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KR101520209B1 - 리간드에 접합될 수 있는 모노메틸발린 화합물 - Google Patents

리간드에 접합될 수 있는 모노메틸발린 화합물 Download PDF

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KR101520209B1
KR101520209B1 KR1020137025895A KR20137025895A KR101520209B1 KR 101520209 B1 KR101520209 B1 KR 101520209B1 KR 1020137025895 A KR1020137025895 A KR 1020137025895A KR 20137025895 A KR20137025895 A KR 20137025895A KR 101520209 B1 KR101520209 B1 KR 101520209B1
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KR
South Korea
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antibody
cancer
drug
alkyl
antibodies
Prior art date
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KR1020137025895A
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English (en)
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KR20130119004A (ko
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스베틀라나 오. 도로니나
피터 디. 센터
브라이언 이. 토키
알렌 제이. 에번스
토니 베스 클라인
폴 폴라키스
마르크 엑스. 슬리우코우스키
수잔 디. 스펜서
Original Assignee
시애틀 지네틱스, 인크.
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Publication date
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Application filed by 시애틀 지네틱스, 인크. filed Critical 시애틀 지네틱스, 인크.
Publication of KR20130119004A publication Critical patent/KR20130119004A/ko
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Abstract

MeVal-Val-Dil-Dap-노레페드린 (MMAE) 및 MeVal-Val-Dil-Dap-Phe (MMAF)을 비롯한 아우리스타틴 펩티드는 제조되어서 말레이미도카프로일-Val-cit-PAB를 비롯한 각종 링커를 통해 리간드에 부착된다. 생성된 리간드 약물 접합체는 시험관내 및 생체내에서 활성이다.

Description

리간드에 접합될 수 있는 모노메틸발린 화합물{MONOMETHYLVALINE COMPOUNDS CAPABLE OF CONJUGATION TO LIGANDS}
본 출원은 2003년 11월 6일에 출원된 미국 가특허출원 제60/518,534호; 2004년 3월 26일에 출원된 미국 가특허출원 제60/557,116호; 2004년 8월 4일에 출원된 미국 가특허출원 제60/598,899호; 및 2004년 10월 27일에 출원된 미국 가특허출원 제60/622,455호를 우선권으로 주장하며, 이들의 개시내용은 본원에 참고문헌으로 도입되어 있다.
본 발명은 약물 화합물, 보다 구체적으로는 약물-링커-리간드 접합체, 약물-링커 화합물, 및 약물-리간드 접합체, 이를 포함하는 조성물, 암, 자가면역 질환 또는 감염성 질환을 치료하기 위하여 이를 이용하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 항체-약물 접합체, 이를 포함하는 조성물, 및 암, 자가면역 질환 또는 감염성 질환을 치료하기 위하여 이를 사용하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 시험관내, 계내, 및 생체내에서 포유동물 세포 또는 관련 병리학적 상태의 진단 또는 치료를 위하여 항체-약물 접합체 화합물을 사용하는 방법에 관한 것이다.
최대의 효능 및 최소의 독성을 얻기 위하여 약물 및 다른 제제의 표적 세포, 조직 및 종양으로의 전달을 개선하는 것은 관심을 받아왔으며, 수년간 상당한 연구가 수행되었다. 생물학적 활성 분자를 세포내로 수송하는 효과적인 방법을 개발하기 위하여 많은 시도가 이루어졌으나, 생체내 및 시험관내 둘다에서 완전히 만족스러운 것으로 증명된 것은 없었다. 약물과 세포내 표적과의 결합을 최적화하면서, 예를 들어 인접 세포로의 약물의 세포간 재분포를 최소화하는 것은 종종 어렵고 비효율적이다.
현재 환자에게 비경구적으로 투여되는 대부분의 제제는 표적화되어 있지 않아서, 불필요한 체내의 세포 및 조직으로 제제를 전신적으로 전달하게 되며, 이는 종종 바람직하지 않다. 이는 약물의 유해한 부작용을 야기할 수 있고, 종종 투여될 수 있는 약물 (예를 들어, 화학요법제 (항암제), 세포독성제, 효소 억제제 및 항바이러스제 또는 항미생물제)의 투여량을 제한하게 된다. 비교에 의하면, 약물의 경구 투여가 투여의 편리하고 경제적인 방식으로 고려되지만, 약물이 일단 전신적 순환으로 흡수되면 영향을 받지 않은 세포로 비특이적 독성이 있을 우려가 있다. 또한, 합병증은 경구 생체이용률, 및 장 (gut)이 약물에 추가로 노출되어 장 독성의 위험을 야기하는 약물의 장내 체류시간과 관련된 문제점과 연관이 있다. 따라서, 주요 목적은 세포 및 조직으로 제제를 특이적으로 표적화하기 위한 방법을 개발하는 것이다. 그러한 치료방법의 장점은 다른 세포 및 조직 (예를 들어, 감염되지 않은 세포)으로 이러한 제제의 부적절한 전달에 의한 일반적인 생리학적 효과를 회피하는 것을 포함한다. 세포내 표적화는 생물학적 활성 제제 (즉, 세포 내의 활성 대사물질)의 축적 및 잔류를 가능하게 하는 방법, 화합물 및 제형에 의하여 달성할 수 있다.
모노클로날 항체 치료법은 암, 면역학적 장애 및 혈관형성 장애를 갖는 환자의 표적화된 치료를 위하여 확립되었다.
세포독성제 또는 세포증식억제제, 예를 들어, 암의 치료에서 종양 세포를 사멸시키거나 억제하는 약물의 국소 전달용 항체-약물 접합체의 용도는 (Syrigos and Epenetos (1999) Anticancer Research 19: 605-614; Niculescu-Duvaz and Springer (1997) Adv. Drg.Del. Rev. 26: 151-172; 미국 특허 제4975278호) 이론적으로 종양으로 약물 잔기의 표적화된 전달 및 그안에서의 세포내 축적을 가능하게 하고, 이들 접합되지 않은 약물 제제의 전신적 투여는 제거되어야 할 종양 세포 뿐만 아니라 정상 세포에 대해 허용될 수 없는 수준의 독성을 야기할 수 있다 (Baldwin et al., 1986, Lancet pp. (Mar. 15, 1986): 603-05; Thorpe, 1985, "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review, "in Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications, A. Pinchera et al. (ed. s), pp. 475-506). 따라서, 최소의 독성을 갖는 최대의 효능을 찾아야 한다. 폴리클로날 항체 및 모노클로날 항체 둘다는 이러한 전략에서 유용하다고 보고되었다 (Rowland et al., 1986, Cancer Immunol. Immunother. 21: 183-87). 이러한 방법에서 사용된 약물은 다우노마이신, 독소루비신, 메토트렉세이트 및 빈데신을 포함한다 (Rowland et al., 1986의 상기 문헌). 항체-독소 접합체에 사용된 독소는 박테리아 독소, 예를 들어 디프테리아 독소, 식물 독소, 예를 들어 리신, 소분자 독소, 예를 들어, 겔다나마이신 (Kerr et al., 1997, Bioconjugate Chem. 8 (6): 781-784; Mandler et al. (2000) Jour. of the Nat. Cancer Inst. 92 (19): 1573-1581; Mandler et al. (2000) Bioorganic & Med. Chem. Letters 10: 1025-1028; Mandler et al. (2002) Bioconjugate Chem. 13: 786-791), 메이탄시노이드 (EP 1391213; Liu et al., (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 8618-8623), 및 칼리체아미신 (Lodeet al. (1998) Cancer Res. 58: 2928; Hinman et al. (1993) Cancer Res. 53: 3336-3342)를 포함한다. 독소는 튜불린 결합, DNA 결합, 또는 토포이소머라제 억제를 포함하는 메카니즘에 의하여 그들의 세포독성 및 세포증식억제 효과를 일으킬 수 있다 (Meyer, D.L. and Senter, P.D. "Recent Advances in Antibody Drug Conjugates for Cancer Therapy" in Annual Reports in Medicinal Chemistry, Vol 38 (2003) Chapter 23, 229-237). 일부 세포독성 약물은 큰 항체 또는 단백질 수용체 리간드에 접합될 때, 비활성이거나 덜 활성이 되는 경향이 있다.
제발린 (ZEVALIN) (등록상표) (이브리투모마브 티욱세탄, Biogen/Idec)은 티오우레아 링커(linker)-킬레이터에 의하여 결합되는 111In 또는 90Y 방사성동위원소 및 보통 및 악성 B 림프구의 표면 상에서 발견되는 CD20 항원에 대한 뮤린(murine) IgG1 카파 모노클로날 항체로 이루어진 항체-방사성동위원소 접합체이다 (Wiseman et al. (2000) Eur. Jour. Nucl. Med. 27 (7):766-77; Wiseman et al. (2002) Blood 99 (12):4336-42; Witzig et al. (2002) J. Clin. Oncol. 20 (10): 2453-63; Witzig et al. (2002) J. Clin. Oncol. 20 (15): 3262-69). 제발린은 B-세포 비-호지킨 림프종 (NHL)에 대한 활성을 가지지만, 투여는 대부분의 환자에서 중증이면서 지연된 혈구감소증을 야기한다. 칼리체아미신에 연결된 hu CD33 항체로 이루어진 항체 약물 접합체인 밀로타르그 (MYLOTARGTM) (겜투주마브 오조카미신 (gemtuzumab ozogamicin), 위트 파마슈티칼스 (Wyeth Pharmaceuticals))은 주사에 의한 급성 골수성 백혈병의 치료용으로 2000년에 승인받았다 (문헌[Drugs of the Future (2000) 25 (7): 686]; 미국 특허 제4970198; 5079233; 5585089; 5606040; 5693762; 5739116; 5767285; 5773001호). 메이탄시노이드 약물 잔기 (DM1)에 디술피드 링커 SPP를 통하여 연결된 huC242 항체로 구성된 항체 약물 접합체인 칸투주마브 메르탄신 (Cantuzumab mertansine) (이뮤노겐 인크 (Immunogen Inc.))은 결장, 췌장, 위 등과 같이 CanAg를 발현하는 암의 치료를 위한 제2상 임상시험 단계를 진행 중이다. 메이탄시노이드 약물 잔기 (DM1)에 연결된 항-전립선 특이적 막 항원 (PSMA) 모노클로날 항체로 이루어진 항체 약물 접합체인 MLN-2704 (밀레니엄 팜 (Millennium Pharm), BZL 바이올로직스 (BZL Biologics), 이뮤노겐 인크)는 전립선 종양의 강력한 치료제로 개발중에 있다. 동일한 메이탄시노이드 약물 잔기 (DM1)는 마우스 뮤린과 모노클로날 항체 (TA.1)에 비-디술피드 링커 (SMCC)를 통하여 연결되어 있다 (Chari et al. (1992) Cancer Research 52: 127-131). 이 접합체는 상응하는 디술피드 링커 접합체보다 200배 덜 강력하다고 보고되었다. 본원에서 SMCC 링커는 "비분해성 (noncleavable)"인 것으로 고려하였다.
몇몇 짧은 펩티드 화합물은 해양 연체동물 돌라벨라 아우리쿨라리아 (Dolabella auricularia)로부터 단리되었고, 생물학적 활성을 가진 것으로 밝혀졌다 (Pettit et al. (1993) Tetrahedron 49: 9151; Nakamura et al. (1995) Tetrahedron Letters 36: 5059-5062; Sone et al. (1995) Jour. Org Chem. 60: 4474). 이들 화합물들의 유사체가 제조되었고, 일부는 생물학적 활성을 가진다고 밝혀졌다 (개관을 위하여 문헌[Pettit et al. (1998) Anti-Cancer Drug Design 13: 243-277] 참조). 예를 들어, 아우리스타틴 E (auristatin E) (미국 특허 번호 제5635483호)는 항암제 빈크리스틴과 같이 튜불린 상의 동일한 도메인에 결합하여 튜불린 중합을 억제하는 제제인 해양 천연 생성물, 돌라스타틴 10 (Dolastatin 10)의 합성 유사체이다 (G.R. Pettit, (1997) Prog. Chem. Org. Nat. Prod. 70: 1-79). 돌라스타틴 10, 아우리스타틴 PE 및 아우리스타틴 E는 4개의 아미노산 (이중 3개는 화합물의 돌라스타틴 부류에 특이적인 것임), 및 C-말단 아미드를 가진 선형 펩티드이다.
아우리스타틴 펩티드, 아우리스타틴 E (AE) 및 모노메틸아우리스타틴 (MMAE) (돌라스타틴의 합성 유사체)은 하기에 접합된다: (i) 키메라 모노클로날 항체 cBR96 (암종 상의 루이스 Y (Lewis Y)에 특이적); (ii) 혈액암 상의 CD30에 특이적인 cAC10 (Klussman, et al. (2004), Bioconjugate Chemistry 15(4): 765-773; Doronina et al. (2003) Nature Biotechnology 21(7): 778-784; "Monomethylvaline Compounds Capable of Conjugation to Ligands"; Francisco et al. (2003) Blood 102(4): 1458-1465; 미국 공개번호 2004/0018194); (iii) CD20-발현 암 및 면역 장애의 치료를 위한 리툭산 (RITUXAN) (등록상표) (WO 04/032828)과 같은 항-CD20 항체; (iv) 직장결장암의 치료를 위한 항-EphB2 항체 2H9 및 항-IL-8 (Mao, et al. (2004) Cancer Research 64(3): 781-788); (v) E-셀렉틴 항체 (Bhaskar et al. (2003) Cancer Res. 63: 6387-6394); 및 (vi) 다른 항-CD30 항체 (WO 03/043583).
모노클로날 항체에 접합되는 아루리스타틴 E는 문헌[Senter et al, Proceedings of the American Association for Cancer Research, Volume 45, Abstract Number 623, presented March 28, 2004]에 개시되어 있다.
돌라스타틴 부류의 화합물 및 그의 유사체에 대한 시험관내 데이타에도 불구하고, 치료 효과를 얻는데 요구되는 투여량에서의 현저한 일반적인 독성은 임상 연구에서의 그의 효능을 저하시킨다. 따라서, 현저하게 낮은 독성을 가지면서도 유용한 치료적 효율성을 갖는 돌라스타틴/아우리스타틴 유도체가 당업계에서 요구된다. 과거의 이들 및 다른 한계점 및 문제점을 본 발명에서 해결하였다.
수용체 타이로신 키나아제의 ErbB 족은 세포 성장, 분화 및 생존의 중요한 매개체이다. 수용체 족은 상피 성장 인자 수용체 (EGFR, ErbB1, HER1), HER2 (ErbB2 또는 p185neu), HER3 (ErbB3) 및 HER4 (ErbB4 또는 tyro2)를 포함하는 4종의 상이한 구성원을 포함한다. 항-ErbB2 항체의 패널은 인간 유방 종양 세포주 SKBR3을 이용하여 특징규명하였다 (Hudziak et al., (1989) Mol. Cell. Biol. 9(3): 1165-1172). 최대 억제율은 56％로 세포 증식을 억제하는, 4D5로 지칭되는 항체에 의해 얻었다. 패널의 다른 항체는 이 분석법에서 적은 정도로 세포 증식을 감소시킨다. 항체 4D5는 추가로 TNF-α의 세포독성 효과에 ErbB2-과발현 유방 종양 세포주를 민감하게 한다고 밝혀졌다 (미국 특허 번호 제5677171호). 문헌[Hudziak et al.]에서 논의된 항-ErbB2 항체는 추가로 문헌[Fendly et al. (1990) Cancer Research 50: 1550-1558; Kotts et al. (1990) In vitro 26 (3): 59A]; [Sarup et al. (1991) Growth Regulation 1: 72-82]; [Shepard et al. J. (1991) Clin. Immunol. 11 (3): 117-127]; [Kumar et al. (1991) Mol. Cell. Biol. 11 (2): 979-986]; [Lewis et al. (1993) Cancer Immunol. Immunother. 37: 255-263]; [Pietras et al. (1994) Oncogene 9: 1829-1838]; [Vitetta et al. (1994) Cancer Research 54: 5301-5309]; [Sliwkowski et al. (1994) J. Biol. Chem. 269 (20): 14661-14665]; [Scottet al. (1991) J. Biol. Chem. 266: 14300-5]; [D'souza et al. Proc. Natl. Acad. Sci. (1994) 91: 7202-7206]; [Lewis et al. (1996) Cancer Research 56: 1457-1465]; 및 [Schaefer et al. (1997) Oncogene 15: 1385-1394]에 특징규명되어 있다.
다양한 특성을 갖는 다른 항-ErbB2 항체는 문헌[Tagliabue et al. Int. J. Cancer 47: 933-937(1991)]; [McKenzie et al. Oncogene 4: 543-548 (1989); Maier et al. Cancer Res. 51: 5361-5369 (1991)]; [Bacus et al. Molecular Carcinogenesis 3: 350-362 (1990)]; [Stancovski et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 8691-8695 (1991)]; [Bacus et al. Cancer Research 52: 2580-2589(1992)]; [Xu et al. Int. J. Cancer 53: 401-408 (1993)]; W094/00136; [Kasprzyk et al. Cancer Research 52: 2771-2776 (1992)]; [Hancock et al. (1991) Cancer Res. 51: 4575-4580]; [Shawver et al. (1994) Cancer Res. 54: 1367-1373]; [Arteaga et al. (1994) Cancer Res. 54: 3758-3765]; [Harwerth et al. (1992) J. Biol. Chem. 267: 15160-15167]; 미국 특허 제5783186호; 및 [Klapper et al (1997) Oncogene 14: 2099-2109]에 기재되었다.
상동성 스크리닝으로 2개의 다른 ErbB 수용체 족 구성원인 ErbB3 (미국 특허 제5,183,884호; 미국 특허 제5,480,968; 문헌[KraU. S. et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 9193-9197]) 및 ErbB4 (EP 599274; [Plowman et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 1746-1750]; 및 [Plowman et al. (1993) Nature 366: 473-475])를 확인하였다. 이들 수용체 둘다는 적어도 일부 유방암 세포주 상에서 발현이 증가된 것으로 나타난다.
헤르셉틴 (HERCEPTIN) (등록상표) (트라츠주마브)는 세포-기재 분석법에서 인간 상피 성장 인자 수용체 2 단백질 (HER2 (ErbB2))의 세포외 도메인에 높은 친화도 (Kd = 5 nM)로 선택적으로 결합하는 재조합 DNA-유도 인간화 모노클로날 항체이다 (미국 특허 제5821337호; 미국 특허 제6054297호; 미국 특허 제6407213호; 미국 특허 제6639055호; 문헌[Coussens L, et al. (1985) Science 230: 1132-9]; [Slamon DJ, et al. (1989) Science 244: 707-12]). 트라츠주마브는 HER2에 결합하는 뮤린 항체 (4D5)의 상보성-결정 영역을 갖는 인간 프레임워크 영역을 함유하는 IgG1 카파 항체이다. 트라츠주마브는 HER2 항원에 결합함으로써 암 세포의 성장을 억제한다. 트라츠주마브는 인간화 항체이기 때문에, 이는 환자의 임의의 HAMA 반응을 최소화한다. HER2에 대한 인간화 항체는 포유동물 세포 (중국 햄스터 난소, CHO) 현탁 배양에 의하여 생성된다. HER2 (또는 c-erbB2) 원발암유전자는 상피 성장 인자 수용체에 구조적으로 관련되어 있는 185 kDa의 막횡단 수용체 단백질을 코딩한다. HER2 단백질 과발현은 일차 유방암의 25％-30％에서 관찰되고, 고정된 종양 블록의 면역조직화학 기초 측정법을 이용하여 결정할 수 있다 (Press MF, et al. (1993) Cancer Res 53: 4960-70). 트라츠주마브는 시험관내 분석법 및 동물 둘다에서 HER2를 과발현하는 인간 종양 세포의 증식을 억제한다고 나타났다 (Hudziak RM, et al. (1989) Mol Cell Biol 9: 1165-72; Lewis GD, et al. (1993) Cancer Immunol Immunother; 37: 255-63; Baselga J, et al. (1998) Cancer Res. 58: 2825-2831). 트라츠주마브는 항체-의존성 세포 독성 (ADCC)의 매개체이다 (Hotaling TE, et al. (1996) [abstract]. Proc. Annual Meeting Am Assoc Cancer Res; 37:471; Pegram MD, et al. (1997) [abstract]. Proc Am Assoc Cancer Res; 38: 602). 시험관내에서, 트라츠주마브 매개 ADCC는 HER2를 과발현하지 않는 암 세포에 비교하여 HER2 과발현 암세포 상에서 우세하게 이루어진다고 나타났다. 단일 제제로서 헤르셉틴 (등록상표)은 종양이 HER2 단백질을 과발현하는 전이성 유방암을 가지며, 전이성 질환을 위한 하나 이상의 화학치료 요법을 받은 환자의 치료를 위하여 처방된다. 파클리탁셀과 병용하는 헤르셉틴 (등록상표)은 종양이 HER2 단백질을 과발현하는 전이성 유방암을 가지며, 그의 전이성 질환을 위한 화학요법을 받지 않은 환자의 치료를 위하여 처방된다. 헤르셉틴 (등록상표)는 이전에 광범위한 항암 요법을 받았던 ErbB2-과발현 전이성 유방암 환자에게서 임상적으로 활성이다 (Baselga et al, (1996) J. Clin. Oncol. 14: 737-744).
뮤린 모노클로날 항-HER2 항체는 2+ 및 3+ (세포 당 1-2 x 106개의 HER2 수용체) 수준으로 HER2를 과발현하는 유방암 세포주의 성장을 억제하지만, 낮은 수준의 HER2을 발현하는 세포에 대해서는 활성이 없다 (Lewis et al., (1993) Cancer Immunol. Immunother. 37: 255-263). 이 관찰에 기초하여, 항체 4D5는 인간화되어 있으며 (huMAb4D5-8, rhuMAb HER2, 미국 특허 제5821337호; 문헌[Carter et al., (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 4285-4289]), 종양이 HER2를 과발현하지만, 통상의 화학요법 이후에 진행된 유방암 환자에서 시험하였다 (Cobleigh et al., (1999) J. Clin. Oncol. 17: 2639-2648).
헤르셉틴은 이전에 광범위한 항암요법을 받은 ErbB2-과발현 유방암 환자의 치료에 있어서 중요한 발견이긴 하지만, 이 집단 중의 일부 환자는 헤르셉틴 치료에 반응하지 않거나, 단지 빈약하게 반응한다.
그러므로, HER2-과발현 종양 또는 헤르셉틴 치료에 반응하지 않거나 빈약하게 반응하는 HER2 발현과 관련된 다른 질환을 가진 환자를 위한 추가의 HER2-관련 암 치료법에 대해 충분히 임상적으로 요구되고 있다.
본 출원에서의 임의의 참조문헌의 인용은 그 문헌을 본 출원 이전의 선행기술로 승인하는 것은 아니다.
한 측면에서, 본 발명은 하기 화학식 Ia를 갖는 약물-링커-리간드 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염 또는 용매화물을 제공한다.
<화학식 Ia>
Figure 112013088873035-pat00001
상기 식에서,
L-은 리간드 단위이고;
-Aa-Ww-Yy-는 링커 단위 (LU)이고, 여기서 링커 단위 중
-A-는 스트레처 단위 (Stretcher unit)이고,
a는 0 또는 1이고,
각각의 -W-는 독립적으로 아미노산 단위이고,
w는 0 내지 12 범위의 정수이고,
-Y-는 스페이서 단위 (Spacer unit)이고,
y는 0, 1 또는 2이고;
p는 1 내지 약 20 범위이고;
-D는 하기 화학식 DE 및 DF를 갖는 약물 단위이며:
<화학식 DE>
Figure 112013088873035-pat00002
<화학식 DF>
Figure 112013088873035-pat00003
여기서, 각각의 위치에서 독립적으로:
R2는 H 및 C1-C8 알킬로부터 선택되고;
R3는 H, C1-C8 알킬, C3-C8 카르보사이클, 아릴, C1-C8 알킬-아릴, C1-C8 알킬-(C3-C8 카르보사이클), C3-C8 헤테로사이클 및 C1-C8 알킬-(C3-C8 헤테로사이클)로부터 선택되고;
R4는 H, C1-C8 알킬, C3-C8 카르보사이클, 아릴, C1-C8 알킬-아릴, C1-C8 알킬-(C3-C8 카르보사이클), C3-C8 헤테로사이클 및 C1-C8 알킬-(C3-C8 헤테로사이클)로부터 선택되고;
R5는 H 및 메틸로부터 선택되거나; 또는
R4 및 R5는 결합하여 카르보시클릭 고리를 형성하고, 화학식 -(CRaRb)n- (여기서, Ra 및 Rb는 독립적으로 H, C1-C8 알킬 및 C3-C8 카르보시클로부터 선택되고, n은 2, 3, 4, 5 및 6로부터 선택됨)을 가지며;
R6은 H 및 C1-C8 알킬로부터 선택되고;
R7은 H, C1-C8 알킬, C3-C8 카르보사이클, 아릴, C1-C8 알킬-아릴, C1-C8 알킬-(C3-C8 카르보사이클), C3-C8 헤테로사이클 및 C1-C8 알킬-(C3-C8 헤테로사이클)로부터 선택되고;
R8은 각각 독립적으로 H, OH, C1-C8 알킬, C3-C8 카르보사이클 및 O-(C1-C8 알킬)로부터 선택되고;
R9는 H 및 C1-C8 알킬로부터 선택되고;
R10는 아릴 또는 C3-C8 헤테로시클로부터 선택되고;
Z는 O, S, NH 또는 NR12 (여기서, R12는 C1-C8 알킬임)이고;
R11은 H, C1-C20 알킬, 아릴, C3-C8 헤테로사이클, -(R13O)m-R14, 또는 -(R13O)m-CH(R15)2로부터 선택되고;
m은 1-1000 범위의 정수이고;
R13은 C2-C8 알킬이고;
R14는 H 또는 C1-C8 알킬이고;
R15는 각각 독립적으로 H, COOH, -(CH2)n-N(R16)2, -(CH2)n-SO3H, 또는 -(CH2)n-SO3-C1-C8 알킬이고;
R16은 각각 독립적으로 H, C1-C8 알킬 또는 -(CH2)n-COOH이고; 여기서 n은 0 내지 6 범위의 정수이고;
R18은 -C(R8)2-C(R8)2-아릴, -C(R8)2-C(R8)2-(C3-C8 헤테로사이클) 및 -C(R8)2-C(R8)2-(C3-C8 카르보사이클)로부터 선택된다.
다른 측면에서, 하기 화학식 Ib의 약물 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염 또는 용매화물이 제공된다:
<화학식 Ib>
Figure 112013088873035-pat00004
R2는 수소 및 -C1-C8 알킬로부터 선택되고;
R3는 수소, -C1-C8 알킬, -C3-C8 카르보사이클, 아릴, -C1-C8 알킬-아릴, -C1-C8 알킬-(C3-C8 카르보사이클), -C3-C8 헤테로사이클 및 -C1-C8 알킬-(C3-C8 헤테로사이클)로부터 선택되고;
R4는 수소, -C1-C8 알킬, -C3-C8 카르보사이클, -아릴, -C1-C8 알킬-아릴, -C1-C8 알킬-(C3-C8 카르보사이클), -C3-C8 헤테로사이클 및 -C1-C8 알킬-(C3-C8 헤테로사이클)로부터 선택되고;
R5는 H 및 메틸로부터 선택되거나; 또는
R4 및 R5는 결합하여 카르보시클릭 고리를 형성하고, 화학식 -(CRaRb)n- (여기서, Ra 및 Rb는 독립적으로 -H, -C1-C8 알킬 및 -C3-C8 카르보시클로부터 선택되고, n은 2, 3, 4, 5 및 6로부터 선택됨)을 가지며 이들이 부착된 탄소 원자와 함께 고리를 형성하고;
R6은 H 및 -C1-C8 알킬로부터 선택되고;
R7은 H, -C1-C8 알킬, -C3-C8 카르보사이클, 아릴, -C1-C8 알킬-아릴, -C1-C8 알킬-(C3-C8 카르보사이클), -C3-C8 헤테로사이클 및 -C1-C8 알킬-(C3-C8 헤테로사이클)로부터 선택되고;
R8은 각각 독립적으로 H, -OH, -C1-C8 알킬, -C3-C8 카르보사이클 및 -O-(C1-C8 알킬)로부터 선택되고;
R9는 H 및 -C1-C8 알킬로부터 선택되고;
R10는 아릴기 또는 -C3-C8 헤테로시클로부터 선택되고;
Z는 -O-, -S-, -NH- 또는 -NR12- (여기서, R12는 C1-C8 알킬임)이고;
R11은 H, C1-C20 알킬, 아릴, -C3-C8 헤테로사이클, -(R13O)m-R14, 또는 -(R13O)m-CH(R15)2로부터 선택되고;
m은 1-1000 범위의 정수이고;
R13은 -C2-C8 알킬이고;
R14는 H 또는 -C1-C8 알킬이고;
R15는 각각 독립적으로 H, -COOH, -(CH2)n-N(R16)2, -(CH2)n-SO3H, 또는 -(CH2)n-SO3-C1-C8 알킬이고;
R16은 각각 독립적으로 H, -C1-C8 알킬 또는 -(CH2)n-COOH이고;
n은 0 내지 6 범위의 정수이다.
화학식 Ib의 화합물은 환자의 암, 자가면역 질환 또는 감염성 질환을 치료하는데 유용하거나, 또는 분해가능한 약물 단위를 갖는 약물-링커, 약물-링커-리간드 접합체 및 약물-리간드 접합체의 합성을 위한 중간체로서 유용하다.
다른 측면에서, 유효량의 약물-링커-리간드 접합체 및 제약상 허용되는 담체 또는 비히클을 포함하는 조성물이 제공된다.
또다른 측면에서, 본 발명은 유효량의 약물-링커 화합물 및 제약상 허용되는 담체 또는 비히클을 포함하는 제약 조성물을 제공한다.
또다른 측면에서, 본 발명은 약물-리간드 접합체로부터 분해가능한 약물 단위를 갖는 약물-리간드 접합체의 유효량 및 제약상 허용되는 담체 또는 비히클을 포함하는 조성물을 제공한다.
또다른 측면에서, 본 발명은 유효량의 약물-링커 화합물을 이를 필요로 하는 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 종양 세포 또는 암 세포를 사멸시키거나 증식을 억제하는 방법을 제공한다.
또다른 측면에서, 본 발명은 유효량의 약물-링커-리간드 접합체를 이를 필요로 하는 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 종양 세포 또는 암 세포를 사멸시키거나 증식을 억제하는 방법을 제공한다.
다른 측면에서, 본 발명은 약물-리간드 접합체로부터 분해가능한 약물 단위를 갖는 약물-리간드 접합체 유효량을 이를 필요로 하는 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 종양 세포 또는 암 세포를 사멸시키거나 증식을 억제하는 방법을 제공한다.
또다른 측면에서, 본 발명은 유효량의 약물-링커 화합물을 이를 필요로 하는 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 암 치료 방법을 제공한다.
또다른 측면에서, 본 발명은 유효량의 약물-링커 리간드 접합체를 이를 필요로 하는 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 암 치료 방법을 제공한다.
또다른 측면에서, 본 발명은 약물-리간드 접합체로부터 분해가능한 약물 단위를 갖는 약물-리간드 접합체의 유효량을 이를 필요로 하는 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 암 치료 방법을 제공한다.
또다른 측면에서, 본 발명은 유효량의 약물-링커 화합물을 이를 필요로 하는 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 자가면역 항체를 발현하는 세포를 사멸시키거나 복제를 억제하는 방법을 제공한다.
또다른 측면에서, 본 발명은 유효량의 약물-링커-리간드 접합체를 이를 필요로 하는 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 자가면역 항체를 발현하는 세포를 사멸시키거나 복제를 억제하는 방법을 제공한다.
또다른 측면에서, 본 발명은 약물-리간드 접합체로부터 분해가능한 약물 단위를 갖는 약물-리간드 접합체의 유효량을 이를 필요로 하는 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 자가면역 항체를 발현하는 세포를 사멸시키거나 복제를 억제하는 방법을 제공한다.
또다른 측면에서, 본 발명은 유효량의 약물-링커 화합물을 이를 필요로 하는 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 자가 면역 질환의 치료 방법을 제공한다.
또다른 측면에서, 본 발명은 유효량의 약물-링커-리간드 접합체를 이를 필요로 하는 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 자가 면역 질환의 치료 방법을 제공한다.
또다른 측면에서, 본 발명은 약물-리간드 접합체로부터 분해가능한 약물 단위를 갖는 약물-리간드 접합체의 유효량을 이를 필요로 하는 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 자가 면역 질환의 치료 방법을 제공한다.
또다른 측면에서, 본 발명은 유효량의 약물-링커 화합물을 이를 필요로 하는 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 감염성 질환의 치료 방법을 제공한다.
또다른 측면에서, 본 발명은 유효량의 약물-링커-리간드 접합체를 이를 필요로 하는 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 감염성 질환의 치료 방법을 제공한다.
또다른 측면에서, 본 발명은 약물-리간드 접합체로부터 분해가능한 약물 단위를 갖는 약물-리간드 접합체의 유효량을 이를 필요로 하는 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 감염성 질환의 치료 방법을 제공한다.
또다른 측면에서, 본 발명은 유효량의 약물-링커 화합물을 이를 필요로 하는 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 종양 세포 또는 암 세포의 증식의 예방 방법을 제공한다.
또다른 측면에서, 본 발명은 유효량의 약물-링커-리간드 접합체를 이를 필요로 하는 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 종양 세포 또는 암 세포의 증식의 예방 방법을 제공한다.
또다른 측면에서, 본 발명은 약물-리간드 접합체로부터 분해가능한 약물 단위를 갖는 약물-리간드 접합체의 유효량을 이를 필요로 하는 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 종양 세포 또는 암 세포의 증식의 예방 방법을 제공한다.
또다른 측면에서, 본 발명은 유효량의 약물-링커 화합물을 이를 필요로 하는 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 암의 예방 방법을 제공한다.
또다른 측면에서, 본 발명은 유효량의 약물-링커-리간드 접합체를 이를 필요로 하는 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 암의 예방 방법을 제공한다.
또다른 측면에서, 본 발명은 약물-리간드 접합체로부터 분해가능한 약물 단위를 갖는 약물-리간드 접합체의 유효량을 이를 필요로 하는 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 암의 예방 방법을 제공한다.
또다른 측면에서, 본 발명은 유효량의 약물-링커 화합물을 이를 필요로 하는 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 자가면역 항체를 발현하는 세포의 증식을 예방하는 방법을 제공한다.
또다른 측면에서, 본 발명은 유효량의 약물-링커-리간드 접합체를 이를 필요로 하는 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 자가면역 항체를 발현하는 세포의 증식을 예방하는 방법을 제공한다.
또다른 측면에서, 본 발명은 약물-리간드 접합체로부터 분해가능한 약물 단위를 갖는 약물-리간드 접합체의 유효량을 이를 필요로 하는 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 자가면역 항체를 발현하는 세포의 증식을 예방하는 방법을 제공한다.
또다른 측면에서, 본 발명은 유효량의 약물-링커 화합물을 이를 필요로 하는 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 자가면역 질환의 예방 방법을 제공한다.
또다른 측면에서, 본 발명은 유효량의 약물-링커-리간드 접합체를 이를 필요로 하는 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 자가면역 질환의 예방 방법을 제공한다.
또다른 측면에서, 본 발명은 약물-리간드 접합체로부터 분해가능한 약물 단위를 갖는 약물-리간드 접합체의 유효량을 이를 필요로 하는 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 자가면역 질환의 예방 방법을 제공한다.
또다른 측면에서, 본 발명은 유효량의 약물-링커 화합물을 이를 필요로 하는 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 감염성 질환의 예방 방법을 제공한다.
또다른 측면에서, 본 발명은 유효량의 약물-링커-리간드 접합체를 이를 필요로 하는 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 감염성 질환의 예방 방법을 제공한다.
또다른 측면에서, 본 발명은 약물-리간드 접합체로부터 분해가능한 약물 단위를 갖는 약물-리간드 접합체의 유효량을 이를 필요로 하는 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 감염성 질환의 예방 방법을 제공한다.
다른 측면에서, 약물-리간드 접합체로부터 분해가능한 약물 단위를 갖는 약물-링커 화합물의 합성을 위한 중간체로서 사용될 수 있는 약물 화합물이 제공된다.
다른 측면에서, 약물-링커-리간드 접합체의 합성을 위한 중간체로서 사용될 수 있는 약물-링커 화합물이 제공된다.
다른 측면에서, 본 발명은 하기 화학식 Ia'를 갖는 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염, 또는 용매화물을 제공한다.
<화학식 Ia'>
Figure 112013088873035-pat00005
Ab는 CD30, CD40, CD70 및 루이스 Y 항원에 결합하는 것을 포함하는 항체를 포함하며,
A는 스트레처 단위이고,
a는 0 또는 1이고,
각각의 W는 독립적으로 아미노산 단위이고,
w는 0 내지 12 범위의 정수이고,
Y는 스페이서 단위이고,
y는 0, 1 또는 2이고,
p는 1 내지 약 20 범위이고,
D는 하기 화학식 DE 및 DF 로부터 선택되는 약물 단위이며,
<화학식 DE>
Figure 112013088873035-pat00006
<화학식 DF>
Figure 112013088873035-pat00007
여기서, 각각의 위치에서 독립적으로:
R2는 H 및 C1-C8 알킬로부터 선택되고;
R3는 H, C1-C8 알킬, C3-C8 카르보사이클, 아릴, C1-C8 알킬-아릴, C1-C8 알킬-(C3-C8 카르보사이클), C3-C8 헤테로사이클 및 C1-C8 알킬-(C3-C8 헤테로사이클)로부터 선택되고;
R4는 H, C1-C8 알킬, C3-C8 카르보사이클, 아릴, C1-C8 알킬-아릴, C1-C8 알킬-(C3-C8 카르보사이클), C3-C8 헤테로사이클 및 C1-C8 알킬-(C3-C8 헤테로사이클)로부터 선택되고;
R5는 H 및 메틸로부터 선택되거나; 또는
R4 및 R5는 결합하여 카르보시클릭 고리를 형성하고, 화학식 -(CRaRb)n- (여기서, Ra 및 Rb는 독립적으로 H, C1-C8 알킬 및 C3-C8 카르보시클로부터 선택되고, n은 2, 3, 4, 5 및 6로부터 선택됨)을 가지며;
R6은 H 및 C1-C8 알킬로부터 선택되고;
R7은 H, C1-C8 알킬, C3-C8 카르보사이클, 아릴, C1-C8 알킬-아릴, C1-C8 알킬-(C3-C8 카르보사이클), C3-C8 헤테로사이클 및 C1-C8 알킬-(C3-C8 헤테로사이클)로부터 선택되고;
각각의 R8은 독립적으로 H, OH, C1-C8 알킬, C3-C8 카르보사이클 및 O-(C1-C8 알킬)로부터 선택되고;
R9는 H 및 C1-C8 알킬로부터 선택되고;
R10는 아릴 또는 C3-C8 헤테로시클로부터 선택되고;
Z는 O, S, NH 또는 NR12 (여기서, R12는 C1-C8 알킬임)이고;
R11은 H, C1-C20 알킬, 아릴, C3-C8 헤테로사이클, -(R13O)m-R14, 또는 -(R13O)m-CH(R15)2로부터 선택되고;
m은 1-1000 범위의 정수이고;
R13은 C2-C8 알킬이고;
R14는 H 또는 C1-C8 알킬이고;
R15는 각각 독립적으로 H, COOH, -(CH2)n-N(R16)2, -(CH2)n-SO3H 또는 -(CH2)n-SO3-C1-C8 알킬이고;
R16은 각각 독립적으로 H, C1-C8 알킬 또는 -(CH2)n-COOH이고;
R18은 -C(R8)2-C(R8)2-아릴, -C(R8)2-C(R8)2-(C3-C8 헤테로사이클) 및 -C(R8)2-C(R8)2-(C3-C8 카르보사이클)로부터 선택되고;
n은 0 내지 6 범위의 정수이다.
한 실시양태에서, Ab는 ErbB 수용체에 결합하거나, 또는 수용체 (1)-(35) 중 하나 이상에 결합하는 항체는 아니다:
(1) BMPR1B (골 형태형성 단백질 수용체-IB형, 진뱅크 수탁 번호 NM_001203);
(2) E16 (LAT1, SLC7A5, 진뱅크 수탁 번호 NM_003486);
(3) STEAP1 (전립선의 6개의 막횡단 상피 항원, 진뱅크 수탁 번호 NM_012449);
(4) 0772P (CA125, MUC16, 진뱅크 수탁 번호 AF361486);
(5) MPF (MPF, MSLN, SMR, 거대핵세포 강화 인자 (megakaryocyte potentiating factor), 메소텔린, 진뱅크 수탁 번호 NM_005823);
(6) Napi3b (NAPI-3B, NPTIIb, SLC34A2, 용질 담체 족 34 (인산나트륨), 2 원, 제II형 나트륨-의존성 포스페이트 전달체 3b, 진뱅크 수탁 번호 NM_006424);
(7) Sema 5b (FLJ10372, KIAA1445, Mm. 42015, SEMA5B, SEMAG, 세마포린 (Semaphorin) 5b Hlog, 세마 도메인, 7개의 트롬보스폰딘 반복체 (제1형 및 제1형-유사), 막횡단 도메인 (TM) 및 짧은 세포질 도메인, (세마포린) 5B, 진뱅크 수탁 번호 AB040878);
(8) PSCA hlg (2700050C12Rik, C530008O16Rik, RIKEN cDNA 2700050C12, RIKEN cDNA 2700050C12 유전자, 진뱅크 수탁 번호 AY358628);
(9) ETBR (엔도텔린 B형 수용체, 진뱅크 수탁 번호 AY275463);
(10) MSG783 (RNF124, 가상 단백질 FLJ20315, 진뱅크 수탁 번호 NM_017763);
(11) STEAP2 (HGNC_8639, IPCA-1, PCANAP1, STAMP1, STEAP2, STMP, 전립선암 관련 유전자 1, 전립선암 관련 단백질 1, 전립선의 6개의 막횡단 상피 항원 2, 6개의 막횡단 전립선 단백질, 진뱅크 수탁 번호 AF455138);
(12) TrpM4 (BR22450, FLJ20041, TRPM4, TRPM4B, 일시적 수용체 잠재적 양이온 채널, M 아족, 4 원, 진뱅크 수탁 번호 NM_017636);
(13) CRIPTO (CR, CR1, CRGF, CRIPTO, TDGF1, 기형암종-유도 성장 인자, 진뱅크 수탁 번호 NP_003203 또는 NM_003212);
(14) CD21 (CR2 (보체 수용체 2) 또는 C3DR (C3d/엡스테인 바르 바이러스 (Epstein Barr virus) 수용체) 또는 Hs.73792, 진뱅크 수탁 번호 M26004);
(15) CD79b (IGb (이뮤노글로불린-연관 베타), B29, 진뱅크 수탁 번호 NM_000626);
(16) FcRH2 (IFGP4, IRTA4, SPAP1A (SH2 도메인 함유 포스파타제 고정 단백질 1a), SPAP1B, SPAP1C, 진뱅크 수탁 번호 NM_030764);
(17) HER2 (진뱅크 수탁 번호 M11730);
(18) NCA (진뱅크 수탁 번호 M18728);
(19) MDP (진뱅크 수탁 번호 BC017023);
(20) IL20Rα (진뱅크 수탁 번호 AF184971);
(21) 브레비칸 (Brevican) (진뱅크 수탁 번호 AF229053);
(22) Ephb2R (진뱅크 수탁 번호 NM_004442);
(23) ASLG659 (진뱅크 수탁 번호 AX092328);
(24) PSCA (진뱅크 수탁 번호 AJ297436);
(25) GEDA (진뱅크 수탁 번호 AY260763);
(26) BAFF-R (진뱅크 수탁 번호 NP_443177.1);
(27) CD22 (진뱅크 수탁 번호 NP-001762.1);
(28) CD79a (CD79A, CD79α, 이뮤노글로불린-연관 알파, Ig 베타 (CD79B)와 공유적으로 상호작용하고 Ig M 분자와 표면 상에서 복합체를 형성하여 B 세포 분화에 관여하는 신호를 전달하는 B 세포-특이적 단백질, 진뱅크 수탁 번호 NP_001774.1);
(29) CXCR5 (버킷 림프종 (Burkitt's lymphoma) 수용체 1, CXCL13 케모카인에 의하여 활성화되고 림프구 이동 및 체액성 방어에 작용하고, HIV-2 감염 및 아마도 AIDS, 림프종, 골수종 및 백혈병의 진행에 중요한 역할을 하는 G 단백질-커플링된 수용체, 진뱅크 수탁 번호 NP_001707.1);
(30) HLA-DOB (펩티드에 결합하여 이를 CD4+ T 림프구에 제시하는 MHC 클래스 II 분자 (Ia 항원)의 베타 서브유닛, 진뱅크 수탁 번호 NP_002111.1);
(31) P2X5 (세포외 ATP에 의하여 개폐되는 이온 채널인 퓨린성 수용체 P2X 리간드-게이트 이온 채널 5는 시냅스 전달 및 신경발생에 관련될 수 있고, 결핍은 특발성 배뇨근 불안정의 병태생리에 기여할 수 있음, 진뱅크 수탁 번호 NP_002552.2);
(32) CD72 (B-세포 분화 항원 CD72, Lyb-2, 진뱅크 수탁 번호 NP_001773.1);
(33) LY64 (림프구 항원 64 (RP105), 류신 풍부 반복체 (LRR) 족의 제I형 막 단백질은 B-세포 활성화 및 아팝토시스를 조절하고 이 기능의 손실은 전신홍반루푸스 환자의 질환 활성 증가와 관련됨, 진뱅크 수탁 번호 NP_005573.1);
(34) FCRH1 (C2 제I형-유사 및 ITAM 도메인을 함유하는 이뮤노글로불린 Fc 도메인을 위한 추정의 수용체인 Fc 수용체-유사 단백질 1은 B-림프구 분화에 있어서 역할을 할 수 있음, 진뱅크 수탁 번호 NP_443170.1); 또는
(35) IRTA2 (B 세포 발달 및 림프종 발생에 작용할 가능성이 있는 추정의 면역수용체인 이뮤노글로불린 거대족 수용체 전위(translocation) 관련 2; 전위에 의한 유전자의 탈조절은 일부 B 세포 악성종양에서 일어남, 진뱅크 수탁 번호 NP_112571.1).
다른 측면에서, 본 발명은 유효량의 약물-링커-항체 접합체 및 제약상 허용되는 담체 또는 비히클을 포함하는 제약 조성물을 제공한다.
또다른 측면에서, 본 발명은 유효량의 약물-항체 접합체로부터의 분해가능한 약물 단위 (잔기)를 갖는 약물-항체 접합체 및 제약상 허용되는 담체 또는 비히클을 포함하는 조성물을 제공한다.
또다른 측면에서, 본 발명은 유효량의 약물-링커-항체 접합체를 이를 필요로 하는 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 종양 세포 또는 암 세포를 사멸시키거나 증식을 억제하는 방법을 제공한다.
또다른 측면에서, 본 발명은 유효량의 약물-항체 접합체로부터 분해가능한 약물 단위를 갖는 약물-항체 접합체를 이를 필요로 하는 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 종양 세포 또는 암 세포를 사멸시키거나 증식을 억제하는 방법을 제공한다.
또다른 측면에서, 본 발명은 유효량의 약물-링커-항체 접합체를 이를 필요로 하는 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 암 치료 방법을 제공한다.
또다른 측면에서, 본 발명은 유효량의 약물-항체 접합체로부터 분해가능한 약물 단위를 갖는 약물-항체 접합체를 이를 필요로 하는 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 암 치료 방법을 제공한다.
또다른 측면에서, 본 발명은 유효량의 약물-링커-항체 접합체를 이를 필요로 하는 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 자가면역 항체를 발현하는 세포를 사멸시키거나 복제를 억제하는 방법을 제공한다.
또다른 측면에서, 본 발명은 유효량의 약물-항체 접합체로부터 분해가능한 약물 단위를 갖는 약물-항체 접합체를 이를 필요로 하는 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 자가면역 항체를 발현하는 세포를 사멸시키거나 복제를 억제하는 방법을 제공한다.
또다른 측면에서, 본 발명은 유효량의 약물-링커-항체 접합체를 이를 필요로 하는 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 자가면역 질환의 치료 방법을 제공한다.
또다른 측면에서, 본 발명은 유효량의 약물-항체 접합체로부터 분해가능한 약물 단위를 갖는 약물-항체 접합체를 이를 필요로 하는 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 자가면역 질환의 치료 방법을 제공한다.
또다른 측면에서, 본 발명은 유효량의 약물-링커-항체 접합체를 이를 필요로 하는 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 감염성 질환의 치료 방법을 제공한다.
또다른 측면에서, 본 발명은 유효량의 약물-항체 접합체로부터 분해가능한 약물 단위를 갖는 약물-항체 접합체를 이를 필요로 하는 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 감염성 질환의 치료 방법을 제공한다.
또다른 측면에서, 본 발명은 유효량의 약물-링커-항체 접합체를 이를 필요로 하는 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 종양 세포 또는 암 세포의 증식을 예방하는 방법을 제공한다.
또다른 측면에서, 본 발명은 유효량의 약물-항체 접합체로부터 분해가능한 약물 단위를 갖는 약물-항체 접합체를 이를 필요로 하는 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 종양 세포 또는 암 세포의 증식을 예방하는 방법을 제공한다.
또다른 측면에서, 본 발명은 유효량의 약물-링커-항체 접합체를 이를 필요로 하는 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 암 예방 방법을 제공한다.
또다른 측면에서, 본 발명은 유효량의 약물-항체 접합체로부터 분해가능한 약물 단위를 갖는 약물-항체 접합체를 이를 필요로 하는 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 암 예방 방법을 제공한다.
또다른 측면에서, 본 발명은 유효량의 약물-링커-항체 접합체를 이를 필요로 하는 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 자가면역 항체를 발현하는 세포의 증식을 예방하는 방법을 제공한다.
또다른 측면에서, 본 발명은 유효량의 약물-항체 접합체로부터 분해가능한 약물 단위를 갖는 약물-항체 접합체를 이를 필요로 하는 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 자가면역 항체를 발현하는 세포의 증식을 예방하는 방법을 제공한다.
또다른 측면에서, 본 발명은 유효량의 약물-링커-항체 접합체를 이를 필요로 하는 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 자가면역 질환의 예방 방법을 제공한다.
또다른 측면에서, 본 발명은 유효량의 약물-항체 접합체로부터 분해가능한 약물 단위를 갖는 약물-항체 접합체를 이를 필요로 하는 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 자가면역 질환의 예방 방법을 제공한다.
또다른 측면에서, 본 발명은 유효량의 약물-링커-항체 접합체를 이를 필요로 하는 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 감염성 질환의 예방 방법을 제공한다.
또다른 측면에서, 본 발명은 유효량의 약물-항체 접합체로부터 분해가능한 약물 단위를 갖는 약물-항체 접합체를 이를 필요로 하는 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 감염성 질환의 예방 방법을 제공한다.
또다른 측면에서, 약물-항체 접합체로부터 분해가능한 약물 단위를 갖는 약물-링커 화합물의 합성을 위한 중간체로서 사용할 수 있는 약물 화합물이 제공된다.
또다른 측면에서, 약물-링커-항체 접합체의 합성을 위한 중간체로서 사용할 수 있는 약물-링커 화합물이 제공된다.
한 측면에서, 본 발명은 하기 화학식 Ic를 갖는 약물-링커-항체 접합체 (항체-약물 접합체로도 지칭됨) 또는 그의 제약학상 허용되는 염 또는 용매화물을 제공한다.
<화학식 Ic>
Figure 112013088873035-pat00008
Ab는 하나 이상의 항원 (1)-(35)에 결합하는 항체이다:
(1) BMPR1B (골 형태형성 단백질 수용체-IB형, 진뱅크 수탁 번호 NM_001203);
(2) E16 (LAT1, SLC7A5, 진뱅크 수탁 번호 NM_003486);
(3) STEAP1 (전립선의 6개의 막횡단 상피 항원, 진뱅크 수탁 번호 NM_012449);
(4) 0772P (CA125, MUC16, 진뱅크 수탁 번호 AF361486);
(5) MPF (MPF, MSLN, SMR, 거대핵세포 강화 인자, 메소텔린, 진뱅크 수탁 번호 NM_005823);
(6) Napi3b (NAPI-3B, NPTIIb, SLC34A2, 용질 담체 족 34 (인산나트륨), 2 원, 제II형 나트륨-의존성 포스페이트 전달체 3b, 진뱅크 수탁 번호 NM_006424);
(7) Sema 5b (FLJ10372, KIAA1445, Mm. 42015, SEMA5B, SEMAG, 세마포린 5b Hlog, 세마 도메인, 7개의 트롬보스폰딘 반복체 (제1형 및 제1형-유사), 막횡단 도메인 (TM) 및 짧은 세포질 도메인, (세마포린) 5B, 진뱅크 수탁 번호 AB040878);
(8) PSCA hlg (2700050C12Rik, C530008O16Rik, RIKEN cDNA 2700050C12, RIKEN cDNA 2700050C12 유전자, 진뱅크 수탁 번호 AY358628);
(9) ETBR (엔도텔린 B형 수용체, 진뱅크 수탁 번호 AY275463);
(10) MSG783 (RNF124, 가상 단백질 FLJ20315, 진뱅크 수탁 번호 NM_017763);
(11) STEAP2 (HGNC_8639, IPCA-1, PCANAP1, STAMP1, STEAP2, STMP, 전립선암 관련 유전자 1, 전립선암 관련 단백질 1, 전립선의 6개의 막횡단 상피 항원 2, 6개의 막횡단 전립선 단백질, 진뱅크 수탁 번호 AF455138);
(12) TrpM4 (BR22450, FLJ20041, TRPM4, TRPM4B, 일시적 수용체 잠재적 양이온 채널, M 아족, 4 원, 진뱅크 수탁 번호 NM_017636);
(13) CRIPTO (CR, CR1, CRGF, CRIPTO, TDGF1, 기형암종-유도 성장 인자, 진뱅크 수탁 번호 NP_003203 또는 NM_003212);
(14) CD21 (CR2 (보체 수용체 2) 또는 C3DR (C3d/엡스테인 바르 바이러스 수용체) 또는 Hs.73792, 진뱅크 수탁 번호 M26004);
(15) CD79b (IGb (이뮤노글로불린-연관 베타), B29, 진뱅크 수탁 번호 NM_000626);
(16) FcRH2 (IFGP4, IRTA4, SPAP1A (SH2 도메인 함유 포스파타제 고정 단백질 1a), SPAP1B, SPAP1C, 진뱅크 수탁 번호 NM_030764);
(17) HER2 (진뱅크 수탁 번호 M11730);
(18) NCA (진뱅크 수탁 번호 M18728);
(19) MDP (진뱅크 수탁 번호 BC017023);
(20) IL20Rα (진뱅크 수탁 번호 AF184971);
(21) 브레비칸 (진뱅크 수탁 번호 AF229053);
(22) Ephb2R (진뱅크 수탁 번호 NM_004442);
(23) ASLG659 (진뱅크 수탁 번호 AX092328);
(24) PSCA (진뱅크 수탁 번호 AJ297436);
(25) GEDA (진뱅크 수탁 번호 AY260763);
(26) BAFF-R (진뱅크 수탁 번호 NP_443177.1);
(27) CD22 (진뱅크 수탁 번호 NP-001762.1);
(28) CD79a (CD79A, CD79α, 이뮤노글로불린-연관 알파, Ig 베타 (CD79B)와 공유적으로 상호작용하고 Ig M 분자와 표면 상에서 복합체를 형성하여 B 세포 분화에 관여하는 신호를 전달하는 B 세포-특이적 단백질, 진뱅크 수탁 번호 NP_001774.1);
(29) CXCR5 (버킷 림프종 수용체 1, CXCL13 케모카인에 의하여 활성화되고 림프구 이동 및 체액성 방어에 작용하고 HIV-2 감염 및 아마도 AIDS, 림프종, 골수종 및 백혈병의 진행에서 중요한 역할을 하는 G 단백질-커플링된 수용체, 진뱅크 수탁 번호 NP_001707.1);
(30) HLA-DOB (펩티드에 결합하여 이를 CD4+ T 림프구에 제시하는 MHC 클래스 II 분자 (Ia 항원)의 베타 서브유닛, 진뱅크 수탁 번호 NP_002111.1);
(31) P2X5 (세포외 ATP에 의하여 개폐되는 이온 채널인 퓨린성 수용체 P2X 리간드-게이트 이온 채널 5는 시냅스 전달 및 신경발생에 관련될 수 있고, 결핍은 특발성 배뇨근 불안정의 병태생리에 기여할 수 있음, 진뱅크 수탁 번호 NP_002552.2);
(32) CD72 (B-세포 분화 항원 CD72, Lyb-2, 진뱅크 수탁 번호 NP_001773.1);
(33) LY64 (림프구 항원 64 (RP105), 류신 풍부 반복체 (LRR) 족의 제I형 막 단백질은 B-세포 활성화 및 아팝토시스를 조절하고, 이 기능의 손실은 전신홍반루푸스 환자의 질환 활성 증가와 관련됨, 진뱅크 수탁 번호 NP_005573.1);
(34) FCRH1 (C2 제I형g-형 및 ITAM 도메인을 함유하는 이뮤노글로불린 Fc 도메인을 위한 추정의 수용체인 Fc 수용체-유사 단백질 1은 B-림프구 분화에 있어서 역할을 할 수 있음, 진뱅크 수탁 번호 NP_443170.1); 또는
(35) IRTA2 (B 세포 발달 및 림프종 발생에 작용할 가능성이 있는 추정의 면역수용체인 이뮤노글로불린 거대족 수용체 전위 관련 2; 전위에 의한 유전자의 탈조절은 일부 B 세포 악성종양에서 일어남, 진뱅크 수탁 번호 NP_112571.1);
A는 스트레처 단위이고,
a는 0 또는 1이고,
W는 각각 독립적으로 아미노산 단위이고,
w는 0 내지 12 범위의 정수이고,
Y는 스페이서 단위이고,
y는 0, 1 또는 2이고;
p는 1 내지 약 20 범위이고;
D는 하기 화학식 DE 및 DF를 갖는 약물 단위이며:
<화학식 DE>
Figure 112013088873035-pat00009
<화학식 DF>
Figure 112013088873035-pat00010
여기서, DE 및 DF 중의 파형 선은 A, W 또는 Y에 대한 공유 부착 부위를 나타내고, 각각의 위치에서 독립적으로:
R2는 H 및 C1-C8 알킬로부터 선택되고;
R3는 H, C1-C8 알킬, C3-C8 카르보사이클, 아릴, C1-C8 알킬-아릴, C1-C8 알킬-(C3-C8 카르보사이클), C3-C8 헤테로사이클 및 C1-C8 알킬-(C3-C8 헤테로사이클)로부터 선택되고;
R4는 H, C1-C8 알킬, C3-C8 카르보사이클, 아릴, C1-C8 알킬-아릴, C1-C8 알킬-(C3-C8 카르보사이클), C3-C8 헤테로사이클 및 C1-C8 알킬-(C3-C8 헤테로사이클)로부터 선택되고;
R5는 H 및 메틸로부터 선택되거나; 또는
R4 및 R5는 결합하여 카르보시클릭 고리를 형성하고, 화학식 -(CRaRb)n- (여기서, Ra 및 Rb는 독립적으로 H, C1-C8 알킬 및 C3-C8 카르보시클로부터 선택되고, n은 2, 3, 4, 5 및 6로부터 선택됨)을 가지며;
R6은 H 및 C1-C8 알킬로부터 선택되고;
R7은 H, C1-C8 알킬, C3-C8 카르보사이클, 아릴, C1-C8 알킬-아릴, C1-C8 알킬-(C3-C8 카르보사이클), C3-C8 헤테로사이클 및 C1-C8 알킬-(C3-C8 헤테로사이클)로부터 선택되고;
R8은 각각 독립적으로 H, OH, C1-C8 알킬, C3-C8 카르보사이클 및 O-(C1-C8 알킬)로부터 선택되고;
R9는 H 및 C1-C8 알킬로부터 선택되고;
R10는 아릴 또는 C3-C8 헤테로시클로부터 선택되고;
Z는 O, S, NH 또는 NR12 (여기서, R12는 C1-C8 알킬임)이고;
R11은 H, C1-C20 알킬, 아릴, C3-C8 헤테로사이클, -(R13O)m-R14, 또는 -(R13O)m-CH(R15)2로부터 선택되고;
m은 1-1000 범위의 정수이고;
R13은 C2-C8 알킬이고;
R14는 H 또는 C1-C8 알킬이고;
R15는 각각 독립적으로 H, COOH, -(CH2)n-N(R16)2, -(CH2)n-SO3H, 또는 -(CH2)n-SO3-C1-C8 알킬이고;
R16은 각각 독립적으로 H, C1-C8 알킬 또는 -(CH2)n-COOH이고;
R18은 -C(R8)2-C(R8)2-아릴, -C(R8)2-C(R8)2-(C3-C8 헤테로사이클) 및 -C(R8)2-C(R8)2-(C3-C8 카르보사이클)로부터 선택되고;
n은 0 내지 6 범위의 정수이다.
다른 측면에서, 본 발명의 항체-약물 접합체 (ADC)의 항체는 ErbB2 유전자에 의하여 코딩하는 수용체에 특이적으로 결합한다.
또다른 측면에서, 항체-약물 접합체의 항체는 huMAb4D5-1, huMAb4D5-2, huMAb4D5-3, huMAb4D5-4, huMAb4D5-5, huMAb4D5-6, huMAb4D5-7 및 huMAb4D5-8 (트라츠주마브)로부터 선택된 인간화 항체이다.
또다른 측면에서, 본 발명은 본 발명의 항체-약물 접합체 화합물; 용기; 및 상기 화합물이 ErbB2 수용체의 과발현을 특징으로 하는 암을 치료하는데 사용될 수 있다고 나타낸 포장 첨부 설명서 (package insert) 또는 표지 (label)를 포함하는 제품을 포함한다.
또다른 측면에서, 본 발명은 본 발명의 항체-약물 접합체 화합물의 치료 유효량을 포유동물에게 투여하는 것을 포함하는, 포유동물에서 ErbB2 수용체의 과발현을 특징으로 하고, 항-ErbB2 항체로의 치료에 반응하지 않거나 빈약하게 반응하는 암의 치료 방법을 포함한다.
또다른 측면에서, 약물 잔기의 실질량은 항체-약물 접합체 화합물이 항체-약물 접합체의 항체에 특이적인 세포 표면 수용체를 갖는 세포로 들어갈 때까지 항체로부터 분해되지 않으며, 약물 잔기는 항체-약물 접합체가 세포로 들어갈 때 항체로부터 분해된다.
또다른 측면에서, 포유동물에서의 항체-약물 접합체 화합물 또는 화합물의 세포내 대사물질의 생체이용률은 항체-약물 접합체 화합물의 약물 잔기를 포함하는 약물 화합물과 비교할 때, 또는 약물 잔기를 갖지 않는 화합물의 유사체와 비교할 때 개선된다.
다른 측면에서, 약물 잔기는 포유동물에서 화합물의 항체로부터 세포내에서 분해되거나, 또는 화합물의 세포내 대사물질이다.
다른 측면에서, 본 발명은 유효량의 본 발명의 항체-약물 접합체 화합물, 또는 그의 제약상 허용되는 염, 및 제약상 허용되는 희석제, 담체 또는 부형제를 포함하는 제약 조성물을 포함한다. 조성물은 튜불린-형성 억제제, 토포이소머라제 억제제 및 DNA 결합제와 같은 화학요법제의 치료 유효량을 추가로 포함할 수 있다.
다른 측면에서, 본 발명은 종양 세포 또는 암 세포를 사멸시키거나 증식을 억제하는 양의 본 발명의 항체-약물 접합체 화합물, 또는 그의 제약상 허용되는 염 또는 용매화물로 종양 세포 또는 암 세포를 치료하는 것을 포함하는, 종양 세포 또는 암 세포를 사멸시키거나 증식을 억제하는 방법을 포함한다.
다른 측면에서, 본 발명은 항체 약물 접합체 화합물이 세포로 들어가고, 약물이 항체 약물 접합체 화합물의 잔여부분로부터 분해되어, 세포의 증식을 억제하게 되는, 세포 배양 배지 중에서 포유동물 세포를 본 발명의 항체 약물 접합체 화합물에 노출시키는 것을 포함하는 세포 증식을 억제하는 방법을 포함한다.
다른 측면에서, 본 발명은 본 발명의 항체-약물 접합체 화합물 및 제약상 허용되는 희석제, 담체 또는 부형제의 제제를 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 암 치료 방법을 포함한다.
다른 측면에서, 본 발명은
(a) 본 발명의 항체-약물 접합체 화합물에 세포를 노출시키는 단계; 및
(b) 세포에 항체-약물 접합체 화합물이 결합하는 정도를 측정하는 단계
를 포함하는 암 세포의 검출 분석법을 포함한다.
본 발명은 첨부 도면, 도해 및 반응식과 함께 예시 실시양태의 상세한 설명을 참고함으로써 가장 잘 이해될 수 있다. 하기 논의는 설명적이고, 예시적이고, 대표적인 것이며, 첨부하는 청구의 범위에서 한정된 범위로 제한되는 것으로 이해되어서는 안된다.
도 1은 피하 카르파스 (Karpas)-299 ALCL 이종이식편 (xenograft)에서 cAC10-mcMMAF의 생체내, 단일 투여량, 효능 분석법을 나타낸다.
도 2는 피하 L540cy에서의 cAClO-mcMMAF의 생체내, 단일 투여량, 효능 분석법을 나타낸다. 이러한 연구에 있어서, 처리되지 않은 군에 4마리의 마우스, 처리된 군 각각에 10마리의 마우스가 있다.
도 3a 및 3b는 피하 L2987에서의 cBR96-mcMMAF의 생체내 효능을 나타낸다. 도 3a에서의 칠해진 삼각형 및 도 3b에서의 화살표는 치료 날짜를 나타낸다.
도 4a 및 4b는 CD30+ 세포주에 대한 cAC1O-항체-약물 접합체의 시험관내 활성을 나타낸다.
도 5a 및 5b는 Ley + 세포주에 대한 cBR96-항체-약물 접합체의 시험관내 활성을 나타낸다.
도 6a 및 6b는 CD70+ 신장 세포 암종 세포주에 대한 c1F6-항체-약물 접합체의 시험관내 활성을 나타낸다.
도 7은 항체 약물 접합체 (ADC)로 처리된 SK-BR-3 세포로의 시험관내 세포 증식 분석법을 나타낸다: -●- 트라츠주마브-MC-vc-PAB-MMAF, 3.8 MMAF/Ab, -○- 트라츠주마브-MC-MMAF, 4.1 MMAF/Ab, 및 -△- 트라츠주마브-MC-MMAF, 4.8 MMAF/Ab, 상대 형광 단위 (RLU) 대 ADC의 농도 (㎍/ml)로 측정함. H = 트라츠주마브 (여기서, H는 시스테인 [cys]을 통하여 연결됨).
도 8은 ADC로 처리된 BT-474 세포로 시험관내 세포 증식 분석법을 나타낸다: -●- 트라츠주마브-MC-vc-PAB-MMAF, 3.8 MMAF/Ab, -○- 트라츠주마브-MC-MMAF, 4.1 MMAF/Ab, 및 -△- 트라츠주마브-MC-MMAF, 4.8 MMAF/Ab.
도 9는 ADC로 처리된 MCF-7 세포로의 시험관내 세포 증식 분석법을 나타낸다: -●- 트라츠주마브-MC-vc-PAB-MMAF, 3.8 MMAF/Ab, -○- 트라츠주마브-MC-(N-Me) vc-PAB-MMAF, 3.9 MMAF/Ab, 및 -△- 트라츠주마브-MC-MMAF, 4.1 MMAF/Ab.
도 10은 ADC로 처리된 MDA-MB-468 세포로의 시험관내 세포 증식 분석법을 나타낸다: -●- 트라츠주마브-MC-vc-PAB-MMAE, 4.1 MMAE/Ab, -○- 트라츠주마브-MC-vc-PAB-MMAE, 3.3 MMAE/Ab, 및 -△- 트라츠주마브-MC-vc-PAB- MMAF, 3.7 MMAF/Ab.
도 11은 스프라그-돌리 래트로의 H-MC-vc-PAB-MMAF-TEG 및 H-MC-vc-PAB-MMAF의 투여 후에 혈장 농도 클리어런스 연구를 나타낸다: 투여량은 래트 kg 당 ADC 2 mg이다. 전체 항체 및 ADC의 농도는 시간에 따라서 측정하였다. (H = 트라츠주마브).
도 12는 상이한 투여량에서 사이노멀구스 원숭이로 H-MC-vc-MMAE를 투여한 후의 혈장 농도 클리어런스 연구를 나타낸다: 제1일 및 제21일에 0.5, 1.5, 2.5 및 3.0 mg/kg 투여. 전체 항체 및 ADC의 농도는 시간에 따라서 측정하였다. (H = 트라츠주마브).
도 13은 제0일에 비히클, 트라츠주마브-MC-vc-PAB-MMAE (1250 ㎍/m2) 및 트라츠주마브-MC-vc-PAB-MMAF (555 ㎍/m2)을 투여하여 MMTV-HER2 Fo5 유선 종양 동종이식편으로 처리한 흉선 없는 누드 마우스에서 시간에 따른 평균 종양 부피 변화를 나타낸 것이다. (H = 트라츠주마브).
도 14는 제0일에 10 mg/kg (660 ㎍/m2)의 트라츠주마브-MC-MMAE 및 1250 ㎍/m2의 트라츠주마브-MC-vc-PAB-MMAE 투여량을 투여하여 MMTV-HER2 Fo5 유선 종양 동종이식편으로 처리한 흉선 없는 누드 마우스에서 시간에 따른 평균 종양 부피 변화를 나타낸 것이다.
도 15는 제0일에 비히클 및 650 ㎍/m2 트라츠주마브-MC-MMAF 투여량을 투여한 MMTV-HER2 Fo5 유선 종양 동종이식편을 처리한 흉선 없는 누드 마우스에서 시간에 따른 평균 종양 부피 변화를 나타낸 것이다.
도 16은 제0일에 MMAF/트라츠주마브 (H) 비율이 2.4, 5.9 및 6인 비히클 및 350 ㎍/m2의 4개의 트라츠주마브-MC-MMAF 접합체 투여량을 투여한 MMTV-HER2 Fo5 유선 종양 동종이식편로 처리한 흉선 없는 누드 마우스에서 시간에 따른 평균 종양 부피 변화를 나타낸 것이다.
도 17은 비히클, 트라츠주마브-MC-val-cit-MMAF, 트라츠주마브-MC(Me)-val-cit-PAB-MMAF, 트라츠주마브-MC-MMAF 및 트라츠주마브-MC-val-cit-PAB-MMAF 투여 후에 동물 (래트) 체중 (평균±SD) 중 군의 평균 변화 (에러 바)로 나타낸다.
도 18은 9.94 mg/kg의 H-MC-vc-MMAF, 24.90 mg/kg의 H-MC-vc-MMAF, 10.69 mg/kg의 H-MC(Me)-vc-PAB-MMAF, 26.78 mg/kg의 H-MC(Me)-vc-PAB-MMAF, 10.17 mg/kg의 H-MC-MMAF, 25.50 mg/kg의 H-MC-MMAF, 및 21.85 mg/kg의 H-MC-vc-PAB-MMAF 투여 후의 동물 (래트) 체중의 군의 평균 변화를 나타낸다. H = 트라츠주마브. MC 링커는 각 접합체에 있어서 트라츠주마브의 시스테인을 통하여 부착된다.
도 19는 2105, 3158 및 4210 ㎍/m2의 투여량으로 트라츠주마브 (H)-MC-MMAF 투여 후의 스프라그 돌리 래트 체중 (평균±SD)의 군 평균 변화 (에러 바)를 나타낸다. MC 링커는 각 접합체에 있어서 트라츠주마브의 시스테인을 통하여 부착된다.
4.1. 정의 및 약어
달리 표시되지 않으면, 본원에 사용된 하기 용어와 어구는 하기 의미를 갖는 것으로 의도된다:
상표명이 본원에서 사용되는 경우, 출원인은 독립적으로 상표명 제품 제제, 일반 약물, 및 상표명 제품의 활성 제약 성분(들)을 포함하는 것으로 의도된다.
본원에서 용어 "항체"는 최대로 넓은 의미에서, 또한 특이적으로 2종 이상의 무손상 (intact) 항체로부터 형성된 무손상 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 다중특이성 항체 (예를 들어, 이중특이성 항체), 및 바람직한 생물학적 활성을 나타내는 한 항체 단편을 포함한다. 항체는 특이적인 항원을 인식하고 결합할 수 있는 면역계에 의하여 생성된 단백질이다. 그의 구조의 면에서, 항체는 통상적으로 4개의 아미노산 쇄 (2개의 중쇄 및 2개의 경쇄)로 이루어진 Y-형상 단백질을 가진다. 각각의 항체는 본래 가변 영역 및 불변 영역의 2개의 영역을 가진다. Y의 팔의 말단 부분에 위치한 가변 영역은 표적 항원에 결합하고 상호작용한다. 가변 영역은 특정 항원 상의 특이적 결합 부위를 인식하고 결합하는 상보성 결정 영역 (CDR)을 포함한다. Y의 꼬리 부분에 위치한 불변 영역은 면역계에 의하여 인식되고 면역계와 상호작용한다 (Janeway, C., Travers, P., Walport, M., Shlomchik (2001) Immuno Biology, 5th Ed., Garland Publishing, NewYork). 표적 항원은 일반적으로 다수의 항체 상의 CDR에 의하여 인식되는, 에피토프로도 불리는 결합 부위를 가지고 있다. 상이한 에피토프에 특이적으로 결합되는 각각의 항체는 상이한 구조를 가진다. 그러므로, 한 항원은 하나 이상의 상응하는 항체를 가질 수 있다.
본원에 사용된 용어 "항체"는 전장 이뮤노글로불린 분자 또는 전장 이뮤노글로불린 분자의 면역학적으로 활성인 부분, 즉 목적하는 표적의 항원 또는 그의 일부에 면역특이적으로 결합하는 항원 결합 부위를 함유하는 분자 (그러한 표적은 암세포 또는 자가면역 질환과 관련된 자가면역 항체를 생산하는 세포를 포함하나 이에 한정되지는 않음)를 또한 지칭한다. 본원에 개시된 이뮤노글로불린은 이뮤노글로불린의 임의의 유형 (예를 들어, IgG, IgE, IgM, IgD 및 IgA), 분류 (예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2) 또는 하위분류일 수 있다. 이뮤노글로불린은 임의의 종으로부터 유래될 수 있다. 그러나, 한 측면에서, 이뮤노글로불린은 인간, 뮤린 또는 토끼 유래이다. 다른 측면에서, 항체들은 암 세포 항원, 바이러스 항원 또는 미생물 항원에 면역특이적으로 결합되는 폴리클로날, 모노클로날, 이중특이성, 인간, 인간화 또는 키메라 항체, 단쇄 항체, Fv, Fab 단편, F(ab') 단편, F(ab')2 단편, Fab 발현 라이브러리에 의하여 생산된 단편, 항-개체특이형 (항-Id) 항체, CDR's, 및 에피토프-결합 단편이다.
