ES2871383T3

ES2871383T3 - Anticuerpos asimétricos modificados que se unen al receptor de Fc y procedimientos de uso

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Publication number: ES2871383T3
Application number: ES14719743T
Authority: ES
Inventors: Joerg Thomas Regula; Wolfgang Schaefer; Tilman Schlothauer
Original assignee: F Hoffmann La Roche AG
Current assignee: F Hoffmann La Roche AG
Priority date: 2013-04-29
Filing date: 2014-04-25
Publication date: 2021-10-28
Anticipated expiration: 2034-04-25
Also published as: US20160068613A1; WO2014177459A3; CA2904805A1; EP3878866A1; US20200172607A1; KR102266819B1; JP7240443B2; US20200095310A1; RU2019108429A; JP2020015723A; WO2014177459A2; EP2992010A2; JP6942162B2; RU2687043C2; PL2992010T3; CN105164157A; EP2992010B1; JP6618893B2; RU2015145719A; HK1218761A1

Abstract

Una región Fc de la clase IgG que comprende un primer polipéptido de la región Fc variante y un segundo polipéptido de la región Fc variante, en la que a) el primer polipéptido de la región Fc variante se deriva de un primer polipéptido de la región Fc de la clase IgG original y el segundo polipéptido de la región Fc variante se deriva de un segundo polipéptido de la región Fc de la clase IgG original, con lo que el primer polipéptido de la región Fc de la clase IgG original es idéntico a o diferente del segundo polipéptido de la región Fc de la clase IgG original, y b) el primer polipéptido de la región Fc variante difiere del segundo polipéptido de la región Fc variante en uno o más residuos de aminoácido distintos de los residuos de aminoácido en los que el primer polipéptido de la región Fc de la clase IgG original difiere del segundo polipéptido de la región Fc de la clase IgG original, y c) la región Fc de la clase IgG que comprende el primer polipéptido de la región Fc variante y el segundo polipéptido de la región Fc variante tiene una afinidad por el receptor de Fc neonatal humano que es diferente a la de una región Fc de la clase IgG que comprende el primer polipéptido de la clase IgG original de a) y el segundo polipéptido de la región Fc de la clase IgG original de a), en la que el primer polipéptido de la región Fc difiere en una o dos de las mutaciones seleccionadas del grupo H310A, H433A e Y436A (numeración de acuerdo con el sistema de numeración del índice EU de Kabat) del segundo polipéptido de la región Fc y el segundo polipéptido de la región Fc difiere en una o dos de las mutaciones seleccionadas del grupo que comprende las mutaciones I253A, H310A, H433A, H435A e Y436A (numeración de acuerdo con el sistema de numeración del índice EU de Kabat) del primer polipéptido de la región Fc de modo que todas las mutaciones H310A, H433A e Y436A están comprendidas en la región Fc de la clase IgG, en la que i) el primer polipéptido de la región Fc de la clase IgG original es un polipéptido de la región Fc de la IgG1 humana y el segundo polipéptido de la región Fc de la clase IgG original es un polipéptido de la región Fc de la IgG1 humana, o ii) el primer polipéptido de la región Fc de la clase IgG original es un polipéptido de la región Fc de la IgG1 humana con las mutaciones L234A, L235A y el segundo polipéptido de la región Fc de la clase IgG original es un polipéptido de la región Fc de la IgG1 humana con las mutaciones L234A, L235A, o iii) el primer polipéptido de la región Fc de la clase IgG original es un polipéptido de la región Fc de la IgG1 humana con las mutaciones L234A, L235A, P329G y el segundo polipéptido de la región Fc de la clase IgG original es un polipéptido de la región Fc de la IgG1 humana con las mutaciones L234A, L235A, P329G, o iv) el primer polipéptido de la región Fc de la clase IgG original es un polipéptido de la región Fc de la IgG1 humana con las mutaciones L234A, L235A, S354C, T366W y el segundo polipéptido de la región Fc de la clase IgG original es un polipéptido de la región Fc de la IgG1 humana con las mutaciones L234A, L235A, Y349C, T366S, L368A, Y407V, o v) el primer polipéptido de la región Fc de la clase IgG original es un polipéptido de la región Fc de la IgG1 humana con las mutaciones L234A, L235A, P329G, S354C, T366W y el segundo polipéptido de la región Fc de la clase IgG original es un polipéptido de la región Fc de la IgG1 humana con las mutaciones L234A, L235A, P329G, Y349C, T366S, L368A, Y407V, o vi) el primer polipéptido de la región Fc de la clase IgG original es un polipéptido de la región Fc de la IgG4 humana y el segundo polipéptido de la región Fc de la clase IgG original es un polipéptido de la región Fc de la IgG4 humana, o vii) el primer polipéptido de la región Fc de la clase IgG original es un polipéptido de la región Fc de la IgG4 humana con las mutaciones S228P, L235E y el segundo polipéptido de la región Fc de la clase IgG original es un polipéptido de la región Fc de la IgG4 humana con las mutaciones S228P, L235E, o viii) el primer polipéptido de la región Fc de la clase IgG original es un polipéptido de la región Fc de la IgG4 humana con las mutaciones S228P, L235E, P329G y el segundo polipéptido de la región Fc de la clase IgG original es un polipéptido de la región Fc de la IgG4 humana con las mutaciones S228P, L235E, P329G, o ix) el primer polipéptido de la región Fc de la clase IgG original es un polipéptido de la región Fc de la IgG4 humana con las mutaciones S228P, L235E, S354C, T366W y el segundo polipéptido de la región Fc de la clase IgG original es un polipéptido de la región Fc de la IgG4 humana con las mutaciones S228P, L235E, Y349C, T366S, L368A, Y407V, o x) el primer polipéptido de la región Fc de la clase IgG original es un polipéptido de la región Fc de la IgG4 humana con las mutaciones S228P, L235E, P329G, S354C, T366W y el segundo polipéptido de la región Fc de la clase IgG original es un polipéptido de la región Fc de la IgG4 humana con las mutaciones S228P, L235E, P329G, Y349C, T366S, L368A, Y407V, o xi) el primer polipéptido de la región Fc de la clase IgG original es un polipéptido de la región Fc de la IgG1, IgG2 o IgG4 humana con la mutación K392D o el primer polipéptido de la región Fc de la clase IgG original es un polipéptido de la región Fc de la IgG3 humana con la mutación N392D y el segundo polipéptido de la región Fc de la clase IgG original es un polipéptido de la región Fc de la IgG1 humana con las mutaciones D399K, D356K y/o E357K o el segundo polipéptido de la región Fc de la clase IgG original es un polipéptido de la región Fc de la IgG2, IgG3 o IgG4 humana con las mutaciones D399K, E356K y/o E357K.

Description

DESCRIPCIÓN

Anticuerpos asimétricos modificados que se unen al receptor de Fc y procedimientos de uso

Campo de la invención

La presente invención se refiere a anticuerpos y polipéptidos de fusión de la región Fc que están asimétricamente modificados con respecto a su receptor de Fc, especialmente a su FcRn, la interacción y procedimientos de uso de los mismos.

Antecedentes

Casi todos los receptores de Fc se unen asimétricamente a la región Fc simétrica de los anticuerpos.

Por ejemplo, el receptor IIIA de Fcy humano interactúa con diferentes residuos de aminoácido en las dos cadenas polipeptídicas de la región Fc. Por tanto, las mutaciones introducidas asimétricamente (por ejemplo, en la región de bisagra inferior en los residuos 233 a 238) se deben usar para incrementar o disminuir la interacción del anticuerpo con el receptor IIIA de Fcy humano.

Pero, la interacción entre el receptor de Fc neonatal humano FcRn es simétrica: dos moléculas FcRn se pueden unir a una única IgG con una estequiometría de 2:1 (véase, por ejemplo, Huber, A.W., et al., J. Mol. Biol. 230 (1993) 1077-1083). Por tanto, las mutaciones introducidas asimétricamente reducen la unión a/mediante un FcRn pero no a/mediante ambos.

Los ejemplos de moléculas asimétricas tipo IgG incluyen, pero no se limitan a, las obtenidas con las siguientes tecnologías o usando los siguientes formatos: Triomab/Quadroma, Knobs-into-Holes (botón en ojal), CrossMab, anticuerpos adaptados electrostáticamente, LUZ-Y, cuerpo de dominio genomanipulado por intercambio de cadena, Biclonic y DuoBody.

En el documento WO 2012/125850 se informa de proteínas que contienen Fc que comprenden sustituciones asimétricas en sus regiones Fc y que tienen una unión incrementada al receptor IIIA de Fcy humano y una actividad ADCC potenciada.

En el documento WO 2012/58768 se informa de heteromultímeros aislados que comprenden una región Fc heterodimérica, en el que la región Fc heterodimérica comprende un dominio CH3 variante que comprende mutaciones aminoacídicas para promover la formación de heterodímeros con estabilidad incrementada, en el que la región Fc heterodimérica comprende además un dominio CH2 variante que comprende modificaciones aminoacídicas asimétricas para promover la unión selectiva de un receptor de Fc gamma.

En el documento WO 2011/131746 se informa de que, al introducir mutaciones asimétricas en las regiones CH3 de las dos proteínas de partida monoespecíficas, la reacción de intercambio Fab-brazo se puede forzar para ser direccional y, de este modo, producir proteínas heterodiméricas altamente estables.

Kim et al. (Kim, H. et al., Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 49 (2008) 2025-2029) informan de que, a excepción del tejido epitelial y coroideo pigmentario retiniano, los tejidos oculares, incluyendo el cuerpo ciliar y el iris, la retina, la conjuntiva, la córnea, el cristalino y el haz de nervios ópticos, mostraron la presencia de transcrito FcRn en el tamaño previsto. La barrera hematoocular mostró la expresión del receptor FcRn, lo que indica que el transporte de IgG desde los tejidos oculares hasta el sistema sanguíneo puede usar este receptor. Dado que los tejidos oculares internos, tales como la retina, están separados del sistema sanguíneo por la barrera hematoocular, no se esperaría detectar un anticuerpo de longitud completa en el sistema sanguíneo solo poco tiempo después de la inyección intravítrea. Sin embargo, los datos farmacocinéticos recientes de monos y humanos indican en todos los casos que el bevacizumab intravítreo aparece en la sangre en las horas siguientes a la inyección intravítrea. Por lo tanto, puede ser que la función del receptor FcRn en los vasos linfáticos conjuntivales sea actuar como un receptor de salida para la eliminación eficaz de los complejos de IgG antígeno-anticuerpo del espacio conjuntival. A pesar de los pesos moleculares similares, se detectó IgG (150 kDa) en el humor acuoso; sin embargo, no se detectó IgA (160 kDa). La discrepancia entre la penetración de IgG e IgA del suero al humor acuoso se puede explicar por la presencia de los receptores FcRn, que son selectivos para las IgG.

Kim et al. informan además (Kim, H. et al., Mol. Vis. 15 (2009) 2803-2812) de que la inyección intravítrea directa se ha convertido en un enfoque común para administrar anticuerpos terapéuticos en el segmento posterior del ojo para tratar trastornos de la retina. Tanto el bevacizumab (IgG) como la IgY de pollo administrados por vía intravítrea superaron la limitante barrera interna de la membrana y se difundieron hacia las estructuras retinianas más profundas. Después de difundirse a través de la retina, el bevacizumab cruzó la barrera hematorretiniana y se filtró en la circulación sistémica. La IgY de pollo intrarretiniana solo se localizó a lo largo del lado abluminal de la barrera hematorretiniana. Además, en los vasos sanguíneos coroideos no se observó la presencia de IgY de pollo. Se han descubierto niveles séricos fisiológicamente relevantes de bevacizumab después de la administración intravítrea, que representan hasta el 30 % de la dosis inyectada. Esto sugiere un mayor riesgo de efectos secundarios sistémicos que los reconocidos previamente. La barrera hematoocular manifiesta un mecanismo específico para transportar y eliminar las IgG de longitud completa a la circulación sistémica. El estudio actual de Kim confirma la hipótesis de que este mecanismo es el receptor de Fc neonatal.

En el documento US 2011/054151 se informa de composiciones y procedimientos para el coacoplamiento simultáneo bivalente y monovalente de antígenos.

En el documento US 2011/236388 se informa de anticuerpos bivalentes anti-VEGF/anti-ANG-2 biespecíficos. En el documento WO 2010/121766 se informa de proteínas de fusión de anticuerpos con sitios de unión a FcRn modificados.

Kim, J.K., et al. informan del mapeo del sitio en la IgG humana para la unión del receptor relacionado con MHC de clase I, FcRn (Eur. J. Immunol. 29 (1999) 2819-2825).

Qiao, S.-W., et al. informan de la dependencia de la presentación de antígeno mediada por anticuerpos en FcRn (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 105 (2008) 9337-9342).

Kuo, T.T., et al. informan sobre el receptor de Fc neonatal: a partir de la inmunidad a los tratamientos (J. Clin. Immunol. 30 (2010) 777-789).

Firan, M., et al. informan de que el receptor relacionado con MHC de clase I, FcRn, juega un papel esencial en la transferencia maternofetal de gammaglobulina en humanos (Int. Immunol. 13 (2001) 993-1002).

Vidarsson, G., et al. informan de que FcRn es un receptor de IgG en fagocitos con un papel novedoso en la fagocitosis (Blood 108 (2006) 3573-3579).

Gillies, S.D., et al. informan de la mejora de la eficacia de las proteínas de fusión anticuerpo-interleucina 2 reduciendo su interacción con los receptores de Fc (Cancer Res. 59 (1999) 2159-2166).

En el documento WO 2013/060867 se informa de la producción de proteínas heterodiméricas.

En el documento US 2010/331527 se informa de anticuerpos biespecíficos fácilmente aislados con formato de inmunoglobulina natural.

En el documento US 2012/321627 se informa de anticuerpos biespecíficos anti-vegf/anti-ang-2.

Shields, R.L., et al. informan del mapeo de alta resolución del sitio de unión en IgG1 humana para FcgammaRI, FcgammaRII, FcgammaRIII y FcRn y del diseño de variantes de IgG1 con unión mejorada al FcgammaR (J. Biol. Chem. 276 (2001) 6591-6604).

En el documento US 2010/158909 se informa de agentes de unión diana variantes y usos de los mismos.

Martin, W.L. et al., informan de la estructura cristalina a 2,8 ANG de un complejo FcRn/Fc heterodimérica: mecanismo de unión dependiente del pH (Mol. Cell. 7 (2001) 867-877).

Sumario

La invención se define por las reivindicaciones. Todo lo que queda fuera del alcance de las reivindicaciones se presenta solo como información.

Se ha descubierto que la unión a FcRn de un anticuerpo o polipéptido de fusión de la región Fc se puede modificar alterando residuos de aminoácido en posiciones no correspondientes en los polipéptidos de la región Fc individuales, ya que estas alteraciones actúan conjuntamente en la modificación de la unión a FcRn. Los anticuerpos y los polipéptidos de fusión de la región Fc de acuerdo con la invención son útiles, por ejemplo, para el tratamiento de enfermedades en las que se requieren tiempos de retención sistémica adaptados individualmente. Un aspecto de acuerdo con la invención es una región Fc de la clase IgG (humana) variante que comprende un primer polipéptido de la región Fc y un segundo polipéptido de la región Fc,

en la que

a) el primer polipéptido de la región Fc y el segundo polipéptido de la región Fc se derivan del mismo polipéptido de la región Fc de la clase IgG (humana) original, y

b) el primer polipéptido de la región Fc tiene una secuencia de aminoácidos que difiere de la secuencia de aminoácidos del segundo polipéptido de la región Fc en al menos una posición correspondiente de acuerdo con el sistema de numeración del índice EU de Kabat,

con lo que la región Fc de la clase IgG (humana) variante tiene una afinidad diferente por el receptor de Fc neonatal humano en comparación con una región Fc de la clase IgG (humana) que tiene los mismos residuos de aminoácido (que el polipéptido de la región Fc humana (original) de a)) en posiciones correspondientes de acuerdo con el sistema de numeración del índice EU de Kabat en el primer polipéptido de la región Fc y el segundo polipéptido de la región Fc,

en la que el primer polipéptido de la región Fc difiere en una o dos de las mutaciones seleccionadas del grupo H310A, H433a e Y436A (numeración de acuerdo con el sistema de numeración del índice EU de Kabat) del segundo polipéptido de la región Fc y el segundo polipéptido de la región Fc difiere en una o dos de las mutaciones seleccionadas del grupo que comprende las mutaciones I253A, H310A, H433A, H435A e Y436A (numeración de acuerdo con el sistema de numeración del índice EU de Kabat) del primer polipéptido de la región Fc de modo que todas las mutaciones H310A, H433A e Y436A están comprendidas en la región Fc de la clase IgG,

en la que

i) el primer polipéptido de la región Fc de la clase IgG original es un polipéptido de la región Fc de la IgG1 humana y el segundo polipéptido de la región Fc de la clase IgG original es un polipéptido de la región Fc de la IgG1 humana, o

ii) el primer polipéptido de la región Fc de la clase IgG original es un polipéptido de la región Fc de la IgG1 humana con las mutaciones L234A, L235A y el segundo polipéptido de la región Fc de la clase IgG original es un polipéptido de la región Fc de la IgG1 humana con las mutaciones L234A, L235A, o

iii) el primer polipéptido de la región Fc de la clase IgG original es un polipéptido de la región Fc de la IgG1 humana con las mutaciones L234A, L235A, P329G y el segundo polipéptido de la región Fc de la clase IgG original es un polipéptido de la región Fc de la IgG1 humana con las mutaciones L234A, L235A, P329G, o

iv) el primer polipéptido de la región Fc de la clase IgG original es un polipéptido de la región Fc de la IgG4 humana y el segundo polipéptido de la región Fc de la clase IgG original es un polipéptido de la región Fc de la IgG4 humana, o

v) el primer polipéptido de la región Fc de la clase IgG original es un polipéptido de la región Fc de la IgG4 humana con las mutaciones S228P, L235E y el segundo polipéptido de la región Fc de la clase IgG original es un polipéptido de la región Fc de la IgG4 humana con las mutaciones S228P, L235E, o

vi) el primer polipéptido de la región Fc de la clase IgG original es un polipéptido de la región Fc de la IgG4 humana con las mutaciones S228P, L235E, P329G y el segundo polipéptido de la región Fc de la clase IgG original es un polipéptido de la región Fc de la IgG4 humana con las mutaciones S228P, L235E, P329G.

Un aspecto de la invención es una región Fc de la clase IgG (humana) variante que comprende un primer polipéptido de la región Fc y un segundo polipéptido de la región Fc,

en la que

a) la secuencia de aminoácidos del primer polipéptido de la región Fc difiere de la secuencia de aminoácidos de un primer polipéptido de la región Fc de la clase IgG original en uno o más residuos de aminoácido,

y

la secuencia de aminoácidos del segundo polipéptido de la región Fc difiere de la secuencia de aminoácidos de un segundo polipéptido de la región Fc de la clase IgG original en uno o más residuos de aminoácido, y

b) el primer polipéptido de la región Fc tiene una secuencia de aminoácidos que difiere de la secuencia de aminoácidos del segundo polipéptido de la región Fc en al menos una posición correspondiente (de acuerdo con el sistema de numeración del índice EU de Kabat) distinta de los residuos de aminoácido en los que el primer polipéptido de la región Fc de la clase IgG original difiere del segundo polipéptido de la región Fc de la clase IgG original,

con lo que la región Fc de la clase IgG (humana) variante tiene una afinidad diferente por el receptor de Fc neonatal humano en comparación con una región Fc de la clase IgG original que comprende el primer y el segundo polipéptido de la región Fc de la clase IgG original de a),

en la que

iv) el primer polipéptido de la región Fc de la clase IgG original es un polipéptido de la región Fc de la IgG1 humana con las mutaciones L234A, L235A, S354C, T366W y el segundo polipéptido de la región Fc de la clase IgG original es un polipéptido de la región Fc de la IgG1 humana con las mutaciones L234A, L235A, Y349C, T366S, L368A, Y407V, o

v) el primer polipéptido de la región Fc de la clase IgG original es un polipéptido de la región Fc de la IgG1 humana con las mutaciones L234A, L235A, P329G, S354C, T366W y el segundo polipéptido de la región Fc de la clase IgG original es un polipéptido de la región Fc de la IgG1 humana con las mutaciones L234A, L235A, P329G, Y349C, T366S, L368A, Y407V, o

vi) el primer polipéptido de la región Fc de la clase IgG original es un polipéptido de la región Fc de la IgG4 humana y el segundo polipéptido de la región Fc de la clase IgG original es un polipéptido de la región Fc de la IgG4 humana, o

vii) el primer polipéptido de la región Fc de la clase IgG original es un polipéptido de la región Fc de la IgG4 humana con las mutaciones S228P, L235E y el segundo polipéptido de la región Fc de la clase IgG original es un polipéptido de la región Fc de la IgG4 humana con las mutaciones S228P, L235E, o

viii) el primer polipéptido de la región Fc de la clase IgG original es un polipéptido de la región Fc de la IgG4 humana con las mutaciones S228P, L235E, P329G y el segundo polipéptido de la región Fc de la clase IgG original es un polipéptido de la región Fc de la IgG4 humana con las mutaciones S228P, L235E, P329G, o

ix) el primer polipéptido de la región Fc de la clase IgG original es un polipéptido de la región Fc de la IgG4 humana con las mutaciones S228P, L235E, S354C, T366W y el segundo polipéptido de la región Fc de la clase IgG original es un polipéptido de la región Fc de la IgG4 humana con las mutaciones S228P, L235E, Y349C, T366S, L368A, Y407V, o

x) el primer polipéptido de la región Fc de la clase IgG original es un polipéptido de la región Fc de la IgG4 humana con las mutaciones S228P, L235E, P329G, S354C, T366W y el segundo polipéptido de la región Fc de la clase IgG original es un polipéptido de la región Fc de la IgG4 humana con las mutaciones S228P, L235E, P329G, Y349C, T366S, L368A, Y407V, o

xi) el primer polipéptido de la región Fc de la clase IgG original es un polipéptido de la región Fc de la IgG1, IgG2 o IgG4 humana con la mutación K392D o el primer polipéptido de la región Fc de la clase IgG original es un polipéptido de la región Fc de la IgG3 humana con la mutación N392D y el segundo polipéptido de la región Fc de la clase IgG original es un polipéptido de la región Fc de la IgG1 humana con las mutaciones D399K, D356K y/o E357K o el segundo polipéptido de la región Fc de la clase IgG original es un polipéptido de la región Fc de la IgG2, IgG3 o IgG4 humana con las mutaciones D399K, E356K y/o E357K.

en la que

a) la secuencia de aminoácidos del primer polipéptido de la región Fc se deriva de un primer polipéptido de la región Fc de la clase IgG original y la secuencia de aminoácidos del segundo polipéptido de la región Fc se deriva de un segundo polipéptido de la región Fc de la clase IgG original, y

b) en el primer polipéptido de la región Fc y/o en el segundo polipéptido de la región Fc se introducen una o más mutaciones de modo que el primer polipéptido de la región Fc tiene una secuencia de aminoácidos que difiere de la secuencia de aminoácidos del segundo polipéptido de la región Fc en al menos una posición correspondiente (de acuerdo con el sistema de numeración del índice EU de Kabat) distinta de los residuos de aminoácido en los que el primer polipéptido de la región Fc de la clase IgG original difiere del segundo polipéptido de la región Fc de la clase IgG original,

con lo que la región Fc de la clase IgG (humana) variante tiene una afinidad diferente por el receptor de Fc neonatal humano en comparación con una región Fc de la clase IgG que comprende el primer y el segundo polipéptido de la región Fc de la clase IgG original de a),

en la que

En un modo de realización de todos los aspectos, la región Fc de la clase IgG (humana) variante es una región Fc heterodimérica de la clase IgG (humana) variante.

En un modo de realización de todos los aspectos, el primer y el segundo polipéptido de la región Fc difieren independientemente entre sí en al menos un residuo de aminoácido del polipéptido de la región Fc de la clase IgG original respectivo.

En un modo de realización de todos los aspectos, el primer polipéptido de la región Fc difiere en 1 o 2 o 3 o 4 o 5 o 6 o 7 u 8 o 9 o 10 u 11 o 12 residuos de aminoácido en la posición correspondiente de acuerdo con el sistema de numeración del índice EU de Kabat del segundo polipéptido de la región Fc.

En un modo de realización, la región Fc de la clase IgG (humana) variante tiene una unión reducida a la proteína A estafilocócica como la región Fc de la clase IgG humana original correspondiente.

En un modo de realización, la región Fc de la clase IgG (humana) variante tiene la misma unión a la proteína A estafilocócica como la región Fc de la clase IgG humana original correspondiente.

De acuerdo con la invención, la región Fc de la clase IgG (humana) variante comprende un primer y un segundo polipéptido de la región Fc, ambos de la subclase IgG1 humana o IgG4 humana (derivados de origen humano), que comprenden una o dos de las mutaciones seleccionadas del grupo de H310A, H433A e Y436A (numeración de acuerdo con el sistema de numeración del índice EU de Kabat) en el primer polipéptido de la región Fc y una o dos de las mutaciones seleccionadas del grupo que comprende las mutaciones I253A, H310A, H433A, H435A e Y436A (numeración de acuerdo con el sistema de numeración del índice EU de Kabat) en el segundo polipéptido de la región Fc, de modo que todas las mutaciones H310A, H433A e Y436A estén comprendidas en la región Fc de la clase IgG (humana) variante.

De acuerdo con la invención, la región Fc de la clase IgG (humana) variante comprende un primer y un segundo polipéptido de la región Fc, ambos de la subclase IgG1 humana o IgG4 humana (derivados de origen humano), que comprenden las mutaciones H310A/H433A/Y436A en el región Fc (numeración de acuerdo con el sistema de numeración del índice EU de Kabat), con lo que una o dos mutaciones se encuentran en el primer polipéptido de la región Fc y una o dos mutaciones se encuentran en el segundo polipéptido de la región Fc de modo que todas las mutaciones H310A, H433A e Y436A están comprendidas en la región Fc.

De acuerdo con la invención, la región Fc de la clase IgG (humana) variante comprende un primer y un segundo polipéptido de la región Fc de la subclase IgG1 humana en la que

a) el primer y el segundo polipéptido de la región Fc comprenden ambos además las mutaciones L234A y L235A (numeración de acuerdo con el sistema de numeración del índice EU de Kabat), o

b) el primer y el segundo polipéptido de la región Fc comprenden ambos además las mutaciones L234A y L235A y P329G (numeración de acuerdo con el sistema de numeración del índice EU de Kabat), o

c) el primer y el segundo polipéptido de la región Fc comprenden ambos además las mutaciones L234A y L235A (numeración de acuerdo con el sistema de numeración del índice EU de Kabat) y el primer polipéptido de la región Fc comprende además la mutación Y349C o S354C y la mutación T366W y el segundo polipéptido de la región Fc comprende además la mutación Y349C o S354C y las mutaciones T366S, L368A e Y407V, o

d) el primer y el segundo polipéptido de la región Fc comprenden ambos además las mutaciones L234A y L235A y P329G (numeración de acuerdo con el sistema de numeración del índice EU de Kabat) y el primer polipéptido de la región Fc comprende además la mutación Y349C o S354C y la mutación T366W y el segundo polipéptido de la región Fc comprende además la mutación Y349C o S354C y las mutaciones T366S, L368A e Y407V.

De acuerdo con la invención, la región Fc de la clase IgG (humana) variante comprende un primer y un segundo polipéptido de la región Fc de la subclase IgG4 humana en la que

a) el primer y el segundo polipéptido de la región Fc comprenden ambos además las mutaciones S228P y L235E (numeración de acuerdo con el sistema de numeración del índice EU de Kabat), o

b) el primer y el segundo polipéptido de la región Fc comprenden ambos además las mutaciones S228P y L235E y P329G (numeración de acuerdo con el sistema de numeración del índice EU de Kabat), o

c) el primer y el segundo polipéptido de la región Fc comprenden ambos además las mutaciones S228P y L235E (numeración de acuerdo con el sistema de numeración del índice EU de Kabat) y el primer polipéptido de la región Fc comprende además la mutación Y349C o S354C y la mutación T366W y el segundo polipéptido de la región Fc comprende además la mutación Y349C o S354C y las mutaciones T366S, L368A e Y407V,

d) el primer y el segundo polipéptido de la región Fc comprenden ambos además las mutaciones S228P y L235E y P329G (numeración de acuerdo con el sistema de numeración del índice EU de Kabat) y el primer polipéptido de la región Fc comprende además la mutación Y349C o S354C y la mutación T366W y el segundo polipéptido de la región Fc comprende además la mutación Y349C o S354C y las mutaciones T366S, L368A e Y407V.

Un aspecto de la invención es un anticuerpo o polipéptido de fusión de la región Fc que comprende la región Fc de la clase IgG (humana) variante de acuerdo con la invención.

En un modo de realización, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.

En un modo de realización, el anticuerpo es un anticuerpo humano, humanizado o quimérico.

En el presente documento se divulga un ácido nucleico que codifica la región Fc de la clase IgG (humana) variante como se informa en el presente documento.

En el presente documento se divulga un ácido nucleico que codifica el anticuerpo como se informa en el presente documento.

En el presente documento se divulga un ácido nucleico que codifica el polipéptido de fusión de la región Fc como se informa en el presente documento.

En el presente documento se divulga una célula huésped que comprende el ácido nucleico como se informa en el presente documento.

En el presente documento se divulga un procedimiento de producción de la región Fc de la clase IgG (humana) variante como se informa en el presente documento que comprende cultivar la célula huésped como se informa en el presente documento de modo que se produzca la región Fc de la clase IgG (humana) variante.

En el presente documento se divulga un procedimiento de producción del anticuerpo como se informa en el presente documento que comprende cultivar la célula huésped como se informa en el presente documento, de modo que se produzca el anticuerpo.

En el presente documento se divulga un procedimiento de producción del polipéptido de fusión de la región Fc como se informa en el presente documento que comprende cultivar la célula huésped como se informa en el presente documento de modo que se produzca el polipéptido de fusión de la región Fc.

Un aspecto de la invención es una formulación farmacéutica que comprende el anticuerpo de acuerdo con la invención o el polipéptido de fusión de la región Fc de acuerdo con la invención.

Otro aspecto de la invención es el anticuerpo de acuerdo con la invención o el polipéptido de fusión de la región Fc de acuerdo con la invención para su uso como medicamento.

Un aspecto de la invención es el uso del anticuerpo de acuerdo con la invención o el polipéptido de fusión de la región Fc de acuerdo con la invención en la fabricación de un medicamento.

Los anticuerpos de acuerdo con la invención se pueden usar como, por ejemplo, reclutadores de linfocitos T, como aglutinante del receptor de Fc gamma con alta actividad biológica (potencia) y rápida depuración de la circulación sanguínea (suero sanguíneo), como conjugados anticuerpo-fármaco con rápida depuración para reducir efectos secundarios sistémicos, o como anticuerpos predirigidos.

Breve descripción de las figuras

Figura 1 Esquema de concepto y ventajas de anticuerpos IgG1 o IgG4 <VEGF-ANG-2> con mutación IHH-AAA (= combinación de mutaciones I253A, H310A y H435A (numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat)).

Figura 2 Medición de viscosidad basada en DLS a pequeña escala: Viscosidad extrapolada a 150 mg/ml en arginina/succinato 200 mM, pH 5,5 (comparación de anticuerpos <VEGF-ANG-2> VEGFang2 0016 (con mutación IHH-AAA) con un anticuerpo de referencia VEGFang2-0015 (sin dichas mutaciones IHH-AAA)).

Figura 3 Agregación por DLS dependiente de la temperatura (incluyendo la temperatura de inicio de la agregación por DLS) en un tampón de histidina 20 mM, NaCl 140 mM, pH 6,0 (comparación de anticuerpos <VEGF-ANG-2> como se informa en el presente documento VEGFang2-0016 (con mutación IHH-AAA) con un anticuerpo de referencia VEGFang2-0015 (sin dicha mutación IHH-AAA)).

Figura 4 Siete días de almacenamiento a 40 °C a 100 mg/ml (disminución del pico principal e incremento de peso molecular alto (PMA)) (comparación de anticuerpos <VEGF-ANG-2> como se informa en el presente documento VEGFang2-0016 (con mutación IHH-AAA) que mostraron una agregación más baja con un anticuerpo de referencia VEGFang2-0015 (sin dicha mutación IHH-AAA)).

Figura 5A y B Afinidad por FcRn en estado estable de A: VEGFang2-0015 (sin mutación IHH-AAA) y B:

VEGFang2-0016 (con mutación IHH-AAA).

Figura 6 Medición de la interacción FcgammaRIIIa de VEGFang2-0015 sin mutación IHH-AAA y VEGFang2-0016 con mutación IHH-AAA (ambos son subclase IgG1 con mutaciones P329G LALA; como control se usaron un anticuerpo anti-digoxigenina (anti-Dig) de subclase IgG1 y un anticuerpo basado en IgG4).

Figura 7A Esquema del principio del ensayo ELISA farmacocinético (FC) para la determinación de concentraciones de anticuerpos biespecíficos <VEGF-ANG-2> en suero y lisados oculares completos.

Figura 7B Concentración sérica después de la aplicación intravenosa (i.v.): comparación de VEGFang2-0015 sin mutación IHH-AAA y VEGFang2-0016 con mutación IHH-AAA.

Figura 7C Concentración sérica después de la aplicación intravítrea: comparación de VEGFang2-0015 sin mutación IHH-AAA y VEGFang2-0016 con mutación IHH-AAA.

Figura 7D Concentración de lisados oculares de VEGFang2-0016 (con mutación IHH-AAA) en el ojo derecho e izquierdo (después de aplicación intravítrea solo en el ojo derecho en comparación con la aplicación intravenosa): se pudieron detectar concentraciones significativas solo en el ojo derecho después de la aplicación intravítrea; después de la aplicación intravenosa no se pudo detectar ninguna concentración en los lisados oculares debido a la baja semivida en suero de VEGFang2-0016 (con mutación IHH-AAA).

Figura 7E Concentración de lisados oculares de VEGFang2-0015 (sin mutación IHH-AAA) en el ojo derecho e izquierdo (después de aplicación intravítrea solo en el ojo derecho en comparación con la aplicación intravenosa): en el ojo derecho (y hasta cierto punto en el ojo izquierdo) después de la aplicación intravítrea se pudieron detectar concentraciones de VEGFang2-0015; esto indica la difusión desde el ojo derecho hacia el suero y desde allí hacia el ojo izquierdo, lo que se puede explicar por la larga semivida de VEGFang2-0015 (sin mutación IHH-AAA); después de la aplicación intravenosa también se pudieron detectar concentraciones significativas en los lisados oculares de ambos ojos debido a la difusión en los ojos del VEGFang2-0015 (sin mutación IHH-AAA) estable en suero.

Figura 8 Anticuerpos genomanipulados con respecto a su capacidad para unirse a FcRn muestran semividas in vivo prolongadas (mutación YTE) o más cortas (mutación IHH-AAA), unión potenciada (mutación YTE) o reducida (mutación IHH-AAA) en comparación con el anticuerpo natural (wt) de referencia en el análisis de resonancia de plasmón superficial (RPS), así como un tiempo de retención potenciado o reducido en la cromatografía en columna de FcRn; a) Datos FC después de la aplicación de un solo bolo i.v. de 10 mg/kg en ratones C57BL/6J transgénicos huFcRn /-276: Datos de ABC para IgG natural, así como IgGs con Fc modificadas con mutaciones YTE e IHH-AAA; b) Sensograma BIAcore; c) Elución en la columna de afinidad por FcRn; anticuerpo anti-IGF-1R natural (referencia), mutante YTE de anticuerpo anti-IGF-1R, mutante IHH-AAA de anticuerpo anti-IGF-1R.

Figura 9 Cambio en el tiempo de retención en una cromatografía de afinidad por FcRn dependiendo del número de mutaciones introducidas en la región Fc.

Figura 10 Cambio en la unión a FcRn dependiendo de la distribución asimétrica de las mutaciones introducidas en la región Fc.

Figura 11 Cromatograma de elución de un anticuerpo biespecífico <VEGF-ANG-2> (VEGF/ANG2-0121) con las mutaciones H310A, H433A e Y436A en ambas cadenas pesadas de dos columnas de cromatografía de afinidad por proteína A consecutivas.

Figura 12 Cromatograma de elución de un anticuerpo anti-IGF-1R (IGF-1R-0045) con las mutaciones H310A, H433A e Y436A en ambas cadenas pesadas de una columna de cromatografía de afinidad por proteína A.

