JP3360174B2 - 酵素等を抗体等に結合させるホモバイファンクショナル試薬 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 〔技術分野〕 本発明は、酵素等を抗体等に結合させる、あるいは酵
素等をホモバイファンクショナル試薬で抗体等に結合さ
せた酵素等に結合させるホモバイファンクショナル試薬
に関するものである。特に、このホモバイファンクショ
ナル試薬は抗体、細胞、酵素、補酵素、蛋白、ハプテ
ン、小分子を、酵素、補酵素、抗体、蛋白、固相、ポリ
マー、リポソームに結合させるのに使用でき、本明細中
で時々「コンジュゲート」と呼ぶ結合化合物は酵素、補
酵素、抗体、蛋白、固相、ポリマー、リポソームに結合
した抗体、細胞、酵素、補酵素、蛋白、ハプテン、小分
子である。

〔背景技術〕

本明細書の開示および請求の範囲の項の理解を容易に
するため、免疫アッセイに関する説明および免疫アッセ
イでよく用いられる用語の定義を、背景として以下に記
載した。

用語「アナライト」はタンパク質であり、検出される
べき抗体でもあり得るが、必ずしもそうとは限らない。

用語「テストサンプル」は、通常、血漿、血清、腹
水、リンパ液、脳脊髄液、乳頭分泌液、尿、興味あるア
ナライトを含む可能性のあるその他の体液等の体液サン
プルである。テストサンプルは、特別な免疫アッセイに
必要とされる体積量にするため、血清成分を含むリン酸
緩衝液のような適当な希釈緩衝液で任意に希釈すること
ができる。

用語「特異的結合メンバー」は、特異的結合ペアのメ
ンバー、すなわち分子のうちのひとつが化学的あるいは
物理的にもうひとつの分子に結合しているふたつの異な
る分子である。アレルゲンと抗体とのペアのような抗原
と抗体との特異的結合ペアに加え、他の特異的結合ペア
には、ビオチンとアビジン、炭水化物とレクチン、相補
的塩基配列や相補的ペプチド配列やエフェクターとリセ
プター分子、酵素コファクターと酵素、酵素阻害剤と酵
素、ペプチド配列と蛋白配列に特異的な抗体、多酸と塩
基、染料と蛋白結合体、ペプチドと特異的蛋白結合体
（例えば、リボヌクレアーゼにおけるＳ−ペプチドとリ
ボヌクレアーゼＳ−蛋白）等がある。さらに、特異的結
合ペアには、例えばアナライトアナログのような、もと
の特異的結合メンバーのアナログであるメンバーを含め
ることができる。特異的結合メンバーが免疫反応物なら
ば、特異的結合メンバーは例えば抗体、抗原、ハプテ
ン、あるいはそれらの複合体となる。抗体を使用したと
きは、特異的結合メンバーは、モノクローナル抗体ある
いはポリクローナル抗体、組み換え蛋白あるいは組み換
え抗体、それらの断片の混合物、抗体と他の特異的結合
メンバーの混合物となる。このような抗体の詳細な調製
法や、特異的結合メンバーとして使用するのに適当な抗
体は、当業者達によく知られている。

用語「インディケーター試薬」は、特異的結合メンバ
ーに直接的あるいは間接的に結合した検出可能なラベル
を含み、直接的あるいは間接的にアナライトに結合する
ことができ、それによってテストサンプル中のアナライ
トの存否や量を示すことができるアッセイ試薬である。
ラベルあるいは特異的結合メンバーのうちいずれかを変
えることにより、さまざまな異なるインディケーター試
薬を調製することができる。一般には、インディケータ
ー試薬がアナライトあるいは相補的特異的結合メンバー
と複合体を形成した後、インディケーター試薬を検出す
るが、結合していないインディケーター試薬を検出する
こともできる。

用語「ラベル」は、特異的結合メンバーに付着し、視
覚的あるいは計器を用いて検出できるシグナルを発する
物質である。ラベルには、色原体；触媒；蛍光化合物；
化学発光化合物；放射活性アイソトープ；コロイド金属
粒子やコロイド非金属粒子、染料粒子、酵素や基質、あ
るいは有機ポリマーラテックス粒子等の直接的な視覚的
ラベル；リポソームや小胞を含む他のシグナルを発する
物質等を含む。

ラベルとして使用するのに適当な酵素は、米国特許4,
275,149、19−23欄に多数開示されており、本明細書に
参考として取り入れてある。例えば、４−メチルウンベ
リフェリルリン酸に有用な酵素／基質シグナル産生系
は、酵素アルカリフォスファターゼである。ウマ−ハツ
カダイコンペルオキシダーゼを使用するならば、ｏ−フ
ェニレンジアミンを酵素基質として加えて、視覚的ある
いは計器を用いて検出測定可能な着色産物を生成させ
る。

別のシグナル産生系に、検出可能なシグナルを得るた
めにラベルを酵素処理する必要のない、ラベルとして蛍
光化合物を使用するものがある。例えばフルオレセイ
ン、クマリン、フィコビリ蛋白質、ローダミン、それら
の誘導体やアナログなどの蛍光分子は、この系のラベル
として使用するのに適当である。

その他の種類のラベルに視覚的に検出可能な着色粒子
があり、シグナル産生試薬を追加使用せずに、テストサ
ンプル中のアナライトの存在や濃度を直接着色測定でき
る。このような粒子として使用する材料には、米国特許
第4,313,734号明細書と第4,373,932号明細書に開示して
いるような、金などのコロイド金属や染料粒子などがあ
る。コロイド状セレン粒子などの非金属コロイドの調製
と使用は、1987年６月９日に出願した共願で現在審査中
の米国特許出願第072,084号に開示してあり、本明細書
に参考として取り入れてある。ラベルとして有機ポリマ
ーラテックスを使用することは、1988年９月23日に出願
した共願で現在審査中の米国特許出願第248,858号に開
示してあり、本明細書に参考として取り入れてある。ラ
ベル自身が、あるいはラベルがひとつあるいはそれ以上
の追加のシグナル産生物質と結合することにより検出可
能なシグナルを発する限り、特定のラベルを選択するこ
とは重要ではない。

用語「シグナル産生構成成分」は、他のアッセイ試薬
やアナライトと反応し、アナライトの存在を示す視覚的
あるいは計器で検出できる反応産物やシグナルを産生で
きる物質である。本明細で使用する「シグナル産生系」
は、希望の反応産物やシグナルを産生するために必要な
一群のアッセイ試薬である。例えば、ひとつあるいはそ
れ以上のシグナル産生構成成分を使用してラベルと反応
させ、検出可能なシグナルを発生させることができる。
すなわち、ラベルが酵素ならば、酵素をひとつあるいは
それ以上の基質や別の酵素と反応させて検出可能な産物
を産生させることにより、検出可能なシグナルを増幅で
きる。

用語「捕獲結合メンバー」は、直接的あるいは間接的
にアナライトあるいはインディケーター試薬に結合する
ことができる特異的結合メンバーであり、捕獲結合メン
バーをテストサンプルや他のアッセイ試薬から分離でき
るように、固相に結合している、あるいは固相に結合さ
せることができる、あるいは沈殿させることができる。

