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KR20240122584A - 대표 진단법 - Google Patents

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KR20240122584A
KR20240122584A KR1020247025871A KR20247025871A KR20240122584A KR 20240122584 A KR20240122584 A KR 20240122584A KR 1020247025871 A KR1020247025871 A KR 1020247025871A KR 20247025871 A KR20247025871 A KR 20247025871A KR 20240122584 A KR20240122584 A KR 20240122584A
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KR
South Korea
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sample
tissue
tumor
cells
representative
Prior art date
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KR1020247025871A
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English (en)
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넬슨 알렉산더
아운 바루미
멜린다 데이
리사 가예고스
캐서린 리스
사만타 라즈코비치
에스테반 로버츠
스테이시 스테니슬로
에릭 워크
Original Assignee
벤타나 메디컬 시스템즈, 인코포레이티드
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
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Publication date
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Abstract

본 공개는 일반적으로 온전한 샘플 또는 이의 거대 부분을 균질화시키기 위해 기계적 및/또는 생화학적 해리 방법을 사용해, 임상 샘플, 예를 들어, 종양(전체 또는 부분), 림프절, 전이물, 낭포, 폴립, 또는 이의 조합 또는 일부분으로부터 대표 샘플을 제조하는 방법에 관한 것이다. 최종 균질물은 샘플 내의 공간적 불균질성에도 불구하고 올바른 대표 샘플을 획득하는 능력을 제공하고, 낮은 출현율 서브클론의 검출 가능성을 증가시키고, 다양한 진단적 어세이뿐만 아니라, 치료제, 특히 "개인화된" 항-종양 백신 또는 면역 세포 기반 요법의 생산에 사용하기 적합하다.

Description

대표 진단법 {REPRESENTATIVE DIAGNOSTICS}
관련 출원에 대한 교차 참조
본 출원은 2016년 11월 4일에 제출된 미국 가출원 일련 번호 62/418,146; 2016년 6월 24일에 제출된 미국 가출원 일련 번호 62/354,622; 2016년 1월 15일에 제출된 미국 가출원 일련 번호 62/279,405, 및 2015년 11월 6일에 제출된 미국 가출원 일련 번호 62/252,153의 출원일의 이익을 주장하며, 이들의 공보는 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
기술 분야
본 명세서는 일반적으로 임상 샘플, 특히 임상 종양학에서 사용하기 위한 샘플에서의 조직 불균질성의 주제를 다루기 위해서, 대표 조직 샘플(representative tissue sample), 예를 들어, 전체 기관, 종양, 림프절, 전이물, 또는 이의 조합을 생성하는 방법의 개발에 관한 것이다. 더욱 특히, 본 명세서는 기계적, 화학적 및/또는 생화학적, 예를 들어, 효소적, 해리 방법을 온전한 고정된(또는 보존된) 조직 샘플, 예를 들어, 전체 기관, 종양, 림프절, 전이된 조직 또는 상기 임의의 조합에 적용함으로써 조직, 예를 들어, 종양 내의 공간 불균질성에도 불구하고 올바른 대표 샘플을 얻는 능력을 제공하는 균질한 샘플을 제작하여, 작은 서브-클론 개체군 및/또는 낮은 출현율 사건에 대한 검출 가능성을 증가시키는 것에 관한 것이다. 대표 조직 샘플, 예를 들어, 종양 샘플은, 다양한 진단적 어세이에서 사용하기에 적합하다. 특히, 이들 대표 종양 샘플 및 이의 일부는 암 예후를 평가하는 어세이 방법(예를 들어, 종양 병기화) 및 적당한 처리 섭생법의 선택 및 디자인에서 유용하다. 대표 조직 샘플, 예를 들어, 종양 샘플 및 이의 일부는 치료제로서 또는 치료제를 생산하는데서, 예를 들어, 백신으로서 또는 암 백신의 제조 또는 면역 세포-기반 요법에서 사용될 수 있는데, 이는 대표 샘플이 주어진 종양 또는 종양들에 의해 발현되는 다양한 배열의 항원을 함유하기 때문이다.
의료 종양학에서 모든 진단적 검사를 위해 사용되는 종양 샘플채취 기술은 1800년대 후기에 종양외과 및 해부 병리학의 동시진화에 뿌리를 둔다. 1842년 에테르 기반 마취의 발견 및 1867년 무균 수술 기술의 발명 이후에 병리학 샘플은 전형적으로 부검으로 수득되었다. 외과수술 기술에서 이들 2가지 중요한 진보 이전에, 병리학자들이 수득한 조직 샘플은 전형적으로 감염으로 인해 그 직후에 또는 쇼크로 인해서 수술대에서 사망한 환자로부터 비롯되었다. 그러므로, 높은 수술 사망률은 병리학자가 환자의 생존 통계치와 종양 구조의 해부상 및 현미경상 특징을 상관지을 수 없게 한다. 마취 및 무균 수술의 영향은 환자 생존 수술의 횟수를 즉각적이고 극적으로 증가시켰으며 복잡한 외과수술 절차의 횟수의 실질적 증가를 초래하였다.
외과수술 세트에서 상기 기술된 진보는 1869년 조직의 파라핀 포매의 출현 및 1893년 시작된 포르말린 고정의 광범위한 이용과 동시에 일어났다. 이들 2가지 혁신으로, 해부 병리학자들은 조직 구조 및 현미경적 형태학에 대해 전례없는 선명도를 갖게 되었다. 1900년대 초에 시작하여, 조직 구조 및 형태학의 별개 패턴을 특이적 종양 유형과 연결하는 통찰력이 만들어졌다. 시간 경과에 따라, 해부 병리학자들과 외과 종양학자들은 전체 생존률에 차이가 있는 동일한 종양 유형에서 이들 특이한 해부적 및 현미경적 특성들을 연결시킬 수 있었다. 종양의 조직학적 특성과 환자 예후 사이의 관련성은 궁극적으로 1950년대 초에 TNM 병기 시스템으로 체계화되었다.
TNM 병기화 시스템은 종양의 형태학적 양상(T), 국부 림프절로 종양 세포가 확산되는 정도(N), 및 종양이 멀리 떨어진 기관으로 전이되었는지 여부(M)를 평가하여 암 환자의 예후를 결정하는 것이 목적이다. TNM 병기화 분석의 "T" 부분에 필요한 정보는 소수(전형적으로 3 내지 5)의 매우 소량의 종양 샘플을 종양의 경계면과 주변 정상 조직으로부터 채취하는 것을 요구한다. 샘플은 적절한 포르말린 고정 및 파라핀 포매할 수 있게 일관적인 크기(약 20 x 20 x 3 밀리미터)여야 한다. 포르말린 고정시키고, 파라핀 포매(FFPE)된 샘플의 4 미크론 절편을 병리학자가 검토하도록 마이크로톰으로 절단하고 유리 슬라이드 상에 위치시킨다. 대부분의 병리학 실험실은 종양의 TNM 병기화할 수 있는 다음의 기본 장비를 구비하게 될 것이다: 탈수하여 조직을 파라핀에 포매시키기 위한 플라스틱 조직 카세트, 포르말린 고정 완충제, 조직 프로세서, 박편(일반적으로, 4 미크론 두께)을 절단하기 위한 마이크로톰, 및 조직 절편을 위치시키기 위한 유리 슬라이드.
