Microbiologia Laboratorial
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Politécnico do Porto
Relatório de Estágio
Microbiologia
Índice Geral
ÍNDICE DE QUADROS..........................................................................................................................................VII
SIGLAS E ABREVIATURAS...................................................................................................................................VIII
INTRODUÇÃO ....................................................................................................................................................... 1
ii
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Fragmentos de tecido.......................................................................................................................................................25
iii
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Índice de Figuras
Figura 11. Kit de deteção de antigénios fecais “Certest Clostridium difficile antigen GDH --------------20
iv
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Figura 18. Colónias características de Haemophilus influenzae no meio Gelose de Chocolate ----------29
Figura 20. Colónias características de Staphylococcus aureus no meio Gelose de Sangue ---------------30
Figura 21. Colónias características de Streptococcus pneumoniae no meio Gelose de Sangue -----------30
Figura 25. Colónias características de Staphylococcus aureus no meio Manitol Salt Agar ---------------32
Figura 27. Colónias características de Staphylococcus aureus resistentes à meticilina no meio MRSA-33
Figura 29. Colónias características de Salmonella spp no meio ChromID Samonella ---------------------34
v
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Figura 41. Placa metálica para colocação de amostras no microflex MALDI-TOF MS -------------------43
Figura 47. Antibiograma/Fungigrama por método de difusão de disco e por método Etest ---------------48
Figura 55. Colónias características de Mycobacterium tuberculosis no meio Lowenstein Jensen -------59
vi
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Índice de Quadros
Quadro 2. Exemplos de coproculturas em meios seletivos e diferenciais requisitadas pelo clínico -------9
Quadro 5. Características das colonias nas placas de Gelose de Chocolate (PVX) ------------------------21
Quadro 6. Características das colonias nas placas de Gelose de Sangue (COS) ----------------------------21
Quadro 10. Limiar e interpretação dos resultados do VIDAS TOXO. IgG ----------------------------------27
Quadro 12. Limiar e interpretação dos resultados do VIDAS Lyme. IgG ----------------------------------30
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Siglas e abreviaturas
viii
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Introdução
1
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receção de amostras até à validação dos resultados e o seu envio para os clínicos de serviço do
IPO, ou entidades externas. O espaço reservado ao diagnóstico laboratorial e investigação em
microbiologia clínica do IPO Porto está assim dividido em várias salas:
Sala de receção de produtos e sementeiras;
Sala das continuações e identificações;
Laboratório de BK (Bacilo de Koch);
Laboratório de serologia;
Laboratório de micologia;
Sala de colorações e lavagem de material;
Gabinete de investigação (Biologia Molecular).
Nesta área, todos os dias se realizam diferentes testes microbiológicos, tais como:
exames micobacteriológicos de urina, exsudados de orofaringe, exsudados
nasais, ponta de cateter, pus, fezes, LCR, lavado broncoalveolar (LBA), lavado
brônquico (LB) e líquidos;
pesquisa de antigénios de Legionella pneumophila na urina e LBA;
pesquisa de antigénios de Streptococcus pneumoniae na urina;
pesquisa de antigénio de Clostridium difficile nas fezes e suas toxinas A e B;
pesquisa de Pneumocystis jirovecci em LB e LBA e
antibiogramas;
deteção de antigénios febris;
deteção de anticorpos anti-Treponema pallidum;
deteção manual da sífilis;
deteção de imunoglobulinas IgG e IgM anti-toxoplasmáticas;
deteção de imunoglobulinas IgG e IgM anti-Borrelia burgdorferi;
pesquisa de Bacilo de Koch (BK).
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Meios de cultura
Os meios de cultura são preparações químicas que contêm substâncias capazes de
promover o crescimento microbiano, principalmente de bactérias e fungos(2). Quando se
realizam culturas “in vitro” dos microrganismos, é possível efetuar o seu isolamento e a sua
caracterização morfológica, fisiológica, bioquímica e/ou genética(3). No entanto, para que os
microrganismos cresçam, os meios de cultura têm de apresentar determinadas condições
ambientais favoráveis, isto é, devem-lhes fornecer nutrientes [fontes de carbono, azoto, fósforo,
carbohidratos (glicose/lactose), vitaminas, aminoácidos, entre outros], e condições de pH,
temperatura, humidade e atmosfera adequadas, tendo em conta que o crescimento microbiano
depende das suas exigências nutricionais, variando de acordo com a constituição dos meios.
Para além dos nutrientes requeridos às exigências dos microrganismos, os meios de
cultura devem ser estéreis, ou seja, não devem conter quaisquer organismos vivos(4).
É também importante ter em conta, que é necessário ter precauções durante o seu
manuseamento a fim de evitar possíveis contaminações. Para isso utilizam-se técnicas de
assepsia, com vista a prevenir as possíveis contaminações durante a manipulação de culturas e
meios de cultura estéreis(5).
