USO DE GRADIENTES EN ANÁLISIS DE CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA DE

ALTA EFICACIA (HPLC, HIGH PERFORMANCE LIQUID

CHROMATOGRAPHY).

Introducción.
Los avances en el campo de la biotecnología han requerido el uso de técnicas
más eficaces para la separación y purificación de biomolecular. La
cromatografía de líquidos ha resultado ser una herramienta muy poderosa y
eficiente para la separación de mezclas complejas tanto de compuestos de
bajo peso molecular como de proteínas y ácidos nucleicos.
La cromatografía es una antigua técnica instrumental (Milhail Tswett, 1906) que
ha evolucionado enormemente en los últimos años, inicialmente concebida
como método de separación, ha llegado a convertirse en una fuente inagotable
de métodos de análisis. El proceso cromatográfico contempla la separación de
los componentes de una mezcla, para ello, una muestra de la mezcla (o el
extracto de una muestra) será disuelta en una fase móvil (en este caso un
líquido). La fase móvil es impulsada a través de una fase inmóvil, que debe ser
inmiscible con ella, a la que se conoce como fase estacionaria, y que puede ser
sólida o líquida (cromatografía líquido-sólido o cromatografía líquido-líquido –el
líquido puede estar embebido o unido a partículas sólidas-). Las fases son
escogidas de tal forma que los componentes de las muestras presenten
diferencias en cuanto a sus propiedades físico-químicas (solubilidad, tamaño,
fuerza iónica, polaridad, afinidad, etc.) para cada fase. Las interacciones
químicas entre la fase móvil y la muestra, y entre la muestra y la fase
estacionaria, determinan el grado de migración y separación de los
compuestos contenidos en la muestra. Un componente que interactúe más con
la fase estacionaria realizará un "viaje" más largo a través de ella que otro
componente que tenga más interacción con la fase móvil. Como resultado de
estas diferencias en la movilidad de los componentes de una muestra estos se
separarán uno de otro (Hernandez, 2005).

Cromatografía líquida de alta eficacia (HPLC)

La Cromatografía líquida de alta eficiencia o High performance liquid
chromatography (HPLC) es un tipo de cromatografía en columna utilizada
frecuentemente en bioquímica y química analítica. También se la denomina a
veces Cromatografía líquida de alta presión o Cromatografía Líquida de Alta
Resolución (High pressure liquid chromatography)(HPLC), aunque esta
terminología se considera antigua y está en desuso. El HPLC es una técnica
utilizada para separar los componentes de una mezcla basándose en
diferentes tipos de interacciones químicas entre las sustancias analizadas y la
columna cromatografía.
En la cromatografía líquida de alta eficacia (HPLC) la muestra es inyectada en
el seno de la fase móvil, donde es soluble, y es transportada a través de una
columna por el flujo continuo de fase móvil a alta presión. La fase estacionaria
está formada por partículas de pequeño diámetro, por tanto, con una gran
superficie de interacción, contenidas en la columna. Este proceso cinético es
conocido con el nombre de elución. La velocidad a la que un analito se mueve
a través de la columna, con respecto a los demás presentes en la mezcla, está
determinada por el tiempo que permanece en la fase móvil (Hernandez, 2005).

Características de las fases móviles y sistemas de elución

Los recipientes que se utilicen para almacenar la fase móvil (y las tuberías que
la conduzcan) tienen que ser inertes, esto es, el disolvente no deberá extraer
especie alguna del material con que estén construidos. Generalmente se usan
botellas de vidrio y tubos de teflón, provistos éstos últimos de un sistema de
filtros para eliminar cualquier partícula que pueda contener la fase móvil.
Los disolventes más utilizados en HPLC suelen ser agua, disoluciones tampón
acuosas y disolventes orgánicos tales como metanol, acetonitrilo o diferentes
mezclas. En cualquier caso, todos los disolventes deberán ser
espectroscópicamente puros, exentos de partículas sólidas y desgasificados.
Esto puede llevarse a cabo por filtración a vacío a través de filtros de 0.22–0.45
μm, o mediante el burbujeo con un gas inerte muy poco soluble, como
nitrógeno o helio. La des-gasificación reduce la posibilidad de formación de
burbujas en las válvulas de las bombas y en los detectores. Asimismo, es
importante porque se reduce el ruido de fondo cuando se utiliza un detector
ultravioleta, y porque se evita la interferencia del oxígeno disuelto en la
detección fluorimétrica. Además, es fundamental cuando se utiliza elución por
gradiente en fase inversa, especialmente con gradientes de presión baja, ya
que de esta forma se evita la formación de burbujas de aire cuando se mezclan
el agua y el disolvente orgánico.
Aunque la separación de muchas mezclas se lleva a cabo utilizando un
disolvente de composición constante (elución isocrática), en ocasiones se usa
la elución por gradiente, en la cual se cambia la composición de la fase móvil
durante el desarrollo del cromatograma. Con ello se consigue aumentar la
eficiencia de la separación, con unos efectos similares a los producidos por la
programación de temperatura en cromatografía de gases.

