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3.1.2.3 Microextracción de fase sólida
Este método es simple y sensible para analizar los compuestos volátiles, ya que requiere una preparación mínima de la muestra, conforme se obtiene límites de detección en el rango de nanogramos por litro para compuestos elegidos. A su vez, se pueden determinar compuestos tanto en matrices simples como complejas (Evans, 1997; Uinard & Beler, 2004). Normalmente esta técnica es más sensible a compuestos no polares, y se ha convertido en un método eficiente de extracción debido a que no es necesario el uso de grandes volúmenes de solvente, El tiempo requerido es corto y se evita la contaminación cruzada o arrastre, por lo tanto, es una alternativa confiable con respecto a las técnicas tradicionales de preparación de muestras, sobre todo cuando se combina con métodos de detección adecuados (Caldeira, 2007).
3.1.2.4. Determinación de α- ácidos e iso- α- ácidos mediante Cromatografía Líquida
de Alto Rendimiento (HPLC)
Figura 16. Esquema general de HPLC.
Fuente: Skoog, 2007.
El método HPLC es capaz de cuantificar los iso-α-ácidos procedentes del lúpulo según reconoce la Agencia Estatal Boletín Oficial del Estado, España (BOE).
En este tipo de cromatografía la fase móvil es un líquido, que actúa como disolvente de los compuestos o analitos presentes en la muestra. Los compuestos pasan con la fase móvil a través de la columna y se reparten entre esta y la fase estacionaria.
Para la medición de los iso-α-ácidos liberados por el lúpulo, se emplea la HPLC de reparto o partición en columna, del tipo fase reversa o inversa. Es una técnica instrumental empleada para el análisis de proteínas y aminoácidos entre otros, siendo el método utilizado para más del 90% de los análisis en cromatografía líquida. Sarmiento Ochoa Ɩ 35
En este tipo de cromatografía tanto la fase móvil como la estacionaria son líquidos. El líquido de la fase estacionaria se inmoviliza mediante el uso de partículas de soporte sólido como gel de sílice, con elevada área superficial.
Para impedir que las fases se mezclen, se usan líquidos de distinta polaridad. En el modo reverso, se usa un líquido polar en la fase móvil, utilizándose uno no polar en la estacionaria. La unión de los analitos a la fase estacionaria es de tipo hidrófobo, y se produce en la región no polar del analito. Las moléculas de soluto tendrán distinta atracción a ambas fases.
La cromatografía HPLC en cerveza, se realiza de acuerdo a la ASBC por medio de elución
por gradiente con una solución tampón citrato con pH=7. La fase móvil se modifica durante el análisis, de forma que favorece la interacción de los componentes presentes en la muestra con la fase estacionaria. La fase reversa se determina por el radical presente en la fase estacionaria, con carácter apolar. De tal forma que la fase reversa tiene como grupo funcional cadenas C8 (n-octil). Las cadenas de la fase estacionaria se acomodan a modo de peine en el soporte de la columna de forma que atrapan los iso-alfa-ácidos que pasan en la fase móvil.
Con respecto al cromatógrafo HPLC, se necesita al menos un depósito para fase móvil que el sistema de bombeo introducirá en gradiente en la columna. El depósito suele poseer un degasificador, para no introducir gas en la columna evitando errores en el análisis. Por otra parte, el sistema de bombeo debe tener capacidad para trabajar a altas presiones, tratándose habitualmente de bombas de pistón, junto con un supresor de pulsos, eliminando los inconvenientes que pueden producir este tipo de bombas. Para el sistema de inyección de muestra, se recomienda usar muestreador automático, que puede estar ubicado antes o después del sistema de bombeo, realizando la mezcla de la muestra con la fase móvil en baja o alta presión respectivamente. La columna será de relleno de sílice bañada en fase estacionaria C8. Respecto al sistema de detección y registro, podría ser de tipo fotométrico, debido a que la mayoría de los compuestos orgánicos absorben radiación en alguna parte del espectro.
