DE2755008A1 - Verfahren zur immunologischen bestimmung mit hilfe von enzym-markierungen - Google Patents

Description

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Patentanmeldung

Anmelder: CARLO ERBA S.p.A.

Via Carlo Imbonati 24 20159 Milan, Italien

Titel: Verfahren zur immunologischen Bestimmung mit Hilfe von Enzym-Markierungen.

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Anmelder: Carlo Erba S.ρ

Beschreibung

Die Erfindung bezieht sich auf immunologische Bestimmungen mit Hilfe von Enzym-Markierungen und betrifft ein neues Verfahren zum Nachweis und zur Bestimmung von Antigenen, sowie auf Reagentien für dieses Verfahren. Der Ausdruck "Antigen", wie er hier verwendet wird, bedeutet nicht nur Substanzen, die selbst imstande sind, die Bildung von Antikörpern in Tieren hervorzurufen, d.h. Immunogene, sondern auch Substanzen, die manchmal als Haptene bezeichnet sind, die nach Konjugation mit einem Trägermolekül imstande sind, die Bildung von und Reaktion mit Antikörpern hervorzurufen.

Es besteht starkes theoretisches und praktisches Interesse daran, das Vorhandensein von Antigenen nachzuweisen und zu messen· Da solche Substanzen oft von komplexer und häufig unbekannter chemischer Struktur sind und in sehr geringen Konzentrationen in biologischen und anderen Materialien vorkommen, ist es nicht möglich, übliche analytische Verfahren anzuwenden. Deshalb wurden in den letzten Jahren zahlreiche Verfahren entwickelt, die auf der Antigen-AntikörperReaktion beruhen, bei der eine Komponente der Reaktion mit einer radioaktiven Markierung oder z.B. mit einem Enzym gekennzeichnet ist, so daß die Reaktionsprodukte oder in einigen Fällen das nicht verbrauchte Reagens nachgewiesen und/oder gemessen werden können. Während Verfahren, die auf der Anwendung radioaktiver Markierungen beruhen, verschiedene

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theoretische Vorteile besitzen, insbesondere die Tatsache, daß mit bestimmten Arten von Markierungen, besonders solchen, die Tritium oder C anwenden, die radioaktive Markierung selbst bei der Antigen-Antikörper-Reaktion nicht stört, treten bei der Anwendung dieses Verfahrens verschiedene Nachteile auf. Insbesondere ist es notwendig, Vorrichtungen zur Messung der Radioaktivität zur Verfugung zu haben, die Laboranten vor möglichen schädlichen Wirkungen der Radioaktivität zu schützen und den radioaktiven Abfall entsprechend zu beseitigen. Viele radioaktive Markierungen müssen in regelmäßigen Zeitabständen verworfen werden aufgrund des radioaktiven Zerfalls des radioaktiven Isotops. Außerdem kann es schwierig sein, niedermolekulare Antigene radio-

ohne
aktiv zu markieren V ihre antigenen Eigenschaften wesentlich zu zerstören. Beachtliches Interesse haben daher Verfahren hervorgerufen, bei denen eine Antigen-Antikörper-Reaktion angewandt wird unter Anwendung eines Reagens , bei dem ein Enzym als Markierung dient. Derartige Verfahren sind einfach durchzuführen mit Hilfe verhältnismäßig einfacher Vorrichtungen und sind nicht gesundheitsgefährdend. Trotzdem haben manche bekannte Verfahren den Nachteil, daß zu ihrer Durchführung ein Konjugat aus dem als Markierung angewandten Enzym und dem zu bestimmenden Antigen hergestellt werden muß. Die Herstellung dieser Konjugate ist nicht immer einfach, da die Enzymaktivität des Enzyms, das ein Teil des Konjugats ist, erhalten bleiben muß und es ist besonders unbequem, ein getrenntes Konjugat für jedes einzelne Antigen herzustellen, das nachgewiesen bzw« bestimmt werden soll. Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren kann andererseits ein einziges enzymhaltiges Konjugat für eine Vielzahl von Antigenen angewandt werden. Tatsächlich kann prinzipiell ein einziges derartiges Konjugat für alle Antigene angewandt werden.

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Es ist bekannt (Engvail et al, J. Immunology 109 (1972) S. 129), Antikörper zu bestimmen durch Umsetzung mit Antigenen auf einem unlöslichen Träger und anschließende Reaktion des auf den Träger enthaltenen Antigen-Antikörper-Konjugats mit einem enzymmarkierten Anti-Immunoglobulin, von dem bekannt ist, daß es mit dem Antikörper des Konjugats reagiert. Bei diesem Verfahren hängt die Menge an Enzymen, die schließlich an den Träger gebunden wird, ab von der Antikörpermenge in der zu untersuchenden Probe, da das Enzym an den Träger gebunden wird über eine Kette» in der der zu bestimmende Anti» körper ein wichtiges und unterscheidbares Glied darstellt.

Das erfindungsgemäße Verfahren zur Durchführung immunologischer Bestimmungen mit Hilfe einer Enzymmarkierung besteht darin, daß man gleichzeitig oder nacheinander in einem flüssigen Medium 1.) ein Antigen (wie eingangs definiert) auf einem unlöslichen Träger oder in Form eines unlöslichen Aggregats, 2») einen ersten Antikörper (wie später näher erläutert wird) und 3.) einen enzymmarkierten zweiten Antikörper (wie später näher erläutert wird) zusammenbringt, den unlöslichen von dem löslichen Anteil trennt und die Enzymaktivität in einer der beiden Phasen mißt.

Die Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, daß der erste Antikörper (2) auch mit einer Probe zusammengebracht wird, die das nachzuweisende oder zu bestimmende Antigen enthält, das das gleiche oder ein anderes sein kann, wie das Antigen (1). Dadurch wird der zweite Antikörper (3) an das unlösliche Material im umgekehrten Verhältnis zu der in der Probe vorhandenen Antigenmenge gebunden, wodurch das Vorhandensein oder die Menge des Antigens in der Probe bestimmt werden kann. Der Ausdruck "erster Antikörper", wie er hier verwendet wird, bedeutet einen Antikörper, der imstande ist, sowohl mit dem Antigen auf dem unlöslichen Träger als auch mit dem nachzu-

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weisenden bzw. zu bestimmenden Antigen Bindungen einzugehen« Der Ausdruck "zweiter Antikörper" bedeutet einen zu allen Antikörpern der Immunoglobulinklasse, zu der der erste Antikörper gehört, z.B. allen Schaf IgG, Kaninchen IgG oder Kaninchen IgM, spezifischen Antikörper. Wenn z.B. der erste Antikörper ein in einem bestimmten Tier, z.B. einem Schaf, gebildetes Immunoglobulin ist, dann ist der zweite Antikörper ein Antikörper gegen Immunoglobuline dieser Art ohne Berücksichtigung ihrer eigenen Antikörperspezifitäten, der in einem anderen Tier, z.B. einem Esel, erzeugt worden ist.

Das neue Verfahren kann leicht für den Nachweis und die Bestimmung einer Vielzahl von Antigenen angewandt werden. Neben echten Antigenen, wie Serum und Gewebeproteinen wie «..-Fötoprotein, ^p-Haptoglobulin und Carcinoembryonantigen, können auch Haptene, wie Hormone, z.B. Triiodthyronin, Norepinephrin, thyroidstimulierende Hormone, follikelstimulierende Hormone, lutetiisierendes Hormon, Insulin und Thyroxin, Steroide, z.B. Cortisol, Progesteron, Östron, östradiol und Testosteron, Arzneimittel, wie z.B. Morphin, Amphetamin, Barbiturate, Diphenylhydantoin, Methotrexat und Gentamycin, Vitamine und Nahrungsmittelschadstoffe, z.B. Pyridoxal-5-phosphat und Aflotoxin, Herbicide, Insecticide und Nitrosoharnstoffe, nachgewiesen bzw. bestimmt werden. In jedem Falle muß das Antigen entweder chemisch oder^weniger günstig,physikalisch an einen geeigneten Träger gebunden sein, z.B. auf die später näher beschriebene Weise.

