Imunohematologia
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Politécnico do Porto
Relatório de Estágio
Imunohematologia
Índice Geral
INTRODUÇÃO ....................................................................................................................... 1
CARACTERIZAÇÃO DA INSTITUIÇÃO ACOLHEDORA .................................................................................... 1
FUNCIONAMENTO DO CENTRO DE SANGUE DO IPST................................................................................ 2
Laboratório de Agentes Transmissíveis ................................................................................... 5
Laboratório de Imunohematologia ......................................................................................... 6
Laboratório de Criobiologia ..................................................................................................... 6
Laboratório de Imunologia Plaquetária .................................................................................. 7
OBJETIVOS ........................................................................................................................... 7
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Resultados ............................................................................................................................. 25
Interpretação dos resultados ................................................................................................ 25
TESTE DE ANTIGLOBULINA HUMANA .................................................................................................. 26
Teste de Antiglobulina Humana Direto ................................................................................. 26
TAD positivo – continuação do estudo .............................................................................................................................27
TAD Monoespecíficos ..................................................................................................................................................27
Classificação da subclasse de IgG .................................................................................................................................28
Determinação do título de IgG presente .....................................................................................................................28
Caso prático 3 – TAD ............................................................................................................. 29
Teste de Antiglobulina Humana Indireto .............................................................................. 30
PESQUISA DE ATC IRREGULARES ........................................................................................................ 31
IDENTIFICAÇÃO DE ATC IRREGULARES.................................................................................................. 32
Identificação de atc em meio AGH ........................................................................................ 33
Identificação de anticorpos em meio salino e/ou enzimas ................................................... 33
CASO PRÁTICO 4 – PESQUISA E IDENTIFICAÇÃO DE ATC .......................................................................... 34
TITULAÇÃO DE ATC ......................................................................................................................... 35
CASO PRÁTICO 5 – TITULAÇÃO DE ATC ............................................................................................... 35
ELUIÇÃO ÁCIDA .............................................................................................................................. 36
OUTROS SISTEMAS SANGUÍNEOS ....................................................................................................... 37
Sistema Lewis ........................................................................................................................ 37
Sistema I ................................................................................................................................ 38
Sistema P ............................................................................................................................... 38
Sistema Duffy ........................................................................................................................ 39
Sistema Kidd .......................................................................................................................... 39
Sistema MNSs ........................................................................................................................ 40
Sistema Luterano ................................................................................................................... 41
Sistema Diego ........................................................................................................................ 41
Sistema Xg ............................................................................................................................. 42
FENOTIPAGEM ALARGADA................................................................................................................ 42
PROVAS DE COMPATIBILIDADE .......................................................................................................... 42
Cado prático 6 – Provas de compatibilidade ......................................................................... 43
ROTINA DE AMOSTRAS DE DADORES .................................................................................. 44
PRIMEIRAS DÁDIVAS ....................................................................................................................... 45
DADORES CONHECIDOS ................................................................................................................... 45
EQUIPAMENTOS AUTOMATIZADOS .................................................................................................... 46
Sysmex XT-1800i® .................................................................................................................. 46
Beckman Coulter®PK7300® ................................................................................................... 46
ORTHO AutoVue® Innova System .......................................................................................... 47
NEO – Immucor Gamma® ..................................................................................................... 47
ESTUDOS PRÉ-TRANSFUSIONAIS ......................................................................................... 48
AUTOADSORÇÃO............................................................................................................................ 49
ALOADSORÇÃO .............................................................................................................................. 49
CONTROLO DA QUALIDADE ................................................................................................ 51
CONTROLO DA QUALIDADE INTERNO ................................................................................................. 51
CONTROLO DA QUALIDADE EXTERNO ................................................................................................. 52
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CONCLUSÃO ....................................................................................................................... 53
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Índice de Figuras
Figura 12. Representação esquemática das alterações dos epítopos dos atg D ------------------------------20
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Figura 21. Kits de células reagentes ID – “DiaCell I-II-III” e ID – “DiaCell I-II-III” ---------------------31
Figura 23. Kit DiaCidel: solução de lavagem, solução de eluição ácida e solução tampão ---------------35
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Índice de Quadros
Quadro 1. Principais caracteristicas dos atc das classes IgG e IgM --------------------------------------------9
Índice de Tabelas
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Siglas e abreviaturas
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Introdução
Serve o presente relatório para descrever, sinteticamente, o trabalho realizado ao longo
do estágio da valência de Imunohematologia, que faz parte da Unidade Curricular de Educação
Clínica III, e relacioná-lo com os conhecimentos apreendidos.
A Educação Clínica III é uma unidade curricular de regime obrigatório e anual, inserida
no plano de estudos do 4º ano da Licenciatura de Análises Clínicas e Saúde Pública da Escola
Superior de Saúde do Porto (ESS) do Politécnico do Porto (P. Porto).
O estágio proporciona ao aluno, futuro profissional de Análises Clínicas, o contacto
alargado com a prática profissional, permitindo que este aprofunde e integre os conhecimentos
adquiridos ao longo da sua formação académica, no âmbito do exercício profissional,
supervisionado.
O presente estágio curricular foi realizado num período de quatro semanas, de 24 de
outubro a 18 de novembro de 2016, no laboratório de imunohematologia do Instituto Português
do Sangue e Transplantação (IPST).
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de saco e agulha estéril de utilização única. Para a dádiva, podem ser colhidos cerca de 470 mL
de sangue total, ou componentes sanguíneos (plaquetas, glóbulos vermelhos ou plasma) por
aférese(1).
O sistema de aférese consiste em colher seletivamente uma pequena percentagem de um
componente sanguíneo (plaquetas, glóbulos vermelhos ou plasma), com a ajuda de um aparelho
automático – separador celular – sendo os restantes componentes sanguíneos restituídos ao
dador, através da mesma punção.
Existem três tipos de aférese:
Plaquetaférese - doação de plaquetas – as plaquetas são células sanguíneas que controlam a
hemorragia. Destinam-se a doentes com leucemia, linfoma, cancro, doentes sujeitos a cirurgia
cardíaca ou transplante de medula óssea. São substituídas 48 horas após a dádiva.
Eritraférese - doação de glóbulos vermelhos – os glóbulos vermelhos são células sanguíneas
que têm como função transportar o oxigénio. Destinam-se a doentes politraumatizados,
submetidos a cirurgias, doentes transplantados, com doenças crónicas como leucemia ou outra
forma de cancro.