Figura 13 Unión de anticuerpos <VEGF-ANG-2> con región Fc de IgG modificada a la proteína A inmovilizada en un chip CM5.

Figura 14 Cromatograma de elución de diferentes anticuerpos <VEGF-ANG-2> en una columna de afinidad por FcRn.

Figura 15 Unión de diferentes polipéptidos de fusión a la proteína A estafilocócica (RPS).

Figura 16 Unión de diferentes anticuerpos <VEGF-ANG-2> y mutantes de anticuerpos anti-IGF-1R a la proteína A inmovilizada (RPS).

Descripción detallada de los modos de realización de la invención

I. Definiciones

El término "aproximadamente" indica un intervalo de un /- 20 % del siguiente valor numérico posterior. En un modo de realización, el término aproximadamente indica un intervalo de un /- 10 % del siguiente valor numérico posterior. En un modo de realización, el término aproximadamente indica un intervalo de un /- 5 % del siguiente valor numérico posterior.

Una "región estructural humana aceptora" para los propósitos en el presente documento es una región estructural que comprende la secuencia de aminoácidos de una región estructural del dominio variable de la cadena ligera (VL) o una región estructural del dominio variable de la cadena pesada (VH) derivada de una región estructural de inmunoglobulina humana o una región estructural consenso humana, como se define a continuación. Una región estructural humana aceptora "derivada de" una región estructural de inmunoglobulina humana o una región estructural consenso humana puede comprender la misma secuencia de aminoácidos de la misma, o puede contener alteraciones en la secuencia de aminoácidos. En algunos modos de realización, el número de alteraciones de aminoácidos es de 10 o menos, 9 o menos, 8 o menos, 7 o menos, 6 o menos, 5 o menos, 4 o menos, 3 o menos o 2 o menos. En algunos modos de realización, la región estructural humana aceptora de VL tiene una secuencia idéntica a la secuencia de la región estructural de inmunoglobulina humana de VL o la secuencia de la región estructural consenso humana.

Un anticuerpo "madurado en afinidad" se refiere a un anticuerpo con una o más alteraciones en una o más regiones hipervariables (HVR), en comparación con un anticuerpo original que no posee dichas alteraciones, dando como resultado dichas alteraciones una mejora en la afinidad del anticuerpo por el antígeno.

El término "alteración" indica la mutación (sustitución), inserción (adición) o deleción de uno o más residuos de aminoácido en un anticuerpo o polipéptido de fusión original, por ejemplo, un polipéptido de fusión que comprende al menos una parte de unión al FcRn de una región Fc, para obtener un anticuerpo o polipéptido de fusión modificado. El término "mutación" indica que el residuo de aminoácido especificado se sustituye por un residuo de aminoácido diferente. Por ejemplo, la mutación L234A indica que el residuo de aminoácido lisina en la posición 234 en una región Fc (polipéptido) de anticuerpo está sustituido por el residuo de aminoácido alanina (sustitución de lisina con alanina) (numeración de acuerdo con el índice EU).

El término "mutación aminoacídica" indica la sustitución de al menos un residuo de aminoácido existente con otro residuo de aminoácido diferente (= residuo de aminoácido de reemplazo). El residuo de aminoácido de reemplazo puede ser un "residuo de aminoácido natural" y seleccionarse del grupo que consiste en alanina (código de tres letras: ala, código de una letra: A), arginina (arg, R), asparagina (asn, N), ácido aspártico (asp, D), cisteína (cys, C), glutamina (gln, Q), ácido glutámico (glu, E), glicina (gly, G), histidina (his, H), isoleucina (ile, I), leucina (leu, L), lisina (lys, K), metionina (met, M), fenilalanina (phe, F), prolina (pro, P), serina (ser, S), treonina (thr, T), triptófano (trp, W), tirosina (tyr, Y) y valina (val, V). El residuo de aminoácido de reemplazo puede ser un "residuo de aminoácido no natural". Véanse, por ejemplo, los documentos US 6.586.207, WO 98/48032, WO 03/073238, US 2004/0214988, WO 2005/35727, WO 2005/74524, Chin, J.W., et al., J. Am. Chem. Soc. 124 (2002) 9026-9027; Chin, J.W. y Schultz, P.G., ChemBioChem 11 (2002) 1135-1137; Chin, J.W., et al., PICAS United States of America 99 (2002) 11020-11024; y Wang, L. y Schultz, P.G., Chem. (2002) 1-10.

El término "inserción aminoacídica" indica la incorporación (adicional) de al menos un residuo de aminoácido en una posición predeterminada en una secuencia de aminoácidos. En un modo de realización, la inserción será la inserción de uno o dos residuos de aminoácido. El/los residuo(s) de aminoácido(s) insertado(s) puede(n) ser cualquier residuo de aminoácido natural o no natural.

El término "deleción aminoacídica" indica la eliminación de al menos un residuo de aminoácido en una posición predeterminada en una secuencia de aminoácidos.

El término "ANG-2", como se usa en el presente documento, se refiere a angiopoyetina-2 (ANG-2) humana (de forma alternativa abreviada como ANGPT2 o ANG2) (SEQ ID NO: 31) que se describe, por ejemplo, en Maisonpierre, P.C. et al., Science 277 (1997) 55-60 y Cheung, A.H. et al., Genomics 48 (1998) 389-91. Las angiopoyetinas-1 (SEQ ID NO: 32) y -2 fueron descubiertas como ligandos para las Tie, una familia de tirosina cinasas que se expresan de manera selectiva dentro del endotelio vascular (Yancopoulos, G.D. et al., Nature 407 (2000) 242-248). Existen cuatro miembros definitivos de la familia de las angiopoyetinas. La angiopoyetina-3 y -4 (ANG-3 y ANG-4) puede representar contrapartes ampliamente divergentes del mismo locus de genes en ratones y hombres (Kim, I. et al., FEBS Let, 443 (1999) 353-356; Kim, I. et al., J. Biol. Chem. 274 (1999) 26523-26528). ANG-1 y ANG-2 se identificaron originalmente en experimentos de cultivo de tejidos como agonista y antagonista, respectivamente (véase para ANG-1: Davis, S. et al., Cell 87 (1996) 1161-1169; y para ANG-2: Maisonpierre, P.C. et al., Science 277 (1997) 55-60). Todas las angiopoyetinas conocidas se unen principalmente a Tie2 (SEQ ID NO: 33), y tanto ANG-1 como -2 se unen a Tie2 con una afinidad de 3 nM (Kd) (Maisonpierre, P.C. et al., Science 277 (1997) 55-60).

El término "anticuerpo" en el presente documento se usa en el sentido más amplio y engloba diversas estructuras de anticuerpos, incluyendo pero sin limitarse a anticuerpos monoclonales, anticuerpos multiespecíficos (por ejemplo, anticuerpos biespecíficos, anticuerpos triespecíficos) y fragmentos de anticuerpo siempre que presenten la actividad de unión a antígeno y/o proteína A y/o FcRn deseada.

Un "anticuerpo que se une al mismo epítopo" que un anticuerpo de referencia se refiere a un anticuerpo que bloquea la unión del anticuerpo de referencia a su antígeno en un ensayo competitivo en un 50 % o más y, a la inversa, el anticuerpo de referencia bloquea la unión del anticuerpo a su antígeno en un ensayo competitivo en un 50 % o más. En el presente documento se proporciona un ensayo de competencia ejemplar.

El término "región Fc asimétrica" indica un par de polipéptidos de la región Fc que tienen diferentes residuos de aminoácido en las posiciones correspondientes de acuerdo con el sistema de numeración del índice EU de Kabat.

El término "región Fc asimétrica con respecto a la unión a FcRn" indica una región Fc que consiste en dos cadenas polipeptídicas que tienen diferentes residuos de aminoácido en las posiciones correspondientes, con lo que las posiciones se determinan de acuerdo con el sistema de numeración del índice EU de Kabat, con lo que las diferentes posiciones afectan a la unión de la región Fc al receptor de Fc neonatal humano (FcRn). Para el propósito en el presente documento, las diferencias entre las dos cadenas polipeptídicas de la región Fc en una "región Fc asimétrica con respecto a la unión a FcRn" no incluyen las diferencias que se han introducido para facilitar la formación de regiones Fc heterodiméricas, por ejemplo, para la producción de anticuerpos biespecíficos. Estas diferencias también pueden ser asimétricas, es decir, las dos cadenas tienen diferencias en residuos de aminoácido no correspondientes de acuerdo con el sistema de numeración del índice EU de Kabat. Estas diferencias facilitan la heterodimerización y reducen la homodimerización. Los ejemplos de dichas diferencias son las sustituciones denominadas "botón en ojal" (véanse, por ejemplo, los documentos US 7.695.936 y US 2003/0078385). Se ha descubierto que las siguientes sustituciones de botón en ojal en las cadenas polipeptídicas individuales de una región Fc de un anticuerpo IgG de la subclase IgG1 incrementan la formación de heterodímeros: 1) Y407T en una cadena y T366Y en la otra cadena; 2) Y407A en una cadena y T366W en la otra cadena; 3) F405A en una cadena y T394W en la otra cadena; 4) F405W en una cadena y T394S en la otra cadena; 5) Y407T en una cadena y T366Y en la otra cadena; 6) T366Y y F405A en una cadena y T394W e Y407T en la otra cadena; 7) T366W y F405W en una cadena y T394s e Y407A en la otra cadena; 8) F405W e Y407A en una cadena y T366w y T394S en la otra cadena; y 9) T366W en una cadena y T366S, l368A e Y407V en la otra cadena, con lo que la última enumerada es especialmente adecuada. Además, los cambios que crean nuevos puentes disulfuro entre las dos cadenas polipeptídicas de la región Fc facilitan la formación de heterodímeros (véase, por ejemplo, el documento US2003/0078385). Se ha descubierto que las siguientes sustituciones que dan como resultado residuos de cisteína separados de manera apropiada para la formación de nuevos enlaces disulfuro intracatenarios en las cadenas polipeptídicas individuales de una región Fc de un anticuerpo IgG de la subclase IgG1 incrementan la formación de heterodímeros: Y349C en una cadena y S354C en la otra; Y349C en una cadena y E356C en la otra; Y349C en una cadena y E357C en la otra; L351C en una cadena y S354C en la otra; T394C en una cadena y E397C en la otra; o D399C en una cadena y K392C en la otra. Otros ejemplos de heterodimerización que facilita los cambios de aminoácidos son las denominadas "sustituciones de pares de carga" (véase, por ejemplo, el documento WO 2009/089004). Se ha descubierto que las siguientes sustituciones de pares de carga en las cadenas polipeptídicas individuales de una región Fc de un anticuerpo IgG de la subclase IgG1 incrementan la formación de heterodímeros: 1) K409D o K409E en una cadena y D399K o D399R en la otra cadena; 2) K392D o K392E en una cadena y D399K o D399R en la otra cadena; 3) K439D o K439E en una cadena y E356K o E356R en la otra cadena; 4) K370D o K370E en una cadena y E357K o E357R en la otra cadena; 5) K409D y K360D en una cadena más D399K y E356K en la otra cadena; 6) K409D y K370D en una cadena más D399K y E357K en la otra cadena; 7) K409D y K392D en una cadena más D399K, E356K y E357K en la otra cadena; 8) K409D y K392D en una cadena y D399K en la otra cadena; 9) K409D y K392D en una cadena y D399K y E356K en la otra cadena; 10) K409D y K392D en una cadena y D399K y D357K en la otra cadena; 11) K409D y K370D en una cadena y D399K y D357k en la otra cadena; 12) D399K en una cadena y K409D y K360D en la otra cadena; y 13) K409D y K439D en una cadena y D399K y E356K en la otra.

El término "unión (a un antígeno)" indica la unión de un anticuerpo a su antígeno en un ensayo in vitro, en un modo de realización en un ensayo de unión en el que el anticuerpo se une a una superficie y la unión del antígeno al anticuerpo se mide mediante resonancia de plasmón superficial (RPS). Unión significa una afinidad de unión (Kd) de 10-8 M o menos, en algunos modos de realización de 10-13 a 10-8 M, en algunos modos de realización de 10-13 a 10-9 M.

La unión se puede investigar mediante un ensayo BIAcore (GE Healthcare Biosensor AB, Uppsala, Suecia). La afinidad de la unión se define mediante los términos ka (constante de velocidad para la asociación del anticuerpo del complejo anticuerpo/antígeno), kd (constante de disociación) y Kd (kd/ka).

El término anticuerpo "quimérico" se refiere a un anticuerpo en el que una parte de la cadena pesada y/o ligera se deriva de una fuente o especie particular, mientras que el resto de la cadena pesada y/o ligera se deriva de una fuente o especie diferente.

El término "dominio CH2" indica la parte de un polipéptido de la cadena pesada de anticuerpo que se extiende aproximadamente desde la posición EU 231 a la posición EU 340 (sistema de numeración Eu de acuerdo con Kabat). En un modo de realización, un dominio CH2 tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 09: APELLGG PSVFLFPPKP KDTLMISRTP EVTCVWDVS HEDPEVKFNW YVDGVEVHNA KTKPREEQ E STYRWSVLT VLHQDWLNGK EYKCKVSNKA LPAPIEKTIS KAK

El término "dominio CH3" indica la parte de un polipéptido de la cadena pesada de anticuerpo que se extiende aproximadamente desde la posición EU 341 a la posición EU 446. En un modo de realización, el dominio CH3 tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 10: GQPREPQ VYTLPPSRDE LTKNQVSLTC LVKGFYPSDI AVEWESNGQP ENNYKTTPPV LDSDGSFFLY SKLTVDKSRW QQGNVFSCSV MHEALHNHYT QKSLSLSPG

La "clase" de un anticuerpo se refiere al tipo de dominio constante o región constante poseído por su cadena pesada. Existen cinco clases principales de anticuerpos: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, y varias de estas se pueden dividir además en subclases (isotipos), por ejemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgAi, e IgA2. Los dominios constantes de la cadena pesada que se corresponden con las diferentes clases de inmunoglobulinas se llaman a, ó, £, y y M, respectivamente.

El término "longitud similar" indica que dos polipéptidos comprenden el número idéntico de residuos de aminoácido o pueden tener una longitud diferente en uno o más y hasta 10 residuos de aminoácido como máximo. En un modo de realización, los polipéptidos de la región Fc comprenden el número idéntico de residuos de aminoácido o difieren en un número de desde 1 a 10 residuos de aminoácido. En un modo de realización, los polipéptidos de la región Fc comprenden el número idéntico de residuos de aminoácido o difieren en un número de desde 1 a 5 residuos de aminoácido. En un modo de realización, los polipéptidos de la región Fc comprenden el número idéntico de residuos de aminoácido o difieren en un número de desde 1 a 3 residuos de aminoácido.

El término "derivado de" indica que una secuencia de aminoácidos se deriva de una secuencia de aminoácidos original mediante la introducción de alteraciones en al menos una posición. Por tanto, una secuencia de aminoácidos derivada difiere de la secuencia de aminoácidos original correspondiente en al menos una posición correspondiente (numeración de acuerdo con el sistema de numeración del índice EU de Kabat para las regiones Fc del anticuerpo). En un modo de realización, una secuencia de aminoácidos derivada de una secuencia de aminoácidos original difiere en uno a quince residuos de aminoácido en las posiciones correspondientes. En un modo de realización, una secuencia de aminoácidos derivada de una secuencia de aminoácidos original difiere en uno a diez residuos de aminoácido en las posiciones correspondientes. En un modo de realización, una secuencia de aminoácidos derivada de una secuencia de aminoácidos original difiere en uno a seis residuos de aminoácido en las posiciones correspondientes. Del mismo modo, una secuencia de aminoácidos derivada tiene una alta identidad de secuencia de aminoácidos con su secuencia de aminoácidos original. En un modo de realización, una secuencia de aminoácidos derivada de una secuencia de aminoácidos original tiene un 80 % o más de identidad de secuencia de aminoácidos. En un modo de realización, una secuencia de aminoácidos derivada de una secuencia de aminoácidos original tiene un 90 % o más de identidad de secuencia de aminoácidos. En un modo de realización, una secuencia de aminoácidos derivada de una secuencia de aminoácidos original tiene un 95 % o más de identidad de secuencia de aminoácidos.

Las "funciones efectoras" se refieren a las actividades biológicas atribuibles a la región Fc de un anticuerpo, que varían con la clase de anticuerpo. Los ejemplos de funciones efectoras de anticuerpo incluyen: unión a C1q y citotoxicidad dependiente del complemento (CDC); unión al receptor de Fc; citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC); fagocitosis; regulación por disminución de receptores de la superficie celular (por ejemplo, el receptor de linfocitos B); y activación de linfocitos B.

Una "cantidad eficaz" de un agente, por ejemplo, una formulación farmacéutica, se refiere a una cantidad eficaz, en las dosificaciones y durante períodos de tiempo necesarios, para lograr el resultado terapéutico o profiláctico deseado.

El término "polipéptido de fusión Fc" indica una fusión de un dominio de unión (por ejemplo, un dominio de unión a antígeno tal como un anticuerpo monocatenario, o un polipéptido tal como un ligando de un receptor) con una región Fc de anticuerpo que presenta la actividad de unión deseada a la diana y/o a la proteína A y/o al FcRn.

El término "región Fc de origen humano" indica la región C terminal de una cadena pesada de inmunoglobulina de origen humano que contiene al menos una parte de la región de bisagra, el dominio CH2 y el dominio CH3. En un modo de realización, una región Fc de la cadena pesada de IgG humana se extiende de Cys226, o de Pro230, al extremo carboxílico de la cadena pesada. En un modo de realización, la región Fc tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 60. Sin embargo, la lisina C terminal (Lys447) de la región Fc puede estar presente o no. A menos que se especifique de otro modo en el presente documento, la numeración de los residuos de aminoácido en la región Fc o región constante se realiza de acuerdo con el sistema de numeración EU, también denominado índice EU, como se describe en Kabat, E.A. et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5.a ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991), NIH Publication 91 3242. La región Fc está compuesta por dos polipéptidos de la región Fc de la cadena pesada, que se pueden enlazar covalentemente entre sí por medio de residuos de cisteína de la región de bisagra que forman enlaces disulfuro interpolipeptídicos.

El término "FcRn" indica el receptor de Fc neonatal humano. El FcRn funciona rescatando a la IgG de la vía de degradación lisosómica, dando como resultado una depuración reducida y una semivida incrementada. El FcRn es una proteína heterodimérica que consiste en dos polipéptidos: una proteína similar al complejo principal de histocompatibilidad de clase I de 50 kDa (a-FcRn) y una microglobulina p2 (p2m) de 15 kDa. El FcRn se une con afinidad alta a la parte CH2-CH3 de la región Fc de la IgG. La interacción entre IgG y FcRn depende estrictamente del pH y se produce en una estequiometría 1:2, uniéndose una IgG a dos moléculas de FcRn por medio de sus dos cadenas pesadas (Huber, A.H., et al., J. Mol. Biol. 230 (1993) 1077-1083). La unión al FcRn se produce en el endosoma a pH ácido (pH < 6,5) y se libera IgG en la superficie celular neutra (pH de aproximadamente 7,4). La naturaleza sensible al pH de la interacción facilita la protección mediada por FcRn de las IgG pinocitadas en las células a partir de la degradación intracelular mediante la unión al receptor en el entorno ácido de los endosomas. A continuación, el FcRn facilita el reciclado de la IgG a la superficie celular y su posterior liberación en la circulación sanguínea tras la exposición del complejo FcRn-IgG al entorno de pH neutro fuera de la célula.

El término "parte de unión a FcRn de una región Fc" indica la parte de un polipéptido de la cadena pesada de un anticuerpo que se extiende aproximadamente desde la posición EU 243 a la posición EU 261 y aproximadamente desde la posición EU 275 a la posición EU 293 y aproximadamente desde la posición EU 302 a la posición EU 319 y aproximadamente desde la posición EU 336 a la posición EU 348 y aproximadamente desde la posición EU 367 a la posición EU 393 y la posición EU 408 y aproximadamente desde la posición EU 424 a la posición EU 440.

"Región estructural" o "FR" se refiere a residuos del dominio variable distintos de los residuos de la región hipervariable (HVR). La FR de un dominio variable consiste en general en cuatro dominios de FR: FR1, FR2, FR3 y FR4. En consecuencia, las secuencias de HVR y FR aparecen, en general, en la siguiente secuencia en VH (o VL): FR1-H1(L1 )-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4.

El término "anticuerpo de longitud completa" indica un anticuerpo que tiene una estructura sustancialmente similar a una estructura de anticuerpo natural o que tiene cadenas pesadas que contienen una región Fc como se define en el presente documento. Un anticuerpo de longitud completa puede comprender otros dominios, tales como, por ejemplo, un scFv o un scFab conjugado con una o más de las cadenas del anticuerpo de longitud completa. Estos conjugados también están englobados por el término anticuerpo de longitud completa.

Los términos "heterodímero" o "heterodimérico" indican una molécula que comprende dos cadenas polipeptídicas (por ejemplo, de longitud similar), en las que las dos cadenas polipeptídicas tienen una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un residuo de aminoácido diferente en una posición correspondiente, con lo que la posición correspondiente se determina de acuerdo con el índice EU de Kabat.

Los términos "homodímero" y "homodimérico" indican una molécula que comprende dos cadenas polipeptídicas de longitud similar, en las que las dos cadenas polipeptídicas tienen una secuencia de aminoácidos que es idéntica en las posiciones correspondientes, con lo que las posiciones correspondientes se determinan de acuerdo con el índice EU de Kabat.

Un anticuerpo o polipéptido de fusión de la región Fc de acuerdo con la divulgación puede ser homodimérico o heterodimérico con respecto a su región Fc que se determina con respecto a las mutaciones o propiedades objetivo. Por ejemplo, con respecto a la unión a FcRn y/o proteína A (es decir, la centrada en las propiedades) una región Fc (anticuerpo) es homodimérica (es decir, ambos polipéptidos de la región Fc de la cadena pesada comprenden estas mutaciones) con respecto a las mutaciones H310A, H433A e Y436A (estas mutaciones están en el centro de atención con respecto a la propiedad de unión a FcRn y/o proteína A del anticuerpo o polipéptido de fusión de la región Fc) pero al mismo tiempo es heterodimérica con respecto a las mutaciones Y349c , T366S, L368A e Y407V (estas mutaciones no son el centro de atención ya que estas mutaciones se dirigen a la heterodimerización de las cadenas pesadas y no a las propiedades de unión a FcRn/proteína A), así como a las mutaciones S354C y T366W, respectivamente (el primer conjunto está comprendido solo en el primer polipéptido de la región Fc mientras que el segundo conjunto está comprendido solo en el segundo polipéptido de la región Fc). Además, por ejemplo, un polipéptido de fusión de la región Fc o un anticuerpo de acuerdo con la divulgación puede ser heterodimérico con respecto a las mutaciones I253A, H310A, H433A, H435A e Y436A (es decir, estas mutaciones se dirigen todas a las propiedades de unión a FcRn y/o proteína A del polipéptido dimérico), es decir, un polipéptido de la región Fc comprende las mutaciones I253A, H310A y H435A, mientras que el otro polipéptido de la región Fc comprende las mutaciones H310A, H433A e Y436A.

Los términos "célula huésped", "línea de células huésped" y "cultivo de células huésped" se usan de manera intercambiable y se refieren a células en las que se ha introducido ácido nucleico exógeno, incluyendo la descendencia de dichas células. Las células huésped incluyen "transformantes" y "células transformadas" que incluyen la célula transformada primaria y la descendencia derivada de la misma independientemente del número de pases. La descendencia puede no ser completamente idéntica en contenido de ácido nucleico a una célula original, sino que puede contener mutaciones. La descendencia mutante que tiene la misma función o actividad biológica que la cribada o seleccionada en la célula transformada originalmente se incluye en el presente documento.

Un "anticuerpo humano" es uno que posee una secuencia de aminoácidos que corresponde con la de un anticuerpo producido por un humano o una célula humana o derivado de una fuente no humana que utiliza repertorios de anticuerpos humanos u otras secuencias que codifican anticuerpos humanos. Esta definición de un anticuerpo humano excluye específicamente un anticuerpo humanizado que comprende residuos de unión a antígeno no humanos.

Una "región estructural consenso humana" es una región estructural que representa los residuos de aminoácido que aparecen más comúnmente en una selección de secuencias estructurales de VL o VH de inmunoglobulina humana. En general, la selección de secuencias de VL o VH de inmunoglobulina humana es de un subgrupo de secuencias de dominio variable. En general, el subgrupo de secuencias es un subgrupo como en Kabat, E.A. et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5.a ed., Bethesda MD (1991), NIH Publication 91-3242, volúmenes 1-3. En un modo de realización, para el VL, el subgrupo es el subgrupo kappa I como en Kabat et al., supra. En un modo de realización, para el VH, el subgrupo es el subgrupo III como en Kabat et al., supra.

El término "polipéptido de la región Fc humana" indica una secuencia de aminoácidos que es idéntica a un polipéptido de la región Fc humana "natural". El término "polipéptido de la región Fc (humana) variante" indica una secuencia de aminoácidos que se deriva de un polipéptido de la región Fc humana "natural" en virtud de al menos una "alteración de aminoácidos". Una "región Fc humana" consiste en dos polipéptidos de la región Fc humana. Una "región Fc (humana) variante" consiste en dos polipéptidos de la región Fc, con lo que ambos pueden ser polipéptidos de la región Fc (humana) variante o uno es un polipéptido de la región Fc humana y el otro es un polipéptido de la región Fc (humana) variante.

En un modo de realización, el polipéptido de la región Fc humana tiene la secuencia de aminoácidos de un polipéptido de la región Fc de la IgG1 humana de SEQ ID NO: 60, o de un polipéptido de la región Fc de la IgG4 humana de SEQ ID NO: 63. En un modo de realización, el polipéptido de la región Fc (humana) variante se deriva de un polipéptido de la región Fc de SEQ ID NO: 60 o 63 y tiene al menos una mutación aminoacídica en comparación con el polipéptido de la región Fc humana de SEQ ID NO: 60 o 63. En un modo de realización, el polipéptido de la región Fc (humana) variante comprende/tiene de aproximadamente una a aproximadamente doce mutaciones aminoacídicas, y en un modo de realización de aproximadamente una a aproximadamente ocho mutaciones aminoacídicas. En un modo de realización, el polipéptido de la región Fc (humana) variante tiene al menos aproximadamente un 80 % de homología con un polipéptido de la región Fc humana de SEQ ID NO: 60 o 63. En un modo de realización, el polipéptido de la región Fc (humana) variante tiene menos de aproximadamente un 90 % de homología con un polipéptido de la región Fc humana de SEQ ID NO: 60 o 63. En un modo de realización, el polipéptido de la región Fc (humana) variante tiene al menos aproximadamente un 95 % de homología con un polipéptido de la región Fc humana de SEQ ID NO: 60 o 63.

El polipéptido de la región Fc (humana) variante derivado de un polipéptido de la región Fc humana de SEQ ID NO: 60 o 63 se define por las alteraciones de aminoácidos que están contenidas. Por tanto, por ejemplo, el término P329G indica un polipéptido de la región Fc (humana) variante derivado del polipéptido de la región Fc humana con la mutación de prolina a glicina en la posición aminoacídica 329 con respecto al polipéptido de la región Fc humana de SEQ ID NO: 60 o 63.

Como se usa en el presente documento, las posiciones aminoacídicas de todas las regiones y dominios constantes de la cadena pesada y ligera se numeran de acuerdo con el sistema de numeración de Kabat descrito en Kabat, et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5.a ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991) y se denomina "numeración de acuerdo con Kabat" en el presente documento. Específicamente el sistema de numeración de Kabat (véanse las páginas 647-660) de Kabat, et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5.a ed., Public Health Service, National Institutes de Health, Bethesda, MD (1991) se usa para el dominio constante de la cadena ligera CL del isotipo kappa y lambda y el sistema de numeración del índice EU de Kabat (véanse las páginas 661-723) se usa para los dominios constantes de la cadena pesada (CH1, bisagra, CH2 y CH3).

Un polipéptido de la región Fc de la IgG1 humana tiene la siguiente secuencia de aminoácidos:

DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPE VKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQ YN STYRVV S YLT YLHQDWLNGKEYK CKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGF YPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNV FSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK ^{(s e q id n o :} eo).

Un polipéptido de la región Fc derivada de la región Fc de la IgG1 humana con las mutaciones L234A, L235A tiene la siguiente secuencia de aminoácidos:

DKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPE VKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQ YN STYRVV S VLTVLHQDWLNGKEYK CKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGF YPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNV FSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK ^{(SEQ ID NO: 64).}

Un polipéptido de la región Fc derivada de la región Fc de la IgG1 humana con mutaciones Y349C, T366S, L368A e Y407V tiene la siguiente secuencia de aminoácidos:

DKTHTCPPCPAPELLGGP S VFLFPPKPKDTLMISRTPEVTC VVVD V SHEDPE VKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQ YNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYK CKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGF YPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNV FSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK ^{(s e q id n o : 65).}

Un polipéptido de la región Fc derivada de la región Fc de la IgG1 humana con mutaciones S354C, T366W tiene la siguiente secuencia de aminoácidos:

DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPE VKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQ YNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYK CKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKG F YP SDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLD SDGSFFL YSKLT VDKSRWQQGN VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK ^{(s e q id n o : 66).}

Un polipéptido de la región Fc derivada de la región Fc de la IgG1 humana con mutaciones L234A, L235A y mutaciones Y349C, T366S, L368A, Y407V tiene la siguiente secuencia de aminoácidos:

DKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPE VKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQ YNSTYRVV S VLTVLHQDWLNGKEYK CKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGF YPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNV FSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK ^{(SEQ id n o : 67).}

Un polipéptido de la región Fc derivada de la región Fc de la IgG1 humana con una L234A, L235A y mutaciones S354C, T366W tiene la siguiente secuencia de aminoácidos:

DKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVYDVSHEDPE VKFNW Y VDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVS VLTVLHQDWLNGKEYK CKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKG F YP SDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLD SDGSFFL YSKLT VDKSRWQQGN VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK ^{(SEQ id n o : 68).}

Un polipéptido de la región Fc derivada de la región Fc de la IgG1 humana con una mutación P329G tiene la siguiente secuencia de aminoácidos:

DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPE VKFNW Y VDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVS VLTVLHQDWLNGKEYK CKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKG FYP SDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLD SDGSFFL YSKLT VDKSRWQQGN VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK ^{(SEQ id n o : 69).}

Un polipéptido de la región Fc derivada de la región Fc de la IgG1 humana con mutaciones L234A, L235A y mutación P329G tiene la siguiente secuencia de aminoácidos:

DKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPE VKFNW Y VDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVS VLTVLHQDWLNGKEYK CKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKG FYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGN VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK ^{(SEQ id n o : 70).}

Un polipéptido de la región Fc derivada de la región Fc de la IgG1 humana con una mutación P239G y mutaciones Y349C, T366S, L368A, Y407V tiene la siguiente secuencia de aminoácidos:

DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPE VKFNW Y VDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVS VLTVLHQDWLNGKEYK CKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKG FYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGN VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK ^{(SEQ id n o : 71).}

Un polipéptido de la región Fc derivado de la región Fc de IgG1 humana con una mutación P329G y las mutaciones S354C, T366W tiene la siguiente secuencia de aminoácidos:

DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPE VKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYK CKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKG F YP SDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLD SDGSFFL YSKLT VDKSRWQQGN VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK ^{(SEQ id n o : 72).}

Un polipéptido de la región Fc derivada de la región Fc de la IgG1 humana con mutaciones L234A, L235A, P329G e Y349C, T366S, L368A, Y407V tiene la siguiente secuencia de aminoácidos:

DKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPE VKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQ YN STYRVV S VLTVLHQDWLNGKEYK CKV SNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQ VCTLPPSRDELTKNQ V SLSCAVKG FYP SDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLD SDGSFFL VSKLT VDKSRWQQGN VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK ^{(SEQ id n o : 73).}

Un polipéptido de la región Fc derivada de la región Fc de la IgG1 humana con mutaciones L234A, L235A, P329G y mutaciones S354C, T366W tiene la siguiente secuencia de aminoácidos:

DKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPE VKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVS VLTVLHQDWLNGKEYK CKV SNK ALGAPIEKTISK AKGQPREPQ VYTLPPCRDELTKNQ V SLW CL VKG FYP SDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLD SDGSFFL YSKLT VDKSRWQQGN VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK ^{(SEQ id n o : 74).}

Un polipéptido de la región Fc de la IgG4 humana tiene la siguiente secuencia de aminoácidos:

ESKYGPPCPSCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQED PEVQFNW YVDGVEVHNAKTKPREEQFNST YRVV S VLTVLHQDWLNGKEY KCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVK GFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGN VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK ^{(s e q id n o : 63).}

Un polipéptido de la región Fc derivada de la región Fc de la IgG4 humana con mutaciones S228P y L235E tiene la siguiente secuencia de aminoácidos:

ESKY GPPCPPCPAPEFEGGP S VFLFPPKPKDTLMISRTPEVTC VVVD VSQED PEVQFNW YVDGVEVHNAKTKPREEQFNST YRVV S VLTVLHQDWLNGKEY KCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVK GFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGN VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK ^{(s e q id n o : 75).}

Un polipéptido de la región Fc derivada de la región Fc de la IgG4 humana con mutaciones S228P, L235E y mutación P329G tiene la siguiente secuencia de aminoácidos:

ESKY GPPCPPCPAPEFEGGP S VFLFPPKPKDTLMISRTPEVTC VVVD VSQED PEYQFNW YVDGVEVHNAKTKPREEQFNST YRVV S YLTYLHQDWLNGKEY KCKVSNKGLGSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLYK GFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGN VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK ^{(SEQ id n o : 76).}

Un polipéptido de la región Fc derivada de la región Fc de la IgG4 humana con mutaciones S354C, T366W tiene la siguiente secuencia de aminoácidos:

ESKY GPPCP SCPAPEFLGGPS VFLFPPKPKDTLMISRTPEVTC VVVD VSQED PEV QFNW YVDGVE VHNAKTKPREEQFN S T YRVV S VLT VLHQDWLN GKE Y KCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCQEEMTKNQVSLWCLVK GF YPSDLAVEWESNGQPENNYKTTPP VLD SDGSFFL Y SRLTVDKSRW QEGN VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK ^{(SEQ id n o : 77).}

Un polipéptido de la región Fc derivada de la región Fc de la IgG4 humana con mutaciones Y349C, T366S, L368A, Y407V tiene la siguiente secuencia de aminoácidos:

ESKY GPPCPSCPAPEFLGGP S VFLFPPKPKDTLMISRTPEVTC VVVD VSQED PEVQFNW YVDGVEVHNAKTKPREEQFNST YRVV S VLTVLHQDWLNGKEY KCK V SNKGLP S SIEKTISK AKGQPREPQ VCTLPP SQEEMTKN Q V SL SC AVK GFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSRLTVDKSRWQEGN VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK ^{(SEQ id n o : 78).}

Un polipéptido de la región Fc derivada de la región Fc de la IgG4 humana con una S228P, L235E y mutaciones S354C, T366W tiene la siguiente secuencia de aminoácidos:

ESKYGPPCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQED PEVQFNW YVDGVE VHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEY KCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCQEEMTKNQVSLWCLVK GF YPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPP VLD SDGSFFL Y SRLTVDKSRW QEGN VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK ^{(SEQ id n o : 79).}

Un polipéptido de la región Fc derivada de la región Fc de la IgG4 humana con una S228P, L235E y mutaciones Y349C, T366S, L368A, Y407V tiene la siguiente secuencia de aminoácidos:

ESKYGPPCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQED PEVQFNW YVDGVE VHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEY KCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSQEEMTKNQVSLSCAVK GF YPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPP VLD SDGSFFL V SRLTVDKSRW QEGN VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK ^{(SEQ id n o : 80).}

Un polipéptido de la región Fc derivada de la región Fc de la IgG4 humana con una mutación P329G tiene la siguiente secuencia de aminoácidos:

ESKYGPPCPSCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCYVVDVSQED PEVQFNW YVDGVEVHNAKTKPREEQFN ST YRVVS VLTVLHQDWLNGKEY KCKVSNKGLGSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVK GFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGN VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK ^{(SEQ id n o : 81).}

Un polipéptido de la región Fc derivada de la región Fc de la IgG4 humana con una P239G y mutaciones Y349C, T366S, L368A, Y407V tiene la siguiente secuencia de aminoácidos:

ESKY GPPCP SCPAPEFLGGPS VFLFPPKPKDTLMISRTPEVTC VVVD VSQED PEV QFNW YVDGVEVHNAKTKPREEQFN S T YRVV S VLT VLHQDWLN GREY KCKVSNKGLGSSIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSQEEMTKNQVSLSCAVK GF YPSDLAVEWESNGQPENNYKTTPP VLD SDGSFFL V SRLTVDKSRW QEGN VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK ^{(SEQ id n o : 82).}

Un polipéptido de la región Fc derivada de la región Fc de la IgG4 humana con una P329G y mutaciones S354C, T366W tiene la siguiente secuencia de aminoácidos:

ESKY GPPCP SCPAPEFLGGPS VFLFPPKPKDTLMISRTPEVTC VVVD VSQED PEV QFNW YVDGVEVHNAKTKPREEQFN S T YRVV S VLT VLHQDWLN GKE Y KCKVSNKGLGSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCQEEMTKNQVSLWCLVK GF YPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPP VLD SDGSFFL Y SRLTVDKSRW QEGN VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK ^{(SEQ id n o : 83).}

Un polipéptido de la región Fc derivada de la región Fc de la IgG4 humana con una S228P, L235E, P329G y mutaciones Y349C, T366S, L368A, Y407V tiene la siguiente secuencia de aminoácidos:

ESKYGPPCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQED PEV QFNW YVDGVEVHNAKTKPREEQFN S T YRVV S VLT VLHQDWLN GKE Y KCKVSNKGLGSSIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSQEEMTKNQVSLSCAVK GF YPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPP VLD SDGSFFL V SRLTVDKSRW QEGN VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK ^{(SEQ id n o : 84).}

Un polipéptido de la región Fc derivada de la región Fc de la IgG4 humana con una S228P, L235E, P329G y mutaciones S354C, T366W tiene la siguiente secuencia de aminoácidos:

ESKYGPPCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQED PEV QFNW YVDGVEVHNAKTKPREEQFN S T YRVV S VLTVLHQDWLNGKEY KCKVSNKGLGSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCQEEMTKNQVSLWCLVK GFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGN VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK ^{(s e q id n o : 85).}

A continuación se muestra una alineación de diferentes regiones Fe humanas (numeración EU):

2 2

3 5

o o

IGG1 DKTHTCPPCP APELLGGPSV FLFPPKPKDTLMISRTPEVT CVWDVSHED

IGG2 ...VECPPCP APP.VAGPSV FLFPPKPKDTLMISRTPEVT CVWDVSHED

IGG3 DTPPPCPRCP APELLGGPSV FLFPPKPKDTLMISRTPEVT CVWDVSHED

IGG4 . . . PPCPSCP APEFLGGPSV FLFPPKPKDTLMISRTPEVT CVWDVSQED

-BISAGRA- |-- CH2 ------------------------------------

3

0

IGG1 PEVKFNWYVD GVEVHNAKTK PREEQYNSTYRWSVLTVLH QDWLNGKEYK

IGG2 PEVQFNWYVD GVEVHNAKTK PREEQFNSTFRWSVLTWH QDWLNGKEYK

IGG3 PEVQFKWYVD GVEVHNAKTK PREEQYNSTFRWSVLTVLH QDWLNGKEYK

IGG4 PEVQFNWYVD GVEVHNAKTK PREEQFNSTYRWSVLTVLH QDWLNGKEYK

-- CH2 -----------------------------------------------

3

5

0

IGG1 CKVSNKALPA PIEKTISKAK GQPREPQVYTLPPSRDELTK NQVSLTCLVK

IGG2 CKVSNKGLPA PIEKTISKTK GQPREPQVYTLPPSREEMTK NQVSLTCLVK

IGG3 CKVSNKALPA PIEKTISKTK GQPREPQVYTLPPSREEMTK NQVSLTCLVK

IGG4 CKVSNKGLPS SIEKTISKAK GQPREPQVYTLPPSQEEMTK NQVSLTCLVK

- - CH2 ------ CH2 -- | - - CH3 --------------------------

4

0

IGG1 GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDSDGSFFLYSKL TVDKSRWQQG

IGG2 GFYPSDISVE WESNGQPENN YKTTPPMLDSDGSFFLYSKL TVDKSRWQQG

IGG3 GFYPSDIAVE WESSGQPENNYNTTPPMLDS DGSFFLYSKL TVDKSRWQQG

IGG4 GFYPSDIAVE WESNGQPENNYKTTPPVLDS DGSFFLYSRL TVDKSRWQEG

-- CH3 -----------------------------------------------

4

7

IGG1 NVFSCSVMHE ALHNHYTQKSLSLSPGK

IGG2 NVFSCSVMHE ALHNHYTQKSLSLSPGK

IGG3 NIFSCSVMHE ALHNRFTQKSLSLSPGK

IGG4 NVFSCSVMHE ALHNHYTQKSLSLSLGK

- - CH3 --------------------- |

Un anticuerpo "humanizado" se refiere a un anticuerpo quimérico que comprende residuos de aminoácido de HVR no humanas y residuos de aminoácido de FR humanas. En determinados modos de realización, un anticuerpo humanizado comprenderá sustancialmente todos de al menos uno, y típicamente dos, dominios variables, en el que todas o sustancialmente todas las HVR (por ejemplo, las CDR) corresponden a las de un anticuerpo no humano y todas o sustancialmente todas las Fr corresponden a las de un anticuerpo humano. Un anticuerpo humanizado opcionalmente puede comprender al menos una parte de una región constante de anticuerpo derivada de un anticuerpo humano. Una "forma humanizada" de un anticuerpo, por ejemplo, un anticuerpo no humano, se refiere a un anticuerpo que se ha sometido a humanización.