여기서 사용된 용어 "모노클로날 항체"는 실질적으로 균일한 항체의 집단으로부터 얻어진 항체를 의미하는데, 즉, 집단에 포함되는 개별 항체는 소량 존재할 수 있는 가능한 자연-발생 돌연변이를 제외하고는 동일하다. 모노클로날 항체는 매우 특이적이어서, 하나의 항원 부위에 대해 지정되어 있다. 나아가, 상이한 결정자(에피토프)에 대해 지정된 상이한 항체를 포함하는 폴리클로날 항체 제조와는 달리, 각각의 모노클로날 항체는 항원에 있어 하나의 결정자에 대해 지정된다. 이들의 특이성 외에, 모노클로날 항체는 이들이 다른 항체에 의해 오염되지 않고 합성될 수 있는 이점이 있다. 수식어 "모노클로날"은 실질적으로 균일한 항체 집단으로부터 얻어진다는 항체의 특성을 나타내고, 어떤 특정 방법에 의한 항체의 생산이 필요한 것으로 해석되진 않는다. 예를 들어, 본 발명에 의해 사용된 모노클로날 항체는 문헌[Kohler et al. (1975) Nature 256:495]에 처음 기재된 하이브리도마 법에 의해 만들어질 수 있거나, 또는 재조합 DNA 법에 의해 만들어질 수 있다(미국 특허 번호 제4816567호 참조). "모노클로날 항체"는 또한 예를 들어, 문헌[Clackson et al.(1991) Nature, 352:624-628] 및 문헌[Marks et al. (1991) J. Mol. Biol., 222:581-597]에 기재된 기법을 사용하여 파지 항체 라이브러리로부터 단리될 수 있다.
여기의 모노클로날 항체는 특히, 중쇄 및(또는) 경쇄의 일부분은 특정 종으로부터 유도되거나 또는 특정 항체 부류 또는 하위부류에 속하는 항체 내 대응 서열과 동일하거나 상동이며, 반면, 사슬의 나머지는 또다른 종으로부터 유도되거나 또는 또다른 항체 부류 또는 하위부류에 속하는 항체 내 대응 서열과 동일하거나 상동인 "키메라" 항체 뿐 아니라 이러한 항체의 단편을, 이들이 원하는 생물학적 활성을 보이는 경우에 포함한다(미국 특허 번호 제mp/4816567호 및 문헌 [Morrison et al. (1984) Proc.Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855]).
모노클로날 항체(MAb)를 생산하는 데에는 다양한 방법이 사용되어 왔다. 항체 단일형을 생산하는 클로닝된 세포주를 의미하는 하이브리도마 기술은, 마우스(뮤린), 햄스터, 래트, 및 인간을 포함하는 다양한 종의 세포를 사용한다. MAb를 제조하는 또다른 방법은 재조합 DNA 기법을 포함하는 유전 공학을 사용한다. 이들 기법으로 만들어진 모노클로날 항체는, 그중에서도, 키메라 항체 및 인간화 항체를 포함한다. 키메라 항체는 하나 이상의 종 유형의 DNA 코딩하는 영역들을 결합시킨다. 예를 들어, 키메라 항체는 가변 영역은 마우스로부터 유래될 수 있고 불변 영역은 인간으로부터 유래될 수 있다. 인간화 항체는 비록 비인간 부분을 포함하고 있더라도, 주로 인간으로부터 유래된다. 키메라 항체처럼, 인간화 항체는 완벽하게 인간 불변 영역을 포함할 수 있다. 그러나, 키메라 항체와는 달리, 가변 영역은 부분적으로는 인간으로부터 유래될 수 있다. 인간화 항체의 비인간, 합성 부분은 종종 뮤린 항체 내 CDR에서 유래된다. 어떻든지, 이 영역은 항체가 특이적 항원을 인식하고 결합하는 것을 가능하게 하는데 결정적이다.
언급한 바와 같이, 뮤린 항체가 사용될 수 있다. 진단 및 단기간 치료에 유용하다 하더라도, 뮤린 항체가 사람에게 장기간 투여시 해로운 면역 반응의 위험이 증가할 수 있다. 인간 항-마우스 항체(HAMA)로 불리는 이 반응은 인간 면역 시스템이 뮤린 항체를 외래 물질로 인식하고 공격할 때 일어난다. HAMA 반응은 독소 쇼크 또는 나아가 사망까지도 야기시킬 수 있다.
키메라 및 인간화 항체는 투여된 항체의 비인간 부분을 최소화하여 HAMA 반응의 가능성을 감소시킨다. 또한, 키메라 및 인간화 항체는 세포독성에 의존하는 항체와 같이, 제2의 인간 면역 반응을 활성화하는 추가적 이점을 가진다.
"항체 단편"은 무손상 항체의 일부분을 포함하며, 바람직하게는 이들의 항원-결합 또는 가변 영역을 포함한다. 항체 단편의 예는 Fab, Fab', F(ab')2, 및 Fv 단편; 디아바디(diabodies); 선형 항체; 단일-사슬 항체 분자; 및 항체 단편에서 형성된 다중특이적 항체를 포함한다.
"무손상" 항체는 항원 결합 가변 영역 뿐 아니라 경쇄 불변 도메인(CL) 및 중쇄 불변 도메인, CH1, CH2 및 CH3를 포함하는 항체이다. 불변 도메인은 천연 서열 불변 도메인(예, 인간 천연 서열 불변 도메인) 또는 이들의 아미노산 서열 변이체일 수 있다.
무손상 항체는 항체의 Fc 영역(천연 서열 Fc 영역 또는 아미노산 서열 변이체 Fc 영역)에 기인할 수 있는 이들의 생물학적 활성을 의미하는 하나 이상의 "이펙터 기능"을 가질 수 있다. 항체 이펙터 기능의 예는 C1q 결합; 보체 의존 세포독성; Fc 수용체 결합; 항체-의존 세포-매개 세포독성(ADCC); 식작용; 세포 표면 수용체(예, B 세포 수용체; BCR) 등의 하향 조절 등을 포함한다.
이들 중쇄의 불변 도메인의 아미노산 서열에 따라, 무손상 항체를 상이한 "부류"로 지정할 수 있다. 무손상 항체는 다섯 개의 주 부류(IgA, IgD, IgE, IgG, 및 IgM)가 있으며, 이들 중 몇몇을 나아가 "하위 부류"(이소형(isotype)), 예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, 및 IgA2로 나눌 수 있다. 항체의 여러가지 부류에 대응하는 중쇄 불변 도메인은 각각 α, β, ε, γ, 및 μ라고 불린다. 이뮤노글로불린의 여러가지 부류의 서브유닛 구조 및 3차원 배위는 잘 알려져 있다.
표현 "ErbB2" 및 "HER2"은 여기서 호환가능하게 사용되며 예를 들어, 문헌[Semba et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA, 82: 6497-6501 (1985)] 및 문헌[Yamamoto et al., (1986) Nature, 319: 230-234(진뱅크 수탁 번호 X03363)]에 기재된 인간 HER2 단백질을 의미한다. 용어 "erbB2"는 인간 ErbB2를 코딩하는 유전자를 의미하며 "neu"는 래트 pl85neu를 코딩하는 유전자를 의미한다. 바람직한 ErbB2는 천연 서열 인간 ErbB2이다.
ErbB 수용체에 대한 항체는 예를 들어, 미국 캘리포니아주에 위치한 산타 크루즈 바이오테크놀러지사(Santa Cruz Biotechnology, Inc.)를 포함하여, 많은 공급원으로부터 입수가능하다.
"ErbB 리간드"는 ErbB 수용체에 결합 및(또는) 활성화하는 폴리펩티드를 의미한다. ErbB 리간드는 예를 들어, 표피 성장 인자(EGF)([Savage et al. (1972) J. Biol. Chem., 247: 7612-7621]); 형질전환 성장 인자 알파(TGF-α)([Marquardt et al. (1984) Science 223: 1079-1082]); 신경초종 또는 각화세포 자가 성장 인자로 또한 공지된 암피레굴린(amphiregulin)([Shoyab et al. (1989) Science 243: 1074-1076;Kimura et al., Nature, 348: 257-260(1990)] 및 [Cook et al., Mol. Cell. Biol., 11: 2547-2557(1991)]); 베타셀룰린(betacellulin))([Shing et al., Science, 259: 1604-1607 (1993)] 및 [Sasada et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 190:1173 (1993)]); 헤파린 결합 표피 성장 인자(HB-EGF)([Higashiyama et al., Science, 251: 936-939 (1991)]); 에피레굴린(epiregulin)([Toyoda et al., J. Biol. Chem., 270:7495-7500(1995)] 및 [Komurasaki et al., Oncogene, 15:2841-2848(1997)]); 헤레굴린(heregulin)(하기 참조); 뉴레굴린-2(neuregulin-2)(NRG-2)([Carraway et al., Nature, 387:512-516 (1997)]; 뉴레굴린-3(NRG-3)([Zhang et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 94:9562-9567 (1997)]; 뉴레굴린-4(NRG-4)([Harari et al., Oncogene, 18:2681-89 (1999)]) 또는 크립토(cripto)(CR-1)([Kannan et al., J. Biol. Chem., 272(6):3330-3335(1997)])와 같은 천연 서열 인간 ErbB 리간드일 수 있다. EGFR에 결합하는 ErbB 리간드는 EGF, TGF-α, 암피레굴린, 베타셀룰린, HB-EGF 및 에피레굴린을 포함한다. ErbB3에 결합하는 ErbB 리간드는 헤레굴린을 포함한다. ErbB4에 결합가능한 ErbB 리간드는 베타셀룰린, 에피레굴린, HB-EGF, NRG-2, NRG-3, NRG-4 및 헤레굴린을 포함한다. ErbB 리간드는 또한 합성 ErbB 리간드일 수 있다. 합성 리간드는 특정 ErbB 수용체에 특이적일 수 있고, 또는 특정 ErbB 수용체 복합체를 인식할 수 있다. 합성 리간드의 예로는 합성 헤레굴린/EGF 키메라 비레굴린이다(예를 들어, 여기서 참고하는 문헌[Jones et al., (1999) REBS Letters, 447:227-231] 참조).
"헤레굴린"(HRG)는 미국 특허 번호 제5641869호 또는 문헌[Marchionni et al., Nature, 362: 312-318 (1993)]에 개시된 바와 같은 헤레굴린 유전자 제품에 의해 코딩된 폴리펩티드를 의미한다. 헤레굴린의 예는 헤레굴린-α, 헤레굴린-β1, 헤레굴린-β2 및 헤레굴린-β3([Holmes et al., Science, 256: 1205-1210 (1992)] 및 미국특허 번호 제5641869호); neu 분화 인자(NDF)([Peles et al., Cell 69: 205-216 (1992)]); 아세틸콜린 수용체-유도 활성(ARIA)([Falls et al. (1993) Cell 72 :801-815)]); 신경교 성장 인자(GGF)([Marchionni et al., Nature, 362: 312-318 (1993)]); 감각 및 운동 뉴런 유도 인자(SMDF)([Ho et al., J. Biol. Chem., 270: 14523-14532(1995)]); γ-헤레굴린([Schaefer et al., Oncogene, 15: 1385-1394 (1997)])을 포함한다. 용어는 생물학적 활성 단편 및(또는) 천연 서열 HRG 폴리펩티드의 아미노산 서열 변이체, 예를 들어, 이들의 EGF-유사 도메인 단편(예, HRGβ1177-244)을 포함한다.
"ErbB 헤테로-올리고머"는 두개 이상의 상이한 ErbB 수용체를 포함하는 비공유적으로 합체된 올리고머이다. "ErbB 이량체"는 두개의 상이한 ErbB 수용체를 포함하는 비공유적으로 합체된 올리고머이다. 이 복합체는 두개 이상의 ErbB 수용체를 발현하는 세포가 ErbB 리간드에 노출될 때 형성할 수 있다. ErbB 이량체와 같은 ErbB 올리고머는 예를 들어, 문헌[Sliwkowski et al., J. Biol.Chem., 269 (20): 14661-14665 (1994)]에 개시된 바와 같이 면역 침강법으로 단리하고 SDS-PAGE로 분석할 수 있다. 이 ErbB 헤테로-올리고머의 예는 EGFR-ErbB2(HER1/HER2로도 불림), ErbB2-ErbB3(HER2/HER3) 및 ErbB3-ErbB4(HER3/HER4) 복합체를 포함한다. 또한, ErbB 헤테로-올리고머는 상이한 ErbB 수용체와 결합한 두개 이상의 ErbB2 수용체, 예를 들어, ErbB3, ErbB4 또는 EGFR(ErbB1)을 포함할 수 있다. 사이토킨 수용체 서브유닛(예, gp130)과 같은 다른 단백질은 헤테로-올리고머에 포함될 수 있다.
"천연 서열" 폴리펩티드는 천연 유래의 폴리펩티드(예, 종양-관련 항원 수용체)와 동일한 아미노산 서열을 갖는 것이다. 이러한 천연 서열 폴리펩티드는 천연에서 단리될 수 있고 또는 재조합 또는 합성 수단으로 생산될 수 있다. 따라서, 천연 서열 폴리펩티드는 자연-발생 인간 폴리펩티드, 뮤린 폴리펩티드, 또는 어떤 다른 포유동물 종의 폴리펩티드의 아미노산 서열을 가질 수 있다.
용어 "아미노산 서열 변이체"는 천연 서열 폴리펩티드와 다소 상이한 아미노산 서열을 가지는 폴리펩티드를 의미한다. 보통, 아미노산 서열 변이체는 천연 리간드의 하나 이상의 수용체 결합 도메인, 또는 천연 수용체의 하나 이상의 리간드 결합 도메인, 예를 들어 종양-관련 항원을 가지면서 약 70％ 이상의 상동성을 지닐것이고, 바람직하게는 이들은 이러한 수용체 또는 리간드 결합 도메인을 가지면서약 80％ 이상, 더욱 바람직하게는, 약 90％ 이상의 상동성이 있을 것이다. 아미노산 서열 변이체는 천연 아미노산 서열의 아미노산 서열 내의 특정 위치에 치환, 결실, 및(또는) 삽입을 지닌다.
"서열 동일성"은 필요하다면, 서열 최대 동일성 퍼센트를 달성하기 위해 서열이 정렬된 후 갭에 도입된, 아미노산 서열 변이체 내의 동일한 잔기 백분율로 정의된다. 정렬의 방법 및 컴퓨터 프로그램은 당 업계에 잘 알려져 있다. 컴퓨터 정렬 프로그램 중 하나는 제넨테크사(Genentech, Inc.,)에 의해 만들어진 "얼라인(align) 2"이며, 이것은 1991년 12월 10일에 워싱턴 디씨 20559에 위치한 미국 저작권청에 사용자 문서로 출원되었다.
"항체-의존 세포-매개 세포독성" 및 "ADCC"는 Fc 수용체(FcRs)(예, 자연 살해(NK) 세포, 호중구 및 대식세포)를 발현하는 비특이적 세포독성 세포가 표적 세포에 결합된 항체를 인식하고 이어서 표적 세포의 용균을 야기시키는 세포-매개 반응을 의미한다. ADCC, NK 세포를 매개하는 1차 세포는 FcγRⅢ만을 발현하나, 단핵구는 FcγRⅠ, FcγRⅡ 및 FcγRⅢ를 발현한다. 개괄적인 조혈 세포에의 FcR 발현은 문헌[Ravetch and Kinet, (1991) Annu. Rev. Immunol, 9: 457-92]의 464 페이지의 표 3에 있다. 관심있는 분자의 ADCC 활성을 평가하기 위해, 미국 특허 번호 제5500362호 또는 제5821337호에 개시된 바와 같이, 시험관 내 ADCC 분석법을 수행할 수 있다. 이 분석법에 유용한 이펙터 세포는 말초 혈액 단핵 세포(PBMC) 및 자연 살해(NK) 세포를 포함한다. 별법으로, 또는 추가적으로, 관심있는 분자의 ADCC 활성은 생체 내, 예를 들면 문헌[Clynes et al., Prco. Natl. Acad. Sci. USA, 95: 652-656 (1998)]에 개시된 바와 같은 동물 모델에서 평가될 수 있다.
용어 "Fc 수용체" 또는 "FcR"은 항체의 Fc 영역에 결합하는 수용체를 기재하는데 사용된다. 바람직한 FcR은 천연 서열 인간 FcR이다. 또한, 바람직한 FcR은 IgG 항체에 결합한 것(감마 수용체)이고, 대립유전자 변이체 및 별법으로 이들 수용체의 스플라이싱된 형태를 포함하는, FcγRⅠ, FcγRⅡ 및 FcγRⅢ 하위 부류 수용체를 포함한다. FcγRⅡ 수용체는 주로 이들의 세포질 도메인에서 상이한 유사 아미노산 서열을 가지는 FcγRⅡA("활성화 수용체") 및 FcγRⅡB("억제 수용체")를 포함한다. 활성화 수용체 FcγRⅡA는 세포질 도메인 내에 면역수용체 티로신-기초 활성화 모티프(ITAM)을 포함한다. 억제 수용체 FcγRⅡB는 세포질 도메인 내에 면역수용체 티로신-기초 억제 모티프(ITIM)을 포함한다(문헌[M. in Dacron, Annu. Rev.ImmunoL, 15 : 203-234 (1997)] 참조). FcR은 문헌[Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol., 9: 457-92(1991)] ;문헌[Capel et aL, Immunomethods, 4: 25-34 (1994)] 및 문헌[de Haas et al., J. Lab. Clin.Med., 126: 330-41 (1995)]에서 조사된다. 미래에 확인되어야 하는 것까지 포함하여, 다른 FcR은 본원의 용어 "FcR"에 포함된다. 용어는 또한 모계 IgG를 태아로 전달을 유발하는 신생아 수용체, FcRn을 포함한다([Guyer et al.,J. Immunol., 117: 587 (1976)] 및 문헌[Kim et al.,J.Immunol., 24: 249 (1994)]).
"보체 의존 세포독성" 또는 "CDC"는 보체의 존재하에 표적을 용해하는 분자의 능력을 의미한다. 보체 활성화 경로는 보체 시스템의 제1의 성분(C1q)과 동족 항원과 복합체를 이룬 분자(예, 항체)의 결합에 의해 개시된다. 보체 활성화를 평가하기 위해, 예를 들어, 문헌[Gazzano-Santoro et al.,J. Immunol. Methods, 202: 163 (1996)]에 기재된 바와 같이, CDC 분석법을 수행할 수 있다.
용어 "가변"은 가변 도메인의 특정 부분이 항체들 사이의 서열에 있어서 광범위하게 상이하여 이것이 특정 항원에 대해 각각의 특정 항체의 결합 및 특이성에 사용된다는 사실을 의미한다. 하지만, 가변성은 항체의 가변 도메인 전체에 골고루 분포되어 있지는 않다. 이것은 경쇄 및 중쇄 가변 도메인 모두에서 초가변 영역이라 불리는 세 개의 절편내에 집중된다. 가변 도메인이 매우 고도로 보존되는 부분을 프레임워크 영역(FR)이라고 부른다. 천연 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인은 주로 β-시트 배위를 채택하며, β-시트 구조와 루프 연결을 형성하여, 경우에 따라서는 부분적으로 형성하는, 세 개의 초가변 영역에 의해 연결되는 네 개의 FR을 각각 포함한다. 각각의 사슬에서 초가변 영역은 FR에 아주 근접하게 모여져 있으며, 다른 사슬의 초가변 영역과 함께, 항체의 항원-결합 부위의 형성에 기여한다(문헌[Kabat et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD] 참조). 불변 도메인은 항체의 항원에의 결합에 직접적으로 관여하지 않으나, 항체 의존 세포독성(ADCC)에의 항체의 관여와 같은, 다양한 이펙터 기능을 보인다.
여기서 사용된 용어 "초가변 영역"은 항원-결합을 유발하는 항체의 아미노산 잔기를 의미한다. 초가변 영역은 일반적으로 "상보성 결정 영역" 또는 "CDR"로부터의 아미노산 잔기(예, 경쇄 가변 도메인의 24-34(L1), 50-56(L2) 및 89-97(L3), 및 중쇄 가변 도메인의 31-35(H1), 50-65(H2) 및 95-102(H3) 잔기; 문헌[Kabat et al. 상기]) 및(또는) "초가변 루프"로부터의 이들의 잔기(예, 경쇄 가변 도메인의 26-32(Ll), 50-52(L2) 및 91-96(L3), 및 중쇄 가변 도메인의 26-32(H1), 53-55(H2) 및 96-101(H3) 잔기; 문헌[Chothia and Lesk (1987) J. Mol. Biol.,196 :901-917])를 포함한다. "프레임워크 영역" 또는 "FR" 잔기는 여기서 정의한 바와 같이 초가변 영역 잔기 이외의 이들의 가변 도메인 잔기이다.
항체의 파파인(papain) 소화는 각각 단일 항원-결합 부위가 있는, "Fab" 단편이라 불리는, 두개의 동일한 항원-결합 단편 및 이름이 이것의 손쉬운 재결정화 능력을 반영하는 한개 잔여 "Fc" 단편을 생산한다. 펩신 처리는 두개의 항원-결합 부위를 갖는 F(ab')2 단편을 수득하고 여전히 항원을 가교시킬 수 있다.
"Fv"는 완벽한 항원-인식 및 항원-결합 부위를 포함하는 최소 항체 단편이다. 이 영역은 단단하고 비공유적으로 결합된, 한개의 중쇄 및 한개의 경쇄 가변 도메인의 이량체로 구성된다. 이러한 구성에서는, 각각 가변 도메인을 갖는 세개의 초가변 영역이 VH-VL 이량체의 표면에 항원-결합 부위를 형성하도록 상호작용한다. 여섯 개의 초가변 영역이 집합적으로 항체에 항원-결합 특이성을 부여한다. 하지만, 비록 전체 결합 부위보다는 낮은 친화성일지라도, 단일 가변 도메인(또는 항원에 대해 특이적인 세개의 초가변 영역만을 포함하는 Fv의 절반) 조차 항원을 인식하고 결합하는 능력을 가진다.
Fab 단편 또한 경쇄의 불변 도메인 및 중쇄의 제1의 불변 도메인(CH1)을 포함한다. Fab' 단편은 항체 힌지 영역으로부터의 하나 이상의 시스테인을 포함하는 중쇄 CH1 도메인의 카르복시 말단부에 몇몇 잔기를 첨가하여 Fab 단편과 상이해진다. Fab'-SH는 불변 도메인의 시스테인 잔기(들)이 하나 이상의 자유 티올 기를 포함하는 Fab'에 대한 명칭이다. F(ab')2 항체 단편은 처음에는 이들 사이에 힌지 시스테인을 가지는 Fab' 단편의 쌍으로 생성되었다. 항체 단편의 다른 화학적 커플링 또한 공지되어 있다.
임의의 척추동물 종으로부터의 항체의 "경쇄"는 이들 불변 도메인의 아미노산 서열을 기준으로, 카파(κ) 및 람다(λ)로 불리는 두개로 명백하게 구별되는 유형 중의 하나로 지정될 수 있다.
"단일-사슬 Fv" 또는 "scFv" 항체 단편은 항체의 VH 및 VL 도메인을 포함하며, 여기서 이러한 도메인은 단일 폴리펩티드 사슬로 존재한다. 바람직하게는, Fv 폴리펩티드는 scFv가 원하는 항원 결합 구조의 형성을 가능하게 하는 VH 및 VL 도메인 사이의 폴리펩티드 링커를 추가로 포함한다. scFv의 조사에 대해서는 문헌[Pluckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Mooreeds., Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994)]를 참조.
용어 "디아바디(diabody)"는 단편이 동일한 폴리펩티드 사슬(VH-VL) 내에서 가변 경도메인(VL)에 연결된 가변 중도메인(VH)를 포함하는, 두개의 항원-결합 부위를 갖는 작은 항체 단편을 의미한다. 너무 짧아서 동일한 사슬 내 두개의 도메인 사이의 쌍형성을 불가능하게 하는 링커를 사용함으로써, 도메인은 또다른 사슬의 상보적 도메인과 쌍을 형성하여 두개의 항원-결합 부위를 생성하도록 한다. 디아바디는, 예를 들어, EP 404,097; WO 93/11161; 및 문헌[Hollinger et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448]에 더욱 자세히 기재되어 있다.
비인간(예, 설치류) 항체의 "인간화" 형태는 비인간 이뮤노글로불린에서 유래된 서열을 최소한 포함하는 키메라 항체이다. 대부분의 부분에서, 인간화 항체는 수용자의 초가변 영역의 잔기가 마우스, 래트, 토끼 또는 원하는 특이성, 친화성, 및 투여량을 가지는 비인간 영장류와 같은 비인간 종(공여자 항체)의 초가변 영역의 잔기로 대체되는 인간 이뮤노글로불린(수용자 항체)이다. 임의의 경우에는, 인간 이뮤노글로불린의 프레임워크 영역(FR) 잔기가 대응하는 비인간 잔기로 대체된다. 또한, 인간화 항체는 수용자 항체 또는 공여자 항체에서 발견할 수 없는 잔기를 포함할 수 있다. 이들 변형은 항체 수행을 좀 더 정련되게 한다. 일반적으로, 인간화 항체는 한개 이상, 및 통상적으로 두개의 가변 도메인 모두를 실질적으로 포함할 것인데, 초가변 루프의 모두 또는 실질적으로 모두는 비인간 이뮤노글로불린의 초가변 루프에 대응하고, FR의 모두 또는 실질적으로 모두는 인간 이뮤노글로불린 서열의 FR에 대응한다. 인간화 항체는 또한 최소한 이뮤노글로불린 불변 영역(Fc)의 일부분, 통상적으로 인간 이뮤노글로불린의 것을 임의로 포함할 것이다. 더 자세한 것은, 문헌[Joneset al. (1986) Nature, 321: 522-525]; 문헌[Riechmannet al. (1988) Nature 332: 323-329]; 및 [Presta, (1992) Curr. Op. Struct. Biol., 2: 593-596]을 참조.
인간화 항-ErbB2 항체는 여기서 명백히 참고하는 미국 특허 번호 제5821337호의 표 3에 기재되어 있는 바와 같이, huMAb4D5-1, huMAb4D5-2, huMAb4D5-3, huMAb4D5-4, huMAb4D5-5, huMAb4D5-6, huMAb4D5-7 및 huMAb4D5-8(헤르셉틴®(HERCEPTIN®); 이하에서 기재하는 바와 같이 인간화 520C9(WO 93/21319) 및 인간화 2C4 항체를 포함한다.
"단리된" 항체는 천연 환경의 성분으로부터 확인되고 분리하여 및(또는) 회수된 항체이다. 천연 환경의 오염 성분은 항체의 진단 또는 치료적 사용을 방해할 수 있는 물질이고, 효소, 호르몬, 및 다른 단백질성 또는 비단백질성 용질을 포함할 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 항체는 (1)로우리(Lowry) 법으로 측정된 95 중량％ 초과, 및 가장 바람직하게는 99 중량％ 초과의 항체로, (2)방사 컵 서열 분석기를 사용하여 N-말단 또는 내부 아미노산 서열의 15개 잔기 이상을 얻기에 충분한 정도로, 또는 (3)쿠마시 블루(Coomassie blue) 또는 바람직하게는, 은 염색을 사용하여 환원 또는 비환원 상태하에서 SDS-PAGE에 의해 균질하게 정제될 것이다. 단리된 항체는 항체 천연 환경의 하나 이상의 성분은 존재하지 않으므로 재조합 세포 내 계내 항체를 포함한다. 하지만, 보통, 단리된 항체는 하나 이상의 정제 단계에 의해 제조될 것이다.
관심있는 항원에 "결합하는" 항체는 항체가 항원을 발현하는 표적 세포에 유용하도록 충분한 친화성으로 항원과 결합할 수 있는 항체이다.
"아팝토시스(apoptosis)를 유발하는" 항체는 아넥신(annexin) V의 결합, DNA 단편화, 세포 수축, 소포체의 확장, 세포 단편화, 및(또는) 막 소포의 형성(아팝토체라 불림)으로 측정된 예정된 세포 사망을 유발하는 것이다. 세포는 종양 세포, 예를 들어, 유방, 난소, 위, 자궁 내막, 타액선, 폐, 신장, 대장, 갑상선, 췌장 또는 방광 세포이다. 아팝토시스와 관련된 세포성 사건을 평가하는데 다양한 방법이 이용될 수 있다. 예를 들어, 포스파티딜 세린(PS) 전위는 아넥신 결합으로 측정될 수 있고, DNA 단편화는 DNA 래더링(laddering)을 통해 평가될 수 있으며, 핵/크로마틴 축합과 DNA 단편화는 저이배체 세포의 증가로 평가될 수 있다.
"장애"는 본 발명의 치료로 인해 이롭게 될 수 있는 임의의 상태이다. 이것은 포유동물의 문제의 장애 소인인 병적 상태를 포함하여 만성 및 급성 장애 또는 질환을 포함한다. 여기서 치료되는 비제한 장애의 예는 양성 및 악성 종양; 백혈병 및 림프성 악성종양, 특히 유방, 난소, 위, 자궁 내막, 타액선, 폐, 신장, 대장, 갑상선, 췌장, 전립선 또는 방광 암; 신경원성, 신경교, 성상세포, 시상하부 및 다른 선상, 대식세포상, 상피성, 기질성 및 할강성 장애; 및 염증성, 혈관형성 및 면역성 장애를 포함한다.
용어 "치료 유효량"은 포유동물에서 질환 또는 장애를 치료하기 위한 약물의 유효량을 의미한다. 암의 경우, 약물의 치료 유효량은 암 세포의 수를 감소시킬 수 있고; 종양 크기를 감소시킬 수 있으며; 말초 기관내의 암 세포 침입을 억제할 수 있고(즉, 다소 서서히 및 바람직하게는 중지시킴); 종양 전이를 억제할 수 있고(즉, 다소 서서히 및 바람직하게는 중지시킴); 종양 성장을 다소 억제할 수 있고; 및(또는) 암과 관련된 하나 이상의 증상을 어느 정도 완화시킬 수 있다. 약물이 존재하는 암 세포 성장을 예방하거나 및(또는) 암세포를 사멸시킬 수 있는 한, 세포증식억제성 및(또는) 세포독성이 있을 수 있다. 암 치료에 있어, 예를 들어, 효능은 질환 진행(TTP)에 대한 시간을 평가하거나 및(또는) 반응 속도(RR)를 측정함으로써 결정될 수 있다.
용어 "실질량"은 집단, 및 집합 또는 샘플의 50％ 초과, 즉 과반수를 의미한다.
용어 "세포내 대사물질"은 항체 약물 접합체(ADC)에서의 대사 과정 또는 세포 내부 반응으로 생성된 화합물을 의미한다. 대사 과정 또는 반응은 ADC 펩티드 링커의 단백질분해적 절단과 같은 효소적 과정, 또는 하이드라존, 에스테르, 또는 아미드와 같은 작용기의 가수분해일 수 있다. 세포내 대사물질은 세포 내로 진입, 확산, 흡수 또는 수송 후 세포내 분해를 거치는 항체 및 유리 약물을 포함하나, 이들로 제한되는 것은 아니다.
용어 "세포내에서 분해된" 및 "세포내 분해"는 약물-리간드 접합체, 약물-링커-리간드 접합체, 항체 약물 접합체(ADC) 등에서 약물 잔기(D)와 항체(Ab) 간의 공유적 연결, 예를 들어 링커가 끊어져 세포 내에서 항체로부터 해리되는 유리 약물을 생성하는, 세포내 대사 과정 또는 반응을 의미한다. 따라서 약물-리간드 접합체, 약물-링커-리간드 접합체 또는 ADC의 분해된 잔기는 세포내 대사물질이다.
용어 "생체 이용률"은 환자에 투여된 약물 일정량에 대한 전신 이용률(즉, 혈액/혈장 수준)을 의미한다. 생체 이용률은 투여된 투여 형태로부터 일반적 순환에 도달하는 시간(속도) 및 약물의 총량(범위) 모두의 측정값을 나타내는 절대적 용어이다.
용어 "세포독성 활성"은 항체 약물 접합체 화합물 또는 항체 약물 접합체화합물의 세포내 대사물질의 세포-사멸, 세포증식억제성 또는 항-증식 효과를 의미한다. 세포독성 활성은 세포의 반이 생존하는 단위 부피당 농도(몰 또는 질량)인 IC50 값으로 표현될 수 있다.
용어 "암" 및 "암성"은 포유동물에서 통상적으로 비조절된 세포 성장이라는 특성이 있는 생리학적 상태를 의미하거나 또는 설명한다. "종양"은 하나 이상의 암성 세포를 포함한다. 암의 예는 암종, 림프종, 모세포종, 육종, 및 백혈병 또는 림프성 악성 종양을 포함하나 이들로 제한되는 것은 아니다. 이러한 암의 보다 구체적인 예는 편평 세포 암(예, 상피성 편평 세포 암), 소세포 폐암, 비 소세포 폐암("NSCLC"), 폐의 선암 및 폐의 편평 암종을 포함하는 폐암, 복막암, 간세포암, 위장관암을 포함하는 위암, 췌장암, 교모세포종, 자궁경부암, 난소암, 간암(liver cancer), 방광암, 간세포암(hepatoma), 유방암, 대장암, 직장암, 결장암, 자궁내막 또는 자궁 암종, 타액선 암종, 신장암, 전립선암, 외음부암, 갑상선암, 간 암종, 항문 암종, 음경 암종 뿐 아니라 두경부암을 포함하나, 이들로 제한되는 것은 아니다.
"ErbB2-발현 암"은 항-ErbB2 항체가 암에 결합하여 암에 대해 치료학적 효과를 가질 수 있도록, 이들의 세포 표면에 충분한 수준의 ErbB2를 생산하는 것이다.
ErbB2 수용체의 "과도한 활성화를 특징으로 하는" 암은 암 세포의 ErbB2 수용체 활성화의 정도가 동일한 조직형의 비-암성 세포의 ErbB2 수용체의 활성화 수준을 상당히 초과하는 암이다. 이러한 과도한 활성화는 ErbB2 수용체의 과발현 및(또는) 암 세포내 ErbB2 수용체를 활성화하는데 이용될 수 있는 ErbB2 리간드의 정상 수준의 초과에 의해 발생될 수 있다. 이러한 과도한 활성화는 암 세포의 악성 상태를 야기키거나 및(또는) 악성 상태에 의해 야기될 수 있다. 특정 실시양태에서, 암은 진단 또는 예후 분석법을 거쳐, ErbB2 수용체의 이러한 과도한 활성화를 초래하는 ErbB2 수용체의 증폭 및(또는) 과발현이 일어났는지를 측정할 수 있다. 별법으로, 또는 추가적으로, 암은 진단 또는 예후 분석법을 거쳐, 수용체의 과도한 활성화에 기인하는 ErbB2 리간드의 증폭 및(또는) 과발현이 일어났는지를 측정할 수 있다. 이러한 암의 아집단에서, 수용체의 과도한 활성화는 자가분비 자극 경로로부터 발생될 수 있다.
ErbB2 수용체를 "과발현"하는 암은 동일한 조직형의 비암성 세포와 비교하여, 이들의 세포 표면에 상당히 더 높은 수준의 ErbB2 수용체를 가지는 것이다. 이러한 과발현은 유전자 증폭 또는 증가된 전사 또는 번역에 의해 야기될 수 있다. ErbB2 수용체 과발현은 진단 또는 예후 분석법으로 세포의 표면에 존재하는 ErbB2 단백질의 증가된 수준을 평가함으로써 측정할 수 있다(예, 면역조직화학 분석법;IHC에 의함). 별법으로, 또는 추가적으로, 세포내 ErbB2-코딩 핵산의 수준을, 예를 들어, 형광 계내 혼성화(FISH; WO 98/45479 참조), 써던 블롯팅, 또는 실시간 정량 PCR(RT-PCR)과 같은 중합효소 연쇄 반응(PCR)법에 의해 측정할 수 있다. ErbB2 수용체 과발현은 상기 기재한 IHC, FISH, 써던 블롯팅, PCR 또는 생체 내 분석법과 같은 다양한 진단 분석법으로 또는 예를 들어 종양 생검에서, 환자의 리간드(또는 리간드를 암호화한 핵산)의 수준을 평가함으로써 진단적으로 측정할 수 있다. 또한 혈청과 같은 생물학적 유체 내에서 탈피된 항원(예, ErbB2 세포외 도메인)을 측정함으로써 ErbB2 수용체 과발현을 조사할 수 있다(예를 들어, 미국 특허 번호 제4933294호; WO 91/05264; 미국 특허 번호 제5401638호; 및 문헌[Sias et al.,(1990) J. Immunol. Methods, 132: 73-80] 참조). 상기 분석법 외에, 다양한 다른 생체 내 분석법이 당업자에게 이용될 수 있다. 예를 들어, 검출가능한 표지(예, 방사성 동위원소)로 임의적으로 표지된 항체를 환자의 체내 세포에 노출시킬 수 있고, 환자 세포에 대한 항체 결합은 예를 들어, 방사능에 대한 외부 주사 또는 이전에 항체에 노출된 환자로부터 얻은 생검을 분석하여 평가될 수 있다.
HER2를 과발현한 종양은 세포당 발현된 HER2 분자의 카피수에 대응하는 면역조직화학적 스코어에 의해 평가되며, 생화학적으로 측정될 수 있다: 0 = 0-10,000 카피/세포, 1+ = 200,000 이상 카피/세포, 2+ = 500,000 이상 카피/세포, 3+ = 약 1-2x106 카피/세포. 티로신 키나아제의 리간드-비의존 활성화를 유발([Hudziak et al., (1987) Proc. Natl. Acad.Sci. USA, 84: 7159-7163])하는 3+ 수준의 HER2 과발현은 대략 30％의 유방암에서 일어나고, 이 환자에서, 재발 없는 생존 및 전체 생존을 줄인다([Slamon et al., (1989) Science,244 : 707-712; Slamonet al., (1987) Science, 235: 177-182]).
반대로, "ErbB2 수용체 과발현을 특징으로 하지 않는" 암은 진단 분석법에 의할 때, 동일한 조직형의 비암성 세포와 비교하여 정상 수준의 ErbB2 수용체보다 높게 발현하지 않는 것이다.
여기서 사용된 용어 "세포독성제"는 세포의 기능을 억제하거나 예방하거나 및(또는) 세포의 파괴를 야기시키는 물질을 의미한다. 용어는 방사성 동위원소(예, 211At, 13 lI, 125I, 90Y, 186Re, 188Re, 153Sm, 212Bi, 32P, 60C, 및 Lu의 방사성 동위원소), 화학요법제, 및 소분자 독소 또는 박테리아, 진균, 식물 또는 동물 기원의 효소적 활성 독소와 같은 독소(이들의 합성 동족체 및 유도체를 포함)를 포함하는 것으로 의도된다. 한 측면에서, 용어는 방사성 동위원소를 포함하지 않는 것으로 의도된다.
"화학요법제"는 암의 치료에 유용한 화학적 화합물이다. 화학요법제의 예는 티오테파 및 시톡산®(CYTOXAN®) 시클로포스파미드와 같은 알킬화제; 부술판, 임프로술판 및 피포술란과 같은 알킬 술포네이트, 벤조도파, 카르보퀀, 메투레도파, 및 우레도파와 같은 아지리딘; 알트레타민, 트리에틸렌멜라민, 트리에틸렌포스포르아미드를 포함하는 에틸렌이민 및 메틸아멜라민; TLK 286(텔시타™(TELCYTA™)); 아세토제닌(특히 불라타신 및 불라타시논); 델타-9-테트라히드로카나비놀(드로나비놀, 마리놀®(MARINOL®)); 베타-라파콘; 라파콜; 콜키신; 베툴린산; 캄프토테신(합성 동족체 토포테캄(히캄틴®(HYCAMTIN®) 포함), CPT-11(이리노테칸, 캄프토사르®(CAMPTOSAR®)), 아세틸캄프토테신, 스코폴렉틴, 및 9-아미노캄프토테신을 포함); 브리오스타틴; 콜리스타틴; CC-1065(이것의 아도젤레신, 카르젤레신 및 비젤레신 합성 동족체 포함); 포도필로톡신; 포도필린산; 테니포시드; 크립토피신(특히 크립토피신 1 및 크립토피신 8); 돌라스타틴; 두오카르미신(합성 동족체, KW-2189 및 CB1-TM1 포함); 엘레우테로빈; 판크라티스타틴; 사르코딕티인; 스폰기스타틴; 클로람부실, 클로르나파진, 콜로포스파미드, 에스트라무스틴, 이포스파미드, 메클로레타민, 메클로레타민 옥시드 히드로클로라이드, 멜팔란, 노벰비킨, 페네스테린, 프레드니무스틴, 트로포스파미드, 우라실 무스타드와 같은 질소 무스타드; 카르무스틴, 클로로조토신, 포테무스틴, 로무스틴, 니무스틴, 및 라님누스틴과 같은 니트로스우레아; 클로드로네이트와 같은 비스포스포네이트; 에네디인 항생제(예, 칼리케아미신, 특히 칼리케아미신 감마 1Ⅰ 및 칼리케아미신 오메가Ⅰ1(예, 문헌[Agnew, Chem Intl. Ed. Engl., 33: 183-186 (1994)]참조)) 및 안나미신과 같은 안트라시클린, AD 32, 알카루비신, 다우노루비신, 덱스라족산, DX-52-1, 에피루비신, GPX-100, 이다루비신, KRN5500, 메노가릴, 디네미신 A를 포함하는 디네미신, 에스페라미신, 네오카르지노스타틴 발색단 및 관련된 색소단백질 에네디인 항생물질 발색단, 아클라시노미신, 악티노미신, 오트라미신, 아자세린, 블레오미신, 칵티노미신, 카라비신, 카르미노미신, 카르지노필린, 프로모미시니스, 닥티노미신, 데토루비신, 6-디아조-5-옥소-L-노르루신, 아드리아미신®(ADRIAMYCIN®) 독소루비신(모르폴리노-독소루비신, 시아노모르폴리노-독소루비신, 2-피롤리노-독소루비신, 리포좀성 독소루비신, 및 데옥시독소루비신을 포함), 에소루비신, 마르셀로미신, 미토미신 C와 같은 미토미신, 미코페놀산, 노갈라미신, 올리보미신, 페플로미신, 포트피로미신, 푸로미신, 퀘라미신, 로도루비신, 스트렙토니그린, 스트렙토조신, 투베르시딘, 유베니멕스, 지노스타틴, 및 조루비신과 같은 항생물질; 데놉테린, 프테롭테린, 및 트리메트렉세이트와 같은 엽산 동족체; 플루다라빈, 6-머르캅토푸린, 티아미프린, 및 티오구아닌과 같은 푸린 동족체; 안시타빈, 아자시티딘, 6-아자우리딘, 카르모푸르, 시타라빈, 디데옥시유리딘, 독시플루리딘, 에노시타빈, 및 플록수리딘과 같은 피리미딘 동족체; 칼루스테론, 드로모스타놀론 프로피오네이트, 에피티오스타놀, 메피티오스탄, 및 테스톨락톤과 같은 안드로겐; 아미노글루테티미드, 미토탄, 및 트릴로스탄과 같은 항-부신성; 폴린산(루코보린)과 같은 엽산 보충물; 아세글라톤; 알림타®(ALIMTA®), LY231514 페메트렉세드와 같은 항-엽산염 항-신생물제, 메토트렉세이트와 같은 디히드로폴레이트 환원효소 억제제, 5-플루오로우라실(5-FU)과 같은 항-대사물질 및 UFT, S-1 및 카페시타빈과 같은 이들의 전구물질, 및 티미딜레이트 합성 억제제 및 랄티트렉세드(토무덱스RM(TOMUDEXRM), TDX)와 같은 리보뉴클레오티드 포르밀전이효소 억제제; 에닐우라실과 같은 디히드로피리미딘 탈수소효소 억제제; 알도포스파미드 글리코시드; 아미노레불린산; 암사크린; 베스트라부실; 비산트렌; 에다트렉세이트; 데포파민드; 데메콜신; 디아지퀀; 엘포르니틴; 엘립티늄 아세테이트; 아네포틸론; 에토글루시드; 갈륨 니트레이트; 히드록시우레아; 렌티난; 로니다이닌; 마이탄신 및 안사미토신과 같은 마이탄시노이드; 미토구아존; 미톡산트론; 모피단몰; 니트래린; 펜토스타틴; 페나멧; 피라루비신; 로속산트론; 2-에틸히드라지드; 프로카르바진; PSK® 폴리사카라이드 복합체(오레곤주 유진에 위치한, JHS 내추럴 프로덕트(JHS Natural Products) 사의 제품); 라족산; 리족신; 시조피란; 스피로게르마늄; 테누아조닌산; 트리아지퀀; 2,2',2"-트리클로트리에틸아민; 트리코테센(특히 T-2 독소, 베라쿠린 A, 로리딘 A 및 안귀딘); 우레탄; 빈데신(엘디신®(ELDISINE®), 필데신®(FILDESIN®)); 다카르바진; 만노무스틴; 미토브로니톨; 미톨락톨; 피포브로만; 가시토신; 아라비노시드("Ara-C"); 시클로포스파미드; 티오테파; 탁소이드 및 탁산, 예를 들어 탁솔®(TAXOL®) 파클리탁셀(뉴저지주, 프린세톤에 위치한 브리스톤-미에르스 스큅 온콜로지(Bristol-Myers Squibb Oncology)사의 제품), 아브락세인®(ABRAXANE®) 크레모포르-없음, 파클리탁셀의 알부민-유전자조작 나노입자 형성(일리노이주, 스카움베르그에 위치한 아메리칸 파르마수티컬 파트너스(American Pharmaceutical Partners)사의 제품), 및 탁소테레®(TAXOTERE®) 독세탁셀(프랑스, 안토니에 위치한 론-포울렌크 로러(Rhone-Poulenc Rorer)사의 제품); 클로란부실; 젬시타빈(젬자르®(GEMZAR®)); 6-티오구아닌; 머르캅토푸린; 플라티늄; 시스플라틴, 옥살리플라틴 및 카르보플라틴과 같은 플라티늄 동족체 또는 플라티늄-기초 동족체; 빈블라스틴(벨반®(VELBAN®)); 에토포시드(VP-16); 이포스파미드; 미톡산트론; 빈크리스틴(온코빈®(ONCOVIN®)); 빈카 알칼로이드; 비노렐빈(나벨빈®(NAVELBINE®)); 노반트론; 에다트렉세이트; 다우노미신; 아미놉테린; 크셀로다; 이반드로네이트; 토포이소머라아제 억제제 RFS 2000; 이플루오로메틸오르니틴(DMFO); 레티노산과 같은 레티노이드; 상기 물질의 제약상 허용되는 염, 산 또는 유도체; 또한 시클로포스파미드, 독소루비신, 빈크리스틴, 및 프레드니솔론의 결합 치료제의 약칭인 촙(CHOP), 및 5-FU과 루코보린이 결합된 옥살리플라틴(엘록사틴™(ELOXATIN™))의 치료 요법의 약칭인 폴폭스(FOLFOX)과 같은 두개 이상의 상기 물질의 조합을 포함한다.
또한, 이 정의에 따라, 항-에스트로겐 및 선택적 에스트로겐 수용체 조절인자(SERM)와 같이 종양의 호르몬 작용을 조절하거나 또는 억제하는 작용을 하는, 예를 들어, 타목시펜(놀바덱스®(NOLVADEX®) 타목시펜), 랄록시펜, 드롤록시펜, 4-히드록시타목시펜, 트리옥시펜, 케옥시펜, LY117018, 오나프리스톤, 및 파레스톤®(FARESTON®) 토레미펜을 포함하는 항-호르몬제; 부신선의 에스트로겐 생산을 조절하는 효소 아로마테아제를 억제하는 아로마테아제 억제제, 예를 들어, 4(5)-이미다졸, 아미노글루테티미드, 메가세®(MEGASE®) 메게스트롤 아세테이트, 아로마신®(AROMASIN®) 엑세메스탄, 포르메스타니에, 파드로졸, 리비소르®(RIVISOR®) 보로졸, 페마라®(FEMARA®) 레트로졸, 및 아리미덱스®(ARIMIDX®) 안나스트로졸; 안나스트로졸; 및 플루타미드, 닐루타미드, 비칼루타미드, 류프롤라미드, 및 고세렐린과 같은 항-안드로겐; 또한 트록사시타빈(1,3-디옥솔란 뉴클레오시드 시토신 동족체); 안티센스(antisense) 올리고뉴클레오티드, 특히, 예를 들어, PKC-알파, Raf, H-Ras, 및 표피 성장 인자 수용체(EGF-R)와 같은 변종(abherant) 세포 증식에 연루된 신호 경로에 있어 유전자 발현을 억제하는 것들; 유전자 치료 백신과 같은 백신, 예를 들어 알로벡틴®(ALLOVECTIN®) 백신, 루벡틴®(LEUVECTIN®) 백신, 및 박시드®(VAXID®) 백신; 프로루킨®(PROLEUKIN®) rIL-2; 러르토테칸®(LURTOTECAN®) 토포이소머라아제 1 억제제; 아바렐릭스®(ABARELIX®) rmRH; 및 상기 물질의 제약상 허용되는 염, 산 또는 유도체도 포함된다.
여기서 사용된 용어 "EGFR-표적 약물"은 EGFR에 결합하여, 임의적으로, EGFR 활성화를 억제하는 치료제를 의미한다. 이 작용제의 예는 EGFR에 결합하는 항체 및 소분자를 포함한다. EGFR에 결합하는 항체의 예는 MAb 579(ATCC CRL HB 8506), MAb 455(ATCC CRL HB8507), MAb 225(ATCC CRL 8508), MAb 528(ATCC CRL 8509)(미국 특허 번호 제4943533호 참조, 멘델손(Mendelsohn) 등) 및 키메라화 225(C225 또는 세툭시맙; 에그비툭스®(ERBITUX®)) 및 재조절 인간 225(H225)(WO 96/40210 참조, 임클론 시스템 사(Imclone Systems Inc.))와 같은 이들의 변이체; 제II형 돌연변이체 EGFR에 결합하는 항체(미국 특허 번호 제5,212,290호); 미국 특허 번호 제5891996호에 기재된 바와 같이 EGRF에 결합하는 인간화 및 키메라 항체; 및 ABX-EGF (WO 98/50433 참조, 압젠닉스(Abgenix) 사)와 같이 EGFR에 결합하는 인간 항체를 포함한다. 항-EGFR 항체는 세포독성제와 접합될 수 있고, 따라서 면역접합체를 생성시킬 수 있다(예를 들어, EP 659,439A2 참조, 머크 특허 GmbH(Merck Patent GmbH) 사). EGFR에 결합하는 소분자의 예는 ZD1839 또는 제피티닙(아스트라 제네카(Astra Zeneca)사의 제품인 이레사™(IRESSA™)), 얼로티닙 HCl(제넨테크/OSI(Genentech/OSI) 사의 제품인 CP-358774, 타르세바™(TARCEVA™)) 및 AG1478, AG1571 (수젠(Sugen) 사의 제품인 SU 5271)를 포함한다.
"티로신 키나아제 억제제"는 ErbB 수용체와 같은 티로신 키나아제의 티로신 키나아제 활성을 다소 억제하는 분자이다. 이 억제제의 예는 상기 단락에서 언급한 EGFR-표적화 약물 뿐 아니라 PD 153035, 4-(3-클로로아닐리노)퀴나졸린, 피리도피리미딘, 피리미도피리미딘, CGP 59326, CGP 60261 및 CGP 62706와 같은 피롤로피리미딘, 및 피라졸로피리미딘, 4-(페닐아미노)7H-피롤로[2,3-d]피리미딘, 커르쿠민(디페룰로일 메탄, 4,5-비스(4-플루오로아닐리노)프탈이미드), 니트로티오펜 잔기를 포함하는 티르포스틴과 같은 퀴나졸린류; PD-0183805(와르너-람베르트(Warner-Lambert)사의 제품); 안티센스 분자(예를 들어, ErbB-코딩 핵산과 결합하는 것들); 퀴녹살린(미국 특허 번호 제5,804,396호); 트리포스틴(미국 특허 번호 제5804396호); ZD6474(아스트라 제네카사의 제품); PTK-787(노바티스/쉐링 AG(Novartis/Sche환 AG) 사의 제품); CI-1033(화이자(Pfizer) 사의 제품)과 같은 pan-ErbB 억제제; 아피니타크(이시스/릴리(Isis/Lilly) 사의 제품인 이시스UISIS) 3521); 이마티닙 메실레이트(노바티스 사의 제품인 글리벡(Gleevac)); PKI 166(노바티스 사의 제품); GW2016(글락소 스미스클라인(Glaxo SmithKline) 사의 제품); CI-1033(화이자 사의 제품); EKB-569(위에쓰(Wyeth) 사의 제품); 세막산닙(수젠 사의 제품); ZD6474(아스트라 제네카 사의 제품); PTK-787 (노바티스/쉐링 AG 사의 제품); INC-1C11(임클론 사의 제품); 또는 하기에 특허 공보에 기재된 것과 같은 것:미국 특허 번호 제5804396호; WO 99/09016(아메리칸 시아나미드(American Cyanamid) 사); WO 98/43960(아메리칸 시아나미드 사); WO 97/38983(와르너-람베르트사); WO 99/06378(와르너-람베르트사); WO 99/06396(와르너-람베르트사); WO 96/30347(화이자 사); WO 96/33978(제네카 사); WO 96/3397(제네카 사); 및 WO96/33980(제네카 사)을 포함한다.
"항-혈관형성제"는 혈관의 발달을 다소 차단하거나 또는 방해하는 화합물을 의미한다. 항-혈관형성 인자는 예를 들어, 혈관형성을 촉진시키는데 관여하는 성장 인자 또는 성장 인자 수용체와 결합하는 소분자 또는 항체일 수 있다. 한 실시양태에서, 항-혈관형성 인자는 혈관 내피 성장 인자(VEGF)와 결합하는 항체이다.
용어 "사이토킨"은 세포내 매개인자와 같이 또다른 세포에 작용하는 하나의 세포 집단에서 방출되는 단백질의 일반적 용어이다. 이러한 사이토킨의 예는 림포킨, 모노킨, 및 전형적인 폴리펩티드 호르몬이 있다. 사이토킨 중에서, 인간 성장 호르몬, N-메티오닐 인간 성장 호르몬, 및 소 성장 호르몬과 같은 성장 호르몬; 부갑상선 호르몬; 티록신; 인슐린; 프로인슐린; 렐락신; 프로렐락신; 난포 자극 호르몬(FSH), 갑상선 자극 호르몬(TSH), 및 황체형성 호르몬(LH)과 같은 당단백질 호르몬; 간 성장 인자; 섬유모세포 성장 인자; 프로락틴; 태반 최유 호르몬; 종양 괴사 인자-α 및 β; 뮬러-억제 물질; 마우스 고나도트로핀-관련 펩티드; 인히빈; 엑티빈; 혈관 내피 성장 인자; 인테그린; 트롬보포이에틴(TPO); NGF-β와 같은 신경 성장 인자; 혈소판-성장 인자; TGF-α 및 TGF-β와 같은 형질전환 성장 인자(TGF); 인슐린-유사 성장 인자-I 및 -II; 에리트로포이에틴(EPO); 골유도 인자; 인터페론-α, -β, 및 -γ와 같은 인터페론; 대식세포-CSF(M-CSF)와 같은 콜로니 자극 인자(CSF); 백혈구-대식세포-CSF(GM-CSF); 및 백혈구-CSF(G-CSF); IL-1, IL-lα, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12와 같은 인터루킨(IL); TNF-α 또는 TNF-β와 같은 종양 괴사 인자; 및 LIF 및 키트(kit) 리간드(KL)를 포함하는 다른 폴리펩티드 인자를 포함한다. 여기서 사용된 용어 사이토킨은 천연 공급원 또는 재조합 세포 배양물으로부터의 단백질 및 천연 서열 사이토킨과 생물학적으로 활성인 등가물을 포함한다.
본 출원에 사용된 용어 "전구약물"은 모 약물에 비해 종양 세포에 약한 세포독성이 있고, 효소적 또는 가수분해적으로 활성화되거나 또는 더 나은 활성 모 형태로 전환가능한 제약상 활성 물질의 전구체 또는 유도 형태를 의미한다. 예를 들어, 문헌[Wilman, "Prodrugs in Cancer Chemotherapy" Biochemical Society Transactions, 14, pp. 375-382, 615th Meeting Belfast(1986)] 및 [Stella et al., "Prodrugs : A Chemical Approach to targeted drug Delivery, "Directed Drug Delivery, Borchardt et al., (ed.), pp.247-267, Humana Press(1985)] 참조. 본 발명의 전구약물은 더 좋은 활성 세포독성 유리 약물로 전환될 수 있는 포스페이트-포함 전구약물, 티오포스페이트-포함 전구약물, 술페이트-포함 전구약물, 펩티드-포함 전구약물, D-아미노산-변형 전구약물, 글리코실화 전구약물, β-락탐-포함 전구약물, 임의적으로 치환된 페녹시아세트아미드-포함 전구약물 또는 임의적으로 치환된 페닐아세타미드-포함 전구약물, 5-플루오로시토신 및 다른 5-플루오로우리딘 전구약물을 포함하나, 이들로 제한되는 것은 아니다. 본 발명에 사용하기 위해 전구약물 형태로 유도될 수 있는 세포독성 약물의 예는 상기에서 기재한 바와 같은 화학요법제를 포함하나, 이들로 제한되는 것은 아니다.
"리포좀"은 포유동물에서 다양한 유형의 지질, 인지질 및(또는) 약물(예를 들어, 항-CD30, CD40, CD70 또는 루이스 Y 항체 및, 임의적으로, 화학요법제 포함)의 수송에 유용한 계면활성제로 구성되는 작은 소포이다. 리포좀 성분은 생물학적 막의 지질 배열과 유사하게, 일반적으로 이중층 형태로 배열된다. 사용된 용어 "제품 첨부 설명서"는 치료 제품의 사용에 관한 증세, 용법, 투여량, 투여, 금기사항 및(또는) 주의사항의 정보를 포함하는, 관례적으로 치료 제품의 상업적 포장에 포함되는 지침서를 의미한다.
"단리된" 핵산 분자는 항체 핵산의 천연 공급원과 보통 관련되는 하나 이상의 오염 핵산 분자로부터 확인되고 분리된 핵산 분자이다. 단리된 핵산 분자는 천연에서 발견된 형태 또는 환경과 다르다. 따라서 단리된 핵산 분자는 천연 세포에 존재하는 핵산 분자와 구별된다. 하지만, 단리된 핵산 분자는 예를 들어, 핵산 분자가 천연 세포의 핵산 분자와 상이한 염색체 위치에 있는 경우에, 보통 항체를 발현하는 세포 내에 포함되는 핵산 분자를 포함한다.
표현 "제어 서열"은 특정 숙주 생물에 작동 가능하게 연결된 코딩 서열의 발현에 필요한 DNA 서열을 의미한다. 예를 들어, 원핵생물에 적합한 제어 서열은 촉진제, 임의적으로 작동유전자 서열, 및 리보솜 결합 부위를 포함한다. 진핵 세포는 촉진제, 폴리아데닐레화 신호, 및 인핸서를 이용하는 것으로 공지되어 있다.
핵산은 또다른 핵산 서열에 기능적 관계가 인정되었을 때 "작동 가능하게 연결"된다. 예를 들어, 전서열 또는 분비 리더의 DNA가 폴리펩티드 분비에 관여하는 전단백질로 발현된다면, 폴리펩티드에 대한 DNA에 작동 가능하게 연결되고; 프로모터 또는 인핸서가 서열의 전사에 영향을 미친다면, 코딩 서열에 작동 가능하게 연결되며; 또는 리보솜 결합 부위가 번역이 용이하기 위한 위치에 있다면, 코딩 서열에 작동 가능하게 연결된다. 일반적으로, "작동 가능하게 연결된"은 연결된 DNA 서열이 분비 리더에 인접해있고, 리딩 상에 인접해 있는 것을 의미한다. 하지만, 인핸서는 인접해있지 않다. 연결은 알맞은 제한 부위에서 라이게이션으로 이루어질 수 있다. 만약 이러한 부위가 존재하지 않는다면, 합성올리고뉴클레오티드 어댑터 또는 링커는 통상적인 실시에 따라 사용될 수 있다.
여기서 사용된 표현 "세포", "세포주" 및 "세포 배양물"은 호환가능하게 사용되며 이 명칭 모두가 자손을 포함한다. 따라서, 단어 "형질전환" 및 "형질전환된 세포"는 전사의 횟수에 관계없이 1차 종속 세포 및 이로부터 유도된 배양물을 포함한다. 고의적 또는 우연한 돌연변이에 의해, 모든 자손이 정확하게 동일한 DNA 함량을 가지고 있지 않을 수도 있다는 것 또한 이해할 수 있다. 처음의 형질전환된 세포에서 스크린된 바와 같은 동일한 기능 또는 생물학적 활성을 가진 돌연변이체 자손을 포함한다. 별개의 명칭으로 의도되는 곳에서, 이것은 문맥상 분명할 것이다.
여기의 "자가면역 질환"은 각각 자신의 조직에 직접 대항하여 나타나는 질환 또는 장애이거나 또는 상호분리 또는 이들의 징후이거나 또는 여기서 발생하는 상태이다. 자가면역 질환 또는 장애의 예는 관절염 (류마티스 관절염, 연소성 류마티스 관절염, 골관절염, 건선성 관절염, 및 강직성 척추염), 건선, 아토피 피부염을 포함한 피부염; 만성 자가면역 두드러기를 포함한 만성 특발성 두드러기, 다발성 근염/피부근염, 독성 표피성 괴사 용해, 전신 피부경화증 및 경화증, 염증성 장질환(IBD)(크론병, 궤양성 대장염)과 관련된 반응, 및 괴저성 농피증의 상호분리를 수반한 IBD, 결절 홍반, 1차 경화성 담관염, 및(또는) 상공막염, 성인 호흡 곤란 증후군(ARDS)을 포함한 호흡 곤란 증후군, 수막염, 과민증 및 알러지성 비염과 같은 IgE-매개성 질환, 라스무센 뇌염과 같은 뇌염, 포도막염, 현미경 대장염 및 콜라겐성 대장염과 같은 대장염, 막성 GN, 특발성 막성 GN, 제I형 및 유형II을 포함하는 막성 증식 GN(MPGN), 및 빠르게 진행되는 GN과 같은 사구체신염(GN), 알러지 상태, 습진, 천식, T 세포의 침입 및 만성 염증 반응과 관련되 상태, 죽상 경화증, 자가면역 심근염, 백혈구 유착 결핍증, 피부성 SLE와 같은 전신 홍반성 루푸스(SLE), 루푸스(신염, 뇌염, 소아성, 비-신장성, 원판양성, 탈모증), 연소성 발병 당뇨병, 척수-시각 MS와 같은 다중 경화증(MS), 알러지성 뇌척수염, 시토카인 및 T-림프구에 의해 매개된 급성 및 지연된 과민증과 관련된 면역 반응, 결핵, 사르코이드증, 베게너 육아종증을 포함한 육아종증, 무과립증, 혈관염(큰 혈관 혈관염(류마티스성 다발성근육통 및 거대 세포성(다카야수) 동맥염 포함), 중간 혈관성 혈관염(카와사키병 및 결정성 다발성동맥염 포함), CNS 혈관염, 및 처크 스트라우스 혈관염 또는 증후군(CSS)과 같은 ANCA-관련 혈관염, 재생불량성 빈혈, 쿰스 양성 빈혈, 다이아몬드 블랙판 빈혈, 자가면역성 용혈성 빈혈(AIHA)과 같은 면역성 용혈성 빈혈, 악성 빈혈, 순수 적혈구 무형성증(PRCA), 인자 Ⅶ 결핍증, 혈우병 A, 자가면역 호중구 감소증, 범혈구 감소증, 백혈구 감소증, 백혈구 유출증과 관련된 질환, CNS 염증성 장애, 다중 기관 손상 증후군, 중증 근무력증, 항원-항체 복합체 매개 질환, 항-사구체 기저막 질환, 항-인지질 항체 증후군, 알러지성 신경염, 베체트병, 캐슬만 증후군, 굳패스쳐 증후군, 람베르트-이톤 근무력 증후군, 레이노드 증후군, 쇼그렌 증후군, 스티븐-존슨 증후군, 실질 기관 이식 거부(고 패널 반응 항체 역가에 의한 사전치료, 조직에의 IgA 축척, 및 신장 이식, 간 이식, 장관 이식, 심장 이식 등에 의한 거부 포함), 이식 편대 숙주 질환(GVHD), 수포성 유천포창, 천포창(심상, 낙엽상, 및 천포성 점막 유천포창 포함), 자가면역 다발성내분비병증, 라이터 질환, 강직-인간 증후군, 면역 복합체 신염, IgM 다발성신경병증 또는 IgM 매개신경병증, 특발성 혈소판감소성 자반증(ITP), 혈전성 혈소판감소성 자반증(TTP), 자가면역 혈소판감소증을 포함한 혈소판감소증(예를 들어, 심근 경색 환자에서 발달되는 것과 같음), 자가면역 고환염 및 난소염을 포함한 고환 및 난소의 자가면역 질환, 1차 갑상선기능저하증; 자가면역 갑상선염, 만성 갑상선엽(하시모토 갑상선염), 아급성 갑상선염, 특발성 갑상선기능저하증, 에디슨병, 그레이브병, 자가면역 다발성 선성 증후군(또는 다발성 선성 내분비병증 증후군), 소아성 IDDM을 포함하여, 인슐린 의존성 당뇨병(IDDM)으로 불리는 제I형 당뇨병, 및 쉬한 증후군을 포함한 자가면역 내분비 질환; 자가면역 간염, 림프성 간질성 폐렴(HIV), 폐쇄성 세기관지(비이식)와 NSIP, 길랑-바레 증후군, 버거병(IgA 신증), 1차 담관성 간경화증, 비열대 스프루(글루텐 장병증), 상호분리 포진상 피부염의 난치성 스프루, 한랭글로불린혈증, 근위축성 측삭 경화증(ALS; 루게릭병), 심장 동맥 질환, 자가면역 내이 질환(AIED), 자가면역 난청, 안간대 간대성근경련 증후군(OMS), 난치성 다발연골염과 같은 다발연골염, 폐포단백증, 아밀로이드증, 거대 세포 간염, 공막염, 불명/원인불명 유의성의 모노클로날 감마글로불린병증(MGUS), 말초 신경병증, 부신생물 증후군, 간질, 편두통, 부정맥, 근육 장애와 같은 채널 질환, 난청, 실명, 주기성 마비증, 및 CNS의 채널 질환; 자폐증, 염증성 심근병증, 및 국성 분절성 사구체경화(FSGS)를 포함하나, 이들로 제한되는 것은 아니다.
"알킬"은 표준, 2급, 3급 또는 시클릭 탄소 원소를 포함하는 Cl-C18 탄화수소이다. 예로는 메틸(Me,-CH3), 에틸(Et,-CH2CH3), 1-프로필(n-Pr, n-프로필, -CH2CH2CH3), 2-프로필(i-Pr, i-프로필, -CH(CH3)2), 1-부틸(n-Bu, n-부틸, -CH2CH2CH2CH3), 2-메틸-1-프로필(i-Bu, i-부틸, -CH2CH(CH3)2), 2-부틸(s-Bu, s-부틸, -CH(CH3)CH2CH3), 2-메틸-2-프로필(t-Bu, t-부틸, -C(CH3)3), 1-펜틸(n-펜틸, -CH2CH2CH2CH2CH3), 2-펜틸(-CH(CH3)CH2CH2CH3), 3-펜틸(-CH(CH2CH3)2), 2-메틸-2-부틸(-C(CH3)2CH2CH3), 3-메틸-2-부틸(-CH(CH3)CH(CH3)2), 3-메틸-1-부틸(-CH2CH2CH(CH3)2), 2-메틸-1-부틸(-CH2CH(CH3)CH2CH3), 1-헥실(-CH2CH2CH2CH2CH2CH3), 2-헥실(-CH(CH3)CH2CH2CH2CH2), 3-헥실(-CH(CH2CH3)(CH2CH2CH3)), 2-메틸-2-펜틸(-C(CH3)2CH2CH2CH3), 3-메틸-2-펜틸(-CH (CH3)CH(CH3)CH2CH3), 4-메틸-2-펜틸(-CH(CH3)CH2CH(CH3)2), 3-메틸-3-펜틸(-C (CH3)(CH2CH3)2), 2-메틸-3-펜틸(-CH(CH2CH3)CH(CH3)2), 2,3-디메틸-2-부틸(-C (CH3)2CH(CH3)2), 3,3-디메틸-2-부틸(-CH(CH3)C(CH3)3)이 있다.
"알케닐"은 하나 이상의 불포화 부위, 즉, 탄소-탄소, sp2 이중 결합을 갖는, 표준, 2급, 3급 또는 시클릭 탄소 원소를 함유하는 C2-C18 탄화수소이다. 예로는 에틸렌 또는 비닐(-CH=CH2), 알릴(-CH2CH=CH2), 시클로펜테닐(-C5H7) 및 5-헥세닐(-CH2CH2CH2CH2CH=CH2)이 있으나, 이들로 제한되는 것은 아니다.
"알키닐"은 하나 이상의 불포화 부위, 즉, 탄소-탄소, sp 삼중 결합을 갖는, 표준, 2급, 3급 또는 시클릭 탄소 원소를 함유하는 C2-C18 탄화수소이다. 예로는 아세틸레닉(-C≡CH) 및 프로파르길(-CH2C≡CH)을 포함하나, 이들로 제한되는 것은 아니다.
"알킬렌"은 탄소 원자수 1-18의 포화된, 분지 또는 직쇄 또는 시클릭 탄화수소 기를 의미하며, 모 알칸의 동일한 또는 두개의 상이한 탄소 원자로부터 두개의 수소 원자의 제거로 유도된 두개의 1가 기 중심을 가진다. 통상적인 알킬렌 기는 메틸렌(-CH2-), 1,2-에틸(-CH2CH2-), 1,3-프로필(-CH2CH2CH2-), 1,4-부틸(-CH2CH2CH2CH2-) 등을 포함하나, 이들로 제한되는 것은 아니다.
"알케닐렌"은 탄소 원자수 2-18의 불포화된, 분지 또는 직쇄 또는 시클릭 탄화수소 기를 의미하며, 모 알켄의 동일한 또는 두개의 상이한 탄소 원자로부터 두개의 수소 원자의 제거로 유도된 두개의 1가 기 중심을 가진다. 통상적인 알케닐렌 기는 1,2-에틸렌(-CH≡CH-)을 포함하나, 이들로 제한되는 것은 아니다.
"알키닐렌"은 탄소 원자수 2-18의 불포화된, 분지 또는 직쇄 또는 시클릭 탄화수소 기를 의미하며, 모 알킨의 동일한 또는 두개의 상이한 탄소 원자로부터 두개의 수소 원자의 제거로 유도된 두개의 1가 기 중심을 가진다. 통상적인 알키닐렌 기는 아세틸렌(-C≡C-), 프로파르길(-CH2C≡C-), 및 4-펜티닐(-CH2CH2CH2C≡CH-)을 포함하나, 이들로 제한되는 것은 아니다.
"아릴"은 모 방향족 고리계의 하나의 탄소 원자로부터 한개의 수소 원자의 제거로 유도된 탄소 원자수 6-20의 1가 방향족 탄화수소 기를 의미한다. 몇몇
아릴 기는 예시적 구조를 "Ar"로 나타낸다. 통상적 아릴 기는 벤젠, 치환된 벤젠, 나프탈렌, 안트라센, 비페닐, 등에서 유도된 기를 포함하나, 이들로 제한되는 것은 아니다.
"아릴알킬"은 탄소 원자(통상적으로 말단 또는 sp3 탄소 원자)에 결합한 수소 원자 중의 하나가 아릴 기로 대체된 아시클릭 알킬 기를 의미한다. 통상적 아릴알킬 기는 벤질, 2-페닐에탄-1-일, 2-페닐에텐-1-일, 나프틸메틸, 2-나프틸에탄-1-일, 2-나프틸에텐-1-일, 나프토벤질, 2-나프토페닐에탄-1-일 등을 포함하나, 이들로 제한되는 것은 아니다. 아릴알킬 기는 탄소 원자 6 내지 20개를 포함하며, 예를 들어 알카닐, 알케닐 또는 알키닐을 포함하는, 아릴알킬 기의 알킬 잔기는 탄소 원자 1 내지 6개이고 아릴 잔기는 탄소 원자 5 내지 14개이다.
"헤테로아릴알킬" 탄소 원자(통상적으로 말단 또는 sp3 탄소 원자)에 결합한 수소 원자 중의 하나가 헤테로아릴 기로 대체된 아시클릭 알킬 기를 의미한다. 통상적 헤테로아릴알킬 기는 2-벤즈이미다졸릴메틸, 2-푸릴에틸, 등을 포함하나 이들로 제한되는 것은 아니다. 헤테로아릴알킬 기는 탄소 원자 6 내지 20개를 포함하며, 예를 들어, 알카닐, 알케닐 또는 알키닐 기를 포함하는, 헤테로아릴알킬 기의 알킬 잔기는 탄소 원자 1 내지 6개이고 헤테로아릴 잔기는 탄소 원자 5 내지 14개 및 N, O, P, 및 S로부터 선택된 헤테로원자 1 내지 3개이다. 헤테로아릴알킬 기의 헤테로아릴 잔기는 3 내지 7원의 모노사이클 (탄소 원자 2 내지 6개) 또는 7 내지 10원의 비사이클 (탄소 원자 4 내지 9개 및 N, O, P, 및 S로부터 선택된 헤테로원자 1 내지 3개), 예를 들어 비시클로 [4,5], [5,5], [5,6], 또는 [6,6] 계일 수 있다.
"치환된 알킬", "치환된 아릴", 및 "치환된 아릴알킬"은 1개 이상의 수소 원자가 각각 독립적으로 치환기로 대체된 각각의 알킬, 아릴, 및 아릴알킬을 의미한다. 통상적 치환기는 -X, -R, -O-, -OR, -SR, -S-, -NR2, -NR3, =NR, -CX3, -CN, -OCN, -SCN, -N=C=O, -NCS, -NO, -NO2, =N2, -N3, NC(=O)R, -C(=O)R, -C(=O)NR2, -S03 -, -SO3H, -S(=O)2R, -OS(=O)2OR, -S(=O)2NR, -S(=O)R, -OP(=O)(OR)2, -P(=O)(OR)2, -PO3 -, -P03H2, -C(=O)R, -C(=O)X, -C(=S)R, -CO2R, -CO2 -, -C(=S)OR, -C(=O)SR, -C(=S)SR, -C(=O)NR2, -C(=S)NR2, -C(=NR)NR2를 포함하나, 이들로 제한되는 것은 아니며, 여기서 각각의 X는 독립적으로 할로겐: F, Cl, Br 또는 I; 및 각각의 R은 독립적으로 -H, C2-Cl8 알킬, C6-C20 아릴, C3-C4 헤테로사이클, 보호 기 또는 전구약물 잔기이다. 상기 언급된 바와 같은 알킬렌, 알케닐렌, 및 알키닐렌 기는 또한 유사하게 치환될 수 있다.
