y diabetes de tipo I); y los descritos en la Tabla 5.
TABLA 5
Hepatitis crónica activa
Enfermedad de Addison
Alveolitis alérgica
Reacción alérgica
Rinitis alérgica
Síndrome de Alport
Anafilaxia
Espondilitis anquilosante
Síndrome antifosfolípidos
Artritis
Ascariasis
Aspergilosis
Alergia atópica
Dermatitis atópica
Rinitis atópica
Enfermedad de Behcet
Pulmón de Bird-Fancier
Asma bronquial
Síndrome de Caplan
Cardiomiopatía
Enfermedad celíaca
Enfermedad de Chagas
Glomerulonefritis crónica
Síndrome de Cogan
Enfermedad por crioaglutininas
Infección por rubeola congénita
Síndrome CREST enfermedad de Crohn
Crioglobulinemia
Síndrome de Cushing
Dermatomiositis
Lupus discoide
Síndrome de Dressler
Síndrome de Eaton-Lambert
Infección por Ecovirus
Encefalomielitis
Oftalmopatía endocrina
Infección por el virus Epstein-Barr
Náusas equinas
Eritematosis
Síndrome de Evan
Síndrome de Felty
Fibromialgia
Ciclitis de Fuch
Atrofia gástrica
Alergia gastrointestinal
Arteritis de células gigantes Glomerulonefritis
Síndrome de Goodpasture
Enfermedad de injerto frente a hospedador Enfermedad de Grave
Enfermedad de Guillain-Barre
Tiroiditis de Hashimoto
Anemia hemolítica
Púrpura de Henoch-Schonlein
Atrofia idiopática de las glándulas suprarrenales Fibrosis pulmonar idiopática
Nefropatía de IgA
Enfermedad inflamatoria del intestino Diabetes mellitus insulinodependiente Artritis juvenil
Diabetes mellitus juvenil
Síndrome de Lambert-Eaton
Laminitis
Liquen plano
Hepatitis lupoide
Lupus
Linfopenia
Enfermedad de Meniere
Enfermedad del tejido conectivo mixto Esclerosis múltiple
Miastenia grave
Anemia perniciosa
Síndromes poliglandulares
Demencia presenil
Agammaglobulinemia primaria
Cirrosis biliar primaria
Psoriasis
Artritis psoriática
Fenómeno de Raynaud
Aborto recurrente
Síndrome de Reiter
Fiebre reumática
Artritis reumatoide
síndrome de Sampler
Esquistosomiasis
Síndrome de Schmidt
Escleroderma
Síndrome de Shulman
Síndrome de Sjorgen
Síndrome de Stiff-Man
Oftalmia simpática
Lupus sistémico eritematoso
Arteritis de Takayasu
Arteritis temporal
Tiroiditis
Trombocitopenia
Tirotoxicosis
Necrolisis epidérmica tóxica
Resistencia a la insulina de tipo B
Diabetes mellitus Tipo 1
Colitis ulcerosa
Uveitis
vitíligo
Macroglobulemia de Waldenstrom, Granulomatosis de
Wegener
4.8.5 TERAPIA MULTIFÁRMACO DE ENFERMEDADES AUTOINMUNITARIAS
Se describen métodos para tratar una enfermedad autoinmunItaria que incluyen la administración a un paciente que lo necesita una cantidad eficaz de un Conjugado ilustrativo y otro agente terapéutico conocido para el tratamiento de una enfermedad autoinmune. En un ejemplo, el agente de la enfermedad autoinmunitaria incluye, aunque no de forma limitativa, los agentes relacionados en la Tabla 6.
Tabla 6
ciclosporina
ciclosporina A
micofenolato de mofetilo
sirolimus
tacrolimus
enanercept
prednisona
azatioprina
metotrexato ciclofosfamida
prednisona
ácido aminocaproico
cloroquina
hidroxicloroquina
hidrocortisona
dexametasona
clorambucilo
DHEA
danazol
bromocriptina
meloxicam
infliximab
4.8.6 TRATAMIENTO DE ENFERMEDADES INFECCIOSAS
Los Conjugados ilustrativos son útiles para destruir o inhibir la multiplicación de una célula que produce una enfermedad infecciosa o para tratar una enfermedad infecciosa. Los Conjugados ilustrativos se pueden usar de acuerdo con ello en varios escenarios para el tratamiento de una enfermedad infecciosa en un paciente. Los Conjugados de fármaco-enlazador-ligando se pueden utilizar para administrar un fármaco a una célula diana. En un ejemplo, la Unidad de ligando se une a la célula de la enfermedad infecciosa.
En un ejemplo, los Conjugados ilustrativos destruyen o inhiben la multiplicación de células que producen una enfermedad infecciosa concreta.
Los tipos concretos de enfermedades infecciosas que se pueden tratar con los Conjugados ilustrativos incluyen, aunque no de forma limitativa, los descritos en la Tabla 7.
TABLA 7
Enfermedades bacterianas:
Difteria
Tosferina
Bacteremia oculta
Infección del tracto urinario
Gastroenteritis
Celulitis
Epiglotitis
Traqueítis
Hipertrofia de adenoides
Absceso retrofaríngeo
Impétigo
Ectima
Neumonía
Endocarditis
Artritis séptica
Pneumocócica
Peritonitis
Bacteremia
Meningitis
Meningitis purulenta aguda
Uretritis
Cervicitis
Proctitis
Faringitis
Salpingitis
Epididimitis
Gonorrea
Sífilis
Listeriosis
Ántrax
Nocardiosis
Salmonella
Fiebre tifoidea
Disentería
Conjuntivitis
Sinusitis
Enfermedades bacterianas:
Brucelosis
Tularemia
Cólera
Peste bubónica Tétanos
Enteritis necrosante
Actinomicosis
Infecciones anaerobias mixtas
Sífilis
Fiebre recurrente
Leptospirosis
Enfermedad de Lyme
Fiebre por mordedura de rata
Tuberculosis
Linfoadenitis
Lepra
Clamidia
Neumonía por clamidia
Tracoma
Conjuntivitis por inclusión
Enfermedades fúngicas sistémicas:
Histoplasmosis
Cocidiodomicosis
Blastomicosis
Esporotricosis
Criptococosis
Candidiasis sistémica
Aspergilosis
Mucormicosis
Micetoma
Cromomicosis
Enfermedades por rickettsia:
Tifus
Fiebre con manchas de las Montañas Rocosas Erliquiosis
Rickettsiosis transmitida por la pulga oriental de la rata Viruela por Rickettsia
Fiebre Q
Bartonelosis
Enfermedades parasíticas:
Malaria
Babesiosis
Enfermedad del sueño africana
Enfermedad de Chagas
Leishmaniasis
Fiebre Dum-Dum
Toxoplasmosis
Meningoencefalitis
Queratitis
Entamebiasis
Enfermedades parasíticas:
Giardiasis
Criptosporidiasis
Isosporiasis
Ciclosporiasis
Microsporidiosis
Ascariasis
Tricuriasis
Anquilostomiasis
Estrongiloidiasis
Larva Migrans ocular
Triquinosis
Dracunculiasis
Filariasis linfática
Loiasis
Oncocercosis
Dirofilariasis
Esquistosomiasis
Picadura de notonéctido
paragonimiasis
Clonorquiasis
Fascioliasis
Fasciolopsiasis
Opistorquiasis
Infección por cestodos
Hidatiasis
Enfermedad hidatídica alveolar Enfermedades víricas:
Sarampión
Panencefalitis esclerosante subaguda Resfriado común
Paperas
Rubeola
Roseola
Eritema infeccioso
Viruela aviar
Infección por virus sincitial respiratorio Laringotraqueobronquitis
Bronquiolitis
Mononucleosis infecciosa
Poliomelitis
Herpangina
Fiebre aftosa humana
Enfermedad de Bornholm
Herpes genital
Verrugas genitales
Meningitis aséptica
Miocarditis
Pericarditis
Gastroenteritis
Síndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA) Enfermedades víricas:
Virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) Síndrome de Reye
Síndrome de Kawasaki
Gripe
Bronquitis
Neumonía atípica
Síndrome paragripal
Fiebre faringoconjuntival aguda Queratoconjuntivitis epidémica
Virus del herpes simple 1 (VHS-1)
Virus del herpes simple 2 (VHS-2)
Herpes zoster
Infección por citomegalovirus
Rabia
Leucoencefalopatía multifocal progresiva
Kuru
Insomnio familiar fatal
Enfermedad de Creutzfeldt-Jakob
Enfermedad de Gerstmann-Straussler-Scheinker
Paraparesis espástica tropical
Encefalitis equina occidental
Encefalitis de California
Encefalitis de San Luis
Fiebre amarilla
Dengue
Coriomeningitis linfocítica
Fiebre de Lassa hemorrágica
Fiebre Síndrome pulmonar por hantavirus
Infecciones por el virus Marburg
Infecciones por el virus del Ébola
Viruela
4.8.7 TERAPIA MULTIFÁRMACO PARA ENFERMEDADES INFECCIOSAS
Se describen métodos para tratar una enfermedad infecciosa que incluyen la administración a un paciente que lo necesita un Conjugado ilustrativo y otro agente terapéutico que es un agente dirigido contra enfermedades infecciosas. En un ejemplo, el agente de la enfermedades antiinfecciosa es, aunque no de forma limitativa,, los agentes relacionados en la Tabla 8.
TABLA 8
Antibióticos de p-lactamas:
Penicilina G
Penicilina V
Cloxacilina
Dicloxacilina
Meticilina
Nafcilina
Oxacilina
Ampicilina
Amoxicilina
Antibióticos de p-lactamas:
Bacampicilina
Azlocilina
Carbenicilina
Mezlocilina
Piperacilina
Ticarcilina
Aminoglicósidos:
Amikacina
Gentamicina
Kanamicina
Neomicina
Netilmicina
Estreptomicina
Tobramicina
Macrólidos:
Azitromicina
Claritromicina
Eritromicina
Lincomicina
Clindamicina
Tetraciclinas:
Demeclociclina
Doxiciclina
Minociclina
Oxitetraciclina
Tetraciclina
Quinolonas:
Cinoxacina
Ácido nalidíxico Fluoroquinolonas:
Ciprofloxacina
Enoxacina
Grepafloxacina
Levofloxacina
Lomefloxacina
Norfloxacina
Ofloxacina
Esparfloxacina
Trovafloxicina
Polipéptidos:
Bacitracina
Colistina
Polimixina B
Sulfonamidas:
Sulfisoxazol
Sulfametoxazol
Sulfadiazina
Sulfametizol
Sulfacetamida
Diversos
Agentes antibacterianos:
Trimetoprim
Sulfametazol
Cloranfenicol
Vancomicina
Metronidazol
Quinupristina
Dalfopristina
Rifampina
Espectinomicina Nitrofurantoina
Agentes antivíricos:
Agentes antivíricos generales:
Idoxuradina
Vidarabina
Trifluridina
Aciclovir
Famciclovir
Penciclovir
Valaciclovir
Ganciclovir
Foscarnet
Ribavirina
Amantadina
Rimantadina
Cidofovir
Antisentido
Oligonucleótidos Inmunoglobulinas
Interferones
Fármacos para la infección por VIH:
Tenofovir
Emtricitabina
Zidovudina
Didanosina
Zalcitabina
Estavudina
Lamivudina
Nevirapina
Delavirdina
Saquinavir
Ritonavir
Indinavir
Nelfinavir
5. Ejemplos
Ejemplo 1 - Preparación del compuesto AB
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Fmoc-val-cit-PAB-OH (14,61 g, 24,3 mmol, 1,0 eq., patente de Estados Unidos n.° 6214345 de Firestone et al.) se diluyó con DCM (120 ml, 0,2 M) y a esta solución se añadió dietilamina (60 ml). La reacción se controló mediante HPLC, y se descubrió que se había completado en 2 h. La mezcla de reacción se concentró y el residuo resultante se precipitó usando acetato de etilo (aprox. 100 ml) con sonicación durante 10 min. Se añadió éter (200 ml) y el precipitado se sonicó durante 5 min más. La solución se dejó reposar durante 30 min sin agitación, y después se filtró y se secó a alto vacío para proporcionar Val-cit-PAB-OH, que se usó en la siguiente etapa sin purificación adicional. Rendimiento: 8,84 g (96 %). Val-cit-PAB-OH (8,0 g, 21 mmol) se diluyó con DMF (110 ml) y la solución resultante se trató con MC-OSu (Willner et al., (1993) Bioconjugate Chem. 4:521; 6,5 g, 21 mmol, 1,0 eq.). Según el HPLC, la reacción se había completado después de 2 h. La mezcla de reacción se concentró y el aceite resultante se precipitó usando acetato de etilo (50 ml). Después de sonicar durante 15 min, se añadió éter (400 ml) y la mezcla se sonicó adicionalmente hasta que todas las partículas grandes se hubieron roto. A continuación, la solución se filtró y el sólido se secó para proporcionar un intermedio sólido de color crema. Rendimiento: 11,63 g (96 %); ES-MS m/z 757,9 [M-H]
Fmoc-val-cit-PAB-OH (14,61 g, 24,3 mmol, 1,0 eq., patente de Estados Unidos n.° 6214345 de Firestone et al.) se diluyó con DCM (120 ml, 0,2 M) y a esta solución se añadió dietilamina (60 ml). La reacción se controló mediante HPLC y se descubrió que se había completado en 2 h. La mezcla de reacción se concentró y el residuo resultante se precipitó usando acetato de etilo (aprox. 100 ml) con sonicación durante 10 min. Se añadió éter (200 ml) y el precipitado se sonicó durante 5 min más. La solución se dejó reposar durante 30 min sin agitación, y después se filtró y se secó a alto vacío para proporcionar Val-cit-PAB-OH, que se usó en la siguiente etapa sin purificación adicional. Rendimiento: 8,84 g (96 %). Val-cit-PAB-OH (8,0 g, 21 mmol) se diluyó con DMF (110 ml) y la solución resultante se trató con MC-OSu (Willner et al., (1993) Bioconjugate Chem. 4:521; 6,5 g, 21 mmol, 1,0 eq.). Según el HPLC, la reacción se había completado después de 2 h. La mezcla de reacción se concentró y el aceite resultante se precipitó usando acetato de etilo (50 ml). Después de sonicar durante 15 min, se añadió éter (400 ml) y la mezcla se sonicó adicionalmente hasta que todas las partículas grandes se hubieron roto. A continuación, la solución se filtró y el sólido se secó para proporcionar un intermedio sólido de color crema. Rendimiento: 11,63 g (96 %); ES-MS m/z 757,9 [M-H].
