DE202012013668U1

DE202012013668U1 - Enzymquantifizierung

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Publication number: DE202012013668U1
Application number: DE202012013668.2U
Authority: DE
Original assignee: Raindance Technologies Inc
Current assignee: Bio Rad Laboratories Inc
Priority date: 2011-06-02
Filing date: 2012-06-01
Publication date: 2019-04-18
Anticipated expiration: 2022-06-02
Also published as: WO2012167142A3; EP3709018A1; EP2714970A4; EP2714970B1; US20210088519A1; US20120264646A1; US20170131279A1; US20140295421A1; WO2012167142A2; US20200249230A1; EP3216872A1; US20190094226A1; US9556470B2; EP3216872B1; US11187702B2; US10533998B2; US11754499B2; EP2714970A2; US20200225232A1; US10139411B2

Abstract

Mikrofluidische Einrichtung zum Identifizieren von Komponenten einer chemischen Reaktion, wobei die Einrichtung umfasst:
eine Vorrichtung zum Bilden von Flüssigkeits-Teilmengen;
einen Mechanismus zum Bereitstellen von Komponenten einer chemischen Reaktion, wobei mindestens eine der Komponenten eine detektierbare Markierung umfasst, auf die die chemische Reaktion wirkt;
einen Detektor zum Detektieren einer oder mehrerer Eigenschaften der detektierbaren Markierung in den Flüssigkeits-Teilmengen; und
eine Einheit zum Bestimmen einer Menge mindestens einer der Komponenten basierend darauf.

Description

Querverweis auf verwandte Anmeldung
Diese Anmeldung beansprucht die Nutznießung der vorläufigen US-Patentanmeldung Nr. 61/492,602 , eingereicht am 2. Juni 2011, deren Inhalt in seiner Gesamtheit hier durch Verweis einbezogen ist.
Gebiet der Erfindung
Die Erfindung betrifft generell Verfahren zum Quantifizieren einer Menge an Enzymmolekülen.
Stand der Technik
Enzym-Assays werden zum Messen einer enzymatischen Aktivität angewendet, die ein Maß der Menge an aktivem Enzym ist, welche bei einer Reaktion vorhanden ist. Enzym-Assays sind wichtig beim Analysieren von Enzymkinetik und Enzyminhibition. Die Enzymkinetik bezieht sich auf chemische Reaktionen, die von Enzymen katalysiert werden. Bei der Enzymkinetik wird die Reaktionsrate gemessen und werden die Effekte des Variierens der Bedingungen der Reaktion untersucht. Die Enzymkinetik zeigt den katalytischen Mechanismus eines Enzyms, seine Rolle beim Stoffwechsel, wie seine Aktivität gesteuert wird und wie ein Arzneimittel oder ein Gift das Enzym inhibieren kann.
Überblick
Mit der Erfindung werden Verfahren zum Identifizieren und Quantifizieren des Vorhandenseins, des Typs und der Menge von Reaktionspartnern und Produkten von chemischen Reaktionen geschaffen. Bei der Erfindung wird die Fähigkeit zum Bilden von diskreten Tropfen genutzt, die die Komponenten einer chemischen Reaktion enthalten. Da Messungen an einzelnen Tropfen und einer Ansammlung von einzelnen Tropfen durchgeführt werden können, ist es möglich, Komponenten von chemischen Reaktionen in den Tropfen gemäß den hier beschriebenen Verfahren zu identifizieren und zu quantifizieren. Die erfindungsgemäßen Verfahren sind nützlich zum Detektieren und/oder Quantifizieren jeglicher Komponente einer chemischen Reaktion. Bei einer bevorzugten Ausführungsform werden Enzymmoleküle auf der Basis ihrer Aktivität in den einzelnen Tropfen quantifiziert. Zum Identifizieren und Quantifizieren einer Enzymaktivität werden Tropfen als „negative“ und/oder „positive“ Tropfen für die durch das Target-Enzym katalysierte Reaktion identifiziert und wird die Anzahl von Enzymmolekülen in positiven Tropfen (z.B. auf der Basis der quantifizierten Signalstärke) ermittelt. Ein digitales Zählen von Enzymmolekülen bietet einen außerordentlich breiten dynamischen Detektionsbereich mit einer Detektion der Untergrenze in Abhängigkeit von der Anzahl von zur Zählung zur Verfügung stehenden Molekülen und der Gesamtanzahl von abgelesenen Tropfen (z.B. 1 in 10⁷ in einer Stunde bei einer Tropfenfließrate von 10⁷ pro Stunde) und einer Obergrenze für eine Einzel-Molekül-Zählung, die von der Anzahl von Tropfen bestimmt wird, aber auch einen weiteren Bereich aufweist, in dem mehrere oder eine mittlere Anzahl von Molekülen in den Tropfen vorhanden sind.
Generell betrifft die Erfindung das Eintragen von Komponenten einer chemischen Reaktion in einen Tropfen und das Ermöglichen des Auftretens der chemischen Reaktion in dem Tropfen. Eine oder mehrere der Komponenten der Reaktion werden derart detektierbar markiert (z.B. mit einem Reportermolekül), dass die Markierung infolge der Reaktion detektierbar ist (z.B. Freisetzen eines Reporters). Detektion und Quantifizierung der Markierung ermöglichen Detektion und Quantifizierung der Reaktionskomponenten. Der Reporteranteil kann jeder detektierbare Rest sein, der als Indikator von Reaktionskomponenten verwendet werden kann (z.B. Enzymaktivität). Jegliches Reportersystem, das beim Stand der Technik bekannt ist, kann bei den erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden. Bei bestimmten Ausführungsformen ist der Reporterrest ein fluoreszierender Rest.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform haftet ein Reporter an einem oder mehreren Substrat(en) einer chemischen Reaktion in einem Tropfen, wobei das Label bei der enzymatischen Katalyse freigesetzt wird. Die Anzahl von Tropfen, die quantifizierte Enzymmoleküle enthalten, wird dann auf der Basis des Vorhanden-seins und/oder der Signalstärke des Reporters bestimmt. Der Reporter (und somit das Enzym) kann ebenfalls auf der Basis dieser Messungen quantifiziert werden. Die erfindungsgemäßen Verfahren umfassen das Bilden eines Probentropfens. Jegliche auf dem Sachgebiet bekannte Technik zum Bilden von Probentropfen kann bei den erfindungsgemäßen Verfahren angewendet werden. Ein beispielhaftes Verfahren umfasst das Leiten eines Stroms einer Probenflüssigkeit derart, dass der Probenstrom einen oder mehrere entgegengesetzte Ströme einer fließenden Trägerflüssigkeit kreuzt. Die Trägerflüssigkeit ist mit der Probenflüssigkeit unmischbar. Das Kreuzen der Probenflüssigkeit mit den zwei entgegengesetzten Strömen der fließenden Trägerflüssigkeit führt zu einem Aufteilen der Probenflüssigkeit in einzelne Probentropfen. Die Trägerflüssigkeit kann jegliche Flüssigkeit sein, die mit der Probenflüssigkeit unmischbar ist. Eine beispielhafte Trägerflüssigkeit ist Öl, das in einigen Fällen fluoriert sein kann. Bei bestimmten Ausführungsformen weist die Trägerflüssigkeit ein Tensid, wie z.B. ein Flurtensid, auf.
Bei einigen Aspekten werden mit der Erfindung Verfahren für Digital-Verteilungs-Assays geschaffen, die zum Beispiel eine Detektion eines physiologischen Zustands bei einem Menschen ermöglichen. Detektierbare physiologische Zustände umfassen Zustände in Zusammenhang mit einer Aggregation von Proteinen oder anderen Targets. Die Verfahren umfassen das Bilden von Flüssigkeits-Teilmengen, die Komponenten einer detektierbaren chemischen Reaktion umfassen, und das Ausführen der Reaktion. Eine Verteilung von mindestens einer der Komponenten wird auf der Basis des Detektierens der detektierbaren Reaktion ermittelt. Eine statistisch erwartete Verteilung kann berechnet und mit der ermittelten Verteilung verglichen werden, oder es erfolgen Vergleiche von Verteilungen von bekannten oder typischen Proben. Auf der Basis dieser Vergleiche können das Vorhandensein und/ oder die Schwere des potenziellen Zustands ermittelt werden. Bei bestimmten Ausführungsformen umfasst der Zustand eine Proteinaggregation. Das Protein kann ein Protein aus einer Probe eines Patienten sein. Bei einigen Ausführungsformen werden mit den Verfahren Assays hinsichtlich der Alzheimer-Krankheit, Parkinson-Krankheit, Huntington-Krankheit, Diabetes mellitus Typ II, mit Prionen in Zusammenhang stehende Krankheiten oder anderer Zustände durchgeführt.
Ein weiteres Tropfenbildungsverfahren umfasst das Verschmelzen von mindestens zwei Tropfen, wobei jeder Tropfen ein unterschiedliches Material aufweist. Ein weiteres Tropfenbildungsverfahren umfasst das Bilden eines Tropfens aus einer Probe und das Inkontaktbringen des Tropfens mit einem Flüssigkeitsstrom, wobei ein Teil des Flüssigkeitsstroms in den Tropfen integriert wird, um einen Tropfen zu bilden. Ein elektrisches Feld kann an den Tropfen und den Flüssigkeitsstrom angelegt werden. Das elektrische Feld unterstützt das Aufbrechen der Grenzfläche, die die zwei Flüssigkeiten trennt. Bei besonderen Ausführungsformen ist das elektrische Feld ein hochfrequentes elektrisches Feld.
Die erfindungsgemäßen Verfahren können in mikrofluidischen Kanälen durchgeführt werden. Somit können bei bestimmten Ausführungsformen die erfindungsgemäßen Verfahren ferner das Leiten durch die Tropfenkanäle und unter mikrofluidischer Steuerung umfassen.
Figurenliste

1A-1G zeigen eine Tropfenbildung und Detektion von reaktionspositiven Tropfen.
2A-2D zeigen Ablesewerte von Zeitkurven bei verschiedenen Enzymkonzentrationen. Die Zeitkurven zeigen digitale Reaktionen in Tropfen bei niedrigen Enzymkonzentrationen.
3A-3D zeigen Ablesewerte von Histogrammen. Durch erhöhte Enzymkonzentrationen verschiebt sich die Verteilung von einer quantifizierten zu einer mittleren Ordnung.
4A und 4B stellen eine Konzentrationsbestimmung unter Verwendung von digitalen Tropfendaten dar. Eine digitale Zählmessung einer Enzymkonzentration stimmt mit einer bekannten Anfangsmenge überein.
5 ist eine schematische Darstellung einer sandwichartigen Ausbildung für einen Digital-Tropfen-ELISA.
6A-6D stellen unterschiedliche Digital-Tropfen-ELISA-Anzeige-Zählmodi dar.
7A und 7B zeigen Ausführungsformen zum Multiplexen eines digitalen Assay.
8A und 8B zeigen eine Fluoreszenzpolarisation als weiteren Modus zum Ablesen.
9A und 9B stellen eine lokalisierte Fluoreszenz als weiteren Modus zum Ablesen dar.
10 stellt einen digitalen kompetitiven allelspezifischen Enzym- (digital competitve allele specific enzyme - CASE) Assay dar.
11A-11C zeigen Multiplex-Ausführungsformen.
12A und 12B zeigen einen Arbeitsablauf für einen Lokalisierte-Fluoreszenz-Bindungs-Assay.
13 zeigt eine Monozytendetektion gemäß bestimmten Ausführungsformen.
14A-14C stellen einzelne Tropfenkurven einschließlich optischer Markierungen dar.
15A-15C zeigen einzelne Tropfenkurven mit einer Streudarstellung und einem Histogramm.
16A-16C sind schematische Darstellungen des Einstellens eines Dynamikbereichs eines Lokalisierte-Fluoreszenz-Assays.
17 ist eine Zeichnung mit Darstellung einer Vorrichtung für die Tropfenbildung.
18 ist eine Zeichnung mit Darstellung einer Vorrichtung für die Tropfenbildung.
19 ist ein Diagramm von Ergebnissen eines Digital-Verteilungs-Assays.