El término "región hipervariable" o "HVR", como se usa en el presente documento, se refiere a cada una de las regiones de un dominio variable de anticuerpo que son hipervariables en secuencia ("regiones determinantes de la complementariedad" o "CDR") y forman bucles estructuralmente definidos ("bucles hipervariables") y/o contienen los residuos de contacto con antígeno ("contactos con antígeno"). En general, los anticuerpos comprenden seis HVR; tres en el VH (H1, H2, H3) y tres en el VL (L1, L2, L3). Las HVR como se indican en el presente documento incluyen

(a) los bucles hipervariables que se producen en los residuos de aminoácido 26-32 (L1), 50-52 (L2), 91-96 (L3), 26-32 (H1), 53-55 (H2) y 96-101 (H3) (Chothia, C. y Lesk, A.M., J. Mol. Biol. 196 (1987) 901-917);

(b) las CDR que se producen en los residuos de aminoácido 24-34 (L1), 50-56 (L2), 89-97 (L3), 31-35b (H1), 50 65 (H2) y 95-102 (H3) (Kabat E.A. et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5.a ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991), NIH Publication 91-3242);

(c) los contactos con antígeno que se producen en los residuos de aminoácido 27c-36 (L1), 46-55 (L2), 89-96 (L3), 30-35b (H1), 47-58 (H2) y 93-101 (H3) (MacCallum et al., J. Mol. Biol. 262: 732-745 (1996)); y

(d) combinaciones de (a), (b) y/o (c), incluyendo los residuos de aminoácido de HVR 46-56 (L2), 47-56 (L2), 48-56 (L2), 49-56 (L2), 26-35 (H1), 26-35b (H1), 49-65 (H2), 93-102 (H3) y 94-102 (H3).

En un modo de realización, los residuos de HVR comprenden aquellos identificados en otro lugar en la memoria descriptiva.

A menos que se indique de otro modo, los residuos de HVR y otros residuos en el dominio variable (por ejemplo, los residuos de FR) se numeran en el presente documento de acuerdo con el sistema de numeración del índice EU de Kabat (Kabat et al., supra.).

El término "IGF-1R", como se usa en el presente documento, se refiere a cualquier IGF-1R natural de cualquier fuente de vertebrado, incluyendo mamíferos tales como primates (por ejemplo, seres humanos) y roedores (por ejemplo, ratones y ratas), a menos que se indique de otro modo. El término engloba el IGF-1R no procesado "de longitud completa", así como cualquier forma de IGF-1R que resulte del procesamiento en la célula. El término también engloba variantes naturales de IGF-1R, por ejemplo, variantes de ayuste o variantes alélicas. La secuencia de aminoácidos de una IGF-1R humana se muestra en la SEQ ID NO: 11.

Un "individuo" o "sujeto" es un mamífero. Los mamíferos incluyen, pero no se limitan a, animales domésticos (por ejemplo, vacas, ovejas, gatos, perros y caballos), primates (por ejemplo, seres humanos y primates no humanos, tales como monos), conejos y roedores (por ejemplo, ratones y ratas). En determinados modos de realización, el individuo o sujeto es un ser humano.

Un anticuerpo "aislado" es uno que se ha separado de un componente de su entorno natural. En algunos modos de realización, se purifica un anticuerpo a más de un 95 % o 99 % de pureza, como se determina, por ejemplo, mediante electroforesis (por ejemplo, SDS-PAGE, isoelectroenfoque (IEF), electroforesis capilar) o cromatografía (por ejemplo, cromatografía de exclusión por tamaño o HPLC de intercambio iónico o de fase inversa). Para una revisión de los procedimientos para evaluar la pureza de los anticuerpos, véase, por ejemplo, Flatman, S. et al., J. Chrom. B 848 (2007) 79-87.

Un ácido nucleico "aislado" se refiere a una molécula de ácido nucleico que se ha separado de un componente de su entorno natural. Un ácido nucleico aislado incluye una molécula de ácido nucleico contenida en células que contienen habitualmente la molécula de ácido nucleico, pero la molécula de ácido nucleico está presente de forma extracromosómica o en una localización cromosómica que es diferente de su localización cromosómica natural.

Un "ácido nucleico aislado que codifica un anticuerpo anti-IGF-1R" se refiere a una o más moléculas de ácido nucleico que codifican las cadenas pesada y ligera del anticuerpo (o fragmentos de las mismas), incluyéndose dicha(s) molécula(s) de ácido nucleico en un único vector o vectores separados, y estando dicha(s) molécula(s) de ácido nucleico presente(s) en una o más localizaciones en una célula huésped.

El término "anticuerpo monoclonal", como se usa en el presente documento, se refiere a un anticuerpo obtenido de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos, es decir, los anticuerpos individuales que comprende la población son idénticos y/o se unen al mismo epítopo, excepto por posibles anticuerpos variantes, por ejemplo, que contienen mutaciones naturales o que surgen durante la producción de una preparación de anticuerpos monoclonales, estando presentes dichas variantes en general en cantidades insignificantes. A diferencia de las preparaciones de anticuerpos policlonales, que típicamente incluyen diferentes anticuerpos dirigidos frente a diferentes determinantes (epítopos), cada anticuerpo monoclonal de una preparación de anticuerpos monoclonales se dirige frente a un único determinante en un antígeno. Por tanto, el modificador "monoclonal" indica el carácter del anticuerpo como que se ha obtenido de una población sustancialmente homogénea de anticuerpos, y no se debe interpretar que requiera la producción del anticuerpo por ningún procedimiento particular. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales que se van a usar de acuerdo con la presente invención se pueden preparar por una variedad de técnicas, incluyendo, pero sin limitarse al procedimiento de hibridoma, procedimientos de ADN recombinante, procedimientos de presentación en fagos y procedimientos que utilizan animales transgénicos que contienen todos o parte de los locus de inmunoglobulina humana, describiéndose en el presente documento dichos procedimientos y otros procedimientos ejemplares para preparar anticuerpos monoclonales.

"Anticuerpos naturales" se refieren a moléculas de inmunoglobulina naturales con estructuras variables. Por ejemplo, los anticuerpos IgG naturales son glucoproteínas heterotetraméricas de aproximadamente 150.000 dalton, compuestas de dos cadenas ligeras idénticas y dos cadenas pesadas idénticas que se unen con enlaces disulfuro. Desde el extremo N al C, cada cadena pesada tiene una región variable (VH), también llamada dominio pesado variable o dominio variable de la cadena pesada, seguida de tres dominios constantes (CH1, CH2 y CH3).

De forma similar, desde el extremo N al C, cada cadena ligera tiene una región variable (VL), también llamada dominio ligero variable o dominio variable de la cadena ligera, seguida de un dominio ligero constante (CL). La cadena ligera de un anticuerpo se puede asignar a uno de dos tipos, llamados kappa (k) y lambda (A), en base a la secuencia de aminoácidos de su dominio constante.

El término "prospecto del envase" se usa para referirse a las instrucciones incluidas habitualmente en envases comerciales de productos terapéuticos que contienen información sobre las indicaciones, uso, dosificación, administración, politerapia, contraindicaciones y/o advertencias en relación con el uso de dichos productos terapéuticos.

"Porcentaje (%) de identidad de secuencia de aminoácidos" con respecto a una secuencia polipeptídica de referencia se define como el porcentaje de residuos de aminoácido en una secuencia candidata que son idénticos a los residuos de aminoácido en la secuencia polipeptídica de referencia, después de alinear las secuencias e introducir huecos, en caso necesario, para lograr el porcentaje máximo de identidad de secuencia, y sin considerar ninguna sustitución conservadora como parte de la identidad de secuencia. Se puede lograr la alineación para los propósitos de determinar el porcentaje de identidad de secuencia de aminoácidos de diversas formas que están dentro de la habilidad en la técnica, por ejemplo, usando un programa informático disponible públicamente, tal como el programa informático BLAST, BLAST-2, ALIGN o Megalign (DNASTAR). Los expertos en la técnica pueden determinar los parámetros apropiados para alinear secuencias, incluyendo cualquier algoritmo necesario para lograr la máxima alineación sobre la longitud completa de las secuencias que se comparan. Sin embargo, para los propósitos en el presente documento, los valores de % de identidad de secuencia de aminoácidos se generan usando el programa informático de comparación de secuencias ALIGN-2. El programa informático de comparación de secuencias ALIGN-2 se creó por Genentech, Inc., y el código fuente se ha presentado con la documentación de usuario en la Oficina de Derechos de Autor de EE. UU., Washington D.C., 20559, donde está registrado con el n.° de registro de derechos de autor de EE. UU. TXU510087. El programa ALIGN-2 está disponible públicamente de Genentech, Inc., South San Francisco, California, o se puede compilar a partir del código fuente. El programa ALIGN-2 se debe compilar para su uso en un sistema operativo UNIX, incluyendo UNIX V4,0D digital. Todos los parámetros de comparación de secuencias se establecen por el programa ALIGN-2 y no varían.

En situaciones donde se emplea ALIGN-2 para las comparaciones de secuencias de aminoácidos, el % de identidad de secuencia de aminoácidos de una secuencia de aminoácidos A dada con respecto a, con o frente a una secuencia de aminoácidos B dada (que, de forma alternativa, se puede parafrasear como una secuencia de aminoácidos A dada que tiene o comprende un determinado % de identidad de secuencia de aminoácidos con respecto a, con o frente a una secuencia de aminoácidos B dada) se calcula como sigue:

100 veces la fracción X/Y

donde X es el número de residuos de aminoácido puntuados como coincidencias idénticas por el programa de alineación de secuencias ALIGN-2 en esa alineación del programa de A y B, y donde Y es el número total de residuos de aminoácido en B. Se apreciará que si la longitud de la secuencia de aminoácidos A no es igual a la longitud de la secuencia de aminoácidos B, el % de identidad de secuencia de aminoácidos de A con respecto a B no igualará el % de identidad de secuencia de aminoácidos de B con respecto a A. A menos que se establezca específicamente de otro modo, todos los valores de % de identidad de secuencia de aminoácidos usados en el presente documento se obtienen como se describe en el párrafo inmediatamente precedente usando el programa informático ALIGN-2.

El término "formulación farmacéutica" se refiere a una preparación que está en tal forma que permite que la actividad biológica de un ingrediente activo contenido en la misma sea eficaz, y que no contiene componentes adicionales que sean inaceptablemente tóxicos para un sujeto al que se le administraría la formulación.

Un "vehículo farmacéuticamente aceptable" se refiere a un ingrediente en una formulación farmacéutica, distinto de un ingrediente activo, que no sea tóxico para un sujeto. Un vehículo farmacéuticamente aceptable incluye, pero no se limita a, un tampón, excipiente, estabilizante o conservante.

El término "conector peptídico" como se usa en el presente documento indica un péptido con secuencias de aminoácidos, que está en un modo de realización de origen sintético. En un modo de realización, el conector peptídico es un péptido con una secuencia de aminoácidos con una longitud de al menos 30 aminoácidos, en un modo de realización con una longitud de 32 a 50 aminoácidos. En un modo de realización, el conector peptídico es un péptido con una secuencia de aminoácidos con una longitud de 32 a 40 aminoácidos. En un modo de realización, el conector peptídico es (GxS)n con G = glicina, S = serina, (x = 3, n = 8, 9 o 10) o (x = 4 y n = 6, 7 u 8), en un modo de realización con x = 4, n = 6 o 7, en un modo de realización con x = 4, n = 7. En un modo de realización, el conector peptídico es (G4S)6G2.

El término "anticuerpo recombinante" indica todos los anticuerpos (quiméricos, humanizados y humanos) que se preparan, expresan, crean o aíslan por medios recombinantes. Esto incluye anticuerpos aislados de una célula huésped tal como una célula NS0 o CHO o de un animal (por ejemplo, un ratón) que es transgénico para los genes de inmunoglobulina humana o anticuerpos expresados usando un vector de expresión recombinante transfectado en una célula huésped. Dichos anticuerpos recombinantes tienen regiones variables y constantes en forma reordenada. Los anticuerpos recombinantes como se informa en el presente documento se pueden someter a hipermutación somática in vivo. Por tanto, las secuencias de aminoácidos de las regiones VH y VL de los anticuerpos recombinantes son secuencias que, aunque derivan de y se relacionan con las secuencias de VH y VL de la línea germinal humana, pueden no existir de forma natural dentro del repertorio de la línea germinal de anticuerpos humanos in vivo.

Como se usa en el presente documento, "tratamiento" (y variaciones gramaticales del mismo, tales como "tratar" o "que trata") se refiere a la intervención clínica en un intento de alterar la evolución natural del individuo que se está tratando, y que se puede realizar para la profilaxis o bien durante la evolución de una patología clínica. Los efectos deseables del tratamiento incluyen, pero no se limitan a, prevención de la aparición o recidiva de la enfermedad, alivio de los síntomas, disminución de cualquier consecuencia patológica directa o indirecta de la enfermedad, prevención de metástasis, disminución de la tasa de progresión de la enfermedad, mejora o atenuación del estado de la enfermedad y remisión o mejora del pronóstico. En algunos modos de realización, se usan anticuerpos o polipéptidos de fusión de la región Fc de acuerdo con la invención para retrasar el desarrollo de una enfermedad o para ralentizar la progresión de una enfermedad.

El término "valente" como se usa en la presente solicitud indica la presencia de un número especificado de sitios de unión en una molécula (de anticuerpo). Como tales, los términos "bivalente", "tetravalente" y "hexavalente" indican la presencia de dos sitios de unión, cuatro sitios de unión y seis sitios de unión, respectivamente, en una molécula (de anticuerpo). Los anticuerpos biespecíficos de acuerdo con la invención son "bivalentes" en un modo de realización preferente.

El término "región variable" o "dominio variable" se refiere al dominio de una cadena pesada o ligera de anticuerpo que está implicado en la unión del anticuerpo a su antígeno. Los dominios variables de la cadena pesada y cadena ligera (VH y VL, respectivamente) de un anticuerpo tienen, en general, estructuras similares, comprendiendo cada dominio cuatro regiones estructurales (FR) y tres regiones hipervariables (HVR) (véase, por ejemplo, Kindt, T.J., etal., Kuby Immunology, 6.a ed., W.H. Freeman and Co., N.Y. (2007), página 91). Un dominio VH o Vl único puede ser suficiente para conferir especificidad de unión a antígeno. Además, los anticuerpos que se unen a un antígeno particular se pueden aislar usando un dominio VH o VL de un anticuerpo que se une al antígeno para cribar una colección de dominios VL o VH complementarios, respectivamente. Véanse, por ejemplo, Portolano, S. et al., J. Immunol. 150 (1993) 880-887; Clackson, T. et al., Nature 352 (1991) 624-628).

El término "enfermedad vascular ocular" incluye, pero no se limita a, síndromes neovasculares intraoculares tales como retinopatía diabética, edema macular diabético, retinopatía del prematuro, glaucoma neovascular, oclusiones de la vena retiniana, oclusiones de la vena retiniana central, degeneración macular, degeneración macular senil, retinitis pigmentaria, proliferación angiomatosa retiniana, telangectasia macular, retinopatía isquémica, neovascularización del iris, neovascularización intraocular, neovascularización corneal, neovascularización retiniana, neovascularización coroidea y degeneración retiniana (véase, por ejemplo, Garner, A., Vascular diseases, en: Pathobiology of ocular disease, A dynamic approach, Garner, A. y Klintworth, G.K. (eds.), 2.a edición, Marcel Dekker, Nueva York (1994), págs. 1625-1710).

El término "vector", como se usa en el presente documento, se refiere a una molécula de ácido nucleico que puede propagar otro ácido nucleico al que se enlaza. El término incluye el vector como una estructura de ácido nucleico autorreplicante, así como el vector incorporado en el genoma de una célula huésped en la que se ha introducido. Determinados vectores pueden dirigir la expresión de los ácidos nucleicos a los que se enlazan de forma funcional. Dichos vectores se denominan en el presente documento "vectores de expresión".

El término "VEGF", como se usa en el presente documento, se refiere al factor de crecimiento endotelial vascular humano (VEGF/VEGF-A), el factor de crecimiento de células endoteliales vasculares humano de 165 aminoácidos (aminoácidos 27-191 de la secuencia precursora del VEGF165 humano: SEQ ID NO: 30; los aminoácidos 1-26 representan el péptido señal), y las isoformas del factor de crecimiento de células endoteliales vasculares relacionadas 121, 189 y 206, como lo describen Leung, D.W. et al., Science 246 (1989) 1306-1309; Houck et al., Mol. Endocrin 5 (1991) 1806-1814; Keck, P.J. et al., Science 246 (1989) 1309-1312 y Connolly, D.T. et al., J. Biol. Chem. 264 (1989) 20017-20024; conjuntamente con las formas alélicas y procesadas naturales de esos factores de crecimiento. VEGF participa en la regulación de la angiogénesis normal y anómala y en la neovascularización asociada con tumores y trastornos intraoculares (Ferrara, N. et al., Endocrin. Rev. 18 (1997) 4-25; Berkman, R.A. et al., J. Clin. Invest. 91 (1993) 153-159; Brown, L.F. et al., Human Pathol. 26 (1995) 86-91; Brown, L.F. et al., Cancer Res. 53 (1993) 4727-4735; Mattern, J. et al., Brit. J. Cancer. 73 (1996) 931-934; y Dvorak, H.F. et al., Am. J. Pathol. 146 (1995) 1029-1039). VEGF es una glucoproteína homodimérica que se ha aislado de varias fuentes e incluye varias isoformas. VEGF muestra una actividad mitogénica altamente específica para las células endoteliales.

El término "con (la) mutación IHH-AAA" como se usa en el presente documento se refiere a la combinación de las mutaciones I253A (Ile253Ala), H310A (His310Ala) y H435A (His435Ala) y el término "con (la) mutación HHY-AAA" como se usa en el presente documento se refiere a la combinación de las mutaciones H310A (His310Ala), H433A (His433Ala) e Y436A (Tyr436Ala) y el término "con (la) mutación YTE" como se usa en el presente documento se refiere a la combinación de mutaciones M252Y (Met252Tyr) S254T (Ser254Thr) y T256E (Thr256Glu) en la región de la cadena pesada constante de las subclases IgG1 o IgG4, en las que la numeración es de acuerdo con el índice EU de Kabat.

El término "con (las) mutaciones P329G LALA" como se usa en el presente documento se refiere a la combinación de las mutaciones L234A (Leu234Ala), L235A (Leu235Ala) y P329G (Pro329Gly) en la región de la cadena pesada constante de la subclase IgG1, en las que la numeración es de acuerdo con el índice EU de Kabat. El término "con (la) mutación SPLE" como se usa en el presente documento se refiere a la combinación de las mutaciones S228P (Ser228Pro) y L235E (Leu235Glu) en la región de la cadena pesada constante de la subclase IgG4, en las que la numeración es de acuerdo con el índice EU de Kabat. El término "con (la) mutación SPLE y P239G" como se usa en el presente documento se refiere a la combinación de las mutaciones S228P (Ser228Pro), L235E (Leu235Glu) y P329G (Pro329Gly) en la región de la cadena pesada constante de la subclase IgG4, en las que la numeración es de acuerdo con el índice EU de Kabat.

II. La invención actual

La invención se basa, al menos en parte, en el descubrimiento de que la unión a FcRn de un anticuerpo o polipéptido de fusión de la región Fc se puede modificar alterando residuos de aminoácido en posiciones no correspondientes en los polipéptidos de la región Fc individuales, porque estas alteraciones actúan conjuntamente en la modificación de la unión a FcRn. Los anticuerpos y los polipéptidos de fusión de la región Fc de acuerdo con la invención son útiles, por ejemplo, para el tratamiento de enfermedades en las que se requieren tiempos de retención sistémica adaptados individualmente.

A. El receptor de Fc neonatal (FcRn)

El receptor de Fc neonatal (FcRn) es importante para el destino metabólico de los anticuerpos de la clase IgG in vivo. El FcRn funciona rescatando a la IgG natural de la vía de degradación lisosómica, dando como resultado una depuración reducida y una semivida incrementada. Es una proteína heterodimérica que consiste en dos polipéptidos: una proteína similar al complejo principal de histocompatibilidad de clase I de 50 kDa (a-FcRn) y una microglobulina p2 (p2m) de 15 kDa. El FcRn se une con afinidad alta a la parte CH2-CH3 de la región Fc de un anticuerpo de la clase IgG. La interacción entre un anticuerpo de la clase IgG y el FcRn depende del pH y se produce en una estequiometría 1:2, es decir, una molécula de anticuerpo IgG puede interactuar con dos moléculas de FcRn por medio de sus dos polipéptidos de la región Fc de la cadena pesada (véase, por ejemplo, Huber, A.H., et al., J. Mol. Biol. 230 (1993) 1077-1083).

Por tanto, las propiedades/características de la unión al FcRn in vitro de las IgG son indicativas de sus propiedades farmacocinéticas in vivo en la circulación sanguínea.

En la interacción entre el FcRn y la región Fc de un anticuerpo de la clase IgG participan diferentes residuos de aminoácido del dominio CH2 y CH3 de la cadena pesada. Los residuos de aminoácido que interactúan con el FcRn se localizan aproximadamente entre la posición Eu 243 y la posición EU 261, aproximadamente entre la posición EU 275 y la posición EU 293, aproximadamente entre la posición EU 302 y la posición EU 319, aproximadamente entre la posición EU 336 y la posición EU 348, aproximadamente entre la posición EU 367 y la posición EU 393, en la posición EU 408, y aproximadamente entre la posición EU 424 y la posición EU 440. Más específicamente, los siguientes residuos de aminoácido de acuerdo con la numeración EU de Kabat están implicados en la interacción entre la región Fc y el FcRn: F243, P244, P245 P, K246, P247, K248, D249, T250, L251, M252, 1253, S254, R255, T256, P257, E258, V259, T260, C261, F275, N276, W277, Y278, V279, D280, V282, E283, V284, H285, N286, A287, K288, T289, K290, P291, R292, E293, V302, V303, S304, V305, L306, T307, V308, L309, H310, Q311, D312, W313, L314, N315, G316, K317, E318, Y319, 1336, S337, K338, A339, K340, G341, Q342, P343, R344, E345, P346, Q347, V348, C367, V369, F372, Y373, P374, S375, D376, 1377, A378, V379, E380, W381, E382, S383, N384, G385, Q386, P387, E388, N389, Y391, T393, S408, S424, C425, S426, V427, M428, H429, E430, A431, L432, H433, N434, H435, Y436, T437, Q438, K439 y S440. Los estudios de mutagénesis dirigida por sitio han demostrado que los sitios de unión críticos en la región Fc de las IgG para FcRn son histidina 310, histidina 435 e isoleucina 253 y, en menor medida, histidina 433 y tirosina 436 (véase, por ejemplo, Kim, J.K., et al., Eur. J. Immunol. 29 (1999) 2819-2825; Raghavan, M., et al., Biochem. 34 (1995) 14649-14657; Medesan, C., et al., J. Immunol. 158 (1997) 2211-2217).

Los procedimientos para incrementar la unión de IgG al FcRn se han realizado mediante la mutación de IgG en diversos residuos de aminoácido: treonina 250, metionina 252, serina 254, treonina 256, treonina 307, ácido glutámico 380, metionina 428, histidina 433 y asparagina 434 (véase Kuo, T.T., et al., J. Clin. Immunol. 30 (2010) 777-789).

En algunos casos, se desean anticuerpos con una semivida reducida en la circulación sanguínea. Por ejemplo, los fármacos para aplicación intravítrea deben tener una semivida prolongada en el ojo y una semivida corta en la circulación del paciente. Dichos anticuerpos también tienen la ventaja de una exposición incrementada a un sitio de enfermedad, por ejemplo, en el ojo.

Se conocen diferentes mutaciones que influyen en la unión al FcRn y, con ello, en la semivida en la circulación sanguínea. Se han identificado residuos de la región Fc críticos para la interacción Fc de ratón-FcRn de ratón mediante mutagénesis dirigida por sitio (véase, por ejemplo, Dall'Acqua, W.F., et al. J. Immunol 169 (2002) 5171 5180). Los residuos 1253, H310, H433, N434 y H435 (numeración e U de acuerdo con Kabat) están implicados en la interacción (Medesan, C., et al., Eur. J. Immunol. 26 (1996) 2533-2536; Firan, M., et al., Int. Immunol. 13 (2001) 993-1002; Kim, J.K., et al., Eur. J. Immunol. 24 (1994) 542-548). Se descubrió que los residuos 1253, H310 y H435 eran críticos para la interacción de Fc humana con FcRn murino (Kim, J.K., et al., Eur. J. Immunol. 29 (1999) 2819 2825). Los residuos M252Y, S254T, T256E se han descrito por Dall'Acqua et al. para mejorar la unión a FcRn mediante estudios de interacción proteína-proteína (Dall'Acqua, W.F., et al. J. Biol. Chem. 281 (2006) 23514 23524). Los estudios del complejo Fc humana-FcRn humano han demostrado que los residuos 1253, S254, H435 e Y436 son cruciales para la interacción (Firan, M., et al., Int. Immunol. 13 (2001) 993-1002; Shields, R.L., et al., J. Biol. Chem. 276 (2001) 6591-6604). En Yeung, Y.A., et al. (J. Immunol. 182 (2009) 7667-7671) se ha informado de y examinado diversos mutantes de los residuos 248 a 259 y 301 a 317 y 376 a 382 y 424 a 437. Las mutaciones ejemplares y su efecto sobre la unión al FcRn se enumeran en la siguiente tabla.

Tabla

Se ha descubierto que una mutación unilateral en un polipéptido de la región Fc es suficiente para debilitar significativamente la unión a un receptor de Fc. Cuantas más mutaciones se introducen en la región Fc, más débil se vuelve la unión al FcRn. Pero las mutaciones asimétricas unilaterales no son suficientes para inhibir completamente la unión al FcRn. Son necesarias mutaciones en ambos lados para inhibir completamente la unión al FcRn.

Por tanto, la región Fc de la clase IgG (humana) variante es un heterodímero y el emparejamiento del primer polipéptido de la región Fc (de la cadena pesada) y el segundo polipéptido de la región Fc (de la cadena pesada) para formar una región Fc funcional da como resultado la formación de un heterodímero.

Los resultados de una genomanipulación simétrica de una región Fc de la IgG1 para influir en la unión al FcRn se muestran en la tabla siguiente (alineación de mutaciones y tiempo de retención en una columna de cromatografía de afinidad del FcRn).

Tabla

Los tiempos de retención inferiores a 3 minutos corresponden a la ausencia de unión, ya que la sustancia se encuentra en el flujo continuo (pico de vacío).

La mutación única H310A es la mutación simétrica más silenciosa para eliminar cualquier unión al FcRn.

La mutación única simétrica I253A y H435A da como resultado una variación relativa del tiempo de retención de 0,3-0,4 min. Esto se puede considerar, en general, una unión no detectable.

La mutación única Y436A da como resultado una fuerza de interacción detectable en la columna de afinidad del FcRn. Sin estar ligados a esta teoría, esta mutación podría tener una semivida mediada por el FcRn que se puede diferenciar de una interacción cero, tal como la combinación de las mutaciones I253A, H310A y H435a (mutación IHH-AAA).

Los resultados obtenidos con un anticuerpo anti-HER2 modificado simétricamente se presentan en la tabla siguiente (véase el documento WO 2006/031370 como referencia).

Tabla

El efecto de la introducción de mutaciones asimétricas que afectan a la unión a FcRn en la región Fc se ha ejemplificado con un anticuerpo biespecífico anti-VEGF/ANG2 (véase a continuación) ensamblado usando la tecnología "botón en ojal" (véanse, por ejemplo, el documento US 7.695.936, el documento US 2003/0078385; mutaciones en la "cadena botón": s 354c /t 366W, mutaciones en la "cadena ojal": Y349C/T366S/L368A/Y407V). El efecto de las mutaciones introducidas asimétricamente en la unión a FcRn se puede determinar fácilmente usando un procedimiento de cromatografía de afinidad por FcRn (véase la figura 9 y la tabla siguiente). Los anticuerpos que tienen una elución posterior de la columna de afinidad por FcRn, es decir, que tienen un tiempo de retención más largo en la columna de afinidad por FcRn, tienen una semivida más larga in vivo, y viceversa.

Tabla

Las mutaciones asimétricas IHH-AAA y LLL-DDD (mutación LLL-DDD = L251D, L314D y L432D) muestran una unión más débil que el anticuerpo original o natural correspondiente.

La mutación simétrica HHY-AAA (= combinación de las mutaciones H310A, H433A e Y436A) da como resultado una región Fc que ya no se une al FcRn humano, mientras que la unión a la proteína A se mantiene (véase Figuras 11, 12, 13 y 14).

El efecto de la introducción de mutaciones asimétricas que afectan a la unión a FcRn en la región Fc se ha ejemplificado además con un anticuerpo biespecífico anti-VEGF/ANG2 (VEGF/ANG2), un anticuerpo monoespecífico anti-IGF-1 R (IGF-1R) y un anticuerpo de longitud completa con fusiones en el extremo C de ambas cadenas pesadas (fusión) ensambladas usando la tecnología "botón en ojal" para permitir la introducción de mutaciones asimétricas (véanse, por ejemplo, el documento US 7.695.936, el documento US 2003/0078385; mutaciones en la "cadena botón": S354C/t 366W, mutaciones en la "cadena ojal": Y349C/T366S/L368A/Y407V). El efecto de las mutaciones introducidas asimétricamente sobre la unión a FcRn y la unión a la proteína A se puede determinar fácilmente usando un procedimiento de cromatografía de afinidad por FcRn, un procedimiento de cromatografía de afinidad por proteína A y procedimientos basados en RPS (véase la siguiente tabla).

La combinación de mutaciones I253A, H310A, H435A o L251D, L314D, L432D o L251S, L314S, L432S da como resultado una pérdida de la unión a la proteína A, mientras que la combinación de las mutaciones I253A, H310A, H435A o H310A, H433A, Y436A, o L251D, L314D, L432D da como resultado una pérdida de la unión al receptor de Fc neonatal humano.

Un aspecto de la invención es un anticuerpo o polipéptido de fusión de la región Fc que comprende la región Fc de la clase IgG humana variante de acuerdo con la invención.

La región Fc en el polipéptido de fusión de la región Fc confiere las características descritas anteriormente a su pareja de fusión. La pareja de fusión puede ser cualquier molécula que tenga una actividad biológica cuya semivida in vivo se reduzca o incremente, es decir, cuya semivida in vivo se defina claramente y se adapte individualmente para su aplicación prevista. Los polipéptidos de fusión de la región Fc pueden comprender, por ejemplo, una región Fc de la clase IgG (humana) variante de acuerdo con la invención y una proteína receptora que se une a una diana que incluye un ligando, tal como, por ejemplo, el polipéptido de fusión de la región Fc del TNFR (TNFR = receptor del factor de necrosis tumoral humano), o un polipéptido de fusión de la región Fc del IL-1R (IL-1R = receptor de interleucina humana 1), o polipéptidos de fusión de la región Fc del VEGFR (VEGFR = receptor del factor de crecimiento endotelial vascular humano), o polipétidos de fusión de la región Fc del ANG2R (ANG2R = receptor de angiopoyetina 2 humana).