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6
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MCK – MacConkey
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SS - Salmonella-Shigella
Meio sólido, seletivo para Salmonella spp e Shigella spp, devido à presença de sais
biliares, citrato de sódio e verde brilhante (inibidores do crescimento de microrganismos
Gram+), e diferencial para a fermentação da lactose, em que as bactérias fermentadoras surgem
em colónias rosa e as não fermentadoras em colónias incolores. Este meio também é diferencial
para a produção de sulfureto de hidrogénio (H2S), sendo que as bactérias produtoras surgem em
colónias com centro negro, devido à presença de tiossulfato de sódio e citrato férrico(6)(12).
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Sementeiras
É traçada uma estria central a dividir a placa ao meio e posteriormente, espalha-se esse
inóculo por estrias perpendiculares à central ao longo de toda a placa. Esta técnica tem como
finalidade a avaliação quantitativa de colónias, para se ter uma noção da carga microbiana
presente, avaliando-a como significativa ou não(4)(13).
Consiste em espalhar o inóculo a partir da parte superior da placa até meio e, rodando a
placa, esgota-se o inóculo, arrastando algumas estrias do quadrante anterior, até obter 3 a 4
quadrantes. Com esta técnica, é possível obter-se colónias isoladas(13)(figura 1).
10
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É utilizada para semear pontas de catéter. Com a ajuda de uma ansa, rola-se a ponta de
catéter cuidadosamente sobre toda a superfície do meio.
Com uma ansa estéril de 1µL recolhe-se o produto a semear e introduz-se, em posição
vertical, no centro do meio de cultura. Remove-se a ansa no mesmo trajeto(15)(figura 2).
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Sementeira em anaerobiose
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Colorações
As colorações são técnicas laboratoriais que permitem uma primeira diferenciação dos
microrganismos presentes nos produtos biológicos, através da observação em microcopia de
certos aspetos morfológicos, tais como o seu tamanho, forma, estrutura e a capacidade de
reterem ou não determinados corantes(2)(15). Neste sentido, existem dois tipos de colorações
diferenciais capazes de fornecer informação preliminar sobre os microrganismos:
coloração de Gram
coloração de Ziehl-Neelsen
No laboratório de microbiologia do IPO Porto, as colorações são realizadas com recurso ao
equipamento caso, são efetuadas no equipamento Mirastainer® da companhia Merck.
Coloração de Gram
Coloração diferencial que permite distinguir os dois tipos principais de bactérias, cocos
e bacilos, quanto à capacidade de retenção de corantes(16). O seu princípio consiste em efetuar
um esfregaço sobre uma lâmina e fixá-lo pelo calor, à chama de um bico de Bunsen, para,
posteriormente, ser corado com violeta de cristal, seguido de um mordente, o lugol, capaz de
aumentar a afinidade celular para o corante básico; o excesso de corante é removido com
álcool-acetona, e finalmente cora-se o esfregaço uma segunda vez, agora com outro corante
(contra-corante), a safranina(12)(4)(17)(15)(figura 4).
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de uma bactéria Gram+, embora mais espessa, é quimicamente mais simples, ou seja, apresenta
predominantemente um único tipo de macromolécula (90% peptidoglicano)(9) (figura 5).
Já a parede celular de uma bactéria Gram- é mais complexa. É formada por uma ou poucas
camadas de peptidoglicano e por uma membrana externa, separadas entre si por um espaço
periplasmático, contendo uma série de enzimas e proteínas(9).
Assim sendo, enquanto as bactérias Gram+ coram de púrpura/roxo (figura 6), visto que
o corante violeta de cristal fica retido pela camada espessa de peptidoglicano existente na
parede celular. As bactérias Gram- coram de vermelho/rosa (figura 7), tendo em conta que
possuem uma camada fina de peptidoglicano, e que esta é incapaz de reter o corante
primário(13)(9).
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Coloração de Ziehl-Neelsen
Coloração diferencial que permite identificar bactérias álcool-ácido resistentes,
principalmente micobactérias, ou seja, microrganismos com paredes celulares constituídas por
ácidos micólicos.(20) Depois de corados a quente com fucsina, estes microorganismos (Quadro
1) resistem à descoloração por álcool-ácido. A importância do uso quotidiano desta coloração
está muito associada ao diagnóstico de tuberculose, doença infeciosa provocada pelo bacilo
álcool-ácido resistente (BAAR) Mycobacterium tuberculosis(8)(15). Assim sendo, quando
observamos uma preparação ao microscópio, enquanto as bactérias álcool-ácido resistentes
coram de vermelho/rosa, as não resistentes coram de azul, devido à posterior coloração do
esfregaço com azul-de-metileno (figura 8).
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Produtos Biológicos
Urina
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Fezes
As fezes são formadas no intestino grosso, e a sua consistência varia desde líquida a
sólida. O exame bacteriológico é realizado sempre que há suspeita clínica de infeção bacteriana
do trato gastrointestinal(17). Os agentes etiológicos que é mais comum aparecerem em amostras
de fezes são:
Escherichia coli
Campylobacter
Vibrio colerae
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Shigella spp
Salmonella spp
Yersínia enterolítica
Helicobacter pilory
Clostridium perfringens.