Detaillierte Beschreibung
Es werden hier Verfahren zum Zählen von Enzymmolekülen in Flüssigkeits-Teilmengen, wie zum Beispiel Mikrotropfen, beschrieben. Es wird eine Anzahl von Ablesemodi und Multiplexformaten dargestellt, und es werden Beispiele für mit der digitalen Ablesung gekoppelte Assays gezeigt.
Bei einigen Ausführungsformen umfassen die erfindungsgemäßen Verfahren einen Sandwich-Immunassay, der das absolute Zählen von Proteinmolekülen in einer Probe (Digital-Tropfen-ELISA) ermöglicht. Es kann jeglicher Upfront-Assay angewendet werden, bei dem eine chemische Reaktion, bei der mindestens eine Komponente ein detektierbares Label (z.B. ein Reporterenzymsystem) aufweist, verwendet wird. Es kann jegliche geeignete detektierbare Markierung enthalten sein (z.B. ein fluoreszierendes Produkt oder ein anderes optisches oder detektierbares nichtoptisches Produkt) und bei dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden.
Bei bestimmten Ausführungsformen werden mit der Erfindung Verfahren zur direkten Detektion und Quantifizierung von enzymatisch aktiven Molekülen, die potenziell in Proben enthalten sind (z.B. Bioprospektion) geschaffen. Reportersubstrate, die für das Target-Enzym oder die Enzymklasse spezifisch sind, werden für einen Assay von enzymenthaltenden Proben verwendet (oder gekoppelte Enzyme und Substratreporter um an ein anderes Enzymmolekül anzuzeigen). Zum Beispiel kann eine Probe erhalten werden, bei der vermutet wird, dass sie ein interessierendes Target-Molekül oder ein Target-Molekülelement einer interessierenden Klasse enthält. Die Probe kann in eine Vielzahl von Flüssigkeits-Teilmengen verteilt werden. Ferner kann dort, wo eine spezifische Aktivität oder ein spezifischer Anteil von Interesse ist oder wenn Enzyme, die einen Bereich oder Schwellwert einer spezifischen Aktivität aufweisen, von Interesse sind, eine große Anzahl von Targets unter Anwendung von erfindungsgemäßen Verfahren und Systemen einem Assay unterzogen werden. Die Targets können zwischen einer Vielzahl von Flüssigkeits-Teilmengen verteilt werden, und jede Teilmenge kann mit Reagenzien für eine bestimmte enzymkatalysierte Reaktion versehen sein. Das Auftreten der Reaktion in bestimmten Teilmengen kann detektiert werden. Wahlweise können unter Anwendung von Sortierverfahren enzympositive Teilmengen zur weiteren Analyse isoliert werden. Somit kann ein einzelnes Target (oder eine sehr kleine Menge eines Targets), selbst ein unbekanntes Target, entsprechend der Aktivität identifiziert und isoliert werden. Eine weitere Diskussion findet sich bei Miller et al., PNAS 109(2):378-383 (2012); Kiss, et al. Anal Chem. 80(23):8975-8981 (2008); und Brouzes et al. Droplet microfluid technology for single-cell high throughput screening, 10.1073(PNAS.0903542106 (15. Juli 2009), deren Inhalt hier in seiner Gesamtheit durch Verweis einbezogen ist.
Die erfindungsgemäßen Verfahren ermöglichen die Detektion von zwei oder mehr Enzymmolekülen oder anderen Molekülen in einem Komplex, die unter Verwendung eines enzymatischen Reporters oder eines anderen aktivierbaren und ablesbaren Reporters einem Assay unterzogen werden können (z.B. Proteinaggregations-Assay hinsichtlich fehlgefalteter oder mit einer Krankheit in Zusammenhang stehender Moleküle). Die Verfahren umfassen das Bereitstellen von separat detektierbaren Substraten für jede Enzymspezies, wobei Komplexe/Aggregate mittels unterschiedlicher Produktkonzentrationen unter Verwendung des gleichen Enzymtyps detektiert werden. Ein Komplex kann detektiert werden, wenn beide Produktsignale in derselben Flüssigkeits-Teilmenge detektiert werden, selbst wenn die Teilbelegung niedrig ist. Zum Beispiel besteht bei sehr niedrigen Teilbelegungen eine verschwindend geringe Wahrscheinlichkeit, dass die zwei Enzyme in einer bestimmten Anzahl von gleichen Flüssigkeits-Teilmengen, wenn nicht gar in einem gemeinsamen Komplex (modelliert entsprechend der Poisson-Statistik) zu finden sind. Somit zeigt die Detektion beider Produktsignale eine Protein-Protein-Interaktion zwischen den zwei Enzymen.
Es wird eine Anzahl von Beispielen gezeigt, bei denen eine „Endpunkt“-Digitalzählung angewendet wird, bei der die enzymatische Reaktion ein Plateau erreicht hat. Es können auch mehr als ein Endpunkt für die Detektion mehrerer Spezies verwendet werden. Die Erfindung umfasst ferner Messungen zu früheren Zeitpunkten während der Reaktion („kinetische“ Messungen versus „Endpunkt“-Messungen), so dass unterschiedliche Signalintensitäten aus einzelnen Enzymmolekülen Unterschiede bei einer enzymatischen spezifischen Aktivität, das Vorhandensein von inhibierenden oder aktivierenden Molekülen oder das Vorhandensein von mehr als einem Enzymmolekül pro Tropfen wiedergeben. Kinetische Messungen können im Anschluss an die Tropfeninkubation bei der angemessenen Temperatur entweder außerhalb des Chips oder auf dem Chip durchgeführt werden. Bei auf dem Chip durchgeführten Messungen kann ein „Zeitsteuerungsmodul“, wie z.B. eine Verzögerungsleitung, verwendet werden, um Tropfen über eine angemessene Zeitdauer auf dem Chip zu halten, und ein oder mehrere Messpunkte entlang der Länge der mikrofluidischen Kanäle können sehr präzise kinetische Messungen ermöglichen. Eine Verzögerungsleitung kann zum Beispiel einen Kanal in einem Chip, durch den die Tropfen fließen, umfassen. Eine Verzögerungsleitung kann Stellen zum Stoppen der Tropfen oder Stellen zum Bewegen der Tropfen aus dem Strom oder Stellen zum Trennen von Tropfen aus dem Öl aufgrund von Auftriebsunterschieden zwischen dem Öl und den Tropfen umfassen. Eine Verzögerungsleitung kann ein Mittel zum Hinzufügen oder Entfernen von Öl zum Beschleunigen oder Verlangsamen der Bewegungsrate der Tropfen durch die Verzögerungsleitung aufweisen. Eine Verzögerungsleitung kann Einschnürungen oder andere Merkmale zum Homogenisieren der mittleren Geschwindigkeit der Tropfen und Minimieren von Dispersionseffekten, wenn sich die Tropfen durch den Kanal bewegen, aufweisen. Eine Tropfenfalle kann zum Einfangen von Tropfen über einen festen Zeitraum vor dem Freigeben der Tropfen verwendet werden. Eine solche Falle kann ein Ventil umfassen oder das Umkehren der Fließrichtung durch die Fallenregion zum Freigeben der eingefangenen Tropfen erfordern oder kann erfordern, dass der Chip umgedreht wird, um die Richtung umzukehren, in der sich die Tropfen im Gravitationsfeld bewegen. Ein Fachmann erkennt eine Anzahl von Wegen zum Regeln der Zeitsteuerung der Reaktion. Ein Abschnitt des Kanals kann einen viel breiteren Querschnittsbereich aufweisen als stromaufwärtige oder stromabwärtige Abschnitte. Somit ist für ein bestimmtes Volumen pro zeitlicher Fließrate die Distanz pro zeitlicher Fließrate in dem breiteren Abschnitt viel geringer. Unter Verwendung von Fluid-Chips und bei bekanntem Tropfenverhalten kann ein Kanal mit einer Verzögerungsleitung ausgelegt sein, die die Strömung für eine vorbestimmte Zeitdauer verzögert. Dadurch kann ermöglicht werden, dass Reaktionen über die angemessene Zeitdauer eine Inkubation bewirken oder fortschreiten. Eine Temperaturregelung spezifischer Regionen kann in den Chipauslegungen enthalten sein und über eine Schnittstelle mit den Chips verbunden sein.
Ein Analyt oder Reportermolekül kann auch Nichtenzym-Spezies enthalten, vorausgesetzt, dass das Molekül oder der Komplex an der Erzeugung eines ablesbaren Signals beteiligt ist (z.B. ein enzymatischer Aktivator oder Inhibitor).
Generell werden mit der Erfindung Verfahren und Systeme zum Messen eines molekularen Target geschaffen. Es wird eine Vielzahl von Flüssigkeits-Teilmengen gebildet. Die Flüssigkeits-Teilmengen können jegliche auf dem Sachgebiet bekannte sein, wie zum Beispiel Wells auf einer Platte oder Wasser-in-ÖI-Tropfen. Eine detektierbare Reaktion, wie z.B. eine enzymkatalytische Reaktion, wird in einem Subsatz der Flüssigkeits-Teilmengen durchgeführt. Wenn zum Beispiel eine Probe, bei der vermutet wird, dass sie das molekulare Target enthält, in die Flüssigkeits-Teilmengen geteilt wird (einschließlich über einen optionalen Verdünnungs- oder einen Seriellen-Verdünnungs-Schritt), enthält der Subsatz der Teilmengen, die das Target enthalten, eine bestimmte Anzahl von Teilmengen. Diese Anzahl kann der Menge an Target in der Probe zugeordnet sein.
Eine detektierbare Reaktion tritt in dem Subsatz von Teilmengen auf, die das molekulare Target enthalten. Bei einigen Ausführungsformen ist das molekulare Target ein Enzym und sind sämtliche Teilmengen mit einem fluoreszenzmarkierten Substrat versehen. Die enzymkatalytische Reaktion kann das Fluoreszenzlabel von dem Substrat freisetzen, so dass die Fluoreszenz ungelöscht werden kann oder durch seine Stelle in der Teilmenge quantifiziert werden kann. Bei bestimmten Ausführungsformen ist das Target ein Substrat und sind sämtliche Teilmengen mit einem Enzym und wahlweise einem zusätzlichen Substrat oder einem Kofaktor versehen. Einer der Reaktionsbestandteile enthält eine molekulare Markierung, die freigesetzt wird, wenn die Reaktion auftritt.
Da eine produktive Reaktion nur innerhalb des Subsatzes der Teilmengen, die das Target enthalten, stattfindet, ermöglicht das Bestimmen der Anzahl von Teilmengen, in denen die Reaktion stattfindet (d.h. Bestimmen der Anzahl des Subsatzes), das Bestimmen der Menge des Target in der Originalprobe. Da jede Teilmenge als reaktionspositiv oder reaktionsnegativ gezählt wird (z.B. in dem Subsatz oder nicht), wird diese Detektion als digital bezeichnet. Dies umfasst Fälle, in denen die Positiven weiter als eine quantifizierte Anzahl von Targets enthaltend quantifiziert werden können.
Bei bestimmten Ausführungsformen erfolgt die digitale Detektion durch eine Reaktion, die eine Anzahl von Phasen umfasst, einschließlich, bei verschiedenen Ausführungsformen, Enzyme, die selbst Substrate für andere enzymkatalytische Reaktionen sind, und Substrate und/oder Enzyme oder Targets, die dunkel sind (d.h. nicht anzeigen), wenn sie an Reaktionen beteiligt sind, und die detektierbar sind, wenn nicht. Es wird bei bestimmten Ausführungsformen dargestellt, dass eine Teilmenge ein Enzym und ein Substrat aufweist, die zusammen das Vorhandensein und die Anzahl von Target-Molekülen anzeigen. Das Substrat ist derart markiert, dass es einen dunklen Zustand aufweist, solange das Enzym vorhanden ist. Ein Target-Molekül, das das Enzym inhibiert, kann entsprechend den hier beschriebenen Schritten einem Assay unterzogen werden. Da das Target das Reporterenzym inhibiert, bewirkt das Vorhandensein des Target, dass der Reporter ein ablesbares Signal erzeugt.
Bei bestimmten Ausführungsformen ist ein Substrat in einer Reaktionsmischung enthalten, und zwar zusammen mit einem Enzym, das eine ablesbare Reaktion des Substrats katalysiert, das enthaltene Enzym liegt jedoch in einer inaktiven Form vor, und Aussetzen des enthaltenen Enzyms mit dem Target-Molekül katalysiert seine Umwandlung in eine aktive Form. Auf diese Weise wird durch das Vorhandensein oder Nichtvorhandensein des Target eine Enzymkaskade initiiert, die zu einem ablesbaren Assay führt (die Kaskade kann mehrere Schritte umfassen) und quantifiziert wird. Bei einer Ausführungsform wird ein Apoenzym zum Detektieren des Vorhandenseins einer Protease verwendet. Das Apoenzym ist in einer Flüssigkeits-Teilmenge mit einem Substrat der aktiven Form des Enzyms vorgesehen. Das Apoenzym wird nur aufgespalten, um die aktive Form zu bilden, wenn die Protease in der Target-Probe vorhanden ist.
Mit der Erfindung werden ferner Verfahren und Systeme zum Detektieren oder Quantifizieren des Vorhandenseins eines Enzyminhibitors oder -aktivators geschaffen. Zum Beispiel können Flüssigkeits-Teilmengen mit einem Enzym und seinem Substrat versehen sein. Eine Probe, bei der vermutet wird, dass sie einen Inhibitor oder Aktivator enthält, wird in die Teilmenge (mit optionaler Verdünnung) getrennt. Das Freisetzen eines Reporters über eine enzymkatalytische Aktivität zeigt das Vorhandensein eines Aktivators oder das Nichtvorhandensein eines Inhibitors an. Ferner können die Enzymkinetik sowie eine Inhibition oder Aktivierung mit den hier beschriebenen Verfahren untersucht werden.
Bei den erfindungsgemäßen Verfahren können jegliche(s) geeignete Enzym(e) oder Substrat(e) verwendet werden. Zum Beispiel kann über die Vielzahl von hier angeführten Beispielen hinaus die Erfindung ferner zum Detektieren einer Aufspaltung eines Peptids durch eine Protease verwendet werden. Wenn bei einer Probe vermutet wird, dass sie eine Protease enthält, kann ein fluoreszenzmarkiertes Peptidsubstrat in den Flüssigkeits-Teilmengen vorgesehen sein.
Als weiteres Beispiel können die erfindungsgemäßen Verfahren die Verwendung eines Polymerase-Enzyms und von fluoreszenzmarkierten Nukleotiden zum Detektieren einer Aktivität einer Ligase verwendet werden. Unter den angemessenen Bedingungen agiert die Polymerase nur auf einem Produkt einer Reaktion, die von der Ligase katalysiert wird (z.B. einem Polynukleotid). Wenn die Polymerase eine Reaktion katalysiert, wird ein Fluoreszenzreporter als ablesbares Signal ausgegeben.
Bei einem weiteren veranschaulichenden Beispiel können das Vorhandensein, der Typ und die Anzahl von Restriktionsenzym(en) durch Bereitstellen eines Konstrukts quantifiziert werden, das einen Oligonukleotid mit einem Fluor und einem Quencher aufweist, die einander nahe genug sind, damit der Quencher das Fluor löscht, jedoch durch eine Restriktionsstelle getrennt sein. Durch das Vorhandensein des Restriktionsenzyms in der Target-Probe wird das beleuchtet, was andernfalls eine dunkle Flüssigkeits-Teilmenge ist. Das Vorhandensein, der Typ und die Anzahl einer Menge an Analyten können unter Verwendung von Restriktionsenzymen, die für die unterschiedlichen ablesbaren Substrate spezifisch sind, einem Assay unterzogen werden oder können zu einem „einer-von-vielen“-Assay konfiguriert sein, wobei sämtliche Analyte das gleiche Restriktionsenzym und Substrat aufweisen, oder können unter Verwendung von Enzym-/Substratklassen zu unterschiedlichen Klassen gruppiert werden.
Bei bestimmten Ausführungsformen werden mit der Erfindung Systeme und Verfahren zum Detektieren und Quantifizieren von Klassen von Enzymen oder Substraten geschaffen. Jegliche Target-Klasse kann Gegenstand eines Assay sein, der zum Beispiel sämtliche Enzyme, die eine bestimmte Aktivität zeigen, oder sämtliche Enzyme in einer bestimmten taxonomischen Gruppe umfasst.
Eine weitere Ausführungsform umfasst einen stromabwärtigen Reporter, der in mehrere Teile gespalten wird (z.B. Spalten von grün fluoreszierendem Protein oder ein gespaltener Enzymreporter), die bei Abwesenheit des stromaufwärtigen Reporters (z.B. Aufspaltung des modifizierten stromabwärtigen Reporters durch den stromaufwärtigen Reporterenzym-Oligo-modifizierten Reporter, der durch die Aktion eines Restriktionsenzym aktiviert wird, oder einen Peptid-modifizierten Reporter, der durch einen Proteasereporter modifiziert wird) nicht produktiv interagieren oder die für eine Aktivität (z.B. werden im Anschluss an das Aufspalten der Inhibitor-Modifikation zwei Anteile eines gespaltenen Enzyms zum Falten und Aktivieren einander nahegebracht) einander sehr nahe gebracht werden müssen. Zwei Unterabschnitte des Reporters können durch einen Oligo, der eine Restriktionsstelle enthält, voneinander getrennt werden, so dass dann, wenn das Restriktionsenzym (oder unter Berücksichtigung, dass ein Enzym wiederum ein Substrat für ein weiteres Enzym sein kann, ein Enzym, das das Restriktionsenzym aktiviert) vorhanden ist, das Oligo aufgespalten wird und die zwei Unterabschnitte zusammenkommen können, um den aktiven Reporter zu bilden. Alternativ kann durch das Aufspalten von vernetzten Anteilen die Inhibition einer Aktivität, die ein ablesbares Signal produziert, aufgehoben werden.
Ein Fachmann erkennt, dass jegliche Anzahl der Beispiele, die hier angeführt sind, kombiniert werden kann, um mehrstufige Assays zu schaffen. Somit kann zum Beispiel ein Restriktionsenzym einen Oligo aufspalten, der zwei Anteile einer Protease trennt. Die aktive Protease kann ein Apoenzym aufspalten, um eine aktive Phosphorylase freizusetzen, die ein stromabwärtiges Enzym phosphoryliert und deaktiviert. Wenn das stromabwärtige Enzym ein Inhibitor eines Endenzyms ist, dann kann die Deaktivierung eines stromabwärtigen Enzyms zu einer Aktivität des Endenzyms führen. Ein Fachmann erkennt die große Vielzahl von Kombinationen der hier angeführten Szenarien, die verwendet werden können.
1A-1G zeigen einen beispielhaften Arbeitsablauf für einen digitalen Tropfen-Reporterenzym-Assay. In 1A werden die zu zählenden Enzymmoleküle mit einem fluorogenen Substrat gemischt und durch Einleitung in eine mikrofluidische Düse in Tropfen geladen. Die wässrige Mischung von Enzym und Substrat fließt in einen Einlasskanal 101 und bildet eine Emulsion bei Verschmelzung mit Öl aus Trägerflüssigkeitskanälen 103a und 103b. In 1A zeigen Pfeile die Fließrichtung an. Durch das Mit-Einfließenlassen von unmischbarem Öl wird die wässrige Strömung in eine Anzahl von gleich großen Tropfen 109 segmentiert.
Die Tropfenemulsion wird für eine Inkubation außerhalb des Chips bei einer angemessenen Temperatur zwecks einer enzymatischen Funktion in einem geeigneten Behälter aufgefangen.
1B stellt einen schematischen Überblick über eine Reaktion gemäß bestimmten Ausführungsformen der Erfindung dar. Generell katalysiert, wie in 1B gezeigt, ein Enzym 113 die Umwandlung eines fluorogenen Substrats 111 in ein fluoreszierendes Produkt 115.
Bei einem Ausführungsbeispiel war das Enzym 113 eine Streptavidin-konjugierte Beta-Galactosidase (β-gal) (Calbiochem-Produkt Nr. 569404 von Merck KGaA (Darmstadt, Deutschland)) und war ein fluorogenes Substrat 111 ein Fluoresceindi-β-galactopyranosid (FDG), verkauft unter dem Markennamen MOLECULAR PRO-BES als Produkt Nummer F1179 von Life Technologies (Carlsbad, CA) mit einem aktiven Enzym, das in der Lage ist, das Substrat aufzuspalten, um als fluoreszierendes Produkt 115 Fluoresceinisothiocyanat (FITC) und zwei Galactose freizusetzen.
Wie in 1C gezeigt, kann nach der Inkubation der Tropfenemulsion bei 37 °C für eine vorbestimmte Zeit die Tropfentemperatur derart verändert werden, dass das Enzym nicht länger das ablesbare Signal beeinträchtigt und die Tropfen in eine zweite mikrofluidische Düse 117 eingeleitet werden können, die unter Verwendung eines unmischbaren Öls in eine Reihe von einzelnen Tropfen beabstandet werden, und an einem Laserfleck 119 vorbeilaufen, der in den mikrofluidischen Kanal 121 fokussiert ist. 1D ist eine Darstellung des Detektionsschritts, wenn kein Enzym vorhanden ist (oder nachdem das Enzym geladen worden ist, jedoch vor der Inkubation). Die Tropfen in 1D zeigen alle eine gleichförmig niedrige Fluoreszenzintensität, was ein Fehlen einer Umwandlung des Substrats 111 in das Produkt 115 anzeigt.
Wie mit Bezug auf 1C-1E diskutiert, kann eine Detektion Tropfen umfassen, die an einem Detektor vorbeifließen. Es kann jedoch jegliches geeignete Verfahren zum Detektieren einer enzymatischen Reaktion in einer Flüssigkeits-Teilmenge angewendet werden, einschließlich zum Beispiel einer optischen oder nichtoptischen Detektion, wie z.B. einer pH-Veränderung oder einer Veränderung der Impedanz oder Leitfähigkeit in einer Flüssigkeits-Teilmenge, oder ein anderes geeignetes Detektionsverfahren. Bei einigen Ausführungsformen umfasst die nichtoptische Detektion eine Nuklear-Magnetresonanz- (NMR) Analyse von Materialien aus Flüssigkeits-Teilmengen. Eine Detektion nach dem Freisetzen der digital erzeugten Reporteranteile aus den Teilmengen kann ebenfalls angewendet werden (z.B. Array-, Elektroden-, Magnet-, Sequenzer-, Massenspektrometer-, andere Verfahren).
1E ist eine Darstellung des Detektionsschritts, wenn eine niedrige Enzymkonzentration vorhanden ist, nach der Inkubation. Der Laserfleck 119 wird zum Detektieren einer Anzahl n von positiven Tropfen 125a, 125b, ..., 125n verwendet. Durch Zählen der Ergebnisse der Laserdetektion wird die Anzahl von Teilmengen (hier Tropfen) in dem Subsatz von Teilmengen, in denen eine enzymkatalysierte Reaktion aufgetreten ist, bestimmt.
Die daraus resultierenden Signalzeitkurven aus Detektions-Photovervielfacherröhren zeigen Beispiele entweder dafür, dass keine Enzymmoleküle geladen worden sind oder nach dem Laden von Enzymmolekülen, jedoch vor der Inkubation (in 1F gezeigt mit einem Insert, der ein gezoomtes Bild von 10 einzelnen Tropfenkurven zeigt), oder Tropfen, die mit einer niedrigen Enzymkonzentration nach der Inkubation erzeugt werden (1G). Die Tropfen, die keine Enzymmoleküle aufweisen (oder Enzymmoleküle aufweisen, die nicht inkubiert worden sind, um eine enzymatische Aktivität zu ermöglichen) zeigen eine gleichförmig niedrige Fluoreszenzsignalintensität, die aus dem nicht umgewandelten fluorogenen Substrat stammt. Für den Fall, in dem eine niedrige Enzymkonzentration verwendet worden ist (siehe 1G), erfolgt ein Laden von Enzymmolekülen in Tropfen auf quantifizierte Weise, wobei die Signalzeitkurve Tropfen, die keine Enzymmoleküle aufweisen (mit ähnlicher Signalintensität wie bei der Erzeugung) und Tropfen mit Enzymmolekülen (die quantifizierte Pegel der Signalintensität, die einer unterschiedlichen Anzahl von Enzymmolekülen pro Tropfen entsprechen zeigen) zeigt.
Die Verteilung der Anzahl von Enzymmolekülen pro Tropfen (d.h. 0, 1, 2, 3 etc. Moleküle pro Tropfen) hängt von der Ausgangs-Enzymkonzentration ab, die in die Tropfen geladen wird, und davon, ob die Enzymmoleküle in undissoziierten Komplexen vorliegen. 2A-2D und 3A-3D stellen dieses Phänomen dar und zeigen die Zeitkurven (2A-2D) und Histogrammverteilungen (3A-3D) für steigende Konzentrationen von β-gal, wie durch die Fluoreszenzintensität von FITC gezeigt ist (niedrigste Konzentration in 2A und 3A gezeigt, höchste Konzentration in 2D und 3D gezeigt). Diese Messungen erfolgten an Tropfen, die ungefähr eine Stunde lang inkubiert worden sind. Wenn die Anfangs-Enzymkonzentration erhöht wird, zeigen die Zeitkurven, dass sich die Anzahl von „negativen“ (kein Enzym) Tropfen verringert, die Anzahl von „positiven“ Tropfen erhöht und die Anzahl von Enzymmolekülen in jeglichem positiven Tropfen erhöht (als höhere Signalintensität zu sehen).
Die Verteilung von Enzymmolekülen in Tropfen kann gemäß der Poisson-Verteilung erfolgen oder kann auf eine Nicht-Poisson-Weise erfolgen. 3A zeigt eine Nicht-Poisson-Verteilung. In einigen Fällen ist der Grad, in dem die Verteilung von einer Poisson-Verteilung abweicht, ein Hinweis auf einen Grad einer Aggregation der Komponenten. In einigen Fällen ist die Interpretation der Abweichung von einer Poisson-Verteilung diagnostisch. In 3A ist die x-Achse die Volt-Achse, und sie zeigt die Reporterintensität gemessen durch einen Photovervielfacher. Es kann ein angemessener Skalierungsfaktor verwendet werden (z.B. separat bestimmt werden), um V in eine Anzahl von Molekülen pro Tropfen umzuwandeln. Wie in 3A gezeigt, kann die erste Spitze bei ungefähr 0,1 V eine Anzahl der Tropfen (d.h. Tropfenzahl) anzeigen, die keine β-gal-Aktivität aufweisen. Die zweite Spitze bei ungefähr 0,23 V kann eine Anzahl von Tropfen anzeigen, die jeweils eine aktive Enzymeinheit aufweisen. Die dritte Spitze bei ungefähr 0,42 V kann eine Anzahl von Tropfen anzeigen, die jeweils zwei aktive Enzymeinheiten enthalten. Die vierte Spitze bei ungefähr 0,58 V kann eine Anzahl von Tropfen anzeigen, die drei aktive Enzymeinheiten enthalten. Die fünfte Spitze bei ungefähr 0,76 V kann eine Anzahl von Tropfen aufweisen, die vier aktive Enzymeinheiten enthalten. 3B-3C zeigen größere Enzymkonzentrationen (d.h. geringere Verdünnung). Bei bestimmten Ausführungsformen würde für ein Enzym, das keine Aggregation oder kovalente oder nicht-kovalenten Komplexbildung zeigt, ein Diagramm bei der in 3A dargestellten Konzentration eine Poisson-Verteilung zeigen. 3A kann anzeigen, dass eine wesentliche und statistisch signifikante Anzahl von Tropfen mehr als eine Enzymeinheit enthält, die durch Poisson vorausgesagt ist. Somit kann 3A zeigen, dass β-gal eine Aggregation zeigt. Wenn die Anfangs-Enzymkonzentration 1,6 pM (2D und 3D) ist, gibt es keine negativen Tropfen und zeigt das Histogramm die meisten Tropfensignale um einen einzelnen mittleren Wert herum zentriert, und zwar mit einer viel kleineren Anzahl, die eine quantifizierte Verteilung zeigt, so wie die, die bei niedrigeren Konzentrationen zu sehen ist (mehrere kleine Spitzen nahe am Ausgangspunkt).

