ANLISIS INSTRUMENTAL I

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CROMATOGRAFA LQUIDA DE ALTA RESOLUCIN

(High Performance Liquid Chromatography, HPLC)
Cromatografa.
Segn define la IUPAC, La Cromatografa es un mtodo, usado primariamente para la separacin de los
componentes de la muestra, en la cual los componentes se distribuyen en dos fases, una de la cuales es
estacionaria, mientras que la otra se mueve. La fase estacionaria puede ser un slido, un lquido retenido
sobre un slido o un gel. La fase estacionaria puede ser extendida como una capa o distribuda como una
pelcula, etc. La fase mvil puede ser lquida o gaseosa. Sin embargo, esta definicin presenta restricciones
como, por ejemplo, ante el desarrollo en los aos 60 de la SFC, en la que la fase mvil no es ni un gas ni un
lquido, sino un fludo supercrtico.
Cromatografa Lquida de Alta Eficiencia o Alta Resolucin, HPLC.
La sigla HPLC en un comienzo se debi a High Pressure Liquid Chromatography, que hubo que cambiar a
High Performance Liquid Chromatography cuando los cromatografistas se dieron cuenta de que la presin
slo constitua una herramienta que forzaba a la fase mvil a atravesar la columna, sin constituir una variable
del sistema.
Tipos de Cromatografa Lquida
La cromatografa lquida puede desarrollarse en diferentes sistemas, en funcin de la forma fsica de la fase
estacionaria.
En la cromatografa en capa fina y en la cromatografa sobre papel dicha fase se extiende en forma de capa
(cromatografa plana), mientras en la cromatografa en columna se empaqueta en una columna, que es
un tubo relativamente delgado.
Existen muchas maneras de clasificar la cromatografa lquida en columna. Basndose en la naturaleza de
la fase estacionaria y en los procesos de separacin, pueden enumerarse los tipos:
Cromatografa Lquido Slido (LSC) o de adsorcin.
Cromatografa Lquido Lquido (LLC) o de particin.
Cromatografa de Fase Ligada (BPC).
Cromatografa de Intercambio Inico (IEC).
Cromatografa de Exclusin por Tamao (SEC).

Cromatografa Lquido Slido (LSC) o de adsorcin.

La fase estacionaria es un adsorbente y la separacin se basa en repetidas etapas de adsorcin desorcin.
Este mtodo emplea una fase estacionaria polar, slicagel, y una fase mvil no polar, por ejemplo hexano.
Cromatografa Lquido Liquido (LLC) o de particin.
Las molculas de soluto se distribuyen entre dos lquidos: uno es la fase mvil, y el otro la fase estacionaria,
que se encuentra homogneamente dispersa en un soporte slido, finamente dividido.
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Cromatografa de Fase Ligada (BPC).

La LLC tuvo varios inconvenientes, derivados del tipo de fijacin de la fase estacionaria al soporte (meramente
mecnica), por lo que, la LLC ha sido casi totalmente desplazada. En la BPC se reemplaz el tipo de unin de
la fase estacionaria a su soporte, hacindola perdurable por medio de una unin qumica covalente. As, el
90% de las separaciones cromatogrficas modernas se efecta sobre material qumicamente modificado, el
cual permite optar, segn el reactivo empleado para su fabricacin, entre materiales altamente hidrofbicos o
altamente hidroflicos, con un amplio rango de polaridad y de selectividad: octadecilo, octilo, hexilo, butilo,
etilo, ciano, diol, fenilo, amino, nitro, amonio cuaternario, etc.
Cromatografa de Intercambio Inico (IEC).
En ella se emplean rellenos en los cuales la partcula est constituda por un polmero unido a un grupo
funcional aninico o catinico (tpicamente sulfnico para el intercambio de cationes, amonio cuaternario para
el intercambio de aniones). La seleccin del tipo de grupo funcional permite escoger entre intercambiadores
dbiles y fuertes. Esta tcnica se usa casi exclusivamente con muestras inicas o ionizables.
Cromatografa de Exclusin por Tamao (SEC).
Se emplea materiales de porosidad controlada, que funcionan como un filtro o tamiz y clasifica las molculas
de la muestra segn un orden decreciente de tamao molecular (las molculas ms grandes son las primeras
en eluir, y las ms pequeas son la ltimas).
En cuanto a los dos primeros tipos, no siempre puede asegurarse cul de los dos procesos implicados
(adsorcin o reparto) desempea el papel ms importante. Por esta razn, en la prctica se definen dos o ms
tipos, segn sea la polaridad relativa de las dos fases: cromatografa en fase normal y cromatografa en
fase reversa.
En la cromatografa en fase normal, la fase estacionaria es de naturaleza fuertemente polar (por ej. Slice) y
la fase mvil es apolar (por ej. n- hexano o THF). Las muestras polares quedan retenidas en la columna
durante tiempos mayores que los materiales menos polares o apolares.
La cromatografa en fase reversa es exactamente a la inversa. La fase estacionaria es de naturaleza apolar
(hidrocarburo), mientras la fase mvil, es un lquido polar, normalmente agua o un alcohol. En este caso,
cuanto ms polar sea la muestra, mayor ser su retencin.
En la Figura 1 se representan estas dos tcnicas, al tiempo que se indica el orden de elucin de los distintos
componentes de una muestra, en funcin de sus diferentes polaridades.

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Figura 1. Ilustracin grfica de la cromatografa lquida en fase normal y en fase reversa. Los crculos
representan los tipos de compuestos presentes en la muestra y su posicin relativa en la direccin del flujo de
la fase mvil indica su orden de elucin.
Antecedentes generales.
La cromatografa gas lquido, G.C., que surgi en 1952 como continuacin del trabajo sobre cromatografa
lquido-lquido, L.C., presentaba la ventaja de la velocidad y la automatizacin. En la siguiente dcada su
desarrollo fue espectacular, en especial desde que algunas muestras analizadas previamente por L.C. se
pudieron analizar tambin por esta tcnica.
Sin embargo, muchas muestras de volatilidad insuficiente o trmicamente inestables no podan analizarse por
G.C. Por tanto, en los aos 60 se empez a examinar la posibilidad de mejorar la tcnica de L.C.
Se pudo establecer la forma de superar la lentitud de la difusin de la fase lquida, comparada con la fase
gaseosa. Para ello fue preciso utilizar partculas de mucho menor tamao, lo que requiri el uso de mayores
presiones de entrada, y de nuevos detectores capaces de operar a bajo caudal y de detectar pequeas
cantidades de sustancias.
La moderna L.C. comparada con la clsica, se caracteriza por:
columnas reutilizables de pequeo dimetro (2 5 mm)
rellenos de columna de partculas muy pequeas (5-50 m) y desarrollo de nuevos materiales para
usarlos como fases estacionarias.
Presiones de entrada relativamente altas y flujo controlado de la fase mvil.
Introduccin precisa de la muestra, sin necesidad de grandes cantidades.
Detectores continuos especiales, capaces de operar a caudales muy bajos y de detectar cantidades muy
pequeas.
Instrumentos normalizados y automatizados.
Anlisis rpidos
Alta resolucin.

