ES2342238T3 - Moleculas de union derivadas de inmunoglobulinas que no activan la lisis mediada de complemento. - Google Patents

Abstract

Anticuerpo recombinante que comprende: (i) un dominio de unión que es capaz de unirse a una molécula objetivo; y (ii) un dominio efector; en el que el anticuerpo recombinante es capaz de unirse a la molécula objetivo sin activar una lisis dependiente del complemento significativa, o destrucción celular mediada del objetivo, y en el que el dominio efector es - capaz de unirse específicamente a FcγRIIb, y - un dominio quimérico que se deriva de dos o más dominios CH2 de cadena pesada de inmunoglobulina humana, cuyas inmunoglobulinas humanas se seleccionan entre IgG1, IgG2 e IgG4, y en donde el dominio quimérico es un dominio CH2 de cadena pesada de inmunoglobulina humana que tiene los siguientes bloques de aminoácidos en las posiciones indicadas: 233P, 234V, 235A y 236G 327G y, 330S y 331 S según el sistema de numeración de la UE, y es al menos un 98% idéntico a una secuencia CH2 (residuos 231-340) de la IgG1, IgG2 o IgG4 humana que tiene dichos aminoácidos modificados.

Description

Moléculas de unión derivadas de inmunoglobulinas que no activan la lisis mediada de complemento.

Campo técnico

La presente invención se refiere a polipéptidos de unión que tienen secuencias de aminoácidos derivadas de una región constante modificada de la inmunoglobulina G (IgG) de cadena pesada. La invención se refiere además a procedimientos y materiales para la producción de dichos polipéptidos, y a procedimientos y materiales que los
emplean.

\vskip1.000000\baselineskip

Estado de la técnica Inmunoglobulinas

Las inmunoglobulinas son glicoproteínas que ayudan a defender al huésped contra la infección. Generalmente se trata de las cadenas pesadas y ligeras, cuyos dominios N-terminal forman un dominio variable o V capaz de la unión del antígeno. El dominio V se asocia con un dominio constante o C-terminal que define la clase (y en ocasiones subclase [isotipo], y alotipo [isoalotipo]) de la inmunoglobulina.

Así, en especies de mamíferos existen inmunoglobulinas como IgD, IgG, IgA, IgM e IgE. La clase IgG a su vez, existe como cuatro subclases en humanos (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4). El C-dominio en IgG se compone de tres dominios C\gamma1, C\gamma2 y C\gamma3, que son muy similares entre estas subclases (más del 90% de homología). Los dominios C\gamma1 y C\gamma2 están unidos por una bisagra. El papel de las subclases parece variar entre las especies.

Se sabe que el C-dominio es responsable de diversas funciones efectoras de las inmunoglobulinas (véase Clark (1997) "IgG Effector Mechanisms" en "Antibody Engineering" Ed. Capra, pub. Immunol Chem, Basilea, Kurger, Vol. 65 pp 88-110, para una revisión detallada).

Brevemente, las funciones de IgG se logran generalmente a través de la interacción entre la región Fc de Ig y un receptor de Fc\gamma (Fc\gammaR) u otra molécula de unión, a veces en una célula efectora. Esto puede desencadenar que las células efectoras maten a las células objetivo a las que los anticuerpos se enlazan a través de sus regiones variables (V). También anticuerpos dirigidos contra antígenos solubles pueden formar complejos inmunes que se dirigen a Fc\gammaRs resultando en la adopción (opsonización) de los complejos inmunes o en la activación de las células efectoras y la liberación de citocinas.

En los seres humanos, se han caracterizado tres clases de Fc\gammaR, aunque la situación se complica aún más por la aparición de múltiples formas receptoras. Las tres clases son:

(i) Fc\gammaRI (CD64) une a la IgG monomérica con gran afinidad y se expresa en macrófagos, monocitos y neutrófilos y a veces en eosinófilos.

(ii) Fc\gammaRII (CD32) se une un complejo IgG de afinidad media a baja y se expresa ampliamente. Estos receptores se pueden dividir en dos tipos importantes, Fc\gammaRIIa y Fc\gammaRIIb.

La forma "a" del receptor se encuentra en muchas células implicadas en la muerte (macrófagos, por ejemplo, monocitos, neutrófilos) y parece capaz de activar el proceso de la muerte, y se presenta como dos alelos alternativos.

La forma "b" parece jugar un papel en los procesos inhibitorios y se encuentra en las células B, macrófagos y mastocitos y eosinófilos. En las células B parece funcionar para suprimir la producción de inmunoglobulinas y el cambio de isotipo a, por ejemplo, la clase IgE. En macrófagos, la forma b actúa para inhibir la fagocitosis mediada a través Fc\gammaRIIa. En los eosinófilos y los mastocitos la forma b puede ayudar a suprimir la activación de estas células a través de fijación de IgE a su receptor separado.

(iii) Fc\gammaRIII (CD16) se une a IgG con afinidad media a baja y existe como dos tipos. Fc\gammaRIIIa se encuentra en células NK, macrófagos, eosinófilos y algunos monocitos y las células T y media la ADCC. Fc\gammaRIIIb está altamente expresada en los neutrófilos. Ambos tipos tienen diferentes formas alotípicas.

Además de la unión a Fc\gammaRs, los anticuerpos IgG pueden activar el complemento y esto también puede dar lugar a la lisis celular, o en opsonización o en liberación de citoquinas e inflamación. La región Fc también media en propiedades tales como el transporte de IgG en el neonato (a través de la llamada "FcRn"); aumento de vida media (también se cree que se efectúan a través de un receptor de tipo FcRn - ver Ghetie y Ward (1997) Immunology Today 18, 592-598) y la auto-agregación. La región FC es también responsable de la interacción con la proteína A y la proteína G (cuya interacción parece ser análoga a la unión de FcRn).

Ingeniería de inmunoglobulinas

Muchos de los receptores propiedades mediadas por Fc mencionados anteriormente pueden ser deseables en anticuerpos construidos de forma natural o artificialmente. Sin embargo, hay circunstancias en que, en particular, la muerte celular, o la liberación de citoquinas y la consiguiente inflamación, es inadecuada e indeseable.

Del mismo modo, sin embargo, puede ser conveniente mantener ciertas funciones mediadas por Fc, por ejemplo, la larga vida media plasmática.

Se sabe que la IgG4 humana, por ejemplo, no activa el complemento y la IgG2 humana no se une al receptor Fc\gammaRI de alta afinidad y entonces éstas han sido previamente utilizadas en algunas situaciones (proteína de fusión receptor de TNF se realizó con IgG4 Fc).

Sin embargo, ninguna subclase humana carece de todas las funciones activadoras del efector Fc pertinentes o la activación del complemento en todas las circunstancias, posiblemente debido a la existencia de las diversas formas de las Fc\gammaRs. Así, por ejemplo, IgG4 puede desencadenar citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC) en algunas personas y IgG2se une a una forma alélica del receptor Fc\gammaRIIa y también activa el complemento.

Un enfoque alternativo se ha de mutar la secuencia Fc para sustituir residuos cruciales para la función. Algunos residuos objetivo han sido identificados y publicados (véase la revisión de Clark 1997, supra). Estos incluyen los carbohidratos N-enlazados unidos al sitio conservado en el dominio C_{H}2, ciertos residuos en la región de la bisagra inferior (por ejemplo, la secuencia ELLGGP) y un residuo de prolina en la posición 331 y una secuencia E-x-K-x-K en las posiciones 318-322. Un ejemplo reciente es divulgado por Cole et al (1997) Journal of Immunology 159, 3613 a 3621. En la divulgación, los residuos 234, 235 y 237 fueron mutados a alaninas (o en el caso de 235, a veces a Glu). Sin embargo, estos son todos los residuos inusuales en estas posiciones en la IgG humana, por lo tanto la presencia de estos aminoácidos inadecuados puede hacer que el Fc más inmunogénico o antigénico y también puede conducir a la pérdida de ciertas funciones Fc deseables.

Una vez más esta estrategia se ha utilizado para la construcción de un anticuerpo CD3 aglicosilado terapéutico (véase Routledge et al, 1993 Eur J Immunol 23: 403-411, Véase también Reino Unido PA 9206422.9) y para un anticuerpo CD18 inhibidor. Sin embargo una desventaja de aquí es que las nuevas construcciones recombinantes tienen secuencias inusuales y pueden ser reconocidas y rechazadas por el sistema inmune como extrañas. Los anticuerpos aglicosilados carecen también de unión al receptor inhibitorio Fc\gammaRIIb, mientras que el mantenimiento de esta unión puede ser ventajoso para algunas aplicaciones.

Otros enfoques para la modificación de las inmunoglobulinas se exponen en WO 92/16562 (Lynxvale Ltd), que analiza la modificación del alotipo del anticuerpo humanizado IgG1 CAMPATH1H que tiene afinidad de unión por el antígeno CD52. El antígeno CD52 se encuentra en los linfocitos y monocitos humanos y se ha utilizado como objetivo terapéutico para el tratamiento de linfomas de células T y B y leucemias, inmuno-supresión de receptores de trasplante de órganos y médula ósea y también el tratamiento de algunos desórdenes autoinmunes y afines, tales como artritis reumatoide y la vasculitis sistémica.

Morgan et al (1995) Inmunology 86: 319-324 describe ciertos mutantes IgG1 e IgG4 y las prueba para Fc\gammaRI, Fc\gammaRIII y actividad del complemento. Entre los mutantes probados fue G1[L235A] el que mostró para demostrar niveles relativamente altos de ADCC en comparación con otros mutantes (Tabla 2, página 321).

La patente WO 95/05468 (Lynxvale Ltd) también dio a conocer la modificación de determinantes alotípicos en Igs (o derivados) con las funciones de unión u otras efectoras deseadas.

Puede verse en lo anterior que la provisión de procedimientos o materiales que faciliten la ingeniería de las regiones Fc, tales como para reducir los efectos no deseados, mientras se mantienen o mejoran propiedades deseables, proporcionaría una contribución a la técnica.

Descripción de la invención

Los presentes inventores han utilizado nuevas combinaciones de secuencias de subclases de IgG humana para generar polipéptidos quiméricos que comprenden secuencias Fc no naturales, que imitan humanos que, sin embargo, no activan el complemento o desencadenan actividad citotóxica a través de Fc\gammaR. Al mismo tiempo, ciertas propiedades deseables de IgG se han mantenido. Por ejemplo, los polipéptidos no contienen aminoácidos "no humanos", y que por ello pueden haber reducido la inmunogenicidad. Por otra parte, aún se unen la proteína A, lo cual es consistente con ser capaz de atravesar la placenta humana a través de la interacción con FcRn (receptor Fc neonatal).

La forma en que las secuencias se han desarrollado y ciertas propiedades demostradas, se discutirá en detalle más adelante. Sin embargo, en pocas palabras, los inventores formularon numerosas construcciones basadas en tres secuencias IgG diferentes (1, 2 y 4). Aunque las regiones afectadas de estos anticuerpos comparten una homología, no precisamente corresponden en términos de longitud, lo que complica el proceso de generación de secuencias de derivados que retengan las actividades de las secuencias naturales. Los anticuerpos construidos se compararon con los anticuerpos de control parental en el contexto de los sistemas de antígeno modelo Rh(Fog1) y CD52(CAMPATH-1H). Sorprendentemente, un número de secuencias se desarrollaron con la combinación necesaria de actividades no encontradas en las moléculas parentales. En términos generales estos contenían 1 o más regiones o bloques que contenían una modificación (en general, 2, 3 ó 4 aminoácidos) que estaban en conformidad con la región correspondiente de una subclase diferente. Dos regiones o bloques de interés fueron 233-236 y 327, 330, 331.

Así, en uno de los aspectos de la presente invención se da a conocer un anticuerpo recombinante que comprende:

(i) un dominio de unión que es capaz de unirse a la molécula objetivo, y

(ii) un dominio efector;

en el que el anticuerpo recombinante es capaz de unir la molécula objetivo, sin dar lugar a una importante lisis dependiente del complemento, o destrucción celular mediada del objetivo,

y en el que el dominio efector es

- capaz de unir específicamente Fc\gammaRIIb, y

- un dominio quimérico que se deriva de dos o más dominios C_{H}2 de cadena pesada de inmunoglobulina humana, dichas inmunoglobulinas humanas se seleccionan a partir de IgG1, IgG2 e IgG4,

y donde el dominio quimérico es un dominio C_{H}2 de cadena pesada de inmunoglobulina humana que tiene los siguientes bloques de aminoácidos en las posiciones establecidas: 233P, 234V, 235A y 236G y 327G, 330S y 331S de acuerdo con el sistema de numeración de la UE,

y es al menos el 98% idéntico a una secuencia C_{H}2 (residuos 231-340) de la IgG1, IgG2 o IgG4 humanas que tienen dicho aminoácidos modificados.

En otro aspecto de la presente invención se da a conocer un anticuerpo recombinante que comprende:

(i) un dominio de unión que es capaz de unirse a la molécula objetivo, y

(ii) un dominio efector;

donde el anticuerpo recombinante es capaz de unirse a la molécula objetivo, sin disparar lisis dependiente del complemento significativa, o destrucción mediada por célula del objetivo,

y donde el dominio efector es

- capaz de unirse específicamente Fc\gammaRIIb, y

- un dominio quimérico que se deriva de dos o más dominios C_{H}2 de cadena pesada de inmunoglobulina humana, dichas inmunoglobulinas humanas se seleccionan a partir de IgG1, IgG2 e IgG4,

y donde el dominio quimérico es un dominio C_{H}2 de cadena pesada de inmunoglobulina humana que tiene los siguientes bloques de aminoácidos en las posiciones establecidas: 233P, 234V, 235A y sin residuo en 236, y 327G, 330S y 331S de acuerdo con el sistema de numeración de la UE,

y es al menos el 98% idéntico a una secuencia C_{H}2 (residuos 231-340) de la IgG1 o IgG2 humana que tiene dichos aminoácidos modificados.

Los anticuerpos también pueden unir FcRn, lo cual puede ser evidenciado por la capacidad de unir específicamente proteínas A.

Así, los anticuerpos según la presente invención tienen propiedades clínicas mejoradas (por ejemplo en el contexto de anticuerpos de "bloqueo"). Esto se logra mediante la provisión de un dominio efector derivado de Fc que tiene una afinidad reducida para Fc\gammaRI, Fc\gammaRIIa y Fc\gammaRIII, pero que conserva la capacidad de unir Fc\gammaRIIb. Los anticuerpos y la proteína A opcionalmente unida (y por tanto FcRn, por lo tanto, permitiendo el transporte neonatal y la vida media alta). Así, los residuos responsables de unir FcRn en IgG no necesitan ser modificados con respecto a una región natural Fc en las moléculas de la presente invención.

En general, la reducción en la afinidad que la región efectora tiene por el receptor Fc\gammaRI (en comparación con una región Fc de la que deriva) puede, en realizaciones preferidas, ser del orden de 100 veces o más. Para algunos de los receptores de baja afinidad discutidos anteriormente la reducción en la afinidad por ejemplo, puede ser menos por ejemplo de alrededor de 2-10 veces, aunque en las realizaciones de mayor preferencia podría ser de hasta 500 veces. En general, la reducción correspondiente en la actividad en el ensayo de quimioluminiscencia (como se describe en detalle más adelante) puede ser tan alta como 30-300 veces. La actividad reducida del complemento puede ser del orden de 50 veces. La cifra correspondiente para ADCC puede ser por ejemplo, mucho más alta de 10.000 veces. Sin embargo los expertos en la técnica apreciarán que la combinación de estas actividades (reducidas) todavía puede ser beneficiosa en ciertas aplicaciones, sin importar el nivel preciso de reducción.

A pesar que las quimeras IgG1/IgG2 y IgG1/IgG4 han sido preparadas en el pasado (véase por ejemplo Morgan et al (1995) Inmunology 86: 319-324O Chappel et al (1991) Proc Natl Acad Sci EE.UU. 88: 9036-9040O Greenwood et al (1993) Eur J Immunol 23: 1098-1104) ninguna de ellas ha demostrado tener la combinación de las propiedades que poseen los anticuerpos de la presente invención.

Las distintas funciones del anticuerpo puede evaluarse sin carga por los expertos en la técnica, por ejemplo, utilizando procedimientos que se indican a continuación, o procedimientos análogos a los mismos. Por ejemplo, las propiedades de unión Fc\gammaR se pueden evaluar directa o indirectamente, por ejemplo, a través de la incapacidad para activar la quimioluminiscencia de los monocitos.