Es ist festzustellen, daß die Art des enzymmarkierten zweiten Antikörpers nicht von dem zu bestimmenden Antigen abhängt. Es ist lediglich erforderlich, daß der erste Antikörper in einem Tier der gleichen Art gebildet worden ist, wie

/ ' ctas Tmmunoglobulin liefert, das angewandt wird, um die Bildung des zweiten Antikörpers in einer anderen Tierart hervorzurufen. Es iat daher nicht erforderlich, eine

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große Vielzahl von enzymmarkierten Antikörpern zur Verfügung zu haben und die Schwierigkeiten, die bei der Bindung von Enzymen an Antikörpern auftreten, müssen nur einmal gelöst werden·

Es kann irgendein Enzym als Markierung für den zweiten Antikörper angewandt werden« Oxidasen, wie Meerretti^chperoxidase, hydrolytische Enzyme, wie alkalische Phosphatase oder Dehydrogenasen, wie Glukose-6-phosphatdehydrogenase sind besonders geeignet· Besonders günstig sollte ein Enzym, das als Markierung angewandt wird, die folgenden Eigenschaften besitzen: 1·) Es sollte relativ billig in hoher Reinheit verfügbar sein. 2·) Es sollte eine hohe Aktivität pro Gewichtseinheit besitzen· 3·) Es sollte leicht wasserlöslich und unter üblichen Lagerbedingungen stabil sein. 4.) Es sollte es ermöglichen, ein Bestimmungsverfahreη anzuwenden, das einfach, schnell, empfindlich und billig ist. 5·) Es sollte in biologischen Flüssigkeiten nicht vorhanden sein und 6.) biologische Flüssigkeiten sollten keine Substraünhibitoren oder Aktivatoren für das Enzym enthalten und 7.) sollte es geeignete chemische Gruppierungen enthalten, die eine Konjugation mit einem zweiten Antikörper ermöglichen, die nur einen minimale Wirkung sowohl auf die Aktivität des Enzyms als auf des Antikörpers ausübt. ß-Galactosidase erfüllt diese Forderungen· Andere ebenfalls anwendbare, aber weniger bevorzugte Enzyme sind GIucoseoxidase, Acetylcholinesterase, Glucoamylase, Lysozym, Glulcose-6-phosphatdehydrogenase und Malatdehydrogenase·

Das Enzym wird vorzugsweise an den zweiten Antikörper mit Hilfe eines unten näher beschriebenen Kupplungsverfahrens gebunden, das anwendbar ist auf jede beliebige Kombination von Antikörper und Enzym, vorausgesetzt, daß dasletztere eine Mercaptogruppe enthält oder so modifiziert werden kann,

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daß es eine solche enthält. Andere Kupplungsverfahren können gegebenenfalls jedoch ebenfalls angewandt werden. Diese sind unter anderem
a.) einstufige Glutaraldehyd-Bindung, bei der der Glutaraldehyd angewandt wird, um Proteine in einer komplizierten Reaktion

von
unter Bildung /heterogenen; hochmolekularen Kon j ugaten zu binden (Ävrameas, S., Immunochemistry 6,43 (1969)), b.) Zweistufige Glutaraldehydbindung, bei der das Enzym Meerrettichperoxidase nur mit einem Molekül Glutaraldehyd reagiert. Dadurch wird die Enzym-Enzym-Konjugation begrenzt und dieses Verfahren stellt eine Verbesserung des einstufigen Verfahrens dar. Es ist jedoch wahrscheinlich auf zahlreiche andere Enzyme nicht anwendbar, da diese mit mehr als einem Molekül Glutaraldehyd reagieren (s. Ävrameas. S und Ternynck, Immunochemistry 8,1175 (1971)).

und folgende .) Oxidation von Saccharidresten in dem Enzyny nach/Bildung einer Schiff'schen Base. Meerrettichperoxidase besitzt verschiedene Oligosaccharidgruppen und deren Oxidation zu Aldehydgruppen (mit Hilfe von Periodat), die mit Aminogruppen reagieren können, ist die Grundlage für dieses Bindungsverfahren. Andere Enzyme enthalten ebenfalls Oligosaccharidgruppen und können im Prinzip ebenfalls angewandt werden«, Bei diesem Verfahren entstehen jedoch hochmolekulare Konjugate (Nakane P.K. + Kawaoki, A· J· Histochem« Cytochem. 22,1084 (1974)).

d) Dimaleinimid-Bindung unter Verwendung von Ν,Ν'-o-Phenylendimaleinimid nach Einführung von -SH-Gruppen in den Antikörper mit Hilfe von 2-Mercaptoäthylamin, das vorher bestehende -S-S-Brücken in zwei -SH-Gruppen spaltet. (Kato et al European J. Biochem. 62,285 (1976)).

e) Andere bifunktionelle Reagentien, die angewandt werden können, sind unter anderem p*p'-Difluor-mjm'-dinitrophenyl-

1-Cyclohexyl-3-(2-morpholinäthyl)-carbodiimid. Diese führen jedoch im allgemeinen zu weniger günstigen Ergebnissen als die oben beschriebenen.

* Toluylen-2,4-diisocyanat

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f) Eine Bindung kann auch erreicht werden mit heterobifunktionellen Reagentien, d«h. Reagentien, die zwei unterschiedliche funktioneile Gruppen in einem Molekül enthalten, z.B· m-Maleinimidobenzyl-N-bydroxysuccinimidester, der in einer zweistufigen Reaktion zur Kupplung von Insulin an ß-Galactosidase angewandt wurde.

(T. Kitagawa + T. Aikawa J. Biochem. 79,233-236 (1976)).

g) Nicht-kovalente Vernetzung durch beispielsweise Kupplung von Antikörpern an Meerrettichperoxidase untex· Bildung eines Konjugates, das nicht kovalent gebunden, aber verhältnismäßig stabil ist. Dieses Verfahren besitzt die Nachteile, daß sich

1. das Enzym-Antikörper-Konjugat bei der Lagerung langsam spaltet,

2. die Antikörper die Enzyme, gegen die sie entstanden sind, hemmen können und

3. die Antikörper mehrere Monate zu ihrer Bildung brauchen und Antikörper, die in verschiedenen Anaätzen erzeugt worden sind, unterschiedliche Eigenschaften besitzen.

Aufgrund der höheren Geschwindigkeit und Bequemlichkeit, die mit der Handhabung verhältnismäßig großer Mengen Antikörper verbunden ist, ist es häufig günstig, wenn die ersten und zweiten Antikörper in verhältnismäßig großen Tieren, wie Pferden, Esel oder Schafen, gebildet werden und nicht in kleinen Tieren, wie Ratten, Mäusen, Meerschweinchen oder Hamstern, obwohl die Anwendung derartiger Tiere ebenfalls möglich ist. Wie oben gesagt, müssen die ersten und zweiten Antikörper in verschiedenen Tierarten gebildet werden. Es hat sich als günstig erwiesen, die ersten Antikörper in Schafen und die zweiten in Eseln zu bilden, während jedoch, wenn das günstiger erscheint, auch irgendein anderes Tierpaar verwendet werden kann.

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Die Möglichkeit, daß der zweite Antikörper die Reaktion zwischen Antigen und erstem Antikörper stört, wird verringert, wenn der zweite Antikörper nicht gegen den gesamten ersten Antikörper gebildet worden ist, sondern nur gegen das Fc-Fragment des Immunoglobulins, das den ersten Antikörper ausmacht.

