JPH01201158A - ヘテロ２官能性結合試薬 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、診断アッセイに用いるための、タンパク質を
タンパク質に、またはタンン”り質を固相に共有結合さ
せるための結合試薬に関する。

（従来の技術および発明か解決しようとする課題）酵素
のようなタンパク質をリンカ−１λを介して抗体のよう
な他のタンパク質に結合させて酵素イムノアッセイ（Ｅ
ＩＡｓ）に用いることのできる結合体を生成させる充分
に確立されている。しかしながら、このようなタンパク
質−タンパク質結合体は、しばしばタンパク質の少な（
とも一方の活性が下がったり変化したりすることを伴っ
ていた。

過去においてタンパク質−タンパク質結合体は、結合し
ようとするタンパク質分子に比べるとかなり短いヘテロ
２官能性結合試薬を用いて生成させていた。タンパク質
のコンホメーションの自由度を制限することによりタン
パク質の機能（たとえば酵素については初期速度、交代
数およびＫｍ、抗体については親和性など）が悪影響を
受け、そのため酵素−抗体結合体の個々の成分が未結合
のものに比べて活性か劣るようになると信じられている
。このことは酵素−抗体結合体の生物活性を制限しイム
ノアッセイへの応用を妨げるものとして問題であった。

タンパク質の固相への結合はまた、過去において込み合
い（ｆｒｅｑｕｅｎｔ＞の問題を伴っていた。たとえば
診断アッセイにおいて、特異的結合成分またはその結合
相手か存在するかどうか、またある種のアッセイにあっ
てはどの位存在するかを検出するために、特異的結合成
分とその結合相手とのあいだの反応がしばしば用いられ
る。診断アッセイの一つの型においては、特異的結合成
分（たとえば抗体）を試料中で検出するのに、その結合
相手（たとえば抗原）を試料に加え、両試薬のあいだで
反応が起こるかどうかを決定することにより行う。

別の方法としては、特異的結合成分を試料に加え、反応
が起こるかどうかを決定することにより、試料中に存在
するその結合相手自体をも検出することができる。反応
が起こったかどうかを決定することはしばしば困難であ
るので、第二の特異的結合成分を試料に加える。第二の
特異的結合成分は第一の特異的結合成分かまたはその結
合相手と反応することができ、この第二の特異的結合成
分は検出可能な標識を有している。もちろん、検出しよ
うとする物質が試料中にどの位の量で存在するかは知ら
れていないので、標識した第二の特異的結合成分をどの
位の量で加えなければならないかを前以て決定すること
は不可能である。

従って、標識特異的結合成分は、そのような試料に一般
に見出だされる物質の最大濃度の過剰量で加える。しか
しながら、結合した標識成分のみを検出して物質が確か
に試料中に存在することを示すことができるように、物
質と結合しない標識特異的結合成分は試料から分離しな
ければならない。

未結合標識成分から結合標識成分を分離するための一般
的な方法は、固相分離法を用いることである。そのよう
な分離法の典型的な例には、第一の特異的結合成分（第
一の特異的結合成分の結合相手のアッセイの場合）また
はその結合相手（特異的結合成分のアッセイの場合）を
固相（微細粒子など）に結合させることか含まれる。こ
のような固相は、たとえば濾過や重力沈降により試料か
ら分離することができる。固相に結合しているかまたは
試料中に以前存在する標識は、最初の試料中に存在する
検出物質の量に比例する。

この固相分離法の変法もまた開発されているが、たいて
いのそのような方法には、固相に結合させた特異的結合
成分に分析しようとする物質を結合させることが含まれ
ている。この結合は、アッセイを行う上で非常に重要で
ある。しかしながら、固相と特異的結合成分とのあいだ
の結合がこの結合に影響を与え得る。例をとって問題点
を説明する。抗体は、非常に特異的な構造的、空間的お
よび極性的空間配置を有しており、そのことによって分
析対象物の１つの型を認識結合するが実質的に他のいか
なる分析対象物をも認識結合しないという能力を付与さ
れる。抗原の検出のためのアッセイに抗体を用いるとき
は、抗体を固相に結合させることができる。しかしなが
ら、固相が抗体に近接するため抗原の結合する部位が妨
げられる。

または抗体と固相とのあいだの結合（通常、共有結合）
が抗体の構造（コンホメーション）を変化させ、抗体の
分析対象物への結合に悪い影響を与えることがある。同
じことは分析対象物、とりわけタンパク質の固相への結
合の場合にも当てはまる。

分析対象物のコンホメーションは結合した途端に変化す
ることがあるため、試料中に存在する遊離の抗体はもは
や分析対象物を認識することができない。

ヘテロ２官能性試薬を用いてタンパク質を固相へ共有結
合的に付着させることが、過去において種々の結果で達
成されている。ある場合にはタンパク質は固相に直接結
合されていた。一般に結合しているつなぎ（ｔｅｔｈｅ
ｒ）は、結合したタンパク質の大きさに比べてかなり短
かった。このことは、立体的に込み合っていること、結
合部位に近寄り難いことなどのために結合タンパク質が
その生物学的機能を行う上で依然妨げとなっているとい
う点で不利である。このことが、過去において誘導体化
した固相の生物活性および安定性を制限する問題であっ
た。

（課題を解決するための手段） 本発明は、一般式（Ｉ）： （式中、Ｘは直鎖中に３〜１０個の炭素原子を有する置
換または非置換アミノ酸、Ｒはアルキル基、シクロアル
キル基、アルキル−シクロアルキル基または芳香族炭素
環、ｎは１〜１０の整数である）で示されるヘテロ２官
能性結合試薬に関する。

本発明はまた、上記新規な結合基への固相の結合体にも
関し、該新規な結合基は、固相をタンパク質、抗体、抗
原なとの物質に結合させるのに用いることができる。こ
れらの結合体は親水性であるため溶液中では非常に安定
であり、上記物質を固相に結合させたときに上記物質の
コンホメーションを保持する。同時に、これらの結合基
は、固相かＬ記物質上の結合部位を妨げることがないよ
うな長さである。

本発明の診断アッセイに用いるための結合体は、一般式
（ビ）・ （式中、Ｂは酵素標識、抗体または抗体断片、ＱはＢが
酵素標識であるときに抗体または抗体断片、Ｂが抗体ま
たは抗体断片であるときに酵素標識、Ｘは直鎖中に３〜
１０個の炭素原子を有する置換または非置換アミ／酸、
Ｒはアルキル基、シクロアルキル基、アルキル−／クロ
アルキル基または芳香族炭素環、ｎは１〜１ｏの整数で
ある）て示されるものである。

本発明の固相結合体は、一般式（ＩＩ）；ハ （式中、Ｂパ°は固相物質を有するアミン、Ｘは直鎖中
に３〜１０個の炭素原子を有する置換または非置換アミ
ノ酸、ｎは１〜１ｏの整数、Ｒはアルキル基、シクロア
ルキル基、アルキル−シクロアルキル基または芳香族炭
素環である）で示されるものである。

不発明はまた、一般式（■）： （式中、Ｑ”″はＳＨ基もしくはチオール基を有するペ
プチド、ポリペプチドまたはタンパク質てあり、Ｂパ°
、Ｘ、ｎおよびＲは前記と同じ）で示される結合体にも
関する。

本発明はさらに、一般式（■）： （式中、Ｘは直鎖中に３〜１０個の炭素原子を有する置
換または非置換アミノ酸、Ｒはアルキル基、シクロアル
キル基、アルキル−シクロアルキル基または芳香族炭素
環、ｎは１−１０の整数、Ｑ゛はハプテン、Ｂｏはポリ
アミノ酸、ｒは１〜約２０の整数である）で示される免
疫原にも関する。

本発明はまた、一般式（■“）： （式中、Ｘは直鎖中に３〜ＩＯ個の炭素原子を有する置
換または非置換アミノ酸、Ｒはアルキル基、シクロアル
キル基、アルキル−シクロアルキル基または芳香族炭素
環、ｎは１〜１０の整数、Ｑ”は酵素または抗体、Ｂ”
はＱ”′が抗体であるときに酵素、Ｑ”が酵素であると
きに抗体、ｒ′は１〜５０の整数である）で示される抗
体−酵素結合体に関する。この結合体を用いて、単一の
抗体に多くの酵素マーカーを、または逆に単一の酵素に
多くの抗体を付着させてイムノアッセイにおいて大きな
応答を得ることかできる。

（発明の構成および効果） 本発明の一般式（１）で示される結合試薬は、タンパク
質を同相に、酵素を抗体に、ハブテンをハブテン担体に
、または事実上すべてのタンパク質を他のタンパク質に
結合させるために用いることができる。そのような結合
体に本発明の結合試薬を用いることにより、抗体、酵素
またはタンパク質の正常な活性が保持された結合体を得
ることができる。従来の結合試薬では、結合させようと
するタンパク質の大きさに比へて全体の長さが短いため
に、得られた結合体は、個々のタンパク質のコンホメー
ションの自由度が損なわれたものであると（言しられて
いる。このコンホメーションの自由度か失われることに
より結合体中のどちらかのタンパク質または両方のタン
パク質の活性が下がり、その結果、ＥＩＡｓが満足のい
くものでな（なり、試薬の安定性も悪くなる。従って、
従来の結合試薬は有用性に限界かある。

本発明の結合試薬におけるアミノ酸の長くて親水性の鎖
は、結合タンパク質のあいだの物理的な隔離をよくする
のみならず、従来の結合試薬においてしばしば用いられ
る疎水性のスペーサー基とは対照的に、溶液中の水によ
り充分に溶媒和される。従って、本発明の結合試薬は、
水溶液中で用いるのに適している。