"헤테로아릴" 및 "헤테로사이클"은 하나 이상의 환원자가 헤테로원자, 예를 들어, 질소, 산소, 및 황인 고리계를 의미한다. 헤테로사이클 기는 탄소 원자 1 내지 20개 및 N, O, P, 및 S로부터 선택된 헤테로원자 1 내지 3개를 포함한다. 헤테로사이클은 3 내지 7원의 모노사이클 (탄소 원자 2 내지 6개 및 N, O, P, 및 S로부터 선택된 헤테로원자 1 내지 3개)일 수 있거나, 또는 7 내지 10원의 비사이클 (탄소 원자 4 내지 9개 및 N, O, P, 및 S로부터 선택된 헤테로원자 1 내지 3개), 예를 들어: 비시클로 [4,5], [5,5], [5,6], 또는 [6,6] 계일 수 있다.
헤테로사이클은 문헌[Paquette, Leo A.;"Principles of Modern Heterocyclic Chemistry" (W. A. Benjamin, New York, 1968)], 특히 제1장, 제3장, 제4장, 제6장, 제7장, 및 제9장; 문헌["The Chemistry of Heterocyclic Compounds, A series of monographs" (John Wiley & Sons, New York, 1950 to present)], 특히 제13권, 제14권, 제16권, 제19권, 및 제28권; 및 문헌[J. Am. Chem. Soc. (1960)82 : 5566]에 기재되어 있다.
헤테로사이클의 예는 피리딜, 디히드로피리딜,테트라히드로피리딜(피페리딜), 티아졸릴, 테트라히드로티오페닐, 황 산화 테트라히드로티오페닐, 피리미디닐, 푸라닐, 티에닐, 피롤릴, 피라졸릴, 이미다졸릴, 테트라졸릴, 벤조푸라닐, 티아나프탈레닐, 인돌릴, 인돌레닐, 퀴놀리닐, 이소퀴놀리닐, 벤즈이미다졸릴, 피페라디닐, 4-피페리도닐, 피롤리디닐, 2-피롤리도닐,피롤리닐, 테트라히드로푸라닐, 비스-테트라히드로푸라닐, 테트라히드로피라닐, 비스-테트라히드로피라닐, 테트라히드로퀴놀리닐, 테트라히드로이소퀴놀리닐, 데카히드로퀴놀리닐, 옥타히드로이소퀴놀리닐, 아조시닐, 트리아지닐, 6H-1,2,5-티아디아지닐, 2H,6H-1,5,2-디티아지닐릴, 티에닐, 티안트레닐, 피라닐, 이소벤조푸라닐, 크로메닐, 크산테닐, 페녹사티닐, 2H-피롤릴, 이소티아졸릴, 이속사졸릴, 피라지닐, 피리다지닐, 인돌리지닐, 이소인돌릴, 3H-인돌릴, 1H-인다졸릴, 푸리닐, 4H-퀴놀리지닐, 프탈라지닐, 나프티리디닐, 퀴녹살리닐, 퀴나졸리닐, 시놀리닐, 프테리디닐, 4aH-카르바졸릴, 카르바졸릴, β-카르볼리닐, 페난트리디닐, 아크리디닐, 피리미디닐, 페난트롤리닐, 페나지닐, 페노티아지닐, 푸라자닐, 페녹사지닐, 이소크로마닐, 크로마닐, 이미다졸리디닐, 이미다졸리닐, 피라졸리디닐, 피라졸리닐, 피페라지닐, 인돌리닐, 이소인돌리닐, 퀴누클리디닐, 모르폴리닐, 옥사졸리디닐, 벤조트리아졸릴, 벤즈이속사졸릴, 옥신돌릴, 벤족사졸리닐, 및 이사티노일을 포함하나, 이들로 제한되는 것은 아니다.
헤테로사이클에 결합하는 탄소는 예를 들어, 피리딘의 2, 3, 4, 5, 또는 6번 위치, 피리다진의 3, 4, 5, 또는 6번 위치, 피리미딘의 2, 4, 5, 또는 6번 위치, 피라진의 2, 3, 5, 또는 6번 위치, 푸란의 2, 3, 4, 또는 5번 위치, 테트라히드로푸란, 티오푸란, 티오펜, 피롤 또는 테트라히드로피롤, 옥사졸의 2, 4, 또는 5번 위치, 이미다졸 또는 티아졸, 이속사졸의 3, 4, 또는 5번 위치, 피라졸, 또는 이소티아졸, 아지리딘의 2 또는 3 번 위치, 아제티딘의 2, 3, 또는 4번 위치, 퀴놀린의 2, 3, 4, 5, 6, 7, 또는 8번 위치, 이소퀴놀린의 1, 3, 4, 5, 6, 7, 또는 8번 위치에 결합하나, 이들로 제한되는 것은 아니다. 더욱 통상적으로는, 헤테로사이클에 결합하는 탄소는 2-피리딜, 3-피리딜, 4-피리딜, 5-피리딜, 6-피리딜, 3-피리다지닐, 4-피리다지닐, 5-피리다지닐, 6-피리다지닐, 2-피리미디닐, 4-피리미디닐, 5-피리미디닐, 6-피리미디닐, 2-피라지닐, 3- 피라지닐, 5-피라지닐, 6-피라지닐, 2-티아졸릴, 4-티아졸릴, 또는 5-티아졸릴을 포함한다.
헤테로사이클에 결합하는 질소는 예를 들어, 아지리딘의 1번 위치, 아제티딘, 피롤, 피롤리딘, 2-피롤린, 3-피롤린, 이미다졸, 이미다졸리딘, 2-이미다졸린, 3-이미다졸린, 피라졸, 피라졸린, 2-피라졸린, 3-피라졸린, 피페리딘, 피페라진, 인돌, 인돌린, 1H-인다졸, 이소인돌, 또는 이소인돌린의 2번 위치, 모르폴린의 4번 위치, 및 카르바졸, β-카르볼린의 9번 위치에 결합하나, 이들로 제한되는 것은 아니다. 더욱 통상적으로, 헤테로사이클에 결합하는 질소는 1-아지리딜, 1-아제테딜, 1-피롤릴, l-이미다졸릴, 1-피라졸릴, 및 1-피페라디닐을 포함한다.
"카르보사이클"은 모노시클로서 탄소 원자 3 내지 7개 또는 비시클로서 탄소 원자 1 내지 12개를 가지는 포화 또는 불포화 환을 의미한다. 모노시클릭 카르보사이클은 환원자 3 내지 6개, 더욱 통상적으로 환원자 5 내지 6개를 가진다. 비시클릭릭 카르보사이클은 예를 들어, [4,5], [5,5], [5,6] 또는 [6,6] 시스템으로 배열된 환원자 7 내지 12개, 비시클로 [5,6] 또는 [6,6] 시스템으로 배열된 환원자 9 내지 10개를 가진다. 모노시클릭 카르보사이클의 예는 시클로프로필, 시클로부틸, 시클로펜틸, 1-시클로펜트-1-에닐, 1-시클로펜트-2-에닐, 1-시클로펜트-3-에닐, 시클로헥실, 1-시클로헥스-1-에닐, l-시클로헥스-2-에닐, 1-시클로헥스-3-에닐, 시클로펩틸, 및 시클로옥틸을 포함한다.
"링커", "링커 유닛", 또는 "링크(link)"는 공유 결합을 포함하는 화학적 잔기 또는 항체에 약물 잔기를 공유적으로 덧붙이는 원자 사슬을 의미한다. 다양한 실시양태에서, 링커는 LU로 명기한다. 링커는 알킬디일, 아릴디일, 헤테로아릴디일과 같은 이가 기, 알킬옥시 유닛이 반복되는 -(CR2)nO(CR2)n-(예를 들어, 폴리에틸레녹시, PEG, 폴리메틸레녹시), 및 알킬아미노 (예를 들어, 폴리에틸렌아미노, 제프아민™(Jeffamine™))와 같은 잔기; 및 숙시네이트, 숙신아미드, 디글리콜레이트, 말로네이트, 및 카프로아미드를 포함하는 이산 에스테르 및 아미드를 포함한다.
용어 "키랄"은 거울상 파트너에 겹쳐질 수 없는 성질을 가진 분자를 의미하고, 반면 용어 "아키랄"은 이들의 거울상 파트너에 겹쳐질 수 있는 분자를 의미한다.
용어 "입체 이성질체"는 동일한 화학적 구성을 가지나, 공간의 원자 또는 기의 배열에 대해서는 상이한 화합물을 의미한다.
"부분입체 이성질체"는 두개 이상의 키랄성 중심이 있고 이들 분자가 서로 거울상이 아닌 입체 이성질체를 의미한다. 부분입체 이성질체는 상이한 물리적 성질, 예를 들어, 융점, 비점, 스펙트럼 성질, 및 반응성을 가진다. 부분입체 이성질체의 혼합물은 전기영동 및 크로마토그래피과 같은 고 분해능 분석 절차하에 분리될 수 있다.
"거울상 이성질체"는 서로 겹쳐질 수 없는 거울상이 있는 두개의 입체 이성질체 화합물을 의미한다.
여기에 사용된 입체화학 정의 및 규약은 문헌[S. P. Parker, Ed., McGraw-Hill Dictionary of Chemical Terms (1984) McGraw-Hill Book Company, New York]; 및 문헌[Eliel, E. and Wilen, S., Stereochemistry of Organic Compounds (1994) John Wiley & Sons, Inc. New York]을 따른다. 많은 유기 화합물은 광학적 활성 형태를 보이는데, 즉, 이들은 평면-평광의 평면을 회전하는 능력을 가진다. 광학적 활성 화합물을 기재함에 있어서, 접두사 D 및 L, 또는 R 및 S는 키랄 중심에 대해 분자의 절대적 배위를 표시하기 위해 사용된다. 접두사 d 및 l 또는 (+) 및 (-)은 화합물의 평면-평광 회전 표시를 나타내기 위해 사용되는데, (-) 또는 l은 화합물이 좌선성임을 의미한다. 화합물 접두사 (+) 또는 d는 우선성이다. 주어진 화학적 구조에서, 이 입체 이성질체는 이들이 서로 거울상이라는 것만 제외하고는 동일하다. 특정 입체 이성질체는 또한 거울상 이성질체로 불릴 수 있고, 이러한 이성질체의 혼합물은 종종 거울상 이성질체 혼합물로 불린다. 거울상 이성질체의 50:50 혼합물은 라세미 혼합물 또는 라세미체로 불리는데, 이들은 화학적 반응 또는 과정에 있어, 임의의 입체선택성 또는 입체특이성도 없었던 경우가 있을 수 있다. 용어 "라세미 혼합물" 및 "라세미체"는 광학 활성이 없는, 두개의 거울상 이성질체 종의 등몰 혼합물을 의미한다.
"환자"의 예는 인간, 래트, 마우스, 기니아 피그, 원숭이, 돼지, 염소, 암소, 말, 개, 고양이, 새 및 가금류를 포함하나, 이들로 제한되는 것은 아니다. 예시적 실시양태에서, 환자는 인간이다.
"아릴"은 카르보시클릭 방향족 기를 의미한다. 아릴 기의 예는 페닐, 나프틸, 안트라세닐을 포함하나, 이들로 제한되는 것은 아니다. 카르보시클릭 방향족 기 또는 헤테로시클릭 방향족 기는 비치환될 수 있거나 또는 -Cl-C8 알킬, -O-(Cl-C8 알킬), -아릴, -C(O)R', -OC(O)R', -C(O)OR', -C(O)NH2, -C(O)NHR', -C(O)N(R')2-NHC(O)R', -S(O)2R', -S (O)R', -OH, -할로겐, -N3, -NH2, -NH(R'), -N(R')2 및 -CN를 포함(각각의 R'는 H, -Cl-C8 알킬 및 아릴로부터 독립적으로 선택됨)하나, 이들로 제한되는 것은 아닌 하나 이상 기로 치환될 수 있다.
여기서 사용된 용어 "C1-C8 알킬"은 탄소 원자 1 내지 8개를 가지는 직쇄 또는 분지된, 포화 또는 불포화 탄화수소를 의미한다. 대표적인 "C1-C8 알킬"기는 -메틸, -에틸, -n-프로필, -n-부틸, -n-펜틸, -n-헥실, -n-펩틸, -n-옥틸, -n-노닐 및 -n-데실을 포함하나, 이들로 제한되는 것은 아니며, 반면, 분지된 Cl-C8 알킬은 -이소프로필, -이차-부틸, -이소부틸, -삼차-부틸, -이소펜틸, 2-메틸부틸을 포함하나, 이들로 제한되는 것은 아니며, 불포화된 C1-C8 알킬은 -비닐, -알릴, -1-부테닐, -2-부테닐, -이소부틸레닐, -1-펜테닐, -2-펜테닐, -3-메틸-1-부테닐, -2-메틸-2-부테닐, -2,3-디메틸-2-부테닐, I-헥실, 2-헥실, 3-헥실, -아세틸레닐, -프로피닐, -1-부티닐, -2-부티닐, -1-펜티닐, -2-펜티닐, -3-메틸-1-부티닐, 메틸, 에틸, 프로필, 이소프로필, n-부틸, 이소부틸, 이차-부틸, 삼차-부틸, n-펜틸, 이소펜틸, 네오펜틸, n-헥실, 이소헥실, 2-메틸펜틸, 3-메틸펜틸, 2,2-디메틸부틸, 2,3-디메틸부틸, 2,2-디메틸펜틸, 2,3-디메틸펜틸, 3,3-디메틸펜틸, 2,3,4-트리메틸펜틸, 3-메틸헥실, 2,2-디메틸헥실, 2,4-디메틸헥실, 2,5-디메틸헥실, 3,5-디메틸헥실, 2,4-디메틸펜틸, 2-메틸헵틸, 3-메틸헵틸, n-헵틸, 이소헵틸, n-옥틸, 및 이소옥틸을 포함하나, 이들로 제한되는 것은 아니다. C1-C8 알킬 기는 비치환되거나, 또는 Cl-C8 알킬, -0-(C1-C8 알킬), -아릴, -C(O)R', -OC(O)R', -C(O)OR', -C(O)NH2, -C(O)NHR', -C(O)N(R')2-NHC(O)R', -SO3R', -S(O)2R', -S(O)R', -OH, -할로겐, -N3, -NH2, -NH(R'), -N(R')2 및 -CN을 포함(여기서 각각의 R'는 H, -C1-C8 알킬 및 아릴로부터 독립적으로 선택됨)하나, 이들로 제한되는 것은 아닌 하나 이상 기로 치환될 수 있다.
"C3-C8 카르보사이클"은 3-, 4-, 5-, 6-, 7- 또는 8- 원자 포화 또는 불포화 비-방향족 카르보시클릭 환이다. 대표적인 C3-C8 카르보사이클은 -시클로프로필, -시클로부틸, -시클로펜틸, -시클로펜타디에닐, -시클로헥실, -시클로헥세닐, -1,3-시클로헥사디에닐, -1,4-시클로헥사디에닐, -시클로헵틸, -1,3-시클로헵타디에닐, -1,3,5-시클로헵타트리에닐, -시클로옥틸, 및 -시클로옥타디에닐을 포함하나, 이들로 제한되는 것은 아니다. C3-C8 카르보사이클 기는 비치환될 수 있고 -Cl-C8 알킬, -O-(Cl-C8 알킬), -아릴, -C(O)R', -OC(O)R', -C(O)OR', -C(O)NH2, -C(O)NHR', -C(O)N(R')2-NHC(O)R', -S(0)2R', -S(O)R', -OH, -할로겐, -N3, -NH2, -NH(R'), -N(R')2 및 -CN를 포함(각각의 R'는 H, -Cl-C8 알킬 및 아릴로부터 독립적으로 선택됨)하나, 이들로 제한되는 것은 아닌 하나 이상 기로 치환될 수 있다.
"C3-C8 카르보시클로"는 카르보사이클 기의 수소 원자 중의 하나가 결합으로 대체된 상기 정의된 C3-C8 카르보사이클 기를 의미한다.
"Cl-C10 알킬렌"은 화학식 -(CH2)1-10-의 직쇄, 포화 탄화수소 기이다. Cl-C10 알킬렌의 예는 메틸렌, 에틸렌, 프로필렌, 부틸렌, 펜틸렌, 헥실렌, 헵틸렌, 옥틸렌, 노닐렌 및 데칼렌을 포함한다.
"아릴렌"은 다음의 구조로 보여지는 바와 같이 두개의 공유 결합은 가지며 오르쏘, 메타, 또는 파라 배위로 존재할 수 있는 아릴 기이며, 여기서, 페닐 기는 비치환되거나, 또는 -Cl-C8 알킬, -0-(C1-C8 알킬), -아릴, -C(O)R', -OC(O)R', -C(O)OR', -C(O)NH2, -C(O)NHR', -C(O)N(R')2-NHC(O)R', -S(O)2R', -S(O)R',-OH, -할로겐, -N3, -NH2, -NH(R'), -N(R')2 및 -CN을 포함(각각의 R'는 H, -Cl-C8 알킬 및 아릴로부터 독립적으로 선택됨)하나, 이들로 제한되는 것은 아닌 4개 이하의 기로 치환될 수 있다.
Figure 112013088873035-pat00011
"C3-C8 헤테로사이클"은 고리 탄소 원자 1개 내지 4개가 O, S, 및 N으로 이루어지는 군의 헤테로원자로 독립적으로 대체된 방향족 또는 비방향족 C3-C8 카르보사이클을 의미한다. C3-C8 헤테로사이클의 대표적인 예는 벤조푸라닐, 벤조티오펜, 인돌릴, 벤조피라졸릴, 쿠마리닐, 이소퀴놀리닐, 피롤릴, 티오페닐, 푸라닐, 티아졸릴, 이미다졸릴, 피라졸릴, 트리아졸릴, 퀴놀리닐, 피리미디닐, 피리디닐, 피리도닐, 피라지닐, 피리다지닐, 이소티아졸릴, 이속사졸릴 및 테트라졸릴을 포함하나, 이들로 제한되는 것은 아니다. C3-C8 헤테로사이클은 비치환되거나, 또는 -Cl-C8 알킬, -O-(C1 -C8 알킬),-아릴, -C(O)R', -OC(O)R', -C(O)OR', -C(O)NH2, -C(O)NHR', -C(O)N(R')2-NHC(O)R', -S(0)2R', -S(O)R', -OH, -할로겐, -N3, -NH2, -NH(R'), -N( R')2 및 -CN을 포함(각각의 R'는 H, -Cl-C8 알킬 및 아릴로부터 독립적으로 선택됨)하나, 이들로 제한되는 것은 아닌 7개 이하의 기로 치환될 수 있다.
"C3-C8 헤테로시클로"는 헤테로사이클 기의 수소 원자 중의 하나가 결합으로 대체된 상기 정의된 C3-C8 헤테로사이클 기를 의미한다. C3-C8 헤테로시클로는 비치환되거나, 또는 -Cl-C8 알킬, -O-(C-C8 알킬), -아릴, -C(O)R', -OC(O)R', -C(O)OR', -C(O)NH2, -C(O)NHR', -C(O)N(R')2-NHC(O)R', -S(0)2R', -S(O)R', -OH, -할로겐, -N3, -NH2, -NH(R'), -N(R')2 및 -CN을 포함(각각의 R'는 H, -Cl-C8 알킬 및 아릴로부터 독립적으로 선택됨)하나, 이들로 제한되는 것은 아닌 6개 이하의 기로 치환될 수 있다.
"예시적인 화합물"은 약물 화합물 또는 약물-링커 화합물이다.
"예시적인 접합체"는 약물-리간드 접합체 또는 약물-링커-리간드 접합체로부터 분해가능한 약물 단위를 갖는 약물-리간드 접합체이다.
특정 실시양태에서, 예시적인 화합물 및 예시적인 접합체는 단리되거나 또는 정제된 형태로 존재한다. 여기서 사용된 "단리된"은 (a)식물 또는 동물 세포 또는 세포물과 같은 천연 공급원, 또는 (b)합성 유기 화학 반응 혼합물의 다른 성분으로부터 분리되는 것을 의미한다. 여기서 사용된 "정제된"은, 단리된 경우 단리물이 단리물 95 중량％ 이상의 예시적인 화합물 또는 예시적인 접합체, 및 또다른 측면에서 98 중량％ 이상의 예시적인 화합물 또는 예시적인 접합체를 포함하는 것을 의미한다.
"히드록실 보호 기"의 예는 메톡시메틸 에테르, 2-메톡시에톡시메틸 에테르, 테트라히드로피라닐 에테르, 벤질 에테르, p-메톡시벤질 에테르, 트리메틸실릴 에테르, 트리에틸실릴 에테르, 트리이소프로필 실릴 에테르, t-부틸디메틸 실릴 에테르, 트리페닐메틸 실릴 에테르, 아세테이트 에스테르, 치환된 아세테이트 에스테르, 피볼레이트, 벤조에이트, 메탄술포네이트 및 p-톨루엔술포네이트를 포함하나, 이들로 제한되는 것은 아니다.
"이탈기"는 또다른 작용기에 의해 치환될 수 있는 작용기를 의미한다. 이러한 이탈기는 당업계에 잘 알려져 있으며, 예는 할로겐화물(예, 염소, 브롬, 요오드), 메탄술포닐(메실), p-톨루엔술포닐(토실), 트리플루오로메틸술포닐(트리플레이트), 및 트리플루오로메틸술포네이트를 포함하나, 이들로 제한되는 것은 아니다.
여기서 사용된 문구 "제약상 허용되는 염"은 예시적인 화합물 또는 예시적인 접합체의 제약상 허용되는 유기 또는 무기 염을 의미한다. 예시적인 화합물 또는 예시적인 접합체는 하나 이상의 아미노 기를 포함하고, 따라서 산 부가 염은 상기 아미노 기와 함께 형성될 수 있다. 예시적 염은 술페이트, 시트레이트, 아세테이트, 옥살레이트, 염소, 브롬, 요오드, 니트레이트, 비술페이트, 포스페이트, 산 포스페이트, 이소니코티네이트, 락테이트, 살리실레이트, 산 시트레이트, 타르트레이트, 올리에이트, 타네이트, 판토테네이트, 비타르트레이트, 아스코르베이트, 숙시네이트, 말리에이트, 겐티시네이트, 푸마레이트, 글루코네이트, 글루쿠로네이트, 사카레이트, 포르메이트, 벤조에이트, 글루타메이트, 메탄술포네이트, 에탄술포네이트, 벤젠술포네이트, p-톨루엔술포네이트, 및 파모에이트(즉, 1,1'-메틸렌-비스-(2-히드로시-3-나프토에이트)) 염을 포함하나, 이들로 제한되는 것은 아니다. 제약상 허용되는 염은 아세테이트 이온, 숙시네이트 이온 또는 다른 반대이온과 같이 또다른 분자의 함유물에 관여할 수 있다. 반대이온은 모 화합물의 전하를 안정화시키는 유기 또는 무기 잔기일 수 있다. 또한, 제약상 허용되는 염은 이것의 구조에 하나 이상의 전하를 띈 원자를 가질 수 있다. 다가 전하를 띈 원자가 제약상 허용되는 염의 일부인 경우에는 다가 반대 이온을 가질 수 있다. 따라서, 제약상 허용되는 염은 하나 이상의 전하를 띈 원자 및(또는) 하나 이상의 반대 이온을 가질 수 있다.
"제약상 허용되는 용매화물" 또는 "용매화물"은 하나 이상의 용매 분자와 본 발명의 화합물과의 결합, 예를 들어, 예시적인 화합물 또는 예시적인 접합체를 의미한다. 제약상 허용되는 용매화물을 형성하는 용매의 예는 물, 이소프로판올, 에탄올, 메탄올, DMSO, 에틸 아세테이트, 아세트산, 및 에탄올아민을 포함하나, 이들로 제한되는 것은 아니다.
다음의 약어는 여기서 사용되며 나타낸 의미를 가진다: AE는 오리스타틴 E, Boc는 N-(t-부톡시카르보닐), cit는 시트룰린, dap는 돌라프로인, DCC는 1,3-디시클로헥실카르보디이미드, DCM은 디클로로메탄, DEA는 디에틸아민, DEAD는 디에틸아조디카르복실레이트, DEPC는 디에틸포스포릴시아니데이트, DIAD는 디이소프로필아조디카르복실레이트, DIEA는 N,N-디이소프로필에틸아민, dil는 돌라이소루신, DMAP는 4-디메틸아미노피리딘, DME는 에틸렌글리콜 디메틸 에테르(또는 1,2-디메톡시에탄), DMF는 N,N-디메틸포름아미드, DMSO는 디메틸술폭사이드, doe는 돌라페닌, dov는 N,N-디메틸발린, DTNB는 5,5'-디티오비스(2-니트로벤조산), DTPA는 디에틸렌트리아민펜타아세트산, DTT는 디티오트레이톨, EDCI는 1-(3-디메틸아미노프로필)-3-에틸카르보디이미드 염화수소, EEDQ는 2-에톡시-1-에톡시카르보닐-1,2-디히드로퀴놀린, ES-MS는 전자 분사 질량분석법, EtOAc는 에틸 아세테이트, Fmoc는 N-(9-플루오레닐메톡시카르보닐), gly는 글리신, HATU는 O-(7-아자벤조트리아졸-1-일)-N,N,N',N'-테트라메틸우로늄 헥사플루오로포스페이트, HOBt는 1-히드록시벤조트리아졸, HPLC는 고압 액체 크로마토그래피, ile는 이소루신, lys는 리신, MeCN(CH3CN)는 아세토니트릴, MeOH는 메탄올, Mtr는 4-아니실디페닐메틸 (또는 4-메톡시트리틸), nor는 (IS,2R)-(+)-노르에페드린, PAB는 p-아미노벤질, PBS는 인산염 완충 염수(pH 7.4), PEG는 폴리에틸렌 글리콜, Ph는 페닐, Pnp는 p-니트로페닐, MC는 6-말레이미드카프로일, phe는 L-페닐알라닌, PyBrop는 브로모 트리스-피롤리디노 포스포늄 헥사플루오로포스페이트, SEC는 크기별 배제 크로마토그래피, Su는 숙신이미드, TBTU는 O-벤조트리아졸-1-일-N,N,N,N-테트라메틸우로늄 테트라플루오로보레이트, TFA는 트리플루오로아세트산, TLC는 얇은 막 크로마토그래피, UV는 자외선, 및 val는 발린이다.
다음의 링커 약어들이 여기서 사용되고, 표시된 대로 정의된다: Val Cit는 프로테아제 분해가능 링커 내 디펩티드 부위인, 발린-시트룰린; PAB는 p-아미노벤질카르바모일; (Me)vc는 링커 펩티드 결합이 개질되어 카텝신 B에 의한 절단을 방지하는 N-메틸-발린 시트룰린; MC(PEG)6-OH는 말레이미도카프로일-폴리에틸렌 글리콜; SPP는 N-숙신이미딜 4-(2-피리딜티오)펜타노에이트이고; SMCC는 N-숙신이미딜 4-(N-말레이미도메틸) 시클로헥산-1 카르복실레이트이다.
"치료하다" 또는 "치료"라는 용어는, 문맥에 의해 다르게 표시되지 않는 한, 치료적 처리 및 방지적 또는 예방적 수단 모두를 의미하며, 여기서 그 목적은 암의 발생 또는 전파와 같은 원치 않는 생리학적 변화 또는 장애를 방지 또는 감속(감소)시키고자 하는 것이다. 본 발명의 목적에 있어, 유익하거나 바람직한 임상 결과들은 감지가능하든, 감지가능하지 않든 간에, 증상의 경감, 질환 정도의 감소, 안정화된(즉, 악화되지 않는) 질환 상태, 질환 진행의 지연 또는 감속, 질환 상태의 개선 또는 완화, 및 차도(부분적 또는 전체적)를 포함하지만 이들에 한정되지는 않는다. "치료"는 또한, 치료를 받지 않은 경우의, 예상되는 생존에 비해 연장되는 생존을 의미할 수 있다. 치료를 필요로 하는 자들은 그 상태 또는 장애를 이미 갖고 있는 자들 뿐 아니라 그 상태 또는 장애를 갖기 쉬운 자들 또는 그 상태 또는 장애가 예방되어야 하는 자들을 포함한다.
암과 관련하여, "치료하는"이라는 용어는 종양 세포, 암 세포, 또는 종양의 성장 방지; 종양 세포 또는 암 세포의 복제 방지, 전체적인 종양 적하의 완화 또는 암성 세포 개수의 감소, 및 그 질환과 관련된 하나 이상의 증상들의 개선 중 일부 또는 전부를 포함한다.
자가면역 질환과 관련하여, "치료하는"이라는 용어는 자가면역 항체를 생성하는 세포들을 포함하지만 이들에 한정되지는 않는 자가면역 질환 상태와 관련된 세포의 복제 방지, 자가면역-항체 적하의 완화 및 하나 이상의 자가면역 질환 증상들의 개선 중 일부 또는 전부를 포함한다.
감염성 질환과 관련하여, "치료하는"이라는 용어는 감염성 질환을 야기하는 병원균의 성장, 배가 또는 복제의 방지 및 하나 이상의 감염성 질환 증상들의 개선 중 일부 또는 전부를 포함한다.
다음의 세포독성 약물 약어들이 여기서 사용되고 표시된 대로 정의된다: MMAE는 모노-메틸 아우리스타틴 E(MW 718); MMAF는 N-메틸발린-발린-돌라이소류신-돌라프로인-페닐알라닌(MW 731.5); MMAF-DMAEA는 C-말단 페닐알라닌에 아미드 연결된 DMAEA(디메틸아미노에틸아민)를 갖는 MMAF (MW 801.5); MMAF-TEG는 페닐알라닌에 에스테르화된 테트라에틸렌 글리콜을 갖는 MMAF; MMAF-NtBu는 MMAF의 C-말단에 아미드로서 부착된 N-t-부틸; AEVB는 AE의 C-말단을 통해 연결된 산에 불안정한 링커인 아우리스타틴 E 발레릴 벤질히드라존(MW 732)이고; AFP는 아우리스타틴 F의 C-말단 페닐알라닌을 갖는 p-페닐렌 디아민의 모노아미드(MW 732)이다.
본 발명의 화합물
1 화학식 (Ia)의 화합물
한 측면에서, 본 발명은 하기 화학식 Ia를 갖는 약물-링커-리간드 접합체 또는 그의 제약상 허용되는 염 또는 용매화물을 제공한다.
<화학식 Ia>
Figure 112013088873035-pat00012
상기 화학식 중 L-은 리간드 단위;
-Aa-Ww-Yy-는 링커 단위(LU);
-A-는 스트레처 단위;
a는 0 또는 1;
각각의 -W-는 독립적으로 아미노산 단위;
w는 0 내지 12 범위의 정수;
-Y-는 스페이서 단위;
y는 0, 1 또는 2;
p는 1 내지 약 20 범위이고;
-D는 하기 화학식 DE 및 DF를 갖는 약물 단위이며:
<화학식 DE>
Figure 112013088873035-pat00013
<화학식 DF>
Figure 112013088873035-pat00014
상기 식 중에서, 각각의 위치에서 독립적으로:
R2는 H 및 C1-C8 알킬로부터 선택되고;
R3은 H, C1-C8 알킬, C3-C8 카르보사이클, 아릴, C1-C8 알킬-아릴, C1-C8 알킬-(C3-C8 카르보사이클), C3-C8 헤테로사이클 및 C1-C8 알킬-(C3-C8 헤테로사이클)로부터 선택되고;
R4는 H, C1-C8 알킬, C3-C8 카르보사이클, 아릴, C1-C8 알킬-아릴, C1-C8 알킬-(C3-C8 카르보사이클), C3-C8 헤테로사이클 및 C1-C8 알킬-(C3-C8 헤테로사이클)로부터 선택되고;
R5는 H 및 메틸로부터 선택되거나; 또는
R4 및 R5가 결합하여 카르보시클릭 고리를 형성하고, 화학식 -(CRaRb)n-(여기서, Ra 및 Rb는 독립적으로 H, C1-C8 알킬 및 C3-C8 카르보시클로부터 선택되고, n은 2, 3, 4, 5 및 6으로부터 선택됨)을 가지며;
R6은 H 및 C1-C8 알킬로부터 선택되고;
R7은 H, C1-C8 알킬, C3-C8 카르보사이클, 아릴, C1-C8 알킬-아릴, C1-C8 알킬-(C3-C8 카르보사이클), C3-C8 헤테로사이클 및 C1-C8 알킬-(C3-C8 헤테로사이클)로부터 선택되고;
R8은 각각 독립적으로 H, OH, C1-C8 알킬, C3-C8 카르보사이클 및 O-(C1-C8 알킬)로부터 선택되고;
R9는 H 및 C1-C8 알킬로부터 선택되고;
R10은 아릴 또는 C3-C8 헤테로시클로부터 선택되고;
Z는 O, S, NH, 또는 NR12 (여기서, R12는 C1-C8 알킬임)이고;
R11은 H, C1-C20 알킬, 아릴, C3-C8 헤테로사이클, -(R13O)m-R14, 또는 -(R13O)m-CH(R15)2로부터 선택되고;
m은 1-1000 범위의 정수이고;
R13은 C2-C8 알킬이고;
R14는 H 또는 C1-C8 알킬이고;
R15는 각각 독립적으로 H, COOH, -(CH2)n-N(R16)2, -(CH2)n-SO3H, 또는 -(CH2)n-SO3-C1-C8 알킬이고;
R16은 각각 독립적으로 H, C1-C8 알킬, 또는 -(CH2)n-COOH이고;
R18은 -C(R8)2-C(R8)2-아릴, -C(R8)2-C(R8)2-(C3-C8 헤테로사이클), 및 -C(R8)2-C(R8)2-(C3-C8 카르보사이클)로부터 선택되고; 및
n은 0 내지 6 범위의 정수이다.
다른 실시양태에서, 본 발명은 하기 화학식 Ib를 갖는 약물 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염 또는 용매화물을 제공한다.
<화학식 Ib>
Figure 112013088873035-pat00015
상기 식 중에서,
R2는 수소 및 -C1-C8 알킬로부터 선택되고;
R3은 수소, -C1-C8 알킬, -C3-C8 카르보사이클, 아릴, -C1-C8 알킬-아릴, -C1-C8 알킬-(C3-C8 카르보사이클), -C3-C8 헤테로사이클 및 -C1-C8 알킬-(C3-C8 헤테로사이클)로부터 선택되고;
R4는 수소, -C1-C8 알킬, -C3-C8 카르보사이클, -아릴, -C1-C8 알킬-아릴, -C1-C8 알킬-(C3-C8 카르보사이클), -C3-C8 헤테로사이클 및 -C1-C8 알킬-(C3-C8 헤테로사이클)로부터 선택되고; R5는 -H 및 -메틸로부터 선택되거나; 또는 R4 및 R5는 결합하여 화학식 -(CRaRb)n- (여기서, Ra 및 Rb는 독립적으로 -H, -C1-C8 알킬 및 -C3-C8 카르보시클로부터 선택되고, n은 2, 3, 4, 5 및 6로부터 선택됨)을 가지며 이들이 부착된 탄소 원자와 함께 고리를 형성하고;
R6은 H 및 -C1-C8 알킬로부터 선택되고;
R7은 H, -C1-C8 알킬, -C3-C8 카르보사이클, 아릴, -C1-C8 알킬-아릴, -C1-C8 알킬-(C3-C8 카르보사이클), -C3-C8 헤테로사이클 및 -C1-C8 알킬-(C3-C8 헤테로사이클)로부터 선택되고;
R8은 각각 독립적으로 H, -OH, -C1-C8 알킬, -C3-C8 카르보사이클 및 -O-(C1-C8 알킬)로부터 선택되고;
R9는 H 및 -C1-C8 알킬로부터 선택되고;
R10은 아릴 기 또는 -C3-C8 헤테로시클로부터 선택되고;
Z는 -O-, -S-, -NH-, 또는 -NR12 (여기서, R12는 C1-C8 알킬임)이고;
R11은 H, C1-C20 알킬, 아릴, -C3-C8 헤테로사이클, -(R13O)m-R14, 또는 -(R13O)m-CH(R15)2로부터 선택되고;
m은 1-1000 범위의 정수이고;
R13은 -C2-C8 알킬이고;
R14는 H 또는 -C1-C8 알킬이고;
R15는 각각 독립적으로 H, -COOH, -(CH2)n-N(R16)2, -(CH2)n-SO3H, 또는 -(CH2)n-SO3-C1-C8 알킬이고;
R16은 각각 독립적으로 H, -C1-C8 알킬, 또는 -(CH2)n-COOH이고;
n은 0 내지 6 범위의 정수이다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명은 하기 화학식 Ia'를 갖는 약물-링커-리간드 접합체 또는 제약상 허용되는 염 또는 용매화물을 제공한다.
<화학식 Ia'>
Figure 112013088873035-pat00016
상기 화학식 중 Ab는 항체,
A는 스트레처 단위,
a는 0 또는 1,
각각의 W는 독립적으로 아미노산 단위,
w는 0 내지 12 범위의 정수,
Y는 스페이서 단위,
y는 0, 1 또는 2,
p는 1 내지 약 20 범위이고,
D는 하기 화학식 DE 및 DF로부터 선택되는 약물 잔기이며:
<화학식 DE>
Figure 112013088873035-pat00017
<화학식 DF>
Figure 112013088873035-pat00018
상기 식 중에서, 각각의 위치에서 독립적으로:
R2는 H 및 C1-C8 알킬로부터 선택되고;
R3은 H, C1-C8 알킬, C3-C8 카르보사이클, 아릴, C1-C8 알킬-아릴, C1-C8 알킬-(C3-C8 카르보사이클), C3-C8 헤테로사이클 및 C1-C8 알킬-(C3-C8 헤테로사이클)로부터 선택되고;
R4는 H, C1-C8 알킬, C3-C8 카르보사이클, 아릴, C1-C8 알킬-아릴, C1-C8 알킬-(C3-C8 카르보사이클), C3-C8 헤테로사이클 및 C1-C8 알킬-(C3-C8 헤테로사이클)로부터 선택되고;
R5는 H 및 메틸로부터 선택되거나; 또는
R4 및 R5가 결합하여 카르보시클릭 고리를 형성하고, 화학식 -(CRaRb)n- (여기서, Ra 및 Rb는 독립적으로 H, C1-C8 알킬 및 C3-C8 카르보시클로부터 선택되고, n은 2, 3, 4, 5 및 6으로부터 선택됨)을 가지며;
R6은 H 및 C1-C8 알킬로부터 선택되고;
R7은 H, C1-C8 알킬, C3-C8 카르보사이클, 아릴, C1-C8 알킬-아릴, C1-C8 알킬-(C3-C8 카르보사이클), C3-C8 헤테로사이클 및 C1-C8 알킬-(C3-C8 헤테로사이클)로부터 선택되고;
R8은 각각 독립적으로 H, OH, C1-C8 알킬, C3-C8 카르보사이클 및 O-(C1-C8 알킬)로부터 선택되고;
R9는 H 및 C1-C8 알킬로부터 선택되고;
R10은 아릴 또는 C3-C8 헤테로시클로부터 선택되고;
Z는 O, S, NH, 또는 NR12 (여기서, R12는 C1-C8 알킬임)이고;
R11은 H, C1-C20 알킬, 아릴, C3-C8 헤테로사이클, -(R13O)m-R14, 또는 -(R13O)m-CH(R15)2로부터 선택되고;
m은 1-1000 범위의 정수이고;
R13은 C2-C8 알킬이고;
R14는 H 또는 C1-C8 알킬이고;
R15는 각각 독립적으로 H, COOH, -(CH2)n-N(R16)2, -(CH2)n-SO3H, 또는 -(CH2)n-SO3-C1-C8 알킬이고;
R16은 각각 독립적으로 H, C1-C8 알킬, 또는 -(CH2)n-COOH이고;
R18은 -C(R8)2-C(R8)2-아릴, -C(R8)2-C(R8)2-(C3-C8 헤테로사이클), 및 -C(R8)2-C(R8)2-(C3-C8 카르보사이클)로부터 선택되고;
n은 0 내지 6 범위의 정수이다.
Ab는 하나 이상의 약물 단위에 공유적으로 부착되는 임의의 항체이다. Ab는 CD30, CD40, CD70, 루이스 Y 항원에 결합하는 항체를 포함한다. 다른 실시양태에서, Ab는 ErbB 수용체 또는 하나 이상의 (1)-(35) 수용체에 결합하지 않는 항체는 포함하지 않는다:
(1) BMPR1B (골 형태형성 단백질 수용체-IB형, 진뱅크 수탁 번호 NM_001203);
(2) E16 (LAT1, SLC7A5, 진뱅크 수탁 번호 NM_003486);
(3) STEAP1 (전립선의 6개의 막횡단 상피 항원, 진뱅크 수탁 번호 NM_012449);
(4) 0772P (CA125, MUC16, 진뱅크 수탁 번호 AF361486);
(5) MPF (MPF, MSLN, SMR, 거대핵세포 강화 인자, 메소텔린, 진뱅크 수탁 번호 NM_005823);
(6) Napi3b (NAPI-3B, NPTIIb, SLC34A2, 용질 담체 족 34 (인산나트륨), 2 원, 제II형 나트륨-의존성 포스페이트 전달체 3b, 진뱅크 수탁 번호 NM_006424);
(7) Sema 5b (FLJ10372, KIAA1445, Mm. 42015, SEMA5B, SEMAG, 세마포린 5b Hlog, 세마 도메인, 7개의 트롬보스폰딘 반복체 (제1형 및 제1형-유사), 막횡단 도메인 (TM) 및 짧은 세포질 도메인, (세마포린) 5B, 진뱅크 수탁 번호 AB040878);
(8) PSCA hlg (2700050C12Rik, C530008O16Rik, RIKEN cDNA 2700050C12, RIKEN cDNA 2700050C12 유전자, 진뱅크 수탁 번호 AY358628);
(9) ETBR (엔도텔린 B형 수용체, 진뱅크 수탁 번호 AY275463);
(10) MSG783 (RNF124, 가상 단백질 FLJ20315, 진뱅크 수탁 번호 NM_017763);
(11) STEAP2 (HGNC_8639, IPCA-1, PCANAP1, STAMP1, STEAP2, STMP, 전립선암 관련 유전자 1, 전립선암 관련 단백질 1, 전립선의 6개의 막횡단 상피 항원 2, 6개의 막횡단 전립선 단백질, 진뱅크 수탁 번호 AF455138);
(12) TrpM4 (BR22450, FLJ20041, TRPM4, TRPM4B, 일시적 수용체 잠재적 양이온 채널, M 아족, 4 원, 진뱅크 수탁 번호 NM_017636);
(13) CRIPTO (CR, CR1, CRGF, CRIPTO, TDGF1, 기형암종-유도 성장 인자, 진뱅크 수탁 번호 NP_003203 또는 NM_003212);
(14) CD21 (CR2 (보체 수용체 2) 또는 C3DR (C3d/엡스테인 바르 바이러스 수용체) 또는 Hs.73792, 진뱅크 수탁 번호 M26004);
(15) CD79b (IGb (이뮤노글로불린-연관 베타), B29, 진뱅크 수탁 번호 NM_000626);
(16) FcRH2 (IFGP4, IRTA4, SPAP1A (SH2 도메인 함유 포스파타제 고정 단백질 1a), SPAP1B, SPAP1C, 진뱅크 수탁 번호 NM_030764);
(17) HER2 (진뱅크 수탁 번호 M11730);
(18) NCA (진뱅크 수탁 번호 M18728);
(19) MDP (진뱅크 수탁 번호 BC017023);
(20) IL20Rα (진뱅크 수탁 번호 AF184971);
(21) 브레비칸 (진뱅크 수탁 번호 AF229053);
(22) Ephb2R (진뱅크 수탁 번호 NM_004442);
(23) ASLG659 (진뱅크 수탁 번호 AX092328);
(24) PSCA (진뱅크 수탁 번호 AJ297436);
(25) GEDA (진뱅크 수탁 번호 AY260763);
(26) BAFF-R (진뱅크 수탁 번호 NP_443177.1);
(27) CD22 (진뱅크 수탁 번호 NP-001762.1);
(28) CD79a (CD79A, CD79α, 이뮤노글로불린-연관 알파, Ig 베타 (CD79B)와 공유적으로 상호작용하고 Ig M 분자와 표면 상에서 복합체를 형성하여 B 세포 분화에 관여하는 신호를 전달하는 B 세포-특이적 단백질, 진뱅크 수탁 번호 NP_001774.1);
(29) CXCR5 (버킷 림프종 수용체 1, CXCL13 케모카인에 의하여 활성화되고 림프구 이동 및 체액성 방어에 작용하고 HIV-2 감염 및 아마도 AIDS, 림프종, 골수종 및 백혈병의 진행에서 중요한 역할을 하는 G 단백질-커플링된 수용체, 진뱅크 수탁 번호 NP_001707.1);
(30) HLA-DOB (펩티드에 결합하여 이를 CD4+ T 림프구에 제시하는 MHC 클래스 II 분자 (Ia 항원)의 베타 서브유닛, 진뱅크 수탁 번호 NP_002111.1);
(31) P2X5 (세포외 ATP에 의하여 개폐되는 이온 채널인 퓨린성 수용체 P2X 리간드-게이트 이온 채널 5는 시냅스 전달 및 신경발생에 관련될 수 있고, 결핍은 특발성 배뇨근 불안정의 병태생리에 기여할 수 있음, 진뱅크 수탁 번호 NP_002552.2);
(32) CD72 (B-세포 분화 항원 CD72, Lyb-2, 진뱅크 수탁 번호 NP_001773.1);
(33) LY64 (림프구 항원 64 (RP105), 류신 풍부 반복체 (LRR) 족의 제I형 막 단백질은 B-세포 활성화 및 아팝토시스를 조절하고, 이 기능의 손실은 전신홍반루푸스 환자의 질환 활성 증가와 관련됨, 진뱅크 수탁 번호 NP_005573.1);
(34) FCRH1 (C2 제I형g-형 및 ITAM 도메인을 함유하는 이뮤노글로불린 Fc 도메인을 위한 추정의 수용체인 Fc 수용체-유사 단백질 1은 B-림프구 분화에 있어서 역할을 할 수 있음, 진뱅크 수탁 번호 NP_443170.1); 또는
(35) IRTA2 (B 세포 발달 및 림프종 발생에 작용할 가능성이 있는 추정의 면역수용체인 이뮤노글로불린 거대족 수용체 전위 관련 2; 전위에 의한 유전자의 탈조절은 일부 B 세포 악성종양에서 일어남, 진뱅크 수탁 번호 NP_112571.1). 한 실시양태에서 -Ww-는 -Val-Cit-이다.
다른 실시양태에서, R3, R4 및 R7은 독립적으로 이소프로필 또는 sec-부틸이고 R5는 -H이다. 예시적인 실시양태에서, R3 및 R4는 각각 이소프로필, R5는 -H이고, R7은 sec-부틸이다. 또 다른 실시양태에서, R2 및 R6은 각각 메틸이고, R9는 -H이다.
또 다른 실시양태에서, 각각의 R8은 -OCH3이다.
예시적인 실시양태에서, R3 및 R4는 각각 이소프로필, R2 및 R6은 각각 메틸, R5는 -H, R7은 sec-부틸, 각각의 R8은 -OCH3이고, R9는 -H이다.
한 실시양태에서, Z는 -O- 또는 -NH-이다.
한 실시양태에서, R10은 아릴이다.
예시적인 실시양태에서, R10은 -페닐이다.
Z가 -O-인 예시적인 실시양태에서, R11은 -H, 메틸 또는 t-부틸이다.
Z가 -NH인 한 실시양태에서, R11은 -CH(R15)2이며, 여기서 R15는 -(CH2)n-N(R16)2이고, R16은 -C1-C8 알킬 또는 -(CH2)n-COOH이다.
Z가 -NH인 다른 실시양태에서, R11은 -CH(R15)2이며, 여기서 R15는 -(CH2)n-SO3H이다.
한 측면에서, Ab는 cAC10, cBR96, cS2C6, c1F6, c2F2, hAC10, hBR96, hS2C6, h1F6, 및 h2F2이다.
화학식 Ia의 예시적인 실시양태는 하기의 구조를 갖는다.
Figure 112013088873035-pat00019
Figure 112013088873035-pat00020
Figure 112013088873035-pat00021
또는
Figure 112013088873035-pat00022
(여기서, L은 항체, Val은 발린이고, Cit는 시트룰린임).
약물 부하량은 분자(예를 들어, 화학식 Ia, Ia' 및 Ic) 내 항체 당 약물 분자의 평균 개수인 p에 의해 나타낸다. 약물 부하량은 리간드(예를 들어, Ab 또는 mAb) 당 1 내지 20 약물(D) 범위일 수 있다. 화학식 Ia 및 화학식 Ia'의 조성물은 1 내지 20 약물 범위로 접합된 항체들의 집합군을 포함한다. 접합 반응 제조에 있어서의 항체 당 약물의 평균 개수는 질량 분광법, ELISA 분석법, 및 HPLC와 같은 통상적인 방법에 의해 규명될 수 있다. p로 표현되는 리간드-약물-접합체의 정량적 분포 또한 결정될 수 있다. 특정 경우에서, P가 다른 약물 부하량을 갖는 리간드-약물-접합체로부터의 특정 값인 동질의 리간드-약물-접합체의 분리, 정제, 및 특징규명은 역상 HPLC 또는 전기영동과 같은 방법에 의해서 이루어질 수 있다.
2 화학식 (Ib)의 약물 화합물
다른 측면에서, 본 발명은 하기 화학식 (Ib)를 갖는 약물 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염 또는 용매화물을 제공한다:
<화학식 Ib>
Figure 112013088873035-pat00023
상기 화학식 중,
R2는 -수소 및 -C1-C8 알킬로부터 선택되고;
R3은 -수소, -C1-C8 알킬, -C3-C8 카르보사이클, 아릴, -C1-C8 알킬-아릴, -C1-C8 알킬-(C3-C8 카르보사이클), -C3-C8 헤테로사이클 및 -C1-C8 알킬-(C3-C8 헤테로사이클)로부터 선택되고;
R4는 -수소, -C1-C8 알킬, -C3-C8 카르보사이클, -아릴, -C1-C8 알킬-아릴, -C1-C8 알킬-(C3-C8 카르보사이클), -C3-C8 헤테로사이클 및 -C1-C8 알킬-(C3-C8 헤테로사이클)로부터 선택되고; R5는 -H 및 -메틸로부터 선택되거나; 또는 R4 및 R5는 결합하여 화학식 -(CRaRb)n- (여기서, Ra 및 Rb는 독립적으로 -H, -C1-C8 알킬 및 -C3-C8 카르보시클로부터 선택되고, n은 2, 3, 4, 5 및 6로부터 선택됨)을 가지며 이들이 부착된 탄소 원자와 함께 고리를 형성하고;
R6은 -H 및 -C1-C8 알킬로부터 선택되고;
R7은 -H, -C1-C8 알킬, -C3-C8 카르보사이클, 아릴, -C1-C8 알킬-아릴, -C1-C8 알킬-(C3-C8 카르보사이클), -C3-C8 헤테로사이클 및 -C1-C8 알킬-(C3-C8 헤테로사이클)로부터 선택되고;
R8은 각각 독립적으로 -H, -OH, -C1-C8 알킬, -C3-C8 카르보사이클 및 -O-(C1-C8 알킬)로부터 선택되고;
R9는 -H 및 -C1-C8 알킬로부터 선택되고;
R10은 아릴 기 또는 -C3-C8 헤테로시클로부터 선택되고;
Z는 -O-, -S-, -NH-, 또는 -NR12- (여기서, R12는 C1-C8 알킬임)이고;
R11은 -H, C1-C20 알킬, 아릴, -C3-C8 헤테로사이클, -(R13O)m-R14, 또는 -(R13O)m-CH(R15)2로부터 선택되고;
m은 1-1000 범위의 정수이고;
R13은 -C2-C8 알킬이고;
R14는 -H 또는 -C1-C8 알킬이고;
R15는 각각 독립적으로 -H, -COOH, -(CH2)n-N(R16)2, -(CH2)n-SO3H, 또는 -(CH2)n-SO3-C1-C8 알킬이고;
R16은 각각 독립적으로 -H, -C1-C8 알킬, 또는 -(CH2)n-COOH이고;
n은 0 내지 6 범위의 정수이다.
한 실시양태에서, R3, R4 및 R7은 독립적으로 이소프로필 또는 sec-부틸이고 R5는 -H이다. 예시적인 실시양태에서, R3 및 R4는 각각 이소프로필, R5는 -H이고, R7은 sec-부틸이다.
다른 실시양태에서, R2 및 R6은 각각 메틸이고, R9는 -H이다.
또 다른 실시양태에서, 각각의 R8은 -OCH3이다.
예시적인 실시양태에서, R3 및 R4는 각각 이소프로필, R2 및 R6은 각각 메틸, R5는 -H, R7은 sec-부틸, 각각의 R8은 -OCH3이고, R9는 -H이다.
한 실시양태에서, Z는 -O- 또는 -NH-이다.
한 실시양태에서, R10은 아릴이다.
예시적인 실시양태에서, R10은 -페닐이다.
Z가 -O-인 예시적인 실시양태에서, R11은 -H, 메틸 또는 t-부틸이다.
Z가 -NH인 한 실시양태에서, R11은 -CH(R15)2이며, 여기서 R15는 -(CH2)n-N(R16)2이고, R16은 -C1-C8 알킬 또는 -(CH2)n-COOH이다.
Z가 -NH인 다른 실시양태에서, R11은 -CH(R15)2이며, 여기서 R15는 -(CH2)n-SO3H이다.
ADC 내 약물 잔기 (D)로서 사용될 수 있는 화학식 Ib의 예시적인 화합물은 하기 구조를 갖는 화합물 및 그의 제약상 허용되는 염 또는 용매화물을 포함한다:
Figure 112013088873035-pat00024
Figure 112013088873035-pat00025
Figure 112013088873035-pat00026
Figure 112013088873035-pat00027
Figure 112013088873035-pat00028
Figure 112013088873035-pat00029
Figure 112013088873035-pat00030
Figure 112013088873035-pat00031
Figure 112013088873035-pat00032
Figure 112013088873035-pat00033
화학식 Ic의 화합물
다른 측면에서, 본 발명은 하나 이상의 약물 단위(잔기)에 공유적으로 부착된 항체를 포함하는, 하기 화학식 Ic를 갖는 항체-약물 접합체 화합물(ADC)를제공한다.
<화학식 Ic>
Figure 112013088873035-pat00034
항체-약물 접합체 화합물은 그의 제약상 허용되는 염 또는 용매화물을 포함한다.
화학식 (Ic) 화합물은 하기와 같이 정의된다:
Ab는 하나 이상의 종양-관련 항원 수용체 (1)-(35)에 결합하는 항체이다:
(1) BMPR1B (골 형태형성 단백질 수용체-IB형, 진뱅크 수탁 번호 NM_001203);
(2) E16 (LAT1, SLC7A5, 진뱅크 수탁 번호 NM_003486);
(3) STEAP1 (전립선의 6개의 막횡단 상피 항원, 진뱅크 수탁 번호 NM_012449);
(4) 0772P (CA125, MUC16, 진뱅크 수탁 번호 AF361486);
(5) MPF (MPF, MSLN, SMR, 거대핵세포 강화 인자, 메소텔린, 진뱅크 수탁 번호 NM_005823);
(6) Napi3b (NAPI-3B, NPTIIb, SLC34A2, 용질 담체 족 34 (인산나트륨), 2 원, 제II형 나트륨-의존성 포스페이트 전달체 3b, 진뱅크 수탁 번호 NM_006424);
(7) Sema 5b (FLJ10372, KIAA1445, Mm. 42015, SEMA5B, SEMAG, 세마포린 5b Hlog, 세마 도메인, 7개의 트롬보스폰딘 반복체 (제1형 및 제1형-유사), 막횡단 도메인 (TM) 및 짧은 세포질 도메인, (세마포린) 5B, 진뱅크 수탁 번호 AB040878);
(8) PSCA hlg (2700050C12Rik, C530008O16Rik, RIKEN cDNA 2700050C12, RIKEN cDNA 2700050C12 유전자, 진뱅크 수탁 번호 AY358628);
(9) ETBR (엔도텔린 B형 수용체, 진뱅크 수탁 번호 AY275463);
(10) MSG783 (RNF124, 가상 단백질 FLJ20315, 진뱅크 수탁 번호 NM_017763);
(11) STEAP2 (HGNC_8639, IPCA-1, PCANAP1, STAMP1, STEAP2, STMP, 전립선암 관련 유전자 1, 전립선암 관련 단백질 1, 전립선의 6개의 막횡단 상피 항원 2, 6개의 막횡단 전립선 단백질, 진뱅크 수탁 번호 AF455138);
(12) TrpM4 (BR22450, FLJ20041, TRPM4, TRPM4B, 일시적 수용체 잠재적 양이온 채널, M 아족, 4 원, 진뱅크 수탁 번호 NM_017636);
(13) CRIPTO (CR, CR1, CRGF, CRIPTO, TDGF1, 기형암종-유도 성장 인자, 진뱅크 수탁 번호 NP_003203 또는 NM_003212);
(14) CD21 (CR2 (보체 수용체 2) 또는 C3DR (C3d/엡스테인 바르 바이러스 수용체) 또는 Hs.73792, 진뱅크 수탁 번호 M26004);
(15) CD79b (IGb (이뮤노글로불린-연관 베타), B29, 진뱅크 수탁 번호 NM_000626);
(16) FcRH2 (IFGP4, IRTA4, SPAP1A (SH2 도메인 함유 포스파타제 고정 단백질 1a), SPAP1B, SPAP1C, 진뱅크 수탁 번호 NM_030764);
(17) HER2 (진뱅크 수탁 번호 M11730);
(18) NCA (진뱅크 수탁 번호 M18728);
(19) MDP (진뱅크 수탁 번호 BC017023);
(20) IL20Rα (진뱅크 수탁 번호 AF184971);
(21) 브레비칸 (진뱅크 수탁 번호 AF229053);
(22) Ephb2R (진뱅크 수탁 번호 NM_004442);
(23) ASLG659 (진뱅크 수탁 번호 AX092328);
(24) PSCA (진뱅크 수탁 번호 AJ297436);
(25) GEDA (진뱅크 수탁 번호 AY260763);
(26) BAFF-R (진뱅크 수탁 번호 NP_443177.1);
(27) CD22 (진뱅크 수탁 번호 NP-001762.1);
(28) CD79a (CD79A, CD79α, 이뮤노글로불린-연관 알파, Ig 베타 (CD79B)와 공유적으로 상호작용하고 Ig M 분자와 표면 상에서 복합체를 형성하여 B 세포 분화에 관여하는 신호를 전달하는 B 세포-특이적 단백질, 진뱅크 수탁 번호 NP_001774.1);
(29) CXCR5 (버킷 림프종 수용체 1, CXCL13 케모카인에 의하여 활성화되고 림프구 이동 및 체액성 방어에 작용하고 HIV-2 감염 및 아마도 AIDS, 림프종, 골수종 및 백혈병의 진행에서 중요한 역할을 하는 G 단백질-커플링된 수용체, 진뱅크 수탁 번호 NP_001707.1);
(30) HLA-DOB (펩티드에 결합하여 이를 CD4+ T 림프구에 제시하는 MHC 클래스 II 분자 (Ia 항원)의 베타 서브유닛, 진뱅크 수탁 번호 NP_002111.1);
(31) P2X5 (세포외 ATP에 의하여 개폐되는 이온 채널인 퓨린성 수용체 P2X 리간드-게이트 이온 채널 5는 시냅스 전달 및 신경발생에 관련될 수 있고, 결핍은 특발성 배뇨근 불안정의 병태생리에 기여할 수 있음, 진뱅크 수탁 번호 NP_002552.2);
(32) CD72 (B-세포 분화 항원 CD72, Lyb-2, 진뱅크 수탁 번호 NP_001773.1);
(33) LY64 (림프구 항원 64 (RP105), 류신 풍부 반복체 (LRR) 족의 제I형 막 단백질은 B-세포 활성화 및 아팝토시스를 조절하고, 이 기능의 손실은 전신홍반루푸스 환자의 질환 활성 증가와 관련됨, 진뱅크 수탁 번호 NP_005573.1);
(34) FCRH1 (C2 제I형g-형 및 ITAM 도메인을 함유하는 이뮤노글로불린 Fc 도메인을 위한 추정의 수용체인 Fc 수용체-유사 단백질 1은 B-림프구 분화에 있어서 역할을 할 수 있음, 진뱅크 수탁 번호 NP_443170.1); 또는
(35) IRTA2 (B 세포 발달 및 림프종 발생에 작용할 가능성이 있는 추정의 면역수용체인 이뮤노글로불린 거대족 수용체 전위 관련 2; 전위에 의한 유전자의 탈조절은 일부 B 세포 악성종양에서 일어남, 진뱅크 수탁 번호 NP_112571.1).
A는 스트레처 단위,
a는 0 또는 1,
각각의 W는 독립적으로 아미노산 단위,
w는 0 내지 12 범위의 정수,
Y는 스페이서 단위,
y는 0, 1 또는 2,
p는 1 내지 약 8 범위이고,
D는 하기 화학식 DE 및 DF로부터 선택되는 약물 잔기이며:
<화학식 DE>
Figure 112013088873035-pat00035
<화학식 DF>
Figure 112013088873035-pat00036
여기서, DE 및 DF의 파형 선은 A, W, 또는 Y에 대한 공유 부착 부위를 나타내고, 각각의 위치에서 독립적으로:
R2는 H 및 C1-C8 알킬로부터 선택되고;
R3은 H, C1-C8 알킬, C3-C8 카르보사이클, 아릴, C1-C8 알킬-아릴, C1-C8 알킬-(C3-C8 카르보사이클), C3-C8 헤테로사이클 및 C1-C8 알킬-(C3-C8 헤테로사이클)로부터 선택되고;
R4는 H, C1-C8 알킬, C3-C8 카르보사이클, 아릴, C1-C8 알킬-아릴, C1-C8 알킬-(C3-C8 카르보사이클), C3-C8 헤테로사이클 및 C1-C8 알킬-(C3-C8 헤테로사이클)로부터 선택되고;
R5는 H 및 메틸로부터 선택되거나; 또는
R4 및 R5는 결합하여 카르보시클릭 고리를 형성하고, 화학식 -(CRaRb)n- (여기서, Ra 및 Rb는 독립적으로 H, C1-C8 알킬 및 C3-C8 카르보시클로부터 선택되고, n은 2, 3, 4, 5 및 6로부터 선택됨)을 가지며;
R6은 H 및 C1-C8 알킬로부터 선택되고;
R7은 H, C1-C8 알킬, C3-C8 카르보사이클, 아릴, C1-C8 알킬-아릴, C1-C8 알킬-(C3-C8 카르보사이클), C3-C8 헤테로사이클 및 C1-C8 알킬-(C3-C8 헤테로사이클)로부터 선택되고;
R8은 각각 독립적으로 H, OH, C1-C8 알킬, C3-C8 카르보사이클 및 O-(C1-C8 알킬)로부터 선택되고;
R9는 H 및 C1-C8 알킬로부터 선택되고;
R10은 아릴 또는 C3-C8 헤테로시클로부터 선택되고;
Z는 O, S, NH, 또는 NR12 (여기서, R12는 C1-C8 알킬임)이고;
R11은 H, C1-C20 알킬, 아릴, C3-C8 헤테로사이클, -(R13O)m-R14, 또는 -(R13O)m-CH(R15)2로부터 선택되고;
m은 1-1000 범위의 정수이고;
R13은 C2-C8 알킬이고;
R14는 H 또는 C1-C8 알킬이고;
R15는 각각 독립적으로 H, COOH, -(CH2)n-N(R16)2, -(CH2)n-SO3H, 또는 -(CH2)n-SO3-C1-C8 알킬이고;
R16은 각각 독립적으로 H, C1-C8 알킬, 또는 -(CH2)n-COOH이고;
R18은 -C(R8)2-C(R8)2-아릴, -C(R8)2-C(R8)2-(C3-C8 헤테로사이클), 및 -C(R8)2-C(R8)2-(C3-C8 헤테로사이클)로부터 선택되고; 및
n은 0 내지 6 범위의 정수이다.
한 실시양태에서, -Ww-는 -Val-Cit-이다.
다른 실시양태에서, R3, R4 및 R7은 독립적으로 이소프로필 또는 sec-부틸이고, R5는 -H이다. 예시적인 실시양태에서, R3 및 R4는 각각 이소프로필, R5는 -H이고, R7은 sec-부틸이다.
또 다른 실시양태에서, R2 및 R6은 각각 메틸이고, R9는 -H이다.
또 다른 실시양태에서, R8은 각각 -OCH3이다.
예시적인 실시양태에서, R3 및 R4는 각각 이소프로필, R2 및 R6은 각각 메틸, R5는 -H, R7은 sec-부틸, 각각의 R8은 -OCH3이고, R9는 -H이다.
한 실시양태에서, Z는 -O- 또는 -NH-이다.
한 실시양태에서, R10은 아릴이다.
예시적인 실시양태에서, R10은 -페닐이다.
Z가 -O-인 예시적인 실시양태에서, R11은 -H, 메틸 또는 t-부틸이다.
Z가 -NH인 한 실시양태에서, R11은 -CH(R15)2이며, 여기서 R15는 -(CH2)n-N(R16)2이고, R16은 -C1-C8 알킬 또는 -(CH2)n-COOH이다.
Z가 -NH인 다른 실시양태에서, R11은 -CH(R15)2이며, 여기서 R15는 -(CH2)n-SO3H이다.
화학식 Ic ADC의 예시적인 실시양태는 하기 구조를 갖는다:
Figure 112013088873035-pat00037
Figure 112013088873035-pat00038
Figure 112013088873035-pat00039
Figure 112013088873035-pat00040
(여기서, Ab는 하나 이상의 종양-관련 항원 수용체 (1)-(35)에 결합하는 항체이고; Val은 발린이고; Cit는 시트룰린임).
약물 부하량은 화학식 I의 분자 내 항체 당 약물 분자의 평균 개수인 p에 의해 나타낸다. 약물 부하량은 항체(예를 들어, Ab 또는 mAb) 당 1 내지 20 약물(D) 범위일 수 있다. 화학식 I의 ADC 조성물은 1 내지 20 약물 범위로 접합된 항체들의 집합군을 포함한다. 접합 반응으로부터 ADC를 제조하는데 있어서 항체 당 약물의 평균 개수는 UV/가시광선 분광법, 질량 분석법, ELISA 분석법, 및 HPLC와 같은 통상적인 방법에 의해 규명될 수 있다. p로 표현되는 ADC의 정량적 분포 또한 결정될 수 있다. 특정 경우에서, p가 다른 약물 부하량을 갖는 ADC로부터의 특정 값인 동질의 ADC의 분리, 정제, 및 특징규명은 역상 HPLC 또는 전기영동과 같은 방법에 의해서 이루어질 수 있다.
일부 항체 약물 접합체에 있어, p는 항체 상의 부착 부위의 개수에 의해 제한될 수 있다. 예를 들어, 부착이 상기 예시적인 실시양태에서와 같이 시스테인 티올에 의한 경우, 항체는 오직 하나 또는 수 개의 시스테인 티올 기를 갖거나, 링커가 부착될 수 있는 오직 하나 또는 수 개의 충분히 반응성인 티올 기를 가질 수 있다.
전형적으로, 이론상 최대치보다 적은 약물 잔기들이 접합 반응 동안 항체에 접합된다. 항체는, 예를 들면 약물-링커 중간체 또는 링커 시약과 반응하지 않는 많은 리신 잔기들을 함유할 수 있다. 가장 반응성인 리신 기만이 아민-반응성 링커 시약과 반응할 수 있다. 일반적으로, 항체는, 존재한다면 유리형이고 반응성인, 약물 잔기에 연결될 수 있는 시스테인 티올 기를 많이 함유하지 않는다. 본 발명 화합물의 항체 내 대부분의 시스테인 티올 잔기들은 디술피드 가교로서 존재하며, 디티오트레이톨(DTT)과 같은 환원제로 환원시켜야 한다. 추가적으로, 항체는 리신 또는 시스테인과 같은 반응성 있는 친핵성 기를 노출시키기 위해 변성 조건에 적용시켜야 한다. ADC의 부하량(약물/항체 비율)은 (i) 항체에 비해 몰 과량인 약물-링커 중간체 또는 링커 시약의 제한, (ⅱ) 접합 반응 시간 또는 온도의 제한, 및 (ⅲ) 시스테인 티올 변형을 위한 부분적 또는 제한적인 환원 조건을 포함하는 몇 가지 상이한 방식들로 조절될 수 있다.
하나 초과의 친핵성 기가 약물-링커 중간체, 또는 링커 시약에 이어서 약물 잔기 시약과 반응함으로써 생성된 생성물은 항체에 부착된 하나 이상의 약물 잔기들의 분포를 갖는 ADC 화합물의 혼합물이라고 이해되어야 한다. 항체 당 약물의 평균 개수는 항체에 특이적이고 약물에 특이적인 이중 ELISA 항체 분석법에 의해 혼합물로부터 계산할 수 있다. 개별적인 ADC 분자들은 질량 분광법에 의해 혼합물 내에서 확인되고, HPLC, 예를 들어 소수성 상호작용 크로마토그래피에 의해 분리될 수 있다(문헌 ["Effect of drug loading on the pharmacology, pharmacokinetics, and toxicity of an anti-CD30 antibody-drug conjugate", Hamblett, K.J., et al, Abstract No. 624, American Association for Cancer Research; 2004 Annual Meeting, March 27-31, 2004, Proceedings of the AACR, Volume 45, March 2004]; ["Controlling the Location of Drug Attachment in Antibody-Drug Conjugates", Alley, S.C., et al, Abstract No. 627, American Association for Cancer Research; 2004 Annual Meeting, March 27-31, 2004, Proceedings of the AACR, Volume 45, March 2004] 참조). 따라서, 단일의 부하량 값을 갖는 동질의 ADC는 전기영동 또는 크로마토그래피에 의해 접합 혼합물로부터 단리될 수 있다.
4.3 링커 단위
"링커 단위"(LU)는 약물 단위 및 리간드 단위를 연결하여 약물-링커-리간드 접합체를 형성하는데 사용될 수 있거나, 종양 관련 항원에 대한 면역접합체의 형성에 유용한 양기능성 화합물이다. 그러한 면역접합체는 독성 약물이 종양 세포에 선택적으로 전달되게 한다. 한 실시양태에서, 약물-링커 화합물 및 약물-링커-리간드 접합체의 링커 단위는 하기의 화학식을 갖는다:
Figure 112013088873035-pat00041
상기 화학식 중 -A-는 스트레처 단위이고;
a는 0 또는 1;
-W-는 각각 독립적으로 아미노산 단위;
w는 독립적으로 0 내지 12 범위의 정수;
-Y-는 스페이서 단위이고;
y는 0, 1 또는 2이다.
약물-링커-리간드 접합체에서, 링커는 약물 잔기 및 리간드 단위를 연결시킬 수 있다.
4.3.1 스트레처 단위
스트레처 단위 (-A-)는, 존재하는 경우, 리간드 단위를 아미노산 단위 (-W-)에 연결시킬 수 있다. 이 관점에서, 리간드 (L)은 스트레처 관능기와 결합을 형성시킬 수 있는 관능기를 갖는다. 천연적으로 또는 화학적 조작을 통해 리간드 상에 존재할 수 있는 유용한 관능기는 술프히드릴(-SH), 아미노, 히드록실, 카르복시, 탄수화물의 아노머성 히드록실 기, 및 카르복실을 포함하지만, 이들에 한정되지는 않는다. 한 측면에서, 리간드 관능기는 술프히드릴 및 아미노이다. 술프히드릴 기는 리간드의 분자 내 디술피드 결합의 환원에 의해 생성될 수 있다. 달리, 술프히드릴 기는 2-이미노티올란(트라우트 시약(Traut's reagent)) 또는 다른 술프히드릴 생성 시약을 이용한, 리간드의 리신 잔기 내 아미노 기의 반응에 의해 생성될 수 있다.
한 실시양태에서, 스트레처 단위는 리간드 단위의 황 원자와 결합을 형성한다. 황 원자는 리간드의 술프히드릴 기로부터 유도될 수 있다. 이 실시양태의 대표적인 스트레처 단위는 화학식 Ⅲa 및 Ⅲb의 꺾쇠 괄호 내에 도시하였으며, 여기서 L-, -W-, -Y-, -D, w 및 y는 상기에서 정의된 바와 같고, R17은 -C1-C10 알킬렌-, -C3-C8 카르보시클로-, -O-(C1-C8 알킬)-, -아릴렌-, -C1-C10 알킬렌-아릴렌-, -아릴렌-C1-C10 알킬렌-, -C1-C10 알킬렌-(C3-C8 카르보시클로)-, -(C3-C8 카르보시클로)-C1-C10 알킬렌-, -C3-C8 헤테로시클로-, -C1-C10 알킬렌-(C3-C8 헤테로시클로)-, -(C3-C8 헤테로시클로)-C1-C10 알킬렌-, -(CH2CH2O)r-, 및 -(CH2CH2O)r-CH2-이고; r은 1-10 범위의 정수이다. 화학식 Ⅲ-Ⅵ과 같은 화학식 Ia의 모든 예시적인 실시양태으로부터, 명확히 표시되어 있지 않더라도, 1 내지 20개의 약물 잔기들이 리간드에 연결되어 있는 것으로 이해해야 한다(p=1-20).
<화학식 Ⅲa>
Figure 112013088873035-pat00042
<화학식 Ⅲb>
Figure 112013088873035-pat00043
예시적인 스트레처 단위는 하기의 R17이 -(CH2)5-인 화학식 Ⅲa의 스트레처 단위이다.
Figure 112013088873035-pat00044
또다른 예시적인 스트레처 단위는 하기의 R17이 -(CH2CH2O)r-CH2-이고; r이 2인 화학식 Ⅲa의 스트레처 단위이다.
Figure 112013088873035-pat00045
또 다른 예시적인 스트레처 단위는 하기의 R17이 -(CH2)5-인 화학식 Ⅲb의 스트레처 단위이다.
Figure 112013088873035-pat00046
다른 실시양태에서, 스트레처 단위는 리간드 단위의 황 원자와 스트레처 단위의 황 원자 사이에 디술피드 결합을 통해 리간드 단위에 연결된다. 이 실시양태의 대표적인 스트레처 단위는 화학식 Ⅳ의 꺾쇠 괄호 내에 도시하였으며, 여기서 R17, L-, -W-, -Y-, -D, w 및 y는 상기에서 정의된 바와 같다.
<화학식 Ⅳ>
Figure 112013088873035-pat00047
또 다른 실시양태에서, 스트레처의 반응성 기는 리간드의 일차 또는 이차 아미노 기와 결합을 형성할 수 있는 반응성 부위를 함유한다. 이들 반응성 부위들의 예로는 숙신이미드 에스테르, 4-니트로페닐 에스테르, 펜타플루오로페닐 에스테르, 테트라플루오로페닐 에스테르, 무수물, 산 염화물, 술포닐 염화물, 이소시아네이트 및 이소티오시아네이트와 같은 활성화된 에스테르를 포함하지만 이들에 한정되지는 않는다. 이 실시양태의 대표적인 스트레처 단위는 화학식 Va 및 Vb의 꺾쇠 괄호 내에 도시하였으며, 여기서 -R17-, L-, -W-, -Y-, -D, w 및 y는 상기에서 정의된 바와 같다.
