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DE69905832T2 - Biologische Verwendungen von halbleitenden Nanokristallen - Google Patents

Biologische Verwendungen von halbleitenden Nanokristallen Download PDF

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DE69905832T2
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Vikram C. Stoneham Sundar
Frederick V. Mikulec
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Massachusetts Institute of Technology
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Description

  • Erfindungsgebiet
  • Diese Erfindung bezieht sich allgemein auf Zusammensetzungen zur Verwendung in biologischen Anwendungen. Insbesondere bezieht sich die Erfindung auf Zusammensetzungen umfassend Fluoreszenz-Halbleiter-Nanokristalle, die mit Verbindungen zur Verwendung in biologischen Anwendungen im Zusammenhang stehen, wie Affinitätsmoleküle, die in der Lage sind, spezifisch mit biologischen Targets in Wechselwirkung zu treten, und auf Verfahren zur Verwendung solcher Verbindungen.
  • Hintergrund der Erfindung
  • Herkömmliche Verfahren zur Detektion biologischer Verbindungen in vivo und in vitro beruhen auf der Verwendung von radioaktiven Markern. Z. B. verwenden diese Verfahren gewöhnlich radioaktiv markierte Sonden, wie Nukleinsäuren, die mit 32P oder 35S markiert sind, und Proteine, die mit 35S oder 125I markiert sind, um biologische Moleküle zu detektieren. Diese Kennzeichen sind aufgrund des hohen Sensitivitätsgrades bei der Detektion von Radioaktivität wirksam. Jedoch bestehen viele grundlegende Schwierigkeiten bei der Verwendung von Radioisotopen. Solche Probleme schließen das Erfordernis für speziell ausgebildetes Personal, allgemeine Sicherheitsbelange beim Arbeiten mit Radioaktivität, die vielen herkömmlich verwendeten Isotopen innewohnenden kurzen Halbwertszeiten und Entsorgungsprobleme aufgrund voller Deponiegelände und behördlicher Vorschriften ein. Daraus folgt, dass gegenwärtige Bemühungen dahin gehen, nicht-radioaktive Verfahren zur Detektion biologischer Verbindungen zu verwenden. Diese Verfahren bestehen häufig aus der Verwendung von Fluoreszenzmolekülen als Markierungen (z. B. Fluorescein, Ethidium, Methylcoumarin, Rhodamin und Texasrot) oder der Verwendung von Chemilumineszenz als Detektionsmethode. Jedoch bestehen gegenwärtig immer noch Probleme, wenn diese Fluoreszenz- und Chemilumineszenzmarker verwendet werden. Diese Probleme schließen Photobleichen, spektrale Auftrennung, niedrige Fluoreszenzintensität, kurze Halbwertszeiten, breite Spektrallinien und nicht-Gauss-förmige asymmetrische Emissionsspektren, die lange Schwänze aufweisen, ein.
  • Fluoreszenz ist die Emission von Licht, welche aus der Absorption von Strahlung bei einer Wellenlänge (Anregung), gefolgt von nahezu sofortiger Abstrahlung gewöhnlich bei einer anderen Wellenlänge (Emission) resultiert. Fluoreszenzfarbstoffe werden häufig als Markierungen in biologischen Systemen verwendet. Z. B. wechselwirken Verbindungen wie Ethidiumbromid, Propidiumiodid, Hoechst-Farbstoffe (z. B. Benzoxanthengelb und Bixbenzimid ((2'(4-Hydroxyphenyl]-5-(4-methyl-1-piperazinyl]-2,5'-bi-1H-benzimidazol) und (2'-(4-Ethoxyphenyl]-5-[4-methyl-1-piperazinyl]-2,5'-bi-1H-benzimidazol)), und DAPI (4,6-Diamidino-2-phenylindol) mit DNA und fluoreszieren, wobei DNA visualisiert wird. Andere biologische Komponenten können durch Fluoreszenz visualisiert werden, indem Techniken wie Immunofluoreszenz verwendet werden, bei welcher mit einem Fluoreszenz-Kennzeichen markierte Antikörper verwendet werden und auf ein spezielles zelluläres Target gerichtet werden. Z. B. können monoklonale oder polyklonale Antikörper, die mit Fluorescein oder Rhodamin markiert sind, auf ein gewünschtes zelluläres Target gerichtet werden und durch Fluoreszenzmikroskopie beobachtet werden. Bei einem alternativen Verfahren werden sekundäre Antikörper verwendet, die mit einem Fluoreszenz-Marker markiert sind, und die gegen die primären Antikörper gerichtet sind, um das Target zu visualisieren.
  • Eine weitere Anwendung von Fluoreszenz-Markern zur Detektion biologischer Verbindungen ist die Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH). Swiger et al. (1996) Environ. Mol. Mutagen. 27: 245–254; Raap (1998) Mut. Res. 400: 287– 298; Nath et al. (1997) Biotechnic. Histol. 73: 6–22. Dieses Verfahren beinhaltet das Fluoreszenzmarkieren einer Oligonukleotid-Sonde, um eine spezifische komplementäre DNA- oder RNA-Sequenz zu detektieren. Ein alternativer Ansatz ist, eine mit einem Antigen, wie Biotin oder Digoxygenin, konjugierte Oligonukleotid-Sonde und einen Fluoreszenz-markierten Antikörper, der gegen das Antigen gerichtet ist, zu verwenden, um die Hybridisierung der Sonde an ihr DNA-Target zu visualisieren. FISH ist ein wirkungsvolles Mittel zur chromosomalen Lokalisierung von Genen, deren Sequenzen teilweise oder vollständig bekannt sind. Andere Anwendungen von FISH schließen die in-situ-Lokalisierung von mRNA in Gewebeproben und die Lokalisierung . von nichtgenetischen DNA-Sequenzen, wie Telomeren, ein. Eine Vielzahl von FISH-Formaten sind im Fachgebiet bekannt. Dewald et al. (1993) Bone Marrow Transplantation 12: 149–154; Ward et al. (1993) Am. J. Hum. Genet. 52: 854-865; Jalal et al. (1998) Mayo Clin. Proc. 73: 132–137; Zahed et al. (1992) Prenat. Diagn. 12: 483–493; Kitadai et al. (1995) Clin. Cancer Res. 1: 1095-1102; Neuhaus et al. (1999) Human Pathol. 30: 81–86; Hack et al., Herausgeber, (1980) Association of Cytogenetic Technologists Cytogenetics Laboratory Manual. (Association of Cytogenetic Technologists, San Francisco, CA); Buno et al. (1998) Blood 92: 2315–2321; Patterson et al. (1993) Science 260: 976–979; Patterson et al. (1998) Cytometry 31: 265–274; Borzi et al. (1996) J. Immunol. Meth. 193: 167–176; Wachtel et al. (1998) Prenat. Diagn. 18: 445–463; Bianchi (1998) J. Perinat. Med. 26: 175–185; und Munne (1998) Mol. Hum. Reprod. 4: 863–870.
  • Fluoreszenzfarbstoffe finden auch Anwendungen in nicht-zellulären biologischen Systemen. Z. B. hat der Beginn Fluoreszenz-markierter Nukleotide die Entwicklung neuer Verfahren zur Hochdurchsatz-DNA-Sequenzierung und DNA-Fragmentanalyse erleichtert (ABI-System; Perkin-Elmer, Norwalk, CT). DNA-Sequenzierungsreaktionen können, wenn sie vorher vier Bahnen auf DNA-Sequenzgelen besetzt haben, jetzt simultan in einer Bahn analysiert werden. Kurzum werden vier Reaktionen durchgeführt, um die Positionen der vier Nukleotidbasen in einer DNA-Sequenz zu bestimmen. Die DNA-Produkte der vier Reaktionen werden unter Verwendung von Polyacrylamidgelelektrophorese nach der Größe aufgetrennt. Mit einfach radiomarkierter (32P oder 35S) DNA wird jede Reaktion in eine einzelne Bahn aufgebracht. Die aufgetrennten Produkte führen zu einem Muster von Banden, welche die Identität einer Base an jeder Nukleotidposition angeben. Dieses Muster entlang von vier Bahnen kann wie ein leichter Code gelesen werden, der der Nukleotidbasensequenz des DNA-Templats entspricht. Bei fluoreszierenden Dideoxynukleotiden können Proben, die alle vier Reaktionen enthalten, in eine einzelne Bahn aufgebracht werden. Die Auftrennung der Produkte ist möglich, da jede Probe mit einem unterschiedlichen gefärbten fluoreszierenden Dideoxynukleotid markiert ist. Z. B. kann die Adenin-Sequenzierungsreaktion mit einer grünen Fluoreszenz-Markierung markiert werden, und die anderen drei Reaktionen können mit anderen Fluoreszenzfarben markiert werden. Wenn alle vier Reaktionen in einer Bahn auf einem DNA-Sequenziergel analysiert werden, führt dies zu einer Leiter von Banden, die aus vier verschiedenen Farben besteht. Jede Fluoreszenzfarbe entspricht der Identität einer Nukleotidbase und kann leicht durch automatisierte Systeme analysiert werden.
  • Es bestehen chemische und physikalische Limitierungen bei der Verwendung organischer Fluoreszenzfarbstoffe. Eine dieser Limitierungen ist die Variation von Anregungswellenlängen von verschiedenen gefärbten Farbstoffen. Daraus folgt, dass die gleichzeitige Verwendung von zwei oder mehreren Fluoreszenz-Markierungen mit unterschiedlichen Anregungswellenlängen mehrere Anregungslichtquellen erfordert. Dieses Erfordernis führt daher zu erhöhten Kosten und erhöhter Komplexität von Verfahren, bei denen mehrere Fluoreszenzfarbstoffe verwendet werden.
  • Ein weiterer Nachteil bei der Verwendung organischer Farbstoffe ist die Verschlechterung der Fluoreszenzintensität bei längerer Anwendung von Anregungslicht. Dieses Verblassen wird Photobleichen genannt und ist abhängig von der Intensität des Anregungslichts und der Dauer der Bestrahlung. Außerdem ist die Umwandlung des Farbstoffes in eine nicht fluoreszierende Spezies irreversibel. Ferner sind die Abbauprodukte von Farbstoffen organische Verbindungen, die mit untersuchten biologischen Prozessen wechselwirken können.
  • Ein weiterer Nachteil organischer Farbstoffe ist die spektrale Überlappung, welche bei einem Farbstoff gegenüber einem anderen besteht. Dies liegt teilweise an dem relativ breiten Emissionsspektrum organischer Farbstoffe und an der Überlappung der Spektren in Nähe des Bereichs der Endenungleichheit (Tailing). Wenige niedermolekulare Farbstoffe weisen eine Kombination einer großen Stokes-Verschiebung, welche als die Auftrennung der Absorptions- und Emissionsmaxima definiert ist, und einer hohen Fluoreszenzleistung auf. Außerdem können niedermolekulare Farbstoffe für manche Anwendungen unzweckmäßig sein, da sie kein Fluoreszenzsignal bereitstellen, das hell genug ist. Das ideale Fluoreszenz-Kennzeichen sollte viele Erfordernisse erfüllen. Unter den gewünschten Qualitäten sind die folgenden: (i) hohe Fluoreszenzintensität (zur Detektion kleiner Mengen), (ii) eine Trennung von mindestens 50 nm zwischen den Absorptions- und Fluoreszenzfrequenzen, (iii) Löslichkeit in Wasser, (iv) Fähigkeit, leicht an andere Moleküle gebunden zu werden, (v) Stabilität gegenüber aggressiven Bedingungen und hohen Temperaturen, (vi) eine symmetrische, nahezu Gauss-förmige Emissionskurve, um eine leichte Auflösung mehrerer Farben zu erhalten und (vii) Kompatibilität mit einer automatisierten Analyse. Gegenwärtig erfüllt keines der konventionellen Fluoreszenz-Kennzeichen alle diese Anforderungen. Ferner machen die Unterschiede in den chemischen Eigenschaften von standardgemäßen organischen Fluoreszenzfarbstoffen Mehrfach-Parallelassays praktisch undurchführbar, da bei jedem Farbstoff, der bei der Vielfalt von Anwendungen von Fluoreszenz-Kennzeichen verwendet wird, verschiedene chemische Reaktionen beteiligt sein können.
  • Somit besteht im Fachgebiet ein Bedürfnis für ein Fluoreszenz-Kennzeichen, das die oben beschriebenen Kriterien zur Verwendung in biologischen Assaysystemen erfüllt.
  • Dabbousi et al (J. Phys. Chem., 1997, 101, 9463–9475) diskutieren (CdSe)ZnS-Kern-Schale-Quantenpunkte (quantum dots) und ihre Synthese und Charakterisierung hinsichtlich der Größe und Lumineszenz. Kern-Schalen-Kompositquantenpunkte werden unter Verwendung einer Reihe von optischen und strukturellen Techniken synthetisiert und charakterisiert.
  • WO 98/04740 offenbart die Verwendung von Nanopartikeln, z. B. Halbleiter-Nanokristallen, die an Oligonukleotide gebunden sind, in Verfahren zur Detektion von Nukleinsäuren.
  • Zusammenfassung der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung stellt eine Zusammensetzung bereit, umfassend ein erstes Element eines Bindepaares; und einen Kern aus einem Halbleiter-Nanokristall, der mit dem ersten Element verbunden ist, wobei der Nanokristall eine äußere Schicht besitzt, die einen Liganden umfasst, der einen ersten Teil mit wenigstens einer Bindungsgruppe für die Verbindung zum Nanokristall hat, und einen zweiten Teil, der wenigstens eine hydrophile Gruppe umfasst.
  • In einem weiteren Aspekt stellt die vorliegende Erfindung auch eine Zusammensetzung bereit, umfassend einen wasserlöslichen Halbleiter-Nanokristall, der einen Kern mit einem Halbleiter-Material und eine kernumhüllende Schale mit einem Halbleiter-Material umfasst; einen Liganden mit einem ersten Teil, der wenigstens eine Verknüpfungsgruppe umfasst, und mit einem zweiten Teil, der eine hydrophile Gruppe umfasst, wobei die Verknüpfungsgruppe mit dem Nanokristall verknüpft ist; und ein erstes Element eines Bindepaares, das mit dem zweiten Teil des Verknüpfungsmittels verbunden ist.
  • Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf Zusammensetzungen, die Informationen über einen biologischen Zustand oder ein biologisches Ereignis bereitstellen können. Somit stellt die vorliegende Erfindung in einem weiteren Aspekt ein Verfahren zur Detektion eines Ziel(Target)analyten in einer Probe bereit, die den Analyten enthält oder die ihn vermutlich enthält, worin der Analyt ein zweites Element des Bindepaares ist, umfassend die Schritte des Bereitstellens der Zusammensetzung nach Anspruch 5 oder 6; des Vermischens der Probe mit der Zusammensetzung; und des Detektierens der Bindung des ersten Elementes des Bindepaares und des zweiten Elementes des Bindepaares mittels Kontrolle der spektralen Emission der Probe, wobei die Intensität und/oder Wellenlänge der Emission mit der Anwesenheit und/oder Menge des Analyten in der Probe in Zusammenhang gebracht wird.
  • In noch einem weiteren Aspekt stellt die Erfindung ein Multiplex-Verfahren zur Detektion von Analyten in einer Probe bereit, die einen oder mehrere der Analyten enthält oder diese vermutlich enthält, worin die Analyten zweite Elemente von Bindepaaren sind, umfassend das Bereitstellen einer Menge von zwei oder mehreren der Zusammensetzungen nach Anspruch 5 oder 6, wobei jedes der Elemente aus dieser Menge dadurch gekennzeichnet ist, dass der Nanokristall ein Emissionsspektrum besitzt, das von den anderen Elementen dieser Menge verschieden ist, und das erste Bindeelement des Bindepaares ein entsprechendes zweites Bindeelement besitzt, das von anderen zweiten Bindeelementen in der Probe verschieden ist; Vermischung der Menge von Zusammensetzungen mit der Probe; und zeitgleiche Detektion der Bindung der ersten Elemente der Bindepaare und der zweiten Elemente der Bindepaare mittels Kontrolle der spektralen Emissionen der Probe, wobei die Intensität und/oder Wellenlänge der Emissionen mit der Anwesenheit und/oder Menge von Analyten in der Probe in Zusammenhang gebracht wird.
  • Die Zusammensetzung kann beispielsweise das Vorhandensein oder die Mengen biologischer Einheiten, z. B. eines biologischen Zielanalyten; die Struktur, Zusammensetzung und Konformation einer biologischen Einheit, z. B. eines biologischen Moleküls oder eines Teils oder Fragments davon; die Lokalisierung einer biologischen Einheit, z. B. eines biologischen Zielanalyten in einer Umgebung; Wechselwirkungen biologischer Einheiten, z. B. eines biologischen Moleküls oder eines Teils oder Fragments davon; Veränderungen in der Struktur biologischer Verbindungen, z. B. eines biologischen Moleküls oder eines Teils oder Fragments davon; und/oder Änderungen in biologischen Prozessen detektieren.
  • Die Zusammensetzung ist aus einem Fluoreszenz-Halbleiter-Nanokristall zusammengesetzt (auch bekannt als Quantum DotTM-Partikel), welcher eine charakteristische spektrale Emission besitzt, welche durch Auswahl der Partikelgröße, Partikelverteilung und Zusammensetzung des Halbleiter-Nanokristalls auf eine gewünschte Energie abgestimmt werden kann. Die Zusammensetzung umfasst ferner eine Verbindung, die mit dem Halbleiter-Nanokristall verbunden ist, welche eine Affinität für ein biologisches Target besitzt. Die Zusammensetzung wechselwirkt oder ist verbunden mit einem biologischen Target, aufgrund der Affinität der Verbindung zu dem Target. Der Ort und die Art der Verbindung kann durch Kontrolle der Emission des Halbleiter-Nanokristalls detektiert werden.
  • Bei der Durchführung wird die Zusammensetzung in eine Umgebung eingeführt, die ein biologisches Target enthält, und die Zusammensetzung verbindet sich mit dem Target. Der Zusammensetzung : Target-Komplex kann spektroskopisch gesichtet werden oder auf andere Weise detektiert werden, z. B. durch Bestrahlung des Komplexes mit einer Anregungslichtquelle. Der Halbleiter-Nanokristall emittiert ein charakteristisches Emissionsspektrum, welches beobachtet und z. B. spektroskopisch gemessen werden kann.
  • Als Vorteil der Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung weisen die Emissionsspektren einer Population von Halbleiter-Nanokristallen Linienbreiten auf, die so eng sind wie 25 bis 30 nm, abhängig von der Größenverteilungsheterogenität der Probenpopulation, und die Kurvenformen sind symmetrisch, Gauss-förmig oder nahezu Gauss-förmig, ohne einen Endenungleichheitsbereich. Die Kombination der Abstimmbarkeit, der engen Linienbreiten und der symmetrischen Emissionsspektren ohne Endenungleichheitsbereiche stellen eine hohe Auflösung von verschieden großen Nanokristallen, z. B. von Populationen monodisperser Halbleiter-Nanokristalle mit mehreren verschiedenen Größenverteilungen, innerhalb eines Systems bereit, und versetzt Forscher in die Lage, simultan eine Vielfalt biologischer Einheiten, z. B. mit Nanokristallen markierte Zielanalyten, zu untersuchen.
  • Hinzu kommt, dass der Bereich der Anregungswellenlängen der Nanokristalle breit ist und energetisch höher sein kann als die Emissionswellenlänge aller vefügbaren Halbleiter-Nanokristalle. Folglich erlaubt dies die simultane Anregung aller Populationen von Halbleiter-Nanokristallen in einem System mit verschiedenen Emissionsspektren mit einer einzelnen Lichtquelle, gewöhnlich im ultravioletten oder im blauen Bereich des Spektrums. Halbleiter-Nanokristalle sind auch robuster als konventionelle organische Fluoreszenzfarbstoffe und sind widerstandsfähiger gegenüber Photobleichen als organische Farbstoffe. Die Widerstandsfähigkeit des Nanokristalls behebt auch das Problem der Kontamination mit Abbauprodukten der organischen Farbstoffe in dem untersuchten System. Daher stellt die vorliegende Erfindung einzigartig wertvolle Markierungen zur Detektion biologischer Moleküle und für die Wechselwirkungen, die diese eingehen, bereit.
  • Die Zusammensetzung umfasst Halbleiter-Nanokristalle, die mit Molekülen verbunden sind, welche physikalisch mit biologischen Verbindungen wechselwirken können. Moleküle schließen solche ein, die an Proteine, Nukleinsäuren, Zellen, subzelluläre Organellen und andere biologische Moleküle binden können. Die in der Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung verwendete Verbindung weist vorzugsweise eine Affinität für ein biologisches Target auf. In manchen bevorzugten Ausführungsformen besitzt die Verbindung eine spezifische Affinität für ein biologisches Target. Die Affinität kann auf beliebigen der Verbindung innewohnenden Eigenschaften, van-der-Waals-Anziehung, hydrophilen Anziehungen, ionischer, kovalenter, elektrostatischer oder magnetischer Anziehung der Verbindung gegenüber einem biologischen Target beruhen. Wie es hierin verwendet wird, bedeutet "biologisches Target" jede Einheit, Verbindung, zelluläre oder subzelluläre Komponente, die mit biologischen Funktionen im Zusammenhang steht. Das biologische Target schließt ohne Einschränkung Proteine, Nukleinsäuren, Zellen, subzelluläre Organellen und andere biologische Einheiten ein.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst die Zusammensetzung mit Proteinen verbundene Halbleiter-Nanokristalle. Die Proteine können Antikörper sein, die gegen spezifische Antigene, z. B. biologische Antigene, wie andere Proteine, Nukleinsäuren, subzelluläre Organellen und kleine Moleküle, die an biologische Verbindungen konjugiert sind, gerichtet sind. Die Proteine können auch Proteine sein, die spezifisch oder nicht-spezifisch mit anderen biologischen Verbindungen Wechselwirken.
  • In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform umfasst die Zusammensetzung Halbleiter-Nanokristalle, die mit Nukleinsäuren verbunden sind. Die Nukleinsäuren können Oligonukleotide oder Deoxyribooligonukleotide sein, die mit Nukleinsäurepolymeren in vivo oder in vitro hybridisieren. Die Nukleinsäuren können auch Nukleotide, Deoxynukleotide, Dideoxynukleotide oder Derivate und Kombinationen davon sein, die für die Synthese von DNA oder RNA verwendet werden.