既に述べたように、本発明はまた、［アミンを有する固
相」の結合体にも関する。そのような固相には、アミン
基（第一、第二または第三アミン基）を有するポリマー
、ガラスおよび天然産物か含まれる。そのようなアミン
基は、マレイミドと反応して安定な共有結合を形成する
ことができる。

広範囲の種類の固相がこの定義に含まれ、たとえば、市
販のポリスチレンアミノ化粒子、アミノンリカゲル、部
分加水分解ナイロン、部分還元ポリアクリルアミド、部
分還元シアノアクリレート、およびそのようなポリマー
を含有するコポリマーが挙げられる。還元されてアミン
基を生成するニトリル基を含有する固相からも、本発明
の「アミンを有する固相」が得られる。

微細粒子固相を用いるのが好ましいが、ビーズ、シート
、球、フィルターなどの池の形態の固相を用いることも
できる。しかし、特に興味深い固相の形態の一つは繊維
である。上述した多（のポリマーが繊維の形態で入手可
能である。これらの繊維は、切ったもの（ｃｈｏｐｐｅ
ｄ）　（非連続）かまたは連続的なものであってよいが
、連続的なものが好ましい。連続的な繊維は本発明の結
合基で誘導体にすることができ、抗体などのタンパク質
を該結合基に結合させることができる。ついでタンパク
質を有する繊維は、布、マット、または織もしくは不織
フィルターなどの固体支持体に縫ったり織ったりするこ
とができる。繊維は、特徴的なパターンに縫ったり織っ
たりすることかできる。たとえば、米国特許出願第８３
１．０１３号明細書に開示されているように、繊維をプ
ラス（＋）の記号に配列し、縦の棒を陽性対照に、横の
棒を陰性対照にすることかできる。従って、この縫った
繊維を用いてアッセイを行ったときには、媒体に通した
試料が中に分析対照物を含有している場合にはプラスの
記号が現れ、試料中に分析対照物が存在しない場合には
マイナス（横棒のみ）の記号が現れるであろう。

池の方法は、本発明の結合基を繊維に付着させ、この繊
維を不活性な支持物質（すなわちマレイミド基を有さな
い物質）中へ縫い込み、結合基上のマレイミド基にタン
パク質を反応させることである。

置換基「Ｑ“′°」は、−３Ｈまたはチオールを有する
ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質である。本発
明の結合基との反応を都合よくするために、本発明の結
合基に結合させようとするペプチド、ポリペプチドまた
はタンパク質は、反応性のチオール（メルカプト）また
はスルフヒドリル（−３Ｈ）基を有している。メルカプ
ト基はスルフヒドリル基を包含すると認められるが、本
発明ではペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質はメ
ルカプト基でないスルフヒドリル基で人工的に誘導体に
することができ、メルカプト基とはスルフヒドリル基を
含有する有機化合物であると意図している。ペプチド、
ポリペプチドまたはタンパク賃上のスルフヒドリル基は
本発明の結合基上のマレイミド残基と反応して本発明の
結合基とペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質との
あいだに共有結合を生成する。

本明細書においてＲとして用いている「アルキル−シク
ロアルキル」にはシクロアルキル環構造に結合したアル
キル基が含まれ、その場合、アルキル基は／クロアルキ
ル基をマレイミド基またはカルホニル基に結合させる。

本明細書において「アルキル」とは直鎖または分枝鎖ア
ルキル基、好ましくは炭素数１〜６の低板アルキル基を
いう。

つぎに実施例に基ついて本発明をさらに詳しく説明する
か、本発明はこれらに限られるものではない。

実施例１〜８には、本発明の種々の結合基の合成を記載
しである。実施例９〜２７には、本発明の結合基を固相
をタンパク質に、タンパク質をタンパク質に結合させる
ために使用することか記載されている。

実施例１［化合物ｌ（式ＩにおいてＲ−シクロヘキシル
メチル、ｎ−１，Ｘ＝６−アミ７カブロイル）の合成］ ニ ドランス−４−（アミ／メチル）シクロヘキサンカルボ
ン酸をアルドリッチ・ケミカル社より購入し、ヨシタケ
（Ｙ　ｏｓｈｉｔａｋｅ）らの方法（Ｊ、　１３　ｉｏ
ｃｈｅｍ、　。

１０１：３９５〜３９９（１９７９））によりＮ−（４
−カルホキシシクロヘキンルメチル）マレイミドに変換
させた。ついでこの物質（１００ｘｙ）を乾燥ジメチル
ホルムアミド（ＤＭｐ）（１，ｏＲ□中に溶解し、６−
アミノカプロン酸（３９，２＋ｙ、１．０当量）を加え
、得られた混合物を窒素雰囲気下、室温で一夜撹拌する
。翌朝、ジンクロヘキンルカルボジイミド（ＤＣＣＩ）
（６７，８Ｑ、１．１当量）を加え、反応混合物をさら
に６時間撹拌する。沈でんしたシンクロヘキシル尿素（
ＤＣＵ）を濾過にて除き、得られたＤＭＦ溶液を減圧下
に蒸発させて粘着性の固体を得、これを７リカゲル上の
フラ。

シュクロマトグラフィー（５％メタノール／クロロホル
ム）で精製して白色固体として化合物１（７１Ｍ９）を
全収率５３％で得る。

実施例２［化合物２（式ＩにおいてＲ＝ヨシロヘキシル
メチル、ｎ＝２、Ｘ＝６−アミ７カブロイル）の合成］ ヱ 実施例１で得た化合物１（１００ｘｌ／）を乾燥ＤＭＦ
　（１、０ＪＩＣ）中に溶解し、ついで６−アミノカプ
ロン酸（２９，３，１９，１，０当量）を加え、得られ
た混合物を窒素雰囲気下、室温で一夜撹拌する。翌朝、
ＤＣＣＩ　（５０，７Ｍ９．１．１当量）を加え、反応
混合物をさらに６時間撹拌する。固体の沈でん（ＤＣＵ
）を濾過にて除き、得られたＤＭＦ溶液を減圧下で蒸発
させて粘着性の固体を得、これをシリカゲル上のフラッ
シュクロマトグラフィー（１０％メタノール／クロロホ
ルム）で精製して白色固体として化合物２（６０ｍｇ）
を全収率４８％で得る。

Ｘｔｄ’ｌ１３［化合物３（式■においてＲ−シクロヘ
キシルメチル、ｎ＝３、Ｘ＝６−アミ７カブロイル）の
合成］ 旦 実施例２で得た化合物２（ｌｏｏａｙｙ）を乾燥ＤＭＦ
（２，０ＩＱ）中に溶解し、ついで６−アミノカプロン
酸（２３，４３１９，１，０当量）を加え、得られた混
合物を窒素雰囲気下、室温で一夜撹拌する。翌朝、ＤＣ
ＣＩ（４０，５所、１．１当量）を加え、反応混合物を
さらに６時間撹拌する。固体の沈でん（ＤＣＵ）を飽過
にて除き、得られたＤＭＦ溶液を減圧下で蒸発させて粘
着性の固体を得、これをシリカゲル上のフラッシュクロ
マトグラフィー（１０％メタノール／クロロホルム）で
精製して白色固体として化合物３（６０，０ＪＩ！？）
を全収率５０％で得る。

衷塁ＦＩ　４　［化合物４（式ＩにおいてＲ−シクロヘ
キシルメチル、ｎ＝４、ｘ＝６−アミ７カブロイル）の
合成１ Ａ 実施例３で得た化合物３（１００ｘ９）を乾燥ＤＭＦ（
１０，０ｍｆ２）中に溶解し、ついで６−アミノカプロ
ン酸（１９゜５戻９．１．０当Ｍ）を加え、得られた混
合物を窒素雰囲気下、室温で一夜撹拌する。

翌朝、ＤＣＣＩ（３３，７２Ｑ、１，１当量）を加え、
反応混合物をさらに６時間撹拌する。固体の沈でん（Ｄ
ＣＵ）を濾過にて除き、得られたＤＭＦ溶液を減圧下で
蒸発させて粘着性の固体を得、これをンリカゲル上のフ
ラッシュクロマトグラフィー（１０％メタノール／クロ
ロホルム）で精製して白色固体として化合物４（５３Ｑ
）を全収率４５％で得る。

実施例５（延長された長さのＭＢＳリンカニの合成） （ａ）化合物５（式ＩにおいてＲ＝３．５−ジ置換ベン
ゼン環、ｎ−１、Ｘ＝６−アミノカプロン酸）の合成 キタガワ（Ｋ　ｉ　ｔａｇａｗａ）らの方法（Ｊ　、　
Ｂ　ｉｏｃｈｅｍ、　。

７９　：２３３〜２３６（１９７６））により調製した
メタマレイミドベンゾイルＮ−ヒドロキシスクシンイミ
ドエステル（ＭＢＳ）の乾燥ＤＭＦ中の０゜１５Ｍ溶液
を６−アミノカプロン酸（１当量）で処理し、窒素雰囲
気下、室温で一夜撹拌する。翌朝、ＤＣＣＩ（１，Ｑ当
量）を加え、反応混合物を室温でさらに６時間撹拌する
。ついで沈でんしたＤＣＵを濾過にて除き、ＤＭＦを高
真空下で蒸発させて粗製の生成物５を得、これをシリカ
ゲルカラム上のフラッシュクロマトグラフィーで精製す
る。

