DE69120700T2

DE69120700T2 - Polypeptidepaar

Info

Publication number: DE69120700T2
Application number: DE69120700T
Authority: DE
Inventors: John Krupey
Original assignee: Orion Yhtyma Oy
Current assignee: Orion Oyj
Priority date: 1990-03-12
Filing date: 1991-03-07
Publication date: 1996-11-07
Anticipated expiration: 2011-03-08
Also published as: JP3110480B2; EP0447133B1; EP0447133A3; EP0447133A2; JPH05322892A; DE69120700D1; US5019521A

Description

Es wurde ein Reagens zur optischen Analyse entwickelt, das sowohl ein erhöhtes Ausmaß optischer Markierung für die Empfindlichkeit als auch einen gesteigerten Bindungsgrad an Zielmoleküle verschafft. Das Agens besteht aus einem Paar von verbundenen Polypeptiden, d.h. einem ersten Polypeptid mit einer Molekülmasse von ≥ 2 und vorzugsweise ≥ 3,8 x 10&sup5; Dalton, am meisten bevorzugt von 5-10 x 10&sup5; Dalton, und einem zweiten Polypeptid mit einer Molekülmasse von ungefähr 2 x 10&sup4; bis 2 x 10&sup5; Dalton. Das größere Polypeptid ("Hauptpolypeptid") trägt die optische Markierung und ein Bindungsmolekül wie zum Beispiel Antikörper, Antigen, Avidin oder Biotin zur Bildung eines "Farbstoff-Polymer-Konjugates". Das zweite Polypeptid ("Verbesserungspeptid") bildet mit dem Farbstoff-Polymer-Konjugat einen Komplex und verbessert die Bindung dieser Moleküle und beschleunigt in einem anschliessenden Immunoassay die spezifische Bindung des Konjugates mit dem Liganden. Das entstehende Reagens kann als optisches Reagens in Analysesystemen verwendet werden, die die spezifische Bindung eines Bindungsmolekül mit seinem Zielmolekül umfassen.
Die zur Herstellung der Farbstoffpolymere verwendeten Hauptpolypeptide enthalten Lysin und Glutaminsäure in einem derartigen Molverhältnis, daß das Polypeptid netto eine positive Ladung aufweist. Vorzugsweise liegen das Lysin und die Glutaminsäure in dem Polypeptid in einem ungefähren Molverhältnis von 3-5:1 bzw. am meisten bevorzugt von 4:1 vor. Die freien Aminogruppen der Polypeptidhauptkette werden mit einem optischen Farbstoff markiert zur Bildung eines Farbstoffpolymers. Optisch aktive Farbstoffe, wie zum Beispiel Fluorescein, Rhodamin oder andere, im Stand der Technik bekannte optisch aktive Farbstoffe, die an ein Polypeptid gekoppelt werden können, können zur Markierung der Polypeptidhauptkette verwendet werden, die selbst an ein Bindungsmolekül, wie zum Beispiel Antikörper, Antigen, Avidin oder Biotin kovalent gebunden ist zur Bildung eines Farbstoff-Polymer-Konjugates.
Die Polypeptidhauptkette der vorliegenden Erfindung läßt sich mit dem Farbstoff in hohem Grad substituieren, wodurch das Analysesystem mit einer verbesserten Empfindlichkeit versehen wird. Zum Beispiel hat die Substitution mit Fluorescein zur Folge, daß die optische Markierung an ungefähr 60-70 % der freien Aminogruppen des Peptids gebunden wird. Die restlichen Aminogruppen stehen für die kovalente Verbindung mit dem Bindungsmolekül zur Verfügung. wegen der großen Menge von bereitgestellten Markierungsmolekülen wäre es sehr erwünscht, dieses Farbstoffpolymer als Reagens für Analysesysteme zu verwenden. Aus verschiedenen, nicht ganz verstandenen Gründen lagert sich der Bindungsmolekülteil des Farbstoffpolymers, falls überhaupt, leider nur sehr schlecht an Zielmoleküle an. Es wurde daher überraschenderweise festgestellt, daß die Bereitstellung eines dem Farbstoff-Polymer-Konjugat beigemengten oder damit komplexierten Verbesserungspeptids die Bindungsparameter des Farbstoffpolymers derartig verbessert, daß ein relativ unbrauchbares Reagens in hohem Maße für Immunoassays geeignet wird.
Das Verbesserungspeptid besteht aus einer Mischung von basischen und sauren Aminosäureresten und kann die gleiche Anzahl an positiven und negativen Ladungen oder netto eine negative Ladung aufweisen. Vorzugsweise weisen die basischen und sauren Aminosäuren entgegengesetzte stereochemische Konfigurationen auf (d.h. D- und L-Aminosäuren). In einem anderen Fall kann das Verbesserungspeptid aus einer Mischung von Homopolymeren einer basischen Aminosäure und Homopolymeren einer sauren Aminosäure gebildet sein. Es wird angenommen, daß die Verbesserungspeptide wegen ihrer gemischten stereochemischen Anordnung an das Farbstoff-Polymer-Konjugat binden zur Bildung eines Analysereagenskomplexes, der wesentlich verbesserte Bindungseigenschaften bei Analyseverfahren im Vergleich zur alleinigen Verwendung des Farbstoff-Polymer-Konjugates aufweist. Vorzugsweise liegt das Molverhältnis des sauren Aminosäurerestes zum basischen Aminosäurerest im Bereich von 2:1 bis 1:1 und am meisten bevorzugt beträgt es etwa 1:1. Das Reagens der vorliegenden Erfindung ist eine Mischung (wahrscheinlich ein Komplex) des Farbstoff-Polymer-Konjugates mit dem Verbesserungspeptid in einer Konzentration, die je nach dem Molverhältnis von saurem Rest zu basischem Rest in dem Verbesserungspeptid variiert. Zum Beispiel steigt mit zunehmendem Anteil des sauren Restes die Menge des Verbesserungspeptids an, die erforderlich ist, um das gleiche Ergebnis wie mit niedrigerem Anteil zu erzielen. Somit sind geeignete Konzentrationen des Verbesserungspeptids 50 % bis 97 % basierend auf dem Gesamtgewicht der Mischung, und vorzugsweise 65 % bis 90 %, wobei das Farbstoff-Polymer-Konjugat den restlichen Anteil bildet. Diese Konzentrationen basieren auf einem mg des Farbstoffpolymers mit 80 Extinktionseinheiten (AU).
Demnach ist es ein Ziel dieser Erfindung, ein optisch markiertes Polypeptidreagens für Bindungsanalysen zur Verfügung zu stellen, das einen hohen Markierungsgrad aufweist und eine erhöhte Empfindlichkeit bei der Analyse verschafft.
Es ist ein weiteres Ziel dieser Erfindung, ein Verbesserungspeptidreagens für Bindungsanalysen (Assays) zur Verfügung zu stellen, das die schlechten Bindungseigenschaften des markierten Polypeptidreagenzes ausgleicht und die Analysespezifität und die Nachweisempfindlichkeit verbessert.
Es ist ein weiteres Ziel dieser Erfindung, ein Polypeptidpaar-Reagenssystem zur Verwendung bei Bindungsanalysen zur Verfügung zu stellen, das aus einem Komplex eines markierten Polypeptids (Farbstoff-Polymer-Konjugat) und eines Verbesserungspeptids besteht.
Es ist ein weiteres Ziel dieser Erfindung, Bindungsanalyseverfahren mit gesteigerter Empfindlichkeit, verbesserter Spezifität und schnellen Reaktionsgeschwindigkeiten zur Verfügung zu stellen, bei denen ein Polypeptidpaar-Reagenssystem verwendet wird.
Es ist noch ein weiteres Ziel dieser Erfindung, Verfahren für den Nachweis eines Zielmoleküls in einer Probe unter Verwendung eines auf einem Polypeptidpaar-Reagenssystem basierenden Bindungsanalyseverfahrens zur Verfügung zu stellen.
Weitere Ziele, Vorteile und neue Merkmale der Erfindung werden zum Teil in der folgenden Beschreibung dargelegt, zum anderen Teil werden sie bei der Untersuchung der folgenden Beschreibung ersichtlich oder können dem Verfahren dieser Erfindung entnommen werden.
