DE3850931T2

DE3850931T2 - Heterobifunktionelle Kupplungsmittel.

Info

Publication number: DE3850931T2
Application number: DE3850931T
Authority: DE
Inventors: Grady Barnes; Christopher Bieniarz; Carol A Schlesinger; Christopher Joseph Welch
Original assignee: Abbott Laboratories
Current assignee: Abbott Laboratories
Priority date: 1987-10-30
Filing date: 1988-10-27
Publication date: 1994-12-01
Anticipated expiration: 2008-10-28
Also published as: EP0314127A2; AU2441188A; JP2964407B2; EP0314127B1; EP0314127A3; ATE109464T1; ES2060636T3; DE3850931D1; AU626809B2; CA1340387C; JPH01201158A

Description

Hintergrund der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft Kupplungsagentien zur kovalenten Konjugation von Proteinen an Proteine oder von Proteinen an feste Phasen für die Verwendung in Diagnoseassays.
Es ist wohlbekannt, daß ein Protein wie ein Enzym über eine verbindende Gruppe mit einem anderen Protein, wie z. B. einem Antikörper, unter Bildung eines Konjugates, das in Enzymimmunoassays (EIAs) verwendet werden kann, konjugiert werden kann. Jedoch sind Protein-Protein-Konjugate häufig mit verringerter oder geänderter Aktivität mindestens eines der Proteine behaftet.
Bisher wurden Protein-Protein-Konjugate mit Hilfe von heterobifunktionellen Reagentien gebildet, die sehr kurz sind im Vergleich zu den Proteinmolekülen, die zu konjugieren sind. Man glaubt, daß durch Einschränkung der konformativen Beweglichkeit eines Proteins die Funktion des Proteins (z. B. Anfangsgeschwindigkeit, Wechselzahl und Km für ein Enzym oder die Affinität zu einem Antikörper) nachteilig beeinflußt werden kann, wodurch die einzelnen Komponenten eines Enzym-Antikörper-Konjugates weniger aktiv als ihre unkonjugierten Gegenstücke werden. Dies war ein Problem, das die Bioaktivität von Enzym-Antikörper- Konjugaten und ihre Anwendung in Immunoassays einschränkte.
Die Bindung von Proteinen an feste Phasen ging in der Vergangenheit ebenfalls häufig mit Problemen einher. Zum Beispiel wird in Diagnoseassays die Reaktion zwischen einem spezifisch bindenden Bestandteil und seinem Komplement oftmals eingesetzt, um nachzuweisen, ob (und, in manchen Assays, wie oft) der spezifisch bindende Bestandteil oder das Komplement in einer Probe vorhanden ist. In einer Art von Diagnoseassays wird ein spezifisch bindender Bestandteil (z. B. ein Antikörper) in einer Probe nachgewiesen durch Einführen seines Komplements (z. B. eines Antigens) in die Probe und durch Bestimmen, ob irgendeine Reaktion zwischen den beiden Reagentien stattfindet. Alternativ hierzu kann das Komplement selbst in einer Probe nachgewiesen werden durch Zugabe des spezifisch bindenden Bestandteils zur Probe und Bestimmen, ob irgendeine Reaktion stattfindet. Da es oftmals sehr schwer ist, nachzuweisen, ob irgendeine Reaktion stattgefunden hat, kann ein zweiter spezifisch bindender Bestandteil der Probe zugefügt werden. Der zweite spezifisch bindende Bestandteil kann entweder mit dem ersten spezifisch bindenden Bestandteil oder dessen Komplement reagieren, und der zweite Bestandteil trägt eine nachweisbare Markierung. Selbstverständlich ist es unmöglich, im vornherein festzulegen, wieviele markierte zweite spezifisch bindende Bestandteile zugefügt werden müssen, da nicht bekannt ist, wieviel der nachzuweisenden Substanz, wenn überhaupt, in der Probe vorhanden ist.
Deshalb wird der markierte spezifisch bindende Bestandteil im Überschuß zugefügt, so daß die maximale Konzentration der typischerweise in solchen Proben gefundenen Substanz überschritten wird. Der markierte spezifisch bindende Bestandteil, der nicht an die Substanz gebunden wird, muß jedoch von der Probe abgetrennt werden, so daß nur der gebundene markierte Bestandteil nachgewiesen wird, um nachzuweisen, daß die Substanz tatsächlich in der Probe vorhanden ist.
Ein verbreiteter Ansatz zur Trennung des gebundenen vom ungebundenen markierten Bestandteil ist der Einsatz von Festphasentrennung. Ein typisches Beispiel für eine solche Trennung umfaßt das Verankern des ersten spezifisch bindenden Bestandteils (für den Fall von Assays für das Komplement zum ersten Bestandteil) oder der Komplemente (im Fall von Assays für spezifisch bindende Bestandteile) an einer festen Phase (wie Mikropartikel), die von der Probe, z. B. durch Filtration oder Schwerkraftsedimentation, abgetrennt werden kann. Die Markierung, die entweder der festen Phase zugeordnet oder noch in der Probe vorhanden ist, ist proportional zu der Menge an nachzuweisender Substanz in der ursprünglichen Probe.
Andere Abwandlungen dieser allgemeinen Festphasentrennungsvorgehensweise wurden entwickelt, aber die meisten dieser Vorgänge beziehen die Bindung der zu analysierenden Substanz an einen spezifisch bindenden Bestandteil, der auf einer festen Phase verankert ist, mit ein. Diese Bindung ist entscheidend für die Assayleistung. Jedoch kann das Bindeglied zwischen der festen Phase und dem spezifisch bindenden Bestandteil den Bindungsvorgang beeinflussen. Ein Beispiel soll diesen Sachverhalt illustrieren. Antikörper haben extrem spezifische strukturelle, räumliche und polare Konfigurationen, die sie mit der Fähigkeit ausstatten, eine Analytart zu erkennen und genau an diese zu binden und an praktisch keine andere. Wenn Antikörper in Assays zum Nachweis von Antigenen eingesetzt werden, können die Antikörper an festen Phasen verankert werden. Jedoch kann die Nähe der festen Phase zum Antikörper Reaktionsstellen für die Antigenbindung blockieren.
Alternativ kann die Anbindung (gewöhnlich kovalent) des Antikörpers an die feste Phase die Struktur (Konformation) des Antikörpers verändern, so daß diese Anbindung die Bindung des Antikörpers an den Analyten in schädlicher Weise beeinflussen kann. Die gleiche Situation ergibt sich für die Konjugation von Analyten, insbesondere Proteinen, an feste Phasen. Die Analytkonformation kann bei der Konjugation verändert werden, so daß der freie Antikörper in der Probe den Analyten nicht länger erkennen kann.
Kovalente Anbindung von Proteinen an feste Phasen mit Hilfe von bifunktionellen Reagentien wurde in der Vergangenheit mit unterschiedlichen Ergebnissen verwirklicht. In manchen Fällen wurden die Proteine direkt an die feste Phase konjugiert. Im allgemeinen war die Verbindungslänge sehr kurz im Vergleich zu der Größe des gebundenen Proteins. Dies ist unvorteilhaft insofern, als daß das gebundene Protein weiterhin behindert werden kann, seine biologische Funktion aufgrund von räumlicher Enge, Unzugänglichkeit der Bindungsstellen usw., in einer Probe auszubilden.
Dies war ein Problem, das die Bioaktivität und Stabilität von derivatisierten festen Phasen in der Vergangenheit eingeschränkt hat.
Als relevanter technischer Hintergrund für die vorliegende Erfindung können die folgenden Schriften genannt werden: Chem. Pharm. Bull., 1981, Vol. 29, Nr. 4, Seiten 1130-1135, offenbart N-(Maleinimidobenzoyloxy)-succinamid- Kreuzvernetzungsreagentien. JP-A-60 146 154 beschreibt die Verwendung von Succinimidyl-4-(N- maleinimidomethyl)cyclohexan-1-carboxylat (SMCC), das mit Osteocarcin kreuzvernetzt ist. JP-A-59 176 675 offenbart N- (Maleinimidarnoyloxy)succinamid als einen Kreuzvernetzer mit einem Antigen oder Antikörper und einem Markierungsenzym. Chemical Abstracts, 1979, Vol. 90, Nr. 21, Abstr. 161 838c legt N-(3-Maleinimidopropionylglycyloxy)succinimid als einen Kreuzvernetzer für Ampicillin offen. EP-A-0 158 291 offenbart N-(Maleinimidomethylcyclohexylen)succinimid als Kreuzvernetzer zwischen einem Anti-CEA-Antikörper und Peroxidase. EP-A-0 178 125 legt heterobifunktionelle Kupplungsmittel offen, die für die Bindung von Radionuklidmetallionen an Antikörperfragmente nützlich sind. EP-A-0 109 653 gibt die Anbindung von Fibrin-adsorbierbarem Protein an Urokinase durch die Verwendung von heterobifunktionellen Reagentien bekannt. J. Biochem., 1982, Vol. 92, Nr. 5, Seiten 1413-1424, gibt den N- Hydroxysuccinimidester von N-(4-Carboxycyclohexylmethyl) maleinimid als heterobifunktionellen Kreuzvernetzer bekannt.
Die vorliegende Erfindung umfaßt heterobifunktionelle Kupplungsmittel der Formel I:
wobei x eine Aminosäure mit drei bis zehn Kohlenstoffatomen in einer unverzweigten Kette ist;
R ist ein Alkyl, Cycloalkyl, ein Alkyl-cycloalkyl oder Phenyl; und
n ist gleich eins bis zehn.
Diese Erfindung umfaßt auch Konjugate von festen Phasen mit den neuen oberen Bindegruppen, die verwendet werden können, um feste Phasen an Substanzen wie Proteine, Antikörper, Antigene und ähnliche zu binden. Diese Konjugate sind hydrophil, daher sind sie, in wäßrigen Lösungen sehr stabil, und sie erhalten die Konformation der Substanzen, wenn diese Substanzen an feste Phasen gebunden werden. Gleichzeitig haben diese Bindegruppen eine solche Länge, daß die festen Phasen nicht dazu neigen, die Bindungsstellen dieser Substanzen zu beeinträchtigen.
Festphasen-Konjugate dieser Erfindung haben die Formel II:
worin Z ein Amin ist, das das Festphasenmaterial trägt; X ist eine Aminosäure mit drei bis zehn Kohlenstoffatomen in unverzweigter Kette; n ist gleich eins bis zehn; und R ist ein Alkyl, Cycloalkyl, ein Alkylcycloalkyl oder Phenyl.
Die vorliegende Erfindung umfaßt auch Protein- Festphasen-Konjugate der Formel III:
worin Q ein -SH oder Thiol-tragendes Peptid, Polypeptid oder Protein ist, oder ein Peptid, Polypeptid oder ein Protein, das mit Sulfhydrylgruppen derivatisiert ist; und worin Z, X, n und R wie oben definiert sind.
Die vorliegende Erfindung umfaßt auch Antikörper- Enzym-Konjugate der Formel IV:
worin X, n und R wie oben definiert sind; B ist ein Antikörper, Antikörperfragment oder Enzym; Q ist ein Antikörper oder Antikörperfragment, wenn B ein Enzym ist, und es ist ein Enzym, wenn B ein Antikörper oder Antikörperfragment ist; und r ist gleich eins bis fünfzig. Mit diesem Konjugat können viele Enzymmarkierungen an einen einzelnen Antikörper angehängt werden (oder umgekehrt), um ein starkes Antwortsignal in einem Immunoassay zu erzeugen.