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Diagrama Bsico de un sistema de HPLC

La Figura 2 representa el esquema funcional de un equipo general de L.C.
DEPSITO DE FASE MVIL
BOMBA
FILTRO
MANMETRO
INTRODUCCIN MUESTRA
COLUMNA
DETECTOR

PROCESADOR DE DATOS

COLECTOR FRACCIONES

Figura 2. Esquema funcional de un equipo moderno de HPLC.

Los componentes bsicos del equipo son:
Depsito de la fase mvil
Una bomba para propulsar la fase mvil
Un mecanismo para la introduccin de la muestra
Una columna que contenga la fase estacionaria
Un detector para determinar la separacin que tiene lugar y proporcionar datos que permitan
una evaluacin cualitativa y cuantitativa de los resultados.
Los equipos de HPLC pueden clasificarse en integrados y modulares.
Depsito de la fase mvil
Es el recipiente que contiene la fase mvil.
Se ubica algunos centmetros sobre el nivel de la bomba para que la fuerza de gravedad dirija el solvente
hacia sta, manteniendo llenas las conexiones.
Se utiliza como depsito cualquier frasco de laboratorio de buena calidad (de vidrio o polmero resistente), con
una tapa adecuada para prevenir el ingreso de partculas al sistema.
Los sistemas que necesitan procesos de desgasificacin continua estn provistos de una tapa especialmente
diseada, en la cual se puede encontrar un orificio para la entrada del gas inerte de desgasificacin, otro para
la salida del solvente y una vlvula que permite una presin positiva del gas sobre el solvente venteando el
exceso.
La fase mvil en HPLC cumple un rol fundamental, ya que por s misma puede modificar completamente la
selectividad de las separaciones en fase normal y es a la vez, el verdadero motor de las separaciones en fase
reversa. De hecho, esta es la principal diferencia que existe entre la GC y la HPLC, porque en G.C. la fase
mvil es simplemente un portador de los solutos y su eleccin depende solamente del detector a utilizar. La
nica herramienta para modificar la selectividad de una separacin es la columna y, por ello, suele utilizarse

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una columna para cada tipo de separacin. En HPLC es posible lograr un nmero muy grande de diferentes
separaciones con una columna, tan slo variando la composicin de la fase mvil.
Eleccin del Solvente
Caractersticas:

Poder solubilizante de las muestras

Baja reactividad
Ser compatible con el detector utilizado.
Adecuado punto de ebullicin.
Tener baja viscosidad para reducir las cadas de presin.
Seguridad
Pureza y Estabilidad. En la actualidad se cuenta con productos de calidad de pureza cromatogrfica.
Transparencia ptica (cuando se usan detectores UV)
Disponible comercialmente
Precio

Poder solubilizante de las muestras: Para inyectar la muestra es conveniente que el solvente de disolucin
sea la misma fase mvil. A veces no es posible, entonces debe tenerse en cuenta la miscibilidad entre el
solvente de disolucin y la fase mvil.
Baja reactividad: Los solventes con un elevado grado de reactividad no se utilizan en HPLC, ya que pueden
reaccionar con la muestra, la fase estacionaria o los componentes del equipo cromatogrfico.
Compatibilidad con el detector utilizado: El detector ms usado es el espectrofotomtrico, por lo que, es
habitual elegir un solvente transparente a la longitud de onda de trabajo. La transparencia se evala por la
de corte, , es decir, la longitud de onda a la cual la absorbancia del solvente, en una cubeta de 10 mm de
paso ptico, es igual a 1 unidad de absorbancia empleando aire como referencia. El metanol (c = 205 nm) y
el acetonitrilo (c = 190 nm), son los solventes ms empleados en HPLC. La presencia de impurezas puede
aumentar el valor de la c; por ej., el hexano p.a. normalmente est contaminado con trazas de benceno, y no
puede usarse en HPLC a menores a 250 nm.
Punto de ebullicin: Se prefieren los solventes de p.e. intermedio. Si el solvente tiene un p.e. bajo su
volatilidad es alta y la composicin de la fase mvil puede variar. Solventes con alto p.e. se correlacionan, por
lo general, con alta viscosidad, que es sinnimo de alta presin (menor vida media de los componentes del
instrumento) y baja eficiencia.
Baja viscosidad: La viscosidad de los solventes est estrechamente relacionada con la presin del sistema.
Con solventes viscosos, la eficiencia de la separacin es menos debido al que el coeficiente de difusin de la
muestra se reduce, y se dificulta la transferencia de masa del soluto entre la fase mvil y la fase estacionaria.
Seguridad: Debe evitarse el empleo de solventes que por sus caractersticas (inflamabilidad y toxicidad),
representen riesgo para el operador. No se recomiendan por su alta toxicidad, sulfuro de carbono, benceno o
tetracloruro de carbono.

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SOLVENTE
Agua
Acetona
Acetonitrilo
Ciclohexano
Ciclopentano
Cloroformo
Cloruro de metileno
Dimetilsulfxido
Dioxano
Etanol
n-heptano
n-hexano
Isooctano
Isopropanol
Metanol
n-pentano
n-propanol
Tetrahidrofurano
Tolueno

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CORTE UV
nm
330
190
200
200
245
233
268
215
210
195
190
197
205
205
195
240
212
285

P.E.
C
100
56
82
81
49
61
40
189
101
78
98
69
99
82
65
36
97
66
110

VISCOSIDAD
cps a 25 C
0.89
0.30
0.34
0.90
0.42
0.53
0.41
2.00
1.20
1.08
0.40
0.30
0.47
1.90
0,54
0.22
1.90
0.46
0.55

En la tabla anterior se presentan las propiedades de los solventes habituales de HPLC.

