DE4033714C3 - Neues Hapten-Analytikum basierend auf dem Prinzip einer Antigen-Antikörper-Reaktion - Google Patents

Description

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist das in den Ansprüchen 1 bis 14 angegebene Hapten- Analytikum basierend auf dem Prinzip einer Antigen-Antikörper- Reaktion. Weiterer Gegenstand der Erfindung sind die zur Herstellung des Hapten-Analytikums geeigneten Zwischenprodukte sowie Verfahren zur Herstellung der Komponenten des Analytikums nach den Ansprüchen 15 bis 47. Gegenstände der Erfindung sind schließlich auch die Verwendung des Hapten-Protein-Konjugats zur Immunisierung gegen Haptene und zur Markierung von Haptenen.

Unter Hapten versteht man bei der vorliegenden Erfindung ein kleineres Molekül (Größenordnung 100 bis 500 Dalton), das als isolierte Substanz nie oder lediglich marginal immunogen wirkt. Ein Hapten fungiert in der Regel erst nach Kopplung an ein Makromolekül als Epitop. Allerdings ist das freie Molekül (Hapten) in der Lage, mit der Antigen-Bindungsstelle eines spezifischen Antikörpers zu reagieren.

Als Hapten-Analytikum, basierend auf dem Prinzip einer Antigen-Antikörper-Reaktion, sind eine Reihe von Möglichkeiten denkbar. Eine übersichtliche und verständliche Darstellung entsprechender Methoden, wie z. B. RIA oder ELISA findet sich in "Humane monoclonale Antikörper" von D. Baron und U. Hartlaub, Stuttgart, New York: Fischer, 1987, insbesondere Seiten 65-86. Im Zentrum eines Hapten-Analytikums steht eine wirkungsvolle und effektive Antigen-Antikörper-Reaktion. In der Regel wird sich das Interesse auf die quantitative oder qualitative Bestimmung des Haptens richten. Allerdings kann sehr wohl auch eine entsprechende Bestimmung eines Hapten-Antikörpers von großem Interesse sein. Häufig verhält es sich auch so, daß gerade die Einzelkomponenten des Analytikums, wie z. B. ein Hapten-Protein-Konjugat oder ein anti-Hapten-Antikörper-Enzym-Konjugat wechselseitig für die Herstellung derselben von Bedeutung sind. So wird z. B. zur Produktion des anti-Hapten-Antikörpers in erster Linie bereits ein Hapten-Protein-Konjugat benötigt. Darüber hinaus ist das Hapten-Protein-Konjugat möglicherweise wichtig bei der Aufarbeitung von, den anti-Hapten-Antikörper produzierenden, Zellinien. Umgekehrt kann wiederum das anti-Hapten-Antikörper-Enzym- Konjugat wertvolle Dienste bei der Isolierung und Aufkonzentrierung eines Hapten-Protein-Konjugats leisten.

In der Regel ist die Konjugation bzw. Kopplung eines Haptens an ein Makromolekül, wie z. B. ein Protein, nicht direkt möglich oder unerwünscht. Aus diesem Grunde bedient man sich im Stand der Technik sogenannter Spacer. Dabei handelt es sich um bifunktionale Moleküle kleineren Molekulargewichts, die sowohl mit reaktiven Gruppen des Haptens als auch des Proteins reagieren können. In der Regel erweisen sich diese Kopplungen über Spacer als unerwartet schwierig. Darüber hinaus besteht die Gefahr, daß durch die Reaktionen mit einem Spacer das Epitop soweit verändert wird, daß eine Eignung des Konjugats innerhalb eines Analytikums oder zur Immunisierung (zwecks Herstellung eines anti-Hapten-Antikörpers) nicht mehr gegeben ist.

Ähnliche Überlegungen gelten auch für die Bereitstellung eines anti-Hapten-Antikörper-Protein-Konjugats. Von überwiegendem Interesse sind solche Konjugate, bei denen das Protein nicht nur als Träger, sondern vielmehr als radioaktiv markiertes Tracer-Molekül oder Enzym wirksam werden kann. Im ersteren Fall eignet sich das Konjugat dann eher für einen RIA-, im letzteren eher für einen ELISA-Test. Wichtig ist dabei z. B. auch, daß gegebenenfalls die Enzymaktivität nicht infolge einer Kopplung verloren­ gegangen ist.

Kleinere als Hapten bezeichnete Moleküle, die mit Trägerproteinen konjugiert werden, können in vielfacher Weise zum Einsatz gelangen. Hervorzuheben sind die Einsatzbereiche Immunisierung, Herstellung von Festphasen-Matrizen, Affinitätssäulen, sogenannten Tracer-Molekülen, usw. Im allgemeinen sind solche Haptene von Interesse, die innerhalb eines lebenden Organismus qualitativ und/ oder quantitativ erfaßt werden sollen. Wegen der Vielzahl der möglichen Derivatisierung biochemischer Moleküle sei hier nur die Phosphorylierung und Oxidation, sowie Reduktion, erwähnt.

Es ist darüber hinaus generell möglich, synthetische Moleküle (vor allem wasserlösliche) in gleicher Weise analytisch zu bestimmen, wie das mit Substanzen der lebenden Materie möglich ist. Analytisch interessant in diesem Zusammenhang sind sicherlich auch kurzkettige Abbauprodukte von Kunststoffen etc.