Die zweiten Antikörper können im wesentlichen auf bekannte Weise hergestellt werden, aber das bevorzugte Verfahren besteht darin, die Tiere zunächst ein erstesmal zu impfen, dann die Bildung von Antikörpern abzuwarten und wenn die Antikörpergehalte im Serum ihren Höchstwert überschritten haben, nochmals nachzuimpfen. Das Blut enthält normalerweise maximale Antikörpergehalte kurz nach der zweiten Impfung. Wenn ein ausreichend hoher Gehalt (oder maximaler Gehalt) an Antiimmunoglobulin sich in dem Blutstrom des Tieres angesammelt hat, wird diesem Blut entnommen und das Serum, das das Antiimmunoglobulin enthält, abgetrennte/Der zweite Antikörper wird vorzugsweise gereinigt durch Inkubieren des Esel-Anbiserums mit einem entsprechenden Immunoadsorbena, z.B. Sepharose oder einem anderen unlöslichen Träger, der aktiviert worden ist, indem man ihn zunächst mit einem geeigneten bifunktionellen Reagens, z.B. 1,4-bis(2,3-Epoxypropoxy)butan,umgesetzt hat und dann mit einer Lösung des Immunoglobulins (oder Fc-Fragment davon), das angewandt worden isb zur Bildung des zweiten Antikörpers. Hierbei entsteht ein Immunoadsorbens, das für den zweiten Antikörper spezifisch ist und dieser kann gereinigt werden durch Adsorption an das Immunoadsorbens und anschließende Elution vor oder nach der Markierung mit einem Enzym.

Um den markierten zweiten Antikörper herzustellen, ist es bevorzugt, das Immunoadsorbens, an dem der zweite Antikörper adsorbiert ist, mit einem Reagens, wie Methylmercaptobutyrimidat-hydrochlorid zu behandeln und dadurch die Aminogruppen in dem Antikörper zu modifizieren und 3 bis 5 Thiolgruppen in jedes Antikörpermolekül anzuführen. Der zweite Antikörper,

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der Mercaptogruppen enthält, wird dann von dem Immonoadsorbens eluiert und so behandelt, daß das Enzym daran gebunden wird. Vorzugsweise wird er mit N,N^l-o-Phenylen-bis-maleinimid behandelt und dann umgesetzt mit gereinigter ß-Galactosidase, die üblicherweise gebildet wordenlist von Escherichia coli« Das Konjugat aus Enzym und zweitem Antikörper wird schließlich durch Chromatographie über ein Diäthylaminoäthylagarosegel oder ein anderes geeignetes Adsorbens gereinigt, um das Konjugat von nicht-umgesetztem Enzym und nicht-umgesetztem zweiten Antikörper zu trennen«

Der erste Antikörper wird in einem entsprechenden Tier nach bekannten Verfahren gebildet« Wenn, was häufig der Fall ist, das nachzuweisende bzw. zu bestimmende Antigen ein Hapten mit einer verhältnismäßig einfachen chemischen Struktur, z«B. Trijodthyronin, Östradiol, Gentamycin, Phenytoin oder Morphin ist, ist es nicht imstande, selbst die Bildung des ersten Antikörpers hervorzurufen. Es ist daher notwendig, das Antigen mit einem Trägermolekül zu konjugieren, um ein konjugiertes Molekül zu erhalten, das imstande ist, die Bildung eines Antikörpers hervorzurufen. Zu diesem Zweck ist es günstig, das Antigen mit einem leicht verfügbaren Protein zu kuppeln, das für das Tier, in dem der erste Antikörper gebildet werden soll, fremd ist, z.B. mit Rinderserumalbumin (BSA). Die Konjugierung kann durchgeführt werden durch Umsetzung des Albumins oder anderen Proteins mit beispielsweise 1-Äthyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimid und anschließende Umsetzung des Produktes mit dem Antigen, das für diese Reaktion eine Amino- oder Carbonsäuregruppe enthalten muß. Andere bekannte Verfahren zur Konjugierung können gegebenenfalls angewandt werden« Idealerweise sollten ungefähr 3 bis 30 Moleküle Antigen an jedes Molekül Albumin oder sonstiges hochmolekulares Protein gebunden werden«

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Der erste Körper kann gebildet werden, indem man einem geeigneten Tier, z.B. einem Schaf, das Antigen oder Antigenkonjugat wiederholt innerhalb eines Zeitraumes von Wochen oder Monaten injiziert bis ein ausreichend hoher Antikörper mit den erwünschten Bindungseigenschaften sich in dem Tierblut gebildet hat. Dem Tier wird dann Blut entnommen und das Antiserum abgetrennt.

Der erste Antikörper wird dann vorzugsweise gereinigt durch Berührung mit dem Antigen,gegen das er gebildet worden ist, oder einer ähnlichen Verbindung auf einem unlöslichen Träger. Nach Absorption können die Antikörper eluiert werden, z.B. mit (Euanidiniumhydrochlorid-Lösuny mit einem hohen oder niederen pH-Wert mit Lösungen hoher Salzkonzentration oder mit nicht-wäßrigen Lösungsmitteln und dann gegen einen ge-

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eigneten Puffer dialysierx, um das Eluierreagens zu entfernen.

Der unlösliche Träger, der angewandt wird, um das Antigen oder die ähnliche Verbindung sowohl bei dem Reinigungsverfahren als auch bei dem erfindungsgemäßen Verfahren zu binden, kann irgendeine wasserunlösliche Substanz sein, an die das Antigen oder die verwandte Verbindung bequem gebunden werden kann, um ausreichend sicherzustellen, daß sie während der Umsetzungen, die bei der Reinigung oder Bestimmung auftreten, gebunden bleiben. Während es möglich ist, einen Träger zu verwenden, der das Antigen einfach adsorbiert, wie bei dem von Engvall et al a.a.O. beschriebenen Verfahren, ist es bevorzugt, das Antigen chemisch an den Träger zu binden und das bedeutet, daß es erforderlich ist, daß der Träger funktionelle Gruppen enthält, über die die notwendigen Reaktionen stattfinden können. Träger, wie Glas, Nylon, Polyacrylamid, Cellulose oder Dextran können angewandt werden. Bestimmte Arten von Immunoadsorbentien, die Hydroxylgruppen enthalten,

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können umgesetzt werden mit 1,4-bis(2,3-Epoxypropoxy)-butan und das Produkt kann mit dem Antigen umgesetzt werden· Dieses Verfahren hat sich als einfach, sicher und wirksam erwiesen und gibt eine stabile kovalente Bindung, vorausgesetzt, daß das Antigen oder die verwandte Verbindung Hydroxyl-,· Amino- oder Thiolgruppen enthält. Die Erfordernisse an das Immunoadsorbens zur Reinigung von Antikörpern sind nicht notwendigerv/eise die gleichen, wie an das Immunoadsorbens für die tatsächliche Bestimmung«

Das erfindungsgemäße Verfahren kann auf eine Vielzahl verschiedener Arten durchgeführt werden. Die Menge an erstem Antikörper und damit Markierung, die an das unlösliche Antigen gebunden wird, ist umgekehrt proportional der Menge an Antigen in der Probe, die bestimmt werden soll. Die Enzymaktivität entweder in der freien Phase oder gebunden an das unlösliche oder auf dem Träger befindliche Antigen, wird gemessen. Einige spezielle Arten zur Durchführung des Verfahrens werda^tm folgenden angegeben.

Bei einem ersten Verfahren wird der erste Antikörper mit der das zu bestimmende Antigen enthaltenden Probe inkubiert· Nach vollständiger Reaktion wird das auf dem Träger enthaltene Antigen zugegeben und das Gemisch erneut inkubiert. Die feste Phase wird dann von der flüssigen Phase abgetrennt, gewaschen und mit einem Überschuß des enzymmarkierten zweiten Antikörpers vermischt. Nach der Inkubation wird die feste Phase erneut abgetrennt und gewaschen. Die Aktivität, die sich in der unlöslichen Fraktion (feste Phase) findet, ist umgekehrt proportional zu der in der Probe vorhandenen Antigenmenge, die Aktivität in der überstehenden Flüssigkeit ist der Antigenmenge direkt proportional. Es kann jede Fraktion gemessen werden.