Los polipéptidos de fusión de la región Fc pueden comprender, por ejemplo, una región Fc de la clase IgG (humana) variante de acuerdo con la invención y un fragmento de anticuerpo que se une a una diana, incluyendo, tal como, por ejemplo, un fragmento Fab de anticuerpo, scFv (véase, por ejemplo, Nat. Biotechnol. 23 (2005) 1126-1136), o anticuerpos de dominio (dAb) (véanse, por ejemplo, los documentos WO 2004/058821, WO 2003/002609).

Los polipéptidos de fusión de la región Fc pueden comprender, por ejemplo, una región Fc de la clase IgG (humana) variante de acuerdo con la invención y un ligando del receptor (natural o bien artificial).

B. Anticuerpos ejemplares

En un aspecto, la invención proporciona anticuerpos aislados que tienen una unión al FcRn modificada, es decir, estos anticuerpos se unen al FcRn humano con una afinidad mayor o menor que un anticuerpo que no tiene mutaciones que afecten a la unión al FcRn.

En un modo de realización, el anticuerpo comprende una región Fc que comprende un primer polipéptido de la región Fc y un segundo polipéptido de la región Fc,

en la que

a) el primer polipéptido de la región Fc y el segundo polipéptido de la región Fc se derivan del mismo polipéptido de la región Fc humana, y

b) el primer polipéptido de la región Fc se ha modificado de forma que su secuencia de aminoácidos difiere de la secuencia de aminoácidos del segundo polipéptido de la región Fc al menos en una posición correspondiente de acuerdo con el sistema de numeración del índice EU de Kabat, y el segundo polipéptido de la región Fc se ha modificado de forma que su secuencia de aminoácidos difiere de la secuencia de aminoácidos del primer polipéptido de la región Fc al menos en una posición correspondiente de acuerdo con el sistema de numeración del índice EU de Kabat, con lo que la posición modificada en el primer polipéptido de la región Fc y la posición modificada en el segundo polipéptido de la región Fc son diferentes, y

c) la región Fc tiene una afinidad diferente por el receptor de Fc neonatal humano en comparación con una región Fc que comprende como primer y segundo polipéptido de la región Fc el polipéptido de la región Fc humana de a) (es decir, que tiene los mismos residuos de aminoácido que el polipéptido de la región Fc humana de a) en las posiciones correspondientes de acuerdo con el sistema de numeración del índice EU de Kabat),

en la que

También un aspecto de la presente invención es un anticuerpo biespecífico bivalente con unión a FcRn suprimida que comprende un primer sitio de unión a antígeno que se une específicamente a VEGF humano y un segundo sitio de unión a antígeno que se une específicamente a ANG-2 humana,

en el que

i) el primer sitio de unión a antígeno que se une específicamente a VEGF comprende, en el dominio variable de la cadena pesada, una región CDR3H de SEQ ID NO: 14, una región CDR2H de Se Q ID NO: 15 y una región CDR1H de SEQ ID NO: 16 y, en el dominio variable de la cadena ligera, una región CDR3L de SEQ ID NO: 17, una región CDR2L de SEQ ID NO: 18 y una región CDR1L de SEQ ID NO: 19, y

ii) el segundo sitio de unión a antígeno que se une específicamente a ANG-2 comprende, en el dominio variable de la cadena pesada, una región CDR3H de SEQ ID NO: 22, una región CDR2H de SEQ ID NO: 23 y una región CDR1H de s Eq ID NO: 24 y, en el dominio variable de la cadena ligera, una región CDR3L de Se Q ID NO: 25, una región CDR2L de SEQ ID NO: 26 y una región CDR1L de SEQ ID NO: 27, y

iii) el anticuerpo biespecífico comprende una región Fc que comprende un primer polipéptido de la región Fc y un segundo polipéptido de la región Fc,

en el que

en el que el primer polipéptido de la región Fc difiere en una o dos de las mutaciones seleccionadas del grupo H310A, H433a e Y436A (numeración de acuerdo con el sistema de numeración del índice EU de Kabat) del segundo polipéptido de la región Fc y el segundo polipéptido de la región Fc difiere en una o dos de las mutaciones seleccionadas del grupo que comprende las mutaciones I253A, H310A, H433A, H435A e Y436A (numeración de acuerdo con el sistema de numeración del índice EU de Kabat) del primer polipéptido de la región Fc de modo que todas las mutaciones H310A, H433A e Y436A están comprendidas en la región Fc de la clase IgG,

en el que

iv) iv) el primer polipéptido de la región Fc de la clase IgG original es un polipéptido de la región Fc de la IgG4 humana y el segundo polipéptido de la región Fc de la clase IgG original es un polipéptido de la región Fc de la IgG4 humana, o

En un modo de realización, la región Fc de la clase IgG (humana) variante es una región Fc heterodimérica de la clase IgG.

En un modo de realización de todos los aspectos, el emparejamiento del primer polipéptido de la región Fc y el segundo polipéptido de la región Fc para formar una región Fc (funcional) da como resultado la formación de un heterodímero.

En un modo de realización, el anticuerpo biespecífico se caracteriza por que

i) el primer sitio de unión a antígeno que se une específicamente a VEGF comprende, como dominio variable de la cadena pesada VH, una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 20 y, como dominio variable de la cadena ligera VL, una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 21, y

ii) el segundo sitio de unión a antígeno que se une específicamente a ANG-2 comprende, como dominio variable de la cadena pesada VH, una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 28 y, como dominio variable de la cadena ligera VL, una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 29.

Todavía otros aspectos de la invención son una formulación farmacéutica que comprende el anticuerpo biespecífico, la formulación farmacéutica para su uso en el tratamiento de enfermedades vasculares oculares, el uso del anticuerpo biespecífico para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de enfermedades vasculares oculares, un procedimiento de tratamiento de un paciente que padece enfermedades vasculares oculares mediante la administración del anticuerpo biespecífico a un paciente que necesite dicho tratamiento. En un modo de realización, el anticuerpo biespecífico o la formulación farmacéutica que comprende el anticuerpo biespecífico se administra por medio de aplicación intravítrea.

En el presente documento se divulgan vectores de expresión que contienen el ácido nucleico como se informa en el presente documento que pueden expresar el ácido nucleico en una célula huésped procariota o eucariota, y células huésped que contienen dichos vectores para la producción recombinante de un anticuerpo biespecífico como se informa en el presente documento.

En el presente documento se divulga una célula huésped procariota o eucariota que comprende un vector como se informa en el presente documento.

En el presente documento se divulga además un procedimiento para la producción de un anticuerpo biespecífico de acuerdo con la invención, caracterizado por expresar un ácido nucleico como se informa en el presente documento en una célula huésped procariota o eucariota y recuperar el anticuerpo biespecífico de la célula o el sobrenadante de cultivo celular. En el presente documento se divulga un procedimiento para la preparación de un anticuerpo biespecífico de acuerdo con la invención que comprende las etapas de

a) transformar una célula huésped con vectores que comprenden moléculas de ácido nucleico que codifican el anticuerpo;

b) cultivar la célula huésped en condiciones que permitan la síntesis del anticuerpo; y

c) recuperar el anticuerpo del cultivo.

Los anticuerpos de acuerdo con la invención tienen propiedades altamente valiosas debido a sus modificaciones específicas en la región Fc que provocan un beneficio para un paciente que padece enfermedades vasculares oculares. Muestran una alta estabilidad en el entorno intravítreo y una lenta difusión desde el ojo (en comparación con los fragmentos de anticuerpos más pequeños sin una región de la cadena pesada constante), donde se localiza y trata la enfermedad real (por lo que, potencialmente, la pauta de tratamiento se puede mejorar en comparación con anticuerpos no de tipo IgG como, por ejemplo, fragmentos Fab y (Fab)2). Los anticuerpos de acuerdo con la invención se eliminan bastante rápidamente del suero (lo que es altamente deseable para reducir los posibles efectos secundarios derivados de la exposición sistémica). Sorprendentemente, los anticuerpos de VEGF-ANG-2 VEGFang2-0016 (con mutación IHH-AAA) también muestran una viscosidad más baja (véase la figura 2) (en comparación con las versiones sin la combinación de las mutaciones I253A, H310A y H435A en la región constante) y, por lo tanto, son especialmente útiles para la aplicación intravítrea a través de agujas finas durante el tratamiento de enfermedades oculares (para dicha aplicación típicamente se usan agujas finas y la alta viscosidad hace que una aplicación apropiada sea bastante difícil). La viscosidad más baja también permite formulaciones de concentración más alta.

También sorprendentemente, los anticuerpos de VEGF-ANG-2 VEGFang2-0016 (con mutación IHH-AAA) muestran una tendencia más baja a la agregación (véase la figura 4) durante el almacenamiento (en comparación con las versiones sin la combinación de las mutaciones I253A, H310A y H435A en la región Fc) que es crítica para la aplicación intravítrea en el ojo (ya que una agregación en el ojo puede dar lugar a complicaciones durante dicho tratamiento).

Los anticuerpos biespecíficos de acuerdo con la invención muestran una buena eficacia en la inhibición de enfermedades vasculares.

En determinados modos de realización, los anticuerpos biespecíficos de acuerdo con la invención debido a sus modificaciones específicas en la región constante (por ejemplo, P329G LALA) muestran propiedades valiosas como la ausencia de unión de/a los receptores de Fc gamma, lo que reduce el riesgo de efectos secundarios como la trombosis y/o la muerte celular no deseada (debido a, por ejemplo, ADCC).

En un modo de realización, el anticuerpo biespecífico de acuerdo con la invención es bivalente.

En un modo de realización, el anticuerpo biespecífico bivalente de acuerdo con la invención se caracteriza por comprender

a) la cadena pesada y la cadena ligera de un primer anticuerpo de longitud completa que se une específicamente a VEGF, y

b) la cadena pesada modificada y la cadena ligera modificada de un segundo anticuerpo de longitud completa que se une específicamente a ANG-2, en el que los dominios constantes CL y CH1 se reemplazan entre sí.

Este formato de anticuerpo biespecífico bivalente para el anticuerpo biespecífico que se une específicamente al factor de crecimiento endotelial vascular humano (VEGF) y a la angiopoyetina-2 humana (ANG-2) se describe en el documento WO 2009/080253 (incluyendo los dominios CH3 modificados "botón en ojal"). Los anticuerpos basados en este formato de anticuerpo biespecífico bivalente se denominan CrossMab.

En un modo de realización, dicho anticuerpo biespecífico bivalente se caracteriza por comprender

a) como cadena pesada del primer anticuerpo de longitud completa la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 38 y como cadena ligera del primer anticuerpo de longitud completa la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 40, y

b) como cadena pesada modificada del segundo anticuerpo de longitud completa la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 39 y como cadena ligera modificada del segundo anticuerpo de longitud completa la secuencia de aminoácidos de Se Q ID NO: 41.

a) como cadena pesada del primer anticuerpo de longitud completa la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 34 y como cadena ligera del primer anticuerpo de longitud completa la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 36, y

b) como cadena pesada modificada del segundo anticuerpo de longitud completa la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 35 y como cadena ligera modificada del segundo anticuerpo de longitud completa la secuencia de aminoácidos de Se Q ID NO: 37.

a) como cadena pesada del primer anticuerpo de longitud completa la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 42 y como cadena ligera del primer anticuerpo de longitud completa la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 44, y

b) como cadena pesada modificada del segundo anticuerpo de longitud completa la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 43 y como cadena ligera modificada del segundo anticuerpo de longitud completa la secuencia de aminoácidos de Se Q ID NO: 45.

a) como cadena pesada del primer anticuerpo de longitud completa la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 90 y como cadena ligera del primer anticuerpo de longitud completa la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 40, y

b) como cadena pesada modificada del segundo anticuerpo de longitud completa la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 91 y como cadena ligera modificada del segundo anticuerpo de longitud completa la secuencia de aminoácidos de Se Q ID NO: 41.

a) como cadena pesada del primer anticuerpo de longitud completa la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 88 y como cadena ligera del primer anticuerpo de longitud completa la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 36, y

b) como cadena pesada modificada del segundo anticuerpo de longitud completa la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 89 y como cadena ligera modificada del segundo anticuerpo de longitud completa la secuencia de aminoácidos de Se Q ID NO: 37.

a) como cadena pesada del primer anticuerpo de longitud completa la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 92 y como cadena ligera del primer anticuerpo de longitud completa la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 44, y

b) como cadena pesada modificada del segundo anticuerpo de longitud completa la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 93 y como cadena ligera modificada del segundo anticuerpo de longitud completa la secuencia de aminoácidos de Se Q ID NO: 45.

En consecuencia, en un modo de realización de la divulgación, el anticuerpo biespecífico bivalente comprende un primer sitio de unión a antígeno que se une específicamente a VEGF humano y un segundo sitio de unión a antígeno que se une específicamente a ANG-2 humana, caracterizado por comprender las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 38, de SEQ ID NO: 39, de SEQ ID NO: 40 y de SEQ ID NO: 41.

En consecuencia, en un modo de realización de la divulgación, el anticuerpo biespecífico bivalente comprende un primer sitio de unión a antígeno que se une específicamente a VEGF humano y un segundo sitio de unión a antígeno que se une específicamente a ANG-2 humana, caracterizado por comprender las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 34, de SEQ ID NO: 35, de SEQ ID NO: 36 y de SEQ ID NO: 37.

En consecuencia, en un modo de realización de la divulgación, el anticuerpo biespecífico bivalente comprende un primer sitio de unión a antígeno que se une específicamente a VEGF humano y un segundo sitio de unión a antígeno que se une específicamente a ANG-2 humana, caracterizado por comprender las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 42, de SEQ ID NO: 43, de SEQ ID NO: 44 y de SEQ ID NO: 45.

En consecuencia, en un modo de realización de la divulgación, el anticuerpo biespecífico bivalente comprende un primer sitio de unión a antígeno que se une específicamente a VEGF humano y un segundo sitio de unión a antígeno que se une específicamente a ANG-2 humana, caracterizado por comprender las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 90, de SEQ ID NO: 91, de SEQ ID NO: 40 y de SEQ ID NO: 41.

En consecuencia, en un modo de realización de la divulgación, el anticuerpo biespecífico bivalente comprende un primer sitio de unión a antígeno que se une específicamente a VEGF humano y un segundo sitio de unión a antígeno que se une específicamente a ANG-2 humana, caracterizado por comprender las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 88, de SEQ ID NO: 89, de SEQ ID NO: 36 y de SEQ ID NO: 37.

En consecuencia, en un modo de realización de la divulgación, el anticuerpo biespecífico bivalente comprende un primer sitio de unión a antígeno que se une específicamente a VEGF humano y un segundo sitio de unión a antígeno que se une específicamente a ANG-2 humana, caracterizado por comprender las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 92, de SEQ ID NO: 93, de SEQ ID NO: 44 y de SEQ ID NO: 45.

En otro modo de realización, el anticuerpo biespecífico se caracteriza por comprender

b) la cadena pesada y la cadena ligera de un segundo anticuerpo de longitud completa que se une específicamente a ANG-2, en el que el extremo N de la cadena pesada está conectado al extremo C de la cadena ligera por medio de un conector peptídico.

Este formato de anticuerpo biespecífico bivalente para este anticuerpo biespecífico que se une específicamente al factor de crecimiento endotelial vascular humano (VEGF) y a la angiopoyetina-2 humana (ANG-2) se describe en el documento WO 2011/117330 (incluyendo los dominios CH3 modificados "botón en ojal"). Los anticuerpos basados en este formato de anticuerpo biespecífico bivalente se denominan Fab de cadena única de un solo brazo (OAscFab).

a) como cadena pesada del primer anticuerpo de longitud completa la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 46 y como cadena ligera del primer anticuerpo de longitud completa la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 48, y

b) como cadena pesada del segundo anticuerpo de longitud completa conectada a la cadena ligera del segundo anticuerpo de longitud completa a través de un conector peptídico, la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 47.

a) como cadena pesada del primer anticuerpo de longitud completa la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 49 y como cadena ligera del primer anticuerpo de longitud completa la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 51, y

b) como cadena pesada del segundo anticuerpo de longitud completa conectada a la cadena ligera del segundo anticuerpo de longitud completa a través de un conector peptídico, la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 50.

a) como cadena pesada del primer anticuerpo de longitud completa la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 94 y como cadena ligera del primer anticuerpo de longitud completa la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 48, y

b) como cadena pesada del segundo anticuerpo de longitud completa conectada a la cadena ligera del segundo anticuerpo de longitud completa a través de un conector peptídico, la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 95.

a) como cadena pesada del primer anticuerpo de longitud completa la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 96 y como cadena ligera del primer anticuerpo de longitud completa la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 51, y

b) como cadena pesada del segundo anticuerpo de longitud completa conectada a la cadena ligera del segundo anticuerpo de longitud completa a través de un conector peptídico, la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 97.

En un modo de realización, el dominio variable de la cadena pesada (VH) del anticuerpo y el dominio variable de la cadena ligera (VL) del anticuerpo de la cadena pesada y ligera del segundo anticuerpo de longitud completa se estabilizan adicionalmente mediante la introducción de un enlace disulfuro entre las siguientes posiciones: posición 44 del dominio variable de la cadena pesada y posición 100 del dominio variable de la cadena ligera (numeración de acuerdo con Kabat (Kabat, E.A., et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5.a ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)). Las técnicas para introducir puentes disulfuro para la estabilización se describen, por ejemplo, en el documento W o 94/029350, Rajagopal, V. et al., Prot. Eng. 10 (1997) 1453-1459, Kobayashi et al., Nuclear Medicine & Biology 25 (1998) 387-393, y Schmidt, M. et al., Oncogene 18 (1999) 1711-1721.

En consecuencia, en un modo de realización de la divulgación, el anticuerpo biespecífico bivalente comprende un primer sitio de unión a antígeno que se une específicamente a VEGF humano y un segundo sitio de unión a antígeno que se une específicamente a ANG-2 humana, caracterizado por comprender las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 46, de SEQ ID NO: 47 y de SEQ ID NO: 48.

En consecuencia, en un modo de realización de la divulgación, el anticuerpo biespecífico bivalente comprende un primer sitio de unión a antígeno que se une específicamente a VEGF humano y un segundo sitio de unión a antígeno que se une específicamente a ANG-2 humana, caracterizado por comprender las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 49, de SEQ ID NO: 50 y de SEQ ID NO: 51.

En consecuencia, en un modo de realización de la divulgación, el anticuerpo biespecífico bivalente comprende un primer sitio de unión a antígeno que se une específicamente a VEGF humano y un segundo sitio de unión a antígeno que se une específicamente a ANG-2 humana, caracterizado por comprender las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 94, de SEQ ID NO: 95 y de SEQ ID NO: 48.

En consecuencia, en un modo de realización de la divulgación, el anticuerpo biespecífico bivalente comprende un primer sitio de unión a antígeno que se une específicamente a VEGF humano y un segundo sitio de unión a antígeno que se une específicamente a ANG-2 humana, caracterizado por comprender las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 96, de SEQ ID NO: 97 y de SEQ ID NO: 51.

En un modo de realización, los dominios CH3 del anticuerpo biespecífico bivalente de acuerdo con la invención se alteran por la tecnología "botón en ojal" que se describe en detalle con varios ejemplos, por ejemplo, en el documento WO 96/027011, Ridgway J.B., et al., Protein Eng. 9 (1996) 617-621, y Merchant, A.M., et al., Nat. Biotechnol. 16 (1998) 677-681. En este procedimiento, las superficies de interacción de los dos dominios CH3 se alteran para incrementar la heterodimerización de ambas cadenas pesadas que contienen estos dos dominios CH3. Cada uno de los dos dominios CH3 (de las dos cadenas pesadas) puede ser el "botón", mientras que el otro es el "ojal". La introducción de un puente disulfuro estabiliza adicionalmente los heterodímeros (Merchant, A.M, et al., Nature Biotech. 16 (1998) 677-681, Atwell, S., et al. J. Mol. Biol. 270 (1997) 26-35) e incrementa el rendimiento. En un modo de realización preferente de todos los aspectos, los anticuerpos biespecíficos se caracterizan por que el dominio CH3 de una cadena pesada y el dominio CH3 de la otra cadena pesada se encuentran cada uno en una interfase que comprende una interfase original entre los dominios CH3 del anticuerpo,

en el que la interfase se altera para promover la formación del anticuerpo biespecífico, en el que la alteración se caracteriza por que:

a) se altera el dominio CH3 de una cadena pesada,

de modo que dentro de la interfase original el dominio CH3 de una cadena pesada que se encuentra con la interfase original del dominio CH3 de la otra cadena pesada dentro del anticuerpo biespecífico,

se reemplaza un residuo de aminoácido con un residuo de aminoácido que tiene un mayor volumen de cadena lateral, generando de este modo una protuberancia dentro de la interfase del dominio CH3 de una cadena pesada que se puede situar en una cavidad dentro de la interfase del dominio CH3 de la otra cadena pesada,

y

b) se altera el dominio CH3 de la otra cadena pesada,

de modo que dentro de la interfase original del segundo dominio CH3 que se encuentra con la interfase original del primer dominio CH3 dentro del anticuerpo biespecífico,

se reemplaza un residuo de aminoácido con un residuo de aminoácido que tiene un volumen de cadena lateral más pequeño, generando de este modo una cavidad dentro de la interfase del segundo dominio CH3 dentro de la que se puede situar una protuberancia dentro de la interfase del primer dominio CH3.

Por tanto, el anticuerpo de acuerdo con la invención está en un modo de realización preferente caracterizado por que

el dominio CH3 de la cadena pesada del anticuerpo de longitud completa de a) y el dominio CH3 de la cadena pesada del anticuerpo de longitud completa de b) se encuentran cada uno en una interfase que comprende una alteración en la interfase original entre los dominios CH3 del anticuerpo,

en el que

i) en el dominio CH3 de una cadena pesada

y en el que

ii) en el dominio CH3 de la otra cadena pesada

En un modo de realización preferente, el residuo de aminoácido que tiene un mayor volumen de cadena lateral se selecciona del grupo que consiste en arginina (R), fenilalanina (F), tirosina (Y), triptófano (W).

En un modo de realización preferente, el residuo de aminoácido que tiene un volumen de cadena lateral más pequeño se selecciona del grupo que consiste en alanina (A), serina (S), treonina (T), valina (V).

En un modo de realización, ambos dominios CH3 se alteran además mediante la introducción de un residuo de cisteína (C) en las posiciones correspondientes de cada dominio CH3, de modo que se puede formar un puente disulfuro entre ambos dominios CH3.

En un modo de realización, el anticuerpo biespecífico comprende una mutación T366W en el dominio CH3 de la "cadena botón" y las mutaciones T366S, L368A e Y407V en el dominio CH3 de la "cadena ojal". También se puede usar un puente disulfuro intercatenario adicional entre los dominios CH3 (Merchant, A.M, et al., Nature Biotech 16 (1998) 677-681), por ejemplo, introduciendo una mutación Y349C o S354C en el dominio CH3 de la "cadena botón" y una mutación Y439C o E356C o S354C en el dominio CH3 de la "cadena ojal".

En un modo de realización, el anticuerpo biespecífico de acuerdo con la invención comprende la mutación S354C y la mutación T366W en uno de los dos dominios CH3 y la mutación Y349C, y las mutaciones T366S, L368A e Y407V en el otro de los dos dominios CH3 (la mutación Y349C adicional en un dominio CH3 y la mutación S354C adicional en el otro dominio CH3 que forma un puente disulfuro intercatenario) (numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat (Kabat, E.A., et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5.a ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)).

Pero también se pueden usar de forma alternativa o adicionalmente otras tecnologías de botón en ojal, como se describe por el documento EP 1 870 459 A1. Por tanto, otro ejemplo para el anticuerpo biespecífico son las mutaciones R409D y K370E en el dominio CH3 de la "cadena botón" y las mutaciones D399K y E357K en el dominio CH3 de la "cadena ojal" (numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat (Kabat, E.A., et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5.a ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)).

En otro modo de realización, el anticuerpo biespecífico comprende una mutación T366W en el dominio CH3 de la "cadena botón" y las mutaciones T366S, L368A e Y407V en el dominio CH3 de la "cadena ojal" y, adicionalmente, las mutaciones R409D, K370E en el dominio CH3 de la "cadena botón" y las mutaciones D399K, E357K en el dominio CH3 de la "cadena ojal".

En un modo de realización, el anticuerpo biespecífico comprende las mutaciones Y349C, T366W en uno de los dos dominios CH3 y las mutaciones S354C, T366S, L368A e Y407V en el otro de los dos dominios CH3, o el anticuerpo biespecífico comprende las mutaciones Y349C, T366W en uno de los dos dominios CH3 y las mutaciones S354C, T366S, L368A e Y407V en el otro de los dos dominios CH3 y, adicionalmente, las mutaciones R409D, K370E en el dominio CH3 de la "cadena botón" y las mutaciones D399K, E357K en el dominio CH3 de la "cadena ojal".

En un modo de realización, el anticuerpo biespecífico comprende las mutaciones S354C, T366W en uno de los dos dominios CH3 y las mutaciones Y349C, T366S, L368A, Y407V en el otro de los dos dominios CH3, o el anticuerpo biespecífico comprende las mutaciones S354C, T366W en uno de los dos dominios CH3 y las mutaciones Y349C, T366S, L368A e Y407V en el otro de los dos dominios CH3 y, adicionalmente, las mutaciones R409D, K370E en el dominio CH3 de la "cadena botón" y las mutaciones D399K, E357K en el dominio CH3 de la "cadena ojal".

En un modo de realización, el anticuerpo biespecífico de acuerdo con la invención se caracteriza por tener una o más de las siguientes propiedades:

- muestra una concentración sérica más baja en comparación con un anticuerpo biespecífico correspondiente sin las mutaciones descritas en iii) (96 horas después de la aplicación intravítrea en ratones, que son deficientes en FcRn de ratón, pero transgénicos hemicigóticos para FcRn humano) (determinado en ensayos como se describe en el ejemplo 6),

- muestra una concentración similar (factor de 0,8 a 1,2) en lisados del ojo derecho completo en comparación con un anticuerpo biespecífico correspondiente sin las mutaciones descritas en iii) (en ratones, que son deficientes en FcRn de ratón, pero transgénicos hemicigóticos para FcRn humano, 96 horas después de la aplicación

intravítrea en el ojo derecho) (determinado en ensayos como se describe en el ejemplo 6),

- no muestra unión al receptor de Fc neonatal humano.

En un modo de realización, el anticuerpo bivalente biespecífico se caracteriza por comprender un primer polipéptido

de la región Fc y un segundo polipéptido de la región Fc en el que

a) el primer y el segundo polipéptido de la región Fc comprenden la mutación Y436A, o

b) el primer

el segundo polipéptido de la región Fc comprenden las mutaciones I253A, H310A y H435A, o c) el primer

el segundo polipéptido de la región Fc comprenden las mutaciones H310A, H433A y Y436A, o d) el primer

el segundo polipéptido de la región Fc comprenden las mutaciones L251D, L314D y L432D, o e) el primer

el segundo polipéptido de la región Fc comprenden las mutaciones L251S, L314S y L432S, o f) el primer polipéptido de la región Fc comprende la mutación Y436A y el segundo polipéptido de la región Fc

comprende

- las mutaciones I253A, H310A y H435A, o

- las mutaciones H310A, H433A e Y436A, o

- las mutaciones L251D, L314D y L432D, o

- las mutaciones L251S, L314S y L432S,

o

g) el primer polipéptido de la región Fc comprende las mutaciones I253A, H310A y H435A y el segundo polipéptido

de la región Fc comprende

- las mutaciones H310A, H433A e Y436A, o

- las mutaciones L251D, L314D y L432D, o

- las mutaciones L251S, L314S y L432S,

o

h) el primer polipéptido de la región Fc comprende las mutaciones H310A, H433A e Y436A y el segundo polipéptido

de la región Fc comprende

a) las mutaciones L251D, L314D y L432D, o

b) las mutaciones L251S, L314S y L432S,

o

i) el primer polipéptido de la región Fc comprende las mutaciones L251D, L314D y L432D y el segundo polipéptido

de la región Fc comprende a) las mutaciones L251S, L314S y L432S.

En un modo de realización, el anticuerpo biespecífico bivalente se caracteriza por comprender

un primer sitio de unión a antígeno que se une específicamente a VEGF humano y un segundo sitio de unión a

antígeno que se une específicamente a ANG-2 humana, caracterizado por que

i) el primer sitio de unión a antígeno comprende, como dominio variable de la cadena pesada (VH), la secuencia

de aminoácidos de SEQ ID NO: 20 y, como dominio variable de la cadena ligera (VL), la secuencia de aminoácidos

de SEQ ID NO: 21, y

ii) el segundo sitio de unión a antígeno comprende, como dominio variable de la cadena pesada (VH), la secuencia

de aminoácidos de SEQ ID NO: 28 y, como dominio variable de la cadena ligera (VL), la secuencia de aminoácidos

de SEQ ID NO: 29, y

iii) el anticuerpo biespecífico comprende una región Fc que comprende un primer y un segundo polipéptido de la región Fc, ambos de subclase IgG1 humana o IgG4 humana (es decir, derivados de origen humano) que comprenden una o dos de las mutaciones seleccionadas del grupo de H310A, H433A, Y436A (numeración de acuerdo con el sistema de numeración del índice EU de Kabat) en el primer polipéptido de la región Fc y una o dos de las mutaciones seleccionadas del grupo que comprende las mutaciones I253A, H310A, H433A, H435a e Y436A (numeración de acuerdo con el sistema de numeración del índice EU de Kabat) en el segundo polipéptido de la región Fc, de modo que todas las mutaciones en el primer y el segundo polipéptido de la región Fc cuando se toman conjuntamente dan como resultado que las mutaciones H310A, H433A e Y436AA estén comprendidas en la región Fc,

y por tener una o más de las siguientes propiedades

- muestra una concentración sérica más baja en comparación con el anticuerpo biespecífico correspondiente sin las mutaciones descritas en iii) (96 horas después de la aplicación intravítrea en ratones, que son deficientes en FcRn de ratón, pero transgénicos hemicigóticos para FcRn humano) (determinado en ensayos como se describe en el ejemplo 6),

- muestra una concentración similar (factor de 0,8 a 1,2) en lisados del ojo derecho completo en comparación con un anticuerpo biespecífico correspondiente sin las mutaciones descritas en iii) (en ratones, que son deficientes en FcRn de ratón, pero transgénicos hemicigóticos para FcRn humano, 96 horas después de la aplicación intravítrea en el ojo derecho) (determinado en ensayos como se describe en el ejemplo 6),

- no muestra unión al receptor de Fc neonatal humano.

En un modo de realización, el anticuerpo biespecífico se caracteriza por comprender un primer sitio de unión a antígeno que se une específicamente a VEGF humano y un segundo sitio de unión a antígeno que se une específicamente a ANG-2 humana, caracterizado por que

i) el primer sitio de unión a antígeno comprende como dominio variable de la cadena pesada (VH) la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 20 con 1, 2 o 3 sustituciones aminoacídicas, y como dominio variable de la cadena ligera (VL) la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 21 con 1, 2 o 3 sustituciones aminoacídicas, y

ii) el segundo sitio de unión a antígeno comprende como dominio variable de la cadena pesada (VH) la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 28 con 1,2 o 3 sustituciones aminoacídicas, y como dominio variable de la cadena ligera (VL) la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 29 con 1, 2 o 3 sustituciones aminoacídicas, y

iii) el anticuerpo biespecífico comprende una región Fc que comprende un primer y un segundo polipéptido de la región Fc, ambos de subclase IgG1 humana o IgG4 humana (es decir, derivados de origen humano) que comprenden una o dos de las mutaciones seleccionadas del grupo de H310A, H433A, Y436A (numeración de acuerdo con el sistema de numeración del índice EU de Kabat) en el primer polipéptido de la región Fc y una o dos de las mutaciones seleccionadas del grupo que comprende las mutaciones I253A, H310A, H433A, H435a e Y436A (numeración de acuerdo con el sistema de numeración del índice EU de Kabat) en el segundo polipéptido de la región Fc, de modo que todas las mutaciones en el primer y el segundo polipéptido de la región Fc cuando se toman conjuntamente dan como resultado las mutaciones H310A, H433A e Y436AA,

y por tener una o más de las siguientes propiedades

- no muestra unión al receptor de Fc neonatal humano.

Un sitio de unión a antígeno del anticuerpo biespecífico como se informa en el presente documento contiene seis regiones determinantes de la complementariedad (CDR) que contribuyen en diversos grados a la afinidad del sitio de unión por su antígeno. Existen tres CDR de dominios variables de la cadena pesada (CDRH1, CDRH2 y CDRH3) y tres CDR de dominios variables de la cadena ligera (CDRL1, CDRL2 y CDRL3). La extensión de las CDR y regiones estructurales (FR) se determina por comparación con una base de datos compilada de secuencias de aminoácidos en la que las regiones se han definido de acuerdo con la variabilidad entre las secuencias.

En un modo de realización de todos los aspectos, el anticuerpo no se une específicamente al FcRn humano. En un modo de realización de todos los aspectos, el anticuerpo además se une específicamente a la proteína A estafilocócica.

En un modo de realización de todos los aspectos, el primer polipéptido comprende además las mutaciones Y349C, T366S, L368A e Y407V ("ojal") y el segundo polipéptido comprende las mutaciones S354C y T366W ("botón").

En un modo de realización de todos los aspectos, el primer polipéptido comprende además las mutaciones S354C, T366S, L368A e Y407V ("ojal") y el segundo polipéptido comprende las mutaciones Y349C y T366W ("botón").

En un modo de realización de todos los aspectos, los polipéptidos de la región Fc son de la subclase IgG1 humana. En un modo de realización, el primer polipéptido de la región Fc y el segundo polipéptido de la región Fc comprenden además las mutaciones L234A y L235A. En un modo de realización, el primer polipéptido de la región Fc y el segundo polipéptido de la región Fc comprenden además la mutación P329G.

En un modo de realización de todos los aspectos, los polipéptidos de la región Fc son de la subclase IgG4 humana. En un modo de realización, el primer polipéptido de la región Fc y el segundo polipéptido de la región Fc comprenden además las mutaciones S228P y L235E. En un modo de realización, el primer polipéptido de la región Fc y el segundo polipéptido de la región Fc comprenden además la mutación P329G.

El anticuerpo de acuerdo con la invención se produce preferentemente por medios recombinantes. Por tanto, se divulga en el presente documento un ácido nucleico que codifica el anticuerpo como se informa en el presente documento y una célula que comprende el ácido nucleico que codifica un anticuerpo de acuerdo con la invención.

Son conocidos ampliamente en el estado de la técnica procedimientos para la producción recombinante y comprenden la expresión de proteínas en células procariotas y eucariotas con el aislamiento posterior del anticuerpo y, normalmente, la purificación hasta una pureza farmacéuticamente aceptable. Para la expresión de los anticuerpos como se ha mencionado anteriormente en una célula huésped, los ácidos nucleicos que codifican las cadenas ligeras y pesadas (modificadas) respectivas se insertan en vectores de expresión por procedimientos estándar. La expresión se realiza en células huésped procariotas o eucariotas apropiadas, como células CHO, células NS0, células SP2/0, células HEK293, células COS, células PER.C6, levaduras o células de E. coli, y el anticuerpo se recupera de las células (sobrenadante de cultivo o células después de la lisis). Son bien conocidos en el estado de la técnica procedimientos generales para la producción recombinante de anticuerpos y se describen, por ejemplo, en los artículos de revisión de Makrides, S.C., Protein Expr. Purif. 17 (1999) 183-202, Geisse, S., et al., Protein Expr. Purif. 8 (1996) 271-282, Kaufman, R.J., Mol. Biotechnol. 16 (2000) 151-160, y Werner, R.G., Drug Res. 48 (1998) 870-880.

En consecuencia, en el presente documento se divulga un procedimiento para la preparación de un anticuerpo biespecífico de acuerdo con la invención que comprende las etapas de

a) transformar una célula huésped con vectores que comprenden moléculas de ácido nucleico que codifican el anticuerpo,

b) cultivar la célula huésped en condiciones que permitan la síntesis del anticuerpo, y

c) recuperar el anticuerpo del cultivo.