4A und 4B zeigen ein Beispiel dafür, wie diese Daten zum Quantifizieren der Konzentration von aktiven Enzymmolekülen, die in Tropfen geladen sind, verwendet werden können. 4A zeigt ein Ablese-Histogramm aus einer Enzymkonzentration, die mit 0,0128 pM berechnet wurde. Unter Verwendung des Histogramms aus einer Enzymkonzentration, die auf der Basis des Multiplizierens der Anfangskonzentration und des Verdünnungsfaktors (4A) mit 0,0128 pM berechnet worden ist, wird das Mittel jeder Spitze bestimmt und als Funktion ganzzahliger Enzymmoleküle aufgetragen, um eine Linearität zu zeigen (4B). Die Anzahl von Tropfen innerhalb jeder Spitze und die Anzahl von aktiven Enzymmolekülen innerhalb jeder Spitze werden gezählt und tabelliert. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 aufgeführt.

Tabelle 1 Verteilung von # Tropfen mit # Molekülen
Enzym/Tropfen	Tropfen	# Enzymen
0	113458	0
1	15249	15249
2	3637	7274
3	1356	4068
4	536	2144
5	280	1400
6	139	834
7	73	511
>7	138	1405
Gesamt:	137866	32885

Durch Dividieren der Gesamtsumme aus Tabelle 1 (Anzahl von aktiven Enzymmolekülen gegenüber der Gesamtanzahl von gezählten Tropfen) kann eine Anzahl von Molekülen pro Tropfen berechnet werden, wie in Gleichung 1 gezeigt ist. $(⧣ Molekülen-Tropfen) = (32885 / 134866) = 0,24$
Durch Multiplizieren mit den entsprechenden Skalierungsfaktoren kann die gemessene Konzentration (measured concentration - MC) unter Anwendung von Gleichung 2 berechnet werden: $M C (p M) = \frac{⧣ Moleküle}{Tropfen} \times \frac{Tropfen}{V o l u m e n (p L)} \times \frac{1,0 p M}{0,6023 Moleküle/pL}$
Die Verwendung des von Gleichung 1 angegebenen Werts in Gleichung 2 ergibt das in Gleichung 3 gezeigte Ergebnis. $M C (p M) = \frac{0,24 Moleküle}{Tropfen} \times \frac{Tropfen}{30 p L} \times \frac{1,0 p M}{0,6023 Moleküle/pL} = 0,01275 p M$
Für dieses Beispiel war die gemessene Konzentration 0,01275 pM, wobei die erwartete Konzentration auf der Basis eines Verdünnungsfaktors 0,0128 pM ist.
Der Dynamikbereich des Assay kann Ordnungen umspannen, bei denen die Anzahl von Enzymmolekülen in sämtlichen Tropfen diskret quantifiziert ist oder bei denen die Mehrzahl der Tropfen (oder sämtliche Tropfen) eine mittlere (mit einer Verteilung um das Mittel herum) Anzahl von Enzymmolekülen enthält. Für das bei dem Beispiel beschriebene spezifische Format (d.h. Tropfengröße, verwendetes Enzym und Substrat) können typischerweise Enzymkonzentrationen von mehr als ~pM unter Verwendung der mittleren Verteilung (und auch des kleinsten quantifizierten Endes, das nahe dem Ausgangspunkt des Diagramms zu sehen ist, wie in 3D gezeigt) analysiert werden und können Enzymkonzentrationen von weniger als ~pM analysiert werden unter Anwendung des digitalen Zählens der Gesamtanzahl von Tropfen, der Anzahl von Enzym enthaltenden Tropfen und unter Verwendung der quantifizierten Signale aus den Enzym enthaltenden Tropfen zum Zählen der Anzahl von Enzymmolekülen pro Tropfen. Somit ist der Dynamikbereich des Assay außerordentlich breit, wobei die Untergrenze der Detektion mittels der Anzahl von detektierbaren Molekülen, die in der Probe vorhanden sind, und der Zeitdauer, die zum Leiten einer ausreichenden Anzahl von Tropfen durch den Detektor benötigt wird (wenn z.B. das Tropfensystem bei 10⁶ Tropfen pro Stunde läuft, ist die Detektionsgrenze 1 in 10⁶ in einer Stunde und ist die Detektionsgrenze 1 in 10⁷ in 10 Stunden) bestimmt wird und die Obergrenze mittels der Menge an Substrat, das in Produkt umgewandelt wird (wenn die Enzymkonzentration größer wird, muss die Substratkonzentration steigen, damit die Produktfluoreszenz linear (oder korrelativ) auf die mittlere Enzymkonzentration bezogen bleibt) bestimmt wird. Weitere Parameter, die eingestellt werden können, umfassen die Zeit und Temperatur der Inkubation sowie das verwendete Tropfenvolumen und weitere Reaktionskomponenten. Bei bestimmten Ausführungsformen sind die Flüssigkeits-Teilmengen Tropfen und werden Assays in Systemen durchgeführt, in denen Tropfen mit 3.000/s an einem Detektor vorbeigeführt werden. Bei einigen Ausführungsformen werden Tropfen mit 10.000/s oder ungefähr 100.000 pro Sekunde geführt. Bei einigen Ausführungsformen ist eine untere Detektionsgrenze 1 in 10⁹ und ist eine Fließrate 10⁹ pro Stunde.
5 zeigt eine Darstellung des Konzepts und des Arbeitsablaufs für einen Digital-Tropfen-ELISA-Assay, ein Beispiel eines Upfront-Assay, der mit der Ablesung des Digital-Reporterenzym-Assay gekoppelt sein kann. Wenn die Proteinkonzentrationen zu niedrig sind für standardmäßige Detektionsverfahren (typischerweise im unteren Sub-Picomol-Bereich), ermöglicht diese Erfindung eine Proteinquantifizierung durch Zählen der einzelnen Proteinmoleküle mit einer Fluoreszenz-Ablesung. Tropfen, die ein einzelnes Molekül enthalten (z.B. in einem ELISA-Sandwich) sind fluoreszierend, und die Anzahl von fluoreszierenden Tropfen in einer Population von Gesamttropfen ergibt eine digitale Zahl von Molekülen pro Volumen (d.h. Konzentration) bis hinunter zu einer Detektionsgrenze, die nur von der Anzahl von untersuchten Tropfen abhängig ist.
5 zeigt ein beispielhaftes ELISA-Assay-Format und sollte nicht als das einzige oder bevorzugte Format angesehen werden (z.B. können Magnet-Beads im Anschluss an eine Antikörperbindung in einer Lösung hinzugefügt werden). Die proteinenthaltende Probe (drei Proteine in Diamantform mit dem zu zählenden seltenen Target-Protein, das als geschwärzte Diamanten gezeigt ist) wird mit den Bindereagenzien kombiniert und über einen ausreichenden Zeitraum inkubiert zwecks Bindung zu Produktkomplexen.
Bei dem „ELISA-Sandwich-Bildungs-“Schritt wird jedes Target-Proteinmolekül an zwei Affinitätsreagenzien gebunden (wobei jedes separate Epitope desselben Target-Moleküls bindet), wobei ein Immunaffinitäts-„Sandwich“-Komplex erzeugt wird. Bei dem gezeigten Beispiel wird eines der Affinitätsreagenzien (z.B. Antikörper) auf ein Magnet-Bead immobilisiert, während der andere biotinylierte Antikörper in der Lösung frei ist. Bei bestimmten Ausführungsformen ist die Anzahl von Magnet-Beads (mit immobilisiertem Antikörper) signifikant größer als die Anzahl von Target-Proteinen in der Lösung, so dass einzelne Target-Proteine durch einzelne Beads gebunden sind. Wenn der zweite Antikörper gleichzeitig verwendet wird, sollte seine Konzentration größer sein als die Anzahl von Target-Molekülen, jedoch kleiner als die Anzahl von immobilisierten Antikörpern. Alternativ kann der zweite Antikörper im Anschluss an den ersten Bindungsschritt hinzugefügt werden (wobei sichergestellt wird, dass sämtliche Target-Moleküle zuerst an den immobilisierten Antikörper gebunden werden).
Nachdem die Target-Proteine zu Sandwich-Komplexen gebunden worden sind, werden die Magnet-Beads von einem Magnetfeld festgehalten, um ein Entfernen von ungebundenen Nicht-Target-Proteinen und freien Antikörpern zu ermöglichen, und gewaschen, um nichtspezifische Binder zu entfernen. Das Hinzufügen des Reporterenzyms (z.B. Streptavitin-Beta-Galactosidase) führt zur Bindung an den zweiten biotinylierten Antikörper und Zusammensetzen eines finalen ELISA-Sandwich, das wiederum gewaschen wird, um ungebundenes Reporterenzym zu entfernen. Das finale Material (siehe z.B. 6A) wird zusammen mit einem fluorogenen Substrat wieder in einem kleinen Volumen suspendiert zwecks Verarbeitung der Digital-Tropfen-Ablesung.
6A-6D zeigen eine Anzahl von unterschiedlichen Ablese„modi“ zum Durchführen des Digital-Tropfen-Ablesens im Anschluss an den ELISA-Sandwich-Komplex-Aufbau. In 6A ist mehr als ein Magnet-Bead in jedem erzeugten Tropfen, jedoch nur ein einzelnes ELISA-Sandwich in jedem einzelnen Tropfen (z.B. werden in diesem Fall Submikrometer-Magnet-Beads verwendet).
6B zeigt einen Modus, bei dem höchstens ein Bead in jedem Tropfen ist bei höchstens einem ELISA-Sandwich.
6C zeigt einen Modus, bei dem der zweite Antikörper, der einen Komplex mit dem Reporterenzym bildet, von dem Magnet-Bead eluiert worden ist und die Tropfen derart geladen sind, dass höchstens ein Antikörper-Reporter-Komplex in jedem Tropfen vorhanden ist.
In 6D wird das Reporterenzym selbst von dem Magnet-Bead freigesetzt, wobei Tropfen derart geladen sind, dass höchstens ein Enzymmolekül in jedem Tropfen vorhanden ist.
Es kann jegliches geeignete Verfahren zum Freisetzen des Enzyms von dem ELISA-Sandwich angewendet werden. Beispielhafte Verfahren umfassen: 1) Konkurrenz einer Desthiobiotin-Streptavidin-Interaktion unter Verwendung von Biotin; 2) Reduktion eines Linkers, der eine Disulfidbindung enthält; 3) enzymatische Spaltung einer Linkergruppe. Andere Variationen können berücksichtigt werden, und Poisson- und Nicht-Poisson-Modelle können zum Ermöglichen einer hohen Belegungsbeladung verwendet werden, wobei immer noch eine quantitative Zählung gegeben ist.
Mit Bezug auf 7A und 7B schafft die Erfindung Verfahren zum Multiplexen einer Digital-Tropfen-Reporterenzym-Ablesung. Es werden mehrere Modi zum Multiplexen eines digitalen Assay bereitgestellt.
Bestimmte Ausführungsformen umfassen Verfahren zum Erzeugen von Tropfen, die unterschiedliche fluorogene Substrate und Enzyme enthalten, die unterschiedliche fluoreszierende Produkte produzieren. Zum Beispiel produzieren Beta-Galactosidase und FDG FITC, während Meerrettich-Peroxidase und Amplex Red Resorufin produzieren. Bei dem ersten Verfahren werden komplett getrennte Enzym- und Fluorogenes-Substrat-Paare, die gleichzeitig in Tropfen geladen werden, verwendet. Zum Beispiel können Beta-Galactosidase und FDG (wobei FITC das fluoreszierende Produkt mit einer Spitzen-Emissionswellenlänge von 518 nm ist) verwendet werden, um einen Satz von Target-Molekülen zu zählen, während Meerrettich-Peroxidase und Amplex Red (wobei Resorufin das fluoreszierende Produkt mit einer Spitzen-Emissionswellenlänge von 582 nm ist) zum gleichzeitigen Reportieren auf einem zweiten Satz von Target-Molekülen verwendet werden können, da die Detektionswellenlängen mit standardmäßigen Laser-/Filteraufbauten leicht unterscheidbar sind.
Es können einige Kombinationen von unterschiedlichen Reporterenzymen und unterschiedlichen Substraten, die das gleiche fluoreszierende Produkt produzieren, verwendet werden. Zum Beispiel katalysiert Beta-Galactosidase Reaktionen von FDG, während alkalische Phosphatase Reaktionen von FDP katalysiert, wobei jede dieser Kombinationen das gleiche fluoreszierende Produkt (FITC) produziert. Trotzdem kann die Endpunkt-Produktkombination für jedes einzelne Enzym beim Multiplexen unterschieden werden.
7A stellt eine Unterscheidung durch eine Signalstärke am Endpunkt dar. Obwohl unterschiedliche Enzyme und Substrate verwendet werden, erzeugen die Substrate das gleiche fluoreszierende Produkt (z.B. FITC). Ein sorgfältiges Titrieren der Endpunkt-Produktkonzentrationen kann ein separates Zählen jedes Target (z.B. Kurven mit eindeutigen Intensitäten in 7A) ermöglichen.
7B stellt eine Unterscheidung durch Laufen zu unterschiedlichen Zeitpunkten dar. Bei diesen Ausführungsformen kann ein kinetischer Assay anstelle eines Endpunkt-Assay durchgeführt werden (z.B. ergeben alkalische Phosphatase und Fluoresceindiphosphat FITC als Produkt mit einer viel schnelleren Kinetik als Beta-Galactosidase und FDG). Ein Assay (Assay #1) läuft über einen Zeitraum und produziert ein detektierbares Produkt. Nach einer Zeitdauer erreicht das detektierbare Produkt ein Intensitätsplateau. Assay #1 wird mit Assay #2 gemultiplext (d.h. läuft gleichzeitig mit diesem). Assay #2 verläuft langsamer als Assay #1. Zu der Zeit, zu der Assay #2 mit einer wesentlichen Erhöhung der Aktivität beginnt, weist das Produkt von Assay #1 ein Plateau auf. Somit bietet der Pegel des detektierbaren Produkts von dem Plateau von Assay #1 eine Basislinie für den Pegel des Produkts von Assay #2. Ein solches Muster kann weiter auf einen geeigneten Pegel von Plexity gemultiplext werden.
Bei bestimmten Ausführungsformen weisen sämtliche Tropfen innerhalb eines Assay eine im Wesentlichen identische Größe auf (z.B. selbst dann, wenn eine optische Markierung verwendet wird). Die gleiche Düse 105 kann zum Erzeugen von Tropfen mit identischer Größe verwendet werden (nachstehend genauer diskutiert). Ferner können, da sämtliche Tropfen separat zum Multiplexen markiert werden, die Tropfen identisch inkubiert werden, und zwar aufgrund der Tatsache, dass sie in derselben Kammer oder Einrichtung verarbeitet werden können. Ähnlich können sämtliche Tropfen mit demselben optischen Mechanismus gelesen werden (z.B. fließen sie alle durch denselben Kanal an demselben Detektionspunkt auf dem Chip vorbei). Somit ermöglicht das optische Probenindexieren einen höheren Durchsatz und bessere Datenvergleiche.
Obwohl hier einige Beschreibungen eine digitale Enzymquantifizierung in Tropfen darstellen, sind die erfindungsgemäßen Systeme und Verfahren bei jeglicher geeigneten Flüssigkeits-Teilmenge anwendbar. Flüssigkeitsvolumen für Teilmengen können von Kammern bereitgestellt werden, die aus Verschlussventilen, SLIP-Chips, Näpfen, spontanem Aufbrechen zum Bilden von Tropfen auf einer strukturierten Oberfläche, Tropfen, die unter Anwendung von Elektrobenetzungs-Verfahren gebildet werden, etc. hergestellt sind.
Fluoreszenzpolarisation/Fluoreszenz-Lebensdauer
Wie hier beschrieben, kann das zu analysierende biologische/chemische Objekt selbst detektierbar sein, zum Beispiel durch eine charakteristische Fluoreszenz, oder sie kann markiert sein oder einem Reporter zugeordnet sein, der ein detektierbares Signal produziert, wenn das gewünschte Protein vorhanden ist oder zumindest in einer Schwellmenge vorhanden ist.
Lumineszierende Kolloid-Halbleiter-Nanokristalle, die als Quantenpunkte oder q-Punkte (QD) bezeichnet werden, sind anorganische Fluorophore, die das Potenzial besitzen, einige der Funktionsbegrenzungen, auf die organische Farbstoffe stoßen, zu umgehen. Insbesondere zeigen CdSe-ZnS-Kern-Schalen-QDs eine größenabhängige abstimmbare Photolumineszenz (PL) mit eingeengten Emissionsbandbreiten (FWHM ~30 bis 45 nm), die das sichtbare Spektrum und breite Absorptionsbänder umspannen. Dadurch wird eine gleichzeitige Anregung mehrerer Partikelgrößen (Farben) bei einer gemeinsamen Wellenlänge ermöglicht. Dadurch wird wiederum eine gleichzeitige Auflösung mehrerer Farbstoffe unter Verwendung einer standardmäßigen Geräteausrüstung ermöglicht. CdSe-ZnS-QDs weisen ferner höher Quantenausbeuten auf, sind widerstandsfähig gegenüber Photoabbau und können bei Konzentrationen, die mit organischen Farbstoffen vergleichbar sind, optisch detektiert werden.
Quantenpunkte sind nanoskalige Halbleiter, die typischerweise aus Materialien, wie z.B. kristallinem Cadmiumselenid, bestehen. Der Ausdruck „Q-Punkt“ unterstreicht den Quanten-Confinement-Effekt dieser Materialien und bezieht sich typischerweise auf fluoreszierende Nanokristalle im Quanten-Confinement-Größenbereich. Quanten-Confinement bezieht sich auf die Lichtemission aus Groß-(makroskopischen) Halbleitern, wie z.B. LEDs, die aus dem Anregen des Halbleiters entweder elektrisch oder durch Beleuchten mit Licht resultiert, wobei Elektron-Loch-Paare erzeugt werden, die bei einer Rekombination Licht emittieren. Die Energie und daher die Wellenlänge des emittierten Lichts werden durch die Zusammensetzung des Halbleitermaterials bestimmt. Wenn jedoch die physische Größe des Halbleiters wesentlich verringert wird, um viel kleiner als der natürliche Radius des Elektron-Loch-Paars (Bohr-Radius) zu sein, ist zusätzliche Energie zum „Beschränken“ dieser Anregung innerhalb der nanoskopischen Halbleiterstruktur erforderlich, was zu einer Verschiebung bei der Emission hin zu kürzeren Wellenlängen führt. Drei unterschiedliche q-Punkte in mehreren Konzentrationen können jeweils in einem Mikrotropfen platziert werden und dann mit einer mikrofluidischen Vorrichtung verwendet werden, um zu dekodieren, was in dem Tropfen ist. Die Q-Punkt-Ablese-Erstreckung zu der Fluoreszenzstation kann in die Auslegung der mikrofluidischen Vorrichtung integriert sein. Eine Reihe von dichroitischen Strahlteilern, Emissionsfiltern und Detektoren kann auf dem System gestapelt sein, wodurch eine Messung der erforderlichen fünf Emissionskanäle (zwei Fluoreszenzpolarisations-Signale und drei q-Punkt-Bänder) ermöglicht wird.
Eine Fluoreszenzpolarisations- (FP) Detektions-Technologie ermöglicht homogene Assays, die für Hochdurchsatz-Screening-Assays auf dem Gebiet der Arzneimittelforschung geeignet sind. Die gängigste Markierung in den Assays ist Fluorescein. Bei einem FP-Assay wird das Fluorophor mit polarisiertem Licht angeregt. Nur Fluorophore parallel zum Licht absorbieren und werden angeregt. Der Anregungszustand hat eine Lebensdauer bis zur Lichtemission. Während dieser Zeit rotieren die markierten Fluorophormoleküle und unterscheidet sich die Polarisation des emittierten Lichts von der Anregungsebene. Zum Bewerten der Polarisation sind zwei Messungen nötig: die erste unter Verwendung eines polarisierten Emissionsfilters parallel zu dem Anregungsfilter (S-Ebene) und die zweite mit einem polarisierten Emissionsfilter rechtwinklig zu dem Anregungsfilter (P-Ebene). Die Fluoreszenzpolarisations-Antwort wird als mP (Milli-Polarisation-Pegel) angegeben und wird erhalten aus der Gleichung: $Polarisation (mP) = 1000 * (S - G*P) / (S + G*P)$
wobei S und P subtrahierte Hintergrund-Fluoreszenz-Zählraten sind und G (Gitter) ein Geräte- und Assay-unabhängiger Faktor ist.
Die Rotationsgeschwindigkeit eines Moleküls ist von der Größe des Moleküls, der Temperatur und der Viskosität der Lösung abhängig. Fluorescein hat eine Fluoreszenz-Lebensdauer, die für die Rotationsgeschwindigkeiten von Molekülen in Bioaffinitäts-Assays, wie Rezeptor-Ligand-Binde-Assays oder Immunassay von Haptenen, geeignet ist. Das grundlegende Prinzip ist, dass die markierte Verbindung klein ist und schnell rotiert (niedrige Polarisation). Wenn sich die markierte Verbindung an das größere Molekül bindet, verlangsamt sich ihre Rotation beträchtlich (Polarisation ändert sich von niedriger zu hoher Polarisation). Somit bietet FP eine direkte Ablesung des Maßes an Tracer-Bindung an Protein, Nukleinsäuren und andere Biopolymere.
Die Fluoreszenzpolarisations-Technologie wird seit Jahrzehnten in Grundlagenforschung und kommerziellen Diagnose-Assays angewendet, wird jedoch erst seit sechs Jahren in größerem Umfang in der Arzneimittelforschung angewendet. Ursprünglich sind FP-Assays für die Arzneimittelforschung für einröhrige Analysegeräte entwickelt worden, die Technologie ist jedoch schnell zu Hochdurchsatz-Screening-Assays weiterentwickelt worden, als kommerzielle Platten-Lesegeräte mit einer äquivalenten Empfindlichkeit auf den Markt kamen. Diese Assays umfassen solche bekannten pharmazeutischen Targets wie Kinasen, Phosphatasen, Proteasen, G-Protein-gekoppelte Rezeptoren und nukleare Rezeptoren. Andere homogene Technologien, die auf der Fluoreszenzintensität basieren, sind entwickelt worden. Diese umfassen Energieübertragung, Quenchen und Enhancement-Assays. FP bietet mehrere Vorteile gegenüber diesen. Die Assays sind üblicherweise einfacher aufzubauen, da die Tracer nicht durch Intensitätsveränderungen auf das Binden ansprechen müssen. Des Weiteren ist nur ein Tracer erforderlich, und es können unaufbereitete Rezeptorpräparate verwendet werden. Ferner, da FP unabhängig von der Intensität ist, ist sie relativ immun gegenüber gefärbten Lösungen und trüben Suspensionen. FP bietet mehrere Vorteile im Bereich der Gerätausrüstung. Da FP eine fundamentale Eigenschaft des Moleküls ist und die Reagenzien stabil sind, ist nur eine geringfügige oder gar keine Standardisierung erforderlich. FP ist relativ unempfindlich gegenüber einer Drift in Detektorverstärkungseinstellungen und Laserleistung.
Die für FP gewählten Farbstoffe werden üblicherweise bei den meisten zellen- und enzymbasierten Assays verwendet und sind derart ausgelegt, dass sie sich nicht in großem Maß mit den q-Punkten überlappen. Die Farbstoffe werden sowohl allein als auch gemeinsam mit den q-Punkten bewertet (zuerst außerhalb des Geräts), um das Übersprechen festzustellen. Vorzugsweise werden die flüssigen q-Punkt-Markierungen außerhalb eines Spektral-Wellenlängenbands gelesen, die derzeit bei der FACS-Analyse und -Sortierung verwendet werden (d.h. die Farbstoffe Fluorescein, Cy3, Cy5 etc.). Dies ermöglicht die Anwendung von derzeit verfügbaren Assays (abhängig von diesen Farbstoffen). Bei Verwendung von spezifischen q-Punkten ist eine Einstreuung minimiert.
Entsprechend werden mit der vorliegenden Erfindung Verfahren geschaffen zum Markieren von Tropfen und/oder Nanoreaktoren, die auf einer mikrofluidischen Vorrichtung ausgebildet sind, nur durch Verwenden eines einzelnen Farbstoff-Codes zum Verhindern von Einstreuung mit anderen Farbstoffen während FP. Des Weiteren werden mit der vorliegenden Erfindung Verfahren geschaffen zum Erstellen von Farbstoff-Codes zum Markieren von Verbindungen, die in Flüssigkeiten enthalten sind (einschließlich Tropfen und/oder Nanoreaktoren), wobei die Verbindung derart ausgelegt ist, dass sie sich durch FP auf einer mikrofluidischen Vorrichtung unterscheidet. Auf diese Weise können Farbstoff-Codes mit der gleichen Farbe, Absorption und Emission zum Markieren von Verbindungen in Flüssigkeiten verwendet werden.
Bei einem Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung der Fluoreszenzpolarisation zum Markieren von Flüssigkeiten. Tropfen können unter Verwendung mehrerer Mittel markiert werden. Diese Markierungsmittel umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, die Verwendung unterschiedlicher Farbstoffe, Quantenpunkte, Kapazität, Lichtundurchlässigkeit, Lichtstreuung, Fluoreszenzintensität (FI), Fluoreszenz-Lebensdauer (FL), Fluoreszenzpolarisation (FP), Zirkulardichroismus (circular dichroism - CD), Fluoreszenzkorrelation und Kombinationen aus sämtlichen dieser oben genannten Markierungsmittel. Die folgende Offenlegung beschreibt die Verwendung von FP und FI als Mittel zum Markieren von Tropfen auf einer mikrofluidischen Vorrichtung. Des Weiteren wird die Verwendung von FL als Mittel zum Einstellen der Gesamt-FP einer Lösung und durch Variieren der Konzentration der Gesamt-FI zum Erstellen eines 2-dimensionalen Kodierungsschemas aufgezeigt.
Generell fallen Moleküle, die mehr Volumen aufnehmen, schneller als ein kleineres Molekül, das mit demselben Fluorophor gekoppelt ist. FP ist unabhängig von der Konzentration des Farbstoffs; Flüssigkeiten können sehr unterschiedliche Konzentrationen von FITC in diesen aufweisen und immer noch identische FP-Messwerte aufweisen.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform ist ein FP-Farbstoff ein organischer Farbstoff, der nicht mit dem verwendeten Assay-Farbstoff interferiert. Ferner, da die Gesamtintensität des FP-Farbstoffs quantifiziert werden kann, ist eine zweite Dimension, in der der Tropfen markiert wird, vorgesehen. Somit können die Unterschiede bei der FP zum Erstellen eines Kodierungsschemas eines Farbstoffs in einer Flüssigkeitslösung, einschließlich Tropfen, genutzt werden. Beispiele von Wegen zum Nutzen der Unterschiede bei der FP sind in WO 2007/081385 und WO 2008/063227 beschrieben. In einer einzelnen Dimension kann FP zum Erstellen eines Kodierungsschemas verwendet werden. Bei der vorliegenden Erfindung kann jedoch auch die Fluoreszenzintensität (FI) der Gesamtlösung zum Erstellen von noch mehr Markierungen in einer zweiten Dimension verwendet werden. Interessanterweise können die Unterschiede der Fluoreszenz-Lebensdauer (FL) von zwei Farbstoffen mit einer Spektralüberlappung in der detektierten Emissionswellenlänge zum Verändern der Gesamt-FP der kombinierten Lösung ebenfalls genutzt werden.