En concreto, la incapacidad para provocar lisis dependientes del complemento significativas (que por lo general será a través de una afinidad reducida para la molécula Clq) se puede medir mediante la CR-51 liberada de las células objetivo en presencia de los componentes del complemento por ejemplo, en forma de suero (como se describe más adelante) donde el anticuerpo provoca menos del 5%, preferiblemente menos de 2% de lisis específica de la célula objetivo.

Del mismo modo, la destrucción mediada por células de la meta puede ser evaluada por CR-51 liberada por las células objetivo en la presencia de células citotóxicas adecuadas, por ejemplo células efectoras mononucleares de la sangre (como se describe más adelante) donde el anticuerpo provoca menos del 5%, preferiblemente inferior al 2% de lisis de células objetivo.

Como alternativa a la medición directa, la funcionalidad puede ser inferida por la capacidad de inhibir estos atributos en las inmunoglobulinas funcionales. Por ejemplo, proporcionando un efecto protector contra la lisis complemento de las células, o la muerte de las células (por ejemplo, mediante ADCC), o mediante la inhibición de la respuesta de los monocitos a las células sensibilizadas.

En los anticuerpos de la invención el dominio efector cuenta con una secuencia de aminoácidos sustancialmente homóloga a la secuencia C_{H}2 de la IgG1, G2 o G4 humana, dicha secuencia comprendiendo una o más de las siguientes modificaciones (sustituciones de aminoácidos o eliminaciones) en las posiciones establecidas, numeradas en relación con el sistema de numeración de EU (véase Kabat et al "Sequences of proteins of immunological interest". Bethesda, US Department of Health and Human Services, NIH, 1991):

1

Estas sustituciones se hacen en "bloques" de 233-236 y/o 327, 330, 331. Así, la región mutada en el dominio C_{H}2 será 100% homóloga con la subclase de la que los residuos sustituidos originados, reduciendo así la probabilidad de que la región representará una célula B o célula T epítope para el sistema inmunológico.

Varias inmunoglobulinas mutantes basadas en IgG1, IgG2 o IgG4 que reúna las características establecidas, se han preparado y han demostrado tener las propiedades requeridas. Aunque algunas de las mutaciones de residuos individuales se han preparado en moléculas de unión de la técnica anterior, las combinaciones especificadas son nuevas como lo son las funcionalidades logradas.

Formas preferidas del anticuerpo se discutirán ahora con más detalle:

El dominio efector

El péptido comprende un dominio efector que tiene una secuencia de aminoácidos sustancialmente homóloga a la totalidad o a parte de una región constante de inmunoglobulina humana, de preferencia un dominio C IgG.

Numerosas secuencias de las regiones C humanas han sido publicadas, véase, por ejemplo Clark (1997) supra. Otras secuencias de cadenas pesadas de inmunoglobulina humana se pueden obtener de las bases de datos SwissProt y PIR utilizando el software de Lasergene (DNAStar Limited, Londres, Reino Unido) bajo los números de acceso A93433, B90563, A90564, B91668, A91723 y A02146 para la región C humana cadena Ig\gamma-1, A93906, A92809, A90752, A93132, A02148 para la región C cadena Ig\gamma-2 humana, A90933, A90249, A02150 para la región C cadena Ig\gamma-4 humana, y A23511 para la región C cadena Ig\gamma-3 humana.

La homología (o de identidad o similitud) puede ser evaluada por cualquier procedimiento conveniente. La homología es en el nivel de la secuencia de aminoácidos codificada. Por "substancialmente homóloga" se indica que la secuencia de aminoácidos comprendida comparte al menos el 98% o 99% de identidad con la inmunoglobulina de referencia.

La similitud u homología puede ser definida y determinada por el programa TBLASTN, de Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403-10, que está en uso estándar en la técnica, o, y esto puede ser preferido, el programa estándar de BestFit, que forma parte de Wisconsin Package, Versión 8, septiembre de 1994, (Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wisconsin, EE.UU., Wisconsin 53711). BestFit hace una alineación óptima del mejor segmento de similitud entre dos secuencias. Se encontraron alineamientos óptimos mediante la inserción de intervalos para maximizar el número de coincidencias, utilizando el algoritmo de homología local de Smith y Waterman.

Esta evaluación se puede hacer sin carga por una persona con conocimientos comunes en la materia, en conjunción con la evaluación de la combinación de actividades requerida, a fin de reconocer una molécula de la presente invención.

Además de tener la afinidad reducida para Fc\gammaRI, Fc\gammaRIIa, Fc\gammaRIIIa y Fc\gammaRIIIb, la capacidad de unir el receptor Fc\gammaRIIb "inhibidor" es retenido o poseído en alguna medida por la molécula efectora, y de preferencia es mayor que su afinidad por el receptor Fc\gammaRIIa, y más preferentemente en consonancia con la de un dominio Ig parental desde el que se deriva. Los resultados obtenidos por los inventores actuales indican que los anticuerpos que se han desarrollado tienen esta propiedad. Hasta ahora no se aprecia en la técnica que la unión de las regiones Fc a Fc\gammaRIIa y Fc\gammaRIIb podía ser manipulado de forma independiente. Esta capacidad puede complementar las otras funciones necesarias (como lo indica la capacidad de obligar a la proteína A) para aumentar el potencial terapéutico de los anticuerpos.

En particular, una serie de publicaciones han puesto de relieve el importante papel que Fc\gammaRIIb puede desempeñar en la inhibición de los procesos celulares (véase Daeron et al, 1995 Immunity 3 (5): 635-46; Van den Herik et al Blood 1995 85 (8): 2201-11; Sarmay et al, 1996 Immunol Lett 54 (2-3): 93-100; Fong et al, 1996 Immunol Lett 54 (2-3): 83-91; Sarmay et al, 1996 J Biol Chem 271 (48): 30499-504; Unkeless y Jin, 1997 Curr Opin Immunol 9 (3): 338-43; Isakov, 1997 Immunol Res 16 (1): 85-100; Hunter et al, 1998 Blood 91 (5): 1762-8; Malbec et al, 1998 J Immunol 160 (4): 1647-58; Clynes et al, 1999 J Exp Med 189 (1): 179-85). Estos trabajadores mostraron que Fc\gammaRIIb, cuando está reticulado a otros receptores, podría inhibir la señalización de los mismos, lo que impide los procesos tales como la activación de las células B, degranulación de mastocitos, y fagocitosis por los macrófagos.

Así, los anticuerpos de la presente invención que retienen esta actividad podrían ser utilizadas no sólo para competir con, e inhibir competitivamente, interacciones antígeno-anticuerpo indeseables (como autoantígenos o aloantígenos), sino también a no inhibir competitivamente estos procesos, por ejemplo mediante la prevención de la producción adicional de autoanticuerpos o aloanticuerpos por la inhibición de la activación de las células B. Otras aplicaciones de ejemplo para este efecto inhibitorio se discuten a continuación en relación con las terapias de la alergia y el asma (inhibición de la degranulación de los mastocitos) y las moléculas anti-RhD (inhibición de la fagocitosis).

El dominio efector se deriva de una región constante de inmunoglobulina humana, más preferiblemente un dominio C de IgG.

La secuencia compuesta de aminoácidos es sustancialmente homóloga a la secuencia C_{H}2 (es decir, aproximadamente residuos 231-340) de la IgG1, G2 o G4 humana, teniendo los aminoácidos modificados discutidos anteriormente.

Las secuencias C_{H}2 más preferidas se muestran en la figura 17, en particular aquellos designados G1\Deltaab, G2\Deltaa o G1\Deltaac respectivamente.

Cualquiera de estas secuencias se puede combinar con (por ejemplo, correr con contigua) C_{H}3 natural o modificado y región bisagra natural o modificada, además opcionalmente de C_{H}1, secuencias en las moléculas de la presente invención.

Sin embargo, será apreciado por los expertos en la técnica que no existe el requisito que otras porciones del dominio efector (o de otros dominios de la molécula) comprendan secuencias naturales - en particular, puede ser conveniente combinar las modificaciones de secuencia divulgadas en este documento con otras, por ejemplo seleccionadas de la literatura, con la única condición de que las actividades requeridas sean retenidas. El experto podrá apreciar que los anticuerpos que comprende, además, tales dominios efectores adicionalmente modificados (por ejemplo, a través de la adi-
ción, inserción, eliminación o sustitución de aminoácidos) entran en el ámbito de aplicación de la presente invención.

Especialmente preferido pueden ser secuencias "alotipo nulo", como secuencias derivadas de cadena pesada IgG (ver la patente WO 92/16562) donde residuos alotípicos están mutados para coincidir con los encontrados en otras moléculas de subclases de IgG humanas. Esto puede minimizar las secuencias que son vistas como extrañas a cualquier individuo.

El dominio de unión y la molécula objetivo

El anticuerpo comprende un dominio de unión capaz de unir una molécula objetivo.

El dominio de unión tendrá una capacidad de interactuar con una molécula objetivo que preferentemente será otro polipéptido, pero puede ser cualquier objetivo (por ejemplo, hidrato de carbono, lípido (como fosfolípido) o de ácido nucléico). Preferiblemente la interacción será específica. El dominio de unión puede derivar de la misma fuente o una fuente diferente a la de dominio efector.

El dominio de unión comprende la totalidad o parte de un anticuerpo o un derivado del mismo, en particular un dominio variable natural o modificado de un anticuerpo. Así, un anticuerpo de acuerdo con la presente invención puede ser un dominio de unión de un anticuerpo originario de roedor o camélido (véase la patente WO 94/25591) y una cadena pesada de la inmunoglobulina humana como se discutió anteriormente.

También pueden ser preferidas moléculas que tienen más de un tipo de dominio de unión, como los anticuerpos biespecíficos (véase, por ejemplo la patente PCT/US92/09965). En estos casos se une un "brazo" a una celda objetivo y el otro se une a una segunda célula para provocar la muerte del objetivo. En tales casos, puede ser deseable minimizar el impacto de la porción efectora, que de otro modo podría activar las células adicionales que interfieren con el resultado deseado. Los "brazos" en sí mismos (es decir, el dominio de unión) pueden basarse en dominios Ig (por ejemplo Fab) o ser de otras proteínas como en una proteína de fusión que se comentan en detalle más adelante.

El anticuerpo puede abarcar más de una cadena de polipéptido en asociación por ejemplo covalente o de otro tipo (por ejemplo, interacción hidrofóbica, interacción iónica, o vinculados a través de puentes de sulfuro). Por ejemplo, podrá comprender una cadena liviana en conjunción con una cadena pesada que comprende el dominio efector. Cualquier cadena liviana adecuada puede utilizarse por ejemplo, el alotipo de cadena liviana kappa más común es Km(3) en la población general. Por lo tanto, puede ser conveniente utilizar este alotipo de cadena liviana kappa común, ya que relativamente pocos miembros de la población que lo verían como extraño.

Normalmente, el objetivo será un antígeno presente en una célula, o un receptor con un ligando soluble para el cual el anticuerpo compite.

Este puede ser seleccionado como un objetivo terapéutico, donde se desea que se una a una molécula con las propiedades discutidas anteriormente, por ejemplo, para competir con o desplazar anticuerpos indeseables del mismo. Alternativamente, puede ser deseable per se unir la molécula objetivo, sin causar destrucción mediada celular, inflamación desencadena por anticuerpos o lisis del complemento. Igualmente el dominio efector puede funcionar primariamente en la mediación de transporte y/o mejorar la vida media sérica - en estos casos, el dominio de unión y la molécula objetivo puede ser cualquier sistema que se beneficiase de estas cualidades.

Una selección de aplicaciones en donde los anticuerpos de la presente invención pueden ser utilizados como anticuerpos terapéuticos que tienen regiones Fc inertes (en algunos aspectos) figuran a continuación:

1) Competencia con aloanticuerpos IgG maternos por el epitope antigénico en las células sanguíneas del feto/recién nacido

Los trastornos aloinmunes de las células sanguíneas fetales tienen una patogenia común. Existe una síntesis de aloanticuerpos IgG por la madre a un antígeno paternalmente heredado de glóbulos rojos, granulocitos o plaquetas del feto. Esto es seguido por el transporte transplacentario del aloanticuerpos. En el feto o el neonato, hay destrucción de los glóbulos sanguíneos fetales recubiertos con anticuerpos, que puede conducir a una disminución clínicamente significativa en los niveles circulantes de las células relevantes. Anticuerpos terapéuticos para el epitope relevante, pero con un Fc que no provoca la destrucción, podría competir con los anticuerpos maternos por la unión a las células fetales, inhibiendo su destrucción.

Anticuerpos para glóbulos rojos aloantígenos que conducen a enfermedad hemolítica del feto y del neonato

Los aloantígenos más importantes de células rojas están en los sistemas de grupo sanguíneo Rhesus y Kell. La incidencia de la enfermedad hemolítica por el antígeno RhD ha caído drásticamente desde la introducción de la profilaxis post natal, pero siguen dándose casos, debido a la sensibilización materna durante el primer embarazo. Otros antígenos Rhesus (C, c, E, e) también pueden causar enfermedad hemolítica, al igual que los anticuerpos del antígeno Kell (K1), que además de deteriorar eritropoyesis en la médula ósea del feto.

La terapia actual para los fetos gravemente afectados es la transfusión de intra-uterina regular de glóbulos rojos antígeno negativo. Las infusiones de inmunoglobulina no específica no han demostrado ser eficaces en esta condición. La anemia e hiperbilirrubinemia en el recién nacido puede requerir transfusión de intercambio y/o fotote-
rapia.

Los experimentos con construcciones Fc inertes con una especificidad RhD (designado Fog-1) han demostrado su fracaso para activar mecanismos efectores (activación de monocitos detectada por quimioluminiscencia y ADCC), y más importante también se han demostrado que inhiben quimioluminiscencia y ADCC desencadenada por suero humano que contengan anti-D policlonal. ADCC y quimioluminiscencia han demostrado previamente que predicen la destrucción de glóbulos rojos in vivo. Trabajos publicados anteriormente también ha demostrado la capacidad de Fog-1 para competir con la mayoría de los sueros anti-D humanos para epitopes en la proteína RhD.

Anticuerpos contra aloantígenos plaquetarios que conducen a trombocitopenia aloinmune fetal y neonatal

El antígeno más relevante es el antígeno de las plaquetas humanas (HPA)-1a. Anticuerpos HPA-1a complican 1 en 350 embarazos normales, y dan lugar a trombocitopenia grave en 1 de cada 1200 fetos. Los casos más severamente afectados resultan en hemorragia intracraneal o muerte. Las opciones actuales de tratamiento son las transfusiones semanales de plaquetas negativas HPA-1a (que conlleva un riesgo de muerte fetal del 0,5%/procedimiento), y altas dosis de inmunoglobulina intravenosa administrada a la madre, que tiene una eficacia variable e impredecible. HPA-1a es definido por un único epitope de glucoproteína plaquetaria IIIa (GPIIIa), y un Fv de cadena única que reconoce este epitope está disponible dentro de la Universidad de Cambridge de la División de Medicina Transfusional (HM Griffin, WH Ouwehand. A human monoclonal antibody specific for the Leucine-33 (PAA1, HPA-1a) form of platelet glycoprotein IIIa from a V gene phage display library. Blood 1995; 86: 4430-4436). La unión de un anticuerpo sobre la base de esa construcción a las plaquetas humanas ha demostrado ser inhibida por sueros humanos anti-HPA-la. La inhibición fue más consistente para los sueros con el título más alto de anticuerpos específicos, que se asociaron con la enfermedad más grave. Esto indica que el anticuerpo recombinante y anticuerpos del suero se unen al mismo epitope sobre las plaquetas.

En las aplicaciones anteriores, y aquellas a continuación, además de un efecto de unión competitiva, los anticuerpos terapéuticos de la presente invención también puede desencadenar un efecto inhibitorio beneficioso a través de Fc\gammaRIIb.