用語「捕獲剤」は、直接的あるいは間接的に固相物質
に付着した捕獲結合メンバーであり、捕獲結合メンバー
に結合したアナライトやインディケーター試薬を、結合
していないアナライトやアッセイ試薬から分離できるよ
うにする。通常、捕獲結合メンバーと固相物質との結合
は、実質的に不可逆的であり、共有結合機構を含めるこ
とができる。捕獲結合メンバーが間接的に固相に付着し
ている捕獲剤は、簡便な本発明の結合試薬を固相材料と
捕獲剤に反応させることにより製造することができ；こ
のような反応の産物例が「コンジュゲート」である。凝
集アッセイにおいて、捕獲剤の捕獲結合メンバーは、ウ
シ血清アルブミンのような可溶性担体物質に結合でき
る。

アッセイに使用する捕獲剤の製造において、捕獲結合
メンバー（例えばアナライト特異的抗体）をひとたび固
相に固定化したら、固相の残りの表面領域を、一般にウ
シ血清アルブミンのような可溶性蛋白質溶液でブロック
し、担体に蛋白質が非特異的に結合するのを防ぐ。その
後、固体の担体を適当な溶液で洗浄し、余分なブロッキ
ング溶液や結合していない捕獲結合メンバーを除去す
る。

アッセイ構成成分間にひとたび複合体が生成したら、
固相を分離手段として使用できる。例えば、反応混合物
を固相物質に接触させることができ、固相物質は新しく
生成した反応複合体を保持する。この分離の段階に別の
方法を使用することもできる。それ自身が捕獲結合メン
バーに結合する固相を使用する方法；捕獲結合メンバー
に特異的な結合メンバーを固相に結合させる方法;1988
年１月29日に出願した共願で現在審査中の米国特許出願
150,278号に開示した荷電した物質などの反応試薬を固
相に結合させ、捕獲結合メンバーに結合させた反対の荷
電をもつ物質を誘引結合する方法で、本明細書に参考と
して取り入れた。捕獲結合メンバーに特異的な結合メン
バーと反応試薬（例えば荷電した物質）はどちらも、固
相物質と結合あるいは化学的に反応した結合試薬と、本
発明の方法により結合あるいは化学的に反応させること
ができ；これらもコンジュゲートの例である。

アッセイ装置はさまざまな外形をもち、そのうちいく
つかは選択した固相物質に依存する。用語「固相物質」
は、特異的結合メンバーを固定するために使用する。当
業者達によく知られた適当なクロマトグラフィー物質、
吸収性物質、浸透性物質、キャピラリー物質、あるいは
他の常套的固体物質である。固相物質は、ひとつあるい
はそれ以上のアッセイ試薬を含むひとつあるいはそれ以
上の層をもつフロースルーアッセイ装置では、ファイバ
ーガラス、セルロース、ナイロンパッドであり；ディッ
プアッセイやリードアッセイでは、ディップスティック
であり；クロマトグラフィー（例えば紙あるいはガラス
ファイバー）技術あるいは薄層クマトグラフィー（例え
ばニトロセルロース）技術では、ひとつあるいはすべて
の試薬が１枚の固層物質のストリップの別々の領域に含
まれている試験ストリップであり；あるいは当業者達に
よく知られた吸収剤を含む。さらに固相物質は制限され
ることなく、ポリアクリルアミドビーズ、ポリスチレン
ビーズあるいはポリスチレンチューブ、磁気ビーズ、ひ
とつあるいはそれ以上の反応ウェルのあるマイクロタイ
タープレート、微粒子、ガラス製あるいはプラスチック
製試験管も含めることができる。

天然物質、合成物質、合成的に修飾された天然由来物
質を固相物質として使用することができ、紙、セルロー
ス、酢酸セルロースやニトロセルロースや酢酸／硝酸セ
ルロースなどのセルロース誘導体を含むセルロース材料
などの多糖；シリカ；ファイバーガラス；不活性化アル
ミナ；珪藻土、あるいは塩化ビニルや塩化ビニル／プロ
ピレン共重合体や塩化ビニル／酢酸ビニル共重合体など
のポリマーの浸透性ポリマーマトリックス中に均一に分
散した他の無機純物質などの無機物質；天然起源（例え
ば綿）や合成起源（例えばナイロン）の繊維；シリカゲ
ル、アガロース、デキストラン、ゼラチンなどの浸透性
ゲル；ポリアクリルアミドのようなポリマーフィルム；
磁気粒子；マイクロタイタープレート、ポリスチレンチ
ューブ；蛋白質結合膜；セファデックス（ファルマシア
ファインケミカルズ社、Piscataway、NJ）；トリスアク
リル（Pointet−Girard、フランス）；シリコン粒子；
浸透性繊維状マトリックス等を含む。固相物質は適度な
固有の強さをもたなければならず、あるいは担体によっ
て適度な強度を与えられてもよい。そして固相物質は、
検出可能なシグナルの産生を妨害してはならない。

捕獲剤の特異的結合メンバーが微粒子に結合したと
き、それらの粒子はカラム中に保持されるか、可溶性試
薬とテストサンプルの混合物に懸濁されるか、あるいは
保持されて別の固相基礎物質により固定化される。「保
持され固定化される」とは、固相基礎物質に結合してい
る粒子が、実質的にその物質内でその位置を動くことが
できない状態を意味している。粒子の大きさは重要では
ないが、固相基礎物質を用いるときは粒子の平均直径が
固相基礎物質の平均ポアサイズより小さいことが望まし
く、凝集アッセイに使用するときは適当な液体に懸濁で
きるような大きさであることが必要である。

用語「補助的特異的結合メンバー」は、捕獲結合メン
バーとインディケーター試薬に加えて使用し、検出可能
な結合複合体の一部となる特異的結合メンバーである。
アッセイには、ひとつあるいはそれ以上の補助的特異的
結合メンバーを使用することができる。例えば、捕獲結
合メンバーが補助的特異的結合メンバーと結合すること
ができ、同時に固相にも結合することができるようなア
ッセイに、補助的特異的結合メンバーを使用することが
できる。

本発明において、記載されたラベル、補助的特異的結
合メンバー、固相物質を選択することは、一般に重要で
はないことが、当業者達に理解される。選択したアッセ
イ系から得られる結果を最適化するように、材料が選択
される。

ジカルボキシル酸ジスクシニミジルエステルを用いて
ペプシンを固定化したアミノ基を含む親水性ゲルをイン
キュベートすることにより、静脈内投与に適した免疫原
を製造できることが、1987年５月13日に公表された欧州
特許出願公開第０ 221 505号に開示されている。ここ
で開示されたジスクシニミジルエステルは、鎖の両端に
以下の構造をもつスクシニミジル基をもっており、 ここでＲは、直鎖状あるいは分岐状の炭素原子１から20
までのアルキレンラジカルである。その明細書中では、
このような化合物をたったひとつだけ明確に開示してお
り；それは上記のＲが炭素原子数４の直鎖状アルキレン
基であるアジピン酸ジスクシニミジルエステルである。

さまざまなバイファンクショナル結合試薬が（例えば
Pierce社から）市販されており、典型的なバイファンク
ショナル結合試薬はこの会社のカタログに記載されてい
る。ジスクシニミジルスベレートやエチレングリコビス
（スクシニミジルスクシネート）は、そのカタログに記
載されたそのような結合試薬の例である。後者の化合物
では、上記の式中のＲは、 である。