Eine besondere Schwierigkeit bei der Bereitstellung von Hapten-Protein-Konjugaten besteht häufig darin, daß das Hapten bei den üblichen Kopplungsbedingungen, wie sie für Trägerproteine empfehlenswert sind, nicht oder nur schlecht löslich sind. Es versteht sich von selbst, daß die dann unter eher drastischen Bedingungen hergestellten Konjugate weder besonders gut zur Immunisierung noch als Tracer (z. B.: Pteridin- und Pterin-Hapten-Enzym-Konjugat) zu gebrauchen sind.

Die vorliegende Erfindung beschäftigt sich mit Haptenen, die über eine Aminogruppe, gegebenenfalls unter Hinzuziehung eines weiteren Spacers, mit einem Protein, Enzym und dergleichen konjugiert werden. Die Erfindung betrifft insbesondere Pteridine und Pterine, wie Neopterin, Biopterin, etc. Diese Substanzklasse ist von besonderem Interesse, da die Bestimmung ihrer Konzentrationen innerhalb des menschlichen oder tierischen Organismus zur Früherkennung von malignen Tumoren und/oder viralen Erkrankungen wichtig ist. Grundlage der Bestimmung dieser Substanzen im Serum oder anderen Körperflüssigkeiten ist in der Regel ein kompetitives Testverfahren, bei dem die Testsubstanz in der spezifischen Antigen-Antikörper-Reaktion mit dem gleichzeitig im Test vorhandenen Substanz-Protein-Konjugat konkurriert. Bei diesem Verfahren ist entweder der Antikörper oder das Hapten, gegebenenfalls als Konjugat vorliegend, an eine Oberfläche immobilisiert. Ein besonderes Problem bei der Herstellung von Pteridin- oder Pterin-Protein- Konjugaten besteht darin, daß Substanzen wie Neopterin, Biopterin und dergleichen in Wasser nur geringfügig löslich sind. Lediglich bei sehr hohem (12) bzw. sehr niedrigem pH-Wert (pH2) ist eine ausreichende Löslichkeit vorhanden. Dieses ungünstige Verhalten führt dazu, daß Protein-Konjugate mit diesen Substanzen nur schwer zugänglich sind. Führt man nämlich eine Konjugation bei entsprechenden höheren oder niederen pH-Werten durch, so resultiert eine Denaturierung oder Ausfällung der Proteine. Hohe Ausbeuten lassen sich mit den üblichen Verfahren zumindest nicht erzielen.

Aus der EP-B-00 12 444 sind ein Diagnostizierverfahren, insbesondere zur Früherkennung von malignen Tumoren und/ oder viralen Erkrankungen und Mittel zu seiner Durchführung, bekannt, wobei eine dem tierischen oder menschlichen Organismus entnommene Körperflüssigkeit auf den Gehalt bestimmter Pteridine untersucht wird. Diese Patentschrift erwähnt verschiedene Möglichkeiten der Konjugation von Pterinen mit Proteinen. Insbesondere wird auch die Möglichkeit einer Verknüpfung des Xanthopterins mit einem immunogenen Träger über die 2-Aminogruppe erwähnt. Durch eine Umsetzung des Xanthopterins mit Bernsteinsäure-Anhydrid in der Wärme ergibt sich zunächst ein Hemisuccinat, das in üblicher Weise mittels Carbodiimid z. B. an Rinderserumalbumin konjugiert werden kann.

Die DE-A-30 25 226 beschreibt einen Radioimmunoassay zur Bestimmung von Pterinen und dafür verwendbare Pterinderivate. Auch diese Literaturstelle erwähnt die Möglichkeit einer Konjugation eines Pterins auf ähnlichem Wege.

Boehringer Mannheim, Biochemica, Immunologicals for the diagnostic industry 1990/91 beschreibt N-Maleinimidohexanoyl- Triiodothyronin. Diese Verbindung wird als Reagenz zur Koppelung der Substanz an andere Moleküle verwendet.

Fujiwara, K., et al. beschreiben in Cancer Research 41, 4121- 4126 (1981) einen Enzymimmunoassay für Pepleomycin. Das Pepleomycin wird an ein Protein gekoppelt, um dessen Immuno­ genität zu steigern. Dabei werden in zwei parallelen Reaktionsansätzen Pepleomycin mit GMBS (N-(Gammamaleimido­ buturyloxy)succinimid) gekoppelt und das Rinderserumalbumin an einer freien Aminofunktion des Proteins mit Acetyl­ mercaptosuccinat gekoppelt. Das BSA - AMS wird mit Hydroxyl­ amin in das Thiol-Spacerderivat MS (Mercaptosuccinyl) umge­ setzt, welches dann mit dem GMBS acetylierten PEP (Pepleo­ mycin) zu einem Hapten-Protein-Konjugat umgesetzt wird. Aus dem Chemikalienkatalog der Firma Fluka 1990/91 sind ver­ schiedene Maleinimidocarbonsäurederivate bekannt, die als Verknüpfungs- und Immobilisierungsreagenzien von Proteinen sowie Sonden für SH-Gruppen verwendet werden. Aus dem Hand­ book und General Catalog der Fa. Pierce (1987) geht ein Reagens SMCC (Succinylimidyl-4(N-maleimindomethyl)cyclohexan- 1-carboxylat) hervor. Dieses Reagens ist geeignet zur Kon­ jugation von affinitätsgereinigten F(ab)₂ Fragementen an andere größere Proteinkörper.