Obwohl die Verwendung von mehreren Verbindungen, an denen ein Farbstoffmolekül haftet, um einen FP-Bereich zu umspannen, möglich ist, ist es auch möglich, den Bereich unter Verwendung von Verbindungen mit hohem und niedrigem Molekulargewicht zu umspannen. Zum Beispiel kann ein Farbstoff an einer großen Verbindung (zum Beispiel Streptavidin) haften und auf einer festen Konzentration gehalten werden, zu der eine kleinere Verbindung (zum Beispiel ein freies Farbstoffmolekül) in dieselbe Lösung titriert wird. Die FP der Lösung kann in erkennbare Inkremente vom Wert des größten Moleküls bis zu einer geringfügig größeren als der FP des kleineren Moleküls eingestellt werden. Die [Gesamt-] Farbstoffintensität kann durch Variieren der Konzentration der Mischung der zwei Verbindungen mit daran haftenden Farbstoffen variiert werden. Durch Variieren der Gesamt-Farbstoffkonzentration und der FP können zwei Dimensionen zum Erzeugen der FP-Farbcodes (FPCodes) verwendet werden. Entsprechend können viele FPCodes unter Verwendung von nur zwei Verbindungen erzeugt werden.
Bei einigen Ausführungsformen wird die Fluoreszenzpolarisation für digitale Assays verwendet. Bei diesem Verfahren werden positive (enzymenthaltende) Tropfen unter Verwendung der Veränderungen der Fluoreszenzpolarisation der Fluoreszenzmoleküle in den Tropfen identifiziert und gezählt. Bei der Fluoreszenzpolarisations-(FP) Detektionstechnologie kann eine Markierung, wie z.B. ein Fluoroscein, verwendet werden. Bei einem FP-Assay wird der Fluorophor mit polarisiertem Licht angeregt. Nur Fluorophore parallel zum Licht absorbieren und werden angeregt. Der Anregungszustand hat eine Lebenszeit bis zur Lichtemission. Während dieser Zeit rotiert das markierte Fluorophormolekül und unterscheidet sich die Polarisation des emittierten Lichts von der Anregungsebene. Bei einigen Ausführungsformen werden zwei Messungen zum Bewerten der Polarisation angewendet: die erste unter Verwendung eines polarisierten Emissionsfilters parallel zu dem Anregungsfilter (S-Ebene) und die zweite mit einem polarisierten Emissionsfilter rechtwinklig zu dem Anregungsfilter (P-Ebene). Fluoreszenz-Lebensdauer- (FL) Veränderungen können auf der Basis der chemischen Umgebung des Fluorophors derart detektiert werden, dass gebundene und ungebundene Antikörper mittels der FL-Messungen, die einem Fachmann bekannt sind, unterschieden werden können.
Die Rotationsgeschwindigkeit eines Moleküls ist abhängig von der Größe des Moleküls, der Temperatur und der Viskosität der Lösung. Das Prinzip lautet hier, dass die markierte Verbindung klein ist und schnell rotiert (niedrige Polarisation). Wenn sich die markierte Verbindung an das größere Molekül bindet, verlangsamt sich seine Rotation beträchtlich (Polarisationsveränderungen von niedriger zu hoher Polarisation). Generell fallen Moleküle, die mehr Volumen aufnehmen, schneller als ein kleineres Molekül, das mit demselben Fluorophor gekoppelt ist. FP ist unabhängig von der Konzentration des Farbstoffs; Flüssigkeiten können sehr unterschiedliche Konzentrationen von FITC in sich aufweisen und immer noch identische FP-Messwerte aufweisen. Somit bietet FP eine direkte Ablesung des Maßes an Bindung an Protein, Nukleinsäuren und anderer Biopolymere oder Targets.
FP bietet Vorteile im Kontext des Multiplexens (an anderer Stelle hier genauer diskutiert). Da FP von der Intensität unabhängig ist, ist sie relativ immun gegenüber gefärbten Lösungen und trüben Suspensionen. FP bietet mehrere Vorteile im Bereich der Geräteausstattung. Da FP eine grundlegende Eigenschaft des Moleküls ist und die Reagenzien stabil sind, ist nur eine geringfügige oder gar keine Standardisierung erforderlich.
Die für FP gewählten Farbstoffe sind jeglicher geeignete Farbstoff, wie zum Beispiel Fluorescein, Cy3, Cy5 etc. Geeignete Farbstoffe umfassen (Bezeichnung gefolgt von [Anregungswellenlänge, Emissionswellenlänge]): Cyan 500 [450, 500]; SYBR Grün, FAM [483, 533], HEX, VIC [523, 568]; RED 610 [558, 610]; RED 640 [615, 640]; und CY5 [650, 670].
Bei einigen Ausführungsformen ist ein FP-Farbstoff ein organischer Farbstoff, der nicht mit anderen Markierungen oder Farbstoffen bei einem Assay interferiert. Ferner, da die Gesamtintensität des FP-Farbstoffs quantifiziert werden kann, ist eine zweite Dimension, in der die Teilmenge markiert wird, vorgesehen. Somit können die Unterschiede bei der FP zum Erstellen eines Kodierungsschemas eines Farbstoffs in einer Flüssigkeitslösung, einschließlich Tropfen, genutzt werden. Beispiele von Wegen zum Nutzen der Unterschiede bei der FP sind in WO 2007/ 081385 und WO 2008/063227 beschrieben. Die Fluoreszenzpolarisation ist in US-Pub. 2010/0022414 beschrieben, deren Inhalt hier in seiner Gesamtheit durch Verweis einbezogen ist.
Bei dem in 8A gezeigten Beispiel phosphoryliert das Enzym Scr-Kinase (Src) ein Src-Substrat-Peptid und schafft eine Bindungsoberfläche für einen Fluoreszenzreporter. Ein Reporterkonstrukt, das die Src-Homologie-2-Domäne (SH2) und ein Fluoresceinisothiocyanat (FITC) enthält, dient als Fluoreszenzreporter (SH2-FITC). Wenn SH2-FITC hinzugefügt wird, bindet es sich an das phosphorylierte Scr-Substrat-Peptid. 8B zeigt die gleiche Sequenz von Schritten, bei denen jedoch das Scr-Substrat-Peptid an ein Bead gebunden ist.
Wenn der Fluoreszenzreporter SH2-FITC in der Lösung frei ist, weist er eine niedrige Fluoreszenzpolarisation auf, wohingegen er dann, wenn er an ein phosphoryliertes Peptid gebunden ist (z.B. der letzte Schritt, wie er in jeder der 8A und 8B gezeigt ist), weist eine messbar höhere Fluoreszenzpolarisation auf. Die Detektion der Fluoreszenzpolarisation zeigt eine reaktionspositive Flüssigkeits-Teilmenge an. Viele andere Enzyme, Bindungsmotive und Fluoreszenzreporter können verwendet werden.
Allelspezifischer Assav
10 zeigt eine Darstellung des Konzepts und des Arbeitsablaufs für einen digitalen kompetitiven allelspezifischen Enzym-Hybridisierungs- (CASE) Assay, ein weiteres Beispiel für einen Upfront-Assay, der mit dem Digital-Reporter-Assay-Ablesen gekoppelt sein kann. Bei dem CASE-Hybridisierungs-Assay wird die allelspezifische Oligonucleotid-Sonden-Hybridisierung zum Auswählen seltener genomischer Targets zum Binden an das Reporterenzym und anschließenden digitalen Zählen angewendet.
Es werden zwei Sondentypen verwendet. Die Wildtyp-Sonde 130 ist komplementär zu dem reichlich vorhandenem Wildtyp-Allel. Die Wildtyp-Sonde 130 umfasst ein Kleine-Furche-Bindungsmotiv 134 (entweder 5' oder 3' zu dem Target-Oligonucleotid).
Eine Mutant-Sonde 131 ist komplementär zu dem seltenen Mutant-Allel. Die Mutant-Sonde 131 umfasst ein Immunaffinitäts-Tag 135 (z.B. TAG) an einem Ende und ein Biotin am anderen Ende. Andere Bindungsmotive können verwendet werden, aber bei diesem Beispiel werden ein DIG TAG (das durch einen Anti-DIG-Antikörper gebunden sein kann) und Biotin (das durch Streptavidin gebunden sein kann) verwendet.
Die Wildtyp-Sonde 130 mit dem Kleine-Furche-Binder 134 verdrängt jegliche nichtspezifische Bindung der Mutant-Sonde 131 an die Wildtyp-Proben-DNA, wodurch die Hybridisierung und Duplexbildung derart begrenzt wird, dass sich nur zwei Duplexspezies bilden: Wildtyp-DNA hybridisiert zu Wildtyp-Sonde 130 und Mutant-DNA hybridisiert zu Mutant-Sonde 131. Es wird ein Überschuss der zwei Sonden gegenüber der Proben-DNA verwendet, wodurch sichergestellt ist, dass jeder einzelne Strang der Mutant-Proben-DNA in einer Duplex- mit einer Mutant-Allel-Sonde vorliegt.
Im Anschluss an die Duplexbildung wird eine einsträngige Nuclease, wie z.B. S1-Nuclease, hinzugefügt. Die Nuclease schließt jegliche ungebundene Mutant-Sonde 131 auf, so dass das Tag 135 von dem Biotin gelöst wird.
Magnet-Beads, die mit Anti-TAG-Antikörpern gekoppelt sind, werden als nächstes im Überschuss hinzugefügt, so dass jedes Bead höchstens einen Komplex von Sonde 131 und Tag 135 bindet. Die Beads werden unter Verwendung eines Magneten 137 immobilisiert und gewaschen, um nichtspezifisch gebundenes Material zu entfernen (aufgeschlossene biotinylierte Sonde und einsträngige Nuclease).
Ein Streptavidin-gekoppeltes Reporterenzym 139 wird als nächstes hinzugefügt. Nach dem Waschen liegt das einzige Enzym, das auf dem Magneten immobilisiert bleibt, in einer Eins-zu-Eins-Stöchiometrie, mit dem ursprünglichen in der Proben-DNA vorhandenen seltenen Mutant-Allel vor. Schließlich wird das Reporterenzym unter Anwendung des Digital-Tropfen-Reporterenzym-Assay wie oben gezählt.
Obwohl in 10 eine bestimmte Ausführungsform gezeigt ist, kann ein CASE-Assay jegliche geeignete Sonde für einen speziellen Assay umfassen. Die Anti-TAG-Antikörper können auf jeglichem geeigneten festen Substrat vorgesehen sein. Das Reporterenzym 139 kann jegliches geeignete Enzym sein, wie z.B. eines von denjenigen, die hier diskutiert werden.
Optische Markierung
Bei bestimmten Aspekten werden mit der Erfindung Verfahren und Vorrichtungen für die optische Markierung von Proben oder Assays geschaffen. Die Verfahren zur optischen Markierung umfassen das Hinzufügen eines Farbstoffs zu einer Probe oder einen Assay vor der Tropfenbildung. Unterschiedliche Proben oder Assays können durch Hinzufügen eines Farbstoffs in unterschiedlichen Konzentrationen gemultiplext werden. 11A zeigt ein Diagramm, bei dem die x-Achse dem Tropfen-Assay-Signal entspricht und die y-Achse unterschiedlichen Konzentrationen des Farbstoffs entspricht. Wie in 11A zu sehen ist, können Flüssigkeits-Teilmengen einen Farbstoff in sechs unterschiedlichen Konzentrationen aufweisen und immer noch klar optisch voneinander auflösbar sein. Es können mehr als sechs unterschiedliche Konzentrationen verwendet werden, wie zum Beispiel sieben, zehn, fünfzig oder mehr.
Die optische Markierung kann ein weiteres Multiplexen durch Verwendung weiterer Farbstoffe umfassen. Zum Beispiel zeigt 11B ein Diagramm, bei dem die x-Achse 10 unterschiedliche Konzentrationen eines Farbstoffs zeigt, der bei 590 nm emittiert, während die y-Achse 10 unterschiedliche Konzentrationen eines Farbstoffs zeigt, der bei 650 nm emittiert. Dadurch, dass zwei Farbstoffe in jeweils 10 Konzentrationen enthalten sind, können 100 Proben separat markiert werden und einen einzelnen Assay durchlaufen (99 Proben sind in 11B) gezeigt.
Das Multiplexen mittels dieser Verfahren bietet eine Hochdurchsatz-Ablesung. Bei bestimmten Ausführungsformen ermöglicht ein einzelner Farbstoff-Laser-Satz 6-7 oder mehr (z.B. 10, 25 oder mehr) Indexpegel pro Durchlauf. Ein weiterer Laser ermöglicht dann eine größere Anzahl (z.B. >30). Durch Multiplexen bei diesen Pegeln können positive und negative Kontrollen in einem Assay erfolgen.
11C zeigt die hohen Pegel von „Plexity“ für gemultiplexte Reaktionen unter Verwendung unterschiedlicher Konzentrationen eines optischen Farbstoffs und unterschiedlicher Kombinationen von fluoreszierend markierten Antikörpern. Wie in 11C gezeigt, stellt jeder Kreis eine Flüssigkeits-Teilmenge dar. Jedes umgekehrte „Y“-Element stellt einen Antikörper dar. Die Markierungen „AB#1“, „AB#2“, ..., AB#20" beziehen sich auf zwanzig unterschiedliche Antikörper und zeigen an, dass in jeglicher vorgegebenen Flüssigkeits-Teilmenge sämtliche Antikörper die gleichen sind. Die Antikörper sind mit zwei unterschiedlichen fluoreszierenden Markern an ihren Köpfen gezeigt. Ein spitzer Marker zeigt eine erste Farbe (z.B. grün) an, während ein kugelförmiger Marker eine zweite Farbe (z.B. rot) anzeigt. „Optischer Farbstoff [1]“ zeigt eine erste Farbstoffkonzentration an; „Optischer Farbstoff [2]“ zeigt eine zweite Farbstoffkonzentration an; „Optischer Farbstoff [3]“ zeigt eine dritte Farbstoffkonzentration an; und „Optischer Farbstoff [0]“ zeigt keinen Farbstoff an.
Es sei darauf hingewiesen, dass in jeglicher vorgegebenen Flüssigkeits-Teilmenge in 11C sämtliche Antikörper die gleichen sind, es ist zu sehen, dass jede Flüssigkeits-Teilmenge trotzdem mittels einer Kombination von gefärbten fluoreszierenden Markern und Farbstoffkonzentrationen eindeutig markiert ist. Das heißt, dass keine zwei Teilmengen in einer Säule die gleiche Kombination von Farben von fluoreszierenden Markern enthalten. Ferner können zwei unterschiedliche optische Farbstoffe in jeder Flüssigkeits-Teilmenge vorhanden sein, die jeweils separat detektierbar sind und jeweils separat in der Lage sind, in unterschiedlichen Konzentrationen vorgesehen zu sein. Durch Abbilden einer idealen Achse, die sich lotrecht zu der Oberfläche von 11C erstreckt, erkennt man, dass ein zweiter optischer Farbstoff, der in 3 unterschiedlichen Konzentrationen vorgesehen ist, ermöglicht, dass der Assay mit einer „Plexity“ von 48 gemultiplext wird - d.h. 48 unterschiedliche Antikörper können separat und eindeutig markiert werden.
Lokalisierte Fluoreszenz
9A und 9B beziehen sich auf Verfahren zur Reaktionsdetektion in Flüssigkeits-Teilmengen, bei denen ein lokalisiertes Fluoreszenzverfahren zur Detektion angewendet wird. Bei diesen Verfahren werden positive (enzymenthaltende) Teilmengen unter Verwendung von Veränderungen bei der lokalisierten Fluoreszenz von fluoreszierenden Molekülen in den Teilmengen identifiziert und gezählt. Generell wird bei den erfindungsgemäßen Verfahren ein Detektionsverfahren angewendet, bei dem eine lokalisierte Konzentration eines Target in einer Flüssigkeits-Teilmenge detektiert wird. Zum Beispiel schafft bei bestimmten Ausführungsformen eine Enzymaktivität eine Bindungsfläche für fluoreszierende Moleküle, die durch eine lokalisierte Fluoreszenzablesung überwacht werden können.
Bei dem in 9A gezeigten Beispiel phosphoryliert das Enzym Src-Kinase (Src) ein Src-Substrat-Peptid, das auf einem Bead immobilisiert ist. Die Phosphorylierung des Src-Substrat-Peptids schafft ein Bindungsmotiv für den Fluoreszenzreporter SH2-FITC. Somit bindet sich SH2-FITC an das Bead-gebundene Src-Substrat-Phosphopeptid, wie im letzten Schritt von 9A gezeigt ist.
9B stellt eine reaktionsnegative Flüssigkeits-Teilmenge auf der linken Seite und eine reaktionspositive Flüssigkeits-Teilmenge auf der rechten Seite dar. Die Lokalisierung der fluoreszierenden Moleküle auf die Bead-Oberfläche kann als verstärktes Signal auf der Bead-Oberfläche, verringertes Signal in einem Teil der Flüssigkeits-Teilmenge (z.B. durchgehend im Teilmengenvolumen) oder beides detektiert werden. Viele andere Enzyme, Bindungsmotive und Fluoreszenzreporter können verwendet werden.
Es kann jegliches geeignete Verfahren zum Detektieren des Musters einer lokalisierten Fluoreszenz innerhalb einer Flüssigkeits-Teilmenge angewendet werden. Zum Beispiel werden bei bestimmten Ausführungsformen Flüssigkeitstropfen durch einen engen Kanal geleitet, der die Tropfen zwingt, eine elongierte Form aufzuweisen (wie in 9B gezeigt). Wenn die Tropfen einen Laserdetektor durchlaufen, zeigen reaktionsnegative Tropfen eine gleichförmige niedrige Fluoreszenzintensität entlang ihrer Länge, während reaktionspositive Tropfen eine Spitze zeigen, die der Situation entspricht, in der der Bead-gebundene Fluoreszenzreporter den Laserdetektor durchläuft. Des Weiteren gibt es dann, wenn Fluore auf (einem) Partikel(n) innerhalb des Tropfens (z.B. auf einer Bead- oder Zellenoberfläche) lokalisiert werden, einen koordinierten Abbau der Anfangs-Fluoreszenz in den Regionen der Tropfen, die kein(e) Partikel enthalten. Es können verschiedene Signalverarbeitungsalgorithmen zum Kombinieren lokaler Signalzunahmen und Hintergrundsignalabnahmen zu einem robusteren Detektionsverfahren angewendet werden.
12A und 12B zeigen einen Arbeitsablauf für einen lokalisierte Fluoreszenzbindungsassay. Eine Zellenprobe 201 stellt Zellen bereit, die in den Tropfengenerator 203 geleitet werden. Eine optisch markierte Bibliothek 211 (z.B. gemäß der hier an anderer Stelle diskutierten Multiplex-Ausführungsformen) wird derart geleitet, dass Tropfen aus der Bibliothek 211 auf Zellentropfen aus der Probe 201 in einem Tropfenverschmelzer 207 treffen. Die Tropfen verlassen den Verschmelzer 207, die optische Markierungen und Reagenzien (z.B. einen fluoreszierenden Antikörper an einem interessierenden Biomarker) aufweisen und inkubiert werden (nicht gezeigt) und fließen dann an dem Detektor 211 vorbei. Bei bestimmten Ausführungsformen weist der Detektor 211 einen engen Kanalabschnitt 225 auf, wie nachstehend mit Bezug auf 13 diskutiert wird. Bibliotheken sind in US-Pub. 2010/0022414 diskutiert, deren Inhalt hier in seiner Gesamtheit für sämtliche Zwecke einbezogen ist.
12B stellt das Prinzip der Detektion in dem Detektor 211 dar. Eine Flüssigkeits-Teilmenge oben in 12B weist eine Vielzahl von fluoreszierend markierten Antikörpern 215 und eine Zelle auf, die ein interessierendes Antigen darstellt. Nach der Inkubation erscheint die Flüssigkeits-Teilmenge wie unten in 12B, wo gezeigt ist, dass sie nur eine Konzentration eines fluoreszierenden Markers 219 enthält, da sämtliche markierten Antikörper an die Zelle gebunden sind.
13 zeigt die Detektion von CD45 auf der Oberfläche von U937-Monozyten mit erfindungsgemäßen Systemen und Verfahren. Eine Bibliothek von optisch markierten Antikörpern wird aus einem Eingang in das System geleitet, um mit Zellen aus dem anderen (Nachverfolgen des Zellenwegs über die Figur von links nach rechts) zu verschmelzen. Die Ströme verschmelzen und die Tropfen werden kombiniert, wonach die Tropfen „außerhalb des Chips“ inkubiert werden, wie durch die mittlere Darstellung angezeigt ist, in der die Tropfen ohne einen umgebenden mikrofluidischen Kanal zu sehen sind. Nach der Inkubation werden die Tropfen zurück auf einen Chip und in einen Kanal geleitet, wonach sie durch einen engen Kanalabschnitt 225 geleitet werden. Das Fließen durch den engen Bereich bewirkt, dass die Zellen elongieren. Ein Laserdetektor führt ein Lesen über den Kanal in der Mitte des engen Abschnitts 225 durch.
Wenn die Zellen den Laser passieren, detektiert der Detektor eine Fluoreszenz und erstellt eine digitale Kurve, die in einem Computer gespeichert und analysiert werden kann. Die digitale Kurve kann auf einer Anzeige als Diagramm betrachtet werden, bei der die x-Achse die Zeit darstellt (und der Länge der Tropfen entspricht, wenn diese den Detektor passieren) und die y-Achse der Signalintensität entspricht (siehe beispielhafte Kurven in 14A-14C).
Der Durchsatz eines Assay ist einstellbar und kann zum Beispiel bei ungefähr 1500 Tropfen pro Sekunde durchgeführt werden (bei dem dargestellten Beispiel entsprechend ungefähr 150 Zellen/Sekunde). Die Inkubationszeit (z.B. außerhalb des Chips, wie im mittleren Teil gezeigt) kann eingestellt werden. Auf dem Chip kann die Inkubation unter Verwendung einer Verzögerungsleitung eingestellt werden (d.h. eines breiteren Abschnitts des Kanals, an dem sich das Fließen verlangsamt). Der Innendurchmesser des engen Abschnitts 225 kann eingestellt werden, um die Tropfenelongation abzustimmen. Zum Beispiel kann der Innendurchmesser ungefähr 10 Mikrometer oder 15 Mikrometer betragen.
Bei bestimmten Ausführungsformen wird die lokalisierte Fluoreszenz zum Screenen hinsichtlich einkettiger variabler Fragment- (scFv) Peptide in Tropfen verwendet. Zum Beispiel kann eine Bibliothek von bakteriell produzierten scFvs entwickelt werden. Im Anschluss an einen Prozess, der in 12A skizziert ist, werden transformierte Bakterienzellen 201 gekapselt und bei 37 °C inkubiert. Nach der Inkubation werden die Tropfen mit Tropfen, die Beads, Antigene und einen Detektionsantikörper aus der Bibliothek 211 enthalten, kombiniert.
Bei den auf Tropfen basierenden Bindungs-Assays wird die Lokalisierte-Fluoreszenz-Detektion von scFv-Bindung angewendet, wie in 12B gezeigt ist. Insbesondere wird das diffuse Signal hell und auf dem eingefangenen Bead lokalisiert.
Positive Tropfen werden gemäß einem lokalisierten Fluoreszenzverfahren detektiert, wie z.B. demjenigen, das in 13 dargestellt ist. Zum Erhalten eines Ablesewerts des Tropfens und des Fluoreszenzpegels darin wird der Tropfen zur Detektion in einem engen Kanalabschnitt 225 elongiert, wie in 13 gezeigt ist.
Die positiven Tropfen können dann aufgebrochen werden, und der Inhalt kann zurückgewonnen und sequenziert werden. Bei dem Prozess kann ein Screenen hinsichtlich scFvs in Tropfen mit einer Rate von ungefähr 1 × 10⁶ pro Stunde durchgeführt werden. Ein Screenen hinsichtlich lokalisierter Fluoreszenz und scFv ist in US-Pub. 2010/0022414 diskutiert, deren Inhalt in seiner Gesamtheit hier durch Verweis einbezogen ist.
14A-14C stellen Kurven einzelner Tropfen mit optischen Markierungen bei einem lokalisierten Fluoreszenzassay dar. Es sei darauf hingewiesen, dass die Kurve jeweils in 14A-14C in einer separaten Farbe zum Beispiel auf einer einzelnen Anzeige gezeigt werden kann. In jeder Figur sind die Achsen die gleichen und können die Kurven bei einem einzelnen Durchlauf zum gleichzeitigen Detektieren von drei unterschiedlich gefärbten Markierungen erhalten werden. 14A zeigt eine Kurve, die die Messung eine Zelllebensfähigkeitsfärbung anzeigt. Hier kann Calcein-AM verwendet werden, das ein Signal mit einer niedrigen Intensität ergibt, bis es durch Esterasen, die sich nur innerhalb einer Zelle befinden, aufgespalten wird. Die beiden Spitzen in 14A (ungefähr 110 ms und ungefähr 300 ms) zeigen den zweiten bzw. den vierten Tropfen an, der den Fluoreszenzdetektor passiert. Diese beiden Spitzen zeigen an, dass diese Tropfen eine lebensfähige Zelle enthalten.
14B zeigt eine Signalstärke des FITC-Signals für Tropfen, die einen markierten Binder (z.B. Anti-CD45-FITC) aufweisen. Eine Spitze (z.B. bei 30 ms) zeigt eine Bindung (d.h. eine lokalisierte Erhöhung der Fluoreszenz) an, während „Ausbuchtungen“, die um ungefähr 60 ms, 125 ms, 190 ms, 355 ms, 420 ms und 480 ms zentriert sind (entsprechend dem zweiten, dritten, vierten, sechsten, siebten und achten Tropfen, die jeweils an dem Detektor vorbeifließen), eine dispergierte Fluoreszenz mit niedrigem Pegel anzeigen und somit keine Bindung anzeigen. In Zusammenhang mit 14A, die das Vorhandensein einer lebensfähigen Zelle in dem vierten Tropfen zeigt, zeigt 14B, dass die lebensfähige Zelle Anti-CD45 bindet.
Es zeigt sich bei Betrachtung von 14B, dass die Spitze bei ungefähr 300 ms von einer „Ausbuchtung“ mit niedrigem Pegel umgeben ist, die ungefähr 275 ms bis ungefähr 320 ms umspannt. Ein positiver Assay kann mittels des niedrigen Pegels des Signals über diese „Ausbuchtung“ im Vergleich zu dem Signalpegel in den reaktionsnegativen Ausbuchtungen detektiert werden (z.B. konsistent über ungefähr 0,1). Somit kann dann die lokalisierte Fluoreszenz mittels eines lokalisierten Anstiegs der Fluoreszenz, teilmengenbreiter Verringerungen der Fluoreszenz oder beidem detektiert werden (und positive oder negative Reaktions-Flüssigkeits-Teilmengen identifiziert werden). Zum Beispiel kann ein Verhältnis zwischen dem lokalisierten Anstieg und der teilmengenbreiten Verringerung berechnet werden und würde dieses Verhältnis ein empfindlicher Indikator und/oder Messwert der Lokalisation innerhalb der Teilmenge sein. Außerdem kann die Messung des Gesamtvolumens der Teilmenge zum weiteren Skalieren oder Normalisieren der teilmengenbreiten Verringerung ebenfalls berücksichtigt werden.