Die vorliegende Erfindung umfaßt auch Immunogene der Formel V:
worin X, n und R wie oben definiert sind; W ist eine Polyaminosäure, Q ist ein Hapten, und r ist gleich 1 bis 20.
Das Kupplungsmittel nach Formel I kann verwendet werden, um Proteine an feste Phasen, Enzyme an Antikörper, Haptene an Haptenträger oder praktisch alle Proteine an andere Proteine zu konjugieren. Die Verwendung eines Kupplungsmittels nach Formel I in solchen Konjugaten liefert ein Konjugat, in dem die normale Aktivität des Antikörpers, Enzyms oder Proteins erhalten bleibt. Es wird angenommen, daß bisherige Kupplungsmittel aufgrund ihrer kurzen Gesamtlänge im Vergleich zu der Größe der Proteine, an die sie konjugiert werden, Konjugate liefern, in denen die konformative Beweglichkeit der einzelnen Proteine beeinträchtigt ist. Dieser Verlust an konformativer Beweglichkeit kann zu verringerter Aktivität entweder eines oder beider Proteine im Konjugat führen, was zu einer geringeren Wirkung in EIAs oder geringerer Stabilität der Reagentien führt. Daher sind viele bisherige Kupplungsmittel nur begrenzt brauchbar.
Die lange hydrophile Kette von Aminosäuren in den Kupplungsmitteln der vorliegenden Erfindung liefert nicht nur eine bessere physikalische Trennung der konjugierten Proteine, sondern sie werden durch das Wasser der Lösung gut solvatisiert, im Gegensatz zu den häufig benutzten hydrophoben Spacergruppen in bisherigen Kupplungsmitteln. Die Kupplungsmittel dieser Erfindung sind daher für die Verwendung in wäßrigen Lösungen gut geeignet.
Wie oben angegeben, umfaßt die vorliegende Erfindung auch Konjugate von "amintragenden festen Phasen". Zu solchen festen Phasen zählen Polymere, Glas und Naturprodukte, die (entweder primäre, sekundäre oder tertiäre) Amingruppen tragen, und die mit einer Maleinimidkomponente umgesetzt werden können, um eine stabile kovalente Bindung zu bilden. Eine große Anzahl fester Phasen sind möglich, die dieser Definition genügen: kommerziell erhältliche aminierte Polystyrol Partikel, Aminosilicagele, teilweise hydrolysiertes Nylon, teilweise reduzierte Polyacrylamide, teilweise reduzierte Cyanoacrylate und Copolymere, die solche Polymere enthalten. Feste Phasen mit Nitrilgruppen, die zu Aminogruppen reduziert werden können, liefern "Amintragende feste Phasen", in Übereinstimmung mit dieser Erfindung.
Während bevorzugt Mikropartikel als feste Phase verwendet werden, sind auch andere Festkörperkonfigurationen möglich: Körner, Platten, Kugeln, Filter und ähnliches. Eine besonders interessante Festkörperkonfiguration ist jedoch Faserstoff. Viele der zuvor genannten Polymere sind in faseriger Form erhältlich. Diese Faserstoffe können zerkleinert (diskontinuierlich) oder kontinuierlich sein, wobei letztere bevorzugt sind. Kontinuierliche Faserstoffe können mit den Bindegruppen dieser Erfindung derivatisiert werden, und Proteine wie Antikörper können an die Bindegruppen konjugiert werden. Die Protein-tragende Faser kann dann auf einen festen Träger, wie Stoff, eine Matte, ein gewebtes oder nicht-gewebtes Filtermedium, aufgenäht oder eingewoben werden. Die Faser kann in unterschiedlichen Mustern aufgenäht oder eingewoben werden. Zum Beispiel können Faserstoffe in Form eines Plus(+)-Zeichens angeordnet werden, wobei der vertikale Strang positive Anzeige und der horizontale Strang negative Anzeige aufweist, wie in der anhängigen U.S.-Anmeldung mit Seriennummer 831 013 offenbart. Wenn ein Assay mit Hilfe eines aufgenähten Faserstoffes ausgeführt wird, erscheint daher ein Pluszeichen, sofern die Probe, die das Medium passiert, Analyt enthält, und es erscheint ein Minuszeichen (-) (nur der horizontaler Streifen), wenn kein Analyt in der Probe enthalten ist.
Ein anderer Ansatz ist das Verankern der Bindegruppen dieser Erfindung an der Faser, das Einnähen der Faser in ein inertes Trägermaterial (d. h. ein Material, dem Maleinimidgruppen fehlen), und das Umsetzen des Proteins mit den exponierten Maleinimidkomponenten an den Bindegruppen.
Der Substituent "Q" ist ein -SH oder Thiol-tragendes Peptid, Polypeptid oder Protein. Für eine günstige Umsetzung mit den Bindegruppen dieser Erfindung tragen das Peptid, Polypeptid oder Protein, das an die Bindegruppen konjugiert werden soll, reaktive Thiol- (Mercapto-) oder Sulfhydryl- (-SH)-Gruppen. Es ist bekannt, daß Mercaptogruppen Sulfhydrylgruppen enthalten, aber diese Erfindung zieht in Betracht, daß Peptide, Polypeptide oder Proteine, denen Sulfhydrylgruppen fehlen, künstlich mit Sulfhydrylgruppen derivatisiert werden können, die keine Mercaptogruppen sind, nachdem Mercaptogruppen organische Verbindungen sind, die Sulfhydrylgruppen tragen. Die Sulfhydrylgruppe am Peptid, Polypeptid oder Protein reagiert mit der Maleinimidkomponente an den Verbindungsgruppen dieser Erfindung und bildet eine kovalente Bindung zwischen den Bindegruppen und dem Peptid, Polypeptid oder Protein.
Der Ausdruck "Alkyl-cycloalkyl", wie er hierin für "R" verwendet wird, umfaßt Alkylgruppen, die mit Cycloalkyl- Ringstrukturen verbunden sind, worin die Alkylgruppe das Cycloalkyl mit Maleinimid- oder den Carbonylgruppen verbindet. Der Ausdruck "Alkyl" umfaßt geradkettige oder verzweigte Alkylgruppen, bevorzugt niedermolekulare Gruppen mit einem bis sechs Kohlenstoffatomen.
Die nachfolgenden Beispiele illustrieren diese Erfindung. Die Beispiele 1-8 beschreiben die Synthese der verschiedenen Bindegruppen dieser Erfindung. Die Beispiele 9-27 beschreiben die Verwendung der Bindegruppen, um feste Phasen an Proteine und Proteine an Proteine zu konjugieren. Beispiel 1 Synthese von
Trans-4-(Aminomethyl)-cyclohexancarbonsäure wurde von Aldrich Chemical Co. erworben und in N-(4- Carboxycyclohexylmethyl)maleinimid mit Hilfe des Verfahrens von Yoshitake et al. (J. Biochem., 101 : 395-399 (1979)) überführt. Dieses Material (100 mg) wird dann in trockenem Dimethylformamid (DMF) (1,0 ml) gelöst, 6-Aminocapronsäure (39,2 mg, 1,0 äq) wird zugefügt, und das resultierende Gemisch wird bei Raumtemperatur über Nacht unter Stickstoffatmosphäre gerührt. Am darauffolgenden Morgen wird Dicyclohexylcarbodiimid (DCCI) (67,8 mg, 1,1 äq) zugefügt und das Reaktionsgemisch wird weitere sechs Stunden gerührt. Gefällter Dicyclohexylharnstoff (DCU) wird durch Filtration entfernt, und die resultierende DMF-Lösung wird unter reduziertem Druck eingedampft und ergibt einen klebrigen Feststoff, der durch Flash-Chromatographie an Silicagel (5% Methanol/Chloroform) gereinigt wird und der Verbindung 1 (71 mg) als weißen Feststoff in 53%iger Gesamtausbeute ergibt.
(R = Cyclohexylmethyl; n = 1; X = 6-Aminocapronyl). Beispiel 2 Synthese von:
Verbindung 1 (100 mg, Synthese wie in Beispiel 1 beschrieben) wird in trockenem DMF (1,0 ml) gelöst, 6- Aminocapronsäure (29,3 mg, 1,0 äq) wird anschließend zugefügt und das resultierende Gemisch wird über Nacht bei Raumtemperatur unter Stickstoffatmosphäre gerührt. Am darauffolgenden Morgen wird DCCI (50,7 mg, 1,1 äq) zugefügt und das Reaktionsgemisch wird weitere sechs Stunden gerührt. Fester Niederschlag (DCU) wird durch Filtration entfernt, und die resultierende DMF-Lösung wird unter reduziertem Druck eingedampft und ergibt einen klebrigen Feststoff, der durch Flash-Chromatographie an Silicagel (10% Methanol/Chloroform) gereinigt wird und der Verbindung Z (60 mg) als weißen Feststoff in 48%iger Gesamtausbeute ergibt. (R = Cyclohexylmethyl; n = 2; X = 6-Aminocapronyl). Beispiel 3 Synthese von:
Verbindung 2 (100 mg, synthetisiert wie in Beispiel 2 beschrieben) wird in trockenem DMF (2,0 ml) gelöst, 6- Aminocapronsäure (23,4 mg, 1,0 äq) wird anschließend zugefügt, und die resultierende Mischung wird über Nacht bei Raumtemperatur unter Stickstoffatmosphäre gerührt. Am darauffolgenden Morgen wird DCCI (40,5 mg, 1,1 äq) zugefügt und das Reaktionsgemisch wird weitere sechs Stunden gerührt. Fester Niederschlag (DCU) wird durch Filtration entfernt, und die resultierende DMF-Lösung wird unter reduziertem Druck eingedampft und ergibt ein klebrigen Feststoff, der durch Flash-Chromatographie an Silicagel (10% Methanol/Chloroform) gereinigt wird und die Verbindung 3 (60 mg) als weißen Feststoff in 50%iger Gesamtausbeute ergibt. (R = Cyclohexylmethyl, n = 3, X = 6-Aminocapronyl). Beispiel 4 Synthese von:
Verbindung 3 (100 mg, Synthese wie in Beispiel 3 beschrieben) wird in trockenem DMF (10,0 ml) gelöst. 6- Aminocapronsäure (19,5 mg, 1,0 äq) wird anschließend zugefügt und die resultierende Mischung wird über Nacht bei Raumtemperatur unter Stickstoffatmosphäre gerührt. Am darauffolgenden Morgen wird DCCI (33,7 mg; 1,1 äq) zugefügt und die Reaktionsmischung wird weitere sechs Stunden gerührt. Fester Niederschlag (DCU) wird durch Filtration entfernt, und die resultierende DMF-Lösung wird unter reduziertem Druck eingedampft und ergibt einen klebrigen Feststoff, der durch Flash-Chromatographie an Silicagel (10% Methanol/Chloroform) gereinigt wird und Verbindung 4 (53 mg) als weißen Feststoff in 45%iger Gesamtausbeute ergibt.
(R = Cyclohexylmethyl; n = 4; X = 6-Aminocapronyl). Beispiel 5 Synthese von NBS-Bindegliedern gesteigerter Länge: a) Synthese von:
Eine 0,15 M Lösung von m-Maleinimidobenzoyl-N- hydroxysuccinimidester (MBS) (hergestellt nach dem Verfahren von Kitagawa, et a., J. Biochem., 79 : 233-236 (1976)) in trockenem DMF wird mit einem Äquivalent 6-Aminocapronsäure behandelt und über Nacht bei Raumtemperatur unter Stickstoffatmosphäre gerührt. Am darauffolgenden Morgen wird 1,0 Äquivalent Dicyclohexylcarbodiimid (DCCI) zugefügt und die Reaktionsmischung wird weitere sechs Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Ausgefallener Dicyclohexylharnstoff (DCU) wird durch Filtration entfernt, das DMF wird unter Hochvakuum eingedampft und ergibt ein Rohprodukt 5, das durch Flash-Chromatographie an einer Silicageltrennsäule gereinigt wird. (R = 3,5-disubstituierter Benzolring; n = 1; X = 6-Aminocapronyl).