Pureza: Las impurezas pueden inducir modificaciones de la selectividad de la fase mvil y adems contribuir
a una seal de base importante en el detector.
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Propiedades qumicas: La separacin se produce por un balance de afinidades entre la muestra, la fase
mvil y la fase estacionaria. Las propiedades qumicas de la fase mvil son las que establecen el tipo y fuerza
de interaccin entre el solvente y la muestra, y por tanto, son determinantes de la separacin. En la tabla
siguiente se muestran propiedades importantes de algunos solventes:
ndice de polaridad: es la resultante de todas las propiedades qumicas e intenta medir
cuantitativamente la fuerza de interaccin de los solventes frente a solutos polares.
Fuerzas dispersivas: indican la polarizabilidad de una molcula y aumentan con el nmero de electrones
de la misma.
Capacidad aceptora o donadora de protones: es una medida de la capacidad e las molculas a
intercambiar protones.
Momento dipolar: se refiere a la capacidad de una molcula para formar dipolos permanentes y est
estrechamente relacionado con la constante dielctrica del solvente.

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Filtracin y Desgasificacin de solventes.

Los solventes para HPLC, todos filtrados cuidadosamente en la fbrica, pueden:
Acumular partculas en suspensin que pueden ser perjudiciales a los componentes del sistema HPLC.
Estas partculas en suspensin pueden venir de varias fuentes, incluso de la exposicin al polvo en el aire
durante el traspaso del solvente al depsito para solvente, la exposicin a partculas del aire durante el
almacenamiento del solvente en el depsito del solvente, la degradacin lenta del recipiente solvente, o
de condensacin y polimerizacin del solvente.
Las partculas pueden ocasionar costosos daos a la bomba HPLC, y en general causar desgaste del
sistema de HPLC.
Los fabricantes de los instrumentos tienen en cuenta este problema y recomiendan que se filtre y desgasifique
los solventes HPLC antes de usarlos.
En el instante que se abre una nueva botella de solvente para HPLC se expone el interior del solvente a la
atmsfera y empieza a acumular gases disueltos que se encuentran en la atmsfera:
El Oxgeno Disuelto que constituye el 21% de la atmsfera puede producir mayor interferencia en los
detectores de fluorescencia y electroqumicos.
El Nitrgeno Disuelto es el otro componente de la atmsfera que puede producir burbujas en la columna
de HPLC y cuando el solvente entra al detector produce picos falsos y desviaciones de la lnea base. El
Dixido de Carbono disuelto algunas veces puede ser la causa de los cambios de pH en el sistema de
solvente.
Filtracin de solventes en HPLC
La filtracin de las fases mviles se considera parte de un tratamiento preventivo para cuidar el adecuado
funcionamiento del equipo de HPLC.
La filtracin se efecta por medio de membranas de 0,45 0,22 m de porosidad en equipos de filtracin
adecuados y es til para eliminar tanto las partculas como las bacterias. La seleccin de la membrana, como
se desprende de la siguiente tabla, depende de su compatibilidad con los solventes.
Las soluciones a inyectar tambin deben filtrarse, idealmente a travs de membranas semejantes a las
empleadas para la fase mvil.

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Mtodos de Desgasificacin de Solventes en HPLC

Existen cuatro mtodos comunes usados para desgasificar solventes en HPLC previos a su uso:

Reflujo
Burbujear Helio
Ultrasonido
Vaco

La cantidad de gas disuelto en un lquido depende de tres factores: temperatura, presin y afinidad
La temperatura puede favorecer o no la disolucin del gas en el lquido. Si el proceso de disolucn es
exotrmico, el aumento de temperatura disminuye la solubilidad. La solubilidad del nitrgeno en agua
disminuye con el aumento de temperatura, pero aumenta en el benceno.
La solubilidad de un gas en un lquido es directamente proporcional a la presin parcial que ese gas ejerce
sobre el lquido. Por ello si por algn mtodo efectivo se reduce la presin, la cantidad de gas en solucin
disminuir.
La cantidad de gas disuelto depende de su afinidad mutua. Si tanto en el gas como en el lquido las
fuerzas predominantes son las de Van der Waals, la solubilidad ser mayor que en aquellos lquidos en
los que predomine otro tipo de fuerzas, como puente hidrgeno, dipolo-dipolo, etc. Por ello, que gases
como el oxgeno o nitrgeno, son ms solubles en solventes como hexano, que en el agua.
Reflujo. Consiste en el calentamiento o la ebullicin a reflujo de la fase mvil con la ayuda de agitacin
durante unos 15 minutos. As se eliminan prcticamente todos los gases disueltos. Se debe aplicar en
forma continua para prevenir la redisolucin de los gases atmosfricos. No puede emplearse en el caso de
mezclas de solventes.
Burbujeo de un gas inerte. Se puede realizar en forma continua o por cortos perodos de tiempo. Se
realiza mediante una pieza de acero inoxidable sinterizado (buzo) con dimetro de poro de 2 a 10 m, y
a un caudal de unos 80-100 mL/min. De esta forma, se logra un efectivo desplazamiento de los gases.
Alcanzado el equilibrio, se reduce el caudal.
Como el He es caro, es conveniente el uso de depsitos de solventes provistos de tapas con vlvulas que
permitan una cierta presin sobre la fase mvil para evitar la redisolucin de los gases y que permita
trabajar a un caudal constante de unos 50 mL/min.
Ultrasonido. El ultrasonido es una onda electromagntica producida por la propagacin de un choque
mecnico. Necesita un soporte material, no se propaga en el vaco y se caracteriza por la frecuencia, en
los baos ultrasnicos de laboratorio se usan equipos en el rango entre 20 y 50 KHz. La onda se propaga
a 20000 Hz dando lugar a la cavitacin.
Esto produce la limpieza de materiales en zonas de difcil acceso, la disolucin de slidos. Aplicado a la
desgasificacin de un lquido, no reduce la solubilidad de un gas disuelto y no puede expulsarlo sino
cuando la solucin est sobresaturada.
Vaco. Es el mtodo ms empleado. Se aplica junto al proceso de filtracin. Se debe desgasificar a diario
fases mviles que estn preparadas con anterioridad. Si se usa bomba de vaco, debe ser a prueba de
explosiones (puede aspirar solventes voltiles de la fase mvil).

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Solventes y aditivos de fase reversa.

Las fases mviles de fase reversa estn formadas por mezclas de solventes polares, en general agua, y un
modificador orgnico (MeOH, acetonitrilo, THF) con o sin el agregado de aditivos (sales inorgnicas o
reactivos de apareamiento inico).
Dioxano y THF se mezclan tanto con agua como con solventes no polares (cloroformo, hexano) y pueden
considerarse tanto solventes de fase normal como de fase reversa.
Agua. Es el ms usado en HPLC. Se puede adquirir de calidad cromatogrfica, o bien puede ser
purificada por el mismo usuario. El agua destilada y desionizada, pueden encontrar limitaciones en HPLC
por la presencia de sustancias orgnicas (ftalatos, cloraminas, etc.) que no se eliminan por el tratamiento
aplicado. Las columnas de fase reversa, muy hidrofbicas, tienen afinidad por compuestos de baja
polaridad.