14C stellt die optische Markierung dar, die in den in 14B gezeigten Tropfen enthalten war (hier als blaue Kurve gezeigt). Hier wurden Kontrolltropfen mit einer niedrigen Konzentration von Farbstoff markiert, während Testtropfen (einschließlich AntiCD45-FITC) mit einer hohen Konzentration des Farbstoffs markiert wurden. Somit zeigen die ersten drei Signale, das fünfte Signal und das sechste Signal an, dass die entsprechenden Flüssigkeits-Teilmengen negative Kontrollen sind, während die vierten und die siebten Tropfen Test-Teilmengen waren. Ein unabhängiger (z.B. stromabwärtiger oder stromaufwärtiger) Kanal kann zum Zählen von Zellen, Zählen von Tropfen, Sortieren von Zellen oder Durchführen anderer Schritte verwendet werden.
15A-15C zeigen einzelne Tropfenkurven mit einer Streudarstellung und einem Histogramm. Diese Figuren stellen die Ergebnisse eines Assay für IgG und CD45 dar. Hier überlagern sich zwei Kurven. Eine Kurve zeigt einen Pegel von Fluoreszenz aus FITC an Stellen innerhalb einer Flüssigkeits-Teilmenge an (ähnlich wie in 14B gezeigt). Die andere Kurve zeigt einen Farbstoff an, der in unterschiedlichen Konzentrationen verwendet wird, um die AntiCD45-Test-Teilmenge eindeutig gegenüber den IgG-Test-Teilmengen optisch zu markieren (d.h. die Kurve ist ähnlich der in 14C). In 15A zeigt das Auftreten eines Signals bei ungefähr 125 ms ohne „Schultern“ (d.h. ohne die Kurve, die der oben diskutierten von 14B entspricht) eine Flüssigkeits-Teilmenge an, die kein FITC-markiertes Target aufweist. Dies zeigt einen unverschmolzenen Zelltropfen an, d.h. einen Tropfen, der den Verschmelzer 207 passiert hat, ohne Reaktionsreagenzien aufzunehmen.
Das Signal bei ungefähr 725 ms zeigt einen AntiCD45-FITC-positiven Tropfen an, während das Signal bei ungefähr 1050 ms einen IgG-FITC-positiven Tropfen (den zehnten bzw. vierzehnten Tropfen, der den Detektor passiert) anzeigt. Hier unterscheiden sich der zehnte und der vierzehnte Tropfen auf der Basis der Konzentration des Farbstoffs zur optischen Markierung (entsprechend der in 14C gezeigten Kurve).
15B zeigt eine Streudarstellung von Ergebnissen, die sich auf die in 15A gezeigten Kurven beziehen. Entlang der x-Achse ist eine Intensität der Antikörpermarkierung aufgetragen, und die y-Achse entspricht einer Intensität eines Lebendzellenfärbung. Eine Population 305 entspricht einer CD45-positiven Population von Flüssigkeits-Teilmengen, und eine Population 301 entspricht einer IgG-positiven Population von Flüssigkeits-Teilmengen. Da unverschmolzene Tropfen ebenfalls gezählt werden (z.B. zweites Signal in 15A), kann die Gesamtanzahl von Tropfen, die aufbereitet werden, berücksichtigt werden. 15C zeigt ein Histogramm, das dem in 15B gezeigten Diagramm entspricht. Die x-Achse ist das einheitenlose Bin, und die y-Achse ist die Frequenz. Solche Histogramme sind auf dem Sachgebiet zum Anzeigen von Durchflusszytometrie-Ergebnissen bekannt.
16A-16C zeigen Wege zum Steuern oder Einstellen des Dynamikbereichs eines lokalisierten Fluoreszenzassay. Wie in 16A gezeigt, kann eine Menge an fluoreszierend markierten Antikörpern 215 in einer festgelegten Beziehung zu einer bekannten oder erwarteten Anzahl von Zellenoberflächen-Markern auf der Zelle 219 vorgesehen sein. Durch Steuern der Konzentration von hinzugefügtem Antikörper (z.B. durch eine Reihe von Kalibrierdurchläufen) kann ein gewünschtes Signal eines gebundenen Antikörpers erzeugt werden, das größer ist als das dispergierte Hintergrundsignal.
16B zeigt ein Verfahren zum Verringern einer Stärke eines Hintergrundsignals (maßstabgetreu gezeigt in der in 16A gezeigten grafischen Darstellung). Durch Vergrößern der Flüssigkeits-Teilmengen werden fluoreszierende Antikörper 215 im ungebundenen Modus stärker dispergiert. Bei Bindung an die Zelle 219 ist das gebundene Signal jedoch im Wesentlichen das gleiche wie zwischen 16A und 16B. Somit können durch Steuern eines Volumens einer Flüssigkeits-Teilmenge die Signalverstärkung moduliert werden und der Dynamikbereich des Assay eingestellt werden.
16C zeigt einen anderen Weg zum Einstellen des Dynamikbereichs durch Dämpfen des Hintergrundsignals. Hier verschmelzen Teilmengen, die fluoreszierende Antikörper 215 enthalten, mit Teilmengen (nur eine ist gezeigt), die jeweils mindestens eine Zelle 219 enthalten (die den Zellenoberflächenmarker, d.h. positive und negative Reaktions-Teilmengen, wobei nur die positive gezeigt ist, darstellen oder nicht darstellen kann). Zu den Flüssigkeits-Teilmengen wird ein Puffer hinzugefügt. Zum Beispiel werden gemäß den hier beschriebenen Verfahren Tropfen, die einen Puffer enthalten, mit Assay-Tropfen verschmolzen. Der Puffer schwächt effektiv das Hintergrundsignal. Bei bestimmten Ausführungsformen wird durch das Hinzufügen des Puffers das lokalisierte Fluoreszenzsignal nicht wesentlich verändert (z.B. in Zusammenhang mit reaktionspositiven Beispielen der Zelle 219). Die in 16C dargestellte Vorgehensweise ermöglicht einen Bindungs- oder Inkubationsschritt zur Durchführung bei einer wesentlich höheren Konzentration (z.B. entsprechend einer Konzentration, die in der linken Darstellung von 16A gezeigt ist), während bei dem Detektionsschritt eine Hintergrund- (nicht lokalisierte) Fluoreszenz bei einer unterschiedlichen Konzentration verwendet werden kann.
Die lokalisierte Fluoreszenz ist in Kombination mit anderen hier beschriebenen Assays und Verfahren anwendbar, einschließlich zum Beispiel auf dem Bead-Einfangen basierte Assays, die ein Aufreißen oder Öffnen einer Teilmenge zum Freisetzen des Inhalts umfasst (da das Signal auf dem eingefangenen Bead lokalisiert bleiben kann, wenn es zum Beispiel in eine Fluid-Teilmenge zurückgeführt wird).
Digital-Verteilungs-Assays
Bei einigen Aspekten werden mit der Erfindung Systeme und Verfahren zum Detektieren von Verteilungen von Molekülen geschaffen. Zum Beispiel sind die erfindungsgemäßen Verfahren zum Detektieren von Umfängen von Genexpression und Proteinen sinnvoll. Insbesondere sind die erfindungsgemäßen Verfahren zum Detektieren von Proteinaggregation oder -komplexen sinnvoll. Bei einem Beispiel werden die erfindungsgemäßen Verfahren zum Detektieren von anomalen oder unerwarteten Verteilungen von Proteinen durch Durchführen einer chemischen Reaktion, bei der ein detektierbarer Report erzeugt wird, der das Vorhandensein und die Menge an Protein anzeigt (z.B. ein ELISA oder ähnlicher Assay). Die Ergebnisse dieser Assays werden mit erwarteten Ergebnissen oder Kontrollproben verglichen, um zu bestimmen, ob es eine anomale Verteilung oder Menge eines speziellen Proteins gibt.
Bei bestimmten Ausführungsformen wird die Erfindung zum Bestimmen einer anomalen Proteinaggregation verwendet. Bei Proben aus dem anomalen Subsatz können Peptidaggregation oder -komplexe mittels der Verteilung von Reaktionen in Flüssigkeits-Teilmengen detektiert werden (z.B. digital) im Vergleich zu der Verteilung aus dem nichtanomalen Rest der Population. Ein solches Phänomen kann auftreten, wenn bekannt ist oder vermutet wird, dass ein Protein alternative Spleiß-, Binde- oder Faltwege zeigt oder in einem stabilen Komplex vorliegt. Zum Beispiel kann bekannt sein, dass ein Protein unterschiedlich verarbeitet wird (z.B. aufgespalten mittels Hydrolyse oder Proteolyse; modifiziert, wie z.B. durch Phosphorylierung, vernetzt; etc.), so dass ein Komplex oder Aggregat gebildet wird, wenn Personen eine Krankheitsanfälligkeit oder einen Krankheitszustand aufweisen.
Bei der Alzheimer-Krankheit können zum Beispiel dann, wenn ein Amyloid-Vorläufer-Protein (amyloid precurser protein - APP) einer Proteolyse unterzogen wird, die daraus resultierenden Fragmente Aggregationen, wie z.B. Fibrillen, bilden. Es wird insbesondere hypothetisch angenommen, dass ein Protein, das als tau bezeichnet wird, hyperphosphoryliert wird, wodurch die Aggregation bewirkt wird, die zu Neurofibrillenbündeln und Neuronendisintegration führt. Somit kann die Alzheimer-Krankheit generell mit einer Aggregation von Beta-Amyloid-Protein assoziiert werden. Eine Akkumulation von aggregierten Amyloidfibrillen kann eine Apoptose oder andere kritische Enzymfunktionen hervorrufen und kann andere kritische Enzymfunktionen inhibieren.
Diese Aggregation zwischen Proteinen kann dazu führen, dass es eine anomale (z.B. Nicht-Poisson-) Verteilung dieser Proteine gibt, wenn diese unter Verdünnungsbedingungen einem Assay unterzogen werden, wodurch eine Poisson-artige statistische Verteilung hervorgerufen werden sollte, und diese nicht-standardmäßige Verteilung kann die Basis für einen digitalen Detektions-Assay bilden.
Somit werden digitale Assays geschaffen, die sich auf Verteilungen von Proteinen und anderen zellulären Komponenten beziehen. Assays gemäß den erfindungsgemäßen Verfahren umfassen das Bestimmen einer tatsächlichen Verteilung und das Vergleichen dieser mit einer erwarteten Verteilung.
19 zeigt Histogramme entsprechend drei unterschiedlichen Phasen der Proteinaggregation. Das mit „normal“ bezeichnete Histogramm zeigt eine erwartete Verteilung von Proteinen an, die nicht aggregieren. Das mit „früh“ bezeichnete Histogramm zeigt eine detektierte Verteilung an, bei der Proteine begonnen haben, eine Aggregation zu zeigen. Das mit „spät“ bezeichnete Histogramm zeigt eine detektierte Verteilung von Proteinen an, die eine extensive Aggregation zeigen.
Assays hinsichtlich digitaler Verteilungs-Assays umfassen jeglichen Assay, der eine Anzahl von Proteinmolekülen pro Flüssigkeits-Teilmenge anzeigen kann. Zum Beispiel kann dort, wo ein Protein ein Epitop aufweist, das entweder in einer monomeren oder aggregierten Form verfügbar ist, ein Assay Antikörper umfassen, die an dasjenige (diejenigen) Epitop(e) gebunden sind, das (die) in jeder Flüssigkeits-Teilmenge mit Reportern gekoppelt ist (sind). Jeder Antikörper kann mit einem Enzym vernetzt sein (kovalent oder nicht, z.B. durch Biotin). Jede Flüssigkeits-Teilmenge ist mit einem fluoreszierend markierten Substrat für das Enzym versehen, das fluoresziert, wenn das Enzym eine Reaktion auf dem Substrat katalysiert.
Es wird eine Probe von einem Subjekt entnommen (z.B. eine Blutprobe von einem Patienten). Jeglicher gewünschte Konzentrier-, Isolier- oder Aufbereitungsschritt wird derart durchgeführt, dass die Target-Moleküle einem Reporter für eine digitale Detektion in Teilmengen zugeordnet werden. Die Probe, die das interessierende Protein und den Reporter aufweist, wird in Flüssigkeits-Teilmengen aufgeteilt (dieses veranschaulichende Beispiel wird hinsichtlich eines Proteins diskutiert, es sei jedoch angemerkt, dass mit den erfindungsgemäßen Verfahren eine Verteilung jegliches Target detektiert werden kann, wodurch eine Aggregation oder ein Komplex angezeigt wird).
Wenn der fluoreszierende Reporter für sämtliche Antikörper der gleiche ist, wird die Anzahl von Proteinen in jeder Flüssigkeit durch die Fluoreszenzintensität des Signals angezeigt. Dies kann im „Kinetik“modus oder „Endpunkt“modus erfolgen. Im Endpunktmodus kann jede Reaktion im Wesentlichen bis zum Abschluss ablaufen, und an diesem Punkt hat die Menge des Produkts im Wesentlichen ein Plateau erreicht. Die Menge an Produkt wird dann in jeder Flüssigkeits-Teilmenge detektiert, und die Anzahl von Proteinen in jeder Teilmenge wird mit der Stärke des Signals korreliert. Die gleiche Korrelation gilt im Kinetikmodus. Messungen werden jedoch zu einem oder mehreren Zeitpunkten durchgeführt, bevor die Menge an Produkt ein Plateau erreicht. Wenn sich eine ganze Reihe von Zeitpunkten ansammelt, liefert diese Zeitreihe auch Informationen über die Enzymkinetik.
Bei bestimmten Ausführungsformen, bei denen ein Assay im Kinetikmodus abläuft, wird ein Zeitpunkt für die Messung zuerst bei einem unabhängigen Kalibrierdurchlauf festgelegt. Eine Reihe von Tropfen wird hergestellt und inkubiert. Die Tropfen werden mit einer Verdünnung eines Proteins, von dem bekannt ist, dass es aggregiert, und einem Reportersystem (z.B. einem Enzym-vernetzten Antikörper, der sich an ein Epitop des Proteins bindet) versehen. Die Fluoreszenzintensität wird zu mehreren Zeitpunkten gemessen. Wenn zum Beispiel die Messung auf dem Chip und die Inkubation außerhalb des Chips erfolgt, werden sämtliche Schritte bei einer Temperatur durchgeführt, bei der das Enzym keine Aktivität außer der Inkubation zeigt, wobei eine Temperatur involviert ist, bei der das Enzym eine Aktivität zeigt. Zum Beispiel zeigt β-gal keine Aktivität bei 4 °C und ist aktiv bei 37 °C. Bei jeglichem vorgegebenen N-mer von aggregiertem Protein zeigen die Flüssigkeits-Teilmengen, die ein solches N-mer aufweisen, eine charakteristische sigmoidale Zeitkurve, nachdem eine Reihe von Messungen der Fluoreszenz durchgeführt worden ist. Zur Unterscheidung zwischen einigen Sätzen von N-meren, wird ein Punkt entlang der Zeitkurve des Diagramms, an dem die entsprechende sigmoidale Zeitkurve eindeutige Höhen zeigt, als Messzeit genommen.
Bei einigen Ausführungsformen ist eine erwartete Verteilung (d.h. von einer gesunden Person) bekannt und braucht ein Assay nur zwischen einer detektierten Verteilung und einer erwarteten Verteilung zu unterscheiden. Somit kann dort, wo zum Beispiel eine erwartete Verteilung ein bekanntes Verhältnis von Teilmengen, die 1 Target aufweisen, zu Teilmengen, die mehr als ein Target aufweisen, umfasst, ein Assay das Detektieren eines Verhältnisses von Teilmengen, die 1 Target aufweisen, zu Teilmengen, die mehr als ein Target aufweisen, umfassen, das sich statistisch signifikant von dem bekannten Verhältnis unterscheidet. Bei einigen Ausführungsformen wird erwartet, dass ein nichtaggregierendes Partikel eine Poisson- oder nahe-Poisson-Verteilung zeigt und ein Assay das Detektieren einer Anzahl von Tropfen umfasst, die mehr als ein Target-Modul enthalten, wobei die detektierte Anzahl nicht mit der Poisson- oder nahe-Poisson-Verteilung übereinstimmt. Bei einigen Ausführungsformen wird erwartet, dass eine Poisson-Verteilung bei einer bestimmten Verdünnung eine verschwindend geringe Anzahl von Flüssigkeits-Teilmengen, die zwei Target-Moleküle aufweisen, und null Flüssigkeits-Teilmengen, die mehr als zwei aufweisen, ergibt. Somit kann ein Assay eine statistisch signifikante Anzahl von Teilmengen detektieren, die mehr als ein Molekül aufweisen, um das Vorhandensein einer Proteinaggregation anzuzeigen und somit das Vorhandensein eines physiologischen Zustands anzuzeigen. Zur Referenz zeigt 3A ein Messergebnis, das eine Proteinaggregation anzeigen kann (d.h. nicht mit der erwarteten Verteilung oder Poisson übereinstimmt).
Bei einer alternativen Ausführungsform ist jede Flüssigkeits-Teilmenge mit Enzym-vernetzten Antikörpern versehen, bei denen sämtliche Antikörper gleich sind, jedoch eine Fraktion (z.B. die Hälfte) mit einem Enzym vernetzt ist, das auf einem Substrat wirksam ist, um einen Reporter zu erzeugen, und der andere Teil der Antikörper mit einem anderen Enzym vernetzt ist, das eine Reaktion katalysiert, durch die ein unterschiedlicher Reporter produziert wird. Bei diesem Beispiel produziert unter der Annahme, dass ein Reporter blau ist und einer gelb ist, eine Anzahl von Flüssigkeits-Teilmengen, die mehr als ein Protein aufweisen, sowohl den blauen als auch den gelben Reporter. Wenn das Protein nicht aggregiert, kann bei einer bestimmten Verdünnung erwartet werden, dass blau und gelb zusammen in nur einer gewissen Anzahl von Tropfen (z.B. null oder 0,00001 % derselben) zu finden ist. Bei diesem Beispiel zeigt das Detektieren von blau mit gelb in einer größeren Anzahl von Tropfen (z.B. 0,05 %, 1 % etc.) an, dass das Protein aggregiert.
Bei Verteilungs-Assays, bei denen die Signalstärke eine Anzahl von Proteinen im Tropfen anzeigt, gibt es für eine vorgegebene Verdünnung der Probe in Tropfen unter der Annahme einer willkürlichen Verteilung eines nicht aggregierenden Proteins eine charakteristische erwartete Verteilung. Selbst bei einem Protein, das unter normalen Bedingungen eine gewisse Aggregation zeigt, gibt es eine charakteristische erwartete Verteilung. Bei bestimmten Ausführungsformen wird die erwartete Verteilung durch Poisson vorhergesagt oder ist Poisson-ähnlich. Eine sehr große Anzahl von Tropfen enthält null Proteine. Eine große Vielzahl der Tropfen, die ein Protein enthalten, enthält 1 Protein. Eine kleine (möglicherweise verschwindend kleine) Anzahl von proteinenthaltenden Tropfen enthält 2 oder mehr.
In dem Fall, in dem die Proteine aggregieren, wird eine solche erwartete Verteilung nicht erhalten. Zum Beispiel enthält bei einem voll aggregierten Protein (z.B. „späte“ Phase), das in 4-mere aggregiert, eine sehr große Anzahl von Tropfen null Proteine und enthält eine große Anzahl von Tropfen, die ein Protein enthalten, vier Proteine, wie in 19 dargestellt.
Ferner kann die Aggregation über die Zeit detektiert werden. Das heißt, dass frühe Phasen der Aggregation eine nichterwartete Verteilung zeigen. Bei einigen Ausführungsformen wird ein Protein, das sich in tertiäre Strukturen und/oder eine quaternäre Anordnung faltet, über beispielsweise Minuten, Stunden oder Tage untersucht. Bei bestimmten Ausführungsformen zeigt eine Verteilung der Aggregation in einer Probe eine Fortschrittsphase eines aggregationsbezogenen Zustands an, dessen Fortschritt Monate, Jahre oder Jahrzehnte dauert. Zum Beispiel können Verteilungen einer späten Phase erst nach ungefähr 50 oder 75 Jahren erwartet werden. Ein Assay-Durchlauf zu einer früheren Zeit (z.B. 15 oder 25 Jahre) kann jedoch eine Aggregation einer „frühen“ Phase anzeigen, wie in 19 gezeigt.
Bei bestimmten Aspekten wird mit der Erfindung ein Verfahren zum Detektieren eines physiologischen Zustands bei einem Menschen geschaffen, das das Bilden von Flüssigkeits-Teilmengen umfasst, die Komponenten einer chemischen Reaktion aufweisen, wobei mindestens eine Komponente eine detektierbare Markierung aufweist, auf die eine chemische Reaktion wirkt. Die Reaktion erfolgt in den Teilmengen, und eine Anzahl von reaktionspositiven Teilmengen wird identifiziert, und eine Menge der Komponente wird bestimmt. Eine statistisch erwartete Verteilung oder Menge der Komponente wird berechnet und mit der tatsächlichen Verteilung oder Menge verglichen. Die Ergebnisse des Vergleichs können das Vorhandensein eines Aggregationsphänomens anzeigen.
Bei einigen Ausführungsformen wird mit der Erfindung ein Verfahren zum Testen eines Ansprechens auf eine Behandlung hinsichtlich eines Zustands oder einer Überwachung eines Fortschritts eines Zustands geschaffen. Ein Zustand umfasst Zustände, die durch eine Aggregation gekennzeichnet sind, wie zum Beispiel die Alzheimer-Krankheit. Das Bestimmen eines Ansprechens auf eine Behandlung ist in Verfahren zum Entwickeln von Behandlungen, wie zum Beispiel einer Arzneimittelentwicklung, enthalten. Bei einigen Aspekten wird ein Arzneimittelkandidat getestet (z.B. verabreicht). Es wird eine Probe entnommen und eine Verteilung von Molekülen bestimmt. Die Moleküle können ein Protein, wie z.B. ein Beta-Amyloid, sein. Auf der Basis der ermittelten Verteilung wird eine Wirksamkeit des Arzneimittels bewertet und kann eine Empfehlung gegeben werden. Bei einigen Aspekten wird der Fortschritt einer Krankheit mittels Verfahren überwacht, die das Entnehmen einer Probe und das Bestimmen einer Verteilung von Molekülen innerhalb der Probe gemäß hier beschriebener Methodologien umfassen.
Erfindungsgemäße Digital-Verteilungs-Assays sind hochempfindlich und können bei sehr kleinen Proben schnell erfolgen. Zum Beispiel kann eine biologische Probe von 5 ml in weniger als einem Tag (z.B. ungefähr einer Stunde) einem Assay unterzogen werden und kann eine Aggregationsphase bestimmt werden.
Bei bestimmten Ausführungsformen ist das Protein ein Beta-Amyloid. Eine Probe menschlichen Bluts kann für den Assay entnommen werden. Eine erwartete Verteilung kann berechnet (z.B. statistisch gemäß Poisson), empirisch abgeleitet (z.B. Probennahme bei zahlreichen Mitgliedern einer Population für das Majoritäts-Muster) oder aus einer Referenz, wie z.B. einer digitalen Datei oder einem Chart, erhalten werden. Entsprechend bietet bei einigen Ausführungsformen die Erfindung einen Bluttest für die Alzheimer-Krankheit. Bei bestimmten Ausführungsformen kann ein erfindungsgemäßer Assay an einem Patienten in jeder Lebensphase (z.B. Kindheit, Teenagerzeit etc.) durchgeführt werden. Es sei angemerkt, dass jegliches Aggregationsmuster einer Detektion mittels eines Digital-Verteilungs-Assay unterzogen werden kann und die Aggregation generell das umgekehrte Phänomen der Fragmentierung umfasst. Somit können Targets für einen Digital-Verteilungs-Assay Peptide, Nukleinsäure, Kohlenhydrate, Lipide oder andere Moleküle umfassen. Mit einem Verteilungs-Assay kann eine Phase der Fragmentierung sowie eine Phase der Polymerisierung bestimmt werden (z.B. Veresterung, Polypeptidbildung, Kohlenhydratvernetzung, synthetische Polymerisierung etc.).
Tropfenbildung
Die erfindungsgemäßen Verfahren umfassen das Bilden von Probentropfen. Die Tropfen sind wässrige Tropfen, die von einer unmischbaren Trägerflüssigkeit umgeben sind. Die Verfahren zum Bilden solcher Tropfen sind zum Beispiel bei Link et al. ( US-Patentanmeldung Nr. 2008/0014589, 2008/0003142 und 2010/0137163 ), Stone et al. ( US-Patent Nr. 7,708,949 und US-Patentanmeldung Nr. 2010/0172803 ), Anderson et al. ( US-Patent Nr. 7,041,481 , neu ausgegeben als RE41 780) und Europäische Veröffentlichung Nr. EP2047910 an RainDance Technologies Inc. gezeigt. Deren Inhalt ist jeweils hier in seiner Gesamtheit durch Verweis einbezogen. Tropfen können mit verschiedenen gleichförmigen Größen, einer nichtgleichförmigen Größe oder einem Bereich von Größen gebildet werden.
17 zeigt ein Ausführungsbeispiel einer Vorrichtung 100 für die Tropfenbildung. Die Vorrichtung 100 weist einen Einlasskanal 101, einen Auslasskanal 102 und zwei Trägerflüssigkeitskanäle 103 und 104 auf. Die Kanäle 101, 102, 103 und 104 treffen sich am Knotenpunkt 105. Der Einlasskanal 101 leitet eine Probenflüssigkeit zu dem Knotenpunkt 105. Die Trägerflüssigkeitskanäle 103 und 104 leiten eine Trägerflüssigkeit, die mit der Probenflüssigkeit unmischbar ist, zu der Knotenpunkt 105. Der Einlasskanal 101 verengt sich an seinem distalen Abschnitt, wobei er sich mit dem Knotenpunkt 105 verbindet (siehe 18). Der Einlasskanal 101 ist rechtwinklig zu den Trägerflüssigkeitskanälen 103 und 104 orientiert. Tropfen werden gebildet, wenn die Probenflüssigkeit aus dem Einlasskanal 101 zu dem Knotenpunkt 105 fließt, wo die Probenflüssigkeit mit der fließenden Trägerflüssigkeit, die über die Trägerflüssigkeitskanäle 103 und 104 dem Knotenpunkt 105 zugeführt wird, interagiert. Der Auslasskanal 102 nimmt die Tropfen der Probenflüssigkeit, die von der Trägerflüssigkeit umgeben sind, auf.