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Bei einem zweiten Verfahren wird der erste Körper mit dem enzymmarkierten zweiten Antikörper unter Bildung eines Komplexes umgesetzt, der dann zu einem Überschuß der Probe, die das zu bestimmende Antigen enthält, zugegeben und inkubiert wird. Der unlösliche Träger, der das Antigen enthält, wird dann zugegeben und nach der Inkubation werden die feste und flüssige Phase getrennt. Die Bestimmung der Enzymaktivität in der flüssigen Phase ergibt einen Viert, der direkt proportional isc der Menge an Antigen in der Probe.

Bei einem dritten Verfahren wird der Komplex aus erstem und zweiten Antikörper, die das zu bestimmende Antigen enthaltende Probe und der das Antigen enthaltende Träger, gleichzeitig inkubiert und nach Abtrennung der festen Phase wird die Enzymaktivität der flüssigen Phase bestimmt. Das Ergebnis ist wieder der Konzentration des Antigens in der Probe direkt proportional.

Wie oben gesagt, muß zur quantitativen Bestimmung nach dem ersten und zweiten oben erwähnten Verfahren die Menge an erstem Antikörper größer sein als diejenige, die erforderlich ist mit dem gesamten Antigen in der Probe zu reagieren und der das Antigen enthaltende Träger muß in einem ausreichenden Überschuß zugesetzt werden, um eine Adsorption des gesamten Antikörpers sicherzustellen, der nicht mit dem Antigen in der Probe reagiert hat. Praktisch besteht die einfachste Weise, das sicherzustellen darin, daß man eine Reihe von Bestimmungen mit unterschiedlichen Konzentrationen an erstem Antikörper in geometrischen oder arithmetischen Reihen durchführt· Nachdem das erfolgt ist, ist es einfach, eine entsprechende Konzentration an erstem Antikörper zu bestimmen, die eine genaue Durchführung der Bestimmung ermöglicht.

Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele näher erläutert.

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Beispiel 1

1« Bildung und Markierung des zweiten Antikörpers.

a) Herstellung des F_c-Fragments von Schaf-Immunoglobulin (IgG). Das zur Herstellung von Schaf-F.-Fragment angewandte Verfahren beruht auf dem von Porter (R.R. Porter, 1959, Biochem. J. 73, 119) beschriebenen Verfahren. 320 ml Sera wurden von 28 Schafen zusammengegeben. 150 ml Serum wurden unter Rühren im Eisbad mit 30 g feuchtem Diäthylaminoäthyl (DEAE)-A 50 Sephadex, das vorher mit 10 mMol Phosphatpuffer, pH 6,5, equilibriert war, inkubiert. Nach 1 h wurde das Gel auf einer groben Glasfritte abfiltriert und mit 50 ml 10 m-molarem Phosphatpuffer, pH 6,5, gewaschen. Das Piltrat und die VJaschflüssigkeiten wurden erneut mit 30 g feuchtem DEAE-Sephadex inkubiert, filtriert und mit 100 ml Phosphatpuffer gewaschen. Das Filtrat und die Waschflüssigkeiten (300 ml) wurden mit 150 ml gesättigter (NH.JgSO.-Lösung behandelt, die langsam unter kontinuierlichem Rühren zu der Lösung gegeben wurde. Der Niederschlag wurde gesammelt und mit 100 ml 20 ?6-iger (NH.^SOa"¹·⁰³¹¹¹¹? gewaschen. Der entstehende Niederschlag wurde in 50 ml 50 m-molarem Phosphatpuffer, pH 3,0, gelöst und über Nacht bei 4⁰C gegen 5 1 destilliertes Wasser dialysiert. Die Lösung wurde danu gefriergetrocknet.

150 g so erhaltenes, gefriergetrocknetes Schaf-IgG wurden in 50 ml 0,1 m Tris-HCl-Puffer, pH 7,2, enthaltend 10 mMol Cystein und 2 mMol EDTA, gelöst. Der Puffer wurde unmittelbar vor der Anwendung hergestellt. 0,6 ml einer kristallinen Suspension von Papain (Sigma^ zweimal umkristallisiert) in 50 mMol Acetatpuffer, pH 4,5, wurden zugegeben. Die Lösung wurde 4 h unter gelegentlichem Schütteln bei 37⁰C lnkubiert. 0,222 g Jodacetamid wurdei dann zugegeben und die Lösung sofort auf eine Säule (80 χ 5 cm) G 100 Sephadex, die mit 10 m-molarem Acetatpuffer, pH 5,6, bei 4⁰C equiliwar, aufgebracht. briert

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Der zweite mit 10 m-molarem Acetatpuffer bei pH 6,5 eluierte Peak enthielt ein Gemisch von F -und F . -Fragmenten· Der

eau ,.

erste Peak enthielt nicht aufgetrenntes IgG. Der zweite Peak wurde auf eine Säule (40 χ 2,5 cm) von Carboxymethylcellulose (Whatman CM 32), die mit 10 mMol Acetatpuffer, pH 5,6, bei 4⁰C equilibriert war, aufgebracht. Eeim Waschen mit 10 mMol Acetatpuffer, pH 5,6, wurde ein Peak eluiert und einige kleinere Peaks bzw. Fraktionen und ein größerer Peak wurden eluiert, wenn ein Gradient von 10 bis 500 mMol Acetat, pH 5,6, aufgebracht wurde (1 000 ml in jeder Kammer des Gradientenmischers). Der Hauptpeak wurde gesammelt und erneut über die Carboxymethylcellulosesäule chromatographiert. Diesmal wurde ein Gradient von 10 bis 300 mMol Acetatpuffer, pH 5,6, mit 1 000 ml in einem Mischgefäß angewandt. Es wurde ein einziger Peak eluiert. Dieser wurde gesammelt, ausgiebig gegen destilliei tes Wasser dialysiert und gefriergetrocknet.

b) Herstellung des zweiten Antikörpers (Esel-Antischaf-Immunoglobulin).

Es wurde eine stabile Emulsion hergestellt durch Vermischen von ein Teil Salzlösung, enthaltend F -Fragment (0,75 mg/ml) und Bacillus Calmette-Guerin (1,5 mg/ml) mit zwei Teilen Marcol 52 Adjuvans. In das untere Bein wurden sechsmal 1 ml der Emulsion intramuskulär injiziert. Die Bildung der Esel-Antischaf-Antikörper wurde überwacht und das Tier nach 2 Monaten erneut geimpft. Eine Emulsion, bestehend aus zwei Teilen Adjuvans auf einen Teil Salzlösung (Schaf F„ 0,75 mg/ml)

wurde an sechs Stellen (0,5 ml) in das untere Bein intraspäter / muskulär injiziert. Die Blutproben zeigten 10 Tage / und /

' während des nächsten Monatr. einen hohen Gehalt an Antikörpern.

c) Herstellung von Immunoadsorbens zur Reinigung von Esel-Antischaf-Immunoglobulin.