Metanol. Es el modificador orgnico ms utilizado en fase reversa, en mezclas con agua o buffers. Por su
mayor poder disolvente de sales y reactivos de apareamiento inico se lo prefiere frente al acetonitrilo
cuando es necesario utilizar altas concentraciones salinas. Es poco txico y el ms barato de grado HPLC.
Genera presiones algo mayores y tiene mayor afinidad por el oxgeno que el acetonitrilo.
Acetonitrilo. Tiene una selectividad muy diferente a la del MeOH y es una primera alternativa cuando se
busca cambiar la selectividad. El solvente grado HPLC se comercializa puro sin conservadores. Su baja c
(190 nm) lo hace el adecuado cuando hay que trabajar a cortas. Es caro.
Tetrahidrofurano. Tiende a formar perxidos, por lo que, se vende con antioxidantes (BHT,
hidroquinona), los que absorben en el UV.
Dioxano. Tiene selectividad similar al THF, pero su alta viscosidad hace que no se emplee en HPLC,
salvo como aditivo en pequeas proporciones.
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Aditivos.
Numerosos mtodos cromatogrficos requieren el uso de sales en la fase mvil, para el control y regulacin
del pH o de la fuerza inica. Deben tener un alto grado de pureza.
Los fosfatos son muy usados en fase reversa como sales de sodio o potasio por su baja absorcin UV
an a longitudes de onda corta.
Los buffers de acetato o citrato se usan menos, el primero porque presenta una alta absorcin UV y, el
segundo, porque se compleja con la slice de las columnas, reduciendo su vida til.
Si se desea recuperar el analito separado por L.C. se recomienda el uso de buffers de trifluoroacetato,
ya que es muy voltil y se elimina por aplicacin de calor o vaco.
Los modificadores orgnicos (metanol, acetonitrilo, etc.) actan como inhibidores de crecimiento
bacteriano.
Otros aditivos corrientes son los reactivos de apareamiento inico, utilizados para el anlisis de
sustancias orgnicas inicas o ionizables.
Bsicamente, existen dos tipos de reactivos de apareamiento inico:
las sales de tetraalquilamonio empleadas para el anlisis de solutos cidos, y
los alquilsulfonatos, para los solutos bsicos.
Ambos se emplean en baja concentracin, entre 1 y 20 mM.
Se debe tener presente que al usar estos reactivos, las columnas quedan marcadas, ya que no se logra
eliminarlos completamene mediante el proceso de lavado, quedando modificada la superficie de las columnas
y, por tanto, su selectividad.
Solventes de fase normal
En cromatografa de fase normal, donde se emplean solventes no polares, el problema ms frecuente es
la desactivacin de la columna de slice o almina por adsorcin de agua.
El agua adsorbida es responsable de los mecanismos mixtos de retencin (particin y adsorcin) y
produce cambios profundos en la retencin y selectividad.
Los solventes no polares que se usan en NP suelen tener trazas de agua. Debido a la baja solubilidad,
estas cantidades son muy pequeas (0,09 % en cloroformo, 3,25 % en acetato de etilo), sin embargo, el
agua resulta ser muy afn a la columna y comienza a concentrarse en la superficie del material de relleno.
El proceso de adsorcin de agua es reversible. Para eliminar el agua de los solventes, se puede utilizar un
desecante como el sulfato de sodio anhidro.

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Eteres
Los teres etlico, proplico e isopropilico tienen una alta presin de vapor, y son altamente inflamables.
Son susceptibles de formar perxidos, especialmente cuando son anhidros. Por ello, su empleo est muy
limitado en HPLC, aunque la selectividad que aportan impide sean descartados como solventes de
elucin.
Una alternativa menos riesgosa consiste en emplear metil-terbutilter.
Hidrocarburos alifticos
Son solventes muy transparentes a bajas longitudes de onda y poco viscosos, por lo que, son muy
apropiados para trabajar en HPLC.
Sin embargo, suelen contener trazas de olefinas o benceno que dificultan su empleo por debajo de los 260
nm.
Hidrocarburos halogenados
Todos los compuestos halogenados pueden contener trazas de HCl o HBr, muy reactivos frente al acero
inoxidable. Estos contaminantes pueden eliminarse por pasaje a travs de una columna de almina.
Las mezclas de hidrocarburos halogenados con teres y/o acetona son particularmente perjudiciales. El
CCl4 y el HCCl3, en mezclas con THF, acetona, dietilter y alcohol isoproplico corroen el acero inoxidable,
mientras que la corrosin no tiene lugar cuando se utilizan estos solventes en forma individual.
El cloruro de metileno es uno de los hidrocarburos halogenados ms estables. Su degradacin trmica en
aire seco se produce a temperaturas mayores a los 120 C.
El HCCl3 se puede descomponer lentamente a la luz, en presencia o no de aire, formando fosgeno y HCl.
Para evitar esta descomposicin se comercializa con el agregado de etanol como estabilizante en
concentraciones de 0,5 a 1,0 %. La presencia de etanol modifica la polaridad y selectividad de la fase
mvil, por lo que, los cromatogramas obtenidos utilizando HCCl 3 con o sin estabilizador puede diferir.
El CCl4 prcticamente no se utiliza en HPLC, dado que es muy sensible a la ruptura oxidativa por
exposicin al aire, humedad o luz y, adems es un solvente muy txico.
Preparacin de las fases mviles.
El trabajar con solventes de alto grado de pureza, implica tambin el empleo de materiales volumtricos
muy limpios.
Se debe tener en cuenta la posible contraccin de volumen, que se produce al mezclar solventes muy
polares. La alteracin en la composicin de la fase mvil debida a esto puede modificar los tiempos de
retencin de los analitos y, en casos crticos, superponer picos que en condiciones apropiadas sern
separados.
La fase mvil luego de preparada, debe ser filtrada y desgasificada.
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Bombas
Los requisitos o aspectos ms importantes que debe reunir una bomba o sistema de bombeo en HPLC son
rigurosos:

Debe producir presiones estables hasta 6000 psi.