Plasmaférese - doação de plasma – o plasma é o componente líquido que contém as
proteínas plasmáticas. É administrado a doentes traumatizados queimados, recetores de
transplante de órgãos e doentes com alterações de coagulação.
A aférese é uma técnica bastante segura, supervisionada durante todo o procedimento por
uma equipa atenta e treinada. Todo o material utilizado é esterilizado e eliminado após cada
doação, sendo impossível contrair alguma doença. Demora entre 30 a 50 minutos, conforme o
tipo de dádiva selecionada. É mais demorada que a colheita de sangue total, embora com
grandes vantagens para os doentes que necessitam de transfusão sanguínea(4). As dádivas por
aférese costumam ser realizadas por dadores cujo perfil sanguíneo é previamente conhecido.
Nas dádivas de sangue, a colheita é efetuada para um sistema de sacos múltiplos que
permite que o processo seja feito em circuito fechado e estéril, garantindo qualidade e segurança
máximas ao processo. O sistema de sacos contém uma solução de anticoagulante
e conservante, para evitar coagulação e aumentar tempo de vida útil. O saco fica em cima de
uma balança que monitoriza a dádiva. Assim que o volume de sangue colhido atinge o volume
pretendido, um sistema eletrónico gera um sinal sonoro.
Paralelamente, são ainda colhidos quatro tubos de sangue para a realização de análises
obrigatórias por lei:
✓ tubo com tampa amarela - serologia vírica;
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Além das dádivas, o IPST possui recursos para estudar casos clínicos relacionados com
reações transfusionais ou outro tipo de reações que possam ocorrer no sangue do doente.
A área laboratorial do centro de sangue do IPST é constituída por quatro laboratórios:
✓ Laboratório de Agentes Transmissíveis:
✓ Laboratório de Serologia Vírica e Laboratório de Rastreio Genómico
Viral - rastreio de dadores de sangue;
✓ Laboratório de Biologia Molecular e Laboratório de testes confirmatórios
- serviço requisitado pelo exterior e estudos confirmatórios pertencentes a
dadores/doentes.
✓ Laboratório de Imunohematologia;
✓ Laboratório de Criobiologia - Banco de Sangue de Grupos Raros;
✓ Laboratório de Imunologia Plaquetária.
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Laboratório de Imunohematologia
Laboratório de Criobiologia
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Objetivos
Os objetivos desta valência de estágio são os seguintes:
✓ Aplicar, aperfeiçoar e consolidar os conhecimentos adquiridos ao longo do curso;
✓ conhecer as análises obrigatórias por lei (serologia e imunohemoterapia);
✓ programar, aplicar e avaliar:
✓ técnicas para a determinação do sistema ABO, Rh e outros sistemas;
✓ técnicas para a pesquisa e identificação de atc eritrocitários;
✓ provas de compatibilidade pré-transfusionais;
✓ reações de Coombs direta e indireta;
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Dependendo da origem dos atgs estimuladores, os atc formados podem ser classificados
em:
✓ aloanticorpos – atc produzidos contra atg conhecidos como “não próprios”,
provenientes de indivíduos da mesma espécie;
✓ autoanticorpos – atc produzidos por atg do próprio indivíduo;
✓ heteroantitcorpos – atc produzidos contra atg de indivíduos de espécies
diferentes.
Os atc podem ser agrupados em cinco classes principais (IgA, IgD, IgE, IgG e IgM). Os
de maior interesse para a medicina transfusional são IgG e IgM(11,12) (quadro 1).
Pentâmero
Reage melhor a frio (4-10 ºC)
Bom ativado complemento
Não atravessa a placenta
Normalmente não têm significado clínico
(exceto grupo ABO)
A reação atg-atc que está na base da imunohematologia pode provocar vários resultados,
como por exemplo:
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Figura 3 Representação esquemática dos efeitos da variação de concentração de atg e atc na aglutinação (15).
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Técnica em tubo
Embora este seja o método de referencia, não é o mais usado porque é pouco sensível e
sujeito a inúmeras interferências. Exige que se lavem muito bem as células, para não
comprometer os resultados, acabando por ser a técnica mais demorada. Além disso, a leitura dos
resultados é mais difícil, comparando com as outras técnicas, visto depender da iluminação do
local e do próprio observador(14,17).
A leitura dos resultados das reações efetuadas em tubo consiste na observação da
existência ou não de aglutinados, sendo depois atribuída uma avaliação semi-quantitativa, com
valores de intensidade/força de reação entre 0 e 4+ (figura 4)(18). Os resultados negativos devem
ser confirmados em microscópio ótico.
Técnica em gel
Trata-se de uma técnica revolucionária, de mais fácil leitura, maior sensibilidade, com
resultados eficientes e seguros e sem a necessidade de lavar as células(19). É efetuada em cards
que contêm o meio em gel. Os resultados podem ser interpretados como positivos, negativos ou
mixed-field (figura 5)(9,10). A figura 6 ilustra o exemplo de um resultado mixed-field, obtido de
um doente que tinha efetuado uma transfusão há dois meses(20).
A cassete com microesferas (ex: cassetes da Ortho) tem um princípio metodológico
muito semelhante ao do card em gel, diferindo apenas na matriz que constitui o poço, nos
tempos de incubação e na centrifugação.
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Figura 5 Interpretação dos resultados no método de aglutinação em coluna (de gel ou microesferas).
A aglutinação apresenta vários graus, de 0 a 4+(19).
Figura 6 Exemplo de uma dupla população (mixed-field) num card de determinação de grupo ABO de uma doente
transfundido recentemente(20).
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Técnica em microplacas
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aglutinados pelo soro de outras, enquanto noutras situações, nada acontecia. Com base nas
reações observadas Landsteiner dividiu as amostras de sangue em três grupos, denominando-os
grupos A, B, e O(7). Descobriu a existência de dois atgs, A e B, presentes nos eritrócitos,
leucócitos e plaquetas, e dois atc, anti-A e anti-B. A descoberta do sistema ABO por
Landsteiner, marcou o início das transfusões de sangue seguras(7,13).