A cultura de fezes (coprocultura) tem como objetivo isolar (de entre a flora
polimicrobiana existente) o microrganismo causador da infeção. Deve ser efetuada nos meios
SS, SM2, MCK, MSA2 e SGC2, por esta ordem. As técnicas de sementeira por estrias paralelas
em superfície (quadrantes), realizadas nesses meios, devem ter como ponto de partida uma
inoculação prévia em meio GN Broth. Neste último, com a ajuda de uma ansa ou pipeta de
Pasteur esterilizada, consoante o tipo de consistência das fezes, é feita uma suspensão com uma
pequena porção da amostra, posteriormente inoculada em cada meio de cultura.
Os meios enriquecidos, como as Geloses de Sangue e de Chocolate, não são utilizados
para a cultura de fezes, por se tratar de um produto polimicrobiano. O isolamento do
microorganismo em causa tornar-se-ia muito difícil ou mesmo impossível de se conseguir obter.
No entanto, caso seja pedido pelo médico requisitante, a amostra poderá ser semeada em meios
seletivos e diferenciais para determinados microrganismos, tais como (quadro 2):
Escherichia coli Ø157:H7
Yersinia enterocolitica
Campylobacter spp
Vibrio cholerae
Quadro 2 Exemplos de coproculturas em meios seletivos e diferenciais requisitadas pelo clínico (24)(25)(2)(17).
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Exame parasitológico
O exame parasitológico das fezes é realizado numa situação de suspeita clínica da presença de
parasitas. O kit utilizado permite a análise de fezes humanas num ambiente
fechado. Contém formalina para fixar os parasitas e Triton X, que consiste num
detergente que rompe as membranas celulares. Estes dois reagentes, em conjunto,
estabilizam os parasitas e separam-nos dos restos alimentares utilizando um sistema
de filtração.
Hemocultura
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O volume colhido para os frascos de hemocultura é diferente consoante o tipo de paciente. isto
No caso de se tratar de um adulto, deve-se colher entre 8 a 10mL de sangue (garrafas azuis ou
rosa), enquanto se for uma criança ou um adulto em que não se possa colher um volume normal,
a colheita deverá conter entre 1 a 3mL de sangue (garrafas cinzentas). As garrafas azuis
correspondem à cultura de microrganismos aeróbios e as garrafas cor de rosa à cultura de
microrganismos anaeróbios.
Quando a hemocultura positiva durante o período de incubação, imprime-se um gráfico
que demonstra o tempo que a hemocultura demorou a positivar. Retira-se a garrafa do
equipamento, e efetua-se um isolamento da amostra para os meios Gelose de Sangue e MCK,
em caso de aerobiose, e/ou SCS e SNVS, em caso de anaerobiose. Esta
passagem da amostra para os meios de cultura é feita pela técnica de sementeira por estrias
paralelas em superfície (quadrantes). O topo da garrafa deve ser previamente desinfetado com
álcool a 70%, para minimizar risco de contaminações, e depois insere-se uma agulha estéril para
inocular uma gota de sangue nos respetivos meios e numa lâmina, efetuando-se também um
esfregaço para coloração de Gram e posterior visualização ao microscópio. Num par de
hemoculturas, quando apenas uma se torna positiva, é provável que se trate de uma
contaminação e não de uma infeção provocada por microrganismos em circulação. Estes e
outros casos são sempre avaliados pelo médico patologista do serviço de microbiologia
laboratorial.
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Ponta de catéter
Exsudados (zaragatoas)
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Exsudados da orofaringe
Exsudados nasais
LCR
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sistema nervoso através da corrente sanguínea ou invadi-lo a partir de uma lesão (ex.:
traumatismo crânio-encefálico). Como estes microoganismos são sensíveis às diferenças de
temperatura, a amostra deve ser enviada rapidamente ao laboratório e mantida a uma
temperatura de aproximadamente 37ºC até à sua análise(17)(28)(3). A cultura do LCR é efetuada
nos meios Gelose de Chocolate, Gelose de Sangue e SGC2, por esta ordem, pela técnica de
sementeira por gota, em que três gotas de amostra são dispostas sob forma de triângulo. Os
meios utilizados e o tipo de sementeira facilitam o crescimento de microrganismos fastidiosos e
nutricionalmente exigentes, aumentando a probabilidade de encontrar o microrganismo
responsável pela infeção. Com este produto, também se efetuam dois esfregaços, um para
coloração de Gram e outro para coloração de Ziehl-Neelsen, e a pesquisa de antigénio de
Cryptococcus spp, através de um ensaio imunocromatográfico de membrana capaz de detetar
esse antigénio no LCR (de uma forma muito semelhante às pesquisas de antigénios na urina e
nas fezes, mas utilizando um kit específico pesquisa de antigénio de Cryptococcus spp).
