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KR100943839B1 - 불규칙 표면구조의 우선 도입에 의해 고수율의바이오-이미지용 나노입자를 제조하는 방법 - Google Patents

불규칙 표면구조의 우선 도입에 의해 고수율의바이오-이미지용 나노입자를 제조하는 방법 Download PDF

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KR100943839B1
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한국과학기술연구원
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Abstract

본 발명은 불규칙 표면구조의 우선 도입에 의해 수용액상에서 분산성이 우수하고 생체친화성과 표적지향성을 갖는 바이오-이미지용 나노입자를 고수율로 제조하는 방법에 관한 것으로, 본 발명의 방법에 따르면 소수성 나노입자의 일부 표면을 친수성으로 부분 개질한 후 이 친수성기에 원하는 기능성 분자를 도입하여 불규칙 표면구조를 가지며 친수성 부분을 포함하지만 전체적으로는 소수성을 나타내는 기능성 나노입자를 제조한 후 이 나노입자 표면의 나머지 소수성 부분을 친수성으로 전환시킴으로써 친수성 나노입자의 뭉침 현상을 원천적으로 배제하고 반응의 전 과정에서 입자의 독립성과 개별성을 확보하여 수용액상 분산성과 생체친화성 및 표적지향성을 모두 갖는 바이오-이미지용 나노입자를 고수율로 제조할 수 있다.
바이오-이미징, 나노입자, 양자점, 표면개질, 생체친화성, 표적지향성

Description

불규칙 표면구조의 우선 도입에 의해 고수율의 바이오-이미지용 나노입자를 제조하는 방법{METHOD FOR THE PRODUCTION OF BIO-IMAGING NANOPARTICLES WITH HIGH YIELD BY EARLY INTRODUCTION OF IRREGULAR STRUCTURE}
본 발명은 불규칙 표면구조의 우선 도입에 의해 수용액상에서 분산성이 우수하고 생체친화성과 표적지향성을 갖는 바이오-이미지용 나노입자를 고수율로 제조하는 방법에 관한 것이다.
최근 들어 계면활성제를 포함한 유기용액 상에서 화학적 방법에 의해 입도가 균일한 소수성 무기물 나노입자를 합성하는 방법이 확립됨에 따라 이를 실용화하려는 노력이 활발해지고 있다. 특히, 수용액상에서 합성한 나노입자의 경우에는 그 입도가 유기용액 상에서 합성한 나노입자의 입도보다 훨씬 불균일하고, 물은 지구상에 존재하는 가장 값싸고 환경친화적이며 유용성이 많은 용매이기 때문에, 유기용액 상에서 합성한 입도가 균일한 소수성 나노입자를 수용액상에서 안정하게 분산될 수 있는 나노입자로 그 표면을 개질하는 것은 그만큼 중요성이 커서 연구자들의 관심이 집중되고 있는 분야이다. 그 중에서 중심에 단일 양자점 또는 단일 무기물 나노입자가 있고, 그 표면에 필요한 기능기를 갖춘 유기물질이 결합하고 있는 형태 의 수용성 양자점 또는 수용성 나노입자는 바이오-이미지용 재료뿐만 아니라 바이오센서나 기억매체와 같은 특정 형태의 나노구조를 만드는 기초재료로도 매우 유용성이 높아서 표면개질을 위한 연구가 집중되고 있는 분야이다.
이러한 표면개질을 위해 가장 널리 사용되고 있는 방법은, 소수성 나노입자에 티올(SH)기와 친수성기가 탄화수소 사슬을 통해 연결된 유기리간드를 과량 반응시켜 나노입자 표면의 계면활성제 리간드를 모두 금속-티올레이트(M-S) 결합으로 치환하고 유기리간드의 친수성기들을 외부로 향하게 하여 친수성 나노입자를 제조한 후에, 상기 나노입자의 친수성기와 표적지향성 바이오분자 같은 기능성 분자간의 공유결합을 형성하여 중심에 무기물 나노입자만을 포함하는 바이오-이미지용 나노입자를 제조하는 것이다(도 1 참조). 이러한 공유결합은 주로 나노입자의 친수성 말단기와 새로운 기능성 분자와의 아마이드 결합이나 에스테르 결합으로 구성된다. 친수성 말단기로서 아민(NH2)기, 카복시(COOH)기, 티올기 및 하이드록시(OH)기 중의 하나와 티올기가 탄화수소 사슬을 통해 연결된 극성 유기리간드가 주된 연구 대상이고, 이러한 유기리간드는 표면에 금속성분이 풍부한 양자점(예: CdSe, ZnS, 또는 코어/쉘 구조의 CdSe/CdS, CdSe/ZnS 등), 귀금속 나노입자(예: Au, Ag) 또는 산화철 자성나노입자 등과 M-S 결합을 잘 형성하는 것으로 알려져 있다. 그러나 이들 중 하이드록시 말단기나 아민 말단기는 중성 또는 중성에 가까운 용액에서도 쉽게 뭉치고 침전되기 때문에 더 이상의 연구가 진행되지 않고 있는 실정이다. 반면, 카복시기는 중성용액에서 상당량이 이온화된 상태로 존재하므로 분산성 및 용 액 안정성이 우수하여 아마이드 결합에 의해 기능성 분자를 나노입자에 연결하기 위한 친수성 말단기로 널리 사용되고 있다.
그러나 상기 방법은 약산성 수용액에서 나노입자 표면의 카복시기를 활성화시키는 단계를 거쳐야만 하는데, 이 과정에서 많은 나노입자들이 뭉쳐서 침전되며(WC Chan 및 S Nie, Science 281: 2016, 1998; Wen Jiang, 등, Chem . Mater. 18: 872, 2006), 특히 자성나노입자의 경우에는 뭉치고 침전되는 현상이 더욱 심각하게 발생한다. 이렇게 뭉치고 침전된 나노입자들은 다음 단계인 기능성 분자와의 결합을 진행하기 어려울 뿐만 아니라, 비록 기능성 분자와의 결합이 진행되더라도 뭉친 나노입자들의 표면에만 기능성 분자가 결합된 생성물이 주로 제조된다(도 1의 단계 B로부터 얻어진 오른쪽 그림 참조). 이렇게 제조된 나노입자들은 혈관을 따라 이동하기엔 크기가 너무 크며 분산성이 현저히 감소되고, 양자점의 경우에는 자체 소광(self quenching)에 의해 형광이 극히 감소한다. 결국에는 이러한 침전물을 분리해서 제거하고 잘 분산된 일부 용액층만을 사용하게 되므로 다량의 나노입자가 손실되는 문제점이 심각하다.
이러한 뭉침과 침전현상을 해결하기 위하여, 최근에 소수성의 무기물 나노입자를 티올 말단기를 가진 폴리에틸렌글라이콜[poly(ethylene glycol), PEG] 고분자와 직접 반응시켜서 M-S 결합을 갖는 유무기 복합체 나노입자를 제조하는 방법이 보고된 바 있다(미국 특허 제7,041,371호). 그러나 이 방법은 긴 사슬에 연결된 친수성 티올기가 계면활성제로 둘러싸인 나노입자의 표면까지 뚫고 들어가야 하기 때문에 반응의 수율이 여전히 낮은 문제점이 있다.
이에 본 발명자들은 친수성 나노입자들이 수용액상에서 뭉치고 침전되는 종래 기술의 문제점을 해결하기 위하여 예의 연구 노력한 결과, 뭉치고 침전되는 원인이 규칙 구조를 갖는 친수성 나노입자의 표면에 있는 과량의 친수성기에 의한 수소결합인력에 기인함을 발견하고, 이러한 입자간 수소결합인력을 구조적으로 방해하는 방법을 고안하여 반응의 전 과정을 통해 나노입자의 독립성과 개별성을 확보함으로써, 뭉치거나 침전되는 현상을 유발하지 않으면서 중심에 단일 입자만을 포함하고 입자 균일도, 용액상 분산성과 안정성, 생체친화성, 표적지향성 등에서 우수한 물성을 나타내는 나노입자를 제조할 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
따라서 본 발명의 목적은 바이오-이미지용 나노입자를 제조함에 있어서, 부분적인 표면개질에 의해 나노입자 표면에 불규칙 구조를 도입함으로써 입자간 수소결합인력에 의한 뭉침과 침전현상을 구조적으로 방해하여 나노입자의 손실이 없으면서 비극성 유기용매 또는 수용액에서 그 용매에 따라 분산성과 안정성이 우수한 바이오-이미지용 나노입자를 높은 수율로 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 방법에 의해 제조된 분산성과 안정성이 우수한 바이오-이미지용 나노입자를 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은
1) 계면활성제로 보호된 코어 또는 코어/쉘 구조의 소수성 나노입자에 티올기와 친수성기가 탄소수 8 내지 20개 중에서 선택되는 탄화수소 사슬을 통해 연결된 유기리간드를 1 내지 30당량 첨가하여 일부분의 계면활성제를 치환하고 나노입자의 표면에 금속-티올레이트(M-S) 결합을 형성함으로써 일부분만이 친수성으로 표면 개질되고 비극성 유기용매에서 개별 분산성을 유지하는 소수성 나노입자를 제조하는 단계;
2) 상기 단계 1)에서 제조된 나노입자의 표면에 도입된 친수성기에 기능성 분자를 결합시켜 개별 분산성을 유지하면서 나노입자의 표면에 기능성과 불규칙 표면구조를 도입하는 단계; 및
3) 상기 단계 2)에서 제조된 나노입자의 표면에 잔존하는 나머지 계면활성제를 적어도 2개의 친수성기가 탄소수 1 내지 7개 중에서 선택되는 탄화수소 사슬을 통해 연결된 유기리간드로 치환하여 친수성 나노입자로 전환시키는 단계를 포함하는, 바이오-이미지용 나노입자의 제조방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 제조된, 계면활성제로 보호된 코어 및 코어/쉘 구조의 소수성 무기물 나노입자의 표면 일부분에 금속-티올레이트 결합된 티올기와 친수성기가 탄소수 8 내지 20개 중에서 선택되는 탄화수소에 의해 연결된 유기리간드를 포함하여 그 부분은 친수성을 띠지만 전체적으로는 소수성을 나타내고 비극성 유기용매에서 개별 분산성을 유지하는 바이오-이미지용 나노입자를 제공한다.