  • In noch einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird ein Verfahren zur Detektion biologischer Verbindungen unter Verwendung von Halbleiter-Nanokristallen bereitgestellt.
  • Ein Aspekt der Erfindung schließt die Verwendung eines Halbleiter-Nanokristalls als Markierung für mindestens ein Element eines biologischen Bindepaares ein, wobei der Nanokristall eine äußere Schicht besitzt, die einen Liganden umfasst, der einen ersten Teil mit wenigstens einer Verknüpfungsgruppe für die Verbindung zum Nanokristall aufweist, und der einen zweiten Teil mit wenigstens einer hydrophilen Gruppe umfasst. Die Markierung kann durch kovalente, nicht-kovalente, hydrophobe, hydrophile, elektrostatische oder magnetische Verbindung oder durch Koordination durch einen Metallkomplex erreicht werden. Vorzugsweise ist der Halbleiter-Nanokristall wasserlöslich.
  • Ein weiterer Aspekt der Erfindung schließt die Verwendung eines wasserlöslichen Halbleiter-Nanokristalls zur Kennzeichnung eines biologischen Moleküls oder biologischen Ereignisses ein.
  • Noch ein weiterer Aspekt der Erfindung schließt ein Verfahren zur Markierung eines biologischen Moleküls oder Ereignisses mit einem fluoreszierenden Kennzeichen ein, wobei das Kennzeichen ein Halbleiter-Nanokristall ist, bei dem das Fluoreszenz-Emissionsspektrum von der Größe des Nanokristalls abhängig ist, wobei der Nanokristall eine äußere Schicht aufweist, die einen Liganden umfasst, der einen ersten Teil mit wenigstens einer Verknüpfungsgruppe für die Verbindung zum Nanokristall besitzt, und der einen zweiten Teil mit wenigstens einer hydrophilen Gruppe umfasst.
  • Noch ein weiterer Aspekt der Erfindung schließt ein Verfahren zur Kontrolle des Fluoreszenz-Emissionsspektrums einer in einem biologischen System verwendeten fluoreszierenden Einheit bereit, das die Auswahl eines Halbleiter-Nanokristalls mit dem gewünschten Fluoreszenz-Emissionsspektrum und Verwendung des ausgewählten Nanokristalls als fluoreszierende Einheit umfasst, wobei der Nanokristall eine äußere Schicht mit einem Liganden besitzt, der einen ersten Teil mit wenigstens einer Verknüpfungsgruppe für die Verbindung zum Nanokristall umfasst, und der einen zweiten Teil mit wenigstens einer hydrophilen Gruppe umfasst.
  • Ein weiterer Aspekt der Erfindung schließt die Verwendung eines wasserlöslichen Halbleiter-Nanokristalls als Fluoreszenz-Kennzeichen in der Immunochemie, gegebenenfalls in der Immunozytochemie oder in einem Immunoassay, in einer DNA-Sequenzanalyse, als Fluoreszenz-Kennzeichen beim Fluoreszenzresonanzenergietransfer zur Bewertung der Nähe von zwei oder mehreren biologischen Komponenten zueinander, als Fluoreszenz-Kennzeichen in der Durchflusszytometrie oder in einem Fluoreszenz-aktivierten Zellsortierer, als fluoreszierendes Kennzeichen bei einer diagnostischen in vitro-Methode oder als fluoreszierendes Kennzeichen in der biologischen Bildgebung ein.
  • Eine bevorzugte Ausführungsform der Erfindung schließt die zuvor erwähnten Verwendungen und Verfahren ein, in welchen zwei oder mehr Halbleiter-Nanokristalle, vorzugsweise bis zu 20 Nanokristalle verschiedener Größe, verwendet werden.
  • Diese und andere Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung werden dem Fachmann durch die Offenbarung hierin leicht verdeutlicht werden.
  • Kurze Beschreibung der Zeichnung
  • 1 ist eine bildhafte Darstellung des mit einer Präparation von Halbleiter-Nanokristall einer Größe markierten Immunoassays.
  • 2 ist eine bildhafte Darstellung des Mehrfachfarben-Halbleiter-Nanokristallmarkierten, parallelen Immunoassays.
  • 3 ist eine bildhafte Darstellung der Verwendung zweier verschiedenfarbiger Nanokristalle oder von Nanokristallen einer Farbe und eines organischen Farbstoffes, um die Nähe von Verbindungen zu detektieren. In diesem Beispiel werden zwei Oligonukleotid-Sonden mit DNA-Sequenzen in enger Nähe hybridisiert und durch Fluoreszenzresonanzenergietransfer detektiert.
  • 4 ist eine bildhafte Darstellung der Bildung von wasserlöslichen Halbleiter-Nanokristallen durch Kappenaustausch.
  • Die 5 und 6 veranschaulichen eine Skizze der Reaktion zwischen Biotin und Hexandithiol, um das Biotin-Hexandithiol (BHDT)-Derivat zu bilden.
  • 7 ist eine Skizze der Reaktion zwischen Biotin und einem Diamin zur Bildung eines Biotin-Amin-Derivats.
  • 8 skizziert die Bildung des Biotin-Thiol-Nanokristall-Komplexes für einen wasserlöslichen Nanokristall.
  • 9 skizziert die Bildung des Biotin-Amin-Nanokristall-Komplexes, wobei das Amin an die Außenschicht des Nanokristalls adsorbiert ist.
  • 10 skizziert die Bildung des Biotin-Amin-Nanokristall-Komplexes, wobei das Amin an die Carbonsäuregruppe der Wasser-solubilisierenden Schicht konjugiert ist.
  • Detaillierte Beschreibung der Erfindung
  • Bevor die vorliegende Erfindung im Detail offenbart und beschrieben wird, soll klargestellt sein, dass diese Erfindung nicht auf spezifische Assay-Formate, Materialien oder Reagenzien beschränkt ist, welche natürlich variieren können. Ferner soll klargestellt sein, dass die hierin verwendete Terminologie nur zum Zwecke der Beschreibung spezieller Ausführungsformen verwendet wird.
  • Es ist zu bemerken, dass die Singularformen "ein", "eine" und "der/die/das", wie sie in der Beschreibung und den anhängigen Ansprüchen verwendet werden, Pluralformen einschließen, sofern der Kontext nicht eindeutig anderes angibt. Somit schließt die Bezeichnung "ein Nanokristall" mehr als ein Nanokristall ein, die Angabe "ein Zielanalyt" schließt mehr als einen solchen Analyten ein und dgl.
  • In dieser Beschreibung und in den Ansprüchen, die folgen, wird auf eine Anzahl von Ausdrücken Bezug genommen, die wie folgt definiert sein sollen: "Quantum dotTM Partikel" sind ein Halbleiter-Nanokristall mit größenabhängigen optischen und elektronischen Eigenschaften. Insbesondere variiert die Bandlückenenergie eines Halbleiter-Nanokristalls mit dem Durchmesser des Kristalls.
  • "Halbleiter-Nanokristall" schließt z. B. anorganische Kristallite zwischen ungefähr 1 nm und ungefähr 1000 nm Durchmesser, vorzugsweise zwischen ungefähr 2 nm und ungefähr 50 nm, mehr bevorzugt ungefähr 5 nm bis ungefähr 20 nm (wie ungefähr 6, 7, 8, 9, 10, 1 1, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 oder 20 nm) ein, der einen "Kern" aus einem oder mehreren ersten Halbleiter-Materialien einschließt, und welcher durch eine "Schale" eines zweiten Halbleitermaterials umgeben sein kann. Ein Halbleiter-Nanokristall-Kern, der von einer Halbleiter-Schale umgeben ist, wird als ein "Kern/Schale"-Halbleiter-Nanokristall bezeichnet. Das umgebende "Schalen"-Material wird vorzugsweise eine Bandlücke aufweisen, die größer ist als die Bandlücke des Kernmaterials, und kann so ausgewählt werden, dass es einen Atomabstand aufweist, der nahe dem des "Kern"-Substrats ist. Der Kern und/oder die Schale können ein Halbleiter-Material sein, einschließlich, aber nicht beschränkt auf eines der Gruppe II–VI (ZnS, ZnSe, ZnTe, CdS, CdSe, CdTe, HgS, HgSe, HgTe, MgTe und dgl.) und III-V (GaN, GaP, GaAs, GaSb, InN, InP, InAs, InSb, AIAs, AIP, AISb, AIS und dgl.) und IV (Ge, Si, Pb und dgl.)-Materialien und einer Legierung davon oder einer Mischung davon.
  • Ein Halbleiter-Nanokristall ist gegebenenfalls durch eine "Schicht" eines organischen Kappungsmittels umgeben. Das organische Kappungsmittel kann jede Anzahl an Materialien sein, weist aber eine Affinität für die Halbleiter-Nanokristall-Oberfläche auf. Im Allgemeinen kann das Kappungsmittel ein isoliertes organisches Molekül, ein Polymer (oder ein Monomer für eine Polymerisationsreaktion), ein anorganischer Komplex und eine erweiterte Kristallstruktur sein. Die Schicht wird verwendet, um die Löslichkeit, z. B. die Fähigkeit, einen beschichteten Halbleiter-Nanokristall homogen in ein ausgewähltes Lösungsmittel zu dispergieren, die Funktionalität, die Bindeeigenschaften oder dgl. zu vermitteln. Außerdem kann die Schicht verwendet werden, um die optischen Eigenschaften des Halbleiter-Nanokristalls abzustimmen.
  • Wie es hierin verwendet wird, bezeichnet der Ausdruck "Bindepaar" erste und zweite Moleküle, die spezifisch aneinander binden. Eine "spezifische Bindung" des ersten Elements des Bindepaars an das zweite Element des Bindepaars in einer Probe zeigt sich durch die größere Affinität und Spezifität der Bindung des ersten Elements an das zweite Element oder umgekehrt als an andere Komponenten in der Probe. Die Bindung zwischen den Elementen des Bindepaars ist typischerweise nicht kovalent. Die Ausdrücke "Affinitätsmolekül" und "Zielanalyt" werden hierin verwendet, um erste bzw. zweite Elemente eines Bindepaars zu bezeichnen.
  • Exemplarische Bindepaare schließen jede Hapten- oder Antigen-Verbindung in Kombination mit einem entsprechenden Antikörper oder einem Bindeteil oder Fragment davon (z. B. Digoxigenin und Anti-Digoxigenin; Maus-Immunoglobulin und Ziegen-Anti-Maus-Immunoglobulin) und nicht-immunologische Bindepaare (z. B. Biotin-Avidin, Biotin-Streptavidin, Hormon [z. B. Thyroxin und Cortisol]-Hormon-Bindeprotein, Rezeptor-Rezeptoragonist oder -antagonist (z. B: Acetylcholinrezeptor-Acetylcholin oder ein Analogon davon), IgG-Protein A, Lectin-Kohlenhydrat, Enzym-Enzymcofaktor, Enzym-Enzyminhibitor und komplementäre Polynukleotidpaare, die Nukleinsäureduplexe bilden können) und dgl. ein.
  • "Halbleiter-Nanokristall-Konjugat" oder "Nanokristall-Konjugat" schließt z. B. ein Halbleiter-Nanokristall ein, der durch die Beschichtung an ein Element eines "Bindepaars" geknüpft ist, welches selektiv an eine detektierbare Substanz, die in einer Probe, z. B. einer biologischen Probe, wie sie hierin definiert ist, vorhanden ist, binden wird. Das an den Halbleiter-Nanokristall gebundene erste Element des Bindepaars kann jedes Molekül oder jeden Teil eines beliebigen Moleküls umfassen, welches/r in der Lage ist, an einen Halbleiter-Nanokristall gebunden zu werden, und das/der, wenn es/er so gebunden ist, in der Lage ist, spezifisch das zweite Element des Bindepaars zu erkennen.
  • "Monodisperse Partikel" schließen eine Population von Partikeln ein, wobei mindestens 60% der Partikel in der Population innerhalb eines spezifizierten Partikelgrößenbereichs liegen. Eine Population von monodispergierten Partikeln weichen weniger als 10% rms (Standardabweichung) im Durchmesser und vorzugsweise weniger als 5% rms ab.
  • "Quantenausbeute" ist definiert als das Verhältnis von emittierten Photonen zu den absorbierten.
  • Die Ausdrücke "Polynukleotid", "Oligonukleotid", "Nukleinsäure" und "Nukleinsäuremolekül", wie sie hierin verwendet werden, schließen eine polymere Form von Nukleotiden beliebiger Länge, entweder Ribonukleotide oder Deoxyribonukleotide ein. Dieser Ausdruck bezieht sich nur auf die Primärstruktur des Moleküls. Somit schließt der Ausdruck dreifach-, doppel- und einzelsträngige DNA sowie dreifach-, doppel- und einzelsträngige RNA ein. Er schließt auch Modifikationen, wie durch Methylierung und/oder durch Kappen, und unmodifizierte Formen des Polynukleotids ein. Insbesondere schließen die Ausdrücke "Polynukleotid", "Oligonukleotid", "Nukleinsäure" und "Nukleinsäuremolekül" Polydeoxyribonukleotide (enthaltend 2-Deoxy-D-ribose), Polyribonukleotide (enthaltend D-Ribose), jede beliebige andere Art von Polynukleotid, welches ein N- oder C-Glycosid einer Purin- oder Pyrimidinbase ist, und andere Polymere enthaltend Nicht-Nukleotid-Gerüste, z. B. Polyamid- (z. B. Peptidnukleinsäuren (PNA)) und Polymorpholino- (kommerziell erhältlich von Anti-Virals, Inc., Corvallis, Oregon, als Neugene) Polymere und andere synthetische sequenzspezifische Nukleinsäurepolymere ein, vorausgesetzt, dass die Polymere Nukleobasen in einer Konfiguration enthalten, welche eine Basenpaarung und Basenstapelung, wie es in DNA und RNA gefunden wird, erlauben. Es besteht zwischen den Ausdrücken "Polynukleotid", "Oligonukleotid", "Nukleinsäure" und "Nukleinsäuremolekül" keine beabsichtigte Unterscheidung in der Länge, und diese Ausdrücke werden austauschbar verwendet. Diese Ausdrücke beziehen sich nur auf die Primärstruktur des Moleküls. Somit schließen diese Ausdrücke z. B. 3'-Deoxy-2',5'-DNA, Oligodeoxyribonukleotid-N3'P5'-phosphoramidate, 2'-O-Alkyl-substituierte RNA, doppel- und einzelsträngige DNA sowie doppel- und einzelsträngige RNA, DNA : RNA-Hybride und Hybride zwischen PNA und DNA oder RNA ein, und schließen auch bekannte Typen von Modifikationen, z. B. Markierungen, die im Fachgebiet bekannt sind, Methylierung, "Caps", Substitution eines oder mehrerer natürlich vorkommender Nukleotide mit einem Analogon, Internukleotidmodifikationen, wie z. B. solche mit ungeladenen Bindungen (z. B. Methylphosphonate, Phosphotriester, Phosphoramidate, Carbamate etc.), mit negativ geladenen Verbindungen (z. B. Phosphorothioate, Phosphorodithioate etc.) und mit positiv geladenen Verbindungen (z. B. Aminoalkylphosphoramidate, Aminoalkylphosphotriester), solche, die anhängende Einheiten enthalten, wie z. B. Proteine (einschließlich Nukleasen, Toxinen, Antikörpern, Signalpeptiden, Poly-L-Lysin etc.), solche mit Einlagerungen (z. B. Acridin, Psoralen etc.), solche, die Chelatoren enthalten (z. B. Metalle, radioaktive Metalle, Bor, oxidative Metalle etc.), solche, die Alkylierer enthalten, solche mit modifizierten Verbindungen (z. B. alpha-anomere Nukleinsäuren etc.) sowie unmodifizierte Formen des Polynukleotids oder Oligonukleotids ein. Insbesondere ist DNA Deoxyribonukleinsäure.
  • Die Ausdrücke "Polynukleotid-Analyt" und "Nukleinsäure-Analyt" werden austauschbar verwendet und schließen ein einzel- oder doppelsträngiges Nukleinsäuremolekül ein, das eine Zielnukleotidsequenz enthält. Die Analyt-Nukleinsäuren können aus einer Vielzahl von Quellen abgeleitet sein, z. B. biologischen Flüssigkeiten oder Feststoffen, Nahrungsmitteln, Umweltmaterialien etc., und können für die Hybridisierungsanalyse mit einer Vielzahl an Mitteln, z. B. Proteinase K/SDS, chaotropen Salzen oder dgl. präpariert werden.
  • Wie es hierin verwendet ist, schließt der Ausdruck "Zielnukleinsäureregion" oder "Zielnukleotidsequenz" eine Sonden-hybridisierende Region, die innerhalb des Zielmoleküls enthalten ist, ein. Der Ausdruck "Zielnukleinsäuresequenz" schließt eine Sequenz ein, mit welcher eine Sonde unter gewünschten Bedingungen ein stabiles Hybrid bilden wird.
  • Wie es hierin verwendet wird, schließt der Ausdruck "Nukleinsäure-Sonde" die Bezeichnung einer Struktur, die aus einem Polynukleotid, wie oben definiert, zusammengesetzt ist, ein, welche eine Nukleinsäuresequenz enthält, die komplementär zu einer in dem Zielnukleinsäureanalyten vorhandenen Nukleinsäuresequenz ist. Die Polynukleotidregionen von Sonden können aus DNA und/oder RNA und/oder synthetischen Nukleotidanaloga zusammengesetzt sein.
  • Bevorzugt ist, dass die Hybridisierungssequenzen nicht perfekt komplementär sein müssen, um stabile Hybride bereitzustellen. In vielen Fällen werden sich stabile Hybride bilden, bei denen weniger als ungefähr 10% der Basen fehlangepasst sind, wobei Schleifen aus vier oder mehr Nukleotiden vernachlässigt werden. Demgemäß bezieht sich der Ausdruck "komplementär", wie er hierin verwendet wird, auf ein Oligonukleotid, das mit seinem "Komplement" unter Assaybedingungen ein stabiles Duplex bildet, im Allgemeinen da, wo eine Homologie von ungefähr 90% oder mehr besteht.
  • "Polypeptid" und "Protein" werden hierin austauschbar verwendet und schließen eine Molekülkette von durch Peptidbindungen verbundenen Aminosäuren ein. Die Ausdrücke beziehen sich nicht auf eine spezifische Länge des Produkts. Somit sind "Peptide", "Oligopeptide" und "Proteine" in der Definition von Polypeptid eingeschlossen. Die Ausdrücke schließen posttranslationale Modifikationen des Polypeptids, z. B. Glykosylierungen, Acetylierungen, Phosphorylierungen und dgl., ein. Außerdem sind Proteinfragmente, Analoga, mutierte oder variierte Proteine, Fusionsproteine und dgl. innerhalb der Bedeutung von Polypeptid eingeschlossen.
  • Der Ausdruck "Alkyl", wie er hierin verwendet wird, schließt die Bezeichnung einer verzweigten oder unverzweigten gesättigten Kohlenwasserstoffgruppe mit 1 bis 100 Kohlenstoffatomen, wie Methyl, Ethyl, n-Piopyl, Isopropyl, n-Butyl, Isobutyl, t-Butyl, Octyl, Decyl, Tetradecyl, Hexadecyl, Eicosyl, Tetracosyl und dgl., sowie Cycloalkylgruppen, wie Cyclopentyl, Cyclohexyl und dgl. ein. Der Ausdruck "niederes Alkyl" schließt eine Alkylgruppe mit 1 bis 20 Kohlenstoffatomen, vorzugsweise 6 bis 20 Kohlenstoffatomen ein.
  • Der Ausdruck "Alkylen", wie er hierin verwendet wird, schließt die Bezeichnung einer difunktionellen gesättigten verzweigten oder unverzweigten Kohlenwasserstoffkette, enthaltend von 1 bis 100 Kohlenstoffatome, ein und schließt z. B. Methylen (-CH2-), Ethylen (-CH2-CH2-), Propylen (-CH2-CH2-CH2-), 2-Methylpropylen (-CH2-CH(CH3)-CH2-), Hexylen (-(CH2)6-) und dgl. ein. "Niederes Alkylen" schließt eine Alkylengruppe mit 1 bis 20, mehr bevorzugt 6 bis 20 Kohlenstoffatomen ein.
  • Der Ausdruck "Alkenyl", wie er hierin verwendet wird, schließt die Bezeichnung einer verzweigten oder unverzweigten Kohlenwasserstoffgruppe mit 2 bis 100 Kohlenstoffatomen ein, die mindestens eine Kohlenstoff-Kohlenstoff-Doppelbindung enthält, wie Ethenyl, n-Propenyl, Isopropenyl, n-Butenyl, Isobutenyl, t-Butenyl, Octenyl, Decenyl, Tetradecenyl, Hexadecenyl, Eicosenyl, Tetracosenyl und dgl. Der Ausdruck "niederes Alkenyl" schließt eine Alkenylgruppe mit 2 bis 20 Kohlenstoffatomen, vorzugsweise 6 bis 20 Kohlenstoffatomen ein, die eine -C=C-Bindung enthält.
  • Der Ausdruck "Alkenylen" schließt die Bezeichnung einer difunktionellen verzweigten oder unverzweigten Kohlenwasserstoffkette, die von 2 bis 100 Kohlenstoffatome und mindestens eine Kohlenstoff-Kohlenstoff-Doppelbindung enthält, ein. "Niederes Alkenylen" schließt ein Alkenylengruppe mit 2 bis 20, mehr bevorzugt 6 bis 20 Kohlenstoffatomen ein, die eine Kohlenstoff-Kohlenstoff-Doppelbindung enthält.
  • Der Ausdruck "Alkinyl", wie er hierin verwendet wird, schließt die Bezeichnung einer verzweigten oder unverzweigten Kohlenwasserstoffgruppe mit 2 bis 100 Kohlenstoffatomen ein, die mindestens eine -C≡C-Bindung, wie Ethinyl, n-Propinyl, Isopropinyl, n-Butinyl, Isobutinyl, t-Butinyl, Octinyl, Decinyl und dgl., ein. Hierin bevorzugte Alkinylgruppen enthalten 6 bis 20 Kohlenstoffatome. Der Ausdruck "niederes Alkinyl" schließt eine Alkinylgruppe mit 2 bis 10 Kohlenstoffatomen und einer -C≡C-Bindung ein.
