ANALISIS INSTRUMENTAL

CROMATOGRAFIA LIQUIDA DE ALTA RESOLUCION

INTRODUCCION

La cromatografía es un método físico de separación basado en la distribución de los componentes de

una mezcla entre dos fases inmiscibles, una fija o estacionaria y otra móvil. En cromatografía líquida,
la fase móvil es un líquido que fluye a través de una columna que contiene a la fase fija.
La cromatografía líquida “clásica” se lleva a cabo en una columna generalmente de vidrio, la cual está
rellena con la fase fija. Luego de sembrar la muestra en la parte superior, se hace fluir la fase móvil a
través de la columna por efecto de la gravedad. Con el objeto de aumentar la eficiencia en las
separaciones, el tamaño de las partículas de fase fija se fue disminuyendo hasta el tamaño de los
micrones, lo cual generó la necesidad de utilizar altas presiones para lograr que fluya la fase móvil.
De esta manera, nació la técnica de cromatografía líquida de alta resolución (HPLC), que requiere de
instrumental especial que permita trabajar con las altas presiones requeridas.

Dependiendo del tipo de fase fija y del tipo de fenómeno físico que provoca la separación, la
cromatografía líquida de alta resolución puede ser:

1. Cromatografía de adsorción.
La fase fija es un sólido y se utiliza casi exclusivamente sílice (sílica) y en mucha menor medida
alúmina.
2. Cromatografía de reparto.
En casi todos los casos, como fase estacionaria se utilizan compuestos unidos químicamente a
un soporte sólido de sílica. Se la subdivide encromatografía en fase normal y fase reversa.
En la cromatografía en fase normal, la fase fija es polar (como por ejemplo agua o trietilenglicol) y
los compuestos menos polares eluyen primero.
En la cromatografía en fase reversa, el compuesto unido químicamente es un hidrocarburo
alifático y se emplean fases móviles polares. En este caso, las sustancias más polares eluyen
primero.
3. Cromatografía iónica.
Se utilizan columnas rellenas con resinas de intercambio iónico para separar y determinar iones.
4. Cromatografía de exclusión por tamaño.
La fase fija está formada por partículas poliméricas o de sílice que contienen una red uniforme de
poros y llevan a cabo un fraccionamiento realcionado con el tamaño molecular. Las moléculas de
tamaño mayor son excluídas y eluyen primero, mientras que las más pequeñas que penetran en
los poros son retenidas más tiempo.

INSTRUMENTAL

Un equipo para cromatografía líquida de alta resolución puede representarse por el siguiente
esquema:

FASE VALVULA REGISTRADOR

MOVIL
BOMBA
INYECTORA
COLUMNA DETECTOR
INTEGRADOR

La fase móvil puede ser un solvente puro o una mezcla de solventes. Cuando se trata de una
mezcla, puede programarse la bomba para que tome solventes de diferentes botellas en una
proporción determinada y realice la mezcla en una cámara de mezclado. Cuando durante toda la
separación se utiliza siempre el mismo solvente, se denomina isocrática, sin embargo es normal
realizar un gradiente de composición del solvente a lo largo de la cromatografía para mejorar la
eficiencia y acortar la duración del proceso. Estos gradientes de solvente también son realizados en
forma automatica por las bombas.
La bomba envía al solvente a través de caños de diámetro pequeño, generalmente de acero
inoxidable, hacia la válvula inyectora. Esta consiste en una válvula de seis vías que permite introducir
en el flujo de solvente, la muestra contenida en un aro o loop de volumen calibrado. Luego de que se

HPLC 1
produzca la separación en la columna, los componentes de la mezcla pasan por el detector. Este
produce una señal eléctrica proporcional a la cantidad de materia y esa señal es enviada al
registrador que realiza un gráfico de intensidad en función del tiempo (cromatograma) del tipo:

0 1 2 3 4 5 6
Tiempo (min.)

Idealmente, se trata de picos gaussianos y cada pico corresponde a un componente de la

muestra original. El integrador calcula además el àrea correspondiente a cada pico, la cual es
proporcional a la cantidad de sustancia.

Dado que los detectores de HPLC son no destructivos, es posible recuperar los productos
que salen de él. De esta manera, dependiendo del tamaño del loop de inyección y de la columna, y
del tipo de bomba, es posible realizar además de separaciones analíticas, cromatografías
preparativas.

PARÁMETROS RELEVANTES

Los parámetros teóricos que caracterizan las separaciones cromatográficas por HPLC son
idénticos a los descriptos en cromatografía gaseosa.