（ｂ）延長された長さの活性エステルの一般的合成法 ＭＢＳまたは他の活性エステルに基づいて一層長いリン
カ−アームを合成するには、Ｎ−ヒドロキシスクシンイ
ミジルエステルを有する化合物（たとえば上記工程（ａ
）の化合物５）のＤＭＦ溶液を６−アミノカプロン酸（
１，０当量）で処理し、もはやＴＬＣで活性エステルが
認められなくなるまで窒素雰囲気下、室温で撹拌する。

ついてＤＣＣ１（１，１当量）を加えると反応混合物は
ＴＬＣで見ることができる。ついで沈でんしたＤＣｔＪ
を濾過にて除き、ＤＭＦを減圧下で蒸発させて粗製の残
渣を得、これをシリカ上のフラッシュクロマトグラフィ
ーで精製する。

この手順は活性エステル中に６−アミノカプロン酸残基
を挿入し、活性エステルをさらに再合成する。この手順
を６−アミノカプロン酸または他のアミノ酸を用いて繰
り返すことによって所望の長さの試薬を得ることができ
る。

実施例６（延長された長さのＭＣ３試薬の合成）（ａ）
化合物６（式ＩにおいてＲ＝１．５−ジ置換ペンチル基
、ｎ＝１、Ｘ＝６−アミノカプロイル）の合成 ケラ−（Ｋｅｌｌｅｒ）およびルーディンガー（Ｒｕｄ
ｉｎｇｅｒ）の方法（Ｈｅｌｖ、　Ｃｈｉｍ、　Ａｃｔ
ａ、　５８　：５３１〜５４１（１９７５））により調
製した６−マレイミドカプロン酸Ｎ−ヒドロキシスクシ
ンイミドエステル（ＭＣＳ）の乾燥ＤＭＦ中のＯ，１５
Ｍ溶液を６−アミノカプロン酸（１当量）で処理し、窒
素雰囲気下、室温で一夜撹拌する。翌朝、ＤＣＣＩ（１
゜１当量）を加え、反応混合物を室温でさらに６時間撹
拌する。ついで沈でんしたＤＣＵを濾過にて除き、ＤＭ
Ｆを高真空下で蒸発させて粗製の生成物６を得、これを
シリカゲルカラム上のフラッシュクロマトグラフィーで
精製する。化合物６の一層長い類似体は、実施例１０工
程（ｂ）に記載した一般的な同族配列法により行うこと
ができる。

実施例７［化合物１２（式ＩにおいてＲ＝シクロヘキシ
ルメチル、ｎ−４、Ｘ−グリノル）の合成］ （ａ）化合物７の合成 ＣＢＺ−トリグリシン（４，０ｇ、バーチエム・ケミカ
ル（Ｂ　ａｃｈｅｍ　Ｃｈｅｍ、　Ｃ○、）社）を乾燥
ＤＭＦ（５０，０虜Ｑ）中に溶解する。Ｎ−ヒドロキジ
スクンンイミド（１，４２９，１，０当量）およびＤＣ
ＣＩ　（２，５５９，１，０当ｍ）を加え、得うｈ　ｆ
ニー　？ｆｉ　合物を窒素雰囲気下、室温で一夜撹拌す
る。翌朝、沈でんしたＣＣＵを〜過にて除き、得られた
ＤＭＦ溶液を減圧下で蒸発させて黄色の油を得る。酢酸
エチル／クロロホルムから再結晶させて中間体化合物７
（３，０９）を収率５７％で得る。

（ｂ）化合物８の合成 溢 グリシンし一ブチルエステル塩酸塩（０，５４Ｌｉ、シ
グマ・ケミカル社）を乾燥ＤＭＦ（２５，ＯｚＯ中に懸
濁する。ついで上記工程（ａ）で得た化合物７（１，３
，５９，１，０当量）をトリエチルアミン（１゜６２９
．５．０当量）とともに加える。得られた溶液を窒素雰
囲気下、室温で一夜撹拌する。翌朝、減圧下で溶媒を除
いて粗製の生成物を得る。酢酸エチル／クロロホルムか
ら再結晶させて中間体化合物８（０，９５ｙ）を収率６
８％で得る。

（ｃ）化合物９の合成 旦 上記工程（ｂ）で得た化合物８（０，９５９）を乾燥メ
タノール（３００Ｒ□中に溶解する。ついで氷酢酸（０
，４５ｉ１２）を加え、窒素ガスで１５分間パー７する
。ついて炭素上のパラジウム（１，５ｈ、パラジウム含
量１０％）を注意深く加え、その間、混合物を撹拌する
。水素ガス流を室温で３時間、撹拌溶液中に通す。溶液
を窒素ガスで１５分間注意深くパージし、ついて認過す
る。応液を減圧下で濃縮して中間体化合物９　（７００
ｉｙ）を酢酸塩として得る。

（ｄ）化合物１０の合成 ユ 上記工程（ｃ）で得１こ化合物９（７００ｍ９、酢酸塩
）を乾燥ＤＭＦ（２５ｉＱ）中に溶解する。ついて実施
例１で得たＮ−（４−カルホキシンクロヘキシルメチル
）マレイミド（６９７ｍ９）を加え、混合物を窒素雰囲
気下、室ｌ晶で一夜撹拌する。翌朝、ＤＭＦを減圧下で
蒸発させて粗製の生成物を得る。酢酸エチル／ヘキサン
から再結晶させて中間体化合物１０を収率２２％で得る
。

（ｅ）化合物１１の５合成 二 上記工程（ｄ）で得た化合物１０（２２５１１ｙ）をク
ロロホルム（１、５ｙｈ（’）中に懸濁する。ついて乾
燥トリフルオロ酢酸（１，５肩Ｑ）を加え、混合物を窒
素雰囲気下、室温で３時間撹拌する。溶媒を減圧下で蒸
発させて粗製の生成物を得る。酢酸エチルで滴定して中
間体化合物１１（１２７βｇ）を収率６１％で得る。

（ｆ）化合物１２の合成 ■ 上記工程（ｅ）テ得た化合物１１　（１００７９）′ｆ
！：、Ｎ〜ヒトロキンスクンンイミド（３７，１：Ｒｈ
、１５当量）およびＤＣＣＩ（２２１，５Ｑ、５０当量
）とともに乾燥Ｄ　Ｍ　Ｆ　（７、Ｏｚ（り中に溶解す
る。反応混合物を窒素雰囲気下、室温で一夜撹拌する。

翌朝、沈でんしたＤＣＵを嬶過にて除き、ＤＭＦを減圧
下で蒸発させて粗製の固体を得る。クロロホルムで滴定
して化合物１２（８６ｘ９）を収率６０％で得る。

化合物１２は、以下に記載する手順を用いてタンパク質
（たとえば抗体や酵素など）を固を目に結合するのに用
いることかできる。

実施例８（メターマレイミトヘンゾイルカブロアミドー
Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドの合成） 坦 マグ不チノクスターラーを備えた丸底フラスコに、ＤＭ
Ｆ（０，ＯｍＱ）中に溶解したメタ−マレイミドヘンシ
イルーＮ−ヒトワキ／スクシンイミドエステル（０，３
１４ｇ、０．００１モル、ピアス・コーホレー／ヨンよ
り入手）を入れる。６−アミノカプロン酸（０，１３１
９，１当量）を加え、得られた溶液を窒素雰囲気下、室
温で一夜撹拌する。

１８時間後、ＤＣＣＩ（０，２０６９，１，１当量）を
加え、ついでＮ−ヒドロキシスクシンイミド（０，１１
５ｙ、１当量）を加える。反応溶液を窒素雰囲気下、室
温でさらに８時間撹拌する。沈でんしたＤＣＵを濾過に
て除き、得られたＤＭＦ溶液を減圧下で蒸発させる。得
られた固体をシリカゲルクロマトグラフィー（クロマト
グラフィー中の５％メタノール）で精製して化合物１３
を収率５０％で得る。この化合物を実施例２．３および
４に記載の手順と同様にアミノカプロン酸で処理して式
Ｉにおいてｎか１０まででありＲ−フェニルである化合
物を得る。

実施例９（化合物３を用いたモノクローナル抗α−フェ
トプロティンＩｇＧと好つシ腸アルカリホスファターセ
の結合） （ａ）酵素の誘導体化 仔つシ腸アルカリホスファターゼの溶液（２５０μＱ、
１０ｎ／ｘＱ、ベーリンガーマンハイム）をガラスびん
中に入れる。ＤＭＦ中の化合物３の溶液（１００μｆ２
．５．０ｍＭ）を加え、得られた混合物を室温で３０分
間、ロータリーアジテータ−上で撹拌する。粗製の反応
混合物を、溶出液としてｐＨ７，０のリン酸バッファー
（０，１Ｍリン酸、０９１Ｍ　　ＮａＣＬ　　１ｍＭ　
　ＭｇＣ１ｔ、０．１ｍＭ　　ＺｎＣ１，）を用い前以
て平衡化したセフアゾ、クスＧ−２５（粗）カラム上の
クロマトグラフィーて精製する。

カラムからフラクションを集め、酵素を含有するフラク
ションをプールし、２８０ｎｍでの吸光１ｉを測定する
ことによりプールしたフラクションのタンパク質のｌ農
度を評価する。２８０ｎｍでの吸光度はタンパク質の濃
度（、ｌＩｇ／ｌのにほぼ等しいことかわかった。