  • Der Ausdruck "Alkinylen" schließt die Bezeichnung einer difunktionellen verzweigten oder unverzweigten Kohlenwasserstoffkette, die 2 bis 100 Kohlenstoffatome und mindestens eine Kohlenstoff-Kohlenstoff-Dreifachbindung enthält, ein. "Niederes Alkinylen" schließt eine Alkinylengruppe mit 2 bis 10 Kokhlenstoffatomen, enthaltend eine -C≡C-Bindung, ein.
  • Gegebenenfalls kann eine Alkyl-, Alkylen-, Alkenyl-, Alkenylen-, Alkinyl- oder Alkinyl-Kette 1, bis 6 Verknüpfungen, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus -O-, -S- und -NR-, worin R Wasserstoff, niederes Alkyl oder niederes Alkenyl darstellt, enthalten.
  • Die Ausdrücke "Heteroalkyl", "Heteroalkylen", "Heteroalkenyl", "Heteroalkenylen", "Heteroalkinyl" und "Heteroalkinylen" schließen die Bezeichnungen von Alkyl-, Alkylen-, Alkenyl-, Alkenylen-, Alkinyl- bzw. Alkinylengruppen ein, in welchen ein oder mehrere der Kohlenstoffatome durch z. B. Stickstoff, Schwefel oder Sauerstoffatome ausgetauscht sind.
  • "Alkoxy" schließt die Bezeichnung der Gruppe -O-R ein, wobei R ein Alkylrest, wie oben definiert, ist. Beispiele eines Alkoxyrestes schließen Methoxy, Ethoxy, Isopropoxy und dgl. ein, sind aber nicht darauf beschränkt.
  • "Alkylamino" schließt die Bezeichnung eines -NHR-Restes ein, worin R ein Alkylrest, wie oben definiert, ist. Beispiele für Alkylaminoreste schließen Methylamino, (1-Ethylethyl)amino und dgl. ein, sind aber nicht darauf beschränkt.
  • "Alkylthio" schließt die Bezeichnung eines -SR-Restes ein, worin R ein Alkylrest, wie oben definiert, ist. Beispiele für Alkylthioreste schließen Methylthio, Butylthio und dgl. ein, sind aber nicht darauf beschränkt.
  • "Dialkylamino" schließt die Bezeichnung eines -NR'R''-Restes ein, worin R' und R'' jeweils unabhängig Alkylreste, wie oben definiert, sind. Beispiele für Dialkylaminoreste schließen Dimethylamino, Methylethylamino, Diethylamino, Di(1-methylethyl)amino und dgl. ein, sind aber nicht darauf beschränkt.
  • "Hydroxyalkyl" schließt die Bezeichnung eines Alkylrestes, wie oben definiert, ein, substituiert mit einer oder mehreren Hydroxygruppen. Beispiele für Hydroxyalkylreste schließen Hydroxymethyl, 2-Hydroxyethyl, 2-Hydroxypropyl, 3-Hydroxypropyl, 2-Hydroxybutyl, 3-Hydroxybutyl, 4-Hydroxybutyl, 2,3-Dihydroxypropyl, 1-(Hydroxymethyl)-2-hydroxyethyl, 2,3-Dihydroxybutyl, 3,4-Dihydroxybutyl und 2-(Hydroxymethyl)-3-hydroxypropyl und dgl. ein, sind aber nicht darauf beschränkt.
  • Der Ausdruck "Acyl", wie er hierin verwendet wird, schließt die Bezeichnung einer Alkylgruppe, die durch eine -(CO)-Verknüpfung gebunden ist, ein. Der Ausdruck "niederes Acyl" schließt eine Acylgruppe ein, in welcher die Alkylgruppe, die durch die Carbonylverknüpfung gebunden ist, eine niedere Alkylgruppe ist.
  • Der Ausdruck "Zuckereinheit" schließt die Bezeichnung für Monosaccharide, Disaccharide, Polysaccharide und dgl. ein. Der Ausdruck "Zucker" schließt solche Einheiten ein, die modifiziert wurden, z.B., worin eine oder mehrere der Hydroxylgruppen durch Halogen, Alkoxyeinheiten, aliphatische Gruppen ersetzt sind oder als Ether, Amine oder dgl. funktionalisiert sind. Beispiele für modifizierte Zucker schließen solche ein, die eine niedere Alkoxygruppe anstatt einer Hydroxyleinheit enthalten, d. h. α- oder ß-Glycoside, wie Methyl-α-Dglucopyranosid, Methyl-ß-D-glucopyranosid und dgl.; solche, die mit Aminen umgesetzt wurden, d. h. N-Glycosylamine oder N-Glycoside, wie N-(α-D- Glucopyranosyl)methylamin; solche, die acylierte Hydroxylgruppen enthalten, typischerweise von 1 bis 5 niedere Acylgruppen; solche, die eine oder mehrere Carbonsäuregruppen enthalten, z. B. D-Gluconsäure oder dgl.; und solche, die freie Aminogruppen enthalten, wie D-Glucosamin, D-Galactosamin, N-Acetyl-Dglucosamin oder dgl. Beispiele für bevorzugte Saccharide sind Glucose, Galactose, Fructose, Ribose, Mannose, Arabinose, Xylose. Beispiele für Polysaccharide sind Dextran und Cellulose.
  • "Aryl" schließt die Bezeichnung eines monovalenten aromatischen Kohlenwasserstoffrestes ein, der aus einem oder mehreren annelierten Ringen besteht, in welchen mindestens ein Ring aromatischer Natur ist, welcher gegebenenfalls mit einem oder mehreren der folgenden Substituenten substituiert sein kann: Hydroxy, Cyano, Alkyl, Alkoxy, Thioalkyl, Halo, Haloalkyl, Hydroxyalkyl, Nitro, Amino, Alkylamino und Dialkylamino, es sei denn, es ist anders angegeben.
  • "Heteroaryl" schließt die Bezeichnung eines monovalenten aromatischen carbocyclischen Restes ein, mit einem oder mehreren Ringen, die ein, zwei oder drei Heteroatome innerhalb des Rings eingebaut haben (ausgewählt aus Stickstoff, Sauerstoff oder Schwefel), der gegebenenfalls mit einem oder mehreren der folgenden Substituenten substituiert sein kann: Hydroxy, Cyano, Alkyl, Alkoxy, Thioalkyl, Halo, Haloalkyl, Hydroxyalkyl, Nitro, Amino und Alkylamino und Dialkylamino, es sei denn, es ist anders angegeben.
  • "Cycloalkyl" schließt die Bezeichnung eines monovalenten gesättigten carbocyclischen Restes ein, der aus einem oder mehreren Ringen besteht, die gegebenenfalls mit einem oder mehreren der folgenden Substituenten substituiert sein können: Hydroxy, Cyano, Alkyl, Alkoxy, Thioalkyl, Halo, Haloalkyl, Hydroxyalkyl, Nitro, Amino, Alkylamino und Dialkylamino, es sei denn, es ist anders angegeben.
  • "Cycloalkenyl" schließt die Bezeichnung eines monovalenten ungesättigten carbocyclischen Restes ein, der aus einem oder mehreren Ringen besteht und eine oder mehrere Kohlenstoff-Kohlenstoff-Doppelbindungen enthält, die gegebenenfalls mit einem oder mehreren der folgenden Substituenten substituiert sein können: Hydroxy, Cyano, Alkyl, Alkoxy, Thioalkyl, Halo, Haloalkyl, Hydroxyalkyl, Nitro, Amino, Alkylamino und Dialkylamino, es sei denn, es ist anders angegeben.
  • "Cycloalkinyl" schließt die Bezeichnung eines monovalenten ungesättigten carbocyclischen Restes ein, der aus einem oder mehreren Ringen besteht und eine oder mehrere Kohlenstoff-Kohlenstoff-Dreifachbindungen enthält, die gegebenenfalls mit einem oder mehreren der folgenden Substituenten substituiert sein können: Hydroxy, Cyano, Alkyl, Alkoxy, Thioalkyl, Halo, Haloalkyl, Hydroxyalkyl, Nitro, Amino, Alkylamino und Dialkylamino, es sei denn, es ist anders angegeben.
  • "Heterocyclisch" schließt die Bezeichnung eines monovalenten gesättigten carbocyclischen Restes ein, der aus einem oder mehreren Ringen besteht, die ein, zwei oder drei Heteroatome eingebaut haben (ausgewählt aus Stickstoff, Sauerstoff oder Schwefel), welche gegebenenfalls mit einem oder mehreren der folgenden Substituenten substituiert sein können: Hydroxy, Cyano, Alkyl, Alkoxy, Thioalkyl, Halo, Haloalkyl, Hydroxyalkyl, Nitro, Amino, Alkylamino und Dialkylamino, es sei denn, es ist anders angegeben.
  • Der Ausdruck "Kronenether" schließt die Bezeichnung eines gesättigten unverzweigten heterocyclischen Moleküls, mono-, di-, trivalenten oder höheren (z. B. 4, 5, 6, 7 oder 8) multivalenten Restes ein. Kronenether werden typischerweise als "x-Krone-y" oder "xKy" bezeichnet, worin x die Gesamtanzahl an Atomen in dem Molekül und y die Anzahl an Heteroatomen in dem Molekül bezeichnen. Somit ist z. B. 12-Krone-4 ein Kronenether mit 12 Atomen, wovon 4 Heteroatome sind und 18C6 ist ein Kronenether mit 18 Atomen, wovon 6 Heteroatome sind. Bevorzugte Heteroatome sind 0, S und N, und in jedem beliebigen speziellen Kronenether können die Heteroatome gleich oder verschieden sein. Ein "Heterokronenether" ist ein Kronenether, in welchem die Heteroatome verschieden sind. Bevorzugte Kronenether sind sechs- bis dreißiggliedrige Kronen- oder Heterokronenether, mehr bevorzugt sind 8C4, 9C3, 12C4, 15C5, 18C6 und 20C8, und noch mehr bevorzugt sind 12C4 und 18C6.
  • Wie es hierin verwendet wird, schließt "biologische Probe" die Bezeichnung einer Gewebe- oder Fluidprobe, isoliert von einem Individuum, ein, z. B. Plasma, Serum, Spinalfluid, Samen, Lymphfluid, externe Bereiche der Haut, des Atmungs-, Intestinal- und Urogenitaltrakts, Tränen, Speichel, Milch, Blutzellen, Tumoren, Organen eingeschlossen, aber nicht beschränkt darauf, und schließt auch Proben von in vitro-Zellkulturbestandteilen (einschließlich konditionierter Medien, die durch das Wachstum von Zellen in Zellkulturmedium erhalten werden, mutmaßlich viral infizierten Zellen, rekombinanten Zellen und Zellkomponenten, aber nicht beschränkt darauf) ein, ist aber nicht darauf beschränkt.
  • Ein "kleines Molekül" ist so definiert, dass eine organische Verbindung, die entweder im Labor synthetisiert wurde oder in der Natur gefunden wurde, eingeschlossen ist. Typischerweise ist ein kleines Molekül dadurch gekennzeichnet, dass es mehrere Kohlenstoff-Kohlenstoff-Bindungen und ein Molekulargewicht von weniger als 1500 Gramm/Mol enthält.
  • Ein "biologischer Zustand" ist so definiert, dass dies das quantitative und qualitative Vorhandensein einer biologischen Einheit; die Struktur, Zusammensetzung und Konformation einer biologischen Einheit; und die Lokalisierung einer biologischen Einheit in einer Umgebung einschließt.
  • Ein "biologisches Ereignis" ist so definiert, dass es eine Wechselwirkung von biologischen Einheiten, einen biologischen Prozess, eine Veränderung in den Strukturen einer biologischen Verbindung oder eine Veränderung in einem biologischen Prozess einschließt.
  • Der Ausdruck "Multiplexing" wird hierin verwendet, um die Durchführung eines Assays oder eines anderen analytischen Verfahrens einzuschließen, in welchem mehrere Analyten oder biologische Zustände simultan unter Verwendung von mehr als einem detektierbaren Kennzeichen detektiert werden können, wobei jedes davon eine unterschiedliche Wellenlänge emittiert und vorzugsweise wobei jedes davon an eines einer Vielzahl von ersten Elementen von Bindepaaren gebunden ist, wobei jedes der ersten Elemente in der Lage ist, ein unterschiedliches entsprechendes zweites Element des Bindepaares zu binden. Ein Multiplex-Verfahren unter Verwendung von Halbleiter-Nanokristallen mit unterschiedlichen Emissionsspektren kann verwendet werden, um simultan im Bereich von 2 und 10.000 Analyten, biologische Verbindungen oder biologische Zustände, vorzugsweise im Bereich von 10 und 100, mehr bevorzugt im Bereich von bis 10 bis 20, z. B. 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 oder 20 Analyten oder biologische Zustände zu detektieren. Multiplexing schließt auch Assays oder Verfahren ein, in welchen die Kombination von mehr als einem Halbleiter-Nanokristall mit unterschiedlichen Emissionsspektren verwendet werden kann, um einen einzelnen Analyten zu detektieren.
  • "Optional" oder "gegebenenfalls" bedeutet, dass das darauffolgend beschriebene Ereignis oder der Umstand auftreten kann oder nicht, und dass die Beschreibung Fälle, bei denen das genannte Ereignis oder der genannte Umstand auftritt und Fälle, wo dies nicht der Fall ist, einschließt. Z. B. bedeutet der Satzteil "gegebenenfalls gewaschen", dass ein Waschschritt auftreten kann oder nicht, und dass die Beschreibung des Verfahrens sowohl die Durchführung mit als auch ohne Waschschritt einschließt, der Satzteil "gegebenenfalls substituiertes Alkylen" bedeutet, dass eine Alkyleneinheit substituiert sein kann oder nicht, und dass die Beschreibung sowohl unsubstituiertes Alkylen als auch Alkylen, das substituiert ist, einschließt und dgl.
  • Die vorliegende Erfindung stellt eine Zusammensetzung bereit, umfassend Halbleiter-Nanokristalle (die in dieser Anmeldung auch als Halbleiter-Nanokristalle bezeichnet werden) als Fluoreszenz-Markierungen, die mit einem Reagenz oder Molekül verbunden sind, wobei die Zusammensetzung das Vorhandensein oder die Menge eines biologischen Moleküls detektieren kann, biologische Wechselwirkungen detektieren kann, biologische Prozesse detektieren kann, Veränderungen in biologischen Prozessen detektieren kann oder Veränderungen in der Struktur einer biologischen Verbindung detektieren kann.
  • Halbleiter-Nanokristalle zeigen Quantenbegrenzungseffekte (Quantum-Confinement-Effekte) in ihren Lumineszenzeigenschaften. Wenn Halbleiter-Nanokristalle mit einer primären Energiequelle bestrahlt werden, tritt eine sekundäre Emission von Energie einer Frequenz auf, die der Bandlücke des in dem Halbleiter-Nanokristall verwendeten Halbleiter-Materials entspricht. In Quanten-begrenzten Partikeln ist die Bandlücke eine Funktion der Größe des Nanokristalls.
  • Ferner stellen Halbleiter-Nanokristalle oder Nanopartikel eine neue Klasse von Lumineszenzmaterial dar, das zwischen molekularen und Masse(bulk)formen einer Materie liegt. Eine Population solcher Nanokristalle kann simultan unter Verwendung einer einzelnen Wellenlänge von Licht angeregt werden und die detektierbare Lumineszenz kann bearbeitet werden, um bei einer Vielzahl von Wellenlängen aufzutreten. Die Lumineszenzemission steht mit der Größe, der Größenverteilung und der Zusammensetzung der einzelnen Halbleiter-Nanokristalle der Population im Zusammenhang. Ferner können die Nanopartikel hochlumineszent gemacht werden, indem ein anorganisches Schalenmaterial verwendet wird, welches die Oberfläche des Halbleiter-Nanokristall-Kerns effizient einkapselt. Ein "Kern/Schale"-Halbleiter-Nanokristall weist eine hohe Quanteneffizienz und eine beträchtlich verbesserte photochemische Stabilität auf. Die Oberfläche des Kern/Schale-Halbleiter-Nanokristalls kann modifiziert werden, um Nanokristalle herzustellen, die durch Techniken, die z. B. von Bruchez et al. (1998) Science 281: 2013–2016, Chan et al. (1998) Science 281: 2016-2018 und in Bruchez "Luminescent Semiconductor Nanocrystals: Intermittency Properties and Use as Fluorescent Biological Labels" (1998) Doctoral dissertation, University of California, Berkeley, beschrieben sind, an eine Vielfalt von biologischen Molekülen gekoppelt werden können.
  • Viele Halbleiter, die aus Elementen der Gruppe II–VI, III–V und VI des Periodensystems aufgebaut sind, wurden als Partikel mit Quantengröße hergestellt, zeigen Quantenbegrenzungseffekte in ihren physikalischen Eigenschaften und können in der Zusammensetzung der Erfindung verwendet werden. Beispielhafte Materialien, die geeignet sind zur Verwendung als Halbleiter-Nanokristall-Kerne schließen CdS, CdSe, CdTe, ZnS, ZnSe, ZnTe, MgTe, GaAs, GaP, GaSb, GaN, HgS, HgSe, HgTe, InAs, InP, InSb, InN, AIAs, AIP, AISb, AIS, PbS, PbSe, Ge, Si, eine Legierung davon oder eine Mischung davon, einschließlich ternärer und quaternärer Mischungen, ein, sind aber nicht darauf beschränkt. Gegebenenfalls wird der Kern mit einem Schalenmaterial umfassend ZnO, ZnS, ZnSe, ZnTe, CdO, CdS, CdSe, CdTe, MgS, MgSe, GaAs, GaN, GaP, GaAs, GaSb, HgO, HgS, HgSe, HgTe, InAs, InN, InP, InSb, AIAs, AIN, AIP, AISb, eine Legierung davon oder eine Mischung davon, überbeschichtet. Vorzugsweise ist die Bandlückenenergie der Überbeschichtung größer als die des Kerns. Die Halbleiter-Nanokristalle können ferner eine Überbeschichtungsschicht eines Halbleiters enthalten, welcher eine größere Bandlücke aufweist, um einen Kern/Schale-Halbleiter-Nanokristall zu bilden.
  • Die Halbleiter-Nanokristalle sind durch ihre einheitliche Nanometergröße gekennzeichnet. Mit "Nanometer"-Größe ist weniger als ungefähr 150 Angstöm (A) und vorzugsweise im Bereich von 12–150 Å gemeint. Die Nanokristalle sind auch innerhalb des oben gegebenen breiten Nanometerbereiches im Wesentlichen monodispers. Mit "monodispers" ist hierin ein kolloidales System gemeint, in welchem die suspendierten Partikel eine im Wesentlichen identische Größe und Form aufweisen. Für den Zweck der vorliegenden Erfindung bedeuten monodisperse Partikel, dass mindestens 60% der Partikel innerhalb eines spezifizierten Partikelgrößenbereichs fallen. Monodisperse Partikel weichen weniger als 10% rms und vorzugsweise weniger als 5% rms im Durchmesser ab.
  • Die enge Größenverteilung der Halbleiter-Nanokristalle erlaubt die Möglichkeit einer Lichtemission in engen spektralen Breiten. Monodispense Halbleiter-Nanokristalle wurden detailliert in Murray et al. (J. Am. Chem. Soc., 115: 8706 (1993)); in der Doktorarbeit von Christopher Murray, "Synthesis and Characterization of II–VI Quantum Dots and Their Assembly into 3-D Quantum Dot Superlattices", Massachusetts Instistute of Technology, September 1995, beschrieben.
  • Die Fluoreszenz von Halbleiter-Nanokristallen resultiert aus der Gebundenheit von elektronischen Anregungen an die physikalischen Dimensionen der Nanokristalle. Im Gegensatz zu dem Masse(bulk)-Halbleiter-Material, von welchem diese Nanokristalle synthetisiert werden, haben diese Halbleiter-Nanokristalle diskrete optische Übergänge, die mit der Größe abstimmbar sind. Die gegenwärtige Technologie erlaubt eine gute Kontrolle ihrer Größen (zwischen 12 bis 150 Å, Standardabweichungen ungefähr 5%), und somit erlauben sie den Aufbau von Halbleiter-Nanokristallen, die Licht bei einer gewünschten Wellenlänge im UVsichtbaren-IR-Spektrum mit einer Quantenausbeute im Bereich von 30–50% bei Raumtemperatur in organischen Lösungsmitteln und 10–30% bei Raumtemperatur in Wasser emittieren.
  • Techniken zur Herstellung von Halbleiter-Nanokristallen, die in einer engen spektralen Verteilung einer ausgewählten Farbe fluoreszieren, sind unten und in Dabbousi et al. (1997) J. Phys. Chem. B 101: 9463–9475 weiter diskutiert. Jedoch sind auch andere Techniken zur Herstellung von Halbleiter-Nanokristallen von dem Umfang der Erfindung umfasst.
  • Z. B. können CdSe-Nanokristalle hergestellt werden, die für das menschliche Auge sichtbares Licht emittieren können, sodass diese Nanokristalle in Kombination mit einer Quelle höherer Energie als die höchste Energie der gewünschten Farbe angepasst werden können, um sichtbares Licht einer beliebigen spektralen Verteilung zu erzeugen. Es können auch Halbleiter-Nanokristalle hergestellt werden, die in Ultraviolett- und Infrarot- Spektralbereichen emittieren. Beispiele für Ultraviolett- und Infrarot-emittierende Nanokristalle sind z. B. CdS, ZnS und ZnSe und InAs, CdTe bzw. MgTe.
  • Die Farbe des durch eine spezielle Größe, Größenverteilung und/oder Zusammensetzung eines Halbleiter-Nanokristalls erzeugten Lichts kann leicht durch Verfahren, die dem Fachmann offensichtlich sein werden, berechnet und gemessen werden. Als Beispiel dieser Messtechniken sind die Bandlücken für Nanokristalle von CdSe mit Größen im Bereich von 12 Å bis 115 Å in Murray et al. (1993), J. Am. Chem. Soc. 1 15: 8706 angegeben. Diese Techniken erlauben die leichte Berechnung einer geeigneten Größe, Größenverteilung und/oder Zusammensetzung von Halbleiter-Nanokristallen und die Wahl einer Anregungslichtquelle, um einen Nanokristall zu erzeugen, der in der Lage ist, Licht in jeder beliebigen gewünschten Wellenlänge zu emittieren.