b) Allgemeines Verfahren zur Synthese von aktiven Estern gesteigerter Länge:

Zur Synthese noch längerer Verbinderarme auf der Basis von MBS oder einem beliebigen aktiven Ester, wird eine DMF- Lösung einer Verbindung mit einem N-Hydroxysuccinimidylester (z. B. Verbindung 5 aus Teil a) mit 1,0 Äquivalent an 6- Aminocapronsäure behandelt und bei Raumtemperatur unter Stickstoffatmosphäre gerührt, bis kein aktiver Ester mehr durch TLC sichtbar ist. 1,1 Äquivalente DCCI werden anschließend zugefügt, und die Reaktionsmischung durch TLC sichtbar gemacht. Ausgefallenes DCU wird durch Filtration entfernt, DMF wird unter vermindertem Druck eingedampft und es ergibt sich ein Rohrückstand, der durch Flash- Chromatographie an einer Silicagel-Trennsäule gereinigt wird.
Dieses Verfahren schiebt einen 6- Aminocapronsäurebaustein in den aktiven Ester ein und liefert den aktiven Ester zurück. Dieses Einschubverfahren kann mit Hilfe von 6-Aminocapronsäure oder anderen Aminosäuren wiederholt werden, was ein Reagens der gewünschten Länge ergibt. Beispiel 6 Synthese von MCS-Reagentien gesteigerter Länge: Synthese von:
Eine 0,15 M Lösung von 6-Maleinimidocapronsäure-N- hydroxysuccinimidester (MCS) (hergestellt nach dem Verfahren, wie es von Keller und Rudinger in Helv. Chim Acta, 58 : 531-541 (1975) beschrieben wurde) in trockenem DMF wird mit einem Äquivalent 6-Aminocapronsäure behandelt und über Nacht bei Raumtemperatur unter Stickstoffatmosphäre gerührt. Am darauffolgenden Morgen wird 1,1 Äquivalent DCCI zugefügt und die Reaktionsmischung wird weitere sechs Stunden gerührt. Ausgefallenes DCU wird durch Filtration entfernt, DMF wird unter Hochvakuum eingedampft und ergibt ein Rohprodukt 6, das durch Flash-Chromatographie an einer Silicageltrennsäule gereinigt wird. Längere Analoga von 6 können entsprechend der allgemeinen Homologisierungssequenz, wie in Beispiel 5, Teil b) beschrieben, dargestellt werden. (Formel I; R = eine 1,5-disubstituierte Pentylgruppe, n = 1, X = 6-Aminocapronyl). Beispiel 7 Synthese von: a) Synthese von Verbindung 7
CBZ-Triglycin (4,0 g, Bachem Chem. Co.) wird in 50,0 ml trockenem DMF gelöst. N-Hydroxysuccinimid (1,42 g, 1,0 äq) und DCCI (2,55 g, 1,0 äq) werden zugefügt und die resultierende Mischung wird über Nacht bei Raumtemperatur unter Stickstoffatmosphäre gerührt. Am darauffolgenden Morgen wird der ausgefallene DCU durch Filtration entfernt, die resultierende DMF-Lösung wird unter reduziertem Druck eingedampft und ergibt ein gelbes Öl. Umkristallisation aus Ethylacetat/Chloroform liefert das Zwischenprodukt 7 (3,0 g) in 57%iger Ausbeute. Synthese von Verbindung 8
Glycin-t-butylesterhydrochlorid (0,54 g, Sigma Chem. Co.) wird in trockenem DMF (25,0 ml) suspendiert. Verbindung 7 (1,35 g, 1,0 äq) aus Teil a) wird dann zugefügt, zusammen mit Triethylamin (1,62 g, 5,0 äq). Die resultierende Lösung wird über Nacht bei Raumtemperatur unter Stickstoffatmosphäre gerührt. Am darauffolgenden Morgen wird das Lösungsmittel unter reduziertem Druck entfernt und ein Rohprodukt bleibt zurück. Die Umkristallisation aus Ethylacetat/Chloroform ergibt das Zwischenprodukt 8 (0,95 g) in 68%iger Ausbeute. Synthese von Verbindung 9
Verbindung 8 (0,95 g) aus Teil b) wird in trockenem Methanol (300 ml) gelöst. Eisessig (0,45 ml) wird anschließend zugefügt, und die Lösung wird mit Stickstoff 15 Minuten lang gespült. Palladium auf Kohlenstoff (1,5 g, Palladiumgehalt 10%) wird dann vorsichtig zugefügt, während die Verbindung gerührt wird. Ein Wasserstoffgasstrom wird in die gerührte Lösung drei Stunden lang bei Raumtemperatur eingeleitet. Die Lösung wird vorsichtig mit Stickstoff 15 Minuten lang gespült und dann filtriert. Die Filtratlösung wird unter reduziertem Druck aufkonzentriert und ergibt das Zwischenprodukt 9 (700 mg) als das Acetatsalz. d) Synthese von Verbindung 10
Verbindung 10 (700 mg Acetatsalz) aus Teil c) wird in trockenem DMF (25 ml) gelöst. N-(4-Carboxycyclohexylmethyl)maleinimid (697 mg) aus Beispiel 1 wird anschließend zugefügt, und die Verbindung wird über Nacht bei Raumtemperatur unter Stickstoffatmosphäre gerührt. Am darauffolgenden Morgen wird DMF unter reduziertem Druck eingedampft und ein Rohprodukt bleibt zurück. Die Umkristallisation aus Ethylacetat/Hexan liefert das Zwischenprodukt 10 in 22%iger Ausbeute. Synthese von Verbindung 11
Verbindung 10 (225 mg) aus Teil d) wird in Chloroform (1,5 ml) suspendiert. Trockene Trifluoressigsäure (1,5 ml) wird anschließend zugefügt, und die Verbindung wird bei Raumtemperatur unter einer Stickstoffatmosphäre für einen Zeitraum von 3 Stunden gerührt. Das Lösungsmittel wird unter reduziertem Druck eingedampft und ergibt ein Rohprodukt. Die Titration mit Ethylacetat ergibt das Zwischenprodukt A1 (127 mg) in 61%iger Ausbeute. f) Synthese von Verbindung 12
Verbindung 11 (100 mg) aus Teil e) wird in trockenem DMF (7,0 ml) zusammen mit N-Hydroxysuccinimid (37,1 mg, 1,5 äq) und DCCI (221,5 mg, 5,0 äq) gelöst. Die Reaktionsmischung wird über Nacht bei Raumtemperatur unter einer Stickstoffatmosphäre gerührt. Am darauffolgenden Morgen wird ausgefallener DCU durch Filtration entfernt, DMF wird unter reduziertem Druck eingedampft und zurück bleibt ein Rohprodukt. Die Titration mit Chloroform ergibt die Verbindung 12 (86 mg) in 60%iger Ausbeute. (R = Cyclohexylmethyl; n = 4; X = Glycyl).
Verbindung 12 kann zur Konjugation von Proteinen (z. B. Antikörpern und Enzymen) an feste Phasen mit Hilfe der in den folgenden Beispielen angeführten Verfahren verwendet werden. Beispiel 8 Synthese von m-Maleinimidobenzoylcapronamido-N-Hydroxysuccinimid
Ein Rundkolben, ausgestattet mit einem Magnetrührer, wird mit m-Maleinimidobenzoyl-N-hydroxysuccinimidester (0,314 g, 0,001 mol) von der Pierce Corporation, gelöst in DMF (5,0 ml), gefüllt. 6-Aminocapronsäure (0,131 g, 1 äq) wird zugefügt und die resultierende Lösung wird über Nacht bei Raumtemperatur unter Stickstoff gerührt. Nach 18 Stunden wird Dicyclohexylcarbodiimid (DCCI 0,206 g, 1,1 äq) und nachfolgend N-Hydroxysuccinimid (0,115 g, 1 äq) zugefügt. Die Reaktionslösung wird weitere 8 Stunden bei Raumtemperatur unter Stickstoff gerührt. Ausgefallener Dicyclohexylharnstoff (DCU) wird durch Filtration entfernt, und die resultierende DMF-Lösung unter reduziertem Druck eingedampft. Der resultierende Feststoff wird durch Silicagelchromatographie (5% Methanol in Chloroform) gereinigt und ergibt Verbindung 13 in 50%iger Ausbeute. Diese Verbindung wird mit Aminocapronsäure auf eine Weise behandelt, die identisch mit dem Verfahren in den Beispielen 2, 3 und 4 dieser Anmeldung ist, was Verbindungen mit n bis hin zu zehn und R = Phenyl ergibt.