En HPLC, en lugar de variar la temperatura de la columna para mejorar la resolución del

cromatograma, se cambia la composición de la fase móvil a lo largo de la separación utilizando
mezclas de entre dos y cuatro solventes.

ETAPAS DEL ANALISIS DE UNA MUESTRA

Son idénticas a las puntualizadas para cromatografía gaseosa.

En lo que respecta a la optimización de las condiciones experimentales, en este caso es

posible realizar ensayos preliminares orientativos utilizando cromatografía en capa delgada con la
misma fase fija que contiene la columna.

Por otra parte es necesario tener en cuenta que dado que se utilizan altas presiones, es
imprescindible evitar la presencia de partículas que puedan obstruir los caños y la formación de
burbujas que puedan deteriorar el relleno de las columnas y que produzcan inestabilidad en la señal
del detector.

Para evitar las obstrucciones, los solventes y las muestras a inyectar se filtran con
membranas de 0,45 a 0,22 m. Para evitar la formación de burbujas, los equipos de HPLC cuentan
con desgasadores de solvente por vacío o por burbujeo con He y, en el caso de no contar con los

HPLC 2
mismos, se deben desgasar los solventes por medio de ultrasonido o agitación bajo vacío antes de
utilizarlos como fase móvil.

PARTE EXPERIMENTAL
Objetivos

• Realizar curvas de calibración para distintos analitos.

• Cuantificar el contenido de los mismos en muestras sintéticas y comerciales.

Materiales a emplear

• Equipo para HPLC marca Thermo Separations compuesto por una bomba binaria modelo Spectra
System P2000, una válvula inyectora Reodyne provista de un loop de inyección de 10 l, un
detector de absorción UV-visible de longitud de onda variable modelo Spectra 100 y un integrador
registrador modelo Datajet.
• Columna analítica marca Alltech econosphere C18 (fase reversa unida quimicamente formada por
cadenas de hidrocarburo lineal de 18 átomos de carbono) de 150 mm de longitud por 4,6 mm de
diámetro interno.
• Buffer fosfato 0,025 M; pH=3; calidad HPLC.
• Metanol calidad HPLC.
• Patrones de aspartamo, cafeína y ácido benzoico en agua, de diferentes concentraciones.

O
CO2H CH3
CO2H H3C
O N
H N
N OCH3
H2N N
O N
O
CH3
aspartamo ácido benzoico
cafeína

• Muestra incógnita sintética que contiene los tres analitos.

• Muestras comerciales que contengan uno o varios de los analitos mencionados (¡mejor los tres!).
Ej.: gaseosas light (con aspartamo), gaseosas cola, edulcorantes a base de aspartamo
(equalsweet), etc. Todas las gaseosas tienen benzoato como conservante.
• jeringas de 1mL.
• Jeringa de 5 ml con soporte para membranas de 0,45 ó 0,22 micrones. Filtros de nylon de 0,45 ó
0,22 micrones.

Procedimiento

Cuando se desarrolla una técnica analítica por HPLC, normalmente se elige en primer lugar
una fase fija adecuada y una fase móvil con una composición tal que sea compatible con la fase fija,
que disuelva los componentes a analizar y que permita una buena separación. Luego se optimizan las
condiciones de flujo de solvente, cantidad de muestra a inyectar y, en el caso de un detector de
absorción como el que se empleará en este caso, se determinará la/s longitud/es de onda de
detección.

Para el análisis de la mezcla de aspartamo, ácido benzoico y cafeína se utilizará una columna
de fase reversa C18 y, como fase móvil, una mezcla formada por 45% de metanol y 55% de buffer
fosfato (acuoso) 0,025M de pH=3. Se inyectarán 10 l de cada solución.

 Buscar en bibliografía los valores de pKa para los tres compuestos y, en base al estado de
ionización de los mismos al pH de trabajo, predecir el orden de elución.
A continuación se presentan los espectros de absorción de soluciones ácidas (pH=2) de
aspartamo (18,7 mg/L); ácido benzoico (6,55 mg/L) y cafeína (7,83 mg/L).

HPLC 3
 Teniendo en cuenta los espectros, elegir la longitud de onda a utilizar en el análisis.