TNM 병기화 시스템은 1987년에 암 병기화를 위한 국제적으로 공인된 방법이 되었고 이제는 미국 암 공동 위원회(American Joint Commission on Cancer; AJCC) 및 국제 암 연맹(Union Internationale Contre le Cancer; UICC)이 관리한다. AJCC 및 UICC 뿐만 아니라 미국 병리학회(College of American Pathologists; CAP)는 전세계 TNM 병기화 기준을 고찰하여 주기적으로 그 가이드라인을 갱신한다. TNM 채점기준표에 입력되는 조직학적 및 해부학적 특성들은 전세계적으로 일관된 조직 샘플을 수득하는 외과 병리학자들에게 달려 있다. 그러므로, 1800년대 후반에 개발된 기술 및 방법을 기반으로 하는, TN 병기화 시스템에 필요한 샘플채취 기술은 의료 종양학에서 고착되었다.
종양의 TNM 병기화를 위한 "올바른" 조직 샘플의 수득은 복수의 교과서에서 외과 병리학자들이 외과수술 샘플을 어떻게 다루는지 설명하고 예시하고 있다는 사실로 증명되는 바와 같이, 외과 병리학의 1차 목표이다. 일반적으로, 채취된 절편은 육안 검사시 보이는 특징들을 최고로 보여준다. 많은 이들 교과서는 공인된 의료 기관으로부터 AJCC, UICC 및 CAP 승인된 절차를 기재하며 샘플채취하려는 종양의 정확한 부분을 상세히 알려주는 예시들을 함유한다(도 1A-1C 참조). 이들 교과서의 목표는 무작위 샘플채취를 피하기 위해 일관성있고 재현가능한 방식으로 절제된 고형 종양의 특별한 영역을 채취하도록 전세계의 외과 병리학자를 훈련시키는 것이다. 예를 들어, 문헌 [Surgical Pathology Dissection: An Illustrated Guide, Second Edition, at p. 29 stating: "The key to an approach that is both economical and thorough is selective sampling]을 참조한다. 선택적인 샘플채취는 주어진 조직 절편으로부터 수득할 수 있는 정보를 극대화하기 위해 시도되는 전략적인 접근법이다. 시료의 무작위적이고 무분별한 샘플채취와 반대로서, 선택적인 샘플채취는 조직학으로 수득할 수 있는 정보를 증가시키고, 그렇게 하기 위해 소수의 절편을 필요로 한다. 이들 참조 문헌은 TNM 병기화를 용이하게 하기 위해 일관적이고 재현가능한 방식으로 고형 종양의 특별한 영역을 수집해야만 한다고 지시한다. 일반적으로, 최고 등급의 절편이 모든 진단 검사에 사용되며 나머지 샘플은 폐기된다.
외과 병리학자들은 종양 샘플채취의 증가로부터 수득되는 추가 정보가 없으면 외과 시료로부터 채취되는 전체 샘플의 수를 증가시키는 것을 삼가하도록 훈련받는다. 샘플채취되지 않은 잔여 종양에서 추가의 진단 정보를 수득할 수 있을 것이라고 인지되지 않았다.
국소 배수 림프절로 종양 전이는 예후의 중요한 지표이다(즉, 예후 TNM 병기화 시스템의 "N"). 국부 림프절 내 종양 세포의 존재는 환자가 보조 화학요법을 받는지 여부에 대한 결정 요인일 수 있다. 통상적으로, 종양 세포는 FFPE 조직의 단일 박편의 외과적 제거 및 현미경 검사 후 림프절에서 검출된다. 림프절의 전이성 성장은 전체 장기를 채울 수 있거나, 또는 오직 소량의 암 세포를 함유하여 미세할 수 있다. 소량의 전이성 성장은 절제된 림프절의 단일 박편만이 전이성 종양의 존재에 대해 검사될 것이므로, 림프절에서 놓칠 수 있다. 림프절 상의 크기에 따라서, 단일 FFPE 조직 절편은 절제된 림프절의 총 부피의 오직 일부만을 함유할 수 있다. 샘플채취되지 않은 림프절 영역에서 성장하는 전이성 종양은 동정되지 않아서, 거짓 음성 분석을 초래하게 될 것이다. 이는 국부적으로 진행된 암(즉, 림프절 전이, N-양성)을 갖는 개체에게 필요한 것보다 덜 공격적인 요법 섭생법을 환자가 받게 만들 것이다.
병리학 부서가 사례 보고를 완결하여 종양 샘플이 절제된 종양 재료로부터 절단되어 TNM 병기가 계산된 후 종양학자에게 제출된다. TNM 병기화에 이용되지 않은 잔여 종양 조직을 함유하는 나머지 외과 재료는 이후, 전형적으로 1996년의 미국 의료 정보보호법(Health Insurance Portability and Accountability Act: HIPAA) 하에서 요구하는 대로 소각을 통해 폐기된다. 그러나, CAP는 모든 파라핀 블록 및 절단된 슬라이드를 10년간 유지시킬 것을 권장한다. 고형 종양에서 유래되는 모든 진단 정보가 소수의 종양 자체를 기반으로 하는 전세계적인 시스템이 존재한다. 예를 들어, 문헌 [De Petris, Proteome Science, 8:9(2010)("De Petris")]을 참조한다. 문헌 [De Petris]에서, "종양의 대표 영역 유래의 생검"만이 추가 추가 검사를 위해 채취되었고, 용혈 및 비고정 요건이 후속 조직학적 실험에 샘플을 부적합하게 만들었다.
종양 불균질성의 발견은 종양 발생과 관련된 통상의 이론에 상반된다. 1950년대에, 우세한 지식은 최종, 임상적으로 검출가능한 종양이 종양 "종족계통"의 특이적 하위개체군의 순차적 선택의 생성물이라는 것이었다. 이러한 이론에서, 대부분의 종양은 자연 선택으로 인해 다른 "종족계통"을 능가하는 단일 "종족계통"이 우세하다. TNM 병기화 시스템은 종양 "종족계통" 개념과 동일한 시기 동안 개발되었으며, 여기서 복수의 종양은 종양의 단일 "유형"으로 구성될 것이다. 문헌 [Peter Nowel, Science(1976) 194:23-28]을 참조한다.
조성이 균질하기 보다는, 고형 종양은 사실 불균질하다. 일부 고형 종양은 복수의 유전적으로 별개인, 공간적으로 분리된 암 세포 개체군으로 구성된다고 보고되었다. 문헌 [Gerlinger et al., NEJM(2012) 366:883-92], 및 문헌 [Yachida et al. nature(2010) 467(7319):1114-1117]을 참조한다. 본 명세서에서 더욱 설명하는 바와 같이, 본 발명자들은 종양의 조직학적 분석을 위한 통상의 샘플채취 방법이 부적절한 종양 샘플(또는 잠재적으로 암 세포를 함유하는 조직, 예컨대 림프절)을 제공하고 개선시킬 수 있다는 것을 확인하였다.