El intermedio sólido de color crema (8,0 g, 14,0 mmol) se diluyó con DMF (120 ml, 0,12 M) y a la solución resultante se añadió bis(4-nitrofenil)carbonato (8,5 g, 28,0 mmol, 2,0 eq.) y D3EA (3,66 ml, 21,0 mmol, 1,5 eq.). Según el HPLC, la reacción se había completado en 1 h. La mezcla de la reacción se concentró para proporcionar un aceite que se precipitó con EtOAc, y después se trituró con EtOAc (aprox. 25 ml). El soluto se precipitó adicionalmente con éter (aprox. 200 ml) y se trituró durante 15 min. El sólido se filtró y se secó con alto vacío para proporcionar el Compuesto AB que tenía una pureza del 93 % según HPLC y se usó en la siguiente etapa sin purificación adicional.
Rendimiento: 9,7 g (94 %).
Ejemplo 2 - Preparación del compuesto 1
Figure imgf000130_0001
La sal de HCl de fenilalanina t-butil éster (868 mg, 3 mmol), W-Boc-Dolaproína (668 mg, 1 eq.), DEPC (820 pl, 1,5 eq.), y DIEA (1,2 ml) se diluyeron con diclorometano (3 ml). Después de 2 horas (h) a temperatura ambiente (aproximadamente 28 grados Celsius), la mezcla de reacción se diluyó con diclorometano (20 ml), se lavó sucesivamente con una solución acuosa saturada de NaHCÜ3 (2 x 10 ml), solución acuosa saturada de NaCl (2 x 10 ml). La capa orgánica se separó y se concentró. El residuo resultante se resuspendió en acetato de etilo y se purificó mediante cromatografía ultrarrápida en acetato de etilo. Las fracciones relevantes se combinaron y se concentraron para proporcionar el dipéptido en forma de un sólido de color blanco: 684 mg (46 %). ES-MS m/z 491,3 [M+H]+.
Para la escisión selectiva de Boc en presencia del t-butil éster, el dipéptido anterior (500 mg, 1,28 mmol) se diluyó con dioxano (2 ml). se añadió HCl 4 M en dioxano (960 pl, 3 eq.), y la mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante la noche. Una desprotección de Boc casi completa se observó mediante RP-HPLC con una cantidad mínima de escisión del t-butil éster. La mezcla se enfrió en un baño de hielo, y se añadió trietilamina (500 pl). Después de 10 min, la mezcla se retiró del baño de refrigeración, se diluyó con diclorometano (20 ml), se lavó sucesivamente con solución acuosa saturada de NaHCÜ3 (2 x 10 ml), solución acuosa saturada de NaCl (2 x 10 ml). La capa orgánica se concentró para dar una espuma de color amarillo: 287 mg (57 %). El intermedio se usó sin purificación adicional.
El tripéptido Fmoc-Meval-val-dil-O-t-Bu (preparado como se describe en el documento WO 02/088172, titulado "Penfapepfide Compounds and Uses Relafed Thereto"; 0,73 mmol) se trató con TFA (3 ml), diclorometano (3 ml) durante 2 horas a temperatura ambiente. La mezcla se concentró a sequedad, el residuo se evaporó simultáneamente con tolueno (3 x 20 ml), y se secó al vacío durante una noche. El residuo se diluyó con diclorometano (5 ml) y se añadió al dipéptido desprotegido (287 mg, 0,73 mmol), seguido por DIEA (550 pl. 4 eq.), DEPC (201 pl, 1,1 eq.). Después de 2 h a temperatura ambiente, la mezcla de reacción se diluyó con acetato de etilo (50 ml), se lavó sucesivamente con una solución acuosa de ácido cítrico al 10 % (2 x 20 ml), solución acuosa saturada de NaHCO3 (2 x 10 ml), solución acuosa saturada de NaCl (10 ml). La capa orgánica se separó y se concentró. El residuo resultante se resuspendió en acetato de etilo y se purificó mediante cromatografía ultrarrápida en acetato de etilo. Las fracciones relevantes se combinaron y se concentraron para proporcionar Fmoc-Meval-valdil-dap-phe-O-t-Bu en forma de un sólido de color blanco: 533 mg (71 %). Rf 0,4 (EtOAc). Es -MS m/z 1010,6 [M+H]+.
El producto (200 mg, 0.2 mmol) se diluyó con diclorometano (3 ml), dietilamina (1 ml). La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante la noche. Los disolventes se eliminaron para proporcionar un aceite que se purificó mediante cromatografía ultrarrápida en gel de sílice con un gradiente en etapas de MeOH 0-10 % en diclorometano para proporcionar el Compuesto 1 en forma de un sólido de color blanco: 137 mg (87 %). Rf 0,3 (MeOH 10 % en CH2Ch). ES-MS m/z 788,6 [M+H]+.
Ejemplo 3 - Preparación del compuesto 2
Figure imgf000130_0002
El compuesto 2 se preparó a partir del compuesto 1 (30 mg, 0,038 mmol) por tratamiento con HCl 4 M en dioxano (4 ml) durante 7 h a temperatura ambiente. El disolvente se eliminó, y el residuo se secó al vacío durante una noche para proporcionar el Compuesto 2 en forma de un sólido higroscópico de color blanco: 35 mg (120 % calculado para la sal de HCl). ES-MS m/z 732,56 [M+H]+.
Ejemplo 4 - Preparación del compuesto 3
Figure imgf000131_0001
Fmoc-Meval-val-dil-dap-phe-O-f-Bu (Ejemplo 2, 50 mg) se trató con HCl 4 M en dioxano (4 ml) durante 16 h a temperatura ambiente. El disolvente se eliminó, y el residuo se secó al vacío durante una noche para proporcionar 50 mg de un intermedio sólido higroscópico de color blanco
El intermedio sólido de color blanco (20 mg, 0.02 mmol) se diluyó con diclorometano (1 ml); se añadió DEPC (5 pl, 0,03 mmol, 1,5 eq.) seguido por DIEA (11 pl, 0,06 mmol, 3 eq.), y f-butilamina (3,2 pl, 0,03 mmol, 1,5 eq.). Después de 2 h a temperatura ambiente, según la RP-HPLC, la reacción estaba incompleta. Se añadieron más DEPC (10 pl) y f-butilamina (5 pl) y la reacción se agitó durante 4 h más. La mezcla de reacción se diluyó con diclorometano (15 ml), se lavó sucesivamente con agua (5 ml), solución ac de HCl 0,1 M (10 ml), solución acuosa saturada de NaCl (10 ml). La capa orgánica se separó y se concentró. El residuo resultante se diluyó con diclorometano y se purificó mediante cromatografía ultrarrápida con un gradiente en etapas de MeOH al 0-5 % en diclorometano. Las fracciones relevantes se combinaron y se concentraron para proporcionar el intermedio protegido con Fmoc en forma de un sólido de color blanco: 7,3 mg (36 %). Rf 0,75 (MeoH 10 % en CH2Ch).
El intermedio protegido con Fmoc se diluyó con diclorometano (0,5 ml) y se trató con dietilamina (0,5 ml) durante 3 h a temperatura ambiente. La mezcla de reacción se concentró a sequedad. El producto se aisló mediante cromatografía ultrarrápida en gel de sílice con un gradiente en etapas de MeOH 0-10 % en diclorometano para proporcionar el Compuesto 3 en forma de un sólido de color blanco: 4 mg (70 %). Rf 0,2 (MeOH 10 % en CH2Ch). ES-MS m/z 787 [M+H]+, 809 [M+Na]+.
Ejemplo 5 - Preparación del compuesto 4
Figure imgf000131_0002
Boc-L-Fenilalanina (265 mg, 1 mmol, 1 eq.) y trietilenglicol monometil éter (164 pl, 1 mmol, 1 eq.) se diluyeron con diclorometano (5 ml). Después, se añadió dCc (412 mg, 2 mmol, 2 eq.), seguido de DMAP (10 mg). La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante la noche. El precipitado se separó por filtración. El disolvente se retiró al vacío, el residuo se diluyó con acetato de etilo, y se purificó mediante cromatografía ultrarrápida en gel de sílice en acetato de etilo. Las fracciones que contenían producto se combinaron, se concentraron y se secaron al vacío para proporcionar un sólido de color blanco: 377 mg (91 %). Rf 0,5 (EtOAc). ES MS m/z 434 [M+H]+.
La eliminación del grupo protector Boc se llevó a cabo por tratamiento del material anterior en dioxane (10 ml) con HCl 4 M en dioxano (6 ml) durante 6 h a temperatura ambiente. El disolvente se retiró al vacío, el residuo se secó al vacío para proporcionar un sólido de color blanco.
La sal de HCl del Fenilalanina-trietilenglicol monometil éter éster (236 mg, 0,458 mmol, 1 eq.) y AT- Boc-Dolaproína (158 mg, 0,55 mmol, 1,2 eq.) se diluyeron con diclorometano (3 ml). DEPC (125 pl, 1,5 eq.) y se añadió a la mezcla seguido por DIEA (250 pl, 3 eq.). Después de 2 h a temperatura ambiente, la mezcla de reacción se diluyó con acetato de etilo (30 ml), se lavó sucesivamente con una solución acuosa de NaHCO3 (2 x 10 ml), solución acuosa de ácido cítrico al 10 % (2 x 10 ml) y solución acuosa de NaCl (10 ml). La capa orgánica se separó y se concentró. El residuo resultante se resuspendió en acetato de etilo y se purificó mediante cromatografía ultrarrápida sobre gel de sílice en acetato de etilo. Las fracciones relevantes se combinaron y se concentraron para proporcionar el intermedio en forma de una espuma de color blanco: 131 mg (50 %). Rf 0,25 (EtOAc). ES-MS m/z 581,3 [M+H]+.