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coloração de Gram (permite pré-avaliar as amostras e ver se são representativas ou não, visto
que um número elevado de células epiteliais e um número baixo de células polimorfonucleares
indicam que houve contaminação da amostra com saliva) e outro para coloração de Ziehl-
Neelsen. Amostras com volume superior a 5mL são transferidas para tubos cónicos de 50mL e
centrifugadas, para que o sedimento se torne homogéneo e representativo da infeção. Nos casos
em que é pedido pesquisa de Mycobacterium tuberculosis, as amostras também têm de ser
transferidas para esses tubos cónicos, de forma a que, posteriormente, possam ser tratadas
(descontaminadas). Amostras muito mucosas requerem homogeneização com auxilio de pérolas
(esferas de vidro) e água esterilizada, com agitação no vortex. Este procedimento facilita a
sementeira de tais amostras.
Fragmentos de tecido
Os fragmentos de tecido são triturados num almofariz e diluídos para obtenção de uma
solução homogénea, antes da sementeira. Posteriormente, são semeados em COS, PVX, MCK,
MSA2 e SGC2.
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Leitura de placas
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Figura 23 Colónias características de Klebsiella spp, não fermentadora da lactose, no meio MacConkey(38)
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Identificação de Microrganismos
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Prova da catalase
Prova da coagulase
A coagulase é uma enzima com capacidade para coagular o plasma sanguíneo através de
um mecanismo similar ao da coagulação normal(45), reagindo com um fator plasmático, o
qual vai atuar sobre o fibrinogénio, formando-se a fibrina. A atividade da coagulase é utilizada
para distinguir espécies patogénicas de Staphylococcus de espécies não patogénicas(47). A prova
da coagulase pode ser feita em lâmina (10-15 segundos) ou em tubo (4h)(14). A prova da
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Prova da oxidase
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Prova da filamentação
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Para uma identificação imediata de Staphylococcus aureus usa-se o kit “Pastorex Staph-
plus®”. Trata-se de teste rápido de aglutinação para a deteção simultânea do fator de
coagulação, da proteína A e dos polissacarídeos capsulares do S. aureus. O reagente é composto
por partículas sensibilizadas com fibrinogénio, anticorpos IgG e anticorpos monoclonais
específicos contra os polissacarídeos capsulares, permitindo o reconhecimento de estirpes de
Staphylococcus aureus. Após a mistura entre colónias suspeitas e o reagente, é observada a
reação que, quando positiva, apresenta formação de aglomerados macroscopicamente visíveis e,
quando negativa, observa-se uma suspensão homogénea(52) (figura 34).
Prova de satelitismo
O Haemophillus influenza é uma bactéria fastidiosa que pode causar graves infeções,
especialmente em crianças menores de 5 anos(17). Este agente etiológico requer a presença de
fatores para o seu desenvolvimento: fator X (hemina) e fator V (NAD - nicotinamida adenina
nucleótido). Cresce bem em meio gelose de sangue, visto que lhe fornece as condições
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Neste equipamento são utilizados vários tipos de cartas de identificação (figura 37). As
turvações das suspensões variam consoante o tipo de carta (Quadro 8).
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Tal como no caso do sistema Vitek para preparar a análise através do equipamento
“WalkAway” é necessário efetuar uma suspensão com colónias do microrganismo em
estudo, em recipiente próprio de inoculação rápida com 3mL de solução salina, a qual é vertida
para um tabuleiro descartável. O painel é inoculado, utilizando o sistema RENOK®, e colocado
no equipamento, onde será incubado a 37ºC, aproximadamente, durante 24 horas. Após o
período de incubação, o painel pode ser interpretado fazendo uso de tecnologias de colorimetria
(leitura através de um espectrofotómetro com vários comprimentos de onda e fibras óticas) e
fluorimetria (leitura através de fluorescência)(57).
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Figura 41 Placa metálica para colocação das amostras no microflex MALDI-TOF MS(59)
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teste à novobiocina
teste à optoquina e à solubilidade da bílis
teste à bacitracina
teste à hidrólise da bílis-esculina e à tolerância ao sal
teste à fermentação da lactose
teste à produção de urease
Este teste é utilizado em caso de resultado negativo na prova da catalase com padrão α-
hemolítico:
Resultado sensível – Streptococcus pneumoniae
Resultado resistente – Enterococcus faecalis
45
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Este teste é utilizado em caso de resultado negativo na prova da catalase com padrão β-
hemolítico:
Resultado sensível – Streptococcus pyogenes
Resultado resistente – Streptococcus agalactiae
Este teste é utilizado em caso de resultado negativo na prova da catalase com padrão γ-
hemolítico
Resultado positivo: Enterococcus faecalis
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Antibiograma e Fungigrama
Painéis:
NC70 (Enterobacteriaceae)
NC71 (Não Enterobacteriaceae)
NUC69 (Bacilos Gram-negativo Urinários)
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Figura 47 Antibiograma/Fungigrama por método de difusão de disco e por método Etest, respetivamente(64)
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necessário confirmar os mesmos manualmente, como, por exemplo no caso dos antibióticos
amicacina, em Proteus spp resistente, e azitromicina, em Pseudomonas aeruginosa.