  • Eine Anzahl von Verfahren zur Herstellung von Halbleiter-Nanokristallen ist im Fachgebiet bekannt. Jedes beliebige Verfahren zur Herstellung von Nanokristallen, die mit einem gewünschten Spektrum fluoreszieren, kann bei der Durchführung der Erfindung verwendet werden. Vorzugsweise können die in Dabbousi et aI., supra, beschriebenen Verfahren verwendet werden, um Halbleiter-Nanokristalle zu erzeugen, die in Zusammensetzungen und Verfahren, wie sie hierin offenbart und beansprucht werden, nützlich sind.
  • Dabbousi et aI., supra, offenbaren auch ein Verfahren, das zur Überbeschichtung von Nanokristallen, die aus CdS, CdSe oder CdTe zusammengesetzt sind, mit ZnS, ZnSe oder Mischungen davon verwendet werden kann. Vor dem Überbeschichten wird ein Nanokristall-Kern durch ein bei Murray et aI., supra, beschriebenes Verfahren hergestellt, welches zu einer im Wesentlichen monodispersen Größenverteilung führt. Dann kann eine Überbeschichtung einer kontrollierten Dicke aufgebracht werden, indem die Dauer und Temperatur des Wachstums der Beschichtungsschicht, wie in Dabbousi et al. beschrieben, kontrolliert wird. Die Monodispersität des Kern-Nanokristalls führt zu einer monochromatischen Emission. Der überbeschichtete Kern-Nanokristall weist eine verbesserte Quanteneffizienz auf und emittiert mehr Licht als ein bloßer Kern-Nanokristall.
  • Das oben beschriebene Verfahren kann verwendet werden, um separate Populationen von Halbleiter-Nanokristallen herzustellen, wobei jede Population ein unterschiedliches charakteristisches Photolumineszenzspektrum zeigt. Jede einer Vielzahl an Populationen von Halbleiter-Nanokristallen kann an verschiedene erste Elemente von Bindepaaren konjugiert werden, um in einem Multiplex-Assay oder einem analytischen Verfahren Verwendung zu finden, in welchem jedes einer Vielzahl von entsprechenden zweiten Elementen der Bindepaare simultan detektiert werden kann.
  • Die vorliegende Erfindung stellt eine Zusammensetzung bereit, umfassend Halbleiter-Nanokristalle, die mit einem Reagenz oder Molekül oder Affinitätsmolekül so verbunden sind, dass die Zusammensetzung das Vorhandensein und/oder die Mengen an biologischen Verbindungen detektieren kann, Wechselwirkungen in biologischen Systemen detektiert werden können, biologische Prozesse detektiert werden können, Veränderungen in biologischen Prozessen detektiert werden können oder Veränderungen in der Struktur der biologischen Verbindungen detektiert werden können. Ohne Begrenzung der vorliegenden Erfindung schließen diese Reagenzien oder das Molekül oder Nanokristall-Konjugat oder Affinitätsmolekül jedes beliebige Molekül oder jeden beliebigen molekularen Komplex, das/der mit einem biologischen Target in Wechselwirkung treten kann, Moleküle oder molekulare Komplexe oder Nanokristall-Konjugate, die mit biologischen Targets zur Detektion biologischer Prozesse in Verbindung treten können oder Reaktionen und Moleküle oder molekulare Komplexe oder Konjugate ein, die biologische Moleküle oder Prozesse verändern können. Vorzugsweise treten die Moleküle oder molekularen Komplexe oder Konjugate physikalisch mit biologischen Verbindungen in Wechselwirkung. Vorzugsweise sind die Wechselwirkungen spezifisch. Die Wechselwirkungen können kovalent, nicht-kovalent, hydrophob, hydrophil, elektrostatisch, van-der-Waals-Wechselwirkungen oder magnetisch sein, sind aber nicht darauf beschränkt. Vorzugsweise sind diese Moleküle kleine Moleküle, Proteine oder Nukleinsäuren oder Kombinationen davon.
  • Halbleiter-Nanokristalle können, wenn sie durch Licht angeregt werden, fluoreszieren. Gegenwärtig werden bei der Detektion biologischer Verbindungen durch Photolumineszenz fluoreszierende organische Farbstoffe und chemilumineszierende Verbindungen verwendet. Die Verwendung von Nanokristallen als Fluoreszenz-Marker in biologischen Systemen stellt Vorteile gegenüber bestehenden fluoreszierenden organischen Farbstoffen bereit. Viele dieser Vorteile beziehen sich auf die spektralen Eigenschaften von Nanokristallen. Z. B. wird durch die Fähigkeit der Kontrolle der Größe der Nanokristalle die Möglichkeit geschaffen, Nanokristalle mit einer Fluoreszenzemission bei jeder beliebigen Wellenlänge im UV-sichtbaren-IR-Bereich aufzubauen. Daher sind die Farben (Emission) von Nanokristallen auf jede beliebige gewünschte spektrale Wellenlänge regelbar. Ferner weisen die Emissionsspektren von monodispersen Nanokristallen enge Linienbreiten wie 25–30 nm auf. Die Linienbreiten sind abhängig von der Größenheterogenität, d. h. Monodispersität, der Population von Nanokristallen in jeder Präparation. Bei einzelnen Halbleiter-Nanokristallen oder monodispersen Populationen von Halbleiter-Nanokristallen wurde beobachtet, dass sie eine Halbwertsbreite ("FWHM" = Full Width at Half Max) von 12–15 nm aufweisen. Außerdem können Nanokristalle mit größeren FWHM im Bereich von 40–60 nm leicht hergestellt werden und die gleichen physikalischen Charakteristiken aufweisen, wie Emissionswellenlängen-Einsteilbarkeit und Anregung im UV-blauen, vorzugsweise im blauen Bereich des Spektrums, wie Nanokristalle mit engeren FWHM.
  • Die engen Spektrallinienbreiten und nahezu Gauss-förmige symmetrische Kurvenformen ohne Endenungleichheitsregion, die bei den Emissionsspektren von Nanokristallen beobachtet werden, kombiniert mit der Regelbarkeit der Emissionswellenlängen von Nanokristallen, erlauben eine hohe spektrale Auflösung in einem System mit mehreren Nanokristallen. Theoretisch können bis zu 10–20 oder mehr Nanokristalle unterschiedlicher Größe oder unterschiedlicher Größenverteilungen von monodispersen Populationen von Nanokristallen aus verschiedenen Präparationen von Nanokristallen, wobei jede Probe ein unterschiedliches Emissionsspektrum aufweist, simultan in einem System verwendet werden, d. h. Multiplexing, wobei die überlappenden Spektren leicht unter Verwendung von im Fachgebiet wohlbekannten Techniken, z. B. optisch mit oder ohne die Verwendung von Auflösungssoftware, aufgelöst werden.
  • Ein weiterer Vorteil der Verwendung von Nanokristallen als Fluoreszenz-Marker gegenüber bestehenden organischen Fluoreszenzfarbstoffen ist, dass nur eine einzelne Lichtquelle (gewöhnlich im UV-blauen und vorzugsweise im blauen Bereich des Spektrums) erforderlich ist, um alle Nanokristalle in einem System anzuregen. Die Lichtquelle ist eine, die Licht mit einem Energiespektrum abstrahlen kann, das Licht höherer Energien einschließt als die Lichtenergie, die durch die Nanokristalle emittiert wird, z. B. herkömmlicherweise, aber nicht unbedingt im UV-blauen und vorzugsweise im blauen Bereich des Spektrums. Im Gegensatz dazu weisen organische Farbstoffe mit verschiedenen Emissionswellenlängen gewöhnlich verschiedene Anregungswellenlängen auf. Somit werden mehrere Lichtquellen oder eine einzelne Lichtquelle mit anpassbaren Lichtfiltern für Systeme benötigt, bei welchen organische Farbstoffe mit verschiedenen Anregungswellenlängen verwendet werden. Da im Allgemeinen alle Nanokristalle der vorliegenden Erfindung durch Licht im UVblauen Bereich des Spektrums (vorzugsweise im blauen sichtbaren Bereich) angeregt werden, kann eine einzelne Lichtquelle verwendet werden. Dies minimiert die technische Komplexität, die erforderlich ist, um eine Anregungslichtquelle bereitzustellen. Außerdem wird die Quellenstrahlung durch die Verwendung von blauem Licht Fluoreszenzmessungen, die im sichtbaren oder Infrarotbereich des Lichtspektrums aufgenommen werden, nicht stören und wird auch nicht die biologischen Moleküle beschädigen. Z. B. kann UV-Licht eine Dimerisierung in DNA-Molekülen verursachen.
  • Ein weiterer Vorteil der Verwendung von Nanokristallen gegenüber organischen fluoreszierenden Farbstoffen, die gegenwärtig erhältlich sind, ist die robuste Natur der Nanokristalle aufgrund ihrer kristallinen anorganischen Struktur und ihrer schützenden Überbeschichtungsschicht. Diese Nanokristalle sind resistenter gegenüber Photobleichen, als es bei organischen Farbstoffen beobachtet wird. Da in der Anmeldung beschriebene Nanokristalle aus ähnlichen Materialien zusammengesetzt sind und durch die gleichen organischen Kappungsgruppen geschützt sind, erlaubt die chemische Einheitlichkeit von Nanokristallen auch die Extrapolation eines Protokolls, das entwickelt wurde, um eine spezielle Größe von Nanokristallen an ein Molekül zu binden, auf Nanokristalle aller Größen innerhalb der Klasse von Nanokristallen. Eine solche Einheitlichkeit sollte wertvoll sein, um konventionelle Assaytechniken so auszuweiten, dass sie parallele Detektionsschemata einschließen. Daher stellt die vorliegende Erfindung eine Serie von Fluoreszenzsonden bereit, die das Spektrum vom UV- bis zum IR-Bereich umfassen, und die auch im Wesentlichen identische chemische Eigenschaften besitzen können.
  • Da die Detektion von biologischen Verbindungen am meisten bevorzugt in wässrigen Medien durchgeführt wird, werden bei einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung Halbleiter-Nanokristalle verwendet, die in Wasser solubilisiert sind. Halbleiter-Nanokristalle, die von Bawendi et al. (J. Am. Chem. Soc., 115: 8706, 1993) beschrieben sind, sind nur in organischen Lösungsmitteln, wie Hexan oder Pyridin, löslich oder dispergierbar. Es ist bevorzugt, dass die Nanokristalle wasserlöslich sind und mit Molekülen verbunden werden, die in der Lage sind, mit biologischen Verbindungen in Wechselwirkung zu treten. Jedoch können alternative Verfahren zur Bindung von Molekülen an Nanokristalle verwendet werden, um ähnliche Ergebnisse zu erhalten.
  • An der äußeren Fläche der Überbeschichtungsschicht findet sich eine Wassersolubilisierende Schicht. Die äußere Schicht schließt eine Wasser-solubilisierende Verbindung mit mindestens einer Verknüpfungsgruppe zur Anbindung der Verbindung an die Überbeschichtungsschicht und mindestens eine hydrophile Gruppe ein, gegebenenfalls ist die hydrophile Gruppe durch eine hydrophobe Region oder einen Spacer so von der Bindungsgruppe getrennt, dass es ausreicht, um einen Elektronenladungstransfer über die hydrophobe Region hinweg zu verhindern. Die Affinität für die Nanokristalloberfläche fördert eine Koordination der Verknüpfungseinheit an die äußere Fläche des Halbleiter-Nanokristalls und die Einheit mit einer Affinität für das wässrige Medium stabilisiert die Halbleiter-Nanokristall-Suspension.
  • Ohne Beschränkung des Umfangs der vorliegenden Erfindung kann die Wassersolubilisierende Verbindung die Strukturformel (I) aufweisen (I) H2X((CH2)nCO2H)y
    und Salze davon sein, wobei X S, N, P oder 0 = P ist; n ≥ 6; und z und y so ausgewählt sind, dass die Valenzanforderungen von X erfüllt werden. Ein Beispiel für eine Verbindung zur Verwendung in der Erfindung kann die Strukturformel (II)
    Figure 00340001

    aufweisen, worin X, X' und X'' gleich oder verschieden sind und ausgewählt sind aus der Gruppe aus S, N, P oder 0 = P; Y eine hydrophile Einheit ist; und Z eine hydrophobe Region mit einem Grundgerüst von wenigstens sechs Atomen ist. X, X' und X'' können andere Substituenten einschließen, damit die Valenzanforderungen erfüllt sind, wie z. B. Amine, Thiole, Phosphine und Phosphinoxide, substituiert durch Wasserstoff oder andere organische Einheiten. Außerdem sind die X, X' und X'' verbrückenden Atome so ausgewählt, dass sie bei Koordination an die Halbleiterfläche einen 5-gliedrigen bis 8-gliedrigen Ring bilden. Die Verbrückungsatome sind typischerweise Kohlenstoff, können aber andere Elemente sein, wie Sauerstoff, Stickstoff und Schwefel. Y kann jede beliebige geladene oder polare Gruppe sein, wie Carboxylate, Sulfonate, Phosphate, Polyethylenglykol und andere Polyole und ein Ammoniumsalz, z. B. Carboxylat (-CO2 –), Sulfonat (SO3 –), Hydroxid (-OH), Alkoxide, Ammoniumsalze (-NH4 +) und Phosphat (-PO4 2–) und Phosphonat (-PO3 2–) und dgl. Z ist typischerweise eine Alkylgruppe oder Alkenylgruppe, kann aber auch andere Atome einschließen, wie Kohlenstoff und Stickstoff. Z kann ferner modifiziert sein, wie es hierin beschrieben ist, um anziehende Wechselwirkungen mit benachbarten Liganden bereitzustellen.
  • In einer insbesondere bevorzugten Ausführungsform stellt die hydrophile Einheit X auch eine reaktive Gruppe bereit, die eine Reaktion eingehen kann, um die Verbindung an den Halbleiter-Nanokristall zu kuppeln. Z. B. kann die hydrophile Einheit, wenn sie eine -COOH- oder eine -COO-Gruppe ist, verwendet werden, um eine Vielfalt an biologischen Verbindungen zu kuppeln, um einen entsprechenden Ester, ein Amid oder Anhydrid zu bilden. Als Beispiel sei nur genannt, dass Carbonsäure-terminierte Nanokristalle mit einer Aminosäure reagieren können, um eine Amidverknüpfung zu bilden. Das Amid kann als Verbindung dienen, die eine Affinität für ein biologisches Target besitzt.
  • In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform umfasst der überbeschichtete Nanokristall eine Wasser-solubilisierende Außenschicht, die ein Molekül mit der Strukturformel (IV) umfasst: (IV) (R1)a-R2-[(R3)b(R4)c]d
    worin:
    R1 ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Heteroalkyl, Heteroalkenyl, Heteroalkinyl, -OR, -SR, -NHR, -NR'R'', -N(O)HR, -N(O)R'R'', -PHR, -PR'R'', -P(NR'R'')NR'R'', -P(O)R'R'', -P(O)(NR'R'')NR'R'', -P(O)(OR')OR'', -P(O)OR, -P(O)NR'R'', -P(S)(OR')OR'' und -P(S)OR, worin R, R' und R" unabhängig ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus H, einem verzweigten oder unverzweigten Alkyl, einem verzweigten oder unverzweigten Alkenyl, einem verzweigten oder unverzweigten Alkinyl, einem verzweigten oder unverzweigten Heteroalkyl, einem verzweigten oder unverzweigten Heteroalkenyl und einem verzweigten oder unverzweigten Heteroalkinyl, mit der Maßgabe, dass, wenn a größer als 1 ist, die R1-Gruppen gleich oder verschieden sein können oder verknüpft sein können, um ein/en sechs-, sieben-, acht-, neun- oder zehngliedriges/n Cycloalkyl, Cycloalkenyl, Heterocyclus, Aryl, Heteroaryl oder einen sechs- bis dreißig-gliedrigen Kronenether oder Heterokronenether zu bilden;
  • R2 ausgewählt ist aus einer Bindung (d. h. R2 ist nicht vorhanden), einem verzweigten oder unverzweigten Alkylen, einem verzweigten oder unverzweigten Alkenylen, einem verzweigten oder unverzweigten Heteroalkylen, einem verzweigten oder unverzweigten Heteroalkenylen, Cycloalkyl, Cycloalkenyl, Cycloalkinyl, Heterocyclus, Aryl und Heteroaryl;
  • R3 ausgewählt ist aus einem verzweigten oder unverzweigten Alkylen, einem verzweigten oder unverzweigten Alkenylen, einem verzweigten oder unverzweigten Heteroalkylen, einem verzweigten oder unverzweigten Heteroalkenylen, Cycloalkyl, Cycloalkenyl, Cycloalkinyl, Heterocyclus, Aryl und Heteroaryl;
  • R4 ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoff, einem Carboxylat, einem Thiocarboxylat, einem Amid, einem Imid, einem Hydrazin, einem Sulfonat, einem Sulfoxid, einem Sulfon, einem Sulfit, einem Phosphat, einem Phosphonat, einem Phosphonium, einem Alkohol, einem Thiol, einem Amin, einem Ammonium, einem Alkylammonium, einem Nitrat, einer Zuckereinheit und einem fünf-, sechs-, sieben-, acht-, neun- oder zehn-gliedrigen Cycloalkenyl, Cycloalkinyl, Heterocyclus, Aryl oder Heteroaryl;
    a 1, 2 3 oder 4 ist;
    b 0, 1, 2 oder 3 ist;
    c 0, 1, 2 oder 3 ist; und
    d 0, 1, 2 oder 3 ist, worin , wenn d 2 oder 3 ist, die R3-Gruppen gleich oder verschieden sein können oder miteinander verbunden sein können, um ein/en fünf-, sechs-, sieben-, acht-, neun- oder zehn-gliedriges/n Cycloalkyl, Cycloalkenyl, Heterocyclus, Aryl oder Heteroaryl zu bilden. Obwohl man nicht auf die Theorie festgelegt werden will, glauben die Erfinder, dass eine Koordination des Moleküls mit der Strukturformel (IV) an den überbeschichteten Nanokristall zwischen Oberflächeneinheiten auf dem Nanokristall und der R1-Einheit des Moleküls auftritt.
  • Vorzugsweise ist R1 ein Thiol (z. B. -SH), ein Phosphin, ein Phosphinoxid oder ein Amin (z. B. -NH2, NHR, NRR).
  • Vorzugsweise enthält R2 zwischen 6 und 20 Atome. Mehr bevorzugt ist R2 ein lineares Alkylen, Alkenylen, Alkinylen, Heteroalkylen, Heteroalkenylen oder Heteroalkinylen, enthaltend 6, 7, 8, 9, 10, 1 1, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 oder 20 Atome, oder ein Cycloalkyl oder Heterocyclus enthaltend 5 oder 6 Atome.
  • Vorzugsweise enthält R3, wenn b 1, 2 oder 3 ist, zwischen 6 und 20 Atome. Mehr bevorzugt ist R3 ein lineares Alkylen, Alkenylen, Alkinylen, Heteroalkylen, Heteroalkenylen oder Heteroalkinylen, enthaltend 6, 7, 8, 9, 10, 1 1, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 oder 20 Atome oder ein Cycloalkyl oder Heterocyclus enthaltend 5 oder 6 Atome.
  • Vorzugsweise ist R4 ein Carboxylat (-COO–), ein Phosphonat (-PO3 –), ein Sulfonat (-SO3 –) oder ein Ammonium (-N+HRR').
  • Die Wasser-solubilisierende Außenschicht kann eine homogene Population von Molekülen mit einer Strukturformel (I), (II), (III) oder (IV), eine gemischte Population von Molekülen jeder beliebigen einzelnen Strukturformel, d. h. eine gemischte Population von Molekülen, welche alle eine Strukturformel (I), (II), (III) oder (IV) aufweisen, oder eine gemischte Population von Molekülen, die eine Kombination aus zwei oder mehreren der Strukturformeln (I), (II), (III) und (IV) aufweisen, umfassen. In anderen bevorzugten Ausführungsformen wird ein wasserlöslicher Nanokristall bereitgestellt, in welchem die äußere Schicht teilweise durch einen Liganden substituiert wurde, welcher am Ende eine reaktive Gruppe enthält. Die reaktive Gruppe ist nicht nach ihren hydrophilen Eigenschaften, sondern nach ihrer Fähigkeit ausgewählt, mit der Verbindung der Erfindung zu kuppeln. Beispielhafte reaktive Gruppen schließen Carbonsäuregruppen, Thiolgruppen und Amingruppen ein. Der Ligand kann die Wasser-solubilisierende Verbindung umfassen, umfassend Strukturformel (I) (I) HzX((CH2)nCO2H)y worin X, z, n und y wie oben definiert sind, Strukturformel (II) oder (III)
    Figure 00380001

    worin Y, Z, X, X' und X'' wie oben definiert sind oder Strukturformel (IV) (IV) (R1)a-R2-[(R3)bR4)c]d
    worin R1, R2, R3, R4, a, b, c und d wie oben definiert sind.
  • In noch einer weiteren Ausführungsform der Erfindung wird ein Wasser-löslicher Nanokristall bereitgestellt, in welchem die äußere Schicht teilweise durch einen Liganden substituiert ist, der die Verbindung der Erfindung umfasst. Nur als Beispiel kann die Verbindung eine Stammgruppe einschließen, die als Ende ein Thiol, Amin oder Phosphin oder Phosphinoxid besitzt, welche direkt mit der Halbleiter-Nanokristall-Oberfläche in Wechselwirkung treten kann.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung eine Zusammensetzung bereit, umfassend einen Halbleiter-Nanokristall, der Licht bei einer abstimmbaren Wellenlänge emittiert und mit einem Protein verbunden ist. Das Protein kann ein Peptid oder eine Aminosäure oder Derivate davon sein. Ohne den Umfang der Erfindung zu begrenzen, da alternative Verfahren zur Erreichung der gleichen Resultate verwendet werden können, können die Nanokristalle mit Aminosäuren und Peptiden verbunden werden, indem ein Aminosäuresrest mit Carbonsäuregruppen, konjugiert mit N-Hydroxysuccinimid (NHS), an die Oberfläche der Nanokristalle konjugiert wird. In einer bevorzugten Ausführungsform sind die Halbleiter-Nanokristalle wasserlöslich, und wie es in Beispiel 4 beschrieben ist, beinhaltet die Bildung der wasserlöslichen Halbleiter-Nanokristalle die Bedeckung der Oberfläche der Nanokristalle mit hydrophilen Einheiten, wie Carbonsäuregruppen. Carbonsäuregruppen können mit N-Hydyroxysuccinimid (NHS) konjugiert werden, um die Carbonylgruppe für eine weitere Konjugation mit einem Aminosäurerest, wie Lysin, zu aktivieren.