아울러, 본 발명은 상기 방법에 의해 제조된, 상기 나노입자의 표면에 도입된 친수성기에 기능성 분자가 결합되어 기능성과 불규칙 표면구조를 가지며, 상기 기능성 분자가 결합된 부분은 친수성을 띠지만 전체적으로는 소수성을 나타내는 바이오-이미지용 나노입자를 제공한다.
마지막으로, 본 발명은 상기 방법에 의해 제조된, 상기 나노입자의 표면에 잔존하는 나머지 계면활성제가 적어도 2개의 친수성기가 탄소수 1 내지 7개 중에서 선택되는 탄화수소 사슬을 통해 연결된 유기리간드로 치환되어 친수성으로 전환되고 수용액상에서 개별 분산성을 유지하는 바이오-이미지용 나노입자를 제공한다.
본 발명에 따른 제조방법은 20 ㎚ 이하의 구형, 입자 균일도, 화학적 안정 성, 수용액상 분산성, 생체친화성, 표적지향성 등의 성질을 갖고, 상자기성 또는 고효율 발광성과 광안정성 등을 확보한 나노입자를 100% 수율로 제조할 수 있으며, 이 방법에 의해 제조된 나노입자는 바이오-이미지용 재료로 매우 유용하게 사용될 수 있을 뿐만 아니라 질병의 진단과 치료 등을 고감도로 실행할 수 있는 의료용 기초재료로도 활용될 수 있다. 또한 본 발명의 제조방법은 내부 무기물 나노입자의 구성 성분에 관계없이 나노입자 표면의 금속성분이 티올기를 갖는 유기물과 공유결합을 형성하는 한, 동 유기물 내에 있는 친수성기를 통해 기능성 물질과 결합할 수 있으므로 다양한 종류의 단일 나노입자를 포함하는 유무기 복합체 나노입자의 제조에 다양하게 적용될 수 있다.
기존의 바이오-이미지용 나노입자 제조를 위한 표면개질 방법은, 친수성 유기리간드를 표면에 결합시켜 만든 친수성 나노입자가 수용액상에서 그 자체로서 또는 바이오 분자와의 결합반응을 진행하는 도중에 표면 친수성 작용기들의 규칙 구조가 유발하는 수소결합인력에 의한 응집과 침전현상으로 인해 그 수율이 극히 저조하였다.
이에 본 발명자들은 입도가 균일하고 친수성인 나노입자들이 수용액상에서 뭉치고 침전되는 원인이 친수성 유기물의 규칙 구조로 인해 발생하는 입자간 수소결합 때문임을 밝혀내고, 단계적 부분 표면개질에 의해 생체친화성 분자, 표적지향성 분자, 이들의 결합체 또는 혼합물과 같은 기능성 유기물의 불규칙 구조를 먼저 도입하여 소수성이면서 생체친화성이거나 표적지향성 또는 이 두 가지 성질을 모두 갖는 나노입자를 제조한 후, 이 나노입자를 친수성으로 전환시킴으로써 기능성 유기물의 입체구조적 장애효과에 의해 입자간 수소결합이 방해를 받도록 하여 수용액상에서 개별 분산된 바이오-이미지용 나노입자를 고수율로 제조하는 방법을 개발하였다.
구체적으로, 본 발명에 따른 바이오-이미지용 나노입자의 제조방법은
1) 계면활성제로 보호된 코어 또는 코어/쉘 구조의 소수성 나노입자에 티올기와 친수성기가 탄소수 8 내지 20개 중에서 선택되는 탄화수소 사슬을 통해 연결된 유기리간드를 1 내지 30당량 첨가하여 일부분의 계면활성제를 치환하고 나노입자의 표면에 금속-티올레이트(M-S) 결합을 형성함으로써 일부분만이 친수성으로 표면 개질되고 비극성 유기용매에서 개별 분산성을 유지하는 소수성 나노입자를 제조하는 단계;
2) 상기 단계 1)에서 제조된 나노입자의 표면에 도입된 친수성기에 기능성 분자를 결합시켜 개별 분산성을 유지하면서 나노입자의 표면에 기능성과 불규칙 표면구조를 도입하는 단계; 및
3) 상기 단계 2)에서 제조된 나노입자의 표면에 잔존하는 나머지 계면활성제를 적어도 2개의 친수성기가 탄소수 1 내지 7개 중에서 선택되는 탄화수소 사슬을 통해 연결된 유기리간드로 치환하여 친수성 나노입자로 전환시키는 단계를 포함한다.
종래기술에 언급한 바와 같이, 계면활성제를 포함한 유기용액 내에서 입도가 균일한 소수성 나노입자를 합성하고, 티올기와 친수성기가 짧은 탄화수소 사슬을 통해 연결된 유기리간드와 나노입자 사이에 M-S 결합을 형성하게 되면, 친수성 작용기가 겉으로 노출되어 분말의 친수성을 확보할 수 있다. 그러나 친수성기가 겉으로 노출된 친수성 나노입자들은 뭉쳐서 침전되는 현상이 매우 심해서 다른 생체고분자와의 아마이드 또는 에스테르 결합 형성이 성공적으로 진행될 수 없다. 이러한 이유로 아직까지 중심에 단일 나노입자를 포함하는 바이오-이미지용 나노입자를 고수율로 제조한 예는 보고된 바 없다.
본 발명에서는 도 1에서와 같이 아민기 또는 카복시기가 겉으로 노출된 친수성 나노입자를 포함하는 다양한 친수성 나노입자들이 입자 표면에 규칙적으로 자기-조립(self assembly)되는 과량의 친수성 작용기들에 의한 입자간 수소결합인력으로 인해 뭉치고 침전되는 현상을 발견하였다. 이러한 현상을 억제하기 위하여, 본 발명에서는 도 2에서와 같이 단계적인 부분 표면개질을 통해 나노입자의 표면에 불규칙 구조를 만들어서 입자간 수소결합을 원천적으로 방해함으로써 입자들이 뭉쳐서 침전되는 현상을 배제하고, 개별적으로 분산될 수 있는 조건을 최초로 확립하였다. 이 조건 하에서 소수성 나노입자는 먼저 일부의 계면활성제만을 티올기와 친수성기가 탄소수 8 내지 20개 중에서 선택된 탄화수소 사슬을 통해 연결된 유기리간드로 치환하여 M-S 결합을 형성하고, 이 친수성기에 생체친화성과 표적지향성을 갖는 기능성 분자를 결합시킴으로써 기능성과 불규칙 구조를 갖게 되며, 이 상태의 소수성 기능성 나노입자는 그 자체로 in vitro 세포실험과 같은 특수한 목적의 바이오-이미징에 사용될 수 있다. 이어서 치환되지 않은 나머지 계면활성제를 적어도 2개의 친수성기가 탄소수 1 내지 7개 중에서 선택된 탄화수소 사슬을 통해 연결 된 유기리간드로 치환하여 친수성 나노입자로 전환시키면, 입자간 수소결합이 구조적으로 방해를 받게 되어 중심에 단일 나노입자를 포함하는 수용액상 분산성과 안정성이 향상된 바이오-이미지용 나노입자를 높은 수율로 제조할 수 있다.
도 2를 참고로 하여, 본 발명에 따른 바이오-이미지용 나노입자의 제조방법을 단계별로 설명하면 다음과 같다.
단계 1)은 소수성 나노입자의 부분적인 표면개질 단계(도 2의 C 참조)로, 계면활성제(14)에 의해 보호되어 있는 코어(10) 또는 코어/쉘(12) 구조의 무기물 나노입자를 포함하고 있는 유기용액에 나노입자 표면의 금속원소와 화학결합을 형성하는 티올기 및 친수성기가 탄소수 8 내지 20개 중에서 선택되는 탄화수소 사슬을 통해 연결된 유기리간드(20)를 소량, 바람직하게는 1 내지 30당량 첨가하고 세게 교반해주면서 반응시킨다. 이 반응을 통해 나노입자 표면의 일부 계면활성제가 상기 유기리간드로 치환되고, 치환된 유기리간드가 나노입자 표면의 금속원소와 M-S 공유결합을 형성한다.