Um die vorstehenden und weitere Ziele gemäß der vorliegenden Erfindung zu erreichen, wie sie hier dargestellt und in großen Zügen beschrieben werden, können die Hauptpolypeptide nach jeglichen, dem Fachmann bekannten Verfahren der Peptidsynthese synthetisch hergestellt werden. Es wird zum Beispiel verwiesen auf Blout, E.R. und Karlson, R.H., Jounal of the American Chemical Society, 78, 941-946, März 1956; Hanby, W.E., Waley, S.G. und Watson, J., Journal of the Chemical Society, Artikel 632, 3239-3249, 1950; Bodanszky, M., Bodanszky, A., Die Technik der Peptidsynthese, Springer Verlag, Berlin, Heidelberg, New York, Tokio, 1984, Seite 211; Bodanszky, M., Bodanszky, A., Grundsätze der Peptidsynthese, Springer Verlag, Berlin, Heidelberg, New York, Tokio, 1984. Vorzugsweise werden sie unter Verwendung eines modifizierten Ringöffnungspolymerisationsverfahrens unter Verwendung von Aminosäure-N-carboxyanhydriden synthetisch hergestellt (Leuchs, H.: Ber. dtsch. Chem. Ges. 39 857 (1906) 1; Leuchs, H., Geiger, W., ibid. 41, 1721 (1908)). Bei diesem Verfahren werden die cyclischen gemischten Anhydride der Kohlensäure durch Reagieren von Phosphorpentachlorid mit N-a-N-e-di-CBZ- L-Lysin und N-CBZ-L-Glutaminsäure-gamma-benzylester (NCA- Derivate) hergestellt. Die aprotische Base Natriummethoxid wird zur Einleitung der Polymerisation verwendet&sub5;
Da das N-Carboxyanhydrid-Derivat der Glutaminsäure ungefähr mit der dreifachen Geschwindigkeit des N-Carboxyanhydrid- Derivats des Lysins polymerisiert, ist die Sequenz des resultierenden Hauptpolypeptids nicht völlig zufällig. Das eine Ende des Copolymerendprodukts besteht überwiegend aus Glutaminsäure und das andere Ende besteht überwiegend aus Lysin. In dem Polypeptid besteht im Molverhältnis ein Überschuß von Lysin gegenüber Glutaminsäure, vorzugsweise ein Verhältnis von ungefähr 4:1.
Farbstoffmoleküle können an die Aminogruppen des Hauptpolypeptids gebunden werden unter Verwendung von dem Fachmann bekannten Verfahren zur Markierung von Proteinen und Polypeptiden mit optischen Farbstoffen, wie zum Beispiel Rhodamin oder Fluorescein. Vorzugsweise wird das Hauptpolypeptid der vorliegenden Erfindung mit Fluorescein markiert gemäß dem von Wier, D.M., angeführten Verfahren, Immunchemie, Kapitel 28, Seite 405, 4. Ausgabe, Blackwell Publikationen, Boston, 1986, durch langsame Beigabe von Fluoresceinisothiocyanat mit nachfolgender Reinigung durch Dialyse und Molekularsiebchromatographie.
Nach der Herstellung des Farbstoffpolymers wird das geeignete Bindungsmolekül an das Farbstoffpolymer zur Bildung eines Farbstoff-Polymer-Konjugates kovalerit gebunden. Geeignete Verfahren zur kovalenten Bindung van Bindungsmolekülen an die Aminogruppen von Polypeptiden sind im Stand der Technik wohl bekannt. Es wird zum Beispiel verwiesen auf Carlsson, J., Drevin, H. und Axen, R., Biochemical Journal 173, 723, 1978. Vorzugsweise ist das verwendete Bindungsverfahren eine Abwandlung des von Carlsson gelehrten Verfahrens Supra, in dem das Polypeptid und das Bindungsmolekül zuerst mit N- Succinimidyl-3- (2-pyridyldithio) propionat (SPDP) modifiziert und anschließend durch eine Disulfidbindung verbunden werden.
Die Verbesserungspeptide können auch nach einem geeigneten, im Stand der Technik bekannten Verfahren zur Synthese von Polypeptiden synthetisch hergestellt werden. Vorzugsweise werden sie auch unter Verwendung einer Ringöffnungspolymerisation mit Aminosäure-N-carboxyanhydriden synthetisch hergestellt, ähnlich dem für die Synthese des Hauptpolypeptids verwendeten Verfahren. Vorzugsweise bestehen die Verbesserungspeptide aus einer Mischung von basischen und sauren Aminosäureresten mit entgegengesetzten stereochemischen Konfigurationen. Am meisten bevorzugt besteht das Verbesserungspeptid aus L-Glutaminsäure und D-Lysin oder D-Glutaminsäure und L-Lysin in einem ungefähren Molverhältnis von 1:1 bis 2:1. Während durch ein höheres Verhältnis angemessene Ergebnisse erzielt werden, ist festgestellt worden, daß bei zunehmendem Molverhältnis von Glutaminsäure gegenüber Lysin die Aktivität des resultierenden Verbesserungspeptids abnimmt, was zur Folge hat, daß eine größere Gesamtmenge des Verbesserungspeptids erforderlich ist, um das gleiche erwünschte Ergebnis wie mit einem niedrigeren Molverhältnis zu erzielen.
In einer anderen Ausführungsform kann das Verbesserungspeptid aus einer Mischung von Homopolymeren einer basischen Aminosäure und Homopolymeren einer sauren Aminosäure bestehen. Bei Mischungen von Homopolymeren ist eine entgegengesetzte stereochemische Konfiguration der basischen und sauren Aminosäurepolypeptide zur Steigerung der Aktivitat nicht erforderlich. Vorzugsweise besteht die Mischung aus Homopolymeren aus D-Lysin (Mr (relative Molekülmasse] 13K) und L-Glutaminsäure (Mr 77K), D-Lysin (Mr 13K) und D-Glutaminsäure (Mr 66K) oder D-Lysin (Mr 26,3K) und D-Glutaminsäure (Mr 66K), worin die Aminosäuren in demselben Verhältnis wie oben beschrieben vorliegen.
Das Polypeptidpaar-Reagens, das ein Komplex eines Farbstoff- Polymer-Konjugates und eines Verbesserungspeptids ist, ist für den optischen Nachweis der Anwesenheit oder Abwesenheit und/oder der Menge von Zielmolekülen in einer Reihe von Bindungsanalyseverfahren in biologischen Flüssigkeiten wie zum Beispiel Blut, Serum, Plasma, Harn, Speichel, Tränenflüssigkeit, Schweiß, Lymphe und dergleichen verwendbar. Solche Analyseverfahren umfassen zum Beispiel, ohne auf diese beschränkt zu sein, Immunoassays, die auf der Bindung zwischen Antigenen und Antikörpern beruhen, oder Bindungsassays, welche Avidin/Biotin-Nachweissysteme umfassen. In solchen Analyseverfahren wird die Nachweisempfindlichkeit und das Bindungsverhalten des Farbstoff-Polymer-Konjugates durch das Verbesserungspeptid wesentlich erhöht.
Im allgemeinen umfassen die Analysetestsysteme der Erfindung, in denen das neue Polypeptidpaar-Reagens verwendet wird, ein Farbstoff-Polymer-Konjugat, das das geeignete Bindungsmolekül trägt, welches sich mit dem vermutlich in der Analysenprobe vorhandenen Zielmolekül verbinden kann, ein Verbesserungspeptid, das mit dem Farbstoff-Polymer-Konjugat einen Komplex bildet, und Mittel für den Nachweis und/oder für die quantitative Bestimmung der optischen Emissionen von dem Farbstoff. Vorzugsweise ist das Analyseverfahren ein kompetitiver Bindungsassay, in dem das Bindungsmolekül an eine feste Phase gebunden ist, um die Abtrennung der Komplexe aus Zielmolekülen und Bindungsmolekülen von der Lösung nach dem Aussetzen der zu untersuchenden Probe zu erleichtern. Der Assay kann auch sandwichartig aufgebaut sein, worin eine feste Phase, auf der ein gegen einen Teil des Zielmoleküls gerichtetes Bindungsmolekül immobilisiert ist, einer Probe ausgesetzt wird, die das Zielmolekül enthält, gefolgt von einer Lösung, die aus dem Farbstoff-Polymer-Konjugat (mit Verbesserungspeptid komplexiert) besteht, das ein Bindungsmolekül enthält, das gegen eine andere Stelle auf demselben Zielmolekül gerichtet ist. Ein Beispiel für eine geeignete feste Phase ist Agarosegel. Andere Beispiele für geeignete feste Phasen sind für den Fachmann offensichtlich und auf dem Fachgebiet der Bindungsassays wohl bekannt.

AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Ein wesentlicher Bestandteil des Polypeptidpaar- Analysereagenzes und der Analysesysteme der Erfindung ist ein Farbstoff-Polymer-Konjugat bestehend aus einer Polypeptidhauptkette, optischen Farbstoffmolekülen, die durch ihre Aminogruppen an die Hauptkette gebunden sind, und einem Bindungsmolekül, das ebenfalls durch seine Aminogruppen an die Hauptkette gebunden ist. Der Hauptkettenbestandteil des Farbstoff-Polymer-Konjugates ist ein Polypeptid, das netto eine positive Ladung aufweist und aus Lysin- und Glutaminsäureresten besteht. Am meisten bevorzugt liegen Lysin und Glutaminsäure in einem ungefähren Molverhältnis von 4:1 in dem Hauptpolypeptid vor, und am meisten bevorzugt weist es eine Molekülmasse von ≥ 5-10 x 10&sup5; Dalton auf, wobei gewöhnlich 1 x 10&sup6; ausgewählt wird, und das Lysin und die Glutaminsäure liegen in der L-Form vor. Werden sie in einem Immunoassay ohne die Verbesserungspeptide der vorliegenden Erfindung verwendet, weisen sie kein geeignetes Bindungsverhalten auf.
Die Polypeptidhauptkette wird vorzugsweise gemäß einer Abwandlung des Ringöffnungspolymerisationsverfahrens von Leuchs Supra synthetisch hergestellt; für den Fachmann sind jedoch viele andere geeignete Verfahren der Polypeptidsynthese offensichlich. Bei dem Ringöffnungspolymerisationsverfahren werden zuerst N-Carboxyanhydride der erwünschten Aminosäuren aus Gamma-benzyl-N-carbobenzoxyglutamat und Natrium-N-e, einem di-Carbobenzoxylysin durch Reaktion mit Phosphorpentachlorid hergestellt. Die kristallinen Reaktionsprodukte werden gereinigt und gewaschen.
Eine optimale Menge von Natriummethoxid wird verwendet, um die Polymerisation der N-Carboxyanhydridaminosäuren zur Herstellung des Verbesserungspeptids einzuleiten.
Statistische Copolymere der N-Carboxyanhydrid (NCA)-Derivate der Glutaminsäure und des Lysins werden synthetisch hergestellt, indem die NCA-Aminosäurekristalle in Dioxan aufgelöst werden, eine ausreichende Menge Natriummethoxid zugesetzt wird, um ein optimales Verhältnis von NCA- Aminosäure zu Initiator zu schaffen, die Mischung zur Reaktion gebracht und das Lösungsmittel verdampft wird. Bei der Herstellung der Polypeptidhauptkette beträgt das Verhältnis von NCA-Aminosäure zu Initiator ungefähr 500:1.
Nach der Polymerisation werden die abgeschirmten Epsilonamino- und Gammacarboxylreste von Lysin bzw. Glutaminsäure entblockiert unter Verwendung von redestilliertem Eisessig und Bromwasserstoff in Essigsäure. Nach drei Tagen bei 4-12ºC wird das Polymer mit Ether ausgefällt und es wird durch Filtration als Filterkuchen gewonnen. Der Filterkuchen wird in 0,5 M NaOH resuspendiert, der pH-Wert wird auf 9-10 eingestellt, und die Lösung wird mehrere Tage in Spectra-por Membranen mit einem Molekulargewichtsrückhaltevermögen von 8.000 bis 10.000 (von Spectrum Medical Industries, Los Angeles, Kalifornien) gegen entionisiertes Wasser dialysiert. Nach der Dialyse wird das Produkt gefriergetrocknet und mit einem optischen Farbstoff, wie zum Beispiel Fluorescein oder Rhodamin markiert.
Die optische Farbstoffmarkierung wird unter Verwendung von normalen Isothiocyanatreaktionen an das Hauptpolypeptid gebunden.
Die Polypeptidhauptkette kann in hohem Grad mit Farbstoff substituiert werden und gerade dieses Merkmal macht das Polypeptid zu einem so nützlichen Material für Immunoassays. Zum Beispiel kann bei Substitution mit Fluorescein jedes Molekül der Polypeptidhauptkette 600 oder mehr Fluoresceinreste enthalten, bei einem molaren Extinktionskoeffizient von Em = 6 x 10&sup7;, was eine relative Molekülmasse von 8 x 10&sup5; Dalton ergibt. Die Absorbanz ist gleich der molare Extinktionskoeffizient mal die Konzentration in Mol pro Liter, d.h.