Serologia
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Widal Test
Weil-Felix Test
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Wright Test
O TPHA é um teste serológico treponémico que permite diagnosticar sífilis, uma doença
infeciosa provocada pela transmissão sexual de Treponema pallidum (bactéria Gram-negativo
do grupo das espiroquetas), em indivíduos com sintomas caraterísticos. O teste consiste em
colocar a amostra de soro (ou plasma, ou LCR) em contacto com eritrócitos de aves
estabilizados e sensibilizados com componentes antigénicos de Treponema pallidum altamente
purificados e verificar se, após incubação, ocorre uma reação de aglutinação, numa microplaca
descartável (figura 48). Uma reação é positiva quando os eritrócitos se depositam no fundo da
cavidade como um tapete, às vezes com bordas irregulares. A presença de aglutinação na
suspensão de eritrócitos indica a presença de anticorpos específicos anti-Treponema pallidum.
Uma reação é negativa quando os eritrócitos se depositam no fundo da cavidade formando um
botão. A ausência de aglutinação indica a ausência de anticorpos específicos anti-Treponema
pallidum, ou que estes existem abaixo do limite de deteção do teste.
Anticorpos inespecíficos provenientes de treponemas saprófitas que poderiam causar
resultados falso-negativos são absorbidos por componentes presentes no diluente estabilizador
dos eritrócitos estabilizados.
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anticorpos marcados com biotina; as etapas de lavagem eliminam os componentes não fixados;
a segunda reação consiste na interação entre a biotina e a estreptavidina conjugada com
fosfatase alcalina, a qual conduz à revelação da reação, através da hidrólise do substrato (4-
metil-umbeliferil fosfato) num produto (4-metl-umberilferona) cuja fluorescência emitida é
medida a 450nm. O valor do sinal de fluorescência é proporcional à quantidade de presentes na
amostra. Terminado o teste, os resultados são analisados automaticamente pelo sistema
informático.
IgG
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Caso o índice dê um resultado equivoco, o teste deve ser repetido. Se a verificação der
novamente uma interpretação equívoca, deve-se proceder a uma nova colheita de amostra e
consequentemente a uma nova análise.
IgM
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IgG
Caso o índice dê um resultado equivoco, o teste deve ser repetido. Se a verificação der
novamente uma interpretação equívoca, deve-se proceder a uma nova colheita de amostra e
consequentemente a uma nova análise.
Micobactérias
O Bacilo de Koch (BK) Mycobacterium tuberculosis é o agente etiológico da
tuberculose, que ataca normalmente os pulmões. Pertencente à família Mycobactereaceae, o BK
não cora pela coloração tradicional de Gram, devido à estrutura da sua parede celular ser mais
espessa e constituída por uma maior quantidade de lípidos(4,8,10,19,20,72). Deve ser realizada a
coloração de Ziehl-Nelseen para observação do BK (álcool-ácido resistente ou BAAR). A sua
pesquisa é efetuada quando existe suspeita de tuberculose a partir de produtos biológicos como
secreções brônquicas, expetoração, lavados, fragmentos de tecido, líquidos, exsudados, urina. O
produto deve ser pré-tratado, descontaminado e posteriormente semeado e analisado.
Pré-tratamento da amostra
O pré-tratamento da amostra é necessário para se conseguir uma produção máxima de
micobactérias, uma vez que os produtos biológicos enviados para análise, com suspeita de
infeção por micobactérias, estão contaminados com uma flora normal de crescimento rápido.
Este pré-tratamento engloba processos de digestão e descontaminação e é realizado com o kit
BD®BBL MycoPrep. Este processo, consiste, resumidamente em tratar os as amostras, em
câmara de fluxo laminar, com uma solução de descontaminação, constituída por hidróxido de
sódio e N-acetil-L-cisteína (agentes mucolíticos), em quantidades iguais de amostra e solução,
seguido de agitação no vortex e repouso durante 15 minutos; posteriormente, é adicionada uma
solução de tampão fosfato com pH=6,8 até à marca de 50mL e a amostra é centrifugada;
finalmente, o sobrenadante é decantado e, após ressuspenção do sedimento com um pouco de
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solução tampão, é adicionada uma gota de ácido clorídrico para ajustar o pH das amostras
(confirma-se a neutralidade com tiras de pH).
Sementeiras
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Lowenstein Jensen
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56), nomeadamente BARR. Contudo, para o resultado ser fornecido como positivo, é necessário
efetuar também um antibiograma, o qual é realizado em meio MGIT, utilizando um suplemento
de crescimento e antibióticos líquidos (estreptomicina, isoniazida, rifampicina, etambutol e
pirazinamida). Para a realização do antibiograma utiliza-se um controlo positivo, para que se
possam interpretar os resultados, isto é, se ocorrer crescimento no meio com controlo positivo e
não ocorrer nos meios com antibióticos, o microrganismo é considerado suscetível; se ocorrer
crescimento no meio com controlo positivo e nos meios com antibióticos, o microrganismo é
considerado resistente; se não ocorrer crescimento no meio com controlo positivo e ocorrer nos
meios com antibióticos, os resultados são considerados inválidos e será necessário repetir o
antibiograma.