La desprotección de Boc se realizó en diclorometano (2 ml), TFA (0.5 ml) a temperatura ambiente durante 2 h. El disolvente se eliminó al vacío y el residuo se evaporó simultáneamente con tolueno (3 x 25 ml), después se secó al vacío para proporcionar 138 mg de la sal del dipéptido de TFA.
Fmoc-Meval-val-dil-OH (Ejemplo 2, 147 mg, 0,23 mmol, 1 eq.), y la sal del dipéptido TFA (138 mg) se diluyeron con diclorometano (2 ml). Se añadió DEPC (63 pl, 1,5 eq.) a la mezcla, seguido por DIEA (160 pl, 4 eq.). Después de 2 h a temperatura ambiente, la mezcla de reacción se diluyó con diclorometano (30 ml), se lavó sucesivamente con una solución acuosa de ácido cítrico al 10 % (2 x 20 ml), solución acuosa saturada de NaCl (20 ml). La capa orgánica se separó y se concentró. El residuo resultante se resuspendió con diclorometano y se purificó mediante cromatografía ultrarrápida con un gradiente en etapas de MeOH al 0-5 % en diclorometano. Las fracciones relevantes se combinaron y se concentraron para proporcionar una espuma de color blanco: 205 mg (81 %). Rf 0,4 (MeOH 10 % en CH2Cl2). ES-MS m/z 1100,6 [M+H]+, 1122,4 [M+Na]+.
El grupo protector Fmoc se eliminó por tratamiento con dietilamina (2 ml) en diclorometano (6 ml). Después de 6 h a temperatura ambiente, el disolvente se eliminó al vacío, el producto se aisló mediante cromatografía ultrarrápida sobre gel de sílice en un gradiente en etapas de MeOH 0-10 % en diclorometano. Las fracciones relevantes se combinaron y se concentraron. Tras la evaporación en diclorometano/hexano, 1:1, el compuesto 4 se obtuvo en forma de una espuma de color blanco: 133 mg (80 %). Rf 0,15 (MeOH 10 % en CH2Ch). ES-Ms mlz 878,6 [M+H]+.
Ejemplo 6 - Preparación del compuesto 5
Figure imgf000132_0001
Fmoc-Meval-val-dil-OH (Ejemplo 2, 0,50 g, 0,78 mmol) y dap-phe-OMe-HCl (0,3 g, 0,78 mmol, preparado de acuerdo con Pettit, G.R., et al Anti-Cancer Drug Design 1998, 13, 243-277) se disolvieron en CH2Ch (10 ml) seguido por la adición de diisopropiletilamina (0,30 ml, 1,71 mmol, 2,2 eq.). Se añadió DEPC (0,20 ml, 1,17, 1,5 eq.) y el contenido se guardó bajo Ar. La reacción se completó de acuerdo con el HPLC en 1 h. La mezcla se concentró hasta obtener un aceite que se purificó mediante cromatografía en SiO2 (columna 300 x 25 mm) y se eluyó con 100 % EtOAc. El producto se aisló en forma de un sólido de color blanco espumoso. Rendimiento: 0,65 g (87 %). ES-MS m/z 968,35 [M+H]+, 991,34 [M+Na]+; UV Amax 215,265 nm.
El péptido protegido con Boc (0,14 g, 0,14 mmol) en cloruro de metileno (5 ml) se trató con dietilamina (2 ml) y el contenido se guardó a temperatura ambiente durante 2 h. La reacción, completa según e1HPLC, se concentró hasta dar un aceite, se capturó en 2 ml de DMSO y se inyectó en una columna de HPLC preparativa (C12-RP, 5 p, 100 A, gradiente lineal de MeCN en agua (que contenía TFA al 0,1 %) 10 a 100 % en 40 min seguido por 20 min a 100 %, a un caudal de 25 ml/min). Las fracciones que contenían el producto se evaporaron para proporcionar un polvo de color blanco para la sal de trifluoroacetato. Rendimiento: 0,126 g (98 %). Fr 0,28 (100 % EtOAc); ES-MS m/z 746,59 [M+H]+, 768,51 [M+Na]+; UV Amax 215 nm.
Ejemplo 7 - Preparación del compuesto 6
Figure imgf000133_0001
La sal de trifluoroacetato del Compuesto 5 (0,11 g, 0,13 mmol), Compuesto AB (0,103 g, 0,14 mmol, 1,1 eq.) y HOBt (3,4 mg, 26 pmol, 0,2 eq.) se suspendieron en DMF/piridina (2 ml/0,5 ml, respectivamente). Se añadió diisopropiletilamina (22,5 pl, 0,13 mmol, 1,0 equiv.) y la solución de color amarillo se agitó bajo atmósfera de argón. Después de 3 h, se añadió 1,0 eq. adicional de DIEA. Después de 24 horas, 0,5 eq. del enlazador activado se incluyó en la mezcla de reacción. Después de 40 h en total, la reacción se completó. El contenido se evaporó, se capturó en DMSO y se inyectó en una columna de HPLC prep (C12-RP, 5 p, 100 A, gradiente lineal de MeCN en agua (que contenía TFA al 0,1 %) 10 a 100 % en 40 min seguido por 20 min a 100 %, a un caudal de 50 ml/min). Las fracciones deseadas se evaporaron para obtener el producto deseado en forma de un aceite de color amarillo. Cloruro de metileno (aprox. 2 ml) y un exceso de éter se añadieron para proporcionar el Compuesto 6 en forma de un precipitado de color blanco que se filtró y se secó. Rendimiento: 90 mg (52 %). ES-MS m/z 1344,32 [M+H]+, 1366,29 [M+Na]+; UV Amax 215, 248 nm.
Ejemplo 8 - Preparación del compuesto 7
Figure imgf000133_0002
Compuesto 4 (133 mg, 0,15 mmol, 1 eq.), Compuesto AB, (123 mg, 0,167 mmol, 1,1 eq.), y HOBt (4 mg, 0.2 eq.) se diluyeron con DMF (1,5 ml). Después de 2 min, se añadió piridina (5 ml) y la reacción se controló mediante RP-HPLC. La reacción se mostró completada en aprox. 18 h. La mezcla de reacción se diluyó con diclorometano (20 ml), se lavó sucesivamente con una solución acuosa de ácido cítrico al 10 % (2 x 10 ml), agua (10 ml), solución acuosa saturada de NaCl (10 ml). La capa orgánica se separó y se concentró. El residuo resultante se resuspendió con diclorometano y se purificó mediante cromatografía ultrarrápida con un gradiente en etapas de MeOH al 0-10 % en diclorometano. Las fracciones relevantes se combinaron y se concentraron para proporcionar el Compuesto 7 en forma de una espuma de color blanco: 46 mg (21 %). Rf 0,15 (MeOH 10 % en CH2Ch). Es -MS m/z 1476,94 [M+H]+.
Ejemplo 9 - Preparación de MC-Val-Cit-PAB-MMAF t-butil éster 8
Figure imgf000134_0001
Compuesto 1 (83 mg, 0,11 mmol), Compuesto AB (85 mg, 0,12 mmol, 1,1 eq.) y HOBt (2,8 mg, 21 pmol, 0,2 eq.) se capturaron en DMF seco (1,5 ml) y piridina (0,3 ml) bajo atmósfera de argón. Después de 30 h, según HPLC, la reacción estaba prácticamente completa. La mezcla se evaporó, se capturó en una cantidad mínima de DMSO y se purificaron mediante HPLC-prep (columna C12-RP, 5 p, 100 A, gradiente lineal de MeCN en agua (que contenía TFA al 0,1 %) 10 a 100 % en 40 min seguido por 20 min a 100 %, a un caudal de 25 ml/min) para proporcionar el Compuesto 8 en forma de un sólido de color blanco. Rendimiento: 103 mg (71 %). ES-MS m/z 1387,06 [M+H]+, 1409,04 [M+Na]+; UV Amax 205, 248 nm.
Ejemplo 10 - Preparación de MC-val-cit-PAB-MMAF 9
Figure imgf000134_0002
El Compuesto 8 (45 mg, 32 pmol) se suspendió en cloruro de metileno (6 ml) seguido por la adición de TFA (3 ml). La solución resultante se mantuvo durante 2 h. La mezcla de reacción se concentró al vacío y se purificó mediante HPLC-prep (columna C12-RP, 5 p, 100 A, gradiente lineal de MeCN en agua (que contenía TFA al 0,1 %) 10 a 100 % en 40 min seguido por 20 min a 100 %, a un caudal de 25 ml/min). Las fracciones deseadas se concentraron para proporcionar maleimidocaproilvalina-citrulina-p-hidroximetilaminobenzeno-MMAF (MC-val-cit-PAB-MMAF) 9 en forma de un sólido de color crema. Rendimiento: 11 mg (25 %). ES-MS m/z 1330,29 [M+H]+, 1352,24 [M+Na]+; UV Amax 205, 248 nm.
Ejemplo 11 - Preparación de MC-val-cit-PAB-MMAF terc-butil amida 10
Figure imgf000134_0003
Compuesto 3 (217 mg, 0,276 mmol, 1,0 eq.), Compuesto AB (204 mg, 0,276 mmol, 1,0 eq.), y HOBt (11 mg, 0,0828 mmol, 0,3 eq.) se diluyeron con piridinina/DMF (6 ml). A esta mezcla se añadió DIEA (0,048 ml), y la mezcla se agitó aprox. 16 h. Los compuestos volátiles se evaporaron al vacío. El residuo en bruto se purificó mediante Chromatotron® (cromatografía en capa fina radial) con un gradiente en etapas de (metanol al 0-5-10 % en DCM) para proporcionar MC-val-cit-PAB-MMAF terc-butil amida 10. Rendimiento: 172 mg (45 %); ES-MS m/z 1386,33 [M+H]+, 1408,36 [M+Na]+; UV Amax 215, 248 nm.
Ejemplo 12 - Preparación de AC10-MC-MMAE por conjugación de AC10 y MC-MMAE
AC10, disuelto en una solución de borato de sodio 500 mM y cloruro de sodio 500 mM a pH 8,0, se trata con un exceso de ditiotreitol 100 mM (DTT). Tras una incubación a 37°C durante aproximadamente 30 minutos, el tampón se intercambió por elución en resina Sephadex G25 y se eluyó con PBS con DTPA 1 mM. El valor tiol/Ab se comprobó determinando la concentración de anticuerpo reducido a partir de la absorbancia de la solución medida a 280 nm y de la concentración de tiol determinada por reacción con DTNB (Aldrich, Milwaukee, WI) y determinación de la absorbancia a 412 nm. El anticuerpo reducido disuelto en PBS se enfrió sobre hielo.
El reactivo enlazador de fármaco, maleimidocaproil-monometil auristatina E, es decir, MC-MMAE, disueltos en DMSO, se diluye en acetonitrilo y agua a concentración conocida, y se añadió al anticuerpo AC10 muy frío en PBS. Después de aproximadamente una hora, se añadió un exceso de maleimida para desactivar la reacción y proteger todos los grupos tiol del anticuerpo sin reaccionar. La mezcla de reacción se concentró mediante ultrafiltración centrífuga y AC10-MC-MMAE se purificó y desaló por elución a través de resina G25 en PBS, se filtró a través de filtros de 0,2 pm en condiciones estériles, y se congeló para su almacenamiento.
Ejemplo 13 - Preparación de AC10-MC-MMAF por conjugación de AC10 y MC-MMAF
AC10-MC-MMAF se preparó por conjugación de AC10 y MC-MMAF según el procedimiento del Ejemplo 12.
Ejemplo 14 - Preparación de AC10-MC-val-cit-PAB-MMAE por conjugación de AC10 y MC-val-cit-PAB-MMAE AC10-MC-val-cit-PAB-MMAE se preparó por conjugación de AC10 y MC-val-cit-PAB-MMAE según el procedimiento del Ejemplo 12.
Ejemplo 15 - Preparación de AC10-MC-val-cit-PAB-MMAF por conjugación de AC10 y MC-val-cit-PAB-MMAF (9) AC10-MC-val-cit-PAB-MMAF se preparó por conjugación de AC10 y MC-val-cit-PAB-MMAF (9) según el procedimiento del Ejemplo 12.