（ｂ）抗体の誘導体化 モノクローナル抗α−フェトプロティン（ＡＦＰ）Ｉｇ
Ｇ７容１ｆｆｌ　（６、４ｍｇ／　ｍｌ）をインキュベ
ートし、／チオトレイトール（ＤＴＴ）（２５ｍＭ、最
終反応溶液の濃度）とともに室ｌ晶で２０分間ロータリ
ーアジテータ−上で撹拌する。ついで部分的に還元され
た抗体の溶液を、溶出液としてｐＨ７，０のリン酸バ・
７７７−（０，１Ｍリン酸、Ｑ、１Ｍ　　ＮａＣ１，５
ｍＭ　　ＥＲＤＴＡ）を用い前以て平衡化したセファデ
ックスＧ−２５（粗）カラム上のクロマトグラフィーで
精製する。

カラムからフラクションを集め、タンパク質を含有する
フラクションをプールし、２８０ｎｍでの吸光度を測定
することによりプールしたフラクションのタンパク質の
濃度を評価する。この場合、２８０ｎｍでの吸光度を約
数（１，３９）で除したものがタンパク質の濃度（１９
／　ｙＱ’）にほぼ等しいことかわかった。

（ｃ）部分的に還元した抗体と誘導体化したアルカリホ
スファターゼの結合（式■′においてＢ”−仔つシ腸ア
ルカリホスファターセ、Ｒ−シクロヘキシルメチル、Ｘ
−６−アミノカプロイル、ｎ＝３、Ｑ”＝モノクローナ
ル抗ＡＦＰ　　ＩｇＧ、ｒ’−１〜５である結合体の調
製） 上記工程（ａ）で得た誘導体化アルカリ土類金属ターゼ
を上記工程（ｂ）で得た部分的に還元した抗体と、１．
５：１のモル比（酵素：抗体）で混合する。

ａ合物を２〜８°Ｃでロータリーアジテータ−上にて一
夜撹拌する。翌朝、Ｎ−エチルマレイミド（ＮＥＭ）の
溶液（１００μｉ２．５．０ｍＭ）で室ｌ晶にて１時間
処理することにより未反応のチオール基を保護する（ｃ
ａｐｐｅｄ）。こうして得られた１縮結合物は、必要に
応じて希釈し、サンドイッチアッセイや池の標識抗体の
用いられるアッセイに用いることかできる。

実施例１０（化合物１．２または３を用いたβ−ガラク
トシダーセとヤギ抗ウサギＩｇ Ｇの結合） （ａ）化合物ｌでの抗体の誘導体化 ヤ４：抗つサキＩｇＧ（１，ｏｚ９）ヲｐＨ７，０ノ’
Ｊ　７酸バツフアー（１，０ｉｆ２．　１５ｉｆ１Ｍリ
ン酸、１５０ｍＭ　　ＮａＣｌ、１．０ｍＭ　　ＥＤＴ
Ａ）に懸濁する。

ついでこの溶液のアリコー）（４２５μのをＤＭＦ中の
化合物ｌの溶１（ｆ（１２，７５μ＆、６．０ｍＭ）に
加える。１６物をときおり撹拌しながら室温にて暗所で
６０分間インキュベートする。ついて粗製の反応混合物
をｐＨ７，０のリン酸バッファー（２，０＆、１５ｍＭ
リン酸、１５０ｍＭ　　ＮａＣｌ、１ｍＭ　　ＥＤＴＡ
）に対し４°Ｃで暗所にて一夜透析する。透析した物質
を遠心分離により回収し、２８０ｎｍでの吸光度を測定
することにより抗体の濃度を評価する。２８０ｎｍでの
吸光度を約数（１，３８）で除したものか抗体のｔ震度
（Ｒｙ／　ｚＱ）にほぼ等しいことがわかった。

（ｂ）誘導体化抗体と天然のβ−ガラクトンターセの結
合（式■′においてＢ゛°＝ヤギ抗ウサキつｇＣ。

Ｒ＝シクロヘキシルメチル、Ｘ＝６−アミ７カブロイル
、ｎ＝　ｌ、Ｑ”−β−ガラクトシターセ、ｒ”−１〜
５である結合体の調製） 上記工程（ａ）で得た誘導体化抗体を天然大腸菌のβ−
ガラクトシターセ（ｐＨ７，０のリン酸バッファー中に
２５ス９／１１のと、０．６・ｌのモル比（酵素、抗体
）で結合する。混合物を撹拌することなく室温で一夜反
応させてイムノアッセイに使用する結合体の濃縮溶液を
得る。

（ｃ）化合物２での抗体の誘導体化 ヤギ抗ウサギＩｇＧ（１，０９）をｐＨ７，０のリン酸
バッフｙ−（１，ＯｘＯ，１５ｍＭリン酸、１５０ｍＭ
　　ＮａＣ１，１，ＯｍＭ　　ＥＤＴＡ）に懸濁する。

ついでこの溶液のアリコート（４２５μＱ）をＤＭＦ中
の化合物２の溶液（１２，７５μｆ！、　６．０ｆｆｉ
Ｍ）に加える。混合物をときおり撹拌しながら室温にて
暗所で６０分間インキュベートする。ついで粗製の反応
ａ＝物をｐＨ７，０のリン酸バッファー（２，０（，１
５ｍＭリン酸、１５０ｍＭ　　ＮａＣＬｌｍＭ　　ＥＤ
ＴＡ）に対し４°Ｃで暗所にて一夜透析する。透析した
物質を遠心分離により回収し、２８０ｎｍでの吸光度を
測定することにより抗体の濃度を評価する。２８０ｎｍ
での吸光度を約数（１，３８）で除したものが抗体の濃
度（ａｔ／ｚ１２）にほぼ等しいことがわかった。

化合物２で誘導体化した抗体は、上記工Ｆｕ（ｂ）に記
載したようにして天然のβ−ガラクトンダーゼに結合す
ることができる（式■°においてＢ゛°＝ヤキ抗ウサキ
つｇＧ、Ｒ＝ンクロヘキンルメチル、Ｘ＝６−アミノカ
プロイル、ｎ＝２、Ｑ”＝β−ガラクトンダーゼ、ｒ゛
＝１〜５である結合体）。

（ｄ）化合物３での抗体の誘導体化 ヤギ抗ウサギＩｇＧ（１，０幻）をｐＨ７，０のリン酸
バッフｙ　　（１，Ｏｚｇ、１５ｍＭリン酸、１５０ｍ
Ｍ　　ＮａＣＬ　　１．ＯｍＭ　　ＥＤＴＡ）に懸濁す
る。

ついでこの溶液のアリコート（４２５μのをＤＭＦ中の
化合物３の溶ｉ＆（１２，７５μＣ１６，０ｍＭ）に加
える。混合物をときおり撹拌しながら室温にて暗所で６
０分間インキュベートする。ついて粗製の反応混合物を
ｐＨ７，０のリン酸バッファー（２，０Ｑ、１５ｍＭリ
ン酸、１５ＱｍＭ　　ＮａＣ１，１ｍＭ　　ＥＤＴＡ）
に対し４°Ｃで暗所にて一夜透析する。透析した物質を
遠心分離により回収し、２８０ｎｍでの吸光度を測定す
ることにより抗体の濃度を評価する。発明者らのもとで
は、２８０　ｎｍでの吸光度を約数（１，３８）で除し
たものが抗体の、・震度（ｍｙ／＋Ｑ）にほぼ等しいこ
とかわかった。

化合物３で誘導体化した抗体は、上記工程（ｂ）に記載
したようにして天然のβ−ガラクトノターセに結合する
ことかできる（式■′においてＢ”＝ヤギ抗つサキＩｇ
Ｇ、Ｒ−シクロヘキシルメチル、ｘ＝６−アミノカプロ
イル、ｎ＝３、Ｑ’“＝β−ガラクトシターゼ、ｒ′−
１〜５である結合体）。

実施例１１（化合物１を用いたポリクローナル抗ＴＨ３
−アルカリホスファターセ結合 体の調製） （ａ）酵素の誘導体化 仔つン腸アルカリホスファターセ（２５μＱ、　　１０
　ｍ９／　；ｔｒ（１）をＤＭＦ中の化合物１の溶液（
１０μＱ、７．８ｍＭ）を混合し、室温で３０分間反応
させる。

粗製の反応混合物を、遠心分離しなからミニゲル１１８
過（Ｇ−２５セフアテツクス）カラムに通すことにより
精製する。カラムはｐ）（７，０の０．０５Ｍリン酸バ
ッファーで平衡化しである。リンカー−誘導体化酵素の
精製溶液を得る。

（ｂ）抗体の誘導体化 ポリクローナル抗ＴＨ３（甲状腺刺激ホルモン）ＩｇＧ
溶液（２５μＱ、５．３所／Ｉｆ２）を、ｐＨ７，０の
リン酸バッファー（０，５Ｍリン酸）中のＤＴＴの溶液
（２５μＱ、０．１Ｍ）と混合する。混合物を室温で３
０分間反応させ、ついで上記工程（ａ）の誘導体化酵素
の場合と同様にして精製する。

（ｃ）酵素と抗体の結合（弐■“においてＢ”′＝アル
カリホスファターセ、Ｒ−ンクロヘキシルメチル、Ｘ＝
６−アミノカプロイル、ｎ＝１、Ｑｏ”＝ポリクローナ
ル抗Ｔ）（Ｓ　　ＩｇＧ、ｒ’＝１〜５である結合体の
調製） 上記工程（ａ）および工程（ｂ）の生成物を混合し、２
〜８°Ｃで一夜インキユヘートして抗Ｔ）（Ｓとアルカ
リホスファターゼの結合体を得る。この結合体はＴＨ８
のサンドイッチアッセイに用いることができる。