コバラミンは、添付した図１に示した一般構造式をも
つ。コバラミンは時々ビタミンB₁₂とも呼ばれるが、実
際には、図１の構造式に示すＲ置換基が互いに異なるい
くつかの種類のコバラミンがある：シアノコバラミン
（Ｒ＝シアノ基）、ヒドロキシコバラミン（Ｒ＝水酸
基）、アクアコバラミン（Ｒ＝H₂O）、ニトロコバラミ
ン（Ｒ＝NO₂）、5'−デオキシアデノシルコバラミン
（Ｒ＝5'−デオキシアデノシル基）、メチルコバラミン
（Ｒ＝メチル基）。これらのコバラミンは、一般にすべ
てビタミンB₁₂であると考えられる：シアノコバラミン
（ビタミンB₁₂）、ヒドロキシゴバラミン（ビタミンB₁₂
a）、アクアコバラミン（ビタミンB₁₂b）、ニトロコバ
ラミン（ビタミンB₁₂c）、5'−デオキシアデノシルコバ
ラミン（補酵素B₁₂）、メチルコバラミン（メチル
B₁₂）。すべてのコバラミンは、類似の代謝活性をも
つ。しかし、シアノコバラミンは、他に比べて安定であ
る。コバラミンは、多数の代謝機能に含まれており、正
常な成長や栄養、造血、上皮細胞の産生、神経系におけ
るミエリンの維持に必須である。

ビタミンB₁₂が欠乏すると、造血が不完全になり、ミ
エリンの合成が不充分になり、消化管の上皮細胞の維持
が不充分になり、貧血をおこす。しかし、ミエリン合成
が不充分になることを除き、これらの症状は、多数の代
謝性貧血に共通したものであり、原因に関係しない。

このような貧血の原因を正確に示すために、ビタミン
B₁₂欠乏試験をすることが必要である。ビタミンB₁₂のア
ッセイには、さまざまなものがある：比色分析、分光分
析、蛍光分析、放射活性アイソトープ。最も一般的な方
法は、ビタミンB₁₂分子のコリン核のコバルトを置換し
たコバルト57放射活性アイソトープを使用するものであ
る。B₁₂を含むサンプルに、放射標識された分子とB₁₂内
因子を加えると、サンプル中の放射標識されたB₁₂とB₁₂
が、B₁₂内因子の結合部位で競合する。B₁₂内因子は固相
に結合しているため、固相の放射活性あるいはサンプル
中の放射活性は、もとのサンプル中のB₁₂の量に比例す
る。最近の放射活性アッセイは、操作性、保存性、放射
活性物質の廃棄性等において、明らかな欠点がある。さ
らに、検出には、時間がかかる。

酵素を使用したビタミンB₁₂の競合結合アッセイが提
唱されている（Bachas著、Biotechnics、４巻、１号、4
2ページ、1986年を見よ）。しかし、アッセイの感度は1
355pg/mlであると報告されており、ヒト血清中のビタミ
ンB₁₂の正常範囲は150−900pg/mlである。そのようなア
ッセイは、ヒト血清中の正常範囲にあるビタミンB₁₂を
検出することすらできないことが報告からわかるため、
ビタミンB₁₂欠乏試験に使用できないことは明らかであ
る。

〔図の簡単な説明〕

図１はコバラミンの通常の構造式を示す。

図２は本発明による好ましい一群の化合物の構造式を
示す。

図３は図２の一群の化合物の好ましい末端基の構造式
を示す。

図４は本明細書にその調製法を記載し、「カルボキシ
ル化B₁₂」と命名された「赤色分画（red fraction）」
の構造式を示す。

図５は同一サンプルにおける、「BIO−RAD QUANTIPH
ASE」B₁₂測定値に対するB₁₂酵素アッセイ測定値のプロ
ットを示す。

図６は本明細書に記載した方法で調製した標準溶液中
のシアノコバラミン濃度の関数としての計器の読みを示
す曲線を示す。

図７は本明細書の実施例１に記載した方法で中間体と
して製造される一群の活性エステルのなかの１つの構造
式を示す。

図８は本明細書の実施例２に記載される方法で製造さ
れるB₁₂/アルカリホスファターゼコンジュゲートにおい
て、B₁₂分子をアルカリフォスファターゼ分子に結合さ
せる基の構造式を示す。

図９は本発明による化合物中の他の好ましい末端基の
構造式を示す。

図10は本発明による他の異なる一群の化合物の構造式
を示す。

図11は本発明による化合物の好ましい末端基の他の１
つの構造式を示す。

図12は本発明によるの他の一群の好ましい化合物の構
造式を示す。

図13は本発明による他の異なる一群の化合物の構造式
を示す。

図14は図13の構造をもつ化合物が製造される中間体の
構造式を示す。

図15は図14の構造をもつ化合物の中間体の構造を示
す。

〔発明の簡単な説明〕

本発明は、図２に示す構造をもつ18原子ホモバイファ
ンクショナルリンカーであるジスクシニミジル化合物の
発見に基づくものであり、ここでＲは図３の構造を持
つ。本発明はさらに、アッセイに上記の化合物を使用す
ることにより、内因子のコンジュゲートが微粒子と結合
し、ビタミンB₁₂の免疫アッセイの感度が予想外に上昇
するという発見に基づくものである。従って、本発明は
式 （式中、ｘは３〜10の整数であり、ｙは１〜10の整数で
あり、ｎは１〜10の整数であり、Ｚは であり、 但し、ｎが１であり、ｙが２又は４であり、そしてＺが であるとき、ｘは４〜10の整数である） の化合物からなる結合試薬、該試薬を用いるコンジュゲ
ートの製法、該試薬を用いるコバラミンのアッセイ用キ
ット及び該試薬を用いるコバラミンのアッセイ法を提供
する。

〔望ましい具体例〕

本発明は、現在本発明から最良の方法であると考えら
れる以下の実施例により、さらに充分に理解されると思
われる。しかし、これらの実施例は単に説明のためのも
のであり、限定するものと解釈してはならないことを、
理解しなければならない。

本明細および添付の請求項に記載される用語「パーセ
ント」および「割合」は、特に指摘がない限り、重量に
基づくパーセントおよび割合である;gはグラムを意味
し;mgはミリグラムを意味し;ngはナノグラムを意味し;p
gはピコグラムを意味し;cmはセンチメートルを意味し、
mmはミリメートルを意味し;Lはリットルを意味し；μＬ
はマイクロリットルを意味し;m/oはモルパーセントを意
味し、組成物中のその成分のモル数を組成物中の総モル
数で除した数の100倍に等しく;v/vは容量パーセントを
意味し;w/vは容量あたりの重量を意味し、g/Lに換算さ
れ;Mはモラーを意味し、１リットルの溶液中の溶質のグ
ラムモル数と等しく；μＭはマイクロモラーを意味し、
１リットルの溶液中のマイクログラムモル数と等しく;m
Mはミリモラーを意味し、１リットルの溶液中の溶質の
ミリグラムモル数と等しく;Nは規定度を意味し、１リッ
トルの溶液中の溶質のグラム当量数と等しく；μＮは、
マイクロ規定度を意味し、１リットルの溶液中の溶質の
マイクログラム当量数と等しい。特に指摘のない限り、
すべての温度は℃である。

実施例１は、図２に示す構造をもつ18原子ホモバイフ
ァンクショナルリンカーの製造を記載している。実施例
２は、18原子ホモバイファンクショナルリンカーを使用
してアルカリフォスファターゼを「B₁₂アミン」に結合
させることを記載しており、この化合物は添付の図４に
示す構造をもち、ただしＣ環の13番炭素に結合した置換
基が以下の構造をもつ。

