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19/7/22, 14:11 Apéndice III D. Cromatografía líquida Farmacopea británica
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Apéndice III D. Cromatografía líquida
(Método Ph. Eur. 2.2.29)
PRINCIPIO
La cromatografía líquida (LC) es un método de separación cromatográfica basado en la diferencia en la distribución de especies entre 2
fases no miscibles, en las que la fase móvil es un líquido que se percola a través de una fase estacionaria contenida en una columna.
La LC se basa principalmente en mecanismos de adsorción, distribución de masa, intercambio iónico, exclusión de tamaño o interacción estereoquímica.
A menos que se especifique lo contrario, toda la información a continuación es válida tanto para LC estándar como para LC que utiliza columnas de tamaño de partícula reducido (por ejemplo, sub
(2,0 µm).
Este último requiere instrumentación que pueda soportar presiones más altas (normalmente hasta 100 MPa, es decir, alrededor de 15 000 psi), genera
La ampliación de banda extracolumna inferior proporciona una mezcla de gradiente mejorada y permite una mayor frecuencia de muestreo en el sistema de detección.
EQUIPO
El equipo normalmente consta de:
— un sistema de bombeo;
— un inyector;
— una columna cromatográfica (se puede utilizar un controlador de temperatura de columna);
— 1 o más detectores;
— un sistema de adquisición de datos.
La fase móvil se suministra desde uno o más depósitos y se bombea al inyector, luego a través de la columna, generalmente a una velocidad constante.
y luego a través del(los) detector(es).
SISTEMAS DE BOMBEO
Los sistemas de bombeo LC suministran la fase móvil a un caudal controlado. Las fluctuaciones de presión deben minimizarse, por ejemplo, haciendo pasar
El disolvente presurizado pasa a través de un dispositivo amortiguador de pulsos. Los tubos y las conexiones son capaces de soportar las presiones desarrolladas.
por el sistema de bombeo. Las bombas LC pueden estar equipadas con un dispositivo para "purgar" el sistema de burbujas de aire atrapadas.
Los sistemas de bombeo controlados por microprocesador son capaces de suministrar con precisión una fase móvil de constante (elución isocrática) o
composición variable (elución en gradiente), según un programa definido. En el caso de la elución en gradiente, se utilizan sistemas de bombeo que suministran
Hay solventes disponibles de varios depósitos y la mezcla de solventes se puede lograr en el lado de baja o alta presión de la(s) bomba(s).
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INYECTORES
La solución de muestra se introduce en la fase móvil que fluye en la cabeza de la columna o cerca de ella mediante un sistema de inyección que puede
funcionan a alta presión. Se utilizan dispositivos de bucle fijo y de volumen variable operados manualmente o mediante un muestreador automático. Llenado parcial de bucles
Durante la inyección manual puede afectar negativamente la precisión del volumen de inyección.
FASES ESTACIONARIAS
Existen muchos tipos de fases estacionarias empleadas en LC, entre ellas:
— sílice o alúmina, comúnmente utilizadas en LC de fase normal (fase estacionaria polar y fase móvil no polar), donde la separación es
basado en diferencias en la adsorción en la fase estacionaria y/o distribución de masa entre la fase móvil y la estacionaria
fase (cromatografía de partición);
— una variedad de soportes modificados químicamente preparados a partir de polímeros, sílice o grafito poroso, utilizados en fase normal e inversa.
fase LC (fase estacionaria no polar y fase móvil polar), donde la separación se basa principalmente en la partición de las moléculas;
— resinas o polímeros con grupos ácidos o básicos, utilizados en cromatografía de intercambio iónico, donde la separación se basa en la competencia
entre los iones a separar y los de la fase móvil;
— sílice porosa o polímeros, utilizados en cromatografía de exclusión por tamaño (2.2.30), donde la separación se basa en las diferencias entre los
volúmenes de las moléculas, correspondientes a la exclusión estérica;
— fases estacionarias especialmente modificadas, por ejemplo, derivados de celulosa o amilosa, proteínas o péptidos, ciclodextrinas, etc., para la separación
de enantiómeros (cromatografía quiral).
La mayoría de las separaciones se basan en cromatografía líquida de fase inversa que utiliza sílice modificada químicamente como fase estacionaria. La superficie del soporte,
es decir, los grupos silanol de la sílice, se hacen reaccionar con varios reactivos de silano para producir derivados de sililo unidos covalentemente que cubren una gama variable
Número de sitios activos en la superficie del soporte. La naturaleza de la fase enlazada es un parámetro importante para determinar la
Propiedades de separación del sistema cromatográfico.