実施例１２（化合物３を用いた西洋ワサビペルオキシタ
ーセとＦａｂ”抗Ｂ型肝炎コア抗体の結合） （ａ）酵素の誘導体化 ｐ）（７，０のリン酸バッファー（０，１Ｍリン酸、０
、ＩＭ　　ＮａＣ１）中の西洋ワサビペルオキシターセ
の溶液（４００μＣ，１０所／ｌのを、ＤＭＦ（２３６
μｍ２）中の化合物３（３，３ｚｙ）の溶液に加える。

混合物を室温で３０分間撹拌し、上記バッファーを用い
セファデツクスＧ−２５（粗）カラム上で脱塩する。フ
ラクションを集め、酵素を含有するフラクンヨンをプー
ルし、２８０　ｎｍでの吸光度を測定することによりプ
ールした酵素の濃度を評価する。２８０ｎｍでの吸光度
を約数（０，６１）で除したものが酵素の濃度（ｍ９／
ＩＫのにほぼ等しいことかわかった。

（ｂ）抗体の誘導体化 抗Ｂ型肝炎コアＩｇＧのＦ　ａｂ’断片の溶液（３，１
奴、３．２ｍｓ／ｉＱ）をガラスびん中に入れる。リン
酸バッファー（ｐＨ７，０，０，５Ｍリン酸、０５Ｍ　
ＮａＣ１，２５ｍＭ　　ＥＤＴＡ）を加える。ついてＤ
ＴＴ（２３，１ＩＲｙ）を加え、混合物を撹拌しながら
室温で２０分間インキユヘートする。

ついで粗製の生成物をＧ−２５セフアデツクスカラム（
ｆｌｕ）上に置き、上記ｐＨ７，０のリン酸ハ。

ファーで溶出する。

フラクンヨンを集め、タンパク質を含有するフラクショ
ンをプールし、２８０ｎｍでの吸光度を測定することに
よりプールしたタンパク質の濃度を評価する。２８０　
ｎｍでの吸光度を約数（１，３８）で除したものが抗体
断片の濃度（ｍ９／　ｘＲ）にほぼ等しいことがわかっ
た。

（ｃ）誘導体化アルカリホスファターゼと抗体断片の結
合（式ＩＶ’においてＢｏ“＝アルカリホスファターゼ
、Ｒ＝シクロヘキンルメチル、Ｘ＝６−アミノカプロイ
ル、ｎ＝３、Ｑ”＝Ｆａｂ’抗Ｂ型肝炎コア抗体、ｒ”
−１〜５である結合体の調製）上記工程（ａ）で得た誘
導体化酵素を上記工程（ｂ）で得た抗体断片と、１．１
（酵素：抗体）のモル比で混合する。混合物を２〜８°
Ｃにてロータリーアジテータ−上で一夜インキユベート
する。翌朝、粗製の結合体混合物をＣｏｎ　　Ａセファ
ロースカラム上を通す。未結合の抗体断片を洗浄して除
き、ついで結合体を０．ＩＭα−メチルグルコシド溶液
で溶出する。回収した結合体をバッファーに対して透析
し、希釈してＢ型肝炎ウィルス粒子のサントイ、チアッ
セイに使用する。

実施例１３（化合物３を用いた仔つ／腸アルカリホスフ
ァターセと大腸菌壁に特異的な ウシγ−グロブリンの結合） （ａ）イミノチオラン（ｉｍｉｎｏｔｈｉｏｌａｎｅ）
での酵素の誘導体化 ｐＨ８，０）リスバッフｙ−（０，０５Ｍトリエタノー
ルアミン（トリス）、Ｉ　Ｑ　ｍＭ　　ＭｇＣ１２、Ｏ
ｌｌ　ｍＭ　Ｚ　ｎＣ１２）中の仔つシ腸アルカリホス
ファターセの溶液（２，０ｘｔ（１，１２，３Ｒ９／ｘ
のに、反応混合物中のイミノチオランの〆農度か４．０
ｍＭとなるようにイミノチオランＨＣｌを加える。反応
混合物を４°Ｃにて１時間撹拌する。ついで未反応のイ
ミノチオランの反応を停止させるために過剰のグリシン
アミドを加える。粗製の反応混合物をＴＳＫ４０カラム
上に置き、上記ｐＨ８，０のトリスバッファーで溶出す
る。カラムのフラクションを集め、酵素を含有するフラ
クンヨンをプールし、２８０ｎｍでの吸光度を測定する
ことによりプールしたタンパク質のＩＱ度を評価する。

２８　Ｏｎ−ｎでの吸光度を約数（０，７６）で除した
ものか酵素の濃度（Ｒ９／ＭＱ＞にほぼ等しいことがわ
かった。

（ｂ）化合物２での抗体の誘導体化 ｐ）１８．０トリスバツフアー（０，５Ｍトリス、０゜
１６Ｍ　　ＮａＣ１，１，ＱｍＭ　　ＭｇＣ１，，０，
１ｍＭＺ　ｎＣ１，）中のつ／γ−グロブリンの溶液（
２，ＯｌＱ、８　、４　ｍｑ／λＱ、大腸菌の細菌壁に
対して産生）を、ＤＭＦ（８５９μＱ）に溶解した化合
物２（３３６２９）の１８液で処理し、混合物を撹拌し
なから４°Ｃで１時間インキュベートする。

粗製の反応混合物をＴＳＫ４０カラム上に置き、上記ｐ
）（８，０のトリスバッファーで〆８出する。

カラムのフラクションを集め、タンパク質を含有するフ
ラクションをプールし、２８０ｎｍての吸光度を測定す
ることによりプールしたタンパク質の濃度を評価する。

２８０ｎｍでの吸光度を約数（１，４０）で除したもの
が酵素の濃度（ｍ９／　ｘｉ２）にほぼ等しいことかわ
かった。（ｃ）酵素と抗体の結合（式■”においてＢ°
′＝ウシγ−グロブリン、Ｒ−シクロヘキシルメチル、
ｘ＝６−アミ７カブロイル、ｎ＝２、Ｑ”−仔つン腸ア
ルカリホスファターゼ、ｒ′＝１〜５である結合体の調
製）上記工程（ａ）で得た誘導体化酵素を上記工程（ｂ
）で得た誘導体化抗体と、１　　ｌ：１（酵素・抗体）
の比で混合し、４°Ｃにて一夜撹拌する。翌朝、粗製の
反応混合物を等容積のｐＨ８，Ｏト’）スバッファ−（
０，０５Ｍ）リス、ｌ　、　ＯｍＭ　　ＭｇＣＩｔ、０
．１ｍＭ　　ＺｎＣ１＝、Ｏ，１６Ｍ　　ＮａＣ１，２
％ウシ而面青アルフ゛ミン（ＢＳＡ）、０．２％アジ化
ナトリウム）に加える。ついでβ−メルカプトエタノー
ル（１０μＱ）を加え、粗製の結合体濃縮物を使用する
ときまでこの形態で貯蔵する。この結合体濃縮物を適当
な希釈液で１：１ＯＯＯ倍に希釈することにより結合体
の約０５μ９／ｘＱ溶液が得られ、これは種々の微生物
のサンドイッチアッセイに用いることができる。

実施例＋４（化合物３を用いたモノクローナル抗ＣＥＡ
　　ＩｇＧと仔つン腸アルカリホスファターセの結合） （ａ）酵素の誘導体化 仔つ／腸アルカリホスファターセの溶液（５０ＯμＱ、
１０　、７　ｍ９／　ｘＱ＞を乾燥ＤＭＦ中の化合物３
の溶１ｆｆｆｉ（２００，ｃｌ、５．０＋ｎＭ）と混合
し、室温で３０分間撹拌する。ついで粗製の反応混合物
を前以て平衡化したセファデックスＧ−２５カラム上に
置き、ｐＨ７，０のリン酸バッファー（０，１〜１リン
酸、０．１Ｍ　　ＮａＣＬ　　１ｍＭ　　ＭｇＣｌ、、
０゜１　ｍＭ　　Ｚ　ｎＣｌ　ｚ）で溶出する。

カラムのフラクションを集め、酵素を含有するフラクン
ヨンをプールし、２８０ｎｍでの吸光度を測定すること
によりプールした酵素の７典度を評価する。２８０　ｎ
ｍでの吸光度はタンパク質の濃度（１ｇ／ｘｃ）にほぼ
等しいことがわかった。

（ｂ）抗体の誘導体化 モノクローナル抗癌胎児性抗原（ＣＥＡ）ＩｇＧの溶液
（３１５μＱ、９．５ｍ９／Ｒのを、ｐｌ（３，０リン
酸バツフアー中のイミノチオランＨＣＩの溶液（０，０
３３ｚ９／ｘ（イミノチオラン、０．１Ｍリン酸、０．
ＩＭ　　ＮａＣ１，５ｍＭ　　ＥＤＴＡ）の５００モル
当量で処理する。反応混合物を室温で３０分間撹拌し、
ついで前以て平衡化したセファデノクスＧ−２５カラム
上に置き、上記ｐＨ８，０のリン酸バッファーで溶出す
る。