상기 단계 1)에서, 무기물 나노입자는 코어 또는 코어/쉘 구조로서 나노입자 표면은 내부보다 화학양론적으로 금속성분이 풍부하고, 이 금속성분은 유기리간드의 구성원소인 티올기와 M-S 공유결합에 의해 화학적으로 결합할 수 있다. 상기 무기물 나노입자는 주기율표상의 Ⅱ족 원소인 아연, 카드뮴 및 납 중의 1 원소와 주기율표상의 Ⅵ족 원소인 황, 셀레늄 및 텔루륨 중의 1 원소로 구성되는 반도체 나노입자, 귀금속 나노입자 또는 산화철 자성나노입자인 것이 바람직하다. 더욱 바람직하게는, 상기 무기물 나노입자로 CdSe, ZnS, CdSe/CdS, CdSe/ZnS, PbS, Au, Ag, Fe2O3, Fe3O4 등을 예로 들 수 있으며, 이외에도 티올기와 공유결합을 형성할 수 있는 물질로 구성된 나노입자라면 본 발명에 제한 없이 사용될 수 있다.
상기 무기물 나노입자와 결합하는 유기리간드는 분자 내에 적어도 1개의 티올기와 적어도 1개의 친수성기를 포함하고 있어 무기물 나노입자와 적어도 1개의 M-S 결합을 형성할 수 있고, 다른 생체고분자(18), 예컨대 생체친화성 분자, 표적지향성 분자, 이들의 결합체(생체친화성-표적지향성 분자) 또는 혼합물과의 결합을 위해 적어도 1개의 결합자리를 제공할 수 있다.
또한 상기 유기리간드에서 긴 탄화수소 사슬의 길이는 8 내지 20개인 것이 나노입자의 소수성을 유지하기에 바람직하다. 만약 탄화수소 사슬의 길이가 8개 미만인 경우에는 나노입자가 소수성을 상실할 수도 있고, 사슬길이가 너무 짧아서 친수성기가 계면활성제 속에 가려지게 되어 기능성 분자와 결합을 형성하기가 곤란하다는 문제점이 발생할 수 있다. 반면 아직까지 탄화수소 사슬의 길이가 20개를 초과하는 경우의 유기리간드가 개발되어 있지는 않지만, 이보다 긴 유기리간드가 개발된다면 이들의 사용도 가능하다. 이때 첨가되는 유기리간드의 양은 1 내지 30당량 범위인 것이 바람직한데, 1당량 미만을 첨가하는 경우에는 유기리간드가 전혀 치환되지 않은 원래의 나노입자가 존재하게 되므로 수율이 감소하는 문제점이 발생할 수 있고, 30당량을 초과하여 첨가하는 경우에는 나노입자의 표면에 친수성기가 과도하게 치환되고, 그로 인해 수소결합인력이 강해져서 나노입자끼리 뭉치고 침전되는 문제점이 발생할 수 있다.
상기 무기물 나노입자 표면의 금속원소와 티올기 사이의 M-S 공유결합에 의해 화학적으로 결합할 수 있는 유기리간드의 수는 입자의 크기에 따라 달라질 수 있으며 1 내지 150개까지 가능하다. 그러나 30개 이상의 M-S 결합을 만들고 여기에 생체친화성 고분자를 결합시키면, 입자들이 뭉쳐서 응집체를 형성하고 어떠한 용매에도 분산되지 않는 것을 확인하였다. 따라서 무기물 나노입자 표면의 금속원소와 티올기 사이의 M-S 공유결합에 의해 화학적으로 결합할 수 있는 유기리간드의 수는 1 내지 30개가 바람직하다. 나노입자의 표면에 불규칙 구조를 형성하기 위해 사용가능한 유기리간드로는 머캅토운데카노산(murcaptoundecanoic acid), 머캅토도데카노산(murcaptododecanoic acid), 머캅토헥사데카노산(mercaptohexadecanoic acid) 등을 예로 들 수 있다.
이 단계에서 부분적으로 표면 개질된 무기물 나노입자는 비록 친수성기가 겉으로 노출되기는 하나 친수성기가 연결된 탄화수소 사슬의 길이가 길어서 실질적으로 친수성을 나타내지 못하며, 또한 그 수가 소수성 계면활성제보다 훨씬 적기 때문에 나노입자는 여전히 소수성을 띠게 되어 비극성 용매에 잘 분산된다.
단계 2)는 단계 1)에서 제조된 나노입자의 친수성기에 생체친화성 분자, 표적지향성 분자, 이들의 결합체 또는 혼합물과 같은 기능성 분자를 결합시켜 표면에 도입된 기능성 분자에 의해 불규칙 구조를 갖는 나노입자를 제조하는 단계이다. 이 단계에서 제조된 나노입자는 여전히 소수성이거나 양쪽성이어서 비극성 용매에 잘 분산되며 in vitro 세포 실험과 같은 특수한 목적의 바이오-이미징에 사용이 가능하다.
단계 3)은 단계 2)에서 제조된 나노입자에 적어도 2개의 친수성기가 탄소수 1 내지 7개 중에서 선택되는 탄화수소 사슬을 통해 연결된 유기리간드(16)를 첨가하여 상기 나노입자 표면에 잔존하던 계면활성제를 치환시킴으로써 친수성 나노입자로 전환시키는 단계이다. 이 단계에 적합한 유기리간드의 바람직한 일례로서 머캅토헥사노산(mercaptohexanoic acid), 머캅토아세트산(mercaptoacetic acid), 머캅토프로피온산(mercaptopropionic acid), 다이머캅토숙신산(dimercaptosuccinic acid), 2-머캅토에탄올(2-mercaptoethanol), 2-아미노에탄티올(2-aminoethanethiol), 라이신(Lysine), 아르기닌(arginine), 아미노발레르산(aminovaleric acid) 등을 포함할 수 있다.
상기 단계 1) 및 2)를 거쳐 나노입자의 표면에 도입된 불규칙 구조는 단계 3)에서 발생할 수 있는 친수성 나노입자끼리의 수소결합을 원천적으로 방해하여 개별 분산성을 유지시키고, 단계 3)에서 도입된 유기리간드의 탄소수 1 내지 7개 중에서 선택되는 짧은 탄화수소 사슬 길이는 유기물의 극성을 증대시켜 물에 대한 분산성을 향상시키는 작용을 한다.
본 발명에서 기능성 분자는 합성고분자 또는 생체구성물질로 생체적합성이 우수하여 부작용이 없고 생분해성과 조건에 따라 용액, 겔, 막 등의 다양한 물성을 가지는 물질을 의미하며, 적어도 한쪽 말단에 아민기, 알데하이드기 및 카복시기 중의 하나를 갖는 물질로 나노입자의 친수성기와 아마이드 또는 에스테르 결합을 하게 된다. 이러한 기능성 분자로 생체친화성 분자, 표적지향성 분자, 이들의 결합체(생체친화성-표적지향성 분자) 또는 혼합물을 예로 들 수 있다.
상기 생체친화성 분자는 양쪽 사슬 말단에 아민기, 알데하이드기 및 카복시기 중에서 선택된 기를 갖거나, 한쪽 사슬 말단에는 아민기, 알데하이드기 및 카복시기 중 하나를 갖고 다른 쪽 사슬 말단에는 탄소수가 1 내지 7개 중에서 선택되는 알콕시기 또는 하이드록시기를 갖는 것이 바람직하다. 이러한 생체친화성 분자로 폴리에틸렌글라이콜(PEG), 덱스트란, 폴리(L-락타이드)(PLLA), 폴리(DL-락타이드)(PDLLA), 폴리-DL-락타이드/글라이콜라이드 공중합체(PLGA), 키토산, 알긴산, 히아루론산, 콜라겐, 헤파린, 폴리(ε-카프로락톤) 등이 사용될 수 있다.
또한, 표적지향성 분자는 생체 내에서 특이적으로 인지되는 물질로서 아민기, 카복시기, 하이드록시기 및 티올기 중의 하나를 가지고 있어서 상기 유기리간드 또는 상기 생체친화성 분자와 아마이드 결합, 에스테르 결합 및 티오에스테르 결합 중의 하나에 의해 연결될 수 있는 것이 바람직하다. 이러한 표적지향성 분자로 엽산 수용체 단백질에 선택적으로 반응하는 엽산(folic acid)이나 메토트랙세이트(methotrexate, MTX), 특정 세포에 선택적인 펩타이드, 예를 들면 알지디 펩타이드(RGD peptide)나 tat 펩타이드(tat peptide), 또는 특이 항원에 선택적으로 반응하는 항체, 예를 들면 스트렙타비딘에 대한 바이오틴, PSA에 대한 PSA 항체 등이 사용될 수 있다.
또한, 상기 생체친화성 분자와 표적지향성 분자를 아마이드 결합이나 에스테르 결합에 의해 연결하여 이들의 결합체 형태로 제조된 생체친화성-표적지향성 분자 또는 이들의 혼합물이 사용될 수 있다.