Beispiel 9

Konjugation von monoklonalem Anti-Alpha-Fetoprotein-IaG mit alkalischer intestinaler Kälber-Phosphatase unter Verwendung von Verbindung 3

Derivatisierung des Enzyms

Eine Lösung von alkalischer intestinaler Kälber- Phosphatase (250 ul, 10 mg/ml, Boehringer Mannheim) wird in ein Gefäß gefüllt. Eine Lösung von Verbindung 3 in DMF (100 ul, 5,0 mM) wird zugefügt, und die resultierende Mischung wird auf einem Rotationsschüttler dreißig Minuten lang bei Raumtemperatur gerührt. Die rohe Reaktionsmischung wird durch Chromatographie an einer zuvor eingestellten Trennsäule Sephadex® G-25 (grob) mit einem Phosphatpuffer von pH 7,0 (0,1 M Phosphat, 0,1 M NaCl, 1 mM MgCl&sub2;, 0,1 mM ZnCl&sub2;) als Laufmittel gereinigt. Fraktionen aus der Trennsäule werden gesammelt, enzymhaltige Fraktionen werden vereinigt, und die Protein-Konzentration der vereinigten Fraktionen wird durch Extinktionsmessung bei 280 nm bestimmt. Nach unserer Erfahrung war die Absorption bei 280 nm näherungsweise gleich der Proteinkonzentration in mg/ml.

b) Antikörperderivatisierung

Eine monoklonale Anti-AFP-IgG-Lösung mit 6,4 mg/ml wird inkubiert und auf einem Rotationsschüttler bei Raumtemperatur mit DTT (Dithiothreotol, 25 mM Konzentration in der Endreaktionslösung) zwanzig Minuten lang gerührt. Die Lösung aus teilweise reduzierten Antikörpern wird dann mittels Chromatographie an einer zuvor eingestellten Trennsäule Sephadex® G-25 (grob) mit einem Phosphatpuffer von pH 7,0 (0,1 M Phosphat, 0,1 M NaCl, 1 mM MgCl&sub2;, 5 mM ERDTA) als Laufmittel gereinigt.
Fraktionen von der Trennsäule werden gesammelt, proteinhaltige Fraktionen werden vereinigt, und die Proteinkonzentration der vereinigten Fraktionen wird durch Extinktionsmessung bei 280 nm bestimmt. In diesem Beispiel ist die Extinktion bei 280 nm geteilt durch einen Faktor von 1,39 näherungsweise gleich der Antikörperkonzentration in mg/ml.

c) Konjugation von partiell reduziertem Antikörper mit derivatisierter alkalischer Phosphatase

Die derivatisierte alkalische Phosphatase aus Teil a) wird mit dem partiell reduzierten Antikörper aus Teil b) in einem molaren Verhältnis von 1,5 : 1 Enzym zu Antikörper zusammengebracht. Die Mischung wird über Nacht bei 2-8ºC auf einem Rotationsschüttler gerührt. Am darauffolgenden Morgen werden nicht umgesetzte Thiolgruppen durch Behandlung mit einer N-Ethylmaleinimid(NEM)-Lösung (100 ul, 5,0 mM) für eine Dauer von einer Stunde bei Raumtemperatur geschützt. Das dabei erhaltene Konjugatkonzentrat kann, wie gewünscht, zur Verwendung in einem Sandwichassay oder jedem anderen Assay, in dem ein markierter Antikörper benötigt wird, verdünnt werden. (Formel IV, B = alkalische intestinale Kälber-Phophatase, R = Cyclohexylmethyl, X = 6-Aminocapronyl n = 3, Q = monoklonales Anti-AFP-IgG, und r ist gleich eins bis fünf).

Beispiel 10

Konjugation von β-Galactosidase an Ziegen-Anti-Hasen-IaG unter Verwendung von Verbindung 1, 2 oder 3

a) Antikörperderivatisierung mit Verbindung 1

Ziegen-Anti-Hasen-IgG (1,0 mg) wird in einem Phosphatpuffer mit pH 7,0 (1,0 ml, 15 mM Phosphat, 150 mM NaCl, 1,0 mM EDTA) suspendiert. Ein Aliquot dieser Lösung (425 ul) wird dann zu einer Lösung von Verbindung 1 in DMF (12,75 ul, 6,0 mM) zugefügt. Die Verbindung wird im Dunkeln sechzig Minuten lang bei Raumtemperatur und gelegentlichem Umrühren inkubiert. Die Rohreaktionsmischung wird anschließend über Nacht im Dunkeln bei 4ºC gegen einen Phosphatpuffer von pH 7,0 (2,0 1, 15 mM Phosphat, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA) dialysiert. Das dialysierte Material wird durch Zentrifugation wiedererhalten, und die Antikörperkonzentration wird durch Messen der Extinktion bei 280 nm bestimmt. Nach unserer Erfahrung ist A&sub2;&sub8;&sub0; dividiert durch den Faktor 1,38 näherungsweise gleich der Antikörperkonzentration in mg/ml.

b) Konjugation des derivatisierten Antikörpers mit nativer β-Galactosidase

Der derivatisierte Antikörper aus Teil a) und native E. Coli-β-Galactosidase (25 mg/ml in Phosphatpuffer von pH 7,0) werden in einem Molverhältnis von 0,6 : 1 Enzym zu Antikörper zusammengebracht. Die Mischung wird über Nacht bei Raumtemperatur ohne Rühren umgesetzt und es ergibt sich eine konzentrierte Konjugatlösung für die Verwendung in einem Immunoassay. (Formel IV: B = Ziegen-anti-Hasen-IgG, R = Cyclohexylmethyl, X = 6-Aminocapronyl, n = 1, Q = β-Galactosidase und r = eins bis fünf).

c) Antikörperderivatisierung mit Verbindung 2

Ziegen-Anti-Hasen-IgG (1,0 mg) wird in einem Phosphatpuffer von pH 7,0 (1,0 ml, 15 mM Phosphat, 150 mM NaCl, 1,0 mM EDTA) suspendiert. Ein Aliquot dieser Lösung (425 ul) wird dann zu einer Lösung von Verbindung 2 in DMF (12,75 ul, 6,0 mM) zugefügt. Die Mischung wird im Dunkeln sechzig Minuten lang bei Raumtemperatur und gelegentlichem Umrühren inkubiert. Die Rohreaktionsmischung wird anschließend über Nacht im Dunkeln bei 4ºC gegen einen Phosphatpuffer von pH 7,0 (2,0 l, 15 mM Phosphat, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA) dialysiert. Das dialysierte Material wird durch Zentrifugation wiedererhalten, und die Antikörperkonzentration wird durch Messen der Extinktion bei 280 nm bestimmt. Nach unserer Erfahrung ist A&sub2;&sub8;&sub0; dividiert durch den Faktor 1,38 näherungsweise gleich der Antikörperkonzentration in mg/ml.
Antikörper, der mit Verbindung 2 derivatisiert worden ist, kann an native β-Galactosidase wie in Teil b) oben beschrieben gekuppelt werden. (Formel IV: B = Ziegen-Anti- Hasen-IgG, R = Cyclohexylmethyl, X = 6-Aminocapronyl, n = 2, Q = β- Galactosidase und r = eins bis fünf).

d) Antikörperderivatisierung mit Verbindung 3

Ziegen-Anti-Hasen-IgG (1,0 mg) wird in einem Phosphatpuffer von pH 7,0 (1,0 ml, 15 mM Phosphat, 150 mM NaCl, 1,0 mM EDTA) suspendiert. Ein Aliquot dieser Lösung (425 ul) wird dann zu einer Lösung von Verbindung 3 in DMF (12,75 ul, 6,0 mM) zugefügt. Die Mischung wird im Dunkeln sechzig Minuten lang bei Raumtemperatur unter gelegentlichem Umrühren inkubiert. Die Rohreaktionsmischung wird anschließend über Nacht im Dunkeln bei 4ºC gegen einen Phosphatpuffer von pH 7,0 (2,0 l, 15 mM Phosphat, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA) dialysiert. Das dialysierte Material wird durch Zentrifugation wiedergewonnen, und die Antikörperkonzentration wird durch Messen der Extinktion bei 280 nm bestimmt. Nach unserer Erfahrung ist A&sub2;&sub8;&sub0; dividiert durch den Faktor 1,38 näherungsweise gleich der Antikörperkonzentration in mg/ml.
Antikörper, der mit Verbindung 3 derivatisiert worden ist, kann an native β-Galactosidase, wie in Teil b) oben beschrieben, gekuppelt werden. (Formel IV: B = Ziegen-Anti- Hasen-IgG, R = Cyclohexylmethyl, X = 6-Aminocapronyl, n = 3, Q = β- Galactosidase und r = eins bis fünf).