カラムのフラクションを集め、抗体を含ａするフラクシ
ョンをプールし、２８０　ｎｍでの吸光度を測定するこ
とによりプールした抗体のｌ農度を評価する。発明者ら
のもとては、２８０ｎｍての吸光度を約数（１，３９）
で除したものが抗体の濃度（ｍ９／Ｉのにほぼ等しいこ
とがわかった。

（Ｃ）酵素と抗体の結合（式■°においてＢ”−仔つシ
腸アルカリホスファターセ、Ｒ−ンクロヘキ／ルメチル
、Ｘ＝６−アミ／カプロイル、ｎ＝３、Ｑ”−モノクロ
ーナル抗ＣＥＡ　　ＩｇＧＸｒ’−１〜５である結合体
の調装） 上記工程（ａ）で得た誘導体化酵素を上記工程（ｂ）で
得た誘導体化抗体と、ｌ　１（酵素抗体）のモル比でｌ
捏合し、２〜８°Ｃにて一夜撹拌する。翌朝、結合体を
適当な希釈液で約１μ９／　：ＲＱの濃度に希釈し、Ｃ
ＥＡのサンドイッチアッセイに直接用いる。

実施例１５（免疫原の合成） （ａ）化合物１によるＢＳＡの官能化 ＢＳＡ（５０，０ｍ９）をｐＨ６，６のリン酸バッファ
ー（０，１Ｍリン酸、５０．１ｌＩＱ）に溶解する。こ
の溶液にＤＭＦ（５００１１ｉ２）中の化合物１（５，
０，ｘ９）の溶液を加える。反応混合物を室温にて一夜
撹拌する。翌朝、粗製の反応混合物をセファデックスＧ
−２５カラムに加え、水で溶出する。

フラクションをカラムから集め、タンパク質を含有する
フラクションをプールし、凍結乾燥して誘導体化ＢＳＡ
（５６Ｒ９）を得る。マレイミド基を滴定することによ
りＢＳＡ当たり約９個のマレイミド基か導入されている
ことか示された。

（ｂ）免疫原の合成（式■においてＢ’＝ＢＳＡ、Ｒ−
／クロヘキシルメチル、Ｘ＝６〜アミ７カブロイル、ｎ
＝　１　、　Ｑ’　＝　Ｔ　Ｓ　）Ｉサブユニ、トペブ
チド、ｒ＝４である結合体の調製） 甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）のβサブユニ、トのアミ
ノ酸３８〜７１に対応する合成ペプチド（分子ｆｆ１３
３００Ｘ　Ｉ　０ｉｙ）を、ＤＭＦ（１，０ｚ□とｐＨ
６，６のリン酸バ２ファー（１，０！Ｑ、　０．１Ｍリ
ン酸）との混合物中に溶解する。この物質は、エルマン
（Ｅ　ｌ１ｍａｎ’　ｓ）試薬滴定により決定されるよ
うにペプチド当たり１個のスルフヒドリル基か存在する
ことを示す。

β−ＴＳＨ溶液に上記工程（ａ）で得た修飾ＢＳＡ（１
，５，ｉｇ）を加えた。この溶液を蓋をしたカラスひん
中で一夜撹拌する。粗製の反応混合物を溶出液として水
を用いたセファテックスＧ−２５カラム上のクロマトグ
ラフィーにより精製し、ついて回収した結合体を凍結乾
燥して物質（１８ｚｙ）を得、これを分析したところ、
ＢＳＡ当たり４個のβ−Ｔ　Ｓ　Ｈペプチドの導入が認
められた。

実施例１６（３０原子結合を用いたモノクローナル抗Ｃ
Ａ−１２５１ｇｃ誘導体化微細 粒子の調製） （ａ）アミン微細粒子の前処理 アミン微細粒子［セラジン（Ｓ　ｅｒａｄｙｎ）、０１
６４ミクロン、２５％固形分、ｌ　；ｓＱ］をバイオレ
ックス（Ｂ　１ｏｒｃｘ）イオン交換樹脂（バイオレッ
クスＭＳＺ５０１Ｄ、２０〜５０メツシユ、カタログ；
１４２−７４２５）（０，５９）と〆見合する。ｌ見合
物を室温で１時間、転倒（ｅｎｄ−ｏｖｅｒ−ｅｎｄ）
回転させ、ついで粗なガラス濾過器で真空濾過し、洗浄
する。

濾液を集め、１５．００　Ｑｒｐｍで３０分間遠心分離
する。濾液を捨て、微細粒子のペレットを撹拌しなから
蒸留水に再ｉヒ濁し、蒸留水を加えて２５％固形分に調
節する。

（ｂ）粒子の誘導体化 再懸濁し前処理した上記工程（ａ）の粒子を２５％固形
分て等量の化合物３（実施例３）の溶液（ＤＭＦ中に２
　ｍ９／　ｍのと混合し、転倒回転させなから室温で１
時間反応させる。ついで反応混合物をリン酸バッファー
食塩水ｒＰＢｓＪ（ｐＨ７，２）で１０倍に希釈し、１
５，０００ｒｐｍで３０分間遠心分離する。得られた上
澄み液を捨て、微細粒子のペレットをリン酸バッファー
食塩水に再懸濁する。

上記遠心分離−再Ｉヒ濁の手順を２回繰り返した後、溶
液を再び遠心分離し、上澄み液を捨て、ペレットをトリ
スバッファー（０，０５Ｍトリス、０．１Ｍ　　ＮａＣ
ｌ、　ｐＨ８，０）で２．５％固形分となるように再１
び濁する。

（ｃ）抗体の調製 モノクローナル抗ＣＡ−１２５１ｇＧの溶液（７４、ｗ
９／　ｍＱ、リン酸バッファー食塩水中）をＤＴＴ（最
終反応１１を合物中に２５ｍＭ）とともにロータリーア
ンチ−ター−トて撹拌しなから室温で２０分間インキュ
ベートする。ついて部分的に還元した抗体の溶液を、ｐ
Ｈ７，０のリン酸バッファー（０，１Ｍ’Ｊン酸、Ｑ、
ｌＮｉ　　ＮａＣ１，５ｍＭ　　ＥＤＴＡ）を溶出液と
して用い、重態て平衡化したセファデックスＧ　−２５
（ｆｌｌ）カラム上のクロマトグラフィーにより脱塩す
る。フラクンヨンを集め、タンパク’ｆｌを含有するフ
ラクションをプールし、２８０ｎｉての吸光度を測定す
ることによりプールした溶液のタンパク質、１度を評価
する。

（ｄ）マレイミド誘導体化微細粒子と部分的に還元した
ＩｇＧとの反応 上記工程（ｃ）で得た部分的に還元した抗体（１！（、
ｌ　ｍｇ／　ＩＩｉりを、上記工程（ｂ）で得たマレイ
ミド誘導体化微細粒子（１２Ｑ、２．５％固形分）と混
合する。

混合物を室温で一夜転倒回転させる。翌朝、反応混合物
を洗浄バッファー（０，０１Ｍ’Ｊン酸、ｐＨ７２，１
％ツイーン）で１０倍に希釈し、ついて１５．００Ｏｒ
ｐｍで３０分間遠心分離する。得られた上澄み液を捨て
、微細粒子ペレットを２回洗浄する（ｌｏ２洗浄バッフ
ァー中で撹拌、洗浄バッファーで１０倍に希釈、ついで
１５．ＯＯＯｒｐｍで３０分間遠心分離したあと上澄み
液を除く）。洗浄したペレットを最終濃度か０．１２５
％固形分となるように貯蔵ハソファ−（０，０１Ｍトリ
ス、ｐＩ］８、Ｌ　Ｏ，ＩＭ　　ＮａＣ１，Ｏ，１％ア
シ化ナトリウム、１３．６％ンヨ糖）中に再懸濁する。

最後の微細粒子をまず２３規格針に、ついで２５規格針
に通す。得られた微細粒子結合体には、抗ＣＡ−１２５
１ｇＧ抗体が実施例３て得た３０原子リンカ−アームに
より微細粒子に結合している。ついで貯蔵バッファー中
の微細粒子溶液は、ＣＡ−１２５抗原の検出のためのイ
ムノアッセイに将来使用するまで貯蔵しておく。

聚施例１７（２３原子結合を用いたモノクローナル抗Ｃ
Ａ−１２５１ｇＧ誘導体化微細 粒子の調製） 実晦例１６の３０原子リンカ−基の代わりに実施例２の
２３原子リンカ−基（化合物２）を用いるほかは実施例
１６の操作を行う。

大旗ｆ＋ｌＩ　Ｉ　Ｅ４　（１６原子結合を用いたモノ
クローナル抗ＣＡ−１２５１ｇＧ誘導体化微細 粒子の調製） 実施例１６の３０原子リンカ−基の代わりに実施例１の
１６原子リンカ−基（化合物１）を用いるほかは実施例
１６の操作を行う。

実施例１９（３０原子結合を用いたポリクローナル抗Ｃ
Ａ−１２ｂ１ｇＧ誘導体化微細 粒子の調製） 実施例１６のモノクローナル抗体の代わりにポリクロー
ナル抗ＣＡ−１２５１ｇＧ抗体を用いるほかは実施例１
６の操作を行う。ポリクローナル抗ＣＡ−１２５抗体は
、フロイントのアンユハント中のｃＡ−１２５抗原５０
，００Ｑ単位でヒツジを皮下的および部内内的に免疫す
ることにより得ることができた。以後のすべてのブース
ター投与は、フロイントの不完全アジュバント中のＣＡ
−１２５抗原５０．０００単位を用いて２週間ごとに行
った。