Sepharose 4B wurde aktiviert mit 1,4-bis-(2,3-Epoxypropoxy)-butan durch Inkubieren gleicher Volumina des Gels, des Bisepoxids und 0,6 m NaOH, enthaltend 2 mg Natriumborhydricl pro

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ml unter kontinuierlichem Rühren, 8 b bei 25⁰C und anschließendes Waschen. Schaf-IgG wurde hergestellt aus einem Pool von normalem Serum durch Ausfüllen mit 33 #-iger Ammoniumsulfatlösung· Eine Lösung des Schaf-IgG in 0,1 m NaHCO,-Puffer, pH 10, wurde zugegeben unter Anwendung von 10 mg Schaf-IgG pro ml Gel. Das aktivierte Gel wurde 48 h mit dem IgG inkubiert und das Immunoadsorbens schließlich gewaschen und mit 0,1 m Äthanolamin, pH 10, 24 h behandelt.

d) Reinigung und Markierung von Esel-Antischaf-zweitem Antikörper. Esel-Antischaf-Immunoglobulin wurde gereinigt durch Inkubieren von Esel-Antiserum (wie oben hergestellt) mit dem Immunoadsorbens· Thiolgruppen wurden in das Immunoglobulin eingeführt, während es an dem Immunoadsorbens adsorbiert war mit Hilfe von Methyl-4-mercaptobutyrimida1/HCl, um die Amminogruppen des Immunoglobulins zu modifizieren. Der Einbau dieser Gruppen wurde so begrenzt, daß man 3 bis 5 Thiolgruppen pro GlobulinmolekUl erhielt.

Der Immunoadsorbens-Antikörper-Komplex wurde gewaschen und in 0,1 m N-Äthylmorpholin χ HCl, pH 7_f5, in einer Konzentration von 1 ml Immunoadsorbens in einem Gesamtvolumen von 10 ml suspendiert. Eine Lösung von Methyl-4-mercaptobutyrimidat χ HOl in 0,5 m Na₃CO₅ (10 mg/ml) wurde unmittelbar vor der Anwendung hergestellt. 0,1 ml dieser Lösung wurden dann zu jeweils 10 ml Suspension gegeben. Die Suspension wurde 30 min bei Raumtemperatur gerührt und dann mit 0,1 m N-Äthylmorpholin χ HCl, pH 7,5, enthaltend 1 mg Dithiothreitol pro 10 ml Puffer, gewaschen. Das Gel wurde dann gründlich mit HCl, enthaltend 0,1 m NaCl bis pH-Wert 3,5, gewaschen.

Das so erhaltene Thiolgruppen-enthaltende Immunoglobulin wurde mit 0,1 m NaCl enthaltender HCl bei einem pH-Wert von 2,5 gewaschen. Das bequemste Verfahren, dies zu erreichen,

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bestand darin, das Immunoadsorbens in eine kleine Kolonne zu füllen und den Auslauf in Puffer enthaltenden Röhrchen bzw· Gläsern zu sammeln· Da die nächste Herstellungsstufe in 0,1 m Acetatpuffer, pH 5,0, durchgeführt wurde, wurde der Auslauf in ausreichend 0,1 m Acetat, pH 6,0, gesammelt, um einen pH-Wert von 5»0 zu ergeben.

2 ml 0,1 m Acetatpuffer, pH 5»O, enthaltend 2,5 mg des mit Diolgruppen modifizierten Immunoglobulins, wurden in einem Eisbad gekühlt. Diese Lösung wurde dann langsam zu 1 ml gesättigter Lösung von Ν,Ν-o-Phenylen-bis-maleinimid in 0,1 m Acetatpuffer, pH 5,0, in einem Eisbad zugetropft· Das Gemisch wurde anschließend 20 min bei 3O⁰C inkubiert· Daa Immunoglobulin wurde dann von überschüssigem Ν,Ν'-ο-ΡηβηνΙβα-bis-maleinimid getrennt durch Durchleiten der Lösung durch eine Säule (20 χ 1,5 cm) von G 25 Sephadex, das bei Raumtemperatur mit 0,01 m Phosphatpuffer, enthaltend 0,01 m MgCl₂, pH 6,0, equilibriert war.

5,0 mg mit Ammoniumsulfat ausgefällte ß-Galaktosidaae von Escherichia coli wurden in der gereinigten aktivierten Immunoglobulinlösung gelöst und 4 h bei 3O⁰C inkubiert· Es wurde ausreichend 1 η NaOH zugegeben, um den pH-Wert des Reaktionsgemisches auf 7,5 einzustellen und ausreichend 2 m 2-Mercaptoäthanol, um eine Endkonzentration von 10 mMol zu ergeben.

Die Immunoglobulin-Enzym-Konjugat-Lösung wurde auf eine Säule (60 χ 0,9 cm) DEAE-Agarose (Biogel), die bei 4⁰C mit 10 mMol Tris-HCl-Puffer, pH 7,5, enthaltend 10 mMol 2-Mercaptoäthanol, 10 mMol MgCIp und 50 mMol Natriumchlorid, equilibriert war, gegeben. Die Lösung wurde mit dem Equilibrierungspuffer auf die Säule gegeben. Ein Gradient von 50 bis 200 mMol

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JA-50 235

Natriumchlorid in dem gleichen Puffer wurde mit 250 ml in dem Mischgefäß aufgebracht· Nioht mit Enzym konjugiertes Immunoglobulin wurde nicht an die Säule adsorbiert und vor dem Aufbringen des Gradienten eluiert. Wenn der Gradient aufgebracht wurde, wurde das mit Enzym markierte Immunoglobulin vor dem freien Enzym eluiert· Die eluierte Fraktion, die das markierte Immunoglobulin enthielt, wurde gefriergetrocknet, um den mit Enzym markierten zweiten Antikörper für das erfindungsgemäße Verfahren zu erhalten«

2. Bildung des ersten Antikörpers·

a) Herstellung von Trijodthyronin (T,) Konjugat·

250 mg Rinderserumalbumin (BSA) wurden in 25 ml destilliertem Wasser gelöst und 1 000 mg 1-Ä*thyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimld (EDC) wurden in 50 ml destilliertem Wasser gelöst. Beide Lösungen wurde auf 4⁰C gekühlt und 2/3 der EDC-lösung langsam mit der SSA-Lösung vermischt· 150 mg gereinigtes T, wurden in 25 ml Äthanol : 2 m NH^ÖH (25 : 1, Vol/Vol) gegeben und die Lösung auf 4⁰C abgekühlt und zu dem Gemisch unter kontinuierlichem Rühren zugetropft, wobei der pH-Wert durch tropfenweise Zugabe von 0,25 m HCl auf 7,0 gehalten wurde. Das Reaktionsgemisch wurde weitere 10 min gerührt und die restliche EDC-Lösung unter Aufrechterhaltung eines pH-Wertes von 7»0 zugetropft.

Das Gemisch wurde über Nacht bei 4⁰C gerührt. Am Morgen wurde die Lösung zentrifugiert und die überstehende Flüssigkeit bei dreimaligem Wechsel gegen 0,1 m Na₂CO₅ZNaHCO₅, pH 11,0, und dann destilliertes Wasser dialysiert. Das Produkt wurde schließlich gefriergetrocknet« Es zeigte sich, daß 4*3 Mol T, pro Mol BSA eingebaut bzw. gebunden worden war·

b) Bildung des ersten Antikörpers.(T,-Antikörper)·

Es wurde eine stabile Emulsion hergestellt durch Vermischen von 1 Teil Salzlösung, enthaltend Tween 80 (50 #) T^ Rinderserumalbumin (2 mg/ml) und Bacillus Calmette-Guerin (BCG

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¹*-50 235

1 mg/ml) mit zwei Teilen Marcol S2 Adjuvana. Seche Anteile von je 1 ml der Emulsion wurden subkutan in den Rücken und vier Anteile von 0,75 ml intramuskulär in die Beine injiziert. Die Antikörpertiter wurden überwacht und nach 36 Wochen wurden die Tiere erneut geimpft. Hierzu wurden 6 χ 0,5 ml intramuskulär in die Beine injiziert. Die Emulsion bestand aus zwei Teilen Adjuvans zu 1 Teile Salzlösung, enthaltend Τ,-BSA-Konjugat (2 mg/ml). Die Blutproben enthielten 10 Tage nach der Nachimpfung und die nächsten

2 Monate hohe Gehalte an T-,-Antikörpern.

c) Bildung des Immunoadsorbens zur Reinigung des ersten Antikörpers.