이러한 생체친화성 분자, 표적지향성 분자, 생체친화성-표적지향성 분자 또 는 이들의 혼합물과 같은 기능성 분자는 적어도 분자의 한쪽 말단에 아민기, 알데하이드기, 카복시기 및 하이드록시기 중의 하나를 가지고 있어서 단계 2)에서 개별 분산된 나노입자의 카복시기, 하이드록시기 또는 아민기와 아마이드 결합 또는 에스테르 결합을 형성하여 표면에 유기물의 불규칙 구조를 갖는 나노입자를 형성할 수 있다.
도 1의 단계 B에 나타낸 바와 같이, 기존의 나노입자 제조방법은 친수성 나노입자들이 집단을 이루어 뭉쳐진 상태로 생체고분자와 아마이드 또는 에스테르 결합반응을 수행하기 때문에, 집단의 표면에만 기능성 분자가 둘러싸는 형태로 결합이 형성되고 그의 내부에 존재하는 나노입자는 기능성 분자와의 접촉이 불가능하여 결합을 형성할 수 없다. 이로 인해 최종 바이오-이미지용 나노입자의 수율이 낮아지고 이미징 기능이 저하되는 문제점이 제기되어 왔다.
그러나 본 발명에 따른 나노입자의 제조방법은, 도 2의 단계 D에 나타낸 바와 같이, 단계적 부분 표면개질에 의해 나노입자의 표면에 있는 계면활성제의 일부분이 탄소수 8 내지 20개 중에서 선택되는 탄화수소 사슬을 통해 연결된 유기리간드로 치환되고 이 유기리간드에 기능성 분자들이 결합하면서 불규칙 구조를 갖는 소수성의 기능성 나노입자를 먼저 제조한다. 그 후에 상기 나노입자 표면의 나머지 계면활성제를 적어도 2개의 친수성기가 탄소수 1 내지 7개 중에서 선택되는 탄화수소 사슬을 통해 연결된 유기리간드로 치환하여 나노입자의 소수성을 친수성으로 전환시키게 된다. 이러한 본 발명의 제조방법에 따르면 입자간 수소결합에 의한 뭉침과 침전현상이 나노입자의 표면에 도입된 불규칙 구조에 의해 방해를 받아 유발되지 않기 때문에 친수성 양자점의 손실 없이 중심에 단일 나노입자를 포함하는 유무기 복합체 나노입자를 100% 수율로 제조할 수 있을 뿐만 아니라 양자 효율도 보존할 수 있다.
본 발명의 바람직한 실시예에 따르면, 20 ㎚ 이하의 구형이며 형광 특성을 갖는 코어 또는 코어/쉘 나노입자, 또는 산화철 자성나노입자를 유기용액 상에서 합성하여 입자의 균일성을 확보한 상태에서, 단계적 부분 표면개질에 의해 긴 사슬 유기리간드와 기능성 분자를 차례로 결합시킴으로써 불규칙 구조의 소수성 기능성 바이오-이미지용 나노입자를 제공한다. 또한 상기 나노입자 표면에서 불규칙 구조로 인한 입체구조적 장애효과가 추후 작용할 입자간 수소결합을 방해하는 상태에서 이 나노입자의 소수성을 친수성으로 전환시킴으로써 수용액상에서 개별 분산성을 유지하는 바이오-이미지용 나노입자를 100% 수율로 제공한다.
또한, 본 발명의 제조방법은 내부 무기물 나노입자의 구성 성분에 관계없이 나노입자 표면의 금속성분이 티올기를 갖는 유기리간드와 공유결합을 형성하기만 하면 상기 유기리간드 내 친수성기를 통해 기능성 분자와 결합할 수 있으므로, 양자점과 자성나노입자 뿐만 아니라 다양한 종류의 단일 나노입자를 포함하는 유무기 복합체 나노입자의 제조에 유용하게 적용될 수 있다.
아울러, 본 발명의 제조방법은 무기물 나노입자와 유기리간드와의 공유결합이 M-S 결합이 아니더라도 단계적 부분 표면개질에 의해 치환 결합된 유기리간드 말단에 아민기, 카복시기 또는 하이드록시기가 노출되어 있으면 기능성 분자와 결합을 형성하여 입체구조적 장애효과가 입자간 수소결합을 방해하는 구조를 만든 후 에 친수성으로 전환시킬 수 있으므로, 친수성 전환 전과 후의 상태로 다양한 종류의 개별 분산된 바이오-이미지용 나노입자 제조에 적용될 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 제조되는 중심에 단일 무기물 나노입자를 포함하는 바이오-이미지용 나노입자를 제공한다.
본 발명에 따른 바이오-이미지용 나노입자는 중심에 코어 및 코어/쉘 구조를 갖는 무기물 나노입자의 표면 일부분에 M-S 결합된 긴 탄화수소 사슬을 갖는 유기리간드를 포함하여 상기 유기리간드가 결합된 부분은 친수성이고 나머지 대부분은 소수성을 띠는 나노입자(본 발명의 제조방법 중 단계 1)에 의해 생성)를 포함하고, 상기 나노입자의 친수성기에 아마이드 또는 에스테르 결합에 의해 기능성 분자가 연결되어 불규칙 표면구조를 갖는 소수성 나노입자(본 발명의 제조방법 중 단계 2)에 의해 생성)를 포함하며, 상기 나노입자의 표면에 잔존하는 나머지 계면활성제가 적어도 2개의 친수성기를 갖는 짧은 탄화수소 사슬의 극성 유기리간드로 치환되어 친수성으로 전환되고 입자간 수소결합이 불규칙 표면구조의 입체구조적 장애효과에 의해 방해를 받아 반응의 전 과정을 통해 개별 분산성을 유지하는 친수성 나노입자(본 발명의 제조방법 중 단계 3)에 의해 생성)를 포함한다.
본 발명에 따른 친수성 바이오-이미지용 나노입자는 하나의 나노입자 표면에 수소결합이 가능한 많은 수의 친수성 유기리간드가 존재하지만, 일부 표면에는 불규칙 구조를 제공하는 긴 탄화수소 사슬의 유기리간드에 결합된 기능성 분자가 결합되어 있어 입자간 수소결합에 입체구조적 장애효과를 주기 때문에, 뭉침 및 침전현상에 의한 나노입자의 손실 없이 우수한 입자 균일도, 화학적 안정성, 수용액상 분산성, 생체친화성 및 표적지향성을 가지며 고효율의 발광성과 광안정성을 확보할 수 있다.
따라서, 본 발명에 따른 나노입자는 바이오-이미지용 재료로 매우 유용하게 사용될 수 있을 뿐만 아니라 질병의 진단과 치료 등을 고감도로 실행할 수 있는 의료용 기초재료로도 활용될 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 자명할 것이다.
하기 실시예에서 양자점의 출발물질로 사용한 코어/쉘 구조의 소수성 나노입자 CdSe/CdS-ODA는 전체 표면에 옥타데실아민(octadecylamine, ODA) 계면활성제가 배위되어 있으며, 문헌(JJ Li, 등, Journal of the American Chemical Society 125: 12567-12575, 2003; WW Yu, 등, Chemistry of Materials 15: 2854-2860, 2003)에 기재된 방법을 참고하여 CdSe 코어 나노입자 표면에 Cd, S, Cd, S 및 Cd를 차례대로 각각 0.5층씩 총 2.5층을 교대로 성장시켜 제조하였다.
또한, 하기 실시예에서 자성나노입자의 출발물질로 사용한 소수성 산화철 나노입자 Fe2O3-OA는 전체 표면에 올레인산(oleic acid, OA) 계면활성제가 배위되어 있으며 문헌(K. Woo, 등, Chemistry of Materials 16: 2814-2818, 2004; K. Woo, 등, IEEE Transactions on magnetics 41, 4137-4139)에 기재된 방법에 따라 Fe2O3 또는 Fe3O4 나노입자를 합성하고 비활성 분위기 하에서 10 몰%의 전구체 Fe(CO)5를 가하고 환류하여 표면에 철 성분이 화학양론적으로 풍부한 자성나노입자를 제조하였다. 그러나 어떠한 방법으로 제조하더라도 표면에 금속성분이 화학양론적으로 풍부한 소수성 나노입자라면 실시예 1 내지 11에 동일하게 적용될 수 있음은 당업자에게 자명한 것이다.
또한, 하기 실시예에서 (-DA)ex 또는 (-OA)ex는 나노입자 표면에 있는 과량의 데실아민(DA) 또는 올레산(OA)을 나타내는 약호로서 이 중에서 일부 리간드가 티올기를 갖는 리간드로 치환되더라도 그 감소 효과가 미미하고 여전히 과량의 DA 또는 OA가 존재하므로 이들을 구별 없이(-DA)ex 또는(-OA)ex로 표기하기로 한다.