2) Competencia con autoanticuerpos para el epitope sobre autoantígeno Destrucción de célula sanguínea mediada por autoanticuerpo

La anemia hemolítica por autoanticuerpos tipo IgG templada y trombocitopenia mediante autoanticuerpos tienen un mecanismo común de destrucción de células sanguíneas. En ambos, los anticuerpos se dirigen a un selecto repertorio de autoantígenos (Rh y K en glóbulos rojos, y la GPIIb/IIIa, GPIb/IX/V en plaquetas). La unión del autoanticuerpo acorta la vida útil de la célula sanguínea que conduce a la anemia o trombocitopenia, respectivamente. No es improbable que los autoanticuerpos de glóbulos rojos y plaquetas seleccionen un número limitado de epitopes de células B en sus respectivos autoantígenos. Anticuerpos de dominio variable recombinantes contra de estos epitopes pueden ser generados por la tecnología de visualización de fagos de gen V. Anticuerpos terapéuticos para los epitopes relevantes, pero con Fc inerte, podrían competir con los autoanticuerpos de células sanguíneas del paciente para la unión al autoantígeno, inhibiendo así la destrucción de la célula sanguínea.

Síndrome de Goodpasture (enfermedad [GHM] de membrana basal anti-glomerular)

Esta es una de las principales causas de glomerulonefritis de progresión rápida, lo que lleva a la hemorragia pulmonar y la insuficiencia renal en fase terminal en semanas o meses desde el inicio. La terapia convencional depende de la diálisis en combinación con la intercambio de plasma intensivo y terapia inmunosupresora, que en sí misma puede ser complicada por infecciones oportunistas micóticas y virales que amenazan la vida. Hay evidencias abrumadoras de que esta enfermedad está mediada por autoanticuerpos, y el autoantígeno ha sido localizado en el colágeno tipo IV, un componente principal del GBM. Se ha demostrado que los autoanticuerpos en la enfermedad de GBM se unen al dominio (NC1) no colágeno de la cadena \alpha3 (IV). El gen que codifica esta secuencia (COL4A3) ha sido clonado y secuenciado. Planteamos la hipótesis de que el efecto de autoanticuerpos anti-GHM nocivos puede ser neutralizado por una molécula competidora de IgG monoclonal que se dirige al epitope inmundominante en \alpha3 (IV) NCl y que ha sido, por diseño, equipada con un dominio Fc biológicamente inactivo. Vamos a desarrollar un anticuerpo IgG quimérico recombinante que se une al epitope NCl \alpha3 (IV) inmunodominante pero que carece de las funciones efectoras clásicas. Seremos capaces de lograr esto ya que los genes que codifican los dominios variables de la anti-\alpha3 (IV) NCl murino se han desarrollado y caracterizado (Pusey CD y otros, Lab Invest 1987, 56; 23-31 y NC Ross et al, Lab Invest 1996, 74; 1051-1059).

Una vez más, además de un efecto de unión competitiva, los anticuerpos terapéuticos de la presente invención también pueden desencadenar un efecto inhibitorio beneficioso a través de Fc\gammaRIIb.

3) Alergias y Asma

Las alergias y el asma resultan de las respuestas inmunes inapropiadas a antígenos ambientales comunes, como las proteínas de pólenes de gramíneas, ácaros del polvo doméstico y muchas otras fuentes de antígenos comunes, siendo un ejemplo la proteína Der P 1 en de los ácaros del polvo doméstico Dermatophagoides pteronyssinus. Las personas afectadas producen altos niveles de inmunoglobulinas en particular de la clase IgE. Estos anticuerpos IgE son capaces de unirse al receptor de gran afinidad de Fc-epsilon RI de los mastocitos y eosinófilos. El entrecruzamiento de IgE unido a los receptores por los alérgenos resulta en la activación de las células y degranulación. Esto libera una serie de mediadores inflamatorios que pueden provocar síntomas graves o incluso la muerte como resultado de una reacción anafiláctica. Podrían preverse dos mecanismos de acción de un anticuerpo bloqueante. En primer lugar un anticuerpo IgG con una región Fc inerte podría competir por la unión del alérgeno a la IgE. Esto evitaría el entrecruzamiento de IgE, impidiendo así la activación de las células. Por este mecanismo, el anticuerpo IgG con Fc inerte tendría que competir directamente por la unión del alérgeno con la IgE.

Un segundo y significativo mecanismo implicaría el papel de la señalización negativa a través del receptor Fc\gammaRIIb. Se ha demostrado que el entrecruzamiento de los Fc gamma RIIB y Fc épsilon RI resulta en una inhibición de las señales de activación que normalmente se ve cuando sólo se entrecruzan receptores Fc épsilon RI. Así, la introducción de un anticuerpo IgG, con una capacidad de unión de Fc para Fc gamma RIIb y una especificidad antigénica para un alérgeno puede resultar en una inhibición de la activación de mastocitos y eosinófilos recubiertos de IgE. Por esto el anticuerpo IgG también sería mediador de su fuerte efecto negativo si se une al alérgeno por un sitio diferente a la IgE de tal manera que ambos pueden unirse al alérgeno al mismo tiempo.

4) Trastornos inflamatorios por ejemplo, enfermedad de Crohn

Hay una serie de trastornos del sistema inmune que aparentemente causan una patología como consecuencia del estado crónico de activación de las células inmunes (leucocitos), incluidos los T-linfocitos, neutrófilos y células NK. Esta activación crónica normalmente se ve como un estado de inflamación con una continua migración de las células activadas en los tejidos afectados. Con el fin de migrar hacia el tejido las células deben recibir y responder a mediadores inflamatorios y luego regulan las moléculas de adhesión para que puedan adherirse primero a las células que recubren las paredes de los vasos sanguíneos y luego migran entre las células de las paredes vasculares y en el tejido. Debería ser posible detener este ciclo de inflamación ya sea por bloqueo de las moléculas de adhesión en la superficie de los leucocitos o los ligandos correspondientes en las células epiteliales activadas que recubren las paredes de los vasos. Este tipo de antígenos de activación es VAP-1 y un anticuerpo con un Fc inerte que se une a esta molécula debe impedir la adhesión y migración de leucocitos en los sitios de la inflamación, rompiendo así el ciclo de activación
crónica.

5) Inhibición de la interacción ligando/receptor Enfermedad de células falciformes

La homocigosidad de la variante de la hemoglobina humana caracterizada por una sustitución de valina por ácido glutámico (HbSS) conduce a la hemólisis crónica y una tendencia a que la molécula se someta a la formación de tactoides en el estado desoxigenado. Esto lleva a los glóbulos rojos adopten una forma de hoz en la microcirculación que conduce a "crisis" depranocítica en zonas localizadas. Estos pueden ser trombóticos (en el hueso, pulmón, cerebro o abdomen), aplásicos, hemolíticos o asociados con la retención masiva de glóbulos rojos en el bazo y el hígado. Se postula que durante estas crisis los glóbulos rojos se adhieren a las células endoteliales. Este proceso de adhesión se basa en la interacción de varios receptores con sus respectivos ligandos. Dos de las vías de adhesión dominantes son la interacción entre luterana y laminina y entre trombospondina y un lípido todavía no definido de la membrana de la célula roja. En experimentos con animales se han obtenido pruebas de que los anticuerpos de dominio variable humanos recombinantes contra la trombospondina disminuyen la adherencia de los glóbulos rojos falciformes a las células endoteliales. Postulamos que anticuerpos de dominio variable recombinantes similares contra el dominio de unión de la laminina de luterana (el dominio proximal de membrana) que bloquean la interacción con laminina pueden ser desarrollados por visualización de fago gen V. Estos fragmentos de anticuerpos de dominio variable se pueden equipar con dominios Fc inertes para producir anticuerpos terapéuticos capaces de interferir con la adherencia de los glóbulos rojos falciformes a las células endoteliales, sin causar la destrucción de glóbulos rojos.

Bloqueo mediado por anticuerpos de receptores de colágeno plaquetario

Tenemos pruebas fehacientes de que dos receptores son cruciales para la activación plaquetaria por colágenos subendoteliales, un suceso iniciador de trombosis, la integrina \alpha_{2}\beta_{1} (glicoproteína plaquetaria Ia/IIa), que se ven principalmente como adhesivo en función, y la glicoproteína no-integrina VI (GpVI) como esencial para la activación, precediendo la secreción y la agregación. Anticuerpos humanos recombinantes pueden generarse por la visualización del fago del gen V que reconoce distintos dominios dentro de cada receptor, y éstos pueden ser utilizados para producir anticuerpos con un dominio Fc inerte para terapia anti-trombótica basada en colágeno. Estos pueden ser utilizados en la mitigación de la trombosis coronaria, de la restenosis tras la angioplastia y de complicaciones trombóticas asociadas con injerto de derivación.

\newpage

6) Los anticuerpos monoclonales se usan a veces para bloquear las funciones celulares, por ejemplo, OKT3 se utiliza para inmunosuprimir las células T por el bloqueo del receptor de células T y anticuerpos CD18 se utilizan para prevenir la adhesión célula-célula a través de las moléculas de integrina. Sin embargo la unión de los receptores Fc a los receptores Fc puede provocar efectos secundarios graves a través de la estimulación de la liberación de citocinas y la inflamación.

7) Regiones Fc de anticuerpos a veces se adjuntan a otras proteínas recombinantes para dar moléculas de fusión con vida media biológica prolongada. Así el receptor del TNF se ha adjuntado al Fc IgG4 humano para formar una molécula que inhibe los efectos de TNF soluble, y CTLA4 ha sido hecha como una proteína de fusión con IgG Fc y utilizada para bloquear la señalización a través de la molécula de correceptor B7 (un ligando para CTLA4) en las superficies celulares. Sin embargo una vez más la activación de citoquinas mediante Fc de la proteína de fusión no es deseable.

Dominios V, u otras regiones de unión, adecuadas para los tipos de aplicación discutidos anteriormente, fueron discutidos en un debate específico, serán bien conocidos por los expertos en la técnica. Por ejemplo un dominio de unión CD3 (por ejemplo, YTH12.5) se divulga por Routledge et al (1991) Eur J Immunol 21, 2717-2725 y Bolt et al (1993) Eur J Immunol 23, 403-411. Un dominio de unión CD52 (por ejemplo, CAMPATH-1) se divulga por Riechmann et al (1988) Nature 332, 323-327. Un dominio de unión VAP-1 se divulga por Salmi et al (1993) J Exp Med 178:22-50-60 y Smith et al (1998) J Exp Med 188: 17-27. Un dominio Der p I (por ejemplo, 2C7) se divulga por McElveen et al (1998) Allergy Clin Exp 28, 1427-1434.

Así, un anticuerpo que no se unía a receptores Fc y provocaba la muerte, y no activaba el complemento, pero que se unía a una molécula objetivo, podría ser utilizado en todos los ejemplos anteriores para minimizar cualquier efecto secundario. En concreto, un anticuerpo de "bloqueo" como tal podría ser introducido en las situaciones 1-5 anteriores y evitar la destrucción no deseada por los anticuerpos de naturalmente producidos. Las mismas regiones Fc de tipo bloqueo serían las regiones Fc de elección para utilizar para anticuerpos recombinantes, como los anticuerpos CD3 o C18 en el número 6 anterior o como el Fc para fusiones en el punto 7 anterior.

Los dominios efectores y vinculantes pueden ser combinados por cualquier procedimiento apropiado. Por ejemplo los dominios pueden estar enlazados covalentemente a través de cadenas laterales. Alternativamente, los grupos sulfhidrilo generados por la reducción química de residuos de cisteína se han utilizado para entrecruzar dominios de anticuerpos (Rhind, SK (1990) EP 0385601 Cross-linked antibodies andprocesses for their preparation). Por último, la modificación química de los grupos de hidratos de carbono se ha utilizado para generar grupos reactivos con fines de entrecruzamiento. Estos procedimientos son técnicas estándar disponibles para los expertos en la técnica. Pueden ser particularmente aplicables en realizaciones en las que el anticuerpo contiene porciones de no proteínas o
grupos.

En general puede ser más apropiado utilizar técnicas de recombinación de expresar la molécula de unión en forma de una proteína de fusión. Procedimientos y materiales que emplean este enfoque forman otros aspectos de la presente invención, como se expone a continuación.

Ácidos nucléicos

En un aspecto de la presente invención se da a conocer un ácido nucléico que codifica un anticuerpo o dominio efector como se describió anteriormente.

El ácido nucléico según la presente invención puede incluir ADNc, ARN, ADN genómico (incluidos los intrones) y ácidos nucléicos modificados o análogos de ácido nucléico (por ejemplo, ácido nucléico peptídico). Cuando se especifica una secuencia de ADN, por ejemplo, con referencia a una figura, a menos que el contexto exija otra cosa el ARN equivalente, con U sustituido por T cuando se produce, está incluido.

Moléculas de ácidos nucléicos según la presente invención pueden proporcionarse aisladas y/o purificadas de su ambiente natural, en forma sustancialmente pura u homogénea, o libre o sustancialmente libre de otros ácidos nucléicos de las especies de origen. Cuando se utiliza aquí, el término "aislado" abarca todas estas posibilidades.

Las moléculas de ácido nucléico pueden ser total o parcialmente sintéticas. En particular, podrán ser recombinantes en que las secuencias de ácido nucléico que no se encuentran juntas en la naturaleza (no van en forma contigua) se han ligado o combinado de otra forma artificial. Alternativamente, puede haber sido sintetizadas directamente por ejemplo, utilizando un sintetizador automatizado.

En otro aspecto se da a conocer una construcción nucleica, por ejemplo, un vector replicable, que comprende la secuencia de ácidos nucleicos.

Un vector que incluye ácido nucléico según la presente invención necesita no incluir un promotor u otra secuencia de regulación, sobre todo si el vector se va a utilizar para introducir el ácido nucléico en células para la recombinación en el genoma.

Preferiblemente, el ácido nucléico en el vector está bajo el control de, y operativamente vinculado a, un promotor apropiado u otros elementos reguladores de la transcripción en una célula huésped, como una célula microbiana (por ejemplo, bacteria, levadura, hongo filamentoso) o eucariotas (por ejemplo, de insecto, planta, mamífero).

En particular, el vector puede contener un gen (por ejemplo, gpt) para permitir la selección en un huésped o de una célula huésped, y uno o más potenciadores adecuados para el huésped.

El vector puede ser un vector de expresión bi-funcional que funciona en varios huéspedes. En el caso de ADN genómico, este puede contener su propio promotor u otros elementos reguladores y en el caso de ADNc puede estar bajo el control de un promotor apropiado u otros elementos reguladores de la expresión en la célula huésped.

Por "promotor" se entiende una secuencia de nucleótidos a partir de los que se puede iniciar la transcripción del ADN enlazado operativamente posteriormente (es decir, en la dirección 3' de la cadena en el sentido de la doble cadena de ADN). El promotor, opcionalmente, puede ser un promotor inducible.

"Operativamente enlazado" significa unido como parte de la misma molécula de ácido nucleico, debidamente colocado y orientado para la transcripción que se iniciará a partir del promotor. ADN operativamente enlazado a un promotor es "bajo regulación de iniciación transcripcional" del promotor.

Así, este aspecto de la invención proporciona una construcción genética, preferentemente un vector replicable, que comprende un promotor operativamente enlazado a una secuencia de nucleótidos proporcionada por la presente invención.

En términos generales, los expertos en la materia son capaces de construir vectores y protocolos de diseño para la expresión de genes recombinantes. Los vectores adecuados pueden elegirse o construirse, que contienen secuencias reguladoras apropiadas, incluyendo secuencias promotoras, fragmentos de terminación, secuencias de poliadenilación, secuencias mejoradoras, genes marcadores y otras secuencias, según proceda. Para más detalles, véase, por ejemplo, Molecular Cloning: a Laboratory Manual: 2ª edición, Sambrook et al, 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press.

Muchas técnicas conocidas y protocolos para la manipulación de ácido nucleico, por ejemplo en la preparación de construcciones de ácidos nucleicos, mutagénesis, secuenciación, introducción de ADN en células y expresión génica, y análisis de proteínas, se describen en detalle en Current Protocols in Molecular Biology, Segunda edición, Ausubel et al. eds., John Wiley & Sons, 1992.

Células huésped y procedimientos

También abarcadas por la presente invención son las células transformadas mediante vectores de expresión definidos anteriormente. También se proporcionan cultivos celulares (preferentemente de roedores) y productos de cultivos celulares que contienen los anticuerpos.

También se proporcionan procedimientos de fabricación de moléculas de unión según la presente invención que comprende:

(i) combinar un ácido nucleico que codifica un dominio de unión con un ácido nucleico que codifica un dominio efector para formar una construcción de ácido nucleico;

(ii) provocar o permitir la expresión de la construcción en una célula huésped apropiada.