Sepharose 4B wurde mit 1,4-bis-(2,3-Epoxypropoxy)-butan, wie oben beschrieben, aktiviert. Die aktivierte Sepharose (4 ml) wurde zu Phosphatpuffer (pH 12,0, 0,025 m, 20 ml), enthaltend T, (50 mg), gegeben. Der Puffer wurde 45 h bei Raumtemperatur gerührt. Das Gel wurde dann mit, Phosphatpuffer (pH 12,0, 0,025 m, 250 ml)_;Natriumchloridlösung (150 ml, 0,1 m) und destilliertem Wasser (100 ml) gewaschen. 9 mg T, wurden pro ml gequollenes Gel aufgenommen. Verbleibende Oxirangruppen wurden blockiert durch Suspendieren des Gels in dem vierfachen Volumen wäßrigem Äthanolamin (1m, pH 11) und 4 h langes Schütteln. Das Gel wurde dann ausgiebig mit destilliertem Wasser gewaschen,um überschüssiges Äthanol-, zu entfernen. amm

d) Reinigung des ersten Antikörpers.

Anti-T.,-Serum (das wie oben beschrieben hergestellt worden war, 20 ml) wurde 1 h bei Raumtemperatur mit T, substituierter Sepharose (1 ιαΐ) vermischt. Nicht-spezifisch adsorbierte Proteine wurden von dem Immunoadsorbens durch ausgiebiges Waschen mit phosphatgepufferter Salzlösung (0,05 m, pH 7,0, 0,02 m NaCl) entfernt. Das Gel wurde, wie oben beschrieben, in einen Zylinder gegeben und mit Salzsäure (pH 3)

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1A-50 235

zur Entfernung des Phosphatpuffers gewaschen. !,-Antikörper wurden eluiert durch Waschen mit Guanidiniumhydrochlorid (4 ml, 6 m, pH 2) und in Barbitonpuffer (1 ml, 0,05 m, pH 8,6, 0,1 i> Rinderserumalbumin) gesammelt. Die Τ-,-Antikörper wurden ausgiebig gegen diesen Puffer dialysiert, um das Guanidiniumhydrochlorid zu entfernen.

3. Bildung von Antigen-T,-haltigem Träger für die Bestimmung;.

Es wurde gearbeitet,wie für die Herstellung des Immunoadsorbens zur Reinigung des ersten Antikörpers beschrieben (2 c), mit der Ausnahme, daß die Konzentration an T, geringer war.

Dadurch nahm die Konzentration an T, in dem Gel ab.

Die Bestimmung von T, mit den oben beschriebenen Reagentien wurde auf die bereits beschriebene Weise durchgeführt.

Das "Universalreagens" kann für verschiedene unterschiedliche Bestimmungen von Antigenen verwendet werden. Diese sind unter anderem:

1a) Inkubation des ersten Antikörpers und freien Antigens und anschließend Zugabe des Immunoadsorbens und nach dem Waschen Zugabe der Markierungssubstanz·

1b) Gleichzeitige Inkubation des ersten Antikörpers, freien Antigens und Immunoadsorbens· Die Markierungssubstanz wird zu dem gewaschenen Immunoadsorbens gegeben.

2a) Inkubation des ersten Antikörpers, freien Antigens und der Markierungssubstanz. Daraufhin wird nach einer entsprechenden Inkubation das Immunoadsorbens zugegeben.

2a) kann modifiziert werden, indem man den ersten Antikörpe) mit der Enzymmar^kierung inkubiert vor der Zugabe des freien Antigens (2b).

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3. Gleichzeitige Zugabe des ersten Antikörpers der Markierungssubstanz, freien Antigens und des Immunoadsorbens. Dieses Verfahren kann leicht modifiziert werden durch vorherige Bildung des Komplexes aus Markierung und erstem Antikörper.

In den folgenden Beispielen sind Bestimmungen beschrieben und die dabei erhaltenen Ergebnisse angegeben unter Verwendung des "Universalreagens¹¹ nach den oben angegebenen Verfahren.

Immunologische Bestimmung von Trijodthyronin (T-^) unter Verwendung des Universalreagens .

Die Bestimmung von T-, wurde auf verschiedene Arten durchgeführt.

Beispiel 2 Bestimmung nach 1a

T,-Antisera (Schaf, Verdünnung 1 : 2 OOO) in Barbitonpuffer (0,1 ml, 0,05 m, pH 8,6, 0,1 % Gew./Vol. BSA) wurden mit T, Standards hergestellt in Barbitonpuffer (0,1 ml) gemischt und 24 h bei 4⁰C gehalten. Barbitonpuffer (0,1 ml, 0,3 % Gew./Vol. Tween 80), enthaltend T,-Immunoadsorbens (50 /Ug) wurde zugegeben, das ganze gemischt und 1 h bei 4⁰C gehalten, darauf zweimal mit barbitongepufferter Salzlösung (5 f> Gew./Vol. NaCl) und einmal mit Barbitonpuffer gewaschen. Das zur Kennzeichnung dienende Enzym (100 /Ul, Esel-Anti-Schaf-IgG-Galactosidase)wurde mit dem gewaschenen Immunoadsorbens gemischt, 24 h bei 4⁰C gehalten, wie zuvor beschrieben gewaschen und dann die an das Immunoadsorbens gebundene Enzymaktivität mit Hilfe üblicher Verfahren gemessen.

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- }* -j£ 1A-50 255

T, Konzentration Δ optische Dichte Null-Bindung * * (nMol/1) (2 h) %

0 0,29 100

1 0,17 50 4 0,16 47

32 0,135 35

unspezifische Bindung der Markierung an das Immunoadaorbens = 0,05 (= NSB)

* Bindung berechnet nach Subtraktion von NSB.

Eine gleichartige Bestimmung wurde durchgeführt unter Verwendung von Esel-Anti-Schaf-Fc-Galactosidase als Markierung bzw· Kennzeichen. Es wurde,wie oben beschrieben, gearbeitet mit der Abwandlung, daß 1. die Antisera und Standards 8 h zusammengehalten wurden und 2. die Antiserumverdünnung 1 : 1 600 betrug.

T, Konzentration (dMol/1, ng/ml)	koptische Dichte (2 h)	Null-Bindung %
0 0	0,43	100
0,42 0,25	0,35	81
1,56 1,0	0,28	65
6,25 4,0	0,16	37
25 16	0,15	35
NSB 0,025
Beispiel 3
Bestimmung nach 2a

Gereinigte Τ,-Antisera (Schaf, Verdünnung 1 : 1 500, 0,1 ml) und T, Standards (0,1 ml) in Barbitonpuffer (0,05 m, pH 8,6, 0,1 56 Gew./Vol. BSA) wurden mit dem kennzeichnenden Enzym

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^--, 1A-30

(25 /Ul, Esel Anti-Schaf IgG-Enzym) gemischt und das Gemisch 24 h bei 4⁰C gehalten. Barbitonpuffer (0,1 ml, 0,3 % Gew./Vol. Tween 80), enthaltend T^-Immunoadsorbens (50 /Ug) wurde unter Mischen zugegeben und das ganze 1 h bei 4⁰C gehalten. Das Immunoadsorbens wurde gewaschen und die gebundene Enzymaktivität, wie in Beispiel 2 beschrieben, bestimmt.

T, Konzentration Aoptische Dichte Null-Bindung * ⁰ (l/1) () #

100 90 70 45 38 36 33 31 22

* Bindung berechnet nach Subtraktion von NSB.