Mantener el flujo libre de pulsaciones
Generar intervalos de caudales de flujo (0,1 a 10 ml/min)
Control y reproducibilidad del flujo de solvente.
Componentes de la bomba resistentes a la corrosin (acero inoxidable o tefln)

Las bombas que se usan en HPLC se pueden clasificar segn su funcionamiento y diseo en:
Reciprocantes o recprocas.
De desplazamiento continuo
Neumticas
Bombas recprocas
Se utilizan en aproximadamente el 90 % de los sistemas de HPLC. Existen varios tipos: de un solo pistn, de
dos pistones, de tres pistones y bomba a pistn y diafragma.
Consisten generalmente en una pequea cmara en la que el disolvente es impelido por el movimiento de
vaivn de un pistn accionado por un motor.
Normalmente la vlvula de entrada se ubica en la parte inferior y la de salida en la parte superior del
cabezal de la bomba. Este sistema permite que las burbujas que accidentalmente entren al sistema sean
fcilmente eliminadas.

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El volumen de la cmara del pistn es pequeo. Este volumen permite cambiar fcilmente la fase mvil, y
disminuye el tiempo de demora para hacer efectivo un cambio de la composicin de solvente durante un
gradiente de elucin.
La unin entre el cabezal de la bomba y el pistn se efecta por medio de una junta de material inerte
(grafito o tefln) llamada sello, que facilita el desplazamiento del pistn y evita la prdida de fase mvil.
Las bombas recprocas tienen la desventaja de que producen un flujo con pulsaciones, que se deben
amortiguar dado que su presencia se manifiesta como ruido en la lnea base en el cromatograma.
Entre las ventajas de las bombas recprocas se pueden citar su pequeo volumen interno (35 a 400 L),
sus altas presiones de salida (por encima de los 10.000 psi), su fcil adaptacin a la elucin con gradiente,
y sus caudales constantes, que son prcticamente independientes de la contrapresin de la columna y de
la viscosidad del disolvente.

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La bomba de un solo pistn es la ms sencilla:

Impulsa a la fase mvil en ciclos alternados dados por los ciclos de llenado y vaciado de la cmara de
bombeo.
En uno de los ciclos el pistn entrega el solvente contenido en la cmara y en el ciclo complementario
cierra su comunicacin con la columna y toma solvente del depsito.
Es evidente que cuando la bomba llena la cmara del pistn, el caudal se discontina. Este proceso se
visualiza como un pulso, no deseable, ya que durante este ciclo no circula fase mvil.
Se reduce este inconveniente con el empleo de atenuadores de pulso, consistentes en una cmara
flexible, que se llena y entrega el solvente acumulado cuando no recibe solvente del pistn.

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Bombas de desplazamiento continuo o bomba jeringa.

Consisten en unas grandes cmaras como una jeringa, equipadas con un mbolo que se activa por un
mecanismo de tornillo accionado mediante un motor.
Producen un flujo que tiende a ser independiente de la viscosidad y de la contrapresin y, adems, el flujo
que resulta est libre de pulsaciones, ya que la cmara no necesita ser recargada.
Las desventajas incluyen una capacidad de disolvente limitada (alrededor de 250 mL) e incomodidad para
el cambio de disolventes.

Bombas neumticas.
En las bombas neumticas ms simples, la fase mvil se encuentra en un contenedor plegable colocado
en un recipiente que puede presurizarse mediante gas comprimido.
Las bombas de este tipo son baratas y no provocan pulsaciones, aunque tienen una limitada capacidad y
presin de salida.
Adems el caudal depende de la viscosidad del disolvente y de la contrapresin de la columna.
No son utilizables en la elucin con gradiente y estn limitadas a presiones menores de unos 2000 psi.

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Sistemas de Inyeccin de muestra o Inyectores.

Estos sistemas han variado durante la historia del sistema de HPLC, en un principio de utilizaba la inyeccin
de la muestra con jeringas de alta presin, las que ya estn de desuso. Hoy se utiliza el sistema de Vlvulas
inyectoras.
El inyector es el dispositivo que permite introducir la muestra sin interrumpir el caudal del solvente a travs del
sistema. El inyector debe reunir una serie de caractersticas importantes, entre ellas:
Debe ser fcil de operar.
Debe ser inerte al ataque qumico y capaz de soportar altas presiones.
Debe ser preciso en cuanto a la cantidad de muestra introducida en el sistema.
No debe provocar diluciones importantes de la solucin inyectada.
En casos especiales puede requerirse que opere a altas temperaturas o que sea biocompatible, para lo
cual puede ser necesario que algunos de sus componentes sean de titanio o PTFE.
Ya han sido descartados los inyectores de septum. Sus inconvenientes derivaban de:
el desprendimiento del material del septum que obstruan la columna
la contrapresin que deba vencerse al inyectar la muestra, lo que obligaba con caudales altos a su
interrupcin momentnea.
Vlvulas
Hoy, los inyectores de HPLC son vlvulas que orientan el caudal hacia la columna, pasando o no segn
su posicin, a travs de un loop en el cual se introduce la solucin a inyectar. Pueden accionarse manual
o automticamente.
Estn constituidas por un cuerpo fijo, un rotor con un sello que gira y un loop de muestra externo que
contiene la muestra.
El loop es intercambiable, de modo que la cantidad de muestra inyectada puede escogerse entre una
serie de medidas estndar (en los inyectores convencionales, entre 5 y 2000 L)

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En la Figura se muestra las diferentes posiciones de una vlvula de 6 vas.

Para llenar el loop se gira el rotor hacia la posicin de carga, obligando a la fase mvil a pasar
directamente a la columna.
En este paso, la va de inyeccin queda abierta y a presin atmosfrica.
Se llena el loop en forma completa o parcial por medio de una jeringa.
Se vuelve a girar la vlvula, obligando a la fase mvil a llegar a la columna a travs del loop que contiene
la solucin muestra, a la que arrastra hacia la columna.
Inyectores automticos.
Las vlvulas de inyeccin de 6 vas se pueden accionar elctrica o neumticamente y se utilizan en la
construccin de inyectores automticos.
La precisin obtenida es en general superior a la de los mtodos manuales.
Deben contener adems de la vlvula de inyeccin y del mecanismo que permite su llenado, un
dispositivo para colocar las muestras a inyectar (un carrusel que aloja viales)