Elución
En función de la composición de la fase móvil inyectada a la columna, la
elución de moléculas puede ser de dos tipos: isocrática y en gradiente.
También existen casos en los que se cambia totalmente la fase móvil en el
transcurso de la cromatografía y se conoce como elución politíptica.

Elución isocrática
Los compuestos eluyen usando una fase móvil de composición constante
durante toda la cromatografía. Todos los compuestos acaban migrando a
través de la columna hasta el final. Sin embargo, cada uno migra con una
velocidad diferente, resultando en una relación de elución más rápida o más
lenta. Este tipo de elución es bastante simple y barato, pero la resolución de
algunos compuestos es cuestionable y el eluido puede no ser obtenido en un
plazo de tiempo adecuado. Las separaciones isocrática usan la misma
composición de fase móvil a través de la separación. Las eluciones isocraticas
se usan cuando la mezcla a separar no es muy compleja o cuando los
componentes de la mezcla tienen tiempos de retención muy diferentes.

Elución en gradiente
En este caso se utilizan dos (y a veces más) disolventes con una polaridad
significativamente distinta. Una vez comienza la elución, se varía la relación de
los disolventes de forma programada, a veces continuamente y a veces
mediante una serie de etapas escalonadas. Los instrumentos en la moderna
HPLC a menudo están equipados con unos dispositivos que permiten introducir
los disolventes desde dos o más recipientes en una cámara de mezcla a una
velocidad que varía continuamente y la relación de volumen de los disolventes
se puede modificar lineal o exponencialmente con el tiempo (figura 1).
Los diferentes compuestos son eluidos modificando gradualmente la
composición de la fase móvil durante el transcurso de la cromatografía
(aumentando la fuerza iónica, modificando la polaridad, etc.). El resultado
sobre la elución es un acortamiento de los tiempos de retención, el factor de
retención disminuye conforme aumenta la variación de flujo del gradiente y el
compuesto eluye. La elución por gradientes es utilizada para la separación de
mezclas de proteínas.
La utilización de gradiente puede llevarse a cabo de forma lineal o escalonada
o linealmente escalonada (figura 1).

Figura 1. Tipos de gradientes utilizados en Cromatografía líquida de alta

eficacia (HPLC)

La figura 2 ilustra la ventaja de una elución con gradiente en la separación de

una mezcla de clorobencenos. La curva (b) corresponde a la elución isocrática
con metanol/agua 50:50 (v/v). La curva (a) muestra la elución con gradiente,
que se inicia con una mezcla 40:60 de los dos disolventes y se va aumentando
la concentración de metanol un 8%/min. Obsérvese que la elución con
gradiente acorta notablemente el tiempo de separación sin sacrificar la
resolución de los primeros picos. Nótese también que la elución con gradiente
produce unos efectos similares a los producidos por la programación de
temperatura en cromatografía de gases.
El gradiente de elución se recomienda generalmente para:
· Muestras que tengan tiempos de retención semejantes.
· Muestras de peso molecular mayor a 1000.
· Muestras de origen biológico.
Aun cuando se piense utilizar una elución isocrática, es recomendable hacer un
primer análisis por gradiente para determinar el porcentaje del solvente más
adecuado.
Cuando se desarrolla un análisis usando el método de gradiente se debe tener
presente dos objetivos:
 Obtener la mejor resolución de los componentes de la muestra en el
menor tiempo posible.
 Asegurar alta precisión y exactitud.
Para obtener buenos resultados con el método de gradiente debemos seguir
cinco pasos fundamentales:
  Determinar la composición inicial y final del solvente.
 Ajustar el tiempo del gradiente.
 Determinar la forma del gradiente (lineal, cóncava o convexa).
 Ajustar la velocidad del flujo para mejorar la resolución.
 Regresar a las condiciones iniciales la columna.

Sistema de mezcla de la fase móvil.

La fase móvil puede ser un solvente puro o una mezcla de solventes. Cuando
se trata de una mezcla, puede programarse la bomba para que tome solventes
de diferentes botellas en una proporción determinada y realice la mezcla en
una cámara de mezclado.
Al utilizar un solvente por método de gradiente de elución, la mezcla de los
disolventes, bajo un sistema de control preciso y reproducible, se puede
realizar de dos maneras.
Mezcla a baja presión: en los equipos de mezclas de baja presión, el
mezclado de los diferentes componentes se lleva a cabo antes que estos
entren en la bomba (en la zona de baja presión del sistema) controlándose el
caudal del sistema cromatográfico por medio de una sola bomba. El mezclado
de los componentes se realiza por medio de válvulas porcentuales controladas
por relés que están calibrados para dar la mezcla adecuada. El dispositivo de
control simplemente abre cada válvula durante un periodo de tiempo adecuado,
que será en función del porcentaje de cada componente que se precise en la
mezcla (figura 3).
 Figura 3. Sistema de mezcla en baja presión.