  • Als Beispiel umfasst die Zusammensetzung Halbleiter-Nanokristalle, die mit einem Protein, das ein Antikörper ist, verbunden sind. Der Antikörper kann ein polyklonaler oder ein monoklonaler Antikörper sein. Dann können mit Nanokristallen markierte Antikörper als Fluoreszenz-Marker mit einer Farbe oder mit mehreren Farben in Anwendungen wie Immunochemie und Immunozytochemie verwendet werden.
  • Als weiteres Beispiel umfasst die Zusammensetzung Nanokristalle, die an Proteine mit gewünschten Bindecharakteristika, wie einer spezifischen Bindung an ein anderes Protein (z. B. Rezeptoren), Bindung an Liganden (z. B. cAMP, Signalmoleküle) und Bindung an Nukleinsäuren (z. B. sequenzspezifische Bindung an DNA und/oder RNA), konjugiert sind.
  • In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung eine Zusammensetzung bereit, umfassend einen Halbleiter-Nanokristall, der Licht bei einer abstimmbaren Wellenlänge emittiert und mit einem Molekül oder Molekülkomplex verbunden ist, das/der mit einer biologischen Verbindung in Wechselwirkung treten kann. Als Beispiel ohne Beschränkung des Umfangs der Erfindung können Nanokristalle an Moleküle konjugiert sein, die physikalisch mit biologischen Verbindungen, wie Zellen, Proteinen, Nukleinsäuren, subzellulären Organellen und anderen subzellulären Komponenten, wechselwirken können. Z. B. können Nanokristalle mit Biotin verbunden werden, welches an die Proteine, Avidin und Streptavidin, binden kann. Nanokristalle können auch mit Molekülen verbunden werden, die nicht spezifisch oder sequenzspezifisch an Nukleinsäuren (DNA, RNA) binden. Als Beispiele ohne Beschränkung des Umfangs der Erfindung schließen solche Moleküle kleine Moleküle, die an die kleinere Furche von DNA binden (für einen Überblick siehe Geierstanger und Wemmer. Annu Rev Biophys Biomol Struct. 24: 463–493, 1995; und Baguley. Mol Cell Biochem. 43(3): 167-181, 1982), kleine Moleküle, die mit DNA und RNA Addukte bilden (z. B. CC-1065, siehe Henderson und Hurley, J Mol Recognit. 9(2): 75–87, 1996; Aflatoxin, siehe Garner. Mutat Res. 402(1-2): 67–75, 1998; Cisplatin, siehe Leng und Brabec. IARC Sci Publ. 125: 339–348, 1994), Moleküle, die zwischen die Basenpaare von DNA eingelagert werden, z. B. Methidium, Propidium, Ethidium, Porphyrine etc., für einen Überblick siehe Bailly, Henichart, Colson und Houssier. J Mol Recognit. 5(4): 155–171, 1992), radiomimetische DNA-schädigende Mittel wie Bleomycin, Neocarzinostatin und andere Endiine (für einen Überblick siehe Povirk. Mutat Res. 355(1-2): 71–89, 1996) und Metallkomplexe, die Nukleinsäuren durch Oxidation binden und/oder schädigen (z. B. Cu-Phenanthrolin, siehe Perrin, Mazumder und Sigman. Prog Nucleic Acid Res Mol Biol. 52: 123–151, 1996; Ru(II)- und Os(II)-Komplexe, siehe Moucheron, Kirsch-De Mesmaeker und Kelly. J. Photochem Photobiol B, 40(2): 91–106, 1997; chemische und photochemische Sonden von DNA, siehe Nielsen, J Mol Recognit, 3(1): 1–25, 1990) ein.
  • Moleküle und Molekülkomplexe höherer Ordnung (z. B. Polymere, Metallkomplexe), die mit Nanokristallen verbunden sind, können natürlich auftreten oder chemisch synthetisiert werden. Moleküle oder molekulare Komplexe höherer Ordnung können so ausgewählt sein, dass sie eine gewünschte physikalische, chemische oder biologische Eigenschaft aufweisen. Solche Eigenschaften schließen kovalente und nicht-kovalente Verbindung mit Proteinen, Nukleinsäuren, Signalmolekülen, prokaryotischen oder eukaryotischen Zellen, Viren, subzellulären Organellen und beliebigen anderen biologischen Verbindungen ein, sind aber nicht darauf beschränkt. Andere Eigenschaften solcher Moleküle schließen die Fähigkeit, einen biologischen Prozess zu beeinflussen (z. B. Zellzyklus, Blutkoagulation, Zelltod, Transkription, Translation, Signaltransduktion, DNA-Schädigung oder -Spaltung, Erzeugung von Radikalen, Einfangen von Radikalen etc.) und die Fähigkeit, die Struktur einer biologischen Verbindung zu verändern (z. B. Vernetzen, proteolytische Spaltung, radikalische Schädigung etc.) ein, sind aber nicht darauf beschränkt. Außerdem können Moleküle und molekulare Komplexe höherer Ordnung, die mit Nanokristallen verbunden sind, allgemeinere physikalische, chemische oder biologische Eigenschaften, wie z. B. Hydrophobie, Hydrophilie, Magnetismus und Radioaktivität, aber nicht beschränkt darauf, besitzen.
  • In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung eine Zusammensetzung bereit, umfassend einen Halbleiter-Nanokristall, welcher Licht bei einer abstimmbaren Wellenlänge emittiert und mit einer Nukleinsäure verbunden ist. Die Verbindung kann direkt oder indirekt sein. Die Nukleinsäure kann jede beliebige Ribonukleinsäure, Deoxyribonukleinsäure, Dideoxyribonukleinsäure oder beliebige Derivate und Kombinationen davon sein. Die Nukleinsäure kann auch Oligonukleotide beliebiger Länge darstellen. Die Oligonukleotide können einzelsträngig, doppelsträngig, dreifachsträngig oder Konfigurationen höherer Ordnung sein (z. B. Holliday-Verbindungen, zirkuläre einzelsträngige DNA, zirkuläre doppelsträngige DNA, DNA-Würfel (siehe Seeman. Annu Rev Biophys Biomol Struct. 27: 225–248, 1998)). Unter den bevorzugten Verwendungen der vorliegenden Zusammensetzungen und Verfahren sind die Detektion und/oder Quantifikation von folgenden Nukleinsäuren: (a) virale Nukleinsäuren; (b) bakterielle Nukleinsäuren; und (c) zahlreiche humane Sequenzen von Interesse, z. B. Einzelnukleotidpolymorphismen.
  • Nanokristalle können mit einzelnen Nukleotiden, Deoxynukleotiden, Dideoxynukleotiden oder beliebigen Derivaten und Kombinationen davon verbunden sein und in DNA-Polymerisationsreaktionen, wie dem DNA-Sequenzieren, der reversen Transkription von RNA in DNA und Polymerasekettenreaktionen (PCR) verwendet werden. Nukleotide schließen auch Monophosphat, Diphosphat und Triphosphate und cyclische Derivate wie cyclisches Adeninmonophosphat (cAMP) ein. Andere Verwendungen von Nanokristallen, die an die Nukleinsäuren konjugiert sind, schließen die Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH) ein. In dieser bevorzugten Ausführungsform sind Nanokristalle an Oligonukleotide konjugiert, die so gestaltet sind, dass sie mit einer spezifischen Sequenz in vivo hybridisieren. Bei der Hybridisierung werden die fluoreszierenden Nanokristall-Markierungen verwendet, um den Ort der gewünschten DNA-Sequenz in einer Zelle zu visualisieren. Z. B. kann der zelluläre Ort eines Gens, dessen DNA-Sequenz teilweise oder vollständig bekannt ist, unter Verwendung von FISH bestimmt werden. Jede DNA oder RNA, deren Sequenz teilweise oder vollständig bekannt ist, kann unter Verwendung von FISH visuell angesteuert werden. Z. B. können Messenger-RNA (mRNA), DNA-Telomere, andere stark wiederholte DNA- Sequenzen und andere nicht-codierende DNA-Sequenzen durch FISH angesteuert werden.
  • In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung eine Zusammensetzung bereit, umfassend fluoreszierende Halbleiter-Nanokristalle, die mit einem Molekül oder einem Reagenz verbunden, sind, zur Detektion von biologischen Verbindungen wie Enzymen, Enzymsubstraten, Enzyminhibitoren, zellulären Organellen, Lipiden, Phospholipiden, Fettsäuren, Sterolen, Zellmembranen, Molekülen, die an der Signaltransduktion beteiligt sind, Rezeptoren und Ionenkanälen. Die Zusammensetzung kann auch verwendet werden, um die Zellmorphologie und den Fluidfluss; die Zell-Lebensfähigkeit, Proliferation und Funktion; Endozytose und Exozytose; und reaktive Sauerstoffspezies (z. B. Superoxid, Stickstoffoxid, Hydroxylradikale, Sauerstoffradikale) zu detektieren. Außerdem kann die Zusammensetzung zur Detektion hydrophober oder hydrophiler Regionen biologischer Systeme verwendet werden.
  • Andere Anwendungen von fluoreszierenden Markern in biologischen Systemen können in Haugland, R. P. Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals (Molecular Probes. Eugene, OR. 6. Ausgabe 1996; Website, www.probes.com) gefunden werden.
  • In einem weiteren Aspekt der Erfindung stellt die vorliegende Erfindung Verfahren zur Detektion biologischer Verbindungen unter Verwendung von Nanokristallen bereit. Die Konjugation von Nanokristallen an solche Moleküle, wie kleine Moleküle, Proteine und Nukleinsäuren, erlaubt die Verwendung von Nanokristallen in jedem beliebigen Verfahren zur Detektion des Vorhandenseins oder der Menge biologischer Verbindungen. Außerdem stellt die vorliegende Erfindung Multiplex-Assays und analytische Verfahren zur Detektion biologischer Zustände und/oder Verbindungen unter Verwendung von Molekülen, die an Halbleiter-Nanokristalle mit verschiedenen Größen, Größenverteilungen und/oder Zusammensetzungen, die unterschiedliche Emissionsspektren aufweisen, gebunden sind, bereit. Das an den Nanokristall konjugierte Molekül ist ein erstes Element eines Bindepaars, das eine spezifische Affinität für ein entsprechendes zweites Element des Bindepaars besitzt. In einem Multiplex-Verfahren wird das Vorhandensein einer Vielzahl von Zielanalyten simultan in einer oder mehreren Assay-Mischungen unter Verwendung von bis zu 10–20 unterschiedlichen Halbleiter-Nanokristall-Bindepaar-Konjugaten detektiert. Die Konjugate unterscheiden sich mindestens in zwei Eigenschaften voneinander: (1) Das Emissionsspektrum jedes Elements der Vielzahl an Nanokristallen ist von dem anderen Element davon unterscheidbar; und (2) die Zielanalyten-Spezifität jedes Elements der Vielzahl an ersten Elementen der Bindepaare ist von den anderen Elementen davon unterscheidbar. Demgemäß können bis zu 10–20 (z. B. 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 1 1, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 oder 20) verschiedene Analyten, d. h. sekundäre Elemente der Bindepaare, in der gleichen oder unterschiedlichen Assay-Mischung simultan nachgewiesen werden.
  • Bestimmte besondere Verfahren werden unten diskutiert werden, um die Vorteile und Zweckmäßigkeiten der erfindungsgemäßen Zusammensetzungen hervorzuheben. Diese Verfahren schließen Fluoreszenz-Immunozytochemie, Fluoreszenzmikroskopie, DNA-Sequenzanalyse, Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH), Fluoreszenzresonanzenergietransfer (FRET), Durchflusszytometrie (Fluoreszenz-aktivierter Zellsortierer; Fluorescence Activated Cell Sorter; FACS) und diagnostische Assays für biologische Systeme ein, sind aber nicht darauf beschränkt.
  • Immunozytochemie.
  • Gegenwärtig erlaubt die Fluoreszenz-Immunozytochemie kombiniert mit Fluoreszenzmikroskopie, dass die Forscher biologische Einheiten, wie Proteine und Nukleinsäuren, innerhalb einer Zelle visualisieren können (siehe Current Protocols in Cell Biology, John Wiley & Sons, Inc., New York). Bei einem Verfahren werden primäre Antikörper, hybridisiert mit dem gewünschten in vivo-Target, verwendet. Dann werden sekundäre Antikörper, konjugiert mit Fluoreszenzfarbstoffen und auf die primären Antikörper gerichtet, verwendet, um den Komplex zu markieren. Der Komplex wird durch Anregung der Farbstoffe mit einer Lichtwellenlänge, die dem Anregungsspektrum des Farbstoffs entspricht, visualisiert. Es werden Fluoreszenzfarbstoffe, die mit Nukleinsäuren Wechselwirken, wie DAPI (4,6-Diamidino-2-phenylindol), Propidiumiodid, Ethidiumbromid und Hoechst-Farbstoffe (z. B. Benzoxanthen-Gelb und Bixbenzimid ((2'-[4-Hydroxyphenyl]-5-i4-methyl-1-piperazinyl]-2,5'-bi-1Hbenzimidazol) und (2'-[4-Ethoxyphenyl]-5-(4-methyl-1-piperazinyl]-2,5'-bi-1Hbenzimidazol)) verwendet, um DNA und RNA zu visualisieren.
  • Fluoreszenz-Markierungen werden auch verwendet, um das Vorhandensein und den Ort spezifischer Nukleinsäuresequenzen zu detektieren. DNA-Sequenzen, die komplementär zu den Zielsequenzen sind, werden direkt mit fluoreszierenden Nukleotiden markiert (z. B. Fluorescein-12-dUTP) und als Sonden zur Visualisierung des Vorhandenseins und des Ortes der Zielnukleotidsequenz verwendet. Beispiele für Targets schließen Messenger-RNA und genomische DNA ein. Alternativ kann die DNA-Sonde mit einem Marker, wie Biotin oder Digoxigenin, markiert werden. Bei der Hybridisierung der Sonde an ihre Zielsequenz wird ein Fluoreszenz-konjugierter Antikörper, der gegen den Marken gerichtet ist (z. B. Biotin oder Digoxigenin) verwendet, um die Sonde zu lokalisieren und visualisieren.
  • Colokalisierung biologischer Einheiten in einer Zelle wird durchgeführt, indem verschiedene Sets an Antikörpern für jedes zelluläre Target verwendet werden. Z. B. kann eine zelluläre Komponente mit einem Maus-monoklonalen Antikörper und eine andere Komponente mit einem Kaninchen-polyklonalen Antikörper angesteuert werden. Diese werden als primärer Antikörper bezeichnet. Anschließend werden sekundäre Antikörper gegen den Maus-Antikörper oder den Kaninchen-Antikörper, konjugiert an verschiedene Fluoreszenzfarbstoffe mit unterschiedlichen Emissionswellenlängen, verwendet, um das zelluläre Target zu visualisieren. Außerdem können Fluoreszenzmoleküle, wie DAPI (4,6-Diamidino-2-phenylindol) biologische Einheiten direkt ansteuern und farbig machen. Eine ideale Kombination von Farbstoffen zur Markierung mehrerer Komponenten innerhalb einer Zelle hätte ein wohl aufgelöstes Emissionsspektrum. Außerdem wäre es für diese Kombination von Farbstoffen wünschenswert, eine starke Absorption bei einer koinzidenten Anregungswellenlänge zu haben.
  • Abstimmbare Nanokristalle sind ideal zur Verwendung bei der Fluoreszenz-Immunozytochemie. Die Absorptionsspektren von Nanokristallen sind breit. Daraus folgt, dass eine einzelne Lichtquelle (im UV-blauen Bereich, vorzugsweise im blauen Bereich) verwendet werden kann, um alle Nanokristalle in einem System simultan anzuregen. Dies erlaubt dem Forscher, den Ort aller Nanokristalle (und somit der angesteuerten biologischen Komponenten) in einer Zelle simultan zu visualisieren. Außerdem vereinfacht eine einzelne Anregungslichtquelle den mit einer Fluoreszenzanregung im Zusammenhang stehenden Aufbau. Ferner erlaubt die Kombination enger Linienbreiten, und symmetrischer, nahezu Gauss-förmiger Kurvenformen ohne eine Endenungleichheitsregion in den Emissionsspektren der Nanokristalle und der Abstimmbarkeit der Emissionswellenlängen die Verwendung von mehreren Nanokristall-Markierungen in einem System. Daraus folgt, dass sogar 10–20 Nanokristalle unterschiedlicher Größe, jeweils mit einem unterschiedlichen Emissionsspektrum, simultan in einem System verwendet werden können, d. h. in einem Multiplex-System und unter Verwendung von im Fachgebiet bekannter Techniken, z. B. optisch mit oder ohne die Verwendung von Auflösungssoftware, leichter aufgelöst werden können.
  • Immunoassay
  • Ein Protokoll zur Verwendung von Halbleiter-Nanokristallen in heterogenen Immunoassays (Assays, in welchen der überschüssige Antikörper in einem separaten Schritt entfernt werden muss) ist in 1 beschrieben. Ein Antikörper zu einem Antigen wird an eine Festphase adsorbiert oder kovalent daran gebunden (siehe Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons, Inc., New York). Dann wird das Antigen zugegeben und man lässt es an den Festphasen-Antikörper binden. Nachdem das überschüssige Antigen entfernt wurde, wird die Matrix mit Nanokristall-markiertem Antikörper umgesetzt. Nach einer zweiten Waschung kann die Fluoreszenz quantifiziert werden.
  • Dieses Protokoll ist genauso auf mehrere, parallele Immunoassayschemata, d. h. Multiplex-Assays, anwendbar (2). Eine Serie unterschiedlicher Antikörper wird kovalent an ein Substrat gebunden. Dann können verschiedene Antikörperspezifische Antigene an dieses Array gebunden werden. Schließlich werden verschiedene Antikörper mit Nanokristallen spezifischer Größe, Größenverteilung oder Zusammensetzung an die Antigene gebunden. Wieder kann die Fluoreszenz jedes Nanokristalls verschiedener Größe, Größenverteilung oder Zusammensetzung quantifiziert werden und die relative Menge von jedem Antigen kann bestimmt werden. Eine solche Erweiterung sollte möglich sein, da Nanokristalle verschiedener Größe, Größenverteilung oder Zusammensetzung nicht nur ähnliche Löslichkeitseigenschaften, enge Linienbreiten und einzigartige, größenabhängige, größenverteilungsabhängige und zusammensetzungsabhängige Fluoreszenzfrequenzen aufweisen, sondern auch durch die gleiche Bestrahlungsquelle angeregt werden können (im UV-blauen, vorzugsweise im blauen Bereich des Spektrums).
  • Hochdurchsatz-DNA-Sequenzanalysen.
  • Halbleiter-Nanokristalle, konjugiert an Nukleinsäuren, finden Anwendung in nichtzellulären biologischen Systemen. Beispielsweise durch den Beginn von Fluoreszenz-markierten Nukleotiden, wurden Hochdurchsatz-DNA-Sequenzierung und DNA-Fragmentanalyse wirksame Werkzeuge bei der Analyse von DNA-Sequenzen (ABI-System; Perkin-Elmer).
  • Um diese Sequenzierungsreaktionen kurz zu beschreiben, werden vier Reaktionen durchgeführt, um die Positionen der vier Nukleotidbasen innerhalb einer DNA-Sequenz zu bestimmen. Unter Verwendung einer DNA-Probe als Templat wird eine DNA-Kette aus einem Pool von Nukleotiden, der die vier Deoxynukleotide und ein zusätzliches Dideoxynukleotid enthält, synthetisiert. Z. B. wird in der Adenin-Sequenzierungsreaktion DNA von einer Mischung synthetisiert, welche alle vier Deoxynukleotide (dATP, dGTP, dCTP, dTTP) und Dideoxyadenosintriphosphat (ddATP) enthält. Das Enzym DNA-Polymerase synthetisiert die neue DNA-Kette durch die Verknüpfung von dNTP. Manchmal wird DNA-Polymerase ein ddATP anstelle von dATP einbauen. Das ddATP in der entstehenden Kette wird dann die Synthese dieser DNA-Kette beenden, da es keine 3'-Hydroxylgruppe als Verbindung zum nächsten dNTP enthält. Somit werden die DNA-Produkte von der Adenin-Sequenzierungsreaktion eine heterogene Mischung von DNA sein, die in der Länge variieren, wobei jede Kette bei einer Position, die Adenin entspricht, endet.
  • Die vier DNA-Sequenzierungsreaktionen werden durch Polyacrylamidgelelektrophorese nach der Größe aufgelöst. Bei einfach radiomarkierter (32P oder 35S) DNA werden die vier Reaktionen in vier individuelle Bahnen aufgebracht. Die aufgelösten Produkte verschiedener Größen führen zu einem Muster von Banden, die die Identität einer Base bei jeder Nukleotidposition anzeigen. Dieses Muster entlang der vier Bahnen kann wie ein einfacher Code gelesen werden, der der Nukleotidbasensequenz des DNA-Templats entspricht. Bei fluoreszierenden Dideoxynukleotiden können Proben, die alle vier Dideoxynukleotidketten-terminierende Reaktionen enthalten, in eine einzelne Bahn aufgebracht werden. Die Auflösung der vier Dideoxynukleotidreaktionen ist aufgrund der verschiedenen Fluoreszenz-Kennzeichen für jede Probe möglich. Z. B. kann ddATP mit einer grünen Fluoreszenz-Markierung konjugiert werden. Die anderen drei ddNTP (Dideoxynukuleotidtriphosphat) werden mit drei unterschiedlichen Fluoreszenzfarben markiert. Somit wird jedes Kettenterminierende ddNTP mit einer unterschiedlichen Farbe codiert. Wenn alle vier Reaktionen in einer Bahn auf einem DNA-Sequenziergel aufgelöst werden, führt dies zu einer Leiter von Banden mit vier verschiedenen Farben. Jede Fluoreszenzfarbe entspricht der Identität der Nukleotidbase und kann leicht durch automatisierte Systeme analysiert werden.