La combinación, para producir una construcción, puede ser mediante cualquier procedimiento conveniente conocido por los expertos en la materia, por ejemplo, mediante ligado de fragmentos (por ejemplo, fragmentos de restricción) o usando diferentes plantillas en una o más etapas de amplificación, por ejemplo, mediante PCR.

Los procedimientos de producción de anticuerpos (y por tanto dominios de unión) incluyen la inmunización de un mamífero (por ejemplo humano, ratón, rata, conejo, caballo, cabra, oveja, camello o mono) con una proteína objetivo adecuada o un fragmento de la misma. Los anticuerpos se pueden obtener a partir de animales inmunizados usando cualquiera de una variedad de técnicas conocidas en la técnica, y se podrían cribar, utilizando preferentemente la unión del anticuerpo al antígeno de interés.

Por ejemplo, se pueden usar técnicas Western blot o de inmunoprecipitación (Armitage et al, 1992, Nature 357: 80-82).

La clonación y la expresión de anticuerpos quiméricos se describen en las patentes EP-A-0120694 y EP-A-0125023.

El ácido nucleico que codifica el dominio efector se puede generar, a la vista de la presente descripción, mediante mutagénesis dirigida al sitio, por ejemplo, mediante los procedimientos aquí descritos o en la técnica publicada (véase por ejemplo las patentes WO 92/16562 o WO 95/05468 ambas Lynxvale Ltd).

Otros aspectos

También se proporciona la utilización de anticuerpos de la presente invención para prevenir, inhibir, o interferir con la unión de una segunda molécula de unión a una molécula objetivo. Esto puede implicar competir, o desplazar, un anticuerpo de un antígeno o célula objetivo terapéuticamente relevante.

La presente invención también proporciona un reactivo que comprende un anticuerpo como anteriormente, producido de manera recombinante o de otra manera.

La presente invención también proporciona una preparación farmacéutica que comprende un anticuerpo como anteriormente, más un portador farmacéuticamente aceptable.

La presente invención también proporciona el uso de un anticuerpo recombinante tal como se describe anteriormente en la preparación de un medicamento para el tratamiento de un paciente de un trastorno, en el que dicho dominio de unión de dicho anticuerpo recombinante se utiliza en dicho tratamiento para unirse a la molécula objetivo que se asocia con dicho trastorno,

en el que el trastorno y la molécula objetivo se seleccionan entre:

(i) enfermedad de injerto contra huésped o enfermedad del huésped contra injerto o rechazo de trasplante de órganos o rechazo de trasplante de médula ósea o vasculitis autoinmune o artritis o asma, en el que la molécula objetivo es un receptor de células T;

(ii) anemia hemolítica autoinmune o trombocitopenia autoinmune, en la que la molécula objetivo se selecciona del grupo que consiste en antígenos de glóbulos rojos Rh D, C, c, E, e, antígeno Kell (K1); glicoproteína plaquetaria GPIIb/IIIa, GPIb/IX/V;

(iii) trombocitopenia aloinmune fetal/neonatal; en la que la molécula objetivo es antígeno plaquetario humano (HPA)-Ia en glucoproteína plaquetaria IIIa;

(iv) alergia del ácaro del polvo, en la que la molécula objetivo es proteína Der P1 de ácaros del polvo doméstico bermatophagoides pteronyssinus;

(v); de Crohn, en el que la molécula objetivo es VAP-1;

(vi) HDN, en el que la molécula objetivo se selecciona del grupo que consiste en antígenos de glóbulos rojos Rh D, C, c, E, e, o antígeno Kell (K1);

(vii) síndrome de Goodpastures; en el que la molécula objetivo es dominio no colágeno (NC1) de colágeno \alpha3(IV);

(viii) anemia de células falciformes, en el que la molécula objetivo se selecciona del grupo que consiste en: trombospondina, laminina, luterana;

(ix) oclusión de la arteria coronaria en la que la molécula objetivo se selecciona del grupo que consiste en: integrina \alpha_{2}\beta_{1} (glicoproteína plaquetaria Ia/IIa), glicoproteína plaquetaria nointegrina VI.

En una realización, el medicamento es para administración a un paciente que es un infante no nacido, y el medicamento se administra a la madre del paciente.

Para que la presente invención se comprenda más completamente ahora se describe con más detalle unas realizaciones, a modo de ejemplo solamente, y no de forma restrictiva. Otras realizaciones que entran en el ámbito de aplicación de la invención puede producirse por los expertos en la materia a la vista de estos.

\vskip1.000000\baselineskip

Dibujos

Figura 1

Rosetas de células de soporte de Fc\gammaRI mediante glóbulos rojos recubiertas con anticuerpos Fog-1. Glóbulos rojos R_{2}R_{2} estaban recubiertos con anticuerpos Fog-1 en un rango de concentraciones de anticuerpos, incubadas con células B2KA que crecen en una placa de 96 pocillos y se determinó el porcentaje de células B2KA con rosetas de glóbulos rojos. Las barras de error indican los valores de la desviación estándar para los pocillos triplicados. Para los mutantes Fog-1 G1\Deltab, G1\Deltac, G1\Deltaab, G1\Deltaac, G2\Deltaa, G4\Deltab y G4\Deltac, como para G2 (mostrado), no hubo rosetas entre las células B2KA y los glóbulos rojos en cualquiera de las concentraciones de recubrimiento.

\newpage

Figura 2

Tinción fluorescente de células de soporte Fc\gammaRI. Líneas celulares transfectantes Fc\gammaRI, B2KA (a y b) y
3T3+Fc\gammaRI+cadena \gamma (c y d) se incubaron secuencialmente con anticuerpos de las series CAMPATH-1 (a y c) o Fog-1 (b y d), anticuerpos \kappa anti-humanos biotinilados y ExtrAvidin FITC. Las intensidades de fluorescencia se midieron para 10000 eventos y se trazó el canal de la media geométrica de la fluorescencia.

Figura 3

Representación del histograma de células de soporte de Fc\gammaRI teñidas fluorescentes. Las células B2KA se tiñeron como en la figura 2 usando anticuerpos 100 \mug/ml de las series CAMPATH-1. Los trazados de histograma que muestran el número de células que caen en cada canal de fluorescencia se cubrió de anticuerpos representativos.

Figura 4

Respuesta CL de monocitos humanos a los glóbulos rojos sensibilizados con series Fog-1 de anticuerpos. Glóbulos rojos R_{1}R_{1} fueron recubiertos con anticuerpos en un rango de concentraciones. El número de moléculas de anticuerpo unidas por célula y la respuesta CL los monocitos a los glóbulos rojos se determinaron para cada muestra tal como se describe.

Figura 5

Inhibición de CL debido a Fog-1 G1 mediante otros anticuerpos Fog-1. Los glóbulos rojos se sensibilizaron con 2 \mug/ml Fog-1 G1 y diferentes concentraciones de la Fog-1 Ab indicado. Estos Ab dieron una baja respuesta de CL en la Figura 4. Se midió la respuesta de CL de monocitos. La respuesta debida a 2 \mug/ml G1 solo se toma como 100%.

Figura 6

Inhibición de la respuesta de CL a suero clínico de Fog-1 G2\Deltaa. Los glóbulos rojos se sensibilizaron con una cantidad constante de Fog-1 G1 (20 \mug/ml) o suero clínicamente relevante y diferentes cantidades de Fog-1 G2\Deltaa. Se consiguió un 100% de respuesta con una cantidad estándar de BRAD 5. En ausencia de Fog-1 G2\Deltaa, los % de respuesta fueron G1: 150% suero A: 142%, suero B: 265%, suero C: 200%, suero D: 163%, suero E: 94%, suero anti-C+D: 259% y sueros anti-K: 119%.

Figura 7

Lisis de complemento mediada por series de anticuerpos CAMPATH-1. PBMC humano fueron etiquetados con ^{51}Cr y se incubaron con los anticuerpos en presencia de suero como fuente de complemento. El % de liberación de Cr específica se representa como una medida de producción de lisis.

Figura 8

Inhibición mediante CAMPATH-1 G2\Deltaa de lisis de complemento mediada mediante CAMPATH-1 G1. Lisis de complemento se realizó como en la figura 7, pero las muestras contenían una cantidad constante (6,25 \mug/ml de concentración final) de CAMPATH-1 G1 y aumentando las cantidades de CAMPATH-1 G2\Deltaa.

Figura 9

ADCC mediada mediante series de anticuerpos CAMPATH-1. PBCM humano fue etiquetado con ^{51}Cr y se incubó con anticuerpo. Después del lavado, las células fueron incubadas con más PBCM, actuando como células efectoras, en una relación efector:objetivo de 20:1. El % de liberación de Cr específico se representa como una medida de producción de lisis.

Figura 10a

ADCC de glóbulos rojos RhD^{+} mediada mediante series Fog-1 de anticuerpos.

Figura 10b

ADCC de glóbulos rojos RhD^{+} mediada mediante series Fog-1 de anticuerpos.

Figura 11a

Inhibición mediante anticuerpos Fog-1 de la ADCC de glóbulos rojos RhD^{+} mediada mediante Fog-1 G1 en
2 ng/mg.

\newpage

Figura 11

La inhibición mediante anticuerpos Fog-1 de la ADCC de glóbulos rojos RhD^{+} mediada mediante Fog-1 G1. Los glóbulos rojos se sensibilizaron en una mezcla de anticuerpos que consiste en una cantidad constante de Fog-1 G1 (2 ng/ml) y diferentes concentraciones de los anticuerpos inhibidores.

Figura 12

Inhibición mediante anticuerpos Fog-1 de la ADCC de glóbulos rojos RhD^{+} mediada mediante anti-RhD policlonal en 3 ng/mg.

Figura 13a

Tinción fluorescente de células de soporte de 131H/H Fc\gammaRIIa. Las células de la línea transfectante 3T6 + Fc\gammaRIIa 131H/H se incubaron con los anticuerpos Fog-1 complejados con \kappa anti-humano F(ab')_{2} de cabra y luego con IgG anti-cabra burro conjugado con FITC. Las intensidades de fluorescencia se midieron para 10000 eventos y se trazó el canal de la media geométrica de la fluorescencia.

Figura 13b

Tinción fluorescente de células de soporte de 131R/R Fc\gammaRIIa. Las células de la línea transfectante 3T6 + Fc\gammaRIIa 131R/R se incubaron con los anticuerpos Fog-1 complejados con \kappa antihumano F(ab')_{2} de cabra conjugado con FITC. Las intensidades de fluorescencia se midieron para 10000 eventos y se trazó el canal de la media geométrica de fluorescencia.

Figura 14a

Tinción fluorescente de células de soporte Fc\gammaRIIb1*. El experimento se llevó a cabo como en la figura 13b utilizando la línea transfectante 3T6 + Fc\gammaRIIb1* y formando complejos de anticuerpos Fog-1 usando una mezcla de \kappa antihumanos F(ab')_{2} de cabra conjugado con FITC y sin etiqueta.

Figura 14b

Tinción fluorescente de células de soporte de NA1 Fc\gammaRIIIb. El experimento se llevó a cabo como en la figura 13 usando la línea de transfectante CHO + Fc\gammaRIIIb NA1.

Figura 14c

Tinción fluorescente de células de soporte de NA2 Fc\gammaRIIIb. El experimento se realizó como en la figura 13 usando la línea transfectante CHO + Fc\gammaRIIIb NA2.

Figura 15

Muestra la tabla 1, que compara las mutaciones hechas con las secuencias G1, G2 y G4 de tipo salvaje.

Figura 16

Muestra la tabla 2, que es un resumen de las actividades de anticuerpos.

Figura 17

Muestra las secuencias de ciertas secuencias C_{H}2 modificadas y de tipo salvaje, incluyendo las designadas G1\Deltaab, G2\Deltaa, G1\Deltaac.

Ejemplos Materiales y Procedimientos Generales Construcción de vectores de expresión

El punto inicial para la región constante IgG1 fue el gen humano de región constante IgG1 de alotipo Glm (1,17) en una versión del vector M13tg131 que contiene un polienlace modificado (Clark, M. R.: WO 92/16562). El inserto 2.3kb IgG1 así tiene un sitio BamHI en el extremo 5' y contiene un sitio HindIII adyacente al sitio BamHI. En el extremo 3', después de la señal de poliadenilación, los sitios siguientes se producen en el orden de 5' a 3': SphI, NoI, BglII, BamHI. El gen humano de región constante IgG2 había sido obtenido como un fragmento de HindIII-SphI en M13tg131 y el sitio HindIII había sido destruido mediante la digestión con HindIII, llenando los extremos salientes y ligando los extremos juntos otra vez. El fragmento SalI-SphI de este vector se clonó para reemplazar su equivalente en el vector IgG1 descrito anteriormente. El gen humano de región constante IgG4 fue obtenido en forma de fragmento HindIII-SmaI en M13tg131 y el el sitio HindIII destruido. El sitio SmaI se produce entre el extremo 3' del exón CH3 y el sitio de poliadenilación, de modo que el sitio de poliadenilación fue restablecido mediante la adición del fragmento SmaI del vector IgG1, que comprende ADN de entre el sitio SmaI equivalente en el gen IgG1 y el sitio SmaI después del gen en el polienlace.

El primer procedimiento fue introducir un sitio de restricción XbaI entre los exones CH1 y de bisagra, un sitio XhoI entre la bisagra y los exones CH2 y un sitio KpnI entre los exones CH3 y CH2 para facilitar el intercambio de las secuencias del exones mutantes. Esto fue similar a la manipulación de genes IgG1 e IgG4 realizada previamente (Greenwood, J., Clark, M. y Waldmann, H. (1993) Structural motifs involved in human IgG antibody effector functions. Eur. J. Immunol. 23, 1098-1104).

Para proporcionar los ADNs de plantilla, E. coli RZ1032 fue infectado con el M13 que se describe anteriormente y preparó ADNss. La cepa es dut^{-}ung^{-} por lo que el ADNss producido debería incluir alguna uridina en lugar de timidina.

Los oligonucleótidos utilizados para introducir las mutaciones fueron:

entre la bisagra y los exones CH2

MO10 5' GGA TGC AGG CTA CTC GAG GGC ACC TG 3'

\vskip1.000000\baselineskip

entre los exones CH2 y CH3

MO11 5' TGT CCA TGT GGC CCT GGT ACC CCA CGG GT 3'

\vskip1.000000\baselineskip

entre los exones CH1 y de bisagra

MO12 5' GAG CCT GCT TCC TCT AGA CAC CCT CCC T 3'

\vskip1.000000\baselineskip

Los sitios de restricción están subrayados.

Los oligonucleótidos fueron fosforilados en reacciones de 50 \mul conteniendo 25 pmol de oligonucleótidos y 5u T4 polinucleótido quinasa (NBL) en 70 mM Tris HCl MgCl pH 7,6, 10 mM_{2}, 100 mM KCl, 5 mM DTT, 0,5 mg/ml BSA, 1 mM ATP. Las reacciones se incubaron a 37ºC durante 1 hora y se calentaron a 70ºC durante 5 min.

Para recocer los oligonucleótidos mutagénicos a la plantilla de ADN, 500 ng de ADN que contiene uridina y 1 pmol de cada oligonucleótido fosforilado se incubaron en 20 \mul de 40 mM Tris HCl pH 7,5, 20 mM MgCl_{2}, 50 mM de NaCl a 80ºC durante 5 min y se dejó enfriar lentamente hasta 37C. El volumen se incrementó a 30 \mul con el mismo tampón y TDT sumado a 7 mM, 1 mM ATP para y dATP, dCTP, dGTP y dTTP cada uno a 250 \muM. 5 u T7 ADN polimerasa (sin modificar, United States Biochemical) y 0,5 u de T4 ADN ligasa (Gibco BRL), y se incubó la reacción a temperatura ambiente durante 16 h para la síntesis de la cadena mutante. El ADN fue precipitado en etanol, disueltos 50 \mul de 20 mM Tris HCl pH 8,0, 1 mM EDTA, 1 mM DTT, 0,1 mg/ml de BSA y añadido 1 u uracilo ADN glicosilasa (New England Biolabs). Después de la incubación a 37ºC durante 2 h, se añadieron 50 \mul 400 mM NaOH y la reacción se dejó a temperatura ambiente durante 5 min para fragmentar la cadena de plantilla de ADN. El ADN se precipitó el etanol, se disolvió en H_{2}O y se transformó en E. coli TG1. La forma replicativa (RF) del ADN se realizó para una selección de los clones resultantes M13 y se digirió para encontrar clones que contenían los sitios de restricción XbaI, XhoI y KpnI requeridos. Clones adecuados fueron obtenidos para IgG1 y 4 vectores MO12, pero parecía no estar recocido en el vector IgG2, de manera que la mutagénesis que se repitió para IgG2 sin este oligonucleótido como sitio entre CH1 y los exones de bisagra no fue necesaria para estos experimentos. Para cada vector, las secuencias de ADN de los exones se confirmaron mediante secuenciación.