Absorbanz

Em = Konzentration in Mcl pro Liter
Das Farbstoffpolymer ist in neutralen oder leicht alkalischen wäßrigen Medien löslich. Es ist auch in Dimethylformamid löslich. Lösungen des Farbstoffpolymers sind weniger viskos als Lösungen, die eine annähernd gleiche Konzentration von nichtumgesetzter Polypeptidhauptkette enthalten.
Die Bindung des Bindungsmoleküls an das Farbstoff-Polymer- Konjugat basiert vorzugsweise auf dem Verfahren von Carlsson Supra; es sind jedoch auch viele andere geeignete Verfahren der Bindung von Bindungsmolekülen an Polypeptide im Stand der Technik wohl bekannt, die ebenso verwendet werden können.
Gemäß der Lehre von Carlsson wird das Bindungsmolekül dem mit Farbstoff markierten Polymer zugesetzt, indem zuerst das Farbstoffpolymer mit N-Succinimidyl-3-(2-Pyridyldithio) propionat (SPDP) modifiziert wird. SPDP ist ein heterobifunktionelles Reagens, das einen N-Hydroxysuccinimidesteranteil und einen s-Pyridyldisulfidanteil enthält. Der Ester reagiert mit den primären Aminogruppen des Polymers, wobei stabile Amidbindungen gebildet werden. Das modifizierte Polypeptid umfaßt eine 2-Pyridyldisulfidstruktur, die mit Dithiothreitol (DTT) reduziert wird. Die Reduktionsreaktion führt zur Freisetzung von Pyridinthion und erzeugt ein modifiziertes Polymer, das freie Sulfhydrylgruppen trägt (thiolisiertes Polymer). Die Konzentration des freigesetzten Pyridinthions wird spektrophotometrisch überwacht und der erhaltene Wert ist ein Maß der Anzahl der in das modifizierte Polypeptid eingebauten Sulfhydrylgruppen.
Zweitens wird das Bindungsmolekül durch die gleichen, für die Modifizierung des Farbstoffpolymers verwendeten Verfahren mit SPDP modifiziert, ohne Reduktion der 2-Pyridyldisulfidstruktur.
Das mit SPDP modifizierte Bindungsmolekül wird an das thiolisierte Polymer kovalent gebunden, indem die beiden Bestandteile über Nacht in einem Puffer gemischt werden. Die Reaktion wird durch Zusatz von iodessigsaurem Natriumsalz abgebrochen, und das Farbstoff-Polymer-Konjugat wird in mehreren Ausfällungs- und Zentrifugationszyklen gereinigt. Das gereinigte Farbstoff-Polymer-Konjugat wird in 0,15 M Tris, pH-Wert 8,5, bei ungefähr 250-400 AU/ml suspendiert.
Der zweite wesentliche Bestandteil des Polypeptidpaar- Analysereagenzes und der Analysesysteme der Erfindung, in denen das Reagens verwendet wird, ist ein Verbesserungspeptid, das ein Copolymer ist, das aus Resten von sauren und basischen Aminosäuren mit entgegengesetzten stereochemischen Konfigurationen (d.h. D- oder L-Aminosäuren) oder aus Mischungen von Homopolymeren davon mit entweder gleichen oder verschiedenen stereochemischen Konfigurationen besteht. Beispiele für geeignete saure Aminosäuren zur Verwendung in dem Verbesserungspeptid sind L-Aspartat, D-Aspartat, L-Glutaminsäure und D-Glutaminsäure. Beispiele für geeignete basische Aminosäuren zur Verwendung in dem Verbesserungspeptid in Verbindung mit sauren Aminosäuren mit entgegengesetzter stereochemischer Konfiguration sind L-Lysin, D-Lysin, L-Arginin, D- Arginin, L-Histidin, D-Histidin, L-Ornithin und D-Ornithin.
Das Verbesserungspeptid weist vorzugsweise eine Molekülmasse von ungefähr 2 x 10&sup4; - 2 x 10&sup5; Dalton auf, es können aber auch Werte außerhalb dieses Bereiches verwendet werden. Es ist ein wichtiger Aspekt der Erfindung, daß das Verbesserungspeptid mit einem derartigen Verhältnis von sauren zu basischen Aminosäureresten synthetisiert wird, daß sich die gleiche Anzahl von positiven und negativen Ladungen oder ein Überschuß der negativen Ladung ergibt. Das heißt, der saure Bestandteil kann in aquimolaren Mengen vorliegen oder der saure Bestandteil kann den basischen Bestandteil in einem solchen Umfang überschreiten, daß sich netto eine maximale negative Ladung von 1,5 ergibt. Vorzugsweise besteht das Verbesserungspeptidcopolymer aus Asparaginsäure- und Lysinresten mit entgegengesetzten stereochemischen Konfigurationen oder aus Glutaminsäure- und Lysinresten mit entgegengesetzten stereochemischen Konfigurationen und weist eine Molekülmasse von 2 x 10&sup4; bis 2 x 10&sup5; Dalton auf. Am meisten bevorzugt ist das Verbesserungspeptid ein statistisches Copolymer aus Glutaminsäure bzw. Lysin in einem ungefähren Molverhältnis von 1:1, und weist eine Molekülmasse von ungefähr 1 x 10&sup5; Dalton auf.
In einem anderen Fall kann das Verbesserungspeptid eine Mischung von einzelnen Homopolymeren von je sauren und basischen Aminosäuren sein. Wenn Mischungen von Homopolymeren zur Reduzierung des unspezifischen Bindens des Farbstoff- Polymer-Konjugates verwendet werden, können die zwei Homopolymere entweder die gleiche oder entgegengesetzte stereochemische Konfiguration aufweisen. Man hat jedoch beobachtet, daß Mischungen von Homopolymeren, in denen beide Peptide die L-Konfiguration aufweisen, zur Steigerung der Bindung wesentlich weniger wirksam sind als Mischungen, in denen D- und L-Polypeptide oder zwei D-Polypeptide gemischt werden. Vorzugsweise enthalten die Mischungen Homopolymere aus D-Lysin (Mr=13K) und L-Glutaminsäure (Mr=77K) oder Homopolymere aus D-Lysin (Mr=13-26,3K) und D-Glutaminsäure (Mr=66K).
Obwohl sich die Anmelder nicht durch eine spezielle Theorie über die Wirkungsweise des Verbesserungspeptids festlegen lassen wollen, nimmt man derzeit an, daß diese Peptide Mikrokolbide oder Mizellen bilden, die die Fähigkeit besitzen, auf Grund ihrer Ladung, ihrer Form und relativ kleinen Größe an das Farbstoff-Polymer-Konjugat zu binden. Ferner wird angenommen, daß der entstehende Komplex eine kugelartigere Form annimmt und daher für die Reaktion mit dem Zielmolekül besser geeignet wird. Man nimmt auch an, daß die Einlagerung der D- und L-Aminosäuren zur Steigerung der Peptidaktivität wichtig ist, da die Richtung der Peptidkette an jeder Stelle effektiv umgekehrt wird, wo sich die Konfiguration des Aminosäurerests ändert. Man nimmt an, daß dabei ein Peptid entsteht, dessen Form runder ist als bei einem Peptid, das aus Aminosäuren mit der gleichen Konfiguration besteht. Es wird vermutet, daß eine kugelartige Form das Bindungsvermögen des Verbesserungspeptids mit dem Farbstoff-Polymer-Konjugat verbessert, was folglich den positiven Einfluß des Verbesserungspeptids auf das bei Analysesystemen erforderliche Binden erhoht.
Im Falle von Mischungen von sauren und basischen Homopolymeren deuten Testergebnisse darauf hin, daß sich Homopolymere mit entgegengesetzter Ladung auch in einem kugelförmigen Komplex verbinden, der wirksam an das Farbstoff-Polymer-Konjugat anlagern kann. Die Größe des verbundenen Komplexes scheint sich in einer Weise auf die Bindung an das Farbstoff-Polymer- Konjugat auszuwirken, wovon man noch keine genaue Kenntnis hat. Zum Beispiel weisen Mischungen von Homopolymeren aus D- Lysin und L-Glutaminsäure eine verminderte Aktivität auf, wenn das Molekulargewicht von wenigstens einem der Homopolymere über eine kritische Masse erhöht wird. Dies variiert mit den Kennzahlen des Systems und den verschiedenen verwendeten Polymeren und Materialien.
Die Verbesserungspeptide werden durch ein ähnliches Verfahren synthetisch hergestellt wie das zuvor beschriebene Verfahren zur Synthese der Polypeptidhauptkette. N-Carboxyanhydridderivate der geeigneten sauren und basischen Aminosäuren werden unter Verwendung von Natriummethoxid als Initiator der Polymerisation polymerisiert. Nach der Polymerisation und Entblockierung der abgeschirmten Amino- und Carboxylreste werden die Peptide gegen entionisiertes Wasser zwei Tage lang in Spectra-por Membranen mit einem Molekulargewichtsrückhaltevermögen von 6.000-8.000 dialysiert und gefriergetrocknet.
Es wurde beobachtet, daß die Anwesenheit von Aggregaten des Verbesserungspeptids nicht nur zu einer Ausfällung, sondern zu einer Hemmung der Komplexbildung mit dem Farbstoff- Polymer-Konjugat führt. Daher nimmt man an, daß die Löslichkeit des Peptids zumindest teilweise die obere Grenze des Molekulargewichts festlegt, die zur Reduzierung des unspezifischen Bindens funktionell ist. Um die Abtrennung der hemmenden Aggregate sicherzustellen, wird das gefriergetrocknete Verbesserungspeptid bei 300.000 x g für 2 Stunden ultrazentrifugiert, dann der Überstand zur Untersuchung entnommen zur Ermittlung 1) der Aktivität in einer unspezifischen Bindungsanalyse, 2) der relativen Molekülmasse durch Gelfiltration und 3) des Verhältnisses von sauren zu basischen Aminosäureresten durch Hochdruckflüssigchromatographie (HPLC) nach der Säurehydrolysee.
Das Farbstoff-Polymer-Konjugat und das Verbesserungspeptid werden zur Verwendung in einem anschließenden Bindungsanalyseverfahren vorgemischt, wobei das Verbesserungspeptid mit 50 bis 97 und vorzugsweise 65 bis 90 Gewichtsprozent der Konjugatpeptidmischung vorhanden ist. Das Polypeptidpaar- Reagens der vorliegenden Erfindung ist zwar zur Verbesserung der Bindung in einer nichtimmunologischen Analyse, wie zum Beispiel in Avidin/Biotin-Bindungsanalysen nützlich, es ist aber besonders vorteilhaft, wenn es in immunologischen Analysen, besonders in kompetitiven Bindungsanalysen verwendet wird, und besonders bei solchen, die kleine Moleküle wie zum Beispiel Thyroxin (T&sub4;), und große Moleküle wie zum Beispiel Thyroxin bindendes Globulin (TBG), humanes Choriongonadotropin (HCG) und apo-A&sub1; umfassen.
Die folgenden Beispiele veranschaulichen lediglich bestimmte Ausführungsformen der Erfindung, es wird jedoch vorausgesetzt, daß die Erfindung nicht auf diese beschränkt ist. Alle Mengenangaben der verschiedenen Bestandteile in den Beispielen und an anderen Stellen in dieser Beschreibung sind auf das Gewicht bezogen, sofern nicht anders angegeben.