Beispiel 11

Darstellung von polyklonalem Anti-TSH (Thyroid-stimulierendes Hormon)-alkalische Phosphatase-Konjugat unter Verwendung von Verbindung 1

a) Derivatisierung des Enzyms

Alkalische intestinale Kälber-Phosphatase (25 ul, 10 mg/ml) wird mit einer Lösung von Verbindung 1 in DMF (10 ul, 7,8 mM) zusammengebracht und dreißig Minuten lang bei Raumtemperatur umgesetzt. Die Rohreaktionsmischung wird durch Durchwandern einer Minigelfiltrationssäule (G-25 Sephadex®) während der Zentrifugation gereinigt, wobei die Trennsäule mit 0,05 M Phopsphatpuffer von pH 7,0 eingestellt war. Eine gereinigte Lösung eines mit Bindegruppe derivatisierten Enzyms wird erhalten.

b) Antikörperderivatisierung

Eine polyklonale Anti-TSH-IgG-Lösung (25 ul, 5,3 mg/ml) wird mit einer Lösung von DTT (25 ul, 0,1 M) in einem Phosphatpuffer von pH 7,0 (0,5 M Phosphat) gemischt. Die Mischung läßt man dreißig Minuten lang bei Raumtemperatur reagieren, anschließend wird sie in der gleichen Weise gereinigt wie das derivatisierte Enzym in Teil a).

c) Konjugation von Enzym und Antikörper

Die Produkte von den Teilen a) und b) werden zusammengebracht, über Nacht bei 2-8ºC inkubiert, und ein Konjugat von Anti-TSH mit alkalischer Phosphatase wird erhalten. Dieses Konjugat kann in Sandwichassays für TSH eingesetzt werden. (Formel IV: B = alkalische Phosphatase, R = Cyclohexylmethyl, X = 6-Aminocapronyl, n = 1, Q = polyklonales Anti-TSH-IgG und r = eins bis fünf).

Beispiel 12

Konjugation von Meerrettich-Peroxidase an Fab'-Anti-Hepatitis-B-Kernantikörper unter Verwendung von Verbindung 3

Derivatisierung des Enzyms

Eine Meerrettich-Peroxidaselösung (400 ul, 10 mg/ml) in einem Phosphatpuffer von pH 7,0 (0,1 M Phosphat, 0,1 M NaCl) wird zu einer Lösung von Verbindung 3 (3,3 mg) in DMF (236 ul) hinzugefügt. Die Mischung wird 30 Minuten lang bei Raumtemperatur gerührt, anschließend an einer Trennsäule Sephadex® G-25 (grob) mit Hilfe des oben beschriebenen Puffers entsalzt. Die Fraktionen werden gesammelt, enzymhaltige Fraktionen vereinigt und die Konzentration des vereinigten Enzyms durch Messung der Absorption bei 280 nm bestimmt. Nach unserer Erfahrung ist A&sub2;&sub8;&sub0; dividiert durch den Faktor 0,61 näherungsweise gleich der Enzymkonzentration in mg/ml.

Derivatisierung des Antikörpers

Eine Lösung von Fab'-Anti-Hepatitis-B-Kern-IgG- Fragment (3,1 ml, 3,2 mg/ml) wird in ein Gefäß eingetragen. Phosphatpuffer (pH 7,0, 0,5 M Phosphat, 0,5 M NaCl, 25 mM EDTA) wird zugefügt. DTT (23,1 mg) wird anschließend zugefügt und die Mischung wird bei Raumtemperatur zwanzig Minuten lang unter Rühren inkubiert.
Das Rohprodukt wird anschließend auf eine Trennsäule Sephadex® G-25 (grob) aufgegeben und mit dem oben beschriebenen Phosphatpuffer von pH 7,0 eluiert.
Die Fraktionen werden gesammelt, proteinhaltige Fraktionen werden vereinigt und die Konzentration der vereinigten Fraktionen werden durch Messung der Extinktion bei 280 nm bestimmt. Nach unserer Erfahrung ist A&sub2;&sub8;&sub0; dividiert durch den Faktor 1,38 näherungsweise gleich der Antikörperfragmentkonzentration in mg/ml.

Konjugation von derivatisierter alkalischer Phosphatase an Antikörperfragment

Derivatisiertes Enzym aus Teil a) wird mit Antikörperfragment aus Teil b) in einem 1 : 1 Enzym zu Antikörper Verhältnis zusammengebracht. Die Mischung wird über Nacht auf einem Rotationsschüttler bei 2-8ºC inkubiert. Am darauffolgenden Morgen wird die Rohkonjugatmischung über eine Con-A-Sepharose-Trennsäule geleitet. Unkonjugierte Antikörperfragmente werden ausgewaschen, und anschließend wird das Konjugat mit einer 0,1 M Alpha-Methylglucosidlösung eluiert. Wiedergewonnenes Konjugat wird gegen einen Puffer dialysiert und für die Verwendung in einem Sandwichassay für Hepatitis-B-Virusteilchen verdünnt. (Formel IV: B = alkalische Phosphatase, R = Cyclohexylmethyl, X = 6-Aminocapronyl, n = 3, Q = Fab'Anti-Hepatitis-B-Kernantikörper und r = eins bis fünf).

Beispiel 13

Konjugation von alkalischer intestinaler Kälber-Phosphatase an Rindergammaglobulin spezifisch für E. Coli-Zellwandantiaene unter Verwendung von Verbindung 2

a) Enzymderivatisierung mit Iminothiolan

Zu einer Lösung von alkalischer intestinaler Kälber- Phosphatase (2,0 ml, 12,3 mg/ml) in Tris-Puffer von pH 8,0 (0,05 M Triethanolamin (Tris), 10 mM MgCl&sub2;, 0,1 mM ZnCl&sub2;) wird Iminothiolan-HCl so zugefügt, daß die Endkonzentration an Iminothiolan in der Reaktionsmischung 4,0 mM beträgt. Die Reaktionsmischung wird eine Stunde lang bei 4ºC gerührt. Glycinamid wird dann im Überschuß zugefügt, um nicht umgesetztes Iminothiolan zu entfernen. Die Rohreaktionsmischung wird auf eine Trennsäule TSK 40 aufgegeben und mit dem oben beschriebenen Tris-Puffer von pH 8,0 eluiert. Die Fraktionen von der Säule werden gesammelt, enzymhaltige Fraktionen vereinigt und die Proteinkonzentration der vereinten Fraktionen durch Messung der Extinktion bei 280 nm bestimmt. Nach unserer Erfahrung ist A&sub2;&sub8;&sub0; dividiert durch den Faktor 0,76 näherungsweise gleich der Enzymkonzentration in mg/ml.

Antikörperderivatisierung mit Verbindung 2

Eine Lösung von Rindergammaglobulin (2,0 ml, 8,4 mg/ml gerichtet gegen Zellwandantigene von E. Coli) in einem Tris- Puffer von pH 8,0 (0,5 M Tris, 0,16 M NaCl, 1,0 mM MgCl&sub2;, 0,1 mM ZnCl&sub2;) wird mit einer Lösung von Verbindung 2 (3,36 mg), gelöst in DMF (859 ul), behandelt und eine Stunde lang bei 4ºC inkubiert und dabei gerührt.
Die Rohreaktionsmischung wird auf eine Trennsäule TSK 40 aufgegeben und mit dem oben beschriebenen Tris-Puffer von pH 8,0 eluiert.
Die Fraktionen von der Säule werden gesammelt, proteinhaltige Fraktionen vereinigt und die Proteinkonzentration der vereinten Fraktionen durch Messung der Extinktion bei 280 nm bestimmt. Nach unserer Erfahrung ist A&sub2;&sub8;&sub0; dividiert durch den Faktor 1,40 näherungsweise gleich der Enzymkonzentration in mg/ml.

Konjugation von Enzym und Antikörper

Derivatisiertes Enzym aus Teil a) wird mit derivatisiertem Antikörper aus Teil b) in einem 1,1 : 1 Enzym zu Antikörper-Verhältnis zusammengebracht und über Nacht bei 4ºC gerührt. Am darauffolgenden Morgen wird die Rohreaktionsmischung zu einem gleichen Volumen Tris-Puffer von pH 8,0 (0,05 M Tris, 1,0 mM MgCl&sub2;, 0,1 mM ZnCl&sub2;, 0,16 M NaCl, 2% Rinderserumalbumin (BSA), 0,2% Natriumazid) zugefügt. β-Mercaptoethanol (10 ul) wird anschließend zugefügt und das Rohkonjugatkonzentrat wird in dieser Form aufbewahrt, bis es verwendet wird. Eine 1 : 1000-Verdünnung dieses Konjugatkonzentrates mit einem geeigneten Verdünnungsmittel ergibt eine Lösung mit etwa 0,5 ug/ml Konjugat, die in einem Assay vom Sandwichtyp für unterschiedliche Mikroorganismen verwendet werden kann. (Formel IV: B = Rindergammaglobulin, n = 2, Q = alkalische intestinale Kälber-Phosphatase und r ist gleich eins bis fünf).