<화학식 Va>
Figure 112013088873035-pat00048
<화학식 Vb>
Figure 112013088873035-pat00049
또 다른 측면에서, 스트레처의 반응성 기는 리간드 상에 존재할 수 있는 개질된 탄수화물의 (-CHO) 기에 대해 반응성인 반응성 부위를 함유한다. 예를 들어, 탄수화물은 과요오드산나트륨과 같은 시약을 사용하여 온화하게 산화될 수 있으며, 산화된 탄수화물의 생성된 (-CHO) 단위는 문헌 [Kaneko, T. et al . (1991) Bioconjugate Chem 2: 133-41]에 기재된 것들과 같은 히드라지드, 옥심, 일급 또는 이급 아민, 히드라진, 티오세미카르바존, 히드라진 카르복실레이트, 및 아릴히드라지드와 같은 관능기를 함유하는 스트레처와 축합될 수 있다. 이 실시양태의 대표적인 스트레처 단위는 화학식 Ⅵa, Ⅵb, 및 Ⅵc의 꺾쇠 괄호 내에 도시하였으며, 여기서 -R17-, L-, -W-, -Y-, -D, w 및 y는 상기에서 정의된 바와 같다.
<화학식 Ⅵa>
Figure 112013088873035-pat00050
<화학식 Ⅵb>
Figure 112013088873035-pat00051
<화학식 Ⅵc>
Figure 112013088873035-pat00052
4.3.2 아미노산 단위
아미노산 단위 (-W-)는, 존재하는 경우, 스페이서 단위가 존재한다면 스트레처 단위를 스페이서 단위에 연결시키고, 스페이서 단위가 없다면 스트레처 단위를 약물 잔기에 연결시키고, 스트레처 단위 및 스페이서 단위가 없다면 리간드 단위를 약물 단위에 연결시킨다.
Ww-는 디펩티드, 트리펩티드, 테트라펩티드, 펜타펩티드, 헥사펩티드, 헵타펩티드, 옥타펩티드, 노나펩티드, 데카펩티드, 운데카펩티드 또는 도데카펩티드 단위이다. 각각의 -W- 단위는 독립적으로 하기 꺾쇠 괄호 내에 표시된 화학식을 가지고, w는 0 내지 12 범위의 정수이다.
Figure 112013088873035-pat00053
상기 화학식 중 R19는 수소, 메틸, 이소프로필, 이소부틸, sec-부틸, 벤질, p-히드록시벤질, -CH2OH, -CH(OH)CH3, -CH2CH2SCH3, -CH2CONH2, -CH2COOH, -CH2CH2CONH2, -CH2CH2COOH, -(CH2)3NHC(=NH)NH2, -(CH2)3NH2, -(CH2)3NHCOCH3, -(CH2)3NHCHO, -(CH2)4NHC(=NH)NH2, -(CH2)4NH2, -(CH2)4NHCOCH3, -(CH2)4NHCHO, -(CH2)3NHCONH2, -(CH2)4NHCONH2, -CH2CH2CH(OH)CH2NH2, 2-피리딜메틸-, 3-피리딜메틸-, 4-피리딜메틸-, 페닐, 시클로헥실,
Figure 112013088873035-pat00054
이다.
아미노산 단위는 종양-관련 프로테아제를 포함하는 하나 이상의 효소에 의해 효소적으로 분해되어 약물 단위 (-D)를 유리시킬 수 있으며, 한 실시양태에서, 약물 단위가 방출되었을 때 생체 내에서 양성자화되어 약물 (D)를 제공한다. 예시적인 Ww 단위는 하기 화학식 (Ⅶ)-(Ⅸ)에 의해 나타낸다:
<화학식 Ⅶ>
Figure 112013088873035-pat00055
상기 화학식 중 R20 및 R21은 다음과 같다:
Figure 112013088873035-pat00056
Figure 112013088873035-pat00057
<화학식 Ⅷ>
Figure 112013088873035-pat00058
상기 화학식 중 R20, R21 및 R22는 다음과 같다:
Figure 112013088873035-pat00059
<화학식 Ⅸ>
Figure 112013088873035-pat00060
상기 화학식 중 R20, R21, R22 및 R23은 다음과 같다:
Figure 112013088873035-pat00061
예시적인 아미노산 단위는 R20이 벤질이고 R21이 -(CH2)4NH2; R20이 이소프로필이고 R21이 -(CH2)4NH2; R20이 이소프로필이고 R21이 -(CH2)3NHCONH2인 화학식 (Ⅶ)의 단위를 포함하지만, 이들에 한정되지는 않는다. 다른 예시적인 아미노산 단위는 R20이 벤질이고, R21이 벤질이고, R22가 -(CH2)4NH2인 화학식 (Ⅷ) 단위이다.
특정 효소, 예를 들어 종양-관련 프로테아제에 의한 효소적 분해에 유용한 -Ww- 단위가 설계되고 그의 선택성에 있어 최적화될 수 있다. 한 실시양태에서, -Ww- 단위는 그 절단이 카텝신 B, C 및 D, 또는 플라스민 프로테아제에 의해 촉매된 것이다.
한 실시양태에서, -Ww-는 디펩티드, 트리펩티드, 테트라펩티드 또는 펜타펩티드이다.
R19, R20, R21, R22 또는 R23이 수소 이외의 것인 경우, R19, R20, R21, R22 또는 R23이 부착된 탄소 원자는 키랄성이다.
R19, R20, R21, R22 또는 R23이 부착된 각각의 탄소 원자는 독립적으로 (S) 또는 (R) 배위로 존재한다.
아미노산 단위의 한 측면에서, 아미노산 단위는 발린-시트룰린이다. 다른 측면에서, 아미노산 단위는 페닐알라닌-리신(즉, fk)이다. 아미노산 단위의 또 다른 측면에서, 아미노산 단위는 N-메틸발린-시트룰린이다. 또 다른 측면에서, 아미노산 단위는 5-아미노발레르산, 호모 페닐알라닌 리신, 테트라이소퀴놀린카르복실레이트 리신, 시클로헥실알라닌 리신, 이소네페코트산 리신, 베타-알라닌 리신, 글리신 세린 발린 글루타민 및 이소네페코트산이다.
특정 실시양태에서, 아미노산 단위는 천연 아미노산을 포함할 수 있다. 다른 실시양태에서, 아미노산 단위는 비-천연 아미노산을 포함할 수 있다.
4.3.3 스페이서 단위
스페이서 단위 (-Y-)는, 존재하는 경우, 아미노산 단위가 존재할 때 아미노산 단위를 약물 잔기에 연결시킨다. 달리, 아미노산 단위가 없는 경우, 스페이서 단위는 스트레처 단위를 약물 잔기에 연결시킨다. 아미노산 단위 및 스트레처 단위 둘다가 없는 경우, 스페이서 단위는 또한 약물 잔기를 리간드 단위에 연결시킨다.
스페이서 단위는 자체-희생성 및 비 자체-희생성의 두 가지 일반적인 유형이 있다. 비 자체-희생성 스페이서 단위는 스페이서 단위의 일부 또는 전부가 약물-링커-리간드 접합체 또는 약물-링커 화합물로부터 아미노산 단위를 분해, 특히 효소적으로 분해된 후에 약물 잔기에 결합된 채 남아 있는 것이다. 비 자체-희생성 스페이서 단위의 예는 (글리신-글리신) 스페이서 단위 및 글리신 스페이서 단위(둘 다 반응식 1에 표시됨)(하기)를 포함하지만, 이들에 한정되지는 않는다. 글리신-글리신 스페이서 단위 또는 글리신 스페이서 단위를 함유하는 예시적인 화합물이 종양-세포 연관-프로테아제, 암-세포-연관 프로테아제 또는 림프구-연관 프로테아제를 통한 효소적 분해를 거치는 경우, 글리신-글리신-약물 잔기 또는 글리신-약물 잔기는 L-Aa-Ww-로부터 절단된다. 한 실시양태에서, 독립적인 가수분해 반응이 표적 세포 내에서 일어나서, 글리신-약물 잔기 결합을 분해하고 약물을 유리시킨다.
다른 실시양태에서, -Yy-는, 페닐렌 부분이, Q가 -C1-C8 알킬, -O-(C1-C8 알킬), -할로겐, -니트로 또는 -시아노이고; m이 0-4 범위의 정수인 Qm으로 치환된 p-아미노벤질 알코올(PAB) 단위(반응식 2 및 3을 참조)이다.
<반응식 1>
Figure 112013088873035-pat00062
한 실시양태에서, 비 자체-희생성 스페이서 단위 (-Y-)는 -Gly-Gly-이다. 다른 실시양태에서, 비 자체-희생성 스페이서 단위 (-Y-)는 -Gly-이다.
한 실시양태에서, 스페이서 단위가 없는(y=0) 약물-링커 화합물 또는 약물-링커 리간드 접합체 또는 그의 제약상 허용되는 염 또는 용매화물이 제공된다.
달리, 자체-희생성 스페이서 단위를 함유하는 예시적인 화합물은 별도의 가수분해 단계를 필요로 하지 않고 -D를 방출시킬 수 있다. 이 실시양태에서, -Y-는 PAB 기의 아미노 질소 원자를 통해 -Ww-에 연결되고, 카르보네이트, 카르바메이트 또는 에테르 기를 통해 -D에 직접 연결되는 PAB 기이다. 임의의 특정 이론 또는 메카니즘에 매이지 않고, 반응식 2는 문헌 [Toki et al. (2002) J Org. Chem. 67: 1866-1872]에 의해 채택된 카르바메이트 또는 카르보네이트 기를 통해 -D에 직접 부착된 PAB 기의 약물 방출의 가능한 메카니즘을 표시한다.
<반응식 2>
Figure 112013088873035-pat00063
상기 반응식 중 Q는 -C1-C8 알킬, -O-(C1-C8 알킬), -할로겐, -니트로 또는 -시아노; m은 0-4 범위의 정수이고; p는 1 내지 약 20 범위이다.
특정 이론 또는 메카니즘에 매이지 않고, 반응식 3은 에테르 또는 아민 연결을 통해 -D에 직접 부착된 PAB 기의 약물 방출의 가능한 메카니즘을 표시한다.
<반응식 3>
Figure 112013088873035-pat00064
상기 반응식 중 Q는 -C1-C8 알킬, -O-(C1-C8 알킬), -할로겐, -니트로 또는 -시아노; m은 0-4 범위의 정수이고; p는 1 내지 약 20 범위이다.
자체-희생성 스페이서의 다른 예는 2-아미노이미다졸-5-메탄올 유도체(문헌 [Hay et al. (1999) Bioorg. Med. Chem. Lett. 9: 2237]) 및 오르쏘 또는 파라-아미노벤질아세탈과 같은 PAB 기와 전자적으로 유사한 방향족 화합물들을 포함하지만, 이들에 한정되지는 않는다. 치환된 및 비치환된 4-아미노부티르산 아미드(문헌 [Rodrigues et al., Chemistry Biology, 1995, 2, 223]), 적당히 치환된 비시클로[2.2.1] 및 비시클로[2.2.2] 고리계(문헌 [Storm, et al., J. Amer. Chem. Soc., 1972, 94, 5815]) 및 2-아미노페닐프로피온산 아미드(문헌 [Amsberry, et al., J. Org. Chem., 1990, 55, 5867])과 같은 아미드 결합의 가수분해 시에 고리화 반응을 거치는 스페이서가 사용될 수 있다. 글리신의 a-위치에서 치환된 아민-함유 약물의 제거(문헌 [Kingsbury, et al ., J. Med. Chem., 1984, 27, 1447]) 또한 예시적인 화합물에 유용한 자체-희생성 스페이서의 예이다.
한 실시양태에서, 스페이서 단위는 다중 약물들을 도입시키고 방출시키는데 사용될 수 있는, 하기 반응식 4에 표시된 바와 같은 분지형 비스(히드록시메틸)스티렌(BHMS) 단위이다.
<반응식 4>
Figure 112013088873035-pat00065
상기 반응식 중 Q는 -C1-C8 알킬, -O-(C1-C8 알킬), -할로겐, -니트로 또는 -시아노; m은 0-4 범위의 정수; n은 0 또는 1이고; p는 1 내지 약 20 범위이다.
한 실시양태에서, -D 잔기들은 서로 같다. 또 다른 실시양태에서, -D 잔기들은 서로 다르다.
한 측면에서, 스페이서 단위 (-Yy-)는 하기 화학식 (X)-(XⅡ)으로 나타난다:
<화학식 X>
Figure 112013088873035-pat00066
상기 화학식 중 Q는 -C1-C8 알킬, -O-(C1-C8 알킬), -할로겐, -니트로 또는 -시아노이고; m은 0-4 범위의 정수이다.
<화학식 XI>
Figure 112013088873035-pat00067
및
<화학식 XⅡ>
Figure 112013088873035-pat00068
화학식 Ia' 및 Ic 항체-약물 접합체 화합물의 실시양태는 하기 화학식을 포함한다.
Figure 112013088873035-pat00069
Figure 112013088873035-pat00070
(여기서, w 및 y는 각각 0임),
Figure 112013088873035-pat00071
Figure 112013088873035-pat00072
Figure 112013088873035-pat00073
4.4 약물 단위( 잔기 )
항체 약물 접합체(ADC)의 약물 잔기(D)는 미세소관 역학, GTP 가수분해, 및 핵 및 세포 분열(문헌 [Woyke et al. (2001) Antimicrob. Agents and Chemother. 45(12): 3580-3584])을 방해하고 항암(미국 특허 No. 5663149) 및 항진균 활성(문헌 [Pettit et al. (1998) Antimicrob. Agents Chemother. 42: 2961-2965)을 갖는 것으로 보여지는 돌라스타틴(dolastatin)/아우리스타틴(auristatin) 유형(미국 특허 Nos. 5635483; 5780588)의 것이다.
D는 y=1 또는 2인 경우엔 스페이서와, y=0인 경우엔 아미노산 단위의 C-말단 카르복실 기와, w 및 y=0인 경우엔 스트레처 단위의 카르복실 기와, 그리고 a, w, 및 y=0인 경우엔 약물 단위의 카르복실 기와 결합을 형성할 수 있는 질소 원자를 갖는 약물 단위(잔기)이다. "약물 단위" 및 "약물 잔기"라는 용어는 동의어이고 본원에서 상호전환가능하게 사용된다고 이해되어야 한다.
한 실시양태에서, -D는 하기 화학식 DE 또는 DF이다.
<화학식 DE>
Figure 112013088873035-pat00074
<화학식 DF>
Figure 112013088873035-pat00075
상기 식 중에서, 각각의 위치에서 독립적으로:
R2는 H 및 C1-C8 알킬로부터 선택되고;
R3은 H, C1-C8 알킬, C3-C8 카르보사이클, 아릴, C1-C8 알킬-아릴, C1-C8 알킬-(C3-C8 카르보사이클), C3-C8 헤테로사이클 및 C1-C8 알킬-(C3-C8 헤테로사이클)로부터 선택되고;
R4는 H, C1-C8 알킬, C3-C8 카르보사이클, 아릴, C1-C8 알킬-아릴, C1-C8 알킬-(C3-C8 카르보사이클), C3-C8 헤테로사이클 및 C1-C8 알킬-(C3-C8 헤테로사이클)로부터 선택되고;
R5는 H 및 메틸로부터 선택되거나; 또는
R4 및 R5는 결합하여 카르보시클릭 고리를 형성하고, 화학식 -(CRaRb)n- (여기서, Ra 및 Rb는 독립적으로 H, C1-C8 알킬 및 C3-C8 카르보시클로부터 선택되고, n은 2, 3, 4, 5 및 6로부터 선택됨)을 가지며;;
R6은 H 및 C1-C8 알킬로부터 선택되고;
R7은 H, C1-C8 알킬, C3-C8 카르보사이클, 아릴, C1-C8 알킬-아릴, C1-C8 알킬-(C3-C8 카르보사이클), C3-C8 헤테로사이클 및 C1-C8 알킬-(C3-C8 헤테로사이클)로부터 선택되고;
각각의 R8은 독립적으로 H, OH, C1-C8 알킬, C3-C8 카르보사이클 및 O-(C1-C8 알킬)로부터 선택되고;
R9는 H 및 C1-C8 알킬로부터 선택되고;
R10은 아릴 또는 C3-C8 헤테로시클로부터 선택되고;
Z는 O, S, NH, 또는 NR12 (여기서, R12는 C1-C8 알킬임)이고;
R11은 H, C1-C20 알킬, 아릴, C3-C8 헤테로사이클, -(R13O)m-R14, 또는 -(R13O)m-CH(R15)2로부터 선택되고;
m은 1-1000 범위의 정수이고;
R13은 C2-C8 알킬이고;
R14는 H 또는 C1-C8 알킬이고;
R15는 각각 독립적으로 H, COOH, -(CH2)n-N(R16)2, -(CH2)n-SO3H, 또는 -(CH2)n-SO3-C1-C8 알킬이고;
R16은 각각 독립적으로 H, C1-C8 알킬, 또는 -(CH2)n-COOH이고;
R18은 -C(R8)2-C(R8)2-아릴, -C(R8)2-C(R8)2-(C3-C8 헤테로사이클), 및 -C(R8)2-C(R8)2-(C3-C8 카르보사이클)로부터 선택되고; 및
n은 0 내지 6 범위의 정수이다.
한 실시양태에서, R3, R4 및 R7은 독립적으로 이소프로필 또는 sec-부틸이고, R5는 -H이다. 예시적인 실시양태에서, R3 및 R4는 각각 이소프로필이고, R5는 H이고, R7은 sec-부틸이다.
다른 실시양태에서, R2 및 R6은 각각 메틸이고, R9는 H이다.
또 다른 실시양태에서, 각각의 R8은 -OCH3이다.
예시적인 실시양태에서, R3 및 R4는 각각 이소프로필, R2 및 R6은 각각 메틸, R5는 H, R7은 sec-부틸, 각각의 R8은 -OCH3이고, R9는 H이다.
한 실시양태에서, Z는 -O- 또는 -NH-이다.
한 실시양태에서, R10은 아릴이다.
예시적인 실시양태에서, R10은 -페닐이다.
Z가 -O-인 예시적인 실시양태에서, R11은 H, 메틸 또는 t-부틸이다.
Z가 -NH인 한 실시양태에서, R11은 -CH(R15)2이며, 여기서 R15는 -(CH2)n-N(R16)2이고, R16은 -C1-C8 알킬 또는 -(CH2)n-COOH이다.
Z가 -NH인 다른 실시양태에서, R11은 -CH(R15)2이며, 여기서 R15는 -(CH2)n-SO3H이다.
예시적인 약물 단위 (-D)는 하기 구조를 갖는 약물 단위 및 그의 제약상 허용되는 염 또는 용매화물을 포함한다:
Figure 112013088873035-pat00076
Figure 112013088873035-pat00077
Figure 112013088873035-pat00078
Figure 112013088873035-pat00079
Figure 112013088873035-pat00080
Figure 112013088873035-pat00081
Figure 112013088873035-pat00082
Figure 112013088873035-pat00083
Figure 112013088873035-pat00084
Figure 112013088873035-pat00085
Figure 112013088873035-pat00086
한 측면에서, 상기에서 나타낸 바와 같이 비제한적인 트리에틸렌 글리콜 에스테르(TEG)와 같은 친수성 기는 R11에서 약물 단위에 부착될 수 있다. 이론에 매이지 않고, 친수성 기는 약물 단위의 내재화 및 비-응집 반응을 돕는다.
4.5 리간드 단위
리간드 단위 (L-)은 그 범위 내에서, 수용체, 항원 또는 주어진 표적-세포 집단과 연관된 다른 수용성 잔기와 결합하거나 반응성 있게 회합하거나 또는 복합체를 형성하는 임의의 리간드 (L) 단위를 포함한다. 리간드는, 치료적으로 또는 달리 생물학적으로 변형시키고자 하는 세포 집단의 잔기와 결합하거나 복합체를 형성하거나 또는 반응하는 분자이다. 한 측면에서, 리간드 단위는 리간드 단위와 반응하는 특정 표적 세포 집단에 약물 단위를 전달하도록 작용한다. 그러한 리간드는 예를 들어, 전장 항체, 항체 단편, 저분자량 단백질, 폴리펩티드 또는 펩티드, 렉틴, 당단백질, 비-펩티드, 비타민, 영양분-수송 분자(트랜스페린을 예로 들 수 있지만, 이에 한정되지는 않음), 또는 임의의 다른 세포 결합 분자 또는 물질과 같은 고분자량 단백질을 포함하지만, 이들에 한정되지는 않는다.
리간드 단위는 스트레처 단위, 아미노산 단위, 스페이서 단위, 또는 약물 단위에 대한 결합을 형성할 수 있다. 리간드 단위는 리간드의 헤테로원자를 통해 링커단위에 대한 결합을 형성할 수 있다. 리간드 상에 존재할 수 있는 헤테로원자는 황(한 실시양태에서, 리간드의 술프히드릴 기로부터 유래), 산소(한 실시양태에서, 리간드의 카르보닐, 카르복실 또는 히드록실 기로부터 유래) 및 질소(한 실시양태에서, 리간드의 일급 또는 이급 아민 기로부터 유래)를 포함한다. 이들 헤테로원자들은 리간드의 천연 상태, 예를 들어 자연-발생 항체의 리간드 상에 존재할 수 있고, 또는 화학적 변형을 통해 리간드 내로 도입될 수 있다.
한 실시양태에서, 리간드는 술프히드릴 기를 가지고, 리간드는 술프히드릴 기의 황 원자를 통해 링커 단위에 결합한다.
또 다른 측면에서, 리간드는 화학적으로 변형되어 하나 이상의 술프히드릴 기를 도입시킬 수 있는 하나 이상의 리신 잔기를 갖는다. 리간드 단위는 술프히드릴 기의 황 원자를 통해 링커 단위에 결합한다. 리신을 변형시키는데 사용될 수 있는 시약은 N-숙신이미딜 S-아세틸티오아세테이트(SATA) 및 2-이미노티올란 히드로클로라이드(트라우트 시약)을 포함하지만, 이들에 한정되지는 않는다.
다른 실시양태에서, 리간드는 화학적으로 변형되어 하나 이상의 술프히드릴 기를 가질 수 있는 하나 이상의 탄수화물 기를 가질 수 있다. 리간드 단위는 술프히드릴 기의 황 원자를 통해, 스트레처 단위와 같은 링커 단위에 결합한다.
또 다른 실시양태에서, 리간드는 산화되어 알데히드 (-CHO) 기를 제공할 수 있는 하나 이상의 탄수화물 기를 가질 수 있다(예를 들어, 문헌 [Laguzza, et al., J. Med . Chem . 1989, 32(3), 548-55] 참조). 상응하는 알데히드는 스트레처 상의 반응성 부위와 결합을 형성할 수 있다. 리간드 상의 카르보닐 기와 반응할 수 있는, 스트레처 상의 반응성 부위는 히드라진 및 히드록실아민을 포함하지만, 이들에 한정되지는 않는다. 약물 단위의 부착 또는 회합을 위한 단백질 변형에 대한 다른 방법이 본원에 의해 참고문헌으로 인용되고 있는 문헌 [Coligan et al., Current Protocols in Protein Science, vol.2, John Wiley & Sons (2002)]에 기재되어 있다.
유용한 비면역반응성 단백질, 폴리펩티드, 또는 펩티드 리간드는 트랜스페린, 상피 성장 인자(EGF), 봄베신, 가스트린, 가스트린-방출 펩티드, 혈소판-유래 성장인자, IL-2, IL-6, TGF-α 및 TGF-β와 같은 형질전환 성장 인자(TGF), 우두 성장 인자(VGF), 인슐린 및 인슐린-유사 성장인자 Ⅰ 및 Ⅱ, 렉틴, 및 저밀도 지단백으로부터의 아포단백을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
유용한 다클론성 항체는 면역화된 동물의 혈청으로부터 얻어지는 항체 분자의 비균질적인 집단이다. 당업계에 잘 알려진 다양한 방법이 대상 항원에 대한 다클론성 항체의 생산에 이용될 수 있다. 예를 들어, 다클론성 항체의 생산을 위해, 토끼, 마우스, 래트, 및 기니피그를 포함하나 이에 제한되지 않는 다양한 숙주 동물이 대상 항원 또는 그의 유도체를 주사함으로써 면역화될 수 있다. 면역성 반응을 증가시키기 위해 숙주종에 따라 프로인트 (완전 및 불완전) 아쥬반트, 알루미늄 히드록시드와 같은 미네랄 젤, 리소레시틴과 같은 계면 활성 물질, 플루론계 폴리올, 다가음이온, 펩티드, 오일 에멀젼, 키홀 림프펫 헤모시아닌, 디니트로페놀, 및 BCG(바실레 칼멧-구에린) 및 코리네박테리움 파르붐(corynebacterium parvum)과 같은 잠재적으로 유용한 인간 아쥬반트를 포함하나 이에 제한되지 않는 다양한 아쥬반트가 사용될 수 있다. 이러한 아쥬반트들 역시 당업계에 잘 알려져 있다.
유용한 모노클로날 항체는 특정한 항원 결정인자(즉, 암세포 항원, 바이러스 항원, 미생물 항원, 단백질, 펩티드, 탄수화물, 화학물질, 핵산, 또는 그 단편)에 대한 항체의 균일한 집단이다. 대상 항원에 대한 모노클로날 항체(mAb)는 배양 중인 연속적 세포주에 의한 항체 분자 생산을 제공하는 당업계에 알려진 어떤 기법으로도 제조될 수 있다. 이러한 것들로는 쾰러 및 밀스테인[1975, Nature 256, 495-497]에 의해 처음 설명된 하이브리도마 기법, 인간 B 세포 하이브리도마 기법[Kozbor et al., 1983, Immunology Today 4: 72], 및 EBV-하이브리도마 기법[Cole et al., 1985, Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp.77-96]을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 이러한 항체들은 IgG, IgM, IgE, IgA, 및 IgD를 포함하는 임의의 이뮤노글로불린 부류 및 그의 하위 부류의 것일 수 있다. 본 발명에서 사용되는 mAb를 생산하는 하이브리도마는 시험관 내 또는 생체 내에서 배양될 수 있다.
유용한 단일 클론 항체는 인간 모노클로날 항체, 인간화 모노클로날 항체, 항체 단편, 또는 인간-마우스(또는 다른 종) 키메라 모노클로날 항체를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 인간 모노클로날 항체는 당업계에 알려진 수많은 기법(예를 들면, [Teng et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 80, 7308-7312]; [Kozbor et al., 1983, Immunology Today 4, 72-79]; 및 [Olsson et al., 1982, Meth. Enzymol. 92, 3-l6]) 중 어떤 것에 의해 제조될 수 있다.
항체는 이중 특이성 항체일 수도 있다. 이중 특이성 항체를 제조하는 방법은 당업계에 알려져 있다. 전체 길이 이중 특이성 항체의 종래 생산은 서로 다른 특이성을 가지는 두개의 이뮤노글로불린 중쇄-경쇄 쌍의 공발현을 기반으로 한다[Milstein et al., 1983, Nature 305: 537-539]. 이뮤노글로불린 중쇄 및 경쇄의 무작위 조합 때문에, 이러한 하이브리도마(쿼드로마)는 10 종의 항체 분자들의 잠재적인 혼합물을 생산하는데, 이들 중 단 하나만이 정확한 이중 특이성 구조를 갖는다. 유사한 방법이 국제 공보 WO93/08829 및 [Traunecker et al., EMBO J. 10: 3655-3659 (1991)]에 개시되어 있다.
다른 접근에 따르면, 원하는 결합 특이성(항체-항원 결합 영역)을 가지는 항체 가변 도메인이 이뮤노글로불린 불변 도메인 서열에 융합된다. 융합은 바람직하게 적어도 경첩부분, CH2, 및 CH3 영역을 포함하는 이뮤노글로불린 중쇄 불변 도메인과 이루어진다. 하나 이상의 융합부에 존재하는, 경쇄 결합에 필수적인 부위를 포함하는 첫번째 중쇄 불변 영역(CH1)을 가지는 것이 바람직하다. 이뮤노글로불린 중쇄 융합 및, 원한다면, 이뮤노글로불린 경쇄를 코딩하는 서열을 가지는 핵산이 개별적인 발현 벡터에 삽입되고, 적절한 숙주 생물에 함께 형질감염된다. 이것은 구축에 사용된 세 폴리펩티드 사슬의 불균등한 비율이 최적의 수율을 제공하는 실시양태에서 세 폴리펩티드 단편의 상호적인 비율을 조정하는데 큰 유연성을 제공한다. 그러나, 2개 이상의 폴리펩티드 사슬이 동등한 비율로 발현되는 것이 높은 수율을 야기하거나, 또는 비율이 별로 중요하지 않을 때에는 폴리펩티드 사슬 2개 또는 3개 모두의 코딩 서열을 하나의 발현 벡터에 삽입하는 것이 가능하다.
이러한 접근의 실시양태에서, 이중 특이성 항원은 한쪽 팔에 첫번째 결합 특이성을 가지는 혼성화 이뮤노글로불린 중쇄를 가지고, 다른쪽 팔에 혼성화 이뮤노글로불린 중쇄-경쇄 쌍(두번째 결합 특이성을 제공하는)을 갖는다. 이중 특이성 분자의 한쪽 반에만 이뮤노글로불린 경쇄가 존재하는 것이 손쉬운 분리 방법(본원에 참고자료로 전문이 포함된 국제 공보 WO94/04690)을 제공하기 때문에, 이러한 비대칭적 구조는 원하지 않는 이뮤노글로불린 사슬 조합으로부터 원하는 이중 특이성 화합물의 분리를 용이하게 한다.
이중 특이성 항체 생성에 대한 추가적인 세부사항을 위해서는 예를 들어, [ Suresh et al., Methods in Enzymology, 1986, 121: 210]; [Rodrigues et al., 1993, J. of Immunology 151: 6954-6961]; [Carter et al., 1992, Bio/Technology 10: 163-167]; [Carter et al., 1995, J. of Hematotherapy 4: 463-470]; [ Merchant et al., 1998, Nature Biotechnology 16: 677-681]을 참고하라. 이러한 기법을 사용하여, 이중 특이성 항체를 본원에 한정한 질병의 치료 또는 예방에 사용될 용도로 제조할 수 있다.
양기능 항체도 유럽 특허 공보 EPA 0 105 360호에서 설명된다. 본 참고자료에 개시된 것처럼, 혼성화 또는 양기능 항체는 생물학적으로, 즉 세포 융합 기법에 의해, 또는 화학적으로, 특히 가교결합제 또는 디술피드-가교 형성 시약을 이용하여 얻어질 수 있고, 전체 항체 또는 그의 단편을 포함할 수 있다. 이러한 혼성화 항체를 얻는 방법은 예를 들어 국제 공보 WO83/03679, 및 유럽특허공보 EPA 0 217 577호에 개시되어 있으며, 이들 둘 다 본원에 참고자료로 포함되어 있다.
항체는 암세포 항원, 바이러스 항원, 또는 미생물 항원에 면역특이적으로 결합하는 항체의 기능적으로 활성있는 단편, 유도체 또는 유사체, 또는 종양 세포 또는 매트릭스에 결합하는 다른 항체일 수 있다. 이러한 점에서, "기능적으로 활성있는 것"은 단편, 유도체, 또는 유사체가, 단편, 유도체, 또는 유사체가 유래한 항체가 인식하는 것과 동일한 항원을 인식하는 항-항이디오타입 항체를 유도할 수 있음을 의미한다. 구체적으로, 한 예시적 실시양태에서 이뮤노글로불린 분자의 이디오타입의 항원성은 프레임워크, 및 특이적으로 항원을 인식하는 CDR 서열의 C-말단 부위인 CDR 서열의 결실에 의해 강화될 수 있다. 어떤 CDR 서열이 항원에 결합하는지 결정하기 위해, CDR 서열을 포함하는 합성 펩티드가 당업계에 알려진 임의의 결합 검정 방법(즉, BIA 코어 검정)에 의해서도 항원을 이용한 결합 검정에 사용될 수 있다(예를 들어, [Kabat et al., 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, National Institute of Health, Bethesda, Md]; [Kabat E et al., 1980, J. of Immunology 125 (3):961-969] 참조).
다른 유용한 항체는 항체 분자의 펩신 분해에 의해 생산되는 가변 영역, 경쇄 불변 구간 및 중쇄 CH1 도메인을 포함하는 F(ab')2 단편, 및 F(ab')2 단편의 디술피드 가교를 환원시킴으로써 생성되는 Fab 단편을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 다른 유용한 항체는 항체의 중쇄 및 경쇄 이합체, 또는 Fvs 또는 단일 사슬 항체(SCAs)와 같은 그의 극히 작은 단편 중 어떤 것이나(예를 들면, 미국 특허 제4946778호; [Bird, 1988, Science 242: 423-42]; [Huston et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 5879-5883] ; 및 [Ward et al., 1989, Nature 334: 544-54]에 설명되어있는 바와 같이), 또는 항체와 동일한 특이성을 가지는 다른 임의의 분자이다.
추가적으로, 표준 재조합 DNA 기법을 이용하여 제조될 수 있는 인간 및 비인간 부분 양쪽 모두를 포함하는 키메라 및 인간화 모노클로날 항체와 같은 재조합 항체도 유용한 항체이다. 키메라 항체는 뮤린 모노클로날로부터 유래한 가변 영역 및 인간 이뮤노글로불린 불변 영역을 가지는 항체와 같이 서로 다른 부분이 서로 다른 동물 종에서 유래한 분자이다(예를 들면, 본원에 참고자료로 전문이 포함되어 있는 카빌리 등의 미국특허 제4816567호 및 보스 등의 미국특허 제4,816397호 참조). 인간화 항체는 비인간 종의 하나 이상의 상보성 결정 영역(CDRs) 및 인간 이뮤노글로불린 분자의 프레임워크 영역을 가지는, 비인간종으로부터의 항체 분자이다(예를 들면, 본원에 참고자료로 전문 포함되어 있는 퀸의 미국특허 제5,585,089호 참조). 이러한 키메라 및 인간화 모노클로날 항체는 당업계에 알려진 재조합 DNA 기법, 예를 들어 본원에 참고자료로 전문이 포함된 국제공보 WO 87/02671; 유럽특허공보 제184,187호; 유럽특허공보 제171496호; 유럽특허공보 제173494호; 국제공보 WO 86/01533; 미국특허 제4816567호; 유럽특허공보 제12,023호; [Berter et al., 1988, Science 240: 1041-1043]; [Liu et al., 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 3439-3443]; [Liu et al., 1987, J. Immunol. 139: 3521-3526]; [Sun et al., 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 214-218]; [Nishimura et al., 1987, Cancer. Res. 47: 999-1005]; [Wood et al., 1985, Nature 314: 446-449]; 및 [Shaw et al., 1988, J. Natl. Cancer Inst. 80: 1553-1559]; [Morrison, 1985, Science 229: 1202-1207]; [Oi et al., 1986, BioTechniques 4: 214]; 미국특허 제5225539호; [Jones et al., 1986, Nature 321: 552-525]; [Verhoeyan et al. (1988) Science 239: 1534]; 및 [Beidler et al., l988, J. Immunol. 141: 4053-4060]에 설명된 방법을 이용하여 제조될 수 있다.
완전 인간 항체가 특히 바람직하고, 내인성 이뮤노글로불린 중쇄 및 경쇄 유전자를 발현할 수 없으나 인간 중쇄 및 경쇄 유전자를 발현할 수 있는 트랜스제닉 마우스를 이용하여 생산할 수 있다. 트랜스제닉 마우스는 선택된 항원, 예를 들면 본 발명의 폴리펩티드 전체 또는 일부를 이용하여 일반적인 방법으로 면역화된다. 항원에 대응하는 모노클로날 항체는 종래의 하이브리도마 기술을 이용하여 얻어질 수 있다. 트랜스제닉 마우스에 안착한 인간 이뮤노글로불린 형질전환 유전자는 B 세포 분화 중에 재배열되고, 그후 분류군 바꾸기(class switching) 및 체세포 돌연변이를 겪는다. 따라서 이러한 기법을 이용하여, 치료적으로 유용한 IgG, IgA, IgM 및 IgE 항체를 제조하는 것이 가능하다. 인간 항체를 생산하는 이 기술의 개괄을 위해서 론버그 및 휴스자[1995, Int. Rev. Immunol. 13: 65- 93]를 참조하라. 인간 항체 및 인간 모노클로날 항체를 생산하는 이 기술의 상세한 논의 및 이러한 항체를 생산하는 프로토콜에 대해서는 본원에 참고자료로 전문이 포함된 미국특허 제5625126호; 제 5633425호; 제5569825호; 제5661016호; 및 제5545806호를 참조하라. 다른 인간 항체는 예를 들어 에이비제닉스사(캘리포니아주 프리몬트 소재) 및 젠팜(캘리포니아주 샌 조스 소재)에서 상업적으로 얻을 수 있다.
선택된 에피토프를 인식하는 완전 인간 항체는 "인도된 선택"으로 불리는 기법을 이용하여 생성될 수 있다. 이 접근에서, 선택된 비인간 모노클로날 항체, 예를 들어 마우스 항체는 동일한 에피토프를 인식하는 완전 인간 항체의 선택을 인도하는데 사용된다[Jespers et al. (1994) Biotechnology 12: 899-903]. 인간 항체는 또한 파지 전시 라이브러리를 포함하는 당업계에 알려진 다양한 기법을 이용하여 생산될 수 있다([Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol., 227: 381 (1991)]; [Marks et al., J. Mol. Biol., 222: 581 (1991)]; [Quan, M. P. and Carter, P. 2002. The rise of monoclonal antibodies as therapeutics. In Anti-IgE and Allergic Disease, Jardieu, P. M. and Fick Jr., R. B, eds., Marcel Dekker, New York, NY, Chapter 20, pp.427-469]).
다른 실시양태에서, 항체는 예를 들어 항체가 항체가 아닌 다른 단백질(또는 그의 일부, 바람직하게 단백질의 아미노산 10, 20, 또는 50개 이상인 일부)의 아미노산 서열의 N-말단 또는 C-말단에 공유 결합(즉, 펩티드 결합)을 통해 융합된 것과 같은 기능적으로 활성있는 항체의 융합 단백질, 또는, 그의 단편이다. 바람직하게, 항체 또는 그의 단편은 다른 단백질의 불변 도메인의 N-말단에 공유적으로 연결된다.
항체는 임의의 종류의 분자의 공유적 부착이 항체가 항원 결합 면역특이성을 유지하게 하는 한, 다른 종류의 분자의 그러한 공유적 부착에 의해 변형된 유사체 및 유도체를 포함한다. 예를 들어, 하지만 제한하지 않는 방식으로, 항체의 유도체 및 유사체는 당화, 아세틸화, PEG화, 인산화, 아미드화, 알려진 보호기/차단기에 의한 유도화, 단백질분해성 절단, 세포 항체 단위 또는 다른 단백질과의 연결 등에 의해 추가로 변형된 적이 있는 것들을 포함한다. 수많은 화학 변형 중 임의의 것은 특이적인 화학적 절단, 아세틸화, 포르밀화, 튜니카마이신 존재하의 대사 합성 등을 포함하나 이에 제한되지 않는 알려진 기법에 의해 수행될 수 있다. 또한, 유사체 또는 유도체는 1 이상의 비천연적인 아미노산을 포함할 수 있다.
항체는 Fc 수용체와 상호작용하는 아미노산 잔기에 변형(즉, 치환, 결실 또는 첨가)을 가지는 항체를 포함한다. 특히, 항체는 항-Fc 도메인 및 FcRn 수용체간의 상호작용에 관여하는 것으로 알려진 아미노산 잔기에 변형을 가진 항체를 포함한다(본원에 참고자료로 전문이 포함된 국제공보 WO97/34631 참조). 암세포 항원에 면역특이적인 항체는 예를 들어, 제넨테크(캘리포니아주 샌프란시스코 소재)에서 상업적으로 얻을 수 있거나, 또는 화학적 합성 또는 재조합 발현 기법과 같이 당업자에게 알려진 임의의 방법으로 제조될 수 있다. 암세포 항원에 면역특이적인 항체를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 진뱅크 데이터베이스 또는 그와 같은 데이터 베이스, 문헌으로부터, 또는 통상적인 클로닝 및 시퀀싱에 의해 얻을 수 있다.
특정한 실시양태에서, 암 치료 및 예방을 위한 알려진 항체가 사용될 수 있다. 암세포 항원에 면역특이적인 항체는 상업적으로 얻거나 또는 재조합 발현 기법과 같이 당업자에게 알려진 임의의 방법에 의해 생산될 수 있다. 암세포 항원에 면역특이적인 항체를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 진뱅크 데이터베이스 또는 그와 같은 데이터베이스, 문헌으로부터, 또는 통상의 클로닝 및 시퀀싱에 의해 얻어질 수 있다. 암 치료에 이용가능한 항체의 예는 인간화된 항-HER2 모노클로날 항체, 전이성 유방암 환자의 치료를 위한 헤르셉틴®(제넨테크사의 트라츠주마브); 비-호지킨 림프종 환자의 치료를 위한 항-CD20 키메라 모노클로날 항체인 리턱산®(제넨테크사의 리턱시마브); 난소암의 치료를 위한 뮤린 항체인 오바렉스(마이애미주 소재 알타렉스 주식회사); 결장암 치료를 위한 뮤린 IgG2a 항체인 파노렉스(노스캐롤라이나주 소재 글락소 웰컴); 두부 및 목의 암과 같은 상피성장인자 양성암의 치료를 위한 항-EGFR IgG 키메라 항체인 세턱시마브 에르비턱스(뉴욕주 소재 임클론 시스템즈사); 육종의 치료를 위한 인간화 항체인 비탁신(매릴랜드주 소재 메드이뮨사); 만성림프구백혈병(CLL)의 치료를 위한 인간화된 IgG1 항체인 캠패쓰 I/H(매사츄세츠주 소재 루코사이트); 급성골수성백혈병(AML)의 치료를 위한 인간화된 항-CD33 IgG 항체인 스마트 MI95(캘리포니아주 소재 프로테인 디자인 랩사); 비-호지킨 림프종의 치료를 위한 인간화된 항-CD22 IgG 항체인 림포사이드(뉴저지주 소재 이뮤노메딕스사); 비-호지킨 림프종의 치료를 위한 인간화된 항-HLA-DR 항체인 스마트 ID10(캘리포니아주 소재 프로테인 디자인 랩사); 비-호지킨 림프종의 치료를 위한 방사성 표지된 뮤린 항-HLA-Dr10 항체인 옹코림(캘리포니아주 소재 테크니클론사); 호지킨병 또는 비-호지킨 림프종의 치료를 위한 인간화된 항-CD2 mAb인 올로뮨(캘리포니아주 소재 바이오트랜스플랜트); 폐암 및 결장암의 치료를 위한 항-VEGF 인간화 항체인 아바스틴(캘리포니아주 소재 제넨테크사); 비-호지킨 림프종의 치료를 위한 항-CD22 항체인 에프라투자마브(뉴저지주 소재 이뮤노메딕스사 및 캘리포니아주 소재 암젠); 및 결장암의 치료를 위한 인간화된 항-CEA 항체인 CEA사이드(뉴저지주 소재 이뮤노메딕스)를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
암 치료에 유용한 다른 항체들로는 CA125 (난소), CA15-3 (암종), CA19-9 (암종), L6 (암종), 루이스 Y (암종), 루이스 X (암종), 알파 태아단백질 (암종), CA 242 (결장), 태반 알칼리인산분해효소 (암종), 전립선 특이적 항원 (전립선), 전립선산 인산효소 (전립선), 상피성장인자 (암종), MAGE-1 (암종), MAGE-2 (암종), MAGE-3 (암종), MAGE-4 (암종), 항-트랜스페린 수용체 (암종), p97 (흑색종), MUC1-KLH (유방암), CEA (결장), gplO0 (흑색종), MART1 (흑색종), PSA (전립선), IL-2 수용체 (T세포 백혈병 및 림프종), CD20 (비-호지킨 림프종), CD52 (백혈병), CD33 (백혈병), CD22 (림프종), 인간 융모성 성선자극호르몬 (암종), CD38 (다발 골수종), CD40 (림프종), 뮤신 (암종), P21 (암종), MPG (흑색종), 및 Neu 종양유전자 생성물 (암종)과 같은 항원에 대한 항체를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 몇몇 특정한, 유용한 항체는 BR96 mAb [Trail, P. A., Willner, D., Lasch, S. J., Henderson, A. J., Hofstead, S. J., Casazza, A. M., Firestone, R. A., Hellstroem, I., Hellstroem, K. E., "Cure of Xenografted Human Carcinomas by BR96-Doxorubicin Immunoconjugates" Science 1993, 261, 212-215], BR64 [Trail, PA, Willner, D, Knipe, J., Henderson, A. J., Lasch, S. J., Zoeckler, M. E., Trailsmith, M. D., Doyle, T. W., King, H. D., Casazza, A. M., Braslawsky, G. R., Brown, J. P., Hofstead, S. J., Greenfield, R. S., Firestone, R. A., Mosure, K., Kadow, D. F., Yang, M. B., Hellstrom, K. E., and Hellstrom, I. "Effect of Linker Variation on the Stability, Potency, and Efficacy of Carcinoma-reactive BR64-Doxorubicin Immunoconjugates" Cancer Research 1997, 57, 100-105], CD40 항원에 대한 mAbs, 예를 들어 S2C6 mAb [Francisco, J. A., Donaldson, K. L., Chace, D., Siegall, C. B., and Wahl, A. F. "Agonistic properties and in vivo antitumor activity of the anti-CD-40 antibody, SGN-14" Cancer Res. 2000, 60, 3225-3231], CD70 항원에 대한 mAbs, 예를 들어 1F6 mAb 및 2F2 mAb, 및 CD30 항원에 대한 mAbs, 예를 들어 AC10 ([Bowen, M. A., Olsen, K.J., Cheng, L., Avila, D., and Podack, E.R. "Functional effects of CD30 on a large granular lymphoma cell line YT" J. Immunol., 151, 5896-5906, 1993]; [Wahl et al., 2002 Cancer Res. 62(13): 3736-42])을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 종양 관련 항원에 결합하는 많은 다른 내재화 항체가 사용될 수 있고, 검토되어왔다([Franke, A. E., Sievers, E. L., and Scheinberg, D. A., "Cell surface receptor-targeted therapy of acute myeloid leukemia: a review" Cancer Biother Radiopharm. 2000, 15, 459-76]; [Murray, J. L., "Monoclonal antibody treatment of solid tumors: a coming of age" Semin Oncol. 2000, 27, 64-70]; [Breitling, F., and Dubel, S., Recombinant antibodies, John Wiley, and Sons, New York, 1998]).
특정 실시양태에서, 항체는 트라츠주마브 (전체 길이, 인간화된 항-HER2 (MW 145167)), 헤르셉틴F(ab')2 (항-HER2로부터 효소적으로 얻어짐(MW 100000)), 4D5 (전체 길이, 뮤린 항HER2, 하이브리도마로부터 유래됨), rhu4D5 (일시적으로 발현되는, 전체 길이 인간화 항체), rhuFab4D5 (재조합 인간화된 Fab(MW 47738)), 4D5Fc8 (전체 길이, 뮤린 항HER2, 돌연변이된 FcRn 결합 도메인을 가짐), 또는 Hg ("무힌지" 전체 길이 인간화된 4D5, 중쇄 경첩 시스테인이 세린으로 돌연변이됨. 이 콜라이에서 발현됨(따라서 글리코실화되지 않음))가 아니다.
다른 특정한 실시양태에서, 자가 면역 질환의 치료 또는 예방을 위한 알려진 항체는 본 발명의 조성물 및 방법에 따라 사용된다. 자가 면역 항체 생산을 담당하는 세포의 항원에 대해 면역특이적인 항체들은 임의의 기관(즉, 대학 과학자 또는 회사)으로부터 입수할 수 있거나, 또는 화학적 합성 또는 재조합 발현 기법과 같이 당업자에게 알려진 임의의 방법에 의하여 생산될 수 있다. 다른 실시양태에서, 자가 면역 질환의 치료에 면역특이적인 유용한 항체는 항-핵 항체; 항-dsDNA; 항-ssDNA, 항-카디올리핀 항체 IgM, IgG; 항-인지질 항체 IgM, IgG; 항-SM 항체; 항-미토콘드리아 항체; 티로이드 항체; 마이크로솜 항체; 티로글로불린 항체; 항-SCL-70; 항-Jo; 항-U1RNP ; 항-La/SSB; 항 SSA; 항-SSB; 항-Perital 세포 항체; 항-히스톤; 항-RNP; C-ANCA; P-ANCA; 항 동원체 ; 항-피브릴라린, 및 항-GBM 항체를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
특정 실시양태에서, 유용한 항체는 활성화된 림프구 상에서 발현되는 수용체 또는 수용체 복합체 양쪽 모두에 결합할 수 있다. 수용체 또는 수용체 복합체는 이뮤노글로불린 유전자 상과 구성원, TNF 수용체 상과 구성원, 인테그린, 시토카인 수용체, 케모카인 수용체, 주요 조직적합 단백질, 렉틴, 또는 보체 조절 단백질을 포함할 수 있다. 적절한 이뮤노글로불린 상과 구성원의 제한하지 않는 예는 CD2, CD3, CD4, CD8, CD19, CD22, CD28, CD79, CD90, CD152/CTLA-4, PD-1, 및 ICOS이다. 적절한 TNF 수용체 상과 구성원의 제한하지 않는 예는 CD27, CD40, CD95/Fas, CD134/OX40, CD137/4-1BB, TNFR-1, TNFR-2, RANK, TACI, BCMA, 오스테오프로테게린, Apo2/TRAIL-Rl, TRAIL-R2, TRAIL-R3, TRAIL-R4, 및 APO-3이다. 적절한 인테그린의 제한하지 않는 예는 CD11a, CD11b, CD11c, CD18, CD29, CD41, CD49a, CD49b, CD49c, CD49d, CD49e, CD49f, CD103, 및 CD104이다. 적절한 렉틴의 제한하지 않는 예는 C형, S형, 및 I형 렉틴이다.
한 실시양태에서, 리간드는 자가 면역 질환과 연관된 활성화된 림프구에 결합한다.
다른 특정한 실시양태에서, 바이러스 또는 미생물 항원에 면역특이적인 유용한 리간드는 모노클로날 항체이다. 항체는 키메라, 인간화된 또는 인간 모노클로날 항체일 수 있다. 본원에서 사용될 때, "바이러스 항원"이라는 용어는 면역반응을 유발할 수 있는 임의의 바이러스 펩티드, 폴리펩티드 단백질(즉, HIV gpl20, HIV nef, RSV F 당단백질, 인플루엔자 바이러스 뉴라미니다아제, 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌, HTLV tax, 단순 헤르페스 바이러스 당단백질(예를 들면, gB, gC, gD, 및 gE) 및 B형 간염 표면 항원)을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 본원에서 사용될 때, "미생물 항원"이라는 용어는 면역 반응을 유발할 수 있는 임의의 미생물 펩티드, 폴리펩티드, 단백질, 당류, 다당류, 또는 지질 분자(즉, 박테리아, 진균류, 병원성 원생동물, 또는 LPS 및 캡슐 다당류 5/8을 포함하는 효모 폴리펩티드)를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
바이러스 또는 미생물 항원에 면역특이적인 항체는 예를 들어 BD 바이오사이언스(캘리포니아주 샌프란시스코 소재), 케미콘 인터내셔널사(캘리포니아주 테메큘라 소재), 또는 벡터 래버러토리즈사(캘리포니아주 벌링엄 소재)에서 상업적으로 얻을 수 있거나, 또는 화학적 합성 또는 재조합 발현 기법과 같이 당업자에게 알려진 임의의 방법에 의해 생산될 수 있다. 바이러스 또는 미생물 항원에 면역특이적인 항체를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 진뱅크 데이터베이스 또는 그와 같은 데이터베이스, 문헌으로부터, 또는 통상의 클로닝 및 시퀀싱에 의해 얻을 수 있다.
특정한 실시양태에서, 유용한 리간드는 본원에 개시된 방법에 따른 바이러스 또는 미생물 감염의 치료 또는 예방에 유용한 것들이다. 바이러스 감염 또는 미생물 감염의 치료에 유용한 이용가능한 항체의 예는 호흡기세포융합바이러스(RSV) 감염 환자의 치료에 유용한 인간화된 항-RSV 모노클로날 항체인 시나지스(매릴랜드주 소재 메드이뮨사), HIV 감염의 치료에 유용한 CD4 융합 항체인 PRO542(프로제닉스); B형 간염 바이러스의 치료에 유용한 인간 항체인 오스타비르(캘리포니아주 소재 프로테인 디자인 랩 사), 시토메갈로바이러스(CMV)의 치료에 유용한 인간화된 IgG1 항체인 프로토비르(캘리포니아주 소재 프로테인 디자인 랩 사); 및 항-LPS 항체를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
감염성 질병의 치료에 유용한 다른 항체는 박테리아의 병원성 균주 (스트렙토코커스 파이오진스(Streptococcus pyogenes), 스트렙토코커스 뉴모니아(Streptococcus pneumoniae), 네이저리아 고너리아(Neisseria gonorrheae), 네이저리아 메닌지티디스(Neisseria meningitidis), 코리네박테리움 디프테리아(Corynebacterium diphtheriae), 클로스트리디움 보툴리눔(Clostridium botulinum), 클로스트리디움 퍼프링엔스(Clostridium perfringens), 클로스트리디움 테타니(Clostridium tetani), 헤모필러스 인플루엔자(Hemophilus influenzae), 클레브시엘라 뉴모니아(Klebsiella pneumoniae), 클레브시엘라 오재나(Klebsiella ozaenas), 클레브시엘라 리노스클레로모티스(Klebsiella rhinoscleromotis), 스타필로코크 어레우스(Staphylococc aureus), 비브리오 콜레라(Vibrio colerae), 에쉐리히아 콜라이(Escherichia coli), 슈도모나스 애루지노사(Pseudomonas aeruginosa), 캠파일로박터 (비브리오) 페터스(Campylobacter ( Vibrio ) fetus), 에어로모나스 히드로필라(Aeromonas hydrophila), 바실러스 세레우스(Bacillus cereus), 에드워드시엘라 타르다(Edwardsiella tarda), 예르시니아 엔테로콜리티카(Yersinia enterocolitica), 예르시니아 페스티스(Yersinia pestis), 예르시니아 슈도튜버큘로시스(Yersinia pseudotuberculosis), 쉬겔라 디센터리아(Shigella dysenteriae), 쉬겔라 플렉스너리(Shigella flexneri), 쉬겔라 손네이(Shigella sonnei), 살모넬라 티피무리움(Salmonella typhimurium), 트레포네마 팔리덤(Treponema pallidum), 트레포네마 퍼테뉴(Treponema pertenue), 트레포네마 카라테늄(Treponema carateneum), 보렐리아 빈센티(Borrelia vincentii), 보렐리아 부르그도르페리(Borrelia burgdorferi), 렙토스피라 익테로헤모라지아(Leptospira icterohemorrhagiae), 미코박테리움 튜버큘로시스(Mycobacterium tuberculosis), 뉴모시스티스 카리니(Pneumocystis carinii), 프란시셀라 툴라렌시스(Francisella tularensis), 브루셀라 아버투스(Brucella abortus), 브루셀라 수이스(Brucella suis), 브루셀라 멜리텐시스(Brucella melitensis), 미코플라즈마 종(Mycoplasma spp.), 리켓치아 프로와제키(Rickettsia prowazeki), 리켓치아 츄츄구무시(Rickettsia tsutsugumushi), 클라마이디아 종(Chlamydia spp.)); 병원성 진균류 (코키디오이데스 이미티스(Coccidioides immitis), 아스페르길러스 푸미가터스(Aspergillus fumigatus), 칸디다 알비칸스(Candida albicans), 블라스토미세스 더마티티디스(Blastomyces dermatitidis), 크립토코커스 네오포만스(Cryptococcus neoformans), 히스토플라스마 캡슐라툼(Histoplasma capsulatum)); 원생동물 (엔토모에바 히스톨리티카(Entomoeba histolytica), 톡소플라스마 곤디(Toxoplasma gondii), 트리초모나스 테나스(Trichomonas tenas), 트리초모나스 호미니스(Trichomonas hominis), 트리초모나스 바지날리스(Trichomonas vaginalis), 트리오아노소마 잠비엔스(Tryoanosoma gambiense), 트리파노소마 로데시엔스( Trypanosoma rhodesiense), 트리파노소마 크루지(Trypanosoma cruzi), 레이슈마니아 도노바니(Leishmania donovani), 레이슈마니아 트로피카(Leishmania tropica), 레이슈마니아 브라질리엔시스(Leishmania braziliensis), 뉴모시스티스 뉴모니아(Pneumocystis pneumonia), 플라스모디움 비박스(Plasmodium vivax), 플라스모디움 팔시파룸(Plasmodium falciparum), 플라스모디움 말라리아(Plasmodium malaria)); 또는 연충 (엔테로비우스 버미큘라리스(Enterobius vermicularis), 트리추리스 트리츄라(Trichuris trichiura), 아스카리스 럼브리코이즈(Ascaris lumbricoides), 트리치넬라 스피랄리스(Trichinella spiralis), 스트롱일로이즈 스터코랄리스( Strongyloides stercoralis), 쉬스토소마 자포니쿰(Schistosoma japonicum), 쉬스토소마 만소니(Schistosoma mansoni), 쉬스토소마 해마토비움(Schistosoma haematobium), 및 구충)으로부터의 항원에 대한 항체를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
바이러스성 질병의 치료를 위한 본 발명의 다른 유용한 항체는 폭스바이러스 과(科), 헤르페스바이러스과, 단순 헤르페스 바이러스 1, 단순 헤르페스 바이러스 2, 아데노바이러스과, 파포바바이러스과, 엔테로바이러스과, 피코나바이러스과, 파보바이러스과, 레오바이러스과, 레트로바이러스과, 인플루엔자 바이러스, 파라인플루엔자 바이러스, 유행이하선염, 홍역, 호흡기세포융합바이러스, 풍진, 아보바이러스과, 랩도바이러스과, 아레나바이러스과, A형 간염바이러스, B형 간염바이러스, C형 간염바이러스, E형 간염바이러스, A/B이외간염바이러스, 리노바이러스과, 코로나바이러스과, 로토바이러스과, 및 인간면역결핍바이러스를 예로 하나 이에 제한되지 않는 병원성 바이러스의 항원에 대한 항체를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
암 진단 및 치료법을 위한 효과적인 세포 표적을 발견하려는 시도에서, 연구자들은 1종 이상의 정상 비암성 세포와 비교했을 때 1종 이상의 특정 유형의 암세포의 표면에서 특이적으로 발현되는 막횡단 또는 종양-관련된 폴리펩티드를 밝혀내려고 해왔다. 종종, 이러한 종양-관련된 폴리펩티드들은 비-암성 세포의 표면상에 비해 암세포의 표면상에 더욱 풍부하게 발현된다. 이러한 종양-관련된 세포 표면 항원 폴리펩티드의 확인은 항체-기반 치료법을 통한 표적 암세포를 특이적으로 파괴하는 것을 가능하게 했다.
식 Ⅰc 항체 약물 접합체(ADC)의 Ab를 포함하며 암 치료에 유용할 수 있는 항체는 종양 관련 항원(TAA)에 대한 항체를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 이러한 종양 관련 항원은 당업계에 알려져 있고, 당업계에 잘 알려진 방법 및 정보를 이용하여 항체를 생성하는 용도로 제조될 수 있다. TAA의 예는 (1) 내지 (35)를 포함하나, 아래 열거된 TAA (1) 내지 (35)에 제한되지 않는다. 편의를 위해, 당업계에 모두 알려진 이러한 항원에 관한 정보를 아래에 열거했고, 명칭, 대체 명칭, 진뱅크 수탁 번호 및 일차적 참조문헌을 포함한다. 항체의 표적이 되는 종양-관련된 항원은 열거된 대응 서열(서열 번호: 1 내지 35)에서 확인되는 서열 또는 언급된 참조에서 확인되는 서열과 비교하여 약 70％, 80％, 85％, 90％, 또는 95％ 이상의 서열 동일성을 가지는 모든 아미노산 서열 변이 및 이소형을 포함한다. 특정 실시양태에서, 아미노산 서열 변이를 가지는 TAA는 열거된 대응 서열(서열 번호: 1 내지 35)에서 발견되는 서열을 가지는 TAA와 실질적으로 동일한 생물학적 성질 또는 특성을 나타낸다. 예를 들어, 변이 서열을 가지는 TAA는 일반적으로 열거된 대응 서열을 가지는 TAA에 특이적으로 결합하는 항체에 특이적으로 결합할 수 있다. 본원에 구체적으로 열거된 서열 및 개시내용은 참고자료로 명백히 포함되었다.
종양-관련된 항원 (1) 내지 (35) :
(1) BMPRIB (골 형태형성 단백질 수용체-IB형, 진뱅크 수탁 번호 NM_001203, [ten Dijke, P., et al. Science 264 (5155): 101-104 (1994)], [Oncogene 14(11) : 1377-1382 (1997)]); WO2004063362 (청구항 2); WO2003042661 (청구항 12); US2003134790-A1 (38-39 쪽); WO2002102235 (청구항 13; 296 쪽); WO2003055443 (91-92 쪽); WO200299122 (실시예 2; 528-530 쪽); WO2003029421 (청구항 6); WO2003024392 (청구항 2; 도 112); WO200298358 (청구항 1; 183 쪽); WO200254940 (100-101 쪽) ; WO200259377 (349-350 쪽); WO200230268 (청구항 27; 376 쪽); WO200148204 (실시예; 도 4)
NP_001194 골 형태형성 단백질 수용체, IB형/pid=NP_001194.1 -
상호참조: MIM: 603248; NP_001194.1; NM_001203_1
아미노산 502 개
Figure 112013088873035-pat00087
(서열 번호: 1)
(2) E16 (LAT1, SLC7A5, 진뱅크 수탁 번호 NM_003486);
[Biochem. Biophys. Res. Commun. 255 (2), 283-288 (1999)], [Nature 395 (6699): 288-291(1998)], [Gaugitsch, H. W., et al. (1992) J. Biol. Chem. 267 (16): 11267-11273]); WO2004048938 (실시예 2); WO2004032842 (실시예 Ⅳ); WO2003042661 (청구항 12); WO2003016475 (청구항 1); WO200278524 (실시예 2); WO200299074 (청구항 19; 127-129 쪽); WO200286443 (청구항 27; 222,393 쪽) ; WO2003003906 (청구항 10; 293 쪽); WO200264798 (청구항 33; 93-95 쪽) ; WO200014228 (청구항 5; 133-136 쪽); US2003224454 (도 3); WO2003025138 (청구항 12; 150 쪽);
NP_003477 용질 담체 족 7 (양이온성 아미노산 전달체, y+ 계), 5 원/pid=NP_003477.3 - 호모 사피엔스
상호참조: MIM: 600182; NP_003477.3; NM_015923 ; NM_003486_1
아미노산 507 개
Figure 112013088873035-pat00088
(서열 번호: 2)
(3) STEAP1 (전립선의 6개의 막횡단 상피 항원, 진뱅크 수탁 번호 NM_012449
[Cancer Res. 61 (15), 5857-5860(2001)], [Hubert, R. S., et al. (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 96 (25): 14523-14528]); WO2004065577 (청구항 6); WO2004027049 (도 1L); EP1394274 (실시예 11); WO2004016225 (청구항 2); WO2003042661 (청구항 12); US2003157089 (실시예 5); US2003185830 (실시예 5); US2003064397 (도 2); WO200289747 (실시예 5; 618-619 쪽); WO2003022995 (실시예 9; 도 13A, 실시예 53; 173 쪽, 실시예 2; 도 2A);
NP_036581 전립선의 6개의 막횡단 상피 항원
상호참조: MIM: 604415; NP_036581.1; NM_012449_1
아미노산 339 개
Figure 112013088873035-pat00089
(서열 번호: 3)
(4) 0772P (CA125, MUC16, 진뱅크 수탁 번호 AF361486
[J. Biol. Chem. 276 (29): 27371-27375 (2001)]); WO2004045553 (청구항 14); WO200292836 (청구항 6; 도 12); WO200283866 (청구항 15; 116-121 쪽); US2003124140 (실시예 16); US2003091580 (청구항 6); WO200206317 (청구항 6; 400-408 쪽);
상호참조: GI: 34501467; AAK74120.3; AF361486_1
아미노산 6995 개
Figure 112013088873035-pat00090
Figure 112013088873035-pat00091
Figure 112013088873035-pat00092
(서열 번호: 4)
(5) MPF (MPF, MSLN, SMR, 거대핵세포 강화 인자, 메소텔린, 진뱅크 수탁 번호 NM_005823
[Yamaguchi, N., et al. Biol. Chem. 269(2), 805-808 (1994)], [Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 96 (20): 11531-11536 (1999)], [Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 93 (1): 136-140 (1996)], [J. Biol. Chem. 270 (37): 21984-21990 (1995)]); WO2003101283 (청구항 14); WO2002102235 (청구항 13; 287-288 쪽); WO2002101075 (청구항 4; 308-309 쪽); WO200271928 (320-321 쪽); WO9410312 (52-57 쪽);
상호참조: MIM: 601051; NP_005814.2; NM_005823_1
아미노산 622 개
Figure 112013088873035-pat00093
(서열 번호: 5)
(6) Napi3b (NAPI-3B, NPTⅡb, SLC34A2, 용질 담체 족 34 (인산나트륨), 2 원, 제Ⅱ형 나트륨-의존 포스페이트 전달체 3b, 진뱅크 수탁 번호 NM_006424,
[J. Biol. Chem. 277 (22): 19665-19672 (2002)], [Genomics 62 (2): 281-284 (1999)], [Feild, J. A., et al. (1999) Biochem. Biophys. Res. Commun. 258 (3): 578-582)]; WO2004022778 (청구항 2); EP1394274 (실시예 11); WO2002102235 (청구항 13; 326 쪽); EP875569 (청구항 1 ; 17-19 쪽) ; WO200157188 (청구항 20; 329 쪽); WO2004032842 (실시예 Ⅳ); WO200175177 (청구항 24; 139-140 쪽);
상호참조: MIM: 604217; NP_006415.1; NM_006424_1
아미노산 690 개
Figure 112013088873035-pat00094
(서열 번호: 6)
(7) Sema 5b (FLJ10372, KIAA1445, Mm.42015, SEMA5B, SEMAG, 세마포린 5b Hlog, 세마 도메인, 7개의 트롬보스폰딘 반복체 (제1형 및 유사 제1형), 막횡단 도메인 (TM) 및 짧은 세포질 도메인, (세마포린) 5B, 진뱅크 수탁 번호 AB040878,
[Nagase T., et al. (2000) DNA Res. 7 (2): 143-150]); WO2004000997 (청구항 1); WO2003003984 (청구항 1); WO200206339 (청구항 1; 50 쪽); WO200188133 (청구항 l; 41-43, 48-58 쪽); WO2003054152 (청구항 20); WO2003101400 (청구항 11);
수탁: Q9P283; EMBL; AB040878 ; BAA95969.1. Genew; HGNC: 10737;
아미노산 1093 개
Figure 112013088873035-pat00095
(서열 번호: 7)
(8) PSCA hlg (2700050C12Rik, C530008O16Rik, RIKEN cDNA 2700050C12, RIKEN cDNA 2700050C12 유전자, 진뱅크 수탁 번호 AY358628);
US2003129192 (청구항 2); US2004044180 (청구항 12); US2004044179 (청구항 11); US2003096961 (청구항 11) ; US2003232056 (실시예 5); WO2003105758 (청구항 12); US2003206918 (실시예 5); EP1347046 (청구항 1); WO2003025148 (청구항 20);
상호참조: GI: 37182378; AAQ88991.1; AY358628_1
아미노산 141 개
Figure 112013088873035-pat00096
(서열 번호: 8)
(9) ETBR (엔도텔린 B형 수용체, 진뱅크 수탁 번호 AY275463);
[Nakamuta M., et al. Biochem. Biophys. Res. Commun. 177, 34-39, 1991]; [Ogawa Y., et al. Biochem. Biophys. Res. Commun. 178, 248-255, 1991]; [Arai H., et al. Jpn. Circ. J. 56, 1303-1307, 1992]; [Arai H., et al. J. Biol. Chem. 268, 3463-3470, 1993]; [Sakamoto A., Yanagisawa M., et al. Biochem. Biophys. Res. Commun. 178, 656-663, 1991]; [Elshourbagy N. A., et al. J. Biol. Chem. 268, 3873-3879, 1993]; [Haendler B., et al. J. Cardiovasc. Pharmacol. 20, s1-S4, 1992]; [Tsutsumi M., et al. Gene 228, 43-49, 1999]; [Strausberg R. L., et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 99, 16899-16903, 2002]; [Bourgeois C., et al. J. Clin. Endocrinol. Metab. 82, 3116-3123, 1997]; [Okamoto Y., et al. Biol. Chem. 272, 21589-21596, 1997]; [Verheij J. B., et al. Am. J. Med. Genet. 108, 223-225, 2002]; [Hofstra R.M.W., et al. Eur. J. Hum. Genet. 5, 180-185, 1997]; [Puffenberger E. G., et al. Cell 79, 1257-1266, 1994]; [Attie T., et al, Hum. Mol. Genet. 4, 2407-2409, 1995]; [Auricchio A., et al. Hum. Mol. Genet. 5: 351-354, 1996]; [Amiel J., et al. Hum. Mol. Genet. 5, 355-357, 1996]; [Hofstra R.M.W., et al. Nat. Genet. 12, 445-447, 1996]; [Svensson P. J., et al. Hum. Genet. 103, 145-148, 1998]; [Fuchs S., et al. Mol. Med. 7, 115-124, 2001]; [Pingault V., et al. (2002) Hum. Genet. 111, 198-206]; WO2004045516 (청구항 1); WO2004048938 (실시예 2); WO2004040000 (청구항 151); WO2003087768 (청구항 1); WO2003016475 (청구항 1); WO200261087 (도 1); WO2003016494 (도 6); WO2003025138 (청구항 12; 144 쪽); WO200198351 (청구항 1; 124-125 쪽); EP522868 (청구항 8; 도 2); WO200177172 (청구항 1; 297-299 쪽); US2003109676; US6518404 (도 3); US5773223 (청구항 1a; Col 31-34); WO2004001004;
아미노산 442 개
Figure 112013088873035-pat00097
(서열 번호: 9)
(10) MSG783 (RNF124, 가상 단백질 FLJ20315, 진뱅크 수탁 번호 NM_017763) ;
WO2003104275 (청구항 1); WO2004046342 (실시예 2); WO2003042661 (청구항 12); WO2003083074 (청구항 14; 61 쪽); WO2003018621 (청구항 1); WO2003024392 (청구항 2; 도 93); WO200166689 (실시예 6);
상호참조: LocusID: 54894; NP_060233.2; NM_017763_1
아미노산 783 개
Figure 112013088873035-pat00098
(서열 번호: 10)
(11) STEAP2 (HGNC_8639, IPCA-1, PCANAP1, STAMP1, STEAP2, STMP, 전립선암 관련 유전자 1, 전립선암 관련 단백질 1, 전립선의 6개의 막횡단 상피 항원 2, 6개의 막횡단 전립선 단백질, 진뱅크 수탁 번호 AF455138,
[Lab. Invest. 82 (11):1573-1582 (2002)]); WO2003087306; US2003064397 (청구항 1; 도 1); WO200272596 (청구항 13; 54-55 쪽) ; WO200172962 (청구항 1; 도 4B); WO2003104270 (청구항 11); WO2003104270 (청구항 16); US2004005598 (청구항 22); WO2003042661 (청구항 12); US2003060612 (청구항 12; 도 10); WO200226822 (청구항 23; 도 2); WO200216429 (청구항 12; 도 10);
상호참조: GI: 22655488; AAN04080.1; AF455138_1
아미노산 490 개
Figure 112013088873035-pat00099
(서열 번호: 11)
(12) TrpM4 (BR22450, FLJ20041, TRPM4, TRPM4B, 일시적 수용체 잠재적 양이온 채널, M 아족, 4 원, 진뱅크 수탁 번호 NM_017636
[Xu, X. Z., et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 98 (19): 10692-10697 (2001)], [Cell 109 (3): 397-407 (2002)], [J. Biol. Chem.278 (33): 30813-30820 (2003)]); US2003143557 (청구항 4); WO200040614 (청구항 14; 100-103 쪽); WO200210382 (청구항 1; 도 9A); WO2003042661 (청구항 12); WO200230268 (청구항 27; 391 쪽); US2003219806 (청구항 4); WO200162794 (청구항 14; 도 1A 내지 D);
상호참조: MIM: 606936; NP_060106.2; NM_017636_1
아미노산 1214 개
Figure 112013088873035-pat00100
(서열 번호: 12)
(13) CRIPTO (CR, CR1, CRGF, CRIPTO, TDGF1, 기형암종-유래 성장인자, 진뱅크 수탁 번호 NP_003203 또는 NM_003212,
[Ciccodicola, A., et al. EMBO J. 8 (7): 1987-1991 (1989)], [Am. J. Hum. Genet. 49 (3): 555-565(1991)]); US2003224411 (청구항 1); WO2003083041 (실시예 1); WO2003034984 (청구항 12); WO200288170 (청구항 2; 52-53 쪽); WO2003024392 (청구항 2; 도 58); WO200216413 (청구항 1; 94-95 쪽, 105 쪽); WO200222808 (청구항 2; 도 1); US5854399 (실시예 2; Col 17-18); US5792616 (도 2);
상호참조: MIM: 187395; NP_003203.1; NM_003212_1
아미노산 188 개
Figure 112013088873035-pat00101
(서열 번호: 13)
(14) CD21 (CR2 (보체 수용체 2) 또는 C3DR (C3d/엡스타인 바 바이러스 수용체) 또는 Hs.73792 진뱅크 수탁 번호 M26004,
[Fujisaku et al. (1989) J. Biol. Chem. 264 (4): 2118-2125]); [Weis J. J., et al. J. Exp. Med. 167, 1047-1066, 1988]; [Moore M., et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 84, 9194-9198, 1987]; [Barel M., et al. Mol. Immunol. 35, 1025-1031, 1998]; [Weis J. J., et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 83, 5639-5643, 1986]; [Sinha S. K., et al. (1993) J. Immunol. 150, 5311-5320]; WO2004045520 (실시예 4); US2004005538 (실시예 1); WO2003062401 (청구항 9); WO2004045520 (실시예 4); WO9102536 (도 9.1-9.9); WO2004020595 (청구항 1);
수탁 : P20023; Q13866; Q14212; EMBL; M26004; AAA35786.1.