Este sistema engloba 4 grupos principais: A, B, AB e O (figura 8). Os seus
atgs são produtos indiretos dos alelos IA e IB que se encontram no braço longo do
cromossoma 9, sendo que cada alelo é herdado por cada um dos progenitores. Os genes A
e B têm caráter codominante, sendo dominantes sobre o O, que é recessivo. O gene O é
silencioso, pois não é detetado nenhum atg produzido por esse gene(7,8,13,22). Este deve ser
estudado em simultâneo com os sistemas H e Lewis, tendo em conta que os seus atgs têm a
mesma natureza bioquímica (carbohidratos) e se encontram associados(6).
Os determinantes antigénicos A e B são estruturas de carbohidratos presentes na
membrana dos eritrócitos. As cadeias de carbohidratos são sintetizadas pela ação de
glicosiltransferases, enzimas que catalisam a transferência de monossacarídeos específicos de
um nucleótido dador para um substrato aceitador, o atg H(7). O gene A produz uma α1,3-N-
acetilgalactosaminiltransferase que transfere uma N-acetil-galactosamida para uma unidade D-
galactose da substância H, produzindo assim o atg A, o gene B produz uma α1,3
galactosiltransferase que é responsável pela ligação de uma D-galactose à porção de D-
galactose presente na substância H, originando o atg B. Relativamente ao grupo O, as enzimas
produzidas não são ativas e, consequentemente, a substância H permanece não convertida, não
havendo produção de atgs(7,8,13,22). A presença de substância H é determinada pela presença do
gene H (FUT1), independente do locus ABO, presente no cromossoma 19. O gene H é
extremamente comum (99,9%) e quase todas as pessoas possuem substância H nos seus
eritrócitos, sendo H/H ou H/h. No entanto, existem indivíduos que são homozigóticos para o
gene inativo h (h/h) e não conseguem produzir a enzima necessária para a ligação da fucose e,
portanto, não possuem substância H. Consequentemente, estes indivíduos não conseguem
produzir os atgs A, B e H (grupo O) (figura 9), e possuem consistentemente atc anti-A, anti-B e
anti-H na circulação. Este é designado o fenótipo de Bombay (Oh)(6,7,23).
Existem vários subgrupos ABO, que são fenótipos que diferem na quantidade de atg A e
B existentes na membrana dos eritrócitos. Entre os subgrupos de A e de B, os do grupo A são
mais comuns. Os subgrupos de maior prevalência na população são o A1 e o A2(7).
Relativamente a estes subgrupos, verifica-se que a enzima A2 transferase é menos eficiente que
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e B presentes nas células da amostra (eritrócitos), por aglutinação destas células com
antissoros conhecidos anti-A, anti-B e anti-A,B (este último não é obrigatório). A prova reversa
(ou prova indireta) consiste em pôr em evidência os atc anti-A e anti-B presentes no
plasma da amostra com a ajuda de células conhecidas A1, A2, B e O, não sendo obrigatória a
utilização de células A2 e O. As células A2 são habitualmente usadas na identificação do anti-
A1, no plasma de indivíduos do grupo A. As células O são utilizadas para identificação de
aglutinações devidas a atc não ABO(7,11).
Para se poder validar o grupo, as provas direta e reversa têm que ser concordantes. Em
caso de discrepância, o grupo ABO não pode ser definido, devendo realizar-se os estudos
necessários para, de forma inequívoca, esclarecer a situação(7,13). Nos casos em que se suspeite
da presença de subgrupos de A, a distinção entre A1 e A2 pode ser realizada pela utilização de
anti-soro anti A1 (lectina A – Dolichos biflorus) que aglutina células com atg A1, mas não com
as de atg A2 (figura 10).
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Determinação do Rh D
O sistema Rh é altamente imunogénico, complexo e polimórfico. Dos mais de 50 atg
que o compõem, os principais são: D, C, E, c e e. A seguir ao ABO, é o mais importante em
medicina transfusional. Os atg do sistema Rh são parte integrante das proteínas da membrana
eritrocitária, estando presentes nos eritrócitos do feto a partir da 8ª – 10ª semana de
gestação(7,22,29). São codificados por 2 genes RHD e RHCE próximos, com orientação oposta e
separados pelo gene SMP1 (figura 11), localizados no cromossoma 1p34-1p36(30).
O RHD não possui alelos e codifica o atg D. O RHCE possui vários alelos, e codifica os
atg codominantes C e E, em várias combinações (ce, Ce, cE e CE)(7,30). A grande proximidade e
homologia entre os genes RHD e RHCE permite a formação de alelos RHD híbridos, levando à
produção de atg D diversificados. Os termos Rh+ e Rh- referem-se, respetivamente, à presença e
ausência do atg D(7,13,30).
A expressão dos atg do sistema Rh na membrana dos eritrócitos é determinada pela sua
associação à glicoproteína RhAG (produto do gene RHAG, localizado no cromossoma 6). Esra
glicoproteína é importante para fixar os atg RhD e RhCE à membrana do eritrócito. A sua
ausência na membrana eritrocitária, devido a mutações que inativam o gene que a codifica,
impede a expressão dos atg do sistema Rh, resultando no fenótipo raro Rhnull(7,13,31). Existem 3
mecanismos moleculares de negatividade do RHD:
✓ deleção total do gene RHD;
✓ pseudogene RHDψ (mutação no gene RHD leva à não produção de proteína);
✓ genes híbridos (possibilidade de geração de novos atg no sistema Rh, alteração
ou diminuição da expressão dos atg)(32).
As funções das proteínas do sistema Rh e da proteína RhAG ainda não são totalmente
conhecidas, mas pensa-se que o complexo Rh-RhAG esteja associado ao transporte da
amónia(32).
A formação de atc anti-D não ocorre naturalmente, sendo sempre resultado de um
estímulo imune, através do contacto de sangue Rh negativo com Rh positivo. Os
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atc do sistema Rh são normalmente da classe IgG (pelo que reagem melhor a 37ºC), embora em
alguns casos possa surgir uma componente de IgM. A força da reação é maior
em meios de baixa força iónica, como Liss, utilização de enzimas proteolíticas e
polietilenoglicol (PEG)(7,13). Habitualmente os atc surgem após imunização durante a gravidez
ou transfusão.
Numa transfusão sanguínea de um dador RhD positivo para um doente RhD negativo,
podem-se gerar atc anti-D. Se se tratar de um primeiro contacto (atg-atc), ocorre a
sensibilização. Num contacto seguinte, o anti-D produzido vai-se ligar mais fortemente ao atg,
conduzindo a uma reação transfusional grave(6,7,13).