BEISPIEL 1

Zur synthetischen Herstellung des Farbstoff-Polymer- Konjugates wurden zuerst statistische Copolymere aus 4:1 L- Lysin und L-Glutaminsäure unter Verwendung der Ringöffnungspolymerisation mit Aminosäure-N-carboxyanhydriden synthetisiert gemäß dem folgenden Protokoll.
1. Synthese von Gamma-benzyl-N-carboxyl-L-glutamatanhydrid (g-Bz-L-GLU NCA). Alle Glasgeräte wurden mit Seife und heißem Wasser gewaschen, zuerst mit entionisiertem Wasser und dann mit Aceton gespült und bei 120ºC für mindestens 2 Stunden getrocknet. Vor der Synthese wurde das Reaktionsgefäß mit dem in dem Reaktionsmedium zu verwendenden Lösungsmittel gespült.
Ein trockener, 100 ml fassender, mit einem Rührstab versehener Rundkolben wurde mit 4 Gramm Gamma-benzyl-N- carbobenzoxy-L-glutamat beladen, wobei die Teilchen des Reagenzes zerkleinert wurden, um die Auflösung sicherzustellen. Vierundzwanzig ml trockener Ether wurden beigemischt und ein Trockenrohr eingesetzt. Die Reaktanten wurden unter leichtem Rühren bei Raumtemperatur für 30 Minuten aufgelöst.
Nach vollständiger Auflösung wurde das Reaktionsgemisch unter fortlaufendem Rühren auf 10ºC in einem Eisbad gekühlt. Phosphorpentachlorid (PCl&sub5;)-Pulver (2,69 g) wurde durch schnellen Zusatz beigemengt, und es wurde weiterhin bei 10ºC gerührt. Nach etwa 30-40 Minuten wurde das Reaktionsgemisch fest.
Ein Rotationsverdampfer mit einem Schutztrockenrohr wurde mit Aceton und Ether ausgespült. Man ließ die Etherphase verdampfen, wodurch ein weißer Feststoff zurückblieb. Fünfzehn ml trockenes Ethylacetat wurden beigemengt, verwirbelt und verdampften. Der Zusatz von trockenem Ethylacetat und die Verdampfung wurden wiederholt. Ein klarer Sirup wurde erhalten.
Der Sirup wurde in ungefähr 10 ml trockenem Ethylacetat aufgelöst. Falls erforderlich wird die Mischung in einem Ölbad auf 50ºC erwärmt. Trockenes Hexan wurde beigemengt, bis die Lösung trübe wurde. Die Lösung wurde auf Raumtemperatur abgekühlt und dann über Nacht in einen Gefrierapparat gestellt, nachdem man sich überzeugt hat, daß der Kolben mit einem Trockenrohr ausgestattet ist.
Die entstehenden Kristalle wurden mit einem Büchner-Trichter unter Verwendung von P-4 Fisher Filterpapier filtriert, zweimal mit Hexan gewaschen und im Vakuum in einem Trockner getrocknet. Der Schmelzpunkt des Produkts sollte 84-88ºC betragen.
2. Synthese von N-e-CBZ-N-a-carboxy-L-lysin-NCA. Ein trockener, 100 ml fassender, mit einem Rührstab versehener Rundkolben wurde mit 5 Gramm N-a-N-e-di-CBZ-L-lysin beladen.
Fünfundzwanzig ml trockener Ether wurden beigemengt und die Mischung wurde zu einem Brei gerührt. Nach Abkühlen in einem 10ºC kalten Eis- und Wasserbad wurden 2,8 Gramm Phosphorpentachlond dem Brei beigemengt, während weiterhin bei 10ºC gerührt wurde. Nach etwa 30 Minuten ergab sich eine klare Lösung.
Durch Rotationsverdampfung und Co-Verdampfung mit trockenem Ethylacetat (zwei Portionen 15 ml) wurde der Ether entfernt. Ein weißer Feststoff wurde erhalten.
Das Produkt wurde aus 15 ml trockenem Ethylacetat und ungefähr 5 ml trockenem Hexan wieder auskristallisiert, wobei die Lösung in einem Ölbad auf etwa 50ºC erwärmt wurde, bevor das Hexan beigemengt wurde. Die Lösung wurde dann auf Raumtemperatur gekühlt und über Nacht in einen Kühlschrank bei 4ºC in ein Gefäß mit einem Trockenrohr gestellt.
Die Kristalle wurden mit einem Büchner-Trichter aufgefangen, mit Hexan gewaschen und unter Vakuum getrocknet. Der Schmelzpunkt des Produkts sollte 90-95ºC betragen.
3. Synthese der statistischen Copolymere. Ein 500 ml fassender Rundkolben mit einem Rührstab und einem Trockenrohr wurde mit 0,95 Gramm g-Benzyl-L-glutaminsäure-NCA beladen. Siebenundfünfzig ml trockenes Dioxan (Aldrich Sure Seal) wurden beigemengt und gerührt, damit es sich auflöst. Es wurde eine farblose Lösung erhalten.
Ein trockener, 100 ml fassender Kolben wurde mit 4,38 Gramm N-e-CBZ-N-a-carboxy-L-lysin-NCA beladen und 44 ml Dioxan wurden beigemengt. Es wurde eine farblose Lösung erhalten.
Die Lysinlösung wurde der Glutaminsäurelösung beigemengt, gefolgt von 0,25 ml einer frisch hergestellten 0,14 M Natriummethoxidlösung in wasserfreiem Methanol, damit sich ein Verhältnis von Anhydrid:Initiator von 500:1 ergibt. Das Natriummethoxid wurde tropfenweise mit einer Spritze zugesetzt, während die NCA-Lösung intensiv gerührt wurde. Nach Zusatz des Initiators wurde der Kolben mit einem Trockenrohr versehen. Das Reaktionsgemisch wurde eine Stunde lang bei Raumtemperatur gerührt, und dann über Nacht bei Raumtemperatur vor Licht geschützt aufbewahrt.
Am nächsten Tag wurden die Lösungsmittel durch Rotationsverdampfung entfernt und es wurde ein pastenartiger Rückstand erhalten. Das Produkt wurde in einem Vakuumtrockner über Drierite für mindestens 4 Stunden getrocknet.
4. Entblockierung des Polypeptids. Dem abgeschirmten Polypeptid wurden 50 ml redestillierter Eisessig beigemengt und die Mischung wurde für etwa 15 Minuten gewirbelt, damit sich der Großteil der Feststoffpartikel auflöst. Dann wurden 100 ml 30 % Bromwasserstoff in Essigsäure beigemengt.
Nach Rühren bei Raumtemperatur für eine Stunde in Abwesenheit von Feuchtigkeit erhält man eine klare bis gelbliche Lösung, die nach etwa 15-20 Minuten trübe wird. Zu diesem Zeitpunkt wurde der Kolben in eine Kältekammer verlegt und 3 Tage gerührt (4-12ºC). Es bildete sich ein dickflüssiger Brei.
Nach drei Tagen in der Kälte wurde ein Volumen Ether (150-200 ml) beigemengt und die Mischung wurde 2 Stunden im Gefrierapparat aufbewahrt. Das Abscheideprodukt wurde mit einem mit P-4 Filterpapier versehenen Büchner-Trichter filtriert und der Filterkuchen wurde zweimal mit 20 ml Ether gewaschen.
Der Filterkuchen wurde in einen 250 ml fassenden Erlenmeyerkolben umgefüllt, und es wurden 100 ml 0,05 M NaOH beigemengt, wodurch sich eine trübe Lösung bildete. Der pH-Wert wurde auf 9-10 eingestellt. Wasser wurde beigefügt, damit die Lösung insgesamt 150 ml ergibt, und die Probe wurde in Spectra-por Membranen mit einem Molekulargewichtsrückhaltevermögen von etwa 8.000 bis 10.000 Dalton eingebracht. Die Probe wurde gegen ein Volumen von 4 x 8 l entionisiertes Wasser zwei Tage bei Raumtemperatur dialysiert und gefriergetrocknet.
5. Kennzeichnung des Polypeptids. Die relative Molekülmasse (Mr) wurde durch Gelfiltration auf einer geeichten Sepharose CL-68 Säule ermittelt.
Das Verhältnis von Lysin zu Glutaminsäure wurde durch Hochdruckflüssigchromatographie ermittelt und es wurde festgestellt, daß es 4,00:1,01 betrug. Verschiedene Verhältnisse können erzeugt werden, indem die Ausgangsmaterialien in den oben beschriebenen Verfahren in geeigneter Weise verändert werden.
6. Markierung der Polypeptidhauptkette. Das statistische Copolymer aus L-Lysin und L-Glutaminsäure (die Polypeptidhauptkette) wurde durch Zusatz von Fluoresceinisothiocyanat (FITC) unter Verwendung des folgenden Verfahrens mit Fluorescein markiert:

1. Reinigung der Peptidhauptkette

a) 100 Milligramm eines statistischen Copolymers {Poly (Glu, Lys HBR) Verhältnis 1:4, ungefähres Molekulargewicht 380.000 (erworben von Sigma Chemical Company, St. Louis, Missouri, Kat-Nr. P-0650)} wurden in 100 Millilitern eines Hydrogencarbonatpuffers 0,15 M, pH-Wert 9,5, aufgelöst.
Die Lösung wurde 48 Stunden gegen ein Volumen von 2 x 1 l desselben Puffers bei Raumtemperatur dialysiert.

2. Herstellung der mit FITC markierten Peptidhauptkette

a) Ein 250 ml fassender, mit einem Rührstab versehener bernsteinfarbener Kolben wurde mit dem zurückbehaltenen Produkt (enthaltend 75 mg Peptidhauptkette) beladen.
b) 350 mg Fluoresceinisothiocyanat wurden eingewogen und in 65,0 ml trockenem Dimethylformamid, das in einem trockenen bernsteinfarbenen Kolben enthalten war, aufgelöst.
c) Die FITC-Lösung wurde in einen trockenen bemsteinfarbenen Scheidetrichter umgefüllt.
d) Unter intensivem Rühren der Peptidlösung wurde das FITC mit einer Geschwindigkeit von ungefähr 1 Tropfen alle 2 Sekunden beigefügt.
e) Nach Zusatz des FITC ließ man die Reaktion unter Rühren 5 Stunden ablaufen.