아미노산 1033 개
Figure 112013088873035-pat00102
(서열 번호: 14)
(15) CD79b (CD79B, CD79β, IGb (이뮤노글로불린-연관 베타), B29, 진뱅크 수탁 번호 NM_000626 또는 11038674,
[Proc. Natl. Acad. Sci. USA. (2003) 100 (7): 4126-4131], [Blood (2002) 100 (9): 3068-3076], [Muller et al. (1992) Eur. J. Immunol. 22 (6): 1621-1625]); WO2004016225 (청구항 2, 도 140); WO2003087768, US2004101874 (청구항 1, 102 쪽); WO2003062401 (청구항 9); WO200278524 (실시예 2); US2002150573 (청구항 5, 15 쪽); US5644033; WO2003048202 (청구항 1, 306 및 309 쪽); WO99/558658, US6534482 (청구항 13, 도 17A/B); WO200055351 (청구항 11, 1145-1146 쪽);
상호참조: MIM: 147245; NP_000617.1; NM_000626_1
아미노산 229 개
Figure 112013088873035-pat00103
(서열 번호: 15)
(16) FcRH2 (IFGP4, IRTA4, SPAP1A (SH2 도메인 함유 포스파타아제 고정 단백질 1a), SPAP1B, SPAP1C, 진뱅크 수탁 번호 NM_030764,
[Genome Res. 13(10) : 2265-2270 (2003)], [Immunogenetics 54 (2): 87-95 (2002)], [Blood 99 (8): 2662-2669 (2002)], [Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 98 (17): 9772-9777 (2001)], [Xu, M. J., et al. (2001) Biochem. Biophys. Res. Commun. 280 (3): 768-775]; WO2004016225 (청구항 2); WO2003077836; WO200138490 (청구항 5; 도 18D-1 내지 18D-2); WO2003097803 (청구항 12); WO2003089624 (청구항 25);
상호참조: MIM: 606509; NP_110391.2; NM_030764_1
아미노산 508 개
Figure 112013088873035-pat00104
(서열 번호: 16)
(17) HER2 (ErbB2, 진뱅크 수탁 번호 M11730, [Coussens L., et al. Science (1985) 230(4730): 1132-1139]); [Yamamoto T., et al. Nature 319, 230-234, 1986]; [Semba K., et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 82, 6497-6501, 1985]; [Swiercz J. M., et al. J. Cell Biol. 165, 869-880, 2004]; [Kuhns J. J., et al. J. Biol. Chem. 274, 36422-36427, 1999]; [Cho H.-S., et al. Nature 421, 756-760, 2003]; [Ehsani A., et al. (1993) Genomics 15, 426-429]; WO2004048938 (실시예 2); WO2004027049 (도 1Ⅰ) ; WO2004009622; WO2003081210; WO2003089904 (청구항 9); WO2003016475 (청구항 1); US2003118592; WO2003008537 (청구항 1); WO2003055439 (청구항 29; 도 1A 내지 B) ; WO2003025228 (청구항 37; 도 5C); WO200222636 (실시예 13; 95-107 쪽); WO200212341 (청구항 68; 도 7); WO200213847 (71-74 쪽); WO200214503 (114-117 쪽) ; WO200153463 (청구항 2; 41-46 쪽); WO200141787 (15 쪽); WO200044899 (청구항 52; 도 7); WO200020579 (청구항 3; 도 2); US5869445 (청구항 3; Col 31-38); WO9630514 (청구항 2; 56-61 쪽); EP1439393 (청구항 7); WO2004043361 (청구항 7); WO2004022709; WO200100244 (실시예 3; 도 4);
수탁 : P04626; EMBL; M11767 ; AAA35808.1. EMBL; M11761 ; AAA35808.1.
아미노산 1255 개
Figure 112013088873035-pat00105
(서열 번호: 17)
(18) NCA (CEACAM6, 진뱅크 수탁 번호 M18728);
[Barnett T., et al Genomics 3, 59-66, 1988]; [Tawaragi Y., et al. Biochem. Biophys. Res. Commun. 150, 89-96, 1988]; [Strausberg R. L., et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 99: 16899-16903, 2002]; WO2004063709; EP1439393 (청구항 7); WO2004044178 (실시예 4); WO2004031238; WO2003042661 (청구항 12); WO200278524 (실시예 2); WO200286443 (청구항 27; 427 쪽); WO200260317 (청구항 2);
수탁 : P40199; Q14920; EMBL; M29541; AAA59915.1. EMBL; M18728;
아미노산 344 개
Figure 112013088873035-pat00106
(서열 번호: 18)
(19) MDP (DPEP1, 진뱅크 수탁 번호 BC017023,
[Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 99 (26): 16899-16903 (2002)]); WO2003016475 (청구항 1); WO200264798 (청구항 33; 85-87 쪽); JP05003790 (도 6-8); WO9946284 (도 9);
상호참조 : NIM: 179780; AAH17023.1; BC017023_1
아미노산 411 개
Figure 112013088873035-pat00107
(서열 번호: 19)
(20) IL20Rα (IL20Ra, ZCYTOR7, 진뱅크 수탁 번호 AF184971);
[Clark H. F., et al. Genome Res. 13, 2265-2270, 2003]; [Mungall A. J., et al. Nature 425, 805-811, 2003]; [Blumberg H., et al. Cell 104, 9-19, 2001]; [Dumoutier L., et al. J. Immunol. 167, 3545-3549, 2001]; [Parrish-Novak J., et al. J. Biol. Chem. 277, 47517-47523, 2002]; [Pletnev S., et al. (2003) Biochemistry 42: 12617-12624]; [Sheikh F., et al. (2004) J. Immunol. 172, 2006-2010]; EP1394274 (실시예 11); US2004005320 (실시예 5); WO2003029262 (74-75 쪽); WO2003002717 (청구항 2; 63 쪽); WO200222153 (45-47쪽) ; US2002042366 (20-21쪽); WO200146261 (57-59 쪽); WO200146232 (63-65쪽); WO9837193 (청구항 1; 55-59 쪽);
수탁: Q9UHF4; Q6UWA9; Q96SH8; EMBL ;AF184971 ; AAF01320.1.
아미노산 553 개
Figure 112013088873035-pat00108
(서열 번호: 20)
(21) 브레비칸 (BCAN, BEHAB, 진뱅크 수탁 번호 AF229053)
[Gary S. C., et al. Gene 256, 139-147, 2000]; [Clark H. F., et al. Genome Res. 13, 2265-2270, 2003]; [Strausberg R. L., et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 99, 16899-16903, 2002]; US2003186372 (청구항 11); US2003186373 (청구항 11); US2003119131 (청구항 1; 도 52); US2003119122 (청구항 1; 도 52); US2003119126 (청구항 1); US2003119121 (청구항 1; 도 52); US2003119129 (청구항1) ; US2003119130 (청구항 1); US2003119128 (청구항 l;도 52) ; US2003119125 (청구항 1); WO2003016475 (청구항 1); WO200202634 (청구항 1);
아미노산 911 개
Figure 112013088873035-pat00109
(서열 번호: 21)
(22) EphB2R (DRT, ERK, Hek5, EPHT3, Tyro5, 진뱅크 수탁 번호 NM_004442)
[Chan, J. and Watt, V. M., Oncogene 6 (6), 1057-1061 (1991)], [Oncogene 10 (5): 897-905 (1995)], [Annu. Rev. Neurosci. 21: 309-345(1998)], [Int. Rev. Cytol. 196: 177-244 (2000)]); WO2003042661 (청구항 12); WO200053216 (청구항 1; 41 쪽); WO2004065576 (청구항 1); WO2004020583 (청구항 9); WO2003004529 (128-132 쪽); WO200053216 (청구항 1; 42 쪽);
상호참조: MIM: 600997 ; NP_004433.2; NM_004442_1
아미노산 987 개
Figure 112013088873035-pat00110
(서열 번호: 22)
(23) ASLG659 (B7h, 진뱅크 수탁 번호 AX092328)
US20040101899 (청구항 2); WO2003104399 (청구항 11); WO2004000221 (도 3); US2003165504 (청구항 1) ; US2003124140 (실시예 2) ; US2003065143 (도 60); WO2002102235 (청구항 13; 299 쪽); US2003091580 (실시예 2); WO200210187 (청구항 6; 도 10); WO200194641 (청구항 12; 도 7b); WO200202624 (청구항 13; 도 1A 내지 1B); US2002034749 (청구항 54; 45-46 쪽); WO200206317 (실시예 2; 320-321 쪽, 청구항 34; 321-322 쪽); WO200271928 (468-469 쪽); WO200202587 (실시예 1; 도 1); WO200140269 (실시예 3; 190-192 쪽); WO200036107 (실시예 2; 205-207 쪽); WO2004053079 (청구항 12); WO2003004989 (청구항 1); WO200271928 (233-234, 452-453 쪽); WO0116318;
아미노산 282 개
Figure 112013088873035-pat00111
(서열 번호: 23)
(24) PSCA (전립선 줄기세포 항원 전구체, 진뱅크 수탁 번호 AJ297436)
[Reiter R. E., et al. Proc. Natl. Acad Sci. USA. 95, 1735-1740, 1998]; [Gu Z., et al. Oncogene 19, 1288-1296, 2000]; [Biochem. Biophys. Res. Commun. (2000) 275 (3): 783-788]; WO2004022709; EP1394274 (실시예 11) ; US2004018553 (청구항 17); WO2003008537 (청구항 1); WO200281646 (청구항 1; 164 쪽); WO2003003906 (청구항 10; 288 쪽); WO200140309 (실시예 1; 도 17); US2001055751 (실시예 1; 도 1b) ; WO200032752 (청구항 18 ; 도 1); WO9851805 (청구항 17; 97 쪽); WO9851824 (청구항 10; 94 쪽); WO9840403 (청구항 2; 도 1B);
수탁: O43653; EMBL; AF043498; AAC39607.1.
아미노산 123 개
Figure 112013088873035-pat00112
(서열 번호: 24)
(25) GEDA (진뱅크 수탁 번호 AY260763);
AAP14954 리포마 HMGIC 융합-협동자-유사 단백질/pid=AAP14954.1-호모 사피엔스
종 : 호모 사피엔스 (인간)
WO2003054152 (청구항 20); WO2003000842 (청구항 1); WO2003023013 (실시예 3, 청구항 20); US2003194704 (청구항 45);
상호참조: GI: 30102449; AAP14954.1 ; AY260763_1
아미노산 236 개
Figure 112013088873035-pat00113
(서열 번호: 25)
(26) BAFF-R (B 세포 활성화 인자 수용체, BLyS 수용체 3, BR3, 진뱅크 수탁 번호 NP_443177.1);
NP_443177 BAFF 수용체/pid=NP_443177.1 - 호모 사피엔스
[Thompson, J. S., et al. Science 293 (5537), 2108-2111 (2001)]; WO2004058309; WO2004011611 ; WO2003045422 (실시예; 32-33 쪽); WO2003014294 (청구항 35; 도 6B); WO2003035846 (청구항 70; 615-616 쪽); WO200294852 (Col 136-137); WO200238766 (청구항 3; 133 쪽); WO200224909 (실시예 3; 도 3);
상호참조: MIM : 606269; NP_443177.1; NM_052945_1
아미노산 184 개
Figure 112013088873035-pat00114
(서열 번호: 26)
(27) CD22 (B 세포 수용체 CD22-B 이소형, 진뱅크 수탁 번호 NP-001762.1);
[Stamenkovic, I. and Seed, B., Nature 345 (6270), 74-77 (1990)]; US2003157113; US2003118592; WO2003062401 (청구항 9); WO2003072036 (청구항 1; 도 1) ; WO200278524 (실시예 2);
상호참조: MIM: 107266; NP_001762.1; NM_001771_1
아미노산 847 개
Figure 112013088873035-pat00115
(서열 번호: 27)
(28) CD79a (Ig 베타 (CD79B)와 공유적으로 상호작용하고 IgM 분자와 표면에서 복합체를 형성하는 B 세포 특이적 단백질인 CD79A, CD79α, 이뮤노글로불린-연관 알파는 B 세포 분화에 관여하는 신호를 전달함) 단백질 서열 전체 mpggpgv… dvqlekp (1번 내지 226번; 아미노산 226개), pI : 4.84, MW: 25028 TM: 2 [P] 진 크로모좀: 19ql3.2, 진뱅크 수탁 번호 NP_001774.1;
WO2003088808, US20030228319; WO2003062401 (청구항 9); US2002150573 (청구항 4, 13-14 쪽); WO9958658 (청구항 13; 도 16); WO9207576 (도 1); US5644033; [Ha et al. (1992) J. Immunol. 148(5) : 1526-1531]; [Mueller et al. (1992) Eur.J. Biochem. 22: 1621-1625]; [Hashimoto et al. (1994) Immunogenetics 40 (4): 287-295] ; [Preud'homme et al. (1992) Clin. Exp. Immunol. 90(1) : 141-146]; [Yu et al. (1992) J. Immunol. 148 (2) 633- 637]; [Sakaguchi et al. (1988) EMBO J. 7 (11): 3457-3464];
아미노산 226 개
Figure 112013088873035-pat00116
(서열 번호: 28)
(29) CXCR5 (CXCL13 케모카인에 의해 활성화된 G 단백질 커플링된 수용체인 버킷림프종 수용체 1은 림프구 이동 및 체액성 방어에 작용하며, HIV-2 감염에 참여하며, AIDS, 림프종, 골수종, 및 백혈병의 발병에 혹시 관련될 수 있음) 단백질 서열 전체 mnypltl… atslttf (1번 내지 372번; 아미노산 372개), pI : 8.54 MW: 41959 TM: 7 [P] 진 크로모좀 : 11q23.3, 진뱅크 수탁 번호 NP_001707.1;
WO2004040000; WO2004015426; US2003105292 (실시예 2); US6555339 (실시예 2); WO200261087 (도 1); WO200157188 (청구항 20, 269 쪽); WO200172830 (12-13 쪽); WO200022129 (실시예 1, 152-153 쪽, 실시예 2, 254-256 쪽); WO9928468 (청구항 1, 38 쪽); US5440021 (실시예 2, col 49-52); WO9428931 (56-58 쪽); WO9217497 (청구항 7, 도 5); [Dobner et al. (1992) Eur. J. Immunol. 22: 2795- 2799]; [Barella et al. (1995) Biochem.J. 309: 773-779];
아미노산 372 개
Figure 112013088873035-pat00117
(서열 번호: 29)
(30) HLA-DOB (펩티드에 부착하여 CD4+ T 림프구에 제시하는 MHC 클래스 Ⅱ 분자 (Ia 항원)의 베타 서브유닛) 단백질 서열 전체 mgsgwvp… vllpqsc (1번 내지 273번; 아미노산 273 개, pI : 6.56 MW: 30820 TM:1 [P] 진 크로모좀 : 6p21.3, 진뱅크 수탁 번호 NP_002111.1;
[Tonnelle et al. (1985) EMBO J. 4 (11): 2839-2847]; [Jonsson et al. (1989) Immunogenetics 29 (6): 411-413]; [Beck et al. (1992) J. Mol. Biol. 228: 433-441]; [Strausberg et al.(2002) Proc. Natl. Acad. Sci USA 99: 16899-16903]; [Servenius et al. (1987) J. Biol. Chem. 262: 8759-8766]; [Beck et al. (1996) J. Mol. Biol. 255: 1-13]; [Naruse et al. (2002) Tissue Antigens 59: 512-519]; WO9958658 (청구항 13, 도 15); US6153408 (Col 35-38); US5976551 (col 168-170) ; US6011146 (col 145-146); [Kasahara et al. (1989) Immunogenetics 30(1) : 66-68]; [Larhammar et al. (1985) J. Biol. Chem. 260 (26): 14111- 14119];
아미노산 273 개
Figure 112013088873035-pat00118
(서열 번호: 30)
(31) P2X5 (세포외 ATP에 의해 조절되는 이온 채널인, 퓨린성 수용체 P2X 리간드-게이트 이온 채널 5는 시냅스 전달 및 신경발생에 관여할 수 있으며, 그의 결핍은 특발성 배뇨근불안정의 병태생리학에 기여할 수 있음) 단백질 서열 전체 mgqagck…lephrst (1번 내지 422번; 아미노산 422 개), pI : 7.63, MW: 47206 TM:1 [P] 진 크로모좀 : 17pl3.3, 진뱅크 수탁 번호 NP_002552.2;
[Le et al. (1997) FEBS Lett. 418 (1-2): 195-199]; WO2004047749; WO2003072035 (청구항 10); [Touchman et al. (2000) Genome Res. 10: 165-173]; WO200222660 (청구항 20); WO2003093444 (청구항 1); WO2003087768 (청구항 1); WO2003029277 (page 82);
아미노산 422 개
Figure 112013088873035-pat00119
(서열 번호: 31)
(32) CD72 (B 세포 분화 항원 CD72, Lyb-2) 단백질 서열 전체 maeaity… tafrfpd (1번 내지 359번; 아미노산 359 개), pI : 8.66, MW: 40225 TM: 1 [P] 진 크로모좀 : 9pl3.3, 진뱅크 수탁 번호 NP_001773.1;
WO2004042346 (청구항 65); WO2003026493 (51-52, 57-58 쪽) ; WO200075655 (105-106 쪽); [Von Hoegen et al. (1990) J. Immunol. 144 (12): 4870-4877]; [Strausberg et al. (2002) Proc. Natl. Acad. Sci USA 99: 16899-16903];
아미노산 359 개
Figure 112013088873035-pat00120
(서열 번호: 32)
(33) LY64 (류신 풍부 반복체 (LRR) 족의 제Ⅰ형 막 단백질인, 림프구 항원 64(RP105)은 B 세포 활성화 및 아팝토시스를 조절하며, 기능을 상실하면 전신홍반루푸스 환자의 질병 활성 증가와 관련됨) 단백질 서열 전체 mafdvsc…rwkyqhi (1번 내지 661번; 아미노산 661 개), pI : 6.20, MW: 74147 TM: 1 [P] 진 크로모좀 : 5ql2, 진뱅크 수탁 번호 NP_005573.1;
US2002193567; WO9707198 (청구항 11, 39-42 쪽); [Miura et al. (1996) Genomics 38 (3): 299-304]; [Miura et al. (1998) Blood 92: 2815-2822]; WO2003083047; WO9744452 (청구항 8, 57-61 쪽); WO200012130 (24-26 쪽);
아미노산 661 개
Figure 112013088873035-pat00121
(서열 번호: 33)
(34) FCRH1 (C2형 Ig-유사 및 ITAM 도메인을 포함하는 이뮤노글로불린 Fc 도메인에 대한 잠정적 수용체인, Fc 수용체 유사 단백질 1은 B 림프구 분화에 참여할지도 모른다.) 단백질 서열 전체 mlprlll…vdyedam (1번 내지 429번; 아미노산 429 개), pI : 5.28, MW: 46925 TM: 1 [P] 진 크로모좀 : lq21-lq22, 진뱅크 수탁 번호 NP_443170.1;
WO2003077836; WO200138490 (청구항 6, 도 18E-1 내지 18-E-2); [Davis et al. (2001) Proc. Natl. Acad. Sci USA 98 (17): 9772-9777]; WO2003089624 (청구항 8); EP1347046 (청구항 1); WO2003089624 (청구항 7);
아미노산 429 개
Figure 112013088873035-pat00122
(서열 번호: 34)
(35) IRTA2 (B 세포 발달 및 림프종 발생에 작용할 수도 있는 잠정적 면역수용체인 이뮤노글로불린 상과 수용체 전위 연관 2; 전위에 의한 유전자 탈조절은 특정 B 세포 악성종양에서 일어난다) 단백질 서열 전체 mllwvil…assaphr(1번 내지 977번; 아미노산 977 개), pI : 6.88 MW: 106468 TM: 1 [P] 진 크로모좀 : lq21, 진뱅크 수탁 번호 NP_112571.1;
WO2003024392 (청구항 2, 도 97); [Nakayama et al. (2000) Biochem. Biophys. Res. Commun. 277(1): 124-127]; WO2003077836; WO200138490 (청구항 3, 도 18B-1 내지 18B-2);
아미노산 977 개
Figure 112013088873035-pat00123
(서열 번호: 35)
또한, 모두 본원에 참고자료로 전문이 포함되어 있는 WO04/045516 (03 Jun 2004); WO03/000113 (03 Jan 2003); WO02/016429 (28 Feb 2002); WO02/16581 (28 Feb 2002); WO03/024392 (27 Mar 2003); WO04/016225 (26 Feb 2004); WO01/40309 (07 Jun 2001), 및 2003년 11월 17일에 출원된 미국 가특허출원 제60/520842호 (발명의 명칭 : "COMPOSITIONS AND METHODS FOR THE TREATMENT OF TUMOR OF HEMATOPOIETIC ORIGIN")도 참조하라.
실시양태에서, 리간드-링커-약물 접합체는 구조식 Ⅲa를 가지고, 여기서 이간드는 CD30, CD40, CD70, 루이스 Y 항원 중 적어도 하나에 결합하는 항체를 포함하는 항체 Ab이고, w=0, y=0, 및 D는 구조식 Ⅰb를 갖는다. 구조식 Ⅲa의 예시적인 접합체는 R17이 -(CH2)5-인 것을 포함한다. 또한 D가 실시예 3의 화합물 2의 구조 및 그의 에스테르를 가지는 것도 구조식 Ⅲa의 예시적인 접합체에 포함된다. 또한 약 3 내지 약 8개, 한 측면에서, 약 3 내지 약 5개의 약물 잔기 D를 포함하는 구조식 Ⅲa의 이러한 접합체, 즉 p가 약 3 내지 8 범위, 예를 들어 약 3 내지 5의 값을 가지는 구조식 Ⅰa의 접합체도 포함된다. 본 문단에 기록된 구조적 특징의 조합을 포함하는 접합체도 역시 본 발명의 화합물의 권리범위 내인 것으로 여겨진다.
다른 실시양태에서, 리간드-링커-약물 접합체는 구조식 Ⅲa을 가지고, 여기서 리간드는 CD30, CD40, CD70, 루이스 Y 항원 중 하나에 결합하는 항체 Ab이고, w=1, y=0, 및 D는 구조식 Ⅰb를 갖는다. R17이 -(CH2)5-인 Ⅲa의 이러한 접합체가 포함된다. 또한 W는 -Val-Cit-이고(이거나), D는 실시예 3의 화합물 2의 구조 및 그의 에스테르를 가지는 이러한 구조식 Ⅲa의 이러한 접합체도 포함된다. 또한 약 3 내지 약 8개, 바람직하게 약 3 내지 약 5개의 약물 잔기 D를 포함하는 이러한 구조식 Ⅲa의 접합체, 즉 p가 약 3 내지 8 범위, 바람직하게 약 3 내지 5의 값을 가지는 구조식 Ⅰa의 접합체도 포함된다. 본 문단에 기록된 구조적 특징의 조합을 포함하는 접합체도 역시 예시적이다.
실시양태에서, 리간드-링커-약물 접합체는 구조식 Ⅲa을 가지고, 여기서 리간드는 CD30, CD40, CD70, 루이스 Y 항원 중 하나에 결합하는 항체 Ab이고, w=1, y=1, 및 D는 구조식 Ⅰb를 갖는다. R17이 -(CH2)5-인 이러한 Ⅲa의 접합체가 포함된다. 또한 W는 -Val-Cit-이고; Y는 구조식 X를 가지고; D는 실시예 3의 화합물 2의 구조 및 그의 에스테르를 가지고; p는 약 3 내지 약 8 범위, 바람직하게 약 3 내지 약 5개의 약물 잔기 D인 구조식 Ⅲa의 이러한 접합체도 포함된다. 본 문단에 기록된 구조적 특징의 조합을 포함하는 접합체도 역시 본 발명의 화합물의 권리범위 내인 것으로 여겨진다.
추가적인 실시양태는 항체 약물 접합체(ADC), 또는 제약학적으로 허용되는 그의 염 또는 용매 화합물이며, 여기서 Ab는 위에 기록된 종양 관련 항원 ("TAA 화합물") (1) 내지 (35) 중 하나에 결합하는 항체이다.
다른 실시양태는 단리형 및 정제형인 TAA 화합물 또는 제약학적으로 허용되는 그의 염 또는 용매 화합물이다.
다른 실시양태는 환자, 예를 들어 과증식성 장애를 가진 인간에게 TAA 화합물 또는 제약학적으로 허용되는 그의 염 또는 용매 화합물을, 종양 세포 또는 암세포를 사멸시키거나 또는 그 증식을 저해하기 위한 유효량으로 투여하는 것을 포함하는, 종양 세포 또는 암세포의 사멸 또는 그 증식 저해 방법이다.
다른 실시양태는 환자, 예를 들어 과증식성 장애를 가진 인간에게 TAA 화합물 또는 제약학적으로 허용되는 그의 염 또는 용매 화합물을, 단독으로 또는 추가적인 항암제의 유효량과 함께, 암을 치료하기 위한 유효량으로 투여하는 것을 포함하는, 암 치료 방법이다.
다른 실시양태는 환자, 예를 들면 과증식성 장애를 가진 인간에게 TAA 화합물 또는 제약학적으로 허용되는 그의 염 또는 용매 화합물을 자가 면역 질환을 치료하기 위한 유효량으로 투여하는 것을 포함하는, 자가 면역 질환 치료 방법이다.
본 발명에 사용되기에 적합한 항체는 항체 합성을 위해 당업계에 알려진 임의의 방법, 특히 화학적 합성 또는 재조합 발현에 의해 생산될 수 있고, 바람직하게는 재조합 발현 기법에 의해 생산된다.
4.5. 1 재조합 항체의 생산
본 발명의 항체는 항체 합성에 유용하다고 알려진 당업계의 임의의 방법, 특히 화학적 합성 또는 재조합 발현에 의해 생산될 수 있다.
항체, 또는 그의 단편, 유도체 또는 유사체의 재조합 발현은 항체를 코딩하는 핵산의 구축을 필요로 한다. 항체의 뉴클레오티드 서열이 알려졌다면, 항체를 코딩하는 핵산은 항체를 코딩하는 서열의 일부분을 포함하는 겹치는 올리고뉴클레오티드의 합성, 그 올리고뉴클레오티드의 어닐링 및 라이게이션, 및 그후 라이게이션된 올리고뉴클레오티드의, 예를 들어 PCR에 의한 증폭을 포함하는, 화학적으로 합성된 올리고뉴클레오티드로부터 조립될 수 있다(예를 들어, [Kutmeier et al., 1994, Biotechniques 17: 242]에 설명된 바와 같이).
대안적으로, 항체를 코딩하는 핵산 분자는 적절한 공급원으로부터 생성될 수 있다. 특정 항체를 코딩하는 핵산을 포함하는 클론이 준비되지 않았으나 항체의 서열은 알려져있다면, 항체를 코딩하는 핵산은 적절한 공급원(즉, 이뮤노글로불린을 발현하는 임의의 조직 또는 세포로부터 생성된 항체 cDNA 라이브러리, 또는 cDNA 라이브러리)으로부터 서열의 3' 및 5' 말단에 혼성화할 수 있는 합성 프라이머를 이용한 PCR 증폭 또는 특정 유전자 서열에 특이적인 올리고뉴클레오티드 탐침을 이용한 클로닝에 의해 얻어질 수 있다.
특정 항원을 특이적으로 인식하는 항체가 상업적으로 (또는 이러한 이뮤노글로불린을 코딩하는 핵산의 클로닝을 위한 cDNA 라이브러리의 공급원이) 이용가능하지 않다면, 특정 항원에 특이적인 항체는 당업계에 알려진 임의의 방법, 예를 들어 환자 또는 토끼 또는 마우스와 같이 적절한 동물 모델을 면역화하여 다클론성 항체를 생성하는 것에 의하는, 더욱 바람직하게는 콜러 및 밀스테인 ([1975, Nature 256: 495-497])에 의해 설명된 바와 같이, 또는 코츠버 외[1983, Immunology Today 4: 72] 또는 콜 등[1985 in Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96]에 의해 설명된 바와 같이 모노클로날 항체를 생성하는 것에 의하는 방법에 의해 생성될 수 있다. 대안적으로, 적어도 항체의 Fab 일부분을 코딩하는 클론은 Fab 발현 라이브러리에서 특정 항원에 결합하는 Fab 단편의 클론을 스크리닝하는 것(예를 들어, [Huse et al., 1989, Science 246: 1275-1281]에 설명된 바와 같이)에 의하거나, 또는 항체 라이브러리를 스크리닝하는 것([ㅊlackson et al., 1991, Nature 352: 624; Haneet al., 1997 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 4937] 참조)에 의해 얻어질 수 있다.
일단 항체의 적어도 가변도메인을 코딩하는 핵산서열이 얻어지면, 그것은 항체의 불변 구간을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 벡터에 삽입될 수 있다(예를 들어, 국제 공보 WO 86/05807; WO 89/01036; 및 미국특허 제5122464호 참조). 완전한 항체 분자가 발현되도록 하는 완전한 경쇄 또는 중쇄가 포함된 벡터가 준비된다. 그후, 항체를 코딩하는 핵산이 술프히드릴 기를 포함하지 않는 아미노산 잔기를 가진 내부사슬 디술피드 결합에 참여하는 1 이상의 가변 구간 시스테인 잔기를 치환(또는 삭제)하는데 필수적인 뉴클레오티드 치환 또는 삭제를 도입하는데 사용될 수 있다. 이러한 변형은 뉴클레오티드 서열에서 특이적 돌연변이 또는 삭제를 도입하기 위해 당업계에 알려진 임의의 방법, 예를 들어, 화학적 돌연변이유발 및 시험관 내 영역 지정 돌연변이유발[Hutchinson et al., 1978, J. Biol. Chem. 253: 6551]과 같은, 그러나 이에 제한되지 않는 방법에 의해 실시될 수 있다.
또한, 적절한 생물학적 활성을 가진 인간 항체 분자의 유전자와 함께 적절한 항원 특이성을 가진 마우스 항체 분자의 유전자를 스플라이싱하는 것에 의한 "키메라 항체"의 생산을 위해 개발된 기법([Morrison et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. 81: 851-855]; [Neuberger et al., 1984, Nature 312: 604-608]; [Takeda et al., 1985, Nature 314: 452-454])이 사용될 수 있다. 키메라 항체는 뮤린 모노클로날 항체에서 유래한 가변 구간 및 인간 이뮤노글로불린 불변 구간을 가지는 항체, 예를 들어 인간화 항체와 같이, 서로 다른 동물 종으로부터 유래한 서로 다른 일부분을 가지는 분자이다.
대안적으로, 단일 사슬 항체의 생산을 위해 설명된 기법(미국특허 제4,694,778호; [Bird, 1988, Science 242: 423-42]; [Huston et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 5879-5883]; 및 [Ward et al., 1989, Nature 334:544-54])이 단일 사슬 항체를 생산하는데 적용될 수 있다. 단일 사슬 항체는 아미노산 다리로 Fv 영역의 중쇄 및 경쇄 단편을 연결함으로써, 단일 사슬 폴리펩티드로 형성된다. 이 콜라이에서 기능적 Fv 단편의 조립에 대한 기법 역시 사용될 수 있다[Skerra et al., 1988, Science 242: 1038-1041].
특이적인 에피토프를 인식하는 항체 단편은 알려진 기법에 의해 생성될 수 있다. 예를 들어, 이러한 단편은 항체 분자의 펩신 분해에 의해 생산될 수 있는 F(ab')2 단편 및 F(ab')2 단편의 디술피드 가교를 환원시킴으로써 생성되는 Fab 단편을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
일단 항체를 코딩하는 핵산 서열이 얻어지면, 항체의 생산을 위한 벡터가 당업계에 널리 알려진 재조합 DNA 기술에 의해 생산될 수 있다. 당업자에게 잘 알려진 방법이 항체 코딩 서열 및 적절한 전사 및 번역 조절 신호를 포함하는 발현 벡터를 구축하는데 사용될 수 있다. 이러한 방법은 예를 들어 실험관 내 재조합 DNA 기법, 합성 기법, 및 생체 내 유전적 재조합을 포함한다. 예를 들어 샘브룩 등[1990, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY] 및 오수벨 등[eds., 1998, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY]에 설명된 기법을 참조하라.
항체의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 발현 벡터 또는 항체의 뉴클레오티드 서열은 종래 기법 (즉, 전기천공법, 리포솜 형질감염, 및 인산 칼슘 침전법)에 의해 숙주 세포로 전달될 수 있고, 형질감염된 세포는 그후 종래 기법으로 배양되어 항체를 생산한다. 특정한 실시양태에서, 항체의 발현은 구조성, 유도되는, 또는 조직 특이적 프로모터에 의해 조절된다.
재조합 항체를 발현시키는데 이용되는 숙주 세포는 이. 콜라이와 같은 박테리아 세포, 또는 특히 재조합 이뮤노글로불린 분자 전체의 발현을 위해서는 바람직하게 진핵세포일 수 있다. 특히, 인간 시토메갈로바이러스의 주요 조기 발현 유전자 프로모터 요소와 같은 벡터와 접합된 중국 햄스터 난소 세포 (CHO)와 같은 포유동물 세포는 이뮤노글로불린에 대한 효과적인 발현 시스템이다([Foecking et al., 198, Gene 45: 101]; [Cockett et al., 1990, BioTechnology 8:2]).
숙주-발현 벡터 시스템의 다양성은 이뮤노글로불린 항체를 발현시키는데 이용될 수 있다. 이러한 숙주-발현 시스템은 항체의 코딩 서열이 생산되고 그후 정제되는 운반체를 나타내지만, 또한 계 내에서 항체 이뮤노글로불린 분자를 발현하는 적절한 뉴클레오티드 코딩 서열로 형질전환 또는 형질감염된 세포를 나타낼 수도 있다. 이러한 것들로는 이뮤노글로불린 코딩 서열을 포함하는 재조합 박테리오파지 DNA, 플라스미드 DNA 또는 코스미드 DNA 발현 벡터로 형질전환된 박테리아(즉, 이. 콜라이 및 비. 섭틸리스); 이뮤노글로불린 코딩 서열을 포함하는 재조합 효모 발현 벡터로 형질전환된 효모(예를 들어, 사카로마이세스 피키아); 이뮤노글로불린 코딩 서열을 포함하는 재조합 바이러스 발현 벡터(예를 들어, 바큘로바이러스)로 감염된 곤충세포 시스템; 이뮤노글로불린 코딩 서열을 포함하는 재조합 바이러스 발현 벡터(예를 들어, 콜리플라워 모자이크 바이러스(CaMV) 및 타바코 모자이크 바이러스(TMV))로 감염되거나 또는 재조합 플라스미드 발현 벡터(예를 들어, Ti 플라스미드)로 형질전환된 식물세포 시스템; 또는 포유동물 세포(예를 들어, 메탈로티오네인 프로모터)의 게놈 또는 포유동물 바이러스(예를 들어, 아데노바이러스 만기 프로모터; 우두 바이러스 7.5K 프로모터)로부터 유래한 프로모터를 포함하는 재조합 발현 구조물을 가지는 포유동물 세포 시스템(예를 들어, COS, CHO, BH, 293, 293T, 3T3 세포)가 있지만 이에 제한되는 것은 아니다.
박테리아 시스템에서, 다수의 발현 벡터는 유리하게는 발현되는 항체에 대하여 의도된 용도에 따라 선택될 수 있다. 예를 들어, 상기 단백질을 다량 제조하는 경우, 쉽게 정제되는 융합 단백질 생성물의 높은 수준의 발현을 지시하는 벡터가 바람직할 수 있다. 이러한 벡터로는, 항체 코딩 서열이 벡터 내에서 lac Z 코딩 영역과 인-프레임 (in-frame)으로 개별적으로 라이게이션될 수 있어서 융합 단백질이 제조되는 대장균 발현 벡터 pUR278 [Ruther et al., 1983, EMBO J. 2:1791] 및 pIN 벡터 ([Inouye & Inouye, 1985, Nucleic Acids Res. 13:3101-3109]; [Van Heeke & Schuster, 1989, J. Biol. Chem. 24:5503-5509]) 등을 들 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 또한, pGEX 벡터를 사용해서 글루타티온 S-트랜스퍼라제 (GST)와의 융합 단백질로서 외래 폴리펩티드를 발현시킬 수도 있다. 일반적으로, 그러한 융합 단백질은 가용성이며, 매트릭스 글루타티온-아가로스 비드로 흡착 및 결합시킨 다음, 유리 글루타티온의 존재하에서 용출시킴으로써 용해된 세포로부터 쉽게 정제할 수 있다. 클로닝된 표적 유전자 생성물이 GST 잔기로부터 방출될 수 있도록, 트롬빈 또는 인자 Xa 프로테아제 분해가능한 부위를 포함하게끔 pGEX 벡터를 설계한다.
곤충 시스템에서, 아우토그라파 칼리포르니카 (Autographa californica) 핵 폴리헤드론형성 바이러스 (AcNPV) 또는 드로소필라 멜라노가스터 (Drosophila Melanogaster) 유래의 유사한 바이러스를 벡터로 사용해서 외래 유전자를 발현시킨다. 상기 바이러스는 스포도프테라 프루기페르다 (Spodoptera frugiperda) 세포 중에서 증식한다. 항체 코딩 서열은 바이러스의 비필수 영역 (예를 들어, 폴리헤드린 유전자)내에 개별적으로 클로닝할 수 있으며, AcNPV 프로모터 (예를 들어, 폴리헤드린 프로모터)의 조절을 받도록 위치시킬 수 있다.
포유동물 숙주 세포에서, 다수의 바이러스-기초 발현 시스템을 이용할 수 있다. 아데노바이러스를 발현 벡터로 사용하는 경우, 관심 항체 코딩 서열을 아데노바이러스 전사/번역 조절 복합체, 예를 들면 후기 프로모터 및 세부분으로 된(tripartite) 리더 서열에 라이게이션할 수 있다. 이후, 상기 키메라 유전자를 시험관내 또는 생체내 재조합에 의해 아데노바이러스 게놈 내에 삽입할 수 있다. 바이러스 게놈의 비필수 영역 (예, 영역 E1 또는 E3)에 삽입함으로써 감염된 숙주 내에서 생존가능하며 이뮤노글로불린 분자를 발현시킬 수 있는 재조합 바이러스가 얻어진다 (예를 들어, 문헌 [Logan & Shenk, 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:355-359] 참조). 또한, 삽입된 항체 코딩 서열의 효과적인 번역을 위해 특정 개시 신호가 필요할 수도 있다. 이들 신호는 ATG 개시 코돈 및 인접한 서열을 포함한다. 또한, 전체 삽입체의 번역을 보장하도록, 개시 코돈이 원하는 코딩 서열의 리딩 프레임과 같은 상으로 존재해야 한다. 이들 외인성 번역 조절 신호 및 개시 코돈은 천연 및 합성 둘 다의 다양한 기원의 것일 수 있다. 적절한 전사 인핸서 요소, 전사 종결자 등을 포함시켜 발현 효율을 증대시킬 수 있다 (문헌 [Bittner et al., 1987, Methods in Enzymol. 153:51-544] 참조).
또한, 숙주 세포 균주는 삽입된 서열의 발현을 조절하도록 선택될 수 있거나, 또는 원하는 특정한 방식으로 유전자 생성물을 변형 및 프로세싱한다. 단백질 생성물에 대한 이러한 변형 (예, 글리코실화) 및 프로세싱 (예, 절단)은 단백질의 기능에 있어서 중요할 수 있다. 상이한 숙주 세포는 단백질 및 유전자 생성물의 번역 후 프로세싱 및 변형에 있어서 특징적이고 특정한 메카니즘을 갖는다. 발현된 외래 단백질의 정확한 변형 및 프로세싱을 보장하도록, 적절한 세포주 또는 숙주 시스템을 선택할 수 있다. 이를 위해, 유전자 생성물의 1차 전사체, 글리코실화 및 인산화의 적절한 프로세싱을 위한 세포 기구를 보유하는 진핵 숙주 세포를 사용할 수 있다. 이러한 포유동물 숙주 세포로는 CHO, VERY, BH, Hela, COS, MDCK, 293, 293T, 3T3, WI38, BT483, Hs578T, HTB2, BT20 및 T47D, CRL7030 및 Hs578Bst를 들 수 있지만, 이에 한정되지 않는다.
재조합 단백질을 장기간 높은 수율로 제조하기 위해서는, 안정한 발현이 바람직하다. 예를 들어, 항체를 안정하게 발현하는 세포주를 조작할 수 있다. 바이러스 복제 기점을 함유하는 발현 벡터를 사용하기보다는, 적절한 발현 조절 요소 (예, 프로모터, 인핸서, 서열, 전사 종결자, 폴리아데닐화 부위 등)에 의해 조절된 DNA, 및 선택가능한 마커로 숙주 세포를 형질전환시킬 수 있다. 외래 DNA의 도입 후, 조작된 세포가 풍부해진 배지 중에서 1일 내지 2일 동안 배양될 수 있도록 하고, 이어서 선택적 배지로 바꿔준다. 재조합 플라스미드 내의 선택가능한 마커는 선별에 대한 내성을 부여하고, 세포가 플라스미드를 그의 염색체 내로 안정하게 통합하여 포커스(focus)를 형성하도록 성장시킴으로써, 이후 세포가 클로닝되어 세포주로 확장될 수 있도록 한다. 이 방법은 항체를 발현하는 세포주를 조작하는데 유리하게 사용될 수 있다. 이와 같이 조작된 세포주는 항체와 직접적으로 또는 간접적으로 상호작용하는 종양 항원을 스크리닝 및 평가하는데 있어서 특히 유용할 수 있다.
단순 헤르페스 바이러스 티미딘 키나제 [Wigler et al., 1977, Cell 11:223], 히포크산틴-구아닌 포스포리보실트랜스퍼라제 [Szybalska & Szybalski, 192, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 48:202], 및 아데닌 포스포리보실트랜스퍼라제 [Lowy et al., 1980, Cell 22:817] 유전자를 포함하지만 이에 한정되지 않는 다수의 선별 시스템이 사용될 수 있는데, 이러한 시스템은 각각 tk-, hgprt- 또는 aprt-세포내에서 사용될 수 있다. 또한, 다음과 같은 유전자에 대한 선별의 기초로서 항대사물질 내성을 이용할 수 있다: 메토트렉세이트에 대한 내성을 부여하는 DHFR ([Wigler et al., 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:357]; [O'Hare et al., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:1527]); 미코페놀산에 대한 내성을 부여하는 gpt [Mulligan & Berg, 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:2072]; 아미노글리코시드 0-418에 대한 내성을 부여하는 neo ([Clinical Pharmacy 12:488-505]; [Wu and Wu, 1991, Biotherapy 3:87-95]; [Tolstoshev, 1993, Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 32:573-596]; [Mulligan, 1993, Science 260:926-932]; [Morgan and Anderson, 1993, Ann. Rev. Biochem. 62:191-217]; 및 [May, 1993, TIB TECH 11(5):155-215]); 및 히그로마이신에 대한 내성을 부여하는 hygro [Santerre et al., 1984, Gene 30:147]. 재조합 DNA 기술 분야에서 통상적으로 사용될 수 있는 공지된 방법은 문헌 ([Ausubel et al. (eds., 1993, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY]; [Kriegler, 1990, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY]; [Chapters 12 and 13, Dracopoli et al. (eds), 1994, Current Protocols in Human Genetics, John Wiley & Sons, NY.]; 및 [Colberre-Garapin et al., 1981, J. Mol. Biol. 150:1])에 기재되어 있다.
항체의 발현 수준은 벡터 증폭에 의해 증가시킬 수 있다 (검토를 위해서는, 문헌 [Bebbington and Hentschel, The use of vectors based on gene amplification for the expression of cloned genes in mammalian cells in DNA cloning, Vol. 3. (Academic Press, New York, 1987)]을 참조한다). 항체를 발현하는 벡터 시스템 내의 마커가 증폭가능한 경우, 숙주 세포의 배양물 중 존재하는 억제제의 수준이 증가하면 마커 유전자의 카피수가 증가하게 될 것이다. 증폭된 영역은 항체의 뉴클레오티드 서열과 관련이 있기 때문에, 항체의 생산이 또한 증가하게 될 것이다 [Crouse et al., 1983, Mol. Cell. Biol. 3:257].
숙주 세포는 두 가지 발현 벡터, 즉 중쇄 유래의 폴리펩티드를 코딩하는 제1 벡터 및 경쇄 유래의 폴리펩티드를 코딩하는 제2 벡터로 공동형질감염시킬 수 있다. 상기 두 벡터는 중쇄 및 경쇄 폴리펩티드의 동등한 발현을 가능하게 하는 동일한 선택가능한 마커를 함유할 수 있다. 또는, 중쇄 및 경쇄 폴리펩티드 둘 다를 코딩하는 단일 벡터를 사용할 수 있다. 이러한 경우, 과량의 독성 유리 중쇄를 방지하기 위해서는 경쇄가 중쇄 앞쪽에 위치해야 한다 ([Proudfoot, 1986, Nature 322:52]; [Kohler, 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:2197]). 중쇄 및 경쇄에 대한 코딩 서열은 cDNA 또는 게놈 DNA를 포함할 수 있다.
일단 항체가 재조합적으로 발현되었다면, 항체의 정제를 위한 당업계에 공지된 임의의 방법을 이용해서, 예를 들어 크로마토그래피 (예, 이온 교환, 친화성, 특히 단백질 A 이후 특정 항원에 대한 친화성, 및 사이징 컬럼 크로마토그래피), 원심분리, 용해도 차등, 또는 단백질 정제를 위한 임의의 다른 표준 기술에 의해 항체를 정제할 수 있다.
또 다른 예시적인 실시양태에서, 항체는 모노클로날 항체이다.
임의의 경우에서, 하이브리드 항체는 이중 특이성을 갖는데, 바람직하게는 선택된 합텐에 대해 특이적인 하나 이상의 결합 부위, 또는 표적 항원, 예를 들어 종양, 자가면역 질환, 감염성 생물체 또는 다른 질환 상태와 관련된 항원에 대해 특이적인 하나 이상의 결합 부위를 갖는다.
4.5.2 항체 제조
항체의 제조는 항-CD30 항체에 대하여 예시될 것이지만, 유사한 방식으로 TNF 수용체 족의 다른 구성원들에 대한 항체를 제조 및 변형할 수 있다는 것은 당업계의 숙련가에게 자명할 것이다. 항체의 제조에 있어서 CD30의 용도는 예시적인 것일 뿐이며, 제한하고자 하는 것은 아니다.
항체의 제조를 위해 사용될 CD30 항원은, 예를 들어 원하는 에피토프를 함유하는 CD30의 가용성 형태의 세포외 도메인 또는 그의 일부일 수 있다. 또는, 세포 표면에서 CD30을 발현하는 세포 (예, L540 (T 세포 표현형을 갖는 호지킨 (Hodgkin's) 림프종 유래의 세포주) 및 L428 (B 세포 표현형을 갖는 호지킨 림프종 유래의 세포주))를 사용해서 항체를 제조할 수 있다. 항체를 제조하는데 유용한 CD30의 다른 형태는 당업계의 숙련가에게 자명할 것이다.
다른 예시적인 실시양태에서, 항체의 제조에 사용될 ErbB2 항원은, 예를 들어 원하는 에피토프를 함유하는 ErbB2의 가용성 형태의 세포외 도메인 또는 그의 일부일 수 있다. 또는, 세포 표면에서 ErbB2를 발현하는 세포 (예, ErbB2를 과발현하도록 형질전환된 NIH-3T3 세포; 또는 암종 세포주, 예를 들어 SK-BR-3 세포, 문헌 [Stancovski et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:8691-8695 (1991)] 참조)를 사용해서 항체를 제조할 수 있다. 항체를 제조하는데 유용한 ErbB2의 다른 형태는 당업계의 숙련가에게 자명할 것이다.
(i) 폴리클로날 항체
폴리클로날 항체는 바람직하게는 동물에게 관련 항원 및 아쥬반트를 수회 피하 (sc) 또는 복강내 (ip) 주사함으로써 생성된다. 폴리클로날 항체는, 양기능성 또는 유도체화 (derivatizing) 작용제, 예를 들어 말레이미도벤조일술포숙신이미드 에스테르 (시스테인 잔기를 통한 접합), N-히드록시숙신이미드 (리신 잔기를 통함), 글루타르알데히드, 숙신산 무수물, SOCl2 또는 R1N=C=NR (R 및 R1은 상이한 알킬기임)을 사용해서, 관련 항원을 면역화될 종에서 면역원성인 단백질, 예를 들어 키홀 림펫 헤모시아닌, 혈청 알부민, 소 티로글로불린, 대두 트립신 억제제에 접합시키는데 유용할 수 있다.
단백질 또는 컨쥬게이트 100 ㎍ 또는 5 ㎍ (각각, 토끼 또는 마우스의 경우)을 3 부피의 프로인트 (Freund's) 완전 아쥬반트와 배합하고, 용액을 여러 부위에서 피내 주사함으로써 동물을 항원, 면역원성 컨쥬게이트 또는 유도체에 대하여 면역화한다. 1 개월 후, 동물에게 프로인트 완전 아쥬반트 중 펩티드 또는 컨쥬게이트의 본래의 양의 1/5 내지 1/10을 피하 주사에 의해 여러 부위에 추가로 주사한다. 7일 내지 14일 후, 동물을 채혈하고, 혈청을 항체 역가에 대하여 검정한다. 역가 평탄역 (titer plateaus)에 이를 때까지 동물에게 추가로 주사한다. 바람직하게는, 동물에게 동일한 항원의 컨쥬게이트이지만 상이한 단백질에 접합되고(되거나) 상이한 가교결합 시약을 통해 접합된 컨쥬게이트를 추가로 주사한다. 또한, 컨쥬게이트는 재조합 세포 중에서 단백질 융합으로 제조할 수도 있다. 또한, 응집제, 예를 들어 백반을 적합하게 사용해서 면역 반응을 증진시킨다.
( ii ) 모노클로날 항체
모노클로날 항체는 실질적으로 균일한 항체의 집단으로부터 얻어지는데, 즉 이러한 집단을 포함하는 개별적인 항체는 소량으로 존재할 수 있는 가능한 자연 발생적인 돌연변이를 제외하고는 동일하다. 따라서, "모노클로날"이라는 수식어는 항체의 특징이 별개의 항체들의 혼합물이 아니라는 것을 암시한다.
예를 들어, 모노클로날 항체는 문헌 [Kohler et al., Nature, 256:495 (1975)]에 최초로 기재된 하이브리도마 방법을 이용하여 제조할 수 있거나 또는 재조합 DNA 방법 (미국 특허 제4816567호)에 의해 제조할 수 있다.
하이브리도마 방법에서, 마우스 또는 다른 적절한 숙주 동물, 예를 들어 햄스터를 상기 기술된 바와 같이 면역화하여, 면역화를 위해 사용된 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 제조하거나 제조할 수 있는 림프구를 유도한다. 또는, 림프구를 시험관내에서 면역화할 수 있다. 이어서, 적합한 융합제, 예를 들어 폴리에틸렌 글리콜을 사용하여 림프구를 골수종 세포와 융합시킴으로써 하이브리도마 세포를 형성시킨다 [Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp. 59-103 (Academic Press,1986)].
이와 같이 제조된 하이브리도마 세포를, 바람직하게는 융합되지 않은 모 골수종 세포의 성장 또는 생존을 억제하는 하나 이상의 물질을 함유하는 적합한 배양 배지 중에 파종하여 배양시킨다. 예를 들어, 모 골수종 세포에 효소 히포크산틴 구아닌 포스포리보실 트랜스퍼라제 (HGPRT 또는 HPRT)가 결여되어 있다면, 하이브리도마에 대한 배양 배지는 전형적으로, HGPRT-결핍된 세포의 성장을 방지하는 물질인 히포크산틴, 아미노프테린, 및 티미딘 (HAT 배지)을 포함할 것이다.
바람직한 골수종 세포는 효과적으로 융합되고, 선택된 항체-생산 세포에 의해 항체를 안정하게 높은 수준으로 제조하며, HAT 배지와 같은 배지에 민감한 세포이다. 이들 중에서, 바람직한 골수종 세포주는 뮤린 골수종 세포주, 예를 들어 설크 인스티튜트 셀 디스트리뷰션 센터 (Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, California USA)로부터 이용가능한 MOPC-21 및 MPC-11 마우스 종양으로부터 유래하는 세포, 및 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (American Type Culture Collection, Rockville, Maryland USA)으로부터 이용가능한 SP-2 또는 X63-Ag8-653 세포이다. 또한, 인간 골수종 및 마우스-인간 헤테로골수종 세포주는 인간 모노클로날 항체의 제조를 위한 것으로도 기술되어 있다 ([Kozbor, J. Immunol., 133:3001 (1984)]; 및 [Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)]).
하이브리도마 세포가 성장하는 배양 배지를 항원에 대해 지정된 모노클로날 항체의 제조에 대하여 검정한다. 바람직하게는, 하이브리도마 세포에 의해 제조된 모노클로날 항체의 결합 특이성을 면역침전법에 의해 또는 시험관내 결합 검정법, 예를 들어 방사성면역 검정법 (RIA) 또는 효소-연결 면역흡착 검정법 (ELISA)에 의해 결정한다. 모노클로날 항체의 결합 친화성은 예를 들어 문헌 [Munson et al., Anal. Biochem., 107:220 (1980)]의 스캐챠드 (Scatchard) 분석법에 의해 결정할 수 있다.
원하는 특이성, 친화성 및(또는) 활성의 항체를 제조하는 하이브리도마 세포를 동정한 다음, 클론을 제한 희석 과정에 의해 서브클로닝할 수 있으며, 표준 방법에 의해 배양할 수 있다 [Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp. 59-103 (Academic Press, 1986)]. 이러한 목적을 위한 적합한 배양 배지로는 예를 들어 D-MEM 또는 RPMI-1640 배지를 들 수 있다. 또한, 하이브리도마 세포는 동물에서 복수 종양으로서 생체내에서 성장시킬 수 있다.
서브클론에 의해 분비된 모노클로날 항체는 적합하게는 통상의 항체 정제 과정, 예를 들어 단백질 A-세파로스, 히드록실아파티트 (hydroxylapatite) 크로마토그래피, 겔 전기영동, 투석, 또는 친화성 크로마토그래피에 의해 배양 배지, 복수 유체, 또는 혈청으로부터 분리한다.
모노클로날 항체를 코딩하는 DNA는 통상의 과정을 이용해서 (예, 뮤린 항체의 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용함으로써) 쉽게 단리하여 서열분석한다. 하이브리도마 세포는 상기 DNA의 바람직한 공급원으로 작용한다. 일단 단리되면, DNA는 발현 벡터 내로 위치시킬 수 있으며, 이어서 상기 벡터로 숙주 세포, 예를 들어 대장균 세포, 시미안 COS 세포, 차이니스 햄스터 난소 (CHO) 세포, 또는 골수종 세포 (항체 단백질을 제조하지 않음)를 형질감염시켜 재조합 숙주 세포 내에서 모노클로날 항체를 합성한다. 항체를 코딩하는 DNA의 박테리아 중의 재조합 발현에 대한 검토 문헌으로는 문헌 ([Skerra et al, Curr. Opinion in Immunol., 5:256-262 (1993)] 및 [Pluckthun, Immunol. Revs., 130:151-188 (1992)])을 들 수 있다.
추가의 실시양태에서, 모노클로날 항체 또는 항체 단편은 문헌 [McCafferty et al., Nature, 348:552-554 (1990)]에 기재된 기술을 이용해서 생성된 항체 파지 라이브러리로부터 단리할 수 있다. 문헌 [Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991)] 및 [Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991)]은 파지 라이브러리를 이용해서 각각 뮤린 및 인간 항체를 단리하는 것을 기술한다. 이후의 간행물들은 매우 거대한 파지 라이브러리를 구성하기 위한 전략으로서 조합 감염 및 생체내 재조합 [Waterhouse et al., Nuc. Acids. Res., 21:2265-2266 (1993)]뿐만 아니라 체인 셔플링 [Marks et al., Bio/Technology, 10:779-783 (1992)]에 의한 고 친화성 (nM 범위) 인간 항체의 제조를 기술한다. 따라서, 이들 기술은 모노클로날 항체의 단리를 위한 전통적인 모노클로날 항체 하이브리도마 기술에 대한 실행가능한 대안이다.
DNA는 예를 들어 상동성 뮤린 서열 대신 인간 중쇄 및 경쇄 불변 도메인에 대한 코딩 서열을 치환함으로써 (미국 특허 제4816567호 및 문헌 [Morrison, et al. (1984) Proc. Natl Acad. Sci. USA 81:6851]) 또는 비-이뮤노글로불린 폴리펩티드에 대한 코딩 서열의 전체 또는 일부를 이뮤노글로불린 코딩 서열에 공유적으로 연결시킴으로써 변형시킬 수도 있다.
전형적으로, 상기 비-이뮤노글로불린 폴리펩티드로 항체의 불변 도메인을 치환하거나 또는 항체의 하나의 항원-결합(combining) 부위의 가변 도메인을 치환함으로써, 항원에 대한 특이성을 갖는 하나의 항원-결합 부위 및 상이한 항원에 대한 특이성을 갖는 다른 항원-결합 부위를 포함하는 키메라 2가 항체를 생성시킨다.
( iii ) 인간화 항체
인간화 항체는 비인간 공급원으로부터 상기 항체 내로 도입된 하나 이상의 아미노산 잔기를 가질 수 있다. 흔히, 이들 비인간 아미노산 잔기는 전형적으로는 "임포트" 가변 도메인으로부터 취해지는 "임포트" 잔기로서 지칭된다. 본질적으로, 인간화는 원터 (Winter) 및 그의 동료들의 문헌 ([Jones et al., Nature 321:522-525 (1986)]; [Riechmann et al., Nature, 332:323-327 (1988)]; [Verhoeyen et al., Science 239:1534-1536 (1988)])의 방법에 따라 초가변 영역 서열로 인간 항체의 상응하는 서열을 치환함으로써 수행할 수 있다. 따라서, 이러한 "인간화" 항체는 온전한 인간 가변 도메인보다 실질적으로 더 적은 것이 비인간 종으로부터의 상응하는 서열로 치환된 키메라 항체이다 (미국 특허 제4,816,567호). 실제로, 인간화 항체는 전형적으로 일부 초가변 영역 잔기 및 가능하게는 일부 FR 잔기가 설치류 항체 내의 유사한 부위로부터의 잔기에 의해 치환된 인간 항체이다.
인간화 항체의 제조에 사용될 경쇄 및 중쇄 둘 다의 인간 가변 도메인의 선택은 항원성을 감소시키는데 있어서 매우 중요하다. 이른바 "베스트-핏(best-fit)"방법에 따라, 설치류 항체의 가변 도메인의 서열을 공지된 인간 가변-도메인 서열의 전체 라이브러리에 대하여 스크리닝한다. 이어서, 설치류의 서열에 가장 가까운 인간 서열은 인간화 항체에 대한 인간 프레임워크 영역 (FR)으로서 허용된다 ([Sims et al., J. Immunol., 151:2296 (1993)]; [Chothia et al., J. Mol. Biol., 196:901 (1987)]). 다른 방법은 경쇄 또는 중쇄의 특정 하위군의 모든 인간 항체의 컨센서스 서열로부터 유래된 특정 프레임워크 영역을 이용한다. 여러 상이한 인간화 항체에 대하여 동일한 프레임워크가 사용될 수 있다 ([Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992)]; [Presta et al., J. Immunol., 151:2623 (1993)]).
다른 실시양태에서, 항체는 항원에 대한 고 친화성 및 다른 바람직한 생물학적 특성을 보유하도록 인간화될 수 있다. 인간화 항체는 모 서열 및 인간화 서열의 3-차원 모델을 이용하여 모 서열 및 다양한 개념적 인간화 생성물을 분석하는 과정에 의해 제조할 수 있다. 3-차원 이뮤노글로불린 모델이 통상적으로 이용가능하며, 당업계의 숙련가에게 잘 알려져 있다. 선택된 후보 이뮤노글로불린 서열의 가능한 3-차원 형태 구조를 예시하고 디스플레이하는 컴퓨터 프로그램을 이용할 수 있다. 이들 디스플레이를 조사하여 후보 이뮤노글로불린 서열의 기능에서 잔기의 가능한 역할을 분석할 수 있으며, 즉 후보 이뮤노글로불린이 그의 항원과 결합하는 능력에 영향을 주는 잔기를 분석할 수 있다. 이러한 방식으로, FR 잔기가 수용자 및 임포트 서열로부터 선택 및 조합될 수 있어서, 표적 항원에 대한 증가된 친화성과 같은 원하는 항체 특징이 달성된다. 일반적으로, 초가변 영역 잔기는 항원 결합에 영향을 주는데 있어서 직접적이며, 가장 실질적으로 관여한다.
다양한 형태의 인간화 항체가 고려된다. 예를 들어, 인간화 항체는 항체 단편, 예를 들어 Fab일 수 있다. 또는, 인간화 항체는 온전한 항체, 예를 들어 온전한 IgG1 항체일 수 있다.
예로서 예시적인 인간화 항-ErbB2 항체의 제조를 기술한다. 인간화 항체는 예를 들어 인간 가변 중쇄 도메인 내로 혼입된 비인간 초가변 영역 잔기를 포함하며, 문헌 [Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)]에 기재된 가변 도메인 넘버링 시스템을 이용하는 경우에 69H, 71H 및 73H로 이루어진 군으로부터 선택된 위치에서 프레임워크 영역(FR) 치환을 추가로 포함할 수 있다. 한 실시양태에서, 인간화 항체는 위치 69H, 71H 및 73H 중 두 군데 또는 모두에서의 FR 치환을 포함한다. 다른 예는 헤르셉틴 (HERCEPTIN; 등록상표) 제제로부터의 정제된 트라츠주마브 항체의 제조를 기술한다.
( iv ) 인간 항체
인간화에 대한 대안으로서, 인간 항체를 생성시킬 수 있다. 예를 들어, 면역화하는 경우 내인성 이뮤노글로불린 제조의 부재하에 인간 항체의 전체 레퍼토리를 제조할 수 있는 트랜스제닉 동물 (예, 마우스)을 생성시킬 수 있다. 예를 들어, 키메라 및 생식세포 돌연변이체 마우스에서 항체 중쇄 연결 영역 (JH) 유전자를 동종접합성 결실시키면 내인성 항체 제조가 완전히 억제되는 것으로 기술되어 있다. 인간 생식세포 이뮤노글로불린 유전자 배열을 상기 생식세포 돌연변이체 마우스에 전달하면 항원 접종시에 인간 항체가 제조될 것이다 (예를 들어, 문헌 [Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:2551 (1993)]; [Jakobovits et. al., Nature, 362:255-258 (1993)]; [Bruggermann et al., Year in Immuno., 7:33 (1993)]; 및 미국 특허 제5,591,669호, 동 제5,589,369호 및 동 제5,545,807호 참조).
또는, 면역화되지 않은 공여자 유래의 이뮤노글로불린 가변 (V) 도메인 유전자 레퍼토리로부터 시험관 내에서 인간 항체 및 항체 단편을 제조하기 위해 파지 디스플레이 기술 [McCafferty et al., Nature 348:552-553 (1990)]을 이용할 수 있다. 이 기술에 따라, 항체 V 도메인 유전자는 사상(filamentous) 박테리오파지, 예를 들면 M13 또는 fd의 메이저 또는 마이너 코트 단백질 유전자 내에 인-프레임으로 클로닝되며, 상기 파지 입자의 표면상에서 기능성 항체 단편으로서 디스플레이된다. 사상 입자는 파지 게놈의 단일 가닥 DNA 카피를 함유하기 때문에, 항체의 기능적 특성을 기준으로 선별함으로써 이러한 특성을 나타내는 항체를 코딩하는 유전자가 또한 선별된다. 따라서, 파지는 B 세포의 일부 특성을 모방한다. 파지 디스플레이는 다양한 포맷으로 수행될 수 있으며, 이에 대한 검토를 위해서는 문헌 [Johnson, Kevin S. and Chiswell, David J., Current Opinion in Structural Biology 3:564-571 (1993)]을 참조한다. 파지 디스플레이를 위해 V 유전자 절편에 대한 여러 공급원을 이용할 수 있다. 클랙슨 (Clackson) 등은 문헌 [Nature, 352:624-628 (1991)]에서 면역화된 마우스의 비장에서 유래하는 V 유전자에 대한 작은 무작위 조합 라이브러리로부터 다양한 배열의 항-옥사졸론 항체를 단리하였다. 면역화되지 않은 인간 공여자 유래의 V 유전자의 레퍼토리를 구성할 수 있으며, 다양한 배열의 항원 (자가 항원 포함)에 대한 항체는 본질적으로 문헌 ([Marks et al., J. Mol. Biol. 222:581-597 (1991)] 또는 [Griffith et al., EMBO J. 12:725-734 (1993)])에 기재된 기술에 따라 단리할 수 있다. 또한, 미국 특허 제5,565,332호 및 동 제5,573,905호를 참조한다. 상기 논의된 바와 같이, 인간 항체는 시험관내 활성화된 B 세포에 의해 생성시킬 수도 있다 (미국 특허 제5,567,610호 및 동 제5,229,275호 참조). 인간 항-CD30 항체는 미국 특허 출원 제10/338,366호에 기재되어 있다.
(v) 항체 단편
항체 단편을 제조하기 위한 다양한 기술들이 개발되어 왔다. 전통적으로, 항체 단편은 온전한 항체의 단백질분해 절단을 통해 유도되었다 (예를 들어, 문헌 [Morimoto et al., Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117 (1992)] 및 [Brennan et al., Science, 229:81 (1985)] 참조). 그러나, 이들 단편은 재조합 숙주 세포에 의해 직접적으로 제조할 수 있다. 예를 들어, 항체 단편은 상기 논의된 항체 파지 라이브러리로부터 단리할 수 있다. 또는, Fab'-SH 단편은 대장균으로부터 직접적으로 회수할 수 있으며, 화학적으로 커플링시켜 F(ab')2 단편을 형성시킬 수 있다 [Carter et al., Bio/Technology 10:163-167 (1992)]. 다른 접근법에 따라, F(ab')2 단편은 재조합 숙주 세포 배양물로부터 직접적으로 단리할 수 있다. 항체 단편의 제조를 위한 다른 기술은 당업자에게는 자명할 것이다. 다른 실시양태에서, 선택된 항체는 단일쇄 Fv 단편 (scFv)이다. WO 93/16185; 미국 특허 제5,571,894호; 및 미국 특허 제5,587,458호를 참조한다. 또한, 항체 단편은 예를 들어 미국 특허 제5,641,870호에 기재된 바와 같은 "선형 항체"일 수도 있다. 이러한 선형 항체 단편은 단일특이적 또는 이중특이성일 수 있다.
( vi ) 이중특이성 항체
이중특이성 항체는 2개 이상의 상이한 에피토프에 대한 결합 특이성을 갖는 항체이다. 예시적인 이중특이성 항체는 CD30 단백질의 두 상이한 에피토프에 결합할 수 있다. 또는, 항-CD30 아암(arm)은 IgG에 대한 Fc 수용체 (FcγR), 예를 들어 FcγRI (CD64), FcγRII (CD32) 및 FcγRIII (CD16)에 결합하는 아암과 결합함으로써 CD30-발현 세포에 대한 세포 방어 메카니즘에 집중될 수 있다. 또한, 이중특이성 항체를 사용해서 CD30을 발현하는 세포에 세포독성제를 국소화할 수 있다.
전장 이중특이성 항체의 전통적인 제조는 두 이뮤노글로불린 중쇄-경쇄 쌍의 공동발현을 기초로 하는데, 상기 2개의 쇄는 상이한 특이성을 갖는다 [Millstein et al., Nature, 305: 537-539 (1983)]. 이뮤노글로불린 중쇄 및 경쇄의 무작위 분류로 인해, 이들 하이브리도마 (쿼드로마; quadroma)는 10 가지 상이한 항체 분자들로 이루어진 잠재적인 혼합물을 생성하는데, 이중 하나만이 정확한 이중특이성 구조를 갖는다. 일반적으로 친화성 크로마토그래피 단계들에 의해 수행되는 정확한 분자의 정제는 다소 번거로우며, 생성물의 수율은 낮다. 유사한 과정들이 WO 93/08829, 및 문헌 [Traunecker et al., EMBO J., 10:3655-3659 (1991)]에 개시되어 있다. 상이한 접근법에 따라, 원하는 결합 특이성 (항체-항원 결합 부위)을 갖는 항체 가변 도메인을 이뮤노글로불린 불변 도메인 서열에 융합시킨다. 융합은 바람직하게는 힌지, CH2 및 CH3 영역 중 적어도 일부를 포함하는 이뮤노글로불린 중쇄 불변 도메인과의 융합이다. 융합물의 적어도 하나에 존재하는, 경쇄 결합에 필요한 부위를 함유하는 제1 중쇄 불변 영역 (CH1)을 갖는 것이 바람직하다. 이뮤노글로불린 중쇄 융합물 및 원한다면 이뮤노글로불린 경쇄를 코딩하는 DNA를 별도의 발현 벡터에 삽입시켜 적합한 숙주 생물체를 공동형질감염시킨다. 이는, 구조물에 사용된 상이한 비율의 세 가지 폴리펩티드 쇄가 최적의 수율을 제공하는 경우, 실시양태에서 세 가지 폴리펩티드 단편의 상호 비율을 조정하는데 있어서 큰 유연성을 제공한다. 그러나, 동등한 비율의 두 가지 이상의 폴리펩티드 쇄가 높은 수율을 나타내거나 또는 이러한 비율이 특별히 중요하지 않은 경우, 두 가지 또는 세 가지 폴리펩티드 쇄에 대한 코딩 서열을 하나의 발현 벡터 내에 삽입할 수 있다.
이러한 접근법의 한 실시양태에서, 이중특이성 항체는 하나의 아암에 제1 결합 특이성을 갖는 하이브리드 이뮤노글로불린 중쇄 및 다른 아암에서의 (제2 결합 특이성을 제공하는) 하이브리드 이뮤노글로불린 중쇄-경쇄 쌍으로 구성된다. 이중특이성 분자의 절반에만 있는 이뮤노글로불린 경쇄의 존재가 용이한 분리 방식을 제공하기 때문에, 상기 비대칭 구조는 원치않는 이뮤노글로불린 쇄 배합물로부터 원하는 이중특이성 화합물의 분리를 촉진시키는 것으로 밝혀졌다. 이러한 접근법은 WO 94/04690에 개시되어 있다. 이중특이성 항체를 생성시키는 추가의 세부사항에 대하여는, 예를 들어 문헌 [Suresh et al., Methods in Enzymology, 121:210 (1986)]을 참조한다.
미국 특허 제5,731,168호에 기재된 다른 접근법에 따르면, 항체 분자의 쌍 사이의 계면을 조작하여, 재조합 세포 배양물로부터 회수되는 이종이량체의 비율을 최대화할 수 있다. 바람직한 계면은 항체 불변 도메인의 CH3 도메인의 적어도 일부를 포함한다. 이러한 방법에서, 제1 항체 분자의 계면으로부터 하나 이상의 작은 아미노산 측쇄를 더 큰 측쇄 (예, 티로신 또는 트립토판)로 대체한다. 더 큰 아미노산 측쇄를 더 작은 측쇄 (예, 알라닌 또는 트레오닌)로 대체함으로써, 더 큰 측쇄와 동일 또는 유사한 크기의 보상성 "공동"을 제2 항체 분자의 계면 상에 생성시킨다. 이는 이종이량체의 수율이 동종이량체와 같은 다른 원치않는 최종 생성물의 수율을 초과하도록 증가시키는 메카니즘을 제공한다.
항체 단편으로부터 이중특이성 항체를 생성시키기 위한 기술은 또한 문헌에 기술되어 있다. 예를 들어, 화학 결합을 사용해서 이중특이성 항체를 제조할 수 있다. 문헌 [Brennan et al., Science, 229:81 (1985)]에는 온전한 항체를 단백질분해에 의해 절단하여 F(ab')2 단편을 생성시키는 과정이 기재되어 있다. 이들 단편을 디티올 복합체인 나트륨 아르세니트의 존재하에 환원시켜 근처의 디티올을 안정화하고 분자간 디술피드 형성을 방지한다. 이어서, 생성된 Fab' 단편을 티오니트로벤조에이트 (TNB) 유도체로 전환시킨다. 이후, Fab'-TNB 유도체들 중 하나를 메르캅토에틸아민을 사용한 환원에 의해 Fab'-티올로 재전환시키고, 등몰량의 다른 Fab'-TNB 유도체와 혼합하여 이중특이성 항체를 형성시킨다. 제조된 이중특이성 항체는 효소의 선택적 고정을 위한 작용제로서 사용할 수 있다.
최근의 진전에 의해 대장균으로부터 Fab'-SH 단편을 직접 회수하는 것이 용이해졌으며, 이를 화학적으로 커플링시켜 이중특이성 항체를 형성시킬 수 있다. 문헌 [Shalaby et al., J. Exp. Med., 175:217-225 (1992)]에는 완전한 인간화 이중특이성 항체 F(ab')2 분자를 제조하는 것에 대하여 기술되어 있다. 각각의 Fab'단편이 대장균으로부터 별도로 분비되었으며, 시험관내에서 지정된 화학적 커플링 처리함으로써 이중특이성 항체를 형성시켰다.
재조합 세포 배양물로부터 이중특이성 항체 단편을 직접적으로 제조 및 단리하는 다양한 기술들이 또한 기술되어 있다. 예를 들어, 류신 지퍼를 사용해서 이중특이성 항체를 제조하였다 [Kostelny et al., J. Immunol., 148(5):1547-1553 (1992)]. Fos 및 Jun 단백질로부터의 류신 지퍼 펩티드를 유전자 융합에 의해 두 가지 상이한 항체의 Fab' 부위에 연결하였다. 항체 동종이량체를 힌지 영역에서 환원시켜 단량체를 제조한 다음, 재산화시켜 항체 이종이량체를 형성시켰다. 이러한 방법은 항체 동종이량체를 제조하는데 이용될 수도 있다. 문헌 [Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)]에 기재된 "디아바디" 기술은 이중특이성 항체 단편을 제조하기 위한 다른 메카니즘을 제공하였다. 단편은, 너무 짧아서 동일 쇄 상의 두 도메인 사이에 쌍을 이루게 할 수 없는 링커에 의해 경쇄 가변 도메인 (VL)에 접속된 중쇄 가변 도메인 (VH)을 포함한다. 따라서, 하나의 단편의 VH 및 VL 도메인이 다른 단편의 상보적 VL 및 VH 도메인과 강제로 쌍을 이루게 됨으로써 2개의 항원-결합 부위를 형성한다. 단일쇄 Fv (sFv) 이량체를 사용해서 이중특이성 항체 단편을 제조하는 다른 전략이 또한 보고되었다. 문헌 [Gruber et al., J. Immunol., 152:5368 (1994)]을 참조한다.
결합가가 2를 초과하는 항체가 고려된다. 예를 들어, 삼중특이적 항체를 제조할 수 있다 [Tutt et al. J. Immunol. 147:60 (1991)].
( vii ) 다른 아미노산 서열 변형
본원에 기재된 항체의 아미노산 서열 변형이 고려된다. 예를 들어, 항체의 결합 친화성 및(또는) 다른 생물학적 특성을 향상시키는 것이 바람직할 수 있다. 항체의 아미노산 서열 변이체는 항체 핵산에 적절한 뉴클레오티드 변화를 도입하거나 또는 펩티드 합성에 의해 제조한다. 이러한 변형으로는 예를 들어 항체의 아미노산 서열 내의 잔기들로부터의 결실 및(또는) 그러한 잔기들로의 삽입 및(또는) 상기 잔기들의 치환을 들 수 있다. 최종 구조물이 원하는 특징을 보유한다면, 결실, 삽입 및 치환의 임의의 조합을 최종 구조물에 적용한다. 또한, 아미노산 변화는 항체의 번역 후 프로세스를 변화시킬 수도 있으며, 예를 들어 글리코실화 부위의 수 또는 위치를 변화시킨다.