현대 병리학에 의해 인도되는, 의사와 과학자는 샘플이 TNM 병기화 시스템을 위해 채취되면, 이후 이의 파괴로 나머지 종양 조직에 대해 임의의 의미있는 의학적 가치를 정상적으로 말하지 않는다. 조직학적 절편의 형태학적 및 바이오마커 기반 분석은 종양 내 또는 종양 사이의 악성 개체군에 의해 전개되는 표현형적, 형태학적, 및 유전자적 불균질성에 의하 제한된다. 종양 세포의 소개체군이 악성종양 및 전이의 주요 공급원을 포함할 수 있고 전체 종양의 유전자 구성의 소량을 구성한다. 그 결과, 대량의 종양에 대해 개발된 바이오마커는 종종 적은 비율의 종양으로 인해 야기되는 암 사망률에 대한 바로 그 이유를 포착할 수 없을 것이다.
소정 종양 내 불균질 유전자 구성은 종양이 그들 조성이 균질한 세포로 구성된다는 가정으로 소수의 종양에서 채취된 정보를 이용하는 진단 종양학에서 요법 결정에 상당한 도전을 제기한다. 예를 들어, 샘플 내 유전자 아형의 공간적 위치는 임상 결과에 대단히 영향을 미친다. 공인된 문헌이 지시하는 선택적 샘플채취를 기반으로 하더라도, 전통적인 통상의 조직 절편 절차는 전체 외과적 시료를 샘플채취할 수 없다. 더욱이, 현행 샘플채취 절차는 소수의 종양만을 검사할 수 있어서, 거대한 대부분의 종양을 임의 방식으로 검사하지 않은 채로 남겨서, 결국 폐기된다.
AJCC, UICC 및 CAP 승인된 절차에서, 병리학자들은 외과적으로 절제된 조직 시료의 오직 적은 분획만을 사용하게 되고 나머지 샘플은 버리게 될 것이다. 종양 샘플이 복수의 유전자적으로 공간적으로 별개인 종양 세포 개체군을 품게 될 것이므로, 가장 경험있는 병리학자가 채취한 3 내지 5개의 적은 샘플은 전체 시료 내 악성종양 또는 전이의 모든 유전적으로 다양한 군을 대표할 수 없다. 게다가, 임의의 게놈이 구별되는 암 세포 개체군의 위치는, 종양 세포의 DNA 서열이 육안 검사 시 분명하지 않으므로, 선험적으로 인식될 수 없다. 사실 원발성 종양 내에 거의 대부분의 모든 세포, 게놈, 및 단백질체 불균질성을 함유하는 것이 폐기되는 나머지 종양 재료이지만, 전체 종양 샘플채취할 수 있는 시간 및 비용 효율적인 방법론 또는 장비가 존재하지 않는다.
현행 병리학적 관행은 전체 원발성 종양 내 세포, 게놈, 및 단백질체 불균질성이 진단 샘플에서 포착되는 것을 보장하도록 도움을 줄 수 있는 전체 종양에 대한 보다 철저한 샘플채취 및 가공 방법을 요구한다.
본 공개는 실질적으로 균질하게 분포된 세포 구조를 포함하는 불균질 조직 샘플로부터 유래되는 가공된 불균질 조성물을 제공하고, 여기서 균질물의 각 서브셋 중 세포 구조의 비율은 원래 불균질 조직 샘플 중 세포 구조의 비율과 실질적으로 유사하다. 균질물 조성물은 원래 불균질 조직 샘플의 핵심 특징을 나타내는 새롭고, 독특한 조직 샘플이다. 개시된 조성물은 임상 샘플, 특히 임상 종양학에서 사용을 위한 샘플의 조직 불균질성을 설명하는데 실패한 종래 방법의 한계를 해결하고 극복한다.
균질물 조성물은 다양한 조직, 기관 또는 이의 샘플, 예를 들어 림프절, 전이물, 폴립, 낭포, 절제물, 장기, 또는 이의 분획, 또는 공간적으로 분리된 세포로부터 유래되거나 또는 공급된다. 일 양상에서, 균질물은 약 25% 내지 약 100%의 조직 샘플의 세포 구조를 포함한다. 균질물은 단백질 분획, 지질, 핵산 또는 출발 조직, 예를 들어 이의 균질물을 유도시키는데 사용되는 전체 종양, 림프절 또는 전이부에 존재하는 기타 모이어티를 포함할 수 있고, 이러한 치환분 구성요소의 상대적 비율은 출발 조직을 대표한다. 실질적으로 균질한 세포 구조는 정상 또는 비정상 조직으로부터 단리된 단일 세포 또는 복수의 세포 클러스터를 포함할 수 있다. 특정 양상에서, 균질물은 다양한 방법으로 수득된, 액체 또는 비액체 조직 샘플, 예컨대 세포검사 바늘 흡인물, 삼출 샘플 또는 파프 도말시료을 포함할 수 있다.
다른 양상에서, 균질물은 보존된 조직, 예를 들어 포르말린 고정된 조직으로부터 단리될 수 있다. 다른 양상에서, 조직 샘플은 보존 또는 고정되지 않고/않았거나, 생존 세포를 포함한다. 불균질 조직 샘플은 하나 이상의 환자로부터 수득된 하나 이상의 조직으로부터 단리될 수 있다.
균질물은 제한없이 대표 종양학 데이타를 포함하는 대표 데이타의 발생, 암 병기화, 질환의 예후의 식별 및 평가(예를 들어, 종양 병기화), 적절한 치료 섭생법의 선택 및 디자인, 임상 실험 매칭, 마커 동정 및 특징규명, 조직 프로파일링, 및 균질물 조성물의 저장을 포함하는, 다양한 진단적, 예후적 및 임상적 응용 분야에서 사용하기에 적합하다. 균질물 조성물은 또한 대표 샘플이 소정 종양 또는 종양들에 의해 발현되는 항원의 다양한 어레이를 함유하므로, 치료제의 스크리닝을 위해 또는 환자의 치료에서의 치료제를 생성시키기 위해, 예를 들어, 백신으로서 또는 암 백신 또는 면역 세포-기반 요법의 제조에서 유용하다.
본 공개는 또한 불균질 조직 샘플, 예를 들어, 대표 샘플을 대표하는 균질물 조성물을 생성시키기 위한 방법을 제공한다. 더욱 특히, 본 공개는 원래 조직 또는 장기, 예를 들어 종양 내에서의 공간 불균질성에도 불구하고 정확한 대표 샘플을 제공하여, 소수의 서브클론 개체군 및/ 저출현율 사건의 검출 가능성을 증가시키기 위해 기계적, 화학적 및/또는 생화학적, 예를 들어, 효소적, 해리 방법을 온전한 조직-함유 샘플, 예를 들어, 전체 기관, 종양, 림프절, 전이된 조직 또는 상기 임의의 조합(동일 또는 상이한 환자 유래)에 적용시키는 단계를 포함한다.