La etapa de recuperación en c) incluye el uso de un reactivo de captura específico del dominio constante de la cadena ligera (que, por ejemplo, es específico para la cadena ligera constante kappa o lambda, dependiendo de si una cadena ligera kappa o lambda está contenida en el anticuerpo biespecífico). Este reactivo de captura específico de cadena ligera se usa en un modo de unión y elución. Los ejemplos de dichos reactivos de captura específicos del dominio constante de la cadena ligera son, por ejemplo, KappaSelect™ y LambdaFabSelect™ (disponibles de GE Healthcare/BAC), que se basan en una matriz de base de agarosa altamente rígida que permite altos caudales y baja contrapresión a gran escala. Estos materiales contienen un ligando que se une a la región constante de la cadena ligera kappa o lambda, respectivamente (es decir, los fragmentos que carecen de la región constante de la cadena ligera no se unirán; figura 1). Por lo tanto, ambas se pueden unir a otras moléculas diana que contienen la región constante de la cadena ligera, por ejemplo, IgG, IgA e IgM. Los ligandos se unen a la matriz por medio de un largo brazo espaciador hidrófilo para que estén fácilmente disponibles para unirse a la molécula diana. Se basan en un fragmento de anticuerpo monocatenario que se criba para detectar Ig kappa o bien lambda humana.

La etapa de recuperación en c) incluye el uso de un reactivo de captura específico de la región Fc. El reactivo de captura específico de la región Fc se usa en un modo de unión y elución. Los ejemplos de dichos reactivos de captura específicos de la región Fc son, por ejemplo, materiales de cromatografía de afinidad basados en la proteína A estafilocócica.

Los anticuerpos biespecíficos se separan adecuadamente del medio de cultivo mediante procedimientos convencionales de purificación de inmunoglobulinas tales como, por ejemplo, cromatografía de afinidad (proteína A-Sepharose o KappaSelect™, LambdaFabSelect™), cromatografía de hidroxilapatita, electroforesis en gel o diálisis.

El ADN y el ARN que codifican los anticuerpos monoclonales se aíslan y secuencian fácilmente usando procedimientos convencionales. Los linfocitos B o las células de hibridoma pueden servir como fuente de dichos ADN y ARN. Una vez aislado, el ADN se puede insertar en vectores de expresión, que se transfectan a continuación en células huésped tales como células HEK293, células CHO o células de mieloma que de otro modo no producen proteína inmunoglobulina, para obtener la síntesis de anticuerpos monoclonales recombinantes en las células huésped.

Algunas de las moléculas como se informa en el presente documento facilitan el aislamiento/purificación al comprender regiones Fc que se modifican diferencialmente, en las que al menos una de las modificaciones da como resultado i) una afinidad diferencial de la molécula por la proteína A (estafilocócica) y ii) una afinidad diferencial de la molécula por el FcRn humano, y la molécula se puede aislar de una célula alterada, de un medio o de una mezcla de moléculas en base a su afinidad por la proteína A.

La purificación de los anticuerpos se realiza para eliminar componentes celulares u otros contaminantes, por ejemplo, otros ácidos nucleicos celulares o proteínas, mediante técnicas estándar, que incluyen tratamiento alcalino/SDS, centrifugación por gradiente de CsCl, cromatografía en columna, electroforesis en gel de agarosa y otros bien conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, Ausubel, F., et al., ed. Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley Interscience, Nueva York (1987)). Diferentes procedimientos están bien establecidos y se usan ampliamente para la purificación de proteínas, tales como cromatografía de afinidad con proteínas microbianas (por ejemplo, cromatografía de afinidad con proteína A o proteína G), cromatografía de intercambio iónico (por ejemplo, intercambio catiónico (resinas de carboximetilo), intercambio aniónico (resinas de aminoetilo) e intercambio en modo mixto), adsorción tiófila (por ejemplo, con beta-mercaptoetanol y otros ligandos SH), cromatografía de interacción hidrófoba o adsorción aromática (por ejemplo, con fenil-Sepharose, resinas azaarenófilas o ácido m-aminofenilborónico), cromatografía de afinidad por quelatos metálicos (por ejemplo, con material de afinidad por Ni(II) y Cu(II)), cromatografía de exclusión por tamaño y procedimientos electroforéticos (tales como electroforesis en gel, electroforesis capilar) (Vijayalakshmi, M.A., Appl. Biochem. Biotech. 75 (1998) 93-102).

El anticuerpo biespecífico bivalente contra VEGF humano y ANG-2 humana de acuerdo con la invención puede tener un valioso perfil de eficacia/seguridad y puede proporcionar beneficios para un paciente que necesite un tratamiento anti-VEGF y anti-ANG-2.

Un aspecto de la invención es una formulación farmacéutica que comprende un anticuerpo de acuerdo con la invención. Otro aspecto de la invención es el uso de un anticuerpo de acuerdo con la invención para la fabricación de una formulación farmacéutica. Otro aspecto de la invención es un procedimiento para la fabricación de una formulación farmacéutica que comprende un anticuerpo de acuerdo con la invención. En otro aspecto, se proporciona una formulación, por ejemplo, una formulación farmacéutica, que contiene un anticuerpo de acuerdo con la invención, formulado conjuntamente con un vehículo farmacéutico.

Una formulación de la presente invención se puede administrar por una variedad de procedimientos conocidos en la técnica. Como se apreciará por el experto en la técnica, la vía y/o modo de administración variarán dependiendo de los resultados deseados. Para administrar un compuesto como se informa en el presente documento mediante determinadas vías de administración, puede ser necesario recubrir el compuesto con, o coadministrar el compuesto con, un material para evitar su inactivación. Por ejemplo, el compuesto se puede administrar a un sujeto en un vehículo apropiado, por ejemplo, liposomas o un diluyente. Los diluyentes farmacéuticamente aceptables incluyen solución salina y soluciones tampón acuosas. Los vehículos farmacéuticos incluyen soluciones o dispersiones acuosas estériles y polvos estériles para la preparación extemporánea de soluciones o dispersiones inyectables estériles. El uso de dichos medios y agentes para sustancias farmacéuticamente activas es conocido en la técnica.

Se pueden usar muchos modos posibles de administración, incluyendo, pero sin limitarse a, la aplicación intraocular o la aplicación tópica. En un modo de realización, la aplicación es intraocular e incluye, pero no se limita a, inyección subconjuntival, inyección intracanieral, inyección en la cámara anterior por medio del limbo temporal, inyección intraestromal, inyección intracorneal, inyección subretiniana, inyección en el humor acuoso, inyección subtenoniana o dispositivo de administración mantenida, inyección intravítrea (por ejemplo, inyección vítrea anterior, media o posterior). En un modo de realización, la aplicación es tópica e incluye, pero no se limita a, colirio en la córnea.

En un modo de realización, el anticuerpo biespecífico o la formulación farmacéutica de acuerdo con la invención se administra por medio de aplicación intravítrea, por ejemplo, por medio de inyección intravítrea. Esto se puede realizar de acuerdo con los procedimientos estándar conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, Ritter et al., J. Clin. Invest. 116 (2006) 3266-3276, Russelakis-Carneiro et al., Neuropathol. Appl. Neurobiol. 25 (1999) 196-206, y Wray et al., Arch. Neurol. 33 (1976) 183-185).

Los kits terapéuticos como se informa en el presente documento pueden contener una o más dosis de un anticuerpo (biespecífico) presente en una formulación farmacéutica descrita en el presente documento, un dispositivo adecuado para la inyección intravítrea de la formulación farmacéutica, y una indicación que detalla los sujetos adecuados y los protocolos para llevar a cabo la inyección. Las formulaciones se administran típicamente al sujeto que necesita tratamiento por medio de inyección intravítrea. Esto se puede realizar de acuerdo con los procedimientos estándar conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, Ritter et al., J. Clin. Invest. 116 (2006) 3266 3276, Russelakis-Carneiro et al., Neuropathol. Appl. Neurobiol. 25 (1999) 196-206, y Wray et al., Arch. Neurol. 33 (1976) 183-185).

Las formulaciones también pueden contener adyuvantes, tales como conservantes, agentes humectantes, agentes emulsionantes y agentes dispersantes. La prevención de la presencia de microorganismos se puede garantizar tanto por procedimientos de esterilización, supra, como por la inclusión de diversos agentes antibacterianos y antifúngicos, por ejemplo, parabeno, clorobutanol, fenol, ácido sórbico y similares. También puede ser deseable incluir agentes isotónicos, tales como azúcares, cloruro de sodio y similares, en las formulaciones. Además, la absorción prolongada de la forma farmacéutica inyectable se puede provocar por la inclusión de agentes que retrasan la absorción tales como monoestearato de aluminio y gelatina.

Independientemente de la vía de administración seleccionada, los compuestos como se informa en el presente documento, que se pueden usar en una forma hidratada adecuada, y/o las formulaciones farmacéuticas de acuerdo con la invención se formulan en formas farmacéuticas farmacéuticamente aceptables mediante procedimientos convencionales conocidos por los expertos en la técnica.

Se pueden variar las concentraciones de dosificación reales de los ingredientes activos en las formulaciones farmacéuticas de acuerdo con la invención para obtener una cantidad del ingrediente activo que sea eficaz para lograr la respuesta terapéutica deseada para un paciente, formulación y modo de administración particulares, sin que sean tóxicas para el paciente. La concentración de dosificación seleccionada dependerá de una variedad de factores farmacocinéticos, incluyendo la actividad de las formulaciones particulares empleadas, la vía de administración, el tiempo de administración, la tasa de excreción del compuesto particular que se emplea, la duración del tratamiento, otros fármacos, compuestos y/o materiales usados en combinación con las formulaciones particulares empleadas, la edad, sexo, peso, estado, salud general y antecedentes médicos del paciente que se trata, y factores similares bien conocidos en las técnicas médicas.

La formulación debe ser estéril y fluida en la medida en que la formulación sea administrable mediante jeringuilla. Además del agua, el vehículo es preferentemente una solución salina tamponada isotónica.

La fluidez apropiada se puede mantener, por ejemplo, por el uso de un recubrimiento, tal como lecitina, por el mantenimiento del tamaño de partícula requerido en el caso de una dispersión y por el uso de tensioactivos. En muchos casos, es preferente incluir agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares, polialcoholes, tales como manitol o sorbitol, y cloruro de sodio en la formulación.

La formulación puede comprender una formulación oftálmica de liberación lenta que comprende un agente activo para administración subconjuntival. La formulación oftálmica de liberación lenta comprende micropartículas de agente activo esencialmente puro, por ejemplo, el anticuerpo biespecífico de acuerdo con la invención. Las micropartículas que comprenden el anticuerpo biespecífico de acuerdo con la invención se pueden incrustar en un polímero farmacéuticamente aceptable biocompatible o un agente de encapsulación lipídica. Las formulaciones de liberación lenta se pueden adaptar para liberar todo de sustancialmente todo el material activo durante un período prolongado de tiempo. El polímero o matriz lipídica, si está presente, se puede adaptar para degradarse lo suficiente como para que se transporte desde el sitio de administración después de la liberación de todo o sustancialmente todo el agente activo. La formulación de liberación lenta puede ser una formulación líquida, que comprende un polímero farmacéuticamente aceptable y un agente activo disuelto o dispersado. Tras la inyección, el polímero forma un depósito en el sitio de las inyecciones, por ejemplo, mediante gelificación o precipitación.

Otro aspecto de la invención es el anticuerpo biespecífico de acuerdo con la invención para su uso en el tratamiento de enfermedades vasculares oculares.

Otro aspecto de la invención es la formulación farmacéutica de acuerdo con la invención para su uso en el tratamiento de enfermedades vasculares oculares.

Otro aspecto de la invención es el uso de un anticuerpo de acuerdo con la invención para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de la enfermedad vascular ocular.

En el presente documento se divulga un procedimiento de tratamiento de un paciente que padece enfermedades vasculares oculares mediante administración de un anticuerpo de acuerdo con la invención a un paciente que necesita dicho tratamiento.

Con el presente documento se indica expresamente que el término "que comprende" como se usa en el presente documento comprende el término "que consiste en". Por tanto, todos los aspectos y modos de realización que contienen el término "que comprende" se divulgan igualmente con el término "que consiste en".

Modificaciones

En otro aspecto, un anticuerpo de acuerdo con cualquiera de los modos de realización anteriores puede incorporar cualquiera de los rasgos característicos, individualmente o en combinación, como se describe en las secciones 1 6 a continuación:

1. Afinidad de anticuerpos

En determinados modos de realización, un anticuerpo proporcionado en el presente documento tiene una constante de disociación (Kd) de < 100 nM, < 10 nM (por ejemplo, 10-7 M o menos, por ejemplo, de 10-7 M a 10 13 M, por ejemplo, de 10-8 M a 10-13 M).

En un modo de realización, la Kd se mide usando un ensayo de resonancia de plasmón superficial BIACORE®. Por ejemplo, se realiza un ensayo usando un BIACORE®-2000 o un BIACo Re®-3000 (GE Healthcare Inc., Piscataway, NJ) a 25 °C con chips CM5 con antígeno inmovilizado a ~10 unidades de respuesta (UR). En un modo de realización, los chips de biosensor de dextrano carboximetilado (CM5, GE Healthcare, Inc.) se activan con clorhidrato de W-etil-W-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida (EDC) y W-hidroxisuccinimida (NHS) de acuerdo con las instrucciones del proveedor. El antígeno se diluye con acetato de sodio 10 mM, pH 4,8, hasta 5 pg/ml (~ 0,2 pM) antes de la inyección a un caudal de 5 pl/minuto para lograr aproximadamente l0 unidades de respuesta (UR) de proteína acoplada. Después de la inyección del antígeno, se inyecta etanolamina 1 M para bloquear los grupos sin reaccionar. Para las mediciones cinéticas, se inyectan diluciones seriadas de dos veces de Fab (de 0,78 nM a 500 nM) en PBS con tensioactivo polisorbato 20 (TWEEN-20™) (PBST) al 0,05 % a 25 °C a un caudal de aproximadamente 25 pl/min. Se calculan las velocidades de asociación (kas) y velocidades de disociación (kd¡s) usando un modelo de Langmuir de unión uno a uno sencillo (programa informático de evaluación de BIACORE® versión 3,2) ajustando simultáneamente el sensograma de asociación y disociación. La constante de disociación en equilibrio (Kd) se calcula como la proporción kd¡s/kas (véase, por ejemplo, Chen, Y. et al., J. Mol. Biol. 293 (1999) 865-881). Si la tasa de asociación excede 106 M'1 s_1 por el ensayo de resonancia de plasmón superficial anterior, entonces, se puede determinar la tasa de asociación usando una técnica de extinción fluorescente que mide el incremento o disminución de la intensidad de emisión de fluorescencia (excitación = 295 nm; emisión = 340 nm, paso de banda de 16 nm) a 25 °C de un anticuerpo anti-antígeno 20 nM (forma Fab) en PBS, pH 7,2, en presencia de concentraciones crecientes de antígeno como se mide en un espectrómetro, tal como un espectrofotómetro equipado con detención de flujo (Aviv Instruments) o un espectrofotómetro SLM-AMINCO™ de la serie 8000 (ThermoSpectronic) con una cubeta agitada.

2. Anticuerpos quiméricos y humanizados

En determinados modos de realización, un anticuerpo proporcionado en el presente documento es un anticuerpo quimérico. Se describen determinados anticuerpos quiméricos, por ejemplo, en el documento US 4.816.567; y Morrison, S.L., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81 (1984) 6851-6855). En un ejemplo, un anticuerpo quimérico comprende una región variable no humana (por ejemplo, una región variable derivada de un ratón, rata, hámster, conejo o primate no humano, tal como un mono) y una región constante humana. En otro ejemplo, un anticuerpo quimérico es un anticuerpo "con cambio de clase" en el que se ha cambiado la clase o subclase con respecto a la del anticuerpo original. Los anticuerpos quiméricos incluyen fragmentos de unión a antígeno de los mismos.

En determinados modos de realización, un anticuerpo quimérico es un anticuerpo humanizado. Típicamente, un anticuerpo no humano se humaniza para reducir la inmunogenicidad en humanos, mientras conserva la especificidad y afinidad del anticuerpo no humano original. En general, un anticuerpo humanizado comprende uno o más dominios variables en los que las HVR, por ejemplo, las CDR (o partes de las mismas), se derivan de un anticuerpo no humano y las FR (o partes de las mismas) se derivan de secuencias de anticuerpos humanos. Un anticuerpo humanizado también comprenderá opcionalmente al menos una parte de una región constante humana. En algunos modos de realización se sustituyen algunos residuos de FR de un anticuerpo humanizado por los residuos correspondientes de un anticuerpo no humano (por ejemplo, el anticuerpo del que se derivan los residuos de HVR), por ejemplo, para restablecer o mejorar la especificidad o afinidad del anticuerpo.

Los anticuerpos humanizados y los procedimientos de preparación de los mismos se revisan, por ejemplo, en Almagro, J.C. y Fransson, J., Front. Biosci. 13 (2008) 1619-1633, y se describen además, por ejemplo, en Riechmann, I., et al., Nature 332 (1988) 323-329; Queen, C., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA86 (1989) 10029 10033; los documentos US 5.821.337, US 7.527.791, US 6.982.321 y US 7.087.409; Kashmiri, S.V., et al., Methods 36 (2005) 25-34 (que describen el injerto en la región determinante de la especificidad (SDR)); Padlan, E.A., Mol. Immunol. 28 (1991) 489-498 (que describe el "rebarnizado"); Dall'Acqua, W.F. et al., Methods 36 (2005) 43-60 (que describen el "barajado de FR"); Osbourn, J. et al., Methods 36 (2005) 61-68; y Klimka, A. et al., Br. J. Cancer 83 (2000) 252-260 (que describen el enfoque de "selección guiada" para el barajado de FR).

Las regiones estructurales humanas que se pueden usar para la humanización incluyen, pero no se limitan a: regiones estructurales seleccionadas usando el procedimiento de "mejor ajuste" (véase, por ejemplo, Sims, M.J., et al., J. Immunol. 151 (1993) 2296-2308; regiones estructurales derivadas de la secuencia consenso de anticuerpos humanos de un subgrupo particular de regiones variables de la cadena ligera o pesada (véase, por ejemplo, Carter, P., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA89 (1992) 4285-4289; y Presta, L.G., et al., J. Immunol. 151 (1993) 2623-2632); regiones estructurales maduras (mutadas somáticamente) humanas o regiones estructurales de la estirpe germinal humana (véase, por ejemplo, Almagro, J.C. y Fransson, J., Front. Biosci. 13 (2008) 1619 1633); y regiones estructurales derivadas del cribado de colecciones de FR (véase, por ejemplo, Baca, M. et al., J. Biol. Chem. 272 (1997) 10678-10684 y Rosok, M.J. et al., J. Biol. Chem. 271 (1996922611-22618).

3. Anticuerpos humanos

En determinados modos de realización, un anticuerpo proporcionado en el presente documento es un anticuerpo humano. Se pueden producir anticuerpos humanos usando diversas técnicas conocidas en la técnica. Los anticuerpos humanos se describen en general en van Dijk, M.A. y van de Winkel, J.G., Curr. Opin. Pharmacol. 5 (2001) 368-374 y Lonberg, N., Curr. Opin. Immunol. 20 (2008) 450-459.

Se pueden preparar anticuerpos humanos administrando un inmunógeno a un animal transgénico que se ha modificado para producir anticuerpos humanos intactos o anticuerpos intactos con regiones variables humanas en respuesta a la exposición a antígeno. Dichos animales contienen típicamente todos o una porción de los locus de inmunoglobulina humana, que reemplazan los locus de inmunoglobulina endógena, o que están presentes de forma extracromosómica o integrados aleatoriamente en los cromosomas del animal. En dichos ratones transgénicos, los locus de inmunoglobulina endógena en general se han inactivado. Para un análisis de los procedimientos para obtener anticuerpos humanos de animales transgénicos, véase Lonberg, N., Nat. Biotech. 23 (2005) 1117-1125. (Véanse también, por ejemplo, los documentos US 6.075.181 y US 6.150.584 que describen la tecnología XENOMOUSE™; el documento US 5.770.429, que describe la tecnología HUMAB®; el documento US 7.041.870, que describe la tecnología K-M MOUSE®, y el documento US 2007/0061900, que describe la tecnología VELOCIMOUSE®). Las regiones variables humanas de anticuerpos intactos generados por dichos animales se pueden modificar además, por ejemplo, por combinación con una región constante humana diferente.

También se pueden preparar anticuerpos humanos por procedimientos basados en hibridoma. Se han descrito líneas celulares de heteromieloma ratón-humano y mieloma humano para la producción de anticuerpos monoclonales humanos (véanse, por ejemplo, Kozbor, D., J. Immunol. 133 (1984) 3001-3005; Brodeur, B.R., et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, Marcel Dekker, Inc., Nueva York (1987), págs.

51-63; y Boerner, P., et al., J. Immunol. 147 (1991) 86-95). Los anticuerpos humanos generados por medio de tecnología de hibridoma de linfocitos B humanos también se describen en Li, J. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103 (2006) 3557-3562. Los procedimientos adicionales incluyen los descritos, por ejemplo, en el documento US 7.189.826 (que describe la producción de anticuerpos IgM humana monoclonales a partir de líneas celulares de hibridoma) y Ni, J., Xiandai Mianyixue 26 (2006) 265-268 (que describe hibridomas humano-humano). La tecnología de hibridoma humano (tecnología Trioma) también se describe en Vollmers, H.P. y Brandlein, S., Histology and Histopathology 20 (2005) 927-937 y Vollmers, H.P. y Brandlein, S., Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology 27 (2005) 185-191.

También se pueden generar anticuerpos humanos aislando secuencias de dominio variable del clon Fv seleccionadas de colecciones de presentación en fagos derivadas de humano. A continuación, se pueden combinar dichas secuencias de dominio variable con un dominio constante humano deseado. Las técnicas para seleccionar anticuerpos humanos de colecciones de anticuerpos se describen a continuación.

4. Anticuerpos derivados de colecciones

Se pueden aislar anticuerpos como se informa en el presente documento cribando colecciones combinatorias para determinar los anticuerpos con la actividad o las actividades deseadas. Por ejemplo, una variedad de procedimientos son conocidos en la técnica para generar colecciones de presentación en fagos y cribar dichas colecciones para determinar los anticuerpos que poseen las características de unión deseadas. Dichos procedimientos se revisan, por ejemplo, en Hoogenboom, H.R., et al., Methods in Molecular Biology 178 (2001) 1 37 y se describen adicionalmente, por ejemplo, en McCafferty, J. et al., Nature 348 (1990) 552-554; Clackson, T. et al., Nature 352 (1991) 624-628; Marks, J.D. et al., J. Mol. Biol. 222 (1992) 581-597; Marks, J.D. y Bradbury, A., Methods in Molecular Biology 248 (2003) 161-175; Sidhu, S.S. et al., J. Mol. Biol. 338 (2004) 299-310; Lee, C.V. et al., J. Mol. Biol. 340 (2004) 1073-1093; Fellouse, F.A., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101 (2004) 12467-12472; y Lee, C.V. et al., J. Immunol. Methods 284 (2004) 119-132.

En determinados procedimientos de presentación en fagos, los repertorios de los genes VH y VL se clonan por separado mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y se recombinan aleatoriamente en colecciones de fagos, que a continuación se pueden cribar para determinar los fagos que se unen a los antígenos como se describe en Winter G., et al., Ann. Rev. Immunol., 12 (1994) 433-455. El fago típicamente presenta fragmentos de anticuerpo, como fragmentos Fv monocatenarios (scFv) o bien como fragmentos Fab. Las colecciones de fuentes inmunizadas proporcionan anticuerpos de alta afinidad para el inmunógeno sin el requisito de construir hibridomas. De forma alternativa, se puede clonar el repertorio sin exposición previa (por ejemplo, de humano) para proporcionar una única fuente de anticuerpos para una amplia gama de antígenos propios y no propios sin ninguna inmunización como se describe por Griffiths, A.D., et al., EMBO J. 12 (1993) 725-734. Finalmente, también se pueden preparar sintéticamente colecciones sin exposición previa clonando segmentos génicos de V no reordenados a partir de células madre y usando cebadores de PCR que contienen una secuencia aleatoria para codificar las regiones CDR3 altamente variables y para conseguir el reordenamiento in vitro, como se describe por Hoogenboom, H.R. y Winter, G., J. Mol. Biol. 227 (1992) 381-388. Las publicaciones de patente que describen colecciones de fagos-anticuerpos humanos incluyen, por ejemplo: los documentos US 5.750.373 y US 2005/0079574, US 2005/0119455, US 2005/0266000, US 2007/0117126, US 2007/0160598, US 2007/0237764, US 2007/0292936 y US 2009/0002360.

Los anticuerpos o fragmentos de anticuerpo aislados de colecciones de anticuerpos humanos se consideran anticuerpos humanos o fragmentos de anticuerpo humano en el presente documento.

5. Anticuerpos multiespecíficos

En determinados modos de realización, un anticuerpo proporcionado en el presente documento es un anticuerpo multiespecífico, por ejemplo, un anticuerpo biespecífico. Los anticuerpos multiespecíficos son anticuerpos monoclonales que tienen especificidades de unión por al menos dos sitios diferentes. También se pueden usar anticuerpos biespecíficos para localizar agentes citotóxicos con respecto a células que expresan uno o más de los antígenos diana. Se pueden preparar anticuerpos biespecíficos como anticuerpos de longitud completa o fragmentos de anticuerpo.

Las técnicas para preparar anticuerpos multiespecíficos incluyen, pero no se limitan a, coexpresión recombinante de dos pares de cadena pesada-cadena ligera de inmunoglobulina que tienen diferentes especificidades (véanse Milstein, C. y Cuello, A.C., Nature 305 (1983) 537-540, documento W o 93/08829 y Traunecker, A., et al., EMBO J. 10 (1991) 3655-3659) y genomanipulación "botón en ojal" (véase, por ejemplo, el documento US 5.731.168). También se pueden preparar anticuerpos multiespecíficos genomanipulando los efectos de conducción electrostática para preparar moléculas heterodiméricas de Fc de anticuerpo (documento WO 2009/089004); reticular dos o más anticuerpos o fragmentos (véanse, por ejemplo, el documento US 4.676.980, y Brennan, M., et al., Science 229 (1985) 81-83); usar cremalleras de leucinas para producir anticuerpos biespecíficos (véase, por ejemplo, Kostelny, S.A., et al., J. Immunol. 148 (1992) 1547-1553); usar la tecnología de "diacuerpos" para preparar fragmentos de anticuerpo biespecífico (véase, por ejemplo, Holliger, P., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA90 (1993) 6444-6448); y usar dímeros de Fv monocatenarios (sFv) (véase, por ejemplo, Gruber, M., et al., J. Immunol. 152 (1994) 5368-5374); y preparar anticuerpos triespecíficos como se describe, por ejemplo, en Tutt, A., et al., J. Immunol. 147 (1991) 60-69).

Los anticuerpos genomanipulados con tres o más sitios de unión a antígeno funcionales, incluyendo "anticuerpos pulpo", también se incluyen en el presente documento (véase, por ejemplo, el documento US 2006/0025576).

El anticuerpo o fragmento en el presente documento también incluye un "Fab de doble acción" o "DAF" que comprende un sitio de unión a antígeno que se une a un primer antígeno, así como a otro antígeno diferente (véase, el documento US 2008/0069820, por ejemplo).

El anticuerpo o fragmento en el presente documento también incluye anticuerpos multiespecíficos descritos en los documentos WO 2009/080251, WO 2009/080252, WO 2009/080253, WO 2009/080254, WO 2010/112193, WO 2010/115589, WO 2010/136172, WO 2010/145792 y WO 2010/145793.

6. Variantes de anticuerpo

En determinados modos de realización se contemplan variantes de secuencia de aminoácidos de los anticuerpos proporcionados en el presente documento. Por ejemplo, puede ser deseable mejorar la afinidad de unión y/u otras propiedades biológicas del anticuerpo. Se pueden preparar variantes de secuencia de aminoácidos de un anticuerpo introduciendo modificaciones apropiadas en la secuencia de nucleótidos que codifica el anticuerpo o por síntesis peptídica. Dichas modificaciones incluyen, por ejemplo, deleciones de, y/o inserciones en y/o sustituciones de residuos dentro de las secuencias de aminoácidos del anticuerpo. Se puede realizar cualquier combinación de deleción, inserción y sustitución para llegar a la construcción final, siempre que la construcción final posea las características deseadas, por ejemplo, unión a antígeno.

a) Variantes de sustitución, inserción y deleción

En determinados modos de realización, se proporcionan variantes de anticuerpo que tienen una o más sustituciones aminoacídicas. Los sitios de interés para la mutagénesis de sustitución incluyen las HVR y las FR. Las sustituciones conservadoras se muestran en la tabla a continuación bajo el encabezamiento de "sustituciones preferentes". Se proporcionan cambios más sustanciales en la siguiente tabla bajo el encabezamiento de "sustituciones ejemplares" y como se describe adicionalmente a continuación en referencia a las clases de la cadena lateral de los aminoácidos. Se pueden introducir sustituciones aminoacídicas en un anticuerpo de interés y cribar los productos para determinar una actividad deseada, por ejemplo, conservación/mejora de unión a antígeno, disminución en inmunogenicidad o mejora en ADCC o CDC.

Tabla

Los aminoácidos se pueden agrupar de acuerdo con propiedades de cadena lateral comunes:

(1) hidrófobos: norleucina, Met, Ala, Val, Leu, Ile;

(2) hidrófilos neutros: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;

(3) ácidos: Asp, Glu;

(4) básicos: His, Lys, Arg;

(5) residuos que influyen en la orientación de la cadena: Gly, Pro;

(6) aromáticos: Trp, Tyr, Phe.

Las sustituciones no conservadoras conllevarán intercambiar un miembro de una de estas clases por otra clase. Un tipo de variante de sustitución implica sustituir uno o más residuos de la región hipervariable de un anticuerpo original (por ejemplo, un anticuerpo humanizado o humano). En general, la(s) variante(s) resultante(s) seleccionada(s) para su estudio adicional tendrá(n) modificaciones (por ejemplo, mejoras) en determinadas propiedades biológicas (por ejemplo, incremento de afinidad, reducción en inmunogenicidad) con respecto al anticuerpo original y/o habrá(n) conservado sustancialmente determinadas propiedades biológicas del anticuerpo original. Una variante de sustitución ejemplar es un anticuerpo de afinidad madurada que se puede generar convenientemente, por ejemplo, usando técnicas de maduración de la afinidad basadasen presentación en fagos, tales como las descritas en el presente documento. En resumen, se mutan uno o más residuos de HVR y los anticuerpos variantes se presentan en fagos y se criban para determinar una actividad biológica particular (por ejemplo, afinidad de unión).

Se pueden realizar alteraciones (por ejemplo, sustituciones) en las HVR, por ejemplo, para mejorar la afinidad de anticuerpos. Dichas alteraciones se pueden realizar en "puntos calientes" de la HVR, es decir, residuos codificados por codones que se someten a una mutación con alta frecuencia durante el proceso de maduración somática (véase, por ejemplo, Chowdhury, P.S., Methods Mol. Biol.207 (2008) 179-196), y/o residuos que entran en contacto con el antígeno, sometiéndose a prueba el VH o VL variante resultante para determinar la afinidad de unión. Se ha descrito la maduración de la afinidad por la construcción y reselección de colecciones secundarias, por ejemplo, en Hoogenboom, H.R. et al., en Methods in Molecular Biology 178 (2002) 1-37. En algunos modos de realización de la maduración de la afinidad se introduce diversidad en los genes variables elegidos para la maduración mediante cualquiera de una variedad de procedimientos (por ejemplo, PCR propensa a error, reordenamiento de cadenas o mutagénesis dirigida por oligonucleótidos). A continuación, se crea una segunda colección. A continuación, se criba la colección para identificar cualquier variante de anticuerpo con la afinidad deseada. Otro procedimiento para introducir diversidad implica enfoques dirigidos a HVR, en los que se aleatorizan varios residuos de HVR (por ejemplo, 4-6 residuos a la vez). Se pueden identificar específicamente los residuos de HVR implicados en la unión a antígeno, por ejemplo, usando modelado o mutagénesis por barrido de alanina. A menudo se seleccionan en particular CDR-H3 y CDR-L3.

En determinados modos de realización se pueden producir sustituciones, inserciones o deleciones dentro de una o más HVR, siempre que dichas alteraciones no reduzcan sustancialmente la capacidad del anticuerpo de unirse al antígeno. Por ejemplo, en las HVR se pueden realizar alteraciones conservadoras (por ejemplo, sustituciones conservadoras como se proporciona en el presente documento) que no reduzcan sustancialmente la afinidad de unión. Dichas alteraciones pueden estar, por ejemplo, fuera de los residuos en contacto con el antígeno en las HVR. En determinados modos de realización de las secuencias de VH y VL variantes proporcionadas anteriormente, cada HVR está inalterada o bien no contiene más de una, dos o tres sustituciones aminoacídicas.

Un procedimiento útil para la identificación de residuos o regiones de un anticuerpo que se puede seleccionar para la mutagénesis se llama "mutagénesis por barrido de alanina" como se describe en Cunningham, B.C. y Wells, J.A., Science 244 (1989) 1081-1085. En este procedimiento se identifican un residuo o grupo de residuos diana (por ejemplo, residuos cargados, tales como arg, asp, his, lys y glu) y se reemplazan por un aminoácido neutro o cargado negativamente (por ejemplo, alanina o polialanina) para determinar si la interacción del anticuerpo con el antígeno se ve afectada. Se pueden introducir otras sustituciones en las localizaciones de aminoácidos que demuestren sensibilidad funcional a las sustituciones iniciales. De forma alternativa, o adicional, se puede usar una estructura cristalina de un complejo antígeno-anticuerpo para identificar los puntos de contacto entre el anticuerpo y el antígeno. Dichos residuos de contacto y residuos adyacentes se pueden seleccionar o eliminar como candidatos para sustitución. Se pueden cribar variantes para determinar si contienen las propiedades deseadas.

Las inserciones en la secuencia de aminoácidos incluyen fusiones amino y/o carboxiterminales que varían en longitud de un residuo a polipéptidos que contienen cien o más residuos, así como inserciones intrasecuenciales de residuos de aminoácido individuales o múltiples. Los ejemplos de inserciones terminales incluyen un anticuerpo con un residuo de metionilo N terminal. Otras variantes de inserción de la molécula de anticuerpo incluyen la fusión en el extremo N o C del anticuerpo con una enzima (por ejemplo, para ADEPT) o un polipéptido que incrementa la semivida en suero del anticuerpo.

b) Variantes de glucosilación

En determinados modos de realización se altera un anticuerpo proporcionado en el presente documento para incrementar o disminuir el grado en el que el anticuerpo se glucosila. La adición o deleción de sitios de glucosilación en un anticuerpo se puede conseguir convenientemente alterando la secuencia de aminoácidos de modo que se crean o se retiran uno o más sitios de glucosilación.

Cuando el anticuerpo comprende una región Fc, se puede alterar el carbohidrato unido a la misma. Los anticuerpos naturales producidos por células de mamífero típicamente comprenden un oligosacárido biantenario ramificado que se une, en general, por un enlace N a Asn297 del dominio CH2 de la región Fc. Véase, por ejemplo, Wright, A. y Morrison, S.L., TIBTECH15 (1997) 26-32. El oligosacárido puede incluir diversos carbohidratos, por ejemplo, manosa, N-acetilglucosamina (GlcNAc), galactosa y ácido siálico, así como una fucosa unida a una GlcNAc en el "tallo" de la estructura oligosacárida biantenaria. En algunos modos de realización se pueden realizar modificaciones del oligosacárido en un anticuerpo como se informa en el presente documento para crear variantes de anticuerpo con determinadas propiedades mejoradas.