Numa situação de gravidez em que mãe é Rh negativo, mas o seu feto é Rh positivo, se a
mãe já tiver desenvolvido atc anti-D (gravidez anterior ou transfusão), estes podem atravessar a
placenta e hemolisar ou aglutinar os eritrócitos do feto(7,33). Neste caso, as medidas profiláticas
aplicadas comumente são:
✓ minimizar o risco de troca sanguínea feto-materna;
✓ uso de imunoglobulina Rh (IgG anti-D) em gestantes Rh negativas, a partir do 3º
trimestre de gravidez e em outros eventos potencialmente sensibilizantes(34).
D variante
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Variante D parcial
Figura 12 Representação esquemática das alterações dos epítopos dos atg D, nos fenótipos D fraco e D parcial (36).
Variante Del
Os eritrócitos Del são caracterizados por terem uma expressão fraca do atg RhD, devido
a várias mutações que impedem a integração do atg D na membrana do eritrócito. Não são
detetados por métodos serológicos de rotina, mas sim por testes de adsorção e eluição com anti-
D e por genotipagem(6,7,13).
Investigação do D variante
Os indivíduos com fenótipo D variante devem ser clarificados acerca do seu significado,
uma vez que ele difere consoante sejam dadores ou doentes.
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D variante em dadores
No caso dos dadores classifica-se como RhD positivas as unidades de sangue com
pesquisa positiva do atg D ou D variante e como RhD negativas as unidades com pesquisa
negativa do atg D e D variante.
Por norma, são realizadas duas determinações com antissoros diferentes e em caso de
discrepância entre os resultados obtidos com os dois soros anti-D, o teste deve ser repetido e,
em caso de dúvida, a unidade deve ser classificada como RhD positiva, podendo ser utilizada. A
execução de estudos serológicos de investigação ou de biologia molecular para caracterização
do atg RhD não devem retardar a utilização da unidade(7,23).
D variante em doentes/grávidas
Para identificar indivíduos com fenótipo D fraco (Du), é necessário realizar um teste de
antiglobulina indireto. Em paralelo, deve ser realizado um controlo positivo e negativo. O
resultado da pesquisa do D fraco só pode ser validado mediante um resultado do teste de
antiglobulina humana direto (TAD) negativo(7,13,37).
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Prova direta
Card: ID-Card “ABO/Rh” da Diamed. Este card permite, num único passo, a determinação do
perfil ABO/RhD, incluindo a confirmação do RhD. O primeiro anti-D pode comprovar a
variante DVI, o segundo anti-D é negativo para a variante DVI. O micropoço ctl é o controlo
negativo.
Tubos: anti-soros Anti-A, Anti-B, e Anti-A,B da Immucor. O uso do anti-soro Anti-A,B pode
ser facultativo dependo do regulação especifica do local. A sua utilização é, no entanto, bastante
útil na confirmação de resultados obtidos com Anti-A e Anti-B, para uma maior segurança da
determinação do grupo ABO.
Resultados
- - - 4+ 4+ -
- - - 4+ 4+ -
Prova reversa
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Resultados
4+ 4+
4+ 4+
Tipagem Rh
A prova direta revela a ausência de atg A e B e a prova reversa mostra que estão
presentes ambos os atc.
Dada a concordância entre a prova direta e a prova reversa, é possível afirmar que se
trata de um grupo O.
A presença do atg D no card “ABO/Rh” e na prova em tubo, indica tratar-se de uma
amostra do grupo RhD (Rh positivo).
Conclui-se que o grupo sanguíneo da amostra em teste é O RhD (Rh positivo).
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Sistema Kell
O sistema Kell é constituído por seis conjuntos de atg de elevada e baixa prevalência:
K (KEL) e k (Cellano);
Kpa, Kpb e Kpc;
Jsa e Jsb;
K11 e K17;
K14 e K24;
VLAN/VONG,
em que os três primeiros apresentam importância clínica, e a negrito estão representados
os de elevada prevalência(7,22).
Os atg Kell estão bem desenvolvidos ao nascimento e são expressos, principalmente, na
superfície da membrana dos eritrócitos e também, nos órgãos linfóides, cérebro, coração e
músculo esquelético(11).
O sistema Kell pode apresentar os fenótipos:
✓ null (K0): nenhum dos atg do sistem Kell está presente; não se deteta a
glicoproteína Kell na membrana dos eritrócitos;
✓ McLeod: subexpressão dos atg Kell; ligada ao cromossoma X;
Ambos os fenótipos podem sofrer imunização e produzir atc anti-Ku e anti-Kx,
respetivamente.
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Os atc deste sistema são normalmente IgG. São detetados em meio AGH, a 37ºC e têm
significado clínico considerável, principalmente o anti-K, uma vez que podem causar:
✓ Reações Hemolíticas Transfusionais extravasculares (RHT);
✓ Doença Hemolítica do Recém-Nascido (DHRN).
Pacientes com atc contra atg do sistema Kell devem ser transfundidos com eritrócitos
sem o(s) atg correspondente(s) a esse(s) atc(7,16,23).
Resultados
C c E e K controlo
4+ - - 4+ - -
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O TAD permite evidenciar a presença de atc adsorvidos aos eritrócitos circulantes, alo-
anticorpos ou autoanticorpos (eritrócitos sensibilizados “in vivo”). Neste teste são utilizados
reagentes com características específicas, que possibilitam aumentar a força de reação entre atg
e atc.
O soro de AGH (ou soro de Coombs) está presente na realização deste teste, que ao
reagir com os atc que se encontram a sensibilizar as células, provoca aglutinação. A AGH reage
com a porção Fc do atc IgG, ou com os componentes do complemento levando à
aglutinação dos eritrócitos sensibilizados.
Para potenciar estas forças, podem ainda ser adicionados outros reagentes que diminuem
o potencial zeta entre atg e atc. O objetivo deste teste é demonstrar “in vitro” eritrócitos
sensibilizados por imunoglobulinas “in vivo” (figura 13)(7,13,37,38).
Esta prova é realizada nos estudos da DHRN, em que se verifica a sensibilização dos
eritrócitos fetais pelos anticorpos maternos; de Anemias Hemolíticas Autoimunes (AHAI), em
que se verifica a sensibilização dos eritrócitos pelos próprios anticorpos (autoanticorpo) e no
estudo de RHT, em que há sensibilização dos eritrócitos do dador pelos anticorpos do recetor.