Beispiel 14

Konjugation von monoklonalem Anti-Carcinoembryonalem Antigen-(CEA)-IgG an alkalische intestinale Kälber-Phosphatase unter Verwendung von Verbindung 3

a) Enzymderivatisierung

Eine Lösung von alkalischer intestinaler Kälber- Phosphatase (500 ul, 10,7 mg/ml) wird mit einer Lösung von Verbindung 3 in trockenem DMF (200 ul, 5,0 mM) gemischt und bei Raumtemperatur 30 Minuten lang gerührt. Die Rohreaktionsmischung wird anschließend auf eine zuvor eingestellte Trennsäule Sephadex® G-25 aufgebracht und mit einem Phosphatpuffer von pH 7,0 (0,1 M Phosphat, 0,1 M NaCl, 1 mM MgCl&sub2;&sub1; 0,1 mM ZnCl&sub2;) eluiert.
Die Fraktionen von der Säule werden gesammelt, enzymhaltige Fraktionen vereinigt und die Enzymkonzentration der vereinigten Fraktion werden durch Messung der Extinktion bei 280 nm bestimmt. Nach unserer Erfahrung ist die Extinktion bei 280 nm näherungsweise gleich der Proteinkonzentration in mg/ml.

b) Antikörperderivatisierung

Eine Lösung von monoklonalem Anti-CEA-IgG (315 ul, 9,5 mg/ml) wird mit 500 Moläquivalenten einer Lösung von Iminothiolanhydrochlorid in einem Phosphatpuffer von pH 8,0 (0,033 mg/ml Iminothiolan, 0,1 M Phosphat, 0,1 M NaCl, 5 mM EDTA) behandelt. Die Reaktionsmischung wird bei Raumtemperatur 30 Minuten lang gerührt, anschließend auf eine zuvor eingestellte Trennsäule Sephadex® G-25 aufgebracht und mit dem oben beschriebenen Phosphatpuffer von pH 8,0 eluiert.
Die Fraktionen von der Säule werden gesammelt, antikörperhaltige Fraktionen werden vereinigt und die Proteinkonzentration der vereinigten Antikörper durch Messung der Extinktion bei 280 nm bestimmt. Nach unserer Erfahrung ist A&sub2;&sub8;&sub0; dividiert durch den Faktor 1,39 näherungsweise gleich der Antikörperkonzentration in mg/ml.

Konjugation von Enzym und Antikörper

Derivatisiertes Enzym aus Teil )a und derivatisierter Antikörper aus Teil b) werden in einem Molverhältnis von 1 : 1 zusammengebracht und über Nacht bei 2-8ºC gerührt. Am darauffolgenden Morgen wird das Konjugat auf eine Konzentration von etwa 1 ug/ml mit einem geeigneten Verdünnungsmittel verdünnt und direkt in einem Assay vom Sandwichtyp für carcinoembryonales Antigen (CEA) verwendet. (Formel IV: B = alkalische intestinale Kälber-Phosphatase, R = Cyclohexylmethyl, X = 6-Aminocapronyl, n = 3, Q = monoklonales Anti-CEA-IgG und r ist gleich eins bis fünf).

Beispiel 15

Immunogensynthese

a) Funktionalisierung von BSA mit Verbindung 1

BSA (50,0 mg) wird in 5,0 ml Phosphatpuffer von pH 6,6 (0,1 M Phosphat) gelöst. Zu dieser Lösung wird eine Lösung von Verbindung 1 (5,0 mg) in DMF (500 ul) zugefügt. Die Reaktionsmischung wird über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Am darauffolgenden Morgen wird die Rohreaktionsmischung auf eine Trennsäule Sephadex® G-25 aufgebracht und mit Wasser eluiert.
Die Fraktionen von der Säule werden gesammelt, proteinhaltige Fraktionen vereinigt und gefriergetrocknet und ergeben 56 mg derivatisiertes BSA. Die Titration der Maleinimidgruppen zeigt den Einbau von etwa neun Maleinimidgruppen je BSA an.

b) Synthese des Immunogens

Ein synthetisches Peptid (10 mg) (MG 3300), korrespondierend zu Aminosäuren 38 bis 71 der Beta- Untereinheit von Thyreotropin (TSH), wird in einer Mischung aus DMF (1,0 ml) und Phosphatpuffer von pH 6,6 (1,0 ml, 0,1 M Phosphat) gelöst. Dieser Stoff zeigt die Gegenwart einer Sulfhydrylgruppe je Peptid an, wie durch Titration mit Ellmans-Reagens bestimmt.
Zu der Lösung von β-TSH-Peptid wurde modifiziertes BSA (1,5 mg) von Teil a) zugefügt. Die Lösung wird über Nacht bei Raumtemperatur in einem geschlossenen Gefäß gerührt. Die Reinigung der Rohreaktionsmischung durch Chromatographie an einer Trennsäule Sephadex® G-25 mit Wasser als Eluent und die nachfolgende Gefriertrocknung des wiedergewonnenen Konjugats liefern 18 mg des Stoffs, der nach Analyse die Einlagerung von vier β-TSH-Peptiden je BSA zeigte. (Formel V: W = BSA, R = Cyclohexylmethyl, X = 6-Aminocapronyl, n = 1, Q = TSH- Untereinheit-Peptid und r = 4).

Beispiel 16

Darstellung von mit monoklonalem Anti-CA-125-IgG-derivatisierten Mikroartikeln unter Verwendung einer 30-atomigen verbindenden Gruppe

a) Vorbehandlung der Aminmikropartikel

Aminmikropartikel (Seradyn® 0,164 um, 2,5% Festphasenanteil, 1 ml) werden mit 0,5 g Biorex®-Ionenaustauscher harz (Biorex® MSZ501D, 297-841, im Durchmesser (20-50 Maschen), Katalog #142-7425) vermischt. Die Mischung wird eine Stunde lang bei Raumtemperatur Kopf über Kopf rotiert, und dann durch eine grobe Glasfritte unter Waschen vakuumfiltriert. Das Filtrat wird gesammelt und 30 Minuten lang bei 15 000 U/min zentrifugiert. Der überstand wird verworfen und der Mikropartikelkuchen wird in destilliertem Wasser unter Verwirbelung resuspendiert und durch Zugabe von destilliertem Wasser auf 2,5% Festphasenanteil eingestellt.

b) Derivatisierung der Partikel

Die resuspendierten, vorbehandelten Partikel aus Teil a) mit 2,5% Feststoffanteil in der Lösung werden mit dem gleichen Volumen einer Lösung von Verbindung 3 (Beispiel 3, 2 mg/ml in DMF) gemischt und bei Raumtemperatur eine Stunde lang Rotation Kopf über Kopf umgesetzt. Die Reaktionsmischung wird anschließend mit phosphatgepufferter Salzlösung "PBS" (pH 7,2) zehnfach verdünnt und bei 15 000 U/min 30 Minuten lang zentrifugiert. Der resultierende Überstand wird verworfen und der Mikropartikelkuchen in phosphatgepufferter Salzlösung resuspendiert. Die Sequenz Zentrifugation-Suspension wird zweimal wiederholt, die Lösung wird wieder zentrifugiert, der Überstand wird verworfen, und der Kuchen wird in Tris-Puffer (0,05 M Tris, 0,1 M NaCl, pH 8,0) suspendiert und die Lösung auf einen Festphasenanteil von 2,5% eingestellt.

c) Darstellung des Antikörpers

Eine Lösung von monoklonalem Anti-CA-125-IgG (7,4 mg/ml in phosphatgepufferter Salzlösung) wird mit DTT (Dithiothreitol, 25 mM in der Endreaktionsmischung) zwanzig Minuten lang bei Raumtemperatur unter Rühren auf einem Rotationsrührapparat inkubiert. Die Lösung von teilweise reduziertem Antikörper wird anschließend durch Chromatographie an einer zuvor eingestellten Trennsäule Sephadex® G-25 (grob) mit einem Phosphatpuffer von pH 7,0 (0,1 M Phosphat, 0,1 M NaCl, 5 mM EDTA) als Laufmittel entsalzt. Die Fraktionen werden gesammelt, proteinhaltige Fraktionen werden vereinigt und die Proteinkonzentration der vereinigten Lösung durch Messung der Extinktion bei 280 nm bestimmt.

d) Umsetzung von Maleinimid-derivatisierten Mikropartikeln mit teilweise reduziertem IaG

Der teilweise reduzierte Antikörper aus Teil c) (1 ml, 1 mg/ml) wird mit den Maleinimid-derivatisierten Mikropartikeln aus Teil b) (1 ml, 2,5% Festphasenanteil) zusammengebracht. Die Mischung wird bei Raumtemperatur über Nacht Kopf über Kopf rotiert. Am darauffolgenden Morgen wird die Reaktionsmischung zehnfach mit Waschpuffer (0,01 M Phosphat, pH 7,2, 1% Tween®) verdünnt, dann bei 15 000 U/min 30 Minuten lang zentrifugiert. Der resultierende Überstand wird verworfen, der Mikropartikelkuchen wird zweimal gewaschen (Verwirbelung in 1 ml Waschpuffer, zehnfache Verdünnung mit Waschpuffer, anschließend 30 Minuten lang Zentrifugation bei 15 000 U/min mit nachfolgendem Verwerfen des Überstands). Der gewaschene Kuchen wird auf eine Endkonzentration von 0,125% Festphasenmaterial in einem Aufbewahrungspuffer (0,01 M Tris, pH 8,1, 0,1 M NaCl, 0,1% Natriumazid, 13,6% Saccharose) suspendiert. Die endgültige Mikropartikelsuspension wird erst durch eine 23er, dann durch eine 25er Eichnadel getrieben. Das resultierende Mikropartikelkonjugat besteht aus dem Anti-CA-125-IgG-Antikörper, der an den Mikropartikel mittels der 30-atomigen verbindenden Gruppe aus Beispiel 3 konjugiert ist.
Die Mikropartikel in Aufbewahrungspuffer werden für späteren Gebrauch aufbewahrt, bis sie in einem Immunoassay für den Nachweis von CA-125-Antigen verwendet werden.

Beispiel 17

Darstellung von mit monoklonalen Anti-CA-125-IgG-derivatisierten Mikropartikeln unter Verwendung einer 23-atomigen verbindenden Gruppe

Das Verfahren aus Beispiel 16 wird mit der 23-atomigen verbindenden Gruppe (Verbindung 2) aus Beispiel 2 anstelle der 30-atomigen Gruppe aus Beispiel 16 wiederholt.

Beispiel 18

Darstellung von mit monoklonalem Anti-CA-125-IgG-derivatisierten Mikropartikeln unter Verwendung einer 16-atomigen verbindenden Gruppe

Das Verfahren aus Beispiel 16 wird mit der 16-atomigen verbindenden Gruppe (Verbindung 1) aus Beispiel 1 anstelle der 30-atomigen verbindenden Gruppe aus Beispiel 16 wiederholt.