실시예 1: 표면 리간드 교환에 의한 반도체 나노입자 CdSe / CdS - DA 의 제조
소수성 CdSe/CdS-ODA 양자점 용액(8×10-5 M) 5 ㎖를 취하여 진공에 연결시켜 용매를 제거한 후 클로로폼 20 ㎖에 분산시키고, 1000당량의 데실아민(decylamine, DA)을 가하여 어두운 비활성 분위기 하에서 2일간 교반하였다. 이 용액에 아세톤을 첨가하여 생긴 침전물을 원심분리하고 클로로폼에 분산시켜 CdSe/CdS-DA 용액(2×10-5 M) 20 ㎖를 제조하였다. CdSe/CdS-DA 시료의 적외선 분광스펙트럼과 투과전자현미경(transmission electron microscope, TEM) 이미지를 분석하였고, 그 결과를 각각 도 3의 (b)와 도 4의 (b)에 나타내었다. TEM 이미지 에서 양자점 사이의 간격이 CdSe/CdS-ODA보다 짧아진 것으로 리간드 교환이 일어났음을 확인하였다.
실시예 2: 부분 표면 개질된 반도체 나노입자 CdSe / CdS (- DA ) ex (- MUA ) 5 의 제조
실시예 1에서 제조한 CdSe/CdS-DA 용액 17 ㎖를 취하여 5당량의 머캅토운데카노산(mercaptoundecanoic acid, MUA)을 가하고 어두운 비활성 분위기 하에서 19시간 동안 교반하였다. 상기 용액을 농축시킨 후에 아세톤을 첨가하여 생성된 침전물을 원심분리하고 클로로폼에 분산시켜 CdSe/CdS(-DA)ex(-MUA)5 용액(2×10-5 M) 17 ㎖를 제조하였다. 이 시료의 적외선 분광스펙트럼과 TEM 이미지를 분석하였고, 그 결과를 각각 도 3의 (c)와 도 4의 (c)에 나타내었다. MUA의 부분치환으로 인해 도 2의 단계 C에서와 같이 규칙 구조가 깨지면서 자기-조립(self-assembly) 구조가 더 이상 나타나지 않는 것을 TEM 이미지에서 확인하였다.
실시예 3: 표적지향성 소수성 반도체 나노입자 CdSe / CdS (- DA ) ex (- MUA - en - FA ) 5 의 제조
실시예 2에서 제조한 CdSe/CdS(-DA)ex(-MUA)5 용액을 2 ㎖ 취하고 클로로폼을 첨가하여 10 ㎖로 희석하였다. 여기에 5당량의 다이사이클로헥실카보다이이미드(dicyclohexylcarbodiimide, DCC)를 가하고 어두운 비활성 분위기 하에서 3시간 동안 교반한 후에, 하기와 같이 제조된 en-FA를 50당량 가하고 2시간 동안 더 교반하였다. 이 용액을 농축시킨 후에 아세톤을 첨가하여 생성된 침전물을 원심분리하고 클로로폼에 분산시켜 CdSe/CdS(-DA)ex(-MUA-en-FA)5 용액(4×10-6 M) 10 ㎖를 제조하였다. en-FA가 MUA에 결합된 것을 적외선 분광스펙트럼과 TEM 이미지로 분석하였고, 그 결과를 각각 도 3의 (d)와 도 4의 (d)에 나타냈다.
표적지향성 분자 엽산( folic acid , FA )과 에틸렌다이아민(en)의 결합체 en - FA 의 제조
441 ㎎(1 m㏖)의 엽산을 건조 증류한 톨루엔 10 ㎖에 넣고 1시간 동안 잘 교반한 후 진공에 연결하여 톨루엔과 수분을 제거하였다. 이것을 다이메틸폼아마이드(dimethylformamide, DMF)에 용해시킨 후, 이 플라스크를 얼음물 중탕에 넣고 10분간 교반하였다. 여기에 226 ㎎(1.1 m㏖)의 DCC를 가하고 18시간 동안 더 교반하였다. 2.5 ㎖의 에틸렌다이아민(ethylenediamine, en)을 20 ㎖의 DMF에 용해시키고 상기 용액을 가하여 3시간 동안 교반하였다. 이 용액에 물과 아세토나이트릴을 가하여 침전물을 형성하고 동일한 용매로 재결정하여 en-FA 224 ㎎을 얻었다.
실시예 4: 생체친화성 수용성 반도체 나노입자 CdSe / CdS (- MPA ) ex (- MUA - aPEGa ) 5 의 제조
실시예 2에서 제조한 CdSe/CdS(-DA)ex(-MUA)5 용액을 0.5 ㎖ 취하고 클로로폼 을 첨가하여 2.5 ㎖로 희석하였다. 여기에 6당량의 DCC를 가하고 어두운 비활성 분위기 하에서 3시간 동안 교반한 후에, O,O’-비스(2-아미노에틸)폴리에틸렌글라이콜(O,O’-Bis(2-aminoethyl)polyethylene glycol, aPEGa, 분자량 1,000)을 7당량 가하고 16시간 동안 더 교반하였다. 이 용액을 농축시킨 후 아세톤을 첨가하여 생성된 침전물을 원심분리하고 클로로폼에 분산시켜 CdSe/CdS(-DA)ex(-MUA-aPEGa)5 용액(1×10-6 M) 10 ㎖를 제조하였다.
이어서 상기 CdSe/CdS(-DA)ex(-MUA-aPEGa)5 용액에 0.05 M NaOH와 0.05 M 머캅토프로피온산(mercaptopropionic acid, MPA)이 용해되어 있는 메탄올 용액 100당량을 첨가하고 교반하였다. 여기에 증류수를 가하여 생성물을 추출하고, 메탄올/에틸아세테이트(1/4) 혼합용매를 첨가하여 생성된 침전물을 원심분리하였다. 분리된 침전물을 pH 7.4인 PBS 완충용액에 분산시켜 1×10-6 M의 CdSe/CdS(-MPA)ex(-MUA-aPEGa)5 10 ㎖를 제조하였다. aPEGa가 MUA에 결합되고 DA가 MPA로 치환되었음을 적외선 분광스펙트럼과 TEM 이미지를 통해 분석하였고, 그 결과를 각각 도 3의 (e)와 도 4의 (e)에 나타내었다.
실시예 5: 표적지향성-생체친화성 수용성 반도체 나노입자 CdSe / CdS (- MPA ) ex (- MUA - aPEGa - FA ) 5 의 제조와 바이오- 이미징
실시예 2에서 제조한 CdSe/CdS(-DA)ex(-MUA)5 용액을 2 ㎖ 취하고 클로로폼을 첨가하여 10 ㎖로 희석하였다. 여기에 6당량의 DCC를 가하고 어두운 비활성 분위기 하에서 3시간 동안 교반한 후에, 하기와 같이 제조된 aPEGa-FA를 15당량 가하고 16시간 동안 더 교반하였다. 이 용액을 농축시킨 후 아세톤과 메탄올을 첨가하여 생성된 침전물을 원심분리하고 클로로폼에 분산시켜 CdSe/CdS(-DA)ex(-MUA-aPEGa-FA)5 용액(1×10-5 M) 4 ㎖를 제조하였다.
이어서 상기 CdSe/CdS(-DA)ex(-MUA-aPEGa-FA)5 용액에 0.05 M NaOH와 0.05 M 머캅토프로피온산(MPA)이 용해되어 있는 메탄올 용액 100당량을 첨가하고 교반하였다. 여기에 증류수를 가하여 생성물을 추출하고, 메탄올/에틸아세테이트(1/4) 혼합용매를 첨가하여 생성된 침전물을 원심분리하였다. 분리된 침전물을 pH 7.4인 PBS 완충용액에 분산시켜 4×10-6 M의 CdSe/CdS(-MPA)ex(-MUA-aPEGa-FA)5 10 ㎖를 제조하였다. aPEGa-FA가 MUA에 결합되고 DA가 MPA로 치환되었음을 적외선 분광스펙트럼과 TEM 이미지를 통해 분석하였고, 그 결과를 각각 도 3의 (f)와 도 4의 (f)에 나타내었다.
상기에서 제조한 FA가 결합된 양자점 CdSe/CdS(-MPA)ex(-MUA-aPEGa-FA)5이 엽산 수용기가 발현되어 있는 특정 세포에 선택성을 보이는지 확인하기 위하여, 엽산 수용기가 있는 KB 세포(Human fibrosarcoma cells, ATCC Manassas, VA)와 엽산 수 용기가 없는 HT1080 세포(Human epidermoid carcinoma cells(ATCC Manassas, VA) 를 FA(9×10-6 M) 존재 및 부재 하에서 FA가 결합된 CdSe/CdS(-MPA)ex(-MUA-aPEGa-FA)5 양자점(2×10-7 M) 또는 FA가 결합되지 않은 CdSe/CdS(-MPA)ex(-MUA-aPEGa)5 양자점(2×10-7 M)이 포함된 PBS 용액에 접종하고 37℃에서 15시간 동안 배양하였다. 배양이 완료된 후, 상기 세포를 PBS 용액으로 3회 세척하고 슬라이드글라스 위에 고정하였다. 형광현미경을 이용하여 세포들의 이미지를 관찰하였고, 그 결과를 도 5에 나타내었다.