Reações pós-transfusionais hemolíticas tardias são também uma causa de TAD
positivo. Se um atg presente nas células transfundidas for capaz de induzir uma
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TAD Monoespecíficos
Geralmente, um TAD positivo com AGH poliespecífica indica que os eritrócitos estão
sensibilizados “in vivo” com imunoglobulina e/ou complemento. Para diferenciar a reação, são
utilizados reagentes AGH monoespecíficos, tais como anti-IgG, anti-IgA, anti-IgM, anti-C3c e
anti-C3d. Estes reagentes encontram-se em suspensão no gel do ID Card “DC Screening I”
(figura 14). A configuração deste card está estruturada de modo a fornecer respostas
clinicamente significativas e permitir que esta importante investigação seja realizada com
apenas um procedimento simples(40).
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No caso de um TAD positivo por IgG (como é o caso da imagem de exemplo acima
apresentada), poderá ser importante saber qual o risco de hemólise eritrocitária “in vivo”. Para
tal, deve-se determinar o título de atc presente e a subclasse de IgG(37).
As diferentes classes de IgG (IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4) apresentam diferente significado
clínico. Existem Cards específicos para esta determinação, um dos quais é o que está
representado na figura 15. Este card possui duas diluições 1:1 e 1:100 para cada subclasse, IgG1
e IgG3. A presença de duas diluições permite diferenciar entre baixo e alto risco de hemólise
eritrocitária.
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Sérgio José Pinto Teixeira
Para efetuar este teste, podem ser utilizados dois tipos de cards:
✓ LISS/Coombs (figura 17) – usado preferencialmente na rotina laboratorial;
✓ Coombs Anti-IgG (figura 18).
29
Relatório de estágio – Imunohematologia - IPST
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No card “Coombs Anti-IgG”, o gel encontra-se impregnado apenas com soro de AGH e
anti-IgG, não havendo interferência de componentes do complemento não específicos.
Neste tipo de cards, um resultado positivo significa, então, que os atg se encontram
sensibilizados “in vivo” com imunoglobulinas e/ou complemento.
Durante o estágio no laboratório de imunohematologia do IPST, foi possível executar
vários testes TAD, dos quais se destaca o seguinte:
ID amostra: XXX XXX8190
Card: Liss/Coombs
Suspensão de células:
Resultado: ausência de aglutinação
TAD negativo
O TAI é utilizado para a deteção “in vitro” de eritrócitos sensibilizados “in vitro”, e é
realizado quando a sensibilização não origina aglutinação direta. Este teste é baseado numa
reação em duas fases (figura 14):
✓ na primeira fase (sensibilização das células), o soro a estudar é posto em contacto
com as células lavadas que possuem o(s) atg(s) correspondente(s) ao(s) atc(s)
pesquisado(s). Se o soro em estudo contiver a ou as aglutininas correspondentes,
estas fixam-se seletivamente sobre as células que possuem células que possuem
o atg homólogo (reação visível macroscopicamente);
✓ na segunda fase (TAI ou fase de revelação), a sensibilização ocorrida na primeira
fase é revelada, por ação do soro de Coombs. Este reagente serve de ligação entre
as globulinas fixadas à superfície das células, ocorrendo assim a sua
aglutinação(7,13,37).
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Relatório de estágio – Imunohematologia - IPST
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O TAI inclui um passo de incubação a 37ºC, de modo a que os atc no soro reajam com
os atg celulares “in vitro”. Após a lavagem das células, é usado soro de Coombs para detetar os
atc que cobrem as células(13).
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Relatório de estágio – Imunohematologia - IPST
Sérgio José Pinto Teixeira
Dado que existem atc [anti-(Kidd, Rh, Lewis, I e P)] que são potenciados pela ação das
enzimas e outros [anti-(Fya, Fyb, M, N, S, s e Xg)] cuja ação enzimática tem capacidade de
anular a reação atg-atc através da destruição de alguns antigénios das células reagente, é
importante a realização deste teste com ambos os conjuntos de células. Nos Dadores apenas se
usam 2 células(6–8,22).
Uma reação positiva numa ou mais células, com ou sem enzimas pode auxiliar a
identificação do atc presente na amostra. A forma como um atc se comporta com enzimas, em
comparação com a PAI não enzimática, pode fornecer-nos pistas importantes para a sua
identificação(7,13,23).
A PAI deve realizar-se em todos os doentes candidatos a transfusões sanguíneas, no
estudo de reações transfusionais, em todas as grávidas, e a dadores com história de gravidez
e/ou transfusões recentes. Por rotina, no laboratório do IPST realiza-se também a PAI em todas
as primeiras dádivas, sendo que resultados positivos de PAI em dadores condiciona a utilização
dos diferentes componentes sanguíneos (componentes plasmáticos não devem ser utilizados
para transfusão)(7,8,22).
Em casos de PAI positiva, deve ser realizado um TAD para se ter a certeza de que a
positividade ocorre “in vivo”. Caso esta seja negativa, procede-se à Identificação de Anticorpos
Irregulares(7,12).
A PAI pode ser realizada em tubo, adicionando células reagentes mais concentradas, e
reagente AGH para potenciar a aglutinação. O uso de agentes potenciadores da ligação atg-atc,
aumenta a especificidade do método(7).
Na PAI em meio AGH, utiliza-se o ID Card “LISS/Coombs e na PAI em meio salino
utiliza-se o card “NaCl/enzyme test”. Esta técnica também pode ser realizada em tubo.
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Figura 22 ID – DiaPanel(45).
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Relatório de estágio – Imunohematologia - IPST
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São utilizados por rotina, painéis de células comerciais, “ID – Dia Painel” e “ID – Dia
Painel P” (células tratadas com papaína), de origem humana com perfil antigénico conhecido,
numa suspensão a 0,8%.
O tratamento das células com enzimas proteolíticas pode destruir alguns antigénios,
inibindo ou potenciando a reatividade dos anticorpos(7).
O laboratório de imunohematologia do IPST tem disponíveis painéis mais alargados (20
células comerciais), para serem utilizados em casos inconclusivos com os painéis de 11 células.
Quando é detetado determinado atc irregular no soro/plasma de um paciente, é
necessário encontrar unidades de sangue sem os atg correspondentes a esse anticorpo e testá-las
para o mesmo (provas de compatibilidade). Se a reação ocorrer, significa que o sangue do dador
apresenta o antigénio correspondente ao atc detetado e não se pode transfundir o indivíduo com
essas unidades de sangue)(7,23).