Zusammengefaßt kann gesagt werden, daß im Stand der Technik Konjugate unter Verwendung von Carbodiimiden und einem weiteren Spacer, der in die Pterine eine Carboxyl-Funktion einführt, erhalten werden.

Bekannt ist auch die Ausnutzung von Antigen-Antikörper-Reaktionen bei der Herstellung von Antiseren oder Immuntoxinen, die therapeutische Verwendung finden sollen.

So werden im Journal of Immunological Methods, 120 (1989), Seiten 133 bis 143, Wege zur Herstellung von Peptid-Protein-Konjugaten aufgezeigt, um die Immunogenität kleiner Peptide zu steigern. Damit sollen Antiseren gegen spezielle Peptid-Fragmente hergestellt werden, um in der Therapie eingesetzt zu werden.

EP-01 69 111 beschreibt die Kopplung von Antikörpern mit zelltoxischen Substanzen und gibt Hinweise auf die therapeutische Verwendung dieser Immuntoxine.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung eines neuen Pteridin-/Pterin-Analytikums basierend auf dem Prinzip einer Antigen-Antikörper-Reaktion. Diese Aufgabe kann allerdings nicht gelöst werden, ohne daß die hier zugrunde liegenden Probleme vorgängig gelöst werden. Demnach ist es eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Pteridin-/Pterin-Protein-Konjugat bereitzustellen, das zum einen in hoher Ausbeute und zum anderen unter Beachtung der aufgezeigten Anforderungen anfällt. Weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist in der Folge dann auch die Bereitstellung eines Hapten-Antikörpers und eines entsprechenden Konjugats, wobei zum einen die Probleme bei der Immunisierung und zum anderen bei der Markierung des Haptens (in einem Testsystem oder Diagnostizierverfahren) Beachtung finden sollen.

Diese Aufgabe wird gelöst durch ein Hapten-Analytikum basierend auf dem Prinzip einer Antigen-Antikörper- Reaktion mit den Merkmalen des Anspruchs 1.

Erfindungsgemäß zu verwendende Haptene sind Pteridine und Pterine, wie Neopterin, Biopterin und dergleichen. Besonders bevorzugt ist allerdings das Neopterin bzw. dessen unmittelbare, in Organismen auftretenden biochemischen Derivate.

Vorzugsweise ist b im Spacer der Formel I gleich der allgemeinen Formel

wobei
R′ = aliphatische Kohlenwasserstoffkette mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen,
P = Amino- oder Amidogruppe des Proteins.

Das bevorzugte Molverhältnis Hapten zu Protein beträgt 1 : 1 bis 1 : 7.

Als Proteinkomponente wird vorzugsweise Rinderserumalbumin (BSA), Schafserumprotein oder Immunglobulin G (IgG) verwendet.

Vorzugsweise ist das Molverhältnis anti-Hapten-Antikörper zu Protein etwa 1 : 1.

Der anti-Hapten-Antikörper ist vorzugsweise ein Immunglobulin G (IgG). Dieser Antikörper kann sowohl poly- als auch monoclonal sein.

Die Proteinkomponente des anti-Hapten-Antikörper-Protein- Konjugats ist vorzugsweise ein Enzym, wie Peroxidase, Phosphatase, β-Galaktosidase oder Urease. Besonders bevorzugt ist die Peroxidase HRP (Horse Radish Peroxidase).

Die einzelnen zuvor genannten Konjugate sind vorzugsweise als Teil eines ELISA-Kits verwendet (enzyme-linked immunosorbent assay). Bei einem Kit zur Bestimmung eines Haptens wird ein kompetitiver ELISA bevorzugt.

Bei dem erfindungsgemäßen Analytikum wird vorzugsweise das Hapten-Protein-Konjugat als Festphasenmatrix immobilisiert. Alternativ kann der anti-Hapten-Antikörper an eine feste Oberfläche immobilisiert werden. In beiden Fällen ist als Kunststoffoberfläche ganz besonders Polystyrol bevorzugt.

Weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein zur Herstellung eines Hapten-Analytikums geeignetes Zwischenprodukt, wie es zuvor in Form des Hapten-Protein- Konjugats beschrieben wurde. Ohne dieses Zwischenprodukt wird es nämlich kaum möglich sein, entsprechende anti- Hapten-Antikörper in ausreichender Konzentration und mit den erfindungsgemäßen Vorteilen herzustellen. Dieses Konjugat dient dann zunächst zur Immunisierung und später zur Aufarbeitung der anti-Hapten-Antikörper mittels Affinitätschromatographie. Als erfindungsgemäße Konjugate haben sich insbesondere bewährt:

• - Neopterin-IgG-Konjugat (Kaninchen-IgG)
• - Neopterin-Rinderserumalbumin-Konjugat
• - Neopterin-Schafserumprotein-Konjugat.

In einem kompetitiven ELISA-System haben sich darüber hinaus Konjugate des Haptens mit Peroxidase, insbesondere HRP, bewährt.