La principal ventaja de este tipo de mezclado, es que el costo del equipo se

reduce considerablemente. El mezclado en baja presión permite la mezcla de
dos o más componentes de la fase móvil con una buena reproducibilidad
aunque con unos tiempos de retardo algo mayores respecto a la mezcla en alta
presión. Como principal desventaja, se tiene la baja reproducibilidad que se
obtiene en mezclas donde uno de los componentes se encuentra en una
proporción de menos del 5%
Mezcla a alta presión: este sistema de mezclado utiliza una bomba para cada
uno de los disolventes que se van a mezclar, estando la salida de cada bomba
conectada a una conexión en t o a una pequeña cámara de mezcla. La
denominación de mezcal de lata presión es debida a que las mezclas se
realizan una vez que los disolventes han pasado la bomba y por lo tanto, han
adquirido la presión de trabajo (figura 4)
 Figura 4. Sistema de mezcla en alta presión.

El mayor inconveniente de este sistema de mezcla, es el alto costo de las

bombas si se requieren mezclas por un porcentaje inferior a un 5% de uno de
los componentes, ya que en este caso deben utilizarse bombas de alta
precisión y además se necesita una bomba para cada uno de los disolventes a
mezclar. Como ventajas se pueden señalar una buena reproducibilidad de las
mezclas, una rápida respuesta en los cambios de concentracion y además la
posibilidad de utilizar cada una de las bombas por separado para trabajar con
sistemas isocrática independientes.
Aplicaciones de HPLC por análisis de gradientes Aplicaciones en el laboratorio
clínico
La HPLC es utilizada en laboratorios clínicos, en la separación de monoglicéridos,
diglicéridos y triglicéridos, y como método preparativo para esteroides o vitaminas
antes del posterior radioinmunoanálisis. En la separación de proteínas y
anticuerpos con fines preparativos. Incluso células con distinta composición en
hidratos de carbono son separadas en columnas de lectinas. Lipoproteínas, como
LDLs y VLDLs, también pueden separarse mediante columnas de heparina, y
glicohemoglobinas mediante columnas de boronato. En general, es aplicable a
cualquier aislamiento de una sustancia específica que pueda llevarse a cabo
mediante una reacción antígeno-anticuerpo, enzima-substrato o metal-sustancia.
Separación de hemoglobinas, isoenzimas de la creatina-cinasa o la L-lactato-
deshidrogenasa y análisis de aminoácidos. Otras aplicaciones van dirigidas a
retirar interferencias iónicas de otras sustancias para su posterior análisis por otros
métodos. Un ejemplo es el porfobilinógeno en orina que queda retenido en la
columna eluyendo las sustancias interferentes, posteriormente se eluye
selectivamente y se cuantifica. Se utiliza en el laboratorio toxicológico para drogas
de abuso (cocaína, benzoilegconina, cocaetieleno), anfetaminas, metaanfetaminas
y antagonistas o narcóticos (naloxona, naltrexona); y en el laboratorio clínico o
alimentario para vitaminas liposolubles, carotenos, licopenos, etc., y péptidos y
proteínas para su posterior análisis por espectrometría de masas. Para la
detección y monitorización de una amplísima variedad de fármacos:
- Analgésicos (acetaminofeno), analgésicos narcóticos (oxicodona) y analgésicos
antiinflamatorios (naproxeno, ibuprofeno, diclofenaco).
- Antagonistas (ranitidina, omeprazol).
- Antiagregantes (warfarina).
- Antiarrítmicos (procainamida, propanolol ó metoprelol, oxoprenol).
- Antibacterianos (sulfadiazina, sulfamerazina, trimetroprim, sulfametoxazol,
tetraciclina, minocliclina, demeclociclina).
- Antidepresivos tricíclicos (doxepina, nordoxepina, nortriptilina, amitriptilina,
imipramina, trimipramina, verapamil, norverapamil).
- Antirretrovirales (aciclovir, delfinavir, saquinavir).
- Barbitúricos (fenobarbital, butabarbital, butabital, secobarbital).
- Broncodilatadores (albuterol, teofilina, teobromina, paraxantina, cafeína).
- Fármacos glucocorticoides (prednisolona, betametasona).
- Hormonas (dosificación de testosteronas: acetato, propionato y benzoato de
testosterona).
- Péptidos terapéuticos (oxitocina, angiotensinas I y II).
- Queratolíticos (ácido salicílico, ácido benzóico).
- Sedativos (nordiazepam, clordiacepóxido, oxacepam, norclordiacepóxido) y
opiáceos (morfina y sus glucorónidos, metadona).

Bibliografía

EDUCACIÓN CONTINUADA EN EL LABORATORIO CLÍNICO Ed Cont Lab Clin

2005;8:49-62
CROMATOGRAFÍA LIQUIDA DE ALTA EFICACIA
José María Hernández Pérez
Servicio de Bioquímica, Hospital Universitari Germans Trias i Pujol, Badalona

UNIVERSIDAD NACIONAL AUTONOMA DE MEXICO

INSTITUTO DE BIOTECNOLOGÍA
Métodos fisicoquímicos en Biotecnología
Trabajo de investigación
CROMATOGRAFÍA DE FASE REVERSA
Presentan
M. en C. Edgar Ernesto Esquivel Soto
Q.F.B. Lidia Irene Leal Guadarrama JUNIO 2004
CUERNAVACA, MORELOS
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