Los cambios en CH2 en las posiciones de los aminoácidos 327, 330 y 331 (mutación \Deltaa) iban a ser introducidos utilizando los oligonucleótidos:

MO22BACK (cadena de codificación):

5' TCT CCA ACA AAG GCC TCC CGT CCT CCA TCG AGA AAA 3'

\vskip1.000000\baselineskip

MO22 (cadena complementaria):

5' TTT TCT CGA TGG AGG ACG GGA GGC CTT TGT TGG AGA 3'

\vskip1.000000\baselineskip

\newpage

Los cambios en CH2 en las posiciones 233 a 236 (mutación \Deltab y \Deltac) iban a ser introducidos utilizando los oligonucleótidos:

MO7BACK (cadena de codificación y mutación de codificación \Deltac):

5' TCC TCA GCA CCT CCA GTC GCG GGG GGA CCG TCA GTC 3'

\vskip1.000000\baselineskip

MO21 (cadena complementaria y mutación de codificación \Deltab):

5' GAC TGA CGG TCC CGC GAC TGG AGG TGC TGA GGA 3'

\vskip1.000000\baselineskip

Las mutaciones se introdujeron mediante PCR de extensión de superposición que requiere también los oligonucleótidos MO11 y MO10BACK:

5' CAG GTG CCC TCG AGT AGC CTG CAT CC 3'

\vskip1.000000\baselineskip

El sitio de restricción XhoI está subrayado.

Para la mutación \Deltaa, el primer conjunto de PCRs utilizó plantillas IgG1 e IgG2 amplificadas con MO22 y
MO10BACK y con MO22BACK y MO11. Para las mutaciones \Deltab y \Deltac, el primer conjunto de PCRs utilizó plantillas IgG1 e IgG4 con MO21 y MO10BACK y con MO7BACK y MO11. En el producto final, los ADNs procedentes de una línea de cebado con MO21 tendrían la mutación \Deltab y los procedentes de MO22BACK llevarían la mutación \Deltac. Cada PCR contenía aproximadamente 30 ng M13tg131 + ADNss de región constante, 25 pmol de cada oligonucleótido y 1 u Pwo ADN polimerasa (Boehringer Mannheim) en 50 ml de HCl 10 mM Tris, pH 8,85, 25 mM KCl, 5 mM (NH_{4})_{2}SO_{4}, 2 mM MgSO_{4} y 250 \muM de cada dATG, dCTP, dGTP y dTTP. Las reacciones fueron sometidas a 14 ciclos de 94C, 30 s; 50C, 30 s; 72C, 60 s, seguido de 72C, 5 minutos hasta el final. Las bandas que representan ADNs de producto de los tamaños esperados fueron extirpadas de agarosa con bajo punto de fusión y se fundieron en 100 \mul de H_{2}O. Para cada mutación, los dos productos de PCR iniciales se unieron entre sí mediante PCR de extensión de superposición. Aproximadamente 4 \mul de las porciones de gel fundidas, de manera que los productos de PCR iniciales estaban en cantidades equimolares, fueron mezclados con 25 pmol cada uno de MO10BACK y MO11 y otros componentes como anteriormente. La PCR se llevó a cabo durante 18 ciclos como anteriormente, excepto que la temperatura de hibridación se redujo de 50C a 48C. Los productos obtenidos, que contenían el exón CH2 entero, se purificaron y digirieron con XhoI y KpnI. Los ADNs RF de los vectores de región constante mutados M13tg131+, que contienen los sitios de restricción adicionales tal como se describe anteriormente, se digirieron con XhoI y KpnI para eliminar los ADNs CH2 existentes y las regiones CH2 mutantes ligadas. Las muestras de ADN se transformaron en E. coli TG1. El ADN de los clones representativos fue secuenciado para identificar correctamente las regiones constantes
mutadas.

Pata obtener vectores IgG1 con \Deltaa y \Deltab o \Deltac, ADN, que representa un mutante \Deltaa, se utilizó como plantilla para una segunda ronda de PCRs para introducir las mutaciones \Deltab y \Deltac tal como se describe anteriormente.

La IgG1, 2 y 4 de tipo salvaje y genes mutados de región constante fueron extirpados cada uno de ADN RF como un fragmento BamHI-NotI y se clonó en vector CAMPATH Hu4VH HuIgG1 pSVgpt modificado (Clark, M.R.: Lynxvale Binding Molecules, como anteriormente) para reemplazar la región constante existente. Los vectores resultantes fueron designados pSVgptCAMPATHHu4VHHuIgG1\Deltaa, etc. El vector también contiene el gen gpt para permitir la selección en células de mamíferos, el potenciador de cadena pesada de inmunoglobulina murina y el ADN de región variable CAMPATH-1 Hu4VH de manera que lleve un gen completo de cadena pesada que se puede expresar en células de mamífero. El gen de cadena ligera CAMPATH-1 humanizado existe en el vector de expresión CAMPATH HuVL pSVneo (Reichmann, L., Clark, M.R., Waldmann, H. y Winter, G. (1988) Nature 332, 323-327).

Los ADNs Fog1 de región variable (Bye, JM, Carter, C., Cui, Y., Gorick, B.D., Songsivilai, S., Winter, G., Hughes-Jones, N.C. y Marks, J.D. (1992) Germline variable región gene segment derivation of human monoclonal anti-Rh(D) antibdodies. J. Clin. Invest. 90, 2481-2490) se obtuvieron en el vector pHEN1. Se amplificaron mediante PCR, utilizando los oligonucleótidos:

3

La porción 5' de la inserción en el vector M13VHPCR1 (Orlandi, R., Gussow, DH, Jones, PT y Winter, G. (1989) Proc. Natl. Acad. SCI. EE.UU. 86, 3833), que comprende el promotor y ADN que codifica el péptido de señal se amplificó usando el cebador universal inverso M13 y VO3:

5' GGA GTG GAC ACC TGT GGA GA 3'

\vskip1.000000\baselineskip

ADN, 3' de V_{H} en M13VHPCR1 y que representa el extremo 5' del intrón V_{H}-C_{H}, fue obtenido mediante PCR utilizando el cebador universal M13 -40 y VO4:

5' GTG AGT CCT TAC AAC CTC TC 3'

\vskip1.000000\baselineskip

Estos dos segmentos de ADN se unieron de forma secuencial a ADN amplificado Fog-1 V_{H} y Fog-1 V_{K} mediante PCR de extensión superpuesta tal como se describe anteriormente. El sitio de restricción BamHI interno a Fog-1 V_{H} fue suprimido mediante el mismo procedimiento utilizando oligonucleótidos que eliminaron el sitio de reconocimiento sin cambiar los aminoácidos codificados. Los productos de PCR completos fueron clonados en M13mp19 como fragmentos de HindIII-BamHI y sus secuencias de ADN se confirmaron.

El fragmento HindIII-BamHI que contiene Fog-1 V_{H} se utilizó para reemplazar el fragmento que contiene CAMPATH-1 V_{H} en los vectores pSVgpt descritos anteriormente, dando vectores de expresión designados
pSVgptFog1VHHuIgG2, etc. Para los vectores IgG1, el sitio de restricción extra HindIII restricción en el extremo 5' de los ADNs de región constante significaba que no era posible cambiar simplemente el fragmento de región variable HindIII-BamHI. En cambio, los correspondientes vectores pSVgptCAMPATHHu4VHHuIgG1 fueron digeridos con HindIII. Enlazadores, diseñados para eliminar el sitio HindIII y agregar un sitio BamHI, se ligaron a los extremos cortados. Los ADNs se digirieron a continuación, con BamHI y NotI de forma que las regiones constantes podrían ser aisladas y se clonaron en pSVgptFog1VHHuIgG2 para sustituir la región constante IgG2.

El fragmento HindIII-BamHI que contiene Fog-1 V_{k} fue transferido al vector PSV hyg-HuCK (Orlandi et al., 1989), que ya contiene potenciador de cadena pesada de inmunoglobulina murina y gen humano de región constante \kappa. El vector de expresión resultante se llamó pSVhygFog1VKHuCK.

Producción de anticuerpos

10 \mug de cada vector de expresión de cadena pesada y 20 \mug del correspondiente vector de expresión de cadena ligera se linealizaron por digestión con PvuI y se combinaron en 50 \mul de H_{2}O. Las células de la línea de mieloma de rata no secretora, YB2/0, se cultivaron en semiconfluencia en medio de Dulbecco modificado de Iscove (IMDM) con 5% de suero fetal bovino (FBS). 10^{7} células se recogieron por centrifugación, se resuspendieron en 0,5 ml de medio y se transfirieron a una cubeta GenePulser (BioRad). El ADN fue añadido y la mezcla se incubó en hielo durante 5 min. Las células se les dio un pulso de 960 \muF/170 V y volvieron en hielo durante 15 minutos antes de ser colocadas en un frasco de 20 ml IMDM + 10% FBS. Se incubaron a 37ºC, 5% de CO_{2} en un ambiente húmedo. Después de 24 h, el volumen se duplicó y el medio selectivo realizado por la adición de ácido micofenólico a 0,8 \mug/ml y xantina a 250 \mug/ml. Las células se separaron en alícuotas en dos placas de 96 pocillos. Aproximadamente 18 d después de aplicar la selección, las colonias eran visibles y los sobrenadantes se analizaron para detectar la presencia de IgG mediante ELISA. En pocas palabras, los pocillos de la placa de microtitulación fueron recubiertos con IgG anti-humano de cabra, los anticuerpos específicos Fc (Sigma) y se incubaron con diluciones de 5 veces de los sobrenadantes. El anticuerpo unido se detectó mediante incubación con los anticuerpos \kappa anti-humano de cabra conjugado HRPO (Seralab) y desarrollando el ensayo con sustrato de o-fenilendiamina. Las células de los pocillos que contienen las cantidades más altas de anticuerpos se ampliaron y las existencias se criopreservaron.

La línea celular que secreta las mayores cantidades de Ab fue expandida a 500 ml en IMDM + 2% FBS para proporcionar sobrenadante saturado para la purificación del anticuerpo. El sobrenadante fue retirado mediante centrifugación y hecho 0,1 M Tris HCl pH 8,0. Se añadió proteína A-agarosa (Sigma) y la mezcla se agitó a 4C durante 16 h. Las cuentas de agarosa se recogieron en una columna y se lavaron con 0,1 M Tris HCl pH 8,0, seguido de 10 mM Tris HCl pH 8,0. El anticuerpo se eluyó con alícuotas de 1 ml de glicina 0,1 M pH 3,0 en muestras de 100 \mul de 1 M Tris HCl pH 8,0 y fracciones que contienen cantidades significativas de proteína fueron identificadas a partir de lecturas A_{280 \ nm}. Estas fracciones fueron dializadas contra PBS, esterilizadas por filtración y se volvieron a medir A_{280 \ nm} para dar la concentración de anticuerpos aproximada (concentración=A_{280 \ nm} x 0,714 mg/ml).

La pureza y la integridad de los anticuerpos se establecieron mediante reducción de SDS-PAGE, usando 12,5% de acrilamida. Las concentraciones se verificaron en un ELISA que utiliza anticuerpos \kappa anti-humanos de cabra (Seralab) como reactivo de captura y anticuerpos \kappa anti-humanos de cabra biotinilados (Sigma), seguido por ExtrAvidin-HRPO (Sigma) para la detección. Esto significaba que la naturaleza de la cadena pesada era poco probable que influyera en el nivel de unión obtenido.

Rosetas de transfectantes Fc\gammaRI

Glóbulos rojos R_{2}R_{2} lavados se incubaron con muestras de Ab en 100 ml de PBS en placas de 96 pocillos a temperatura ambiente durante 1 h. Los glóbulos rojos se lavaron tres veces, se resuspendieron en PBS y se incubaron a 37ºC durante 40 min con transfectantes que expresan Fc\gammaRI cDNA, B2KA (Gorman S. y G. Hale, sin publicar), creciendo en placas de 96 pocillos. El sobrenadante fue descartado y los pocillos se lavaron una vez para eliminar el exceso de glóbulos rojos. Para cada pocillo, se examinaron 200 células B2KA y el anotó el número de rosetas de glóbulos rojos. El porcentaje promedio y la desviación estándar de los pocillos se trazó por triplicado. Alternativamente, los glóbulos rojos sensibilizados y las células B2KA se mezclaron en tubos de microcentrifugación, granulado y suavemente resuspendidos antes de la transferencia a un portaobjetos de microscopio.

Tinción fluorescente de transfectantes Fc\gammaR

Los transfectantes que expresan Fc\gammaRI ADNc, B2KA y 3T3 + Fc\gammaRIa + cadena \gamma (van Urgt, MJ, Heijnen, IAFM, Capel, PJA, Park, S.Y., Ra, C., Saito, T., Verbeek, JS y van de Winkel, JGJ (1996) la cadena \gamma FcR es esencial para la expresión de superficie y para la función Fc\gammaRI humano (CD64) en vivo. Blood 87, 3593-3599), se obtuvieron como suspensiones de célula única en una solución salina de tampón fosfato que contiene 0,1% (w/v) NaN_{3}, 0,1% (w/v) BSA (tampón de lavado) después del tratamiento con tampón de disociación celular (Gibco BRL). Las células fueron formadas en cuentas en 10^{5} células/pocillo en placas de 96 pocillos, se resuspendieron en diluciones de 100 \mul de CAMPATH-1 o Fog-1 Ab y se incubaron en hielo durante 30 min. Las células se lavaron tres veces con 150 \mul/pocillo de tampón de lavado y de forma similar se incubaron con 20 \mug/ml de conjugado con Ab de cadena \kappa anti-humano de cabra conjugado con biotina (Sigma), y con 20 \mug/ml ExtrAvidin-FITC (Sigma). Después del último lavado, las células fueron fijadas en 100 \mul de tampón de lavado con un 1% (v/v) de formaldehído. La expresión superficial de Fc\gammaRI fue confirmada por tinción con CD64 monoclonal (Serotec) y Ab IgG de cabra y ratón conjugado con FITC (Sigma). Las intensidades de fluorescencia se midieron en un FACScan (Becton Dickinson).

Para transfectantes que soportan Fc\gammaRII, 3T6 + Fc\gammaRIIa 131H/H, 3T6 + Fc\gammaRIIa 131R/R (Warmerdam, PAM, van de Winkel, JGJ, Gosselin, EJ, y Capel, PJA (1990) Molecular basis for a polymorphism of human Fc\gamma receptor II (CD32). J. Exp. Med. 172, 19-25; Warmerdam, PAM, van de Winkel, JGJ, Vlug, A., Westerdaal, NAC y Capel, PJA (1991) un solo aminoácido en el segundo dominio a modo de Ig del receptor humano Fc\gamma II es crítico para unión de IgG2 humano. J. Immunol. 147, 1338-1343) y 3T6 + Fc\gammaRIIb1* (Warmerdam, PAM, van den Herik-Oudijk, IE, Parren, PWHI, Westerdaal, NAC, van de Winkel, JGJ y Capel, PJA (1993) Int. Immunol. 5, 239-247) los anticuerpos fueron complejados, antes de ser incubados con las células. Para Fc\gammaRIIa 131H/H, los anticuerpos fueron mezclados con cantidades equimolares de F(ab')_{2} de cabra \kappa antihumano (Seralab) y se incubaron a 37ºC durante 1 h. Los complejos se mezclaron luego con las células y se continuó el ensayo como anteriormente excepto que el anticuerpo de detección fue IgG anti-cabra de burro conjugada con FITC (Serotec). Para Fc\gammaRIIa 131R/R, los complejos se realizaron con cantidades equimolares de F(ab')_{2} de cabra conjugado con FITC \kappa antihumano (Seralab), y para Fc\gammaRIIb1*, los complejos se realizaron con cantidades equimolares de una mezcla 1:1 de F(ab')_{2} de cabra conjugado con FITC y sin marcar \kappa antihumano. Así, para estos receptores se necesitaba sólo una etapa de incubación.