En un modo de realización, se proporcionan variantes de anticuerpo que tienen una estructura carbohidratada que carece de fucosa unida (directa o indirectamente) a una región Fc. Por ejemplo, la cantidad de fucosa en dicho anticuerpo puede ser de un 1 % a un 80 %, de un 1 % a un 65 %, de un 5 % a un 65 % o de un 20 % a un 40 %. La cantidad de fucosa se determina calculando la cantidad promedio de fucosa dentro de la cadena glucídica en Asn297, en relación con la suma de todas las glucoestructuras unidas a Asn297 (por ejemplo, estructuras complejas, híbridas y de alto contenido en manosa) como se mide por espectrometría de masas mA l DI-TOF, como se describe en el documento WO 2008/077546, por ejemplo. Asn297 se refiere al residuo de asparagina localizado en aproximadamente la posición 297 en la región Fc (numeración EU de los residuos de la región Fc); sin embargo, Asn297 también se puede localizar aproximadamente ± 3 aminoácidos corriente arriba o corriente abajo de la posición 297, es decir, entre las posiciones 294 y 300, debido a variaciones de secuencia insignificantes en los anticuerpos. Dichas variantes de fucosilación pueden tener una mejora en la función ADCC. Véanse, por ejemplo, los documentos US2003/0157108; US2004/0093621. Los ejemplos de publicaciones relacionadas con variantes de anticuerpo "desfucosilado" o "carente de fucosa" incluyen: los documentos US 2003/0157108; WO 2000/61739; WO 2001/29246; US 2003/0115614; US 2002/0164328; US 2004/0093621; US 2004/0132140; US 2004/0110704; US 2004/0110282; US 2004/0109865; WO 2003/085119; WO 2003/084570; WO 2005/035586; WO 2005/035778; WO 2005/053742; WO 2002/031140; Okazaki, A., et al., J. Mol. Biol. 336 (2004) 1239-1249; Yamane-Ohnuki, N., et al., Biotech. Bioeng. 87 (2004) 614-622. Los ejemplos de líneas celulares que pueden producir anticuerpos desfucosilados incluyen células CHO Lec13 carentes de fucosilación de proteínas (Ripka, J. et al., Arch. Biochem. Biophys. 249 (1986) 533-545; los documentos US 2003/0157108; y WO 2004/056312, en especial en el ejemplo 11) y líneas celulares con desactivación génica, tales como el gen de alfa-1,6-fucosiltransferasa, FUT8, células CHO con desactivación génica (véanse, por ejemplo, Yamane-Ohnuki, N. et al., Biotech. Bioeng. 87 (2004) 614 622; Kanda, Y. et al., Biotechnol. Bioeng. 94 (2006) 680-688; y el documento WO 2003/085107).

Se proporcionan además variantes de anticuerpos con oligosacáridos bisecados, por ejemplo, en las que un oligosacárido biantenario unido a la región Fc del anticuerpo se biseca por GlcNAc. Dichas variantes de anticuerpo pueden tener una reducción en la fucosilación y/o una mejora en la función ADCC. Los ejemplos de dichas variantes de anticuerpo se describen, por ejemplo, en los documentos WO 2003/011878; US 6.602.684; y US 2005/0123546. También se proporcionan variantes de anticuerpo con al menos un residuo de galactosa en el oligosacárido unido a la región Fc. Dichas variantes de anticuerpo pueden tener una mejora en la función CDC. Dichas variantes de anticuerpo se describen, por ejemplo, en los documentos WO 1997/30087; WO 1998/58964; y WO 1999/22764.

c) Variantes de la región Fc

En determinados modos de realización se pueden introducir una o más modificaciones adicionales de aminoácidos en la región Fc de un anticuerpo proporcionado en el presente documento, generando de este modo una variante de la región Fc. La variante de la región Fc puede comprender una secuencia de la región Fc humana (por ejemplo, una región Fc de IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4 humana) que comprende una modificación aminoacídica (por ejemplo, una sustitución/mutación) en una o más posiciones aminoacídicas.

En determinados modos de realización, la invención contempla una variante de anticuerpo que posee algunas, pero no todas, las funciones efectoras, lo que la convierte en un candidato deseable para aplicaciones en las que la semivida del anticuerpo in vivo es importante, aunque determinadas funciones efectoras (tales como CDC y ADCC) son innecesarias o perjudiciales. Se pueden realizar ensayos de citotoxicidad in vitro y/o in vivo para confirmar la reducción/disminución de las actividades CDC y/o ADCC. Por ejemplo, se pueden llevar a cabo ensayos de unión a receptor de Fc (FcR) para garantizar que el anticuerpo carece de unión a FcyR (por consiguiente, probablemente carece de actividad ADCC), pero conserva su capacidad de unión a FcRn. Las células primarias para mediar en la ADCC, los linfocitos NK, expresan solo FcyRIII, mientras que los monocitos expresan FcyRI, FcyRII y FcyRIII. La expresión de FcR en células hematopoyéticas se resume en la tabla 3 en la página 464 de Ravetch, J.V. y Kinet, J.P., Annu. Rev. Immunol. 9 (1991) 457-492. Los ejemplos no limitantes de ensayos in vitro para evaluar la actividad de ADCC de una molécula de interés se describen en el documento US5.500.362 (véase, por ejemplo, Hellstrom, I., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83 (1986) 7059-7063; y Hellstrom, I., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA82 (1985) 1499-1502); el documento US 5.821.337 (véase Bruggemann, M., et al., J. Exp. Med. 166 (1987) 1351-1361). De forma alternativa, se pueden emplear procedimientos de ensayos no radioactivos (véase, por ejemplo, el ensayo de citotoxicidad no radioactivo ACTI™ para citometría de flujo (CellTechnology, Inc. Mountain View, CA); y el ensayo de citotoxicidad no radioactivo CytoTox 96® (Promega, Madison, WI)). Las células efectoras útiles para dichos ensayos incluyen leucocitos monomorfonucleares en la sangre periférica (PBMC) y linfocitos citolíticos (NK). De forma alternativa, o adicionalmente, se puede evaluar in vivo la actividad ADCC de la molécula de interés, por ejemplo, en un modelo animal tal como el divulgado en Clynes, R. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95 (1998) 652-656. También se pueden llevar a cabo ensayos de unión de C1q para confirmar que el anticuerpo no se puede unir a C1q y por consiguiente carece de actividad CDC. Véase, por ejemplo, ELiSa de unión de C1q y C3c en los documentos WO 2006/029879 y WO 2005/100402. Para evaluar la activación del complemento, se puede realizar un ensayo de CDC (véanse, por ejemplo, Gazzano-Santoro, H., et al., J. Immunol. Methods 202 (1996) 163-171; Cragg, M.S., et al., Blood 101 (2003) 1045-1052; y Cragg, M.S. y M.J. Glennie, Blood 103 (2004) 2738-2743). También se pueden realizar la unión al FcRn y las determinaciones de la depuración/semivida in vivo usando procedimientos conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, Petkova, S.B., et al., Int. Immunol. 18 (2006) 1759-1769).

Los anticuerpos con una reducción en la función efectora incluyen aquellos con una sustitución de uno o más de los residuos de la región Fc 238, 265, 269, 270, 297, 327 y 329 (documento US 6.737.056). Dichas variantes de la región Fc incluyen regiones Fc con sustituciones en dos o más de las posiciones aminoacídicas 265, 269, 270, 297 y 327, incluyendo el denominado mutante de la región Fc "DANA" con la sustitución de los residuos 265 y 297 por alanina (documento US 7.332.581).

Se describen determinadas variantes de anticuerpo con unión mejorada o disminuida al FcR (véanse, por ejemplo, los documentos US 6.737.056, WO 2004/056312, y Shields, R.L. et al., J. Biol. Chem. 276 (2001) 6591-6604).

En determinados modos de realización, una variante de anticuerpo comprende una región Fc con una o más sustituciones aminoacídicas que mejoran la ADCC, por ejemplo, sustituciones en las posiciones 298, 333 y/o 334 de la región Fc (numeración Eu de residuos).

En algunos modos de realización, se realizan alteraciones en la región Fc, que dan como resultado una alteración (es decir, una mejora o bien una disminución) en la unión a C1q y/o citotoxicidad dependiente del complemento (CDC), por ejemplo, como se describe en los documentos US 6.194.551, WO 99/51642, e Idusogie, E.E. et al., J. Immunol. 164 (2000) 4178-4184.

Se describen anticuerpos con un incremento en las semividas y una mejora en la unión al receptor de Fc neonatal (FcRn), que es responsable de la transferencia de IgG maternas al feto (Guyer, R.L., et al., J. Immunol. 117 (1976) 587-593, y Kim, J.K., et al., J. Immunol. 24 (1994) 2429-2434) en el documento US 2005/0014934. Estos anticuerpos comprenden una región Fc con una o más sustituciones en la misma que mejoran la unión de la región Fc a FcRn. Dichas variantes de la región Fc incluyen aquellas con sustituciones en uno o más residuos de la región Fc: 238, 256, 265, 272, 286, 303, 305, 307, 311, 312, 317, 340, 356, 360, 362, 376, 378, 380, 382, 413, 424 o 434, por ejemplo, sustitución del residuo 434 de la región Fc (documento US 7.371.826).

Véanse también Duncan, A.R. y Winter, G., Nature 322 (1988) 738-740; los documentos US 5.648.260; US 5.624.821; y WO 94/29351 en relación con otros ejemplos de variantes de la región Fc.

d) Variantes de anticuerpos genomanipulados con cisteína

En determinados modos de realización, puede ser deseable crear anticuerpos genomanipulados con cisteína, por ejemplo, "thioMAb", en los que uno o más residuos de un anticuerpo se sustituyen con residuos de cisteína. En modos de realización particulares, los residuos sustituidos se producen en sitios accesibles del anticuerpo. Al sustituir esos residuos con cisteína, los grupos tiol reactivos se posicionan de este modo en sitios accesibles del anticuerpo y se pueden usar para conjugar el anticuerpo a otros restos, tales como restos de fármaco o restos de conector-fármaco, para crear un inmunoconjugado, como se describe además en el presente documento. En determinados modos de realización se puede sustituir uno cualquiera o más de los siguientes residuos con cisteína: V205 (numeración de Kabat) de la cadena ligera; A118 (numeración EU) de la cadena pesada; y S400 (numeración EU) de la región Fc de la cadena pesada. Los anticuerpos genomanipulados con cisteína se pueden generar como se describe, por ejemplo, en el documento US 7.521.541.

e) Derivados de anticuerpos

En determinados modos de realización, un anticuerpo proporcionado en el presente documento se puede modificar además para que contenga restos no proteínicos adicionales que son conocidos en la técnica y están fácilmente disponibles. Los restos adecuados para la derivatización del anticuerpo incluyen, pero no se limitan a, polímeros hidrosolubles. Los ejemplos no limitantes de polímeros solubles en agua incluyen, pero no se limitan a, polietilenglicol (PEG), copolímeros de etilenglicol/propilenglicol, carboximetilcelulosa, dextrano, poli(alcohol vinílico), polivinilpirrolidona, poli-1,3-dioxolano, poli-1,3,6-trioxano, copolímero de etileno/anhídrido maleico, poliaminoácidos (homopolímeros o copolímeros aleatorios) y dextrano o poli(n-vinilpirrolidona)polietilenglicol, homopolímeros de propropilenglicol, copolímeros de óxido de polipropileno/óxido de etileno, polioles polioxietilados (por ejemplo, glicerol), poli(alcohol vinílico) y mezclas de los mismos. El polietilenglicol-propionaldehído puede tener ventajas en la fabricación debido a su estabilidad en agua. El polímero puede ser de cualquier peso molecular y puede ser ramificado o no ramificado. El número de polímeros unidos al anticuerpo puede variar y, si se une más de un polímero, pueden ser moléculas iguales o diferentes. En general, el número y/o tipo de polímeros usados para la derivatización se puede determinar en base a consideraciones que incluyen, pero sin limitarse a, las propiedades o funciones particulares del anticuerpo que se van a mejorar, si el derivado de anticuerpo se usará en un tratamiento en condiciones definidas, etc.

En otro modo de realización se proporcionan conjugados de un anticuerpo y un resto no proteínico que se pueden calentar de forma selectiva por exposición a la radiación. En un modo de realización, el resto no proteínico es un nanotubo de carbono (Kam, N.W. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102 (2005) 11600-11605). La radiación puede ser de cualquier longitud de onda, e incluye, pero no se limita a, longitudes de onda que no dañan células normales, pero que calientan el resto no proteínico hasta una temperatura a la que las células próximas al anticuerpo-resto no proteínico se destruyen.

f) Heterodimerización

Existen varios enfoques para las modificaciones en CH3 para garantizar la heterodimerización, que se describen bien, por ejemplo, en los documentos WO 96/27011, WO 98/050431, EP 1870459, WO 2007/110205, WO 2007/147901, WO 2009/089004, WO 2010/129304, WO 2011/90754, WO 2011/143545, WO 2012058768, WO 2013157954, WO 2013096291. Típicamente, en todos estos enfoques, tanto el primer dominio CH3 como el segundo dominio CH3 se genomanipulan de manera complementaria, de modo que cada dominio CH3 (o la cadena pesada que lo comprende) ya no puede homodimerizarse, sino que se ve obligado a heterodimerizarse con el otro CH3 genomanipulado complementario (de modo que el primer y el segundo dominio CH3 se heterodimerizan y no se forman homodímeros entre los dos primeros o los dos segundos dominios CH3). Estos diferentes enfoques para mejorar la heterodimerización de la cadena pesada se contemplan como alternativas diferentes en combinación con las modificaciones de la cadena pesada y ligera (intercambio/reemplazo de VH y VL en un brazo de unión y la introducción de sustituciones de aminoácidos cargados con cargas opuestas en la interfase CH1/CL) en los anticuerpos multiespecíficos de acuerdo con la invención que reducen el emparejamiento erróneo de una cadena ligera y los productos secundarios tipo Bence-Jones.

En un modo de realización preferente de la invención (en caso de que el anticuerpo multiespecífico comprenda dominios CH3 en las cadenas pesadas), los dominios CH3 de dicho anticuerpo multiespecífico de acuerdo con la invención se pueden alterar mediante la tecnología de "botón en ojal" que se describe con detalle con varios ejemplos, por ejemplo, en el documento WO 96/027011, Ridgway, J.B., et al., Protein Eng. 9 (1996) 617-621; y Merchant, A.M., et al., Nat. Biotechnol. 16 (1998) 677-681; el documento WO 98/050431. En este procedimiento, las superficies de interacción de los dos dominios CH3 se alteran para incrementar la heterodimerización de ambas cadenas pesadas que contienen estos dos dominios CH3. Cada uno de los dos dominios CH3 (de las dos cadenas pesadas) puede ser el "botón", mientras que el otro es el "ojal". La introducción de un puente disulfuro estabiliza además los heterodímeros (Merchant, A.M, et al., Nature Biotech. 16 (1998) 677-681, Atwell, S., et al. J. Mol. Biol.

270 (1997) 26-35) e incrementa el rendimiento.

Por tanto, en un modo de realización de la invención, dicho anticuerpo multiespecífico (comprende un dominio CH3 en cada cadena pesada y) se caracteriza además por que

el primer dominio CH3 de la primera cadena pesada del anticuerpo en a) y el segundo dominio CH3 de la segunda cadena pesada del anticuerpo en b) se encuentran cada uno en una interfase que comprende una interfase original entre los dominios CH3 del anticuerpo.

en el que dicha interfase se altera para promover la formación del anticuerpo multiespecífico, en el que la alteración se caracteriza por que:

i) se altera el dominio CH3 de una cadena pesada,

de modo que dentro de la interfase original del dominio CH3 de una cadena pesada que se encuentra con la interfase original del dominio CH3 de la otra cadena pesada dentro del anticuerpo multiespecífico,

se reemplaza un residuo de aminoácido con un residuo de aminoácido que tiene un mayor volumen de cadena lateral, generando de este modo una protuberancia dentro de la interfase del dominio CH3 de una cadena pesada que se puede situar en una cavidad dentro de la interfase del dominio CH3 de la otra cadena pesada

y

ii) se altera el dominio CH3 de la otra cadena pesada,

de modo que dentro de la interfase original del segundo dominio CH3 que se encuentra con la interfase original del primer dominio CH3 dentro del anticuerpo multiespecífico,

se reemplaza un residuo de aminoácido con un residuo de aminoácido que tiene un volumen de cadena lateral más pequeño, generando de este modo

una cavidad dentro de la interfase del segundo dominio CH3 dentro de la que se puede colocar una protuberancia dentro de la interfase del primer dominio CH3.

Preferentemente, dicho residuo de aminoácido que tiene un mayor volumen de cadena lateral se selecciona del grupo que consiste en arginina (R), fenilalanina (F), tirosina (Y), triptófano (W).

Preferentemente dicho residuo de aminoácido que tiene un volumen de cadena lateral más pequeño se selecciona del grupo que consiste en alanina (A), serina (S), treonina (T), valina (V).

En un aspecto de la invención, ambos dominios CH3 se alteran además mediante la introducción de cisteína (C) como aminoácido en las posiciones correspondientes de cada dominio CH3, de modo que se puede formar un puente disulfuro entre ambos dominios CH3.

En un modo de realización preferente, dicho anticuerpo multiespecífico comprende una mutación aminoacídica T366W en el primer dominio CH3 de la "cadena botón" y las mutaciones aminoacídicas T366S, L368A, Y407V en el segundo dominio CH3 de la "cadena ojal". También se puede usar un puente disulfuro intercatenario adicional entre los dominios CH3 (Merchant, A.M., et al., Nature Biotech. 16 (1998) 677-681), por ejemplo, introduciendo una mutación aminoacídica Y349C en el dominio CH3 de la "cadena ojal" y una mutación aminoacídica E356C o una mutación aminoacídica S354C en el dominio CH3 de la "cadena botón".

En un modo de realización preferente, dicho anticuerpo multiespecífico (que comprende un dominio CH3 en cada cadena pesada) comprende las mutaciones aminoacídicas S354C, T366W en uno de los dos dominios CH3 y las mutaciones aminoacídicas Y349C, T366S, L368A, Y407V en el otro de los dos dominios CH3 (la mutación aminoacídica S354C adicional en un dominio CH3 y la mutación aminoacídica Y349C en el otro dominio CH3 que forma un puente disulfuro intercatenario) (numeración de acuerdo con Kabat).

Otras técnicas de modificaciones de CH3 para garantizar la heterodimerización se contemplan como alternativas de la invención y se describen por ejemplo, en los documentos WO 96/27011, WO 98/050431, EP 1870459, WO 2007/110205, WO 2007/147901, WO 2009/089004, WO 2010/129304, WO 2011/90754, WO 2011/143545, WO 2012/058768, WO 2013/157954, WO 2013/096291.

En un modo de realización, el enfoque de heterodimerización descrito en el documento EP1 870459A1 se puede usar de forma alternativa. Este enfoque se basa en la mediante la introducción de sustituciones/mutaciones de aminoácidos cargados con la carga opuesta en posiciones aminoacídicas específicas en la interfase del dominio CH3/CH3 entre ambas cadenas pesadas. Un modo de realización preferente para dicho anticuerpo multiespecífico es las mutaciones aminoacídicas R409D; K370E en el primer dominio CH3 del (del anticuerpo multiespecífico) y las mutaciones aminoacídicas D399K; E357K en el segundo dominio CH3 del anticuerpo multiespecífico (numeración de acuerdo con Kabat).

En otro modo de realización, dicho anticuerpo multiespecífico comprende una mutación aminoacídica T366W en el dominio CH3 de la "cadena botón" y las mutaciones aminoacídicas T366S, L368A, Y407V en el dominio CH3 de la "cadena ojal" y, adicionalmente, las mutaciones aminoacídicas R409D; K370E en el dominio CH3 de la "cadena botón" y las mutaciones aminoacídicas D399K; E357K en el dominio CH3 de la "cadena ojal".

En otro modo de realización, dicho anticuerpo multiespecífico comprende las mutaciones aminoacídicas S354C, T366W en uno de los dos dominios CH3 y las mutaciones aminoacídicas Y349C, T366S, L368A, Y407V en el otro de los dos dominios CH3 o dicho anticuerpo multiespecífico comprende las mutaciones aminoacídicas Y349C, T366W en uno de los dos dominios CH3 y las mutaciones aminoacídicas S354C, T366S, L368A, Y407V en el otro de los dos dominios CH3 y, adicionalmente, las mutaciones aminoacídicas R409D; K370E en el dominio CH3 de la "cadena botón" y las mutaciones aminoacídicas D399K; E357K en el dominio CH3 de la "cadena ojal".

En un modo de realización, el enfoque de heterodimerización descrito en el documento WO 2013/157953 se puede usar de forma alternativa. En un modo de realización, un primer dominio CH3 comprende la mutación aminoacídica T366K y un segundo dominio CH3 comprende la mutación aminoacídica L351D. En otro modo de realización, el primer dominio CH3 comprende otra mutación aminoacídica L351K. En otro modo de realización, el segundo dominio CH3 comprende otra mutación aminoacídica seleccionada de Y349E, Y349D y L368E (preferentemente L368E).

En un modo de realización, el enfoque de heterodimerización descrito en el documento WO 2012/058768 se puede usar de forma alternativa. En un modo de realización, un primer dominio CH3 comprende las mutaciones aminoacídicas L351Y, Y407A y un segundo dominio CH3 comprende las mutaciones aminoacídicas T366A, K409F. En otro modo de realización, el segundo dominio CH3 comprende otra mutación aminoacídica en la posición T411, D399, S400, F405, N390 o K392, por ejemplo, seleccionada de a) T411 N, T411 R, T411Q, T411 K, T411D, T411E o T411W, b) D399R, D399W, D399Y o D399K, c) S400E, S400D, S400R, o S400K F405I, F405M, F405T, F405S, F405V o F405W N390R, N390K o N390D K392V, K392M, K392R, K392L, K392F o K392E. En otro modo de realización, un primer dominio CH3 comprende las mutaciones aminoacídicas L351Y, Y407A y un segundo dominio CH3 comprende las mutaciones aminoacídicas T366V, K409F. En otro modo de realización, un primer dominio CH3 comprende la mutación aminoacídica Y407A y un segundo dominio CH3 comprende las mutaciones aminoacídicas T366A, K409F. En otro modo de realización, el segundo dominio CH3 comprende otras mutaciones aminoacídicas K392E, T411E, D399R y S400R.

En un modo de realización, el enfoque de heterodimerización descrito en el documento WO 2011/143545 se puede usar de forma alternativa, por ejemplo, con la modificación aminoacídica en una posición seleccionada del grupo que consiste en 368 y 409.

En un modo de realización, el enfoque de heterodimerización descrito en el documento WO 2011/090762, que también usa la tecnología "botón en ojal" descrita anteriormente, se puede usar de forma alternativa. En un modo de realización, un primer dominio CH3 comprende las mutaciones aminoacídicas T366W y un segundo dominio CH3 comprende las mutaciones aminoacídicas Y407A. En un modo de realización, un primer dominio CH3 comprende las mutaciones aminoacídicas T366Y y un segundo dominio CH3 comprende las mutaciones aminoacídicas Y407T.

En un modo de realización, el enfoque de heterodimerización descrito en el documento WO 2009/089004 se puede usar de forma alternativa. En un modo de realización, un primer dominio CH3 comprende la sustitución aminoacídica de K392 o N392 con un aminoácido cargado negativamente (por ejemplo, ácido glutámico (E), o ácido aspártico (D), preferentemente K392D o N392D) y un segundo dominio CH3 comprende la sustitución aminoacídica de D399, E356, D356 o E357 con un aminoácido cargado positivamente (por ejemplo, lisina (K) o arginina (R), preferentemente D399K, E356K, D356K o E357K, y más preferentemente D399K y E356K). En otro modo de realización, el primer dominio CH3 comprende además la sustitución aminoacídica de K409 o R409 con un aminoácido cargado negativamente (por ejemplo, ácido glutámico (E), o ácido aspártico (D), preferentemente K409D o R409D). En otro modo de realización, el primer dominio CH3 comprende además o de forma alternativa la sustitución aminoacídica de K439 y/o K370 con un aminoácido cargado negativamente (por ejemplo, ácido glutámico (E), o ácido aspártico (D)).

En un modo de realización, el enfoque de heterodimerización descrito en el documento WO 2007/147901 se puede usar de forma alternativa. En un modo de realización, un primer dominio CH3 comprende las mutaciones aminoacídicas K253E, D282K y K322D y un segundo dominio CH3 comprende las mutaciones aminoacídicas D239K, E240K y K292D.

En un modo de realización, el enfoque de heterodimerización descrito en el documento WO 2007/110205 se puede usar de forma alternativa.

Procedimientos y formulaciones recombinantes

Los anticuerpos se pueden producir usando procedimientos y formulaciones recombinantes, por ejemplo, como se describe en el documento US 4.816.567. Se proporciona(n) ácido(s) nucleico(s) aislado(s) que codifica(n) un anticuerpo como se describe en el presente documento. Dicho ácido nucleico puede codificar una secuencia de aminoácidos que comprende el VL y/o una secuencia de aminoácidos que comprende el VH del anticuerpo (por ejemplo, las cadenas ligeras y/o pesadas del anticuerpo). Se proporcionan uno o más vectores (por ejemplo, vectores de expresión) que comprenden dicho ácido nucleico. Se proporciona una célula huésped que comprende dicho ácido nucleico. Una célula huésped comprende (por ejemplo, se ha transformado con): (1) un vector que comprende un ácido nucleico que codifica una secuencia de aminoácidos que comprende el VL del anticuerpo y una secuencia de aminoácidos que comprende el VH del anticuerpo, o (2) un primer vector que comprende un ácido nucleico que codifica una secuencia de aminoácidos que comprende el VL del anticuerpo y un segundo vector que comprende un ácido nucleico que codifica una secuencia de aminoácidos que comprende el VH del anticuerpo. La célula huésped es eucariota, por ejemplo, una célula de ovario de hámster chino (CHO) o célula linfática (por ejemplo, célula Y0, NS0, Sp20). Se proporciona un procedimiento de preparación de un anticuerpo como se informa en el presente documento, en el que el procedimiento comprende cultivar una célula huésped que comprende un ácido nucleico que codifica el anticuerpo, como se proporciona anteriormente, en condiciones adecuadas para la expresión del anticuerpo y recuperar opcionalmente el anticuerpo de la célula huésped (o medio de cultivo de células huésped).

Para la producción recombinante de una región Fc variante, el ácido nucleico que codifica la región Fc variante, por ejemplo, como se describe anteriormente, se aísla e inserta en uno o más vectores para su clonación y/o expresión adicional en una célula huésped. Dicho ácido nucleico se puede aislar y secuenciar fácilmente usando procedimientos convencionales (por ejemplo, usando sondas de oligonucleótidos, que se pueden unir específicamente a genes que codifican los polipéptidos de la región Fc variante o las cadenas pesadas y ligeras del anticuerpo).

Las células huésped adecuadas para la clonación o expresión de vectores que codifican el anticuerpo incluyen las células procariotas o eucariotas descritas en el presente documento. Por ejemplo, se pueden producir anticuerpos en bacterias, en particular, cuando no son necesarias la glucosilación ni la función efectora de Fc. Para la expresión de fragmentos de anticuerpo y polipéptidos en bacterias, véanse, por ejemplo, los documentos US 5.648.237, US 5.789.199 y US 5.840.523 (véase también Charlton, K.A., en: Methods in Molecular Biology, vol. 248, Lo, B.K.C. (ed.), Humana Press, Totowa, NJ (2003), págs. 245-254, que describe la expresión de fragmentos de anticuerpo en E. coli). Después de la expresión, se puede aislar el anticuerpo de la pasta de células bacterianas en una fracción soluble y además se puede purificar.

Además de los procariotas, los microbios eucariotas, tales como los hongos filamentosos o levaduras, son huéspedes de clonación o expresión adecuados para vectores que codifican anticuerpos, incluyendo cepas de hongos y levaduras en las que sus vías de glucosilación se han "humanizado", lo que da como resultado la producción de un anticuerpo con un patrón de glucosilación parcial o completamente humano. Véanse Gerngross, T.U., Nat. Biotech. 22 (2004) 1409-1414; y Li, H. et al., Nat. Biotech. 24 (2006) 210-215.

Las células huésped adecuadas para la expresión del anticuerpo glucosilado también se derivan de organismos pluricelulares (invertebrados y vertebrados). Los ejemplos de células de invertebrado incluyen células vegetales y de insecto. Se han identificado numerosas cepas de baculovirus que se pueden usar junto con células de insecto, en particular para la transfección de células de Spodoptera frugiperda.

También se pueden utilizar cultivos de células vegetales como huéspedes. Véanse, por ejemplo, los documentos US 5.959.177, US 6.040.498, US 6.420.548, US 7.125.978 y US 6.417.429 (que describen la tecnología PLANTIBODIES™ para producir anticuerpos en plantas transgénicas).

También se pueden usar células de vertebrado como huéspedes. Por ejemplo, pueden ser útiles líneas de células de mamífero que se adaptan para el cultivo en suspensión. Otros ejemplos de líneas de células huésped de mamífero útiles son línea CV1 de riñón de mono transformada por SV40 (COS-7); línea de riñón embrionario humano (células HEK293 o 293 como se describe, por ejemplo, en Graham, F.L., et al., J. Gen Virol. 36 (1977) 59 74); células de riñón de cría de hámster (BHK); células de Sertoli de ratón (células TM4 como se describe, por ejemplo, en Mather, J.P., Biol. Reprod. 23 (1980) 243-252); células de riñón de mono (CV1); células de riñón de mono verde africano (VERO-76); células de carcinoma de cuello uterino humano (HELA); células de riñón canino (MDCK); células de hígado de rata búfalo (BRL3A); células de pulmón humano (W138); células de hígado humano (Hep G2); tumor mamario de ratón (MMT060562); células TRI, como se describe, por ejemplo, en Mather, J.P., et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383 (1982) 44-68; células MRC5; y células FS4. Otras líneas de células huésped de mamífero útiles incluyen células de ovario de hámster chino (CHO), incluyendo células CHO DHFR- (Urlaub G., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77 (1980) 4216-4220); y líneas celulares de mieloma, tales como Y0, NS0 y Sp2/0. Para una revisión de determinadas líneas de células huésped de mamífero adecuadas para la producción de anticuerpos, véase, por ejemplo, Yazaki, P. y Wu, A.M., Methods in Molecular Biology, vol. 248, Lo, B.K.C. (ed.), Humana Press, Totowa, Nj (2004), págs. 255-268.

Ensayos

Los anticuerpos proporcionados en el presente documento se pueden identificar, cribar o caracterizar para determinar sus propiedades físicas/químicas y/o sus actividades biológicas mediante diversos ensayos conocidos en la técnica.

En un aspecto, un anticuerpo como se informa en el presente documento se somete a prueba para determinar su actividad de unión a antígeno, por ejemplo, mediante procedimientos conocidos, tales como ELISA, inmunoelectrotransferencia, etc.

Inmunoconjugados

La invención también proporciona inmunoconjugados que comprenden un anticuerpo de acuerdo con la invención conjugado a uno o más agentes citotóxicos, tales como agentes o fármacos quimioterápicos, agentes inhibidores del crecimiento, toxinas (por ejemplo, toxinas proteínicas, toxinas enzimáticamente activas de origen bacteriano, fúngico, vegetal o animal o fragmentos de las mismas) o isótopos radioactivos.

En un modo de realización, un inmunoconjugado es un conjugado anticuerpo-fármaco (ADC) en el que un anticuerpo está conjugado a uno o más fármacos, incluyendo, pero sin limitarse a, un maitansinoide (véanse los documentos US 5.208.020, US 5.416.064 y EP 0 425 235 B1); una auristatina tal como restos de fármaco monometil auristatina DE y DF (MMAE y MMAF) (véanse los documentos US 5.635.483, US 5.780.588 y US 7.498.298); una dolastatina; una caliqueamicina o un derivado de la misma (véanse los documentos US 5.712.374, US 5.714.586, US 5.739.116, US 5.767.285, US 5.770.701, US 5.770.710, US 5.773.001 y US 5.877.296; Hinman, L.M. et al., Cancer Res. 53 (1993) 3336-3342; y Lode, H.N. et al., Cancer Res. 58 (1998) 2925-2928); una antraciclina tal como daunomicina o doxorrubicina (véase Kratz, F. et al., Curr. Med. Chem. 13 (2006) 477-523; Jeffrey, S.C. et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. 16 (2006) 358-362; Torgov, M.Y. et al., Bioconjug. Chem. 16 (2005) 717-721; Nagy, A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97 (2000) 829-834; Dubowchik, G.M. et al., Bioorg. & Med. Chem. Letters 12 (2002) 1529-1532; King, H.D. et al., J. Med. Chem. 45 (2002) 4336-4343; y el documento US 6.630.579); metotrexato; vindesina; un taxano tal como docetaxel, paclitaxel, larotaxel, tesetaxel y ortataxel; un tricoteceno; y CC1065.

En otro modo de realización, un inmunoconjugado comprende un anticuerpo como se describe en el presente documento conjugado a una toxina enzimáticamente activa o fragmento de la misma, que incluye, pero sin limitarse a, la cadena A de difteria, fragmentos activos que no se unen de la toxina diftérica, la cadena A de exotoxina (de Pseudomonas aeruginosa), la cadena A de ricina, la cadena A de abrina, la cadena A de modeccina, alfa-sarcina, proteínas de Aleurites fordii, proteínas de diantina, proteínas de Phytolaca americana (PAPI, PAPII y PAP-S), inhibidor de Momordica charantia, curcina, crotina, inhibidor de Saponaria officinalis, gelonina, mitogelina, restrictocina, fenomicina, enomicina y los tricotecenos.

En otro modo de realización, un inmunoconjugado comprende un anticuerpo como se describe en el presente documento conjugado a un átomo radioactivo para formar un radioconjugado. Está disponible una variedad de isótopos radioactivos para la producción de radioconjugados. Los ejemplos incluyen At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32, Pb212 e isótopos radioactivos de Lu. Cuando se usa el radioconjugado para la detección, puede comprender un átomo radioactivo para estudios gammagráficos, por ejemplo, TC99m o I123, o un marcador de espín para resonancia magnética nuclear (RMN) (también conocida como resonancia magnética, RM), tal como yodo-123, yodo-131, indio-111, flúor-19, carbono-13, nitrógeno-15, oxígeno-17, gadolinio, manganeso o hierro.

Se pueden preparar conjugados de un anticuerpo y agente citotóxico usando una variedad de agentes de acoplamiento de proteínas bifuncionales, tales como 3-(2-piridilditio)propionato de N-succinimidilo (SPDP), 4-(N-maleimidometil)ciclohexano-1-carboxilato de succinimidilo (SMCC), iminotiolano (IT), derivados bifuncionales de imidoésteres (tales como adipimidato de dimetilo HCl), ésteres activos (tales como suberato de disuccinimidilo), aldehídos (tales como glutaraldehído), compuestos de bis-azido (tales como bis(p-azidobenzoil)hexanodiamina), derivados de bis-diazonio (tales como bis-(p-diazoniobenzoil)-etilendiamina), diisocianatos (tales como toluen-2,6-diisocianato) y compuestos de flúor bis-activos (tales como 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenceno). Por ejemplo, se puede preparar una inmunotoxina de ricina como se describe en Vitetta, E.S. et al., Science 238 (1987) 1098-1104. El ácido 1-isotiocianatobencil-3-metildietilentriaminopentaacético (MX-DTPA) marcado con carbono 14 es un agente quelante ejemplar para la conjugación del radionúclido al anticuerpo. Véase el documento WO 94/11026. El conector puede ser un "conector escindible" que facilite la liberación de un fármaco citotóxico en la célula. Por ejemplo, se puede usar un conector lábil en ácido, un conector sensible a peptidasa, un conector fotolábil, un conector de dimetilo o un conector que contiene disulfuro (Chari, R.V. et al., Cancer Res. 52 (1992) 127-131; documento US5.208.020).

Los inmunoconjugados o ADC en el presente documento contemplan expresamente, pero no se limitan a, dichos conjugados preparados con reactivos de reticulación, incluyendo, pero sin limitarse a, BMPS, EMCS, GMBS, HBVS, LC-SMCC, MBS, MPBH, SBAP, SIA, SIAB, SMCC, SMPB, SMPH, sulfo-EMCS, sulfo-GMBS, sulfo-KMUS, sulfo-MBS, sulfo-SIAB, sulfo-SMCC y sulfo-SMPB y SVSB ((4-vinilsulfona)benzoato de succinimidilo), que están disponibles comercialmente (por ejemplo, de Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL., EE. UU.).

Procedimientos y formulaciones para diagnóstico y detección

Cualquiera de los anticuerpos proporcionados en el presente documento es útil para detectar la presencia de su(s) antígeno(s) afín o afines en una muestra biológica. El término "detectar" como se usa en el presente documento engloba la detección cuantitativa o cualitativa. En determinados modos de realización, una muestra biológica comprende una célula o tejido.

Se proporcionan anticuerpos marcados como se informa en el presente documento. Los marcadores incluyen, pero no se limitan a, marcadores o restos que se detectan directamente (tales como marcadores fluorescentes, cromóforos, electrodensos, quimioluminiscentes y radioactivos), así como restos, tales como enzimas o ligandos, que se detectan indirectamente, por ejemplo, a través de una reacción enzimática o interacción molecular. Los marcadores ejemplares incluyen, pero no se limitan a, los radioisótopos 32P, 14C, 125I, 3H y 131I, fluoróforos, tales como quelatos de tierras raras o fluoresceína y sus derivados, rodamina y sus derivados, dansilo, umbeliferona, luciferasas, por ejemplo, luciferasa de luciérnaga y luciferasa bacteriana (US4.737.456), luciferina, 2,3-dihidroftalacindionas, peroxidasa de rábano picante (HRP), fosfatasa alcalina, p-galactosidasa, glucoamilasa, lisozima, oxidasas de sacáridos, por ejemplo, glucosa oxidasa, galactosa oxidasa y glucosa-6-fosfato deshidrogenasa, oxidasas heterocíclicas, tales como uricasa y xantina oxidasa, acopladas con una enzima que emplea peróxido de hidrógeno para oxidar un precursor de tinte, tal como HRP, lactoperoxidasa o microperoxidasa, biotina/avidina, marcadores de espín, marcadores de bacteriófagos, radicales libres estables y similares.