Beispiel 19

Darstellung von mit polyklonalem Anti-CA-125-IgG-derivatisierten Mikropartikeln unter Verwendung einer 30-atomigen verbindenden Gruppe

Das Verfahren aus Beispiel 16 wird mit einem polyklonalem Anti-CA-125-IgG-Antikörper anstelle des monoklonalen Antikörpers aus Beispiel 16 wiederholt. Polyklonaler Anti-CA-125-Antikörper wurde durch subkutane und intramuskuläre Immunisierung von Schafen mit 50 000 Einheiten CA-125-Antigen in Freundschem Adjuvans erhalten. Die nachfolgenden Auffrischungen wurden alle zwei Wochen mit 50 000 Einheiten CA-125-Antigen in unvollständigem Freundschem Adjuvans ausgeführt.

Beispiel 20

Darstellung von mit monoklonalem Anti-PAP-IgG-derivatisierten Mikropartikeln unter Verwendung einer 30-atomigen verbindenden Gruppe

a) Darstellung von reduziertem Anti-PAP-Antikörper

Dithiothreitol (DTT. 1,93 mg) wird in ein Reaktionsgefäß gegeben. Monoklonaler Maus-Anti-PAP- Antikörper (0,5 ml, 6,98 mg/ml) wird anschließend zugefügt und die Verbindung wird 20 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert. Die Reaktionsmischung wird dann auf eine zuvor eingestellte Trennsäule Sephadex®-G-25 (grob 1 · 20 cm) aufgebracht und mit Phosphatpuffer mit pH 7,2 (0,2 M Phosphat, 0,1 M NaCl, 5,0 mM EDTA) eluiert. Die Fraktionen werden gesammelt und die Extinktion bei 280 nm gemessen. Proteinhaltige Fraktionen werden vereinigt, die vereinigten Fraktionen werden zehnfach mit Chromatographiepuffer verdünnt und die Proteinkonzentration der resultierenden Vereinigung aktivierter Antikörper durch Messung der Extinktion bei 280 nm bestimmt.

b) Umsetzung von derivatisierten Mikropartikeln mit reduziertem Anti-PAP-Antikörper

Reduzierter Antikörper aus Teil a) (0,5 mg (z. B. 336 ul, bei 1,49 mg/ml)) wird in ein Reaktionsgefäß gegeben. Derivatisierte Mikropartikellösung (0,5 ml) aus Beispiel 16, Teil b), wird anschließend hinzugefügt und die Reaktionsmischung wird über Nacht bei Raumtemperatur auf einem Rotationsschüttler inkubiert. Am darauffolgenden Morgen wird die Reaktionsmischung zentrifugiert (20 Minuten bei 12 000 U/min), der Überstand wird verworfen und die Extinktion bei 280 nm gemessen. Die mit Antikörper derivatisierten Mikropartikel werden anschließend in PBS-Tween®-Puffer (0,1 g Tween® in 100 ml PBS, 1,0 ml) resuspendiert. Die Mischung wird wieder zentrifugiert (20 Minuten bei 12 000 U/min), der Überstand wird verworfen, und 5,0 ml Aufbewahrungspuffer (0,05 M Tris, 0,1 M NaCl, 0,1% Natriumazid, 13,6% Saccharose, pH 8,1) werden anschließend zugefügt. Die Mikropartikel werden erst durch eine 23er Eichnadel, dann durch eine 25er Eichnadel getrieben. Die resultierende Mikropartikelsuspension wird anschließend in ein 10 ml-Gefäß mit Plastikschraubdeckel zur Aufbewahrung bis zur Verwendung in einem Enzymimmunoassay für den Nachweis von PAP-Antigen überführt.

Beispiel 21

Kovalente Anlagerung von B-12-Intrinsischem-Faktor an aminierte Polystyrolmikropartikel

100 ul einer 10%igen Lösung von aminierten Polystyrolmikropartikel (0,164 um, erworben von Seradyn) werden in ein Reaktionsgefäß gegeben. Eine Lösung von Verbindung 2 in DMF (9 ul, 1,21 mM) wird mit einer von Lösung B-12-Intrinsischem-Faktor (210 ul, 0,1537 mg/ml) zugefügt. Die Reaktionsmischung wird über Nacht bei Raumtemperatur Kopf über Kopf rotiert. Am darauffolgenden Morgen wird die Reaktionsmischung zentrifugiert (30 Minuten, 13 000 U/min). Der Überstand wird verworfen, der verbleibende Feststoff wird in destilliertem Wasser resuspendiert, und der Zentrifugations-Suspensions-Schritt wird wiederholt.
Die Partikel werden anschließend in 750 ul Aufbewahrungspuffer suspendiert und in einem Assay für den Nachweis von B-12 verwendet. Das sich ergebende Produkt ist ein B-12-Intrinsischer-Faktor/Mikropartikel-Konjugat, das mittels einer 23-atomigen verbindenden Gruppe aus Beispiel 2 geknüpft ist.

Beispiel 22

Kovalente Anlagerung von rekombiniertem Hepatitis-B-Kernantigen an aminierte Polystyrolmikropartikel unter Verwendung von Verbindung 3

a) Derivatisierung der Mikropartikel mit Verbindung 3

Aminomikropartikel (Polyscience, 0,5 um) werden in ein Reaktionsgefäß gegeben. Eine Lösung von Verbindung 3 (Beispiel 3) in DMF wird anschließend zugefügt und die Mischung wird wie in Beispiel 16, Teil b), beschrieben, behandelt.

b) Umsetzung von rekombinantem Kernantigen mit derivatisierten Mikropartikeln

Rekombinantes Hepatitis-B-Kernantigen wird in ein Gefäß gefüllt. Derivatisierte Mikropartikel (aus Teil a)) werden anschließend zugefügt und die Mischung wird behandelt wie in Beispiel 6, Teil d), beschrieben und ergibt Mikropartikel, die an das Antigen mittels einer 30-atomigen verbindenden Gruppe konjugiert sind und in Assays für den Nachweis von Hepatitis-B eingesetzt werden können.

Beispiel 23

Darstellung von E. coli-β-Galactosidase-derivatisierten Mikropartikeln mit einer 30-atomigen verbindenden Gruppe

E. Coli-β-Galactosidase (1 ml, 1 mg/ml) in phosphatgepufferter Salzlösung von pH 7,0 (0,1 M Phosphat, 0,1 M NaCl) wird zu Maleinimid-derivatisierten Mikropartikeln aus Beispiel 16, Teil b), zugefügt. Die Reaktionsmischung wird über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Am darauffolgenden Morgen wird die Reaktionsmischung bei 15 000 U/min 30 Minuten lang zentrifugiert. Der resultierende überstand wird verworfen, und der Mikropartikelkuchen in phosphatgepufferter Salzlösung von pH 7,0 (0,1 M Phosphat, 0,1 M NaCl) unter Einstellung von 2,5% Festphasenanteil resuspendiert. Die Sequenz Zentrifugation, Dekantieren, Suspension wird zweimal wiederholt. Der Mikropartikelkuchen wird zuletzt in einem Aufbewahrungspuffer (0,1 M Tris, pH 7,0, 0,1 M NaCl, 0,1% Natriumazid, 13,6% Saccharose) suspendiert. Die resultierende Mikropartikelsuspension wird erst durch eine 23er, dann durch eine 25er Meßnadel getrieben. Die über eine 30-atomige verbindende Gruppe Enzym-derivatisierten Mikropartikel in Aufbewahrungspuffer werden dann bis zur späteren Verwendung aufbewahrt.

Beispiel 24

Präparation von mit alkalischer intestinaler Kälber-Phosphatase derivatisierten Mikropartikeln unter Verwendung einer 30-atomigen verbindenden Gruppe

a) Thiolierung des Enzyms

Alkalische intestinale Kälber-Phosphatase (0,5 ml, 10 mg/ml) in Trispuffer von pH 8,0 (0,05 M Tris, 10 mM MgCl&sub2;, 0,1 mM ZnCl&sub2; ) wird in ein Reaktionsgefäß gegeben. Iminothiolanhydrochlorid wird anschließend bis zu einer Konzentration von 4,0 mM zugefügt. Die Mischung wird 30 Minuten lang bei Raumtemperatur gerührt, anschließend an einer Trennsäule Sephadex® G-25 (grob) mit phosphatgepufferter Salzlösung (0,1 M Phosphat, 0,1 M NaCl, 10 nM MgCl&sub2;, 0,1 M ZnCl&sub2;, pH 7,0) als Laufmittel entsalzt. Die Fraktionen werden aufgefangen, proteinhaltige Fraktionen vereinigt, und die Proteinkonzentration der vereinigten Lösungen von thioliertem Enzym wird durch Messung der Extinktion bei 280 nm bestimmt.

b) Umsetzung von thioliertem Enzym mit Maleinimid-derivatisierten Mikropartikeln

Thioliertes Enzym aus Teil a) (1 ml, 1 mg/ml) wird mit den Maleinimid-derivatisierten Mikropartikeln aus Beispiel 16, Teil b), zusammengebracht (1 ml, 2,5 Festphasenanteil). Die Reaktionsmischung wird über Nacht bei Raumtemperatur Kopf über Kopf rotiert, dann wie in Beispiel 16, Teil d) beschrieben, behandelt, und liefert eine Lösung von Mikropartikeln, die kovalent mit alkalischer intestinaler Kälber-Phosphatase derivatisiert sind.

Beispiel 25

Darstellung von mit monoklonalem Anti-CA-125-IgG-derivatisierten Mikropartikeln

a) Präparation von thiolierten Mikropartikeln

Resuspendierte, vorbehandelte Aminmikropartikel aus Beispiel 16, Teil a), (1 ml, 2,5% Festphasenanteil) werden mit Iminothiolan-HCl gemischt, bis zum Erhalt einer Endkonzentration an Iminothiolan von 50 mM. Die Reaktionsmischung wird bei Raumtemperatur eine Stunde lang gerührt, anschließend behandelt wie in Beispiel 16, Teil b), beschrieben.

b) Derivatisierung des Antikörpers

Eine Lösung von monoklonalem Anti-CA-125-IgG (7,4 mg/ml) in phosphatgepufferter Salzlösung wird mit 30 Moläquivalenten einer DMF-Lösung von Verbindung 3 (5,0 mM) inkubiert. Die Reaktionsmischung wird 30 Minuten lang bei Raumtemperatur gerührt, dann an einer Trennsäule Sephadex® G-25 (grob) mit Phosphatpuffer von pH 7,0 (0,1 M Phosphat, 0,1 M NaCl) als Laufmittel entsalzt. Die Fraktionen werden gesammelt, proteinhaltige Fraktionen werden vereinigt, und die Proteinkonzentration der vereinigten Lösungen von thioliertem Enzym wird durch Messung der Extinktion bei 280 nm bestimmt.

c) Umsetzung von thiolierten Mikropartikeln mit Maleinimid-derivatisierten Antikörpern

Thiolierte Mikropartikel aus Teil a) (1 ml, 2,5% Feststoffanteil) werden mit Maleinimid-derivatisierten Antikörpern aus Teil b) (1 ml, 1 mg/ml) gemischt. Die Reaktionsmischung wird über Nacht bei Raumtemperatur Kopf über Kopf rotiert. Am darauffolgenden Morgen werden die Antikörper-derivatisierten Mikropartikel wie in Beispiel 16, Teil d), beschrieben zur Darstellung eines Mikropartikel/IgG-Konjugates, das in einem Assay zum Nachweis von CA-125-Antigenen verwendet werden kann, behandelt.