実施例１および実施例２の導入として、B₁₂アミンの
製造を以下に記載する。

〔B₁₂アミンの合成〕 2.2gのシアノコバラミンを酸加水分解し、生成したモ
ノカルボキシル酸を単離し、酸のひとつを分離し、分離
した酸を1,6−ジアミノヘキサンに結合させることによ
り、上記のB₁₂アミンを製造した。シアノコバラミンを3
00mLの0.8Mリン酸に加え、窒素雰囲気下暗中で６時間70
℃に加熱した。反応混合物を、カラムに詰めた洗浄した
イオン交換樹脂にアプライした；結合しない誘導体を溶
出した；そして結合したB₁₂酸をメタノールで溶出し、
ロータリー真空乾燥により濃縮した。使用したイオン交
換樹脂は、AMBERLITE XAD−２という商標で市販されて
いるものである。その後、NaOH、HCl、NaOAcで洗浄して
脱イオン水でpH5.0に平衡化したDE−52セルロースカラ
ムを用いて、それぞれのB₁₂酸を分離した。サンプルを4
x75cmのカラムに加え、ゆっくりと溶出した。２日後、
無反応性のコリノイドを含む単一の赤色バンドを、蒸留
水で除去した。B₁₂モノ酸を、0.05パーセント酢酸で溶
出した。36時間で、３つのピークが溶出された。それぞ
れのバンドを回収し、ロータリー真空乾燥により濃縮し
た。赤色物質を含む分画を集め、橙黄色の分画を廃棄し
た。赤色分画の反応性を試験するために、放射アッセイ
を行った。赤色分画の性質を調べるため、マス分光、C1
3NMR、HPLCを使用した；赤色分画は、添付の図４に示す
構造（「モノカルボキシル化B₁₂」）をもつことが明ら
かになった；赤色分画は、Ｃ環の13番の位置がカルボキ
シル化されていた。

その後、B₁₂アミンを、63mgのモノカルボキシル化
B₁₂、0.2554gの1,6−ヘキシルジアミン、88.8mgの１−
エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボ
ジイミド（「EDAC」）から製造した。モノカルボキシル
化B₁₂と1,6−ヘキシルジアミンを13mLの蒸留水に溶解
し；溶液のpHを1N塩酸で6.0に合わせ;EDACを加え；反応
混合物を窒素雰囲気下で約16時間攪拌した（Tetsuo To
raya著、J.Biol.Chem.、255巻、3520−3525ページ、198
0年）。反応混合物をロータリー真空乾燥により濃縮
し、HPLCで精製した（Tetsuo Toraya著、Biochem.、18
巻、417−426ページ、1979年）。20v/vのメタノールと8
0v/vの１パーセント酢酸水溶液から成る溶媒系を使用
し、初期流速4ml/分で、B₁₂アミンをＣ−18（Magnum9）
カラムで精製した;80分後、流速を6ml/分に上げた。産
物を、B₁₂アミンと同定した。

〔実施例１〕 18原子ホモバイファンクショナルリンカーの合成 （Ａ）エステル中間体の合成 ジスクシニミジルエステル中間体を、200mLのジメチ
ルホルムアミドに溶解した8.16gのＮ−ヒドロキシスク
シニミド、7.17gのトリエチルアミン、5.0gのスクシニ
ルクロリドから製造した。トリエチルアミンを、窒素雰
囲気下で、ジメチルホルムアミド溶液に加えた。スクシ
ニルクロリドをゆっくりと加えて攪拌を開始し、加え終
わってから８時間後まで攪拌し続けた。生成した沈殿を
濾過して反応混合液から分離し、高真空下で乾燥し、得
られたクルードな産物を50mlのクロロホルムで粉砕し、
アルゴンガス下で高真空乾燥し、Ｚが図３に示す構造で
ある添付の図７に示す構造をもつ、ジスクシニミジルエ
ステル中間体と同定される8.52gの純粋な白色粉末を得
た。

（Ｂ）リンカーの合成 その後、18原子ホモバイファンクショナルリンカー
を、150mlの乾燥ジメチルホルムアミドに溶解した5.0g
のジスクシニミジルエステル中間体、4.20gの６−アミ
ノカプロン酸、6.93gのジシクロヘキシルカルボジイミ
ドから合成した。６−アミノカプロン酸をジメチルホル
ムアミド溶液に加え、得られた反応混合液を、窒素雰囲
気下約22℃の室温で３時間攪拌した。その後、ジシクロ
ヘキシルカルボジイミドを加え、反応混合液を、窒素雰
囲気下室温で約16時間攪拌した。その後、生成したジシ
クロヘキシル尿素の沈殿を濾過して反応混合物から分離
し、減圧下で濾過物からジメチルホルムアミドを蒸発さ
せた。エーテルで粉砕した後、高真空下で乾燥させ、7.
94gの18原子ホモバイファンクショナルリンカーを得
た。

〔実施例２〕 B₁₂の製造：アルカリフォスファターゼコンジュゲート コンジュゲートは、 （１）0.82mMB₁₂アミンの50v/vジメチルホルムアミドと
ジメチルスルホキシド溶液0.173mL、 （２）1.88mM18原子ホモバイファンクショナルリンカー
の50v/vジメチルホルムアミドとジメチルスルホキシド
溶液0.142mL、 （３）塩化亜鉛0.1mMを含む50mMリン酸カリウム緩衝液
（pH7.4）に対して透析したアルカリフォスファターゼ
（Boehringer Mannheim;10mg/mL）1.0mL、 （４）50v/vジメチルホルムアミドとジメチルスルホキ
シド0.0749mL、 から調製した。

B₁₂アミン溶液と、18原子ホモバイファンクショナル
リンカー溶液と、50v/vジメチルホルムアミドとジメチ
ルスルホキシドとを、ガラスバイアル中で混合し、約22
℃の室温で30分間反応させた。その後、反応混合物を透
析したアルカリフォスファターゼに加え、穏やかに攪拌
し、４℃で約20時間放置した。１リットルあたり1.0mg
モルの塩化マグネシウムと１リットルあたり0.10mgモル
の塩化亜鉛を含む50mMトリス（ヒドロキシメチル）−ア
ミノメタン（「TRIS」;pH7.4）の脱イオン水溶液を使用
し、反応混合物をセファデックスG50−100（1.2x44cm）
で分離した。適当な分画を集め、１リットルあたり1.0m
gモルの塩化マグネシウムと１リットルあたり0.10mgモ
ルの塩化亜鉛を含む1000mlのTRIS（pH7.4）の脱イオン
水溶液に対して透析した。産物は、コンジュゲート調製
中に図２に示すＺ基が置換し、添付の図８に示す構造の
原子団を介してB₁₂分子がアルカリフォスファターゼ分
子と結合したB₁₂/アルカリフォスファターゼコンジュゲ
ートである。その後、アルカリフォスファターゼコンジ
ュゲートを希望の濃度に希釈し、「酵素−B₁₂コンジュ
ゲート反応溶液」を調製した。

以下の実施例３は、精製した内因子を処理した微粒子
に結合させるため、実施例１の方法で製造したリンカー
を使用することを記載する。精製した内因子の調製、お
よび内因子に結合した実施例１の18原子ホモバイファン
クショナルリンカーが結合する処理した微粒子の調製
は、実施例３の導入として以下に記載する。