Formulaciones farmacéuticas

Las formulaciones farmacéuticas de un anticuerpo como se describe en el presente documento se preparan mezclando dicho anticuerpo que tiene el grado de pureza deseado con uno o más vehículos farmacéuticamente aceptables opcionales (Remington's Pharmaceutical Sciences, 16.a edición, Osol, A. (ed.) (1980)), en forma de formulaciones liofilizadas o soluciones acuosas. Los vehículos farmacéuticamente aceptables, en general, no son tóxicos para los receptores a las dosificaciones y concentraciones empleadas e incluyen, pero no se limitan a: tampones tales como fosfato, citrato y otros ácidos orgánicos; antioxidantes, incluyendo ácido ascórbico y metionina; conservantes (tales como cloruro de octadecildimetilbencilamonio; cloruro de hexametonio; cloruro de benzalconio, cloruro de bencetonio; fenol, alcohol butílico o bencílico; alquilparabenos tales como metil o propilparabeno; catecol; resorcinol; ciclohexanol; 3-pentanol; y m-cresol); polipéptidos de bajo peso molecular (menos de aproximadamente 10 residuos); proteínas, tales como seroalbúmina, gelatina o inmunoglobulinas; polímeros hidrófilos tales como polivinilpirrolidona; aminoácidos tales como glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina o lisina; monosacáridos, disacáridos y otros carbohidratos, incluyendo glucosa, manosa o dextrinas; agentes quelantes tales como EDTA; glúcidos tales como sacarosa, manitol, trehalosa o sorbitol; contraiones formadores de sal tales como sodio; complejos metálicos (por ejemplo, complejos Zn-proteína) y/o tensioactivos no iónicos tales como polietilenglicol (PEG). Los vehículos farmacéuticamente aceptables ejemplares en el presente documento incluyen además agentes de dispersión de fármacos intersticiales tales como glucoproteínas hialuronidasas activas a pH neutro solubles (sHASEGP), por ejemplo, glucoproteínas hialuronidasas a pH-20 solubles humanas, tales como rhuPH20 (HYLENEX®, Baxter International, Inc.). Determinadas sHASEGP ejemplares y procedimientos de uso, incluyendo rhuPH20, se describen en los documentos US 2005/0260186 y US 2006/0104968. En un aspecto, una sHASEGP se combina con una o más glucosaminoglucanasas adicionales tales como condroitinasas.

Las formulaciones de anticuerpo liofilizadas ejemplares se describen en el documento US 6.267.958. Las formulaciones de anticuerpo acuosas incluyen las descritas en los documentos US 6.171.586 y WO 2006/044908, incluyendo las últimas formulaciones un tampón histidina-acetato.

La formulación en el presente documento también puede contener más de un ingrediente activo según sea necesario para la indicación particular que se está tratando, preferentemente aquellos con actividades complementarias que no se vean afectadas de forma adversa entre sí. Dichos ingredientes activos están presentes adecuadamente en combinación en cantidades que son eficaces para el propósito pretendido.

Se pueden atrapar ingredientes activos en microcápsulas preparadas, por ejemplo, por técnicas de coacervación o por polimerización interfacial, por ejemplo, microcápsulas de hidroximetilcelulosa o gelatina y microcápsulas de poli(metacrilato de metilo), respectivamente, en sistemas de suministro de fármaco coloidales (por ejemplo, liposomas, microesferas de albúmina, microemulsiones, nanopartículas y nanocápsulas) o en macroemulsiones. Dichas técnicas se divulgan en Remington's Pharmaceutical Sciences, 16.a edición, Osol, A. (ed.) (1980).

Se pueden preparar preparaciones de liberación mantenida. Los ejemplos adecuados de preparaciones de liberación mantenida incluyen matrices semipermeables de polímeros hidrófobos sólidos que contienen el anticuerpo, estando dichas matrices en forma de artículos conformados, por ejemplo, películas o microcápsulas.

Las formulaciones que se van a usar para su administración in vivo son en general estériles. La esterilidad se puede conseguir fácilmente, por ejemplo, por filtración a través de membranas de filtración estériles.

Procedimientos y formulaciones terapéuticos

Cualquiera de los anticuerpos proporcionados en el presente documento se puede usar en procedimientos terapéuticos.

En un aspecto, se proporciona un anticuerpo de acuerdo con la invención para su uso como medicamento.

En otro aspecto, la invención proporciona el uso de un anticuerpo en la fabricación o preparación de un medicamento. Un "individuo" de acuerdo con cualquiera de los modos de realización anteriores puede ser un ser humano.

En otro aspecto, la invención proporciona formulaciones farmacéuticas que comprenden cualquiera de los anticuerpos proporcionados en el presente documento, por ejemplo, para su uso en cualquiera de los procedimientos terapéuticos anteriores. En un modo de realización, una formulación farmacéutica comprende cualquiera de los anticuerpos proporcionados en el presente documento y un vehículo farmacéuticamente aceptable. En otro modo de realización, una formulación farmacéutica comprende cualquiera de los anticuerpos proporcionados en el presente documento y al menos un agente terapéutico adicional, por ejemplo, como se describe a continuación.

Los anticuerpos de acuerdo con la invención se pueden usar solos o bien en combinación con otros agentes en un tratamiento. Por ejemplo, se puede coadministrar un anticuerpo de acuerdo con la invención con al menos un agente terapéutico adicional.

Un anticuerpo de acuerdo con la invención (y cualquier agente terapéutico adicional) se puede administrar por cualquier medio adecuado, que incluye la administración parenteral, intrapulmonar e intranasal y, si se desea para el tratamiento local, la administración intralesional. Las infusiones parenterales incluyen administración intramuscular, intravenosa, intraarterial, intraperitoneal o subcutánea. La dosificación puede ser por cualquier vía adecuada, por ejemplo, por inyecciones, tales como inyecciones intravenosas o subcutáneas, dependiendo en parte de si la administración es breve o crónica. En el presente documento se contemplan diversas pautas de dosificación incluyendo, pero sin limitarse a, administraciones individuales o múltiples durante diversos puntos temporales, administración en bolo e infusión pulsada.

Los anticuerpos de acuerdo con la invención se formularán, dosificarán y administrarán de forma consecuente con las buenas prácticas médicas. Los factores que se deben tener en consideración en este contexto incluyen el trastorno particular que se está tratando, el mamífero particular que se está tratando, el estado clínico del paciente individual, la causa del trastorno, el sitio de administración del agente, el procedimiento de administración, la programación de la administración y otros factores conocidos por los médicos. El anticuerpo no lo necesita, pero opcionalmente se formula con uno o más agentes usados actualmente para prevenir o tratar el trastorno en cuestión. La cantidad eficaz de dichos otros agentes depende de la cantidad de anticuerpo presente en la formulación, del tipo de trastorno o tratamiento y de otros factores analizados anteriormente. Estos se usan, en general, en las mismas dosificaciones y con las vías de administración como se describe en el presente documento, o aproximadamente de un 1 a un 99 % de las dosificaciones descritas en el presente documento, o en cualquier dosificación y por cualquier vía que se determine empíricamente/clínicamente que sea apropiada.

Para la prevención o tratamiento de la enfermedad, la dosificación apropiada de un anticuerpo de acuerdo con la invención (cuando se usa solo o en combinación con uno o más de otros agentes terapéuticos adicionales) dependerá del tipo de enfermedad que se va a tratar, el tipo de anticuerpo, la gravedad y evolución de la enfermedad, si se administra anticuerpo con propósitos preventivos o terapéuticos, tratamiento previo, anamnesis del paciente y respuesta al anticuerpo y el criterio del médico especialista. El anticuerpo se administra adecuadamente al paciente de una vez o durante una serie de tratamientos. Dependiendo del tipo y gravedad de la enfermedad, de aproximadamente 1 pg/kg a 15 mg/kg (por ejemplo, 0,5 mg/kg - 10 mg/kg) de anticuerpo puede ser una dosificación candidata inicial para su administración al paciente, ya sea, por ejemplo, por una o más administraciones separadas o por infusión continua. Una dosificación diaria típica podría variar de aproximadamente 1 pg/kg a 100 mg/kg o más, dependiendo de los factores mencionados anteriormente. Para administraciones repetidas durante varios días o más, dependiendo de la afección, el tratamiento en general se mantendría hasta que se produzca una supresión deseada de los síntomas de enfermedad. Una dosificación ejemplar del anticuerpo estaría en el intervalo de aproximadamente 0,05 mg/kg a aproximadamente 10 mg/kg. Por tanto, se pueden administrar al paciente una o más dosis de aproximadamente 0,5 mg/kg, 2,0 mg/kg, 4,0 mg/kg o 10 mg/kg (o cualquier combinación de las mismas). Dichas dosis se pueden administrar de forma intermitente, por ejemplo, cada semana o cada tres semanas (por ejemplo, de modo que el paciente recibe de aproximadamente dos a aproximadamente veinte, o por ejemplo, aproximadamente seis dosis del anticuerpo). Se puede administrar una dosis de carga mayor inicial, seguido de una o más dosis menores. La progresión de este tratamiento se sigue fácilmente por técnicas y ensayos convencionales.

Se entiende que cualquiera de las formulaciones o procedimientos terapéuticos anteriores se puede llevar a cabo usando un inmunoconjugado como se informa en el presente documento en lugar de o además de un anticuerpo de acuerdo con la invención.

Artículos de fabricación

Como se informa en el presente documento, se proporciona un artículo de fabricación que contiene materiales útiles para el tratamiento, prevención y/o diagnóstico de los trastornos descritos anteriormente. El artículo de fabricación comprende un recipiente y una ficha técnica o prospecto del envase en o asociado con el recipiente. Los recipientes adecuados incluyen, por ejemplo, frascos, viales, jeringuillas, bolsas de solución i.v., etc. Los recipientes pueden estar formados por una variedad de materiales, tales como vidrio o plástico. El recipiente contiene una formulación que es por sí misma o combinada con otra formulación eficaz para tratar, prevenir y/o diagnosticar la afección y puede tener una vía de acceso estéril (por ejemplo, el recipiente puede ser una bolsa con solución intravenosa o un vial que tiene un tapón perforable por una aguja de inyección hipodérmica). Al menos un agente activo de la formulación es un anticuerpo de acuerdo con la invención. La ficha técnica o prospecto del envase indica que la formulación se usa para tratar la afección de elección. Además, el artículo de fabricación puede comprender (a) un primer recipiente con una formulación contenida en el mismo, en el que la formulación comprende un anticuerpo de acuerdo con la invención; y (b) un segundo recipiente con una formulación contenida en el mismo, en el que la formulación comprende otro agente citotóxico o terapéutico de otro tipo. El artículo de fabricación puede comprender además un prospecto del envase que indique que las formulaciones se pueden usar para tratar una afección particular. De forma alternativa, o adicionalmente, el artículo de fabricación puede comprender además un segundo (o tercer) recipiente que comprenda un tampón farmacéuticamente aceptable, tal como agua bacteriostática para inyectables (BWFI), solución salina tamponada con fosfato, solución de Ringer y solución de dextrosa. Puede incluir además otros materiales deseables desde un punto de vista comercial y del usuario, incluyendo otros tampones, diluyentes, filtros, agujas y jeringuillas.

Se entiende que cualquiera de los artículos de fabricación anteriores puede incluir un inmunoconjugado como se informa en el presente documento en lugar o además de un anticuerpo de acuerdo con la invención.

III. Ejemplos

Los siguientes son ejemplos de procedimientos y formulaciones como se informa en el presente documento. Se entiende que se pueden poner en práctica diversos otros modos de realización, dada la descripción general proporcionada anteriormente.

Aunque la invención anterior se ha descrito con cierto detalle a modo de ilustración y ejemplo con propósitos de claridad de comprensión, las descripciones y ejemplos no se deben interpretar como limitantes del alcance como se informa en el presente documento.

Procedimientos

Espectrometría de masas de ionización por electronebulización (EM-IEN)

Se desglucosilaron alícuotas de proteína (50 pg) añadiendo 0,5 pl de N-glucanasa plus (Roche) y tampón de fosfato de sodio (0,1 M, pH 7,1) para obtener un volumen de muestra final de 115 pl. La mezcla se incubó a 37 °C durante 18 h. Después, para la reducción y desnaturalización se añadieron 60 pl de TCEP 0,5 M (Pierce) en guanidina * HCl 4 M (Pierce) y 50 pl de guanidina * HCl 8 M. La mezcla se incubó a 37 °C durante 30 min. Se desalaron las muestras por cromatografía de exclusión por tamaño (Sepharose G-25, isocrática, acetonitrilo al 40 % con ácido fórmico al 2 %). Se registraron espectros de masas de IEN (+va) en un instrumento Q-TOF (maXis, Bruker) equipado con una fuente de nano-IEN (TriVersa NanoMate, Advion). Las configuraciones de los parámetros de e M fueron como sigue: transferencia: embudo de RF, 400 Vpp; energía ISCID, 0 eV; RF multipolar, 400 Vpp; cuadrupolo: energía iónica, 4,0 eV; masa baja, 600 m/z; fuente: gas seco, 8 l/min; temperatura del gas seco, 160 °C; celda de colisión: energía de colisión, 10 eV; RF de colisión: 2000 Vpp; refrigerador de iones: RF de refrigerador de iones, 300 Vpp; tiempo de transferencia: 120 ps; almacenamiento de prepulsos, 10 ps; intervalo de barrido de m/z de 600 a 2000. Para la evaluación de los datos se usó un programa informático desarrollado internamente (MassAnalyzer).

Análisis por resonancia de plasmón superficial (RPS) para FcRn

Se analizaron las propiedades de unión del anticuerpo natural y los mutantes al FcRn mediante tecnología de resonancia de plasmón superficial (RPS) usando un instrumento BIAcore T100 (BIAcore AB, Uppsala, Suecia). Este sistema está bien establecido para el estudio de las interacciones moleculares. Permite un seguimiento continuo ultrarrápido de las uniones ligando/analito y, por tanto, la determinación de los parámetros cinéticos en diversas configuraciones de ensayo. La tecnología de RPS se basa en la medición del índice de refracción cerca de la superficie de un chip de biosensor recubierto de oro. Los cambios en el índice de refracción indican cambios de masa en la superficie provocados por la interacción del ligando inmovilizado con el analito inyectado en solución. Si las moléculas se unen a un ligando inmovilizado en la superficie, la masa se incrementa, en caso de una disociación, la masa disminuye. En el ensayo actual, se inmovilizó el receptor FcRn en un chip biosensor CM5 de BIAcore (GE Healthcare Bioscience, Uppsala, Suecia) por medio de acoplamiento de amina a un nivel de 400 unidades de respuesta (UR). El ensayo se llevó a cabo a temperatura ambiente con PBS, Tween-20TM al 0,05 %, pH 6,0 (GE Healthcare Bioscience) como tampón de migración y dilución. Se inyectaron 200 nM de muestras de anticuerpos a un caudal de 50 pl/min a temperatura ambiente. El tiempo de asociación fue de 180 segundos, la fase de disociación duró 360 segundos. La regeneración de la superficie del chip se alcanzó por una inyección corta de HBS-P, pH 8,0. Se realizó la evaluación de los datos de r Ps mediante comparación de la altura de señal de respuesta biológica a los 180 segundos después de la inyección y a los 300 segundos después de la inyección. Los parámetros correspondientes son el nivel máx. de UR (180 segundos después de la inyección) y la estabilidad tardía (300 segundos después del final de la inyección).

Análisis por resonancia de plasmón superficial (RPS) para proteína A

El ensayo se basa en la espectroscopia de resonancia de plasmón superficial. Se inmoviliza proteína A en la superficie de un biosensor de RPS. Al inyectar la muestra en las cubetas de lectura del espectrómetro de RPS, forma un complejo con la proteína A inmovilizada, dando como resultado un incremento de masa en la superficie del chip del sensor y, por lo tanto, una respuesta más alta (ya que 1 UR se define como 1 pg/mm2). Después se regenera el chip del sensor disolviendo el complejo de muestra-proteína A. Las respuestas obtenidas se evalúan a continuación para la determinación de la señal alta en unidades de respuesta (UR) y el comportamiento de disociación.

Se acoplaron alrededor de 3500 unidades de respuesta (UR) de proteína A (20 pg/ml) en un chip CM5 (GE Healthcare) a pH 4,0 usando el kit de acoplamiento de amina de GE Healthcare.

La muestra y el tampón del sistema fueron HBS-P+ (HEPES 0,01 M, NaCl 0,15 M, tensioactivo P20 al 0,005 % filtrado estéril, pH 7,4). La temperatura de la cubeta de lectura se configuró a 25 °C y la del compartimento de muestras a 12 °C. El sistema se cebó con tampón de migración. A continuación, se inyectaron soluciones 5 nM de las construcciones de la muestra durante 120 segundos con un caudal de 30 pl/min, seguido de una fase de disociación de 300 segundos. A continuación, la superficie del chip del sensor se regeneró mediante dos inyecciones de 30 segundos de duración de glicina-HCl pH 1,5 a un caudal de 30 pl/min. Cada muestra se midió como un triplicado.

Anticuer os bies ecíficos sus res ectivas secuencias

El término "con (la) mutación IHH-AAA", como se usa en el presente documento, se refiere a la combinación de las mutaciones I253A (Ile253Ala), H310A (His310Ala) y H435A (His435Ala) en una región de la cadena pesada constante de la subclase IgG1 o IgG4 (numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat), el término "con (la) mutación HHY-AAA", como se usa en el presente documento, se refiere a la combinación de las mutaciones H310A (His310Ala), H433A (His433Ala) e Y436A (Tyr436Ala) en una región de la cadena pesada constante de la subclase IgG1 o IgG4 (numeración de acuerdo con el índice UE de Kabat), el término "con (la) mutación P329G LALA", como se usa en el presente documento, se refiere a la combinación de las mutaciones L234A (Leu234Ala), L235A (Leu235Ala) y P329G (Pro329Gly) en una región de la cadena pesada constante de la subclase IgG1 (numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat), y el término "con (la) mutación SPLE", como se usa en el presente documento, se refiere a la combinación de las mutaciones S228P (Ser228Pro) y L235E (Leu235Glu) en una región de la cadena pesada constante de la subclase IgG4 (numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat).

General

La información general sobre las secuencias de nucleótidos de las cadenas ligera y pesada de inmunoglobulina humana se proporciona en: Kabat, E.A., et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5.a ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991). Los residuos de aminoácido de las cadenas de los anticuerpos se numeran y se denominan de acuerdo con la numeración EU (Edelman, G.M., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA63 (1969) 78-85; Kabat, E.A., et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5.a ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, (1991)).

Técnicas de ADN recombinante

Se usaron procedimientos estándar para manipular el ADN como se describe en Sambrook, J. et al., Molecular cloning: A laboratory manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York (1989). Se usaron los reactivos biológicos moleculares de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

Síntesis génica

Los segmentos de genes deseados se ordenaron de acuerdo con las especificaciones dadas en Geneart (Regensburg, Alemania).

Determinación de la secuencia de ADN

Las secuencias de ADN se determinaron mediante secuenciación bicatenaria realizada en MediGenomix GmbH (Martinsried, Alemania) o SequiServe GmbH (Vaterstetten, Alemania).

Análisis de la secuencia de ADN y proteínas y gestión de datos de secuencia

Se usaron el paquete de programa informático de GCG (Genetics Computer Group, Madison, Wisconsin), versión 10,2 y el paquete Vector NT1 Advance, versión 8,0 de Infomax para la creación, mapeo, análisis, anotación e ilustración de secuencia.

Vectores de expresión

Para la expresión de los anticuerpos descritos se usaron plásmidos de expresión para la expresión transitoria (por ejemplo, en células HEK293-F) basados en una organización de ADNc con o sin un promotor de CMV-Intrón A o bien en una organización genómica con un promotor de CMV.

La unidad de transcripción del gen del anticuerpo se componía de los siguientes elementos:

- sitio(s) de restricción único(s) en el extremo 5',

- el potenciador y promotor temprano inmediato de citomegalovirus humano,

- en el caso de la organización de ADNc, la secuencia de intrón A,

- una región 5' no traducida de un gen de inmunoglobulina humana,

- un ácido nucleico que codifica una secuencia señal de la cadena pesada de inmunoglobulina,

- un ácido nucleico que codifica la cadena de anticuerpo humano (natural o con intercambio de dominios) como ADNc o bien en organización genómica con la organización de exón-intrón de inmunoglobulina,

- una región 3' no traducida con una secuencia señal de poliadenilación, y

- sitio(s) de restricción único(s) en el extremo 3'.

Además del casete de expresión del anticuerpo, los plásmidos contenían:

- un origen de replicación que permite la replicación de este plásmido en E. coli,

- un gen de p-lactamasa que confiere resistencia a la ampicilina en E. coli, y

- el gen de la dihidrofolato reductasa de Mus musculus como marcador seleccionable en células eucariotas. Los ácidos nucleicos que codifican las cadenas de anticuerpo se generaron mediante PCR y/o síntesis génica y se ensamblaron mediante procedimientos y técnicas recombinantes conocidos mediante la conexión de los segmentos de ácido nucleico correspondientes, por ejemplo, usando sitios de restricción únicos en los vectores respectivos. Las secuencias de ácido nucleico subclonadas se verificaron por secuenciación de ADN. Para las transfecciones transitorias se prepararon mayores cantidades de los plásmidos mediante la preparación de plásmidos a partir de cultivos transformados de E. coli (Nucleobond AX, Macherey-Nagel).

Técnicas de cultivo celular

Se usaron técnicas de cultivo celular estándar como se describe en Current Protocols in Cell Biology (2000), Bonifacino, J.S., Dasso, M., Harford, J.B., Lippincott-Schwartz, J. y Yamada, K.M. (eds.), John Wiley & Sons, Inc. Los anticuerpos biespecíficos se expresaron mediante cotransfección transitoria de los respectivos plásmidos de expresión en células HEK293-F que crecen en suspensión como se describe a continuación.

Ejemplo 1

Expresión y purificación

Transfecciones transitorias en el sistema HEK293-F

Los anticuerpos monoespecíficos y biespecíficos se generaron por transfección transitoria con los plásmidos respectivos (por ejemplo, codificando la cadena pesada y pesada modificada, así como la cadena ligera y ligera modificada correspondiente) usando el sistema HEK293-F (Invitrogen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. En resumen, se transfectaron células HEK293-F (Invitrogen) que crecen en suspensión en un matraz agitador o bien en un fermentador agitado en un medio de expresión sin suero FreeStyle™ 293 (Invitrogen) con una mezcla de los respectivos plásmidos de expresión y 293Fectin™ o Fectin (Invitrogen). Para el matraz agitador de 2 l (Corning) se sembraron células HEK293-F a una densidad de 1 *106 células/ml en 600 ml y se incubaron a 120 rpm, con un 8 % de CO2. Al día siguiente, las células se transfectaron a una densidad celular de aproximadamente 1,5*106 células/ml con aproximadamente 42 ml de una mezcla de A) 20 ml de Opti-MEM (Invitrogen) con 600 pg de ADN plasmídico total (1 pg/ml) que codifica la cadena pesada o pesada modificada, respectivamente, y la cadena ligera correspondiente en una proporción equimolar, y B) 20 ml de Opti-MEM con 1,2 ml de 293Fectin o Fectin (2 pl/ml). De acuerdo con el consumo de glucosa, se añadió solución de glucosa durante el curso de la fermentación. El sobrenadante que contenía el anticuerpo secretado se recogió después de 5-10 días y los anticuerpos se purificaron directamente del sobrenadante o bien el sobrenadante se congeló y almacenó.

Purificación

Se purificaron anticuerpos biespecíficos de los sobrenadantes de cultivo celular mediante cromatografía de afinidad usando MabSelectSure-Sepharose™ (para mutantes que no son IHH-AAA) (GE Healthcare, Suecia) o KappaSelect-Agarose (para mutantes IHH-AAA) (GE Healthcare, Suecia), cromatografía de interacción hidrófoba usando butil-Sepharose (GE Healthcare, Suecia) y cromatografía de exclusión por tamaño Superdex 200 (GE Healthcare, Suecia).

En resumen, se capturaron sobrenadantes de cultivo celular filtrados estériles en una resina MabSelectSuRe equilibrada (mutaciones que no son IHH-AAA y anticuerpos naturales) con tampón de PBS (Na2HPO4 10 mM, KH2PO4 1 mM, NaCl 137 mM y KCl 2,7 mM, pH 7,4), se lavaron con tampón de equilibrado y se eluyeron con citrato de sodio 25 mM a pH 3,0. Se capturaron los mutantes IHH-AAA en una resina KappaSelect equilibrada con Tris 25 mM, NaCl 50 mM, pH 7,2, se lavaron con tampón de equilibrado y se eluyeron con citrato de sodio 25 mM pH 2,9. Se combinaron las fracciones de anticuerpo eluido y se neutralizaron con Tris 2 M, pH 9,0. Las mezclas de anticuerpos se prepararon para la cromatografía de interacción hidrófoba añadiendo solución de sulfato de amonio 1,6 M a una concentración final de sulfato de amonio 0,8 M y el pH se ajustó a pH 5,0 usando ácido acético. Después de equilibrar la resina de butil-Sepharose con acetato de sodio 35 mM, sulfato de amonio 0,8 M, pH 5,0, se aplicaron los anticuerpos a la resina, se lavaron con tampón de equilibrado y se eluyeron con un gradiente lineal a acetato de sodio 35 mM pH 5,0. Las fracciones que contenían anticuerpos (monoespecíficos o biespecíficos) se combinaron y purificaron adicionalmente mediante cromatografía de exclusión por tamaño usando una columna Superdex 200 26/60 GL (GE Healthcare, Suecia) equilibrada con histidina 20 mM, NaCl 140 mM, pH 6,0. Las fracciones que contenían anticuerpos (monoespecíficos o biespecíficos) se combinaron, se concentraron en la concentración requerida usando dispositivos de ultrafiltración Vivaspin (Sartorius Stedim Biotech S.A., Francia) y se almacenaron a -80 °C.

Tabla: Rendimientos de anticuerpos <VEGF-ANG-2> biespecíficos

Se analizaron la pureza y la integridad de los anticuerpos después de cada etapa de purificación por CE-SDS usando la tecnología microfluídica Labchip (Caliper Life Science, EE. UU.). Se prepararon cinco pl de solución de proteína para el análisis de CE-SDS usando el kit de reactivo HT Protein Express de acuerdo con las instrucciones del fabricante y se analizó en un sistema LabChip GXII usando un chip HT Protein Express. Los datos se analizaron usando el programa informático LabChip GX.

Tabla: Eliminación de productos secundarios típicos mediante diferentes etapas de purificación secuencial determinada por CE-SDS.

El contenido agregado de las muestras de anticuerpo se analizó por SEC de alto rendimiento usando una columna de exclusión por tamaño analítica Superdex 200 (GE Healthcare, Suecia) en 2xPBS (Na2HPO420 mM, KH2PO4 2 mM, NaCl 274 mM y KCl 5,4 mM, pH7,4) con tampón de migración a 25 °C. Se inyectaron 25 pg de proteína en la columna a un caudal de 0,75 ml/min y se eluyó en condiciones isocráticas en 50 minutos.

Análogamente, los anticuerpos biespecíficos <VEGF-ANG-2> VEGFang2-0012 y VEGFang2-0201 se prepararon y purificaron con los siguientes rendimientos:

También los anticuerpos biespecíficos <VEGF-ANG-2> <VEGF-ANG-2> CrossMAb IgG4 con mutación IHH-AAA y con mutación SPLE (SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45), <VEGF-ANG-2> OAscFab IgG1 con mutación IHH-AAA (SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 48), <VEGF-ANG-2> OAscFab IgG4 con mutación IHH-AAA y con mutación SPLE (SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51), <VEGF-ANG-2> CrossMab IgG1 con mutación HHY-AAA y mutación P329G LALA (SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41), <VEGF-ANG-2> CrossMab IgG4 con mutación HHY-AAA y mutación SPLE (SEQ ID NO: 92, SEQ ID NO: 93, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45), <VEGF-ANG-2> OAscFab IgG1 con mutación HHY-AAA (SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO: 95, SEQ ID NO: 48), y <VEGF-ANG-2> OAscFab IgG4 con mutación HHY-AAA y mutación SPLE (SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 97, s EQ ID NO: 51) se pueden preparar y purificar de forma análoga.

Ejemplo 2

Analítica y desarrollabilidad

Medición de viscosidad basada en DLS a pequeña escala.

La medición de la viscosidad se realizó esencialmente como se describe en He, F. et al., Analytical Biochemistry 399 (2009) 141-143. En resumen, las muestras se concentraron a diversas concentraciones de proteína en succinato de arginina 200 mM, pH 5,5, antes de que se añadieran microesferas de látex de poliestireno (diámetro de 300 nm) y Polisorbato 20 (0,02 % v/v). Las muestras se transfirieron a una placa óptica de 384 pocillos mediante centrifugación a través de una placa de filtro de 0,4 pm y se cubrieron con aceite de parafina. El diámetro aparente de las microesferas de látex se determinó mediante dispersión dinámica de la luz a 25 °C. La viscosidad de la solución se puede calcular como q = q0(rh/rh,0) (q: viscosidad; q0: viscosidad del agua; rh: radio hidrodinámico aparente de las microesferas de látex; rh,0: radio hidrodinámico de las microesferas de látex en agua).

Para permitir la comparación de diversas muestras a la misma concentración, los datos de viscosidadconcentración se ajustaron con la ecuación de Mooney (Ecuación 1) (Mooney, M., Colloid. Sci., 6 (1951) 162-170; Monkos, K., Biochem. Biophys. Acta 304 (1997) 1339) y los datos se interpolaron en consecuencia.

n = n0exp^SO) Ecuación 1

(S: parámetro de interacción hidrodinámica de la proteína; K: factor de apiñamiento; O: fracción de volumen de la proteína disuelta)

Los resultados se muestran en la figura 2: VEGFang2-0016 con mutación IHH-AAA en la región Fc muestra una viscosidad más baja a todas las temperaturas medidas en comparación con VEGFang2-0015 sin la mutación IHH-AAA en la región Fc.

Temperatura de comienzo de la agregación por DLS

Las muestras se prepararon a una concentración de 1 mg/ml en histidina/clorhidrato de histidina 20 mM, NaCl 140 mM, pH 6,0, se transfirieron a una placa óptica de 384 pocillos mediante centrifugación a través de una placa de filtro de 0,4 pm y se cubrieron con aceite de parafina. El radio hidrodinámico se midió repetidamente mediante dispersión dinámica de la luz (DLS), mientras que las muestras se calentaron a una velocidad de 0,05 °C/min de 25 °C a 80 °C. La temperatura de comienzo de la agregación se define como la temperatura a la que el radio hidrodinámico se empieza a incrementar. Los resultados se muestran en la figura 3. En la figura 3 se muestra la agregación de VEGFang2-0015 sin la mutación IHH-AAA frente a VEGFang2-0016 con mutación IHH-AAA en la región Fc. VEGFang2-0016 mostró una temperatura de comienzo de la agregación de 61 °C, mientras que VEGFang2-0015 sin la mutación IHH-AAA mostró una temperatura de comienzo de 60 °C.

Evolución temporal por DLS

Las muestras se prepararon a una concentración de 1 mg/ml en histidina/clorhidrato de histidina 20 mM, NaCl 140 mM, pH 6,0, se transfirieron a una placa óptica de 384 pocillos mediante centrifugación a través de una placa de filtro de 0,4 pm y se cubrieron con aceite de parafina. El radio hidrodinámico se midió repetidamente mediante dispersión dinámica de la luz (DLS), mientras las muestras se mantuvieron a una temperatura constante de 50 °C durante hasta 145 horas. En este experimento, las tendencias de agregación de la proteína natural, desplegada a temperatura elevada darían lugar a un incremento del diámetro de partícula promedio con el tiempo. Este procedimiento basado en DLS es muy sensible para los agregados, ya que estos contribuyen de manera sobreproporcionada a la intensidad de luz dispersada. Incluso después de 145 horas a 50 °C (una temperatura cercana a la temperatura de comienzo de la agregación, véase arriba), se descubrió un incremento del diámetro de partícula promedio de solo menos de 0,5 nm para VEGFang2-0015 y para VEGFang2-0016.

Siete días de almacenamiento a 40 °C a 100 mg/ml

Las muestras se concentraron a una concentración final de 100 mg/ml en succinato de arginina 200 mM, pH 5,5, se filtraron de forma estéril y se almacenaron de forma estable a 40 °C durante siete días. Antes y después del almacenamiento, el contenido de especies de alto y bajo peso molecular (PMA y PMB, respectivamente) se determinó mediante cromatografía de exclusión por tamaño. La diferencia en el contenido de PMA y PMB entre la muestra almacenada y una muestra medida inmediatamente después de la preparación se informa como "incremento de PMA" e "incremento de PMB", respectivamente. Los resultados se muestran en la siguiente tabla y en la figura 4, que muestran que VEGFang2-0015 (sin mutación IHH-AAA) muestra una mayor reducción del pico principal y un mayor incremento de PMA en comparación con VEGFang2-0016 (con mutación IHH-AAA). Sorprendentemente, VEGFang2-0016 (con mutación IHH-AAA) mostró una menor tendencia a la agregación en comparación con VEGFang2-0015 (sin mutación IHH-AAA).

Tabla: Picos de PMA y PMB principales delta después de siete días a 40 °C

El análisis funcional de los anticuerpos biespecíficos <VEGF-ANG-2> se evaluó mediante resonancia de plasmón de superficie (RPR) usando un instrumento BIAcore® T100 o T200 (GE Healthcare) a 25 °C. El sistema BIAcore® está bien establecido para el estudio de las interacciones moleculares. La tecnología de RPS se basa en la medición del índice de refracción cerca de la superficie de un chip de biosensor recubierto de oro. Los cambios en el índice de refracción indican cambios de masa en la superficie provocados por la interacción del ligando inmovilizado con el analito inyectado en solución. La masa se incrementa si las moléculas se unen a ligandos inmovilizados en la superficie, y viceversa, la masa disminuye en caso de disociación del analito del ligando inmovilizado (reflejando la disociación del complejo). La RPS permite un seguimiento continuo en ultrarrápido de las uniones ligando/analito y, por tanto, la determinación de la constante de velocidad de asociación (ka), la constante de velocidad de disociación (kd) y la constante de equilibrio (KD).

Ejemplo 3

Unión a VEGF, ANG-2, FcgammaR y FcRn

Afinidad cinética de las isoformas de VEGF, incluyendo la evaluación de la reactividad cruzada entre especies

Aproximadamente 12.000 unidades de resonancia (UR) del sistema de captura (10 pg/ml de anti-F(Ab)'2 humano caprino; código de pedido: 28958325; GE Healthcare Bio-Sciences AB, Suecia) se acoplaron a un chip CM5 (GE Healthcare BR-1005-30) a pH5,0 usando un kit de acoplamiento de amina suministrado por GE Healthcare. La muestra y el sistema tampón fueron PBS-T (solución salina tamponada con fosfato 10 mM que incluía Tween-20™ al 0,05 %), pH 7,4. La cubeta de lectura se fijó a 25 °C y el bloque de muestra se fijó a 12 °C y se purgó dos veces con tampón de migración. El anticuerpo biespecífico se capturó inyectando una solución 50 nM durante 30 segundos a un caudal de 5 pl/min. Se midió la asociación mediante inyección de hVEGF121 humano recombinante, mVEGF120 de ratón o rVEGF164 de rata a diversas concentraciones en solución durante 300 segundos a un caudal de 30 pl/min, partiendo de 300 nM en diluciones 1:3. Se hizo seguimiento de la fase de disociación durante hasta 1200 segundos y se desencadenó cambiando de la solución de muestra al tampón de migración. La superficie se regeneró en 60 segundos lavando con solución de glicina pH 2,1 a un caudal de 30 pl/min. Se corrigieron las diferencias en el índice de refracción aparente restando la respuesta obtenida de una superficie de anti-F(ab')2 humano caprino. También se restaron las inyecciones del blanco (= doble referencia). Para el cálculo de Kd aparente y otros parámetros cinéticos se usó el modelo 1:1 de Langmuir. Los resultados se muestran a continuación.