돌연변이유발을 위한 바람직한 위치인 항체의 특정 잔기 또는 영역을 확인하는 유용한 방법은 문헌 [Cunningham and Wells Science, 244:1081-1085 (1989)]에 기재된 바와 같이 "알라닌 스캐닝 돌연변이유발"이라고 불린다. 여기서, 잔기 또는 표적 잔기들의 군이 확인되며 (예, 하전된 잔기, 예를 들면 arg, asp, his, lys 및 glu), 아미노산과 항원의 상호작용에 영향을 주는 중성 또는 음으로 하전된 아미노산 (가장 바람직하게는 알라닌 또는 폴리알라닌)에 의해 대체된다. 이어서, 치환 부위에서 또는 이 부위에 대한 추가의 또는 다른 변이체를 도입함으로써, 치환에 대한 기능적 민감도를 입증하는 아미노산 분류를 상세하게 설명한다. 따라서, 아미노산 서열 변화를 도입하기 위한 부위는 미리 결정되지만, 돌연변이 그 자체의 특성은 미리 결정될 필요가 없다. 예를 들어, 주어진 부위에서 돌연변이의 성능을 분석하기 위해, 표적 코돈 또는 영역에서 ala 스캐닝 또는 무작위 돌연변이유발을 수행하고, 발현된 항체 변이체를 원하는 활성에 대하여 스크리닝한다.
아미노산 서열 삽입은 단일 또는 복수개 아미노산 잔기의 서열내 삽입뿐만 아니라, 하나의 잔기로부터 수백개 이상의 잔기를 함유하는 폴리펩티드에 이르는 길이 범위에서의 아미노- 및(또는) 카르복실-말단 융합을 포함한다. 말단 삽입의 예는 N-말단 메티오닐 잔기를 갖는 항체 또는 세포독성 폴리펩티드에 융합된 항체를 포함한다. 항체 분자의 다른 삽입 변이체는 항체의 혈청 반감기를 증가시키는 폴리펩티드 또는 효소에 대한 항체 (예, ADEPT의 경우)의 N- 또는 C-말단으로의 융합을 포함한다.
다른 유형의 변이체는 아미노산 치환 변이체이다. 이들 변이체는 상이한 잔기에 의해 대체된 항체 분자 내에 하나 이상의 아미노산 잔기를 갖는다. 치환 돌연변이유발에 대한 가장 큰 관심 부위는 초가변 영역을 포함하지만, FR 변화가 또한 고려된다.
항체의 생물학적 특성에서의 실질적인 변화는, (a) 치환 영역에서 폴리펩티드 주쇄의 구조, 예를 들어 시트 또는 나선형 형태, (b) 표적 부위에서 분자의 전하 또는 소수성, 또는 (c) 측쇄의 벌크(bulk)를 유지하는데 있어서 상당히 다른 효과를 나타내는 치환을 선택함으로써 달성된다. 자연 발생적인 잔기는 공통적인 측쇄 특성을 기준으로 하기와 같은 군으로 분류된다:
(1) 소수성: norleucine, met, ala, val, leu, ile;
(2) 중성 친수성: cys, ser, thr;
(3) 산성: asp, glu;
(4) 염기성: asn,gln, his, lys, arg;
(5) 쇄 배향에 영향을 주는 잔기: gly, pro; 및
(6) 방향족: trp, tyr, phe.
비-보존적 치환은 이들 종류 중 어느 한 구성원을 다른 종류의 것으로 교환하는 것을 수반할 것이다.
치환 변이체의 특히 바람직한 유형은 모 항체 (예, 인간화 또는 인간 항체)의 하나 이상의 초가변 영역 잔기를 치환하는 것을 포함한다. 일반적으로, 추가의 개발을 위해 선택된 생성된 변이체는 그의 생성이 유래되는 모 항체에 비해 향상된 생물학적 특성을 갖게 될 것이다. 이러한 치환 변이체를 생성시키는 편리한 방식은 파지 디스플레이를 이용하는 친화성 성숙을 포함한다. 요약하면, 여러 초가변 영역 부위 (예, 6-7 부위)를 돌연변이시켜 각 부위에서 모든 가능한 아미노 치환을 일으킨다. 이와 같이 제조된 항체 변이체는 각 입자 내에 패키지화된 M13의 유전자 III 생성물에 대한 융합물로서 사상 파지 입자로부터 1가 방식으로 디스플레이된다. 이후, 파지-디스플레이된 변이체를 본원에 개시된 바와 같이 상기 변이체의 생물학적 활성 (예, 결합 친화성)에 대하여 스크리닝한다. 변형을 위한 후보 초가변 영역 부위를 확인하기 위해, 알라닌 스캐닝 돌연변이유발을 수행하여, 항원 결합에 상당히 기여하는 초가변 영역 잔기를 확인할 수 있다. 별법으로 또는 추가로, 항체와 항원 사이의 접촉점을 확인하기 위해 항원-항체 복합체의 결정 구조를 분석하는 것이 유익할 수 있다. 이러한 접촉 잔기 및 인접 잔기는 본원에 상술된 기술에 따라 치환하기 위한 후보이다. 일단 이러한 변이체가 생성되면, 변이체 패널을 본원에 기재된 바와 같이 스크리닝하고, 하나 이상의 관련 검정에서 우수한 특성을 나타내는 항체를 추가의 개발을 위해 선택할 수 있다.
이펙터 기능과 관련하여, 예를 들면 항체의 항원-의존성 세포-매개 세포독성 (ADCC) 및(또는) 보체 의존성 세포독성 (CDC)을 증대시키기 위해 본 발명의 항체를 개질시키는 것이 바람직할 수 있다. 이는 항체의 Fc 영역에 하나 이상의 아미노산 치환을 도입함으로써 달성될 수 있다. 별법으로 또는 부가적으로, 시스테인 잔기(들)를 Fc 영역에 도입하여, 이 영역에서의 사슬간 디술피드 결합 형성을 가능하게 할 수 있다. 그 결과 생성된 동종이량체 항체는 향상된 내재화능 및(또는) 증가된 보체-매개 세포 사멸 및 항체-의존성 세포성 세포독성 (ADCC)을 가질 수 있다 (문헌 [Caron et al. J. Exp Med. 176:1191-1195 (1992)] 및 문헌 [Shopes, B. J. Immunol. 148:2918-2922 (1992)] 참조). 증대된 항-종양 활성을 갖는 동종이량체 항체를 또한 문헌 [Wolff et al. Cancer Research 53:2560-2565 (1993)]에 개시된 헤테로양기능성 가교제를 사용하여 제조할 수도 있다. 별법으로, 2개의 Fc 영역을 갖는 항체가 엔지니어링될 수 있고 그에 따라 증대된 보체 용해 및 ADCC 능력을 가질 수 있다 (문헌 [Stevenson et al. Anti-Cancer Drug Design 3:219-230 (1989)] 참조).
항체의 혈청 반감기를 연장시키기 위해, 예를 들면, 미국 특허 제5739277호에 개시되어 있는 바와 같이 재이용(salvage) 수용체 결합 에피토프를 항체 (특히 항체 단편)에 도입할 수 있다. 본원에서 사용되는 "재이용 수용체 결합 에피토프"라는 용어는 IgG 분자의 생체내 혈청 반감기를 연장시킬 수 있는 IgG 분자 (예를 들면, IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4)의 Fc 영역의 에피토프를 지칭한다.
(viii) 글리코실화 변이체
본 발명의 ADC의 항체는 그들의 불변 영역 보존 위치에서 글리코실화될 수 있다 (문헌 [Jefferis and Lund, (1997) Chem. Immunol. 65:111-128]; 문헌 [Wright and Morrison, (1997) TibTECH 15:26-32]). 이뮤노글로불린의 올리고당 측쇄는 단백질의 기능 (문헌 [Boyd et al., (1996) Mol. Immunol. 32:1311-1318]; 문헌 [Wittwe and Howard, (1990) Biochem. 29:4175-4180]) 및 배좌(conformation)에 영향을 미칠 수 있는 당단백질 부분과 당단백질의 현재 3차 표면 간의 분자내 상호작용 (상기 Hefferis 및 Lund의 문헌; 문헌 [Wyss and Wagner, (1996) Current Opin. Biotech. 7:409-416])에 영향을 미친다. 올리고당은 또한 특정 인식 구조에 따라 특정 분자에 대해 해당 당단백질을 표적화하는 작용을 할 수 있다. 예를 들면, 갈락토실화된 IgG에서, CH2 사이 공간으로부터의 올리고당 잔기 '플립(flip)' 및 말단 N-아세틸글로코사민 잔기는 만노스 결합 단백질을 결합시키는 데 이용된다는 것이 보고되었다 (문헌 [Malhotra et al., (1995) Nature Med. 1:237-243]). 중국 햄스터 난소 (CHO) 세포에서 생산된 CAMPATH-1H (인간 림프구의 CDw52 항원을 인식하는 재조합 인간화 뮤린 모노클로날 IgG1 항체)로부터의 올리고당을 글리코펩티다제에 의해 제거하는 것은 보체 매개 용해 (CMCL)의 완전한 감소를 초래하고 (문헌 [Boyd et al., (1996) Mol. Immunol. 32:1311-1318]), 반면 뉴라미니다제를 사용하여 시알산 잔기를 선택적으로 제거하는 것은 DMCL의 감소를 초래하지 않는다. 항체의 글리코실화는 또한 항체-의존성 세포성 세포독성 (ADCC)에 영향을 미치는 것으로 보고되었다. 특히, β(1,4)-N-아세틸글루코사미닐트랜스퍼라제 III (GnTIII)의 테트라시클린-조절 발현, 이분지형 GlcNAc의 글리코실트랜스퍼라제 촉매 형성이 일어난 CHO 세포는 향상된 ADCC 활성을 갖는 것으로 보고되었다 (문헌 [Umana et al. (1999) Mature Biotech. 17:176-180]).
항체의 글리코실화는 전형적으로 N-연결형 또는 O-연결형이다. N-연결형은 탄수화물 잔기가 아스파라긴 잔기의 측쇄에 부착되는 것을 지칭한다. 트리펩티드 서열 (X가 프롤린을 제외한 임의의 아미노산인, 아스파라긴-X-세린 및 아스파라긴-X-트레오닌)은 탄수화물 잔기가 아스파라긴 측쇄에 효소작용으로 부착되기 위한 인식 서열이다. 따라서, 폴리펩티드에서 상기 트리펩티드 서열의 존재는 잠재적인 글리코실화 부위를 형성한다. O-연결형 글리코실화는 당 N-아세틸갈락토사민, 갈락토스, 또는 크실로스 중 하나가 히드록시아미노산 (5-히드록시프롤린 또는 5-히드록시리신 또한 사용될 수 있지만, 가장 통상적으로는 세린 또는 트리오닌)에 부착되는 것을 지칭한다.
항체의 글리코실화 변이체는 항체의 글리코실화 패턴이 변화된 변이체이다. 변화란 항체에 존재하는 하나 이상의 탄수화물 잔기를 결실시키고, 하나 이상의 탄수화물 잔기를 항체에 부가하고, 글리코실화 조성 (글리코실화 패턴), 글리코실화 정도를 변화시키는 것 등을 의미한다.
글리코실화 부위를 항체에 부가하는 것은 아미노산 서열을 하나 이상의 전술한 트리펩티드 서열을 함유하도록 변화시킴으로써 편리하게 행해진다 (N-연결형 글리코실화 부위일 경우). 또한 오리지널 항체의 서열에 하나 이상의 세린 또는 트레오닌 잔기를 부가하거나 또는 치환함으로써 변화시킬 수도 있다 (O-연결형 글리코실화 부위일 경우). 마찬가지로, 글리코실화 부위의 제거는 항체의 천연 글리코실화 부위 내에서 아미노산을 변화시킴으로써 행해질 수 있다.
아미노산 서열은 통상적으로 기본 핵산 서열을 변화시킴으로써 변화된다. 상기 방법에는 천연 기원으로부터의 단리 (자연 발생하는 아미노산 서열 변이체일 경우에) 또는 올리고뉴클레오티드-매개 (또는 부위-지정) 돌연변이유발, PCR 돌연변이유발, 및 항체의 앞서 제조된 변이체 또는 비-변이체 버전의 카셋트 돌연변이유발에 의한 제조가 포함되나, 이들로 한정되지는 않는다.
항체의 글리코실화 (글리코실화 패턴을 포함함)는 또한 아미노산 서열 또는 기본 뉴클레오티드 서열을 변화시키지 않으면서 변화될 수 있다. 글리코실화는 항체를 발현시키기 위해 사용되는 숙주 세포에 크게 좌우된다. 잠재적인 치료제로서의 재조합 당단백질, 예를 들어 항체의 발현을 위해 사용되는 세포 유형은 거의 천연 세포가 아니기 때문에, 항체의 글리코실화 패턴의 상당한 변이가 예상될 수 있다 (예를 들면, 문헌 [Hse et al., (1997) J. Biol. Chem. 272:9062-9070] 참조). 숙주 세포의 선택과 함께, 항체의 재조합 생산 중에 글리코실화에 영향을 미치는 인자에는 성장 모드, 배지 제형, 배양 밀도, 산소 공급, pH, 정제 방법 등이 포함된다. 올리고당 생산에 관여하는 특정 효소를 도입하거나 또는 과발현시키는 것을 비롯한, 특정 숙주 유기체에서 달성되는 글리코실화 패턴을 변화시키기 위한 다양한 방법이 제안되었다 (미국 특허 제5047335호; 동 제5510261호; 동 제5278299호). 글리코실화, 또는 특정 유형의 글리코실화는 예를 들면, 엔도글리코시다제 H (Endo H)를 사용하여 당단백질로부터 효소작용에 의해 제거될 수 있다. 또한, 재조합 숙주 세포는 유전공학적 조작될 수 있는데, 예를 들면 특정 유형의 다당류를 프로세싱할 때 손상을 일으킬 수 있다. 상기 기술 및 유사 기술은 당업계에 널리 공지되어 있다.
항체의 글리코실화 구조는 렉틴 크로마토그래피, NMR, 질량 분석법, HPLC, GPC, 단당류 조성 분석법, 연속 효소 분해 및 HPAEC-PAD (전하 기준으로 올리고당을 분리하기 위해 고 pH 음이온 교환 크로마토그래피를 사용함)를 비롯한, 통상적인 탄수화물 분석 기술을 사용하여 용이하게 분석할 수 있다. 분석 목적의 올리고당 방출 방법 또한 공지되어 있으며, 효소 처리 (통상적으로 펩티드-N-글리코시다제 F/엔도-β-갈락토시다제를 사용하여 수행됨), 주로 O-연결형 구조물을 방출하기 위한 극한 알칼리성 환경을 사용하는 제거, 및 N- 및 O- 연결된 올리고당을 둘다 방출하기 위한 무수 히드라진을 사용하는 화학적 방법이 포함되고, 이들로 한정되지는 않는다.
4.5.2a 항체-약물 접합체 ( ADC )의 스크리닝
트랜스제닉 동물 및 세포주는 루이스 Y, CD30, CD40, 및 CD70을 비롯한 단백질의 과발현과 관련있는 질환 또는 장애의 예방적 또는 치료적 처치로서 잠재력을 갖는 항체 약물 접합체 (ADC)를 스크리닝하는 데 있어서 특히 유용하다. 트랜스제닉 동물 및 세포주는 HER2의 과발현과 관련있는 질환 또는 장애의 예방적 또는 치료적 처치로서 잠재력을 갖는 항체 약물 접합체 (ADC)를 스크리닝하는 데 있어서 특히 유용하다 (미국 특허 제6632979호). 유용한 ADC의 스크리닝은 소정의 투여량 범위에 걸쳐서 후보 ADC를 트랜스제닉 동물에 투여하고, 수많은 시점에서 ADC가 평가되는 질환 또는 장애에 미치는 영향(들)을 검정하는 단계를 포함할 수 있다. 별법으로, 또는 부가적으로, 적용 가능하다면, 약물을 질환 유발인자에 노출되기 전에 또는 노출과 동시에 투여할 수 있다. 후보 ADC를 연속적으로 및 개별적으로, 또는 중간- 또는 고-처리량 스크리닝 포맷하에서 병행하여 스크리닝할 수 있다. 질환 또는 장애의 예방적 또는 치료적 처치를 위해 사용되는 ADC가 스크리닝될 수 있는 속도는 단지 데이타의 검출/측정/분석을 비롯한, 합성 또는 스크리닝 방법의 속도에 의해서 제한된다.
한 실시양태는 (a) 안정한 신장 세포 암 세포주로부터의 세포를 비-인간 동물에 이식하고, (b) ADC 약물 후보를 비-인간 동물에 투여하고, (c) 후보가 이식된 세포주로부터의 종양 형성을 억제하는 능력을 측정하는 단계를 포함하는 스크리닝 방법이다.
또다른 실시양태는 (a) 안정한 호치킨병(Hodgkin's disease) 세포주로부터의 세포를 ADC 약물 후보와 접촉시키고 (b) ADC 후보가 CD40의 리간드 활성화를 차단하는 능력을 평가하는 단계를 포함하는 스크리닝 방법이다.
또다른 실시양태는 (a) 안정한 호치킨병 세포주로부터의 세포를 ADC 약물 후보와 접촉시키고 (b) ADC 후보가 세포 사멸을 유도하는 능력을 평가하는 단계를 포함하는 스크리닝 방법이다. 한 실시양태에서 ADC 후보가 아팝토시스를 유도하는 A능력을 평가한다.
한 실시양태는 (a) 안정한 암 세포주로부터의 세포를 비-인간 동물에 이식하고, (b) ADC 약물 후보를 비-인간 동물에 투여하고, (c) 후보가 이식된 세포주로부터의 종양 형성을 억제하는 능력을 측정하는 단계를 포함하는 스크리닝 방법이다. 본 발명은 또한 (a) 안정한 유방암 세포주로부터의 세포를 약물 후보와 접촉시키고 (b) ADC 후보가 안정한 세포주의 성장을 억제하는 능력을 평가하는 단계를 포함하는, HER2의 과발현을 특징으로 하는 질환 또는 장애의 치료를 위한 ADC 후보의 스크리닝 방법에 관한 것이다.
또다른 실시양태는 (a) 안정한 암 세포주로부터의 세포를 ADC 약물 후보와 접촉시키고 (b) ADC 후보가 HER2의 리간드 활성화를 차단하는 능력을 평가하는 단계를 포함하는 스크리닝 방법이다. 한 실시양태에서 ADC 후보가 헤레굴린 결합을 차단하는 능력을 평가한다. 또다른 실시양태에서, ADC 후보가 리간드-자극 티로신 인산화를 차단하는 능력을 평가한다.
또다른 실시양태는 (a) 안정한 암 세포주로부터의 세포를 ADC 약물 후보와 접촉시키고 (b) ADC 후보가 세포 사멸을 유도하는 능력을 평가하는 단계를 포함하는 스크리닝 방법이다. 한 실시양태에서, ADC 후보가 아팝토시스를 유도하는 능력을 평가한다.
또다른 실시양태는 (a) ADC 약물 후보를 젖샘 세포에서 천연 인간 HER2 단백질 또는 그의 단편이 과발현된 트랜스제닉 비-인간 포유동물, 또는 상기 트랜스제닉 비-인간 포유동물로부터 이식된 종양을 지닌 비-인간 포유동물에 투여하고, (b) ADC 후보가 표적 질환 또는 장애에 미치는 영향을 평가하는 단계를 포함하는 스크리닝 방법이며, 상기 트랜스제닉 포유동물은 젖샘으로의 발현을 지시하는 전사 조절 서열에 작동가능하게 연결된, 천연 인간 HER2의 생물학적 활성을 갖는 천연 인간 HER2 단백질 또는 그의 단편을 코딩하는 핵산 서열이 그의 게놈으로 안정하게 통합되고, 항-HER2 항체 처치에 반응하지 않거나 또는 약하게 반응하는 유방 종양을 발달시킨다. 상기 질환 또는 장애는 HER2-과발현 암, 예컨대 유방암, 난소암, 위암, 자궁내막암, 침샘암, 폐암, 신장암, 결장암, 갑상선암, 췌장암 및 방광암일 수 있으나, 이들로 한정되지는 않는다. 암은 바람직하게는 세포당 약 500,000 카피 이상, 보다 바람직하게는 세포당 약 2,000,000 카피 이상으로 HER2가 발현된 유방암이다. 당업계에 널리 공지되어 있고 후술되어 있는 검정 방법을 사용하여, ADC 약물 후보를, 예를 들면 세포 사멸 및(또는) 아팝토시스를 유도하는 능력에 대해 평가할 수 있다.
한 실시양태에서, 후보 ADC를 소정의 투여량 범위로 트랜스제닉 동물에 투여하고, 시간에 따른 동물의 화합물에 대한 생리 반응을 평가함으로써 스크리닝한다. 평가될 화합물의 화학적 특성에 따라, 경구 투여되거나, 또는 적합한 주사에 의해 투여될 수 있다. 몇몇 경우에, 화합물의 효능을 증대시키는 보조인자와 함께 화합물을 투여하는 것이 적합할 수 있다. 대상체 트랜스제닉 동물로부터 유래된 세포주를 사용하여 각종 장애를 치료하는 데 유용한 화합물을 스크리닝한다면, 시험 화합물을 적합한 시간에 세포 배양 배지에 첨가하고, 화합물에 대한 세포 반응을 적합한 생화학적 및(또는) 조직학적 검정법을 사용하여 시간에 따라 평가한다. 몇몇 경우에, 해당 화합물을 화합물의 효능을 증대시킬 보조인자와 함께 배양 배지에 적용하는 것이 적합할 수 있다.
따라서, 단백질의 존재가 비정상적인 세포 기능과 상관관계가 있고, 때로는 종양의 발달과 관련있는 세포 증식 및(또는) 분화의 발병과 상관관계가 있는, 표적 단백질을 특이적으로 표적화하고 그와 결합하는 ADC를 확인하기 위한 검정법이 제공된다.
ErbB (예를 들면, ErbB2) 수용체의 리간드 활성화를 차단하는 ADC를 확인하기 위해, ErbB 리간드가 ErbB(ErbB2) 수용체 (예를 들어, 해당 ErbB 수용체가 ErbB 헤테로-올리고머를 형성하는 또다른 ErbB 수용체와 함께)를 발현하는 세포에 결합하는 것을 차단하는 화합물의 능력을 측정할 수 있다. 예를 들면, HER2가 과발현된 트랜스제닉 동물로부터 단리되고 형질감염되어 또다른 ErbB 수용체 (HER2가 함께 헤테로-올리고머를 형성함)를 발현하는 세포를 ADC와 함께 인큐베이션, 즉 배양하고, 그 후에 표지된 ErbB 리간드에 노출시킬 수 있다. 리간드가 ErbB 헤테로-올리고머의 ErbB 수용체에 결합하는 것을 차단하는 화합물의 능력을 그 후에 평가할 수 있다.
본원에서, 예를 들면, HER2가 과발현되고, 트랜스제닉 비-인간 포유동물 (예, 마우스)로부터 확립된, 유방 종양 세포주에 헤레굴린(HRG)이 결합하는 것을 후보 ADC에 의해 억제하는 것은 24-웰-플레이트 포맷으로 빙상에서 단층 배양물을 사용하여 행히질 수 있다. 항-ErbB2 모노클로날 항체를 각 웰에 첨가하고 30분 동안 인큐베이션할 수 있다. 125I-표지된 rHRGβ1177-224 (25,000 cpm)를 그 후에 첨가하고, 인큐베이션을 4 내지 16시간 동안 계속할 수 있다. 투여량 반응 곡선을 작성하고 해당 화합물의 IC50 값 (세포독성 활성)을 계산할 수 있다.
별법으로, 또는 부가적으로, ADC가 ErbB 헤테로-올리고머에 존재하는 ErbB 수용체의 ErbB 리간드-자극 티로신 인산화를 차단하는 능력을 평가할 수 있다. 예를 들면, 본원에서 트랜스제닉 동물로부터 확립된 세포주를 시험 ADC와 함께 인큐베이션하고 그 후에 항-포스포티로신 모노클로날 항체 (검출가능한 표지와 임의로 접합됨)를 사용하여 ErbB 리간드-의존성 티로신 인산화 활성을 검정할 수 있다. 미국 특허 제5766863호에 개시된 키나제 수용체 활성화 검정법 또한 ErbB 수용체 활성화 및 화합물에 의한 상기 활성의 차단을 측정하기 위해 이용가능하다.
한 실시양태에서, 본질적으로 후술된 바와 같이 MCF7 세포에서 pl80 티로신 인산화의 HRG 자극을 억제하는 ADC를 스크리닝할 수 있다. 예를 들면, HER2-트랜스제닉 동물로부터 확립된 세포주를 24-웰 플레이트에 플레이팅할 수 있고 화합물을 각 웰에 첨가하고 실온에서 30분 동안 인큐베이션할 수 있으며, 그 후에 rHRGβ1177-244를 0.2 nM의 최종 농도까지 각 웰에 첨가할 수 있고, 인큐베이션을 약 8분 동안 계속할 수 있다. 배지는 각 웰로부터 흡인될 수 있고, SDS 샘플 완충액 (5％ SDS, 25 mM DTT, 및 25 mM 트리스-HCl, pH 6.8) 100 ㎕를 첨가함으로써 반응을 중지시킬 수 있다. 각 샘플 (25 ㎕)을 4 내지 12％ 구배의 겔 (노벡스(Novex)) 상에서 전기영동하고 그 후에 폴리비닐리덴 디플루오라이드 막으로 전기영동에 의해 이동시킬 수 있다. 항포스포티로신 (1 ㎍/ml) 이뮤노블롯이 발달될 수 있고, Mr-180,000에서 우세한 반응 밴드의 강도를 반사 농도계측기로 정량화할 수 있다. 수용체 인산화의 억제를 평가하기 위한 별법은 문헌 [Sadick et al. (1998) Jour. of Pharm. and Biomed. Anal.]의 KIRA (키나제 수용체 활성화) 검정법이다. p180 티로신 인산화의 HRG 자극을 억제하는 것으로 공지되어 있는, HER2에 대한 잘 확립된 모노클로날 항체 몇몇이 이 검정법에서 양성 대조군으로서 사용될 수 있다. 반사 농도계측기에 의해 측정된 p180 티로신 인산화의 HRG 자극의 억제에 대한 투여량-반응 곡선을 작성할 수 있고 해당 화합물의 IC50을 계산할 수 있다.
또한 시험 ADC가 HER2-트랜스제닉 동물로부터 유래된 세포주에 미치는 성장 억제 영향을, 예를 들면 본질적으로 문헌 [Schaefer et al. (1997) Oncogene 15:1385-1394]에 개시된 바와 같이 평가할 수 있다. 상기 검정법에 따라, 세포를 다양한 농도의 시험 화합물로 4일 동안 처리하고 크리스털 바이올렛 또는 레독스 염료 (알라마르 블루(Alamar Blue))로 염색할 수 있다. 화합물과 함께 인큐베이션하면 MDA-MB-175 세포에서 모노클로날 항체 2C4에 의해 나타나는 효능과 유사하게 상기 세포주에서 성장 억제 효과를 확인할 수 있다 (상기 Schaefer 등의 문헌). 추가의 실시양태에서, 외인성 HRG는 이러한 억제를 유의하게 역전시키지 않을 것이다.
해당 항원을 특이적으로 표적화하는 성장 억제 화합물을 확인하기 위하여, 트랜스제닉 동물로부터 유래된 해당 항원이 과발현된 암 세포의 성장을 억제하는 화합물을 스크리닝할 수 있고, 미국 특허 제5677171호에 개시된 검정법을 행할 수 있다. 상기 검정법에 따라, 해당 항원이 과발현된 암 세포를 10％의 소 태아 혈청, 글루타민 및 페니실린 스트렙토마이신이 보충된, F12와 DMEM 배지의 1:1 혼합물에서 성장시킨다. 세포를 35 mm의 세포 배양 디쉬에 20,000개의 세포 (2 ml/35 mm 디쉬)로 플레이팅하고 시험 화합물을 다양한 농도로 첨가한다. 6일 후에, 비처리된 세포와 비교하여, 세포수를 전자 카울터(COULTER; 상표명) 세포개수 측정기를 사용하여 카운팅한다. 약 20 내지 100％ 또는 약 50 내지 100％ 세포 성장을 억제하는 화합물이 성장 억제 화합물로 선별될 수 있다.
세포 사멸을 유도하는 화합물을 선별하기 위해, 예를 들면, PI, 트립판 블루 또는 7AAD 흡수에 의해 표시되는, 막 무결성의 손상을 대조와 비교하여 평가할 수 있다. PI 흡수 검정법은 트랜스제닉 동물의 해당 종양 조직으로부터 단리된 세포를 사용한다. 상기 검정법에 따라서, 세포를 10％의 가열-불활성화된 FBS (하이클론(Hyclone)) 및 2 mM의 L-글루타민이 보충된, D-MEM(Dulbecco's Modified Eagle Medium):Ham's F-12 (50:50)에서 배양한다. 따라서, 상기 검정법은 보체 및 면역 이펙터 세포의 부재하에 행해진다. 세포를 100 x 20 mm 디쉬에 디쉬당 3 x 106의 밀도로 접종하고 부착되도록 밤새 둔다. 그 후에 배지를 제거하고 신선한 배지 단독으로 또는 다양한 농도의 화합물을 함유하는 배지로 교체한다. 세포를 3일 동안 인큐베이션한다. 각 처리 후에, 단층을 PBS로 세척하고 트립신화에 의해 분리한다. 그 후에 세포를 1200 rpm으로 5분 동안 4℃에서 원심분리하고, 펠렛을 3 ml의 냉 Ca2 + 결합 완충액 (10 mM Hepes, pH 7.4, 140 mM NaCl, 2.5 mM CaCl2)에 재현탁시키고, 세포 덩어리를 제거하기 위해 35 mm 스트레이너(strainer)-캡핑 12 x 75 mm 튜브에 나눈다 (튜브당 1 ml, 처리군당 3개의 튜브). 그 후에 튜브에 PI (10 ㎍/ml)를 가한다. 샘플을 파스칸(FACSCAN; 상표명) 유세포 분석기 및 파스컨버트(FACSCONVERT; 상표명) 셀퀘스트(CellQuest) 소프트웨어 (벡톤 디킨슨(Becton Dickinson))를 사용하여 분석할 수 있다. PI 흡수로 측정하였을 때 통계적으로 유의한 수준의 세포 사멸을 유도하는 화합물이 세포 사멸-유도 화합물로 선별될 수 있다.
아팝토시스를 유도하는 화합물을 선별하기 위해, 트랜스제닉 동물의 해당 종양 조직으로부터 확립된 세포를 사용하는 아넥신(annexin) 결합 검정법을 행한다. 상기 단락에 기재된 바와 같이 세포를 배양하고 디쉬에 접종한다. 그 후에 배지를 제거하고 신선한 배지 단독으로 또는 항체 약물 접합체 (ADC) 10 ㎍/ml를 함유하는 배지로 교체한다. 3일간 인큐베이션한 후에, 단층을 PBS로 세척하고 트립신화에 의해 분리한다. 그 후에 세포를, 세포 사멸 검정법에 대해 전술한 바와 같이, 원심분리하고, Ca2 + 결합 완충액에 재현탁시키고, 튜브에 나눈다. 그 후에 튜브에 표지된 아넥신 (예를 들면, 아넥신 V-FITC) (1 ㎍/ml)을 가한다. 샘플을 파스칸(상표명) 유세포 분석기 및 파스컨버트(상표명) 셀퀘스트 소포트웨어 (벡톤 디킨슨)를 사용하여 분석할 수 있다. 대조와 비교하여 통계적으로 유의한 수준의 아넥신 결합을 유도하는 화합물이 아팝토시스-유도 화합물로 선별된다.
4.5.3. 시험관내 세포 증식 검정법
일반적으로, 항체 약물 접합체 (ADC)의 세포독성 또는 세포분열 억제 활성은, 수용체 단백질을 갖는 포유동물 세포를 세포 배양 배지에서 ADC의 항체에 노출시키고, 세포를 약 6시간 내지 약 5일 동안 배양하고, 세포 생존률을 측정함으로써 측정된다. 세포-기재 시험관내 검정법을 사용하여 생존률 (증식), 세포독성, 및 본 발명의 ADC에 의한 아팝토시스 유도 (카스파제 활성화)를 측정한다.
항체 약물 접합체의 시험관내 효능을 세포 증식 검정법 (실시예 18, 도 7 내지 10)에 의해 측정한다. 셀타이터-글로(CellTiter-Glo; 등록상표) 발광 세포 생존률 검정법 (딱정벌레목 루시퍼라제의 재조합 발현 기재의 순일(homogeneous) 검정 방법)이 상업적으로 이용가능하다 (미국 위스콘신주 매디슨 소재의 프로메가 코포레이션(Promega Corp.)) (미국 특허 제5583024호, 동 제5674713호, 및 동 제5700670호). 상기 세포 증식 검정법은 물질대사적 활성 세포의 지표인, 존재하는 ATP의 정량화를 기초로 배양물 중 생존 가능한 세포수를 측정한다 (문헌 [Crouch et al. (1993) J. Immunol. Meth. 160:81-88], 미국 특허 제6602677호). 셀타이터-글로(등록상표) 검정법을 96 웰 포맷으로 행하여, 자동화된 고-처리량 스크리닝 (HTS)에 적용할 수 있도록 한다 (문헌 [Cree et al. (1995) AntiCancer Drugs 6:398-404]). 순일 검정법 절차는 단일 시약 (셀타이터-글로(등록상표) 시약)을 혈청-보충된 배지에서 배양된 세포에 직접 첨가하는 것을 포함한다. 세포 세척, 배지의 제거 및 수차례의 피펫팅 단계는 필요하지 않다. 상기 시스템은 시약을 첨가하고 혼합한 10분 후에 384-웰 포맷으로 15개의 세포/웰 정도까지 검출한다. 세포를 ADC로 계속해서 처리하거나, 또는 ADC로 처리하고 ADC로부터 분리할 수 있다. 일반적으로, 잠시동안 (3시간) 처리한 세포는 계속해서 처리한 세포와 동일한 효능을 나타낸다.
순일 "첨가-혼합-측정" 포맷은 세포 용해 및 존재하는 ATP의 양에 비례하는 발광 신호 발생을 초래한다. ATP의 양은 배양물에 존재하는 세포수에 정비례한다. 셀타이터-글로(등록상표) 검정법은 루시퍼라제 반응에 의해 발생되고, 사용된 세포 유형 및 배지에 따라 일반적으로 5시간 보다 긴 반감기를 갖는 "글로형(glow-type)" 발광 신호를 발생시킨다. 생존 가능한 세포는 상대 발광 단위 (RLU)로서 나타난다. 기질 (딱정벌레 루시페린(Beetle Luciferin))은 재조합 개똥벌레 루시퍼라제에 의해 산화적 탈카르복실화되고, 이때 ATP의 AMP로의 전환 및 광자의 발생을 수반한다. 반감기 연장은 시약 주입기를 사용할 필요성을 제거하고 다수 개의 플레이트의 연속식 또는 배치식 프로세싱에서 유동성을 제공한다. 상기 세포 증식 검정법은 다양한 멀티웰 포맷, 예를 들면 96 또는 384 웰 포맷과 함께 사용될 수 있다. 데이타는 발광계 또는 CCD 카메라 영상화 장치로 기록할 수 있다. 발광 결과는 시간에 따라 측정한, 상대 광 단위 (RLU)로 나타낸다.
Figure 112013088873035-pat00124
항체 약물 접합체의 항-증식 효과를 세포 증식에 의해 측정한다 (4가지의 상이한 유방 종양 세포주에 대한 상기 시험관내 세포 사멸 검정법) (도 7 내지 10). HER2 수용체 단백질이 과발현된 것으로 알려져 있는 SK-BR-3 및 BT-474의 IC50 값을 측정한다. 표 2a는 SK-BR-3 세포의 세포 증식 검정법에서 예시 항체 약물 접합체의 효능 (IC50) 측정치를 나타낸다. 표 2b는 BT-474 세포의 세포 증식 검정법에서 예시 항체 약물 접합체의 효능 (IC50) 측정치를 나타낸다.
항체 약물 접합체: 트라츠주마브-MC-vc-PAB-MMAF, 3.8 MMAF/Ab; 트라츠주마브-MC-(N-Me)vc-PAB-MMAF, 3.9 MMAF/Ab; 트라츠주마브-MC-MMAF, 4.1 MMAF/Ab; 트라츠주마브-MC-vc-PAB-MMAE, 4.1 MMAE/Ab; 트라츠주마브-MC-vc-PAB-MMAE, 3.3 MMAE/Ab; 및 트라츠주마브-MC-vc-PAB-MMAF, 3.7 MMAF/Ab는 MCF-7 세포의 증식을 억제하지 않는다 (도 9).
항체 약물 접합체: 트라츠주마브-MC-vc-PAB-MMAE, 4.1 MMAE/Ab; 트라츠주마브-MC-vc-PAB-MMAE, 3.3 MMAE/Ab; 트라츠주마브-MC-vc-PAB-MMAF, 3.7 MMAF/Ab; 트라츠주마브-MC-vc-PAB-MMAF, 3.8 MMAF/Ab; 트라츠주마브-MC-(N-Me)vc-PAB-MMAF, 3.9 MMAF/Ab; 및 트라츠주마브-MC-MMAF, 4.1 MMAF/Ab는 MDA-MB-468 세포의 증식을 억제하지 않는다 (도 10).
MCF-7 및 MDA-MB-468 세포는 HER2 수용체 단백질을 과발현하지 않는다. 따라서 본 발명의 항-HER2 항체 약물 접합체는 HER2를 발현하는 세포의 억제에 대한 선택성을 보인다.
Figure 112013088873035-pat00125
<표 2b>
Figure 112013088873035-pat00126
H = 트라츠주마브
7C2 = 트라츠주마브과는 상이한 에피토프를 결합시키는 항-HER2 뮤린 항체
Fc8 = FcRn과 결합하지 않는 돌연변이체
Hg = 중쇄 힌지 시스테인이 세린으로 돌연변이된 "힌지리스(hingeless)" 전장 인간화 4D5, 대장균에서 발현됨 (따라서 비-글리코실화)
항-TF Fab = 항-조직 인자 항체 단편
* MDA-MB-468 세포에 대한 활성
놀랍고도 예상밖으로, 표 2a 및 2b에서 ADC의 시험관내 세포 증식 활성 결과는 일반적으로 항체당 적은 평균 갯수의 약물 잔기를 갖는 ADC가 예를 들어,IC50이 0.1 ㎍ ADC/ml 미만인 효능을 나타낸다는 것을 입증한다. 상기 결과는 적어도 트라츠주마브 ADC의 경우에, 항체당 약물 잔기의 최적의 비율이 8미만일 수 있고, 약 2 내지 약 5일 수 있다는 것을 설명해준다.
4.5.4 생체내 혈장 클리어런스 ( clearance ) 및 안정성
ADC의 약물동력학적 혈장 클리어런스 및 안정성을 래트 및 사이노몰거스(cynomolgus) 원숭이에서 조사한다. 시간에 따른 혈장 농도를 측정한다. 표 2c는 래트에서 항체 약물 접합체 및 기타 투여된 샘플의 약물동력학적 데이타를 나타낸다. 래트가 HER2 수용체 단백질을 발현하지 않는 것으로 알려져 있기 때문에, 래트는 ErbB 수용체 항체에 대한 비-특이적 모델이다.
<표 2c>
Figure 112013088873035-pat00127
Figure 112013088873035-pat00128
Figure 112013088873035-pat00129
AUC inf는 투여 시간부터 무한대까지의 혈장 농도-시간 곡선 아래의 면적이고 측정된 물질 (약물, ADC)에 대한 총 노출 정도의 측정치이다. CL은 단위 시간에 측정된 물질을 함유하는 혈장의 부피로 정의되고 체중에 대해 표준화함으로써 표시된다. T1/2 기간은 제거기 동안에 측정된 체내 약물의 반감기이다. ％ Conj.는 개별 ELISA 면역친화 시험에 의해 검출된 총 항체에 대한 ADC의 상대량이다 (Pharmacokinetics of Drugs (1994) P.G. Welling and L. P. Balant, Eds., Handbook of Experimental Pharmacology, Vol. 110, Springer-Verlag의 "Analytical Methods for Biotechnology Products", Ferraiolo et al., p85-98). ％ Conj. 계산치는 간단히 ADC의 AUC inf ÷ 전체 Ab의 AUC inf이고, 기타 인자 및 기작이 영향을 미칠 수도 있지만, 링커 안정성의 일반적인 지표이다.
도 11은 항체 약물 접합체: H-MC-vc-PAB-MMAF-TEG 및 H-MC-vc-PAB-MMAF를 스프래그-돌리(Sprague-Dawley) 래트에 투여한 후 혈장 농도 클리어런스의 그래프를 나타낸다. 전체 항체 및 ADC의 농도를 시간에 따라 측정한다.
도 12는 ADC를 상이한 투여량으로 투여하는 2 단계 혈장 농도 클리어런스 연구의 그래프를 나타내고 전체 항체 및 ADC의 농도를 시간에 따라 측정한다.
생체내 효능
본 발명의 ADC의 생체내 효능을 고 발현 HER2 트랜스제닉 외식편 마우스 모델을 사용하여 측정한다. 동종이식편을 헤르셉틴(HERCEPTIN; 등록상표) 요법에 반응하지 않거나, 또는 약하게 반응하는 Fo5 mmtv 트랜스제닉 마우스로부터 증식시킨다. 피험체를 ADC로 1회 처리하고 3 내지 6주에 걸쳐서 모니터링하여, 종양이 배가되는 시간, 대수 세포 사멸 및 종양 감소를 측정한다. 그 후에 투여량-반응 및 수차례의 투여 실험을 행한다.
종양은 neu (HER2의 래트 동족체)의 돌연변이 활성화된 형태를 발현하는 트랜스제닉 마우스에서 신속하게 발생하지만, 유방암에서 과발현된 HER2는 돌연변이되지 않고 종양 형성이 비돌연변이 HER2를 과발현하지 않는 트랜스제닉 마우스에서 훨씬 덜 활발하다 (문헌 [Webster et al. (1994) Semin. Cancer Biol. 5:69-76]).
비돌연변이 HER2로의 종양 형성을 증가시키기 위해, 트랜스제닉 마우스를, 상류 ATG 코돈에서 번역 개시를 방지하기 위해 상류 ATG를 결실시키거나, 그렇지 않으면 HER2의 하류 진성 개시 코돈으로부터 번역 개시의 빈도를 감소시킨 HER2 cDNA 플라스미드를 사용하여 생산한다 (예를 들어, 문헌 [Child et al. (1999) J. Biol. Chem. 274:24335-24341] 참조). 부가적으로, 키메라 인트론을 5' 말단에 부가하여 또한 앞서 보고된 바와 같이 발현 수준을 증대시킬 것이다 (문헌 [Neuberger and Williams (1988) Nucleic Acids Res. 16:6713]; 문헌 [Buchman and Berg (1988) Mol. Cell. Biol. 8:4395]; 문헌 [Brinster et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:836]). 키메라 인트론은 프로메가 벡터 (pCI-neo 포유동물 발현 벡터 (bp 890-1022))로부터 유래된다. cDNA 3'-말단은 인간 성장 호르몬 엑손 4 및 5와 폴리아데닐화 서열에 의해 플랭킹된다. 또한, FVB 마우스를 사용하는데, 그 이유는 상기 계통이 종양 발생 가능성이 더 크기 때문이다. MMTV-LTR로부터의 프로모터를 사용하여 젖샘에서 조직-특이적 HER2 발현을 보장한다. 동물에게 AIN 76A 정규식을 먹여 종양 형성 가능성을 증가시킨다 (문헌 [Rao et al. (1997) Breast Cancer Res. and Treatment 45:149-158]).
<표 2d>
Figure 112013088873035-pat00130
Figure 112013088873035-pat00131
Figure 112013088873035-pat00132
Ti란 용어는 연구군 중 종양이 있는 동물 수 (T = 0) ÷ 군의 전체 동물 수이다. PR이란 용어는 종양이 부분적으로 완화된 동물의 수 ÷ 군 중 종양이 있는 동물 수 (T = 0)이다. CR이란 용어는 종양이 완전히 완화된 동물의 수 ÷ 군 중 종양이 있는 동물 수 (T = 0)이다. 세포 사멸 로그값이란 용어는 (종양 부피가 배가되는 시간일수 - 대조 종양 부피가 배가되는 시간일수) ÷ (3.32 × (비히클이 투여된) 대조군 동물에서의 종양 부피가 배가되는 시간)을 나타낸다. 상기 세포 사멸 로그 계산에서는 치료로 인한 종양 성장의 지체 및 대조군의 종양 부피 배가 시간이 고려된다. ADC의 항-종양 활성은 다음과 같은 세포 사멸 로그값으로 분류된다:
Figure 112013088873035-pat00133
도 13은 0일차에 비히클, 트라츠주마브-MC-vc-PAB-MMAE (1250 ㎍/m2) 및 트라츠주마브-MC-vc-PAB-MMAF (555 ㎍/m2)가 투여된 MMTV-HER2 Fo5 유선 종양 동종이식편을 갖는 무흉선 누드 마우스에서의 평균 종양 부피의 경시 변화를 나타낸다. (H = 트라츠주마브). 종양의 성장은 대조군 (비히클)의 성장 수준과 비교되는 바와 같이, ADC 치료에 의해 지연되었다. 도 14는 0일차에 트라츠주마브-MC-MMAE 10 mg/kg (660 ㎍/m2) 및 트라츠주마브-MC-vc-PAB-MMAE 1250 ㎍/m2가 투여된 MMTV-HER2 Fo5 유선 종양 동종이식편을 갖는 무흉선 누드 마우스에서의 평균 종양 부피의 경시 변화를 나타낸다. 도 15는 트라츠주마브-MC-MMAF 650 ㎍/m2가 투여된 MMTV-HER2 Fo5 유선 종양 동종이식편을 갖는 무흉선 누드 마우스에서의 평균 종양 부피의 경시 변화를 나타낸다. 표 2d 및 도 13-15는 ADC가, MMTV-HER2 트랜스제닉 마우스에서 최초 발생한 HER2 양성 종양 (Fo5)의 동종이식편에서 강력한 항-종양 활성을 보유함을 나타낸다. 항체 단독 (예를 들어, 트라츠주마브)에는 상기 모델에서 유의한 항-종양 활성이 없다 (에릭손 (Erickson)등의 미국 특허 제6,632,979호). 도 13 내지 15에 제시된 바와 같이, 종양의 성장은 대조군 (비히클)의 성장 수준과 비교되는 바와 같이, ADC 치료에 의해 지연되었다.
예상하지 못한 놀라운 발견으로서, 표 2d에 제시된 ADC의 생체내 항-종양 활성에 대한 결과는, 일반적으로 항체 당 약물 잔기의 평균 개수가 적을수록 이를 갖는 ADC가 효능이 있었음 (예를 들어, 15 일 초과의 종양 배가 시간 및 1.0 초과의 평균 세포 사멸 로그값)을 나타낸다. 도 16은 항체 약물 접합체 트라츠주마브-MC-vc-PAB-MMAF에 있어서, MMAF:트라츠주마브 비율이 2 및 4인 경우에는 평균 종양 부피가 감소되어 진행되지 않았으며, 5.9 및 6의 비율에서는 종양이 진행하되 비히클 (완충액)보다는 느린 속도였음을 나타낸다. 상기 마우스 이종이식 모델에서의 종양 진행 속도는 비히클 및 트라츠주마브의 경우와 거의 동일하였다 (즉, 3 일). 상기 결과는, 적어도 트라츠주마브 ADC의 경우에 항체 당 약물 잔기의 최적 비율이 약 8 미만일 수 있으며 약 2 내지 약 4일 수 있음을 나타낸다.
4.5.5 설치류 독성
항체 약물 접합체 및 및 ADC가 없는 대조군 "비히클"을 급성 독성 래트 모델에서 평가하였다. 수컷 및 암컷 스프라그-돌리 래트를 ADC로 치료한 후, 다양한 기관에서의 효과에 대해 정밀 검사 및 분석함으로써 ADC의 독성을 조사하였다. 전체적인 관찰 결과에는 체중 변화, 및 병변 및 출혈의 징후가 포함되었다. 투여된 동물에서 임상 병리학 파라미터 (혈청 화학 및 혈액학) 연구, 조직 병리학 연구 및 검시를 수행하였다.
ADC 투여 이후 동물에서의 체중 손실, 또는 비히클만 투여된 동물을 기준으로 한 체중 변화는 전신성 또는 국소 독성에 대한 총체적이고 일반적인 척도로 여겨진다. 도 17 내지 19는 투여 이후 다양한 ADC 및 대조군 (비히클)이 래트의 체중에 미치는 영향을 나타낸다.
간독성은 증가된 간 효소, 증가된 유사분열 (mitotic) 및 아폽토틱 (apoptotic) 형태의 수 및 간세포 괴사로서 관찰되었다. 간림프계 독성은 백혈구, 주로 과립백혈구 (호중성백혈구) 및(또는) 혈소판의 고갈, 및 림프계 기관 병발, 즉 위축증 또는 아폽토틱 활성으로서 관찰되었다. 증가된 유사분열 및 아폽토틱 형태의 수 및 퇴행성 소장결장염과 같은 위장관 병변으로도 독성이 나타났다.
본 발명에서 조사된, 간 손상을 나타내는 효소로는 다음과 같은 것들이 포함된다:
AST (아스파르테이트 아미노트랜스퍼라제)
- 부위: 세포질; 간, 심장, 골격근, 신장
- 간:혈장 비율 7000:1
- T1/2: 17 시간
ALT (알라닌 아미노트랜스퍼라제)
- 부위: 세포질; 간, 신장, 심장, 골격근
- 간:혈장 비율 3000:1
- T1/2: 42 시간; 주간 변화
GGT (g-글루타밀 트랜스퍼라제)
- 부위: 분비 또는 흡수 용량이 큰 세포의 원형질막; 간, 신장, 소장
- 간 손상의 예측자로는 부적절함; 담관 장애에서 통상적으로 증가됨
암컷 스프라그-돌리 래트에서, 트라츠주마브-MC-val-cit-MMAF, 트라츠주마브-MC(Me)-val-cit-PAB-MMAF, 트라츠주마브-MC-MMAF 및 트라츠주마브-MC-val-cit-PAB-MMAF의 독성 프로파일을 조사하였다 (실시예 19). 인간화 트라츠주마브 항체는 래트 조직에 완전히 결합하지는 않으므로, 임의의 독성이든 비특이적인 것으로 간주될 것이다. MMAF 투여량 840 및 2105 ㎍/m2에서의 변형체들을 2105 ㎍/m2에서의 트라츠주마브-MC-val-cit-PAB-MMAF와 비교하였다.
군 1, 2, 3, 4, 6 및 7 (각각 비히클, 트라츠주마브-MC-val-cit-MMAF 9.94 및 24.90 mg/kg, 트라츠주마브-MC(Me)-val-cit-PAB-MMAF 10.69 mg/kg 및 트라츠주마브-MC-MMAF 10.17 및 25.50 mg/kg)의 동물들은 연구 동안 체중이 증가되었다. 군 5 및 8 (각각 트라츠주마브-MC(Me)-val-cit-PAB-MMAF 26.78 mg/kg 및 트라츠주마브-MC-val-cit-PAB-MMAF 21.85 mg/kg)의 동물들은 연구 동안 체중이 감소되었다. 연구 5일차에, 군 2, 6 및 7의 동물들의 체중 변화는 군 1의 동물들과 크게 다르지 않았다. 군 3, 4, 5 및 8의 동물들의 체중 변화는 군 1의 동물들과 통계적으로 상이하였다 (실시예 19).
트라츠주마브-MC-MMAF로 처리된 래트들 (군 6 및 7)은 2가지 투여량 둘 다에서 비히클-처리 대조군 동물과 구별이 불가능하였다 (즉, 상기 접합체는 상기 모델에서 탁월한 안전성 프로파일을 나타냈음). 트라츠주마브-MC-val-cit-MMAF로 처리된 래트 (자체-희생성 PAB 잔기가 없음; 군 2 및 3)에서는 MMAF 접합체의 경우에 전형적인 투여량-의존성 변화가 나타났고, 이 변화의 범위는 전장 MC-val-cit-PAB-MMAF 접합체 (군 8)에 비해 작았다. 5일차에 혈소판의 양은 군 3 (트라츠주마브-MC-val-cit-MMAF 다량 투여)의 동물들에서 기준값의 약 30％인데 비해, 군 8 (트라츠주마브-MC-val-cit-PAB-MMAF 다량 투여)의 동물들에서는 15％였다. 간 효소 AST 및 ALT, 빌리루빈 및 혈소판감소증 수준의 증가는 투여량-의존성 방식으로 트라츠주마브-MC(Me)-val-cit-PAB-MMAF로 처리된 동물들 (군 4 및 5)에서 가장 뚜렷하였다 (5일차에 군 5 (다량 투여 군)의 동물들에서는 ALT량이 기준값의 약 10배로 나타났고, 검시시 혈소판은 약 90％ 감소되었음).
또한, 암컷 스프라그-돌리 래트에 트라츠주마브-MC-MMAF를 다량으로 투여하였다 (실시예 19, 다량 투여 연구: 군 2, 3, 4 + 비히클 대조군 (군 1)). 간 효소 ALT, AST 및 GGT의 투여량-의존성 증가를 비롯한 경미한 독성 징후가 관찰되었다. 5일차에, 최다량 투여 군의 동물들에서는 ALT가 2배 증가되고, AST가 5배 증가된 것으로 나타났고, GGT도 증가되었다 (6U/L). 12일차에는 효소량이 정상화되는 경향이 나타났다. 5일차에, 세 군 모두에서 경증 과립백혈구증가증이 존재하였고, 혈소판의 양은 모든 동물에서 본질적으로 불변하였다. 형태 변화는 경미하였고; 4210 ㎍/m2의 투여량으로 처리된 동물들 (군 2)의 간, 비장, 흉선, 소장 및 골수 조직에서는 주목할 만한 것이 없었다. 5500 ㎍/m2의 투여량으로 처리된 동물들 (군 3)의 흉선 및 간 각각에서는 경미하게 증가된 아폽토틱 및 유사분열 활성이 관찰되었다. 골수 세포는 정상이었지만, 과립백혈구증가증의 징후가 나타났는데, 이는 상기 동물들의 말초 혈액량에서 관찰되는 완전한 과립백혈구증가증과 부합한다. 군 4의 최다 투여량 동물에서는 정성적으로 동일한 특징들이 나타났고, 간에서의 유사분열 활성이 군 3의 동물들에 비해 다소 증가한 것으로 나타났다. 비장 및 간에서 골수외조혈도 관찰되었다.
EphB2R은 마우스와 인간 사이에서 유사한 상동성을 갖는 타입 1 TM 티로신 키나제 수용체이며, 결장직장암 세포에서 과발현된다. 2H9는 EphB2R에 대한 항체이다. 상기 항체 자체로는 종양 성장에 영향을 미치지는 않으나, 2H9-val-cit-MMAE는 EphB2R 발현 세포를 사멸시키며 CXF1103 인간 결장 종양 [Mao et al. (2004) Cancer Res. 64:781-788]이 있는 마우스 이종이식 모델에서 효능을 나타낸다. 2H9 및 7C2는 둘 다 마우스 IgG1 항-HER2 항체이다. 2H9-MC-val-cit-PAB-MMAF (3.7 MMAF/Ab), 7C2-MC-val-cit-PAB-MMAF (4 MMAF/Ab) 및 트라츠주마브-MC-val-cit-PAB-MMAF (5.9 MMAF/Ab)의 독성 프로파일을 비교하였다. 각 면역접합체 또는 그의 약물 부분의 구조간 차이는 약동학 및 궁극적으로 안전성 프로파일에 영향을 줄 수 있다. 인간화 트라츠주마브 항체는 래트 조직에 완전히 결합하지는 않으므로, 임의의 독성이든 비특이적인 것으로 간주될 것이다.
사이노몰구스 원숭이 독성/안전성
상기 래트 독성/안전성 연구와 유사하게, 사이노몰구스 원숭이를 ADC로 처리한 후, 간 효소를 측정하고, 다양한 기관에서의 효과에 대해 정밀검사 및 분석을 수행하였다. 전체적인 관찰 결과에는 체중 변화, 및 병변 및 출혈의 징후가 포함되었다. 투여된 동물에서 임상 병리학 파라미터 (혈청 화학 및 혈액학) 연구, 조직 병리학 연구 및 검시를 수행하였다 (실시예 19).
항체 약물 접합체 H-MC-vc-PAB-MMAE (H = 시스테인을 통해 연결된 트라츠주마브)에서는 임의의 시험 투여량에서도 간 독성의 징후가 나타나지 않았다. 말초 혈액 과립백혈구는 1100 mg/m2의 단일 투여 후에 고갈되어, 투여후 14일차에 완전히 회복된 것으로 나타났다. 항체 약물 접합체 H-MC-vc-PAB-MMAF에서는 550 (일시량) 및 880 mg/m2의 투여량에서 간 효소가 증가되고, 과립백혈구감소증의 징후가 없고, 혈소판이 투여량에 따라 일시적으로 감소 (군 2 및 3)된 것으로 나타났다.
4.6 본 발명의 화합물의 합성
하기 반응식 5 내지 16에 개략된 합성 방법을 이용하여 전형적인 화합물 및 전형적인 접합체가 제조될 수 있다. 하기에 보다 상세하게 기재된 바와 같이, 전형적인 화합물 또는 전형적인 접합체는 약물 및 리간드로의 결합을 위한 반응 부위를 갖는 링커를 사용하여 용이하게 제조될 수 있다. 한 측면에서, 링커는 항체 (이에 제한되는 것은 아님)와 같은 리간드 상에 존재하는 친핵성 기에 대해 반응성인 친전자성 기를 갖는 반응 부위를 갖는다. 유용한 항체 상 친핵성 기로는 술프히드릴, 히드록실 및 아미노기가 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다. 항체의 친핵성 기의 헤테로원자는 링커 상의 친전자성 기에 대해 반응성이어서 링커 단위로의 공유 결합을 형성한다. 유용한 친전자성 기로는 말레이미드기 및 할로아세트아미드기가 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다. 친전자성 기는 항체 부착에 유용한 부위를 제공한다.
또다른 실시양태에서, 링커는 항체 상에 존재하는 친전자성 기에 대해 반응성인 친핵성 기를 갖는 반응 부위를 갖는다. 유용한 항체 상의 친전자성 기로는 알데히드기 및 케톤 카르보닐기가 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다. 링커의 친핵성 기의 헤테로원자는 항체 상의 친전자성 기와 반응하여 항체 단위로의 공유 결합을 형성할 수 있다. 유용한 링커 상 친핵성 기로는 히드라지드, 옥심, 아미노, 히드라진, 티오세미카르바존, 히드라진 카르복실레이트 및 아릴히드라지드가 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다. 항체 상의 친전자성 기는 링커로의 부착에 유용한 부위를 제공한다.
카르복실산 관능기 및 클로로포르메이트 관능기도 링커에 유용한 반응 부위인데, 이들은 약물의 제2 아미노기와 반응하여 아미드 결합을 형성할 수 있기 때문이다. N-메틸 발린 (이에 제한되는 것은 아님)과 같은 약물의 아미노기와 반응하여 카르바메이트 결합을 형성할 수 있는, p-니트로페닐 카르보네이트 (이에 제한되는 것은 아님)와 같은 링커 상의 카르보네이트 관능기도 반응 부위로서 유용하다. 통상적으로, 펩티드-기재 약물은 2종 이상의 아미노산 및(또는) 펩티드 단편 간 펩티드 결합을 형성시킴으로써 제조될 수 있다. 이러한 펩티드 결합은 예를 들어, 펩티드 화학 분야에서 잘 알려져 있는 액상 합성 방법 (문헌 [E. Schroeder and K.Luebke, "The Peptides", volume 1, pp 76-136, 1965, Academic Press] 참조)에 따라 제조될 수 있다.
친전자성 말레이미드기를 갖는 예시적인 스트레처의 합성은 하기 반응식 8 및 9에 예시되어 있다. 링커의 합성에 유용한 일반적인 합성 방법은 반응식 10에 기재되어 있다. 반응식 11은 val-cit기 (친전자성 말레이미드기) 및 PAB 자체-희생성 스페이서기를 갖는 링커 단위의 제조를 나타낸다. 반응식 12는 phe-lys기 (친전자성 말레이미드기)를 가지며 PAB 자체-희생성 스페이서기를 갖거나 갖지 않는 링커의 합성을 나타낸다. 반응식 13은 약물-링커 화합물 합성에 대한 일반적인 개요를 나타내고, 반응식 14는 약물-링커 화합물을 제조하기 위한 다른 경로를 나타낸다. 반응식 15는 BHMS기를 함유하는 분지 링커의 합성을 나타낸다. 반응식 16에는 항체를 약물-링커 화합물에 부착시켜 약물-링커-항체 접합체를 형성하는 것이 요약되어 있고, 반응식 14에는 예를 들어 항체 당 2 또는 4개의 약물 (이에 제한되는 것은 아님)을 갖는 약물-링커-항체 접합체의 합성이 예시되어 있다.
하기에 보다 상세하게 기재된 바와 같이, 전형적인 접합체는 약물 및 리간드로의 결합을 위한 2개 이상의 반응 부위를 갖는 링커를 사용하여 용이하게 제조될 수 있다. 한 측면에서, 링커는 항체와 같은 리간드 상에 존재하는 친핵성 기에 대해 반응성인 친전자성 기를 갖는 반응 부위를 갖는다. 유용한 항체 상 친핵성 기로는 술프히드릴, 히드록실 및 아미노기가 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다. 항체의 친핵성 기의 헤테로원자는 링커 상의 친전자성 기에 대해 반응성이어서 링커 단위로의 공유 결합을 형성한다. 유용한 친전자성 기로는 말레이미드기 및 할로아세트아미드기가 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다. 친전자성 기는 항체 부착에 유용한 부위를 제공한다.
다른 실시양태에서, 링커는 항체와 같은 리간드 상에 존재하는 친전자성 기에 대해 반응성인 친핵성 기를 갖는 반응 부위를 갖는다. 유용한 항체 상의 친전자성 기로는 알데히드기 및 케톤 카르보닐기가 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다. 링커의 친핵성 기의 헤테로원자는 항체 상의 친전자성 기와 반응하여 항체 단위로의 공유 결합을 형성할 수 있다. 유용한 링커 상 친핵성 기로는 히드라지드, 옥심, 아미노, 히드라진, 티오세미카르바존, 히드라진 카르복실레이트 및 아릴히드라지드가 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다. 항체 상의 친전자성 기는 링커로의 부착에 유용한 부위를 제공한다.
4.6.1 약물 잔기 합성
통상적으로, 펩티드-기재 약물은 2종 이상의 아미노산 및(또는) 펩티드 단편 간 펩티드 결합을 형성시킴으로써 제조될 수 있다. 이러한 펩티드 결합은 예를 들어, 펩티드 화학 분야에서 잘 알려져 있는 액상 합성 방법 (문헌 [E. Schroeder and K.Luebke, "The Peptides", volume 1, pp 76-136, 1965, Academic Press] 참조)에 따라 제조될 수 있다.
아우리스탄틴/돌라스타틴 약물 잔기는 미국 특허 제5,635,483호; 미국 특허 제5,780,588호; 문헌 [Pettit et al. (1989) J. Am. Chem. Soc. 111:5463-5465; Pettit et al. (1998) Anti-Cancer Drug Design 13:243-277]; [Pettit et al. (1996) J. Chem. Soc. Perkin Trans. 15:859-863]의 일반적인 방법에 따라 제조될 수 있다.
한 실시양태에서, 약물은 적합한 축합 조건 하에 바람직하게는 단일 반응기(one-pot) 반응으로 대략 화학량론적 당량의 디펩티드와 트리펩티드를 배합함으로써 제조된다. 상기 방법은 하기 반응식 5 내지 7에 제시되어 있다.
반응식 5는 화학식 Ib의 약물 화합물의 합성에 유용한 중간체인 N-말단 트리펩티드 단위 F의 합성을 예시한다.
<반응식 5>
Figure 112013088873035-pat00134
반응식 5에 나타낸 바와 같이, 보호된 아미노산 A (식 중, PG는 아민 보호기를 나타내고, R4는 수소, C1-C8 알킬, C3-C8 카르보사이클, -O-(C1-C8 알킬), -아릴, 알킬-아릴, 알킬-(C3-C8 카르보사이클), C3-C8 헤테로사이클, 알킬-(C3-C8 헤테로사이클)로부터 선택되고 R5는 H 및 메틸로부터 선택되거나; 또는 R4 및 R5는 결합하여 화학식 -(CRaRb)n- (식 중, Ra 및 Rb는 독립적으로 수소, C1-C8 알킬 및 C3-C8 카르보시클로부터 선택되고, n은 2, 3, 4, 5 및 6으로부터 선택됨)을 가지며 이들이 부착된 탄소 원자와 함께 고리를 형성함)를 적합한 커플링 조건 하에, 예를 들어 PyBrop 및 디이소프로필에틸아민의 존재 하에, 또는 DCC 하에 tert-부틸 에스테르 B (식 중, R6은 -H 및 -C1-C8 알킬로부터 선택되고; R7은 수소, C1-C8 알킬, C3-C8 카르보사이클, -O-(C1-C8 알킬), -아릴, 알킬-아릴, 알킬-(C3-C8 카르보사이클), C3-C8 헤테로사이클 및 알킬-(C3-C8 헤테로사이클)로부터 선택됨)와 커플링된다 (예를 들어, 문헌 [Miyazaki, K. et al. Chem. Pharm. Bull. 1995, 43(10), 1706-1718] 참조).
적합한 보호기 PG, 및 보호기로 아미노기를 보호하기에 적합한 합성 방법은 당업계에 잘 알려져 있다. 예를 들어 문헌 [Greene, T. W. and Wuts, P.G.M., Protective Groups in Organic Synthesis, 2nd Edition, 1991, John Wiley ＆ Sons]를 참조한다. 전형적인 보호된 아미노산 A로는 PG-Ile, 특히 PG-Val이 있으며, 다른 적합한 보호된 아미노산으로는 비제한적으로 PG-시클로헥실글리신, PG-시클로헥실알라닌, PG-아미노시클로프로판-1-카르복실산, PG-아미노이소부티르산, PG-페닐알라닌, PG-페닐글리신 및 PG-tert-부틸글리신이 포함된다. Z는 전형적인 보호기이다. Fmoc는 또다른 전형적인 보호기이다. 전형적인 tert-부틸 에스테르 B로는 돌라이소류인 tert-부틸 에스테르가 있다.
디펩티드 C는 예를 들어, 크로마토그래피에 의해 정제된 후, 예를 들어 PG가 벤질옥시카르보닐인 경우 H2 및 에탄올 중 10％ Pd-C를 사용하거나, 또는 Fmoc 보호기를 제거하기 위해 디에틸아민을 사용하여 탈보호될 수 있다. 생성된 아민 D는 아미노산 BB (식 중, R1은 -H, -C1-C8 알킬 및 -C3-C8 카르보시클로부터 선택되고 R2는 -H 및 -C1-C8 알킬로부터 선택되거나; 또는 R1 및 R2는 결합하여 화학식 -(CRaRb)n- (식 중, Ra 및 Rb는 독립적으로 -H, C1-C8 알킬 및 C3-C8 카르보시클로부터 선택되고, n은 2, 3, 4, 5 및 6으로부터 선택됨)을 가지며 이들이 부착된 질소 원자와 함께 고리를 형성하고; R3은 수소, C1-C8 알킬, C3-C8 카르보사이클, -O-(C1-C8 알킬), -아릴, 알킬-아릴, 알킬-(C3-C8 카르보사이클), C3-C8 헤테로사이클 및 알킬-(C3-C8 헤테로사이클)로부터 선택됨)와 펩티드 결합을 쉽게 형성한다. N,N-디알킬 아미노산은 시판중인 N, N-디메틸 발린과 같은 전형적인 아미노산 BB이다. 다른 N,N-디알킬 아미노산은 공지된 방법을 이용하여 환원성 비스-알킬화에 의해 제조될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Bowman, R.E, Stroud, H.H J. Chem. Soc., 1950, 1342-1340] 참조). Fmoc-Me-L-Val 및 Fmoc-Me-L-글리신은 N-모노알킬 유도체의 합성에 유용한 2가지의 전형적인 아미노산이다. 아민 D 및 아미노산 BB는 커플링 시약 DEPC 및 염기로서의 트리에틸아민 하에 반응하여 트리펩티드 E를 제공한다. 이어서, E의 C-말단 보호기는 HCl에 의해 탈보호되어 화학식 F의 트리펩티드 화합물을 제공한다.
반응식 5에 제시된 예시적인 DEPC 커플링 방법 및 PyBrop 커플링 방법은 각각 하기 일반적인 방법 A 및 일반적인 방법 B에 개략되어 있다. 하기 일반적인 방법 C에는 촉매 수소화를 통해 Z-보호 아민을 탈보호하기 위한 예시적인 방법이 개략되어 있다.
일반적인 방법 A: DEPC 를 사용한 펩티드 합성. N-보호 또는 N,N-이치환 아미노산 또는 펩티드 D (1.0 당량) 및 아민 BB (1.1 당량)를 디클로로메탄과 같은 비양성자성 유기 용매 (0.1 내지 0.5 M)로 희석시킨다. 이후, 트리에틸아민 또는 디이소프로필에틸아민과 같은 유기 염기 (1.5 당량)를 첨가한 후에 DEPC (1.1 당량)를 첨가한다. 생성된 용액을 바람직하게는 아르곤 하에 12 시간까지 교반하면서, HPLC 또는 TLC에 의해 모니터링한다. 용매를 실온에서 진공 하에 제거하고, 조 생성물을 예를 들어, HPLC 또는 플래쉬 컬럼 크로마토그래피 (실리카 겔 컬럼)에 의해 정제한다. 해당 분획물을 합하고, 진공 하에 농축하여 얻은 트리펩티드 E를 밤새 진공 하에 건조시킨다.
일반적인 방법 B: PyBrop 를 사용한 펩티드 합성. 임의로 카르복실 보호기를 갖는 아미노산 B (1.0 당량)를 디클로로메탄 또는 DME과 같은 비양성자성 유기 용매로 희석시켜 농도 0.5 내지 1.0 mM의 용액을 제공한 후, 디이소프로필에틸아민 (1.5 당량)을 첨가한다. Fmoc- 또는 Z-보호 아미노산 A (1.1 당량)를 한꺼번에 고체로서 첨가한 후, 생성된 혼합물에 PyBrop (1.2 당량)를 첨가한다. TLC 또는 HPLC에 의해 반응을 모니터링한 후, 일반적인 방법 A에 기재된 것과 유사한 후처리 과정을 수행한다.
일반적인 방법 C: 촉매성 수소화를 통한 Z-제거. 벽이 두꺼운 둥근 바닥 플라스크와 같은 적합한 용기에서 Z-보호 아미노산 또는 펩티드 C를 에탄올로 희석시켜 농도 0.5 내지 1.0 mM의 용액을 제공한다. 탄소상 10％ 팔라듐 (5 내지 10％ w/w)을 첨가하고, 반응 혼합물을 수소 분위기 하에 위치시킨다. HPLC에 의해 반응 과정을 모니터링하는데, 상기 반응은 일반적으로 1 내지 2 시간 내에 완료된다. 반응 혼합물을 사전-세척된 셀라이트 패드를 통해 여과하고, 여과 후 메탄올과 같은 극성 유기 용매로 셀라이트를 다시 세척한다. 용출액을 진공 하에 농축하여 얻은 잔류물을 유기 용매, 바람직하게는 톨루엔으로 희석시킨다. 이후, 유기 용매를 진공 하에 제거하여 탈보호된 아민 C를 얻는다.
반응식 6은 화학식 K의 C-말단 디펩티드의 제조에 유용한 방법, 및 화학식 K의 디펩티드를 화학식 F의 트리펩티드와 커플링시켜 화학식 Ib의 약물 화합물을 제조하는 방법을 제시한다.
<반응식 6>
Figure 112013088873035-pat00135
반응식 5에 나타낸 바와 같이, 디펩티드 K는 트리에틸아민의 존재 하에 펩티드 화학 분야에 잘 알려져 있는 축합제, 예를 들어 DEPC를 사용한, 개질 아미노산 Boc-돌라프로인 G (예를 들어, 문헌 [Pettit, G.R., et al. Synthesis, 1996, 719-725] 참조)와 화학식 H의 아민의 축합에 의해 쉽게 제조될 수 있다.
이후, 화학식 K의 디펩티드를 일반적인 방법 D에 의해 화학식 F의 트리펩티드와 커플링시켜 화학식 L의 Fmoc-보호 약물 화합물을 제조하고, 이어서 이를 일반적인 방법 E에 의해 탈보호시켜 화학식 Ib의 약물 화합물을 제공할 수 있다.
일반적인 방법 D: 약물 합성. 디펩티드 K (1.0 당량)와 트리펩티드 F (1 당량)의 혼합물을 디클로로메탄과 같은 비양성자성 유기 용매로 희석시켜 0.1 M 용액을 형성한 후, 트리플루오로아세트산 (1/2 v/v)과 같은 강산을 첨가하고, 생성된 혼합물을 0 ℃에서 2 시간 동안 질소 분위기 하에 교반한다. TLC 또는 바람직하게는 HPLC에 의해 반응을 모니터링할 수 있다. 용매를 진공 하에 제거하고, 생성된 잔류물을 바람직하게는 톨루엔을 사용하여 2회 공비 건조시킨다. 생성된 잔류물을 12 시간 동안 고진공 하에 건조시킨 후에 디클로로메탄과 같은 비양성자성 유기 용매로 희석시킨다. 이후, 트리에틸아민 또는 디이소프로필에틸아민과 같은 유기 염기 (1.5 당량)를 첨가한 다음, 잔류물 상의 화학적 관능기에 따라 PyBrop (1.2 당량) 또는 DEPC (1.2 당량)를 첨가한다. 반응 혼합물을 TLC 또는 HPLC에 의해 모니터링하고, 반응 완료시 반응물을 일반적인 방법 A에 기재된 것과 유사하거나 동인한 후처리 과정을 수행한다.
일반적인 방법 E: 디에틸아민을 이용한 Fmoc -제거. Fmoc-보호 약물 L을 디클로로메탄과 같은 비양성자성 유기 용매로 희석시키고, 생성된 용액에 디에틸아민 (1/2 v/v)을 첨가한다. TLC 또는 HPLC에 의해 반응 과정을 모니터링하는데, 상기 반응은 통상적으로 2 시간 내에 완료된다. 반응 혼합물을 진공 하에 농축하고, 생성된 잔류물을 바람직하게는 톨루엔을 사용하여 공비 건조시킨 후에 진공 하에 건조시켜 탈보호된 아미노기를 갖는 약물 Ib를 얻는다.