Beispiel 26

Darstellung von mit monoklonalem Anti-CA-125-IgG-derivatisierten Nylonfasern

a) Vorbehandlung der Nylonfasern

Einfaserige Nylonangelschnur (Berkley, 15 cm, 0,9 kg Test) wird mit 3 N HCl (10 ml) 30 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert und geschüttelt. Die Faser wird dann zweimal mit 20 ml destilliertem Wasser gewaschen. Die gewaschene, teilweise hydrolisierte Faser wird zur späteren Verwendung in destilliertem Wasser aufbewahrt.

b) Maleinimid-Derivatisierung von teilweise hydrolysierter Nylonfaser

Ein 5 cm langes Stück teilweise hydrolisierter Nylonfaser aus Teil a) wird in 3 mm lange Stücke geschnitten. Die 3 mm langen Nylonstücke werden in ein Reaktionsgefäß zusammen mit einer DMF-Lösung von Verbindung 3 (1,0 ml, 5,0 mM) gegeben. Die Reaktionsmischung wird zwei Stunden lang heftig geschüttelt, dann durch eine grobe Glasfritte filtriert. Die Maleinimid-derivatisierten Nylonfasern werden mehrmals mit destilliertem Wasser gewaschen, dann bis zur späteren Verwendung in destilliertem Wasser aufbewahrt.

c) Umsetzung von Maleinimid-derivatisierten Nylonfasern mit teilweise reduziertem Anti-CA-125-IgG

Teilweise reduziertes monoklonales Anti-CA-125-IgG aus Beispiel 16, Teil c), (1 ml, 1 mg/ml) wird zu den Maleinimidderivatisierten Nylonfasern aus Teil b) zugefügt. Die Reaktionsmischung wird über Nacht bei Raumtemperatur unter Rotation inkubiert. Am darauffolgenden Morgen wird die Reaktionsverbindung durch eine grobe Glasfritte filtriert, und die Antikörper-derivatisierten Fasern werden mehrmals mit Waschpuffer (0,1 M Phosphat, 0,1 M NaCl, pH 7,0) gewaschen. Die resultierenden Fasern enthalten kovalent über eine 30-atomige verbindende Gruppe angelagertes monoklonales CA-125-IgG. Die resultierenden Fasern werden in einem Faseraufbewahrungspuffer (0,1 M Phosphat, 0,1 M NaCl, 1% BSA, 0,1% Natriumazid) für die Verwendung in einem Assay zum Nachweis von CA-125-Antigen aufbewahrt.

Beispiel 27

Darstellung von mit monoklonalem Anti-CA-125-IgG-derivatisierten Wollfasern

a) Teilweise Reduktion des Wollfadens

Der Wollfaden wird in 13 mm lange Stücke aufgeteilt. Ein Fadenstück wird anschließend in 1 ml 5 mM DTT-Lösung eingetaucht und das Ganze eine Stunde lang heftig geschüttelt. Die Reaktionsmischung wird dann durch eine grobe Glasfritte filtriert und fünfmal mit einem Puffer (pH 7,0, 0,1 M Phosphat, 0,1 M NaCl, 5 mM EDTA) gewaschen.

b) Umsetzung von Maleinimid-derivatisiertem Antikörper mit teilweise reduziertem Wollfaden

Teilweise reduzierter Wollfaden aus Teil a) wird in ein Reaktionsgefäß gegeben. Maleinimid-derivatisiertes monoklonales Anti-CA-125-IgG aus Beispiel 12, Teil b), (1 ml, 1 mg/ml) wird anschließend zugefügt, und die Verbindung wird über Nacht bei Raumtemperatur Kopf über Kopf rotiert. Am darauffolgenden Morgen wird die Reaktionsmischung durch eine grobe Glasfritte filtriert und mit Waschpuffer (0,1 M Phosphat, 0,1 M NaCl, pH 7,0) gewaschen. Die resultierende Faser enthält kovalent über eine 30-atomige verbindende Gruppe angelagertes monoklonales CA-125-IgG. Die resultierenden Fasern werden in einem Faseraufbewahrungspuffer (0,1 M Phosphat, 0,1 M NaCl, 1% BSA, 0,1% Natriumazid) für die Verwendung in einem Assay zum Nachweis von CA-125-Antigen aufbewahrt.

Claims

1. Ein heterobifunktionelles Reagens umfassend:

worin X eine Aminosäure mit drei bis zehn Kohlenstoffatomen in einer geraden Kette ist;

R entweder ein Alkyl mit einem bis sechs Kohlenstoffatomen, Cycloalkyl, Alkyl-cycloalkyl, worin das Alkyl eins bis sechs Kohlenstoffatome enthält, oder Phenyl ist; und

n gleich eins bis zehn ist.

2. Das Reagens nach Anspruch 1, worin R Cyclohexylmethyl ist.

3. Das Reagens nach Anspruch 1, worin n gleich zwei bis fünf ist.

4. Das Reagens nach Anspruch 1, worin n gleich drei ist.

5. Das Reagens nach Anspruch 1, worin (X)n ein Polyamid ist, das aus wiederholten 6-Aminocapronsäureeinheiten gebildet wird.

6. Ein Konjugat für die Verwendung in einem Diagnoseassay, umfassend

worin B ein Enzymmarkierer, ein Antikörper oder ein Antikörperfragment ist;

Q ein -SH oder thioltragendes Peptid, Polypeptid oder Protein, oder ein Peptid, Polypeptid oder Protein ist, das mit Sulfhydrylgruppen derivatisiert worden ist, vorausgesetzt daß, wenn B ein Antikörper oder Antikörperfragment ist, Q ein Enzymmarkierer ist, und daß, wenn B ein Enzymmarkierer ist, Q ein Antikörper oder Antikörperfragment ist;

X eine Aminosäure mit drei bis zehn Kohlenstoffatomen in einer geraden Kette ist;

R entweder ein Alkyl mit eins bis sechs Kohlenstoffatomen, Cycloalkyl, Alkyl-cycloalkyl, worin das Alkyl eins bis sechs Kohlenstoffatome enthält, oder Phenyl ist; und

n gleich eins bis zehn ist.

7. Das Konjugat nach Anspruch 6, worin n gleich zwei bis fünf ist.

8. Das Konjugat nach Anspruch 6, worin (X)n ein Polyamid ist, das aus wiederholten 6-Aminocapronsäureeinheiten gebildet wird.

9. Das Konjugat nach Anspruch 6, worin Q ein Enzym ist.

10. Ein Konjugat zur Verwendung für die Darstellung eines Immunogens, umfassend

R entweder ein Alkyl mit eins bis sechs Kohlenstoffatomen, Cycloalkyl, Alkyl-cycloalkyl, worin das Alkyl eins bis sechs Kohlenstoffatome enthält, oder Phenyl ist;

n gleich eins bis zehn ist;

Q ein Hapten, gewählt aus einem -SH oder thioltragenden Peptid, Polypeptid oder Protein, oder ein Peptid, Polypeptid oder Protein ist, das mit Sulfhydrylgruppen derivatisiert worden ist;

W eine Polyaminosäure ist; und

r gleich 1 bis 20 ist.

11. Ein Konjugat für die Verwendung in einem Diagnoseassay, umfassend

n gleich eins bis zehn ist;

B ein Enzym, Antikörper oder Antikörperfragment ist;

Q ein -SH oder thioltragendes Peptid, Polypeptid oder Protein, oder ein Peptid, Polypeptid oder Protein ist, das mit Sulfhydrylgruppen derivatisiert worden ist, vorausgesetzt, daß Q ein Antikörper oder Antikörperfragment ist, wenn B ein Enzym ist, und daß Q ein Enzym ist, wenn B ein Antikörper oder Antikörperfragment ist; und

r gleich zwei bis fünfzig ist.

12. Das Konjugat nach Anspruch 11, worin B ein Enzym ist.

13. Ein Festphasenkonjugat umfassed:

worin Z ein amintragendes Festphasenmaterial ist; X eine Aminosäure mit drei bis zehn Kohlenstoffatomen in einer geraden Kette ist; n gleich eins bis zehn ist und R entweder ein Alkyl mit eins bis sechs Kohlenstoffatomen, Cycloalkyl, Alkyl-cycloalkyl, worin das Alkyl eins bis sechs Kohlenstoffatome enthält, oder Phenyl ist.

14. Ein Festphasenkonjugat nach Anspruch 13, worin R Cyclohexylmethyl ist.

15. Ein Konjugat der Formel:

worin Q ein -SH oder thioltragendes Peptid, Polypeptid oder Protein ist, oder ein Peptid, Polypeptid oder Protein ist, das mit Sulfhydrylgruppen derivatisiert worden ist; Z ein amintragendes Festphasenmaterial ist; X eine Aminosäure mit drei bis zehn Kohlenstoffatomen in einer geraden Kette ist; n gleich eins bis zehn ist; und R entweder ein Alkyl mit eins bis sechs Kohlenstoffatomen, Cycloalkyl, Alkylcycloalkyl, worin das Alkyl eins bis sechs Kohlenstoffatome enthält, oder Phenyl ist.

16. Das Konjugat nach Anspruch 15, worin Z ein amintragendes Mikroteilchen ist.