Afinidad en solución de ANG-2, incluyendo la evaluación de la reactividad cruzada entre especies

La afinidad en solución mide la afinidad de una interacción al determinar la concentración de compañeros de interacción libre en una mezcla en equilibrio. El ensayo de afinidad en solución implica la mezcla de un anticuerpo biespecífico <VEGF-ANG-2>, mantenido a una concentración constante, con un ligando (= ANG-2) a concentraciones variables. Las unidades de resonancia máximas posibles (por ejemplo, 17.000 unidades de resonancia (UR)) de un anticuerpo se inmovilizaron en la superficie del chip c M5 (GE Healthcare BR-1005-30) a pH 5,0 usando un kit de acoplamiento de amina suministrado por GE Healthcare. El tampón de muestra y el tampón del sistema fueron HBS-P a pH 7,4. La cubeta de lectura se fijó a 25 °C y el bloque de muestra a 12 °C y se purgó dos veces con tampón de migración. Para generar una curva de calibración se inyectaron concentraciones crecientes de ANG-2 en una cubeta de lectura BIAcore que contenía el anticuerpo biespecífico <VEGF-ANG-2> inmovilizado. La cantidad de ANG-2 unida se determinó como unidades de resonancia (UR) y se representó frente a la concentración. Soluciones de cada ligando (11 concentraciones de 0 a 200 nM para el anticuerpo biespecífico <VEGF-ANG-2>) se incubaron con ANG-2 10 nM y se dejó que alcanzaran el equilibrio a temperatura ambiente. Las concentraciones de ANG-2 libre se determinaron a partir de la curva de calibración generada antes y después de medir la respuesta de las soluciones con cantidades conocidas de ANG-2. Se estableció un ajuste de 4 parámetros con XLfit4 (IDBS Software) usando el Modelo 201 usando la concentración de ANG-2 libre como eje y y la concentración de anticuerpo usada para la inhibición como eje x. La afinidad se calculó determinando el punto de inflexión de esta curva. La superficie se regeneró mediante un lavado de 30 segundos con una solución de H3PO4 al 0,85 % a un caudal de 30 pl/min. Las diferencias en el índice de refracción aparente se corrigieron sustrayendo la respuesta obtenida a partir de una superficie acoplada al blanco. Los resultados se muestran a continuación.

Afinidad por FcRn de estado estable

Para la medición de FcRn se usó una afinidad de estado estable para comparar los anticuerpos biespecíficos entre sí. El FcRn humano se diluyó en un tampón de acoplamiento (acetato de Na 10 pg/ml, pH 5,0) y se inmovilizó en un chip CI (GE Healthcare BR-1005-35) mediante un procedimiento de inmovilización dirigida usando un asistente BIAcore hasta una respuesta final de 200 UR. La cubeta de lectura se fijó a 25 °C y el bloque de muestra a 12 °C y se purgó dos veces con tampón de migración. La muestra y el sistema tampón fueron PBS-T (solución salina tamponada con fosfato 10 mM que incluía Tween-20™ al 0,05 %), pH 6,0. Para evaluar diferentes concentraciones de IgG para cada anticuerpo se preparó una concentración de 62,5 nM, 125 nM, 250 nM y 500 nM. El caudal se estableció en 30 pl/min y las diferentes muestras se inyectaron consecutivamente sobre la superficie del chip, eligiendo el tiempo de asociación de 180 segundos. La superficie se regeneró inyectando PBS-T pH 8 durante 60 segundos a un caudal de 30 pl/min. Las diferencias en el índice de refracción aparente se corrigieron sustrayendo la respuesta obtenida a partir de una superficie de blanco. También se restaron las inyecciones de tampón (= doble referencia). Para el cálculo de la afinidad de estado estable se usó el procedimiento del programa informático BIA-Evaluation. En resumen, los valores de UR se representaron frente a las concentraciones analizadas, proporcionando una curva dosis-respuesta. En base a un ajuste de 2 parámetros, se calculó la asíntota superior, permitiendo la determinación del valor de UR medio-máximo y, por tanto, de la afinidad. Los resultados se muestran en la figura 5 y la tabla a continuación. De manera análoga, se puede determinar la afinidad por FcRn de macaco cangrejero, ratón y conejo.

Medición de FcgammaRIIIa

Para la medición de FcgammaRIIIa se usó un ensayo de unión directa. Se acoplaron aproximadamente 3000 unidades de resonancia (UR) del sistema de captura (1 pg/ml de Penta-His, Qiagen) en un chip CM5 (GE Healthcare BR-1005-30) a pH5,0 usando un kit de acoplamiento de amina suministrado por GE Healthcare. El tampón de muestra y el tampón del sistema fueron HBS-P+ a pH 7,4. La cubeta de lectura se fijó a 25 °C y el bloque de muestra se fijó a 12 °C y se purgó dos veces con tampón de migración. El receptor FcgammaRIIIa-His se capturó inyectando una solución 100 nM durante 60 segundos a un caudal de 5 pl/min. La unión se midió mediante la inyección de 100 nM de anticuerpo biespecífico o anticuerpos de control monoespecíficos (anticuerpo anti-digoxigenina (anti-Dig) para un anticuerpo de subclase IgG1 y de subclase IgG4) durante 180 segundos a un caudal de 30 pl/min. La superficie se regeneró en 120 segundos lavando con solución de glicina pH 2,5 a un caudal de 30 pl/min. Debido a que la unión a FcgammaRIIIa difiere del modelo 1:1 de Langmuir, con este ensayo solo se determinó la unión/no unión. De forma similar, se puede determinar la unión a FcgammaRIa y FcgammaRIIa. Los resultados se muestran en la figura 6, donde se deduce que la introducción de las mutaciones P329G LALA provocó que ya no se pudiera detectar la unión a FcgammaRIIIa.

Evaluación de la unión independiente de VEGF y ANG-2 a los anticuerpos biespecíficos <VEGF-ANG-2>

Se acoplaron aproximadamente 3500 unidades de resonancia (UR) del sistema de captura (10 pg/ml de anti-IgG humana caprino; GE Healthcare Bio-Sciences AB, Suecia) en un chip CM4 (GE Healthcare, BR-1005-34) a pH 5,0 usando un kit de acoplamiento de amina suministrado por GE Healthcare. La muestra y el sistema tampón fueron PBS-T (solución salina tamponada con fosfato 10 mM que incluía Tween-20™ al 0,05 %), pH 7,4. La temperatura de la cubeta de lectura se fijó a 25 °C y la del bloque de muestra a 12 °C. Antes de la captura, se purgó dos veces la cubeta de lectura con tampón de migración.

El anticuerpo biespecífico se capturó inyectando una solución 10 nM durante 60 segundos a un caudal de 5 pl/min. La unión independiente de cada ligando al anticuerpo biespecífico se analizó determinando la capacidad de unión activa para cada ligando, añadido secuencial o simultáneamente (caudal de 30 pl/min):

1. Inyección de VEGF humano a una concentración de 200 nM durante 180 segundos (identifica la unión única del antígeno).

2. Inyección de ANG-2 humana a una concentración de 100 nM durante 180 segundos (identifica la unión única del antígeno).

3. Inyección de VEGF humano a una concentración de 200 nM durante 180 segundos, seguida de una inyección adicional de ANG-2 humana a una concentración de 100 nM durante 180 segundos (identifica la unión de ANG-2 en presencia de VEGF).

4. Inyección de ANG-2 humana a una concentración de 100 nM durante 180 segundos, seguida de una inyección adicional de VEGF humano a una concentración de 200 nM (identifica la unión de VEGF en presencia de ANG-2).

5. Coinyección de VEGF humano a una concentración de 200 nM y de ANG-2 humana a una concentración de 100 nM durante 180 segundos (identifica la unión de VEGF y de ANG-2 al mismo tiempo).

La superficie se regeneró mediante un lavado de 60 segundos con una solución 3 M de MgCb a un caudal de 30 pl/min. Se corrigieron las diferencias en el índice de refracción aparente restando la respuesta obtenida de una superficie de anti-IgG humana caprino.

El anticuerpo biespecífico se puede unir a ambos antígenos independientemente de forma mutua si la señal final resultante de los enfoques 3, 4 y 5 iguala o es similar a la suma de las señales finales individuales de los enfoques 1 y 2. Los resultados se muestran en la tabla a continuación, donde se demostró que ambos anticuerpos VEGFang2-0016, VEGFang2-0012 se pueden unir mutuamente de forma independiente a VEGF y ANG-2.

Evaluación de la unión simultánea de VEGF y ANG-2 a los anticuerpos biespecíficos <VEGF-ANG-2>

En primer lugar, se acoplaron aproximadamente 1600 unidades de resonancia (UR) de VEGF (20 pg/ml) en un chip CM4 (GE Healthcare BR-1005-34) a pH5,0 usando un kit de acoplamiento de amina suministrado por GE Healthcare. La muestra y el sistema tampón fueron PBS-T (solución salina tamponada con fosfato 10 mM que incluía Tween-20™ al 0,05 %), pH 7,4. La cubeta de lectura se fijó a 25 °C y el bloque de muestra a 12 °C y se purgó dos veces con tampón de migración. En segundo lugar, se inyectó una solución 50 nM del anticuerpo biespecífico durante 180 segundos a un caudal de 30 pl/min. En tercer lugar, se inyectó hANG-2 durante 180 segundos a un caudal de 30 pl/min. La respuesta de unión de hANG-2 depende de la cantidad del anticuerpo biespecífico unido a VEGF y muestra la unión simultánea. La superficie se regeneró mediante un lavado de 60 segundos con una solución de H3PO4 al 0,85 % a un caudal de 30 pl/min. La unión simultánea se muestra mediante una señal de unión específica adicional de hANG-2 a los anticuerpos biespecíficos <VEGF-ANG-2> unidos previamente a VEGF. Para ambos anticuerpos biespecíficos VEGFang2-0015 y VEGFang2-0016, se pudo detectar la unión simultánea de VEGF y ANG-2 a los anticuerpos biespecíficos <VEGF-ANG-2> (datos no mostrados).

Tabla: Resultados: Afinidades cinéticas por las isoformas de VEGF de diferentes especies

Tabla: Resultados: Afinidades en solución por ANG-2

Tabla: Resultados: Afinidad por FcRn de anticuerpos biespecíficos <VEGF-ANG-2>

Tabla: Resultados de la unión a FcgammaRI - IlIa

Tabla: Resultados: Unión independiente de VEGF y ANG-2 a anticuerpos biespecíficos <VEGF-ANG-2>

Ejemplo 4

Espectrometría de masas

Esta sección describe la caracterización de anticuerpos biespecíficos <VEGF-ANG-2> con énfasis en el correcto ensamblaje. Las estructuras primarias esperadas se confirmaron mediante espectrometría de masas de ionización por electronebulización (EM-IEN) de los anticuerpos biespecíficos <VEGF-ANG-2> desglucosilados e intactos o digeridos con IdeS (enzima degradante de IgG de S. pyogenes). La digestión con IdeS se realizó con 100 pg de anticuerpo purificado incubado con 2 pg de proteasa IdeS (Fabricator) en 100 mmol/l de NaH2PO4/Na2HPÜ4, pH 7,1 a 37 °C durante 5 h. Posteriormente, los anticuerpos se desglucosilaron con N-glucosidasa F, neuraminidasa y O-glucosidasa (Roche) en 100 mmol/l de NaH2PO4/Na2HPO4, pH 7,1 a 37 °C durante hasta 16 horas a una concentración de proteína de 1 mg/ml y posteriormente se desalificaron mediante HPLC en una columna Sephadex G25 (GE Healthcare). La masa total se determinó por medio de EM-IEN en un sistema de EM maXis 4G UHR-QTOF (Bruker Daltonik) equipado con una fuente TriVersa NanoMate (Advion).

Las masas obtenidas para las moléculas desglucosiladas y digeridas con IdeS (Tabla a continuación) o desglucosiladas intactas (tabla a continuación) corresponden a las masas previstas deducidas de las secuencias de aminoácidos para los anticuerpos biespecíficos <VEGF-ANG-2> que consisten en dos cadenas ligeras diferentes LCang-2 y LCLucentis, y dos cadenas pesadas diferentes HCang-2 y HCLucentis.

Tabla: Masas de los anticuerpos <VEGF/ANG2> biespecíficos desglucosilados y digeridos con IdeS VEGFang2-0201 (sin mutación IHH-AAA) y VEGFang2-0012 (con mutación IHH-AAA)

Tabla: Masas de los anticuerpos <VEGF/ANG2> desglucosilados VEGFang2-0016 (con mutación IHH-AAA) y VEGFang2-0015 (sin mutación IHH-AAA)

Ejemplo 5

Cromatografía con FcRn

Acoplamiento a estreptavidina Sepharose:

Se le añadió un gramo de estreptavidina Sepharose (GE Healthcare) al receptor biotinilado y dializado y se incubó durante dos horas con agitación. Se cargó la Sepharose derivatizada receptora en una columna XK de 1 ml (GE Healthcare).

Cromatografía usando la columna de afinidad por FcRn:

Condiciones:

dimensiones de la 50 mm x 5 mm

columna:

altura de lecho: 5 cm

carga: 50 pg de muestra

tampón de equilibrado: MES 20 mM, con NaCl 150 mM, ajustado a pH 5,5

tampón de elución: Tris/HCl 20 mM, con NaCl 150 mM, ajustado a pH 8,8

elución: tampón de equilibrado 7,5 VC, en tampón de elución 30 VC a 100 %, tampón de elución 10 VC

Cromatografía en columna de afinidad por FcRn humano

En la siguiente tabla se proporcionan los tiempos de retención de anticuerpos biespecíficos <VEGF-ANG-2> en columnas de afinidad que comprenden FcRn humano. Se obtuvieron los datos usando las condiciones anteriores.

Tabla: Resultados: tiempos de retención de anticuerpos biespecíficos <VEGF-ANG-2>

Ejemplo 6 Propiedades farmacocinéticas (FC) de los anticuerpos con mutación IHH-AAA

Datos FC con ratones FcRn transgénicos para FcRn humano

Fase in vivo:

El estudio incluyó ratones C57BL/6J hembra (fondo), que eran ratones deficientes en FcRn pero transgénicos hemicigóticos para FcRn humano (huFcRn, línea 276 -/tg)

Parte 1:

A todos los ratones se les inyectaron una vez por vía intravítrea en el ojo derecho 2 pl/animal de la solución apropiada (es decir, 21 pg compuesto/animal (VEGFAng2-0015 (sin mutación IHH-AAA)) o 23,6 pg de compuesto/animal (VEGFAng2-0016 (con mutación IHH-AAA)).

Los ratones se asignaron a 2 grupos con 6 animales cada uno. Se tomaron muestras de sangre del grupo 1 a las 2, 24 y 96 horas y del grupo 2 a las 7, 48 y 168 horas después de la dosificación.

La inyección en el vítreo del ojo derecho del ratón se realizó usando el sistema de microjeringa NanoFil para inyección de nanolitros de World Precision Instruments, Inc., Berlín, Alemania. Se anestesiaron los ratones con isoflurano al 2,5 % y para la visualización del ojo del ratón se usó un microscopio Leica MZFL3 con un aumento de 40 veces y un anillo de luz con una iluminación Leica KL2500 LCD. Posteriormente, se inyectaron 2 pl del compuesto usando una aguja de calibre 35.

Se extrajo sangre del plexo venoso retroocular del ojo contralateral de cada animal para la determinación de los niveles de compuesto en suero.

Se obtuvieron muestras de suero de al menos 50 pl de la sangre después de 1 hora a temperatura ambiente mediante centrifugación (9.300 x g) a 4 °C durante 3 min. Las muestras de suero se congelaron directamente después de la centrifugación y se almacenaron congeladas a -80 °C hasta su análisis. Los ojos tratados de los animales del grupo 1 se aislaron 96 horas después del tratamiento y los de los animales del grupo 2 se aislaron 168 horas después del tratamiento. Las muestras se almacenaron congeladas a -80 °C hasta su análisis.

Parte 2:

A todos los ratones se les inyectaron una vez por vía intravenosa en la vena de la cola 200 pl/animal de la solución apropiada (es decir, 21 pg compuesto/animal (VEGFAng2-0015 (sin mutación IHH-AAA)) o 23,6 pg de compuesto/animal (VEGFAng2-0016 (con mutación IHH-AAA)).

Los ratones se asignaron a 2 grupos con 5 animales cada uno. Se tomaron muestras de sangre del grupo 1 a las 1, 24 y 96 horas y del grupo 2 a las 7, 48 y 168 horas después de la dosificación. Se extrajo sangre del plexo venoso retroocular de cada animal para la determinación de los niveles de compuesto en suero.

Se obtuvieron muestras de suero de al menos 50 pl de la sangre después de 1 hora a temperatura ambiente mediante centrifugación (9.300 x g) a 4 °C durante 3 min. Las muestras de suero se congelaron directamente después de la centrifugación y se almacenaron congeladas a -80 °C hasta su análisis.

Preparación de lisados oculares completos (ratones)

Los lisados oculares se obtuvieron por desintegración fisicoquímica de todo el ojo de animales de laboratorio. Para la disgregación mecánica, se transfirió cada ojo a un microvial de 1,5 ml con fondo cónico. Después de la congelación y la descongelación, los ojos se lavaron una vez con 1 ml de tampón de lavado celular (Bio-Rad, kit de lisis celular Bio-Plex, ref. 171-304011). En la siguiente etapa, se añadieron 500 pl de tampón de lisis celular recién preparado y se molieron los ojos usando una mano de mortero de molienda de tejido de 1,5 ml (Kimble Chase, mano de mortero de 1,5 ml, art. n.° 749521 -1500). A continuación, la mezcla se congeló y descongeó cinco veces y se volvió a moler. Para separar el lisado del tejido restante, se centrifugaron las muestras durante 4 min a 4500 x g. Después de la centrifugación, se recogió el sobrenadante y se almacenó a -20 °C hasta su análisis posterior en el ELISA de cuantificación.

Análisis

Las concentraciones de los anticuerpos <VEGF-ANG-2> en el suero y los lisados oculares de los ratones se determinaron con un ensayo de inmunoadsorción enzimática (ELISA).

Para la cuantificación de los anticuerpos <VEGF-ANG-2> en muestras de suero y lisados oculares de ratón, se realizó un inmunoensayo de tipo sándwich en serie de fase sólida estándar con anticuerpos monoclonales biotinilados y digoxigenilados usados como anticuerpos de captura y detección. Para verificar la integridad de la biespecificidad del analito, el anticuerpo de captura biotinilado reconoce el sitio de unión a VEGF, mientras que el anticuerpo de detección digoxigenilado se unirá al sitio de unión a ANG-2 del analito. A continuación, se detectó el complejo inmunitario unido del anticuerpo de captura, analito y anticuerpo de detección en la fase sólida de la placa de microvaloración recubierta con estreptavidina (SA-MTP) con una peroxidasa de rábano picante acoplada a un anticuerpo anti-digoxigenina. Después de lavar el material no unido de la SA-MTP y de la adición de sustrato ABTS, la señal conseguida fue proporcional a la cantidad de analito unido en la fase sólida de la SA-MTP. A continuación, se realizó la cuantificación convirtiendo las señales medidas de las muestras en concentraciones referenciadas a los calibradores analizados en paralelo.

En una primera etapa, se recubrió la SA-MTP con 100 pl/pocillo de la solución de anticuerpo de captura biotinilado (anticuerpo anti-idiotipico mAb<Id<VEGF>>M-45/2/51-IgG-Bi(DDS)) con una concentración de 1 pg/ml durante una hora a 500 rpm en un agitador de MTP.

Mientras tanto, se prepararon los calibradores, las muestras de control de calidad (CC) y las muestras. Los calibradores y las muestras de CC se diluyeron al 2 % en una matriz de suero; las muestras se diluyeron hasta que las señales estuvieron dentro del intervalo lineal de los calibradores.

Después de recubrir la SA-MTP con el anticuerpo de captura, la placa se lavó tres veces con tampón de lavado y 300 pl/pocillo. Posteriormente, se pipetearon 100 pl/pocillo de los calibradores, muestras de CC y muestras en la SA-MTP y se incubaron de nuevo durante una hora a 500 rpm. El analito se unió ahora con su sitio de unión anti-VEGF por medio del anticuerpo de captura a la fase sólida de la SA-MTP. Después de la incubación y eliminación del analito no unido mediante lavado de la placa, se añadieron 100 pl/pocillo del primer anticuerpo de detección (anticuerpo anti-idiotipico mAb<Id-<ANG-2>>M-6/2/81-IgG-Dig(XOSu)) con una concentración de 250 ng/ml a la SA-MTP. De nuevo, se incubó la placa durante una hora a 500 rpm en un agitador. Después del lavado, se añadieron 100 pl/pocillo del segundo anticuerpo de detección ((pAb<Digoxigenina>S-Fab-POD (poli)) a una concentración de 50 mU/ml a los pocillos de la SA-MTP y se incubó nuevamente la placa durante una hora a 500 rpm. Después de una etapa de lavado final para eliminar el exceso del anticuerpo de detección, se añadieron 100 pl/pocillo de sustrato (ABTS). El conjugado anticuerpo-enzima cataliza la reacción de color del sustrato ABTS®. A continuación, se midió la señal mediante un lector de ELISA a una longitud de onda de 405 nm (longitud de onda de referencia: 490 nm ([405/490] nm)).

Evaluación farmacocinética

Se calcularon los parámetros farmacocinéticos mediante análisis no compartimental, usando el programa de evaluación farmacocinética WinNonlin™ (Pharsight), versión 5,2.1.

Resultados:

A) Concentraciones en suero

Los resultados para las concentraciones séricas se muestran en las siguientes tablas y figuras 7B a 7C.

Tabla: VEGFAng2-0015 (sin mutación IHH-AAA): Comparación de concentraciones séricas después de aplicación intravítrea e intravenosa

Tabla: VEGFAng2-0016 (con mutación IHH-AAA): Comparación de concentraciones séricas después de aplicación intravítrea e intravenosa

Tabla: VEGFang2-0015 (sin mutación IHH-AAA) y VEGFang2-0016 (con mutación IHH-AAA): Comparación de concentraciones séricas después de aplicación intravítrea

Tabla: VEGFang2-0015 (sin mutación IHH-AAA) y VEGFang2-0016 (con mutación IHH-AAA): Comparación de concentraciones séricas después de aplicación intravenosa

Resultados:

B) Concentraciones en lisados oculares de ojos izquierdo y derecho

Los resultados de las concentraciones en lisados oculares se muestran en las siguientes tablas y en las figuras 7D a 7E.

Tabla: Concentraciones de VEGFang2-0015 (sin mutación IHH-AAA) en lisados oculares después de aplicación intravítrea en el ojo derecho

Tabla: Concentraciones de VEGFang2-0015 (sin mutación IHH-AAA) en lisados oculares después de aplicación intravenosa

Tabla: Concentraciones de VEGFang2-0016 (con mutación IHH-AAA) en lisados oculares después de aplicación intravítrea en el ojo derecho

Tabla: Concentraciones de VEGFang2-0016 (con mutación IHH-AAA) en lisados oculares después de aplicación intravenosa

Resumen de resultados:

Después de la aplicación intravítrea, el anticuerpo biespecífico <VEGF-ANG-2> como se informa en el presente documento VEGFang2-0016 (con mutación IHH-AAA) muestra concentraciones similares (después de 96 y 168 horas) en los lisados oculares en comparación con el anticuerpo biespecífico <VEGF-ANG-2> VEGFang2-0015 (sin mutación IHH-AAA).

También después de la aplicación intravítrea, el anticuerpo biespecífico <VEGF-ANG-2> como se informa en el presente documento VEGFang2-0016 (con mutación IHH-AAA) muestra además un aclaramiento más rápido y una semivida más corta en suero en comparación con el anticuerpo biespecífico <VEGF-ANG-2> VEGFang2-0015 (sin mutación IHH-AAA).

Ejemplo 7

Ensayo de angiogénesis en m icrobolsillo corneal de ratones

Para someter a prueba el efecto anti-angiogénico del anticuerpo biespecífico <VEGF-ANG-2> con los respectivos VH y VL de unión a VEGF de SEQ ID NO: 20 y 21 y los VH y VL de unión a ANG-2 de SEQ ID NO: 28 y 29 en la angiogénesis inducida por VEGF in vivo, se realizó un ensayo de angiogénesis en microbolsillo corneal de ratón. En este ensayo se implantó un disco de Nylaflo empapado de VEGF en un bolsillo de la córnea avascular a una distancia fija de los vasos del limbo. Los vasos crecen inmediatamente en la córnea hacia el gradiente de VEGF en desarrollo. Se adquirieron ratones Balb/c hembra de 8 a 10 semanas de edad de Charles River, Sulzfeld, Alemania. El protocolo se modificó de acuerdo con el procedimiento descrito por Rogers, M.S., et al., Nat. Protoc.

2 (2007) 2545-2550. En resumen, se prepararon microbolsillos con un ancho de aproximadamente 500 pm bajo un microscopio a aproximadamente 1 mm desde el limbo hasta la parte superior de la córnea usando un bisturí quirúrgico y unas pinzas afiladas en el ratón anestesiado. Se implantó el disco (Nylaflo®, Pall Corporation, Michigan) con un diámetro de 0,6 mm y se alisó la superficie del área de implantación. Los discos se incubaron en el factor de crecimiento correspondiente o en un vehículo durante al menos 30 min. Después de 3, 5 y 7 días (o de forma alternativa solo después de 3, 5 o 7 días) se fotografiaron los ojos y se midió la respuesta vascular. El ensayo se cuantificó calculando el porcentaje del área de nuevos vasos por área total de la córnea.

Los discos se cargaron con 300 ng de VEGF o con PBS como control y se implantaron durante 7 días. El crecimiento de los vasos desde el limbo hasta el disco se monitorizó a lo largo del tiempo los días 3, 5 y/o 7. Un día antes de la implantación del disco, los anticuerpos se administraron por vía intravenosa a una dosis de 10 mg/kg (debido a la aplicación intravenosa, se usó como sustituto el VEGFang2-0015 (sin mutación IHH-AAA) estable en suero que solo difiere del VEGFang2-0016 por la mutación IHH-AAA y tiene los mismos VH y VL anti-VEGF y anti-ANG-2 para mediar en la eficacia) para someter a prueba el efecto anti-angiogénico en la angiogénesis inducida por VEGF in vivo. Los animales del grupo de control recibieron el vehículo. El volumen de aplicación fue de 10 ml/kg.

Ejemplo 8

Propiedades farmacocinéticas (FC) de los anticuerpos con mutación HHY-AAA

Datos FC con ratones FcRn transgénicos para FcRn humano

Fase in vivo:

El estudio incluye ratones C57BL/6J hembra (fondo); ratones deficientes en FcRn pero transgénicos hemicigóticos para FcRn humano (huFcRn, línea 276 -/tg)

Parte 1:

Todos los ratones se inyectan una vez por vía intravítrea en el ojo derecho con 2 pl/animal de la solución apropiada de VEGF/ANG2-0016, VEGF/ANG2-0096, VEGF/ANG2-0098, VEGF/ANG2-0121.

Los ratones se asignan a 2 grupos con 6 animales cada uno. Se toman muestras de sangre del grupo 1 a las 2, 24 y 96 horas y del grupo 2 a las 7, 48 y 168 horas después de la dosificación.

La inyección en el vítreo del ojo derecho del ratón se realiza usando el sistema de microjeringa NanoFil para inyección de nanolitros de World Precision Instruments, Inc., Berlín, Alemania. Se anestesian los ratones con isoflurano al 2,5 % y para la visualización del ojo del ratón se usa un microscopio Leica MZFL 3 con un aumento de 40 veces y un anillo de luz con una iluminación Leica KL2500 LCD. Posteriormente, se inyectan 2 pl del compuesto usando una aguja de calibre 35.

Se extrae sangre del plexo venoso retrobulbar del ojo contralateral de cada animal para la determinación de los niveles de compuesto en suero.

Se obtienen muestras de suero de al menos 50 pl de la sangre después de 1 hora a temperatura ambiente mediante centrifugación (9.300 x g) a 4 °C durante 3 min. Las muestras de suero se congelan directamente después de la centrifugación y se almacenan congeladas a -80 °C hasta su análisis. Los ojos tratados de los animales del grupo 1 se aíslan 96 horas después del tratamiento y los de los animales del grupo 2 se aíslan 168 horas después del tratamiento. Las muestras se almacenan congeladas a -80 °C hasta su análisis.

Parte 2:

Todos los ratones se inyectan una vez por vía intravenosa a través de la vena de la cola con 200 pl/animal del VEGF/ANG2-0096, VEGF/ANG2-0098 o VEGF/ANG2-0121 apropiados.

Los ratones se asignan a 2 grupos con 5 animales cada uno. Se toman muestras de sangre del grupo 1 a 1, 24 y 96 horas y del grupo 2 a las 7, 48 y 168 horas después de la dosificación. Se extrae sangre del plexo venoso retrobulbar de cada animal para la determinación de los niveles de compuesto en suero.

Se obtienen muestras de suero de al menos 50 pl de la sangre después de 1 hora a temperatura ambiente mediante centrifugación (9.300 x g) a 4 °C durante 3 min. Las muestras de suero se congelan directamente después de la centrifugación y se almacenan congeladas a -80 °C hasta su análisis.

Preparación de lisados oculares completos (ratones)

Los lisados oculares se obtienen por desintegración fisicoquímica de todo el ojo. Para la disgregación mecánica, se transfiere cada ojo a un microvial de 1,5 ml con fondo cónico. Después de la congelación y la descongelación, los ojos se lavan una vez con 1 ml de tampón de lavado celular (Bio-Rad, kit de lisis celular Bio-Plex, ref. 171 304011). En la siguiente etapa, se añaden 500 pl de tampón de lisis celular recién preparado y se muelen los ojos usando una mano de mortero de molienda de tejido de 1,5 ml (Kimble Chase, mano de mortero de 1,5 ml, art. n.° 749521-1500). A continuación, la mezcla se congela y descongela cinco veces y se vuelve a moler. Para separar el lisado del tejido restante, se centrifugan las muestras durante 4 min a 4.500 g. Después de la centrifugación, se recoge el sobrenadante y se almacena a -20 °C hasta su análisis posterior en el ELISA de cuantificación.

Análisis

Las concentraciones de los anticuerpos en el suero y los lisados oculares de los ratones se determinan con un ensayo de inmunoadsorción enzimática (ELISA).

Para la cuantificación de los anticuerpos en muestras de suero y lisados oculares de ratón, se realiza un inmunoensayo de tipo sándwich en serie de fase sólida estándar con anticuerpos monoclonales biotinilados y digoxigenados usados como anticuerpos de captura y detección. Para verificar específicamente la integridad de la biespecificidad del analito, el anticuerpo de captura biotinilado reconoce el sitio de unión a VEGF, mientras que el anticuerpo de detección digoxigenado se une al sitio de unión a ANG-2 del analito. A continuación, se detecta el complejo inmunitario unido del anticuerpo de captura, analito y anticuerpo de detección en la fase sólida de la placa de microvaloración recubierta con estreptavidina (SA-MTP) con una peroxidasa de rábano picante acoplada a un anticuerpo anti-digoxigenina. Después de lavar el material no unido de la SA-MTP y de la adición de sustrato ABTS, la señal conseguida es proporcional a la cantidad de analito unido en la fase sólida de la SA-MTP. A continuación, se realiza la cuantificación convirtiendo las señales medidas de las muestras en concentraciones referenciadas a los calibradores analizados en paralelo.

En una primera etapa, se recubre la SA-MTP con 100 pl/pocillo de la solución de anticuerpo de captura biotinilado (anticuerpo anti-idiotípico, por ejemplo, mAb<Id<VEGF>>M-45/2/51-IgG-Bi(DDS)) con una concentración de 1 pg/ml durante una hora a 500 rpm en un agitador de MTP. Mientras tanto, se preparan los calibradores, las muestras de control de calidad (CC) y las muestras. Los calibradores y las muestras de CC se diluyen al 2 % en una matriz de suero; las muestras se diluyen hasta que las señales estén dentro del intervalo lineal de los calibradores.

Después de recubrir la SA-MTP con el anticuerpo de captura, la placa se lava tres veces con tampón de lavado y 300 pl/pocillo. Posteriormente, se pipetean 100 pl/pocillo de los calibradores, muestras de CC y muestras, respectivamente, en la SA-MTP y se incuban de nuevo durante una hora a 500 rpm. El analito está unido ahora con uno de sus sitios de unión por medio del anticuerpo de captura a la fase sólida de la SA-MTP. Después de la incubación y eliminación del analito no unido mediante lavado de la placa, se añaden 100 pl/pocillo del primer anticuerpo de detección (anticuerpo anti-idiotípico, por ejemplo, mAb<Id-<ANG-2>>M-2.6.81-IgG-Dig(XOSu)) con una concentración de 250 ng/ml a la SA-MTP. De nuevo, se incuba la placa durante una hora a 500 rpm en un agitador. Después del lavado, se añaden 100 pl/pocillo del segundo anticuerpo de detección (por ejemplo, pAb<Digoxigenina>S-Fab-POD (poli)) a una concentración de 50 mU/ml a los pocillos de la SA-MTP y se incuba nuevamente la placa durante una hora a 500 rpm. Después de una etapa de lavado final para eliminar el exceso del anticuerpo de detección, se añaden 100 pl/pocillo de sustrato (ABTS®6). El conjugado anticuerpo-enzima cataliza la reacción de color del sustrato ABTS®. La señal se mide con un lector de ELISA a una longitud de onda de 405 nm (longitud de onda de referencia: 490 nm ([405/490] nm)).

Claims

REIVINDICACIONES

1. Una región Fc de la clase IgG que comprende un primer polipéptido de la región Fc variante y un segundo polipéptido de la región Fc variante,

en la que

a) el primer polipéptido de la región Fc variante se deriva de un primer polipéptido de la región Fc de la clase IgG original y el segundo polipéptido de la región Fc variante se deriva de un segundo polipéptido de la región Fc de la clase IgG original, con lo que el primer polipéptido de la región Fc de la clase IgG original es idéntico a o diferente del segundo polipéptido de la región Fc de la clase IgG original, y

b) el primer polipéptido de la región Fc variante difiere del segundo polipéptido de la región Fc variante en uno o más residuos de aminoácido distintos de los residuos de aminoácido en los que el primer polipéptido de la región Fc de la clase IgG original difiere del segundo polipéptido de la región Fc de la clase IgG original, y

c) la región Fc de la clase IgG que comprende el primer polipéptido de la región Fc variante y el segundo polipéptido de la región Fc variante tiene una afinidad por el receptor de Fc neonatal humano que es diferente a la de una región Fc de la clase IgG que comprende el primer polipéptido de la clase IgG original de a) y el segundo polipéptido de la región Fc de la clase IgG original de a),

en la que

2. La región Fc de la clase IgG de acuerdo con la reivindicación 1, en la que la región Fc de la clase IgG tiene una unión reducida a la proteína A estafilocócica que una región Fc de la clase IgG que comprende el primer polipéptido de la región Fc de la clase IgG original de a) y el segundo polipéptido de la región Fc de la clase IgG original de a).

3. Un anticuerpo que comprende la región Fc de la clase IgG de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2.

4. El anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 3, en el que el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.

5. El anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 4, en el que el anticuerpo es un anticuerpo humano, humanizado o quimérico.

6. El anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 5, en el que el anticuerpo es un anticuerpo biespecífico.

7. El anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 6, en el que el anticuerpo es un anticuerpo bivalente.

8. Un polipéptido de fusión de la región Fc que comprende la región Fc de la clase IgG de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2.

9. Una formulación farmacéutica que comprende el anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 7 o el polipéptido de fusión de la región Fc de acuerdo con la reivindicación 8.

10. La formulación farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 9, en la que la formulación farmacéutica es para su uso en el tratamiento de enfermedades vasculares oculares.

11. El anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 7 o el polipéptido de fusión de la región Fc de acuerdo con la reivindicación 8 para su uso como medicamento.

12. El uso del anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 7 o el polipéptido de fusión de la región Fc de acuerdo con la reivindicación 8 en la fabricación de un medicamento.

13. El uso de acuerdo con la reivindicación 12, en el que el uso es para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad vascular ocular.

14. El anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 7 o el polipéptido de fusión de la región Fc de acuerdo con la reivindicación 8 para su uso en el tratamiento de una enfermedad vascular ocular.