〔精製した内因子の精製〕

約40gのブタ十二指腸を洗浄し、小さな断片に切断し
た。小片を混合し、過塩素酸でpH1.0に酸性化し、１時
間混合した。大きな断片を遠心して除去し、上清を5N水
酸化カリウム脱イオン水溶液で中和した。４℃で約16時
間後、沈殿が生成した。上清の上層90パーセントを吸引
除去し、セライトを通して濾過し、リピドを除去した。
透明な濾過物中の内因子を、ｅおよびdB₁₂カルボキシル
誘導体の混合物を臭化シアンセファロース4bに結合させ
たアフィニティーカラムを用い、親和性クロマトグラフ
ィー精製した。

非特異的に結合した蛋白質は、4M塩化ナトリウム脱イ
オン水溶液で、続いて50mMリン酸カリウム緩衝液の脱イ
オン水溶液でカラムを洗浄することにより除去した。内
因子は、3.8Mグアニジン塩酸で溶出した。カラムから溶
出した最初の内因子画分は、本発明のアッセイに使用す
るために選択される内因子を含む；後の画分はアッセイ
の性能が低い。コバラミンを含むがコバラミントは限ら
ないさまざまなコリノイド環含有化合物（すなわちコビ
ナミド類）と結合するＲ蛋白が、望ましい画分の内因子
中に存在するかを試験した。（B₁₂コバルト57を使用し
た放射アッセイにより）試験した内因子のコビナミド類
との交差反応性が少なくとも0.004パーセント未満を示
したら、脱イオン水を数回交換しながら内因子を完全に
透析した。この方法でアフィニティー精製した最初の分
画（「精製した内因子」）は、少なくとも85％がコバラ
ミンと結合する蛋白を含むことが示された。機能純度が
約85パーセント未満であると、アッセイの感度が悪くな
ることが示された。

〔微粒子の処理〕 BIORAD BIOREX MSX501（Ｄ）という商品名で市販さ
れている樹脂0.5gを脱イオン水で数回洗浄した。その
後、アミノ微粒子（SERADYNE、平均直径0.26μｍ、平均
面積アミノ基あたり390平方オングストローム）1mLと脱
イオン水1mLを樹脂と混合し、混合物を室温で１時間回
転した。樹脂を沈殿させ、微粒子をデカントした。樹脂
にさらに1mLの脱イオン水を加えて攪拌した後、もう一
度微粒子をデカントした。すずぎ、混合、デカントを２
度繰り返し、デカントした微粒子に脱イオン水を加えて
微粒子固体濃度を7.5パーセントに合わせた（「処理し
た微粒子」）。

〔実施例３〕 微粒子の機能化 微粒子／内因子コンジュゲートを、300μＬの処理し
た微粒子と、38μg/mLの内因子と実施例１（Ｂ）で製造
した18原子ホモバイファンクショナルリンカーを1.0mg/
mL含有するジメチルホルムアミド33μＬを含む600μＬ
の精製した内因子溶液とから製造した。微粒子と18原子
ホモバイファンクショナルリンカーのジメチルホルムア
ミド溶液を小さなプラスチック製バイアルに入れ、バイ
アルを30分間回転させた；その後内因子を加え、約22℃
の室温でバイアルを約16時間回転させ、内因子／微粒子
コンジュゲートを製造した。使用前に、コンジュゲート
をTWEEN20という商品名で市販されている界面活性剤の
0.05パーセント脱イオン水溶液で２回、0.05MTRIS（pH
7.4）の脱イオン水溶液で２回洗浄した。その後、内因
子／微粒子コンジュゲート１容量に対して、ウシ血清ア
ルブミン１パーセントとアジ化ナトリウム0.1パーセン
トとTWEEN20という商品名で市販されている界面活性剤
0.01パーセントとショ糖0.4gモル／リットルを含有する
0.8mTRIS溶液（pH7.4）の脱イオン水溶液である粒子希
釈液250容量で希釈し、「内因子−微粒子コンジュゲー
ト、18原子リンカー」を製造した。

実施例４および実施例５は、酵素に使用したB₁₂アッ
セイを全自動の装置（ABBOTT IMxアナライザー）で行
ったときの、標準溶液中のシアノコバラミン濃度に相関
するシグナルを示す標準曲線を誘導する方法、および未
知サンプルのコバラミンをアッセイするために標準曲線
を使用する方法を記載する。実施例４および実施例５を
行うために、酵素−B₁₂コンジュゲート反応溶液、内因
子−微粒子反応コンジュゲート、18原子リンカー、反応
基質インディケーターを使用した。反応基質インディケ
ーターは、1mgモル/Lの塩化マグネシウムと4mgモル/Lの
テトラミソールと1.2mgモル/Lの４−メチルウンベリフ
ェロン−リン酸（「MUP」）と0.1パーセントのアジ化ナ
トリウムを含有する100mM2−アミノ−２−メチル−１−
プロパノール（pH10.3）溶液である。

〔酵素を使用したB₁₂アッセイ法〕 標準サンプルあるいは血清サンプルに、標準液あるい
はサンプルに水酸化ナトリウムを１リットルあたり0.3g
等量含むまで、コビナミドとｘ−モノチオグリセロール
のようなチオール剤と水酸化ナトリウムを加え、34℃で
８分間変性させた（このステップの目的は、血清結合蛋
白質からB₁₂を解離させることにある）。その後、変性
溶液を内因子−微粒子反応コンジュゲートで中和し、中
和した組成物を室温で15分間インキュベートした。その
後、インキュベートした組成物を、分離物質（Abbott
Laboratories、North Chicago、Illinoisが販売するIM
xディスポーザブル反応セル）の表面にのせた；微粒子
とコンジュゲートした内因子に結合したB₁₂は分離物質
の表面に保持されたが、結合していないB₁₂は洗浄除去
された。その後、分離物質の表面を50mMTRIS（pH7.4）
の脱イオン水溶液で洗浄し、結合していないB₁₂を除去
した。分離物質の表面に酵素−B₁₂コンジュゲート反応
溶液50μＬを加え、フリーの内因子部位に結合させた。
分離物質の表面を再び50mMTRIS（pH7.4）の脱イオン水
溶液で洗浄した後、反応基質インディケーター50μＬを
加え、362nmの波長の放射で分離物質の表面を励起し
た。MUPはアルカリフォスファターゼにより加水分解さ
れ、４−メチルウンベリフェロンを遊離し、362nmの波
長の放射で励起したときに448nmの波長の蛍光を発す
る。IMx装置による読み取り値は、アルカリフォスファ
ターゼ基質インディケーターを分離物質表面に加えたと
きの、波長448nmにおける単位時間あたりの発光初期強
度である。患者の血清サンプルの読み取り値を曲線と比
較し、B₁₂含量を測定した。

〔実施例４〕 ウシ血清アルブミン１パーセントとアジ化ナトリウム
0.2パーセントと塩化ナトリウム100mgモル/Lと塩化マグ
ネシウム1.0mgモル/Lと塩化亜鉛0.1mgモル/Lを含有する
USPシアノコバラミンの50mMTRIS（pH7.4）の脱イオン水
溶液で希釈して調製した標準液中のシアノコバラミン濃
度に相関したシグナルを測定するため、以下の方法を使
用した。標準液は、０、62.5、125、250、1000、2000pg
/mLのシアノコバラミンを含有する。標準サンブルのIMx
装置による読み取り値を、B₁₂含量に相関する曲線を書
くためのデータとした。