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Controlo da Qualidade
O laboratório de análises clínicas deve assegurar que os resultados produzidos reflitam,
de forma fidedigna e consistente, a situação clínica apresentada pelos pacientes, assegurando
que não representem o resultado de alguma interferência no processo.
O Controlo de Qualidade é o conjunto de técnicas que são adotadas, para garantir a
fiabilidade dos resultados produzidos no laboratório. A validação dos resultados analíticos
implica o cumprimento de determinados princípios de boas práticas laboratoriais.
O laboratório de microbiologia do IPO Porto possui um sistema de qualidade que
engloba um conjunto de procedimentos de controlo de qualidade interno e está também inserido
em programas de controlo de qualidade externo.
Figura 57 Programas de CQE em que o Laboratório de Microbiologia do IPO Porto participa (79).
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Conclusão
61
Relatório de estágio – Microbiologia
Sérgio José Pinto Teixeira
Referências Bibliográficas
1. Serviço de Microbiologia | IPO-PORTO [Internet]. [cited 2017 Feb 17]. Available from:
http://www.ipoporto.pt/servico/microbiologia/
2. Carroll. Jawetz, Melnick, & Adelberg’s Medical Microbiology. 17th ed. McGraw-Hill
Education; 2016 p.
5. Engelkirk PG, Duben-Engelkirk J. Burton’s Microbiology for the Health Sciences. 10th ed.
Wolters Kluwer Health; 2015.
6. Snyder JW, Atlas RM. Handbook of Media for Clinical Microbiology [Internet]. 2006. 544 p.
Available from: http://books.google.com/books?hl=en&lr=&id=EiXPAYU9ragC&pgis=1
7. Ryan KJ, Ray CG. Sherris medical microbiology, 6th Ed. [Internet]. Sherris medical
microbiology. 2014. x, 994 . Available from:
http://www.loc.gov/catdir/description/mh031/2003054180.html%5Cnhttp://www.loc.gov/catdir/t
oc/mh031/2003054180.html%5Cnhttp://www.loc.gov/catdir/enhancements/fy0739/2003054180-
b.html
9. Buckley D, Madigan M, Martinko J. Brock Biology of Microorganisms. 14th ed. Vol. 53, Journal
of Chemical Information and Modeling. Pearson; 2015. 1689-1699 p.
10. Willey, Sherwood, Woolverton. Prescott’s Microbiology. Vol. 53, Journal of Chemical
Information and Modeling. 2013. 1689-1699 p.
15. Morello J a., Granato P a., Mizer HE. Laboratory Manual and Workbook in Microbiology:
Applications to Patient Care [Internet]. McGraw-Hill Science/Engineering/Math. 2002. Available
from:
http://scholar.google.com/scholar?hl=en&btnG=Search&q=intitle:Laboratory+Manual+and+Wor
kbook+in+Microbiology:+Applications+to+Patient+Care#0
17. Geo. F. Brooks , Janet S. Butel, Karen C. Carroll SAM y TAM. Microbiología Médica [Internet].
2011. 85-95 p. Available from:
https://books.google.com.mx/books?id=rHOEBgAAQBAJ&pg=PA89&dq=vías+de+fermentació
62
Relatório de estágio – Microbiologia
Sérgio José Pinto Teixeira
n&hl=es&sa=X&redir_esc=y#v=onepage&q=vías de fermentación&f=false
18. . The bacterial cell wall. (a) The Gram-positive envelope. (b)... - Figure 1 of 6 [Internet]. [cited
2017 Feb 17]. Available from: https://www.researchgate.net/figure/221794421_fig1_Fig-1-The-
bacterial-cell-wall-a-The-Gram-positive-envelope-b-The-Gram-negative
19. Engelkirk P, Duben-Engelkirk J. Burton’s Microbiology for the Health Sciences. 10th ed.
Philadelphia: Wolters Kluwer Health; 2015.
22. BinaxNOW Legionella Product Demo - Alere [Internet]. [cited 2017 Feb 17]. Available from:
http://www.alere.com/en/home/support/product-demos/binaxnow/binaxnow-legionella-ous-
html5.html
23. BinaxNOW S. pneumoniae Product Demo - Alere [Internet]. [cited 2017 Feb 17]. Available
from: http://www.alere.com/en/home/support/product-demos/binaxnow/binaxnow-s-pneumoniae-
ous-html5.html
24. Carroll KC, Hobden JA, Miller S, Morse SA, Mietzner TA, Detrick B, et al. Medical
Microbiology. 2013. 867 p.