A menos que el fabricante indique lo contrario, las columnas de fase inversa basadas en sílice se consideran estables en fases móviles que tienen una
pH aparente en el rango de 2,0 a 8,0. Columnas que contienen grafito poroso o partículas de materiales poliméricos como estirenodivinilbenceno
Los copolímeros son estables en un rango de pH más amplio.
Análisis mediante LC de fase normal con sílice no modificada o sílice modificada químicamente polar (por ejemplo, cianopropilo o diol) como fase estacionaria.
con una fase móvil no polar es aplicable en ciertos casos.
Para las separaciones analíticas, el tamaño de partícula de las fases estacionarias más utilizadas varía entre 2 y 10 µm. Las partículas pueden
ser esféricos o irregulares y de porosidad y área superficial específica variables. Estas propiedades contribuyen al comportamiento cromatográfico de
una fase estacionaria particular. En el caso de fases inversas, la naturaleza de la fase estacionaria, el grado de unión, expresado por ejemplo como
la carga de carbono y si la fase estacionaria está protegida en los extremos (es decir, parte de los grupos silanol residuales están sililados) son factores adicionales.
Factores determinantes. La formación de colas en los picos, especialmente en el caso de sustancias básicas, puede producirse cuando hay grupos silanol residuales.
Además de partículas porosas, se pueden utilizar materiales superficialmente porosos o monolíticos.
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A menos que se prescriba lo contrario en la monografía, se utilizan columnas de acero inoxidable de longitud y diámetro interno (Ø) variables.
Cromatografía analítica. Las columnas con diámetros internos inferiores a 2 mm se denominan a menudo columnas de microdiámetro.
La temperatura de la fase móvil y de la columna debe mantenerse constante durante el análisis. La temperatura de la columna puede especificarse en
la monografía para un rendimiento óptimo, pero la mayoría de las separaciones se realizan a 2025 °C.
FASES MÓVILES
Para la cromatografía líquida de fase normal, generalmente se emplean disolventes orgánicos de baja polaridad. El contenido de agua residual de los disolventes utilizados en la cromatografía móvil
La fase debe controlarse estrictamente para obtener resultados reproducibles.
En la LC de fase inversa, se emplean fases móviles acuosas, generalmente con disolventes orgánicos y/o modificadores.
Los componentes de la fase móvil se suelen filtrar para eliminar partículas de tamaño superior a 0,45 µm (o superiores a 0,2 µm cuando la
La fase estacionaria está formada por partículas de menos de 2,0 µm y cuando se utilizan detectores especiales, por ejemplo, detectores de dispersión de luz). Multicomponente
Las fases móviles se preparan midiendo los volúmenes requeridos (a menos que se especifiquen masas) de los componentes individuales, seguido de
Mezcla. Alternativamente, los disolventes pueden suministrarse mediante bombas individuales controladas por válvulas dosificadoras, mediante las cuales se realiza la mezcla.
según la proporción deseada. Los disolventes normalmente se desgasifican antes del bombeo mediante burbujeo con helio, sonicación y/o utilizando in
módulos de membrana/vacío de línea para evitar la creación de burbujas de gas en la celda del detector.
Los disolventes para la preparación de la fase móvil normalmente están libres de estabilizadores y, si se emplea un detector ultravioleta, son transparentes.
en la longitud de onda de detección. Los disolventes y otros componentes utilizados deben ser de calidad adecuada. En particular, el agua para La cromatografía R se utiliza para la preparación de fases móviles cuando el agua o una solución acuosa es uno de los componentes.
Los ajustes necesarios del pH se realizan en el componente acuoso de la fase móvil y no en la mezcla. Si se utilizan soluciones tampón o salinas
Se utilizan soluciones acuosas, se realiza un enjuague adecuado del sistema con una mezcla de agua y una pequeña proporción de la parte orgánica del mismo.
fase móvil (5 por ciento V/V) para evitar la cristalización de sales una vez completado el análisis.
Las fases móviles pueden contener otros componentes, por ejemplo, un contraión para cromatografía de pares iónicos o un selector quiral para cromatografía quiral.
cromatografía utilizando una fase estacionaria aquiral.
DETECTORES
Espectrofotómetros ultravioleta/visibles (UV/Vis) (incluidos los detectores de matriz de diodos) (2.2.25), Son los detectores más comúnmente empleados.
Espectrofotómetros de fluorescencia, refractómetros diferenciales (RI), detectores electroquímicos (ECD), detectores de dispersión de luz, detectores cargados
detectores de aerosoles (CAD), espectrómetros de masas (MS) (2.2.43), detectores de radiactividad, detectores de dispersión de luz multiángulo (MALS) u otros
Se pueden utilizar detectores.