〔実施例５〕 以下の方法は、さまざまな患者のサンプルからシグナ
ルを測定するために使用した。このアッセイは、38pg/m
LのB₁₂を検出できることが見い出されている。患者の血
清サンブル（ｎ＝136）を上記の方法でおよびBecton D
ickinson（Orangeberg、New York）からSimulTracとい
う商品名で市販されている放射アッセイ装置でアッセイ
した。ふたつの試験法のデータから相関曲線を計算し
た；曲線の傾きは1.01であり、相関係数（Ｒ）は0.99で
あった。

以下の実施例６（参考例）は、Ｎ−（カルボシクロヘ
キシルメチル）マレイミド、６−アミノカプロン酸、ジ
シクロヘキシルカルボジイミド、Ｎ−ヒドロキシスクシ
ニミドからＮ−ヒドロキシスクシニミジルトリカプロア
ミドシクロヘキシルメチルマレイミドを合成する方法、
およびＮ−ヒドロキシスクシニミジルトリカプロアミド
シクロヘキシルメチルマレイミドから、Z'が図11に示す
構造をもちC₆H₁₀が1,4−シクロヘキシレンである添付の
図13の構造式をもつ68原子ホモバイファンクショナルリ
ンカーを合成する方法について記載する。

〔実施例６〕 （Ａ）Ｎ−ヒドロキシスクシニミジルカプロアミドシク
ロヘキシルメチルマレイミドの調製 Ｎ−ヒドロキシスクシニミジルカプロアミドシクロヘ
キシルメチルマレイミドは、Ｚが図３の構造をもち、Z'
が図11の構造をもち、ｎが１で、C₆H₁₀が1,4−シクロヘ
キシルである添付の図14の構造をもつ化合物であり、10
0mgのＮ−（４−カルボキシシクロヘキシルメチル）マ
レイミドの乾燥ジメチルホルムアミド溶液、39.23mgの
６−アミノカプロン酸、67.8mgのジシクロヘキシルカル
ボジイミド、37.8mgのＮ−ヒドロキシスクシニミドから
製造した。Ｎ−（４−カルボキシシクロヘキシルメチ
ル）マレイミドは、Yoshitakeらの方法（J.Biochem.、1
01巻、395−399ページ、1979年）により、trans−４−
（アミノメチル）−シクロヘキサンカルボキシル酸（Al
drich Chemical社）から製造した。上記のＮ−（４−
カルボキシシクロヘキシルメチル）マレイミド溶液の入
ったフラスコを窒素雰囲気にして、６−アミノカプロン
酸をフラスコに加えた。その後、反応混合物を、窒素雰
囲気下約22℃の室温で16時間攪拌した後、ジシクロヘキ
シルカルボジイミドとＮ−ヒドロキシスクシニミドをフ
ラスコに加えた。さらに６時間室温で攪拌を続けた後、
濾過して混合物から沈殿したジシクロヘキシル尿素を除
去し、減圧下で濾過物からジメチルホルムアミドを蒸発
させた。残存した粘性の固体をシリカゲルフラッシュク
ロマトグラフィー（クロロホルム中5v/vメタノール）に
より精製し、示した構造式をもつ白色固体のＮ−ヒドロ
キシスクシニミジルカプロアミドシクロヘキシルメチル
マレイミド71mgを得た。

（Ｂ）Ｎ−ヒドロキシスクシニミジルジカプロアミドシ
クロヘキシルメチルマレイミドの調製 Ｎ−ヒドロキシスクシニミジルジカプロアミドシクロ
ヘキシルメチルマレイミドは、Ｚが図３の構造で、Z'が
図11の構造で、ｎが２で、C₆H₁₀が1,4−シクロヘキシル
である添付の図14の構造をもつ化合物であり、100mgの
Ｎ−ヒドロキシスクシニミジルカプロアミドシクロヘキ
シルメチルマレイミドの1ml乾燥ジメチルホルムアミド
溶液、29.3mgの６−アミノカプロン酸、50.7mgのジシク
ロヘキシルカルボジイミドから製造した。上記Ｎ−ヒド
ロキシスクシニミジルカプロアミドシクロヘキシルメチ
ルマレイミド溶液の入ったフラスコを窒素雰囲気にし
て、６−アミノカプロン酸をフラスコに加えた。その
後、反応混合物を、窒素雰囲気下約22℃の室温で16時間
攪拌した後、ジシクロヘキシルカルボジイミドをフラス
コに加えた。さらに６時間室温で攪拌を続けた後、濾過
して混合物から沈殿したジシクロヘキシル尿素を除去
し、減圧下で濾過物からジメチルホルムアミドを蒸発さ
せた。残存した粘性の固体をシリカゲルフラッシュクロ
マトグラフィー（クロロホルム中10v/vメタノール）に
より精製し、示した構造式をもつＮ−ヒドロキシスクシ
ニミジルジカプロアミドシクロヘキシルメチルマレイミ
ド60mgを得た。

（Ｃ）Ｎ−ヒドロキシスクシニミジルトリカプロアミド
シクロヘキシルメチルマレイミドの調製 Ｎ−ヒドロキシスクシニミジルトリカプロアミドシク
ロヘキシルメチルマレイミドは、Ｚが図３の構造で、Z'
が図11の構造で、ｎが３で、C₆H₁₀が1,4−シクロヘキシ
ルである添付の図14の構造をもつ化合物であり、100mg
のＮ−ヒドロキシスクシニミジルジカプロアミドシクロ
ヘキシルメチルマレイミドの2ml乾燥ジメチルホルムア
ミド溶液、23.4mgの６−アミノカプロン酸、40.5mgのジ
シクロヘキシルカルボジイミドから製造した。上記Ｎ−
ヒドロキシスクシニミジルジカプロアミドシクロヘキシ
ルメチルマレイミド溶液の入ったフラスコを窒素雰囲気
にして、６−アミノカプロン酸をフラスコに加えた。そ
の後、反応混合物を、窒素雰囲気下約22℃の室温で16時
間攪拌した後、ジシクロヘキシルカルボジイミドをフラ
スコに加えた。さらに６時間室温で攪拌を続けた後、濾
過して混合物から沈殿したジシクロヘキシル尿素を除去
し、減圧下で濾過物からジメチルホルムアミドを蒸発さ
せた。残存した粘性の固体をシリカゲルフラッシュクロ
マトグラフィー（クロロホルム中10v/vメタノール）に
より精製し、示した構造式をもつ白色固体のＮ−ヒドロ
キシスクシニミジルトリカプロアミドシクロヘキシルメ
チルマレイミド60mgを得た。

（Ｄ）68原子ホモバイファンクショナルリンカーの調製 68原子ホモバイファンクショナルリンカーは、Z'が図
11の構造で、C₆H₁₀が1,4−シクロヘキシルである図13の
構造をもつ化合物であり、0.2342gの1,6−ヘキサンジア
ミンの3mL乾燥ジメチルホルムアミド溶液と2.695gのＮ
−ヒドロキシスクシニミジルトリカプロアミドシクロヘ
キシルメチルマレイミドの10mL乾燥ジメチルホルムアミ
ド溶液から、約22℃の室温で製造することができる。Ｎ
−ヒドロキシスクシニミジルトリカプロアミドシクロヘ
キシルメチルマレイミド溶液をヘキサンジアミン溶液に
激しく攪拌しながらすばやく注ぐ。約２時間攪拌を続け
た後、ジメチルホルムアミドを蒸発させ、残存物を50v/
vアセトンメタノール溶媒15mLずつで３回洗浄し、減圧
下で乾燥して希望の産物を得る。