일 양상에서, 본 공개는 일반적으로, 임상 시료, 특히 임상 종양학에서 사용을 위한 임상 시료에서의 불균질성, 예를 들어 종양 불균질성의 문제를 해결하기 위해 예를 들어, 전체 기관, 종양, 림프절, 전이물, 또는 이의 조합의 대표 조직 샘플을 생성시키기 위한 방법론의 개발, 및 다양한 진단적 및 요법적 방법에서 이러한 대표 샘플 또는 이의 일부분의 용도를 비롯하여 진단 및 요법, 특히 종양학에서 사용을 위한 이러한 대표 샘플을 포함하는 조성물에 관한 것이다.
더욱이, 상이한 환자 또는 단일 또는 상이한 환자의 상이한 조직 유래의 대표 샘플은 각각 고유한 식별 표지, 예를 들어 합텐으로 표지될 수 있고 상이한 환자 또는 조직의 표지된 샘플은 바람직한 어세이 방법에서 조합하여 사용된다.
본 개시 내용의 예시적인 실시태양에 의해 유래된 대표 샘플은 종양 조직 유형, 위치, 크기 또는 부피와 무관하게, 상이한 종양 유형의 검출, 진단, 및/또는 병기화의 정확도를 개선시키는데 이용될 수 있다. 현재 개시된 방법은 희귀 세포를 동정하기 위해 정상 조직 또는 추정 전암성 조직(예를 들어, 유전적 위험성 또는 이전의 암때문에 암이 발병될 보다 높은 위험성이 있는 대상체로부터 수득)으로부터 대표 샘플을 생산하는데 유용하다.
일 양상에서, 본 공개는 종양, 림프절, 또는 전이부 내의 세포의 불균질성의 평가 및/또는 대상체에서 특정 암성 병태의 예후의 평가 및/또는 암성 병태를 갖는 대상체에 대해 적당한 치료적 프로토콜의 결정을 위해 적합한 생물학적 샘플을 생산하기 위한 방법을 제공한다. 이 방법은 (i) 공간적으로 별개인 조직 영역을 포함하거나 또는 전체 종양 또는 이의 실질적인 부분을 포함하는 조직(예컨대, 종양 샘플 또는 림프절 또는 전이부)을 수득하는 단계, 및(ii) 세포의 불균질성이 최종 균질물 또는 이의 부분 또는 분획 내에서 실질적으로 균질하게 분포되도록 조직을 균질화시키는 단계를 포함한다. 샘플 또는 샘플들은 임의로는, 전체 또는 실질적으로 전체 종양, 림프절, 전이부 또는 심지어 전체 장기 예컨대 신장의 균질화 이전 또는 이후에, 고정되고/되거나 보존될 수 있는데, 예를 들어 포르말린, 고정, 에탄올, 고정, 동결 또는 동결 건조, 왁스(예컨대, 파라핀) 중 저장 등이 될 수 있다.
또 다른 양상에서, 본 공개는 샘플(예컨대 종양 샘플, 림프절, 전이부 또는 이의 조합) 내의 세포의 불균질성의 평가 및/또는 대상체에서 특정 암성 병태의 예후의 평가에 적합한 생물학적 샘플을 생산하기 위한 방법을 제공하고, 이 방법은 (i) 고형 종양 또는 림프절로부터 하나 이상의 온전한 샘플을 수득하는 단계로서, 바람직하게 각각의 온전한 샘플은 를 포함한다 적어도 약 100-200; 200-1,000; 1,000-5,000; 10,000-100,000; 100,000-1,000,000; 1,000,000-5,000,000; 5,000,000-1,000,000,000; 1,000,000,000-5,000,000,0000, 또는 그 이상의 세포, 또는 대안적으로 적어도 1,000; 10,000; 100,000; 1,000,000; 5,000,000; 10,000,000; 50,000,000; 100,000,000; 500,000,000; 1,000,000,000; 5,000,000,000; 10,000,000,000; 50,000,000,000; 100,000,000,000; 500,000,000,000; 1,000,000,000,000; 5,000,000,000,000; 10,000,000,000,000; 50,000,000,000,000; 100,000,000,000,000 또는 그 이상의 세포를 포함하고, 임의로는 고정되거나 또는 보존(예컨대 포르말린, 파라핀, 또는 에탄올 고정되거나 또는 보존된 샘플)되는 것인 단계, 및(ii) 별개로 또는 조합하여 하나 이상의 샘플을 균질화시키는 단계로서, 하나 이상의 균질물은 각각 개별 샘플 또는 샘플들의 불균질성을 실질적으로 균질하게 발현시키는 것인 단계를 포함한다. 하나의 실시태양에서, 고형 종양 또는 림프절 유래의 온전한 샘플 또는 샘플들은 고형 종양 또는 림프절의 일부분을 포함하거나 또는 대안적으로 본질적으로 그로 이루어지거나, 또는 더욱 이루어진다. 또다른 실시태양에서, 고형 종양 또는 림프절 유래의 온전한 샘플 또는 샘플들은 고형 종양 또는 림프절의 일부분을 포함하거나, 또는 대안적으로, 본질적으로 그로 이루어지거나, 또는 추가로 실질적으로 그로 이루어진다. 추가의 실시태양에서, 고형 종양 또는 림프절 유래의 온전한 샘플 또는 샘플들은 전체 고형 종양 또는 전체 림프절을 포함하거나, 또는 대안적으로, 본질적으로 그로 이루어지거나, 또는 더욱 그로 이루어진다.
대표 샘플은 임의로는 예를 들어, 진단적 및 치료적 방법에서 사용되는 일루미나(Illumina) 시퀀싱 출력값의 CAVA 컴퓨터 분석을 사용하여, 분자의 특이적 유형, 예컨대 특이적 세포 유형, 단백질, 핵산, 또는 지질 등을 제거하거나 또는 단리하기 위해서 더욱 해리되고/되거나 처리될 수 있다.
또 다른 양상에서, 본 공개는 종양 또는 림프절 또는 전이부 또는 이의 조합 내에서 세포의 불균질성을 평가하는데 적합한 생물학적 샘플을 생산하기 위한 방법을 제공하고, 이 방법은 (i) 고형 종양 또는 림프절 또는 전이부로부터 하나 이상의 생검 샘플을 수득하는 단계로서, 바람직하게는 각각의 생검 샘플은 적어도 약 100-200; 200-1,000; 1,000-5,000; 10,000-100,000; 100,000-1,000,000; 1,000,000-5,000,000; 5,000,000-1,000,000,000; 1,000,000,000-5,000,000,0000, 또는 대안적으로 적어도 1,000; 10,000; 100,000; 1,000,000; 5,000,000; 10,000,000; 50,000,000; 100,000,000; 500,000,000; 1,000,000,000; 5,000,000,000; 10,000,000,000; 50,000,000,000; 100,000,000,000; 500,000,000,000; 1,000,000,000,000; 5,000,000,000,000; 10,000,000,000,000; 50,000,000,000,000; 100,000,000,000,000 또는 그 이상의 세포를 포함하고, 임의로는 고정되거나 또는 보존(예컨대 포르말린, 파라핀, 또는 에탄올 고정되거나 또는 보존된 샘플)되는 것인 단계, 및 (ii) 개별적으로 또는 조합하여 최종 균질물 또는 균질물들이 개별 세포로 실질적으로 해리되고 최종 균질물 또는 균질물들이 실질적으로 균질하게 되는 조건 하에서 하나 이상의 생검 샘플을 균질화시키는 단계를 포함한다.