Ejemplo 16 - Determinación de la citotoxicidad de compuestos seleccionados
Se evaluó la actividad citotóxica de MMAF y los compuestos 1-5 en las líneas de células OVCAR-3 positivas para Lewis Y, se pueden evaluar las líneas de células H3396 de carcinoma de mama, L2987 de carcinoma de pulmón y LS174t de carcinoma de colon positivas para Lewis Y para la citotoxicidad. Para evaluar la citotoxicidad de los compuestos 1-5, se pueden sembrar las células a aproximadamente 5 - 10.000 por pocillo en 150 pl de medio de cultivo tratado con dosis graduadas de compuestos 1-5 por cuadriplicado al inicio del ensayo. Los ensayos de citotoxicidad se llevan a cabo habitualmente en las 96 horas posteriores a la adición de los compuestos de ensayo. Cincuenta pl de colorante resazurina se pueden añadir a cada pocillo en las últimas 4 a 6 horas de la incubación para evaluar las células viables al final del cultivo. Se puede determinar la reducción del colorante mediante espectrometría de fluorescencia utilizando longitudes de onda de excitación y emisión de 535nm y 590nm, respectivamente. Para análisis, se puede comparar la extensión de la reducción de la resazurina por las células tratadas con las células del control sin tratar.
Para los ensayos de exposición de 1 h se pueden someter a pulsos las células con el fármaco durante 1 h y a continuación lavarse; se puede determinar el efecto citotóxico tras 96 h de incubación.
EJEMPLO 17 - Datos de citotoxicidad in vitro para los compuestos seleccionados
La Tabla 10 muestra el efecto citotóxico de los conjugados cAC10 de los compuestos ds 7-10, evaluados como se describe en el Procedimiento General I en una línea de células CD30+ Karpas 299. Se presentan los datos de dos experimentos separados. Se encontró que los conjugados cAC10 de los compuestos 7 y 9 eran ligeramente más activos que cAC10-val-cit-MMAE.
TABLA 10
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En otros experimentos, BR96-val-cit-MMAF era al menos 250 veces más potente que el MMAF libre.
Procedimiento General I - Determinación de la citotoxicidad. Para evaluar la citotoxicidad de los conjugados ilustrativos 7-10, se sembraron las células a aproximadamente 5 - 10.000 por pocillo en 150 pl de medio de cultivo tratado a continuación con dosis graduadas de los conjugados ilustrativos 7-10 por cuadruplicado al inicio del ensayo. Los ensayos de citotoxicidad se llevan a cabo habitualmente en las 96 horas posteriores a la adición de los compuestos de ensayo. Cincuenta pl de colorante resazurina se pueden añadir a cada pocillo en las últimas 4 a 6 horas de la incubación para evaluar las células viables al final del cultivo. Se determinó la reducción del colorante mediante espectrometría de fluorescencia utilizando longitudes de onda de excitación y emisión de 535nm y 590nm, respectivamente. Para análisis, se comparó la extensión de la reducción de resazurina por las células tratadas con la de las células del control sin tratar.
Ejemplo 18- Ensayos de proliferación celular in vitro
Se puede medir la eficacia de ADC mediante un ensayo de proliferación celular que utiliza el siguiente protocolo (Promega Corp. Technical Bulletin TB288; Mendoza et al. (2002) Cancer Res. 62:5485-5488):
1. Una alícuota de 100 pl de cultivo celular que contiene aproximadamente 104 células (SKBR-3, BT474, MCF7 o MDA-MB-468) en medio se depositó en cada pocillo de una placa de 96 pocillos, de paredes opacas.
2. Los pocillos de control se prepararon con medio y sin células.
3. Se añadió ADC a los pocillos experimentales y se incubó durante 3-5 días.
4. Las placas se equilibraron a temperatura ambiente durante aproximadamente 30 minutos.
5. Se añadió un volumen del reactivo CellTiter-Glo igual al volumen del medio de cultivo celular presente en cada pocillo.
6. Los contenidos se mezclaron durante 2 minutos en un agitador orbital para inducir la lisis celular.
7. La placa se incubó a temperatura ambiente durante 10 minutos para estabilizar la señal de luminiscencia. 8. Se registró la luminiscencia y se notificó en gráficos como URL = unidades relativas de luminiscencia.
Ejemplo 19 - Aclaramiento del plasma en ratas
Se estudió la farmacocinética del aclaramiento del plasma de los conjugados de anticuerpo fármaco y los anticuerpos totales en ratas Sprague-Dawley (Charles River Laboratories, 250-275 g cada una). Se dosificaron los animales mediante inyección en bolo en la vena de la cola (IV Empujar). Se recogieron aproximadamente 300 pl de sangre completa mediante una cánula en la yugular, o mediante una varilla en la cola, en recipientes con anticoagulante de litio/heparina en cada punto temporal: 0 (predosis), 10, y 30 minutos; 1, 2, 4, 8, 24 y 36 horas; y 2, 3, 4, 7, 14, 21, 28 días después de la dosis. Se midieron los anticuerpos totales mediante ELISA - ECD/GxhuFc-HRP. Se midió el conjugado de anticuerpo fármaco mediante ELISA - MMAE/MMAF/ECD-Bio/SA-HRP.
Ejemplo 20 - Aclaramiento del plasma en monos
La farmacocinética del aclaramiento en plasma de los conjugados anticuerpo fármaco y los anticuerpos totales se pueden estudiar en macacos. La Figura 12 muestra un estudio en dos etapas del aclaramiento de la concentración en plasma después de la administración de H-MC-vc-MMAE a macacos a diferentes dosis: 0,5, 1,5, 2,5, y 3,0 mg/kg, administrados en el día 1 y el día 21. Las concentraciones de anticuerpo total y ADC se midieron con el tiempo. (H = Trastuzumab).
Ejemplo 21 - Eficacia in vivo sobre el volumen tumoral en explantes de ratones transgénicos
Los animales adecuados para los experimentos transgénicos se pueden obtener de fuentes comerciales convencionales tales como Taconic (Gennantown, N.Y.). Muchas cepas son adecuadas, pero se prefieren ratones FVB hembras debido a su elevada susceptibilidad a la formación de tumores. Los machos FVB se pueden utilizar para el emparejamiento, y los machos CD.1 vasectomizados se pueden utilizar para estimular el pseudoembarazo. Los ratones vasectomizados se pueden obtener de cualquier proveedor comercial. Las hembras fértiles se pueden reproducir tanto con ratones FVB o con ratones heterozigóticos 129/BL6 x FVB p53. Los ratones con el alelo p53 heterozigótico se pueden utilizar para aumentar potencialmente la formación de tumores. Algunos tumores F1 son cepas mixtas. Los tumores fundadores solamente pueden ser FVB.
Los animales que tienen tumores (propagados por aloinjerto a partir de ratones transgénicos Fo5 mmtv) se pueden tratar con una dosis simple o múltiple mediante inyección IV de ADC. El volumen del tumor se puede evaluar en varios puntos temporales después de la inyección.
Ejemplo 22 - Síntesis de MC-MMAF mediante terc-butil éster
Síntesis 1:
Figure imgf000137_0001
MeVal-Val-Dil-Dap-Phe-OtBu (compuesto 1, 128,6 mg, 0,163 mmol) se suspendió en CH2Ch (0,500 ml). Se añadieron ácido 6-maleimidocaproico (68,9 mg, 0,326 mmol) y 1,3-diisopropilcarbodiimida (0,0505 ml, 0,326 mmol) seguido por piridina (0,500 ml). La mezcla de reacción se dejó en agitación durante 1,0 h. El análisis de HPLC indicó el consumo completo de la compuesto de partida 1. Los compuestos orgánicos volátiles se evaporaron a presión reducida. Se aisló el producto mediante cromatografía en columna ultrarrápida, usando un gradiente en etapas metanol al 0 a 5 % en CH2Ch. Se recuperaron un total de 96 mg de MC-MeVal-Val-Dil-Dap-Phe-OtBu (12) puro (rendimiento del 60 %). ES-MS m/z 981,26 [M+H]+; 1003,47 [M+Na]; 979,65 [M-H]-.
Se suspendió MC-MeVal-Val-Dil-Dap-Phe-OtBu (Compuesto12, 74 mg, 0,0754 mmol) en CH2Ch (2,0 ml) y TFA (1 ml) a temperatura ambiente. Después de 2,5 h, el análisis mediante HPLC indicó el consumo completo de materiales de partida. Los compuestos orgánicos volátiles se evaporaron a presión reducida y el producto se aisló mediante RP-HPLC preparatoria, utilizando una columna Phenomenex C12 Synergi Max-RP 80Á (250 x 21,20 mm). Eluyente: gradiente lineal 10 % a 90 % de MeCN/0,05 % de TFA (ac) durante 30 minutos, a continuación isocrático 90 % de MeCN/0,05 % de TFA (ac) durante 20 minutos más. ES-EMm/z 925,33 [M+H]4; 947,30 [M+Na]+; 923,45 [M-H]-.
Ejemplo 23a - Síntesis de MC-MMAF (11) mediante el dimetoxibencil éster
Síntesis 2:
Figure imgf000138_0001
MC-MMAF
Preparación de Fmoc-L-fenilalanina-2,4-dimetoxibencil éster (Fmoc-Phe-ODMB)
Un matraz de fondo redondo de 3 bocas de 5 l se cargó con Fmoc-L-fenilalanina (200 g, 516 mmol Bachem), alcohol 2,4-dimetoxbencílico (95,4 g, 567 mmol, Aldrich), y CH2Cl2 (2,0 l). Se añadió t-butil acetal de N,N-dimetilformamida (155 ml, 586 mmol, Fluka) a la suspensión resultante durante 20 min bajo N2, que dio como resultado una solución transparente. La reacción se agitó a continuación a temperatura ambiente durante la noche, momento en el cual, el análisis por TLC (0,42, Heptano/EtOAc = 2:1) indicó que la reacción se había completado. La mezcla de reacción se concentró a presión reducida para dar un aceite de color amarillo claro, que se volvió a disolver en CH2C12 (200 ml) y se purificó mediante un lecho corto de gel de sílice (25 cm x 25 cm, CH2Cl2) para dar una espuma incolora (250 g). Se añadió MeCN (1 l) a la espuma resultante, que disolvió totalmente el lote. A continuación se concentró hasta sequedad y se volvió a disolver en MeCN (1 l) y la suspensión resultante se agitó durante 1 h, se filtró, y la torta del filtro se enjuagó con MeCN (2 x 200 ml) para dar Fmoc-L-fenilalanina-2,4-dimetoxibencil éster en forma de un sólido de color blanco (113,58 g, 41 %, 95,5 % ABC mediante el análisis de HPLC). Datos: HPLC.
Preparación de L-fenilalanina-2,4-dimetoxibencil éster (Phe-ODMB)
Un matraz de fondo redondeado de 500 ml se llenó con Fmoc-L-fenilalanina-2,4-dimetoxibencil éster (26,00 g), 48,3 mmol), CH2CI2 (150 ml) y dietilamina (75 ml, Acros). La mezcla se agitó a temperatura ambiente y la finalización se controló mediante HPLC. Después de 4 h, La mezcla se concentró (temperatura del baño < 30 °C). El residuo se volvió a suspender en CH2Ch (200 ml) y se concentró. Esto se repitió una vez. Al residuo se añadió MeOH (20 ml), lo que produjo la formación de un gel. Este residuo se diluyó con CH2Cl2 (200 ml), y el aceite turbio se dejó al vacío durante la noche. El residuo se suspendió en CH2Ch (100 ml), a continuación se añadió tolueno, (120 ml). La mezcla se concentró y el residuo se dejó al vacío durante la noche.
Datos: HPLC, RMN 1H.