Por outro lado, se o paciente for uma grávida com um atc clinicamente significativo,
realiza-se a titulação de atc.
Amostra: CQ 1/8
Resultados PAI:
células IAT Enzym
I 4+ 4+
II 4+ 4+
III 0 0
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Interpretação do painel:
✓ exclusão de atc que não são responsáveis pela reatividade observada: examinam-se todas
as células cuja reação foi negativa, dado que os atg presentes nestas células reagente
provavelmente não são os alvos dos atc.
✓ exclusão apenas em antigénios expressos em homozigotia na célula, evitando assim a
exclusão de atc fracos para atg expressos em heterozigotia.
✓ os atgs restantes devem ser examinados para se observar o padrão de reatividade das
células positivas.
Atc identificado: anti-D, mas não se pode excluir: Cw e Kpa.
Titulação de atc
Depois de um determinado atc ser identificado, e no caso de suspeita de este atc ser
causador de hemólise eritrocitária, é importante verificar se a sua concentração relativa poderá
ser considerada crítica.
A titulação de atc é um método semi-quantitativo que permite determinar a concentração
relativa de um determinado anticorpo em circulação em diluições sucessivas da amostra em
estudo(10). As diferentes diluições da amostra são posteriormente incubadas com células que
contém o atg para o qual se pretende quantificar o título(7).
De acordo com as características do atc em causa, pode-se efetuar o teste em
meios diferentes: salino a frio, Coombs a 37ºC ou teste enzimático com células papaínizadas a
37ºC. Pode ser realizado em tubo ou em cards: ID Card “Liss/Coombs” ou ID-Card
“NaCl/enzyme test” (7,37).
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Resultados:
Diluições 1 1/2 1/4 1/8 1/16 1/32 1/64 1/128 1/256
Força das 4+ 4+ 3+ 3+ 2+ 1+ 0 0 0
reações
Título do atc: 32
Também se efetuou a titulação da mesma amostra em tubo, obtendo-se resultado semelhante.
O título dos atc em estudo deve corresponder à diluição mais alta onde se
verifique aglutinação. Um título deve ser descrito como 64 ou 32 (por exemplo), não 1 em 64
ou 1 em 32.
Quando se verifica aglutinação na última diluição utilizada significa que o
ponto final não foi encontrado, pelo que se deve prosseguir com as diluições e posterior
titulação. Uma reação negativa (ausência de aglutinação) indica que a amostra não contém
anticorpos detetáveis contra qualquer um dos antigénios presentes nas células.
Eluição ácida
A eluição é um processo de recuperação de atc ligados aos eritrócitos através
da quebra das forças de ligação entre atg e atc. O eluído ou eluado, obtido a
partir das células sensibilizadas “in vivo” ou “in vitro”, pode ser utilizado para vários fins, sendo
o mais comum a identificação de atc que revestem glóbulos vermelhos em doentes
com TAD positivo.
Na técnica de eluição ácida, os glóbulos vermelhos revestidos com atc são
inicialmente lavados minuciosamente, de forma a remover qualquer vestígio de proteínas não
ligadas, utilizando uma solução de lavagem que permite manter a ligação dos atc (figura 23).
Após esta lavagem, os glóbulos vermelhos são suspensos numa solução de glicina de pH baixo
(daí o nome eluição ácida), com o objetivo de dissociar os atc. Após a centrifugação, o
sobrenadante contendo atc dissociados é separado dos glóbulos vermelhos e neutralizado pela
adição de uma solução tampão. Na última lavagem, o sobrenadante é guardado para ser
utilizado como controlo negativo, a fim de garantir que a lavagem foi eficiente na remoção de
resíduos. Após uma rápida centrifugação para retirar alguns eritrócitos que possam ainda estar
presentes, o eluído está então pronto para ser utilizado na deteção e/ou
identificação de anticorpos.
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Figura 23 Kit DiaCidel: solução de lavagem, solução de eluição ácida e solução tampão (46).
Sistema Lewis
O sistema do grupo sanguíneo Lewis é análogo ao sistema ABO e Hh: os atg são
produtos indiretos dos genes e resultam da ação de glicosiltransferases específicas; quer o
sistema ABO quer o Lewis são dependentes da ação da substância H, que serve de substrato
precursor que dando origem aos epítopos A, B e Lewis (b)(7,8,22).
Os atg do sistema Lewis são produzidos por células epiteliais do intestino e são
secretados nos fluidos corporais, nomeadamente secreções e plasma. Não estão integrados na
estrutura da membrana eritrocitária e são adsorvidos aos glicolípidos e glicoproteínas
membranares. Também podem ser encontrados nas plaquetas, rins e epitélio gastrointestinal.
Estes atg são sintetizados pela ação sequencial de duas fucosiltransferases que adicionam fucose
a cadeias de substância H tipo 1 que se encontram nas secreções(7,22). A ação destas enzimas na
mesma substância base produz os atg Lea e H, e a sua interação produz Leb(22).
O desenvolvimento dos atg dá-se após nascimento até aos 6 anos. Os eritrócitos do
recém-nascido tem fenótipo Le(a-b-)(13).
Os atc anti-Lea reagem bem a temperatura ambiente e inferior. Geralmente são da classe
IgM (maioria) sem significado clínico. Se forem reativos a 37ºC com AGH originam quadro
clínico grave. Podem fixar complemento e causar quadro hemolítico. A sua reatividade é
aumentada quando as células são tratadas com enzimas proteolíticas (ex: papaína, ficina,
tripsina e bromelina).
Os atc anti-Leb ocorrem normalmente nos genótipos Le(a-b-), e por vezes Le(a+b-)
muitas vezes em simultâneo com anti-Lea. São da classe IgM e reagem a temperatura ambiente
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(4-22ºC). Raramente causam reação transfusional. O anti-Leb pode ser neutralizado com plasma
ou saliva com substância Leb.
Sistema I
O grupo I tem dois atg I e i, que são carbohidratos. Uma glicosiltransferase converte o
atg i (linear) em I (ramificado). Os atg estão presentes na membrana do eritrócito, plaquetas,
linfócitos, tecidos e fluídos. Os atg I e i são expressos de forma recíproca. As crianças possuem
atg i, mas o atg I é quase indetetável. Durante os primeiros dois anos de idade o atg I aumenta
gradualmente em detrimento do i. Os adultos possuem atg I e possui pouco ou nenhum atg i.