또 다른 양상에서, 본 공개는 대상체가 특정 암의 악성 형태로 발병될 위험성을 갖거나 또는 위험성에 있는지 여부 및/또는 악성 형태의 암을 갖는지 여부를 평가하는데 적합한 생물학적 샘플을 생산하기 위한 방법을 제공하고, 이 방법은 (i) 고형 종양 또는 림프절 또는 전이 또는 전암성 낭포 유래의 하나 이상의 온전한 생검 샘플을 수득하는 단계로서, 바람직하게는 각각의 생검 샘플은 적어도 약 100-200; 200-1,000; 1,000-5,000; 10,000-100,000; 100,000-1,000,000; 1,000,000-5,000,000; 5,000,000-1,000,000,000; 1,000,000,000-5,000,000,0000, 또는 그 이상의 세포, 또는 대안적으로 적어도 1,000; 10,000; 100,000; 1,000,000; 5,000,000; 10,000,000; 50,000,000; 100,000,000; 500,000,000; 1,000,000,000; 5,000,000,000; 10,000,000,000; 50,000,000,000; 100,000,000,000; 500,000,000,000; 1,000,000,000,000; 5,000,000,000,000; 10,000,000,000,000; 50,000,000,000,000; 100,000,000,000,000 또는 그 이상의 세포를 포함하고, 임의로는 고정되거나 또는 보존(예컨대 포르말린, 파라핀, 또는 에탄올 고정된 또는 보존된 샘플)된 것인 단계, 및(ii) 개별적으로 또는 조합하여 하나 이상의 생검 샘플을 균질화시키는 단계로서, 최종 하나 이상의 균질물은 각각이 실질적으로 균질하게 개별 생검 샘플 또는 샘플들의 불균질성을 함유하고, 임의로는 적어도 하나의 바이오마커의 존재를 단리하거나 또는 검출하는 것인 단계를 포함한다. 이러한 특면에서, 바이오마커의 존재 또는 부재는 암의 악성 형태를 의미하거나, 또는 대안적으로 바이오마커의 상향조절 또는 하향조절은 특정 암의 악성 형태와 연관된다.
또 다른 양상에서, 본 공개는 불균질 종양, 림프절 또는 전이 또는 전암성 낭포 내에서 경관을 특징규명 및/또는 불균질 종양 림프절 또는 전이 또는 전암성 낭포 내에서 유전자적으로 구별되는 서브클론을 검출 및/또는 종양 림프절 또는 전이 또는 전암성 낭포 내에서 저출현율 사건을 동정 및/또는 종양 림프절 또는 전이 또는 전암성 낭포 내에서 표적의 출현율을 결정하기 위한 방법을 제공하고, 이 방법은 (i) 균질화 이전에, 예를 들어 포르말린, 파라핀 및/또는 에탄올로 임의로는 고정되거나 또는 보존된 종양 림프절 또는 전이 또는 전암성 낭포의 공간적으로 구별되는 영역을 포함하는 종양 림프절 또는 전이부 또는 전암성 낭포의 샘플 또는 샘플들을 수득하는 단계, 및 (ii) 종양 림프절 또는 전이 또는 전암성 낭포 샘플 또는 샘플들을 개별적으로 균질화시켜서, 종양, 림프절, 전이물, 또는 전암성 낭포 내에서 불균질성의 경관을 대표하고, 종양의 경관을 특징규명 및/또는 불균질 종양 림프절 또는 전이 또는 전암성 낭포 내에서 유전자적으로 구별되는 서브클론을 검출 및/또는 종양 또는 림프절 또는 전이 또는 전암성 낭포 내에서 저출현율 사건을 동정 및/또는 종양 림프절 또는 전이 또는 전암성 낭포 내에서 표적의 출현율을 검출하는데 적합한 균질물의 세트를 생성시키는 단계를 포함한다. 이들 경관은 게놈 다양성(예를 들어, 종양 내에서 점 돌연변이, 삽입, 및 결실의 개수), 종양 표현형의 다양성(예를 들어, 상피에서 간염으로의 전이를 겪은 종양의 양), 숙주 면역 반응의 다양성(예를 들어, 종양 및 면역 세포에서 면역 체크포인트 조절인자의 발현의 다양성), 모든 잠재적인 내성 기전의 다양성(예를 들어, 표적화 요법에 대해 내성을 부여하는 종양 돌연변이의 개수 및 다양성), 조직 조직학의 다양성(예를 들어, 폐암에서 선암종 대비 편평상피에 있는 종양의 양), 종양에 의해 발현되는 신생 항원의 다양성, 및/또는 대상체로부터 절개된 모든 영향받거나, 또는 잠재적으로 영향받는 조직 전반의 기타 복합적인 표현형적, 형태학적, 조직학적, 게놈적, 단백질체적, 대사체학적 경관에 관한 것이다.
또 다른 양상에서, 본 공개는 유전자 돌연변이 또는 이전의 암때문에 암이 발병될 위험성에 있는 환자, 또는 전암성 낭포 또는 폴립을 갖는 환자의 가정되는 정상 조직 또는 추정 전암성 조직에서 전암성 세포 또는 암성 세포를 검출하기 위한 방법을 제공하고, 이 방법은 (i) 균질화 이전에 임의로는 고정되거나 또는 부존된, 환자의 가정되는 정상 조직 또는 추정 전암성 조직의 공간적으로 구별되는 영역을 포함하는 가정되는 정상 조직 또는 추정 전암성 조직 예컨대 전암성 낭포 또는 폴립의 샘플 또는 샘플들을 수득하는 단계, 및 (ii) 샘플 또는 샘플들을 균질화시켜서, 가정되는 정상 조직 또는 추정 전암성 조직을 대표하고, 예를 들어 질환의 임의 징후가 환자에서 표현되기 이전이더라도, 희귀 암성 세포 또는 암 줄기 세포를 검출하기에 적합한 균질물을 생산하는 단계를 포함한다.
또 다른 양상에서, 본 공개는 상이한 어세이 형식으로 임의의 전술한 방법에 의해 생산된 대표 샘플 및 이의 일부를 사용하는 방법에 관한 것으로서, 이들 어세이는 높은 처리량으로 실시되고/되거나, 동시에 또는 상이한 횟수로 또는 상이한 위치, 및/또는 자동(완전 자동화 또는 반자동화)으로 수행될 수 있다.
또 다른 양상에서, 본 공개는 향후 사용을 위해 저장되는 임의의 전술한 방법으로 생산된 대표 샘플 또는 이의 일부분을 제공하며, 이것의 비제한적인 예는 예를 들어, 동결, 포르말린 고정, 파라핀, 포매, 에탄올 처리, 또는 동결 건조를 포함한다.
또 다른 양상에서, 본 공개는 환자 샘플 중 암 세포 또는 세포 유형 유래의 특정 항원에 특이적인 항체 또는 항원을 유도(및 임의로는 정제)시키는데 사용되는 임의의 전술한 방법으로 생산된 대표 샘플 또는 이의 일부분을 제공하며, 이러한 항체 또는 항원은 잠재적으로 개인화된 약물, 즉 치료적 또는 예방적 암 백신의 생산에서 사용될 수 있다.