도 5에 나타낸 바와 같이, 배양액 속에 자유로운 FA가 없는 경우에는 표적지향성 양자점 CdSe/CdS(-MPA)ex(-MUA-aPEGa-FA)5이 표적지향성이 없는 양자점 CdSe/CdS(-MPA)ex(-MUA-aPEGa)5에 비해 FA 수용기가 있는 KB 세포 내로 훨씬 많은 양이 선택적으로 전달된 반면, 배양액 속에 과량의 FA가 존재하는 경우에는 자유로운 FA가 수용기에 대부분 결합하기 때문에 KB 세포와 HT1080 세포 사이에 선택성이 나타나지 않는 것을 확인하였다.
생체친화성 분자 aPEGa 와 표적지향성 분자 FA 의 결합에 의한 aPEGa - FA 의 제조
441 ㎎(1 m㏖)의 FA를 건조 증류한 톨루엔 10 ㎖에 넣고 1시간 동안 잘 교반한 후에 진공에 연결하여 톨루엔과 수분을 제거하였다. 이것을 14 ㎖의 다이메틸폼아마이드에 용해시키고 이 플라스크를 얼음물 중탕에 넣고 10분간 교반하였다. 여기에 226 ㎎(1.1 m㏖)의 DCC를 가하고 18시간 동안 교반한 후, 1 m㏖의 aPEGa를 가하여 3시간 동안 더 교반하였다. 이 용액에 다이에틸에테르를 가하여 침전물을 형성하고 동일한 용매로 재결정하여 aPEGa-FA 179 ㎎을 얻었다.
실시예 6: 반도체 나노입자 CdSe / CdS (- DA ) ex (- MUA - aPEGa ) n (n=5, 10 또는 30)의 제조
실시예 1에서 제조한 CdSe/CdS-DA 용액 0.5 ㎖를 취하고 클로로폼을 첨가하여 10 ㎖로 희석한 용액 3개를 준비했다. 이 용액에 각각 5, 10 및 30당량의 머캅토운데카노산(mercaptoundecanoic acid, MUA)을 가하고 어두운 비활성 분위기 하에서 19시간 동안 교반하였다. 이 용액을 농축시킨 후 메탄올을 첨가하여 생성된 침전물을 원심분리하고 클로로폼에 분산시켜 CdSe/CdS(-DA)ex(-MUA)n(n=5, 10 또는 30) 용액(4×10-6 M) 2.5 ㎖씩을 제조하였다.
상기의 CdSe/CdS(-DA)ex(-MUA)n(n=5, 10 또는 30) 용액에 각각 5.5, 11 및 33당량의 DCC를 가하고 어두운 비활성 분위기 하에서 3시간 동안 교반한 후, 각각의 용액에 aPEGa를 6, 12 및 36당량씩 가하고 16시간 동안 더 교반하였다. 이 용액을 농축시킨 후에 메탄올을 첨가하여 생성된 침전물을 원심분리하고 클로로폼에 분산시켜 CdSe/CdS(-DA)ex(-MUA-aPEGa)n(n=5, 10 또는 30) 용액(1×10-6 M) 각 10 ㎖씩을 제조하였다. 세 경우 모두 aPEGa가 MUA에 결합된 것을 적외선 분광스펙트럼으로 확인하였고, 그 결과를 도 6에 나타내었다.
또한, TEM 이미지를 통해서 나노입자간 수소결합인력의 영향이 CdSe/CdS(-DA)ex(-MUA-aPEG)5의 경우에는 미미한 반면, CdSe/CdS(-DA)ex(-MUA-aPEG)10의 경우에는 상당히 작용하여 응집된 나노입자를 형성하고 있음을 도 7에서 확인하였다. 상기 분자식에서 n이 5와 10인 경우에는 클로로폼에 잘 분산되었으나, 30인 경우에는 나노입자간 수소결합인력이 너무 커서 응집된 고체를 형성하게 되어 이를 분산시킬 수 있는 용매를 찾을 수 없었으며 TEM 이미지도 얻을 수 없었다. 이로부터 나노입자의 표면에 규칙 구조를 갖는 친수성기의 수가 증가함에 따라서 입자간 수소결합인력이 통제할 수 없을 정도로 커질 수 있음을 확인하였다.
이상의 실시예 1 내지 6에서 반응 후의 양자점 용액에 불용성 용매를 가하여 원심분리한 후 폐기하는 액체에서 형광이 전혀 검출되지 않는 것으로 100% 수율임을 확인하였다.
실시예 7: 부분 표면 개질된 자성나노입자 SPION (- OA ) ex (- MHA ) 10 의 제조
8 ㎚ 크기의 소수성 SPION-OA 자성나노입자 용액(3×10-6 M) 2 ㎖를 취하여 에탄올로 2회 세척하고 톨루엔 20 ㎖에 분산시킨 용액을 100℃로 승온하였다. 여기에 10당량의 머캅토헥사데카노산(mercaptohexadecanoic acid, MHA)을 가하고 1시간 동안 환류하고 냉각시켰다. 이 용액 2 ㎖를 취하여 농축한 후 소량의 에탄올을 첨가한 상태에서 자석을 이용하여 부분적으로 표면 개질된 자성나노입자 SPION(- OA)ex(-MHA)10를 분리하였고, 이의 적외선 분광스펙트럼과 TEM 이미지를 분석하여 각각 도 8의 (b)와 도 9의 (b)에 나타내었다. TEM 이미지에서 SPION(-OA)ex(-MHA)10의 양자점 사이의 간격이 SPION-OA의 경우와 비슷한 것은 OA보다 탄소사슬 길이가 2개 짧은 MHA가 도 2의 단계 C에서 얻어진 생성물과 같이 산발적으로 일부의 OA를 치환했기 때문인 것으로 해석되며, 적외선 분광스펙트럼에서 MHA가 치환되어 3300 ㎝-1 부근의 O-H 피크가 증가한 것을 확인하였다.
실시예 8: 표적지향성-생체친화성 소수성 자성나노입자 SPION (- OA ) ex (- MHA - aPEGa - MTX ) 10 의 제조
실시예 7에서 제조한 SPION(-OA)ex(-MHA)10 용액(3×10-7 M) 18 ㎖에 DCC 30당량을 가하여 3시간 동안 교반한 후에 하기와 같이 제조된 aPEGa-MTX 30당량을 소량의 DMF에 용해시켜서 첨가하고 16시간 동안 교반하였다. 이 용액을 농축하고 에탄올을 첨가한 후에 자석을 이용하여 SPION(-OA)ex(-MHA-aPEGa-MTX)10을 분리하고 이를 클로로폼 9 ㎖에 분산시켰다. 이 중 1 ㎖를 취하여 적외선 분광스펙트럼과 TEM 이미지 분석을 수행하였고, 그 결과를 각각 도 8의 (c)와 도 9의 (c)에 나타내었다. TEM 이미지에서 자성나노입자들이 자기조립에 의한 육각배열을 깨고 산발적으로 흩어진 것으로 보아 aPEGa-MTX에 의해 불규칙 구조가 도입된 것을 알 수 있었으며, 적외선 분광스펙트럼에서 1100 및 1630 ㎝-1 부근에 PEG와 MTX의 특성 피크가 나타난 것을 확인하였다.
생체친화성 분자 aPEGa 와 표적지향성 분자 MTX 의 결합에 의한 aPEGa - MTX 의 제조
454 ㎎(1 m㏖)의 MTX(methotrexate, USP 레퍼런스 표준품)를 건조 증류한 14 ㎖의 다이메틸폼아마이드에 용해시키고 이 플라스크를 얼음물 중탕에 넣고 10분간 교반하였다. 여기에 226 ㎎(1.1 m㏖)의 DCC를 가하고 18시간 동안 교반한 후, 1 m㏖의 aPEGa를 가하여 3시간 동안 더 교반하였다. 상기 용액에 다이에틸에테르를 가하여 침전물을 형성하고 동일한 용매로 재결정하여 aPEGa-MTX 138 ㎎을 얻었다.
실시예 9: 표적지향성-생체친화성 수용성 자성나노입자 SPION (- MPA ) ex (- MUA - aPEGa - MTX ) 10 의 제조
실시예 8에서 제조한 SPION(-OA)ex(-MHA-aPEGa-MTX)10 용액(6×10-7 M) 8 ㎖에 0.05 M MPA와 0.05 M NaOH를 용해시킨 메탄올 용액을 150당량 첨가하고 2시간 동안 교반하였다. 여기에 메탄올을 첨가하고 원심분리하여 얻은 고체 SPION(-MPA)ex(-MUA-aPEGa-MTX)10를 pH 7.4인 PBS 완충용액 16 ㎖에 분산시켰다. 이 중 1 ㎖를 취하여 적외선 분광스펙트럼과 TEM 이미지를 분석하였고, 그 결과를 각각 도 8의 (d)와 도 9의 (d)에 나타내었다. 적외선 분광스펙트럼에서 OA가 MPA로 치환됨에 따라 탄소사슬의 길이가 감소하기 때문에 C-H 피크의 세기가 현저히 감소된 것을 확인하였다. 또한, TEM 이미지에서 시편 제조 시 수용액의 사용으로 인해 표면장력에 의한 겹침 효과가 있음에도 불구하고 입자간 거리가 확보되었음을 확인하였다.