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Las vlvulas se accionan con motores elctricos o por medios neumticos ya sea empleando aire
comprimido, nitrgeno o helio.
Columnas
Se construyen generalmente con tubos de acero inoxidable, de dimetro interno uniforme. Tambin se
encuentran tubos de vidrio de paredes resistentes. stas se usan a presiones menores de 600 psi.
Columnas analticas.
La mayora tiene una longitud entre 10 y 30 cm.
Comnmente, son rectas y se pueden alargar, acoplando dos ms columnas.
El dimetro interno es a menudo de 4 a 10 mm.
Los tamaos de las partculas de los rellenos ms usados son 3,5 y 10 m.
La ms usada es la de 25 cm de longitud y 4,6 mm de dimetro interno, y empaquetada con partculas de
5 m. Estas columnas tienen de 40.000 a 60.000 platos/metro.
Las columnas de alta resolucin tienen dimetros internos entre 1 y 4,6 mm y se rellenan con partculas
de 3 o 5 m. Su longitud es de 3 a 7,5 cm. Tienen hasta 100.000 platos/metro y presentan como ventaja
la rapidez y mnimo consumo de disolvente.
Precolumnas.
Para aumentar la vida de la columna analtica, se coloca delante una precolumna que elimina la materia
en suspensin y los contaminantes de los disolventes.
En cromatografa lquido-lquido, la precolumna sirve para saturar la fase mvil con la fase estacionaria y
as minimizar la prdida de sta en la columna analtica.
La composicin del relleno de la precolumna debe ser semejante al de la columna analtica; el tamao de
partcula es comnmente mayor para minimizar la cada de presin.
Tipos de relleno de la columna.
Se han utilizado dos tipos de rellenos, pelicular y de partcula porosa.
El pelicular consiste en bolas de vidrio o de polmero, no porosas y esfricas con unos dimetros
caractersticos de 30 a 40 m.
En su superficie se deposita una capa delgada y porosa de slice, almina o de resina de intercambio
inico.
Para algunas aplicaciones se aplica un recubrimiento adicional, constituido por una fase estacionaria
lquida que se mantiene fija por adsorcin.

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Las bolas tambin se pueden tratar qumicamente para obtener una capa superficial orgnica.
Los rellenos peliculares se utilizan ampliamente en las precolumnas y no en las columnas analticas.
Los de partcula porosa estn formados por micropartculas porosas con dimetros entre 3 y 10 m y
con la menor dispersin posible para un tamao determinado.
Las partculas son de slice, almina o resinas de intercambio inico.
Las de slice se sintetizan aglomerando partculas de slice de tamaos inferiores al micrn en unas
condiciones tales que se forman partculas mayores con dimetros muy uniformes.
Termostatos.
Muchas aplicaciones no necesitan un control estricto de la temperatura, y las columnas trabajan a
temperatura ambiente.
Muchas veces si se controla la temperatura de la columna en unas pocas dcimas de grado centgrado,
se obtienen mejores cromatogramas.
Actualmente, los instrumentos llevan hornos para las columnas que controlan la temperatura de la
columna a las dcimas de grado, desde la temperatura ambiente hasta 150 C.
Las columnas tambin se pueden colocar en camisas con agua que provenga de un bao a temperatura
constante, para controlar con precisin la temperatura.
Detectores.
Permite ver y ubicar en tiempo y espacio la posicin de cada componente de una muestra a la salida de la
columna.
Requisitos:
Amplio rango dinmico de respuesta.
Respuesta lineal.
No contribuir al ensanchamiento de banda extracolumnar.
Responder a todos los solutos.
Sensibilidad apropiada.
No afectarse por cambios de temperatura.
Una buena relacin seal/ruido.
No destruir la muestra.
Constante de tiempo baja.
Tipos de detectores.
Se clasifican en generales y selectivos.

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Detectores generales.
Miden el cambio de alguna propiedad fsica de la fase mvil que contiene el analito en comparacin con la
fase mvil pura. Ejemplos:
detector de ndice de refraccin
detector de conductividad.
Detectores selectivos.
Son aquellos sensibles a alguna propiedad propia del soluto. Ejemplos:
el detector UV, que producir una seal proporcional a la absorbancia del soluto a una longitud de onda
dada,
el detector de fluorescencia, empleado para la deteccin de solutos con fluorescencia natural o conferida
por reaccin con un reactivo fluorognico,
el electroqumico empleado para la deteccin de analitos que pueden oxidarse o reducirse ante la
aplicacin de un potencial.

Detectores Generales
Detector de Indice de Refraccin.
Mide la diferencia de indice de refraccin entre el solvente puro y el solvente que contiene la muestra.
Es un detector universal (ya que es muy improbable que el ndice de refraccin del soluto sea similar al
del solvente).
No destructivo.
Sin embargo, es muy poco sensible, lo cual limita su campo de aplicacin y es muy afectado por cambios
de temperatura.
No puede utilizarse con programacin de solventes, porque el cambio de la composicin de la fase mvil
se acompaa del cambio de su ndice de refraccin. Como consecuencia, no puede estabillizarse la lnea
base.
Existen varios diseos de estos detectores, pero solamente se usan ahora dos tipos:
Tipo Fresnel
Tipo Deflexin
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Detector de Indice de Refraccin.

Tipo Fresnel
Es un detector diferencial que utiliza dos celdas, una de medicin que es atravesada por el efluente de la
columna, y una celda de referencia por la cual fluye la fase mvil.
Opera segn la ley de Fresnel, que establece que la cantidad de luz reflejada en una interfase
lquido/vidrio vara con el ngulo de incidencia y con el ndice de refraccin del lquido.
Posee una celda de medicin pequea, del orden de los 3 L que est constituda por un prisma, una
base de acero pulido y un sello de tefln entre ambos.
Para cubrir todo el rango de ndice de refraccin ( = 1,33 a 1,63) se utilizan dos prismas, el primero se
utiliza con solventes de fase reversa y el segundo con solventes de fase normal.
Detector de Indice de Refraccin.
Tipo Deflexin
Es un detector diferencial que, a diferencia del Fresnel, slo usa un prisma para todo el rango de ndices
de refraccin, pero empleando celdas de mayor tamao, del orden de los 8 a 10 L.
El disolvente en su camino hacia la columna pasa a travs de una mitad de la cubeta y el efluente de la
columna pasa por la otra mitad .
Los dos compartimientos estn separados por una placa de vidrio montada a un ngulo tal que si las dos
disoluciones difieren en el ndice de refraccin se produce una desviacin del haz incidente.
El desplazamiento del haz con respecto a la superficie fotosensible del detector provoca una variacin de
la seal de salida, la que una vez amplificada y registrada, proporciona el cromatograma.
La figura siguiente muestra un diseo tpico de estos detectores.