반응식 7은 약물 Ib의 MMAF 유도체의 제조에 유용한 방법을 제시한다.
<반응식 7>
Figure 112013088873035-pat00136
반응식 5 및 6에 나타낸 바와 같이, 디펩티드 O는 트리에틸아민의 존재 하에 펩티드 화학 분야에 잘 알려져 있는 축합제, 예를 들어 DEPC를 사용한, 개질 아미노산 Boc-돌라프로인 G (예를 들어, 문헌 [Pettit, G.R., et al. Synthesis, 1996, 719-725] 참조)와 화학식 M의 보호된 아미노산의 축합에 의해 쉽게 제조될 수 있다.
이후, 화학식 O의 디펩티드를 일반적인 방법 D에 의해 화학식 F의 트리펩티드와 커플링시켜 화학식 P의 Fmoc-보호 MMAF 화합물을 제조하고, 후속적으로 이를 일반적인 방법 E에 의해 탈보호시켜 화학식 Ib의 MMAF 약물 화합물을 제공할 수 있다.
따라서, 상기 방법들은 본 발명에서 사용될 수 있는 약물의 제조에 유용하다.
4.6.2 약물 링커 합성
본 발명의 약물-링커 화합물을 제조하기 위해서는 약물을 링커 상의 반응 부위와 반응시킨다. 일반적으로, 링커는 스페이서 단위 (-Y-) 및 스트레처 단위 (-A-)가 존재하는 경우에 다음과 같은 구조를 가질 수 있다.
Figure 112013088873035-pat00137
또한, 링커는 스페이서 단위 (-Y-)가 없는 경우에 다음과 같은 구조를 가질 수 있다.
Figure 112013088873035-pat00138
또한, 링커는 스트레처 단위 (-A-) 및 스페이서 단위 (-Y-)가 없는 경우에 다음과 같은 구조를 가질 수 있다.
Figure 112013088873035-pat00139
또한, 링커는 아미노산 단위 (W) 및 스페이서 단위(Y)가 없는 경우에 다음과 같은 구조를 가질 수 있다.
Figure 112013088873035-pat00140
일반적으로, 적합한 링커는 임의의 스트레처 단위 및 임의의 스페이서 단위에 연결된 아미노산 단위를 갖는다. 반응 부위 1은 스페이서의 말단에 존재하고, 반응 부위 2는 스트레처의 말단에 존재한다. 스페이서 단위가 존재하지 않는 경우, 반응 부위 1은 아미노산 단위의 C-말단에 존재한다.
본 발명의 전형적인 실시양태에서, 반응 부위 1은 약물의 질소 원자에 대해 반응성이고, 반응 부위 2는 리간드 상의 술프히드릴기에 대해 반응성이다. 반응 부위 1 및 2는 다양한 관능기에 대해 반응성일 수 있다.
본 발명의 한 측면에서, 반응 부위 1은
Figure 112013088873035-pat00141
이다.
본 발명의 다른 측면에서, 반응 부위 1은
Figure 112013088873035-pat00142
이다.
본 발명의 또다른 측면에서, 반응 부위 1은 화학식
Figure 112013088873035-pat00143
를 갖는 p-니트로페닐 카르보네이트이다.
본 발명의 한 측면에서, 반응 부위 2는 티올-수용기이다. 적합한 티올-수용기로는 화학식
Figure 112013088873035-pat00144
(식 중, X는 이탈기, 바람직하게는 O-메실, O-토실, -Cl, -Br 또는 -I, 또는 화학식
Figure 112013088873035-pat00145
를 갖는 말레이미드기를 나타냄)를 갖는 할로아세트아미드기들이 포함된다.
유용한 링커는 미국 콜로라도주 보울더에 소재한 몰레큘라 바이오사이언시스 인코포레이티드 (Molecular Biosciences Inc.)와 같은 판매원을 통해 입수할 수 있거나, 하기 반응식 8 내지 10에 요약된 바와 같이 제조할 수 있다.
<반응식 8>
Figure 112013088873035-pat00146
식 중, X는 -CH2- 또는 -CH2OCH2-이고; X가 -CH2-인 경우 n은 0 내지 10 범위의 정수이거나; X가 -CH2OCH2-인 경우 n은 1 내지 10 범위의 정수이다.
반응식 9에 제시된 방법에서는, 미츠노부 (Mitsunobu) 조건 하에 말레이미드와 글리콜을 합하여 폴리에틸렌 글리콜 말레이미드 스트레처 (예를 들어, 문헌 [Walker, M.A. J. Org. Chem. 1995, 60, 5352-5] 참조)를 제조한 후, p-니트로페닐 카르보네이트 반응 부위 기를 도입한다.
<반응식 9>
Figure 112013088873035-pat00147
상기 식에서, E는 -CH2- 또는 -CH20CH2-이고, e는 0 내지 8의 정수이다.
대안적으로, PEG-말레이미드 및 PEG-할로아세트아미드 스트레처는 문헌 [Frisch, et al., Bioconjugate Chem. 1996, 7, 180-186]에 기재된 바와 같이 제조될 수 있다. 반응식 10은 말레이미드 스트레처기 및 임의로 p-아미노벤질 에테르 자체-희생성 스페이서를 함유하는 예시적인 링커 단위의 일반적인 합성법을 도시한다.
<반응식 10>
Figure 112013088873035-pat00148
상기 식에서, Q는 -C1-C8 알킬, -O-(C1-C8 알킬), -할로겐, -니트로 또는 -시아노이고, m은 0 내지 4의 정수이고, n은 0 내지 10의 정수이다.
유용한 스트레처는 유기 합성의 공지된 기술을 이용하여 하기 기재된 바와 같이 몰레큘라 바이오사이언시즈(Molecular Biosciences, 콜로라도주 보울더 소재)로부터 시판되는 중간체를 이용하여 링커에 도입할 수 있다. 화학식 IIIa의의 스트레처는 반응식 11 및 12에 도시된 바와 같이 하기 중간체와 아미노산 단위의 N-말단을 반응시킴으로써 링커에 도입될 수 있다.
Figure 112013088873035-pat00149
(상기 식에서, n은 1 내지 10의 정수이고, T는 -H 또는 -S03Na임)
Figure 112013088873035-pat00150
(상기 식에서, n은 0 내지 3의 정수임)
Figure 112013088873035-pat00151
Figure 112013088873035-pat00152
Figure 112013088873035-pat00153
및
Figure 112013088873035-pat00154
화학식 IIIb의 스트레처 단위는 하기 중간체와 아미노산 단위의 N-말단을 반응시킴으로써 링커에 도입할 수 있다.
Figure 112013088873035-pat00155
Figure 112013088873035-pat00156
Figure 112013088873035-pat00157
Figure 112013088873035-pat00158
및
(상기 식에서, X는 -Br 또는 -I임)
Figure 112013088873035-pat00159
화학식 IV의의 스트레처 단위는 하기 중간체와 아미노산 단위의 N-말단의 반응에 의해 링커에 도입될 수 있다.
Figure 112013088873035-pat00160
및
Figure 112013088873035-pat00161
화학식 Va의 스트레처 단위는 하기 중간체와 아미노산 단위의 N-말단을 반응시킴으로써 링커에 도입될 수 있다.
Figure 112013088873035-pat00162
및
Figure 112013088873035-pat00163
다른 유용한 스트레처는 공지된 절차에 따라 합성될 수 있다. 하기 화학식의 아미노옥시 스트레처는 문헌 [Jones, D. S. et al., Tetrahedron Letters, 2000, 41(10), 1531-1533] 및 [Gilon, C. et al., Tetrahedron, 1967, 23(11), 4441-4447]에 기재된 절차에 따라 알킬 할로겐화물을 N-Boc-히드록실아민으로 처리함으로써 제조될 수 있다.
Figure 112013088873035-pat00164
상기 식에서, -R17-은 -C1-C10 알킬렌-, -C3-C8 카르보시클로-, -O-(C1-C8 알킬)-, -아릴렌-, -C1-C10 알킬렌-아릴렌-, -아릴렌-C1-C10 알킬렌-, -C1-C10 알킬렌-(C3-C8 카르보시클로)-, -(C3-C8 카르보시클로)-C1-C10 알킬렌-, -C3-C8 헤테로시클로-, -C1-C10 알킬렌-(C3-C8 헤테로시클로)-, -(C3-C8 헤테로시클로)-C1-C10 알킬렌-, -(CH2CH2O)r-, -(CH2CH20)r-CH2-로부터 선택되고, r은 1 내지 10의 정수이다.
하기 화학식의 이소티오시아네이트 스트레처는 문헌 [Angew. Chem., 1975, 87(14): 517]에 기재된 바와 같이 이소티오시아네이토카르복실산 클로라이드로부터 제조될 수 있다.
Figure 112013088873035-pat00165
상기 식에서, -R17-은 본원에 기재된 바와 같다.
반응식 11은 말레이미드 스트레처 및 임의로 p-아미노벤질 자체-희생성 스페이서를 갖는 val-cit 디펩티드 링커를 수득하는 방법을 도시한다.
<반응식 11>
Figure 112013088873035-pat00166
상기 식에서, Q는 -C1-C8 알킬, -O-(C1-C8 알킬), -할로겐, -니트로 또는 -시아노이고, m은 0 내지 4의 정수이다.
반응식 12는 말레이미드 스트레처 단위 및 p-아미노벤질 자체-희생성 스페이서 단위를 갖는 phe-lys(Mtr) 디펩티드 링커 단위의 합성을 도시한다. 출발 물질 AD (lys(Mtr))은 바켐(Bachem, 캘리포니아주 토렌스 소재)으로부터 시판되거나, 문헌 [Dubowchik, et al. Tetrahedron Letters (1997) 38: 5257-60]에 기재된 방법에 따라 제조될 수 있다.
<반응식 12>
Figure 112013088873035-pat00167
상기 식에서, Q는 -C1-C8 알킬, -O-(C1-C8 알킬), -할로겐, -니트로 또는 -시아노이고, m은 0 내지 4의 정수이다.
반응식 13에 도시된 바와 같이, 링커는 화학식 Ib의 약물 화합물의 아미노 기와 반응하여, 약물 단위를 링커 단위에 연결하는 아미드기 또는 카르바메이트기를 함유하는 약물-링커 화합물을 형성할 수 있다. 제1 반응성 부위가 링커 AJ에 있는 것과 같이 카르복실산기인 경우, 커플링 반응은 HATU 또는 PyBrop 및 적절한 아민 염기를 사용하여 수행하여, 약물 단위와 링커 단위 사이에 아미드 결합을 함유하는 약물-링커 화합물 AK를 생성할 수 있다. 제1 반응성 부위가 링커 AL에 있는 것과 같이 카르보네이트인 경우, 링커는 DMF/피리딘의 혼합물 중에서 HOBt를 이용하여 약물에 커플링되어, 약물 단위와 링커 단위 사이에 카르바메이트 결합을 함유하는 약물-링커 화합물 AM을 제공할 수 있다.
대안적으로, 제1 반응성 부위가 링커 AN에 있는 것과 같이 양호한 이탈기인 경우, 링커는 친핵성 치환 방법을 통해 약물의 아민기에 커플링되어, 약물 단위와 링커 단위 사이에 아민 링커 (AO)를 갖는 약물-링커 화합물을 제공할 수 있다.
약물을 리간드에 연결하여 약물-링커 화합물을 형성하는데 유용한 예시적인 방법이 반응식 13에 도시되고, 일반 절차 G 내지 H에서 개략적으로 설명된다.
<반응식 13>
Figure 112013088873035-pat00168
일반 절차 G: HATU 를 이용하여 아미드 형성. 약물 (Ib) (1.0 당량) 및 카르복실산 반응성 부위를 함유하는 N-보호된 링커 (1.0 당량)을 디클로로메탄과 같은 적합한 유기 용매로 희석하고, 생성된 용액을 HATU (1.5 당량) 및 유기 염기, 바람직하게는 피리딘 (1.5 당량)으로 처리한다. 반응 혼합물을 불활성 대기, 바람직하게는 아르곤하에 6시간 동안 교반하고, 이 시간 동안 HPLC를 이용하여 반응 혼합물을 모니터링한다. 반응 혼합물을 농축하고, 생성된 잔류물을 HPLC를 이용하여 정제하여, 화학식 AK의 아미드를 수득한다.
절차 H: HOBt 를 이용하여 카르바메이트 형성. p-니트로페닐 카르보네이트 반응성 부위를 갖는 링커 AL (1.1 당량) 및 약물 (Ib) (1.0 당량)의 혼합물을 DMF와 같은 비양성자성 유기 용매로 희석하여, 농도가 50 내지 100 mM인 용액을 수득하고, 생성된 용액을 HOBt (2.0 당량)으로 처리하고, 불활성 대기, 바람직하게는 아르곤하에 둔다. 반응 혼합물을 15분 동안 교반한 다음, 피리딘과 같은 유기 염기 (1/4 v/v)를 첨가하고, 반응의 진행을 HPLC를 이용하여 모니터링한다. 링커는 전형적으로 16시간 내에 소비된다. 그 후, 반응 혼합물을 진공에서 농축하고, 생성된 잔류물을 예를 들어 HPLC를 이용하여 정제하여, 카르바메이트 AM을 수득한다.
약물-링커 화합물을 제조하는 대안적인 방법이 반응식 14에 개략적으로 도시된다. 반응식 14의 방법을 이용하여, 약물을 스트레처 단위가 부착되지 않은 부분 링커 단위 (예를 들어, ZA)에 부착시킨다. 이는 N-말단이 Fmoc-보호된 아미노산 단위를 갖는 중간체 AP를 제공한다. 그 후, Fmoc 기를 제거한 다음, 생성된 아민 중간체 AQ를 PyBrop 또는 DEPC에 의해 촉매되는 커플링 반응을 통해 스트레처 단위에 부착한다. 브로모아세트아미드 스트레처 AR 또는 PEG 말레이미드 스트레처 AS를 함유하는 약물-링커 화합물을 반응식 14에 도시한다.
<반응식 14>
Figure 112013088873035-pat00169
상기 식에서, Q는 -C1-C8 알킬, -O-(C1-C8 알킬), -할로겐, -니트로 또는 -시아노이고, m은 0 내지 4의 정수이다.
분지된 스페이서를 함유하는 링커 단위의 제조에 유용한 방법이 반응식 15에 도시된다.
<반응식 15>
Figure 112013088873035-pat00170
반응식 15는 말레이미드 스트레처 단위 및 비스(4-히드록시메틸)스티렌 (BHMS) 단위를 갖는 val-cit 디펩티드 링커의 합성법을 예시한다. BHMS 중간체 (AW)의 합성법은 이전 문헌의 절차보다 개선되었고 (국제출원공보 WO 9813059호 (Firestone 등) 및 문헌 [Crozet, M.P.; Archaimbault, G.; Vanelle, P.; Nouguier, R. Tetrahedron Lett. (1985) 26:5133-5134] 참조), 출발 물질로서 시판되는 디에틸 (4-니트로벤질)포스포네이트 (AT) 및 시판되는 2,2-디메틸-1,3-디옥산-5-온 (AU)를 사용한다. 링커 AY 및 BA는 반응식 9에 도시된 방법을 이용하여 중간체 AW로부터 제조될 수 있다.
4.6.3 수지형( dendritic ) 링커
링커는 1개 이상의 약물 부분을 분지형 다관능성 링커 부분을 통해 리간드 (예를 들어 항체가 있으나, 이로 한정되지 않음)에 공유 부착시키는 수지형 링커일 수 있다 (문헌 [Sun et al. (2002) Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 12: 2213-2215], [Sun et al. (2003) Bioorganic & Medicinal Chemistry 11: 1761-1768] 참조). 수지형 링커는 약물:항체의 몰비, 즉 부하량을 증가시킬 수 있으며, 이는 약물-링커-리간드 접합체의 효능과 관련이 있다. 따라서, 시스테인으로 조작된 항체가 단지 1개의 반응성 시스테인 티올기를 보유하는 경우, 수많은 약물 부분이 수지형 링커를 통해 부착할 수 있다.
하기 예시적인 실시양태의 수지형 링커 시약은 9개 이하의 친핵성 약물 부분 시약을 클로로에틸 질소 머스타드 관능기와의 반응에 의해 접합시킬 수 있다.
Figure 112013088873035-pat00171
4.6.4 약물 부분과 항체의 접합
반응식 16은 항체 당 약 2 내지 약 4개의 약물을 갖는 약물-링커-리간드 접합체의 제조에 유용한 방법을 예시한다. 항체를 디티오트레이톨 (DTT)과 같은 환원제로 처리하여, 시스테인 디술피드 잔기의 일부 또는 전부를 환원시켜, 고도의 친핵성 시스테인 티올기 (-CH2SH)를 형성한다. 따라서, 문헌 [Klussman, et al. (2004), Bioconjugate Chemistry 15(4): 765-773, page 766]에 기재된 접합 방법에 따라 친전자성 관능기, 예컨대 말레이미드 또는 α-할로 카르보닐을 이용하여 부분적으로 환원된 항체를 약물-링커 화합물, 또는 링커 시약과 반응시킨다.
<반응식 16>
Figure 112013088873035-pat00172
예를 들어, 500 mM 붕산나트륨 및 500 mM 염화나트륨에 용해된 AC10과 같은 항체를 pH 8.0에서 과량의 100 mM 디티오트레이톨 (DTT)로 처리한다. 37℃에서 약 30분 동안 인큐베이션한 후, 스판덱스 G25 수지 상에서 용출시킴으로써 완충액을 교환하고, 1 mM DTPA를 갖는 PBS로 용출시킨다. 티올/Ab 수치는 280 nm에서 용액의 흡광도로부터 환원된 항체 농도를 측정하고, DTNB (알드리치(Aldrich), 위스콘신주 밀워키 소재)와의 반응 및 412 nm에서 흡광도 측정에 의해 티올 농도를 측정함으로써 체크한다. PBS에 용해된 환원된 항체를 얼음 상에서 냉각시킨다. 아세토니트릴 및 물에 용해된 기지 농도의 약물 링커 (예를 들어, DMSO 중의 MC-val-cit-PAB-MMAE)를 PBS 중의 냉각된 환원된 항체에 첨가한다. 약 1시간 후에, 과량의 말레이미드를 첨가하여 반응을 중단시키고, 임의의 미반응 항체 티올기를 캡핑한다. 반응 혼합물을 원심분리 한외여과에 의해 농축하고, ADC, 예를 들어 AC10-MC-vc-PAB-MMAE를 정제하고, PBS 중 G25 수지를 통해 용출시켜 탈염시키고, 멸균 조건하에 0.2 ㎛ 여과기를 통해 여과하고, 저장을 위해 동결시켰다.
다양한 항체 약물 접합체 (ADC)를 다양한 링커 및 약물 부분 (MMAE 및 MMAF)를 이용하여 제조하였다. 하기 표는 실시예 27의 프로토콜에 따라 제조되고 HPLC 및 약물 부하량 검정에 의해 특성분석된 ADC 군의 예이다.
Figure 112013088873035-pat00173
Figure 112013088873035-pat00174
Figure 112013088873035-pat00175

4.7 조성물 및 투여 방법
다른 실시양태로, 유효량의 예시적인 화합물 및(또는) 예시적인 접합체 및 제약상 허용되는 담체 또는 비히클을 포함하는 조성물이 기재된다. 편의를 위해, 약물 단위 및 약물-링커 화합물은 예시적인 화합물로서 지칭되고, 약물-리간드 접합체 및 약물-링커-리간드 접합체는 예시적인 접합체로서 지칭될 수 있다. 조성물은 수의학적 투여 또는 인간 투여에 적합하다.
본 발명의 조성물은 조성물이 환자에게 투여되도록 하는 임의의 형태를 가질 수 있다. 예를 들어, 조성물은 고체, 액체 또는 기체 (에어로졸) 형태일 수 있다. 전형적인 투여 경로로는 경구, 국소, 비경구, 설하, 직장, 질, 안구, 종양내 및 비강내를 들 수 있으나, 이로 한정되는 것은 아니다. 비경구 투여로는 피하 주사, 정맥내, 근육내, 자궁내 주사 또는 주입 기술이 있다. 한 측면으로, 조성물은 비경구로 투여될 수 있다. 또다른 측면으로, 예시적인 화합물 및(또는) 예시적인 접합체 또는 조성물은 정맥내로 투여된다.
조성물을 환자에게 투여하였을 때, 예시적인 화합물 및(또는) 예시적인 접합체가 생체 이용가능하도록 제약 조성물을 제제화할 수 있다. 조성물은 하나 이상의 투여 단위의 형태를 가질 수 있으며, 이 경우 예를 들어 정제가 단일 투여 단위일 수 있고, 에어로졸 형태의 예시적인 화합물 및(또는) 예시적인 접합체의 용기는 다수개의 투여 단위를 보유할 수 있다.
제약 조성물의 제조에 사용되는 물질은 사용된 양에서 무독성일 수 있다. 당업자에게는, 제약 조성물 중 활성 성분의 최적 투여량이 다양한 인자에 의존할 것이라는 것이 자명할 것이다. 관련 인자로는 동물의 유형 (예를 들어, 인간), 예시적인 화합물 또는 예시적인 접합체의 특정 형태, 투여 방식, 및 사용되는 조성물이 있으나, 이로 한정되는 것은 아니다.
조성물이 예를 들어 정제 또는 분말 형태인 경우, 제약상 허용되는 담체 또는 비히클이 입자일 수 있다. 조성물이 예를 들어 경구용 시럽 또는 주사용 액체인 경우, 담체는 액체일 수 있다. 또한, 담체로서 기체 또는 입자를 사용하여, 예를 들어 흡입 투여에 유용한 에어로졸 조성물을 제공할 수 있다.
경구 투여로 의도된 경우, 조성물은 바람직하게는 고체 또는 액체 형태이고,본원에서 고체 또는 액체의 범위 내에는 반-고체, 반-액체, 현탁액 및 겔 형태가 포함된다.
경구 투여용 고체 조성물로서, 조성물은 분말, 과립, 압축 정제, 환제, 캡슐, 츄잉검, 웨이퍼 등의 형태로 제제화될 수 있다. 이러한 고체 조성물은 전형적으로 하나 이상의 불활성 희석제를 함유한다. 또한, 결합제, 예컨대 카르복시메틸셀룰로즈, 에틸 셀룰로즈, 미세결정질 셀룰로즈, 또는 젤라틴; 부형제, 예컨대 전분, 락토즈 또는 덱스트린; 붕괴제, 예컨대 알긴산, 알긴산나트륨, 프리모겔, 옥수수전분 등; 윤활제, 예컨대 스테아르산마그네슘 또는 스테로텍스; 활주제, 예컨대 콜로이드성 이산화규소; 감미제, 예컨대 수크로즈 또는 사카린; 향미제, 예컨대 페퍼민트, 메틸 살리실레이트 또는 오렌지향, 및 착색제 중 하나 이상이 존재할 수 있다.
조성물이 캡슐, 예를 들어 젤라틴 캡슐 형태인 경우, 이는 또한 상기 유형의 물질, 액체 담체, 예컨대 폴리에틸렌 글리콜, 시클로덱스트린 또는 지방 오일을 함유할 수 있다.
조성물은 액체, 예를 들어 엘릭시르, 시럽, 용액, 에멀젼 또는 현탁액 형태일 수 있다. 액체는 경구 투여 또는 주사에 의한 전달에 유용할 수 있다. 경구 투여로 의도된 경우, 조성물은 감미제, 보존제, 염료/착색제 및 향미 개선제 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 주사 투여용 조성물에도 계면활성제, 보존제, 습윤제, 붕괴제, 현탁제, 완충액, 안정화제 및 등장성 제제 중 하나 이상이 포함될 수 있다.
용액, 현탁액 등의 형태인 액체 조성물 또한 멸균 희석제, 예컨대 주사용 물, 염수 용액, 바람직하게는 생리학적 염수, 링거액, 등장성 염화나트륨, 경화유, 예컨대 용매 또는 현탁 매질로서 작용할 수 있는 합성 모노 또는 디글리세라이드, 폴리에틸렌 글리콜, 글리세린, 시클로덱스트린, 프로필렌 글리콜 또는 다른 용매; 항균제, 예컨대 벤질 알콜 또는 메틸 파라벤; 항산화제, 예컨대 아스코르브산 또는 이황화나트륨; 킬레이팅제, 예컨대 에틸렌디아민테트라아세트산; 완충액, 예컨대 아세테이트, 시트레이트 또는 포스페이트 및 강장성 조정제, 예컨대 염화나트륨 또는 덱스트로즈 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 비경구 조성물은 유리, 플라스틱 또는 다른 물질로 제조된 앰플, 일회용 주사기 또는 다중-투여 바이알일 수 있다. 예시적인 아쥬반트는 생리학적 염수이다. 주사용 조성물은 바람직하게는 멸균이다.
특정 질환 또는 증상의 치료에 효과적인 예시적인 화합물 및(또는) 예시적인 접합체의 양은 질환 또는 증상의 성질에 의존할 것이며, 표준 임상 기술에 의해 결정될 수 있다. 또한, 최적 투여 범위의 확인을 돕기 위해, 임의로 시험관내 또는 생체내 검정을 이용할 수 있다. 조성물에 사용되는 정확한 투여량은 또한 투여 경로 및 질병 또는 질환의 중증도에 의존할 것이고, 담당의의 판단 및 각 환자의 상황에 따라 결정되어야 한다.
조성물은 적합한 투여량이 달성되도록 유효량의 예시적인 화합물 및(또는) 예시적인 접합체를 포함한다. 전형적으로, 예시적인 화합물 및(또는) 예시적인 접합체의 양은 조성물의 중량의 약 0.01％ 이상이다. 경구 투여로 의도된 경우, 이 양은 조성물의 약 0.1 중량％ 내지 약 80 중량％ 범위로 다양할 수 있다. 한 측면으로, 경구용 조성물은 조성물의 약 4 중량％ 내지 약 50 중량％로 예시적인 화합물 및(또는) 예시적인 접합체를 포함할 수 있다. 또다른 측면으로, 본 발명의 조성물은 비경구 투여 단위가 약 0.01 중량％ 내지 약 2 중량％의 예시적인 화합물 및(또는) 예시적인 접합체를 함유하도록 제조된다.
정맥내 투여의 경우, 조성물은 동물의 체중 1 kg 당 약 0.01 내지 약 100 mg의 예시적인 화합물 및(또는) 예시적인 접합체를 포함할 수 있다. 한 측면으로, 조성물은 동물의 체중 1 kg 당 약 1 내지 약 100 mg의 예시적인 화합물 및(또는) 예시적인 접합체를 포함할 수 있다. 또다른 측면으로, 투여되는 양은 동물의 체중 1 kg 당 약 0.1 내지 약 25 mg의 예시적인 화합물 및(또는) 예시적인 접합체일 것이다.
일반적으로, 환자에게 투여되는 예시적인 화합물 및(또는) 예시적인 접합체의 투여량은 전형적으로 동물의 체중 1 kg 당 약 0.01 mg/kg 내지 약 2000 mg이다. 한 측면으로, 환자에게 투여되는 투여량은 동물의 체중 1 kg 당 약 0.01 mg 내지 약 10 mg이고, 또다른 측면으로, 환자에게 투여되는 투여량은 동물의 체중 1 kg 당 약 0.1 mg 내지 약 250 mg이고, 또다른 측면으로, 환자에게 투여되는 투여량은 동물의 체중 1 kg 당 약 0.1 mg 내지 약 20 mg이고, 또다른 측면으로, 투여량은 동물의 체중 1 kg 당 약 0.1 mg 내지 약 10 mg이고, 또다른 측면으로, 투여량은 동물의 체중 1 kg 당 약 1 mg 내지 약 10 mg이다.
예시적인 화합물 및(또는) 예시적인 접합체 또는 조성물은 임의의 편리한 경로를 통해, 예를 들어 주입 또는 볼루스 주사에 의해, 상피 또는 점막피부 (예를 들어, 경구 점막, 직장 및 소장 점막 등)을 통한 흡수에 의해 투여될 수 있다. 투여는 전신 또는 국소로 할 수 있다. 다양한 전달 시스템, 예를 들어 리포좀, 미립자, 마이크로캡슐, 캡슐 등으로의 캡슐화가 공지되어 있고, 이를 이용하여 예시적인 화합물 및(또는) 예시적인 접합체 또는 조성물을 투여할 수 있다. 특정 실시양태에서, 하나 이상의 예시적인 화합물 및(또는) 예시적인 접합체 또는 조성물을 환자에게 투여할 수 있다.
구체적인 실시양태에서, 하나 이상의 예시적인 화합물 및(또는) 예시적인 접합체 또는 조성물을 국소적으로 치료를 요하는 부위에 투여하는 것이 바람직할 수 있다. 이는 예를 들어 수술하는 동안의 국소 주입에 의해; 국소 도포에 의해, 예를 들어 수술 후 창상 드레싱과 접합시킴으로써; 주사에 의해; 카테터를 사용하여; 좌약을 사용하여; 또는 이식편 (상기 이식편은 다공성, 비다공성 또는 젤라틴성 물질, 예컨대 막, 예를 들어 실라스틱 막, 또는 섬유임)을 사용하여 달성될 수 있으나, 이로 한정되는 것은 아니다. 한 실시양태에서, 암, 종양 또는 신생물성 또는 전-신생물성 조직의 부위 (또는 이전의 부위)에 직접 주사함으로써 투여될 수 있다. 또다른 실시양태에서, 자가면역 질환의 징후가 있는 부위 (또는 이전의 부위)에 직접 주사함으로써 투여될 수 있다.
특정 실시양태에서, 하나 이상의 예시적인 화합물 및(또는) 예시적인 접합체 또는 조성물을 심실내 및 수막강내 주사를 비롯한 임의의 적합한 경로에 의해 중추 신경계로 도입하는 것이 바람직할 수 있다. 심실내 카테터, 예를 들어 옴마야(Ommaya) 저장소와 같은 저장소에 부착된 심실내 카테터를 이용하여 심실내 주사하는 것이 용이할 수 있다.
또한, 흡입기 또는 분무기를 사용하고, 에어로졸화제를 갖는 제제를 이용하여, 또는 불화탄소 또는 합성 폐 계면활성제 중의 관류를 통해 폐로 투여할 수 있다.
또다른 실시양태에서, 예시적인 화합물 및(또는) 예시적인 접합체 또는 조성물은 제어된 방출 시스템, 예컨대 비제한적인 예로 펌프 또는 다양한 중합체 물질을 이용하여 전달할 수 있다. 또다른 실시양태에서, 제어된-방출 시스템을 예시적인 화합물 및(또는) 예시적인 접합체 또는 조성물의 표적 (예를 들어, 뇌)의 근처에 두어서, 전신 투여량을 일부분만이 필요할 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Goodson, in Medical Applications of Controlled Release, supra, vol. 2, pp. 115-138 (1984)] 참조). 문헌 [Langer (Science 249: 1527-1533 (1990)]에서 논의된 다른 방출 시스템을 이용할 수 있다.
용어 "담체"는 예시적인 화합물 및(또는) 예시적인 접합체와 함께 투여되는 희석제, 아쥬반트 또는 부형제이다. 이러한 제약 담체는 액체, 예컨대 물 및 오일, 예를 들어 석유 오일, 동물성유, 식물성유 또는 합성 오일, 예컨대 땅콩유, 대두유, 광물유, 참깨유 등이 있다. 담체는 염수, 검 아카시아, 젤라틴, 전분 페이스트, 활석, 케라틴, 콜로이드성 실리카, 우레아 등일 수 있다. 또한, 아쥬반트, 안정화제, 증점제, 윤활제 및 착색제를 사용할 수 있다. 한 실시양태에서, 환자에게 투여할 때, 예시적인 화합물 및(또는) 예시적인 접합체 또는 조성물 및 제약상 허용되는 담체는 멸균이다. 예시적인 화합물 및(또는) 예시적인 접합체를 정맥내로 투여할 때의 예시적인 담체는 물이다. 염수 용액 및 수성 덱스트로즈 및 글리세롤 용액 또한 액체 담체로서, 특히 주사용 용액으로서 사용할 수 있다. 적합한 제약 담체로는 또한 부형제, 예컨대 전분, 글루코스, 락토즈, 수크로즈, 젤라틴, 맥아, 쌀, 밀가루, 백악, 실리카 겔, 스테아르산나트륨, 글리세롤 모노스테아레이트, 활석, 염화나트륨, 건조 탈지유, 글리세롤, 프로필렌, 글리콜, 물, 에탄올 등이 있다. 본 발명의 조성물은 경우에 따라 소량의 습윤제 또는 유화제, 또는 pH 완충제를 함유할 수 있다.
본 발명의 조성물은 용액, 현탁액, 에멀젼, 정제, 환제, 펠렛, 캡슐, 액체 함유 캡슐, 분말, 서방형 방출 제제, 좌약, 에멀젼, 에어로졸, 스프레이, 현탁액의 형태, 또는 사용에 적합한 임의의 다른 형태를 취할 수 있다. 적합한 제약 담체의 다른 예는 문헌 ["Remington's Pharmaceutical Sciences" by E.W. Martin]에 기재되어 있다.
한 실시양태에서, 예시적인 화합물 및(또는) 예시적인 접합체는 동물, 특히 인간에게 정맥내 투여하기 위해 채택된 제약 조성물로서 일반적인 절차에 따라 제제화된다. 전형적으로, 정맥내 투여를 위한 담체 또는 비히클은 멸균 등장성 수성 완충액 용액이다. 필요에 따라, 조성물은 또한 가용화제를 함유할 수 있다. 정맥내 투여용 조성물은 임의로 국소 마취제, 예컨대 리그노카인을 포함하여, 주사 부위에서의 통증을 경감시킬 수 있다. 일반적으로, 단위 투여 형태에서 별도로 또는 함께 혼합하여, 예를 들어 활성제의 양이 표시된 앰플 또는 샤쉐와 같은 기밀 밀봉된 용기 중의 동결건조 분말 또는 물이 없는 농축물로서 성분을 공급한다. 예시적인 화합물 및(또는) 예시적인 접합체가 주입에 의해 투여되는 경우, 이는 예를 들어 멸균 제약 등급의 물 또는 염수를 함유하는 주입병을 이용하여 분배될 수 있다. 예시적인 화합물 및(또는) 예시적인 접합체를 주사에 의해 투여하는 경우, 주사용 멸균수 또는 염수의 앰플은 투여 전에 성분들을 혼합할 수 있도록 제공될 수 있다.
경구 전달용 조성물은 예를 들어 정제, 로렌지, 수성 또는 유성 현탁액, 과립, 분말, 에멀젼, 캡슐, 시럽 또는 엘릭시르의 형태일 수 있다. 경구 투여용 조성물은 임의로 맛좋은 제약 제제를 제공하기 위해 감미제, 예컨대 프럭토즈, 아스파탐 또는 사카린; 향미제, 예컨대 페퍼민트, 동록유 또는 체리; 착색제; 및 보존제와 같은 1종 이상의 제제를 함유할 수 있다. 더욱이, 정제 또는 환제 형태인 경우, 조성물을 코팅하여 위장관에서의 붕괴 및 흡수를 지연함으로써, 장시간에 걸쳐 서방형으로 작용하게 할 수 있다. 삼투압적으로 활성인 유도 화합물을 둘러싸는 선택적으로 투과성인 막 또한 경구 투여용 화합물에 적합하다. 이러한 형태에서는, 캡슐을 둘러싸는 환경으로부터의 액체가 유도 화합물에 흡수되고, 캡슐이 팽창되어, 구멍을 통해 제제 또는 제제 조성물이 방출된다. 이러한 전달 형태는 즉시 방출 제제의 스파이크형 프로파일과는 반대로 본질적으로 영차 전달 프로파일을 제공할 수 있다. 시간 지연 물질, 예컨대 글리세롤 모노스테아레이트 또는 글리세롤 스테아레이트 또한 사용될 수 있다.
조성물은 국소 투여용으로 의도될 수 있고, 이 경우 담체는 용액, 에멀젼, 연고 또는 겔 베이스의 형태일 수 있다. 경피 투여용으로 의도된 경우, 조성물은 경피용 패치 또는 이온삼투요법 장치의 형태일 수 있다. 국소용 제제는 약 0.05％ 내지 약 50％ w/v (조성물의 단위 부피 당 중량), 또다른 측면으로 0.1％ 내지 10％ w/v 농도의 예시적인 화합물 및(또는) 예시적인 접합체를 포함할 수 있다.
상기 조성물은 예를 들어 좌제 형태로 직장 투여될 수 있으며, 이것은 직장에서 용융되어 예시 화합물 및(또는) 예시적인 접합체를 방출할 것이다.
상기 조성물은 고체 또는 액체 투여 단위의 물리적 형태를 변형시키는 각종 물질을 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 조성물은 활성 성분 주위에서 코팅 쉘을 형성하는 물질을 포함할 수 있다. 코팅 쉘을 형성하는 물질은 전형적으로 불활성이며, 예를 들어, 당, 쉘락, 및 기타 장용성 코팅제로부터 선택될 수 있다. 별법으로, 상기 활성 성분을 젤라틴 캡슐에 넣을 수도 있다.
상기 조성물은 기체상 투여 단위로 구성될 수 있으며, 예를 들어 에어로졸의 형태일 수 있다. 용어 "에어로졸"은 콜로이드 성질을 갖는 시스템에서부터 가압된 패키지(package)로 구성된 시스템에 이르는 각종 시스템을 일컫는다. 전달은 액화되거나 압축된 기체 또는 활성 성분을 투약하는 적합한 펌프 시스템에 의해 행해질 수 있다.
고체, 액체 또는 기체 형태인지 여부와는 관계 없이, 본 발명의 조성물은 암, 자가면역 질환 또는 감염성 질환의 치료에 사용되는 약리 제제를 포함할 수 있다.
4.8 예시적인 접합체의 치료 용도
예시 화합물 및(또는) 예시적인 접합체는 환자에서의 암, 자가면역 질환 또는 감염성 질환의 치료에 유용하다.
4.8.1 암 치료
예시 화합물 및(또는) 예시적인 접합체는 종양 세포 또는 암 세포 증식을 억제하거나, 종양 또는 암 세포에서 아팝토시스를 유도하거나, 또는 환자에서 암을 치료하는 데 유용하다. 이에 따라, 예시 화합물 및(또는) 예시적인 접합체는 동물의 암을 치료하기 위한 다수의 세팅에 이용될 수 있다. 약물-링커-리간드 접합체는 종양 세포 또는 암 세포에 약물 또는 약물 단위를 전달하는 데 이용될 수 있다. 이론에 얽매이지 않고, 한 실시양태에서, 예시적인 접합체의 리간드 단위는 암 세포 또는 종양 세포와 관련된 항원에 결합하거나 또는 이와 회합되고, 예시적인 접합체는 수용체-매개된 세포내이입을 통해 종양 세포 또는 암 세포 내부로 흡수될 수 있다. 상기 항원은 종양 세포 또는 암 세포에 부착된 것일 수 있고, 또는 상기한 종양 세포 또는 암 세포와 관련된 세포외 매트릭스 단백질일 수 있다. 일단 세포 내부에서는, 링커 단위 내의 1개 이상의 특이적인 펩티드 서열이 종양 세포 또는 암 세포와 관련된 1종 이상의 프로테아제에 의한 가수분해로 절단되어 약물 또는 약물-링커 화합물을 방출시킨다. 이어서, 방출된 약물 또는 약물-링커 화합물은 세포 내에서 자유롭게 이동하고 세포독성 활성 또는 세포증식억제 활성을 유도한다. 또다른 실시양태에서, 약물 또는 약물 단위는 종양 세포 또는 암 세포 외부에서 예시적인 접합체로부터 절단된 후에 이 약물 또는 약물-링커 화합물이 세포에 침투한다.
한 실시양태에서, 상기 리간드 단위는 종양 세포 또는 암 세포에 결합한다.
다른 실시양태에서, 상기 리간드 단위는 종양 세포 또는 암 세포의 표면에 존재하는 종양 세포 또는 암 세포 항원에 결합한다.
다른 실시양태에서, 상기 리간드 단위는 종양 세포 또는 암 세포와 관련된 세포외 매트릭스 단백질인 종양 세포 또는 암 세포 항원에 결합한다.
특정 종양 세포 또는 암 세포에 대한 리간드 단위의 특이성은 가장 효과적으로 치료되는 종양 또는 암을 결정하는 데 있어서 중요할 수 있다. 예를 들어, BR96 리간드 단위를 갖는 예시적인 접합체는 폐, 유방, 결장, 난소 및 췌장에서 암종을 비롯한 항원 양성 암종을 치료하는 데 유용할 수 있다. 항-CD30 또는 항-CD40 리간드 단위를 갖는 예시적인 접합체는 혈액계 악성종양을 치료하는 데 유용할 수 있다.
예시적인 접합체로 치료될 수 있는 다른 특정 유형의 암으로는 하기 표 3에 개시된 것들이 있으나, 이들로 한정되지는 않는다.
Figure 112013088873035-pat00176
Figure 112013088873035-pat00177

예시적인 접합체는 접합-특이적 종양 또는 암 표적화를 제공하므로 상기 화합물들의 일반적인 독성을 감소시킨다. 링커 단위는 혈액에서 예시적인 접합체를 안정화시키며, 이것은 세포 내의 종양-특이적 프로테아제에 의해 절단되어 약물을 유리시킬 수 있다.
4.8.2 여러가지 방식의 암 요법
종양, 전이물, 또는 통제되지 않는 세포 증식을 특징으로 하는 다른 질환 또는 장애 등을 비롯한 암은 예시적인 접합체 및(또는) 예시 화합물의 투여에 의해 치료 또는 예방될 수 있다.
다른 실시양태에서는, 암의 치료 또는 예방이 필요한 환자에게 유효량의 예시적인 접합체 및 화학요법제를 투여하는 것을 포함하는 암의 치료 또는 예방 방법이 제공된다. 한 실시양태에서, 화학요법제는 이것을 사용한 암 치료가 무 반응성이라고 밝혀진 바가 없는 것이다. 다른 실시양태에서, 화학요법제는 이것을 사용한 암 치료가 무 반응성이라고 밝혀진 바가 있는 것이다. 예시적인 접합체는 암에 대한 치료로서 수술을 받은 적이 있는 환자에게 투여할 수도 있다.
한 실시양태에서, 추가의 치료 방법은 방사선 요법이다.
특정 실시양태에서, 예시적인 접합체의 투여는 화학요법제의 투여 또는 방사선 요법과 병행될 수 있다. 다른 특정 실시양태에서, 화학요법제의 투여 또는 방사선 요법은 예시적인 접합체를 투여하기 전 또는 후에 실시되고, 한 측면에서는 예시적인 접합체를 투여하기 전 또는 후에 적어도 1 시간, 5 시간, 12 시간, 1 일, 1 주, 1 개월의 간격을 투고 실시되고, 추가의 측면에서는 수개월 (예를 들어, 3 개월까지)의 간격을 두고 실시된다.
화학요법제는 연속 치료 기간에 걸쳐 투여될 수 있다. 표 4에 열거된 화학요법제 중 어느 하나 또는 이들의 조합물을 투여할 수 있다. 방사선과 관련하여, 치료될 암의 유형에 따라 임의의 방사선 요법 프로토콜이 이용될 수 있다. 한정적인 예는 아니지만, 예를 들어 x-선 방사선이 이용될 수 있는데, 특히 고에너지 메가볼트 (1 MeV 초과의 에너지를 갖는 방사선)는 심부 종양에 이용될 수 있으며, 전자빔 및 오르토볼트 x-선 방사선이 피부암에 이용될 수 있다. 감마선 방출 방사성 동위원소, 예컨대 라듐, 코발트 및 다른 원소의 방사성 동위원소도 투여될 수 있다.
추가로, 화학요법 또는 방사선 요법이 치료받는 대상체에게 매우 치명적이라고 증명되거나 또는 증명할 수 있는 경우, 예를 들어 수용할 수 없거나 또는 견디기 힘든 부작용이 초래된 경우에 상기 예시 화합물 및(또는) 예시적인 접합체를 사용하는 암 치료 방법이 화학요법 또는 방사선 요법에 대한 대안으로서 제공된다. 치료되는 동물은, 임의로는 수술, 방사선 요법 또는 화학요법과 같은 다른 암 치료를 수용할 수 있거나 또는 견딜 수 있는 것으로 밝혀는 경우에, 상기 요법과 같은 다른 암 치료법으로 치료될 수 있다.
또한, 예시 화합물 및(또는) 예시적인 접합체는 예컨대 백혈병 및 림프종 등을 비롯한 특정한 암을 치료하기 위해 시험관내 또는 생체외 방식으로 사용될 수 있으며 상기 치료는 자가 줄기 세포 이식과 관련되어 있다. 이는 동물의 자가 조혈줄기세포를 수확하고 모든 암 세포 제거하며, 이어서 고투여 수준의 방사선 요법을 병행하거나 또는 병행하지 않고 고투여량의 예시 화합물 및(또는) 예시적인 접합체를 투여하여 동물의 나머지 골수 세포 집단을 완전히 제거하며, 줄기 세포 이식편을 다시 동물에게 주입하는 다단계 과정을 포함할 수 있다. 이후에 골수 기능이 복구되고 동물이 회복되는 동안 보조적인 보살핌이 제공된다.
4.8.3 암을 위한 다중-약물 요법
암의 치료가 필요한 환자에게 유효량의 예시적인 접합체 및 항암제인 다른 치료제를 투여하는 것을 포함하는 암 치료 방법이 개시되어 있다. 적합한 항암제로는 메토트렉세이트, 탁솔, L-아스파라기나제, 머캅토퓨린, 티오구아닌, 히드록시우레아, 시타라빈, 시클로포스파미드, 이포스파미드, 니트로소우레아, 시스플라틴, 카르보플라틴, 미토마이신, 다카르바진, 프로카르비진, 토포테칸, 질소 머스타드, 시톡산, 에토포시드, 5-플루오로우라실, BCNU, 이리노테칸, 캄프토테신, 블레오마이신, 독소루비신, 이다루비신, 다우노루비신, 닥티노마이신, 플리카마이신, 미톡산트론, 아스파라기나제, 빈블라스틴, 빈크리스틴, 비노렐빈, 파클리탁셀 및 도세탁셀이 있으나, 이들로 한정되지는 않는다. 한 측면에서, 항암제는 표 4에 열거된 약물을 포함하나, 이들로 한정되지는 않는다.
알킬화제
질소 머스타드류 시클로포스파미드
이포스파미드
트로포스파미드
클로르암부실
멜팔란
니트로소우레아류 카르무스틴(BCNU)
로무스틴(CCNU)
알킬술포네이트류 부술판
트레오술판
트리아젠류 데카르바진
백금 함유 화합물 시스플라틴
카르보플라틴
식물성 알칼로이드류
빈카 알칼로이드류 빈크리스틴
빈블라스틴
빈데신
비노렐빈
탁소이드류 파클리탁셀
도세탁솔
DNA 토포이소머라제 억제제
에피포도필린류 에토포시드
테니포시드
토포테칸
9-아미노캄프토테신
캄프토테신
크리스나톨
미토마이신류 미토마이신 C
항-대사물질
항-폴레이트류
DHFR 억제제 메토트렉세이트
트리메트렉세이트
IMP 데히드로게나제 억제제 미코페놀산
티아조푸린
리바비린
EICAR
리보뉴클레오티드 리덕타제 억제제
피리미딘 유사체
우라실 유사체 5-플루오로우라실
플록스우리딘
독시플루리딘
라티트렉세드
사이토신 유사체 시타라빈 (아라 C)
사이토신 아라비노시드
플루다라빈
퓨린 유사체 머캅토퓨린
티오구아닌
호르몬 요법
수용체 길항제
항-에스트로겐 타목시펜
랄록시펜
메게스트롤
LHRH 효능제 고세렐린
류프롤리드 아세테이트
항-안드로겐 플루타미드
비칼루타미드
레티노이드/델토이드류
비타민 D3 유사체 EB 1089
CB 1093
KH 1060
광역학 요법 베르토포르핀 (BPD-MA)
프탈로시아닌
감광제 Pc4
데메톡시-히포크렐린 A (2BA-2-DMHA)
사이토킨류 인터페론-α
인터페론-γ
종양 괴사 인자
기타 겜시타빈
벨케이드
레바미드
탈라미드
이소프레닐화 억제제 로바스타틴
도파민성 신경독 1-메틸-4-페닐피리디늄 이온
세포주기 억제제 스타우로스포린
악티노마이신류 악티노마이신 D
닥티노마이신
블레오마이신류 블레오마이신 A2
블레오마이신 B2
페플로마이신
안트라시클린류 다우노루비신
독소루비신 (아드리아마이신)
이다루비신
에피루비신
피라루비신
조루비신
므톡산트론
MDR 억제제 베라파밀
CA2 + ATPase 억제제 타프시가르긴
4.8.4 자가면역 질환의 치료
예시적인 접합체는 자가면역 질환을 초래하는 세포를 사멸시키거나 또는 이러한 세포의 복제를 억제하는 데 유용하거나, 또는 자가면역 질환을 치료하는 데 유용하다. 이에 따라, 예시적인 접합체는 환자의 자가면역 질환을 치료하기 위해 다양한 상황에 따라 사용될 수 있다. 약물-링커-리간드 접합체는 표적 세포에 약물을 전달하는 데 이용될 수 있다. 이론에 얽매이지 않고, 한 실시양태에서, 약물-링커-리간드 접합체는 표적 세포의 표면 상에서 항원과 회합되어 있으며, 이어서 이 예시적인 접합체는 수용체-매개된 세포내이입을 통해 표적 세포 내부로 흡수된다. 일단 세포 내부에서는, 링커 단위 내의 1개 이상의 특이적인 펩티드 서열이 효소에 의해 또는 가수분해에 의해 분해되어 약물을 방출시킨다. 이어서, 방출된 약물은 시토졸 내에서 자유롭게 이동하고 세포독성 또는 세포증식억제 활성을 유도한다. 또다른 실시양태에서, 약물은 표적 세포의 외부에서 예시적인 접합체로부터 절단된 후에 약물이 세포에 침투한다.
한 실시양태에서, 리간드 단위는 자가면역 항원에 결합한다. 한 측면에서, 항원은 자가면역 상태와 관련된 세포의 표면에 존재한다.
다른 실시양태에서, 리간드 단위는 세포의 표면에 존재하는 자가면역 항원에 결합한다.
한 실시양태에서, 리간드는 자가면역 질환 상태와 회합된 활성화된 림프구에 결합한다.
추가의 실시양태에서, 예시적인 접합체는 특정 자가면역 질환과 관련된 자가면역 항체를 생성하는 세포를 사멸시키거나 또는 이러한 세포의 증식을 억제한다.
예시적인 접합체로 치료될 수 있는 특정 유형의 자가면역 질환으로는, Th2 림프구 관련 장애(예를 들어, 아토피성 피부염, 아토피성 천식, 비결막염, 알레르기성 비염, 오멘 증후군(Omenn's syndrome), 전신성 경화증 및 이시편대숙주 질환); Th1 림프구-관련 질병(예를 들어, 류마티스성 관절염, 다발성 경화증, 건선, 쇼그렌 증후군(Sjorgren's syndrome), 하시모토(Hashimoto) 갑상선염, 그레이브스병(Grave's disease), 원발성 담즙성 간경변, 베게너(Wegener) 육아종증 및 결핵); 활성화된 B 림프구-관련 장애 (예를 들어, 전신성 홍반 루푸스, 구드패스츄어 증후군(Goodpasture's syndrome), 류마티스성 관절염 및 제I형 당뇨병); 및 표 5에 개시된 것들이 있으나, 이들로 한정되지는 않는다.
Figure 112013088873035-pat00178
Figure 112013088873035-pat00179

4.8.5 자가면역 질환의 다중-약물 요법
또한, 자가면역 질환의 치료가 필요한 환자에게 유효량의 예시적인 접합체 및 자가면역 질환의 치료에 공지되어 있는 다른 치료제를 투여하는 것을 포함하는 자가면역 질환의 치료 방법이 개시되어 있다. 한 실시양태에서, 항-자가면역 질환 제제로는 표 6에 열거된 제제들이 있으나, 이들로 한정되지는 않는다.
시클로스포린
시클로스포린 A
미코페닐레이트 모페틸
시롤리무스
탁롤리무스
에나네르셉트
프레드니손
아자티오프린
메토트렉세이트 시클로포스파미드
프레드니손
아미노카프로산
클로로퀸
히드록시클로로퀸
히드로코르티손
덱사메타손
클로르암부실
DHEA
다나졸
브로모크립틴
멜록시캄
인플릭시맵
4.8.6 감염성 질환의 치료
예시적인 접합체는 감염성 질환을 초래하는 세포를 사멸시키거나 또는 이러한 세포의 증식을 억제하는 데 유용하거나, 또는 감염성 질환을 치료하는 데 유용하다. 이에 따라, 예시적인 접합체는 환자에서 감염성 질환을 치료하기 위한 다수의 세팅에 이용될 수 있다. 약물-링커-리간드 접합체는 약물을 표적 세포로 전달하는 데 이용될 수 있다. 한 실시양태에서, 상기 리간드 단위는 감염성 질환 세포에 결합한다.
한 실시양태에서, 접합체는 특정 감염성 질환을 초래하는 세포를 사멸시키거나 또는 이러한 세포의 증식을 억제한다.
예시적인 접합체로 치료될 수 있는 특정 유형의 감염성 질환으로는 표 7에 개시된 질환들이 있으나, 이들로 한정되지는 않는다.
Figure 112013088873035-pat00180
Figure 112013088873035-pat00181
Figure 112013088873035-pat00182
Figure 112013088873035-pat00183

4.8.7 감염성 질환의 다중-약물 요법
감염성 질환의 치료가 필요한 환자에게 예시적인 접합체 및 항-감염성 질환 제제인 다른 치료제를 투여하는 것을 포함하는 감염성 질환의 치료 방법이 개시되어 있다. 한 실시양태에서, 항-감염성 질환 제제는 표 8에 열거된 제제이나, 이들로 한정되지는 않는다.
Figure 112013088873035-pat00184
Figure 112013088873035-pat00185
Figure 112013088873035-pat00186

<실시예>
실시예 1 - 화합물 AB의 제조
Figure 112013088873035-pat00187
Fmoc-val-cit-PAB-OH (14.61 g, 24.3 mmol, 1.0 당량, 파이어스톤 등의 미국 특허 제6214345호)를 DMF (120 mL, 0.2 M)로 희석하고, 이 용액에 디에틸아민 (60 mL)을 첨가하였다. 반응을 HPLC에 의해 모니터링하여 2시간내에 완결되었음을 알았다. 반응 혼합물을 농축하고, 생성된 잔류물을 초음파처리하에 에틸 아세테이트 (약 100 mL)를 사용하여 10분 동안 침전시켰다. 에테르 (200 mL)를 첨가하고, 침전물을 5분 동안 더 초음파처리하였다. 용액을 교반하지 않고 30분 동안 정치시킨 후, 여과하고, 고 진공하에 건조시켜 Val-cit-PAB-OH를 얻었으며, 이를 추가의 정제없이 다음 단계에서 사용하였다. 수율: 8.84 g (96％). Val-cit-PAB-OH (8.0 g, 21 mmol)를 DMF (110 mL)로 희석하고, 생성된 용액을 MC-OSu (문헌 [Willner et al., (1993) Bioconjugate Chem. 4:521]; 6.5 g, 21 mmol, 1.0 당량)로 처리하였다. 반응은 HPLC에 따르면 2시간 후에 완결되었다. 반응 혼합물을 농축하고, 생성된 오일을 에틸 아세테이트 (50 mL)를 사용하여 침전시켰다. 15분 동안 초음파처리한 후, 에테르 (400 mL)를 첨가하고, 모든 대형 입자가 분쇄될 때까지 혼합물을 더 초음파처리하였다. 그 후, 용액을 여과하고, 고체를 건조시켜 회백색 고체 중간체를 얻었다. 수율: 11.63 g (96％); ES-MS m/z 757.9 [M-H]
Fmoc-val-cit-PAB-OH (14.61 g, 24.3 mmol, 1.0 당량, 파이어스톤 등의 미국 특허 제6214345호)를 DMF (120 mL, 0.2 M)로 희석하고, 이 용액에 디에틸아민 (60 mL)을 첨가하였다. 반응을 HPLC에 의해 모니터링하여 2시간내에 완결되었음을 알았다. 반응 혼합물을 농축하고, 생성된 잔류물을 초음파처리하에 에틸 아세테이트 (약 100 mL)를 사용하여 10분 동안 침전시켰다. 에테르 (200 mL)를 첨가하고, 침전물을 5분 동안 더 초음파처리하였다. 용액을 교반하지 않고 30분 동안 정치시킨 후, 여과하고, 고 진공하에 건조시켜 Val-cit-PAB-OH를 얻었으며, 이를 추가의 정제없이 다음 단계에서 사용하였다. 수율: 8.84 g (96％). Val-cit-PAB-OH (8.0 g, 21 mmol)를 DMF (110 mL)로 희석하고, 생성된 용액을 MC-OSu (문헌 [Willner et al., (1993) Bioconjugate Chem. 4:521]; 6.5 g, 21 mmol, 1.0 당량)로 처리하였다. 반응은 HPLC에 따르면 2시간 후에 완결되었다. 반응 혼합물을 농축하고, 생성된 오일을 에틸 아세테이트 (50 mL)를 사용하여 침전시켰다. 15분 동안 초음파처리한 후, 에테르 (400 mL)를 첨가하고, 모든 대형 입자가 분쇄될 때까지 혼합물을 더 초음파처리하였다. 그 후, 용액을 여과하고, 고체를 건조시켜 회백색 고체 중간체를 얻었다. 수율: 11.63 g (96％); ES-MS m/z 757.9 [M-H].
회백색 고체 중간체 (8.0 g, 14.0 mmol)를 DMF (120 mL, 0.12 M)로 희석하고, 생성된 용액에 비스(4-니트로페닐)카르보네이트 (8.5 g, 28.0 mmol, 2.0 당량) 및 DIEA (3.66 mL, 21.0 mmol, 1.5 당량)를 첨가하였다. 반응은 HPLC에 따르면 1시간내에 완결되었다. 반응 혼합물을 농축하여 오일을 얻고, 이를 EtOAc로 침전시킨 후, EtOAc (약 25 mL)로 연화시켰다. 용질을 에테르 (약 200 mL)로 더 침전시키고, 15분 동안 연화시켰다. 고체를 여과하고, 고 진공하에 건조시켜 HPLC에 따른 순도가 93％인 화합물 AB를 얻었으며, 이것을 다음 단계에서 추가의 정제없이 사용하였다. 수율: 9.7 g (94％).
실시예 2 - 화합물 1의 제조
Figure 112013088873035-pat00188
페닐알라닌 t-부틸 에스테르 HCl 염 (868 mg, 3 mmol), N-Boc-돌아프로인 (668 mg, 1 당량), DEPC (820 ㎕, 1.5 당량) 및 DIEA (1.2 mL)를 디클로로메탄 (3 mL)으로 희석하였다. 실온 (약 28℃)에서 2시간 후에 반응 혼합물을 디클로로메탄 (20 mL)으로 희석하고, 포화 수성(aq.) NaHC03 (2 x 10 mL), 포화 수성 NaCl (2 x 10 mL)로 연속적으로 세척하였다. 유기층을 분리하고 농축하였다. 생성된 잔류물을 에틸 아세테이트에 재현탁시키고, 에틸 아세테이트 중에서 플래시 크로마토그래피로 정제하였다. 관련된 분획물을 합하고, 농축하여 백색 고체로서 디펩티드를 얻었다: 684 mg (46％). ES-MS m/z 491.3 [M+H]+.
t-부틸 에스테르의 존재하에 선택적 Boc 분해를 위하여, 상기 디펩티드 (500 mg, 1.28 mmol)를 디옥산 (2 mL)으로 희석하였다. 4 M HCl/디옥산 (960 ㎕, 3 당량)을 첨가하고, 반응 혼합물을 실온에서 밤새 교반하였다. 거의 완전한 Boc 탈보호가 극소량의 t-부틸 에스테르 분해와 함께 RP-HPLC에 의해 관찰되었다. 혼합물을 빙조에서 냉각시키고, 트리에틸아민 (500 ㎕)을 첨가하였다. 10분 후, 혼합물을 냉각조에서 꺼내고, 디클로로메탄 (20 mL)으로 희석하고, 포화 수성 NaHC03 (2 x 10 mL), 포화 수성 NaCl (2 x 10 mL)로 연속적으로 세척하였다. 유기층을 농축하여 황색 발포체를 얻었다: 287 mg (57％). 중간체를 추가의 정제없이 사용하였다.
트리펩티드 Fmoc-Meval-val-dil-O-t-Bu ("펜타펩티드 화합물 및 이와 관련된 용도"를 표제로 하는 WO02/088172호에 기재된 바와 같이 제조됨; 0.73 mmol)를 TFA (3 mL), 디클로로메탄 (3 mL)으로 2시간 동안 실온에서 처리하였다. 혼합물을 농축하여 건조상태로 만들고, 잔류물을 톨루엔 (3 x 20 mL)과 함께 공증발시키고, 진공하에 밤새 건조시켰다. 잔류물을 디클로로메탄 (5 mL)으로 희석하고, 탈보호된 디펩티드 (287 mg, 0.73 mmol)에 첨가한 후, DIEA (550 ㎕, 4 당량), DEPC (201 ㎕, 1.1 당량)에 첨가하였다. 실온에서 2시간 후에 반응 혼합물을 에틸 아세테이트 (50 mL)로 희석하고, 10％ 수성 시트르산 (2 x 20 mL), 포화 수성 NaHC03 (2 x 10 mL), 포화 수성 NaCl (10 mL)로 연속적으로 세척하였다. 유기층을 분리하고 농축하였다. 생성된 잔류물을 에틸 아세테이트에 재현탁시키고, 에틸 아세테이트 중에서 플래시 크로마토그래피로 정제하였다. 관련된 분획물을 합하고, 농축하여 백색 고체로서 Fmoc-Meval-val-dil-dap-phe-O-t-Bu를 얻었다: 533 mg (71％). Rf 0.4 (EtOAc). ES-MS m/z 1010.6 [M+H]+.
생성물 (200 mg, 0.2 mmol)을 디클로로메탄 (3 mL), 디에틸아민(1 mL)으로 희석하였다. 반응 혼합물을 실온에서 밤새 교반하였다. 용매를 제거하여 오일을 얻고, 이를 디클로로메탄 중에서 단계 구배 0 내지 10％ MeOH로 플래시 실리카 겔 크로마토그래피에 의해 정제하여 백색 고체로서 화합물 1을 얻었다: 137 mg (87％). Rf 0.3 (10％ MeOH/CH2Cl2). ES-MS m/z 788.6 [M+H]+.
실시예 3 - 화합물 2의 제조
Figure 112013088873035-pat00189
화합물 2는, 화합물 1 (30 mg, 0.038 mmol)로부터 실온에서 4 M HCl/디옥산 (4 ml)으로 7시간 동안 처리하여 제조하였다. 용매를 제거하고, 잔류물을 진공하에 밤새 건조시켜 흡습성 백색 고체로서 화합물 2를 얻었다: 35 mg (120％; HCl 염에 대해 계산됨). ES-MS m/z 732.56 [M+H]+.
실시예 4 - 화합물 3의 제조
Figure 112013088873035-pat00190
Fmoc-Meval-val-dil-dap-phe-O-t-Bu (실시예 2, 50 mg)를 4 M HCl/디옥산 (4 ml)으로 실온에서 16시간 동안 처리하였다. 용매를 제거하고, 잔류물을 진공하에 밤새 건조시켜 흡습성 백색 고체 중간체 50 mg을 얻었다.
백색 고체 중간체 (20 mg, 0.02 mmol)를 디클로로메탄 (1 mL)으로 희석하고, DEPC (5 ㎕, 0.03 mmol, 1.5 당량)를 첨가한 후, DIEA (11 ㎕, 0.06 mmol, 3 당량) 및 t-부틸아민 (3.2 ㎕, 0.03 mmol, 1.5 당량)을 첨가하였다. 실온에서 2시간 후에, RP-HPLC에 의해 반응이 완결되지 않은 것을 알았다. 추가의 DEPC (10 ㎕) 및 t-부틸아민 (5 ㎕)을 첨가하고, 반응물을 추가의 4시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 디클로로메탄 (15 mL)으로 희석하고, 물 (5 mL), 0.1 M 수성 HCl (10 mL), 포화 수성 NaCl (10 mL)로 연속적으로 세척하였다. 유기층을 분리하고, 농축하였다. 생성된 잔류물을 디클로로메탄으로 희석하고, 디클로로메탄 중에서 단계 구배 0 내지 5％ MeOH로 플래시 크로마토그래피로 정제하였다. 관련된 분획물을 합하고, 농축하여 백색 고체로서 Fmoc 보호된 중간체를 얻었다: 7.3 mg (36％). Rf 0.75 (10％ MeOH/CH2Cl2).
Fmoc 보호된 중간체를 디클로로메탄 (0.5 mL)으로 희석하고, 실온에서 3시간 동안 디에틸아민 (0.5 mL)으로 처리하였다. 반응 혼합물을 농축하여 건조상태로 만들었다. 생성물을 디클로로메탄 중에서 단계 구배 0 내지 10％ MeOH로 플래시 실리카 겔 크로마토그래피에 의해 단리하여 백색 고체로서 화합물 3을 얻었다: 4 mg (70％). Rf 0.2 (10％ MeOH/CH2Cl2). ES-MS m/z 787 [M+H]+, 809 [M+Na]+.
실시예 5 - 화합물 4의 제조
Figure 112013088873035-pat00191
Boc-L-페닐알라닌 (265 mg, 1 mmol, 1 당량) 및 트리에틸렌글리콜 모노메틸 에테르 (164 ㎕, 1 mmol, 1 당량)를 디클로로메탄 (5 mL)으로 희석하였다. 그 후, DCC (412 mg, 2 mmol, 2 당량)를 첨가한 다음, DMAP (10 mg)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 밤새 교반하였다. 침전물을 여과 제거하였다. 용매를 진공하에 제거하고, 잔류물을 에틸 아세테이트로 희석하고, 에틸 아세테이트 중에서 실리카 겔 플래시 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 생성물 함유 분획물을 모으고, 농축하고, 진공하에 건조시켜 백색 고체를 얻었다: 377 mg (91％). Rf 0.5 (EtOAc). ES-MS m/z 434 [M+Na]+.
디옥산 (10 mL) 중 상기 물질을 4 M HCl/디옥산 (6 mL)으로 6시간 동안 실온에서 처리함으로써 Boc 보호기를 제거하였다. 용매를 진공하에 제거하고, 잔류물을 진공하에 건조시켜 백색 고체를 얻었다.
페닐알라닌-트리에틸렌글리콜 모노메틸 에테르 에스테르의 HCl 염 (236 mg, 0.458 mmol, 1 당량) 및 N-Boc-돌아프로인 (158 mg, 0.55 mmol, 1.2 당량)을 디클로로메탄 (3 mL)으로 희석하였다. DEPC (125 ㎕, 1.5 당량)를 혼합물에 첨가한 후, DIEA (250 ㎕, 3 당량)를 첨가하였다. 실온에서 2시간 후에 반응 혼합물을 에틸 아세테이트 (30 mL)로 희석하고, 포화 수성 NaHC03 (2 x 10 mL), 10％ 수성 시트르산 (2 x 10 mL), 포화 수성 NaCl (10 mL)로 연속적으로 세척하였다. 유기층을 분리하고 농축하였다. 생성된 잔류물을 에틸 아세테이트에 재현탁시키고, 에틸 아세테이트 중 실리카 겔 상에서 플래시 크로마토그래피로 정제하였다. 관련된 분획물을 합하고, 농축하여 백색 발포체 중간체를 얻었다: 131 mg (50％). Rf O.25 (EtOAc). ES-MS m/z 581.3 [M+H]+.
디클로로메탄 (2 mL), TFA (0.5 mL) 중에서 실온에서 2시간 동안 Boc 탈보호를 수행하였다. 용매를 진공하에 제거하고, 잔류물을 톨루엔 (3 x 25 mL)과 함께 공증류시킨 후, 진공하에 건조시켜 디펩티드 TFA 염 138 mg을 얻었다.
Fmoc-Meval-val-dil-OH (실시예 2, 147 mg, 0.23 mmol, 1 당량) 및 디펩티드 TFA 염 (138 mg)을 디클로로메탄 (2 mL)으로 희석하였다. 혼합물에 DEPC (63 ㎕, 1.5 당량)를 첨가한 후, DIEA (160 ㎕, 4 당량)를 첨가하였다. 실온에서 2시간 후에, 반응 혼합물을 디클로로메탄 (30 mL)으로 희석하고, 10％ 수성 시트르산 (2 x 20 mL), 포화 수성 NaCl (20 mL)로 연속적으로 세척하였다. 유기층을 분리하고 농축하였다. 생성된 잔류물을 디클로로메탄에 재현탁시키고, 디클로로메탄 중에서 단계 구배 0 내지 5％ MeOH로 실리카 겔 상에서 플래시 크로마토그래피로 정제하였다. 관련된 분획물을 합하고, 농축하여 백색 발포체를 얻었다: 205 mg (81％). Rf 0.4 (10％ MeOH/CH2Cl2). ES-MS m/z 1100.6 [M+H]+, 1122.4 [M+Na]+.
디클로로메탄 (6 mL) 중 디에틸아민 (2 mL)으로 처리하여 Fmoc 보호기를 제거하였다. 실온에서 6시간 후에 용매를 진공하에 제거하고, 생성물을 디클로로메탄 중에서 단계 구배 0 내지 10％ MeOH로 실리카 겔 상에서 플래시 크로마토그래피에 의해 단리시켰다. 관련된 분획물을 합하고, 농축하였다. 디클로로메탄/헥산 (1:1)으로부터 증발시킨 후, 화합물 4를 백색 발포체로서 얻었다: 133 mg (80％). Rf 0.15 (10％ MeOH/CH2Cl2). ES-MS m/z 878.6 [M+H]+.
실시예 6 - 화합물 5의 제조
Figure 112013088873035-pat00192
Fmoc-Meval-val-dil-OH (실시예 2, 0.50 g, 0.78 mmol) 및 dap-phe-OMe·HCl (0.3 g, 0.78 mmol, 문헌 [Pettit, G. R., et al. Anti-Cancer Drug Design 1998, 13, 243-277]에 따라 제조됨)을 CH2Cl2 (10 mL)에 용해시킨 후, 디이소프로필에틸아민 (0.30 mL, 1.71 mmol, 2.2 당량)을 첨가하였다. DEPC (0.20 mL, 1.17, 1.5 당량)를 첨가하고, 내용물을 Ar하에 정치시켰다. 반응은 HPLC에 따르면 1시간내에 완결되었다. 혼합물을 오일로 농축하고, 100％ EtOAc로 용리하는 Si02 크로마토그래피 (300 x 25 mm 컬럼)에 의해 정제하였다. 생성물을 백색 발포성 고체로 단리하였다. 수율: 0.65 g (87％). ES-MS m/z 968.35 [M+H]+, 991.34 [M+Na]+; UV λ최대 215, 265 nm.
메틸렌 클로라이드 (5 mL) 중 Fmoc-보호된 펩티드 (0.14 g, 0.14 mmol)를 디에틸아민 (2 mL)으로 처리하고, 내용물을 실온에서 2시간 동안 정치시켰다. HPLC에 의해 완결된 반응을 오일로 농축하고, DMSO 2 mL에 용해시키고, 정제-HPLC (C12-RP 컬럼, 5 μ, 100 Å, 수 중 MeCN의 선형 구배 (0.1％ TFA 포함) 10 내지 100％ 에서 40분, 그 후 100％에서 20분, 유속 25 mL/분)에 주입하였다. 생성물을 함유하는 분획물을 증발시켜 트리플루오로아세테이트 염 백색 분말을 얻었다. 수율: 0.126 g (98％). Rf 0.28 (100％ EtOAc); ES-MS m/z 746.59 [M+H]+, 768.51 [M+Na]+; UV λ최대 215 nm.
실시예 7 - 화합물 6의 제조
Figure 112013088873035-pat00193
화합물 5 (0.11 g, 0.13 mmol)의 트리플루오로아세테이트 염, 화합물 AB (0.103 g, 0.14 mmol, 1.1 당량) 및 HOBt (3.4 mg, 26 μmol, 0.2 당량)를 DMF/피리딘 (각각 2 mL/0.5 mL)에 현탁시켰다. 디이소프로필에틸아민 (22.5 ㎕, 0.13 mmol, 1.0 당량)을 첨가하고, 황색 용액을 아르곤하에 교반하였다. 3시간 후에, 추가로 1.0 당량의 DIEA를 첨가하였다. 24시간 후에, 0.5 당량의 활성화된 링커를 반응 혼합물에 포함시켰다. 총 40시간 후에, 반응이 완결되었다. 내용물을 증발시키고, DMSO에 용해시키고, 정제-HPLC (C12-RP 컬럼, 5 μ, 100 Å, 수 중 MeCN의 선형 구배 (0.1％ TFA 포함) 10 내지 100％ 에서 40분, 그 후 100％에서 20분, 유속 50 mL/분)에 주입하였다. 목적하는 분획물을 증발시켜 황색 오일로서 생성물을 얻었다. 메틸렌 클로라이드 (약 2 mL) 및 과량의 에테르를 첨가하여 백색 침전물로서 화합물 6을 얻고, 이를 여과하고, 건조시켰다. 수율: 90 mg (52％). ES-MS m/z 1344.32 [M+H]+, 1366.29 [M+Na]+; UV λ최대 215, 248 nm.
실시예 8 - 화합물 7의 제조
Figure 112013088873035-pat00194
화합물 4 (133 mg, 0.15 mmol, 1 당량), 화합물 AB (123 mg, 0.167 mmol, 1.1 당량) 및 HOBt (4 mg, 0.2 당량)를 DMF (1.5 mL)로 희석하였다. 2분후, 피리딘 (5 mL)을 첨가하고, 반응을 RP-HPLC를 이용하여 모니터링하였다. 반응은 18시간내에 완결된 것으로 나타났다. 반응 혼합물을 디클로로메탄 (20 mL)으로 희석하고, 10％ 수성 시트르산 (2 x 10 mL), 물 (10 mL), 포화 수성 NaCl (10 mL)로 연속적으로 세척하였다. 유기층을 분리하고, 농축하였다. 생성된 잔류물을 디클로로메탄에 재현탁시키고, 디클로로메탄 중에서 단계 구배 0 내지 10％ MeOH로 실리카 겔 상에서 플래시 크로마토그래피로 정제하였다. 관련된 분획물을 합하고, 농축하여 백색 발포체로서 화합물 7을 얻었다: 46 mg (21％). Rf 0.15 (10％ MeOH/CH2Cl2). ES-MS m/z 1476.94 [M+H]+.