Curva de Calibración y análisis de muestras

1. Una vez elegidas las condiciones, se realizará la curva de calibración para cada analito
inyectando 1 mL de cada solución patrón mezcla de modo de saturar y limpiar el loop del
inyector. Ajustar los valores de velocidad de papel y atenuación adecuados en el integrador y
registrar los cromatogramas. Graficar luego el área de pico en función de la concentración y
verificar que se está trabajando dentro del ámbito lineal. Idealmente cada punto de la curva
de calibración se realizará por triplicado.
2. Realizar el análisis cromatográfico de la muestra sintética y de las muestras comerciales. La
muestra sintética no requiere tratamiento previo mientras que las comerciales deben
desgasarse al vacío (especialmente las de bebidas gaseosas) y filtrarse antes de ser
inyectadas. El filtrado se lleva a cabo con una jeringa de 5 ml unida a un soporte conteniendo
un filtro de nylon de 0,45 ó 0,22 micrones; se descarta el primer ml de filtrado y luego se
recoge el líquido en un recipiente limpio.
3. Si fuera necesario, diluir la muestra para obtener valores dentro del intervalo de calibración.
Para el caso de muestras sólidas, preparar soluciones de concentración adecuada y verificar
que el material se disuelva por completo.
4. Para uno de los patrones mezcla utilizados en la curva de calibración, realizar variaciones en
la longitud de onda del detector. Discutir la longitud de onda de trabajo.
5. Por último, realizar variaciones en el flujo de análisis.

Análisis de los resultados

— Una vez obtenidas las curvas de calibración, comparar la sensibilidad del método para la
determinación de cada compuesto en las condiciones de trabajo. Relacionar la misma con los
espectros de absorción y proponer mejoras en las condiciones experimentales para hacer más
eficiente el análisis.
— Informar las concentraciones de las muestras-problema con su error. Comparar con los valores
informados en literatura y con los declarados por los fabricantes de las muestras comerciales.
— Proponer un método para evaluar el límite de detección.
— Discutir la necesidad de utilizar otros métodos (estándar interno, agregado patrón) para realizar la
cuantificación.
— Calcular los parámetros cromatográficos de relevancia y realizar los gráficos de Van Deemter.

HPLC 4
Cuestionario

1.- Cual(es) es(son) los criterios de elución para cada una de las siguientes cromatografías:
a.- líquida con columna con fase estacionaria inversa
b.- iónica con columna de intercambio aniónico.

2.- Los parabenos se utilizan en la industria cosmética como conservantes. Su fórmula

general es dada en la figura 1, donde R es un grupo alquílico. Un fabricante de columnas de fase
reversa C18 recomienda las siguientes condiciones de uso: Fase móvil: 40/60 Acetonitrilo/agua,
buffer fosfato pH 7.0 con los resultados observados en la Figura 1.
i.- Cuando se intentó hacer un cambio en la fase móvil usando 40/60 Acetonitrilo/agua,
buffer pH 4.0 se obtuvo el cromatograma de la figura 2. Qué efecto tiene en la corrida una
disminución del pH.
ii.- Como reduciría el tiempo de la corrida si tiene la posibilidad de aplicar un gradiente de
solventes.

3.- El ácido etidrónico se utiliza para el tratamiento de osteoporosis. Con el fin determinar
dicho ácido en una tableta que contiene como excipiente NaCl, se utiliza un equipo de
cromatografía líquida con una columna de intercambio aniónico y un detector
conductimétrico. Utilizando como fase móvil ácido nítrico 1,5 mM se observa que el pico
correspondiente al ácido se superpone con el de Cloruro. Que cambios realizaría para
separarlos. Acido etridrónico, pK1:1,3; pK2: 2,5;pK3: 7,0 pK4: 11,0
ácido etidrónico

HPLC 5
BIBLIOGRAFÍA
General de cromatografía:

— “Análisis Instrumental”. Skoog y Leary.

— "Principios de Análisis Instrumental", Skoog, Holler, Nieman.
— “Métodos Instrumentales de Análisis”. Willard, Merritt y otros.
— “Cromatografía líquida de alta presión”. H. M. McNair y B. Esquivel. Monografía científica de la
OEA.

Determinación de cafeína, aspartamo y benzoato por HPLC:

— K. Helrich (Editor). Official Methods of the Association of Official Analytical Chemistry (AOAC
Official Methods of Analysis), 15 th. Ed., Vol. 2, pág. 752 (1990).
— M. F. Delaney, K. M. Pasko, D. M. Mauro, D. S. Gsell, P. C. Korologos, J. Morawski, L. J.
Krolikowski, F. V. Warren Jr. J. Chem Ed., 62, 618 (1985).
— J. E. DiNunzio. J. Chem Ed., 62, 446 (1985).
— A. N. Strohl. J. Chem Ed., 62, 447 (1985).
— V. L. McDevitt, A. Rodríguez, K. R. Williams. J. Chem Ed., 75, 625 (1998).

HPLC 6