3. Reinigung der mit FITC markierten Peptidhauptkette

a) Das mit FITC markierte Hauptpolymer wurde gegen ein Volumen von 2 x 4 l Hydrogencarbonatpuffer zwei Tage dialysiert.
b) Das mit FITC markierte Peptid wurde in einer Spektralultrafiltrationsvorrichtung, die mit Spectra/Por UF-Membranen (MWCO 1 x 10&sup6;), Spectrum Medical Industries, Los Angeles, Kalifornien, versehen war, bearbeitet, mit 1,0 1 eines 0,05 M Natrium-phosphatpuffers, pH-Wert 9,0, eluiert und anschließend auf ein Volumen von 25 ml konzentriert.
c) Die Lösung wurde auf einer Sephadex G-25 Säule (2,5 cm x 54 cm) gereinigt, die zuvor mit 0,05 M Phosphatpuffer, pH-Wert 7,5, äquilibriert wurde.
d) Die Totvolumen-Fraktion (50 ml) wurde gesammelt.

4. Kennzeichnung der mit FITC markierten Peptidhauptkette

a) Die Zahl der Extinktionseinheiten des Polymers, die in dem Totvolumen-Eluat aus der Sephadex G-25 Säule enthalten sind, wurde ermittelt.
b) 5,0 ml des Eluats wurden mit 10 % Essigsäure ausgefällt, die Pellets mit Wasser gewaschen, zentrifugiert und dann gefriergetrocknet.
c) Das Gewicht des Rückstandes wurde bestimmt und die Zahl der in 1,0 Milligramm des Rückstandes enthaltenen Extinktionseinheiten wurde unter Verwendung von (b) als Bezugsmenge berechnet.
Das mit FITC markierte Polypeptid (Farbstoffpolymer) wurde dann unter Verwendung des folgenden Verfahrens an einen Antikörper gepaart.
1. SPDP-Derivatisierung des Antikörpers und der Farbstoffpolymere. Ein kegelförmiges Zentrifugenglas wurde mit Ethanol (6,67 ml) beladen unter Verwendung einer mit Ethanol gespülten Spritze. In einem Trockenraum wurde Ethanol zu 10 mg SPDP (im Trockner aufbewahrt) in einer Menge von 1,5 mg/ml beigemengt. Im Labor wurden die Bestandteile gut gemischt (10-15 Minuten), bis sie sich aufgelöst hatten.
Eine bernsteinfarbene Phiole wurde mi 70 mg Antikörper beladen. (Die Antikörperkonzentration sollte zwischen 3 und 5 mg/ml betragen). Pro einem Mol Antikörper wurden 8,6 Mol SPDP in vier Aliquoten in Abständen von 5 Minuten unter Verrühren beigemengt. Das Rühren wurde dann eingestellt und die Phiole wurde 75 Minuten stehengelassen, damit die Reaktion eintreten kann.
10.000 AU des Farbstoffpolymers mit 150-200 AU/ml wurden abgemessen und ein 100 ml fassendes bemsteinfarbenes Fläschchen wurde damit beladen. 3,5 ml des restlichen SPDP wurden mit Ethanol auf 10,5 ml verdünnt (Endkonzentration 0,5 mg/ml SPDP). Pro einem Mol des Farbstoffpolymers wurden 30 Mol SPDP in vier Aliquoten in Abständen von 5 Minuten unter Rühren beigemengt. Es wurde weitere 2 Stunden und 15 Minuten gerührt.
Der SPDP-derivatisierte Antikörper wurde in einem 2,5 cm breiten Dialyse-Schlauch gegen 1 Liter 0,1 M PO4, 0,1 M NaCl- Puffer, pH-Wert 7,4, über Nacht bei 4ºC dialysiert.
Das SPDP-derivatisierte Farbstoffpolymer wurde gegen 2 Liter 0,05 M PO4, pH-Wert 7,5, über Nacht bei 4ºC dialysiert.
2. Reduktion des SPDP-derivatisierten Farbstoffpolymers. Das Farbstoffpolymer wurde aus dem Dialyse-Schlauch entfernt und das Gesamtvolumen gemessen&sub4; Die Menge von 0,2 M DTT, die dem Farbstoffpolymer beigefügt werden sollte, um eine Endkonzentration von 0,02 M DTT zu erhalten (Farbstoffpolymervolumen x 11 %), wurde berechnet und das Farbstoffpolymer und das berechnete Volumen des DTT wurden eine Stunde in einem sauberen, mit einem Deckel versehenen, bemsteinfarbenen Fläschchen unter Rühren zur Reaktion gebracht.
Nach der Reaktion wurde das reduzierte Polymer ausgefällt, indem der pH-Wert der Lösung mit 10 % Essigsäure auf 5 herabgesetzt wurde. Die Proben wurden in 50 ml fassende kegelförmige Röhrchen umgefüllt und im Kalten zentrifugiert. Die Überstände wurden zur Feststellung von Pyridin-2-thion aufgehoben, ein Maß für die Anzahl der in das Polymer eingebauten Sulfhydrylgruppen.
Jedes Pellet wurde in 50 ml eines 0,01 M Acetatpuffers, pH- Wert 5, dispergiert, gut gemischt und zentrifugiert. Die Überstände wurden verworfen und der Arbeitsgang wurde wiederholt. Die Zentrifugengläser wurden gewechselt und das Produkt wurde drei weitere Male mit 0,01 Natriumacetat gewaschen, wobei im Kalten zentrifugiert wurde und die Überstände verworfen wurden.
Die Pellets wurden einmal mit entionisiertern Wasser gewaschen und die Überstände verworfen. Dann wurde das Pellet in 1,0 ml 0,05 M PO4, pH-Wert 7,4, auf je 200 AU des Ausgangsmaterials aufgelöst. Mit 0,5 M Natriumdihydrogenphosphat wurde der pH- Wert unverzüglich auf 7,5 eingestellt. Eine Menge von 0,1 ml des Polymers wurde im Verhältnis 1:200 mit 0,15 M Trispuffer, pH-Wert 8,5, verdünnt und bei 492 Nanometern abgelesen. Die Konzentration und der Gesamtgehalt der gewonnenen Extinktionseinheiten wurden berechnet. Die Proben wurden auf ungefähr 100 AU/ml als Vorbereitung auf die Konjugation verdünnt. (Sobald das reduzierte Polymer aufgelöst ist, sollte der Antikörper innerhalb 30 Minuten beigemischt werden).
Die Thiolgruppenkonzentration wurde gemäß dem Verfahren von Carlsson Supra berechnet.
3. Bearbeitung des SPDP-Antikörpers. Der SPDP-Antikörper wurde aus dem Dialyse-Schlauch entfernt und das Volumen gemessen. Die Antikörperkonzentration wurde durch Ablesen der Absorbanz bei 280 Nanometern ermittelt.
4. Konjugation des Farbstoffpolymers an den Antikörper. Der gesamte mg-Gehalt des verfügbaren Antikörpers und der Gesamtgehalt der Extinktionseinheiten des verfügbaren reduzierten Polymers wurden berechnet. Unter Verwendung von 6,6 mg des SPDP-modifizierten Antikörpers auf je 1.000 AU des Polymers wurde die Menge des herstellbaren Konjugates berechnet, wobei 1,0 mg des SPDP-Antikörpers zur Untersuchung der Thiolgruppen zurückbehalten wurde.
Ein durchsichtiges Glasfläschchen mit einem Rührstab wurde mit reduziertem Polymer mit 100 AU/ml beladen. Der Antikörper wurde unter Rühren der Mischung beigemengt, dann wurde die Mischung von der Rührplatte genommen und über Nacht bei Raumtemperatur inkubiert. (Die Zahl der Thiolgruppen an dem Antikörper war nach dem Verfahren von Carlsson berechnet worden.)
Am folgenden Tag wurde die Konjugationsreaktion durch Zusatz von 100 l von 1,0 M iodessigsaurem Natriumsalz auf je 10.000 AU abgebrochen. Nachdem die Mischung ein paar Minuten gemischt wurde, ließ man sie zwei Stunden stehen, ohne zu rühren.
5. Reinigung des Konjugates durch Ausfällung Auf jeweils 2500 AU wurde das Konjugat in ein 50 ml fassendes Zentrifugenglas aus Kunststoff umgefüllt, und der pH-Wert wurde mit 1,0 M Mononatriumphosphat auf 5,5 herabgesetzt. Nach Zentrifugation im Kalten wurde der Überstand verworfen.
Jedes Pellet wurde in 50 ml kaltem 0,15 M NaCl dispergiert, zentrifugiert und dekantiert. Der Waschvorgang wurde wiederholt.
Das Pellet wurde in ungefähr 10 ml 0,01 M Tris, pH-Wert 8,5, wieder aufgelöst, dann in ein sauberes, 50 ml fassendes Zentrifugenglas aus Kunststoff umgefüllt. Die pH-Wert-Einstellung, die Zentrifugation und die Waschungen mit NaCl wurden wiederholt. Jedes Pellet wurde im 10 ml 0,01 M Tris, pH-Wert 8,5, wieder aufgelöst, und das Verfahren mit sauberen Zentrifugengläsern wiederholt, wobei die Pellets schließlich mit ungefähr 250 bis 400 AU/ml in 0,15 Tris, pH-Wert 8,5, wieder aufgelöst wurden. Drei Aliquoten von 20 µl wurden mit 0,15 M Tris (1:200) auf 4 ml verdünnt und die optische Dichte wurde bei 492 monochrom abgelesen. Ein durchschnittlicher Skalenwert, multipliziert mit 200, wurde zum Erhalt der Konzentration verwendet.