寒鞭鮮λ楽（３０原子結合を用いたモノクローナル抗Ｐ
ＡＰ　　ＩｇＧ誘導体化微細粒子の調製） （ａ）還元抗ＰＡＰ抗体の調製 ｒ−ｔ’ｒ’ｒ（１，９３ａｙ）を反応ガラスひん中に
入れる。ついでマウスモノクローナル抗ＰＡＰ抗体（０
，５ｘＱ、　６．９８ｍｑ／ｘＱ’）を加え、混合物を
室温で２０分間インキュベートする。ついで反応、混合
物を重態て平衡化したセファデックスＧ−２５カラム（
粗、ｌ　Ｘ　２０　ｃｚ）に加え、ｐＨ７，２リン酸バ
ツフｙ　　（０，２Ｍリン酸、０．ＩＭ　　ＮａＣ１，
５，０ｍＭ　　ＥＤＴＡ）で溶出する。フラクンヨンを
集め、２８０　ｎｍでの吸光度を測定する。タンパク質
を含有するフラクションを集め、得られたプールをクロ
マトグラフィーバッファーで１０倍に希釈シ、２８０ｎ
ｍでの吸光度を測定することにより得られた活性化抗体
の希釈プールのタンパク質ｌ農度を計画する。

（ｂ）誘導体化微細粒子と還元抗ＰＡＰ抗体との反応 上記工程（ａ）で得た還元抗体（０，５ｆｆ！／、すな
わち１．４９ａ９／ｚ（！で３３６μのを反応ガラスひ
ん中に入れる。ついで実施例１６の工程（ｂ）で得た誘
導体化微細粒子の溶液（０，５，Ｗのを加え、混合物を
ロータリーアジテータ−上、室温で一夜インキユペート
する。翌朝、反応ａ６物を遠心分離にかけ（１２，ＯＯ
Ｏｒｐｍで２０分間）、上澄み液を除き、２８０ｎｍて
の吸光度を１４ｔ１１定する。ついで抗体誘導体化微細
粒子をＰＢＳ−ツイーンバッファー（ｌｏｏｍＣＪＰＢ
Ｓ中に０．１ｇツイーン、ｌ　、　ＯｒｘＱ）由に再１
び濁する。再ひ混合物を遠心分離にかけ（１２，０００
ｒｐｍで２０分間）、上澄み液を捨て、ついて貯蔵バッ
ファー（０，０５Ｍｌ−リス、Ｏ，ＬＭＮａＣｌ、０．
１％アジ化ナトリウム、１３．６％ショ糖、ｐＨ８，１
）（５，Ｏｍのを加える。微細粒子をまず２３規格針に
、ついで２５規格針に通す。

ついで得られた微細粒子懸濁液をＬＭ容プラスチックね
し蓋ガラスびんに移し、ＰＡＰの検出のための酵素イム
ノアッセイに使用するときまで貯蔵する。

実施例２１（Ｂ−１２内因子のアミノ化ポリスチレン微
細粒子への共有結合付着〉 アミノ化ポリスチレン微細ｆＥ子（０，ｌ　６４　ミ’
ｙロン、セラジンより購入）の１０％溶液（１００μｇ
）を反応ガラスびん中に入れる。Ｄ〜□ＩＦ中の化合物
２の溶液Ｃ９ｕＱ、１．２１ｍＭ）をＢ−１２内因子の
溶１（ｆｆｉ（２１０ｔｔＬ　Ｏ，ｌ　５３７ｚ９／ｍ
１２）とともに加える。反応混合物を室温で一夜、１８
０°交互回転させる。翌朝、反応混合物を遠心分離にか
ける（１３．　ＯＯＯｒｐｍで３０分間）。上澄み液を
捨て、残った固体を蒸留水中に再懸濁し、遠心分離−再
懸濁の手順を繰り返す。

ついで粒子を貯蔵バッファー（７５０μの中に懸濁し、
Ｂ−１２の検出のためのアッセイに用いる。得られた生
成物は、実施例２の２３原子’）ンカーで結合されたＢ
−１２内因子／微細粒子結合体である。

実施例２２（化合物３を用いた組換えＢ型肝炎コア抗原
のアミン化ポリスチレンへの共 有結合付着） （ａ）化合物３による微細粒子の誘導体化アミノ微細粒
子（ポリサイエンス、０．５ミクロン）を反応ガラスひ
ん中に入れる。ついてＤＭＦ中の化合物３（実施例３）
の溶液を加え、混合物を実施例１６の工程（ｂ）と同様
にして処理する。

（ｂ）組換えＢ型肝炎コア抗原と誘導体化微細粒子との
反応 組換えＢ型肝炎コア抗原をガラスびん中に入れる。つい
で上記工程（ａ）の誘導体化微細粒子を加え、混合物を
実施例６の工程（ｄ）に記載のように処理して３０原子
リンカ−により抗原に結合した微細粒子を得る。これは
Ｂ型肝炎の検出のためのアッセイに用いることかできる
。

実施例２３（３０原子結合による大腸菌β−ガラクトシ
ダーセ誘導体化微細粒子の調製）ｐ）ｉ７．０リン酸ハ
、ファー食塩水（０，１Ｍリン酸、０．１Ｍ　　ＮａＣ
１）中の大腸菌β−ガラクトシダーゼ（ＩＩＩ！（、１
１１９／肩Ｑ）を、実施例１６の工程（ｂ）で得たマレ
イミド誘導体化微細粒子に加える。反応混合物を室温で
一夜、１８００交互回転させる。

翌朝、反応混合物を１５．ＯＯＯｒｐｍで３０分間遠心
分離する。得られた上澄み液を捨て、微細粒子ベレット
をｐＨ７，０リン酸バツフア一食ｔｉ水（０１Ｍ、Ｑ、
１Ｍ　　ＮａＣ１）で２．５％固形分となるように再懸
濁する。遠心分離、デカント、再懸濁手順を２回繰り返
す。最後に微細粒子ベレットを貯蔵バッファー（０，１
Ｍトリス、ｐＨ７，０，Ｏ。

ＬＭ　　ＮａＣ１，０，１％アシ化ナトリウム、１３゜
６％ショ糖）に再懸濁する。得られた微細粒子懸濁液を
まず２３規格の針に、ついで２５規格の針に通す。得ら
れた微細粒子は、３０原子結合によリアミノ微細粒子に
結合されたものである。ついで貯蔵バッファー中の酵素
誘導体化微細粒子は、将来使用するときまで貯蔵する。

実施例２４（３０原子結合を用いた好ウシ腸アルカリホ
スファターセ誘導体化微細粒子 の調製） （ａ）酵素のチオール化 ｐ＋（８，０トリスバツフアー（０，０５Ｍトリス、１
０　ｍＭ　　Ｎ、ｉｇｃ　＋２、Ｏ、ｌ　ｍＭ　　Ｚ　
ｎＣＩ、）中の仔つ／腸アルカリホスファターセ（０，
５，ｖＩＱ、　　ｌ　ＯＲｇ／７ＩＱ）を１ズ応ガラス
ひん中に入れる。ついでイミノチオラン！−Ｉ　ＣＩを
濃度４．Ｑｍｔｖｌまで加える。混合物を室１品で３０
分間撹拌し、ついでリン酸バッファー食塩水（０，１Ｍ
リン酸、Ｑ、ＩＭ　　ＮａＣ１、ＩＱ　ｎＭ　　ＭｇＣ
１２、ｐ）−１７，０）を溶出液として用い、でファテ
ノクスＧ−２５（粗）カラム上で脱塩スる。

フラクンヨンを集め、タンパク質を含有するフラクショ
ンをプールし、２８０　ｎｍでの吸光度を測定すること
によりチオール化酵素のプール溶液のタンパク質濃度を
評価する。

（ｂ）チオール化酵素とマレイミド誘導体化微細粒子と
の反応 上記工程（ａ）で得たチオール化酵素（１肩ρ、ｌｕｇ
／’７Ｒのを、実施例１６の工程（ｂ）で得たマレイミ
ド誘導体化微細粒子（ｌ　ｍ（１，２５％固形分）と混
合する。反応混合物を室温で一夜、１８０°交互回転し
、ついて実施例１６の工程（ｄ）に記載のようにして反
応させて仔つシ腸アルカリホスファターセで共有結合的
に誘導体化した微細粒子の懸濁液を得る。

実施例２５（モノクローナル抗ＣＡ−１２５１ｇＧ誘導
体化微細粒子の調製） （ａ）チオール化微細粒子の調製 再懸濁し前処理した実施例１６エ程（ａ）からのアミン
微細粒子（１ｆｆ＋２．２５％固形分）をイミノチオラ
ンＨＣｌと混合してイミノチオランの最終１・態度を５
０ｍＭとする。反応混合物を室温で１時間撹拌し、つい
で実施例１６エ程（ｂ）に記載のようにして処理する。

（ｂ）抗体の誘導体化 リン酸バッファー食塩水中のモノクローナル抗ＣＡｉ２
５１ｇＧの溶液（７、４Ｒｇ／肩のを、化合物３のＤＭ
Ｆ溶液（５，０ｍＭ）の３０モル当量とともにインキュ
ベートする。反応混合物を室温で３０分間撹拌し、つい
でｐＨ７，０リン酸バツフアー（０，１Ｍリン酸、０　
、　Ｉ　Ｍ　　Ｎ　ａＣｌ）を溶出液として用いたセフ
ァデックスＧ−２５（粗）カラム上で脱塩する。フラク
ションを集め、タンパク質を含有するフラクンヨンをプ
ールし、２８０ｎｍでの吸光度を測定することによりプ
ール溶液のタンパク″肖濃度を評ｆ＋ＩＩｉする。