  • Jedoch werden, wie zuvor diskutiert, mehrere Lichtquellen zur Anregung der vier unterschiedlichen fluoreszierenden organischen Farbstoffmarker benötigt. Die Verwendung von Halbleiter-Nanokristallen als Fluoreszenz-Markierungen für jede Dideoxynukleotidketten-terminierende Reaktion vereinfacht die Automatisierung einer Hochdurchsatz-DNA-Sequenzierung, da nur eine einzige Lichtquelle benötigt wird, um alle vier Fluoreszenz-Markierungen anzuregen. Außerdem erlaubt das Multiplexing mit Halbleiter-Nanokristallen die Durchführung und simultane Analyse mehrerer Sequenzierungsreaktionen, wobei der Durchsatz des Assays weiter erhöht wird.
  • Bei der PCR (Polymerasekettenreaktion)-basierenden DNA-Typisierung und Identifikation werden kurze Tandemrepeat (STR)-Stellen im humanen Genom durch PCR amplifiziert, indem Primen verwendet werden, die mit Fluoreszenz-Markierungen markiert sind. Die Größe dieser Stellen kann von Person zu Person oder von individuellem Subjekt zu individuellem Subjekt unterschiedlich sein oder übereinstimmen, und hängt von den genetischen Unterschieden in der Bevölkerung ab. Gewöhnlich werden mehrere Stellen untersucht. Jede beliebige Stelle, die einen Größenunterschied mit einer anderen Probe zeigt, gibt eindeutig an, dass die zwei Proben von zwei unterschiedlichen Individuen abgeleitet sind. Jedoch ist es weniger eindeutig, zu zeigen, dass zwei Proben von dem gleichen Individuum stammen. Im Gegensatz zu Fingerabdrücken kann die Größe von STR-Stellen zwischen zwei Individuen übereinstimmen. Jedoch nimmt die statistische Wahrscheinlichkeit, dass mehrere Stellen von zwei Individuen in der Größe übereinstimmen, ab, wenn die Anzahl an untersuchten Stellen erhöht wird. Bei der Verwendung konventioneller organischer Fluoreszenzfarbstoffe besteht die Beschränkung der Anzahl an in einer einzigen Bahn aufgelösten Proben (und somit des Hochdurchsatzes) in der Anzahl der erhältlichen Fluoreszenz-Markierungen und der Auflösung der Emissionsspektren. Eine Erhöhung der Auflösung der Fluoreszenz-Markierungen würde daher zur Erhöhung der Kapazität der Anzahl an Stellen, die pro Bahn auf einem Gel getestet werden, führen.
  • Fluoreszenzresonanzenergietransfer (FRET)
  • Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zur Detektion der Nähe zweier oder mehrerer biologischer Verbindungen bereit. Weitreichender (long-range) Resonanzenergietransfer zwischen Nanokristallen und zwischen einem Nanokristall und einem organischen Fluoreszenzfarbstoff kann effizient auftreten, wenn der Zwischenraum zwischen ihnen weniger als ungefähr 100 Å ist. Dieser long-range-Effekt kann zur Untersuchung biologischer Systeme ausgenutzt werden. Insbesondere kann dieser Effekt verwendet werden, um die Nähe von zwei oder mehreren biologischen Komponenten zueinander zu bestimmen. Umgekehrt kann dieser Effekt verwendet werden, um zu bestimmen, dass zwei oder mehrere biologische Verbindungen nicht in Nähe zueinander stehen. Vorteile bei der Verwendung von Nanokristallen, kombiniert mit organischen Farbstoffen für den FRET, schließen die Fähigkeit ein, die enge Emission der Nanokristalle abzustimmen, sodass sie genau die Anregungswellenlänge von organischen Farbstoffen trifft, womit Hintergrundsignale verringert werden.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform können Nanokristalle an eine biologische Verbindung oder ein Molekül konjugiert werden, die/das sich mit einer biologischen Verbindung verbinden. Ein fluoreszierender organischer Farbstoff wird verwendet, um eine zweite biologische Verbindung oder ein zweites Molekül zu markieren, die/das sich mit einer zweiten biologischen Verbindung verbindet. Die Nanokristalle werden so aufgebaut, dass sie Licht bei einer Wellenlänge emittieren, welche der Anregungswellenlänge des organischen Farbstoffs entspricht. Daher wird bei Vorhandensein von Anregungslicht, das auf die Anregungswellenlänge der Nanokristalle und nicht auf die des Farbstoffes abgestimmt ist, wenn eine erste Verbindung, markiert mit Nanokristallen, in enger Nähe ( < 100 Å) zu einer zweiten Verbindung, markiert mit einem organischen Farbstoff, ist, die Emission der Nanokristalle von dem Farbstoff absorbiert werden, was zur Anregung und Fluoreszenz des Farbstoffes führt. Folglich wird die für dieses System beobachtete Farbe die Farbe des Fluoreszenzfarbstoffes sein. Wenn die erste Verbindung, die mit Nanokristallen markiert ist, nicht in enger Nähe zu einer zweiten Verbindung ist, die mit einem organischen Farbstoff markiert ist, welcher Licht bei einer Wellenlänge absorbiert, die von den Nanokristallen emittiert wird, wird der Farbstoff die Emissionen der Nanokristalle nicht löschen. Somit wird die Farbe des Systems mit der Farbe der Fluoreszenz-Nanokristalle übereinstimmen.
  • Als Beispiel wird eine erste DNA-Sonde mit einer organischen Fluoreszenz-Markierung markiert und mit ihrer Ziel-DNA-Sequenz hybridisiert. Eine zweite DNA-Sonde wird mit Nanokristallen markiert, die so abgestimmt sind, dass sie Licht emittieren, das der Anregungswellenlänge . der organischen Fluoreszenz-Markierung entspricht. Wenn die zweite Sonde an eine Zielsequenz hybridisiert, die innerhalb eines bestimmten Abstandes ( < 100 Å) zu der ersten Probe ist, wird bei Vorhandensein von Anregungslicht, das auf die Nanokristalle und nicht auf den Farbstoff abgestimmt ist, die Fluoreszenzemission der Nanokristalle den organischen Farbstoff anregen und somit ein Signal erzeugen (Farbe des Farbstoffes), das die Nähe der zwei Sequenzen anzeigt (3). Ein Signal, das anzeigt, dass keine enge Nähe zwischen den zwei Sonden besteht, wäre die Farbe der Nanokristalle, da der Farbstoff das Licht, das von den Nanokristallen emittiert wird, nicht absorbieren und daher nicht fluoreszieren würde.
  • Alternativ sind zwei Nanokristall-Kennzeichen mit verschiedenen Größen mit Sonden-Nukleotidsequenzen verbunden. Wenn diese Stränge an die Ziel-DNA binden, dann sollten die Emissionen von den Nanokristallen kleinerer Größe gelöscht werden, während die von den größeren verstärkt werden sollten. Eine spektroskopische Quantifizierung dieses Energietransfereffekts könnte in situ durchgeführt werden. Folglich könnte auch eine automatisierte Detektion von Sets an DNA-Sequenzen realisiert werden.
  • In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform kann ein Verfahren zur Detektion von Proteasen unter Verwendung von FRET ausgenutzt werden. Ein Peptid mit einer Protease-Spaltstelle wird synthetisiert, sodass es einen Nanokristall an der einen Seite der Spaltungsstelle und einen organischen Fluoreszenzfarbstoff an der anderen Seite in enger Nähe enthält, sodass die Emission des Nanokristalls durch den Farbstoff absorbiert und somit gelöscht wird. In Gegenwart der Protease wird das Peptid gespalten werden, wobei die zwei Hälften des Peptids freigesetzt werden und der Löschungseffekt des Fluoreszenzfarbstoffes beseitigt wird. Daher zeigt die Detektion von emittiertem Licht von dem Nanokristall an, dass das Peptid durch die Protease gespalten wurde.
  • Die Verwendung von Nanokristallen bei der Durchflusszytometrie/in einem Fluoreszenz-aktivierten Zellsortierer (FACS).
  • In diesem Verfahren (siehe Current Protocols in Cytometry and Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons, Inc., New York) werden Zellen mit einem Fluoreszenzfarbstoff markiert und dann in einem Suspendiermedium durch einen engen Tropfenformer geführt, sodass jede Zelle in einem kleinen Tropfen vorliegt. Ein Laser-basierendes Detektorsystem wird verwendet, um die Fluoreszenz anzuregen und Tropfen mit positiv fluoreszierenden Zellen wird eine elektrische Ladung verliehen. Geladene und ungeladene Tropfen werden separiert, wenn sie zwischen geladene Platten fallen und auf diese Weise in verschiedenen Röhrchen aufgefangen. Die Vorrichtung kann entweder als analytisches Arbeitsgerät verwendet werden, bei dem die Anzahl an markierten Zellen in einer Population gezählt wird, oder verwendet werden, um die Zellen für ein anschließendes Wachstum der ausgewählten Population zu trennen. Es kann eine weitere komplexe Ausgestaltung in das System eingebaut werden, indem ein zweites Lasersystem in rechten Winkeln zu dem ersten verwendet wird, um auf ein zweites Fluoreszenz-Kennzeichen zu schauen oder um die Zellgröße auf Basis von Lichtstrahlung zu messen. Die Zweckmäßigkeit des Verfahrens ist, dass es eine große Anzahl von einzelnen Zellen sieht und es ermöglicht, Populationen z.B durch spezielle Oberflächeneigenschaften zu separieren.
  • Nanokristall-Technologie kann auf FACS angewandt werden. Ein Vorteil der Verwendung von Nanokristallen in FACS ist, dass bei Verwendung einer einzelnen Anregungslichtquelle mehrere Komponenten markiert werden können.
  • Daher können Zellen unter Verwendung einer Vielfalt von Parametern sortiert werden.
  • Diagnostik in biologischen Anwendungen.
  • Die Halbleiter-Nanokristall-Technologie kann in diagnostischen Systemen für biologische Anwendungen verwendet werden. Gegenwärtig bestehen bei der Verwendung von Antikörpern, die an fluoreszierende organische Farbstoffe konjugiert sind, bei der Detektion von biologischen Einheiten, wie weißen Blutzellen und Viren (z. B. HIV), Begrenzungen, die mit den physikalischen und spektralen Eigenschaften dieser Farbstoffe im Zusammenhang stehen. Diese Beschränkungen, wie zuvor diskutiert, schließen die spektrale Überlappung ein, die beobachtet wird, wenn mehrere Farbstoffe mit unterschiedlichen Emissionsspektren verwendet werden, was zum Hintergrund beiträgt, wenn Fluoreszenz-konjugierte Antikörper als diagnostischen Assay verwendet werden. Somit stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Detektion biologischer Einheiten als diagnostischen Assay für medizinische Zwecke bereit. In einer bevorzugten Ausführungsform können Nanokristalle an Moleküle konjugiert sein, die verwendet werden, um das Vorhandensein und/oder die Konzentration einer biologischen Verbindung in einem diagnostischen Assay für medizinische Zwecke zu detektieren.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform können Nanokristalle an Antikörper konjugiert sein, um Komponenten in Blut oder Plasma, wie weiße Blutzellen, Viren (z. B. HIV), Bakterien, Zelloberflächenantigene von Krebszellen und jede beliebige biologische Komponente, die mit menschlichen Krankheiten und Störungen im Zusammenhang steht, zu detektieren. Wie bei den zuvor beschriebenen biologischen Anwendungen der Nanokristall-Technologie erlaubt die Verwendung mehrerer Nanokristalle das Hochdurchsatz-Screening von Proben.
  • Es gibt viele Assays, die zur Detektion der Sequenz von einer DNA-Probe ausgestaltet sind. Jedes dieser Verfahren teilt manche oder alle eines Sets von üblichen Merkmalen. Diese Merkmale schließen ein: Sequenzspezifität, abgeleitet von komplementärer Oligonukleotid-Hybridisierung oder Annealing; ein fester Träger oder eine Festphase, die die Auftrennung spezifisch gebundener Assayreagenzien erlaubt; und ein Kennzeichen, das verwendet wird, um das Vorhandensein oder die Abwesenheit der spezifischen beabsichtigten Assay-Wechselwirkung zu detektieren. Beispiele von Assays, die zur Detektion der Sequenz einer DNA-Probe ausgestaltet sind, können in den U. S. Patenten Nr. 5,888,731 von Yager et al., 5,830,711 von Barany et al., 5,800,994 von Martinelli et al., 5,792,607 von Backman et al., 5,716,784 von Di Cesare, 5,578,458 von Caskey et al., 5,494,810 von Barany et al., 4,925,785 von Wang et al., 4,9898,617 von Landegren et al. gefunden werden. Nukleinsäurehybridisierungsassays sind z. B. in den U. S. Patenten Nr. 5,681,697 von Urdea et al., 5,124,246 von Urdea et al., 4,868,105 von Urdea et al. und in der europäischen Patentveröffentlichung Nr. 70.685, mit den Erfindern Heller et al., beschrieben.
  • Ein Halbleiter-Nanokristall, konjugiert an eine Oligonukleotid-Sonde, kann verwendet werden, um einen Nukleinsäure-Analyten oder das Vorhandensein einer Zielnukleotidsequenz darin unter Verwendung jedes der in den zuvor erwähnten Patenten oder Patentveröffentlichungen beschriebenen Verfahren oder jedes beliebigen Verfahrens, das einem Fachmann bekannt ist, detektiert werden. Außerdem kann eine Vielzahl unterschiedlicher Oligonukleotid-Sonden, wobei jede davon an einen Halbleiter-Nanokristall mit einem unterschiedlichen Emissionsspektrum konjugiert ist, in einem Multiplex-Assay verwendet werden, um eine Vielzahl von Nukleinsäure-Analyten oder eine Vielzahl von Zielnukleinsäuresequenzen in einem einzelnen Oligonukleotid-Analyten zu detektieren.
  • Bildgebungsvorrichtung.
  • Die vorliegende Erfindung stellt auch eine Vorrichtung zum Ablesen des Ergebnisses von biologischen Substraten, die mit Mehrfarbenfluoreszenzmarkern codiert sind, bereit. Eine automatisierte Vorrichtung, die lumineszierende biologische Mehrfarbensysteme detektiert, kann verwendet werden, um ein Bild des Mehrfarbenfluoreszenzsystems zu erhalten und es spektral aufzulösen. Die Vorrichtung kann Proben durch Bildgebung oder Scanning detektieren. Bildgebung ist bevorzugt, da sie schneller ist als Scanning. Die Bildgebung beinhaltet das Einbringen der kompletten Fluoreszenzdaten in ihrer Gesamtheit. Das Sammeln von Fluoreszenzdaten durch Scanning beinhaltet das Bewegen der Proben relativ zu einem Mikroskopobjektiv.
  • Es gibt drei Teile der Vorrichtung: 1) eine Anregungsquelle, 2) einen Monochromator, um das Bild spektral aufzulösen, oder ein Set an Schmalbandfiltern, und 3) ein Detektor-Array. Diese Vorrichtung kann an biologischen Systemen, wie einzelnen Zellen, einer Population von Zellen oder mit einem Array von DNA angewandt werden.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform wird die Vorrichtung zur Anregung von Fluoreszenz-Markern aus einer blauen oder ultravioletten Lichtquelle zur Anregung der Nanokristalle bestehen. Vorzugsweise ist die Wellenlänge der Lichtquelle kürzer als die Wellenlänge der Emissionen aller Nanokristalle. Als Beispiel ist, da alternative Verfahren verwendet werden können, um ähnliche Ergebnisse zu erhalten, die Lichtquelle vorzugsweise eine Breitband-UV-Blau-Lichtquelle, wie eine Deuteriumlampe mit einem angebrachten Filter. Ein weiterer Ansatz ist, die Lichtquelle von der Ausgabe (output) einer weißen Lichtquelle, wie einer Xenonlampe oder einer Deuteriumlampe, abzuleiten und das Licht durch einen Monochromator durchzuführen, um die gewünschten Wellenlängen zu gewinnen. Alternativ könnten Filter verwendet werden, um die gewünschten Wellenlängen zu gewinnen.
  • In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform zur Anregung der Fluoreszenz-Marker kann jede beliebige Anzahl an kontinuierlichen Wellengaslasern verwendet werden. Diese schließen jede beliebige der Argon-Ionenlaserlinien (z. B. 457, 488, 515 nm etc.) oder einen HeCd-Laser ein, sind aber nicht darauf beschränkt. Ferner können Festkörperdiodenlaser verwendet werden, die Licht im blauen Bereich des Spektrums erzeugen, wie GaN-basierende Laser oder GaAsbasierende Laser mit verdoppelter Ausgabe. Außerdem können YAG- oder YLFbasierende Laser mit verdoppelter oder verdreifachter Ausgabe oder jeder beliebige gepulste Laser, der auch eine Ausgabe im blauen Bereich besitzt, verwendet werden.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform wird für die spektrale Auflösung der Fluoreszenz-Nanokristalle in einem System die Lumineszenz von den Nanokristallen vorzugsweise durch einen Bild-subtrahierenden Doppelmonochromator geführt. Ein alternatives Verfahren zur Auflösung der Spektren jedes Nanokristalls in einem System mit mehreren Nanokristallen ist, das Lumineszenzlicht durch zwei einzelne Monochromatoren durchzuführen, wobei der zweite entgegengesetzt ist zum ersten. Der Doppelmonochromator besteht aus zwei Gittern oder zwei Prismen und einem Spalt zwischen den zwei Gittern. Das erste Gitter streut die Farben räumlich. Der Spalt sammelt eine kleine Bande an Farben und das zweite Gitter bildet wieder das Bild. Dieses Bild enthält nur die Farben, die für die Ausgabe eines Nanokristalls einer bestimmten Größe (Emission) spezifisch sind.
  • Eine weitere bevorzugte Ausführungsform zur Auflösung der Emissionsspektren eines Systems, das mehrere Nanokristalle enthält, ist die Verwendung eines Computer-kontrollierten Farbfilterrevolvers, wobei jeder Filter ein Schmalbandfilter ist, der bei der Emissionswellenlänge einer der Nanokristalle in einem System zentriert ist.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform werden die Fluoreszenzbilder unter Verwendung einer Kamera aufgezeichnet, die vorzugsweise mit einer ladungsgekoppelten Vorrichtung ausgerüstet ist. Es kann jeder zweidimensionale Detektor verwendet werden. Unter Verwendung von Software werden die Bilder dann artifiziell mit den tatsächlichen beobachteten Wellenlängen farbig gemacht. Das System bewegt sich dann an den Gittern zu einer neuen Farbe und wiederholt den Prozess. Die Endausgabe besteht aus einem Set an Bildern des gleichen räumlichen Bereichs, wobei jedes mit einer speziellen Wellenlänge gefärbt ist. Dies liefert die erforderliche Information für eine schnelle Analyse der Daten.
  • In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist ein alternatives Verfahren zur Detektion der fluoreszierenden Nanokristalle in biologischen Systemen, die Proben zu scannen. Eine Vorrichtung, in welcher das Scanningverfahren zur Detektion verwendet wird, sammelt Lumineszenzdaten von der Probe relativ zu einem Mikroskopobjektiv, indem entweder die Probe oder das Objektiv bewegt werden. Die resultierende Lumineszenz wird durch einen einzelnen Monochromator, ein Gitter oder ein Prisma durchgeleitet, um die Farben spektral aufzulösen. Alternativ können Filter verwendet werden, um die Farben spektral aufzulösen.
  • Für das Scanningverfahren der Detektion ist der Detektor ein Diodenarray, welches die Farben, die bei einer speziellen räumlichen Position emittiert werden, aufnimmt. Das gescannte Bild wird dann durch Software wieder hergestellt, was zu einem einzelnen Bild (File) führt, das alle Farben der Nanokristalle in der Probe enthält.
  • Da ein gesamtes Spektrum in einem einzelnen File vereinigt wird, ist in Systemen mit mehreren Nanokristallen eine spektrale Auflösung notwendig und wird leicht durchgeführt, um überlappende Spektren aufzulösen. Wie zuvor diskutiert, erlauben die schmalen spektralen Linienbreiten und die nahezu Gauss-förmigen symmetrischen Kurvenformen, die keine Endenungleichheitsregion aufweisen, die für die Emissionsspektren von Nanokristallen beobachtet werden, kombiniert mit der Abstimmbarkeit der Emissionswellenlängen von Nanokristallen eine hohe spektrale Auflösung in einem System mit mehreren Nanokristallen. Theoretisch können bis zu 10–20 Nanokristalle verschiedener Größe von verschiedenen Präparationen von Nanokristallen, wobei jede Probe ein unterschiedliches Emissionsspektrum besitzt, simultan in einem System verwendet werden, wobei die überlappenden Spektren leicht unter Verwendung von Auflösungssoftware aufgelöst werden können.
  • Photolumineszenz von einzelnen Halbleiter-Nanokristallen
  • Einzelne Halbleiter-Nanokristalle besitzen eine detektierbare Lumineszenz (Mixmal et al. Nature 383: 802, 1996; und Empedocles et al. Phys. Rev. Lett. 77: 3873, 19961, welche auf biologische Systeme angewandt werden kann. Ein Vorteil davon, dass man hochfluoreszierende einzelne Nanokristalle besitzt, welche detektierbar sind und mit biologischen Verbindungen verbunden sind, ist, dass dies die Detektion sehr kleiner Mengen von biologischen Molekülen erlaubt. Somit kann der Durchsatz von Assays, die eine große Anzahl an Proben screenen, verbessert werden, indem einzelne Nanokristalle, die mit biologischen Verbindungen verbunden sind, verwendet werden, um die Probengröße zu verringern und dies erlaubt folglich, eine größere Anzahl von Proben zur gleichen Zeit zu screenen.
  • Es soll so verstanden werden, dass, während die Erfindung zusammen mit den bevorzugten spezifischen Ausführungsformen davon beschrieben wurde, die vorangehende Beschreibung sowie die Beispiele, die nun folgen, die Erfindung veranschaulichen sollen und nicht den Umfang der Erfindung begrenzen. Weitere Aspekte, Vorteile und Modifikationen innerhalb des Umfangs der Erfindung werden dem Fachmann des Gebietes, zu welchem die Erfindung gehört, offensichtlich sein.