Im Prinzip ist die Auswahl der Träger-Proteine für die Konjugate kaum beschränkt. Ein wichtiger Parameter für die Auswahl geeigneter Trägerproteine ist eine gute Bindung an die Festphasenmatrix, wie z. B. eine Polystyrol-Kunststoffoberfläche. Für die Auswahl des mit dem Hapten (insbesondere Neopterin) vorgesehenen Enzyms spielt die Aufrechterhaltung der enzymatischen Aktivität die entscheidende Rolle.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist als weiteres zur Herstellung eines Hapten-Analytikums geeignetes Zwischenprodukt ein anti-Hapten-Antikörper-Protein-Konjugat, wie zuvor beschrieben. Vorzugsweise wird der Antikörper zunächst mittels des erfindungsgemäßen Hapten-Protein- Konjugats bereitgestellt. Dabei kommt sowohl eine monoclonale als auch eine polyclonale Präparation in Frage. Bei der Herstellung des anti-Hapten-Antikörpers sowie des anti-Hapten-Antikörper-Protein-Konjugats sollte jeweils berücksichtigt werden, daß die Proteinkomponente von derselben Spezies abstammt.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist weiterhin ein Verfahren zur Herstellung eines Pteridin-/Pterin-Konjugats, gekennzeichnet durch folgende Verfahrensschritte:

• 1. Umsetzung des Pteridin-/Pterin mit dem bifunktionellen Spacer der Formel I, wobei eine funktionelle Gruppe des Spacers mit einer Aminogruppe des Pteridin-/Pterin unter Ausbildung einer kovalenten Bindung reagiert und
• 2. weitere Umsetzung des gebildeten Produktes mit dem Protein zum Pteridin-/Pterin-Protein-Konjugat, wobei Sulfhydrilgruppen des Proteins oder des in vorgeschaltetem/en Reaktionsschritt/en entsprechend durch weitere Spacer modifizierten Proteins mit einer anderen funktionellen Gruppe des Spacers reagieren.

Vorzugsweise wird die Reaktion zwischen Pteridin-/Pterin und Spacer bei einem pH-Wert von 8 bis 9 durchgeführt. Besonders bevorzugt ist die Verwendung von Dimethylformamid (DMF) als zusätzliches Lösungsmittel.

Gegebenenfalls ist es erforderlich in das Protein durch vorgelagerte Reaktionsschritte Sulfhydrilgruppen einzuführen. Diese lassen sich in der Regel sehr leicht durch Behandlung mit Reduktionsmitteln erhalten. Bevorzugtes Reduktionsmittel ist ein Thiol. Besonders bevorzugt werden Mercapthoethanol (ME), Dithiothreitol (DTT) oder Dithioerythritol (DTE).

Die Reduktion wird vorzugsweise bei einem pH-Wert von 7 bis 8 durchgeführt. Vorzugsweise werden 10 bis 15 mol Sulfhydrilgruppen pro mol Protein eingeführt.

Alternativ ist es möglich, in dem/den vorgeschalteten Reaktionsschritt/en Sulfhydrilgruppen mittels eines weiteren Spacers in das Protein einzuführen. Vorzugsweise kann dieser weitere Spacer zunächst eine -S-S- oder -S-Gruppe enthalten, die erst durch eine weitere Reaktion, vorzugsweise mit Reduktionsmitteln, in eine Sulfhydrilgruppe umgebildet wird. Besonders bevorzugt ist in einem solchen Fall ein Spacer der allgemeinen Formel

wobei
R = aliphatische Kohlenwasserstoffkette mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen.

Als besonders bevorzugt gilt hierbei N-Succinimidyl-S- Acetylthioacetat (SATA).

Ein weiterer bevorzugter Spacer hat die allgemeine Formel

wobei
R′ = aliphatische Kohlenwasserstoffkette mit 1 bis 6 Kohlenwasserstoffatomen, aromatischer Kohlenwasserstoff oder Heteroaromat,
R = aliphatische Kohlenwasserstoffkette mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen.

Besonders bevorzugt ist als ein solcher Spacer Succinimidyl- 3-(2-pyridyldithio)propionat (SPDP).

Mittels der vorstehend genannten vorgeschalteten Reaktionsschritte werden vorzugsweise 10 bis 15 mol weiterer Spacer pro mol Protein eingeführt.

Die weitere Umsetzung des aus Hapten und bifunktionalem Spacer gebildeten Produkts mit einem Protein zum Pteridin-/Pterin- Protein-Konjugat wird vorzugsweise in einer auf den pH-Wert 7,5 bis 9 gepufferten Lösung ausgeführt. Es hat sich als günstig erwiesen, die nicht umgesetzten Sulfhydrilgruppen im Anschluß daran durch an sich bekannte Reagenzien zu blocken.

Vorzugsweise wird das Molverhältnis Hapten zu Protein auf Werte von 1 : 1 bis 1 : 7 eingestellt.

Die vorzugsweise eingesetzten Proteine sind Rinderserumalbumin (BSA), Schafserumprotein oder Immunglobulin G (IgG).

Weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung eines anti-Pteridin-/Pterin-Antikörper- Protein-Konjugats, gekennzeichnet durch folgende Verfahrensschritte:

• 1. Umsetzung des anti-Pteridin-/Pterin-Antikörpers oder des Proteins mit dem bifunktionellen Spacer der Formel III, wobei eine funktionelle Gruppe des Spacers mit einer Amino- oder Amidogruppe des anti-Pteridin-/Pterin-Antikörpers oder des Proteins unter Ausbildung einer kovalenten Bindung reagiert und
• 2. weitere Umsetzung des so gebildeten Produktes mit dem Protein oder dem anti-Pteridin-/Pterin-Antikörper zum gewünschten Konjugat, wobei durch vorgeschaltete/n Reaktionsschritt/e in den noch nicht in Verfahrens­ schritt 1) umgesetzten Reaktionspartner weitere bifunktionale Spacer eingebracht wurden und eine andere funktionelle Gruppe des an den in Verfahrensschritt 1) an den einen Reaktionspartner gebundenen bifunktionalen Spacers mit dem/den weiteren bifunktionalen Spacer/n unter Ausbildung von -S-S- Gruppen reagiert.

Vorzugsweise entstammt der Antikörper selber einer Immunisierung mittels des erfindungsgemäßen Hapten-Protein- Konjugats.

Der weitere bifunktionale Spacer hat vorzugsweise die allgemeine Formel

wobei
R = aliphatische Kohlenwasserstoffkette mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen.

Besonders bevorzugt ist hierbei der Spacer N-Succinimidyl- S-Acetylthioacetat (SATA).

Vorzugsweise kann der weitere bifunktionale Spacer auch die allgemeine Formel

haben, wobei
R′ = aliphatische Kohlenwasserstoffkette mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen, aromatischer Kohlenwasserstoff oder Heteroaromat,
R = aliphatische Kohlenwasserstoffkette mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen.

Hierbei ist als Spacer Succinimidyl-3-(2-pyridyldithioacetat)­ propionat (SPDP) bevorzugt.

In an sich bekannter Weise kann der im Verfahrensschritt 1) umgesetzte Spacer mit Sulfhydrilgruppen versehen werden. Hierzu bietet sich insbesondere eine Umsetzung mit Hydroxylamin (im Falle, daß SATA der Spacer ist) oder Thiolen (im Falle, daß SPDP der Spacer ist) an.

Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren soll das Molverhältnis anti-Pteridin-/Pterin-Antikörper zu Protein so gewählt werden, daß im Konjugat weder der Antikörper noch das Protein - im Falle, daß das Protein ein Enzym ist - seine Aktivität verliert.

Bevorzugte Enzyme innerhalb des Konjugats sind Peroxidase, Phosphatase, ß-Galaktosidase oder Urease. Besonders bevorzugt ist als Peroxidase HRP (Horse Radish Peroxidase).

Das bevorzugte Molverhältnis anti-Pteridin-/Pterin-Antikörper zu Protein beträgt etwa 1 : 1.

Der anti-Pteridin-/Pterin-Antikörper kann vorzugsweise poly- oder monoclonal sein.

In bevorzugter Weise läßt sich im erfindungsgemäßen Verfahren als anti-Pteridin-/Pterin-Antikörper eine Immunglobulin G- Fraktion verwenden.

Weiterer Gegenstand der Erfindung ist die Verwendung des erfindungsgemäßen Zwischenproduktes Hapten-Protein-Konjugat zur Immunisierung.

Darüber hinaus ist die Verwendung des Zwischenproduktes anti-Hapten-Antikörper-Protein-Konjugat zur Markierung von Pteridin/Pterin.

In den folgenden Beispielen wird die Erfindung näher erläutert. Als Modellsubstanz der Erfindung dient im folgenden Neopterin (2-Amino-6-(1,2,3-trihydroxypropyl)-4(3H)- pteridinon).

I. Neopterin-Protein-Konjugat a) Kopplung eines Spacers an das Neopterin

In einer ersten Reaktion wird ein Spacer mit dem Neopterin bei einem pH-Wert von 8 bis 9 umgesetzt. Die Löslichkeit des Neopterins bei diesem pH-Wert ist allerdings sehr gering. Deshalb wird Neopterin zunächst einmal bei einem höheren pH-Wert gelöst. Im Anschluß daran wird Dimethylformamid zugegeben und der pH-Wert auf die gewünschte Größe eingestellt. Schließlich wird zu dieser Lösung eine Lösung des Spacers (hier: GMBS) in DMF zugegeben. Bei der Reaktion liegt das Neopterin im Überschuß vor. Nach etwa 4stündiger Reaktionsdauer bei Raumtemperatur ist die Reaktion so gut wie abgeschlossen.

Als Trägerproteine für das Neopterin kommen eine Reihe von Substanzen, wie

- Kaninchen-IgG
- (HRP)

in Frage. In Abhängigkeit von dem gewählten Trägerprotein ist es entweder möglich, aus diesem Sulfhydrilgruppen freizusetzen oder durch Umsetzung mit weiteren Spacern entsprechende Gruppen in das Protein einzuführen.

b) Erzeugung von SH-Gruppen im Trägerprotein

Freie Sulfhydrilgruppen können relativ leicht durch Reduktion von Disulfidbrücken mittels Reagenzien, wie Dithiothreitol und dergleichen, in Proteine eingeführt werden. Diese Reduktion wird in der Regel in einer Pufferlösung bei einem pH-Wert zwischen 7 und 8 durchgeführt. Die Generierung von SH-Gruppen läßt sich dadurch steuern, daß das Reduktionsmittel mittels Gelfiltrationschromatographie und dergleichen aus dem Reaktionsgemisch entfernt wird. Bei den angegebenen Bedingungen wurden etwa 10 bis 15 mol SH- Gruppen pro mol IgG oder BSA erzeugt.