São raros os adultos a possuírem muito atg i(7,11,14).
Os atc anti I/i são atc IgM e reagem a frio (≤ TA, ideal 4ºC). Normalmente não têm
significado clínico, exceto no caso de se observar hemólise “in vitro” a 37ºC. Podem ligar
complemento (normalmente C3d) mas não há hemólise. É um autoanticorpo frequente
(aglutininas frias). As enzimas e albumina podem potenciar a reação. Os componentes a
transfundir devem ser pré-aquecidos(7,37).
Sistema P
O sistema P possui os três atg carbohidratos: P1, P e Pk. Os atg P1, P e Pk encontram-se
nos eritrócitos, e os atg P e Pk encontram-se no plasma. Face à presença ou ausência desses três
atg (P1, P, Pk) podem surgir cinco fenótipos (quadro 2):
O atg P1 não está muito desenvolvido à nascença, apesar de ter sido detetado à 12ª
semana gestação. No momento do parto, a sua expressão é fraca, atingindo a sua expressão
completa por volta dos 7 anos de idade. Este antigénio funciona como recetor para a
Escherichia coli, podendo a sua presença favorecer a infeção do trato urinário por esta bactéria.
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O atg P funciona como recetor celular para o Parvovirus B19, sendo uma causa de
eritema infecioso nas crianças e, por isso, indivíduos que não expressem este antigénio são
resistentes à infeção por este vírus.
O antigénio Pk, presente nas células epiteliais e linfócitos B, está também envolvido na
infeção por E. coli, funcionando como recetor para as suas toxinas.
Os atc deste sistema são naturais e regulares e são produzidos de acordo com o antigénio
ausente na membrana eritrocitária. O atc com maior prevalência é o anti-P1, concordante com os
fenótipos mais frequentes na população. Normalmente é uma IgM natural e raramente causa
reação transfusional. Como não atravessa a placenta, também não se encontra relacionado com
DHRN. Os restantes anticorpos são raros. No entanto, o anti-P pode causar hemoglobinúria
paroxística fria e AHAI e o anti-PP1Pk, devido à sua natureza (IgG) está implicado em DHRN e
RHT imediata(6–8,13).
Sistema Duffy
O sistema Duffy é constituído por dois atg major, Fya e Fyb, os quais estão presentes no
feto a partir da sexta semana de gestação, e determina quatro fenótipos – Fy(a+b−), Fy(a−b+),
Fy(a+b+) e Fy(a-b-). Atg Fya, Fyb e Fy6 são sensíveis ao tratamento pelas enzimas
ficina/papaína, mas são resistentes ao tratamento por DTT e cloroquina.
Os atc anti-Fya e Anti-Fyb (menos comum) são normalmente da classe IgG (subclasse
IgG1), e raramente da classe IgM. Reagem a 37ºC, em meio AGH e normalmente têm
significado clínico, pois causam RHT e DHRN moderada. O anti-Fya provoca quadros clínicos
mais graves.
Este é um dos sistemas cuja atividade dos atc é suprimida pela presença de enzimas
proteolíticas.
Sistema Kidd
O sistema Kidd é constituído por dois atg Jka, Jkb que estão bem desenvolvidos à
nascença e encontram-se nos eritrócitos, leucócitos e rins. Determina quatro fenótipos –
Jk(a+b+), Jk(a+b-), Jk(a-b+) e Jk(a-b-).
Os atg Jka e Jkb são responsáveis pelos 3 fenótipos mais comuns Jk(a+b−), Jk(a−b+), e
Jk(a+b+). O fenotipo Jk(a-b-), fenotipo null, é mais raro.
Os atg são resistentes ao tratamento por enzimas, DTT e cloroquina.
Os atc induzem resposta anamnésica rápida e forte que é responsável por causarem:
✓ reação hemolítica aguda e tardia, severa e muitas vezes fatal;
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Sistema MNSs
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enzimas ficina/papaína é variável. O anti-U é um atc muito raro, IgG (IgG1), e ocorre após
imunização. Ocorre normalmente em células S-s- e é responsável por RTH fatal e DHRN
grave(5,10,14).
Sistema Luterano
Sistema Diego
O sistema Diego foi durante muito tempo constituído apenas por dois atg antitéticos, Dia
e Dib. Em 1995 foram descritos os atg Wra e Wrb e agora sabe-se que é constituído por cerca de
21 atg(7,22).
O antigénio Dia é raro na maioria das populações, sendo mais prevalente em nativos
brasileiros, americanos, japoneses e chineses. O atg Dib está presente em cerca de 99,9% das
populações, sendo que a sua incidência é mais baixa em populações com elevada incidência do
atg Dia.
Os atg do sistema Diego estão expressos nos eritrócitos do recém-nascido e são
resistentes ao tratamento com enzimas proteolíticas(7). Normalmente são da classe IgG (IgG1 e
IgG3). Os atc anti-Dia e anti-Dib podem causar DHRN e, raramente, RTH tardia. Os atc anti-
Wra podem causar DHRN e RTH severas(7,8).
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Sistema Xg
Fenotipagem alargada
As transfusões são feitas com sangues compatíveis com os sistemas ABO, RhD, sendo
em certos casos considerados os fenótipos Rh e Kell. De modo geral não são considerados
outros grupos atg. Deve, no entanto, ser utilizado, sangue com o atg negativo correspondente
sempre que estiver presente um atc clinicamente significativo. Em casos deste género é
altamente vantajoso dispor da tipagem completa do dador(49).
No laboratório de imunohematologia do IPST procede-se, sempre que necessário, à
verificação do fenótipo alargado em unidades de concentrados eritrocitários, para se ter a
certeza que não tem o atg raro que não pode ser transfundido para o doente (porque este possui
o atc correspondente). Durante o trabalho de estágio, foi possível efetuar várias fenotipagens
alargadas, cumprindo os protocolos estipulados pelo laboratório para o efeito.
Provas de compatibilidade
As provas de compatibilidade consistem em pôr em contacto o soro do recetor com as
células do(s) potenciais dador(es), de modo a detetar no recetor atc suscetíveis de
destruir as células do dador. Ou seja, têm por objetivo verificar “in vitro” a compatibilidade
eritrocitária entre o dador e o recetor.
Para preparar uma transfusão sanguínea é necessário selecionar o componente
sanguíneo mais adequado ao recetor da transfusão. Assim, uma prova de compatibilidade
deve ser precedida por um estudo pré-transfusional(29).