Die Probenflüssigkeit ist typischerweise eine wässrige Pufferlösung, wie z.B. ultrareines Wasser (z.B. 18 Megaohm spezifischer Widerstand, erhalten zum Beispiel durch Säulenchromatografie), 10 mM Tris HCl und 1 mM EDTA (TE)-Puffer, phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) oder Acetatpuffer. Jegliche Flüssigkeit oder jeglicher Puffer, die/der mit Enzymen physiologisch kompatibel ist, kann verwendet werden. Die Trägerflüssigkeit ist mit der Probenflüssigkeit unmischbar. Die Trägerflüssigkeit kann ein nichtpolares Lösungsmittel, Decan (z.B. Tetradecan oder Hexadecan), Fluorkohlenstofföl, Silikonöl oder ein anderes Öl (zum Beispiel Mineralöl) sein.
Bei bestimmten Ausführungsformen enthält die Trägerflüssigkeit ein oder mehrere Additive, wie z.B. Stoffe, der die Oberflächenspannungen verringert (Tenside). Tenside können Tween, Span, fluorenthaltende Tenside und andere Stoffe, die in Öl relativ zu Wasser lösbar sind, umfassen. Bei einigen Anwendungen wird die Leistung durch Hinzufügen eines zweiten Tensids verbessert. Tenside können das Steuern oder Optimieren von Tropfengröße, -fließen und -gleichförmigkeit zum Beispiel durch Verringern der Scherkraft, die zum Extrudieren oder Injizieren von Tropfen in einen Kanal erforderlich ist, unterstützen. Dadurch können Tropfenvolumen und -periodizität oder die Rate oder Frequenz, mit der Tropfen in einen kreuzenden Kanal gebrochen werden, beeinflusst werden. Ferner kann das Tensid zum Stabilisieren von wässrigen Emulsionen in fluorierten Ölen durch Koaleszieren dienen.
Bei bestimmten Ausführungsformen können die Tropfen mit einem Tensid beschichtet sein. Bevorzugte Tenside, die zu der Trägerflüssigkeit hinzugefügt werden können, umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, Tenside, wie z.B. sorbitanbasierte Carbonsäureester (z.B. die „Span“-Tenside, Fluka Chemika), einschließlich Sorbi-tanmonolaureat (Span 20), Sorbitanmonopalmitat (Span 40), Sorbitanmonostearat (Span 60) und Sorbitanmonooleat (Span 80) und perfluorierte Polyether (z.B. DuPont Krytox 157 FSL, FSM und/oder FSH). Weitere nicht als Einschränkung zu verstehende Beispiele für nichtionische Tenside, die verwendet werden können, umfassen polyoxyethylenierte Alkylphenole (zum Beispiel Nonyl-, p-Dodecyl- und Dinonylphenole), polyoxyethylenierte geradkettige Alkohole, polyoxyethylenierte Polyoxypropylenglykole, polyoxyethylenierte Mercaptane, langkettige Carbonsäureester (zum Beispiel Glyceryl- und Polyglycerylester von natürlichen Fettsäuren, Propylenglykol, Sorbit, polyoxyethylenierte Sorbitester, Polyoxyethylenglykolester etc.) und Alkanolamide (z.B. Diethanolamin-Fettsäurekondensate und Iso-propanolamin-Fettsäurekondensate).
Bei bestimmten Ausführungsformen kann bewirkt werden, dass die Trägerflüssigkeit durch den Auslasskanal strömt, so dass mit dem Tensid in der Trägerflüssigkeit die Kanalwände beschichtet werden. Bei einer Ausführungsform kann das Fluortensid durch Reagieren des perfluorierten Polyethers DuPont Krytox 157 FSL, FSM oder FSH mit wässrigem Ammoniumhydroxid in einem flüchtigen fluorierten Lösungsmittel hergestellt werden. Das Lösungsmittel und das Restwasser und Ammoniak können mit einem Rotationsverdampfer entfernt werden. Das Tensid kann dann in einem fluorierten Öl (z.B. Flourinert (3M)) aufgelöst werden (z.B. 2,5 Gew.-%), das dann als Trägerflüssigkeit dient.
Unbekannte oder bekannte Analyte oder Verbindungen über einen sehr breiten Dynamikbereich von Konzentrationen können mit Tropfen, die ein einziges oder mehrere Enzymmoleküle und Reporter enthalten, durch Anwendung einer Taylor-Dispersion, die vor der Tropfenbildungsdüse gebildet wird, verschmolzen werden. Eine Mitverkapselung eines optischen Farbstoffs, der auf ähnliche Weise über ein Taylor-Fließprofil dispergiert worden ist, kann zum Verfolgen der Analyt-/Verbindungskonzentration angewendet werden (siehe z.B. Miller et al., PNAS 109(2):378-383 (2012); US-Pat. 7,039,527 ; und US-Pub. 2011/0063943 , deren Inhalt hier in seiner Gesamtheit durch Verweis einbezogen ist).
Bei bestimmten Ausführungsformen wird eine Aliquote einer Probe in ein PEEK-Röhrchen gesaugt, so dass ein Teil der Probe mit einer im Wesentlichen gleichmäßigen Konzentration in dem PEEK-Röhrchen ist. Das Röhrchen wird in einen Port in einen mikrofluidischen Kanal eingesetzt, und die Probe tritt in den Kanal ein und bildet einen Konzentrationsgradienten in der wässrigen Phase, wobei der Gradient generell der Taylor-Aris-Dispersionsmechanik folgt. Die Probenflüssigkeit verbindet sich mit der Trägerflüssigkeit, die zuerst eine verschwindend kleine Konzentration aufweist und dann einen Gradienten asymptotisch steigert, bis ein Maximum (z.B. 10 Mikromolar) erreicht ist, wonach er auf ähnliche Weise sinkt. Die Flüssigkeit wird zu einer Tropfendüse geleitet, wo eine Reihe von Tropfen hergestellt wird. Die Probe kann über eine Pumpe, einen Plunger oder durch Druck (z.B. aus einen Gastank) getrieben in den Kanal gedrückt werden.
Bei bestimmten Ausführungsformen wird die Dispersion für jede Teilmenge einer Vielzahl (z.B. für zahlreiche oder sämtliche Wells von einer 96-Well-Platte, bei der jedes Well eine Target-Probe, wie z.B. ein kleines Molekül, aufweist) hergestellt. Mit den erfindungsgemäßen Systemen und Verfahren wird eine Reihe von Mikrotropfen hergestellt, bei denen der Inhalt einen durch einen einfachen Injiziervorgang gesteuerten Konzentrationsgradienten aufweist. Ferner kann die Probe mit einem Farbstoff mit einer bekannten Konzentration versetzt sein und kann die Farbstoffkonzentration stromabwärts gemessen werden (z.B. während eines oder nach einem anderen Assay). Die gemessenen Farbstoffkonzentrationen können zum Bestimmen der Probenkonzentration verwendet werden.
Mittels der hier bereitgestellten Verfahren und Systeme kann ein gesteuerter Gradient von Konzentrationen eines oder mehrerer Proben-Aliquoten mit Tropfen verschmolzen werden, die ein einzelnes Target, wie z.B. ein einzelnes Enzymmolekül, aufweisen. Eine Enzymaktivität kann einem Assay unterzogen werden, und die Kinetik kann untersucht werden. Zum Beispiel können einzelne Enzymmoleküle hinsichtlich eines Konzentrationsbereichs von Aktivatoren, Inhibitoren etc. getestet werden.
Substrate oder andere Reaktions- oder Reporterkomponenten können durch „Mitfließen“ der separaten Komponenten in Tropfen mit dem Enzym mitverkapselt werden, ohne sich vor der Tropfenbildung zu mischen. Wenn ein Mitfließen verwendet wird, wird jede separate Komponente zu dem mikrofluidischen Kanal stromaufwärts der Tropfenbildungsdüse geleitet und fließen beide Komponenten in laminarer Form zu der Düse, ohne sich zu mischen. Beim Mitfließ-Verfahren werden die Komponenten in parallelen Strömen durch einen Kanal geleitet. Aufgrund der Fließdynamik mischt sich der Inhalt der Ströme nicht, bis sie auf den Lambda-Injektor oder die Tropfenbildungsdüse auftreffen. Zwei separate Ströme können gemeinsam fließen, oder drei, vier oder mehr. Wenn die Hardware für N Ströme konfiguriert ist und N-1 Ströme, die Reaktionskomponenten enthalten, gewünscht sind, kann ein „Dummy“-Strom von Wasser oder Kochsalzlösung vorgesehen sein.
Eine weitere Technik zum Bilden von Tropfen, die Enzyme und Substrate aufweisen, aus unterschiedlichen Flüssigkeiten oder zuvor erzeugten Tropfen umfassen ein Verschmelzen von Tropfen. Das Verschmelzen von Tropfen kann zum Beispiel unter Anwendung einer oder mehrerer Tropfenverschmelztechniken erfolgen, die zum Beispiel bei Link et al. ( US-Patentanmeldung Nr. 2008/0014589, 2008/0003142 und 2010/0137163 ) und Europäische Veröffentlichung Nr. EP2047910 an RainDance Technologies Inc. beschrieben sind. Bei Ausführungsformen, die das Verschmelzen von Tropfen umfassen, werden zwei Tropfenbildungsmodule verwendet. Ein erstes Tropfenbildungsmodul produziert die Tropfen, die Enzyme aufweisen. Ein zweites Tropfenbildungsmodul produziert Tropfen, die ein Substrat enthalten. Die Tropfenbildungsmodule sind derart angeordnet und gesteuert, dass sie eine wechselseitige Verzahnung von Tropfen, die durch einen Kanal fließen, erzeugen. Eine solche Anordnung ist zum Beispiel bei Link et al. ( US-Patentanmeldung Nr. 2008/ 0014589, 2008/0003142 und 2010/ 0137163 ) und Europäische Veröffentlichung Nr. EP2047910 an RainDance Technologies Inc. beschrieben.
Es wird dann bewirkt, dass die Tropfen verschmelzen, wodurch ein Tropfen produziert wird, der Enzyme und Substrate aufweist. Die Tropfen können zum Beispiel verschmelzen durch: Erzeugen von dielektrophoretischen Kräften auf den Tropfen unter Verwendung von Gradienten eines elektrischen Felds und dann Steuern der Kräfte zum Bewirken, dass die Tropfen verschmelzen; Produzieren von Tropfen mit unterschiedlichen Größen, die sich somit mit unterschiedlichen Geschwindigkeiten bewegen, wodurch bewirkt wird, dass die Tropfen verschmelzen; und Produzieren von Tropfen mit unterschiedlichen Viskositäten, die sich somit mit unterschiedlichen Geschwindigkeiten bewegen, wodurch bewirkt wird, dass die Tropfen miteinander verschmelzen. Jede dieser Techniken wird bei Link et al. ( US-Patentanmeldung Nr. 2008/0014589, 2008/0003142 und 2010/0137163 ) und Europäische Veröffentlichung Nr. EP2047910 an RainDance Technologies Inc. weiter beschrieben. Eine weiterführende Beschreibung des Erzeugens und Steuerns von dielektrophoretischen Kräften auf den Tropfen zum Bewirken, dass die Tropfen verschmelzen, ist bei Link et al. ( US-Patentanmeldung Nr. 2007/0003442 ) und Europäisches Patent Nr. EP2004316 an RainDance Technologies Inc. beschrieben. Es können weitere Verfahren zum gesteuerten Verschmelzen von Tropfen zum Beispiel durch Verändern der Fließprofile von gepaarten Tropfen über eine Auslegung eines angemessen eingeengten mikrofluidischen Kanals angewendet werden. Verschmelzungen können sukzessive durchgeführt werden, wodurch ein schrittweises Hinzufügen von Substraten, Reagenzien oder Reaktionsstufenkomponenten ermöglicht wird.
Eine weitere Vorgehensweise zum Bilden eines Tropfens, der Enzyme und Substrate aufweist, umfasst das Bilden eines Tropfens, der Enzyme aufweist, und Inkontaktbringen des Tropfens mit einem Flüssigkeitsstrom, der ein Substrat aufweist, wobei ein Teil des Flüssigkeitsstroms in den Tropfen integriert wird, um einen Tropfen zu bilden, der Enzyme und Substrate aufweist. Bei dieser Vorgehensweise braucht nur eine Phase einen Verschmelzungsbereich in Form eines Tropfens zu erreichen. Eine weitere Beschreibung eines solchen Verfahrens ist in der gleichzeitig anhängigen, mitgehaltenen US-Patentanmeldung von Yurkovetsky (US-Patentanmeldungs-Ser.-Nr. 61/441,985 und US-Patentanmeldung Nr. 13/371,222 ) dargelegt, deren Inhalt hier in seiner Gesamtheit durch Verweis einbezogen ist.
Ein Tropfen wird wie oben beschrieben gebildet. Nach dem Bilden wird der Tropfen mit einem zweiten Probenflüssigkeitsstrom in Kontakt gebracht. Der Kontakt zwischen dem Tropfen und dem Flüssigkeitsstrom führt dazu, dass ein Teil des Flüssigkeitsstroms in den Tropfen integriert wird, um einen Tropfen zu bilden, der Nukleinsäure aus unterschiedlichen Proben aufweist.
Die monodispersen Tropfen der ersten Probenflüssigkeit fließen durch einen ersten Kanal, und zwar durch unmischbare Trägerflüssigkeit voneinander getrennt und suspendiert in der unmischbaren Trägerflüssigkeit. Die Tropfen werden zu dem Verschmelzungsbereich geliefert, d.h. einem Knotenpunkt des ersten Kanals mit dem zweiten Kanal, und zwar durch eine druckgetriebene Strömung, die von einer Verdrängerpumpe erzeugt wird. Wenn der Tropfen im Verschmelzungsbereich ankommt, ragt ein Bolus einer zweiten Probenflüssigkeit aus einer Öffnung des zweiten Kanals in den ersten Kanal. Vorzugsweise sind die Kanäle rechtwinklig zueinander orientiert. Es kann jedoch jeglicher Winkel, der zu einem Kreuzen der Kanäle führt, verwendet werden.
Der Bolus des zweiten Probenflüssigkeitsstroms vergrößert sich weiter aufgrund der Pumpwirkung einer Verdrängerpumpe, die mit dem Kanal verbunden ist, der einen beständigen Strom der zweiten Probenflüssigkeit in den Verschmelzungsbereich ausgibt. Der fließende Tropfen, der die erste Probenflüssigkeit enthält, kommt schließlich mit dem Bolus der zweiten Probenflüssigkeit in Kontakt, der in den ersten Kanal ragt. Der Kontakt zwischen den zwei Probenflüssigkeiten führt dazu, dass ein Teil der zweiten Probenflüssigkeit von dem zweiten Probenflüssigkeitsstrom abgetrennt wird und sich mit dem Tropfen der ersten Probenflüssigkeit verbindet, um einen Mischtropfen zu bilden. Bei bestimmten Ausführungsformen verschmilzt jeder ankommende Tropfen der ersten Probenflüssigkeit mit der gleichen Menge der zweiten Probenflüssigkeit.
Bei bestimmten Ausführungsformen wird eine elektrische Ladung an die erste und die zweite Probenflüssigkeit angelegt. Eine Beschreibung des Anlegens der elektrischen Ladung an die Probenflüssigkeiten ist bei Link et al. ( US-Patentanmeldung Nr. 2007/0003442 ) und Europäisches Patent Nr. EP2004316 an RainDance Technologies Inc. (Lexington, MA) dargelegt, deren Inhalt hier in seiner Gesamtheit durch Verweis einbezogen ist. Die elektrische Ladung kann in der ersten und der zweiten Probenflüssigkeit innerhalb der Trägerflüssigkeit unter Anwendung jeglicher geeigneten Technik erzeugt werden, zum Beispiel durch Platzieren der ersten und der zweiten Probenflüssigkeit in ein elektrisches Feld (das Wechselstrom, Gleichstrom etc. sein kann) und/oder durch Bewirken des Auftretens einer Reaktion, die bewirkt, dass die erste und die zweite Probenflüssigkeit eine elektrische Ladung aufweisen, zum Beispiel einer chemischen Reaktion, einer ionischen Reaktion, einer photokatalytischen Reaktion etc.
Das elektrische Feld wird bei einigen Ausführungsformen durch einen elektrischen Feldgenerator erzeugt, d.h. eine Vorrichtung oder ein System, die/das in der Lage ist, ein elektrisches Feld zu erzeugen, das an die Flüssigkeit angelegt werden kann. Der elektrische Feldgenerator kann ein Wechselstromfeld (d.h. eines, das periodisch relativ zur Zeit variiert, zum Beispiel sinusförmig, sägezahnförmig, quadratisch etc.), ein Gleichstromfeld (d.h. eines, das relativ zur Zeit konstant ist), ein gepulstes Feld etc. erzeugen. Der elektrische Feldgenerator kann zum Erzeugen eines elektrischen Felds in einer Flüssigkeit, die in einem Kanal oder einem mikrofluidischen Kanal enthalten ist, konstruiert und angeordnet sein. Der elektrische Feldgenerator kann bei einigen Ausführungsformen einstückig mit dem fluidischen System, das den Kanal oder den mikrofluidischen Kanal enthält, oder getrennt von diesem vorgesehen sein.
Techniken zum Erzeugen eines geeigneten elektrischen Felds (das Wechselstrom, Gleichstrom etc. sein kann) sind Fachleuten bekannt. Zum Beispiel wird bei einer Ausführungsform ein elektrisches Feld durch Anlegen einer Spannung über ein Paar von Elektroden erzeugt, die auf dem fluidischen System positioniert oder in dieses eingebettet sein können (zum Beispiel in einem Substrat, das den Kanal oder den mikrofluidischen Kanal bildet) und/oder nahe der Flüssigkeit positioniert sein können, so dass zumindest ein Teil des elektrischen Felds mit der Flüssigkeit interagiert. Die Elektroden können aus jeglichem geeigneten Elektrodenmaterial oder -materialien, das/die Fachleuten bekannt ist/sind, gefertigt sein, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf, Silber, Gold, Kupfer, Kohlenstoff, Platin, Kupfer, Wolfram, Zinn, Cadmium, Nickel, Indiumzinnoxid („ITO“) etc. sowie Kombinationen daraus. In einigen Fällen können transparente oder im Wesentlichen transparente Elektroden verwendet werden.
Das elektrische Feld erleichtert das Aufbrechen der Grenzfläche, das die zweite Probenflüssigkeit und den Tropfen trennt. Das Aufbrechen der Grenzfläche erleichtert das Verschmelzen des Bolus der zweiten Probenflüssigkeit und des Tropfens der ersten Probenflüssigkeit. Der gebildete Mischtropfen vergrößert sich weiter, bis ein Teil der zweiten Probenflüssigkeit von dem zweiten Probenflüssigkeitsstrom abbricht oder von diesem abgeteilt wird, und zwar vor dem Ankommen und Verschmelzen des nächsten Tropfens, der die erste Probenflüssigkeit enthält. Das Abteilen des Teils der zweiten Probenflüssigkeit von dem zweiten Probenflüssigkeitsstrom erfolgt, sobald die Scherkraft, die von der unmischbaren Trägerflüssigkeit auf den gebildeten Mischtropfen aufgebracht wird, die Oberflächenspannung überwindet, deren Aufgabe es ist, den abgeteilten Teil der zweiten Probenflüssigkeit mit dem zweiten Probenflüssigkeitsstrom verbunden zu halten. Der jetzt voll ausgebildete Mischtropfen fließt weiterhin durch den ersten Kanal.
Tropfensortierung
Die erfindungsgemäßen Verfahren können ferner das Sortieren der Tropfen umfassen. Ein Sortiermodul kann einen Knotenpunkt eines Kanals sein, wo der Strom von Tropfen die Richtung ändern kann, um in einen oder mehrere andere Kanäle, z.B. einen Abzweigkanal, einzutreten, und zwar in Abhängigkeit von einem Signal, das in Verbindung mit einer Tropfenabfrage in dem Detektionsmodul aufgenommen wird. Typischerweise wird ein Sortiermodul überwacht und/oder steht unter der Kontrolle des Detektionsmoduls, und daher kann ein Sortiermodul dem Detektionsmodul entsprechen. Die Sortierregion steht in Kommunikation mit und wird beeinflusst von einer oder mehreren Sortiereinrichtungen.
Eine Sortiereinrichtung umfasst Techniken oder Steuersysteme, z.B. ein dielektrisches, elektrisches, elektroosmotisches, (Mikro-) Ventil etc. Ein Steuersystem kann eine Vielzahl von Sortiertechniken zum Ändern oder Leiten des Fließens von Molekülen, Zellen, kleinen Molekülen oder Partikeln in einen vorbestimmten Abzweigkanal anwenden. Ein Abzweigkanal ist ein Kanal, der mit einer Sortierregion und einem Hauptkanal in Kommunikation steht. Der Hauptkanal kann mit zwei oder mehr Abzweigkanälen an dem Sortiermodul oder der Abzweigstelle, die zum Beispiel eine T-Form oder ein Y-Form bildet, kommunizieren. Andere Formen und Kanalgeometrien können verwendet werden, falls gewünscht. Typischerweise nimmt ein Abzweigkanal interessierende Tropfen auf, die von dem Detektionsmodul detektiert und an dem Sortiermodul sortiert werden. Ein Abzweigkanal kann ein Auslassmodul aufweisen und/oder an einem Well oder Reservoir enden, um das Auffangen oder Entsorgen (Auffangmodul bzw. Abfallproduktmodul) der Moleküle, Zellen, kleinen Moleküle oder Partikel zu ermöglichen. Alternativ kann ein Abzweigkanal mit anderen Kanälen in Kommunikation stehen, um eine weitere Sortierung zu ermöglichen.
Ein Charakteristikum eines Flüssigkeitstropfens kann zum Beispiel auf bestimmte Weise wie hier beschrieben erfasst und/oder bestimmt werden (z.B. kann die Fluoreszenz des Flüssigkeitstropfens bestimmt werden), und in Reaktion darauf kann ein elektrisches Feld an den Flüssigkeitstropfen angelegt oder von diesem entfernt werden, um den Flüssigkeitstropfen in eine spezielle Region (z.B. einen Kanal) zu leiten. Bei bestimmten Ausführungsformen wird ein Flüssigkeitstropfen sortiert oder gelenkt durch Induzieren eines Dipols in dem ungeladenen Flüssigkeitstropfen (der anfangs geladen oder ungeladen sein kann) und Sortieren oder Lenken des Tropfens unter Verwendung eines angelegten elektrischen Felds. Das elektrische Feld kann ein Wechselstromfeld, ein Gleichstromfeld etc. sein. Zum Beispiel teilt sich ein Kanal, der Flüssigkeitstropfen und eine Trägerflüssigkeit enthält, in einen ersten und einen zweiten Kanal an einer Abzweigstelle. Generell ist der Flüssigkeitstropfen ungeladen. Hinter der Abzweigstelle ist eine erste Elektrode nahe dem ersten Kanal positioniert und ist eine zweite Elektrode nahe dem zweiten Kanal positioniert. Eine dritte Elektrode ist nahe der Abzweigstelle des ersten und des zweiten Kanals positioniert. Ein Dipol wird dann unter Verwendung einer Kombination der Elektroden in dem Flüssigkeitstropfen induziert. Durch die Kombination von verwendeten Elektroden wird bestimmt, welcher Kanal den fließenden Tropfen aufnimmt. Somit können durch Anlegen des korrekten elektrischen Felds die Tropfen wie gewünscht entweder in den ersten oder den zweiten Kanal geleitet werden. Eine weiterführende Beschreibung der Tropfensortierung ist zum Beispiel bei Link et al. ( US-Patentanmeldung Nr. 2008/0014589, 2008/ 0003142 und 2010/0137163 ) und Europäische Veröffentlichung Nr. EP2047910 an RainDance Technologies Inc. dargelegt.
Die Tropfensortierung bezieht sich auf hier beschriebene Verfahren und Systeme, die das Detektieren der Wirkung einer enzymatischen Reaktion in einer Flüssigkeits-Teilmenge (oder das Nichtvorhandensein derselben) und das selektive weitere Untersuchen dieser spezifischen Teilmenge ermöglichen. Zum Beispiel kann dort, wo eine spezifische Molekülklasse einem Assay unterzogen wird, ein enzympositiver Tropfen sortiert und von dem Rest getrennt werden. Dieser spezifische Tropfen kann „aufgebrochen“ werden, und sein Inhalt kann weiter untersucht werden. Zum Beispiel kann eine cDNA-Bibliothek aus der gesamten RNA (z.B. mRNA) in diesem Tropfen erstellt werden. Nukleinsäuren können dann sequenziert werden.
Freisetzen aus Tropfen
Die erfindungsgemäßen Verfahren können ferner das Freisetzen der Enzyme oder Produkte oder von anderem identifizierbarem Material aus den Tropfen zur weiteren Analyse umfassen. Verfahren zum Freisetzen von Inhalt aus den Tropfen sind zum Beispiel bei Link et al. ( US-Patentanmeldung Nr. 2008/0014589, 2008/ 0003142 und 2010/0137163 ) und Europäische Veröffentlichung Nr. EP2047910 an RainDance Technologies Inc. gezeigt.
Bei bestimmten Ausführungsformen können Probentropfen im oberen Teil der Trägerflüssigkeit aufrahmen. Bei einem nicht als Einschränkung zu verstehenden Beispiel kann die Trägerflüssigkeit ein Perfluorkohlenstofföl aufweisen, das ein oder mehrere stabilisierende Tenside enthalten kann. Der Tropfen steigt nach oben oder trennt sich dadurch von der Trägerflüssigkeit, dass die Dichte der Trägerflüssigkeit größer ist als diejenige der wässrigen Phase, die den Tropfen bildet. Zum Beispiel beträgt die Dichte des bei einer Ausführungsform der erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Perfluorkohlenstofföls 1,8 im Vergleich zur Dichte der wässrigen Phase des Tropfens, die 1,0 beträgt.
Die aufgerahmten Flüssigkeiten werden dann auf die zweite Trägerflüssigkeit platziert, die ein destabilisierendes Tensid, wie z.B. perfluorierten Alkohol (z.B. 1H,1H,2H,2H-Perfluor-1-Octanol) enthält. Die zweite Trägerflüssigkeit kann ebenfalls ein Perfluorkohlenstofföl sein. Beim Mischen beginnen die wässrigen Tropfen zu koaleszieren, und die Koaleszenz wird durch eine kurze Zentrifugierung bei niedriger Drehzahl (z.B. 1 Minute bei 2000 U/min in einer Mikrozentrifuge) beendet. Die koaleszierte wässrige Phase kann jetzt entfernt und weiter analysiert werden.
Einbeziehung durch Verweis
Verweise auf und Zitate aus andere(n) Dokumente(n), wie z.B. Patente(n), Patentanmeldungen, Patentveröffentlichungen, Fachzeitschriften, Bücher(n), Vorträge(n), Webinhalte(n), sind in dieser Offenbarung durchgehend erfolgt. Sämtliche dieser Dokumente sind hier in ihrer Gesamtheit für sämtliche Zwecke durch Verweis einbezogen.
Äquivalente
Die Erfindung kann in anderen spezifischen Formen ausgeführt werden, ohne dass dadurch vom Geist oder von wesentlichen Kennzeichen derselben abgewichen wird. Die vorstehenden Ausführungsformen sind daher in jeder Hinsicht als Veranschaulichung und nicht als Einschränkung der hier beschriebenen Erfindung zu verstehen.
Offenbarte Elemente