Alternativ lassen sich auch mittels bekannter Methoden SH-Gruppen dadurch in das Trägerprotein einführen, daß Spacer, wie SATA oder SPDP, eingeführt werden. Auch bei dieser Reaktion, die in an sich bekannter Weise durchgeführt wird, sollen 10 bis 15 mol Spacer pro Trägerprotein eingeführt werden. In der Regel reagieren bei den oben genannten Spacern die Aminogruppen der Proteine mit den zuletzt genannten. Die freien SH-Gruppen werden in der Regel durch Umsetzung mit Reduktionsmitteln (s. zuvor) gewonnen.

c) Kopplung des Neopterin-Spacer-Konjugats an ein mit SH-Gruppen versehenes Protein

Diese Kopplungsreaktion wird bei pH-Werten zwischen 7,5 und 9 durchgeführt. Hierbei ist es sinnvoll, zunächst einen Teil des Dimethylformamids zu entfernen und schließlich die Neopterin-Spacer-Lösung in eine verdünnende Pufferlösung aufzunehmen. Nach Zugabe einer Lösung des modifizierten Proteins läßt man die Lösung über einen Zeitraum von etwa 24 Stunden inkubieren. Nach Abschluß der Reaktion werden die nicht abreagierten SH-Gruppen mit z. B. Jodacetamid blockiert. Die übrigen Reaktionsteilnehmer werden im Anschluß daran nach an sich bekannten Methoden aus der Lösung entfernt.

Bei der eben beschriebenen Methode, insbesondere bei Verwendung von IgG, BSA, Neopterin und GMBS als Spacer, wird ein Neopterin-Protein-Verhältnis von 1 bis 7 mol zu 1 mol erreicht.

II. Herstellung eines anti-Neopterin-Antikörper-HRP- Konjugats

Mono- bzw. polyclonale anti-Neopterin-Antikörper werden in an sich bekannter Weise durch Verwendung der erfindungsgemäßen Neopterin-Protein-Konjugate gewonnen.

a) Kopplung von SPDP oder SATA an IgG

Gereinigte IgG-Fraktionen (anti-Neopterin-Antikörper) werden nach bekannten Methoden leicht mit Spacern versehen (beispielsweise SATA, SPDP). Aus diesen Spacern werden dann auch leicht, durch z. B. reduktive Umsetzung mit Mercapthoethanol, SH-Gruppen freigesetzt.

b) Kopplung von SPDP oder SATA an HRP

In der zuvor beschriebenen Weise gelingt auch die Umsetzung von Horse Radish Peroxidase (HRP) mit SPDP oder SATA.

c) Kopplung IgG-(SPDP oder SATA) an HRP-SPDP

HRP-SPDP koppelt unter milden Bedingungen an IgG- (SPDP oder SATA). Typische Reaktionsausbeuten betragen 1 bis 3 mol HRP pro mol IgG.

Claims (49)

1. Hapten-Analytikum, basierend auf dem Prinzip einer Antigen-Antikörper-Reaktion, das umfaßt

• 1. Pteridine und Pterine als Hapten und
• 2. ein Pteridin-/Pterin-Protein-Konjugat, wobei
  • 2.1. zwischen dem Hapten und Protein mindestens ein bifunktioneller Spacer der Formel I wobei
    a = Bindung zur Aminofunktion,
    R = aliphatische Kohlenwasserstoffkette mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen,
    b = Bindung an Protein bzw. weiteren an das Protein gebundenen Spacer bedeuten,
    vorhanden ist, der
    • 2.1.1. mit einer funktionellen Gruppe an die Amino­ gruppe des Pteridins/Pterins bindet und
    • 2.1.2. mit einer anderen funktionellen Gruppe ent­ weder direkt oder mittels eines weiteren bifunktionalen Spacers über Thiol-Gruppen an das Protein koppelt;
  • 2.2. das Protein die Funktion eines Trägermole­ küls, gegebenenfalls die eines Tracer-Mole­ küls, erfüllt und
  • 2.3. das gebundene Hapten die Funktion eines Epitops erfüllt;
    und/oder
• 3. ein Konjugat aus einem Antikörper, der das Pteridin/ Pterin als Hapten bindet und einem Protein, wobei
  • 3.1. zwischen dem anti-Hapten-Antikörper und dem Protein mindestens ein bifunktioneller Spacer der Formel III wobei
    c = Bindung zum Protein oder anti- Hapten-Antikörper,
    R = aliphatische Kohlenwasserstoffkette mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen,
    d = Bindung zum anti-Hapten-Antikörper oder Protein bedeuten,
    vorhanden ist, wobei der Spacer
    • 3.1.1. mit einer funktionellen Gruppe an eine Amino- oder Amidogruppe des Proteins oder anti-Hapten- Antikörpers gebunden ist und
    • 3.1.2. mit einer anderen funktionellen Gruppe über Schwefel-Schwefel-Bindungen eine Verknüpfung zum jeweils anderen Teil des Konjugats, gege­ benenfalls unter Verwendung eines weiteren bifunktionalen Spacer, herstellt;
  • 3.2. das Protein die Funktion eines Tracer- Moleküls erfüllt.