Beispiel 4 Bestimmung nach 2b

Gereinigte Τ,-Antikörper (Verdünnung 1 : 1 500) in Barbitonpuffer (0,05 m, pH 8,6, 0,1 $> Gew./Vol. BSA, 8,5 ml) wurden mit der Enzymmarkierung (Esel Anbi-Schaf IgG-Galactosidasekonjugat, 5,1 ml) gemischt und bis zum Gebrauch bei 4⁰C aufbewahrt.

T, Standards in Barbitonpuffer (50 /Ul) wurden mit dem Komplex aus Kennzeichen bzw. Markierung und erstem Antikörper (200 /Ul) und zusätzlichem Barbitonpuffer (0,5 /Ul) gemischt und dann 4 h bei 4⁰C gehalten. T^-Imraunoadsorbens (50 /Ug) la Barbitonpuffer, enthaltend Tween 80 (0,4 fi) wurde zu den

Konzentration	/!optische
(tiMol/1)	(1 h
O	0,47
0,5	0,42
1	0,35
2	0,24
4	0,21
8	0,20
16	0,18
32	0,17
64	0,14
NSB	0,05

Röhrchen gegeben und das ganze 1 h bei 4⁰C inkubiert. Das

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U-50 235

Immunoadsorbens wurde nacheinander mit Barbitonpuffer gewaschen, der zunächst 5 $> und dann 1 j6 Natriumchlorid enthielt· Die an das Immunoadsorbens gebundene Enzymaktivität wurde mit Hilfe der üblichen Verfahren bestimmt.

T~ Konzentration ^(nMol/1)	/!optische Sichte (1 h)	Null-Bindung ♦
O	0,44	100
0,125	0,40	83
0,25	0,36	69
0,5	0,37	74
1	0,29	46
2	0,24	27
4	0,20	15
8	0,19	12
NSB	0,16

* Bindung berechnet nach Subtraktion von NSB·

Dieser Versuch wurde mit einer Esel Anti-Schaf Fc-Enzymmarkierung wiederholt mit gleichartigen Ergebnissen, wie oben.

Beispiel 5 Bestimmung nach 3

T^ Standards in Barbitonpuffer (100 /Ul) wurden mit dem Komplex aus Markierung und erstem Antikörper (200 /Ul) und mit T,-Immunoadsorbens (25 /Ug) in Barbitonpuffer (100 /Ul), enthaltend Tween 80 (0,4 # Gew./Vol.) vermischt und das Gemisch 2 h bei 4⁰C inkubiert. Das Immunoadsorbens wurde gewaschen und das gebundene Enzym, wie in Beispiel 4 beschrieben, bestimmt.

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809824/0896

	1A-50 235 2755008
/^optische Dichte ( 1 h)	Null-Bindu
0,33	100
0,32	94
0,29	83
0,28	77
0,24	60
0,21	42
0,18	32

T, Konzentration
-> (nMol/1)

0,5

8
16
NSB = 0,114

* Bindung berechnet nach Subtraktion von NSB.

Beispiel 6 Bestimmung nach 2b

Es wurde wie in Beispiel 4 gearbeitet mit der Abwandlung, daß die Standards in Form von Piasmaatreifen hergestellt wurden. Das bindende Schilddrüsenglobulin wurde durch ein— stiindiges Erhitzen der Plasmaproben in einem V/asserbad auf 7O⁰C zerstört. Es wurden gleichartige Ergebnisse erzielt wie in Beispiel 4.

Beispiel 7

Enzymmarkiürte immunologische Bestimmung von Wachstumshormon (HGIi) unter Verwendung des Universalreagens.

Bestimmung nach 1a

HGH-Antisera (Kaninchen, Verdünnung 1 : 20 000) in Barbitonpuffer (0,1 ml, 0,05 m, pH 8,6, 0,65 m NaCl, 0,5 % Gew./Vol. BSA) wurde mit HGH Standards gelöst in Barbitonpuffer (0,1 ml)

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gemischt uad 24 h bei 4⁰C gehalten. HGH-Immunoadsorbenü in Barbitonpuffer (0,1 ml, 10 /Ug) wurde dann zugegeben, das ganze gemischt und 1 h bei 4⁰C gehalten; darauf wurde einmal mit Barbitonpuffer (2 ml, 0,05 m, pH 8,6), enthaltend 5 % NaCl und einmal mit Puffer, enthaltend 1 % NaCl, gewaschen· Das zur Markierung dienende Enzym (50 /Ul, Esel Anti-Kaninchen Fc-Galactosidase) wurde zu dem gewaschenen Immunoadsorbens gegeben, das ganze gemischt, 24 h bei Raumtemperatur gehalten, wie oben beschrieben gewaschen und schließlich die an das Immunoadsorbens gebundene Enzymaktivität mit Hilfe üblicher Verfahren gemessen.

HGH Konzentration	Δ optische Dichte ( 1 h)	Null-Bindung
(ng/ml)	0,64	%
O	0,61	100
0,39	0,60	95
0,78	0,51	93
1,56	0,43	75
3,125	0,38	63
6,25	0,31	53
12,5	0,26	41
25	0,22	33
30	0,18	24
100	18

unspezifi3che Bindung der Markierung an das Immunoadsorbens

* Bindung berechnet nach Subtraktion von NSB.

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Beispiel 8

Enzymmarkier be immunologische Bestimmung für Insulin unter Verwendung des Universalreagens.

Bestimmung nach 1a

Insuilnantisera (Meerschweinchen, Verdiinnung 1 : 10 OOO oder 1 : 40 000) in Phosphatpuffer (0,1 ml, 0,04 m, pH 7,4, 0,5 °/o Gev/./Vol. B3A) wurdoimit Rinderiniiulin Standardpräparaten hergestellt in Phosphatpuffer (0,1 ml)'gemischt und das ganze 24 h bei 4⁰G gehalten. Darauf wurde Insulinimmunoadsorbens in Phosphatpuffer (0,1 ml, 25 /Ug) zugegeben, das ganze gemischt und die Röhrchen 30 min bei 4 C gehalten. Darauf wurde das Immunoadsorbens mit Phosphatpuffer (2 ml), enthaltend 5 $ und anschließend 1 i» Natriumchlorid gewaschen. Die Enzymmarkierung (50 /Ul, Esel Anti-Meerschweinchen IgG-Galactosldasekonjugat) wurde zu den Röhrchen gegeben, der Inhalt gemischt und 24 h bei Raumtemperatur gehalten. Das Immunoadsorbens wurde, wie oben beschrieben, gewaschen und die an da3 Immunoadsorbens gebundene Galactosidaseaktivitat mit Hilfe üblicher Verfahren gemessen.

Antisera Verdünnung 1 : 10 000.

Insulin Konzentration (ng/ml)

0,96

4,0

24

/^optische Dichte (90 min)

0,62 0,50 0,34 0,26

Null-Bindung %

100 83

55 42

Antisera Verdünnung I : 40 000.

0
0, %

4, a

0,36 0,10 0,17 0, 16

100 50

47 44

ί i.:;t:h.· Bindung - 0,05 Ktizymniarkierung Im Imniunouduorbetii).

B O 9 8 2 W O 8 9 6

- 27 -

1A-50

Beispiel 9

Enzymmarkierte immunologische Bestimmung für Hydrocortison unter Verwendung des Universalreagens.