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Detectores Selectivos
Detector UV
Es el detector ms utilizado en HPLC.
Posee buena sensibilidad y rango lineal.
Permite detectar analitos en el orden de los nanogramos.
No es destructivo y puede emplearse con gradientes de solventes, con la nica limitacin de que stos
sean transparentes en la longitud de onda de trabajo.
Para la medida de la absorbancia de los efluentes de la columna cromatogrfica se usa una cubeta de
flujo en forma de Z.
Para minimizar el ensanchamiento de banda extracolumna, el volumen de estas cubetas debe ser lo
menor posible,de modo que se limitan a volmenes de 1 a 10 L.y las longitudes de la cubeta de 2 a 10
mm.
El uso de estas cubetas est restringido a presiones no mayores de 600 psi. A menudo, es necesario un
dispositivo para reducir la presin.
Es un detector muy poco sensible a los cambios de caudal y de temperatura.
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Opera en el rango 190 a 350 nm, y en algunos equipos se puede extender a la zona visible del espectro
(350 a 700 nm) recibiendo as el nombre de detector UV/Visible.
La concentracin del analito en la muestra se determina por aplicacin de la ley de Beer.
Hay bsicamente tres tipos:
Detector de Longitud de Onda Fija
Detector de Longitud de Onda Variable
Detector de Arreglo de Diodos

Detector de Longitud de Onda Fija o fotomtrico

Opera a longitudes de onda prefijadas, determinadas por las lneas de emisin de su lmpara,
habitualmente de mercurio de baja presin.
Como longitudes de onda de trabajo se utilizan las bandas de emisin de la lmpara de mercurio,
especialmente la lnea intensa 254 nm. Para eliminar lneas de otras longitudes de onda se utilizan filtros
de interferencia.
Suelen emplearse filtros que permiten trabajar a 313, 334, 365 nm. El empleo de filtros de xido de fsforo
permite trabajar incluso a 280 nm.
La lmpara de mercurio no emite a 280 nm, pero estos filtros al ser irradiados con la lmpara de mercurio,
emiten a esa longitud de onda.
El cambio de lmpara permite incluso trabajar a otras longitudes de onda, por ejemplo, a 214 nm con una
lmpara de Zn, a 229 nm con una lmpara de Cd.

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Detector de onda variable o espectrofotomtrico

Es un espectrofotmetro, en el que se reemplaza el compartimiento de cubetas por una celda de flujo.
Es ms verstil que el de longitud de onda fija, ya que al tener red de difraccin permite seleccionar
libremente la longitud de onda de trabajo. Se puede as escoger la longitud de onda de mxima absorcin
del analito para aumentar la sensibilidad de medicin.
Emplea una lmpara de emisin continua, de Deuterio o de Xenn.
Algunos instrumentos abarcan radiacin UV y visible

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Detector de Arreglo de Diodos

Emplea un sistema ptico invertido: la celda se ilumina con luz blanca, es decir, no monocromada.
La luz emergente de la celda llega a la red de difraccin y es dispersada hacia el elemento fotosensible,
que emplea un conjunto de fotoceldas o fotodiodos montados en un chip de silicio. As, se consigue medir
no slo la luz transmitida a una longitud de onda, sino todo el espectro de absorcin del efluente en tiempo
real.
Este tipo de detector permite recoger los datos de un espectro completo en aproximadamente 1 seg. As,
los datos espectrales para cada pico cromatogrfico se pueden recoger y almacenar a medida que van
saliendo de la columna.
Una de las formas de presentacin de los datos espectrales, que resulta til para la identificacin de las
especies y para elegir las condiciones de determinacin cuantitativa, consiste en un grfico tridimensional.

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Detector de Fluorescencia.
Este detector solamente puede detectar compuestos que tengan fluorescencia nativa o inducida por
derivatizacin con un reactivo fluorognico.
Su alta sensibilidad y selectividad lo hace adecuado para el anlisis de trazas.
La selectividad se debe a dos factores: 1) existen pocas sustancias de fluorescencia nativa y las
reacciones de derivatizacin implican la presencia de un grupo funcional derivatizable en la molcula del
analito y 2) se usan 2 , una de excitacin y otra de emisin.

La luz emitida por la lmpara de Xe va al monocromador de excitacin G 1 por medio de un espejo cncavo
M1, a travs de la ranura de entrada S1.
El haz monocromado sale por la ranura S2, se focaliza en un espejo esfrico M2 e incide en un separador
de onda BS.
De aqu la casi totalidad del haz luminoso entra en la celda de medida y un 7% incide en un
fotomultiplicador PM1 para el control de la intensidad.
La emisin del haz luminoso que sale de la celda pasa al monocromador de emisin, formado por la
ranura de salida S3 y un espejo plano M3, una red de difraccin cncava G2 y una ranura de salida S4
siendo detectado por el fotomultiplicador PM2 que va a generar la seal de salida.
La lmpara de Xe es la fuente de emisin ms difundida por producir un espectro continuo en el rango 260
a 660 nm y de muy alta intensidad.

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Detectores Electroqumicos.
Se basan en cuatro mtodos electroanalticos que incluyen la amperometra, la voltamperometra, la
coulombimetra y la conductimetra.
Muy sensible, unas 1000 veces ms que el UV, y altamente selectivo (no slo detecta compuestos
capaces de ser oxidados y reducidos, sino que puede reducirse el nmero de compuestos detectados por
eleccin cuidadosa del potencial aplicado).
La deteccin de compuestos electrooxidables o electroreducibles ocurre en la superficie de un electrodo
interpuesto en el paso del efluente de la columna.
Este detector emplea tres electrodos: el electrodo de trabajo, el de referencia y el auxiliar.
La reaccin redox es inducida en el electrodo de trabajo, mientras el electrodo auxiliar provee la carga de
neutralizacin complementaria. Entre estos electrodos se fija el voltaje apropiado para la deteccin.
El electrodo de referencia produce un potencial fijo y estable contra el cual se mide el potencial del
electrodo de trabajo. Un potenciostato provee una diferencia de potencial estable entre el electrodo de
trabajo y el auxiliar.
Un amplificador de corriente de nanoamperes produce una seal de salida, proveniente del flujo de
corriente entre los electrodos auxiliar y de referencia, causada por la transferencia de electrones del
proceso de xido reduccin.
Es destructivo.

La principal limitacin est dada por el tipo de fase mvil a emplear, que debe ser conductiva, limitando
su campo de aplicacin a la cromatografa de fase reversa e Intercambio Inico.
Para la construccin de electrodos se emplean entre otros: pasta de carbn, carbn cristalino, platino oro
y mercurio.
La desgasificacin es muy importante en el modo reductivo, ya que la presencia de aire disuelto en la
fase mvil da lugar al gasto de potencial en la reduccin de ese oxgeno, generando seales ruidosas y
baja sensibilidad de deteccin. Se recomienda la desgasificacin continua, por burbujeo con Helio.