실시예 9 - MC - Val - Cit - PAB - MMAF t-부틸 에스테르 8의 제조
Figure 112013088873035-pat00195
화합물 1 (83 mg, 0.11 mmol), 화합물 AB (85 mg, 0.12 mmol, 1.1 당량) 및 HOBt (2.8 mg, 21 μmol, 0.2 당량)를 아르곤하에 무수 DMF (1.5 mL) 및 피리딘 (0.3 mL)에 용해시켰다. 30시간 후에, 반응이 HPLC에 의해 본질적으로 완결된 것을 알았다. 혼합물을 증발시키고, 극소량의 DMSO에 용해시키고, 정제-HPLC (C12-RP 컬럼, 5 μ, 100 Å, 수 중 MeCN의 선형 구배 (0.1％ TFA 포함) 10 내지 100％ 에서 40분, 그 후 100％에서 20분, 유속 25 mL/분)에 의해 정제하여 백색 고체로서 화합물 8을 얻었다. 수율: 103 mg (71％). ES-MS m/z 1387.06 [M+H]+, 1409.04 [M+Na]+; UV λ최대 205, 248 nm.
실시예 10 - MC - val - cit - PAB - MMAF 9의 제조
Figure 112013088873035-pat00196
화합물 8 (45 mg, 32 μmol)을 메틸렌 클로라이드 (6 mL)에 현탁시킨 후, TFA (3 mL)를 첨가하였다. 생성된 용액을 2시간 동안 정치시켰다. 반응 혼합물을 진공하에 농축하고, 정제-HPLC (C12-RP 컬럼, 5 μ, 100 Å, 수 중 MeCN의 선형 구배 (0.1％ TFA 포함) 10 내지 100％ 에서 40분, 그 후 100％에서 20분, 유속 25 mL/분)에 의해 정제하였다. 목적하는 분획물을 농축하여 회백색 고체로서 말레이미도카프로일-발린-시트룰린-p-히드록시메틸아미노벤젠-MMAF (MC-val-cit-PAB-MMAF) 9를 얻었다. 수율: 11 mg (25％). ES-MS m/z 1330.29 [M+H]+, 1352.24 [M+Na]+; UV λ최대 205, 248 nm.
실시예 11 - MC - val - cit - PAB - MMAF tert -부틸 아미드 10의 제조
Figure 112013088873035-pat00197
화합물 3 (217 mg, 0.276 mmol, 1.0 당량), 화합물 AB (204 mg, 0.276 mmol, 1.0 당량) 및 HOBt (11 mg, 0.0828 mmol, 0.3 당량)를 피리딘/DMF (6 mL)로 희석하였다. 이 혼합물에 DIEA (0.048 mL)를 첨가하고, 혼합물을 약 16시간 동안 교반하였다. 휘발성 유기물을 진공하에 증발시켰다. 조 잔류물을 단계 구배 (DCM 중 0-5-10％ 메탄올)로 크로마토트론(Chromatotron; 등록상표) (방사상 박층 크로마토그래피)에 의해 정제하여 MC-val-cit-PAB-MMAF tert-부틸 아미드 10을 얻었다. 수율: 172 mg (45％); ES-MS m/z 1386.33 [M+H]+, 1408.36 [M+Na]+; UV λ최대 215, 248 nm.
실시예 12 - AC10 및 MC - MMAE 의 접합에 의한 AC10 - MC - MMAE 의 제조
pH 8.0에서 500 mM 붕산나트륨 및 500 mM 염화나트륨에 용해된 AC10을 과량의 100 mM 디티오트레이톨 (DTT)로 처리하였다. 37℃에서 약 30분 동안 인큐베이션한 후, 완충액을 세파덱스 G25 수지를 이용한 용리에 의해 교환하고, 1 mM DTPA를 이용하여 PBS로 용리하였다. 용액의 280 nm에서의 흡광도로부터 감소된 항체 농도 및 DTNB (위스콘신 밀워키 소재 알드리치 제품)와의 반응 및 412 nm에서의 흡광도 측정에 의한 티올 농도를 측정함으로써 티올/Ab 수치를 확인하였다. PBS에 용해된 감소된 항체를 얼음으로 냉각시켰다.
DMSO에 용해된 약물 링커 시약인 말레이미도카프로일-모노메틸 아우리스타틴 E, 즉 MC-MMAE를 아세토니트릴 및 물에 공지된 농도로 희석하고, PBS 중 냉각된 감소된 항체 AC10에 첨가하였다. 약 1시간 후에, 과량의 말레이미드를 첨가하여 반응을 켄칭시키고, 임의의 미반응 항체 티올기를 캡핑하였다. 반응 혼합물을 원심 한외여과에 의해 농축하고, AC10-MC-MMAE를 정제하고, PBS 중 G25 수지를 통해 용리하여 탈염하고, 무균 조건하에 0.2 μm 필터를 통해 여과하고, 저장을 위해 냉동시켰다.
실시예 13 - AC10 및 MC - MMAF 의 접합에 의한 AC10 - MC - MMAF 의 제조
AC10-MC-MMAF를 실시예 12의 방법에 따라 AC10 및 MC-MMAF의 접합에 의해 제조하였다.
실시예 14 - AC10 및 MC - val - cit - PAB - MMAE 의 접합에 의한 AC10 - MC - val - cit -PAB-MMAE의 제조
AC10-MC-val-cit-PAB-MMAE를 실시예 12의 방법에 따라 AC10 및 MC-val-cit-PAB-MMAE의 접합에 의해 제조하였다.
실시예 15 - AC1O 및 MC - val - cit - PAB - MMAF (9)의 접합에 의한 AC10 - MC - val -cit-PAB-MMAF의 제조
AC10-MC-val-cit-PAB-MMAF를 실시예 12의 방법에 따라 AC1O 및 MC-val-cit-PAB-MMAF (9)의 접합에 의해 제조하였다.
실시예 16 - 선택된 화합물의 세포독성 측정
MMAF 및 화합물 1 내지 5의 세포독성을 루이스 Y 양성 세포주 OVCAR-3에 대해 평가하였으며, H3396 유방 암종, L2987 폐 암종 및 LS174t 결장 암종 루이스 Y 양성 세포주를 세포독성에 대해 분석하였다. 화합물 1 내지 5의 세포독성을 평가하기 위하여, 세포를 배양 매질 150 ㎕ 중 웰 당 약 5 내지 10,000개 시딩(seeding)한 후, 분석 개시시에 등급화된 투여량의 화합물 1 내지 5로 4회 처리하였다. 세포독성 분석은 일반적으로 시험 화합물의 첨가후 96시간 동안 수행하였다. 인큐베이션의 마지막 4 내지 6시간 동안 레사주린 염료 50 ㎕를 각각의 웰에 첨가하여 배양 말엽에 생존 세포를 평가하였다. 염료 환원을 각각 535 nm 및 590 nm의 들뜸 및 방출 파장을 사용하여 형광 분광법에 의해 측정하였다. 분석을 위하여 처리된 세포에 의한 레사주린 환원 정도를 비처리된 대조군 세포에 의한 레사주린 환원 정도와 비교하였다.
1시간 노출 분석을 위하여 세포를 1시간 동안 약물로 펄스한 후, 세척하고, 96시간 동안 인큐베이션한 후 세포독성 효과를 측정하였다.
실시예 17 - 선택된 화합물에 대한 시험관내 세포독성 데이타
표 10은 CD30+ 세포주 Karpas 299에 대해 일반적인 방법 I에 기재된 바와 같이 분석된 화합물 7 내지 10의 cAC10 접합체의 세포독성 효과를 나타낸다. 2개의 별개의 실험의 데이타를 나타낸다. 화합물 7 및 9의 cAC10 접합체가 cAC10-val-cit-MMAE보다 약간 더 활성인 것으로 밝혀졌다.
<표 10>
Figure 112013088873035-pat00198
다른 실험에서는, BR96-val-cit-MMAF가 유리 MMAF보다 250배 이상 더 유효하였다.
일반적인 방법 I - 세포독성 측정. 대표적인 접합체 7 내지 10의 세포독성을 평가하기 위하여, 세포를 배양 매질 150 ㎕ 중 웰 당 약 5 내지 10,000개로 시딩한 후, 분석 개시시에 단계적인 투여량의 대표적인 접합체 7 내지 10으로 4회 처리하였다. 세포독성 분석은 시험 화합물을 첨가한 후 96시간 동안 수행하였다. 인큐베이션의 마지막 4 내지 6시간 동안 레사주린 염료 50 ㎕를 각각의 웰에 첨가하여 배양 말엽에 생존 세포를 평가하였다. 염료 환원을 각각 535 nm 및 590 nm의 들뜸 및 방출 파장을 사용하여 형광 분광법에 의해 측정하였다. 분석을 위하여 처리된 세포에 의한 레사주린 환원 정도를 비처리된 대조군 세포에 의한 레사주린 환원 정도와 비교하였다.
실시예 18 - 시험관내 세포 증식 분석
ADC의 효능을 다음의 프로토콜을 사용하여 세포 증식 분석에 의해 측정하였다 (문헌 [Promega Corp. Technical Bulletin TB288; Mendoza et al. (2002) Cancer Res. 62:5485-5488]).
1. 매질 중 약 104개의 세포 (SKBR-3, BT474, MCF7 또는 MDA-MB-468)를 함유하는 100 ㎕의 분취량의 세포 배양물을 96-웰 불투명한 벽의 플레이트의 각각의 웰에 침착시켰다.
2. 매질을 함유하고 세포를 포함하지 않는 대조군 웰을 제조하였다.
3. ADC를 실험 웰에 첨가하고 3 내지 5일 동안 인큐베이션하였다.
4. 플레이트를 약 30분 동안 실온으로 평형시켰다.
5. 각각의 웰에 존재하는 세포 배양 매질의 부피와 동일한 부피의 셀티터-글로(CellTiter-Glo) 시약을 첨가하였다.
6. 내용물을 2분 동안 오비탈 진탕기 상에서 혼합하여 세포 용균을 유도하였다.
7. 플레이트를 실온에서 10분 동안 인큐베이션하여 발광 신호를 안정화시켰다.
8. 발광을 기록하고, RLU = 상대 발광 단위로서 그래프에 기록하였다.
실시예 19 - 래트에서 혈장 클리어런스
항체 약물 접합체 및 전체 항체의 혈장 클리어런스 약동학을 스프라그-덜리(Sprague-Dawley) 래트 (찰스 리버 래버러터리즈(Charles River Laboratories), 각각 250 내지 275 gms)에서 연구하였다. 동물에게 볼루스(bolus) 꼬리 정맥 주사 (IV 푸쉬(Push))에 의해 투여하였다. 약 300 ㎕의 전체 혈액을 경정맥 캐뉼러를 통해 또는 꼬리 스틱에 의해 리튬/헤파린 항응고제 용기로 투여한지 각각 0 (예비투여), 10 및 30분; 1, 2, 4, 8, 24 및 36시간; 및 2, 3, 4, 7, 14, 21, 28일 후의 시점에 수거하였다. 전체 항체를 ELISA-ECD/GxhuFc-HRP에 의해 측정하였다. 항체 약물 접합체를 ELISA-MMAE/MMAF/ECD-Bio/SA-HRP에 의해 측정하였다.
실시예 20 - 원숭이에서 혈장 클리어런스
항체 약물 접합체 및 전체 항체의 혈장 클리어런스 약동학을 시노몰구스 원숭이(cynomolgus monkey)에서 연구하였다. 도 12는 H-MC-vc-MMAE를 시노몰구스 원숭이에게 상이한 투여량, 즉 0.5, 1.5, 2.5 및 3.0 mg/kg으로 1일 및 21일째에 투여한 후의 2 단계 혈장 농도 클리어런스 연구를 나타낸다. 전체 항체 및 ADC의 농도를 시간에 따라 측정하였다. (H = 트라츠주마브).
실시예 21 - 트랜스제닉 체외이식 마우스에서 종양 크기 생체내 효능
트랜스제닉 실험에 적합한 동물을 표준 상업적 공급원, 예컨대 타코닉(Taconic) (뉴욕 절먼타운 소재)으로부터 입수하였다. 다수의 종들이 적합하지만, FVB 암컷 마우스가 바람직한데, 이는 이들의 종양 형성에 대한 높은 감수성 때문이다. FVB 암컷을 교배에 사용하고, 정관을 절제한 CD.1 수컷을 사용하여 가임신을 유도하였다. 정관을 절제한 마우스는 임의의 상업적 공급원으로부터 입수하였다. 시조자(founder)는 FVB 마우스 또는 129/BL6 x FVB p53 이종접합 마우스와 함께 사육되었다. p53 대립유전자에서 이종접합성을 갖는 마우스를 사용하여 종양 형성을 잠재적으로 증가시켰다. 일부 F1 종양은 혼합된 종의 것이었다. 시조 종양은 오직 FVB이었다.
종양 (Fo5 mmtv 트랜스제닉 마우스로부터 전파된 동종이식)을 가진 동물을 ADC의 IV 주사에 의해 단일 또는 다중 투여로 처리하였다. 종양 크기를 주사후 다양한 시점에서 평가하였다.
실시예 22 - t-부틸 에스테르를 통한 MC - MMAF 의 합성
합성 1:
Figure 112013088873035-pat00199
MeVal-Val-Dil-Dap-Phe-OtBu (화합물 1, 128.6 mg, 0.163 mmol)를 CH2Cl2 (0.500 mL)에 현탁시켰다. 6-말레이미도카프로산 (68.9 mg, 0.326 mmol) 및 1,3-디이소프로필카르보디이미드 (0.0505 mL, 0.326 mmol)를 첨가한 후, 피리딘 (0.500 mL)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 1.0시간 동안 교반하였다. HPLC 분석은 출발 화합물 1의 완전한 소모를 나타내었다. 휘발성 유기물을 감압하에 증발시켰다. 생성물을 CH2Cl2 중 0 내지 5％ 메탄올의 단계 구배를 사용하여 플래시 컬럼 크로마토그래피를 통해 단리시켰다. 순수한 MC-MeVal-Val- Dil-Dap-Phe-OtBu (12) (수율 60％)가 총 96 mg 회수되었다. ES-MS m/z 981.26 [M+H]+; 1003.47 [M+Na]+; 979.65 [M-H]-.
MC-MeVal-Val-Dil-Dap-Phe-OtBu (화합물 12, 74 mg, 0.0754 mmol)를 실온에서 CH2Cl2 (2.0 mL) 및 TFA (1 mL)에 현탁시켰다. 2.5시간 후에, HPLC 분석은 출발 물질의 완전한 소비를 나타내었다. 휘발성 유기물을 감압하에 증발시키고, 생성물을 페노메넥스(Phenomenex) C12 시네르기(Synergi) Max-RP 80 Å 컬럼 (250 x 21.20 mm)을 사용하여 정제 RP-HPLC를 통해 단리시켰다. 용리: 30분에 걸쳐 선형 구배 10％ 내지 90％ MeCN/0.05％ TFA(aq), 그 후 추가의 20분 동안 등용매 90％ MeCN/0.05％ TFA(aq). ES-MS m/z 925.33 [M+H]+; 947.30 [M+Na]+; 923.45 [M-H]-.
실시예 23a - 디메톡시벤질 에스테르를 통한 MC - MMAF (11)의 합성
합성 2:
Figure 112013088873035-pat00200
Fmoc-L-페닐알라닌-2,4-디메톡시벤질 에스테르 (Fmoc-Phe-ODMB)의 제조
3-목 5-L 둥근 바닥 플라스크를 Fmoc-L-페닐알라닌 (200 g, 516 mmol, 바쳄 (Bachem) 제품), 2,4-디메톡시벤질 알코올 (95.4 g, 567 mmol, 알드리치(Aldrich) 제품) 및 CH2Cl2 (2.0 L)로 충전하였다. N,N-디메틸포름아미드 t-부틸 아세탈 (155 mL, 586 mmol, 플루카(Fluka) 제품)을 20분에 걸쳐 N2하에 생성된 현탁액에 첨가하자, 맑은 용액이 생성되었다. 그 후, 반응을 실온에서 밤새 교반한 후, TLC 분석 (0.42, 헵탄/EtOAc = 2:1)은 반응이 완결되었음을 나타내었다. 반응 혼합물을 감압하에 농축하여 밝은 황색 오일을 얻었으며, 이를 CH2Cl2 (200 mL)에 재용해시키고, 짧은 플러그의 실리카 겔 (25 cm x 25 cm, CH2Cl2)을 통해 정제하여 무색 발포체 (250 g)를 얻었다. MeCN (1 L)을 생성된 발포체에 첨가하고, 배치를 완전히 용해시켰다. 그 후, 이것을 농축하여 건조상태로 만들고, MeCN (1 L)에 재용해시키고, 생성된 현탁액을 1시간 동안 교반하고, 여과하고, 필터 케이크를 MeCN (2 x 200 mL)으로 세정하여 백색 고체로서 Fmoc-L-페닐알라닌-2,4-디메톡시벤질 에스테르 (113.58 g, 41％, HPLC 분석에 의한 AUC 95.5％)를 얻었다. 데이타: HPLC.
L-페닐알라닌-2,4-디메톡시벤질 에스테르 (Phe-ODMB)의 제조
500-mL 둥근 바닥 플라스크를 Fmoc-L-페닐알라닌-2,4-디메톡시벤질 에스테르 (26.00 g, 48.3 mmol), CH2Cl2 (150 mL) 및 디에틸아민 (75 mL, 아크로스(Acros) 제품)으로 충전시켰다. 혼합물을 실온에서 교반하고, HPLC에 의해 완결을 모니터링하였다. 4시간 후에, 혼합물을 농축하였다 (조 온도 30℃ 미만). 잔류물을 CH2Cl2 (200 mL)에 재현탁시키고, 농축하였다. 이것을 1회 반복하였다. 잔류물에 MeOH (20 mL)를 첨가하자 겔이 형성되었다. 이 잔류물을 CH2Cl2 (200 mL)로 희석하고, 농축하고, 흐린 오일을 진공하에 밤새 정치시켰다. 잔류물을 CH2Cl2 (100 mL)에 현탁시킨 후, 톨루엔 (120 mL)을 첨가하였다. 혼합물을 농축하고, 잔류물을 진공하에 밤새 정치시켰다.
데이타: HPLC, 1H NMR.
Fmoc-돌아프로인 (Fmoc-Dap)의 제조
Boc-돌아프로인 (58.8 g, 0.205 mol)을 1,4-디옥산 (256 mL, 1.02 mol, 알드리치 제품) 중 4 N HCl에 현탁시켰다. 1.5시간 동안 교반한 후, TLC 분석은 반응이 완결되었음을 나타내었고 (10％ MeOH/CH2Cl2), 혼합물을 거의 건조상태로 농축시켰다. 추가의 1,4-디옥산 (50 mL)을 충전시키고, 혼합물을 농축하여 건조상태로 만들고, 진공하에 밤새 건조시켰다. 생성된 백색 고체를 H20 (400 mL)에 용해시키고, 기계적 교반기 및 온도 프로브가 장착된 3-L 3-목 둥근 바닥 플라스크로 옮겼다. N,N-디이소프로필에틸아민 (214.3 mL, 1.23 mol, 아크로스 제품)을 1분 동안 첨가하자, 20.5℃에서 28.2℃로 발열되었다 (내부). 혼합물을 빙조에서 냉각시키고, 1,4-디옥산 (400 mL)을 첨가하였다. 1,4-디옥산 (400 mL) 중 Fmoc-OSu (89.90 g, 0.267 mol, 어드밴스드 켐테크(Advanced ChemTech) 제품)의 용액을 반응 온도를 9℃ 미만으로 유지시키면서 첨가 깔때기로부터 15분에 걸쳐 첨가하였다. 혼합물을 실온으로 가온시키고, 19시간 동안 교반한 후, 혼합물을 회전 증발기에 의해 수성 슬러리 (390 g)로 농축하였다. 현탁액을 H20 (750 mL) 및 Et20 (750 mL)로 희석시키자 다량의 백색 침전물이 형성되었다. 고체를 유기층으로 유지시키면서 층을 분리하였다. 수성층을 진한 HCl (30 mL)을 사용하여 산성화하고, EtOAc (3 x 500 mL)로 추출하였다. 합한 추출물을 MgS04로 건조시키고, 여과하고, 농축하여 황색 오일 A 59.25 g을 얻었다. Et20 추출물을 고체를 유기층으로 유지시키면서 포화 NaHC03 (200 mL)로 한번 추출하였다. 수성 현탁액을 진한 HCl (50 mL)을 사용하여 산성화하고, 고체를 유기층으로 유지시키면서 Et20 (50 mL)로 추출하였다. 유기층을 여과하고, 농축하여 황색 오일 B 32.33 g을 얻었다. 두 오일 (A 및 B)을 합하고, CH2Cl2 (3.5 L)로 용리한 후, 3％ MeOH/CH2Cl2 (9 L)로 용리하는 실리카 겔 상 플래시 크로마토그래피에 의해 정제하여 백색 발포체로서 Fmoc-돌아프로인 68.23 g (81％, HPLC (AUC)에 의한 순도 97.5％)을 얻었다.
Fmoc-Dap-Phe-ODMB의 제조
조 Phe-ODMB (48.3 mmol)를 무수 DMF (105 mL, 아크로스 제품)에 5분 동안 현탁시키고, Fmoc-Dap (19.80 g, 48.3 mmol)를 첨가하였다. 혼합물을 빙조에서 냉각시키고, TBTU (17.08 g, 53.20 mmol, 매트릭스 이노베이션즈(Matrix Innovations) 제품)를 첨가하였다. N,N-디이소프로필에틸아민 (25.3 mL, 145.0 mmol, 아크로스 제품)을 주사기를 통해 3분에 걸쳐 첨가하였다. 1시간 후, 빙조를 제거하고, 혼합물을 30분 동안 가온시켰다. 혼합물을 물 (1 L)에 붓고, 에틸 아세테이트 (300 mL)로 추출하였다. 분리한 후, 수성층을 에틸 아세테이트 (2 x 150 mL)로 재추출하였다. 합한 유기층을 염수 (150 mL)로 세척하고, 건조시키고 (MgS04), 여과하여 (필터 종이) 불용물 (무기물 및 약간의 디벤조풀벤)을 제거하였다. 농축한 후에, 잔류물 (41 g)을 실리카 (41 g) 상에 흡수시키고, 크로마토그래피 (22 cm x 8 cm 컬럼; 65％ 헵탄/EtOAc (2.5 L); 33％ 헵탄/EtOAc (3.8 L))에 의해 정제하여 백색 발포체로서 생성물 29.4 g (86％, HPLC에 의한 순도 92％)을 얻었다.
데이타: HPLC, 1H NMR, TLC (1:1 EtOAc/헵탄 Rf = 0.33, 바닐린 염색에서 적색).
Dap-Phe-ODMB의 제조
1-L 둥근 바닥 플라스크를 Fmoc-Dap-Phe-ODMB (27.66 g), CH2Cl2 (122 mL) 및 디에틸아민 (61 mL, 아크로스 제품)으로 충전시켰다. 용액을 실온에서 교반하고, HPLC에 의해 완결을 모니터링하였다. 7시간 후, 혼합물을 농축하였다 (조 온도 30℃ 미만). 잔류물을 CH2Cl2 (300 mL)에 현탁시키고, 농축하였다. 이것을 2회 반복하였다. 잔류물에 MeOH (20 mL) 및 CH2Cl2 (300 mL)를 첨가하고, 용액을 농축하였다. 잔류물을 CH2Cl2 (100 mL) 및 톨루엔 (400 mL)에 현탁시키고, 농축하고, 잔류물을 진공하에 밤새 정치시켜 크림형 잔류물을 얻었다.
데이타: HPLC, 1H NMR, MS.
Fmoc-MeVal-Val-Dil-Dap-Phe-ODMB의 제조
조 Dap-Phe-ODMB (39.1 mmol)를 무수 DMF (135 mL, 아크로스 제품)에 5분 동안 현탁시키고, Fmoc-MeVal-Val-Dil-OH (24.94 g, 39.1 mmol, 제법에 대해서는 실시예 2 참조)를 첨가하였다. 혼합물을 빙조에서 냉각시키고, TBTU (13.81g, 43.0 mmol, 매트릭스 이노베이션즈 제품)를 첨가하였다. N,N-디이소프로필에틸아민 (20.5 mL, 117.3 mmol, 아크로스 제품)을 주사기를 통해 2분에 걸쳐 첨가하였다. 1시간 후에, 빙조를 제거하고, 혼합물을 30분에 걸쳐 가온시켰다. 혼합물을 물 (1.5 L)에 붓고, 에틸 아세테이트 (480 mL)로 희석하였다. 15분 동안 정치시킨 후, 층을 분리하고, 수성층을 에틸 아세테이트 (300 mL)로 추출하였다. 합한 유기층을 염수 (200 mL)로 세척하고, 건조시키고 (MgS04), 여과하여 (필터 종이) 불용물 (무기물 및 약간의 디벤조풀벤)을 제거하였다. 농축한 후, 잔류물 (49 g)을 플라스크로부터 긁어내고, 실리카 (49 g) 상에 흡수시키고, 크로마토그래피 (15 cm x 10 cm dia 컬럼; 2:1 EtOAc/헵탄 (3 L), EtOAc (5 L); 250 mL 단편)에 의해 정제하여백색 발포체로서 Fmoc-MeVal-Val-Dil-Dap-Phe-ODMB 31.84 g (73％, HPLC에 의한 순도 (AUC) 93％)을 얻었다.
데이타: HPLC, TLC (2:1 EtOAc/헵탄, Rf = 0.21, 발린 염색에서 적색).
MeVal-Val-Dil-Dap-Phe-ODMB의 제조
1-L, 둥근-바닥 플라스크를 Fmoc-MeVal-Val-Dil-Dap-Phe-ODMB (28.50 g), CH2Cl2 (80 mL) 및 디에틸아민 (40 mL)으로 충전시켰다. 혼합물을 실온에서 밤새 교반시킨 다음, 감압 하에 농축시켰다. 잔류물을 실리카 (30 g) 상에 흡착시키고, 플래쉬 크로마토그래피 (15 cm x 8 cm 직경 컬럼; 2％ MeOH/DCM (2 L), 3％ MeOH/DCM (1 L), 6％ MeOH/DCM (4 L); 250 mL 분획)로 정제하여 백색 발포체로서 MeVal-Val-Dil-Dap-Phe-ODMB 15.88 g을 수득하였다 (69％, HPLC (AUC))에 의해 96％ 순도).
데이타: HPLC, TLC (6％ MeOH/DCM, Rf = 0.24, 바닐린 염료 중 적색).
MC-MeVal-Val-Dil-Dap-Phe-ODMB의 제조
50-mL, 둥근-바닥 플라스크를 실온에서 MeVal-Val-Dil-Dap-Phe-ODMB (750 mg, 0.85 mmol), 무수 DMF (4 mL), 말레이미도카프로산 (180 mg, 0.85 mmol) 및 TBTU (300 mg, 0.93 mmol, 매트릭스 이노베이션즈(Matrix Innovations))로 충전시켰다. N,N-디이소프로필에틸아민 (450 ㎕, 2.57 mmol)을 주사기를 통해 첨가하였다. 1.5시간 후에, 혼합물을 물 (50 mL) 중에 붓고, 에틸 아세테이트 (30 mL)로 희석하였다. NaCl을 첨가하여 분리를 촉진하였다. 층을 분리한 후, 수성층을 에틸 아세테이트 (25 mL)로 추출하였다. 합한 유기층을 건조하고 (MgSO4), 여과하고, 농축시켰다. 생성된 오일 (1 g)을 플래쉬 크로마토그래피 [100 mL 실리카; 25％ 헵탄/EtOAc (100 mL), 10％ 헵탄/EtOAc (200 mL), EtOAc (1.5 L)]로 정제하여 백색 발포체로서 MC-MeVal-Val-Dil-Dap-Phe-ODMB (13)을 수득하였다 (521 mg, 57％, HPLC (AUC)에 의한 순도 94％).
데이타: 1H NMR, HPLC.
MC-MeVal-Val-Dil-Dap-Phe-OH (MC-MMAF) (11)의 제조
50-mL,-둥근 바닥 플라스크를 MC-MeVal-Val-Dil-Dap-Phe-ODMB (화합물 13, 428 mg, 0.39 mmol)으로 충전시키고, 2.5％ TFA/CH2Cl2 (20 mL) 중에 용해시켰다. 용액이 2분에 걸쳐 분홍-보라색으로 변하였다. 완료를 HPLC 및 TLC (6％ MeOH/DCM, KMnO4 염료)로 모니터링하였다. 40분 후, 물 3 방울을 첨가하고, 탁한 분홍-보라색 혼합물을 농축시켜 분홍색 잔류물 521 mg을 수득하였다. 크로마토그래피 (15％ IPA/DCM)로 정제하여 백색 고체로서 MC-MMAF (73％, HPLC에 의한 순도 92％) 270 mg을 수득하였다.
실시예 23b - mc - MMAF 의 유사체의 합성
Figure 112013088873035-pat00201
MeVal-Val-Dil-Dap-Phe-OtBu (화합물 1, 35 mg, 0.044 mmol)를 DMF (0.250 mL) 중에 현탁시켰다. 4-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-피롤-1-일)-벤조산 (11 mg, 0.049 mmol) 및 HATU (17 mg, 0.044 mmol)를 첨가한 후, DIEA (0.031 mL, 0.17 mmol)를 첨가하였다. 이 반응 혼합물을 2.0시간 동안 교반시켰다. HPLC 분석은 출발 화합물 1의 완전 소모를 나타내었다.
생성물을 페노메넥스 C12 시너지 맥스-RP 80Å 컬럼 (250 x 21.20 mm)을 사용하는 정제용 RP-HPLC를 통해 단리하였다. 용출: 8분에 걸쳐 10％에서 80％로의 MeCN/0.05％ TFA (수성) 선형 구배 이 후, 추가 12분 동안 동용매 80％ MeCN/0.05％ TFA (수성). 순수한 생성물 (14)를 총 20 mg 단리하였다 (0.02 mmol, 수율 46％). ES-MS m/z 987.85 [M+H]+; 1019.41 [M+Na]+; 985.54 [M-H]-.
MB-MeVal-Val-Dil-Dap-Phe-OtBu (화합물 14, 38 mg, 0.0385 mmol)를 CH2Cl2 (1 mL) 및 TFA (1 mL) 중에 현탁시켰다. 혼합물을 2.0시간 동안 교반시킨 다음, 휘발성 유기물을 감압 하에 증발시켰다. 생성물을 페노메넥스 C12 시너지 맥스-RP 80Å 컬럼 (250 x 21.20 mm)을 사용하는 정제용 RP-HPLC로 정제하였다. 용출: 8분에 걸쳐 10％에서 80％로의 MeCN/0.05％ TFA (수성) 선형 구배 이 후, 추가 12분 동안 동용매 80％ MeCN/0.05％ TFA (수성). MB-MMAF 생성물을 총 14.4 mg 단리하였다 (0.015 mmol, 수율 40％). ES-MS m/z 930.96 [M+H]+; 952.98 [M+Na]+; 929.37 [M-H]-.
실시예 23c - MC - MeVal - Cit - PAB - MMAF (16)의 제조
Figure 112013088873035-pat00202
CH2Cl2 (80 mL) 중의 Fmoc-MeVal-OH (3.03 g, 8.57 mmol) 및 N,N'-디숙시미딜 카르보네이트 (3.29 g, 12.86 mmol)의 실온 현탁액에 DIEA (4.48 mL, 25.71 mmol)를 첨가하였다. 이 반응 혼합물을 3.0시간 동안 교반시킨 다음, 분별 깔때기 중으로 붓고, 이 중 유기 혼합물을 0.1 M HCl (수성)로 추출하였다. 조질의 유기 잔류물을 감압 하에 농축시키고, 생성물을 20％에서 100％로의 에틸 아세테이트/헥산 선형 구배를 사용하는 실리카겔 상의 플래쉬 컬럼 크로마토그래피로 단리하였다. 순수한 Fmoc-MeVal-OSu (4.80 mmol, 수율 56％)를 총 2.18 g 회수하였다.
DME (13 mL) 및 THF (6.5 mL) 중의 Fmoc-MeVal-OSu (2.18 g, 4.84 mmol)의 실온 현탁액에 H2O (13 mL) 중의 L-시트룰린 (0.85 g, 4.84 mmol) 및 NaHCO3 (0.41 g, 4.84 mmol)의 용액을 첨가하였다. 현탁액을 실온에서 16시간 동안 교반시킨 다음, tert-BuOH/CHCl3/H2O 중으로 추출하고, 1 M HCl을 사용하여 pH 2 내지 3으로 산성화하였다. 유기상을 분리하고, 건조하고, 감압하에 농축시켰다. 잔류물을 디에틸 에테르로 연화처리하여 Fmoc-MeVal-Cit-COOH 2.01 g을 수득하고, 이를 추가 정제 없이 사용하였다.
조질의 Fmoc-MeVal-Cit-COOH를 2:1 CH2Cl2/MeOH (100 mL) 중에 현탁시키고, 이에 p-아미노벤질 알콜 (0.97 g, 7.9 mmol) 및 EEDQ (1.95 g, 7.9 mmol)를 첨가하였다. 이 현탁액을 125시간 동안 교반시킨 다음, 휘발성 유기물을 감압하에 제거하고, 잔류물을 10％ MeOH/CH2Cl2를 사용하는 실리카겔 상의 플래쉬 컬럼 크로마토그래피로 정제하였다. 순수한 Fmoc-MeVal-Cit-PAB-OH (0.55 g, 0.896 mmol, 수율 18.5％)를 회수하였다. ES-MS m/z 616.48 [M+H]+.
CH2Cl2 중의 Fmoc-MeVal-Cit-PAB-OH (0.55 g, 0.896 mmol)의 현탁액에 STRATOSPHEREStm (피페리진-수지-결합됨) ( > 5 mmol/g, 150 mg)를 첨가하였다. 실온에서 16시간 동안 교반시킨 후, 혼합물을 셀라이트 (MeOH로 미리 세척시킴)를 통해 여과하고, 감압하에 농축시켰다. 잔류물을 디에틸 에테르 및 헥산으로 연화처리하였다. 생성된 고체 물질, MeVal-Cit-PAB-OH을 CH2Cl2 (20 mL) 중에 현탁시키고, 이에 MC-OSu (0.28 g, 0.896 mmol), DIEA (0.17 mL, 0.99 mmol) 및 DMF (15 mL)를 첨가하였다. 이 현택액을 16시간 동안 교반하였지만, 반응 혼합물의 HPLC 분석은 반응이 완료되지 않았음을 나타내었고, 따라서 현탁액을 감압하에 부피가 6 mL가 되도록 농축시킨 다음, 10％ NaHCO3 (수성) 용액을 첨가하고, 현탁액을 추가 16시간 동안 교반시켰다. 용매를 감압 하에 제거하고, 잔류물을 0％에서 10％로의 MeOH/CH2Cl2 구배를 사용하는 실리카겔 상의 플래쉬 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 MC-MeVal-Cit-PAB-OH 42 mg (0.072 mmol, 수율 8％)을 수득하였다.
CH2Cl2 (10 mL) 중의 MC-MeVal-Cit-PAB-OH (2.37 g, 4.04 mmol) 및 비스(니트로페닐)카르보네이트 (2.59 g, 8.52 mmol)의 현탁액에 DIEA (1.06 mL, 6.06 mmol)를 첨가하였다. 이 현탁액을 5.5시간 동안 교반하고, 감압하에 농축시키고, 디에틸 에테르로 연화처리하여 정제하였다. MC-MeVal-Cit-PAB-OCO-pNP (147 mg, 0.196 mmol)를 1:5 피리딘/DMF 용액 (3 mL) 중에 현탁시키고, 이에 HOBt (5 mg, 0.039 mmol), DIEA (0.17 mL, 0.978 mmol) 및 MMAF (화합물 2, 150 mg, 0.205 mmol)를 첨가하였다. 이 반응 혼합물을 실온에서 16시간 동안 교반시킨 다음, 페노메넥스 C12 시너지 맥스-RP 80Å 컬럼 (250 x 21.20 mm)을 사용하는 정제용 RP-HPLC로 정제하였다. 용출: 30분에 걸쳐 10％에서 90％로의 MeCN/0.05％ TFA (수성) 선형 구배 이 후, 추가 20분 동안 동용매 90％ MeCN/0.05％ TFA (수성). MC-MeVal-Cit-PAB-MMAF (16)을 노랑색 고체로서 수득하였다 (24.5 mg, 0.0182, 수율 0.45％). ES-MS m/z 1344.95 [M+H]+; 1366.94 [M+Na]+.
실시예 23d - 수베릴 - Val - Cit - PAB - MMAF 의 숙신이미드 에스테르 (17)의 제조
Figure 112013088873035-pat00203
화합물 1 (300 mg, 0.38 mmol), Fmoc-Val-Cit-PAB-pNP (436 mg, 0.57 mmol, 1.5 당량)를 무수 피리딘 5 mL 중에 현탁시켰다. HOBt (10 mg, 0.076 mmol, 0.2 당량)을 첨가한 후, DIEA (199 ㎕, 1.14 mmol, 3 당량)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 10분 동안 초음파처리한 다음, 밤새 실온에서 교반시켰다. 피리딘을 감압 하에 제거하고, 잔류물을 CH2Cl2 중에 재현탁하였다. 혼합물을 CH2Cl2 중의 0％에서 10％로의 MeOH의 단계 구배로 실라카겔 플래쉬 크로마토그래피에 의해 분리하였다. 생성물을 함유하는 분획물을 모으고, 농축시키고, 진공 하에 밤새 건조하여 Fmoc-Val-Cit-PAB-MMAF-OtBu 317 mg (수율 59％)을 수득하였다. ES-MS m/z 1415.8 [M+H]+.
Fmoc-Val-Cit-PAB-MMAF-OtBu (100 mg)를 20％ TFA/CH2Cl2 (10 mL) 중에서 2시간 동안 교반시켰다. 혼합물을 CH2Cl2 (50 mL)로 희석하였다. 유기층을 물 (2 x 30 mL) 및 염수 (1 x 30 mL)로 연속적으로 세척하였다. 유기상을 농축시키고, 10％ MeOH/CH2Cl2 중의 실리카겔의 패드 상으로 로딩하였다. 생성물을 30％ MeOH/CH2Cl2로 용출하였다. 진공 하에 밤새 건조시킨 후, Fmoc-Val-Cit-PAB-MMAF를 백색 고체로서 수율 40％로 30 mg 수득하였다. ES-MS m/z 1357.7 [M-H]-.
Fmoc-Val-Cit-PAB-MMAF 67 mg을 CH2Cl2 (2 mL), 디에틸아민 (2 mL) 및 DMF (2 mL) 중에 현탁시켰다. 혼합물을 2시간 동안 실온에서 교반시켰다. 용매를 감압 하에 제거하였다. 잔류물을 피리딘 (2 mL)와 공-증발시킨 다음, 톨루엔 (2 x 5 mL)과 공-증발시키고, 진공 하에 건조하였다. Val-Cit-PAB-MMAF를 갈색 오일로서 수득하고, 추가 정제 없이 사용하였다.
Fmoc-Val-Cit-PAB-MMAF 67 mg으로부터 제조된 모든 Val-Cit-PAB-MMAF를 피리딘 (2 mL) 중에 현탁시키고, 피리딘 (1 mL) 중의 디숙신이미딜 수베레이트 (74 mg, 0.2 mmol, 4 당량)의 용액에 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 교반시켰다. 3시간 후에, 에테르 (20 mL)를 첨가하였다. 침전물을 수집하고, 추가량의 에테르로 세척하였다. 적색 고체를 30％ MeOH/CH2Cl2 중에 현탁시키고, 용출액으로서 30％ MeOH/CH2Cl2를 사용하는 실리카겔의 패드를 통해 여과하였다. 화합물 17을 백색 고체로서 20 mg (수율 29％) 수득하였다. ES-MS m/z 1388.5 [M-H]-.
실시예 24 - mcMMAF 항체-약물 접합체의 생체내 효능
Karpas -299 ALCL 이종이식물에서의 cAC10 - mcMMAF 의 효능: 항체 (cAC10-mcF4) 당 평균 4개의 약물 잔기를 갖는 cAC10-mcMMAF의 생체내 효능을 평가하기 위해, Karpas-299 인간 ALCL 세포를 면역결핍 C.B-17 SCID 마우스에 피하로 이식하였다 (마우스 당 5 x 106개 세포). 종양 부피는 화학식 (0.5 x L x W2, 식 중 L 및 W는 2회의 양방향 측정 중 긴 것 및 짧은 것임)을 사용하여 계산하였다. 연구 동물에서의 평균 종양 부피가 대략 100 mm3 (48 내지 162의 범위)에 이르렀을 때, 마우스를 3개의 그룹 (그룹 당 5마리의 마우스)으로 나누고, 비처리로 두거나, 1 또는 2 mg/kg의 cAC10-mcF4를 꼬리 정맥을 통해 단일 정맥내 주사로 투여하였다 (도 1). 비처리 마우스에서의 종양은 치료 개시 7일 내에 평균 부피가 1,000 mm3 초과가 되도록 빠르게 성장하였다. 반면에, cAC10-mcF4로 처리된 종양은 모두 1 mg/kg 그룹에서는 5마리 중 3마리에서 신속한 퇴행을 나타냈으며, 2 mg/kg 그룹에서는 5마리 중 5마리에서 신속한 퇴행을 나타내어 완벽한 종양 반응을 수득하였다. 2 mg/kg 그룹에서의 완벽한 반응자 중 한 마리에서의 종양이 대략 4주 후에 재발되었지만, 이 그룹에서의 5마리의 반응자 중 나머지 4마리에서는 임의의 검출가능한 종양도 검출되지 않았으며, 1 mg/kg 그룹에서는 치료 10주 후에 3마리의 완벽한 반응자에서 임의의 검출가능한 종양도 관찰되지 않았다.
L2987 NSCLC 이종이식물에서의 cBR96 - mcMMAF 의 효능: cBR96은 LeY 항원을 인지하는 키메라 항제이다. 항체 (cBR96-mcF4) 당 4개의 약물을 갖는 cBR96-mcMMAF의 생체내 효능을 평가하기 위해, L2987 비-소세포 폐암 (NSCLC) 종양 단편을 무흉선 누드 마우스 중으로 이식하였다. 종양의 평균이 대략 100 mm3이 되었을 때, 마우스를 비처리 그룹 및 2개의 치료 그룹의 3개의 그룹으로 나누었다. 치료를 위해, 도 3a에 나타낸 바와 같이 마우스에 cBR96-mcF4를 주입 당 3 또는 10 mg/kg으로 매 4일 마다 총 4회 주입으로 투여하였다 (q4d x 4). 도 3b에 나타낸 바와 같이, 마우스에 cBR96-mcF4 또는 결합하지 않은 대조군 접합체, cAC10-mcF4를 주입 당 10 mg/kg으로 매 4일 마다 총 4회 주입으로 투여하였다 (q4d x 4). 도 3a 및 3b에 나타낸 바와 같이, BR96-mcF4는 대조군에 비해 현저한 종양 성장 지연을 발생시켰다.
도 2는 피하 L540CY에서의 cAC10-mcMMAF의 생체내 단일 투여 효능 분석을 나타낸다. 이 연구를 위해, 비처리 그룹에서 4마리의 마우스 및 각각의 처리 그룹에서 10마리가 있었다.
실시예 25 - MC - MMAF 항체-약물 접합체의 실험관내 효능
CD30 + 세포주에 대한 cAC10 -항체-약물 접합체의 활성
도 4a 및 16b는 Karpas 299 (미분화 대세포 림프종) 및 L428 (호지킨 림프종)의 배양물을 계열 희석시킨 cAC10-mcMMAF (도 4a) 또는 cAC10-vcMMAF (도 4b)와 함께 96시간 동안 인큐베이션시킨 경우의 대표적인 실험으로부터의 투여량-반응 곡선을 나타낸다. 배양물을 50 μM 레사주린 [7-히드록시-3H-페녹사진-3-온 10-옥시드]으로 함께 4시간 동안 표지화하고, 형광을 측정하였다. 데이타를 4개-파라미터 투여량-반응 곡선 맞춤 절차를 사용하는 그래프패드 프리즘(GraphPad Prism) 버젼 4.00으로 환산시켰다. IC50 값을 성장이 비처리 대조군 배양물과 비교하여 50％ 감소된 경우의 농도로 정의하였다. 각각의 농도를 4중으로 시험하였다.
Le y + 세포주에 대한 cBR96 -항체-약물 접합체의 활성
도 5a 및 5b는 H3396 (유방 암종) 및 L2987 (비-소세포 폐 암종)의 배양물을 계열 희석시킨 cBR96-mcMMAF (도 5a) 또는 -vcMMAF (도 5b)와 함께 96시간 동안 인큐베이션시킨 경우의 대표적인 실험으로부터의 투여량-반응 곡선을 나타낸다. 배양물을 50 μM 레사주린으로 4시간 동안 표지화하고, 형광을 측정하였다. 데이타를 4개-파라미터 투여량-반응 곡선 맞춤 절차를 사용하는 그래프패드 프리즘 버젼 4.00으로 환산시켰다. IC50 값을 성장이 비처리 대조군 배양물과 비교하여 50％ 감소된 경우의 농도로 정의하였다. 각각의 농도를 4중으로 시험하였다.
CD70 + 신장 세포 암종 세포주에 대한 c1F6 -항체-약물 접합체의 활성
도 6a 및 6b는 Caki-1 및 786-O 세포의 배양물을 계열 희석시킨 c1F6-mcMMAF (도 6a) 또는 -vcMMAF (도 6b)와 함께 96시간 동안 인큐베이션시킨 경우의 대표적인 실험으로부터의 투여량-반응 곡선을 나타낸다. 배양물을 50 μM 레사주린으로 4시간 동안 표지화하고, 형광을 측정하였다. 데이타를 4개-파라미터 투여량-반응 곡선 맞춤 절차를 사용하는 그래프패드 프리즘 버젼 4.00으로 환산시켰다. IC50 값을 성장이 비처리 대조군 배양물과 비교하여 50％ 감소된 경우의 농도로 정의하였다. 각각의 농도를 4중으로 시험하였다.
실시예 26 - 트라츠주마브의 정제
HERCEPTIN® (huMAb4D5-8, rhuMAb HER2, (미국 특허 제5821337호) 항체) 440 mg을 함유하는 하나의 바이알을 MES 완충액 (25 mM MES, 50 mM NaCl, pH 5.6) 50 mL 중에 용해시키고, 동일한 완충액 중에 평형화시킨 양이온 교환 컬럼 (세파로스 S, 15 cm x 1.7 cm) 상에 로딩하였다. 그 다음, 컬럼을 동일한 완충액 (5개 컬럼 부피)으로 세척하였다. 트라츠주마브을 완충액의 NaCl 농도를 200 mM으로 상승하여 용출하였다. 항체를 함유하는 분획물을 모으고, 10 mg/mL로 희석하고, 50 mM 인산칼륨, 50 mM NaCl, 2 mM EDTA (pH 6.5)를 함유하는 완충액 중으로 투석하였다.
실시예 27 - 트라츠주마브 및 MC - MMAE 의 접합에 의한 트라츠주마브 - MC - MMAE의 제조
pH 8.0에서 500 mM 붕산나트륨 및 500 mM 염화나트륨 중에 용해된 트라츠주마브을 과량의 100 mM 디티오트레이톨 (DTT)로 처리하였다. 37℃에서 약 30분 동안 인큐베이션한 후, 완충액을 세파덱스(Sephadex) G25 수지 상의 용출에 의해 교환하고, 1 mM DTPA를 함유한 PBS로 용출하였다. 티올/Ab 값을 용액의 280 nm에서의 흡광도, DTNB (미국 위스콘신주 밀워키 소재한 알드리치(Aldrich))와의 반응에 의한 티올 농도 및 412 nm에서의 흡광도의 측정에 의해 감소된 항체 농도를 측정함으로써 확인하였다. PBS 중에 용해된 감소된 항체를 얼음 상에서 빙냉시켰다.
DMSO 중에 용해시킨 약물 링커 시약, 말레이미도카프로일-모노메틸 아우리스타틴 E (MMAE), 즉 MC-MMAE를 아세토니트릴 및 물 중에 공지된 농도로 희석하고, PBS 중의 빙냉된 감소된 항체 트라츠주마브에 첨가하였다. 약 1시간 후에, 과량의 말레이미드를 첨가하여 반응물을 켄칭하고, 임의의 비처리 항체 티올 기를 캡핑하였다. 반응 혼합물을 원심 한외여과로 농축시키고, 트라츠주마브-MC-MMAE를 정제하고, PBS 중의 G25 수지를 통한 용출로 탈염시키고, 멸균 조건 하에 0.2 ㎛ 여과기를 통해 여과하고, 저장을 위해 냉동하였다.
실시예 28 - 트라츠주마브 및 MC - MMAF 의 접합에 의한 트라츠주마브 - MC - MMAF의 제조
트라츠주마브-MC-MMAF를 실시예 27의 절차에 따라 트라츠주마브 및 MC-MMAF의 접합에 의해 제조하였다.
실시예 29 - 트라츠주마브 및 MC - val - cit - PAB - MMAE 의 접합에 의한 트라츠주마브-MC-val-cit-PAB-MMAE의 제조
트라츠주마브-MC-val-cit-PAB-MMAE를 실시예 27의 절차에 따라 트라츠주마브 및 MC-val-cit-PAB-MMAE의 접합에 의해 제조하였다.
실시예 30 - 트라츠주마브 및 MC - val - cit - PAB - MMAF 9의 접합에 의한 트라츠주마브-MC-val-cit-PAB-MMAF의 제조
트라츠주마브-MC-val-cit-PAB-MMAF를 실시예 27의 절차에 따라 트라츠주마브 및 MC-val-cit-PAB-MMAF 9의 접합에 의해 제조하였다.
실시예 31 - 래트 독성
유리 약물 및 ADC의 급성 독성 프로파일을 청년기 스프라그-돌리(Sprague-Dawley) 래트 (각각 75 내지 125 mg, 챨스 리버 라보라토리즈(Charles River Laboratories; 미국 캘리포니아주 홀리스터 소재))로 평가하였다. 동물들에게 제1일에 주사하고, 완전 화학 및 혈액학 프로파일을 기저선에서 제3일 및 제5일에 수득하고, 완전 부검을 제5일에 수행하였다. 간 효소 측정을 모든 동물들에 대하여 수행하고, 일반적인 혈액분석을 흉골, 간, 신장, 흉선, 비장, 대장 및 소장의 조직들에 대하여 각각의 그룹에서 3마리의 무작위 동물들에 대하여 수행하였다. 실험 그룹은 하기와 같았다.
Figure 112013088873035-pat00204
트라츠주마브-MC-val-cit-MMAF, 트라츠주마브-MC(Me)-val-cit-PAB-MMAF, 트라츠주마브-MC-MMAF 및 트라츠주마브-MC-val-cit-PAB-MMAF에 대해서는, ㎍ MMAF/㎡를 MMAF의 MW로서 731.5를 사용하고, 허셉틴의 MW로서 145167을 사용하여 계산하였다.
체표면적을 다음과 같이 계산하였다: [{(체중 (g) 0.667 거듭제곱(power)) x 11.8}/10000]. (문헌 [Guidance for Industry and Reviewers, 2002] 참조).
투여 용액을 단일 정맥내 볼루스 꼬리 정맥 주사로 10 mL/kg의 투여 부피를 연구 제1일에 투여하였다. 동물들의 체중을 연구 제1일에 투여전에 측정하고, 그 이후로 매일 측정하였다. 전혈을 EDTA를 함유한 혈액학 분석을 위한 튜브에 수집하였다. 전혈을 임상 화학 분석을 위한 혈청 분리기 튜브 중으로 수집하였다. 혈액 샘플을 연구 제-4일, 연구 제3일 및 연구 제5일에 투여 전에 수집하였다. 전혈을 부검에서 나트륨 헤파린을 함유한 튜브 중으로 수집하고, 혈장을 가능한 이후의 분석을 위해 -70℃로 냉동시켰다. 간, 신장, 심장, 흉선, 비장, 뇌, 흉골 및 위, 대장 및 소장을 비롯한 GI 관의 절편 조직을 수집하고, 부검에서 중성 완충된 포르말린 중에 두었다. 흉골, 소장, 대장, 간, 흉선, 비장 및 신장을 시험하였다.
각각 시점에서 간 관련 혈청 효소 수준을 정상 암컷 스프라그-돌리 래트로부터의 범위 (5th 및 95th 백분위수)와 비교하였다. 각각의 시점에서 백혈구 및 혈소판 수를 정상 암컷 스프라그-돌리 래트로부터의 범위 (5th 및 95th 백분위수)와 비교하였다.
정상 암컷 스프라그-돌리 래트에서의 고 투여량 연구:
Figure 112013088873035-pat00205
11마리의 동물들로부터의 조직에 일반적인 조직분석을 수행하였다. 이들 동물들은 트라츠주마브-MC-MMAF 이뮤노접합체를 사용한 급성 투여-범위 독성 연구의 일부였다. 동물들은 12일 동안 하기 투여량을 따랐다.
실시예 32 - 시노몰구스 ( Cynomolgus ) 원숭이 독성/안전성
4마리 (암컷 2마리, 수컷 2마리) 비처리 마카카 패스시큘라리스(Macaca fascicularis)의 3개의 그룹을 트라츠주마브-MC-vc-PAB-MMAE 및 트라츠주마브-MC-vc-PAB-MMAF에 대해 연구하였다. 정맥내 투여를 연구 제1일 및 제22일에 수행하였다.
Figure 112013088873035-pat00206
Figure 112013088873035-pat00207
H = 트라츠주마브
투여량을 동물의 표면적으로 표현하여 다른 종과 관련되도록 하였다 (즉, ㎍/㎡로의 투여량은 종과 무관하며, 따라서 종들 사이에서 비교가능함). ADC의 제형은 PBS, 5.4 mM 인산나트륨, 4.2 mM 인산칼륨, 140 mM 염화나트륨를 함유하였다 (pH 6.5).
혈액을 혈액학 분석을 위해, 투여전 및 각각 투여 후 5분, 6시간, 10시간 및 1일, 3일, 5일, 7일, 14일, 21일에 수집하였다. 적혈구 (RBC) 및 혈소판 (PLT) 수는 광산란법으로 측정하였다. 백혈구 (WBC) 수는 퍼옥시다제/호염기구 법에 의해 측정하였다. 그물적혈구 수는 양이온 염료를 사용한 광산란법으로 측정하였다. 세포 수는 아드비아(Advia) 120 장치 상에서 측정하였다. ALT (알라닌 아미노트랜스퍼라제) 및 AST (아스파르테이트 아미노트랜스퍼라제)를 UV/NADH에 의한 U/L; 올림푸스(Olympus) AU400 장치 상에서의 IFCC법; 및 전체 Ab ELISA-ECD/GxhuFc-HRP. Conj. Ab ELISA-MMAE/MMAF//ECD-Bio/SA-HRP 시험을 사용하여 측정하였다.
실시예 33 - 항- ErbB2 모노클로날 항체 4 D5 의 제조, 특성화 및 인간화
ErbB2의 세포외 도메인에 특이적으로 결합하는 뮤린 모노클로날 항체 4D5를 문헌 [Fendly et al. (1990) Cancer Research 50:1550-1558]에 기재된 바와 같이 제조하였다. 간단하게는, 문헌 [Hudziak et al. Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 84: 7158-7163 (1987)]에 기재된 바와 같이 제조된 NIH 3T3/HER2-3400 세포 (세포 당 대략 1 x 105개 ErbB2 분자를 나타냄)를 25 mM EDTA를 함유한 인산염 완충된 식염수 (PBS)를 써서 수확하고, BALB/c 마우스를 면역화시키는 데 사용하였다. 마우스에 제0주, 제2주, 제5주 및 제7주에 PBS 0.5 ml 중의 107개 세포를 복막내 주사하였다. 32P-표지된 ErbB2를 면역침강시킨 항혈청을 갖는 마우스를 제9주 및 제13주에 밀 배아 응집소-세파로스 (WGA) 정제된 ErbB2 막 추출물을 복막내 주사하였다. 이는 ErbB2 제제 0.1 ml의 정맥내 주사 후 행하고, 비장세포를 마우스 골수종 세포주 X63-Ag8.653과 함께 융합하였다. 하이브리도마 상청액을 ELISA 및 방사면역침강법에 의해 ErbB2-결합에 대해 스크리닝하였다.
에피토프 맵핑 ( mapping ) 및 특성화
모노클로날 항체 4D5에 의해 결합된 ErbB2 에피토프를 경쟁 결합 분석 (문헌 Fendly et al. Cancer Research 50: 1550-1558 (1990)] 참조)에 의해 측정하였다. 교차-차단 연구를 형광을 정량하는 PANDEXTM 스크린 머쉰(Screen Machine)을 사용하여 무손상 세포 상에서의 직접적인 형광으로 수행하였다. 모노클로날 항체를 확립된 절차 (문헌 [Wofsy et al. Selected Methods in Cellular Immunology, p.287, Mishel and Schiigi (eds.) San Francisco: W.J. Freeman Co. (1980)] 참조)를 사용하여 플루오레세인 이소티오시아네이트 (FITC)와 접합하였다. NIH 3T3/HER2-3400 세포의 융합성 단층들을 트립신처리하고, 1회 세척하고, 0.5％ 소혈청 알부민 (BSA) 및 0.1％ NaN3을 함유한 냉동된 PBS 중에 1.75 x 106개 세포/ml로 재현탁시켰다. 최종 농도 1％의 라텍스 입자 (IDC, Portland, OR)를 첨가하여 PANDEXTM 플레이트 막의 막힘을 감소시켰다. 현탁액 중의 세포 20 ㎕, 정제된 모노클로날 항체 20 ㎕ (100 ㎍/ml 내지 0.1 ㎍/ml)를 PANDEXTM 플레이트 웰에 첨가하고, 30분 동안 얼음 중에서 인큐베이션하였다. 20 ㎕ 중의 FITC-표지된 모노클로날 항체의 미리 측정된 희석액을 각각의 웰에 첨가하고, 30분 동안 인큐베이션하고, 세척하고, 형광을 PANDEXTM로 정량하였다. 모노클로날 항체는 각각이 관련없는 모노클로날 항체 대조군과 비교하여 50％ 이상으로 다른 결합을 차단하는 경우 에피토프를 공유하는 것으로 간주되었다. 이 실험에서, 모노클로날 항체 4D5는 ErbB2 세포외 도메인 내에 포함된 에피토프 I (약 529에서 약 625의 아미노산 잔기)에 할당되었다.
모노클로날 항체 4D5의 성장 억제 특성을 유방암 세포주 SK-BR-3을 사용하여 평가하였다 (문헌 [Hudziak et al. (1989) Molec. Cell. Biol. 9 (3):1165-1172] 참조). 간략하면, SK-BR-3 세포를 0.25％ (vol/vol) 트립신을 사용하여 분리하고, ml 당 4 x 105개의 세포 밀도로 완전 배지 중에 현탁시켰다. 분취액 100 ㎕ (4 x 104 세포)를 96-웰 미세희석 플레이트 중으로 플레이팅하고, 세포가 부착되도록 하고, 그 다음 배지 단독 100 ㎕ 또는 모노클로날 항체를 함유한 배지 (최종 농도 5 ㎍/ml)를 첨가하였다. 72시간 후, 플레이트를 PBS (pH 7.5)로 2회 세척하고, 크리스탈 바이올렛 (메탄올 중의 0.5％)으로 염색하고, 문헌 [Sugarman et al. (1985) Science 230: 943-945]에 기재된 바에 따라 관련 세포 증식에 대해 분석하였다. 모노클로날 항체 4D5는 약 56％ 까지 SK-BR-3 관련 세포 증식을 억제하였다.
모노클로날 항체 4D5는 또한 MCF7 세포의 전체-세포 용해물로부터의 Mr 180,000 범위인 단백질들의 HRG-자극된 티로신 인산화를 억제하는 능력에 대해 평가하였다 (문헌 [Lewis et al. (1996) Cancer Research 56: 1457-1465] 참조). MCF7 세포는 모든 공지된 ErbB 수용체를 발현하지만 매우 낮은 수준으로 발현하는 것으로 보고되어 있다. ErbB2, ErbB3 및 ErbB4가 거의 동일한 분자 크기를 가지기 때문에, 전체 세포 용해물을 웨스턴 블럿 분석에 의해 평가하는 경우, 임의의 단백질이 티로신 인산화가 되었지는 분별하는 것은 불가능하다. 그러나, 사용되는 분석 조건이 외부적으로 첨가된 HRG가 없는 경우, 이들은 Mr 180,000 범위에서 티로신 인산화 단백질들의 검출가능하지 않은 정도의 낮은 수준을 나타내기 때문에, 이들 세포는 HRG 티로신 인산화 분석에 대해 이상적이다.
MCF7 세포를 24-웰 플레이트 중에 플레이팅하고, ErbB2에의 모노클로날 항체를 각각의 웰에 첨가하고, 실온에서 30분 동안 인큐베이션한 다음, rHRGβ1177-244를 각각의 웰에 첨가하여 최종 농도가 0.2 nM이 되도록하고, 인큐베이션을 8분 동안 계속하였다. 배지를 각각의 웰로부터 조심스럽게 흡인하고, 반응을 SDS 샘플 완충액 (5％ SDS, 25 mM DTT 및 25 mM 트리스-HCl, pH 6.8) 100 ㎕를 첨가하여 중단시켰다. 각각의 샘플 (25 ㎕)을 4％에서 12％로의 구배 겔 (노벡스(Novex)) 상에서 전기영동시키고, 폴리비닐리덴 디플루오리드 막으로 전기영동적으로 이동하였다. 항인산화티로신 (4G10, UBI로부터 입수, 1 ㎍/ml로 사용) 면역블럿을 전개하고, Mr 180,000에서의 현저한 반응성 밴드의 강도를 상기 기재된 바와 같이 (문헌 [Holmes et al. (1992) Science 256: 1205-1210; Sliwkowski et al. J. Biol. Chem. 269: 14661-14665 (1994)]), 반사도 농도계측기에 의해 정량하였다.
모노클로날 항체 4D5는 Mr 180,000에서 HRG-유도된 티로신 인산화 신호의 발생을 유의하게 억제하였다. 그러나, HRG의 부재 하에서는, Mr 180,000 범위에서 단백질의 티로신 인산화를 자극할 수 없었다. 또한, 이들 항체는 EGFR (문헌 [Fendly et al. Cancer Research 50 : 1550-1558 (1990)]), ErbB3 또는 ErbB4와 교차-반응을 하지 않는다. 모노클로날 항체 4D5는 티로신 인산화의 HRG 자극을 50％ 까지 차단할 수 있었다.
외인성 rHRGβ1의 존재하에 또는 부재하에 MDA-MB-175 및 SK-BR-3 세포에 대한 모노클로날 항체 4D5의 성장 억제 효과를 평가하였다 (문헌 [Schaefer et al. Oncogene 15: 1385-1394 (1997)]). MDA-MB-175 세포에서의 ErbB2 수준은 정상 유방 상피 세포에서 발견되는 수준보다 4 내지 6배 높았으며, ErbB2-ErbB4 수용체는 MDA-MB-175 세포에서 구성적으로 티로신 인산화된다. 모노클로날 항체 4D5는 외인성 HRG의 존재하에 및 부재하에 둘 다에서 MDA-MB-175 세포의 세포 증식을 억제할 수 있다. 4D5에 의한 세포 증식의 억제는 ErbB2 발현 수준에 의존한다 (문헌 [Lewis et al. Cancer Immunol. Immunother. 37: 255-263 (1993)]). SK-BR-3 세포에서의 66％의 최대 억제를 검출할 수 있었다. 그러나, 이러한 효과는 외인성 HRG에 의해 넘어설 수 있었다.
뮤린 모노클로날 항체 4D5를 미국 특허 제5821337호 (이의 전체 기재 내용이 본원에 참고로 명백히 혼입됨)에 기재된 바와 같이, "유전자 전환 돌연변이" 방법을 사용하여 인간화시킨다. 하기 실험에서 사용되는 인간화 모노클로날 항체 4D5를 huMAb4D5-8로 지칭하였다. 이 항체는 IgG1 이소형 (isotype)이다.
인용된 참고문헌
본 발명은 본 발명의 몇몇의 측면의 예시를 위한 실시예에서 개시된 구체적인 실시양태에 의한 범주로 한정되지 않으며, 기능적으로 동등한 임의의 실시양태는 본 발명의 범주 내에 속한다. 실제로, 본원에 나타내고 기재된 것 외에, 본 발명의 다양한 변형이 당업자에게 분명할 것이며, 첨부한 청구의 범위의 범주 내에 속하는 것으로 의도된다.
본원에 인용된 모든 참고문헌은 각각의 개별 공보 또는 특허 또는 특허 출원이 구체적으로, 또한 개별적으로 모든 목적을 위해 이의 전문이 참고로 혼입된다는 것을 명시한 경우, 동일한 정도의 모든 목적을 위해 이들의 전문이 참고로 혼입된다.
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Cys Cys Pro Val Ser Ser Asn Thr 170 175 180 Val Lys Ile Gln Val Gln Glu Pro Phe Thr Arg Pro Val Leu Arg 185 190 195 Ala Ser Ser Phe Gln Pro Ile Ser Gly Asn Pro Val Thr Leu Thr 200 205 210 Cys Glu Thr Gln Leu Ser Leu Glu Arg Ser Asp Val Pro Leu Arg 215 220 225 Phe Arg Phe Phe Arg Asp Asp Gln Thr Leu Gly Leu Gly Trp Ser 230 235 240 Leu Ser Pro Asn Phe Gln Ile Thr Ala Met Trp Ser Lys Asp Ser 245 250 255 Gly Phe Tyr Trp Cys Lys Ala Ala Thr Met Pro His Ser Val Ile 260 265 270 Ser Asp Ser Pro Arg Ser Trp Ile Gln Val Gln Ile Pro Ala Ser 275 280 285 His Pro Val Leu Thr Leu Ser Pro Glu Lys Ala Leu Asn Phe Glu 290 295 300 Gly Thr Lys Val Thr Leu His Cys Glu Thr Gln Glu Asp Ser Leu 305 310 315 Arg Thr Leu Tyr Arg Phe Tyr His Glu Gly Val Pro Leu Arg His 320 325 330 Lys Ser Val Arg Cys Glu Arg Gly Ala Ser Ile Ser Phe Ser Leu 335 340 345 Thr Thr Glu Asn Ser Gly Asn Tyr Tyr Cys Thr Ala Asp Asn Gly 350 355 360 Leu Gly Ala Lys Pro Ser Lys Ala Val Ser Leu Ser Val Thr Val 365 370 375 Pro Val Ser His Pro Val Leu Asn Leu Ser Ser Pro Glu Asp Leu 380 385 390 Ile Phe Glu Gly Ala Lys Val Thr Leu His Cys Glu Ala Gln Arg 395 400 405 Gly Ser Leu Pro Ile Leu Tyr Gln Phe His His Glu Asp Ala Ala 410 415 420 Leu Glu Arg Arg Ser Ala Asn Ser Ala Gly Gly Val Ala Ile Ser 425 430 435 Phe Ser Leu Thr Ala Glu His Ser Gly Asn Tyr Tyr Cys Thr Ala 440 445 450 Asp Asn Gly Phe Gly Pro Gln Arg Ser Lys Ala Val Ser Leu Ser 455 460 465 Ile Thr Val Pro Val Ser His Pro Val Leu Thr Leu Ser Ser Ala 470 475 480 Glu Ala Leu Thr Phe Glu Gly Ala Thr Val Thr Leu His Cys Glu 485 490 495 Val Gln Arg Gly Ser Pro Gln Ile Leu Tyr Gln Phe Tyr His Glu 500 505 510 Asp Met Pro Leu Trp Ser Ser Ser Thr Pro Ser Val Gly Arg Val 515 520 525 Ser Phe Ser Phe Ser Leu Thr Glu Gly His Ser Gly Asn Tyr Tyr 530 535 540 Cys Thr Ala Asp Asn Gly Phe Gly Pro Gln Arg Ser Glu Val Val 545 550 555 Ser Leu Phe Val Thr Val Pro Val Ser Arg Pro Ile Leu Thr Leu 560 565 570 Arg Val Pro Arg Ala Gln Ala Val Val Gly Asp Leu Leu Glu Leu 575 580 585 His Cys Glu Ala Pro Arg Gly Ser Pro Pro Ile Leu Tyr Trp Phe 590 595 600 Tyr His Glu Asp Val Thr Leu Gly Ser Ser Ser Ala Pro Ser Gly 605 610 615 Gly Glu Ala Ser Phe Asn Leu Ser Leu Thr Ala Glu His Ser Gly 620 625 630 Asn Tyr Ser Cys Glu Ala Asn Asn Gly Leu Val Ala Gln His Ser 635 640 645 Asp Thr Ile Ser Leu Ser Val Ile Val Pro Val Ser Arg Pro Ile 650 655 660 Leu Thr Phe Arg Ala Pro Arg Ala Gln Ala Val Val Gly Asp Leu 665 670 675 Leu Glu Leu His Cys Glu Ala Leu Arg Gly Ser Ser Pro Ile Leu 680 685 690 Tyr Trp Phe Tyr His Glu Asp Val Thr Leu Gly Lys Ile Ser Ala 695 700 705 Pro Ser Gly Gly Gly Ala Ser Phe Asn Leu Ser Leu Thr Thr Glu 710 715 720 His Ser Gly Ile Tyr Ser Cys Glu Ala Asp Asn Gly Pro Glu Ala 725 730 735 Gln Arg Ser Glu Met Val Thr Leu Lys Val Ala Val Pro Val Ser 740 745 750 Arg Pro Val Leu Thr Leu Arg Ala Pro Gly Thr His Ala Ala Val 755 760 765 Gly Asp Leu Leu Glu Leu His Cys Glu Ala Leu Arg Gly Ser Pro 770 775 780 Leu Ile Leu Tyr Arg Phe Phe His Glu Asp Val Thr Leu Gly Asn 785 790 795 Arg Ser Ser Pro Ser Gly Gly Ala Ser Leu Asn Leu Ser Leu Thr 800 805 810 Ala Glu His Ser Gly Asn Tyr Ser Cys Glu Ala Asp Asn Gly Leu 815 820 825 Gly Ala Gln Arg Ser Glu Thr Val Thr Leu Tyr Ile Thr Gly Leu 830 835 840 Thr Ala Asn Arg Ser Gly Pro Phe Ala Thr Gly Val Ala Gly Gly 845 850 855 Leu Leu Ser Ile Ala Gly Leu Ala Ala Gly Ala Leu Leu Leu Tyr 860 865 870 Cys Trp Leu Ser Arg Lys Ala Gly Arg Lys Pro Ala Ser Asp Pro 875 880 885 Ala Arg Ser Pro Pro Asp Ser Asp Ser Gln Glu Pro Thr Tyr His 890 895 900 Asn Val Pro Ala Trp Glu Glu Leu Gln Pro Val Tyr Thr Asn Ala 905 910 915 Asn Pro Arg Gly Glu Asn Val Val Tyr Ser Glu Val Arg Ile Ile 920 925 930 Gln Glu Lys Lys Lys His Ala Val Ala Ser Asp Pro Arg His Leu 935 940 945 Arg Asn Lys Gly Ser Pro Ile Ile Tyr Ser Glu Val Lys Val Ala 950 955 960 Ser Thr Pro Val Ser Gly Ser Leu Phe Leu Ala Ser Ser Ala Pro 965 970 975 His Arg

Claims (16)

  1. 하기 화학식을 갖고, 하나 이상의 약물 잔기에 공유적으로 부착된 항체를 포함하는 항체-약물 접합체, 또는 그의 제약상 허용되는 염 또는 용매화물.
    Figure 112014091486962-pat00230

    상기 식에서,
    Ab는 종양-관련 항원인 STEAP1에 결합하는 항체이고,
    p는 2 내지 8 범위이다.
  2. 제1항에 있어서, 항체가 그의 시스테인 잔기를 통해 약물 잔기에 부착되는 것인 항체-약물 접합체, 또는 그의 제약상 허용되는 염 또는 용매화물.
  3. 제1항에 있어서, 항체가 모노클로날 항체, 이중특이성 항체, 키메라 항체, 인간화 항체 및 항체 단편으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 항체-약물 접합체, 또는 그의 제약상 허용되는 염 또는 용매화물.
  4. 제3항에 있어서, 항체 단편이 Fab 단편인 항체-약물 접합체, 또는 그의 제약상 허용되는 염 또는 용매화물.
  5. 유효량의 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 항체-약물 접합체, 또는 그의 제약상 허용되는 염 또는 용매화물, 및 제약상 허용되는 희석제, 담체 또는 부형제를 포함하는, 암, 자가면역 질환 또는 감염성 질환을 치료하기 위한 제약 조성물.
  6. 제5항에 있어서, 치료 유효량의 튜불린-형성 억제제, 토포이소머라제 억제제 및 DNA 결합제로 이루어진 군으로부터 선택된 화학치료제를 추가로 포함하는 제약 조성물.
  7. 제5항에 있어서, 암이 유방암, 난소암, 위암, 자궁내막암, 침샘암, 폐암, 신장암, 직장암, 결장암, 갑상선암, 췌장암, 전립선암, 방광암, 혈액 유래 암, 급성 및 만성 백혈병 및 림프종으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 제약 조성물.
  8. 제7항에 있어서, 유효량의 항암제, 면역억제제 및 항-감염제로 이루어진 군으로부터 선택된 추가 작용제를 추가로 포함하는 제약 조성물.
  9. 제5항에 있어서, 항체-약물 접합체, 또는 그의 제약상 허용되는 염 또는 용매화물의 양이 환자의 체중 kg 당 0.1 내지 10 mg 범위인 제약 조성물.
  10. 제5항에 있어서, 3주 간격으로 투여되는 제약 조성물.
  11. 제5항에 있어서, 상기 항체-약물 접합체, 또는 그의 제약상 허용되는 염 또는 용매화물이 제약상 허용되는 비경구용 비히클로 제제화되어 비경구로 투여되거나 단위 투여량 주입 형태로 제제화된 것인 제약 조성물.
  12. 제5항에 있어서, 정맥내로 투여되는 제약 조성물.
  13. (a) 종양-관련 항원에 특이 결합하는 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 항체-약물 접합체, 또는 그의 제약상 허용되는 염 또는 용매화물, 및 (b) 화학 치료제를 포함하고, 상기 (a) 또는 (b)의 별도, 연속 또는 동시 투여용으로 제제화된, 종양-관련 항원을 과발현하는 종양 세포의 성장을 억제하기 위한 제약 조성물.
  14. 제13항에 있어서, ErbB2 수용체의 과발현을 특징으로 하는 질환에 민감하거나 상기 질환으로 진단받은 포유동물을 치료하기 위한 제약 조성물.
  15. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 항체-약물 접합체, 또는 그의 제약상 허용되는 염 또는 용매화물;
    용기; 및
    상기 항체-약물 접합체, 또는 그의 제약상 허용되는 염 또는 용매화물이 암을 치료하는 데 사용될 수 있다고 나타낸 패키지 첨부 설명서 또는 표지
    를 포함하는 제품.
  16. 제5항에 있어서, 유방암, 난소암, 위암, 자궁내막암, 침샘암, 폐암, 신장암, 직장암, 결장암, 갑상선암, 췌장암, 전립선암 및 방광암으로 이루어진 군으로부터 선택된 암을 치료하기 위한 유효량의 항암제, 면역억제제 및 항-감염제로 이루어진 군으로부터 선택된 추가 작용제와 조합된 제약 조성물.
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