실시예 10: 표적지향성-생체친화성 수용성 자성나노입자 SPION (- Lys ) ex (- MUA - aPEGa - MTX ) 10 의 제조
실시예 7 및 8에서 제조한 SPION(-OA)ex(-MHA-aPEGa-MTX)10 용액(6×10-7 M) 6 ㎖에 테트라옥틸암모늄브로마이드(tetraoctylammonium bromide, TOAB) 1,000당량을 가하고 16시간 동안 교반하였다. 여기에 0.1 M 라이신(Lysine, Lys) 수용액 6 ㎖를 가하고 19시간 동안 교반하였다. 상기 용액에 메탄올을 첨가하고 자석을 이용하여 SPION(-Lys)ex(-MUA-aPEGa-MTX)10 나노입자를 분리한 후 톨루엔 5 ㎖와 에탄올 5 ㎖를 이용하여 세척하고 pH 7.4인 PBS 완충용액에 분산시켰다. 이 중 1 ㎖를 취하여 적외선 분광스펙트럼과 TEM 이미지를 분석하였고, 그 결과를 각각 도 8의 (e)와 도 9의 (e)에 나타내었다. 적외선 분광스펙트럼에서 OA가 라이신으로 치환됨에 따라 탄소사슬의 길이가 감소하기 때문에 C-H 피크의 세기가 현저히 감소된 것을 확인하였다. 또한, TEM 이미지에서 시편 제조 시 수용액의 사용으로 인해 표면장력에 의한 겹침 효과가 있음에도 불구하고 입자간 거리가 확보되었음을 확인하였다.
실시예 11: 표적지향성-생체친화성 소수성 자성나노입자 SPION (- OA ) ex (- MHA - en - FA ) 5 의 제조와 바이오- 이미징
11 ㎚ 크기의 소수성 SPION-OA 자성나노입자 용액(3×10-6 M) 2 ㎖를 취하여 에탄올로 2회 세척하고 톨루엔 20 ㎖에 분산시킨 용액을 100℃로 승온하였다. 여기에 5당량의 머캅토헥사데카노산(mercaptohexadecanoic acid, MHA)을 가하고 1시간 동안 환류하고 냉각시켰다. 이 용액에 15당량의 DCC를 가하고 어두운 비활성 분위기 하에서 3시간 동안 교반한 후에, 실시예 3에서 제조한 en-FA 15당량을 소량의 DMF에 용해시켜 가하고 16시간 동안 교반하였다. 상기 용액을 농축시키고 에탄올을 첨가한 후에 자석을 이용하여 SPION(-OA)ex(-MHA-en-FA)5을 분리하여 클로로폼 10 ㎖에 분산시켰다. 이 나노입자의 적외선 분광스펙트럼을 도 8의 (f)에 나타내었으며, 1630 ㎝-1 부근에서 FA의 특성 피크를 확인하였다.
상기에서 제조한 SPION(-OA)ex(-MHA-en-FA)5 용액을 희석하여 1×10-7 M로 만들고 이로부터 1 ㎖를 취하여 배양접시 위에 고르게 펴 바른 후 자연 건조시켰다. 다음날 배양접시를 70% 에탄올과 자외선으로 소독한 후 사람의 상피암세포인 KB 세포(ATCC Manassas, VA) 2×105개를 그 위에 접종하고 37℃ 인큐베이터에서 16시간 동안 배양하였다. 배양된 세포를 긁어모아 아무 처리도 하지 않은 배양접시에서 4 시간 동안 더 배양하였다. 이 나노입자의 표적지향 거동을 비교하기 위해서 10 ㎍/㎖의 FA를 배양액에 첨가한 것을 제외하고는 상기와 동일한 실험을 수행하였다. 상기와 같이 처리된 세포 각각의 MR(magnetic resonance imaging) 이미지를 분석하였고, 그 결과를 도 10에 나타내었다. MR 이미지를 정량 분석한 결과, 공존하는 과량의 유리된(free) FA가 세포 표면의 수용기를 차지하여 표적지향성 자성나노입자 SPION(-OA)ex(-MHA-en-FA)5의 표적지향성이 10% 가량 감소함을 확인하고, 이로부터 소수성 자성나노입자의 FA에 의한 표적지향성이 상당히 의미있는 수준임을 알 수 있었다.
이상에서는 본 발명의 실시예를 들어 부분 표면개질에 의해 불규칙 표면구조를 가지며, 친수성, 생체친화성, 표적지향성의 일부 또는 전부를 가진 바이오-이미지용 나노입자 및 그 제조방법을 구체적으로 설명하였다. 그러나 전술한 실시예는 본 발명을 구체적으로 설명하기 위하여 예시적으로 제시하는 것일 뿐, 본 발명은 하기의 특허청구범위에서 명시적으로 언급되지 않는 한, 이러한 실시예에 의하여 제한되는 것이 아니다.
도 1은 종래기술에 따른 바이오-이미지용 나노입자의 제조과정과 각 단계의 나노입자 구조를 나타낸 것이고,
도 2는 본 발명에 따른 바이오-이미지용 나노입자의 제조과정과 각 단계의 나노입자 구조를 나타낸 것이고,
도 3은 양자점 출발물질과 실시예 1 내지 5에서 제조된 양자점의 적외선 분광스펙트럼을 나타낸 것이고,
a) 출발물질로 사용된 CdSe/CdS-ODA 양자점
b) 실시예 1에서 제조된 CdSe/CdS-DA 양자점
c) 실시예 2에서 제조된 CdSe/CdS(-DA)ex(-MUA)5 양자점
d) 실시예 3에서 제조된 CdSe/CdS(-DA)ex(-MUA-en-FA)5 양자점
e) 실시예 4에서 제조된 CdSe/CdS(-MPA)ex(-MUA-aPEGa)5 양자점
f) 실시예 5에서 제조된 CdSe/CdS(-MPA)ex(-MUA-aPEGa-FA)5 양자점
도 4는 양자점 출발물질과 실시예 1 내지 5에서 제조된 양자점의 투과전자현미경(TEM) 이미지를 나타낸 것이고,
a) 출발물질로 사용된 CdSe/CdS-ODA 양자점
b) 실시예 1에서 제조된 CdSe/CdS-DA 양자점
c) 실시예 2에서 제조된 CdSe/CdS(-DA)ex(-MUA)5 양자점
d) 실시예 3에서 제조된 CdSe/CdS(-DA)ex(-MUA-en-FA)5 양자점
e) 실시예 4에서 제조된 CdSe/CdS(-MPA)ex(-MUA-aPEGa)5 양자점
f) 실시예 5에서 제조된 CdSe/CdS(-MPA)ex(-MUA-aPEGa-FA)5 양자점
도 5는 실시예 4 및 5에서 제조된 양자점을 대조용과 표적지향용으로 사용하여 HT1080 세포와 KB 세포로 전달한 후 각 세포의 형광현미경 이미지를 나타낸 것이고,
QD: 대조용으로 사용된 CdSe/CdS(-MPA)ex(-MUA-aPEGa)5 양자점
QD-FA: 표적지향용으로 사용된 CdSe/CdS(-MPA)ex(-MUA-aPEGa-FA)5 양자점
+ FA: 과량의 유리된(free) FA가 존재하는 상태
- FA: 유리된 FA가 존재하지 않는 상태
도 6은 실시예 6에서 제조된 양자점의 적외선 분광스펙트럼을 나타낸 것이고,
a) CdSe/CdS(-DA)ex(-MUA-aPEGa)5 양자점
b) CdSe/CdS(-DA)ex(-MUA-aPEGa)10 양자점
c) CdSe/CdS(-DA)ex(-MUA-aPEGa)30 양자점
도 7은 실시예 6에서 제조된 양자점의 TEM 이미지를 나타낸 것이고,
a) CdSe/CdS(-DA)ex(-MUA-aPEGa)5 양자점
b) CdSe/CdS(-DA)ex(-MUA-aPEGa)10 양자점
도 8은 자성나노입자 출발물질과 실시예 7 내지 11에서 제조된 자성나노입자의 적외선 분광스펙트럼을 나타낸 것이고,
a) 출발물질로 사용된 SPION-OA 나노입자
b) 실시예 7에서 제조된 SPION(-OA)ex(MHA)10 나노입자
c) 실시예 8에서 제조된 SPION(-OA)ex(MHA-aPEGa-MTX)10 나노입자
d) 실시예 9에서 제조된 SPION(-MPA)ex(MHA-aPEGa-MTX)10 나노입자
e) 실시예 10에서 제조된 SPION(-Lys)ex(MHA-aPEGa-MTX)10 나노입자
f) 실시예 11에서 제조된 SPION(-OA)ex(MHA-en-FA)5 나노입자
도 9는 자성나노입자 출발물질과 실시예 7 내지 10에서 제조된 자성나노입자의 투과전자현미경(TEM) 이미지를 나타낸 것이고,
a) 출발물질로 사용된 SPION-OA 나노입자
b) 실시예 7에서 제조된 SPION(-OA)ex(MHA)10 나노입자
c) 실시예 8에서 제조된 SPION(-OA)ex(MHA-aPEGa-MTX)10 나노입자
d) 실시예 9에서 제조된 SPION(-MPA)ex(MHA-aPEGa-MTX)10 나노입자
e) 실시예 10에서 제조된 SPION(-Lys)ex(MHA-aPEGa-MTX)10 나노입자
도 10은 실시예 11에서 제조된 SPION(-OA)ex(MHA-en-FA)5 자성나노입자를 KB 세포 내로 표적지향한 실험의 자기공명영상(MR) 이미지를 나타낸 것이다.