26. CERTEST Biotec » Clostridium difficile antigen GDH [Internet]. [cited 2017 Feb 17]. Available
from: http://www.certest.es/products/clostridium-difficile-antigen-gdh/
29. bioMérieux - Culture Media | product - CLED agar [Internet]. [cited 2017 Feb 17]. Available
from: http://www.biomerieux-culturemedia.com/product/28-cled-agar
30. Klebsiella pneumoniae on Cystine Lactose Electrolyte Deficient Agar (C.L.E.D Agar) | Medical
Laboratories [Internet]. [cited 2017 Feb 17]. Available from: http://www.medical-
labs.net/klebsiella-pneumoniae-on-cystine-lactose-electrolyte-deficient-agar-c-l-e-d-agar-2195/
31. Micrococcus luteus on C.L.E.D. Agar [Internet]. [cited 2017 Feb 17]. Available from:
https://farm8.static.flickr.com/7032/6797431831_15a76f25ce_b.jpg
32. Pseudomonas aeruginosa CLED [Internet]. [cited 2017 Feb 18]. Available from:
https://www.google.pt/search?q=Pseudomonas+aeruginosa+CLED&tbm=isch&tbo=u&source=u
niv&sa=X&ved=0ahUKEwiN07et0prSAhXCXhoKHRO2D0MQsAQIKw&biw=1242&bih=580
#imgrc=GropQ0Tgr0nZUM:
33. Cultivation Media for Bacteria [Internet]. [cited 2017 Feb 17]. Available from:
http://learn.chm.msu.edu/vibl/content/differential/
63
Relatório de estágio – Microbiologia
Sérgio José Pinto Teixeira
34. Hib colonies on chocolate agar, Haemophilus influenzae colonies in pure culture cultivated on
chocolate agar. [Internet]. [cited 2017 Feb 17]. Available from:
http://www.microbiologyinpictures.com/bacteria photos/haemophilus influenzae
photos/HAIN2.html
35. Description of the 12 bacterial genes identified by the PCR test [Internet]. [cited 2017 Feb 17].
Available from: https://www.landbrugsinfo.dk/kvaeg/maelkekvalitet/sider/description-of-the-12-
bacterial-genes-identified-by-the-pcr-test.aspx
36. A virulent strain of Streptococcus pneumoniae (pneumococcus) growing on blood agar. Colonies
with alpha hemolysis. Pure culture streaked on blood agar plate. S.pneumoniae (pneumococcus)
appearance. [Internet]. [cited 2017 Feb 17]. Available from:
http://www.microbiologyinpictures.com/bacteria photos/streptococcus pneumoniae
photos/STPN2.html
37. Escherichia Coli Bacteria Colonies On Macconkey Agar Culture Dish Lactose Fermenters Are
Red Foto de stock | Getty Images [Internet]. [cited 2017 Feb 17]. Available from:
http://www.gettyimages.pt/detail/foto/escherichia-coli-bacteria-colonies-on-macconkey-
fotografia-de-stock/vis25879
38. Klebsiella spp [Internet]. [cited 2017 Feb 17]. Available from:
http://pt.slideshare.net/HiwrHastear/klebsiella-spp/10
40. Mannitol Salt Agar (MSA): Composition, uses and colony characteristics - microbeonline
[Internet]. [cited 2017 Feb 17]. Available from: http://microbeonline.com/mannitol-salt-agar-
msa-composition-uses-and-colony-characteristics/
43. Know your culture – a quick reference guide – MicrobeBlog [Internet]. [cited 2017 Feb 17].
Available from: https://microbeblog.org/2016/05/09/know-your-culture-a-quick-reference-guide/
44. Medios cromogénicos - chromID Salmonella - bioMérieux España S.A. [Internet]. [cited 2017
Feb 17]. Available from:
http://www.biomerieux.es/servlet/srt/bio/spain/dynPage?open=SPN_CLN_PRD&doc=SPN_CLN
_PRD_G_PRD_CLN_123&pubparams.sform=6&lang=es#
45. Pommerville J. Alcamos’s Fundamentals of Microbiology [Internet]. Vol. 94. Jones and Barlet
Publishers; 2007. 9 p. Available from:
http://linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/S0022391305001745
64
Relatório de estágio – Microbiologia
Sérgio José Pinto Teixeira
46. Catalase Test [Internet]. [cited 2017 Feb 17]. Available from:
http://iws2.collin.edu/dcain/CCCCD Micro/catalase_test.htm
47. Sullivan JOEH, Graham TJ. Microbiology: An Evolving Science. Vol. 2624.
48. .::Microbiologia::.: Prova da Coagulase [Internet]. [cited 2017 Feb 18]. Available from:
http://microbiologiabrasil.blogspot.pt/2009/01/teste-da-coagulase.html
49. BD. BBL DrySlide Oxidase [Internet]. 2005 [cited 2017 Feb 18]. Available from:
https://bd.com/europe/regulatory/Assets/IFU/US/L000146(0905)_PT.pdf
50. Fumouze Diagnostics har hurtigtest for identifikation af de vaesentligste Candida svampe.
51. Quindos G, San Millan R, Robert R, Bernard C, Ponton J. Evaluation of Bichro-latex Albicans, a
New Method for Rapid Identification of Candida albicans. J Clin Microbiol. 1997;35(5):1263–5.
52. Website W, Bio-Rad US, Australia -800-2bio-. Pastorex TM Staph Plus Direct Identification
Visibly Reliable Pastorex TM Staph Plus. 1629;61(0):61–717.