Preparación de Fmoc-Dolaproína (Fmoc-Dap)
Boc-Dolaproína (58,8 g, 0,205 mol) se suspendió en HCl 4 N en 1,4-dioxano (256 ml, 1,02 mol, Aldrich). Después de agitar durante 1,5 horas, el análisis de TLC indicó que la reacción se había completado (10 % de MeOH/CH2Ch) y la mezcla se concentró hasta casi sequedad. Se cargó más 1,4-dioxano (50 ml) y la mezcla se concentró hasta sequedad y se secó al vacío durante la noche. El sólido de color blanco resultante se disolvió en H2O (400 ml) y se transfirió a un matraz de fondo redondeado de 3 bocas de 3 l con un agitador mecánico y una sonda de temperatura. Se añadió N,N-diisopropiletilamina (214,3 ml, 1,23 mol, Acros) durante un minuto, dando lugar a una exoterma desde 20,5 a 28,2 °C (interna). La mezcla se enfrió en un baño de hielo y se añadió 1,4-dioxano (400 ml). Se añadió una solución de Fmoc-OSu (89,90 g, 0,267 mol, Advanced ChemTech) en 1,4-dioxano (400 ml) desde un embudo de adición durante 15 minutos, manteniendo la temperatura de reacción por debajo de 9 °C. La mezcla se dejó calentar a temperatura ambiente y se agitó durante 19 horas, tras lo cual, se concentró la mezcla mediante evaporación rotatoria en una suspensión acuosa (390 g). Se diluyó la suspensión con H2O (750 ml) y Et2O (750 ml), dando lugar a la formación de un precipitado copioso de color blanco. Las capas se separaron, manteniéndose los sólidos en la capa orgánica. La capa acuosa se acidificó utilizando HCl concentrado (30 ml) y se extrajo con EtOAc (3 x 500 ml). Los extractos orgánicos combinados se secaron con MgSO4, se filtraron y se concentraron para dar 59,25 g de un aceite A de color amarillo. El extracto de Et2O se extrajo una vez con una solución saturada de NaHCO3 (200 ml), manteniendo los sólidos en la capa acuosa. La suspensión acuosa se acidificó utilizando HCl concentrado (50 ml) y se extrajo con Et2O (50 ml) manteniendo los sólidos con la capa orgánica. La capa orgánica se filtró y se concentró para dar 32,33 g de un aceite B de color amarillo. Los dos aceites (A y B) se combinaron y se purificaron mediante cromatografía instantánea sobre gel de sílice eluyendo con CH2Ch (3.5 l), a continuación 3 % de MeOH/ CH2Ch (9 l) para dar 68,23 g de Fmoc-dolaproína como una espuma de color blanco (81 %, 97,5 % de pureza mediante h PlC (ABC)).
Preparación de Fmoc-Dap-Phe-ODMB
Phe-ODMB en bruto (48,3 mmol) se suspendió en DMF anhidro (105 ml, Acros) durante 5 minutos y se añadió Fmoc-Dap (19,80 g, 48,3 mmol). La mezcla se enfrió en un baño de hielo y se añadió TBTU (17,08 g, 53,20 mmol, Matrix Innovations). Se añadió N,N-diisopropiletilamina (25,3 ml, 145,0 mmol, Acros) mediante jeringuilla durante 3 min. Después 1 h, se retiró el baño de hielo y se dejó la mezcla calentar durante 30 min. Se vertió la mezcla en agua (1 l) y se extrajo con acetato de etilo (300 ml). Tras la separación, la capa acuosa se volvió a extraer con acetato de etilo (2 x 150 ml). Las capas orgánicas combinadas se lavaron con salmuera (150 ml), se secaron (MgSO4) y se filtraron (papel de filtro) para retirar los compuestos insolubles (los compuestos inorgánicos y algo de dibenzofulveno). Después de la concentración, el residuo (41 g) se absorbió sobre sílice (41 g) y se purificó mediante cromatografía (columna de 22 cm x 8 cm; Heptano al 65 % en EtOAc (2,5 l); Heptano al 33 % en EtOAc (3,8 l), para dar 29,4 g de producto en forma de una espuma de color blanco (86 %, 92 % de pureza mediante HPLC).
Datos: HPLC, RMN 1H, TLC (1:1 EtOAc/Heptano Rf= 0,33, tinción de rojo en vainillina).
Preparación de Dap-Phe-ODMB
Un matraz de fondo redonado de 1 l se cargó con Fmoc-Dap-Phe-ODMB (27,66 g), CH2Ch (122 ml) y dietilamina (61 ml, Acros). La solución se agitó a temperatura ambiente y se controló la finalización mediante HPLC. Después de 7 h, la mezcla se concentró (temperatura del baño. <30 °C). El residuo se suspendió en CH2Cl2 (300 ml) y se concentró. Esto se repitió dos veces. Al residuo se añadió MeOH (20 ml) y CH2CI2 (300 ml), y se concentró la solución. Se suspendió el residuo en CH2Cl2 (100 ml) y tolueno (400 ml), se concentró, y el residuo se dejó al vacío durante la noche para dar un residuo de tipo crema.
Datos: HPLC, RMN 1H, MS.
Preparación de Fmoc-MeVal-Val-Dil-Dap-Phe-ODMB
Se suspendió Dap-Phe-ODMB en bruto (39,1 mmol) en DMF anhidro (135 ml, Acros) durante 5 minutos y se añadió Fmoc-MeVal-Val-Dil-OH (24,94 g, 39,1 mmol, véase el Ejemplo 2 para la preparación). La mezcla se enfrió en un baño de hielo y se añadió TBTU (13,81 g, 43,0 mmol, Matrix Innovations). Se añadió N,N-diisopropiletilamina (20,5 ml, 117,3 mmol, Acros) mediante jeringuilla durante 2 minutos. Después de 1 hora, se retiró el baño de hielo y se dejó la mezcla calentar durante 30 min. Se vertió la mezcla en agua (1,5 l) y se extrajo con acetato de etilo (480 ml). Después de reposar durante 15 minutos, las capas se separaron y la capa acuosa se extrajo con acetato de etilo (300 ml). Las capas orgánicas combinadas se lavaron con salmuera (200 ml), se secaron (MgSO4) y se filtraron (papel de filtro) para retirar los compuestos insolubles (los compuestos inorgánicos y algo de dibenzofulveno). Después de la concentración, el residuo (49 g) se rascó del matraz y se absorbió sobre sílice (49 g) y se purificó mediante cromatografía (columna de 15 cm x 10 cm; EtOAc/Heptano 2:1 (3 l), EtOAc (5 l); fracciones de 250 ml) para dar 31,84 g de Fmoc-McVal-Val-Dil-Dap-Phe-ODMB en forma de un espuma de color blanco (73 %, 93 % de pureza mediante HPLC (ABC)).
Datos: HPLC, TLC (EtOAc/heptano 2:1, Rf = 0,21, tinción de rojo en vainillina).
Preparación de MeVal-Val-Dil-Dap-Phe-ODMB
Un matraz de fondo redondo de 1 l se cargó con Fmoc-MeVal-Val-Dil-Dap-Phe-ODMB (28,50 g), CH2Cl2 (80 ml) y dietilamina (40 ml). La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante una noche y después se concentró a presión reducida. El residuo se absorbió sobre gel de sílice (30 g) y se purificó mediante cromatografía ultrarrápida (columna de 15 cm x 8 cm diá.; MeOH al 2 % en DCM (2 l), MeOH al 3 % en DCM (1 l), MeOH al 6 % en DCM (4 l); fracciones de 250 ml) para dar 15,88 g de MeVal-Val-Dil-Dap-Phe-ODMB como una espuma de color blanco (69 %, 96 % de pureza mediante HPLC (ABC)).
Datos: HPLC, TLC (MeOH al 6 % en DCM, Rf = 0,24, tinción de rojo en vainillina).
Preparación de MC-MeVal-Val-Dil-Dap-Phe-ODMB
Un matraz de fondo redondo de 50 ml se cargó con MeVal-Val-Dil-Dap-Phe-ODMB (750 mg, 0,85 mmol), DMF anhidro (4 ml), ácido maleimidocaproico (180 mg, 0,85 mmol), y TBTU (300 mg, 0,93 mmol, Matrix Innovations) a temperatura ambiente. Se añadió N,N-Diisopropiletilamida (450 pl, 2,57 mmol) con una jeringuilla. Después de 1,5 horas, la mezcla se vertió en agua (50 ml) y se diluyó con acetato de etilo (30 ml). Se añadió NaCl para ayudar en la separación. Tras la separación de las capas, la capa acuosa se extrajo con acetato de etilo (25 ml). Las capas orgánicas combinadas se secaron (MgSO4), se filtraron y se concentraron. El aceite resultante (1 g) resultante se purificó por cromatografía ultrarrápida [100 ml de gel de sílice; Heptano al 25 % en EtOAc (100 ml), Heptano al 10 % en EtOAc (200 ml), EtOAc(1,5 l) para dar MC-MeVal-Val-Dil-Dap-Phe-ODMB (13) en forma de una espuma de color blanco (521 mg, 57 %, 94 % de pureza mediante HPLC (ABC)).
Datos: RMN 1H, HPLC.
Preparación de MC-MeVal-Val-Dil-Dap-Phe-OH (MC-MMAF) (11)
Un matraz de fondo redondo de 50 ml se cargó con MC-MeVal-Val-Dil-Dap-Phe-ODMB (Compuesto 13, 428 mg, 0,39 mmol) y se disolvió en TFA al 2,5 % en CH2Ch (20 ml). La solución se volvió de color rosa-púrpura durante 2 min. La finalización se controló por HPLC y TLC (MeOH al 6 % en DCM, tinción con KMnO4). Después de 40 min, se añadieron tres gotas de agua y la mezcla turbia de color rosa púrpura se concentró para dar 521 mg de un residuo de color rosa. La purificación mediante cromatografía (IPA al 15 % en DCM) produjo 270 mg de MC-MMAF (73 %, pureza del 92 % según HPLC) en forma de un sólido de color blanco.
Ejemplo 23b - Síntesis de un análogo de mc-MMAF
Figure imgf000141_0001
MeVal-Val-Dil-Dap-Phe-OtBu (compuesto 1,35 mg, 0,044 mmol) se suspendió en DMF (0,250 ml). Se añadieron ácido 4-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-pirrol-1-il)-benzoico (11 mg, 0,049 mmol) y HATU (17 mg, 0,044 mmol) seguido por DIEA (0,031 ml, 0,17 mmol). Esta mezcla de reacción se dejó en agitación durante 2,0 h. El análisis de HPLC indicó el consumo completo de la compuesto de partida 1.
El producto se aisló mediante RP-HPLC preparativa, utilizando una columna Phenomenex C12 Synergi Max-RP 80Á (250 x 21,20 mm). Eluyente: gradiente lineal 10 % a 80 % de MeCN/0,05 % de TFA (ac) durante 8 minutos, a continuación isocrático 80 % de MeCN/0,05 % de TFA (ac) durante 12 minutos más. Se aislaron un total de 20 mg de producto puro (14) (0,02 mmol, rendimiento del 46 %). ES-MS m/z 987,85 [M+H]+; 1019,41 [M+Na]+; 985,54 [M-H]-.
Se suspendió MB-MeVal-Val-Dil-Dap-Phe-OtBu (compuesto14, 38 mg, 0,0385 mmol) en CH2Ch (1 ml) y TFA (1 ml). La mezcla se agitó durante 2,0 h, y después los compuestos orgánicos volátiles se evaporaron a presión reducida. El producto se purificó mediante RP-HPLC preparativa, utilizando una columna Phenomenex C12 Synergi Max-RP 80Á (250 x 21,20 mm). Eluyente: gradiente lineal 10 % a 80 % de MeCN/0,05 % de TFA (ac) durante 8 minutos, a continuación isocrático 80 % de MeCN/0,05 % de TFA (ac) durante 12 minutos más. Se aislaron un total de 14,4 mg de producto MB-MMAF (0,015 mmol, rendimiento del 40 %). ES-MS m/z 930,96 [M+H]+ 952,98 [M+Na]+; 929,37 [M-H]-.
Ejemplo 23c - Preparación de MC-MeVal-Cit-PAB-MMAF (16)
Figure imgf000142_0001
A una sus a temperatura ambiente de Fmoc-MeVal-OH (3.03 g, 8,57 mmol) y carbonato de N,N'-disuccimidilo (3,29 g, 12,86 mmol) en CH2Cl2 (80 ml) se añadió DIEA (4,48 ml, 25,71 mmol). Esta mezcla de reacción se dejó en agitación durante 3,0 h y después se vertió en un embudo de decantación, donde la mezcla orgánica se extrajo con una solución acuosa de HCl 0,1 M. El residuo orgánico en ruto se concentró a presión reducida, y el producto se aisló mediante cromatografía ultrarrápida en gel de sílice, usando un gradiente lineal de acetato de etilo al 20-100 % en hexanos. Se recuperó un total de 2,18 g de Fmoc-MeVal-OSu puro (4,80 mmoles, rendimiento del 56 %).