Bestimmung nach 1a

Hydrocortison-Antisera (Schaf, Verdünnung 1 : 20 OOO) in Phosphatpuffer (0,1 ml, 0,1 m, pH 7,4, 0,1 # Gew./Vol. Gelatine. 0,83 # Gew./Vol· NaCl, 0,1 $> Thiomersal) wurde mit Hydrocortison Standardpräparaten,hergestellt in Phosphatpuffer (0,1 ml),gemischt und 24 h bei 4⁰C gehalten. Phosphatpuffer (0,3 $> Gew./Vol. Tween 80), enthaltend Hydrocortison-Immunoadsorbens (0,1 ml, 25 /Ug) wurde dann zugegeben, gemischt, 1 h bei 4⁰C gehalten und dann einmal mit Phosphatpuffer-Salzlösung (3 % Gew./Vol.) und einmal mit Phosphatpuffer gewaschen. Die Enzymmarkierung (25 /Ul, Esel AntiSchaf IgG-Galactosidasekonjugat, 0,5 $> Gew./Vol. Tween 80) wurde zu dem gewaschenen Immunoadsorbens gegeben, das ganze gemischt, 24 h bei 4⁰C gehalten, wie oben gewaschen und die an die feste Phase gebundene Enzymaktivität, wie üblich , bestimmt.

Hydrocortison-Konzentration koptische Dichte Null-Bindung (ng/ml) (1h) i>

125

250

500 1000 2000 4000 8000

unspezifische Bindung der Markierung an das Immunoadsorbens

* Bindung berechnet nach Substraktion von NSB.

- 28 809824/0896

0,33	100
0,29	87
0,26	74
0,21	59
0,18	47
0,15	37
0,11	24
0,11	24

1A-50 235

Es ist zweckmäßig Kits bereitzustellen, die die für die Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens gegenüber bestimmten Antigenen erforderlichen Stoffe enthalten. Ein derartiges Kit,(Handelspackung) umfaßt einen unlöslichen Träger, an den ein Antigen gebunden ist, welches gleich oder verschieden sein kann von dem Antigen, das mit Hilfe des Kits nachgewiesen und bestimmt werden soll. Weiterhin enthält der Kit einen geeigneten ersten Antikörper und einen geeigneten enzymmarkierten, zweiten Antikörper, sowie Mittel zum Bestimmen der Enzymaktivität, wie dies bei der Ausführung des Verfahrens notwendig ist. Vorzugsweise enthält das Kit für Eichzwecke auch eine Lösung, die eine bekannte Menge

... , , . Wendung,,., , . , des Antigens, welches unter An-VdesTCits nachgewiesen oder bestimmt werden soll, enthält.

Es kann von Vorteil sein, wenn die feste Phase mit einem Stab kombiniert ist, der in die weiteren Komponenten des Bestimmungsgemisches eingeführt und wieder herausgenommen werden kann. Dies erleichtert das Waschen der festen Phase und erhöht die Genauigkeit der Bestimmung.

Beispielsweise kann ein Kit für T^-Bestimmung folgende Bestandteile enthalten oder umfassen:

1. Einen unlöslichen Träger, entweder als Suspension In einem Puffer (beispielsweise Barbitou) oder in lyophilisierter Form, mit daran gebundenem Antigen T,.

2. Den ersten Antikörper (Anti-T,, gebildet in Schafen) zusammen mit dem zweiten Antikörper (gebildet in Esel AntiSchaf IgG Fc, wobei der zweite Antikörper mit ß-Galactosidase markiert ist) und diese Komponente vorzugsweise in lyophilisierter Form vorliegt.

3. Ein Substrat,(wie Nitrophenylgalactosid) bei einer Endkonzentration von etwa 10 bis 3 m in einem Puffer (z.B. Barbiton), vorzugsweise mit einem pH-Wert von 7 bis 9 und einer Molarität von 0,010 bis 0,200; diese Komponente liegt vorzugsweise in lyophilisierter Form vor.

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4. Eine Lösung, die eine bekannte Menge Antigen T-, enthält (z.B. 10 nMol/l)_f wobei diese Komponente vorzugsweise in lyophilisierter Form vorliegt.

627292

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Claims (1)

1. DII. INO. KtVUKSTHOFK. SOOO H"ONiUIKN OO

   I)H-K-V-IMC(IlXl ANA' SCIMV EIU KKSTllASSK 2

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   1A-50 235

   Anmelder: Carlo Erba S.ρ

   ■ f . ■

   P a t e η t a η s ρ r ü c h e

   Verfahren zur immunologischen Bestimmung mit Hilfe von Enzym-Markierungen, bei dem ein flüssiges Medium gleichzweitig oder nacheinander mit (1) einem Antigen auf einem unlöslichen Träger oder in form eines unlöslichen Aggregats,

   (2) mit einem ersten Antikörper und {5) mit einem enzymmarkiertet zweiten Antikörper in Berührung gebracht wird, der unlösliche und der lösliche Anteil voneinander getrennt werden und die Enzymaktivität entweder in der löslichen oder in der unlöslichen Phase bestimmt wird, dadurch gekennzeichnet, daß man den ersten Antikörper (2) auch mit einer Probe in Berührung bringt, die das nachzuweisende oder bestimmende Antigen enthält, welches gleich oder verschieden sein kann von dem Antigen in (1), den zweiten Antikörper (3) in umgekehrtem Verhältnis zu der Menge Antigen in der Probe, die nachgewiesen oder bestimmt werden sollten das unlösliche Material bindet und damit die Anwesenheit oder Menge des Antigens in der Probe bestimmt,

   2, Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man den ersten Antikörper (2) mit (1) und der Probe umsetzt, die feste Phase von der flüssigen Phase trennt und den gesamten an die abgetrennte feste Phase gebundenen ersten Antikörper darauf mit dem zweiten Antikörper

   (3) in einem zweiten flüssigen Medium, das frei von (2) und der Probe ist, umsetzt, worauf man die feste Phase von dem zweiten flüssigen Medium abtrennt und die Enzymaktivität in der festen Phase bestimmt bzw. mißt·

   809824/0896 - 2 -

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   3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man den zweiten Antikörper (3) mit dem ersten Antikörper (2) unter Bildung eines Komplexes aus beiden Antikörpern umsetzt und diesen Komplex anschließend mit dem Antigen (1) und der Probe umsetzt.

   4· Verfahren nach Anspruch 2 oder 3» dadurch gekennzeichnet , daß man den ersten Antikörper oder den Komplex zuerst mit der Probe und dann mit (1) umsetzt·

   5. Verfahren nach Anspruch 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet , daß man den ersten Antikörper oder den Komplex gleichzeitig mit (1) und der Probe umsetzt.

   6. Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet , daß man den ersten Antikörper in einer Menge einsetzt, die mehr als ausreicht, um mit allem in der Probe vorhandenen Antigen zu reagieren, aber nicht mehr als ausreicht, um mit allem Antigen in der Probe plus allem Antigen in (1) zu reagieren.

   7. Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man als Antigen in (1) das gleiche Antigen wie in der Probe auf einem unlöslichen Träger einsetzt.

   8. Verfahren nach einem der Ansprüche 3 bis 7» dadurch gekennzeichnet , daß man zur Bestimmung der Anwesenheit oder der Menge von Antigen in der Probe die Enzymaktivität in der abgetrennten flüssigen Phase bestimmt.

   9. Kit zur Durchführung des Verfahrens nach einem der vorangegangenen Ansprüche, dadurch g e k e nin zeichnet, daß es einen unlöslichen Träger (1) mit daran gebundenem Antigen, welches gleich oder verschieden sein kann von dem Antigen, das mit Hilfe des Kits nachgewiesen oder

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   - 3 - 1A-50 235

   !A-50 235

   bestimmt werden soll oder das Antigen in Form eines unlöslichen Aggregats, einen geeigneten ersten Antikörper (2), einen geeigneten enzymmarkierten zweiten Antikörper (3), sowie Mittel zum Bestimmen der Enzymaktivität, wie sie bei Durchführung des Verfahrens benötigt werden, enthält·

   10. Kit nach Anspruch 9, dadurch g e k e η η ze lehnet, daß es zusätzlich eine Lösung umfaßt, die eine bekannte Menge des Antigens enthält, welches mit Hilfe des Kits nachgewiesen oder bestimmt werden soll·

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