実施例７は、実施例６（Ｂ）記載の23原子ヘテロバイ
ファンクショナルリンカーを、精製した内因子と処理し
た微粒子とを結合させるために使用する方法を記載す
る。内因子に結合した実施例６（Ｂ）記載の23原子ヘテ
ロバイファンクショナルリンカーが結合する精製した内
因子および処理した微粒子の調製法は、実施例３の導入
として上に記載してある。

〔実施例７〕 微粒子の機能化 処理した微粒子を、内因子30μg/mLと実施例３（Ｂ）
記載の23原子ヘテロバイファンクショナルリンカー80μ
ｇの17.5mMトリエタノールアミン緩衝液（pH8.0）を含
有する精製した内因子溶液700μＬと結合させて微粒子
0.6パーセントを含む溶液1mLを得、微粒子／内因子コン
ジュゲートを製造した。得られた溶液を暗下約22℃の室
温で２時間攪拌した。インキュベートした後、粒子を沈
殿させ、弱い界面活性剤/50mMTRIS緩衝液で数回洗浄
し、粒子の大きさの分布の均一性を確実にするためにホ
モゲナイズし、希望の濃度に希釈した（「内因子−微粒
子コンジュゲート、23原子リンカー」）。

〔実施例８〕 内因子−微粒子コンジュゲートの18原子リンカーを23
原子リンカーに置き換え、実施例４に方法を繰り返し
た。添付の図６は、この方法で測定した、B₁₂含量に相
関した装置の読み取り値を示す曲線である。精製した内
因子を、23原子リンカー由来の化学部分を介し、微粒子
にコンジュゲートした；その部分は添付の図15の構造を
もつ。

〔実施例９〕 内因子−微粒子コンジュゲートを18原子リンカーから
置き換え、実施例５に方法を繰り返した。このアッセイ
は、ゼロ標準を複数測定した標準偏差を２回使用した計
算に基づき、60pg/mL未満のB₁₂を検出できることが明ら
かにされた。患者の血清サンプル（ｎ＝76）を上記の方
法で、およびBIORAD Quantaphaseラジオアッセイとい
う商品名で市販されている放射アッセイ装置でアッセイ
した。添付の相関曲線は、ふたつの試験法のデータから
計算した；曲線の傾きは1.10であり、相関係数（Ｒ）は
0.99であった。

本発明の他のさまざまなリンカーを、上記の方法およ
びその変法により製造した。それらの調製法の代表例
を、以下の実施例に記載する。

〔実施例10〕 22原子ビス（ヒドラジド）ホモバイファンクショナル
リンカーを、5mlの乾燥メタノールに溶解させた実施例
１（Ｂ）記載の18原子バイファンクショナルリンカー0.
50gと、2mlのメタノールに溶解させたヒドラジン水和物
0.14gとから製造した。ヒドラジン水和物の溶液をフラ
スコに注ぎ込み、０℃に冷却した；磁気攪拌を開始し、
リンカー溶液をゆっくり加える間攪拌を続け、加え終わ
ってからも30分間攪拌を続けた。リンカー溶液を加える
間フラスコ内容物を０℃に保ち、その後30分間で約22℃
の室温にまで温めた。その後、反応混合物を焼結ガラス
製漏斗で濾過し、クロロホルム中0.5から20v/vメタノー
ルグラジエントを使用し、シリカゲルカラムでクロマト
グラフィーを行った。ビス（ヒドラジド）ホモバイファ
ンクショナルリンカーを含む分画を集め、乾燥し、Ｚが
H₂NHNである添付の図２の構造をもつ希望の化合物0.21g
を得た。化合物をNMRで同定した。

〔実施例11〕 ビス（ヨードアセチル）26原子ホモバイファンクショ
ナルリンカーを、ビス（ヒドラジド）ホモバイファンク
ショナルリンカー（実施例10）0.15gを含有する3mLメタ
ノール溶液と、ヨード酢酸Ｎ−ヒドロキシスクシニミド
エステル0.15gを含有する3mLメタノール溶液とから、約
22℃の室温で製造した。ビス（ヒドラジド）ホモバイフ
ァンクショナルリンカーを含むフラスコを暗中に置き、
溶液の攪拌を開始した。ヨード酢酸Ｎ−ヒドロキシスク
シニミドエステル溶液をフラスコにゆっくりと加えた；
加えている間攪拌を続け、加え終わってからも１時間攪
拌を続けた。その後、クロロホルム中0.5から10v/vメタ
ノールを使用し、溶液を短いシリカゲルカラムクロマト
グラフィーにかけた。その後、希望の産物を含む分画か
ら溶媒を蒸発させ、Ｚが図９の構造をもつ添付の図２の
構造をもつビス（ヨードアセチル）20原子ホモバイファ
ンクショナルリンカー0.06gを得た。

〔実施例12〕 ビス（マレイミド）22原子ホモバイファンクショナル
リンカーを、乾燥ジメチルホルムアミド5mLに溶解した
スクシニミジル４−（Ｎ−マレイミジルメチル）シクロ
ヘキサン−１−カルボキシレート0.668gと新しいトリエ
チルアミン0.200gとエチレンジアミン0.060gとから、室
温で製造した。スクシニミジル４−（Ｎ−マレイミジル
メチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート溶液
を、100mL丸底フラスコに入れた。攪拌を開始し、トリ
エチルアミンとエチレンジアミンを加えている間攪拌を
続け、加え終わってからも１時間攪拌を続けた（トリエ
チルアミンとエチレンジアミンを加え終わって２分後に
大量の沈殿が生成した）。その後、濾過して沈殿を除去
し、水／メタノールで洗浄し、乾燥した。産物は、Z'が
図11の構造をもちC₆H₁₀が1,4−シクロヘキシレンである
添付の図10の構造をもつビス（マレイミド）22原子ホモ
バイファンクショナルリンカーであることが、NMRによ
り同定された。

実施例13は、２とＺが図３の構造をもつ添付の図12の
構造をもつ本発明のホモバイファンクショナルリンカー
の合成法を記載する。

〔実施例13〕 図12の構造をもつホモバイファンクショナルリンカー
は、乾燥ジメチルホルムアミド410mlに溶解した18原子
ホモバイファンクショナルリンカー〔実施例１（Ｂ）〕
13.6gと、６−アミノカプロン酸6.65gと、ジシクロヘキ
シルカルボジイミド10.4gとから合成することができ
る。６−アミノカプロン酸をジメチルホルムアミド溶液
に加え、得られた反応混合物を窒素雰囲気下約22℃の室
温で３時間攪拌する。その後、ジシクロヘキシルカルボ
ジイミドを加え、反応混合物を窒素雰囲気下室温で約16
時間攪拌する。その後、濾過して沈殿したジシクロヘキ
シル尿素を反応混合物から分離し、減圧下でジメチルホ
ルムアミドを濾過物から蒸発させた。エーテルで粉砕し
た後、高真空下で乾燥し、示したホモバイファンクショ
ナルリンカーを得る。