1. Verfahren zum Identifizieren von Komponenten einer chemischen Reaktion, wobei das Verfahren umfasst:
- Bilden von Flüssigkeits-Teilmengen, die Komponenten einer chemischen Reaktion umfassen, wobei mindestens eine der Komponenten eine detektierbare Markierung umfasst, auf die durch die chemische Reaktion gewirkt wird;
- Durchführen der chemischen Reaktion;
- Bestimmen einer Menge mindestens einer der Komponenten auf der Basis der einen oder mehreren Eigenschaften der detektierbaren Markierung in den Flüssigkeits-Teilmengen.
2. Verfahren nach Element 1, wobei die eine oder die mehreren Eigenschaften der detektierbaren Markierung die Menge der detektierbaren Markierung umfasst.
3. Verfahren nach Element 2, wobei die Menge der detektierbaren Markierung durch eine optische Eigenschaft detektiert wird.
4. Verfahren nach Element 1, das ferner den Schritt des Identifizierens von Flüssigkeits-Teilmengen, die eine freigesetzte detektierbare Markierung enthalten, umfasst.
5. Verfahren nach Element 1, wobei die Komponenten ein Enzym und mindestens ein Substrat des Enzyms umfassen.
6. Verfahren nach Element 5, wobei das Enzym eine Reaktion katalysiert, die zum Freisetzen der detektierbaren Markierung aus dem Substrat führt.
7. Verfahren nach Element 6, wobei der Bestimmungsschritt das Quantifizieren einer Menge an Enzym in den Flüssigkeits-Teilmengen umfasst.
8. Verfahren nach Element 7, das ferner das Bestimmen einer Anzahl von Enzymmolekülen innerhalb jeder Teilmenge auf der Basis der Signalstärke der detektierbaren Markierung umfasst.
9. Verfahren nach Element 1, wobei das Bestimmen der Menge der mindestens einen der Komponenten auf einer lokalisierten Konzentration der detektierbaren Markierung basiert.
10. Verfahren nach Element 9, wobei die lokalisierte Konzentration innerhalb einer Flüssigkeits-Teilmenge detektiert wird.
11. Verfahren nach Element 1, wobei die Flüssigkeits-Teilmengen Tropfen sind.
12. Verfahren nach Element 11, wobei die Tropfen von einer unmischbaren Trägerflüssigkeit umgeben sind.
13. Verfahren nach Element 1, wobei das Bestimmen der Menge der mindestens einen der Komponenten auf einem Verhältnis eines lokalisierten Anstiegs zu einer Teilmengen-weiten Abnahme der Signalintensität basiert.
14. Verfahren zum Quantifizieren einer Menge an Enzymmolekülen, wobei das Verfahren umfasst:
- Bilden von Flüssigkeits-Teilmengen, die Enzymmoleküle und Substrate umfassen, wobei mindestens ein Substrat eine detektierbare Markierung umfasst;
- Durchführen einer Enzymreaktion in den Teilmengen, die zum Freisetzen der detektierbaren Markierung führt; und
- Quantifizieren einer Menge an Enzym auf der Basis einer Signalstärke der detektierbaren Markierung.
15. Verfahren nach Element 14, wobei die Signalstärke durch eine Anzahl von Flüssigkeits-Teilmengen, die die detektierbare Markierung aufweisen, gemessen wird.
16. Verfahren nach Element 14, wobei die Signalstärke mit einem Laser gemessen wird.
17. Verfahren zum gleichzeitigen Messen einer Vielzahl von Targets, wobei das Verfahren umfasst:
- Bilden einer Vielzahl von Flüssigkeits-Teilmengen, die mindestens zwei Subsätze umfassen, wobei jeder Subsatz Tropfen umfasst, die ein Target und eine einzigartige Konzentration eines Farbstoffs enthalten;
- Durchführen einer Reaktion in den Teilmengen, die ein Target enthalten;
- Detektieren von Tropfen, in denen eine Reaktion aufgetreten ist, und der Konzentration von Farbstoff in den detektierten Tropfen; und
- Bestimmen einer Menge an Target auf der Basis einer Anzahl von detektierten Tropfen, die jeweils eine Konzentration eines Farbstoffs aufweisen.
18. Verfahren nach Element 17, wobei die Reaktion von einem Enzym in den Flüssigkeits-Teilmengen katalysiert wird.
19. Mikrofluidische Einrichtung zum Identifizieren von Komponenten einer chemischen Reaktion, wobei die Einrichtung umfasst:
- eine Vorrichtung zum Bilden von Flüssigkeits-Teilmengen;
- einen Mechanismus zum Bereitstellen von Komponenten einer chemischen Reaktion, wobei mindestens eine der Komponenten eine detektierbare Markierung umfasst, auf die die chemische Reaktion wirkt;
- einen Detektor zum Detektieren einer oder mehrere Eigenschaften der detektierbaren Markierung in den Flüssigkeits-Teilmengen; und
- eine Einheit zum Bestimmen einer Menge mindestens einer der Komponenten basierend darauf.
20. Einrichtung nach Element 19, wobei der Mechanismus die Reagenzien bereitstellt, wenn die Flüssigkeits-Teilmengen gebildet werden.
21. Verfahren zum Detektieren eines Zustands eines Menschen, wobei das Verfahren umfasst:
- Bilden von Flüssigkeits-Teilmengen, die Komponenten einer chemischen Reaktion umfassen;
- Durchführen der chemischen Reaktion;
- Bestimmen einer Verteilung mindestens eines Produkts der chemischen Reaktion;
- Vergleichen der Verteilung mit einer erwarteten Verteilung des Produkts; und
- Identifizieren des Vorhandenseins des Zustands, wenn sich die Verteilung statistisch signifikant von der erwarteten Verteilung unterscheidet.
22. Verfahren nach Element 21, wobei das Produkt ein Protein ist.
23. Verfahren nach Element 22, wobei das Protein ein Beta-Amyloid-Protein ist.
24. Verfahren nach Element 23, wobei die Verteilung als Aggregat des Beta-Amyloid-Proteins gemessen wird.

ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
Diese Liste der vom Anmelder aufgeführten Dokumente wurde automatisiert erzeugt und ist ausschließlich zur besseren Information des Lesers aufgenommen. Die Liste ist nicht Bestandteil der deutschen Patent- bzw. Gebrauchsmusteranmeldung. Das DPMA übernimmt keinerlei Haftung für etwaige Fehler oder Auslassungen.
Zitierte Patentliteratur

US 61/492602 [0001]
WO 2007/081385 [0070]
WO 2008/063227 [0070, 0076]
US 2010/0022414 [0076, 0096, 0104]
US 2008/0014589 [0135, 0146, 0147, 0158, 0160]
US 2008/0003142 [0135, 0146, 0147, 0158, 0160]
US 2010/0137163 [0135, 0146, 0147, 0158, 0160]
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US 2010/0172803 [0135]
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EP 2047910 [0135, 0146, 0147, 0158, 0160]
US 7039527 [0141]
US 2011/0063943 [0141]
US 2007/0003442 [0147, 0152]
EP 2004316 [0147, 0152]
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Zitierte Nicht-Patentliteratur

Miller et al., PNAS 109(2):378-383 (2012); Kiss, et al. Anal Chem. 80(23):8975-8981 (2008); und Brouzes et al. Droplet microfluid technology for single-cell high throughput screening, 10.1073(PNAS.0903542106 (15. Juli 2009) [0012]

Claims

Mikrofluidische Einrichtung zum Identifizieren von Komponenten einer chemischen Reaktion, wobei die Einrichtung umfasst: eine Vorrichtung zum Bilden von Flüssigkeits-Teilmengen; einen Mechanismus zum Bereitstellen von Komponenten einer chemischen Reaktion, wobei mindestens eine der Komponenten eine detektierbare Markierung umfasst, auf die die chemische Reaktion wirkt; einen Detektor zum Detektieren einer oder mehrerer Eigenschaften der detektierbaren Markierung in den Flüssigkeits-Teilmengen; und eine Einheit zum Bestimmen einer Menge mindestens einer der Komponenten basierend darauf.
Einrichtung nach Anspruch 1, wobei der Mechanismus die Reagenzien bereitstellt, wenn die Flüssigkeits-Teilmengen gebildet werden.
Mikrofluidische Einrichtung zum Quantifizieren von Enzymmolekülen, wobei die Einrichtung umfasst: eine Vorrichtung zum Bilden einer Vielzahl von Flüssigkeits-Teilmengen; einen Mechanismus zum Bereitstellen von Komponenten einer enzymatischen Reaktion, wobei mindestens eine der Komponenten eine detektierbare Markierung umfasst, auf die die enzymatische Reaktion wirkt; einen Detektor zum Detektieren einer oder mehrere Eigenschaften der detektierbaren Markierung in den Flüssigkeits-Teilmengen; und eine Einheit zum Quantifizieren der Enzymmoleküle durch Bestimmen der Anzahl von Flüssigkeits-Teilmengen, die die detektierbare Markierung freigesetzt haben.
Einrichtung nach Anspruch 3, wobei der Mechanismus die Reagenzien bereitstellt, wenn die Flüssigkeits-Teilmengen gebildet werden.
Einrichtung nach Anspruch 3 oder 4, die ferner mikrofluidische Kanäle umfasst, welche derart ausgestaltet sind, dass sie die Komponenten der chemischen Reaktion aufweisen, die Enzymmoleküle und Substrate umfassen, welche darin reagieren, wobei mindestens ein Substrat eine detektierbare Markierung umfasst.
Einrichtung nach einem der Ansprüche 3 oder 4, die ferner mikrofluidische Kanäle umfasst, die derart ausgestaltet sind, dass die chemische Reaktion darin durchgeführt wird.
Einrichtung nach einem der Ansprüche 3 bis 6, wobei der Detektor derart ausgestaltet ist, dass er eine enzymatische Reaktion in mindestens einer der Flüssigkeits-Teilmengen detektiert, wobei die detektierbare Markierung freigesetzt wird.
Einrichtung nach einem der Ansprüche 3 bis 7, wobei der Detektor derart ausgestaltet ist, dass er ein Signal aus der freigesetzten detektierbaren Markierung in mindestens einer Flüssigkeits-Teilmenge detektiert.
Einrichtung nach einem der Ansprüche 3 bis 8, wobei die Vorrichtung zum Bilden von Flüssigkeitspartikeln derart ausgestaltet ist, dass sie einen Flüssigkeitsstrom, der die Substrate umfasst, in eine Vielzahl von Flüssigkeits-Teilmengen, die die Enzymmoleküle umfassen, einleitet.
Einrichtung nach einem der Ansprüche 3 bis 9, die ferner einen Behälter außerhalb des Chips umfasst, der derart ausgestaltet ist, dass er die enzymatische Reaktion darin durchführt.
Einrichtung nach einem der Ansprüche 3 bis 10, die derart ausgestaltet ist, dass sie die Vielzahl von Fluid-Teilmengen inkubiert, um einen ELISA-Assay durchzuführen.
Mikrofluidische Einrichtung zum Identifizieren von Komponenten einer chemischen Reaktion, wobei die Einrichtung umfasst: einen Mechanismus zum Bereitstellen von Komponenten einer chemischen Reaktion, wobei die Komponenten mindestens ein Target-Molekül, ein oder mehrere Reagenzien zum Durchführen einer Reaktion mit dem mindestens einen Target-Molekül und mehrere detektierbare Markierungen umfassen; eine Vorrichtung zum Bilden von Flüssigkeits-Teilmengen, wobei mindestens eine Flüssigkeits-Teilmenge das Target-Molekül, das eine oder die mehreren Reagenzien zum Durchführen der Reaktion mit dem mindestens einen Target-Molekül und die mehreren detektierbaren Markierungen umfasst; einen Detektor zum Detektieren einer oder mehrerer Eigenschaften zumindest der detektierbaren Markierungen in einem der Flüssigkeits-Teilmengen; und eine Einheit zum Bestimmen einer Menge mindestens einer der Komponenten basierend darauf.
Einrichtung nach Anspruch 12, wobei der Mechanismus die Reagenzien bereitstellt, wenn die Flüssigkeits-Teilmengen gebildet werden.
Einrichtung nach Anspruch 12 oder 13, die mikrofluidische Kanäle umfasst, welche derart ausgestaltet sind, dass die chemische Reaktion darin durchgeführt werden kann.
Einrichtung nach einem der Ansprüche 12 bis 14, wobei der Detektor derart ausgestaltet ist, dass er eine Reaktion in mindestens einer der Fluid-Teilmengen detektiert, wobei die detektierbare Markierung freigesetzt wird.
Einrichtung nach einem der Ansprüche 12 bis 15, wobei der Detektor derart ausgeführt ist, dass er ein Signal aus der freigesetzten detektierbaren Markierung in mindestens einer Flüssigkeits-Teilmenge detektiert.
Einrichtung nach einem der Ansprüche 12 bis 16, wobei die Vorrichtung zum Bilden von Flüssigkeits-Partikeln derart ausgestaltet ist, dass sie einen Flüssigkeitsstrom, der die Substrate umfasst, in eine Vielzahl von Flüssigkeits-Teilmengen, die die Enzymmoleküle umfassen, einleitet.