Para transfectantes que soportan Fc\gammaRIIIb, CHO + Fc\gammaRIIIb NA1 o NA2 (Bux, J., Kissel, K., Hofmann, C. y Santoso, S. (1999) el uso de antígenos IIIb receptores gamma Fc recombinantes específicos de alelos para la detección de anticuerpos de granulocitos. Blood 93, 357-362), la tinción se llevó a cabo tal como se describe para las células 3T6 + Fc\gammaRIIa 131H/H anteriores.

Sensibilización de los glóbulos rojos

El grupo de glóbulos rojos O R_{1}R_{1} se lavó en PBS y se resuspendió en RPMI + 10% FBS en una concentración final de 5% v/v. 10 \mul de células se añadieron a 50 \mul de mAb o RPMI/FBS en placas de pocillos de fondo en V y se incubaron durante 60 min. a 37ºC. En algunos experimentos, el mAb se diluyó en serie en RPMI/FBS para alcanzar un rango de IgG unida a células rojas. En experimentos de competencia, los glóbulos rojos se sensibilizaron en una mezcla de 25 \mul de mAb competidoras y 25 \mul de mAb de tipo salvaje o 25 \mul de suero que contiene aloanticuerpos. Después de la sensibilización, las células se lavaron 4 veces con volúmenes de 200 \mul de PBS y se resuspendieron en 50 \mul de RPMI/FBS (concentración final = 1% v/v). En todos los experimentos, una alícuota de células (E-IgG) fue utilizada en ensayo de quimioluminiscencia (CL) y una alícuota se determinó mediante citometría de flujo para determinar el nivel de IgG unidas a glóbulos rojos.

Ensayo de quimioluminiscencia

PBMC se aisló mediante centrifugación de gradiente de densidad de sangre anticoagulada con EDTA agrupada de seis donantes sanos. PBMC se lavó 4 veces con PBS que contiene 1% de BSA libre de globulina y se resuspendieron a continuación en 2 x 10^{6}/ml en solución de sal equilibrada de Hank (HBSS) que contenía un 25% de RPMI y un 2,5% de FBS. Alícuotas (100 \mul) se distribuyeron en 96 placas de fondo plano de color blanco opaco y se incubaron durante 2 horas a 37ºC en una atmósfera húmeda de 5% de CO_{2} en aire. Las placas se colocaron a continuación en un luminómetro (Anthos Lucy 1, Labtech Internacional, Uckfield, Reino Unido) y 100 \mul de HBSS que contenía 4 x 10^{-4} luminol M (Sigma) y 20 \muL de E-IgG se añadieron a cada pocillo. La respuesta de CL fue monitorizada a 37ºC durante 60 minutos.

Determinación de IgG unida a glóbulos rojos

Alícuotas de 25 \mul de E-IgG fueron transferidas a una placa de pocillos de fondo en V, se lavaron una vez con PBS, se centrifugaron en un precipitado y se resuspendieron en 50 \mul F(ab)_{2} FITC anti-TGG (diluido 1/30 en PBS/BSA al 1%). Después de 30 min a temperatura ambiente, las células se lavaron una vez con 200 \mul de PBS/BSA y se mantuvieron en hielo hasta su análisis mediante citometría de flujo (EPICS XL-MCL, Coulter Electronics, Luton, Reino Unido). La fluorescencia de canal promedio fue registrada.

La fluorescencia media del canal se convirtió a las moléculas de IgG/célula mediante el uso de una curva estándar que se preparó añadiendo 100 l de 5% v/v de células R_{1}R_{1} a 900 \mul de diluciones 2 veces en serie de IgG1 monoclonal humano anti-D (BRAD-5). Los glóbulos rojos sensibilizados se lavaron 3 veces con PBS/BSA y se resuspendieron en 1% v/v en PBS/BSA. Alícuotas de 25 \mul fueron retiradas y analizadas por citometría de flujo tal como se describe anteriormente. Los glóbulos rojos restantes se contaron, se centrifugaron en un precipitado, se lisaron en un tampón con Triton X-100 y IgG en lisados se determinó mediante ELISA tal como se describe por Kumpel (Kumpel, B.M. (1990). A simple non-isotopic method for the quantitation of rec cell-bound immunoglobulin. Vox Sanguinis, 59, 34-39). El número de moléculas de IgG unidas por glóbulo rojo se dedujo a partir de la concentración de IgG y el número de glóbulos rojos a partir de la cual se preparó cada lisado. Una curva estándar fue entonces trazada comparando la intensidad de fluorescencia con el número de moléculas de IgG unidas por glóbulo rojo.

Lisis de complemento mediada mediante series de anticuerpos CAMPATH-1

100 ml de sangre venosa de un voluntario sano fueron desfibrinados y los componentes separados mediante centrifugación en gradiente de densidad usando Ficoll-Paque Plus (Pharmacia). El suero y las capas de células mononucleares fueron trasladadas a tubos nuevos. Las células se diluyeron en medio de Dulbecco modificado de Iscove (IMDM) y recogidas por centrifugación. Las células se lavaron dos veces en IMDM mientras se combinan en una cuenta que se resuspendió en 200 \mul de IMDM. 900 \muCi cromato de sodio [^{51}Cr] se añadieron y las células se incubaron a 37ºC durante 40 min. 10 ml de IMDM fueron agregados y las células se formaron en gránulos. Las células se lavaron dos veces y se resuspendieron en IMDM en aproximadamente 6 x 10^{6} células/ml. Alícuotas de 50 \mul de células marcadas se añadieron a las muestras de anticuerpo en 50 \mul de IMDM en los pocillos de una placa de 96 pocillos. 100 \mul de suero retenido diluido 1:1 con IMDM se añadieron a cada pocillo y las placas se incubaron a 37ºC durante 1 h. Las placas fueron centrifugadas y los sobrenadantes se muestrearon y las cantidades relativas de ^{51}Cr liberadas se midieron en un contador \gamma. El nivel de liberación espontánea se obtuvo a partir de muestras donde no se añadió ningún anticuerpo y una medición de la cantidad total de ^{51}Cr disponible para la liberación se encontró a partir de muestras similares tomadas después de resuspender las células. El % específico de liberación de Cr^{51} se calculó mediante la fórmula:

\frac{(cuentas \ de \ muestra - cuentas \ espontáneas) x 100}{(cuentas \ totales - cuentas \ espontáneas)}

Se trazaron los promedios y las desviaciones estándar de las muestras por triplicado.

Para la inhibición de la lisis de complemento, las muestras de anticuerpos contenían una cantidad constante (6,25 \mug/ml de concentración final) de CAMPATH-1 G1 y cantidades cada vez mayores de CAMPATH-1 G2\Deltaa.

ADCC mediada por series de anticuerpos CAMPATH-1

Células mononucleares de sangre periférica fueron preparadas tal como se describió anteriormente. Después del lavado, las células se resuspendieron en IMDM suplementado con 5% de SFB y se transfirieron al frasco que había sido recubierto con anticuerpo CD3. Las células se cultivaron a 37ºC, 5% de CO_{2} durante tres días. 5% de las células se marcaron con ^{51}Cr para su uso como células objetivo, se lavaron y se resuspendieron en 6 x 10^{5} células/ml en IMDM + 5% FBS. Alícuotas de 50 \mul se añadieron a los pocillos de placas de 96 pocillos que contienen muestras de 50 \mul de anticuerpos en IMDM + 5% FBS. Las células objetivo y los anticuerpos se incubaron a 37ºC durante 1 h, se añadieron glóbulos rojos como portadores y las células se formaron en gránulos. Las células se lavaron dos veces en IMDM. Las células mononucleares restantes se recogieron por centrifugación y se resuspendieron en 4 x 10^{6} células/ml en IMDM + 5% FBS y se añadieron 150 \mul a cada pocillo resuspendiendo las células objetivo en el proceso. Esto proporciona una relación efector:objetivo de 20:1. Las células fueron centrifugadas con suavidad y se colocaron en una incubadora de cultivo de tejidos durante 6 h. El sobrenadante se muestreó y se determinó la liberación de Cr^{51} específico tal como se describe anteriormente. Los valores promedio de la liberación específica para las muestras duplicadas se trazaron respecto a las concentraciones de anticuerpos finales.

Ejemplo 1 Generación y caracterización básica de los anticuerpos

Las mutaciones elegidas para eliminar las funciones efectoras se muestran en la Tabla 1 (Fig. 15). La mutación \Deltaa realizada en los genes IgGl e IgG2 introduce los residuos IgG4 en las posiciones 327, 330 y 331. Del mismo modo, los residuos IgG2 en las posiciones 233 a 236 se introdujeron en IgGl e IgG4, pero como IgG2 tiene una eliminación en 236, donde las otras subclases tienen un residuo de glicina, la mutación se hizo omitiendo (\Deltab) o incluyendo (\Deltac) G236.

Los vectores que permiten la expresión de CAMPATH-1 o ADN Fog-1 V_{H} en relación con genes de tipo salvaje o de región constante mutante se cotransfectan con los correspondientes vectores de expresión de cadena ligera en células de mieloma de rata. Los transfectantes estables fueron aislados, se expandieron y purificaron con Ab a partir del sobrenadante en proteína A-agarosa.

CAMPATH-1H fue seleccionada, ya que proporciona un buen sistema de orientación para el estudio de lisis de complemento y celular mediada en vitro.

Para Fog-1 Ab, se apreció un precipitado formado después de la purificación, pero una vez que este había sido eliminado por filtración y esterilización, sin precipitación. Las concentraciones de Ab se estimaron a partir de la absorbancia en 280 nm y se ajustaron en su caso a raíz de una prueba ELISA que mide las cantidades relativas de la cadena \kappa presente. El Ab fue sometido a reducción de SDS-PAGE. Cada muestra mostró dos bandas con pesos moleculares aparentes de aproximadamente 25 y 55 kDa, que representan el tamaño esperado de las cadenas ligeras y pesadas. No hubo diferencias discernibles en el tamaño entre las cadenas pesadas de cada serie Ab, pero las dos cadenas de Fog-1 Ab parecían ser ligeramente más pequeñas que sus contrarios CAMPATH-1. El hecho de que la cadena pesada de cada serie parecía tener el mismo peso molecular aparente indica que las mutaciones no causaron diferencias considerables en la glicosilación de las proteínas. Para Ab con especificidad CAMPATH-1, el rendimiento después de la purificación varió de 0,6 a 9 \mug/ml de sobrenadante, mientras que el rendimiento de Fog-1 Ab soluble fue entre 3 y 20 \mug/ml. No se encontró correlación en el ranking de los rendimientos de purificación para las dos series de anticuerpos,
lo que sugiere que ninguna de las mutaciones afectó la producción de Ab o su capacidad de unirse a la proteína A.

Las especificidades de las dos series de Ab fueron analizadas. El CAMPATH Ab-1 se muestra para competir con grado clínico CAMPATH-1H en la unión del anticuerpo monoclonal idiotipo anti-CAMPATH 1 mAb, YID13.9. El Fog-1 Ab era capaz de aglutinar glóbulos rojos RhD^{+} en presencia de Ab IgG anti-humano como reactivos de entrecruzamiento. Del mismo modo, las subclases IgG de Fog1 Ab fueron examinadas mediante el recubrimiento de los glóbulos rojos RhD^{+} con los diferentes Ab y mirando el patrón de aglutinación usando anti-G1m(a), anti-IgG2 o Ab anti-IgG4 como Ab de entrecruzamiento. El resultado indica que los anticuerpos eran de las subclases correctas. La aglutinación de glóbulos rojos RhD^{+} mediante Fog-1 IgG1 y anti GlM-(a), mediante Fog-1 IgG2 y anti-IgG2 y mediante Fog-1 IgG4 y anti-IgG4 se llevó a cabo en presencia de exceso de Ab de las series CAMPATH-1. El CAMPATH-1 Ab fue capaz de inhibir la aglutinación, compitiendo por el reactivo del entrecruzamiento, únicamente donde era de la misma subclase que Fog-1 Ab, verificando por lo tanto sus subclases.

Ejemplo 2 Unión de Fc\gammaRI

Glóbulos rojos con aproximadamente 30 000 sitios Rh por célula (R_{2}R_{2}) Se recubrieron con cada uno de los Ab 11 Fog-1 en un rango de concentraciones y se añadieron a transfectantes humanos que expresan Fc\gammaRI, B2KA, que crece en pozos. Después de la incubación, el exceso de glóbulos rojos ha desaparecido, y el porcentaje de células B2KA que forman rosetas mediante glóbulos rojos se registró (Figura 1). Para G1 y G1\Deltaa, se incluyen residuos de IgG4 en las posiciones 327, 330 y 331, niveles similares de rosetas se lograron, al producirse rosetas de media máxima cuando los glóbulos rojos se recubrieron con Ab en aproximadamente 0,1 \mug/ml, una concentración en la que Fog-1 Ab se esperaría que ocupe aproximadamente un tercio de los sitios RhD. Concentraciones ligeramente mayores de G4 fueron necesarias para obtener los mismos niveles de rosetas. No se formaron rosetas utilizando glóbulos rojos recubiertos con G1 y G4 Ab que contiene \Deltab y mutaciones \Deltac o Ab G2. En el experimento que se muestra en la Figura 1, la mayor concentración de recubrimiento de la prueba fue de 10 mg/ml, que se predice que corresponde a aproximadamente el 90% de ocupación de los sitios RhD. El experimento se repitió utilizando concentraciones de revestimiento de hasta 80 mg/ml, esencialmente saturando los sitios RhD y todavía no se observaron rosetas en G2 y Ab que contiene las mutaciones Cb o Dc e incorporando así residuos de IgG2 en la región de bisagra inferior. Esto indica que, aun cuando los glóbulos rojos se cubrieron con estos Ab en la densidad máxima para este antígeno, no había suficiente interacción IgG/Fc\gammagRI para la formación de rosetas.

Se encontró que la centrifugación de glóbulos rojos y células B2KA sensibilizados juntos antes de la observación de rosetas en un portaobjetos de microscopio que daba una mayor proporción de rosetas de incubación de células en los pozos, por lo que este procedimiento fue utilizado para investigar la inhibición de la formación de rosetas. Glóbulos rojos R_{2}R_{2} se recubrieron con una mezcla de 1 mg/ml Fog-1 G1 y diferentes cantidades de Fog-1 G2Da o Fog-1 G4Db antes de mezclarse con las células B2KA. Cuando se utilizó 1 \mug/ml Fog-1 G1 en solitario, los glóbulos rojos recubiertos formaron rosetas en el 95% de las células B2KA mientras que la sensibilización en presencia de 64 mg/ml G2\Deltaa o G4\Deltab completamente abolió las rosetas (datos no mostrados).

La unión de Ab de ambas series en dos líneas diferentes de células, que expresan el ADNc Fc\gammaRI en su superficie, se midió mediante tinción fluorescente. La figura 2 muestra los experimentos representativos. El nivel de Fc\gammaRI expresado en superficie, detectado usando Ab CD64, fue mayor para los transfectantes 3T3 que para la línea B2KA y esto se refleja en señales más altas obtenidas en la medición de la unión a través de receptores Fc. Para ambas series, el G1 y Ab G1\Deltaa se unen al receptor con la misma afinidad aparente, que indica que las mutaciones en las posiciones 327, 330 y 331 no afectaron significativamente la interacción. La unión de G4 Ab fue aproximadamente tres veces menor que la del G1 y Ab G1\Deltaa. Poca unión se apreció para el Ab G2 o cualquiera de los otros Ab mutantes, lo que sugiere que las mutaciones \Deltab y \Deltac en IgG1 e IgG4 fueron suficientes para reducir la unión a Fc\gammaRI por lo menos 10^{4} veces. Ab contiene la mutación \Deltac, especialmente G1\Deltac mostró un pequeño grado de unión a Fc\gammaRI en las concentraciones máximas a prueba si el nivel de fluorescencia se compara con la base o el Ab equivalente con la mutación \Deltab. Si los histogramas de intensidad de fluorescencia se cubren, como se ve en la Figura 3 para las concentraciones más altas de células Campath-1 Ab y B2KA, los trazados para G1 y G1\Deltaa coinciden. Hay una diferencia clara entre los histogramas para G1\Deltab y Ab G1\Deltac.