BEISPIEL 2

Die Synthese eines repräsentativen Verbesserungspeptids bestehend aus L-Glutaminsäure bzw. D-Lysin in einem Molverhältnis von 6:4 wurde wie in Beispiel 1 zur Synthese des Hauptpolypeptids beschrieben mit den folgenden Abwandlungen bewerkstelligt.
1. Die Menge des verwendeten g-Benzyl-L-glutaminsäure-NCA betrug 2,84 Gramm.
2. Die Menge des verwendeten N-e-CBZ-N-a-carboxy-D-lysin- NCA betrug 2,19 Gramm.
3. Das Volumen des verwendeten Natriummethoxids betrug 2,5 ml, damit ein Verhältnis von Anhydrid zu Initiator von 50:1 erhalten wurde.
4. Das nach der Dialyse erhaltene Peptid wurde bei 300.000 x g für 2 Stunden ultrazentrifugiert. Der Überstand wurde gewonnen und gefriergetrocknet.
5. Kennzeichnung des Polypeptids: Die relative Molekülmasse (Mr) wurde durch Gelfiltration auf einer geeichten Sephacryl S-300 Säule bestimmt.
6. Das Verhältnis von Glutaminsäure zu Lysin wurde durch Hochdruckflüssigchromatographie ermittelt und es wurde festgestellt, daß es 6,02 zu 4,01 betrug. Ein höheres oder niedrigeres Verhältnis als das vorstehende kann erzeugt werden, indem die Mengen der Glutaminsäure und/oder des Lysins, die in den vorstehenden Verfahren verwendet werden, in geeigneter Weise angepaßt werden.

BEISPIEL 3

VERGLEICH DER AKTIVITÄT DER VERBESSERUNGSPEPTIDE

Die Verbesserungspeptide, die in einem Verhältnis von 6:4 aus L-.Glu:D-Lys, D-Glu:L-Lys, L-Asp:D-Lys, L-Glu:D-Lys, D-Glu:D- Lys und Mischungen von Homopolymeren von D-Lys und L-Glu oder L-Lys und D-Glu zusammengesetzt sind, wurden in Immunoassays auf ihre Aktivität zur Verbesserung der Bindung des Farbstoff-Polymer-Konjugates an das Zielmolekül bei immunologischen Reaktionen geprüft.
TBG-Immunoassay: Der TBG-Immunoassay beruht auf der Fähigkeit des Anti-TBG-Farbstoff-Polymer-Konjugates, zirkulierendes TBG zu binden mit anschließender Einfangreaktion des Anti-TBG- Farbstoffpolymer-TBG-Komplexes, wobei T&sub4; auf einer festen Phase immobilisiert ist.
100 Milligramm Anti-TBG-Farbstoff-Polymer-Konjugat (8 AU), das wie in Beispiel 1 hergestellt wurde, wurde mit 400 Mikrolitern einer 2,5 % Lösung eines Verbesserungspeptids aus 6:4 D-Glu:L-Lys in 0,05 M Trispuffer, pH-Wert 8,5, vorgemischt, welche Lösung 2 mg des Verbesserungspeptids enthielt, das wie in Beispiel 2 hergestellt wurde. Diese nun ungefähr 96 % Verbesserungspeptid enthaltende Mischung (basierend auf dem Gewicht des Farbstoffpolymers plus Verbesserungspeptid) wurde zu der TBG enthaltenden Probe beigemischt. Ein Milliliter der Gelsuspension, die immobilisiertes T&sub4; trug, wurde dann zugesetzt und nach 60 Minuten Inkubation wurde der Anstieg der Absorbanz der flüssigen Phase bei 492 nm ermittelt. Ein Anstieg der Absorbanz von mindestens 300 Milli-AU galt als wesentliche Verbesserungspeptidaktivität.
In diesem Immunoassay verursachte ein Verbesserungspeptid aus 6:4 L-Glu:D-Lys bei Proben, die ungefähr 60 Mikrogramm TBG pro Milliliter enthielten, eine Änderung der Absorbanz von ungefähr 2000 Milli-AU. Ähnliche Verbesserungspeptide, die aus L-Glu und L-Lys oder D-Glu und D-Lys zusammengesetzt waren, verursachten nur eine geringe oder überhaupt keine Änderung der Absorbanz in diesem Assay, was darauf hindeutete, daß Verbesserungspeptide, in denen die sauren und basischen Aminosäuren die gleiche stereochemische Konfiguration aufweisen, die Bindung des Farbstoff-Polymer-Konjugates in Immunoassays nicht wesentlich verbessern.
Mischungen von Homopolymeren von basischen und sauren Aminosäuren wurden auch auf die Hemmung des unspezifischen Bindens in dem TBG-Assay geprüft. Vor dem Zusatz zum Farbstoff-Polymer-Konjugat wurden äquimolare Mengen der Homopolymere in Wasser bei einem pH-Wert von 8,5 gemischt. Die erhaltenen Ergebnisse bei Verwendung einer Probe, die 60 Mikrogramm TBG pro Milliliter enthielt, sind in der folgenden Tabelle gezeigt. TABELLE 1 Absorbanzänderung (Milli-AU)
Proben a, b, c und g weisen akzeptable Eigenschaften zur Verbesserung der Bindung auf. Diese Ergebnisse weisen auch darauf hin, daß im Gegensatz zu einzelnen Verbesserungspeptiden, wo eine Mischung von stereochemischen Konfigurationen für die Aktivität entscheidend ist, bei der Verwendung von Homopolymeren in einem Komplex von Polymeren die gleiche stereochemische Konfiguration funktionell sein kann. Die Größe des Komplexes kann ebenso einen gewissen Einfluß auf die Aktivität ausüben.
Die folgende Tabelle (Tabelle 2) zeigt die Aktivität der Zusammensetzung in dem Bereich der normalerweise vorkommenden TBG-Konzentration im Plasma von Patienten. TBG-ANTIGENKONZENTRATION IN MIKROGRAMM PRO MILLILITER ABSORBANZÄNDERUNG BEI 492 NANOMETERN (MILLIEXTINKTIONSEINHEITEN)