2. Analytikum gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß
b der Formel I gleich der allgemeinen Formel ist, wobei
R′ = aliphatische Kohlenwasserstoffkette mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen,
P = Amino- oder Amidogruppe des Proteins.

3. Analytikum gemäß einem der Ansprüche 1 und/oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Molverhältnis Hapten zu Protein 1 : 1 bis 1 : 7 beträgt.

4. Analytikum gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß das Protein Rinderserumalbumin (BSA), Schafserumprotein oder Immunglobulin G (IgG) ist.

5. Analytikum gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß das Molverhältnis anti-Hapten-Antikörper zu Protein etwa 1 : 1 ist.

6. Analytikum gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß der anti-Hapten-Antikörper ein Immunglo­ bulin G (IgG) ist.

7. Analytikum gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß der anti-Hapten-Antikörper poly- oder monoclonal ist.

8. Analytikum gemäß einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß das Protein ein Enzym, wie Peroxidase, Phosphatase, β-Galaktosidase oder Urease, ist.

9. Analytikum gemäß Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß die Peroxidase HRP (Horse Radish Peroxidase) ist.

10. Analytikum gemäß einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß es Teil eines ELISA-Kits (enzyme-linked immunosorbent assay) ist.

11. Analytikum gemäß Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß das Kit für einen kompetitiven ELISA zusammengestellt ist.

12. Analytikum gemäß einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß das Hapten-Protein-Konjugat immobilisiert als Festphasenmatrix vorliegt.

13. Analytikum gemäß einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß der anti-Hapten-Antikörper immobilisiert als Festphasenmatrix vorliegt.

14. Analytikum gemäß Anspruch 12 oder 13, dadurch gekennzeichnet, daß die Festphasenmatrix eine Kunststoffoberfläche aus Polystyrol ist.

15. Hapten-Protein-Konjugat, wie in 1. und 2. im Anspruch 1 bezeichnet, geeignet zur Herstellung eines Hapten- Analytikums nach einem der Ansprüche 1 bis 14.

16. Anti-Hapten-Antikörper-Protein-Konjugat, wie in 3. im Anspruch 1 bezeichnet, geeignet zur Herstellung eines Hapten-Analytikums nach einem der Ansprüche 1 bis 14.

17. Verfahren zur Herstellung eines Pteridin/Pterin-Protein- Konjugats, wie in 1. und 2. des Anspruchs 1 bezeichnet, gekennzeichnet durch folgende Verfahrensschritte:

• 1. Umsetzung des Pteridins/Pterins mit dem bifunktionel­ len Spacer der Formel I, wobei eine funktionelle Gruppe des Spacers mit der Aminofunktion des Pteri­ dins/Pterins unter Ausbildung einer kovalenten Bin­ dung reagiert und
• 2. weitere Umsetzung des gebildeten Produkts mit dem Protein zum Pteridin/Pterin-Protein-Konjugat, wobei Sulfhydrilgruppen des Proteins oder des in vorge­ schaltetem/en Reaktionsschritt/en entsprechend durch weitere Spacer modifizierten Proteins mit einer anderen funktionellen Gruppe des Spacers reagieren.

18. Verfahren gemäß Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß die Reaktion zwischen Pteridin/Pterin und Spacer bei einem pH-Wert von 8 bis 9 durchgeführt wird.

19. Verfahren gemäß Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, daß als zusätzliches Lösungsmittel Dimethylformamid (DMF) zugegeben wird.

20. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 17 bis 19, dadurch gekennzeichnet, daß in dem/den vorgeschaltetem/en Reaktions­ schritt/en in das Protein Sulfhydrilgruppen eingeführt werden.

21. Verfahren gemäß Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, daß die Sulfhydrilgruppen durch Reduktion erzeugt werden.

22. Verfahren gemäß Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, daß zur Reduktion Thiol eingesetzt wird.

23. Verfahren gemäß Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, daß das Thiol Mercapthoethanol (ME), Dithiothreitol (DTT) oder Dithioerythritol (DTE) ist.

24. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 21 bis 23, dadurch gekennzeichnet, daß die Reduktion bei einem pH-Wert von 7 bis 8 durchgeführt wird.

25. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 20 bis 24, dadurch gekennzeichnet, daß 10 bis 15 mol Sulfhydrilgruppen pro mol Protein eingeführt werden.

26. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 17 bis 19, dadurch gekennzeichnet, daß in dem/den vorgeschaltetem/en Reaktions­ schritt/en Sulfhydrilgruppen mittels eines weiteren Spacers in das Protein eingeführt werden.

27. Verfahren gemäß Anspruch 26, dadurch gekennzeichnet, daß der weitere Spacer zunächst eine -S-S- oder -S-Gruppe ent­ hält, die erst durch eine weitere Reaktion, vorzugsweise mit Reduktionsmitteln, in eine Sulfhydrilgruppe umgebildet wird.

28. Verfahren gemäß Anspruch 27, dadurch gekennzeichnet, daß der weitere Spacer die allgemeine Formel hat, wobei
R = aliphatische Kohlenwasserstoffkette mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen.