本発明の範囲からはずれることなく、以上の実施例に
開示したような本発明の特定な詳細にさまざまな変化や
修飾ができることを、以上の実施例から理解しなければ
ならない。例えば、実施例１（Ｂ）では18原子ホモバイ
ファンクショナルリンカーをジスクシニミジルエステル
中間体と６−アミノカプロン酸とから合成しているが、
他の異なる原子数のリンカーを製造するため、６−アミ
ノカプロン酸の代わりに当量の他のさまざまなアミノ酸
を使用することができる。そのように置換できるアミノ
酸の例にはグリシン、３−アミノ−ｎ−プロピオン酸、
４−アミノ−ｎ−ブチル酸、５−アミノ−ｎ−吉草酸、
７−アミノ−ｎ−ヘプト酸、８−アミノ−ｎ−カプリル
酸、９−アミノ−ｎ−ノニル酸、10−アミノ−ｎ−カプ
リン酸を含む。同様に、ふたつの異なるアミノ酸をジス
クシニミジルエステル中間体と反応させ、ふたつの異な
るアミノアルキル基をもつリンカーを製造することもで
きる。

さらに、実施例６（Ａ）（Ｂ）（Ｃ）の部分は、前段
落に記載したすべてのアミノ酸を当量使用して他のＮ−
ヒドロキシスクシニミジルトリアミドシクロヘキシルメ
チルマレイミドを製造することができ、これは実施例６
（Ｄ）の方法でホモバイファンクショナルリンカーに変
換することかでき、実施例６（Ｂ）のＮ−ヒドロキシス
クシニミジルジアミドシクロヘキシルメチルマレイミド
も実施例６（Ｄ）の方法でホモバイファンクショナルリ
ンカーに変換することかできる。同様に、実施例６
（Ｄ）の1,6−ヘキサンジアミンの代わりに他のジアミ
ンを使用し、他のリンカーを製造することもできる。そ
のように置換できるジアミンの例には、以下の式に示す
構造をもつものを含む、 H₂N（−CH₂）_ｘ−NH₂ ここでｘは２から10までの整数である。

従って、本発明の特徴は下記の構造式をもつ化合物で
あることが理解できる。

（式中、ｘは３〜10の整数であり、ｙは１〜10の整数で
あり、ｎは１〜10の整数であり、Ｚは であり、 但し、ｎが１であり、ｙが２又は４であり、そしてＺが であるとき、ｘは４〜10の整数である） 他の変化や修飾は、当業者達に明らかであり、添付の
請求項に記載したように、本発明の精神と範囲をはずれ
ることなく、行うことができる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ウエルチ，クリストファー アメリカ合衆国イリノイ州 60801 ウ ルバナ イー オレゴン ストリート 910 (56)参考文献 特開 昭51−23290（ＪＰ，Ａ) 特開 平４−228098（ＪＰ，Ａ) Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，（1985）, Ｖｏｌ．28，Ｎｏ．９，ｐ．1140−1141 Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔ ｅｃｈｎｏｌ．，（1985），Ｖｏｌ. 11，Ｎｏ．６，ｐ．445−456 Ｊ．Ｃｏｏｒｄ．Ｃｈｅｍ．, （1986），Ｖｏｌ．14，Ｎｏ．３，ｐ. 241−248 Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，Ｃｈｅｍ. Ｃｏｍｍｕｎ．，（1986），ｐ．659− 661 (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) ＣＡ（ＳＴＮ) ＣＡＯＬＤ（ＳＴＮ) ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ)

Claims (11)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】式 （式中、ｘは３〜10の整数であり、ｙは１〜10の整数で
   あり、ｎは１〜10の整数であり、Ｚは であり、 但し、ｎが１であり、ｙが２又は４であり、そしてＺが であるとき、ｘは４〜10の整数である） の化合物からなる結合試薬。
2. 【請求項２】化合物が式 （式中、Ｚは である） の化合物からなる請求項１記載の結合試薬。
3. 【請求項３】化合物が式 （式中、Ｚは である） の化合物からなる請求項２記載の結合試薬。
4. 【請求項４】化合物が式 （式中、Ｚは である） の化合物からなる請求項２記載の結合試薬。
5. 【請求項５】微粒子を、請求項１記載の化合物からなる
   結合試薬由来の部分を介して、コビナミドとの交叉反応
   性が0.004パーセント未満になるようにＲ蛋白を分離し
   て精製した内因子と結合させることを特徴とするコンジ
   ュゲートを製造する方法。
6. 【請求項６】微粒子を、請求項１記載の化合物からなる
   結合試薬由来の部分（但し、結合試薬由来の部分がCO
   （CH₂）₅NHCO（CH₂）₂CONH（CH₂）₅COである場合は除
   く）を介して、コビナミドとの交叉反応性が0.004パー
   セント未満になるようにＲ蛋白を分離して精製した内因
   子と結合させたことを特徴とするコンジュゲート。
7. 【請求項７】少なくとも95パーセントの蛋白がコバラミ
   ンと結合している請求項６記載の微粒子と内因子とのコ
   ンジュゲート。
8. 【請求項８】微粒子を、請求項１記載の化合物からなる
   結合試薬由来の部分（但し、結合試薬由来の部分がCO
   （CH₂）₅NHCO（CH₂）₂CONH（CH₂）₅COである場合は除
   く）を介して、コビナミドとの交叉反応性が0.004パー
   セント未満になるようにＲ蛋白を分離して精製した内因
   子と結合させたコンジュゲートと、酵素と該精製内因子
   の特異的結合メンバーとを請求項１記載の化合物からな
   る結合試薬由来の部分（但し、結合試薬由来の部分がCO
   （CH₂）₅NHCO（CH₂）₂CONH（CH₂）₅COである場合は除
   く）を介して互いに結合させたコンジュゲートと、該酵
   素と反応してシグナルを発生するか又はシグナルを発生
   する反応産物を生成する基質インディケーターとからな
   ることを特徴とするコバラミンのアッセイ用キット。
9. 【請求項９】酵素がアルカリホスファターゼであり、イ
   ンディケーターがMUP（４−メチルウンベリフェロンホ
   スフェート）である請求項８記載のキット。
10. 【請求項１０】特異的結合メンバーがB₁₂アミンである
    請求項８記載のキット。
11. 【請求項１１】テストサンプルを変性し、該変性したテ
    ストサンプルに、微粒子を請求項１記載の化合物からな
    る結合試薬由来の部分（但し、結合試薬由来の部分がCO
    （CH₂）₅NHCO（CH₂）₂CONH（CH₂）₅COである場合は除
    く）を介してコビナミドとの交叉反応性が0.004パーセ
    ント未満になるようにＲ蛋白を分離して精製した内因子
    と結合させたコンジュゲートを加え、該コンジュゲート
    を含む変性したテストサンプルをインキュベートし、内
    因子／微粒子コンジュゲートを保持する分離物質の上に
    該インキュベートした組成物をのせ、該分離物質を洗浄
    して未結合のビタミンB₁₂を除去し、酵素と該精製内因
    子の特異的結合メンバーとのコンジュゲートを該分離物
    質に加えてフリーの内因子の部位に結合させ、該分離物
    質を洗浄し、酵素と反応してシグナルを発生するか又は
    シグナルを発生する反応産物を生成する基質インディケ
    ーターを加え、該酵素と該インディケーターとが反応し
    て発生するシグナルを測定するか、又は該酵素と該イン
    ディケーターとの反応産物が発生するシグナルを測定す
    ることからなることを特徴とするコバラミンのアッセイ
    法。