（ｃ）チオール化微細粒子とマレイミド誘導体化抗体と
の反応 上記工程（３戸ご得だチオール化微細粒子＜１ｍａ、２
５％固形分）を、上記工程（ｂ）で得たマレイミ：・誘
導体化抗体（ＩｍＱ、１ｍ９／ｍのと混合する。反応混
合物を室温で一夜、１８０°交互回転する。

翌朝、抗体誘導体化微細粒子を実施例１６の工程（（１
）に記載のようにして処理して微細粒子／ＩｇＧ結合体
を得る。これはＣＡ−１２５抗原の検出のためのアッセ
イに用いることかできる。

夫鵠詳けｊ（モノクローナル抗ＣＡ−１２５１ｇＧ誘停
体化ナイロン繊維のＡ製） （ａ）ナイロン調相の前処理 ナイロンモノフィラメント釣糸（バークレー、６インチ
、２１ｂ、試験）をインキニペートし、３ＮＨＣＩ（ｌ
　Ｏｍのとともに室温で３０分間振盪する。

ついで繊維を蒸留水（２Ｍ）で２回洗浄する。洗浄し部
分的に加水分解した洗浄を、使用するときまで蒸留水中
に貯蔵する。

（ｂ）部分的に加水分解された繊維のマレイミド誘導体
化 上記工程（ａ）で得た部分的に加水分解されたナイロ７
・繊維の２インチ切片を１／８インチの断片に切断する
。この１／８インチの長さのナイロン繊維を化合物３の
ＤＭＦ溶液（１，０ａ（！、５．０ｍＭ）とともに反応
ガラスびん中に入れる。反応混合物を２時間激しく振盛
し、ついで組なガラス濾過器で濾過する。マレイミド誘
導体化ナイロン繊維を蒸留水で数回洗浄し、ついて使用
するときまで俺留水中に貯蔵する。

（ｃ）マレイミド誘導体化ナイロン繊維と部分的に還元
された抗ＣＡ−１２５１ｇＧとの反応上記工程（ｂ）で
得たマレイミド誘導体化ナイロン繊維に、実施例１６の
工程（ｃ）で得た部分的に還元されたモノクローナル抗
ＣＡ−１２５１ｇＧを加える。反応混合物を１８０°交
互回転しなから室温で一夜インキユヘートする。翌朝、
反応混合物を粗なカラス濾過器でＭ過し、抗体誘導体化
繊維を洗浄バッファー（０，１Ｍリン酸、０．ＩＭＮａ
ＣＬ　ｐＨ７，０）で数回洗浄する。得られた繊（ＩＬ
は、３０原子スペーサー基を介してモノクローナル抗Ｃ
Ａ−１２５１８Ｇか共有結合的に付着している。得られ
た繊維は、ＣＡ−１２５抗原の検出のためのアッセイに
用いるため繊維貯蔵バフファー（０，１Ｍリン酸、Ｑ、
１Ｍ　　ＮａＣ１，１％ＢＳＡ、０１％アン化ナトリウ
ム）中に貯蔵する。

実施例２７（モノクローナル抗ＣＡ−１２５１ｇＧ誘導
体化羊毛繊維の調製） （ａ）羊毛糸の部分的還元 羊毛繊維を１／２インチ切片に切断する。ついでこの糸
の切片を５ｍＭ　　ＤＴＴ溶液（Ｉ　Ｍ（１）中に浸請
し、１時間激しく振盛する。ついで反応混合物を）Ｈな
カラス濾過器で濾過し、バッファー（ｐｉ−１７０，０
，１Ｍリン酸、Ｑ、ＩＭ　　ＮａＣ１，５ｍＭＥＤＴＡ
）で５回洗浄する。

（ｂ）マレイミド誘導体化抗体と部分的にぶ元された羊
毛糸との反応 上記工程（ａ）で得た部分的に還元された羊毛糸を反応
ガラスびん中に入れる。ついて実施例１２工程（ｂ）で
得たマレイミド誘導体化モノクローナル抗ＣＡ　−１２
５１ｇＧ（１ｈｉ２．１ｍ９７ｍのを加え、混合物を室
温で一１１８０’交互回転させた。翌朝、反応混合物を
租なカラス、ｊム過器て、ｊ但過し、）・ノフ７−（０
，１〜１リン酸、０．１Ｍ　　ＮａＣｌ、ｐ［］７０）
で５回洗浄する。得られた繊維は、３０原子スペーサー
基を介して共有結合的に付着したモノクローナル抗ＣＡ
−１２５１ｇＧを含有して（・る。

得られた繊維は、ＣＡ−１２５抗原を検出するためのア
ッセイに使用するため繊維貯蔵バッファー（０，１Ｍリ
ン酸、Ｑ、ＩＭ　　ＮａＣｌ、１％ＢＳ、八、Ｏ１％ア
シ化ナトリウム）中で貯蔵する。

Claims (16)

【特許請求の範囲】
1. （１）一般式（ I ）： ▲数式、化学式、表等があります▼（ I ） （式中、Ｘは直鎖中に３〜１０個の炭素原子を有する置
   換または非置換アミノ酸、Ｒはアルキル基、シクロアル
   キル基、アルキル−シクロアルキル基または芳香族炭素
   環、ｎは１〜１０の整数である）で示されるヘテロ２官
   能性結合試薬。
2. （２）一般式（ I ）においてＲがシクロヘキシルメチ
   ル基である特許請求の範囲第（１）項記載の試薬。
3. （３）一般式（ I ）においてｎが２〜５の整数である
   特許請求の範囲第（１）項記載の試薬。
4. （４）一般式（ I ）においてｎが３である特許請求の
   範囲第（１）項記載の試薬。
5. （５）一般式（ I ）においてＸが６−アミノカプロン
   酸の繰り返し単位から構成されたポリアミドである特許
   請求の範囲第（１）項記載の試薬。
6. （６）一般式（ I ’）； ▲数式、化学式、表等があります▼（ I ’） （式中、Ｂは酵素標識、抗体または抗体断片、ＱはＢが
   酵素標識であるときに抗体または抗体断片、Ｂが抗体ま
   たは抗体断片であるときに酵素標識、Ｘは直鎖中に３〜
   １０個の炭素原子を有する置換または非置換アミノ酸、
   Ｒはアルキル基、シクロアルキル基、アルキル−シクロ
   アルキル基または芳香族炭素環、ｎは１〜１０の整数で
   ある）で示される、診断アッセイに用いるための結合体
   。
7. （７）一般式（ I ’）においてｎが２〜５の整数であ
   る特許請求の範囲第（６）項記載の結合体。
8. （８）一般式（ I ’）においてＸが６−アミノカプロ
   ン酸の繰り返し単位から構成されたポリアミドである特
   許請求の範囲第（６）項記載の結合体。
9. （９）一般式（ I ’）においてＱが酵素である特許請
   求の範囲第（６）項記載の結合体。
10. （１０）一般式（IV）； ▲数式、化学式、表等があります▼（IV） （式中、Ｘは直鎖中に３〜１０個の炭素原子を有する置
    換または非置換アミノ酸、Ｒはアルキル基、シクロアル
    キル基、アルキル−シクロアルキル基または芳香族炭素
    環、ｎは１〜１０の整数、Ｑ’はハプテン、Ｂ’はポリ
    アミノ酸、ｒは１〜約２０の整数である）で示される、
    免疫原を製造するために用いる結合体。
11. （１１）一般式（IV’）； ▲数式、化学式、表等があります▼（IV’） （式中、Ｘは直鎖中に３〜１０個の炭素原子を有する置
    換または非置換アミノ酸、Ｒはアルキル基、シクロアル
    キル基、アルキル−シクロアルキル基または芳香族炭素
    環、ｎは１〜１０の整数、Ｑ’’は酵素または抗体、Ｂ
    ’’はＱ’’が抗体であるときに酵素、Ｑ’’が酵素で
    あるときに抗体、ｒ’は１〜５０の整数である）で示さ
    れる診断アッセイに用いる結合体。
12. （１２）一般式（IV’）においてＢ’’が酵素である特
    許請求の範囲第（１１）項記載の結合体。
13. （１３）一般式（II）： ▲数式、化学式、表等があります▼（II） （式中、Ｂ’’’は固相物質を有するアミン、Ｘは直鎖
    中に３〜１０個の炭素原子を有する置換または非置換ア
    ミノ酸、ｎは１〜１０の整数、Ｒはアルキル基、シクロ
    アルキル基、アルキル−シクロアルキル基または芳香族
    炭素環である）で示される固相結合体。
14. （１４）一般式（II）においてＲがシクロヘキシルメチ
    ル基である特許請求の範囲第（１３）項記載の結合体。
15. （１５）一般式（III）； ▲数式、化学式、表等があります▼（III） （式中、Ｑ’’’はＳＨ基もしくはチオール基を有する
    ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質、Ｂ’’’は
    固相物質を有するアミン、Ｘは直鎖中に３〜１０個の炭
    素原子を有する置換または非置換アミノ酸、ｎは１〜１
    ０の整数、Ｒはアルキル基、シクロアルキル基、アルキ
    ル−シクロアルキル基または芳香族炭素環である）で示
    される結合体。
16. （１６）一般式（III）においてＢ’’’が微細粒子を
    有するアミンである特許請求の範囲第（１５）項記載の
    結合体。