A una suspensión a temperatura ambiente de Fmoc-MeVal-OSu (2,18 g, 4,84 mmol) en DME (13 ml) y THF (6.5 ml) se añadió una solución de L-citrulina (0,85 g, 4,84 mmol) y NaHCO3 (0,41 g, 4,84 mmol) en H2O (13 ml). La suspensión se dejó en agitación a temperatura ambiente durante 16 h, después se extrajo con terc-BuOH/CHCl3/H2O, se acidificó hasta pH=2-3 con HCl 1 M. La fase orgánica se separó, se secó y se concentró a presión reducida. El residuo se trituró con dietil éter, dando como resultado 2,01 g de Fmoc-MeVal-Cit-COOH que se usó sin purificación adicional.
El Fmoc-MeVal-Cit-COOH en bruto se suspendió en CH2Ch/MeOH 2:1 (100 ml), y a esto se añadió alcohol paminobencilo (0,97 g, 7,9 mmol) y EEDQ (1,95 g, 7,9 mmol). Esta suspensión se dejó en agitación durante 125 h, a continuación, los compuestos orgánicos volátiles se eliminaron a presión reducida y el residuo se purificó mediante cromatografía en columna ultrarrápida sobre gel de sílice usando MeOH al 10 % en CH2Cl2. Se recuperó el Fmoc-MeVal-Cit-PAB-OH puro (0,55 g, 0,896 mmol, rendimiento del 18,5 %). ES-MS m /z616,48 [M+H]+.
A una suspensión de Fmoc-MeVal-Cit-PAB-OH (0,55 g, 0,896 mmol) en CH2Ch (40 ml) se añadió STRATO-SPHEREStm(resina unida a piperazina) (>5 mmol/g, 150 mg). Después de agitar a temperatura ambiente durante 16 h, la mezcla se filtró a través de celite (prelavado con MeOH), y se concentró a presión reducida. El residuo se trituró con éter dietílico y hexanos. El material sólido resultante, MeVal-Cit-PAB-OH, se suspendió en CH2Ch (20 ml), y a esto se añadió MC-OSu (0,28 g, 0,896 mmol), DIEA (0,17 ml, 0,99 mmol), y DMF (15 ml). Esta suspensión se agitó durante 16 h, pero el análisis de la mezcla de reacción mediante análisis por HPLC indicó que la reacción estaba incompleta, de forma que la suspensión se concentró a presión reducida hasta un volumen de 6 ml, después se añadió una solución acuosa de NaHCO3 al 10 % y la solución se agitó durante 16 h más. El disolvente se eliminó a presión reducida, y el residuo y el residuo se purificó mediante cromatografía en columna ultrarrápida sobre gel de sílice usando un gradiente de MeOH al 0-10 % en CH2Ch gradiente, dando como resultado 42 mg (0,072 mmol, rendimiento del 8 %) de MC-MeVal-Cit-PAB-OH.
A una suspensión de MC-MeVal-Cit-PAB-OH (2,37 g, 4,04 mmol) y bis(nitrofenil)carbonato (2,59 g, 8,52 mmol) en CH2Cl2 (10 ml) se añadió DIEA (1,06 ml, 6,06 mmol). Esta suspensión se agitó durante 5,5 h, se concentró a presión reducida, y se purificó mediante trituración con dietil éter. MC-MeVal-Cit-PAB-OCO-pNP (147 mg, 0,196 mmol) se suspendió en una solución de piridinina/DMF 1:5 (3 ml), y a esto se añadieron HOBt (5 mg, 0,039 mmol), DIEA (0,17 ml, 0,978 mmol) y MMAF (compuesto 2, 150 mg, 0,205 mmol). Esta mezcla de reacción se agitó durante 16 horas a temperatura ambiente, y después se purificó mediante RP-HPLC (x3) preparativa, utilizando una columna Phenomenex C12 Synergi Max-RP 80Á (250 x 21,20 mm). Eluyente: gradiente lineal 10 % a 90 % de MeCN/0,05 % de TFA (ac) durante 30 minutos, a continuación isocrático 90 % de MeCN/0,05 % de TFA (ac) durante 20 minutos más. Se obtuvo MC-MeVal-Cit-PAB-MMAF (16) en forma de un sólido amarillento (24,5 mg, 0,0182, rendimiento del 0,45 %). ES-MS m/z 1344,95 [M+H]+; 1366,94 [M+Na]+.
Ejemplo 23d - Preparación del éster de succinimida de suberil-Val-Cit-PAB-MMAf (17)
Figure imgf000143_0001
Compuesto 17
Compuesto 1 (300 mg, 0,38 mmol), Fmoc-Val-Cit-PAB-pNP (436 mg, 0,57 mmol, 1,5 eq.) se suspendieron en piridinina anhidra, 5 ml. HOBt (10 mg, 0,076 mmol, 0,2 eq.) se añadió seguido por DIEA (199 pl, 1,14 mmol, 3 eq.). La mezcla de reacción se sonicó durante 10 min, y a continuación se agitó durante toda la noche a temperatura ambiente. Se retiró la piridina a presión reducida, el residuo se volvió a suspender en CH2Ch. La mezcla se separó mediante cromatografía ultrarrápida en gel de sílice con un gradiente en etapas de MeOH, del 0 al 10 %, en CH2Ch. Las fracciones que contenían producto se combinaron, se concentraron, se secaron al vacío durante la noche para dar 317 mg (rendimiento del 59 %) de Fmoc-Val-Cit-PAB-MMAF-OtBu. ES-MS m/z 1415,8 [M+H]+.
Fmoc-Val-Cit-PAB-MMAF-OtBu (100 mg) se agitó con TFA al 20 % TFA en CH2Ch (10 ml), durante 2 h. La mezcla se diluyó con CH2Ch (50 ml). La capa acuosa se lavó sucesivamente con agua (2 x 30 ml) y salmuera (1 x 30 ml). La fase orgánica se concentró, se cargó sobre un lecho de gel de sílice en MeOH al 10 % en CH2Cl2. El producto se eluyó con MeOH al 30 % en CH2Cl2. Tras secar al vacío durante la noche, Fmoc-Val-Cit-PAB-MMAF se obtuvo en forma de un sólido de color blanco, 38 mg, 40 % de rendimiento. ES-MS m/z 1357,7 [M-H]-.
Fmoc-Val-Cit-PAB-MMAF, 67 mg, se suspendió en CH2Cl2 (2 ml) dietilamina (2 ml) y DMF (2 ml). La mezcla se agitó durante 2 h a temperatura ambiente. El disolvente se eliminó a presión reducida. El residuo se coevaporó con piridinina (2 ml), después con tolueno (2 x 5 ml), se secó al vacío. Val-Cit-PAB-MMAF se obtuvo en forma de un aceite de color pardo que se usó sin purificación adicional.
Todo el Val-Cit-PAB-MMAF preparado a partir de 67 mg de Fmoc-Val-Cit-PAB-MMAF, se suspendió en piridina (2 ml), y se añadió a una solución de suberato de disuccinimidilo (74 mg, 0,2 mmol, 4 eq.), en piridina (1 ml). La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente. Después de 3 horas, se añadió éter (20 ml). El precipitado se recogió, se lavó con más cantidad de éter. El sólido rojizo se suspendió en MeOH al 30 % en CH2Cl2, se filtró a través de un lecho de gel de sílice con MeOH al 30 % en CH2Cl2 como eluyente. El compuesto 17 se obtuvo en forma de un sólido de color blanco, 20 mg (29 % de rendimiento). ES-MS m/z 1388,5 [M-H]-
Ejemplo 24 - Eficacia in vivo de los conjugados de anticuerpo y fármaco mcMMAF
Eficacia de cAC10-mcMMAF en xenoinjertos de Karpas-299ALCL: Para evaluar la eficacia in vivo de cAC10-mcMMAF con un promedio de 4 restos de fármaco por anticuerpo (cAC10-mcF4), Las células Karpas-299 ALCL humanas se implantaron de forma subcutánea en ratones inmunodeficientes C.B-17 SCID (5 x 106 células por ratón). Los volúmenes tumorales se calcularon mediante la fórmula (0,5xLxW2), donde L y W son la longitud y las más corta de las dos mediciones bidimensionales. Cuando el volumen tumoral promedio de los animales del estudio alcanzó aproximadamente 100 mm3 (intervalo 48-162) los ratones se dividieron en 3 grupos (5 ratones por grupo) y bien se dejaron sin tratamiento o recibieron una sola inyección intravenosa a través de la vena de la cola con 1 o 2 mg/kg de cAC10-mcF4 (Figura 1). Los tumores de los ratones no tratados crecieron rápidamente hasta un volumen promedio de >1.000 mm3 en los 7 días desde el inicio de la terapia. Por el contrario, todos los tratados con cAC10-mcF4 mostraron una regresión rápida con 3/5 en el grupo 1 mg/kg y de 5/5 en el grupo de 2 mg/kg, consiguiendo una respuesta del tumor completa. Aunque el tumor en uno de los respondedores completo del grupo de 2 mg/kg presento recidiva al cabo de aproximadamente 4 semanas, no hubo tumores detectables en los 4/5 respondedores restantes de este grupo y en los 3 respondedores completos del grupo de 1 mg/kg en las 10 semanas posteriores a la terapia.
Eficacia de cBR96-mcMMAF en xenoinjertos de L2987 NSCLC: cBR96 es un anticuerpo quimérico que reconoce el antígeno LeY. Para evaluar la eficacia in vivo de cBR96-mcMMAF con 4 fármacos por anticuerpo (cBR96-mcF4), fragmentos tumorales de cáncer de pulmón no microcítico (NSCLC) L2987 se implantaron en ratones atímicos sin pelo. Cuando los tumores promediaron aproximadamente 100 mm3, los ratones se dividieron en 3 grupos: sin tratar y 2 grupos de terapia. Para la terapia, como se muestra en la Figura 3a, los ratones recibieron cBR96-mcF4 bien a 3 o 10 mg/kg/inyección cada 4 días para un total de 4 inyecciones (q4dx4). Tal como se muestra en la Figura 3b, los ratones recibieron cBR96-mcF4 o un conjugado de control no unido, cAC10-mcF4, a 10 mg/kg/inyección cada 4 días para un total de 4 inyecciones (q4dx4). Como se muestra en las Figuras 3a y 3b, BR96-mcF4 produjo un notable retraso en el crecimiento tumoral, en comparación con los controles.
La Figura 2 muestra un ensayo de eficacia in vivo de una sola dosis de cAC10-mcMMAF en L540CY subcutáneo. Para este estudio, se usaron 4 ratones en el grupo no tratado y 10 en cada grupo de tratamiento.
Ejemplo 25 - Eficacia in vitro de Conjugados de anticuerpo y fármaco MC-MMAF
Actividad de conjugados de anticuerpo-fármaco cAC10 contra líneas de células CD30+. Las Figuras 4a y 16b muestran curvas dosis-respuesta de un experimento representativo donde cultivos de Karpas 299 (linfoma anaplásico macrocítico) y L428 (linfoma de Hodgkin) se incubaron con cAC10-mcMMAF (Figura 4a) o cAC10-vcMMAF (Figura 4b) diluido en serie durante 96 horas. Los cultivos se marcaron durante 4 horas con resazurina 50 pM [7-hidroxi-3H-fenoxazin-3-ona-10-óxido] y se midió la fluorescencia. Los datos se redujeron en GraphPad Prism versión 4.00 usando un procedimiento de ajuste a la curva de 4 parámetros. Los valores de CI50 se definieron como la concentración donde el crecimiento se reduce al 50 % en comparación con los cultivos de control sin tratar. Cada concentración se ensayó por cuadruplicado.
Actividad de conjugados de anticuerpo-fármaco cBR96 contra líneas de células Le y+. Las Figuras 5a y 5b muestran curvas dosis-respuesta de un experimento representativo donde cultivos de H3396 (carcinoma de mama) y L2987 (carcinoma de pulmón no microcítico) se incubaron con cBR96-mcMMAF (Figura 5a) o-vcMMAF (Figura 5b) diluido en serie durante 96 horas. Los cultivos se marcaron durante 4 horas con resazurina 50 pM y se midió la fluorescencia. Los datos se redujeron en GraphPad Prism versión 4.00 usando un procedimiento de ajuste a la curva de 4 parámetros. Los valores de CI50 se definieron como la concentración donde el crecimiento se reduce al 50 % en comparación con los cultivos de control sin tratar. Cada concentración se ensayó por cuadruplicado.