A técnica consiste na incubação de uma suspensão de células do dador com o plasma do
recetor. Para o procedimento em gel (cards) o card utilizado (“LISS/Coombs”) contém
antiglobulina humana (AGH) poliespecífica (anti-IgG de coelho e anti-C3d monoclonal), ou
seja, é uma prova de compatibilidade em meio AGH. A interpretação dos resultados é simples,
podendo considerar-se o dador compatível com o recetor caso não ocorra qualquer
aglutinação(7,12).
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O método possui contudo algumas limitações: não consegue prever alo-imunização; não
deteta erros Rh(7).
Os componentes a transfundir deverão pertencer ao mesmo grupo ABO/Rh D do
doente, sempre que possível. Quando não é possível, as unidades de concentrados eritrocitários
deverão ser compatíveis com o sistema ABO(5,7).
Fenótipo Rh/Kell
C c E e K ctl
4+ 4+ 4+ 4+ 0 0
PAI:
células IAT Enzym
I 0 0
II 4+ 0
III 4+ 0
O atc presente é sensível à ação de enzimas.
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6 4+
7 0
8 4+
9 4+
10 0
11 4+
Dador a pesquisar: O RhD, K-, s-, com o mesmo fenótipo Rh que o do doente.
Dador XXX X575019 (O RhD, s-): reação negativa, indicando compatibilidade entre o dador
de sangue e o recetor/doente.
Dador XXX XX81649 (O RhD, s+): reação positiva, indicando incompatibilidade entre o
dador de sangue e o recetor/doente.
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Primeiras dádivas
As amostras de sangue de primeiras dádivas, antes da etapa da centrifugação, são
colocadas no equipamento para a realização do hemograma, de forma a determinar valores de
alguns parâmetros que ajudam a garantir a qualidade da dádiva.
O valor de hemoglobina deve ser superior ou igual a 12,5 g/dL para as mulheres e 13,5
g/dL para os homens. Valores inferiores ao estabelecido podem ser aceites desde que
justificados por critério médico. Valores baixos de hemoglobina (<11g/dL) devem ser
confirmados (realização de hemograma) e investigados posteriormente. Valores superiores a 18
g/dL no homem ou a 16,5 g/dL na mulher devem ser confirmados (realização de hemograma) e
posteriormente investigados de forma a excluir patologia associada.
Caso a dádiva não seja aceite, é enviada uma carta com a informação analítica ao
médico assistente do dador em causa(50).
Depois do hemograma segue-se uma centrifugação das amostras de sangue dos dadores
novos, a uma velocidade de 3000 rpm, durante 5 minutos.
Após a centrifugação, as amostras são colocadas nos equipamentos automáticos para as
seguintes determinações:
✓ fenótipo Rh – no “ORTHO AutoVue® Innova System” – método em gel;
✓ grupo ABO/Rh + fenótipo Rh - no “PK7300® blood grouping analyser” –
método em microplaca; é obrigatória a confirmação de grupo e fenótipo em
duas metodologias diferentes. O segundo método da determinação do grupo é
efetuado nos seguimentos de tubuladura referentes à amostra, no equipamento
“ORTHO AutoVue® Innova System” – método em microesferas de vidro;
✓ PAI – no equipamento NEO® da Immucor – método em microplaca;
✓ Pesquisa de D variante, apenas nas amostras Rhd – no equipamento NEO® da
Immucor – pesquisa de D fraco.
Dadores conhecidos
Após a centrifugação (5 minutos; 3000rpm), as amostras são colocadas nos
equipamentos automáticos para as seguintes determinações:
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Equipamentos automatizados
Num esforço para resolver questões de segurança, aumentar a eficiência do laboratório,
e diminuição do erro humano, a medicina transfusional tem evoluído de um setor manual para
um setor cada vez mais automatizado. Os equipamentos automáticos utilizados no laboratório
de imunohematologia do IPST do Porto são:
Sysmex XT-1800i®
Beckman Coulter®PK7300®
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Estudos pré-transfusionais
O principal objetivo de um estudo pré-transfusional é assegurar a compatibilidade
serológica entre o dador e o recetor. No entanto, este estudo só se considera completo após a
confirmação do grupo sanguíneo do doente (por prova celular e reversa), assim como a
verificação do resultado da PAI Em alguns casos, é ainda necessário realizar o TAD e
determinar o fenótipo Rh.
Dada a importância deste processo e dos riscos associados, todos os pedidos de
transfusão devem ter toda a informação necessária para a identificação correta do recetor/doente
e que a informação constante na requisição deve ser concordante com a presente na rotulagem
da amostra.
Quando chega um pedido de estudo transfusional de uma unidade de concentrado
eritrocitário, ao laboratório de imunohematologia do IPST, significa que devem ser realizados
os seguintes testes analíticos e procedimentos:
✓ Grupo ABO/Rh;
✓ Fenótipo Rh;
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Autoadsorção
O plasma do doente é incubado com as próprias células do doente. Adiciona-se um
potenciador da reação (PEG).
Aloadsorção
É utilizado um par de células regente preparadas, complementares no fenótipo.
49
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Controlo da Qualidade
Para prevenir a ocorrência de erros que são uma das principais causas de morbilidade e
mortalidade consequentes à terapêutica transfusional, é preciso garantir que se realiza o teste
certo, com a amostra certa para obter os resultados certos, assegurando a transfusão do
componente certo para o doente certo(37). Assim, torna-se necessário que o laboratório de
imunohematologia esteja envolvido num sistema de qualidade que lhe permita a manutenção de
níveis elevados de qualidade dos seus serviços cientifico-técnicos e analíticos e até melhorá-los.
O controlo da qualidade permite avaliar a precisão, exatidão e reprodutibilidade dos
métodos analíticos e pode ser dividido em:
✓ controlo de qualidade interno (CQI) (realizado diariamente);
✓ controlo de qualidade externo (CQE) (realizado com uma periodicidade
definida).
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✓ R2R2 (ccEE), K-
✓ PAI: diluições de anti-D’s comerciais (1/8 e 1/16)
✓ parâmetros hematológicos (Sysmex XT-1800i):
✓ três níveis: baixo; médio; alto.
Também são realizadas fenotipagens alargadas de amostras conhecidas, para controlo
dos novos frascos de reagentes.
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Conclusão
53
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