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El hierro y sus xidos presentes en la fase mvil en forma de iones provenientes de tuberas, vlvulas, etc,
son electroqumicamente activos, y pueden tambin producir corrientes de fondo. Resulta conveniente
agregar EDTA 0,01 M a la fase mvil para complejar estos iones.
Se deben tener algunas precauciones con los detectores electroqumicos para asegurarse anlisis
reproducibles:
Chequear que estn conectados adecuadamente a tierra la bomba, el detector e integrador.
Usar bombas reciprocantes de doble pistn
Mantener en todo momento el flujo de la fase mvil en el detector.
Operar con el voltaje adecuado
Monitorear la altura de los picos para observar cambios en la eficiencia que nos indique la necesidad de
reacondicionar los electrodos.
Tener electrodos de referencias extras y reemplazar el electrodo de referencia en la celda 1 2 veces a
la semana.
Desconectar el detector electroqumico cuando est limpiando las columnas.
Utilizar agua, buffers y solventes orgnicos de alta pureza.

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Deteccin por espectrometra de masas, E.M.

El acoplamiento de la cromatografa de lquidos con la E.M, (la primera se trabaja con volmenes
relativamente grandes y en la segunda se requiere de vaco), se ha realizado mediante diversas interfaces:
En una, el efluente de la columna se divide y slo una pequesima fraccin se introduce directamente en
el espectrmetro de masas. Tambin la utilizacin de columnas microcapilares, con caudales de 10 a 50
L/min.
En otra interfaz, se puede depositar el efluente de la columna sobre una cinta o alambre que se mueve
continuamente y que transporta el solvente y el analito hacia una cmara calorfica para la eliminacin del
solvente por volatilizacin, luego los residuos del analito sobre la cinta o alambre pasan a la zona de
ionizacin, donde tiene lugar la desorcin y la ionizacin.
Otra, que se denomina termovaporizador, permite la entrada de todo el efluente, con caudales de hasta 2
mL/min, el lquido se vaporiza al pasar por un tubo capilar (acero inoxidable) calentado y forma un chorro
de aerosol de solvente y analito. En el aerosol el analito se ioniza. Se puede aplicar a molculas de
analitos polares.
En la deteccin por E.M. se emplea el control y almacenamiento de datos por computador.
Programacin del Solvente
Existen dos mtodos de programacin de solvente en HPLC:
1. Isocrtico: se usa una nica sustancia como fase mvil durante el anlisis de una mezcla de dos o ms
sustancias, ajustando adecuadamente las caractersticas de la fase.
2. Elucin por Gradiente: Es un trmino que se utiliza para describir el proceso mediante el cual se cambia
la composicin de la fase mvil.
La elucin por gradiente se utiliza con muestras cuyos componentes posean polaridades muy
diferentes, pues en estos casos es preferible variar la polaridad de la fase mvil durante el anlisis con
el fin de mejorar la separacin de los componentes que eluyen en ltimo lugar.
En general, pero no necesariamente, se empieza con una sustancia nica y se aumenta con el tiempo
la concentracin del otro componente (o componentes) de la fase mvil.
La figura siguiente representa el esquema funcional del sistema que efecta las mezclas y suministra la fase
mvil a la columna.

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Esquema funcional de un equipo para la elucin por gradiente.

La seleccin de los lquidos usados como fase mvil depende de varios parmetros. En las cromatografas de
adsorcin y de particin, el papel ms importante lo desempea la polaridad, pero tambin son importantes la
viscosidad y otras caractersticas que pueden influir en el funcionamiento del detector.
En la cromatografa de intercambio inico son importantes la fuerza inica y el pH, mientras en la
cromatografa de exclusin la consideracin primordial es la solubilidad de la muestra en la fase mvil.
En cromatografa lquida es corriente hablar de disolventes dbiles y fuertes (fases mviles o componentes de
la fase mvil respectivamente dbiles o fuertes). Sin embargo, pueden conducir a error ya que su significado
depende de la fase estacionaria:

En la cromatografa en fase normal y en la de adsorcin, en las cuales la fase estacionaria es

generalmente ms polar que la fase mvil, un disolvente dbil es menos polar que el otro componente
de la fase mvil.

En la cromatografa en fase reversa, en la cual la fase mvil es ms polar que la fase estacionaria, un
disolvente dbil es ms polar que el otro componente de la fase mvil.

Existen dos tipos de formadores de gradientes:

Los de baja presin
Los de alta presin
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Los gradientes de baja presin emplean, en general, slo una bomba y vlvulas solenoides que
entregan cada solvente en una cmara de mezclado de pequeo volumen.
La fase mvil Instantnea, es decir, la que se crea en ese preciso instante en base al programa deseado,
es entregada a la bomba.
Este sistema permite mezclar 2 a 4 solventes individuales, regulando el ciclo de apertura de cada vlvula
individual.
La ventaja principal de los sistemas de baja presin est dada por el costo (ya que slo es necesaria una
bomba impulsora) y por la precisin lograda en los extremos del gradiente, ya que todo el caudal es
entregado por el mismo dispositivo.
Este sistema requiere la desgasificacin continua para cada solvente individual. Esto se debe a que la
solubilidad de los gases en los solventes individuales es en general diferente de su solubilidad en la
mezcla deseada.

Sistema de formacin de gradiente de baja presin.

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Los gradientes de alta presin utilizan una bomba de alta presin para cada solvente individual.
Cada bomba es comandada por un programador, y el solvente entregado se mezcla a alta presin en una
cmara de bajo volumen y dirigido hacia el sistema.
El principal inconveniente de este sistema reside en el costo, ya que cada solvente necesita su bomba
impulsora.
Las bombas deben ser exactas y precisas para que el gradiente mantenga su calidad en toda su
extensin, en especial a bajos caudales:

Por ejemplo, si se emplean dos bombas para crear un gradiente lineal con un caudal de 1,0 mL/min, en
los extremos de 0 a 5% del gradiente una bomba entregar 0 hasta 0,05 mL/min. La otra bomba entregar
ese caudal cuando la primera entregue ms del 95% del programado.

Cuando se desarrolla un anlisis usando el mtodo de gradiente se deben tener presentes dos objetivos:
Obtener la mejor resolucin de los componentes de la muestra en el menor tiempo posible.
Asegurar alta precisin y exactitud.

Sistema de formacin de gradiente de alta presin.

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