Ejemplo 3 Activación de Fc\gammaRI medida por quimioluminiscencia

Para medir la actividad funcional a través de Fc\gammaRI/II, la respuesta de la quimioluminiscencia (CL) de los monocitos a los glóbulos rojos sensibilizados con Ab de la serie Fog-1 fue medida y trazada en relación con el número de moléculas de Ab unidas por los glóbulos rojos (Figura 4). Una diferencia entre el G1 y G1\Deltaa Ab se aprecia con mayores cantidades de Ab, pero ambos dan una mayor respuesta que el Ab G4 en toda la gama de las concentraciones de Ab. Se logra una activación significativa mediante el Ab G1\Deltac y, en menor medida, mediante G1\Deltaac y G4\Deltac, pero el otro Ab no da ninguna respuesta.

Ab, que se sabía que era deficiente en la activación de Fc\gammaRI de la sección anterior, se mezcló en concentraciones en aumento con una cantidad constante de Fog-1 G1 y se utilizó para sensibilizar a los glóbulos rojos. La respuesta CL a los glóbulos rojos se muestra en la Figura 5. Al comparar la respuesta de CL a la obtenida cuando se tituló G1 solamente, se desprende que seis de los ocho Ab inhiben la reacción en un grado que se predice si se supone que los mutantes desplazan el G1 activo de los glóbulos rojos en proporción a su concentración relativa. Para G2, el efecto inhibidor se retrasa, por es necesario aproximadamente tres veces más de G2 para dar la misma cantidad de inhibición. G1\Deltac
inhibe en aproximadamente la misma medida que los otros mutantes, excepto en que la respuesta no se reduce a cero.

Dos documentos que han discutido la utilidad de la quimioluminiscencia para predecir la severidad de la patología in vivo son Hadley (1995) Transfusion Medicine Reviews 9:302-313 y Hadley et al (1998) Br J Obstet Gynaecol 105: 231-234.

En estos ensayos un resultado superior al 30% de quimioluminiscencia producida por el control del anticuerpo monoclonal BRAD-5 sería predictivo de patología in-vivo en HDN. Así, aquellos anticuerpos que pueden bloquearse en niveles por debajo del 30% deben ser adecuados para terapia.

Uno de los mutantes Ab, Fog-1 G2\Deltaa fue probado para comprobar su capacidad de inhibir la respuesta de CL a sueros que contienen Ab clínicamente significativo. Los sueros contenían Ab anti-RhD o antiC+D y, en ausencia de inhibidor, dieron respuestas CL mayores del 30% en esta escala, lo cual es indicativo de enfermedad grave hemolítica del recién nacido y la necesidad de transfusiones intrauterinas. Los sueros se mezclaron con diferentes concentraciones de G2\Deltaa, las mezclas utilizadas para sensibilizar a los glóbulos rojos y las respuestas de los monocitos fueron medidas (Figura 6). La adición de G2\Deltaa Ab redujo las señales CL debido a que todos los cinco sueros anti-RhD estaban por debajo del 30% de corte. La cantidad de Ab necesario para lograr esto varió desde 16 hasta 260 \mug/ml, reflejando el rango presumiblemente las cantidades y afinidades diferentes de anti-RhD Ab en el suero. Hay dos sueros control. El suero anti-K no puede ser bloqueado en absoluto por G2\Deltaa, ya que su reactividad está dirigida a un antígeno diferente sobre los glóbulos rojos. Sólo parte de la actividad del suero anti-C+D podría ser inhibida mediante G2\Deltaa.

Ejemplo 4 Actividad en la lisis de complemento

La figura 7 muestra que todas las mutaciones introducidas en los anticuerpos CAMPATH-1 G1 y G2 redujeron drásticamente su capacidad para mediar la lisis de complemento. Cuando el ensayo se llevó a cabo utilizando una cantidad constante de G1 y cantidades diferentes de G2\Deltaa (Figura 8), el anticuerpo G2\Deltaa fue capaz de bloquear la muerte de PBMC mediante CAMPATH-1 G1.

Ejemplo 5 Actividad en ADCC

La capacidad de mediar ADCC se midió para los anticuerpos CAMPATH-1 utilizando PBMC humano como células objetivo (Figura 9) y para los anticuerpos Fog-1 utilizando glóbulos rojos RhD^{+} como células objetivo (Figuras 10 y 10b). La figura 9 muestra las habilidades mixtas de los anticuerpos CAMPATH-1 en ADCC, con algunos de los mutantes teniendo actividades muy bajas. Las Figuras 10 y 10b muestran que los mutantes de anticuerpo Fog-1 G1\Deltaab, G1\Deltaac, G2\Deltaa, G4\Deltab y G4\Deltac fueron incapaces de soportar ninguna muerte de los glóbulos rojos. En la Figura 10 se aprecia alguna lisis de glóbulos rojos sensibilizados con G2 o G4, pero estos anticuerpos no tienen actividad aparente en el ensayo de la Figura 10b. Esto demuestra la observación de que el grado de lisis puede depender de los donantes de las células efectoras e incluso puede variar cuando se utilizan células efectoras tomadas del mismo donante en momentos diferentes. Sin embargo, para los mutantes indicados anteriormente no se ha apreciado actividad por encima de los niveles de base, aunque se han probado una serie de donantes de células efectoras.

Algunos de los anticuerpos Fog-1 se utilizaron para tratar de inhibir el ADCC de los glóbulos rojos Rh^{+} mediante Fog-1 G1 (Figuras 11 y 11b) y mediante una muestra clínica de suero anti-Rh (Figura 12). Las figuras muestran que todos los anticuerpos probados fueron capaces de inhibir ADCC cuando se mezclan con los anticuerpos activos antes de la sensibilización de glóbulos rojos. Los anticuerpos mutantes Fog-1 G1\Deltab, G1\Deltaab, G1\Deltaac, G4\Deltab y G4\Deltac fueron particularmente efectivos en el bloqueo de ADCC.

Ejemplo 6 Unión Fc\gammaRII

Las Figuras 13, 13b y 14 muestran la unión de complejos de anticuerpos de la serie Fog-1 en células que soportan Fc\gammaRIIa 131H/H, Fc\gammaRIIa 131R/R y Fc\gammaRIIb1* respectivamente. Es necesario formar complejos de anticuerpos cuando se mide la unión a estos receptores debido a su poca afinidad para las moléculas de anticuerpos individuales. Fc\gammaRIIa 131H/H es un alotipo de Fc\gammaRIIa al que los anticuerpos IgG2 se espera que se fijen fuertemente y, de hecho, G1 y G2 muestran una fuerte actividad de unión (Figura 13). La adición de las mutaciones a estos dos anticuerpos parece dar una reducción gradual en los niveles de unión y los anticuerpos G1\Deltac y G1\Deltaac sólo tienen niveles de base de unión según lo exhibido por los anticuerpos G4. La figura 13b muestra que los anticuerpos tienen diferentes actividades relativas cuando se unen con el alotipo 131R de Fc\gammaRIIa, pero las mutaciones introducidas en el anticuerpo G1 de tipo salvaje disminuyen de nuevo la unión al receptor. Todos los anticuerpos presentan significativamente más unión al receptor inhibitorio, FcyRIIb1*, que las muestras de control negativo de entrecruzamiento F(ab')_{2} solo o un anticuerpo IgG1 aglicosil complejo con F(ab')_{2} (Figura 14). Aunque la unión de la mayoría de los mutantes es reducida en relación con los anticuerpos correspondientes de tipo salvaje, algunos mutantes muestran una unión dos veces mayor de la que presenta el anticuerpo G1 de tipo salvaje.

Ejemplo 6b Unión FcgRIII

Las figuras 14b y 14c muestran la unión de complejos de anticuerpos de las series Fog-1 a células que soportan Fc\gammaRIIIb de los alotipos NA1 y NA2, respectivamente. Para los dos alotipos, se aprecia unión para el anticuerpo G1 y, en menor medida, los anticuerpos G1\Deltaa y G1\Deltac. No se observa unión para los otros anticuerpos mutantes, ya que muestran niveles similares de fluorescencia de las muestras de control negativo de entrecruzamiento F(ab')_{2} solo o un anticuerpo IgG1 aglicosil complejo con F(ab')_{2}.

Ejemplo 7 Producción de los anticuerpos anti-HPA-1a

El V_{H} y V_{\lambda} del scFv anti-HPA-la (Griffin, H.M. y Ouwehand, W.H. (1995), un anticuerpo monoclonal humano específico para la leucina-33 forma la glucoproteína plaquetaria IIIa de una librería de visualización de fagos de gen V. Blood 86, 4430-4436) se amplificó y cada uno se fijó a la secuencia líder del vector M13VHPCR1 (Orlandi et al., 1989) mediante la superposición de extensión PCR como se describió anteriormente. ADN, 3' de V_{H} en M13VHPCR1 y que representa el extremo 5' del intrón V_{H}-C_{H}, se unió de manera similar al líder/V_{H}ADN. El producto se clonó como un fragmento HindIII-BamHI en el vector de expresión IgG1 e IgG2 para reemplazar el fragmento de región variable existente y dar los vectores PSVGPTB2VHHuIgG1 y PSVGPTB2VHHuIgG2.

El líder/V\lambda ADN se unió en el marco del ADN humano de región constante de cadena \lambda del alotipo Kern Oz (Rabbitts, T.H. Forster, H. y Matthews, J.G. 1983. Mol. Biol. Med.1: 11), tomado de un vector de expresión existente (Routledge, EG, Lloyd, I, Gorman, SD, Clark, M. y Waldmann, H. 1991, Eur. J. Immunol. 21:2717). Todo el gen \lambda se clonó en M13 como un fragmento HindIII-BamHI y el potenciador de cadena pesada murino de PSVhyg-Huck (Orlandi et al., 1989) agregó 5' del gen usando adaptadores, de manera que toda la inserción podría ser transferida a pSV2neo (Southern, P. J. y Berg. P. 1982. J. Mol. Appl. Genet. 1:327) como un fragmento BamHI. El vector fue designado PSVneoB2V\lambdaHuC\lambda.

Los vectores de expresión se transfectaron en la línea celular de mieloma de rata YB2/0, transfectantes seleccionados y anticuerpo purificado tal como se describe anteriormente. Estos anticuerpos B2IgG1 y B2IgG2 se pueden utilizar como anticuerpos de control.

Una vez que las regiones constantes nulas preferidas han sido seleccionadas, el fragmento B2 VH HindIII-BamHI se puede introducir en vectores de expresión que contienen los genes adecuados de región constante, sustituyendo el fragmento de la región variable existente. Los vectores de expresión de cadena pesada pueden ser cotransfectados con PSVneoB2V\lambdaHuC\lambda en células de mieloma y los anticuerpos purificados para su uso.

Ejemplo 8 Uso terapéutico de la molécula de unión

Una molécula terapéutica, según la presente invención, puede utilizarse para tratar embarazos complicados por aloinmunización HPA-1a, por ejemplo mediante la administración intravenosa a la madre, por lo que contará en la transferencia placentaria (por ejemplo, a través de la FcRn) para proporcionar una dosis terapéutica al feto.

Una alternativa es la administración directa al feto por muestreo percutáneo de los vasos umbilicales. Este procedimiento se realiza normalmente en FAIT para entregar transfusiones de plaquetas compatibles. A causa de la corta supervivencia de las plaquetas transfundidas, el procedimiento puede tener que repetirse muchas veces durante el transcurso de un embarazo. Sin embargo, es peligroso, con un riesgo de pérdida fetal del procedimiento del 0,5%.

Sin embargo, la administración fetal de un anticuerpo terapéutico tiene la ventaja de que es probable que se requiera una dosis mucho más baja, y por lo tanto un enfoque combinado a partir de las moléculas de la presente invención en relación con la transfusión de plaquetas puede ser considerado como una primera etapa en la terapia. Este planteamiento puede reducir o eliminar la necesidad de transfusiones de plaquetas adicionales antes del parto.

Resumen

Las actividades de los anticuerpos se resumen en la Tabla 2 (Figura 16). Como puede verse, las moléculas de unión se han producido, que tienen una capacidad reducido de unión a Fc\gammaRI, Fc\gammaRIIa 131H/H, Fc\gammaRIIa 131R/R, Fc\gammaRIIIb NA1 y Fc\gammaRIIIb NA2; no pueden accionar quimioluminiscencia de monocitos, no pueden mediar en la lisis por complemento y no se mueve en ADCC. Sin embargo, las moléculas de unión mantienen su unión al receptor inhibitorio, Fc\gammaRIIb. Otras mutaciones utilizadas anteriormente para eliminar funciones efectoras, como la retirada al sitio de glicosilación en el dominio CH2 para producir anticuerpos aglicosil, también puede eliminar la unión a este receptor, que puede no ser deseable.

Los mutantes seleccionados han demostrado ser capaces de inhibir completamente las rosetas de células de soporte de Fc\gammaRI mediante Fog-1 G1, la respuesta de los monocitos a glóbulos rojos sensibilizados con Fog-1 G1; la respuesta de los monocitos a los glóbulos rojos policlonales sensibilizados con anti-RhD; la muerte de PBMC mediante lisis de complemento con CAMPATH-1 G1, la muerte de glóbulos rojos mediante ADCC con Fog-1 G1, la muerte de glóbulos rojos mediante ADCC con suero policlonal anti-RhD.

Los resultados demuestran aquí que la alteración incluso un solo residuo en un dominio CH2 IgG para corresponder a una subclase diferente pueden llevar a diferentes actividades. Así, para los tres pares de mutantes Db y Dc: G1\Deltab y G1\Deltac, G1\Deltaab y G1\Deltaac, G4\Deltab y G4\Deltac. En cada par, los anticuerpos se diferencian sólo por la ausencia (\Deltab) o presencia (\Deltac) del G236. Sin embargo, para la mayoría de las funciones aquí medidas, los anticuerpos \Deltab y \Deltac tienen actividades diferentes. Los mutantes Db son más activos en la unión a Fc\gammaRIIa 131H/H, mientras que los mutantes Dc son más activos en la unión a Fc\gammaRI, Fc\gammaRIIIb NA1 y NA2, la activación de monocitos y ADCC. La región donde se forman las mutaciones \Deltab y \Deltac se conoce como bisagra inferior o región de enlace de bisagra y es probable que tenga una estructura extendida, conectando la bisagra al resto del dominio CH2. La adición o eliminación de un residuo de esta región presumiblemente altera la alineación de la bisagra inferior en relación con los residuos de sitios de interacción del receptor en el resto del dominio CH2.

Sin embargo hay que subrayar que el efecto de las mutaciones no siempre se puede predecir a partir de las actividades de los anticuerpos de tipo salvaje, sino que dependerá del nuevo contexto (basado en subclases "mixtas" de IgG) en el que la mutación está presente. Un ejemplo es en el ensayo de la lisis por complemento donde la actividad de los anticuerpos IgG2 es solamente casi tres veces menor que la de IgG1 pero introduciendo residuos de IgG2 en IgG1 (G1\Deltab y G1\Deltac) se elimina la lisis. De manera similar, IgG1 e IgG2 muestran una igualdad de unión a Fc\gammaRIIa 131H pero las actividades de G1\Deltab y G1\Deltac son 50 y 10 veces menores, respectivamente. En los ensayos de ADCC de las Figuras 9 y 10, IgG2 e IgG4 dan niveles similares bajos, pero mensurables, de lisis. La sustitución de los residuos entre IgG2 e IgG4, así como en IgG1, reduce la actividad. Estos datos sugieren que los anticuerpos de tipo salvaje de las diferentes subclases de IgG humano y, presumiblemente, los anticuerpos mutantes pueden utilizar diferentes residuos en la unión a otras moléculas para activar actividades.

\vskip1.000000\baselineskip

Referencias citadas en la descripción

Esta lista de referencias citadas por el solicitante está prevista únicamente para ayudar al lector y no forma parte del documento de patente europea. Aunque se ha puesto el máximo cuidado en su realización, no se pueden excluir errores u omisiones y la OEP declina cualquier responsabilidad al respecto.