BEISPIEL 4

T&sub4;-Assoziationbassay: Dieses Immunoassayformat basiert auf dem Zusatz eines Anti-T&sub4;-Farbstoffpolymers, das mit einer T&sub4; enthaltenden Probe reagiert wurde, gefolgt von dem Zusatz von auf einem Trägermaterial immobilisiertem T&sub3;, um das ungebundene Anti-T&sub4;-Farbstoff-Polymer-Konjugat einzufangen.
Einhundert Mikroliter einer 0,2 % Lösung aus 8-Anilinonaphthalinsulfonat (ANS) wurden zu T&sub4; enthaltenden Proben mit den in Tabelle 3 angegebeden Konzentrationen beigemischt, gefolgt von dem Zusatz von Anti-T&sub4;-Farbstoff-Polymer-Konjugat (8 AU), das zuvor mit 400 Mikrolitern einer 2,5 % Lösung des wie in Beispiel 2 hergestellten Verbesserungspeptids in Tris, pH-Wert 8,6, gemischt worden war. Ein Milliliter einer 50 % Gelsuspension, die kovalent gebundenes T&sub3; enthielt, wurde zuletzt beigemischt, und die Mischung wurde für 15-60 Minuten inkubiert. Die Absorbanz wurde bei 492 nm abgelesen und die Absorbanzänderung wurde ermittelt wie zuvor für die Probe beschrieben und berechnet. Bei Proben, die ungefähr 1 Nanogramm T&sub4; enthalten, beträgt die minimale akzeptable Verringerung der Absorbanz etwa 300 Milli-AU. Tabelle 3 unten zeigt die Immunreaktivität vom T&sub4;-monoklonaler Antikörper-Farbstoff-Polymer-Konjugat bei Verwendung mit dem 6:4 Verbesserungspeptid. TABELLE 3 T&sub4;-ANTIGEN-KONZENTRATION MIKROGRAMM PRO DEZILITER ABSORBANZÄNDERUNG BEI 492 NANOMETERN (MILLIEXTINKTIONSEINHEITEN)
Wurde die Untersuchung der Serumproben mit den oben genannten Reagenzien in Form von Tabletten durchgeführt, waren die Ergebnisse in Übereinstimmung mit denjenigen, die mit im Handel erhältlichen Testkits erhalten wurden.
Man stellte fest, daß in dem T&sub4;-Assoziationsassay ein statistisches Copolymer, das aus einem Verbesserungspeptid aus 6:4 D-Glu und L-Lys bestand, vergleichbar war mit einem Peptid aus 6:4 L-Glu und D-Lys in bezug auf die Steigerung der Aktivität (Absorbanzänderung 1.363 Milli-AU bzw. 1.166 Milli-AU nach 15 Minuten). Ein statistisches Copolymer aus 6:4 L-Asp und D-Lys entfaltete auch eine akzeptable Aktivitätssteigerung, mit einer Absorbanzänderung von 414 Milli-AU nach einer Stunde. Wurde an Stelle des Materials mit dem Verhältnis 6:4 ein Verbesserungspeptid mit dem Verhältnis 1:1 von L- Glu:D-Lys verwendet, bewirkte die zehnfache Abnahme der Menge des Verbesserungspeptids eine ähnliche und vergleichbare Absorbanzänderung wie das Material mit dem Verhältnis 6:4.

BEISPIEL 5

IMMUNOASSAY MIT HUMANEM CHORIONGONADOTROPIN

Es wurde eine Reagenslösung enthaltend 8 AU (0,1 mg) HCGmonoklonaler Antikörper, mit FITC markiertes, wie in Beispiel 1 hergestelltes Polymerkonjugat und 2,0 Milligramm eines 6:4 Verbesserungspeptids (wie in Beispiel 2 hergestellt) in 1, Millilitern 0,05 M Trispuffer, pH-Wert 8,5, hergestellt. Die Lösung wurde gemischt und bei Raumtemperatur 30 Minuten stehengelassen.
Zu einer Reihe von Röhrchen enthaltend 400 Mikroliter von 0, 100 und 200 Milli-I.E. von HCG in 0,05 M Trispuffer wurde 1, Milliliter der oben genannten Reagenslösung beigefügt. Die Röhrchen wurden dann 2 Stunden bei Raumtemperatur gemischt.
Dann wurden 2 Milliliter einer 50 % Gelsuspension in 0,05 M Trispuffer, pH-Wert 8,5, enthaltend Ziegen-Anti-HCG IgG, das durch das traditionelle Bromcyanverfahren an Ultragel kovalent gebunden war, beigemengt. Die Röhrchen wurden dann 2 Stunden bei Raumtemperatur gemischt. Eine Aliquote des Überstands wurde entnommen, mit Trispuffer verdünnt und die Absorbanz bei 492 Nanometern abgelesen. TABELLE HCG-Konzentration in Milli-I .E. * pro Röhrchen Absorbanzänderung bei 492 Nanometern Milliextinktionseinheiten * 1,0 Milli-I.E. = 1,3 Nanogramm

Claims

1. Reagens zur Bindungsanalyse umfassend ein Hauptpolypeptid umfassend Glutaminsäurereste und Lysinreste in einem solchen Verhältnis, daß das Hauptpolypeptid netto eine positive Ladung aufweist, wobei besagtes Hauptpolypeptid eine Molekülmasse von ≥ 2,0 x 10&sup5; Dalton aufweist; eine optische Farbstoffmarkierung, die an das Hauptpolypeptid kovalent gebunden ist, ein spezifisches Bindungsmolekül, das an das Hauptpolypeptid kovalent gebunden ist, und ein mit dem Hauptpolypeptid verbundenes Verbesserungspeptid, wobei besagtes Verbesserungspeptid eine Mischung umfaßt aus

a) sauren und basischen Aminosäuremonomerresten mit entgegengesetzten stereochemischen Konfigurationen oder

b) Mischungen von Homopolymeren von sauren Aminosäuren und basischen Aminosäuren, worin die Homopolymere die gleiche

oder verschiedene stereochemische Konfigurationen aufweisen können und worin besagtes Verbesserungspeptid elektrisch neutral ist oder netto eine negative Ladung aufweist.

2. Reagens zur Bindungsanalyse gemäß Anspruch 1, in dem das Hauptpolypeptid Lysin bzw. Glutaminsäure in einem Molverhältnis von ungefähr 4:1 enthält und eine Molekülmasse von ungefähr ≥ 3,8 x 10&sup5; Dalton aufweist.

3. Reagens zur Bindungsanalyse gemäß Anspruch 2, in dem das Verbesserungspeptid eine Molekülmasse von 2 x 10&sup4; bis 2 x 10&sup5; Dalton aufweist und ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Polypeptiden, die ein Molverhältnis der L-Glutaminsäure zu D-Lysing oder der D-Glutaminsäure zu L-Lysin, oder der L-Asparaginsäure zu D-Lysin von 1:1 bis 2:1 aufweisen.

4. Reagens zur Bindungsanalyse gemäß Anspruch 3, in dem der

optische Farbstoff Fluorescein ist und das Bindungsmolekül ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Antikörpern, Antigenen, Biotin und Avidin.

5. Reagens zur Bindungsanalyse gemäß Anspruch 4, in dem das Bindungsmolekül ein Antikörper zu TBG, ein Antikörper zu T&sub4;, ein Antikörper zu HCG oder ein Antikörper zu apo A&sub1; ist.

6. Reagens zur Bindungsanalyse gemäß Anspruch 1, in dem das Verbesserungspeptid eine Mischung von äquimolaren Mengen von Homopolymeren von sauren und basischen Aminosäuren ist, wo bei besagte Mischungen ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Poly-L-Lysin und Poly-L-Glutaminsäure, Poly-D-Lysin und Poly-L-Glutaminsäure, Poly-D-Lysin und Poly-D-Glutaminsäure.

7. Reagens zur Bindungsanalyse gemäß Anspruch 4, in dem das Hauptpolypeptid eine Molekülmasse von ungefähr 5-10 x 10&sup5; Dalton aufweist.

8. Reagens zur Bindungsanalyse nach Anspruch 7, in dem das Bindungsmolekül ein Antikörper zu T&sub4; ist; oder das Bindungsmolekül ein Antikörper zu TBG ist; oder das Bindungsmolekül ein Antikörper zu HCG ist.

9. Diagnostikverfahren in vitro für den Nachweis der Menge, der Anwesenheit oder Abwesenheit eines Zielmoleküls in einer flüssigen Probe, umfassend In-Kontakt-Bringen des Reagenzes nach einem der vorhergehenden Ansprüche mit einer flüssigen Probe für einen ausreichenden Zeitraum und unter für die Reaktion des Zielmolekül mit besagtem Reagens geeigneten Bedingungen, und Korrelieren des Ausmaßes, in dem die Reaktion stattgefunden hat, mit der Menge, der Anwesenheit oder Abwesenheit des besagten Zielmoleküls (zum Beispiel durch Bestimmung der optischen Absorbanz (z.B. bei einer Wellenlänge von 492 bis 499 nm) der flüssigen Phase und Bestimmung der Menge, der Anwesenheit oder Abwesenheit des Zielmoleküls in der Probe unter Bezugnahme auf eine Standardkurve).

10. Verfahren nach Anspruch 9, in dem der Schritt des Korrelierens durch Bestimmung der optischen Absorbanz der flüssigen Phase bei einer Wellenlänge von 492 nm bis 499 nm und durch Bestimmung der Menge, der Anwesenheit oder Abwesenheit des Zielmoleküls in der Probe unter Bezugnahme auf eine Standardkurve durchgeführt wird, und in dem das Bindungsmolekül, das an das Reagens zur Bindungsanalyse kovalent gebunden ist, ein Anti-T&sub4;-Antikörper, ein Anti-TBG- Antikörper, ein Anti-HCG-Antikörper oder ein Anti-ApoA- Antikörper ist.