  • Die folgenden Beispiele sind dazu gedacht, dem Fachmann eine vollständige Offenbarung und Beschreibung dafür zu liefern, wie die neuen Zusammensetzungen der Erfindung herzustellen und zu verwenden sind, und sind nicht dazu gedacht, den Umfang davon, was die Erfinder als ihre Erfindung betrachten, auf irgend eine Weise zu begrenzen. Es wurden Bemühungen gemacht, die Genauigkeit hinsichtlich der verwendeten Zahlen (z. B. Mengen, Temperaturen etc.) zu gewährleisten, aber manche experimentelle Fehler und Abweichungen sollten natürlich gestattet sein. Wenn es nicht anders angegeben ist, sind Anteile Gewichtsanteile, Temperaturen sind in Grad Celsius und der Druck ist bei oder nahezu Atmosphärendruck.
  • Bei der Durchführung der vorliegenden Erfindung werden, wenn es nicht anders angegeben ist, konventionelle Techniken synthetischer organischer Chemie, der Biochemie, molekularen Biologie und dgl. verwendet werden, welche innerhalb des Wissens des Fachmanns liegen. Solche Techniken sind vollständig in der Literatur beschrieben. Siehe z. B. Sambrook, Fritsch & Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, zweite Ausgabe (1989); Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait, Herausgeber, 1984); Nucleic Acid Hybridization (B. D. Hames & S. J. Higgins, Herausgeber, 1984); und eine Folge von Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.); Kirk-Othmer's Encylopedia of Chemical Technologe; House's Modern Synthetic Reactions; der Marvel et al. Text ORGANIC SYNTHESIS; Sammelausgabe 1 und dgl.
  • Beispiele
  • Beispiel 1
  • Herstellung von TOPO-gekapptem (CdSe)ZnS
  • (a) Herstellung von CdSe. Trioctylphosphinoxid (TOPO, 90% Reinheit) und Trioctylphosphin (TOP, 95% Reinheit) wurden von Strem bzw. Fluka erhalten. Dimethylcadmium (CdMe2) und Diethylzink (ZnEt2) wurden von Alfa bzw. Fluka gekauft, und beide Materialien wurden in einer Inertatmosphärenbox separat durch einen 0,2 Mikronfilter filtriert. Trioctylphosphinselenid wurde hergestellt, indem 0,1 Mol Se-Stücke in 100 ml TOP gelöst wurden, wodurch eine 1 M-Lösung von TOPSe hergestellt wurde. Hexamethyl(disilathian) (TMS2S) wurde verwendet, wie es von Aldrich gekauft wurde. n-Hexan, Methanol, Pyridin und n-Butanol mit HPLC-Qualität wurden von EM Sciences gekauft.
  • Die typische Präparation von TOP/TOPO-gekappten CdSe-Nanokristallen folgt. TOPO (30 g) wurde in einen Kolben eingebracht und unter Vakuum (ungefähr 1 Torr) bei 180 Grad Celsius für 1 Stunde getrocknet. Der Kolben wurde dann mit Stickstoff gefüllt und auf 350 Grad C erhitzt. In einer Inertatmosphäretrockenbox wurde die folgende Injektionslösung hergestellt: CdMe2 (200 Mikroliter, 2,78 mmol), 1 M TOPSe-Lösung (4,0 ml, 4,0 mmol) und TOP (16 ml). Die Injektionslösung wurde sorgfältig gemischt, in eine Spritze gefüllt und von der Trockenbox entfernt.
  • Von dem Reaktionskolben wurde die Wärme entfernt und die Reaktionsmischung wurde mit einer einzigen kontinuierlichen Injektion in das kräftig rührende TOPO eingebracht. Dadurch wurde eine dunkelgelbe/orangene Lösung mit einer scharfen Absorptionseigenschaft bei 470–500 nm und eine plötzliche Temperaturabnahme auf ungefähr 240 Grad C erzeugt. Der Reaktionskolben wurde wieder erwärmt und die Temperatur wurde stufenweise auf 260–280 Grad C erhöht.
  • Allquoten der Reaktionslösung wurden in regelmäßigen Intervallen (5–10 min) entfernt, und um das Wachstum der Kristallite zu beobachten, wurden die Absorptionsspektren aufgenommen. Die besten Proben wurden über eine Zeitdauer von wenigen Stunden gleichmäßigen Wachstums hergestellt, indem die Wachstumstemperatur als Reaktion auf Veränderungen der Größenverteilung moduliert wurde, wie es ausgehend von der Schärfe der Charakteristika in den Absorptionsspektren abgeschätzt wurde. Die Temperatur wurde als Reaktion auf eine Erhöhung der Größenverteilung um 5–10 Grad C erniedrigt. Alternativ kann die Reaktion an diesem Punkt auch gestoppt werden. Wenn es scheint, dass das Wachstum aufhört, wird die Temperatur um 5–10 Grad C erhöht. Als die gewünschten Absorptionscharakteristiken beobachtet wurden, ließ man den Reaktionskolben auf ungefähr 60 Grad C abkühlen und es wurden 20 ml Butanol zugegeben, um eine Verfestigung des TOPO zu verhindern. Eine Zugabe eines großen Überschusses an Methanol führt dazu, dass die Partikel ausflocken. Die Ausflockung wurde von der Überstandsflüssigkeit durch Zentrifugation abgetrennt; das resultierende Pulver kann in einer Vielfalt von organischen Lösungsmitteln (Alkanen, Ethern, Chloroform, Tetrahydrofuran, Toluol etc.) dispergiert werden, um eine optisch klare Lösung zu erzeugen.
  • (b) Herstellung von (CdSe)ZnS. Ein Kolben mit 5 g TOPO wurde für mehrere Stunden unter Vakuum auf 190 Grad C erhitzt und dann auf 60 Grad C abgekühlt, wonach 0,5 ml Trioctylphosphin (TOP) zugegeben wurden. Mittels einer Spritze wurden ungefähr 0,1-0,4 Mikromol von in Hexan dispergierten CdSe-Nanokristallen in das Reaktionsgefäß transferiert, und das Lösungsmittel wurde abgepumpt.
  • Diethylzink (ZnEt2) und Hexamethyldisilathian ((TMS)2S) wurden als Zn- bzw. S-Vorläufer verwendet. Die Mengen an Zn- und S-Vorläufer, die benötigt wurden, um für jede CdSe-Probe eine ZnS-Schale der gewünschten Dicke wachsen zu lassen, wurden wie folgt bestimmt: Zunächst wurde der mittlere Radius der CdSe-Nanokristalle aus TEM- oder SAXS-Messungen abgeschätzt. Danach wurde das Verhältnis von ZnS zu CdSe, das notwendig ist, um eine Schale der gewünschten Dicke zu bilden, basierend auf dem Verhältnis des Schalenvolumens zu dem des Kerns, berechnet, wobei ein sphärischer Kern und eine sphärische Schale angenommen wurden und die Masse(bulk)raumgitterparameter von CdSe und ZnS berücksichtigt wurden. Für größere Partikel ist das Verhältnis von Zn zu Cd, das notwendig ist, um eine Schale mit gleicher Dicke zu erreichen, kleiner als das von kleineren Nanokristallen. Die tatsächliche Menge an ZnS, die auf den CdSe-Kernen wächst, war im Allgemeinen aufgrund der unvollständigen Reaktion der Vorläufer und des Verlustes von Material an den Wänden des Kolbens während der Zugabe geringer als die zugegebene Menge.
  • Äquimolare Mengen der Vorläufer wurden in 2–4 ml TOP in einer Inertatmosphären-Handschuhbox gelöst. Die Vorläufer-Lösung wurde in eine Spritze gefüllt und in einen Zugabetrichter, der an dem Reaktionskolben angebracht war, transferiert. Der Reaktionskolben, der in TOPO- und TOPdispergierte CdSe-Nanokristalle enthält, wurde unter einer Atmosphäre von N2 erwärmt. Die Temperatur, bei welcher die Vorläufer zugegeben wurden, reichte von 140 Grad C für Nanokristalle mit einem Durchmesser von 23 Å bis 220 Grad C für Nanokristalle mit einem Durchmesser von 55 Å. Wenn die gewünschte Temperatur erreicht war, wurden die Zn- und S-Vorläufer über eine Zeitdauer von 5–10 Minuten tropfenweise zu der kräftig rührenden Reaktionsmischung zugegeben.
  • Nach der vollständigen Zugabe wurde die Mischung auf 90 Grad C abgekühlt und man ließ sie für mehrere Stunden rühren. Der Mischung wurde Butanol (5 ml) zugegeben, um zu verhindern, dass TOPO bei Abkühlen auf Raumtemperatur verfestigt wird. Die überbeschichteten Partikel wurden in ihrer Wachstumslösung aufbewahrt, um zu gewährleisten, dass die Oberfläche der Nanokristalle mit TOPO passiviert wurde. Sie wurden später in Pulverform gebracht, indem mit Methanol präzipitiert wurde, und sie wurden in einer Vielfalt von Lösungsmitteln, einschließlich Hexan, Chloroform, Toluol, THF und Pyridin, redispergiert.
  • Beispiel 2
  • Herstellung eines wasserlöslichen Halbleiter-Nanokristalls unter Verwendung von Langketten-Mercaptocarbonsäure
  • TOPO-gekappte (CdSe)ZnS-Halbleiter-Nanokristalle wurden, wie in Beispiel 1 beschrieben, hergestellt. Die überbeschichteten (CdSe)ZnS-Nanokristalle wurden unter Verwendung einer Mischung aus Butanol und Methanol aus der Wachstumslösung präzipitiert. Um die präzipitierten Halbleiter-Nanokristalle zu erhalten, wurde die Lösung für 5–10 Minuten zentrifugiert, der Überstand wurde abdekantiert und der Rückstand wurde mit Methanol (2X) gewaschen.
  • Der Rückstand wurde gewogen. Das Gewicht der TOPO-Kappe wurde auf 30% des Gesamtgewichts geschätzt; und es wurde ein 30-facher molarer Überschuss der neuen Kappungsverbindung, 11-Mercaptoundecansäure (MUA), zugegeben. Der Rückstand und MUA (pure Lösung) wurden bei 60 Grad C für 8–12 Stunden gerührt. Ein Tetrahydrofuran-Volumen (THF), das der zugegebenen MUA entspricht, wurde der MUA/Nanokristall-Mischung zugegeben, wobei die Mischung immer noch heiß war. Dies führte zu einer klaren Lösung, und die beschichteten Halbleiter-Nanokristalle wurden unter THF aufbewahrt.
  • Die beschichteten Halbleiter-Nanokristalle wurden durch Deprotonierung der Carbonsäure-funktionellen Gruppe der MUA (4) wasserlöslich gemacht. Die Deprotonierung wurde durch Zugabe einer Suspension von Kalium-t-butoxid in THF zu der MUA-Halbleiter-Nanokristall/THF-Lösung durchgeführt. Dies führte zu einem Gel, welches dann zentrifugiert wurde, und die Überstandsflüssigkeit wurde abgegossen. Der Rückstand wurde zwei Mal mit THF gewaschen, jedes Mal zentrifugiert und die Überstandsflüssigkeit wurde abgegossen. Man ließ den Endrückstand für 10 Minuten in Luft trocknen. Dem Rückstand wurde entionisiertes Wasser (Millipore) zugegeben, bis eine klare Lösung gebildet wurde.
  • Die resultierenden beschichteten Halbleiter-Nanokristalle wurden auf ihre Photolumineszenz-Quantenausbeute hin untersucht. Ein CdSe-Halbleiter-Nanokristall mit einer Vier-Monoschichten-Beschichtung von ZnS, beschichtet wie beschrieben, wies eine Absorptionsbande bei 480 nm und eine Photolumineszenzbande bei 500 nm bei einer Quantenausbeute von 12% auf. Ein zweiter CdSe-Halbleiter-Nanokristall mit einer Vier-Monoschichten-Beschichtung von ZnS, beschichtet wie beschrieben, hatte eine Absorptionsbande bei 526 nm und eine Photolumineszenzbande von 542 nm, mit einer Quantenausbeute von 18%.
  • Beispiel 3
  • Verbinden eines Wasser-solubilisierten Halbleiter-Nanokristalls mit einem Protein
  • CdSe-Halbleiter-Nanokristalle, überbeschichtet mit ZnS, wurden hergestellt, gereinigt und in Wasser solubilisiert, wie zuvor beschrieben. Die Proben, die in diesem Experiment verwendet wurden, hatten CdSe-Kerne mit einem Durchmesser von 40 Å, eine ZnS-Schale, die nominell 4 Monoschichten (ungefähr 9 Å) dick war und waren mit einer 11-Mercaptoundecansäure (MUA)-Kappe versehen.
  • Die folgenden drei Reagenzien wurden gemischt: 5,8 mg 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimidhydrochlorid (EDAC), 2,4 mg N-Hydroxysuccinimid (NHS) und 4 ml einer 0,82 mikromolaren Lösung von Avidin in Millipore-gefiltertem Wasser. Die anfänglich saure Mischung wurde mit 0,1 M NaOH (aq) behandelt, um den pH-Wert auf 7,8 einzustellen. Dann wurden 3 ml einer 2,1 mikromolaren wässrigen Lösung von (CdSe)ZnS-Halbleiter-Nanokristallen zugegeben. Die Mischung wurde für 1 Stunde bei Raumtemperatur gerührt. Überschüssige Reagenzien wurden mit einem Tropfen 0,25 M Ethanolamin in Wasser gequencht.
  • Um zu bestimmen, ob die Avidin-Kupplung erfolgreich war, wurde die gefärbte Reaktionslösung durch eine kurze Säule geleitet, die Biotin-beschichtete acrylische Beads enthielt. Das herauskommende Filtrat war nahezu farblos. Die Säule wurde dann mit einem 10-fachen Volumen an Wasser gewaschen. Unter Anregung mit ultraviolettem Licht zeigten die Beads aufgrund der gebundenen Halbleiter-Nanokristalle eine starke Fluoreszenz, was eine erfolgreiche Kupplung an Avidin anzeigte. Ein Kontrollexperiment unter Verwendung von nur Halbleiter-Nanokristallen und Avidin mit Reagenzien, um diese zu kuppeln (d. h. kein EDAC oder NHS), erzeugte Beads mit wenig oder keiner Fluoreszenz, was bestätigte, dass die Halbleiter-Nanokristalle ohne Avidin-Verknüpfung nicht an die Biotinbeschichteten Beads binden.
  • Beispiel 4
  • Biotin-Hexandithiol (BHDT)-Bildung
  • Diese Vorgehensweise nutzt die aktivierte Carbonsäuregruppe aus, die in dem Biotinderivat, Biotin-N-hydroxysuccinimid (BNHS; Pierce Chemicals, Rockford, IL) vorhanden ist, um ein Biotinderivat herzustellen, welches mit einer Thiol (SH)-Gruppe terminiert ist (5 und 6). Das Vorhandensein einer Thiolgruppe ist erwünscht, da Thiole im Allgemeinen dazu neigen, an Metalloberflächen zu adsorbieren. Daher kann die Thiolbindung ausgenutzt werden, um Biotin an die wasserlöslichen Halbleiter-Nanokristalle zu binden.
  • BNHS wurde in DMF gelöst und es wurde ein 10-facher Überschuss von 1,6-Hexandithiol in Gegenwart von einer schwachen Base (Triethylamin) zugegeben. Die Lösung wurde bei Raumtemperatur für 16 Stunden gerührt. Dies führte zu einem NHS-Präzipitat und die Lösung wurde filtriert, um dieses NHS-Präzipitat zu entfernen. Das Präzipitat wurde mit DMF gewaschen. Das Präzipitat wurde auf ein Minimalvolumen reduziert, indem Lösungsmittel im Vakuum entfernt wurde. Zu der aufkonzentrierten Lösung wurde dann Ether zugegeben, um Rohprodukt zu präzipitieren. Das Produkt wurde durch Filtration isoliert und der Rückstand wurde im Vakuum abgepumpt, um den Überschuss Dithiol zu entfernen. Es wurde ein weißes Pulver (BHDT) isoliert und im Handschuhbox-Kühlschrank aufbewahrt, um eine Thioloxidation zu Disulfid zu verhindern. Die resultierende Ausbeute betrug ungefähr 68%.
  • Beispiel 5
  • Biotin-Amin-Bildung
  • Das Prinzip dieser Vorgehensweise ist ähnlich der in Beispiel 6 beschriebenen. In diesem Beispiel wird die aktivierte Carbonsäuregruppe in Biotin verwendet, um ein Biotinderivat mit einer terminalen Amingruppe herzustellen (7). Wie Thiole konjugieren Amine an Metalloberflächen und können verwendet werden, um Biotin an die Nanokristalle zu binden.
  • 100 mg BNHS wurden in einem Reagenzgefäß zu 2 ml DMF gegeben und gemischt, bis sich das ganze BNHS gelöst hatte. Danach wurden 0,9 ml 1,3-Diaminopropan (ein 30-facher Überschuss) in ein anderes Reagenzgefäß gegeben. Die BNHS/DMF-Lösung wurde in 2 Allquoten in das Reagenzgefäß, das das pure 1,3-Diaminopropan enthält, pipettiert. Die Zugaben wurden in ungefähr 2 Minuten durchgeführt, mit 5-minütiger Pause. Die resultierende Lösung wurde für 24 Stunden bei Raumtemperatur gerührt, und es bildete sich ein weißer Niederschlag (NHS). Der NHS-Niederschlag wurde durch Zentrifugation entfernt und der klare Überstand wurde in ein anderes Reagenzgefäß transferiert. Dem Überstand wurde überschüssiger Ether zugegeben. Durch Schütteln wurde eine unvermischbare Schicht am Boden gebildet, die in einen Rundkolben transferiert wurde. Dann wurden DMF und überschüssiges Diamin unter Vakuum entfernt, um ein weißes Pulver zu ergeben. Die resultierende Ausbeute betrug ungefähr 72%.
  • Beispiel 6
  • Biotin-Thiol-Nanokristall-Komplexbildung
  • Das Ziel dieses Protokolls ist, eine Biotin-Kappe auf die Oberfläche der Halbleiter-Nanokristalle aufzubringen. Die Thiol-Endgruppe von BHDT sollte an die Nanokristall-Oberfläche adsorbieren (8). Überschüssige MUA von der Kappe wurde durch Präzipitation der Nanokristalle mit einer Hexan/Butanol-Mischung von der Halbleiter-Nanokristall/THF-Lösung entfernt. Das Präzipitat wurde in DMF redispergiert und dann wieder mit einer Hexan/BuOH-Mischung präzipitiert. Das Präzipitat ließ man für 20–25 Minuten in Luft trocknen, wog es und löste es wieder in DMF. Um die Menge an BHDT zum Lösen in DMF zu berechnen, wurde abgeschätzt, dass 30% des Gesamtgewichts des Nanokristalls der Kappe zuzuschreiben sind. Ausgehend von dieser Abschätzung wurde ein 10-facher Überschuss an BHDT (bezogen auf die Kappe) in einem separaten Reagenzgefäß in DMF gelöst. Die BHDT-Lösung wurde dann der Nanokristall/DMF-Lösung über eine Zeitdauer von 5 Minuten zugegeben. Diese Mischung wurde bei Raumtemperatur für ungefähr 15 Stunden gerührt. Die Reaktion wurde durch Zentrifugation gestoppt, wobei nur der Überstand zurückbehalten wurde. Es wurde eine Lösung von Kalium-tert-butoxid in DMF verwendet, um die MUA-Säurekappe zu deprotonieren. Es wurde ein gefärbtes Präzipitat gebildet, welches das wasserlösliche Produkt ist. Die Mischung wurde einer Zentrifugation unterzogen, und der klare Überstand wurde verworfen. Von dieser Schicht wurde keine Photolumineszenz beobachtet, was angibt, dass alle Nanokristalle erfolgreich aus der Lösung präzipitiert wurden.
  • Das Präzipitat wurde in entionisiertem H2O (Millipore; Bedford, MA) gelöst. Die resultierende Lösung wurde durch einen 0,2 Mikron-Filter (Millipore) filtriert und in einen Ultrafree-4-Konzentrator (Millipore) transferiert. Die Lösung wurde drei Mal mit dem Konzentrator zentrifugiert und nach jeder Zentrifugation wurden die Röhrchen mit Wasser versetzt. Die konzentrierte Lösung wurde in ein Reagenzgefäß transferiert und mit Wasser verdünnt. Um zu bestätigen, dass Biotin erfolgreich an die Nanokristalle konjugiert worden ist, wurde die resultierende Lösung über eine Säule mit immobilisiertem Avidin geleitet (Ultra-Link, Pierce, Rockford, IL). Nanokristalle, die mit Biotin derivatisiert waren, wurden von der Säule zurückgehalten, was zu einer Fluoreszenz der Säule führte, wenn diese mit einer UV-Lampe bestrahlt wurde. Kontrollsäulen, über welche nicht-biotinylierte Nanokristalle gelaufen waren, zeigten keine Fluoreszenz, wenn sie mit einer UV-Lampe bestrahlt wurden.
  • Beispiel 7
  • Biotin-Amin-Nanokristall-Komplexbildung
  • Dieses Protokoll erlaubt, Biotin an die Oberfläche der Halbleiter-Nanokristalle zu binden. Konjugation von Biotin an die Nanokristalle wird durch die primäre Amingruppe am Ende von Biotin erreicht. In diesem Protokoll wird wieder die Affinität der Amingruppe für die Oberfläche des Nanokristalls ausgenutzt ( 9).
  • In diesem Protokoll wurden die MUA-gekappten Nanokristalle unter Verwendung einer Hexan/BuOH-Mischung aus der Nanokristall/THF-Lösung präzipitiert. Die Nanokristalle wurden für ungefähr 5 Minuten luftgetrocknet und gewogen. Die Deprotonierung der Nanokristalle wurde durchgeführt, indem der pH-Wert der Lösung mit einer 1 M-Lösung von NH4OH auf 10,5 eingestellt wurde. Um die Menge an zu verwendendem Überschuss Biotin-Amin zu berechnen, wurde abgeschätzt, dass ungefähr 30% des Gesamtgewichts der Nanokristalle der Kappe zuzuschreiben sind. Somit wurde ein 10-facher Überschuss (zur Kappe) des Biotin-Amin-Reagenz, das zuvor wie in Beispiel 5 synthetisiert wurde, in einem separaten Reagenzgefäß eingewogen. Dieses Biotinderivat wurde dann in einem Minimalvolumen von Wasser gelöst. Die Lösung, enthaltend das Biotin-Amin-Konjugat, wurde über einen Zeitraum von ungefähr 3 Minuten in die Lösung von deprotonierten Nanokristallen pipettiert, und dann wurde für ungefähr 12 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Die Reaktion wurde durch Zentrifugation gestoppt, und der resultierende Überstand wurde durch einen 0,2 Mikron-Filter (Millipore) geleitet.