Documentos de patente citados en la descripción

\bullet GB PA9206422 A [0015]

\bullet US 9209965 W [0053]

\bullet WO 9216562 A [0016] [0049] [0096] [0125]

\bullet EP 0385601 A [0074]

\bullet WO 9505468 A [0018] [0096]

\bullet EP 0120694 A [0095]

\bullet WO 9425591 A [0052]

\bullet EP 015023 A [0095]

Documentos no procedentes de patentes citados en la descripción

\bullet IgG Effector Mechanisms. Clark. Antibody Engineering. Chem Immunol, 1997, vol. 65, 88-110 [0004]

\bulletGhetie; Ward. Immunology Today, 1997, vol. 18, 592-598 [0009]

\bulletCole et al. Journal of Immunology, 1997, vol. 159, 3613-3621 [0014]

\bulletRoutledge et al. Eur J Immunol, 1993, vol. 23, 403-411 [0015]

\bulletMorgan et al. Immunology, 1995, vol. 86, 319-324 [0017] [0027]

\bulletChappel et al. Proc Natl Acad Sci USA, 1991, vol. 88, 9036-9040 [0027]

\bulletGreenwood et al. Eur J Immunol, 1993, vol. 23, 1098-1104 [0027]

\bulletKabat et al. Sequences of proteins of immunological interest. US Department of Health and Human Services, NIH, 1991 [0032]

\bulletAltschul et al. J. Mol. Biol., 1990, vol. 215, 403-10 [0039]

\bulletDaeron et al. Immunity, 1995, vol. 3 (5), 635-46 [0042]

\bullet Van den Herik. Blood, 1995, vol. 85 (8), 2201-11 [0042]

\bulletSarmay et al. Immunol Lett, 1996, vol. 54 (2-3), 93-100 [0042]

\bulletFong et al. Immunol Lett, 1996, vol. 54 (2-3), 83-91 [0042]

\bulletSarmay et al. J Biol Chem, 1996, vol. 271 (48), 30499-504 [0042]

\bulletUnkeless; Jin. Curr Opin Immunol, 1997, vol. 9 (3), 338-43 [0042]

\bulletIsakov. Immunol Res, 1997, vol. 16 (1), 85-100 [0042]

\bulletHunter et al. Blood, 1998, vol. 91 (5), 1762-8 [0042]

\bulletMalbec et al. J Immunol, 1998, vol. 160 (4), 1647-58 [0042]

\bulletClynes et al. J Exp Med, 1999, vol. 189 (1), 179-85 [0042]

\bulletBlood, 1995, vol. 86, 4430-4436 [0062]

\bulletPusey CD et al. Lab Invest, 1987, vol. 56, 23-31 [0065]

\bulletRoss CN et al. Lab Invest, 1996, vol. 74, 1051-1059 [0065]

\bulletRoutledge et al. Eur J Immunol, 1991, vol. 21, 2717-2725 [0072]

\bulletBolt et al. Eur J Immunol, 1993, vol. 23, 403-411 [0072]

\bulletRiechmann et al. Nature, 1988, vol. 332, 323-327 [0072]

\bulletSalmi et al. J Exp Med, 1993, vol. 178, 22-5060 [0072]

\bulletSmith et al. J Exp Med, 1998, vol. 188, 17-27 [0072]

\bulletMcElveen et al. Clin Exp Allergy, 1998, vol. 28, 1427-1434 [0072]

\bulletSambrook et al. Molecular Cloning: a Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989 [0088]

\bullet Current Protocols in Molecular Biology. John Wiley & Sons, 1992 [0089]

\bulletArmitage et al. Nature, 1992, vol. 357, 80-82 [0094]

\bulletGreenwood, J.; Clark, M.; Waldmann, H. Structural motifs involved in human IgG antibody effector functions. Eur. J. Immunol., 1993, vol. 23, 1098-1104 [0126]

\bulletReichmann, L.; Clark, M. R.; Waldmann, H.; Winter, G. Nature, 1988, vol. 332, 323-327 [0136]

\bulletBye, J. M.; Carter, C.; Cui, Y.; Gorick, B. D.; Songsivilai, S.; Winter, G.; Hughes-Jones, N. C.; Marks, J. D. Germline variable region gene segment derivation of human monoclonal anti-Rh(D) antibodies. J. Clin. Invest., 1992, vol. 90, 2481-2490 [0137]

\bulletOrlandi, R.; Gussow, D. H.; Jones, P. T.; Winter, G. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1989, vol. 86, 3833 [0138]

\bullet van Urgt, M. J.; Heijnen, I. A. F. M.; Capel, P. J. A.; Park, S. Y.; Ra, C.; Saito, T.; Verbeek, J. S.; van de Winkel, J. G. J. FcR \gamma-chain is essential for both surface expression and function of human Fc\gammaRI (CD64) in vivo. Blood, 1996, vol. 87, 3593-3599 [0147]

\bulletWarmerdam, P. A. M.; van de Winkel, J. G. J.; Gosselin, E. J.; Capel, P. J. A. Molecular basis for a polymorphism of human Fc\gamma receptor II (CD32). J. Exp. Med., 1990, vol. 172, 19-25 [0148]

\bulletWarmerdam, P. A. M.; van de Winkel, J. G. J.; Vlug, A.; Westerdaal, N. A. C.; Capel, P. J. A. A single amino acid in the second Ig-like domain of the human Fc\gamma receptor II is critical for human IgG2 binding. J. Immunol., 1991, vol. 147, 1338-1343 [0148]

\bulletWarmerdam, P. A. M.; van den Herik-Oudijk, I. E.; Parren, P. W. H. I.; Westerdaal, N. A. C.; van de Winkel, J. G. J.; Capel, P. J. A. Int. Immunol., 1993, vol. 5, 239-247 [0148]

\bulletBux, J.; Kissel, K.; Hofmann, C.; Santoso, S. The use of allele-specific recombinant Fc gamma receptor IIIb antigens for the detection of granulocyte antibodies. Blood, 1999, vol. 93, 357-362 [0149]

\bulletKumpel, B.M. A simple non-isotopic method for the quantitation of red cell-bound immunoglobulin. Vox Sanguinis, 1990, vol. 59, 34-39 [0153]

\bulletHadley. Transfusion Medicine Reviews, 1995, vol. 9, 302-313 [0168]

\bulletHadley et al. Br J Obstet Gynaecol, 1998, vol. 105, 231-234 [0168]

\bulletGriffin, H.M.; Ouwehand, W.H. A human monoclonal antibody specific for the leucine-33 form of the platelet glycoprotein IIIa from a V gene phage display library. Blood, 1995, vol. 86, 4430-4436 [0176]

\bulletRabbitts, T.H.; Forster, H.; Matthews, J.G. Mol. Biol. Med., 1983, vol. 1, 11 [0177]

\bulletRoutledge, E.G.; Lloyd, I; Gorman, S.D.; Clark, M.; Waldmann, H. Eur. J. Immunol., 1991, vol. 21, 2717 [0177]

\bulletSouthern, P. J.; Berg. P. J. Mol. Appl. Genet., 1982, vol. 1, 327 [0177]

Claims (30)

1. Anticuerpo recombinante que comprende:

(i) un dominio de unión que es capaz de unirse a una molécula objetivo; y

(ii) un dominio efector;

en el que el anticuerpo recombinante es capaz de unirse a la molécula objetivo sin activar una lisis dependiente del complemento significativa, o destrucción celular mediada del objetivo,

y en el que el dominio efector es

- capaz de unirse específicamente a Fc\gammaRIIb, y

- un dominio quimérico que se deriva de dos o más dominios C_{H}2 de cadena pesada de inmunoglobulina humana, cuyas inmunoglobulinas humanas se seleccionan entre IgG1, IgG2 e IgG4,

y en donde el dominio quimérico es un dominio C_{H}2 de cadena pesada de inmunoglobulina humana que tiene los siguientes bloques de aminoácidos en las posiciones indicadas: 233P, 234V, 235A y 236G 327G y, 330S y 331 S según el sistema de numeración de la UE,

y es al menos un 98% idéntico a una secuencia C_{H}2 (residuos 231-340) de la IgG1, IgG2 o IgG4 humana que tiene dichos aminoácidos modificados.

\vskip1.000000\baselineskip

2. Anticuerpo recombinante según la reivindicación 1, en el que el dominio efector es G1\Deltaac que tiene la siguiente secuencia de aminoácidos:

5

\vskip1.000000\baselineskip

3. Anticuerpo recombinante según la reivindicación 1, en el que el dominio efector es G4\Deltac que tiene la siguiente secuencia de aminoácidos:

6

\vskip1.000000\baselineskip

4. Anticuerpo recombinante que comprende:

(i) un dominio de unión que es capaz de unirse a la molécula objetivo, y

(ii) un dominio efector;

en el que el anticuerpo recombinante es capaz de unirse a la molécula objetivo sin activar una lisis dependiente complemento significativa, o la destrucción celular mediada del objetivo,

y en el que el dominio efector es

- capaz de unirse específicamente a Fc\gammaRIIb, y

- un dominio quimérico que se deriva de dos o más dominios C_{H}2 de cadena pesada de inmunoglobulina humana, cuyas inmunoglobulinas humanas se seleccionan entre IgG1, IgG2 e IgG4,

y en el que el dominio quimérico es un dominio C_{H}2 de cadena pesada de inmunoglobulina humana que tiene los siguientes bloques de aminoácidos en las posiciones indicadas: 233P, 234V, 235A y ningún residuo en 236, y 327G, 330S y 331S según el sistema de numeración de la UE,

y es al menos un 98% idéntico a una secuencia C_{H}2 (residuos 231-340) de IgG1 o IgG2 humana que tiene dichos aminoácidos modificados.

\vskip1.000000\baselineskip

5. Anticuerpo recombinante según la reivindicación 4, en el que el dominio efector es G1\Deltaab que tiene la siguiente secuencia de aminoácidos:

7

6. Anticuerpo recombinante según la reivindicación 4, en el que el dominio efector es G2\Deltaa que tiene la siguiente secuencia de aminoácidos:

8

7. Anticuerpo recombinante según cualquiera de las reivindicaciones anteriores

en el que el dominio efector se deriva de un primer dominio C_{H}2 de cadena pesada de inmunoglobulina humana, donde al menos el 1 amino ácido en al menos 1 región del dominio C_{H}2 ha sido modificado al aminoácido correspondiente de un segundo dominio C_{H}2, diferente, de cadena pesada de inmunoglobulina humana, y

en el que el dominio efector tiene una afinidad reducida para Fc\gammaRI, Fc\gammaRIIa o Fc\gammaRIII y una capacidad reducida para mediar la lisis por complemento en comparación con el primer o segundo dominio C_{H}2 de cadena pesada de inmunoglobulina humana.

8. Anticuerpo recombinante según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el dominio de unión se deriva de una fuente diferente a la del dominio efector.

9. Anticuerpo recombinante según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el dominio de unión es capaz de unirse cualquiera de: el antígeno RhD de glóbulos rojos; un aloantígeno HPA plaquetario; un antígeno de neutrófilos; un receptor de células T; integrina; colágeno GBM, y Der P1; HPA-1a; VAP-1; laminina; luterano; glicoproteína plaquetaria VI; glicoproteína plaquetaria Ia/IIa.

10. Anticuerpo recombinante según la reivindicación 9, en el que el dominio de unión se selecciona entre CAMPATH-1 y FOG1; OKT3; B2 (anti-HPA-1a); VAP-1; anti-\alpha3 (IV) NC1 murino; YTH12.5 (CD3); 2C7 (anti-Der p I); anti-laminina, anti-luterana.

11. Ácido nucleico aislado que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica el dominio efector del anticuerpo recombinante tal como se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones anteriores.

12. Ácido nucleico según la reivindicación 11, en el que la secuencia de nucleótidos codifica un anticuerpo recombinante según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10.

13. Ácido nucleico según la reivindicación 11 ó la reivindicación 12, que es un vector replicable.

14. Ácido nucleico según la reivindicación 13, en el que la secuencia de nucleótidos está operativamente vinculada a un promotor.

15. Célula huésped que comprende o transformada con el vector de la reivindicación 13 o la reivindicación 14.

16. Procedimiento para producir un anticuerpo recombinante según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, comprendiendo el procedimiento la etapa de modificar una secuencia de nucleótidos que codifica una primera cadena pesada C_{H}2 de inmunoglobulina humana, de manera que 2, 3 ó 4 aminoácidos en al menos 1 región del dominio C_{H}2 corresponden a un aminoácido de un segundo dominio C_{H}2 de cadena pesada de inmunoglobulina humana, en el que la región se selecciona entre las 2 regiones discretas numeradas de residuos 233-236, y 327-331 según el sistema de numeración de la UE, y en donde en cada caso la inmunoglobulina humana se selecciona entre IgG1, IgG2 e IgG4.

17. Procedimiento según la reivindicación 16, en el que 2 aminoácidos en 1 región del dominio C_{H}2 se modifican a los aminoácidos correspondientes de un segundo dominio C_{H}2 de cadena pesada de inmunoglobulina humana.

18. Procedimiento según la reivindicación 16, en el que por lo menos 2 aminoácidos en cada una de las 2 regiones discretas del dominio C_{H}2 se modifican a los aminoácidos correspondientes en la región correspondiente en un segundo y tercer dominio C_{H}2 de cadena pesada de inmunoglobulina humana respectivamente.

19. Utilización in vitro de un anticuerpo recombinante según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 para unir la molécula objetivo con dicho dominio de unión.

20. Utilización según la reivindicación 19, en el que el dominio efector se une específicamente a Fc\gammaRIIb y cuya unión provoca la inhibición de uno o más de: activación de células B; degranulación de los mastocitos; fagocitosis.

21. Utilización según la reivindicación 19, para prevenir, inhibir, o interferir con la unión de una segunda molécula de unión a la molécula objetivo.

22. Utilización según la reivindicación 21, en la que la segunda molécula de unión es un anticuerpo.

23. Utilización según cualquiera de las reivindicaciones 19 a 22, en el que la molécula objetivo se selecciona entre: el antígeno RhD de glóbulos rojos; un aloantígeno plaquetario HPA; un antígeno de neutrófilos; un receptor de células T; integrina; colágeno GBM; Der P1; HPA-1a; VAP-1; laminina; luterano; glicoproteína plaquetaria VI; glicoproteína plaquetaria Ia/IIa.

24. Utilización de un anticuerpo recombinante según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en la preparación de un medicamento para el tratamiento de un paciente para un trastorno, en la que dicho dominio de unión de dicho anticuerpo recombinante se utiliza en dicho tratamiento para unirse a la molécula objetivo que está asociada con dicho trastorno,

en la que el trastorno y la molécula objetivo se seleccionan entre:

(i) la enfermedad de injerto contra huésped o enfermedad de huésped contra injerto o rechazo del trasplante de órganos o rechazo de trasplante de médula ósea o vasculitis autoinmune o artritis o asma, en la que la molécula objetivo es un receptor de células T;

(ii) anemia hemolítica autoinmune o trombocitopenia autoinmune, en la que la molécula objetivo se selecciona del grupo que consiste en antígenos de glóbulos rojos Rhesus D, C, c, E, e; antígeno Kell (K1); glucoproteína plaquetaria IIb/IIIa, GPIb/IX/V;

(iii) trombocitopenia aloinmune fetal/neonatal; en la que la molécula objetivo es antígeno plaquetario humano (HPA)-1a sobre la glucoproteína plaquetaria IIIa;

(iv) alergia del ácaro del polvo, en la que la molécula objetivo es proteína Der P1 del ácaro del polvo doméstico Dermatophagoides pteronyssinus;

(v); Crohn, en la que la molécula objetivo es VAP-1;

(vi) HDN, en la que la molécula objetivo se selecciona del grupo formado por antígenos de glóbulos rojas Rhesus D, C, c, E, e, o antígeno Kell (K1);

(vii) síndrome de Goodpastures; en el que la molécula objetivo es un dominio no colágeno (NC1) de colágeno \alpha3 (IV);

(viii) anemia de células falciformes, en la que la molécula objetivo se selecciona del grupo que consiste en: trombospondina, laminina, luterana;

(ix) oclusión de la arteria coronaria en la que la molécula objetivo se selecciona del grupo que consiste en: integrina \alpha_{2}\beta_{1} (glicoproteína plaquetaria Ia/IIa), glicoproteína plaquetaria VI no-integrina.

25. Utilización según la reivindicación 24, en la que el medicamento es para la administración a un paciente que es un bebé por nacer, y el medicamento se administra a la madre del paciente.

26. Preparación farmacéutica que comprende un anticuerpo recombinante según una de las reivindicaciones 1 a 10, o un ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 11 a 14, más un portador farmacéuticamente aceptable.

27. Preparación farmacéutica según la reivindicación 26, para su utilización en un procedimiento de tratamiento médico.

28. Región C_{H}2 de anticuerpo que es G1\Deltaac que tiene la siguiente secuencia de aminoácidos:

9

29. Región C_{H}2 de anticuerpo que es G1\Deltaab que tiene la siguiente secuencia de aminoácidos:

10

30. Región C_{H}2 de anticuerpo que es G2\Deltaa que tiene la siguiente secuencia de aminoácidos:

11