Actividad de conjugados de anticuerpo-fármaco c1F6 contra líneas de células de carcinoma de células renales CD70+. Las Figuras 6a y 6b muestran curvas dosis-respuesta de un experimento representativo donde cultivos de células Caki-1 y 786-0 se incubaron con c1F6-mcMMAF (Figura 6a) o-vcMMAF (Figura 6b) diluido en serie durante 96 horas. Los cultivos se marcaron durante 4 horas con resazurina 50 pM y se midió la fluorescencia. Los datos se redujeron en GraphPad Prism versión 4.00 usando un procedimiento de ajuste a la curva de 4 parámetros. Los valores de CI50 se definieron como la concentración donde el crecimiento se reduce al 50 % en comparación con los cultivos de control sin tratar. Cada concentración se ensayó por cuadruplicado.
Ejemplo 26 - Purificación de trastuzumab
Un vial que contenía 440 mg de HERCEPTIN® (huMAb4D5-8, rhuMAb HER2, patente de Estados Unidos N° 5821337) anticuerpo) se disolvió en 50 ml de tampón MES (MES 25 mM, NaCl 50 mM, pH 5,6) y se cargaron en una columna de intercambio catiónico (Sepharose S, 15 cm x 1,7 cm) que se había equilibrado con el mismo tampón. A continuación se lavó con el mismo tampón (5 volúmenes de columna). Trastuzumab se eluyó aumentando la concentración de NaCl del tampón hasta 200 mM. Las fracciones que contenían el anticuerpo se combinaron, se diluyeron hasta 10 mg/ml, y se dializaron en un tampón que contenía fosfato de potasio 50 mm, NaCl 50 mM, EDTA 2 mM, pH 6,5.
Ejemplo 27 - Preparación de Trastuzumab-MC-MMAE por conjugación de trastuzumab y MC-MMAE Trastuzumab, disuelto en una solución de borato de sodio 500 mM y cloruro de sodio 500 mM a pH 8,0, se trata con un exceso de ditiotreitol 100 mM (DTT). Tras una incubación a 37°C durante aproximadamente 30 minutos, el tampón se intercambió por elución en resina Sephadex G25 y se eluyó con PBS con DTPA 1 mM. El valor tiol/Ab se comprobó determinando la concentración de anticuerpo reducido a partir de la absorbancia de la solución medida a 280 nm y de la concentración de tiol determinada por reacción con DTNB (Aldrich, Milwaukee, WI) y determinación de la absorbancia a 412 nm. El anticuerpo reducido disuelto en PBS se enfrió sobre hielo.
El reactivo enlazador de fármaco, maleimidocaproil-monometil auristatina E (MMAE), es decir, MC-MMAE, disueltos en DMSO, se diluyó en acetonitrilo y agua a concentración conocida, y se añadió al anticuerpo trastuzumab muy frío en PBS. Después de aproximadamente una hora, se añadió un exceso de maleimida para desactivar la reacción y proteger todos los grupos tiol del anticuerpo sin reaccionar. La mezcla de reacción se concentró mediante ultrafiltración centrífuga y trastuzumab-MC-MMAE se purificó y desaló por elución a través de resina G25 en PBS, se filtró a través de filtros de 0,2 pm en condiciones estériles, y se congeló para su almacenamiento.
Ejemplo 28 - Preparación de trastuzumab-MC-MMAF por conjugación de trastuzumab y MC-MMAF Trastuzumab-MC-MMAF se preparó por conjugación de trastuzumab y MC-MMAF según el procedimiento del Ejemplo 27.
Ejemplo 29 - Preparación de trastuzumab-MC-val-cit-PAB-MMAE por conjugación de trastuzumab y MC-val-cit-PAB-MMAE
Trastuzumab-MC-val-cit-PAB-MMAE se preparó por conjugación de trastuzumab y MC-val-cit-PAB-MMAE según el procedimiento del Ejemplo 27.
Ejemplo 30 - Preparación de trastuzumab-MC-val-cit-PAB-MMAF por conjugación de trastuzumab y MC-val-cit-PAB-MMAF 9
Trastuzumab-MC-val-cit-PAB-MMAF se preparó por conjugación de trastuzumab y MC-val-cit-PAB-MMAF 9 según el procedimiento del Ejemplo 27.
Ejemplo 31- Toxicidad en ratas
El perfil de toxicidad aguda de los fármacos libres y el ADC se evaluó en ratas Sprague Dawley adolescentes (75­ 125 g cada una, Charles River Laboratories (Hollister, CA). Los animales se inyectaron el día 1, la química completa y los perfiles hematológicos se obtuvieron en la línea base, día 3 y día 5 y se realizó necropsia complete el día 5. Las mediciones de enzimas hepáticas se realizaron sobre todos los animales y se realizó histología de rutina sobre tres animales al azar de cada grupo para los siguientes tejidos: esternón, hígado, riñón, timo, bazo, intestino grueso y delgado. Los grupos experimentales fueron los siguientes:
Figure imgf000145_0001
Para trastuzumab-MC-val-cit-MMAF, trastuzumab-MC(Me)-val-cit-PAB-MMAF, trastuzumab-MC-MMAF y trastuzumab-MC-val-cit-PAB-MMAF, el pg MMAF/m2 se calculó usando 731,5 como el MW de MMAF y 145167 como el MW de herceptina.
El área de la superficie corporal se calculó de la siguiente forma: [{(peso corporal en gramos a un potencia de 0,667) x 11,8}/10000]. (Guidance for Industry and Reviewers, 2002).
Las soluciones de dosis se administraron mediante una inyección intravenosa en bolo subcutánea en la vela de la cola en el Día 1 del estudio, a una dosis en volumen de 10 ml/kg. Los pesos corporales de los animales se midieron antes de la dosis del Día 1 del estudio, y el día posterior. Se recogió sangre completa en tubos que contenían EDTA para análisis hematológico. Las muestras de sangre se recogieron en tubos de separación de suero para análisis de química clínica. Se recogieron muestras de sangre antes de la dosis en el Día 4 del estudio, Día 3 del estudio y Día 5 del estudio. La sangre completa también se recogió en tubos que contenían heparina sódica el día de la necropsia, y el plasma se congeló a -70 °C para posible análisis posterior. Los siguientes tejidos se recogieron y se introdujeron en formalina neutra tamponada durante la necropsia: hígado, riñones, corazón, timo, bazo, cerebro, esternón y secciones del tracto GI, incluido estómago, intestino grueso y delgado. El esternón, intestino delgado, intestino grueso, hígado, timo, bazo y riñón se examinaron.
Los niveles de enzimas séricas asociadas al hígado para cada punto temporal se compararon con un intervalo (percentil 5° y 95°) para ratas Sprague Dawley hembra normales. Los recuento de glóbulos blancos y plaquetas para cada punto temporal se compararon con un intervalo (percentil 5° y 95°) para ratas Sprague Dawley hembra normales.
Los estudios de alta dosis en ratas Sprague Dawley hembra normales:
Grupo 1: Vehículo
Grupo 2: trastuzumab-MC-MMAF, 52,24 mg/kg, 4210 pg/m2
Grupo 3: trastuzumab-MC-MMAF, 68,25 mg/kg, 5500 pg/m2
Grupo 4: trastuzumab-MC-MMAF, 86,00 mg/kg, 6930 pg/m2
Los tejidos de 11 animales se enviaron para análisis histológico rutinario. Estos animales han sido parte de un estudio de toxicidad en rango agudo usando el inmunoconjugado trastuzumab-MC-MMAF. Los animales se siguieron durante 12 días tras la dosificación.
Ejemplo 32- Toxicidad/seguridad en macacos
Tres grupos de cuatro a modo de ejemplo (2 machos, 2 hembras) de Macaca fascicularis (macaco) no expuestos a tratamiento se estudiaron para trastuzumab-MC-vc-PAB-MMAE y trastuzumab-MC-vc-PAB-MMAF. La administración intravenosa se realizó en los días 1 y 22 de los estudios.
Figure imgf000146_0001
Figure imgf000146_0002
La dosificación se expresa como área superficial de un animal, de forma que sea relevante para otras especies, es decir, dosificación a pg/m2 es independiente de la especie y, por tanto, comparable entre especies. Las formulaciones de ADC contenidas en PBS, fosfato de sodio 5,4 mM, fosfato de potasio 4,2 mM, cloruro de sodio 140 mM, pH 6,5.
La sangre se recogió para análisis hematología antes de la dosis, y a 5 min., 6 h, 10 h, y 1, 3, 5, 7, 14, 21 días después de cada dosis. Los recuentos de eritrocitos (RBC) y plaquetas (PLT) se midieron según un método de dispersión de luz. El recuento de leucocitos (WBC) se midió por el método de la peroxidasa/basófilos. El recuento de reticulocitos se midió según un método de dispersión de luz con un colorante catiónico. Los recuentos de células se midieron con un aparato Advia 120. ALT (alanina aminotransferasa) y AST (aspartato aminotransferasa) se midieron por U/l mediante UV/NADH; metodología IFCC en un aparato Olympus Au400, y usando Ab Total ELISA -ECD/GxhuFc-HRP. Conj. Ab ELISA - MMAE/MMAF//ECD-Bio/SA-HRP ensayos.
Ejemplo 33 - Producción, caracterización y humanización del anticuerpo monoclonal 4D5 dirigido contra ErbB2
El anticuerpo monoclonal 4D5 murino que se une específicamente al dominio extracelular de ErbB2 se produjo como se describe en Fendly et al. (1990) Cancer Research 50:1550-1558. En resumen, células NIH 3T3/HER2-3400 (que se expresa aproximadamente a 1 x 105 ErbB2 moléculas/célula) producido como se describe en Hudziak et al. Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 84:7158-7163 (1987) se recogieron con solución salina tamponada con fosfato (PBS) que contenía EDTA 25 mM y se usaron para inmunizar ratones BALB/c. Los ratones recibieron inyecciones i.p. de 107 células en PBS 0,5 ml en las semanas 0, 2, 5 y 7. Los ratones con antisueros que inmunoprecipitaron ErbB2 marcado con 32P recibieron inyecciones i.p. de un extracto de membrana de aglutinina de germen de trigo-ErbB2 purificado en Sepharose (WGA) en las semanas 9 y 13. Esto fue seguido por una inyección i.v., de 0,1 ml de la preparación de ErbB2 y los esplenocitos se fusionaron con la línea de mieloma de ratón X63-Ag8.653. Los sobrenadantes de hibridoma se cribaron para determinar la unión de ErbB2 mediante ELISA y radioinmunoprecipitación.
Cartografiado y caracterización de epítopos
El epítopo ErbB2 unido por el anticuerpo monoclonal 4D5 se determinó mediante análisis de unión competitiva (Fendly et al. Cancer Research 50:1550 -1558 (1990)). Los estudios de bloqueo cruzado se realizaron mediante fluorescencia directa sobre células intactas, usando la PANDEX™ Screen Machine para la fluorescencia cuantitativa. El anticuerpo monoclonal se conjugó con isotiocianato de fluoresceína (FITC), usando procedimientos establecidos (Wofsy et al. Selected Methods in Cellular Immunology, p. 287, Mishel y Schiigi (eds.) San Francisco: W.J. Freeman Co. (1980)). Las monocapas confluentes de células NIH 3T3/HER2-3400 se tripsinizaron, se lavaron una vez, y se resuspendieron a 1,75 x 106 células/ml en PBS frío que contenía albúmina de suero bovino al 0,5 % (BSA) y NaN3 al 0,1 %. Una concentración final de partículas de látex al 1 % (IDC, Portland, OR) se añadió para reducir la obstrucción de las membranas de las placas PANDEX™. Células en suspensión, 20 pl, y 20 pl de anticuerpos monoclonales purificados (100 pg/ml a 0,1 pg/ml) se añadieron a los pocillos de la placa PANDEX™ y se incubaron sobre hielo durante 30 minutos. Una dilución predeterminada del anticuerpo monoclonal marcado con FITC en 20 pl se añadieron a cada pocillo, se incubó durante 30 minutos, se lavó, y la fluorescencia se cuantificó mediante PANDEX™. Se consideró que los anticuerpos monoclonales comparten un epítopo si cada uno bloquea la unión del otro en un 50 % o más en comparación con un anticuerpo monoclonal de control irrelevante. En este experimento, el anticuerpo monoclonal 4D5 recibió la asignación del epítopo I (restos de aminoácidos de aproximadamente 529 a aproximadamente 625, inclusive dentro del dominio extracelular de ErbB2.