PROCEDIMIENTO
Equilibrar la columna con la fase móvil y el caudal prescritos, a 2025 °C o a la temperatura especificada en la monografía, hasta obtener una
Se alcanza una línea base estable. Prepare la(s) solución(es) de la sustancia que se va a examinar y la(s) solución(es) de referencia requeridas. Las soluciones
Debe estar libre de partículas sólidas.
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Los criterios para evaluar la idoneidad del sistema se describen en el capítulo general 2.2.46. Técnicas de separación cromatográfica.
También se muestra en qué medida se pueden realizar ajustes de los parámetros del sistema cromatográfico para satisfacer los criterios de idoneidad del sistema.
que se dan en este capítulo.
Puntos adicionales para monografías de la Farmacopea Británica
La composición y el caudal de la fase móvil se indican en la monografía. Es recomendable utilizar como fase móvil mezclas de disolventes.
que se han desaireado utilizando una bomba de vacío u otro medio adecuado de desaireación que no tenga efecto sobre la composición del
mezcla.
En el trabajo cuantitativo, en particular cuando no se especifica el uso de un estándar interno en la monografía, se recomienda el uso de un asa de volumen fijo.
Se recomienda el uso de un inyector. En algunos casos excepcionales, en la monografía se prescribe el uso exclusivo de las alturas de pico; cuando este sea el caso
Las alturas de pico deben utilizarse independientemente del factor de simetría.
La columna suele estar hecha de acero inoxidable y sus dimensiones se indican en la monografía. Las dimensiones se indican como
(longitud × diámetro interior). Cuando la monografía prescriba el uso de una fase estacionaria designada por una letra, la fase estacionaria pertinente
Se entiende por fase la fase definida a continuación. El diámetro nominal de las partículas de la fase estacionaria se indica entre paréntesis inmediatamente
A continuación de la letra de designación. En la mayoría de los casos se hace referencia a una marca comercial en particular que se ha considerado adecuada para el
propósito, pero tales declaraciones no implican que no se pueda utilizar una marca comercial diferente pero equivalente. La separación debe ser
se lleva a cabo a temperatura ambiente constante a menos que se especifique lo contrario en la monografía. Cuando se utilizan fases móviles de pH alto con un
Columna a base de sílice, es aconsejable utilizar una precolumna antes de la columna analítica.
A menos que se especifique lo contrario en la monografía, el detector consiste en un detector fotométrico equipado con una celda de flujo de bajo volumen (aproximadamente 10 µL
es adecuado); el ajuste de la longitud de onda se especifica en la monografía.
El diseño de un cromatógrafo en particular puede requerir la modificación de las condiciones detalladas en la monografía. En tal caso, el analista
Debería estar convencido de que las condiciones modificadas producen resultados comparables.
VOLUMEN DE INYECCIÓN
Cuando no se especifica ningún volumen de inyección en la monografía, el analista debe seleccionar un volumen apropiado para su aplicación específica.
El volumen elegido depende de la respuesta del analito, el detector utilizado, la eficiencia de la columna y el rendimiento general de
El sistema cromatográfico. Cuando no se indica un volumen, normalmente es adecuado utilizar 20 µL; sin embargo, se debe comprobar su idoneidad.
en las condiciones operativas locales.
FACTOR DE RESOLUCIÓN
A menos que se indique lo contrario en la monografía, para las monografías con un factor de resolución establecido, léase Resolución (Rs) como se menciona en el Apéndice.
III Técnicas de separación cromatográfica.
TIEMPO DE EJECUCIÓN
Cuando no se especifica un tiempo de ejecución en la monografía, el analista debe seleccionar un tiempo de ejecución apropiado para su aplicación específica.
El tiempo elegido depende del tipo de prueba. Por ejemplo, cuando no se indica un tiempo de ejecución en una prueba de sustancias relacionadas, el analista
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debe garantizar que el tiempo de ejecución sea mayor que todos los picos secundarios conocidos o probables; de manera similar, en un ensayo, el tiempo de ejecución debe elegirse para
permitir que la línea base se estabilice después de la elución del pico de interés.
PICOS SECUNDARIOS
Se puede hacer referencia a picos secundarios. Un pico secundario es un pico en el cromatograma distinto del pico principal y cualquier pico
debido al estándar interno, al disolvente o a los agentes derivatizantes. Los picos identificados se deben al contraión y/o a otros excipientes. incluido
También podrán excluirse los conservantes presentes en el material examinado.
MATERIALES
Los disolventes y reactivos utilizados en la preparación de soluciones para examen deben ser de una calidad adecuada para su uso en cromatografía líquida.