모든 상기 언급된 방법에서 균질화 단계는 샘플 중 세포의 무결성을 보존하는 방법에 의해 실시될 수 있으며, 다시 말해서, 균질화된 샘플 또는 샘플들 중 대량의 세포가 용해되지 않아서 최종 균질물 및 이의 일부가 샘플 또는 샘플들의 "대표"이다. 그러므로, 샘플 또는 이의 일부 중 세포는 조직 샘플 또는 샘플들, 예를 들어, 고형 종양 또는 림프절의 전체 중 상이한 세포 유형의 비율을 반영한다. 이는 예를 들어, 종양 샘플 또는 이의 일부의 기계적 해리(예컨대, 종양 샘플 또는 이의 일부에 액체의 첨가와 함께 또는 없이 수행되는 기계적 해리) 및/또는 종양 샘플 또는 이의 일부의 화학적 또는 효소적 해리(예컨대, 막-회합된 단백질과 비교하여 세포외 매트릭스 단백질에 대한 선택적이거나 또는 우선적이거나 또는 주로 작용하는 효소에 의한 처리)에 의해 수행될 수 있다. 대안적으로, 균질화 방법은 출발 조직, 예컨대 전체 종양을 대표하는 샘플을 여전히 생성시키면서 세포의 해리를 유발시킬 수 있다. 균질화된 대표 샘플은 임의로는 분자의 특이적 유형, 예컨대 특이적 세포 유형, 단백질, 핵산 또는 지질 등을 제거하거나 또는 단리하기 위해 더욱 해리 및/또는 처리될 수 있어서, 진단적 및 치료적 방법에 사용될 수 있는 다른 대표 샘플을 생성시킬 수 있다.
임의의 상기 방법은 균질물 또는 이의 일부분 또는 분획에서, 적어도 하나의 바이오마커, 예를 들어, 적어도 하나의 지질, 단백질, 또는 핵산 바이오마커를 검출하는 단계를 포함할 수 있다. 부가적으로, 방법은 특정 바이오마커 또는 바이오마커의 조합을 발현하는 균질물 또는 이의 일부분 또는 분획에서 종양 세포의 비율을 검출하는 단계를 더 포함할 수 있다. 임의로는, 균질물 또는 이의 일부분 또는 분획 중 종양 줄기 세포 및/또는 종양 서브클론의 상대적 빈도 또는 비율이 검출 및/또는 단리된다. 부가적으로, 방법은 유전자 표적(예컨대, 점 돌연변이, 결실, 삽입, 전위, 유전자 융합, 또는 유전자의 증폭)을 검출하는 단계를 포함할 수 있다.
임의의 상기 방법은 또한 가치있는 임상 정보, 예를 들어 번역 상태 및 질환 상태를 제공하고, 또한 처리 프로토콜 예컨대 체크포인트 억제인자, 사이토카인, 또는 기타 면역 조정인자를 선택하기 위해서, 균질물 또는 이의 일부분 또는 분획에 존재하는 특이적 면역 세포(예컨대, B 림프구, T 림프구, 마크로파지, NK 세포, 단핵구, 또는 이의 조합)를 검출, 단리, 및/또는 정량하는데 사용될 수 있다.
최종 균질물 또는 대표 샘플은 약 100-200; 200-1,000; 1,000-5,000; 10,000-100,000; 100,000-1,000,000; 1,000,000-5,000,000; 5,000,000-1,000,000,000; 1,000,000,000-5,000,000,0000 세포 또는 대안적으로, 적어도 1,000; 10,000; 100,000; 1,000,000; 5,000,000; 10,000,000; 50,000,000; 100,000,000; 500,000,000; 1,000,000,000; 5,000,000,000; 10,000,000,000; 50,000,000,000; 100,000,000,000; 500,000,000,000; 1,000,000,000,000; 5,000,000,000,000; 10,000,000,000,000; 50,000,000,000,000; 100,000,000,000,000 또는 그 이상의 세포를 포함할 수 있거나, 본질적으로 그로 이루어지거나, 또는 더욱 그로 이루어질 수 있다.
최종 균질물 또는 그의 분획 또는 일부분은 임의로는 동결되거나 또는 동결 건조되거나, 왁스(예컨대, 파라핀)에 포매될 수 있거나, 또는 대안적으로, 이러한 동결 또는 동결-건조 또는 왁스없이 추가 단계에서 사용될 수 있다. 예를 들어, 대표 파라핀 블록, 즉 파라핀에 포매된 균질물 또는 이의 분획 또는 일부분으로부터 생산된 것은 현행 해부 병리학 작업흐름, 예를 들어, 절편화, 슬라이드 준비, 염색, 현미경관찰, 항원 회수 등에 사용하기 적합하다.
균질물은 동일하거나 또는 상이한 시점에 하나 이상의 대상체(예를 들어, 처리 이전 또는 이후 동일한 대상체 또는 서로 동일하거나 또는 상이한 처리 이전 및 이후 복수의 대상체)로부터 채취된 둘 이상의 종양에서 유래될 수 있고, 각 종양의 최종 균질물 또는 이의 분획은 상이한 환자의 둘 이상의 종양 또는 질환 병태의 유사성 및/또는 차이를 평가하는데 사용된다. 추가의 양상에서, 하나 이상의 대상체 유래의 균질물은 복수의 대상 대표 샘플의 목적을 위해 조합될 수 있다.
균질물은 한 대상체 또는 복수의 대상체, 예를 들어 BRCA 돌연변이를 갖는 대상체로부터 수득된 둘 이상의 추정되는 정상 또는 전암성 조직, 예를 들어, 유방, 자궁경부, 직대장, 또는 전암성 낭포 또는 폴립으로부터 유래될 수 있고, 최종 균질물 또는 이의 분획은 임의의 비정상 세포 또는 질환 바이오마커가 존재하는지 여부를 평가하는데 사용될 수 있다.
또한, 비-인간 세포(예컨대 곤충 세포 및/또는 마우스 세포) 또는 기타 외래 단백질, 핵산, 또는 소형 분자가 균질물에 첨가되어서 양성 단백질 또는 핵산 검출을 위한 내부 대조군을 생성시킬 수 있다.
소형 분자(예컨대 합텐, 펩티드 태그, 단백질 태그, 형광 태그, 및/또는 핵산 태그)가 샘플에 첨가될 수 있고 대표 샘플 중 공간적 정보를 제공하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 샘플(예컨대, 종양 또는 림프절)은 절편화될 수 있는데, 예를 들어 사분면으로 절단될 수 있으며, 상이한 합텐(또는 다른 적합한 소형 분자)이 대표 샘플을 생성시키기 위해 절편을 균질화하기 이전에 각각의 절편에 "도핑"될 수 있다. 균질화 이전에 "도핑"을 위해 각 샘플로부터 생성시킬 수 있는 절편의 수는 제한되지 않으며, 그보다는 샘플의 크기에 따라 일정비율로 선택될 수 있을 것이며, 즉, 샘플이 클수록, 균질화 이전에 소형 분자로 "태그화"될 수 있는 절편의 수카 커진다는 것을 이해해야 한다. 이러한 방식으로, 공간적 정보는 균질물 또는 이의 분획에서 유지될 수 있다.