*** 도면의 주요부분에 대한 부호의 설명 ***
10: 나노입자(코어) 12: 나노입자(쉘)
14: 계면활성제
16: 적어도 2개의 친수성기가 탄소수 1 내지 7개 중에서 선택되는 탄화수소 사슬을 통해 연결된 유기리간드
18: 기능성 분자(예컨대, 생체친화성 분자, 표적지향성 분자, 이들의 결합체 또는 혼합물)
20: 티올기와 친수성기가 탄소수 8 내지 20개 중에서 선택되는 탄화수소 사슬을 통해 연결된 유기리간드
A: 소수성 나노입자의 친수성 표면개질 단계
B: 친수성 나노입자의 기능성 분자 결합 단계
C: 소수성 나노입자의 부분적 친수성 표면개질 단계
D: 친수성 부분을 일부 포함하지만 전체적으로는 소수성을 나타내는 나노입자의 기능성 분자 결합 단계
E: 친수성 부분을 일부 포함하지만 전체적으로는 소수성을 나타내는 기능성 나노입자의 친수성 표면개질 단계

Claims (16)

1) 계면활성제로 보호된 코어 또는 코어/쉘 구조의 소수성 무기물 나노입자에 티올기와 친수성기가 탄소수 8 내지 20개 중에서 선택되는 탄화수소 사슬을 통해 연결된 유기리간드를 1 내지 30당량 첨가하여 반응시킴으로써 상기 유기리간드가 일부분의 계면활성제를 치환하면서 나노입자 표면에 금속-티올레이트(M-S) 공유결합에 의해 화학적으로 결합하는 단계;
2) 상기 단계 1)에서 제조된 나노입자의 표면에 도입된 친수성기에 생체친화성, 표적지향성 또는 이 둘 모두를 갖는 분자를 결합시켜 개별 분산성을 유지하면서 나노입자의 표면에 불규칙 표면구조를 도입하는 단계; 및
3) 상기 단계 2)에서 제조된 나노입자의 표면에 잔존하는 나머지 계면활성제를 적어도 2개의 친수성기가 탄소수 1 내지 7개 중에서 선택되는 탄화수소 사슬을 통해 연결된 유기리간드로 치환하여 친수성 나노입자로 전환시키는 단계를 포함하는, 바이오-이미지용 나노입자의 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 단계 1)에서 무기물 나노입자가 주기율표상의 Ⅱ족 원소인 아연, 카드뮴 및 납 중의 1 원소와 주기율표상의 Ⅵ족 원소인 황, 셀레늄 및 텔루륨 중의 1 원소로 구성되는 반도체 나노입자, 귀금속 나노입자 또는 산화철 나노입자인 것을 특징으로 하는 제조방법.
제2항에 있어서, 상기 무기물 나노입자가 CdSe, ZnS, CdSe/CdS, CdSe/ZnS, Au, Ag, Fe2O3 및 Fe3O4로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 단계 1)에서 유기리간드가 분자 내에 적어도 1개의 티올기와 적어도 1개의 친수성기를 포함하고, 상기의 친수성기는 아민기, 카복시기, 하이드록시기 및 티올기로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 제조방법.
제4항에 있어서, 상기 유기리간드가 머캅토운데카노산(murcaptoundecanoic acid), 머캅토도데카노산(murcaptododecanoic acid) 및 머캅토헥사데카노산(mercaptohexadecanoic acid)으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 단계 1)에서 나노입자 표면에 M-S 공유결합에 의해 화학적으로 결합할 수 있는 유기리간드의 수가 1 내지 30개인 것을 특징으로 하는 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 단계 2)에서 생체친화성, 표적지향성 또는 이 둘 모두를 갖는 분자가 적어도 한쪽 말단에 아민기, 알데하이드기, 카복시기, 하이드록시기 및 티올기로 구성된 군으로부터 선택되는 기가 연결된 생체친화성 분자, 표적지향성 분자, 이들의 결합체 또는 혼합물인 것을 특징으로 하는 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 단계 3)에서 유기리간드가 분자 내에 적어도 2개의 친수성기를 포함하고, 상기의 친수성기는 아민기, 카복시기, 하이드록시기 및 티올기로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 제조방법.
제8항에 있어서, 상기 유기리간드가 머캅토헥사노산(mercaptohexanoic acid), 머캅토아세트산(mercaptoacetic acid), 머캅토프로피온산(mercaptopropionic acid), 다이머캅토숙신산(dimercaptosuccinic acid), 2-머캅토에탄올(2-mercaptoethanol), 2-아미노에탄티올(2-aminoethanethiol), 라이신(Lysine), 아르기닌(arginine) 및 아미노발레르산(aminovaleric acid)으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 제조방법.
제7항에 있어서, 상기 생체친화성 분자가 양쪽 사슬 말단에 아민기, 알데하이드기 및 카복시기 중에서 선택된 기를 갖거나, 한쪽 사슬 말단에는 아민기, 알데하이드기 및 카복시기 중 하나를 갖고 다른 쪽 사슬 말단에는 탄소수가 1 내지 7개 중에서 선택되는 알콕시기 또는 하이드록시기를 갖는 것을 특징으로 하는 제조방 법.
제10항에 있어서, 상기 생체친화성 분자가 폴리에틸렌글라이콜(PEG), 덱스트란, 폴리(L-락타이드)(PLLA), 폴리(DL-락타이드)(PDLLA), 폴리-DL-락타이드/글라이콜라이드 공중합체(PLGA), 키토산, 알긴산, 히아루론산, 콜라겐, 헤파린 및 폴리(ε-카프로락톤)으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 제조방법.
제7항에 있어서, 상기 표적지향성 분자가 아민기, 알데하이드기, 카복시기, 하이드록시기 및 티올기 중의 하나를 가지고 있어서 유기리간드 또는 생체친화성 분자와 아마이드 결합, 에스테르 결합 및 티오에스테르 결합 중의 하나에 의해 연결될 수 있는 것을 특징으로 하는 제조방법.
제12항에 있어서, 상기 표적지향성 분자가 엽산(folic acid), 메토트랙세이트(methotrexate, MTX), 특정 세포에 선택적인 펩타이드, 또는 특이 항원에 선택적으로 반응하는 항체인 것을 특징으로 하는 제조방법.
계면활성제로 보호된 코어 및 코어/쉘 구조의 소수성 무기물 나노입자의 표면에 일부분의 계면활성제 대신 금속-티올레이트 결합된 티올기와 친수성기가 탄소수 8 내지 20개 중에서 선택되는 탄화수소에 의해 연결된 유기리간드가 금속-티올레이트 (M-S) 공유결합에 의해 화학적으로 결합되어 있고,
상기 유기리간드가 결합된 부분은 친수성을 띠지만 전체적으로는 소수성을 나타내는 바이오-이미지용 나노입자.
계면활성제로 보호된 코어 및 코어/쉘 구조의 소수성 무기물 나노입자의 표면에 일부분의 계면활성제 대신 금속-티올레이트 결합된 티올기와 친수성기가 탄소수 8 내지 20개 중에서 선택되는 탄화수소에 의해 연결된 유기리간드가 금속-티올레이트 (M-S) 공유결합에 의해 화학적으로 결합되어 있고,
상기 유기리간드의 친수성기에 생체친화성, 표적지향성 또는 이 둘 모두를 갖는 분자가 결합되어 불규칙 표면구조를 가지며,
상기 생체친화성, 표적지향성 또는 이 둘 모두를 갖는 분자가 결합된 부분은 친수성을 띠지만 전체적으로는 소수성을 나타내는 바이오-이미지용 나노입자.
계면활성제로 보호된 코어 및 코어/쉘 구조의 소수성 무기물 나노입자의 표면에 일부분의 계면활성제 대신 금속-티올레이트 결합된 티올기와 친수성기가 탄소수 8 내지 20개 중에서 선택되는 탄화수소에 의해 연결된 유기리간드가 금속-티올레이트 (M-S) 공유결합에 의해 화학적으로 결합되어 있고,
상기 유기리간드의 친수성기에 생체친화성, 표적지향성 또는 이 둘 모두를 갖는 분자가 결합되어 불규칙 표면구조를 가지며,
상기 나노입자의 표면에 잔존하는 나머지 계면활성제가 적어도 2개의 친수성기가 탄소수 1 내지 7개 중에서 선택되는 탄화수소 사슬을 통해 연결된 유기리간드로 치환되어 나노입자의 표면 전체가 친수성을 나타내는 바이오-이미지용 나노입자.
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