53. SLIDEX® - aglutinação em látex | bioMérieux Brasil [Internet]. [cited 2017 Feb 18]. Available
from: http://www.biomerieux.com.br/veterinaria/slidexr-aglutinacao-em-latex
54. X and V factor test for Haemophilus: Principle, Procedure and Results - microbeonline
[Internet]. [cited 2017 Feb 18]. Available from: http://microbeonline.com/x-v-factor-test-
haemophilus-principle-procedure-results/
55. VITEK 2 Compact | bioMérieux Portugal [Internet]. [cited 2017 Feb 18]. Available from:
http://www.biomerieux.pt/produto/vitek-2-compact
56. VITEK 2 ANC ID card - clinical diagnostics products | bioMérieux Clinical Diagnostics
[Internet]. [cited 2017 Feb 18]. Available from: http://www.biomerieux-diagnostics.com/vitek-2-
anc-id-card
57. Beckman Coulter Diagnostics Highlights Automation and Workflow Benefits of its MicroScan
Microbiology Solutions at ECCMID 2016 [Internet]. [cited 2017 Feb 18]. Available from:
http://www.selectscience.net/industry-news/beckman-coulter-diagnostics-highlights-automation-
and-workflow-benefits-of-its-microscan-microbiology-solutions-at-eccmid-2016/?artID=40687
58. [Microbiology] Atlas of Antimicrobial Susceptibility Testing | Atlas for Medical [Internet]. [cited
2017 Feb 18]. Available from: http://www.tuyenlab.net/2016/08/microbiology-atlas-of-
antimicrobial.html
62. Biomedicina Padrão [Internet]. [cited 2017 Feb 18]. Available from:
http://oddish3.rssing.com/chan-3342108/all_p6.html
63. Teste da hidrólise da bile esculina [Internet]. [cited 2017 Feb 18]. Available from: https://s-
65
Relatório de estágio – Microbiologia
Sérgio José Pinto Teixeira
media-cache-ak0.pinimg.com/originals/12/27/7d/12277d6f79959825ef020626abe092ba.jpg
65. Widal Test- Introduction, Principle, Procedure, Interpretation and Limitation [Internet]. [cited
2017 Feb 18]. Available from: http://www.microbiologyinfo.com/widal-test-introduction-
principle-procedure-interpretation-and-limitation/
66. Weil Felix Test: Principle, Procedure and limitation - microbeonline [Internet]. [cited 2017 Feb
18]. Available from: https://microbeonline.com/weil-felix-test-principle-procedure-limitation/
67. Serology for Brucellosis [Internet]. [cited 2017 Feb 18]. Available from:
http://www.healthline.com/health/serology-for-brucellosis#Reliability7
68. Treponema pallidum particle agglutination assay - Wikipedia [Internet]. [cited 2017 Feb 18].
Available from: https://en.wikipedia.org/wiki/Treponema_pallidum_particle_agglutination_assay
69. Leboffe MJ, Pierce BE. A Photographic Atlas for the Microbiology Laboratory. 4th ed. Morton
Publishing; 2011. 1-266 p.
70. FTA-ABS Test: Principle, Procedure, Results and Interpretation - microbeonline [Internet]. [cited
2017 Feb 19]. Available from: https://microbeonline.com/fluorescent-treponemal-antibody-
absorption-fta-abs-test/
71. CDC - Toxoplasmosis [Internet]. [cited 2017 Feb 19]. Available from:
https://www.cdc.gov/parasites/toxoplasmosis/
72. Lyme Disease | Lyme Disease | CDC [Internet]. [cited 2017 Feb 19]. Available from:
https://www.cdc.gov/lyme/index.html
73. Bacterial identification system - BACTECTM MGITTM 960 - BD [Internet]. [cited 2017 Feb 19].
Available from: http://www.medicalexpo.com/prod/bd/product-71022-622519.html
75. BD (Becton, Dickinson and Company) - Diagnostic Systems: BBLTM MGITTM Mycobacteria
Growth Indicator Tube [Internet]. [cited 2017 Feb 19]. Available from:
http://www.bd.com/ds/productCenter/245111.asp
76. Meios de Cultura - Biomedicina Brasil [Internet]. [cited 2017 Feb 19]. Available from:
http://www.biomedicinabrasil.com/2010/09/meios-de-cultura.html
77. Tuberculosis pictures. Mycobacterium tuberculosis, MT, growth on solid media. [Internet]. [cited
2017 Feb 19]. Available from: http://www.microbiologyinpictures.com/bacteria
photos/mycobacterium tuberculosis photos/MYTU9.html
78. Tuberculosis Test and Research with Primo Star iLED [Internet]. [cited 2017 Feb 19]. Available
from: https://www.zeiss.com/microscopy/us/products/light-microscopes/primo-star-iled.html
79. United Kingdom National External Quality Assessment Service (UK NEQAS) - Group Website
[Internet]. [cited 2017 Feb 19]. Available from:
http://www.ukneqas.org.uk/content/Pageserver.asp
66
Relatório de estágio – Microbiologia
Sérgio José Pinto Teixeira
67
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