Las características de inhibición del crecimiento del anticuerpo monoclonal 4D5 se evaluaron usando la línea de células de tumor de mama, SK-BR-3 (véase Hudziak et al. (1989) Molec. Cell. Biol. 9(3): 1165-1172). En resumen, las células SK-BR-3 se desprendieron usando tripsina al 0,25 % (vol/vol) y se suspendieron en medio completo a una densidad de 4 x 105 células por ml. Alícuotas de 100 pl (4 x 104 células) se sembraron en placas de microdilución de 96 pocillos, se dejaron adherir las células, y se añadieron 100 pl de media solo o media que contenía anticuerpo monoclonal (concentración final, 5 pg/ml) a continuación. Después de 72 horas, las placas se lavaron dos veces con PBS (pH 7,5), se tiñeron con violeta cristal (0,5 % en metanol), y se analizaron para determinar la proliferación celular relativa como se describe en Sugarman et al. (1985) Science 230:943-945. El anticuerpo monoclonal 4D5 inhibió la proliferación relativa de células SK-BR-3 en aproximadamente un 56 %.
También se evaluó la capacidad del anticuerpo monoclonal 4D5 para inhibir la fosforilación de la tirosina de proteínas estimulada con HRG en el intervalo de Mr 180,000 procedentes de lisados de células MCF7 completas (Lewis et al. (1996) Cancer Research 56:1457-1465). Se sabe que las células MCF7 expresan todos los receptores de ErbB, pero a relativamente bajos niveles. Como ErbB2, ErbB3, y ErbB4 tienen tamaños moleculares casi idénticos, no es posible discernir qué proteína tiene la tirosina fosforilada cuando los lisados de células completas, se evaluaron mediante análisis por transferencia Western. Sin embargo, estas células son ideales para los ensayos de fosforilación de tirosina HRG debido a las condiciones de ensayo usadas, en ausencia de HRG añadido exógenamente, muestran niveles de indetectables a bajos de fosforilación de tirosina de proteínas en el intervalo de Mr 180.000.
Las células MCF7 se sembraron en placas de 24 pocillos y pueden añadirse anticuerpos monoclonales a ErbB2 a cada pocillo e incubarse durante 30 minutos a temperatura ambiente; después se añadió rHRGpl 177-244 a cada pocillo hasta una concentración final de 0,2 nM, y la incubación puede continuarse durante 8 minutos. El medio se aspiró cuidadosamente de cada pocillo, y se detuvieron las reacciones mediante la adición de 100 pl de tampón de muestra SDS (SDS al 5 %, DTT 25 mM; y Tris-HCl 25 mM, pH 6,8). Cada muestra (25 pl) se sometió a electroforesis en un gel de gradiente de 4-12 % (Novex) y después transferirse electroforéticamente a membrana de difluoruro de polivinilideno. Antifosfotirosina (4G10, de UBI, usada a 1 pg/ml), se usó para revelar las inmunotransferencias, y la intensidad de la banda reactiva predominante Mr 180.000 se cuantifió mediante densitometría de reflectancia, como se ha descrito anteriormente (Holmes et al. (1992) Science 256:1205-1210; Sliwkowski y col. J. Biol. Chem.
269:14661-14665 (1994)).
El anticuerpo monoclonal 4D5 inhibió significativamente la generación de una señal de fosforilación de tirosina inducida por a Mr 180.000. En ausencia de HRG, pero fue incapaz de estimular la fosforilación de la tirosina en proteínas en el intervalo Mr 180.000. También, este anticuerpo no reacciona en cruzado con EGFR (Fendly et al. Cancer Research 50:1550-1558 (1990)), ErbB3 o ErbB4. El anticuerpo monoclonal 4D5 fue capaz de bloquear la fosforilación de tirosina estimulada con HRG en un 50 %.
Se evaluó el efecto inhibidor del crecimiento del anticuerpo monoclonal 4D5 sobre células MDA-MB-175 y SK-BR-3 en presencia o ausencia de rHRGpl exógeno (Schaefer et al. Oncogene 15:1385-1394 (1997)). Los niveles de ErbB2 en células MDA-MB-175 son 4-6 veces superiores al nivel encontrado en células epiteliales de mama normales y el receptor ErbB2-ErbB4 tiene l tirosina fosforilada de forma constitutiva en células MDA-MB-175. El anticuerpo monoclonal 4D5 fue capaz de inhibir la proliferación celular de células MDA-MB-175, tanto en presencia como en ausencia de HRG exógeno. La inhibición de la proliferación celular mediante 4D5 es dependiente del nivel de expresión de ErbB2 (Lewis et al. Cancer Immunol. Immunother. 37:255-263 (1993)). Se pudo detectar una inhibición máxima del 66 % en las células SK-BR-3. Sin embargo, este efecto se pudo superar mediante HRG exógeno.

Claims (13)

REIVINDICACIONES
1. Un conjugado que tiene la fórmula:
LU-Df
o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en la que:
LU- es una Unidad enlazadora que comprende un grupo funcional capaz de unirse a un ligando o a un anticuerpo, y
Df es un grupo que tiene la siguiente fórmula:
Figure imgf000238_0001
en la que:
independientemente en cada localización:
R2 se selecciona entre H y alquilo C1-C8;
R3 se selecciona de H, alquilo C1-C8, carbociclo C3-C8, arilo, alquilarilo C1-C8, alquil C1-C8-(carbociclo C3-C8), heterociclo C3-C8 y alquil C1-C8-(heterociclo C3-C8);
R4 se selecciona de H, alquilo C1-C8, carbociclo C3-C8, arilo, alquilarilo C1-C8, alquil C1-C8-(carbociclo C3-C8), heterociclo C3-C8 y alquil C1-C8-(heterociclo C3-C8);
R5 se selecciona entre H y metilo;
o:
R4 y R5 forman conjuntamente un anillo carbocíclico que tiene la fórmula -(CRaRb)n-, en la que Ra y Rb se seleccionan de forma independiente de H, alquilo C1-C8 y carbociclo C3-C8 y n se selecciona entre 2, 3, 4, 5 y 6; R6 se selecciona entre H y alquilo C1-C8;
R7 se selecciona de H, alquilo C1-C8, carbociclo C3-C8, arilo, alquilarilo C1-C8, alquil C1-C8-(carbociclo C3-C8), heterociclo C3-C8 y alquil C1-C8-(heterociclo C3-C8);
cada R8 se selecciona independientemente entre H, OH, alquilo C1-C8, carbociclo C3-C8 y O-(alquilo C1-C8);
R9 se selecciona entre H y alquilo C1-C8;
R10 se selecciona entre arilo y heterociclo C3-C8;
Z es O, S, NH o NR12, en donde R12 es alquilo C1-C8;
R11 se selecciona entre H, alquilo C1-C20, -(R13O)m-R14 y -(R13O)m-CH(R15)2;
m es un número entero comprendido de 1 a 1000;
R13 es alquilo C2-C8;
R14 es H o alquilo C1-C8;
cada aparición de R15 es independientemente H, COOH, -(CH2)n-N(R16)2, -(CH2)n- SO3H o -(CH2)n-SO3- alquilo C1-C8;
cada aparición de R16 es independientemente H, alquilo C1-C8 o -(CH2)n-COOH; y
n es un número entero comprendido entre 0 y 6.
2. Un conjugado de la reivindicación 1, en el que la Unidad enlazadora comprende:
-Aa-Ww-Yyen la que
-A- es una Unidad ensanchadora,
a es 0 o 1,
cada -W- es independientemente una Unidad de aminoácido,
w es un número entero comprendido entre 0 y 12,
-Y- es una Unidad separadora, y
y es 0, 1 o 2.
3. Un conjugado de la reivindicación 2, o una sal o un solvato farmacéuticamente aceptables del mismo, en donde w es un número entero comprendido entre 2 y 12.
4. Un conjugado de la reivindicación 2, o una sal o un solvato farmacéuticamente aceptables del mismo, en donde w es 2.
5. Un conjugado de acuerdo con la reivindicación 2, o una sal o un solvato farmacéuticamente aceptables del mismo, en donde Ww es -valina-citrulina-, -fenilalanina-lisina- o
-N-metil valina-citrulina-.
6. Un conjugado de acuerdo con la reivindicación 2, o una sal o un solvato farmacéuticamente aceptables del mismo, en donde Ww es -valina-citrulina-.
7. Un conjugado de acuerdo con la reivindicación 2, o una sal o un solvato farmacéuticamente aceptables del mismo, en donde la Unidad enlazadora comprende:
Figure imgf000239_0001
8. Un conjugado de acuerdo con la reivindicación 2, o una sal o un solvato farmacéuticamente aceptables del mismo, en donde la Unidad enlazadora comprende:
Figure imgf000239_0002
9. Un conjugado de acuerdo con la reivindicación 2, o una sal o un solvato farmacéuticamente aceptables del mismo, en donde la Unidad enlazadora comprende:
10. Un conjugado de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, o una sal o un solvato farmacéuticamente aceptables del mismo, en donde R2 y R6 son cada uno metilo, y R9 es -H.
11. Un conjugado de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, o una sal o un solvato farmacéuticamente aceptables del mismo, en donde R2 y R6 son cada uno metilo, R5 es -H, R7 es sec-butilo, cada aparición de R8 es -OCH3, y R9 es -H.
12. Un conjugado de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, o una sal o un solvato farmacéuticamente aceptables del mismo, en donde DF es:
Figure imgf000240_0001
13. Un compuesto que tiene la fórmula:
Figure imgf000240_0002
en la que:
independientemente en cada localización:
R2 se selecciona entre H y alquilo C1-C8;
R3 se selecciona de H, alquilo C1-C8, carbociclo
Figure imgf000240_0003
C3-C8, arilo, alquilarilo C1-C8, alquil C1-C8-(carbociclo heterociclo C3-C8 y alquil C1-C8-(heterociclo C3-C8);
R4 se selecciona de H, alquilo C1-C8, carbociclo
Figure imgf000240_0004
C3-C8, arilo, alquilarilo C1-C8, alquil C1-C8-(carbociclo heterociclo C3-C8 y alquil C1-C8-(heterociclo C3-C8);
R5 se selecciona entre H y metilo;
o:
R4 y R5 forman conjuntamente un anillo carbocíclico que tiene la fórmula -(CRaRb)n-, en donde Ra
y Rb se seleccionan independiente entre H, alquilo C1-C8 y carbociclilo C3-C8, y
n se selecciona entre 2, 3, 4, 5 y 6;
R6 se selecciona entre H y alquilo C1-C8;
R7 se selecciona de H, alquilo C1-C8, carbociclo C3-C8, arilo, alquilarilo C1-C8, alquil C1-C8-(carbociclo C3-C8), heterociclo C3-C8 y alquil C1-C8-(heterociclo C3-C8);
cada R8 se selecciona independientemente entre H, OH, alquilo C1-C8, carbociclo C3-C8 y O-(alquilo C1-C8);
R9 se selecciona entre H y alquilo C1-C8;
R10 se selecciona entre arilo y heterociclo C3-C8;
Z es O, S, NH o NR12, en donde R12 es alquilo C1-C8;
R11 se selecciona entre H, alquilo C1-C20, -(R13O)m-R14 y -(R13O)m-CH(R15)2;
m es un número entero comprendido de 1 a 1000;
R13 es alquilo C2-C8;
R14 es H o alquilo C1-C8;
cada aparición de R15 es independientemente H, COOH, -(CH2)n-N(R16)2, -(CH2)n-SO3H o -(CH2)n-SO3-alquilo C1-C8;
cada aparición de R16 es independientemente H, -alquilo C1-C8 o -(CH2)n-COOH; y
n es un número entero comprendido entre 0 y 6.
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