일 실시태양에서, 소형 분자는 또 다른 환자 또는 동일한 환자 유래의 상이한 샘플과 샘플을 조합하기 이전에 샘플에 첨가될 수 있고, 따라서 복합 어세이 형식으로 작업시 샘플을 구별하는 수단을 제공한다.
균질화된 샘플은 보존, 예를 들어 포르말린 고정될 수 있거나, 또는 균질화 이전 또는 이후에 에탄올로 처리될 수 있다. 안정성 우려때문에, 조직 샘플은 대부분의 진단적 방법에 사용하기 전에 병리학 실험실에서 일루미나 시퀀싱 출력값의 CAVA 컴퓨터 분석을 사용하여 가공되기 전에 일반적으로 포르말린 또는 다른 것으로 고정된다. 포르말린 또는 기타 고정 방법은 당분야에서 일반적으로 알려진 기술에 의해 수행될 수 있다. 이러한 경우에서, 포르말린 고정된 종양 샘플은 단계 (ii)에서 균질화 이전에 물 또는 완충 염수 용액(예컨대, PBS)에 함침될 수 있다.
대안적으로, 또는 부가적으로, 개시된 방법에서 사용되는 종양 샘플은 균질화 이전에 에탄올에 보존될 수 있다. 그러나 포르말린 고정, 메탄올 또는 에탄올 고정, 또는 기타 보존 절차는 대상 방법에 필수적이지 않으며, 최종 균질화된 대표 샘플의 적합성을 손상시키지 않으면 제거될 수 있다.
미고정된 조직의 균질화를 이용하여 대표 생존 샘플을 생성시킬 수 있다. 생존 대표 샘플을 배양하여 개별 환자 유래의 대표 조직 배양 샘플을 생성시킬 수 있다. 이러한 대표 샘플은 복수회 분할되어 복수의 대표 배양 샘플을 생성시킬 수 있고, 이것을 사용하여 화학요법(예컨대, 적어도 하나의 기지 또는 미지의 바이오마커의 발현 또는 기능적 활성을 길항하거나, 억제하거나, 또는 차단하는 항체, 핵산, 소형 분자, 또는 폴리펩티드)의 효능을 결정할 수 있다. 더욱이, 특이적 세포 유형(예컨대 면역 세포 또는 종양 세포)은 FACS 분석을 사용해 선택할 수 있다. 예를 들어, 종양 침윤된 면역 세포를 선택하고 배양하여 면역 시스템에 의해 분비되는 종양 특이적 항체를 결정할 수 있다.
또한, 본 명세서에 표시된 바와 같이, 대표 샘플을 생산하기 위한 개시된 방법 및 진단적 및 치료적 방법에서 그들의 용도는 고정 및 미고정 조직 샘플 둘 모두에 적합하다.
대표 샘플을 제조하기 위한 임의의 개시된 방법은 균질화 이전, 그 동안, 또는 그 이후에 적어도 하나의 콜라게나아제(또는 다른 적합한 효소 또는 효소 조합 또는 기타 화학물, 예컨대 그 자체로 파괴되거나 또는 세포외 매트릭스의 파괴를 촉진하는 염)의 첨가; 상승된 온도 및/또는 완충제 조건(예컨대, 세포 교차결합을 파괴하는 세포 조건화 완충제, 예를 들어, CC1 또는 CC2)의 사용; 및/또는 기계적 전달을 위한 장치(예컨대, IKA 블렌더, gentleMACs 해리기, 또는 기능적 균등물)의 사용을 포함할 수 있다. 다시, 이들 방법은 샘플 내 세포의 생존능 및 무결성을 유지하는 조건, 예를 들어 세포가 실질적으로 용해되지 않는 일부 균질화 조건 하에서, 실시될 수 있거나 또는 그렇지 않을 수 있다.
일 양상에서, 균질화 과정은 기계적 과정의 사용을 포함하고, 이의 비제한적인 예는 임의로는 회전식 호모지나이저의 경우 약 100 내지 약 75,000 RPM 속도, 또는 비드 비터의 경우 0.5 m/s 내지 약 2.5 m/s의 속도에서, 약 30초 내지 약 5분, 약 5분 내지 약 10분, 약 10분 내지 약 30분, 또는 약 30분 내지 약 60분의 기간 동안, 막자사발 및 막자, 다운스 호모지나이저 또는 조직 그라인더, 휴대용 전자 회전식 블레이드 조직 균질화기(예컨대, Thomas Scientific에서 수득할 수 있는 Omni-TH), 비드 비팅 균질화기(예컨대, OMNI에서 수득할 수 있는 불렛 블렌드 또는 버튼 프리셀리스(Burton Precellys) 24 조직 균질화기 또는 비드 럽터(Bead Ruptor))를 포함한다. 본 명세서에서 언급시, 기계적 균질화 과정은 단독으로 또는 다른 과정과 조합하여 사용될 수 있다.
또 다른 실시태양에서, 균질화는 단독으로 또는 다른 과정과 조합하여, 효소 조제물의 사용을 포함하며, 이의 비제한적인 예는 임의로는 약 0.001 ㎍/mL 내지 약 1000 mg/mL의 농도에서, 약 1분 내지 약 120분의 길이 동안, 예를 들어, 사이질 콜라게나아제, 젤라니타아제-A, 스트로멜리신 1, 마트릴리신, 호중구 콜라게나아제, 젤라니타아제-B, 스트로멜리신 2, 스트로멜리신 3, 마크로파지 메탈로엘라스타아제, 콜라게나아제 3, MT1-MMP, MT2-MMP, MT3-MMP, MT4-MMP, 콜라게나아제 4, 에나멜리신, X-MMP, CA-MMP, MT5-MMP, MT6-MMP, 마트릴리신-2, MMP-22, 엔도프로테이나아제, 트립신, 키모트립신, 엔도프로테이나아제 Asp-N, 엔도프로테이나아제 Arg-C, 엔도프로테이나아제 Glu-C(V8 프로테아제), 엔도프로테이나아제 Lys-C, 펩신, 서몰리신, 엘라스타아제, 파파인, 프로테이나아제 K, 서브틸리신, 클로스트리파인, 엑소펩티다아제, 카르복시펩티다아제 A, 카르복시펩티다아제 B, 카르복시펩티다아제 P, 카르복시펩티다아제 Y, 카텝신 C, 아실아미노-산-방출 효소, 파이로글루타메이트 아미노펩티다아제, 또는 이의 임의 조합을 포함한다.
종양 또는 기타 조직의 공간적으로 구별되는 영역을 포함하는 개시된 방법에서 사용되는 종양 또는 기타 샘플은 환자로부터 외과적으로 제거된 종양 또는 조직 샘플의 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 적어도 85%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 바람직하게는 전체를 포함할 수 있다. 종양 샘플은 직경이 적어도 1, 5, 10, 20, 50, 100 또는 그 이상의 밀리미터(mm) 또는 센티미터(cm)일 수 있다.