29. Verfahren gemäß Anspruch 28, dadurch gekennzeichnet, daß der weitere Spacer N-Succinimidyl-S-Acetylthio-acetat (SATA) ist.

30. Verfahren gemäß Anspruch 27, dadurch gekennzeichnet, daß der weitere Spacer die allgemeine Formel hat, wobei
R′ = aliphatische Kohlenwasserstoffkette mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen, aromatischer Kohlenwas­ serstoff oder Heteroaromat,
R = aliphatische Kohlenwasserstoffkette mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen.

31. Verfahren gemäß Anspruch 30, dadurch gekennzeichnet, daß der weitere Spacer Succinimidyl-3-(2-pyridyldithio)propionat (SPDP) ist.

32. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 17 bis 31, dadurch gekennzeichnet, daß das Protein durch Einführung von 10 bis 15 mol weiterer Spacer pro mol Protein modifiziert wird.

33. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 17 bis 32, dadurch gekennzeichnet, daß der Verfahrensschritt 2) in einer auf den pH-Wert 7,5 bis 9 gepufferten Lösung ausgeführt wird.

34. Verfahren gemäß Anspruch 33, dadurch gekennzeichnet, daß die nicht umgesetzten Sulfhydrilgruppen durch an sich bekannte Reagenzien geblockt werden.

35. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 17 bis 34, dadurch gekennzeichnet, daß das Molverhältnis Pteridin/Pterin zu Protein auf Werte von 1 : 1 bis 1 : 7 eingestellt wird.

36. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 17 bis 35, dadurch gekennzeichnet, daß als Protein Rinderserumalbumin (BSA), Schafserumalbumin oder Immunglobulin G (IgG) eingesetzt wird.

37. Verfahren zur Herstellung eines anti-Pteridin/Pterin-Anti­ körper-Protein-Konjugats gemäß 3. des Anspruchs 1, gekenn­ zeichnet durch folgende Verfahrensschritte:

• 1. Umsetzung des anti-Pteridin/Pterin-Antikörpers oder des Proteins mit dem bifunktionellen Spacer der For­ mel III, wobei eine funktionelle Gruppe des Spacers mit einer Amino- oder Amidogruppe des anti-Pteridin/ Pterin-Antikörpers oder des Proteins unter Ausbildung einer kovalenten Bindung reagiert und
• 2. weitere Umsetzung des so gebildeten Produktes mit dem Protein oder dem anti-Pteridin/Pterin-Antikörper zum gewünschten Konjugat, wobei durch vorgeschaltete/n Reaktionsschritt/e in den noch nicht in Verfahrens­ schritt 1) umgesetzten Reaktionspartner weitere bifunktionale Spacer eingebracht wurden und eine andere funktionelle Gruppe des an den in Verfahrensschritt 1) an den einen Reaktionspartner gebundenen bifunk­ tionalen Spacers mit den/dem weiteren bifunktionalen Spacer/n unter Ausbildung von -S-S-Gruppen reagiert.

38. Verfahren gemäß Anspruch 37, dadurch gekennzeichnet, daß der weitere bifunktionale Spacer die allgemeine Formel hat, wobei
R = aliphatische Kohlenwasserstoffkette mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen.

39. Verfahren gemäß Anspruch 38, dadurch gekennzeichnet, daß der Spacer N-Succinimidyl-S-Acetylthioacetat (SATA) ist.

40. Verfahren gemäß Anspruch 37, dadurch gekennzeichnet, daß der weitere bifunktionale Spacer die allgemeine Formel hat, wobei
R′ = aliphatische Kohlenwasserstoffkette mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen, aromatischer Kohlenwas­ serstoff oder Heteroaromat,
R = aliphatische Kohlenwasserstoffkette mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen.

41. Verfahren gemäß Anspruch 40, dadurch gekennzeichnet, daß der Spacer Succinimidyl-3-(2-pyridyldithioacetat)propionat (SPDP) ist.

42. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 37 bis 41, dadurch gekennzeichnet, daß das Molverhältnis anti-Pteridin/Pterin- Antikörper zu Protein so gewählt wird, daß im Konjugat weder der Antikörper noch das Protein seine Aktivität verliert.

43. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 37 bis 42, dadurch gekennzeichnet, daß als Proteine Enzyme, nämlich Peroxidase, Phosphatase, β-Galaktosidase oder Urease eingesetzt werden.

44. Verfahren gemäß Anspruch 43, dadurch gekennzeichnet, daß die Peroxidase HRP (Horse Radish Peroxidase) ist.

45. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 37 bis 44, dadurch gekennzeichnet, daß das Molverhältnis anti-Pteridin/Pterin- Antikörper zu Protein etwa 1 : 1 beträgt.

46. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 37 bis 45, dadurch gekennzeichnet, daß der anti-Pteridin/Pterin-Antikörper poly- oder monoclonal ist.

47. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 37 bis 46, dadurch gekennzeichnet, daß der anti-Pteridin/Pterin-Antikörper ein Immunglobulin G (IgG) ist.

48. Verwendung des Hapten-Protein-Konjugates gemäß Anspruch 15 zur Immunisierung.

49. Verwendung des Anti-Hapten-Antikörper-Protein-Konjugats gemäß Anspruch 16 zur Markierung von Pteridin/Pterin.