  • Nach der Filtration wurde die Lösung in einen Ultrafree-4-Konzentrator transferiert (Millipore; MW-Grenze = 30 kDa). Die Lösung wurde drei Mal mit dem Konzentrator zentrifugiert und nach jeder Zentrifugation wurden die Röhrchen mit entionisiertem Wasser versetzt. Die konzentrierte Endlösung wurde wieder mit Wasser verdünnt und durch einen 0,2 Mikron-Filter refiltriert. Die resultierende klare Lösung wurde über eine Säule mit immobilisiertem Avidin geleitet (Ultralink-Matrix; Pierce), um die Biotinylierung der Nanokristalle, wie in Beispiel 6 beschrieben, zu bestätigen.
  • Beispiel 8
  • Biotin-Amin-Nanokristall-Komplexbildung (alternative Route)
  • Im Gegensatz zu den Vorgehensweisen, die in den vorhergehenden Beispielen beschrieben wurden, werden bei diesem Protokoll die Carbonsäuregruppen, die Kappen an der Oberfläche der wasserlöslichen Nanokristalle darstellen, die in Beispiel 2 beschrieben sind (siehe Figur 101, verwendet. Durch Konjugation eines Biotin-primären Amin-Derivats an die Carbonsäuregruppe an der Oberfläche der Nanokristalle wird eine Amidbindung gebildet. Diese Verknüpfung wird mithilfe von 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carboimidhydrochlorid (EDC; Pierce Chemicals, MW = 191,7 g/mol) durchgeführt, einer weiteren Gruppe, die die Carbonsäuregruppe zur Verwendung in folgenden Reaktionen aktiviert.
  • Die in THF gelösten MUA-gekappten Nanokristalle wurden durch Deprotonierung der Carbonsäuregruppe präzipitiert. Diese Deprotonierung wurde durch Zugabe einer Kalium-tert-butoxid/THF-Suspension durchgeführt. Der resultierende Rückstand wurde zwei Mal mit THF gewaschen, für 10–15 Minuten luftgetrocknet und gewogen. Dann wurde dem Rückstand entionisiertes Wasser zugegeben, und die Suspension wurde geschüttelt, bis der Rückstand vollständig gelöst war. Dann wurde ein Aliquot von dieser Lösung durch dreimalige Zentrifugation unter Verwendung eines Ultrafee-4-Konzentrators (Millipore) konzentriert. Wieder wurde das Röhrchen nach jeder Konzentration mit Milliporegefiltertem Wasser versetzt. Der pH-Wert der Lösung wurde unter Verwendung einer 1 M-Lösung von NH4OH auf 9 eingestellt.
  • Für die folgenden Berechnungen wurde angenommen, dass das Gewicht der Säurekappe 30% des Gesamtgewichts der Nanokristalle beträgt. Dann wurde den Nanokristallen eine Lösung von EZ-Link Biotin-PEO-LC-Amin (Pierce Chemicals, MW = 418 g/mol) und 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carboimidhydrochlorid (EDC) in Wasser bei einem molaren Äquivalent von 1 : 1 (Biotinderivat : Säurekappe) und 10 : 1 (EDC : Säurekappe) zugegeben (pH = 8,5). Diese Mischung wurde für 2–3 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Die Reaktion wurde durch zweimaliges Filtrieren der Lösung durch einen 0,2 Mikron Millipore-Filter gestoppt.
  • Wie in Beispiel 6 wurde die Konjugation von Biotin an die Nanokristalle bestätigt, indem die Probe über eine Avidin-Säule geleitet wurde. Eine erfolgreiche Konjugation führte zu einer fluoreszierenden Säule. Eine Kontrollsäule, über die nicht-biotinylierte Nanokristalle geleitet wurden, fluoreszierte nicht.
  • Beispiel 9
  • Halbleiter-Nanokristall-Oligonukleotid-Komplexbildung
  • Diese Prozedur wird abgeleitet von der Synthese des Biotin-Amin-Nanokristall-Komplexes. Insbesondere werden molare Äquivalente, die in Beispiel 5 verwendet werden, verwendet, um die Halbleiter-Nanokristalle an 5'-Aminmarkierte Oligonukleotide zu komplexieren.
  • Eine Lösung von in THF gelösten Nanokristallen mit MUA-Kappen wird unter Verwendung von Kalium-tert-butoxid deprotoniert. Das resultierende Gel wird zwei Mal mit THF gewaschen, zentrifugiert und der folgende Überstand wird verworfen. Der Endrückstand wird luftgetrocknet und gewogen. Dem getrockneten Rückstand wird entionisiertes Wasser zugegeben, und es wird geschüttelt, bis eine klare Lösung entsteht. Ein Aliquot der Lösung wird entsalzt und unter Verwendung eines Ultrafree-4-Konzentrators (Millipore) zwei Mal aufkonzentriert. Nach jeder Aufkonzentration wird das Konzentratorröhrchen mit entionisiertem Wasser versetzt.
  • Die Menge an Nanokristallen wird von dem Verhältnis der Volumina der Aliquote und des Gesamtvolumens an verwendetem Wasser abgeschätzt. Bezogen auf die Menge an Nanokristallen werden ein molares Äquivalent von 5'-Amin-markiertem Oligonukleotid und 10 molare Äquivalente von EDC (Pierce, Molgewicht = 192) in Wasser gelöst. Der pH-Wert dieser Lösung wird auf 8,5 eingestellt. Diese Lösung wird dann der Lösung von Nanokristallen, die in dem vorangehenden Teil beschrieben ist, zugegeben und für 2–3 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Die Reaktion wird gestoppt, indem die Lösung durch einen 0,2 Mikron Millipore-Filter geleitet wird, und indem das Filtrat unter Verwendung eines Ultrafree-4-Konzentrators aufkonzentriert wird.
  • Die Konjugation der Nanokristalle an das Oligonukleotid wird unter Verwendung eines im nächsten Beispiel beschriebenen Protokolls überprüft.
  • Beispiel 10
  • Halbleiter-Nanokristall-Oligonukleotid-Komplexbildungsüberprüfung
  • Die gleiche Säule, die zur Bestätigung der Biotin-Nanokristall-Bildung verwendet wird, kann modifiziert werden, um eine Oligo-Nanokristall-Komplexbildung zu überprüfen. Eine Lösung von 5'-Biotin-markiertem Oligonukleotid, mit einer komplementären Sequenz zu dem Oligonukleotid, das mit den Nanokristallen komplexiert wird, wird durch eine Ultra-Link (Pierce Chemicals)-Säule mit immobilisiertem Avidin geleitet. Das Biotin bindet an das Avidin; um eine immobilisierte Oligonukleotid-Säule zu bilden. Die Oligonukleotid-Nanokristall-Konjugation wird dann überprüft, indem die Lösung des Oligonukleotid-Nanokristall-Komplexes über diese Säule geleitet wird. Man lässt komplementäre DNA-Sequenzen bei der geeigneten Hybridisierungstemperatur für 12 Stunden, wie es durch Standardverfahren berechnet wird, hybridisieren (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989). Nach der Hybridisierung wird die Säule mit Wasser gewaschen, um jegliche ungebundenen Oligonukleotid-Nanokristall-Komplexe zu entfernen. Eine erfolgreiche Oligonukleotid-Nanokristall-Konjugation und anschließende Hybridisierung an die komplementäre Oligonukleotid-Säule sollte zu einer Säule führen, die mit dem geeigneten Anregungslicht fluoresziert. Keine Fluoreszenz weist darauf hin, dass die Farbe durch Eluierung verschwunden ist, und dass zwischen den Nanokristallen und dem Oligonukleotid kein Komplex gebildet wurde.

Claims (41)

  1. Zusammensetzung umfassend: ein erstes Element eines Bindepaares; und einen Kern aus einem Halbleiter-Nanokristall, der mit dem ersten Element verbunden ist, wobei der Nanokristall eine äußere Schicht besitzt, die einen Liganden umfasst, der einen ersten Teil mit wenigstens einer Bindungsgruppe für die Verbindung zum Nanokristall hat, und einen zweiten Teil, der wenigstens eine hydrophile Gruppe enthält.
  2. Zusammensetzung nach Anspruch 1, des Weiteren umfassend: eine den nanokristallinen Kern beschichtende Schale, wobei die Schale ein Halbleiter-Material mit einer Bandlücke umfasst, die größer als diejenige des nanokristallinen Kerns ist.
  3. Zusammensetzung nach Anspruch 1 oder 2, worin die Verbindung des ersten Elementes des Bindepaares zum Nanokristall ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus kovalenter, nicht-kovalenter, hydrophober, hydrophiler, elektrostatischer, magnetischer Verbindung oder aus koordinativer Bindung durch einen Metallkomplex.
  4. Zusammensetzung nach Anspruch 1 oder 2, worin die wenigstens eine hydrophile Gruppe räumlich von der Bindungsgruppe getrennt ist durch eine hydrophobe Region, die ausreicht, um eine Übertragung von Elektronenladung über die hydrophobe Region hinweg zu verhindern.
  5. Zusammensetzung nach Anspruch 4, worin das erste Element des Bindepaares mit dem zweiten Teil des Liganden verbunden ist.
  6. Zusammensetzung, umfassend: a) einen wasserlöslichen Halbleiter-Nanokristall, der i) einen Kern mit einem Halbleiter-Material und ii) eine kernumhüllende Schale mit einem Halbleiter-Material umfasst; b) einen Liganden mit einem ersten Teil, der wenigstens eine Verknüpfungsgruppe umfasst, und mit einem zweiten Teil, der eine hydrophile Gruppe umfasst, wobei die Verknüpfungsgruppe mit dem Nanokristall verknüpft ist; und c) ein erstes Element eines Bindepaares, das mit dem zweiten Teil des Verknüpfungsmittels verbunden ist.
  7. Zusammensetzung nach Anspruch 4 oder 6, worin der nanokristalline Kern ein Halbleiter der Gruppe II–VI, Gruppe III–V oder Gruppe IV ist.
  8. Zusammensetzung nach Anspruch 4 oder 6, worin der Kern CdS, CdSe, CdTe, ZnS, ZnSe, ZnTe, MgTe, GaAs, GaP, GaSb, GaN, HgS, HgSe, HgTe, InAs, InP, InSb, InN, AIAs, AIP, AISb, AIS, PbS, PbSe, Ge, Si, eine Legierung davon, oder eine Mischung davon umfasst.
  9. Zusammensetzung nach Anspruch 6, 7 oder 8, worin die Schale ZnO, ZnS, ZnSe, ZnTe, CdO, CdS, CdSe, CdTe, MgS, MgSe, GaAs, GaN, GaP, GaSb, HgO, HgS, HgSe, HgTe, InAs, InN, InP, InSb, AIAs, AIN, AIP, AISb, eine Legierung davon, oder eine Mischung davon umfasst.
  10. Zusammensetzung nach Anspruch 6, 7 oder 8, worin der Kern CdSe und die Schale ZnS ist.
  11. Zusammensetzung nach Anspruch 1, 4 oder 6, worin der Ligand umfasst: (a) ein Molekül mit der Strukturformel (I), HzX((CH2)nCO2H)y(I) oder ein Salz davon, wobei X den ersten Teil des Liganden darstellt und S, N, P oder O=P ist, n größer oder gleich 6 ist, und z und y so ausgewählt werden, dass die Valenzanforderungen von X erfüllt werden; (b) ein Molekül mit der Strukturformel (II),
    Figure 00740001
    wobei Y die hydrophile Einheit ist, Z eine hydrophobe Region mit einem Grundgerüst von wenigstens 6 Atomen ist, X und X' einzeln oder zusammen die Verknüpfungsgruppen darstellen, gleich oder verschieden sind, und aus der Gruppe S, N, P und O=P ausgewählt sind, oder so mit einander verknüpft sind, dass sie durch koordinative Bindung an die Oberfläche des Nanokristalls einen 5- bis 8-gliedrigen Ring ausbilden; oder (c) ein Molekül mit der Strukturformel (III),
    Figure 00750001
    wobei Y die hydrophile Einheit ist, Z eine hydrophobe Region mit einem Grundgerüst von wenigstens 6 Atomen ist, X, X' und X" einzeln oder zusammen die Verknüpfungsgruppen darstellen, gleich oder verschieden sind, und aus der Gruppe S, N, P und O=P ausgewählt sind, oder so mit einander verknüpft sind, dass sie durch koordinative Bindung an die Oberfläche des Nanokristalls einen 5- bis 8-gliedrigen Ring ausbilden.
  12. Zusammensetzung nach Anspruch 11, worin der erste Teil des Liganden eine Einheit umfasst, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Aminen, Thiolen, Phosphinen, Phosphinoxiden und Aminooxiden.
  13. Zusammensetzung nach Anspruch 5, 6 oder 11, worin die hydrophile Gruppe ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Carboxylaten, Sulfonaten, Phosphaten, Polyethylenglykol und anderen Polyolen, Ammoniumsalzen, Hydroxid, Alkoxiden, Phosphat und Phosphonat.
  14. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 13, worin der Kern ein Element einer monodispersen Population von Partikeln ist.
  15. Zusammensetzung nach Anspruch 14, wobei die Population monodisperser Partikel dadurch gekennzeichnet ist, dass die Population unter Bestrahlung Licht in einem Spektralbereich von weniger als etwa 40 nm Halbwertsbreite (FWHM), bevorzugt von weniger als etwa 25 nm FWHM emittiert.
  16. Zusammensetzung nach Anspruch 14, wobei die Population monodisperser Partikel dadurch gekennzeichnet ist, dass sie im Kerndurchmesser eine Abweichung des mittleren quadratischen Fehlers von nicht mehr als etwa 10%, bevorzugt eine Abweichung des mittleren quadratischen Fehlers von nicht mehr als etwa 5% beim Kerndurchmesser aufweist.
  17. Zusammensetzung nach Anspruch 5 oder 6, worin das erste Element ein Protein, ein Oligonucleotid, ein Enzyminhibitor, ein Polysaccharid oder ein kleines Molekül mit einem Molekulargewicht von weniger als etwa 1500 g/mol ist.
  18. Zusammensetzung nach Anspruch 5 oder 6, worin das erste Element ein Antikörper, Avidin, Streptavidin, Biotin oder Anti-Digoxigenin ist.
  19. Verfahren zur Detektion eines Zielanalyten in einer Probe, die den Analyten enthält oder die ihn vermutlich enthält, worin der Analyt ein zweites Element des Bindepaares ist, umfassend die Schritte: Bereitstellung der Zusammensetzung nach Anspruch 5 oder 6; Vermischung der Probe mit der Zusammensetzung; und Detektion der Bindung des ersten Elementes des Bindepaares und des zweiten Elementes des Bindepaares mittels Kontrolle der spektralen Emission der Probe, wobei die Intensität und/oder Wellenlänge der Emission mit der Anwesenheit und/oder Menge des Analyten in der Probe in Zusammenhang gebracht wird.
  20. Multiplex-Verfahren zur Detektion von Analyten in einer Probe, die einen oder mehrere der Analyten enthält oder diese vermutlich enthält, worin die Analyten zweite Elemente von Bindepaaren sind, umfassend: (a) Bereitstellung einer Menge von zwei oder mehreren der Zusammensetzungen nach Anspruch 5 oder 6, wobei jedes der Elemente aus dieser Menge dadurch gekennzeichnet ist, dass (i) der Nanokristall ein Emissionsspektrum besitzt, das von den anderen Elementen dieser Menge verschieden ist, und (ii) das erste Bindeelement des Bindepaares ein entsprechendes zweites Bindeelement besitzt, das von anderen zweiten Bindeelementen in der Probe verschieden ist; (b) Vermischung der Menge von Zusammensetzungen mit der Probe; und (c) zeitgleiche Detektion der Bindung der ersten Elemente der Bindepaare und der zweiten Elemente der Bindepaare mittels Kontrolle der spektralen Emissionen der Probe, wobei die Intensität und/oder Wellenlänge der Emissionen mit der Anwesenheit und/oder Menge von Analyten in der Probe in Zusammenhang gebracht wird.
  21. Verwendung eines Halbleiter-Nanokristalls als eine Markierung für wenigstens ein Element eines biologischen Bindepaares, wobei der Nanokristall eine äußere Schicht besitzt, die einen Liganden umfasst, der einen ersten Teil mit wenigstens einer Verknüpfungsgruppe für die Verbindung zum Nanokristall aufweist, und der einen zweiten Teil mit wenigstens einer hydrophilen Gruppe aufweist.
  22. Verwendung nach Anspruch 21, worin die Markierung erreicht wird durch kovalente, nicht-kovalente, hydrophobe, hydrophile, elektrostatische oder magnetische Verbindung, oder durch koordinative Bindung über einen Metallkomplex.
  23. Verwendung nach Anspruch 21 oder Anspruch 22, worin der Nanokristall wasserlöslich ist.
  24. Verwendung eines wasserlöslichen Halbleiter-Nanokristalls zur Markierung eines biologischen Moleküls oder Ereignisses, worin der wasserlösliche Halbleiter-Nanokristall eine äußere Schicht mit wenigstens einer hydrophilen Gruppe aufweist.
  25. Verfahren zur Kennzeichnung eines biologischen Moleküls oder Ereignisses mit einem fluoreszierenden Kennzeichen, worin das Kennzeichen ein Halbleiter-Nanokristall ist, bei dem das Fluoreszenz-Emissionsspektrum von der Größe des Nanokristalls abhängig ist, wobei der Nanokristall eine äußere Schicht aufweist, die einen Liganden umfasst, der einen ersten Teil mit wenigstens einer Verknüpfungsgruppe für die Verbindung zum Nanokristall besitzt, und der einen zweiten Teil mit wenigstens einer hydrophilen Gruppe besitzt.
  26. Verfahren zur Kontrolle des Fluoreszenz-Emissionsspektrums einer in einem biologischen System verwendeten fluoreszierenden Einheit, das die Auswahl eines Halbleiter-Nanokristalls mit dem gewünschten Fluoreszenz-Emissionsspektrum und Verwendung des ausgewählten Nanokristalls als fluoreszierende Einheit umfasst, wobei der Nanokristall eine äußere Schicht mit einem Liganden besitzt, der einen ersten Teil mit wenigstens einer Verknüpfungsgruppe für die Verbindung zum Nanokristall aufweist, und der einen zweiten Teil mit wenigstens einer hydrophilen Gruppe aufweist.
  27. Verwendung eines wasserlöslichen Halbleiter-Nanokristalls mit einer äußeren Schicht, die wenigstens eine hydrophile Gruppe aufweist, als ein fluoreszierendes Kennzeichen in der Immunchemie, ggf. in der Immunocytochemie oder in einem Immunoassy, in der DNA-Sequenzanalyse, als ein fluoreszierendes Kennzeichen beim Fluoreszenz-Resonanzenergietransfer zur Bewertung der Nähe von zwei oder mehreren biologischen Komponenten zueinander, als ein fluoreszierendes Kennzeichen in der Durchflusszytometrie oder in einem fluoreszenz-aktivierten Zellsortierer, als ein fluoreszierendes Kennzeichen bei einer diagnostischen In-vitro-Methode oder als ein fluoreszierendes Kennzeichen in der biologischen Bildgebung.
  28. Verwendung nach einem der Ansprüche 21 bis 24, oder 27, oder Verfahren nach Anspruch 25 oder Anspruch 26, worin zwei oder mehr solcher Nanokristalle verwendet werden.
  29. Verwendung nach Anspruch 28, worin bis zu zwanzig Nanokristalle unterschiedlicher Größe simultan verwendet werden, wobei jeder ein unterschiedliches Emissionsspektrum aufweist.
  30. Verfahren nach Anspruch 19 oder 20, worin die Kontrolle der spektralen Emission bei Untersuchungen angewendet wird, die ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus: Immunchemie, Immunocytochemie, Immunoassay, Immunofluoreszenz, DNA-Sequenzanalyse, Fluoreszenz-Resonanzenergietransfer, Durchflusszytometrie, fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung, diagnostische Verfahren in biologischen Systemen und Hochdurchsatz-Screening.
  31. Verfahren nach Anspruch 19 oder 20, worin das erste Element eines Bindepaares Teil eines Molekülkomplexes ist, der mit einer biologischen Komponente Wechselwirken kann.
  32. Verfahren nach Anspruch 19 oder 20, worin die spektrale Emission auf eine gewünschte Wellenlänge abstimmbar ist, indem die Größe des Nanokristalls kontrolliert wird.
  33. Verfahren nach Anspruch 19 oder 20, worin die Wechselwirkung zwischen dem zweiten Element und der Zusammensetzung kovalente Wechselwirkung umfasst.
  34. Verfahren nach Anspruch 19 oder 20, worin die Wechselwirkung zwischen dem zweiten Element und der Zusammensetzung nicht-kovalente Wechselwirkung umfasst.
  35. Verfahren nach Anspruch 34, worin die nicht-kovalente Wechselwirkung hydrophobe Wechselwirkung, hydrophile Wechselwirkung, elektrostatische Wechselwirkung, Van-Der-Waals-Wechselwirkung oder magnetische Wechselwirkung umfasst.
  36. Verfahren nach Anspruch 19 oder 20, worin das zweite Element ein kleines Molekül, Protein, Peptid, einen Antikörper, eine Nukleinsäure, eine Aminosäure, einen Liganden, ein Antigen, eine Zelle oder eine subzelluläre Organelle umfasst.
  37. Verfahren nach Anspruch 36, worin das zweite Element eine Nukleinsäure ist, umfassend DNA oder RNA.
  38. Verfahren nach Anspruch 19 oder 20, worin die spektrale Emission Information über einen biologischen Zustand oder über ein Ereignis liefert.
  39. Verfahren nach Anspruch 19 oder 20, worin die spektrale Emission Information über die Menge an biologischer Einheit in der Probe liefert.
  40. Verfahren nach Anspruch 19 oder 20, worin die spektrale Emission Information über die Anwesenheit der biologischen Einheit in der Probe liefert.
  41. Verfahren nach Anspruch 38, worin der biologische Zustand oder das Ereignis biologische Wechselwirkungen, biologische Prozesse, Veränderungen von biologischen Prozessen, Veränderungen von biologischen Einheiten, Struktur von biologischen Einheiten, Zusammensetzung von biologischen Einheiten, Konformation von biologischen Einheiten oder Lokalisation von biologischen Einheiten umfasst.
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