주제 방법에서 사용되는 샘플은 일반적으로 임의의 적당한 조직 샘플, 예를 들어, 고형 종양 또는 종양(원발성 종양 및 전이성 종양을 포함), 림프절, 전이물, 또는 전암성 조직 예컨대 낭포 또는 폴립으로부터 유래될 것이다. 대안적으로, 또는 부가적으로, 방법은 또한 비-고형 종양, 예를 들어, 혈액암에서 효과적일 수 있다. 예를 들어, 균질화된 조직 샘플 또는 고형 종양 샘플은 임의로는 액체 환자 샘플, 예를 들어, 환자 유래의 혈액, 림프액, 삼출 시료, 뇌척수액, 담즙, 점액, 및/또는 소변 샘플과 조합될 수 있다. 균질화된 샘플은 추가로 또는 대안적으로 예를 들어 질환 징후 이전에 질환있는 세포를 검출하기 위해서, 완전 또는 부분 샘플, 예를 들어 생검 "정상" 또는 전암성 조직을 포함할 수 있다.
개시된 방법에서 사용되는 이러한 종양 또는 기타 조직 샘플 또는 샘플들은 임의의 공급원, 예를 들어 유방, 대장, 폐, 췌장, 담낭, 피부, 뼈, 근육, 간, 신장, 자궁경부, 난소, 전립선, 식도, 위, 또는 기타 기관, 예를 들어, 유방암 종양, 폐암 종양, 간 종양, 전립선암 종양, 대장암 종양, 방광암 종양, 또는 신장암 종양으로부터 유래될 수 있다. 하나의 실시태양에서, 개시된 방법에서 사용되는 종양 샘플 또는 기타 조직은 인간 기원이지만 임의의 적당한 조직 공급원일 수 있다.
개시된 방법에서 사용되는 종양 또는 기타 조직 샘플은 적어도 1 ㎤, 적어도 2 ㎤, 적어도 3 ㎤, 적어도 4 ㎤, 적어도 5 ㎤, 적어도 6 ㎤, 적어도 7 ㎤, 적어도 8 ㎤, 적어도 9 ㎤, 적어도 10 ㎤, 적어도 15 ㎤, 적어도 20 ㎤, 적어도 25 ㎤, 적어도 50 ㎤, 적어도 100 ㎤, 적어도 250 ㎤, 적어도 500 ㎤, 적어도 1,000 ㎤, 적어도 2,500 ㎤, 적어도 5,000 ㎤, 적어도 7,500 ㎤, 적어도 10,000 cm3의 부피 또는 보다 큰 부피를 가질 수 있다.
개시된 방법에서 사용되는 종양 또는 기타 조직 샘플은 가장 폭넓은 지점에서 적어도 0.5 cm, 적어도 1 cm, 적어도 1.5 cm, 적어도 2 cm, 적어도 2.5 cm, 적어도 3 cm, 적어도 3.5 cm, 적어도 4 cm, 적어도 4.5 cm, 적어도 5 cm, 적어도 6 cm, 적어도 7 cm, 적어도 10 cm, 적어도 25 cm, 적어도 50 cm의 너비 또는 그보다 큰 너비를 가질 수 있다.
부가적 실시태양에서, 대표 샘플은 이전에 포르말린 고정되고 파라핀 왁스에 포매된 조직으로 제조될 수 있다. 특히 왁스를 용융시킬 수 있고, 조직을 회수하여 수화시킨 후, 본 명세서에 기술된 방법, 즉 균질화를 샘플에 적용할 수 있고, 이는 임의 수의 어세이에 사용하기 적합하다. 이러한 방식으로, 개시된 방법은 왁스를 용융시키고, 샘플을 회수하여, 조직을 재수화시키고 따라서 균질화시켜서 TNM 병기화를 위해 이미 제조된 샘플 또는 샘플들을 사용해 대표 샘플을 생성시키는데 사용될 수 있다.
임의의 상기 방법은 (iii) 균질물 또는 이의 일부분 또는 분획을 하나 이상의 슬라이드 또는 기타 고형 지지체 상에 분포시키는 단계를 더 포함할 수 있고, 임의로는, 균질물 또는 이의 일부분 또는 분획을 함유하는 하나 이상의 슬라이드 또는 기타 고형 지지체를 헤마톡실린 및 에오신 착색제로 염색하는 단계; 균질물 또는 이의 일부분 또는 분획을 함유하는 슬라이드 또는 기타 고형 지지체 상에서 면역조직화학적 염색을 수행하는 단계; 또는 균질물 또는 이의 일부분 또는 분획을 함유하는 슬라이드 또는 기타 고형 지지체 상에서 인시츄(in situ) 하이브리드화를 수행하는 단계를 더 포함할 수 있으며, 즉 이들 중 어느 하나는 방법에서 단계 (iv)로 간주될 수 있다. 예를 들어, 균질물 또는 이의 일부분은 분석을 위한 자동화 플랫폼 상에서 분석될 수 있다. 이러한 플랫폼은 당분야에 공지되어 있고, 벤타나 메디칼 시스템즈 인코포레이션(Ventana Medical Systems, Inc.)에서 상업적으로 수득할 수 있다(예시적인 자동화 플랫폼의 경우 Ventana.com을 참조함).
또한, 임의의 상기 방법은 (iii) 균질물 또는 이의 일부분 또는 분획으로부터 핵산(예컨대 DNA 또는 mRNA)을 정제하는 단계를 더 포함할 수 있다. 정제된 핵산에 대해서 노던 블롯, DNA 시퀀싱, PCR, RT-PCR, 마이크로어레이 프로파일링, 차등적 디스플레이, 또는 인시츄 하이브리드화를 수행할 수 있다. 대안적으로, 정제된 핵산은 나노입자(예컨대, 양자점, 상자성 나노입자, 초상자성 나노입자, 및 금속 나노입자, 바람직하게는 예로서 제한없이, CdSe, ZnSSe, ZnSeTe, ZnSTe, CdSSe, CdSeTe, ScSTe, HgSSe, HgSeTe, HgSTe, ZnCdS, ZnCdSe, ZnCdTe, ZnHgS, ZnHgSe, ZnHgTe, CdHgS, CdHgSe, CdHgTe, ZnCdSSe, ZnHgSSe, ZnCdSeTe, ZnHgSeTe, CdHgSSe, CdHgSeTe, InGaAs, GaAlAs, 및 InGaN을 포함하는 합금 양자점을 포함)에 접합될 수 있다.
임의의 상기 방법은 균질물 또는 이의 일부분 또는 분획으로부터 지질 또는 엑소솜 또는 기타 소기관을 정제하는 단계를 더 포함할 수 있다는 것을 역시 고려한다. 정제된 지질에 대해서 질량 분광법 또는 조직화학법을 수행할 수 있다.
부가적으로, 임의의 상기 방법은 균질물 또는 이의 일부분 또는 분획으로부터 단백질을 정제하는 단계를 더 포함할 수 있다는 것을 또한 고려한다. 정제된 단백질에 대해서 웨스턴 블롯, 효소-연결 면역흡착 어세이(Enzyme-linked immunosorbent assay: ELISA), 면역침전법, 크로마토그래피, 질량 분광법, 마이크로어레이 프로파일링, 간섭계법, 전기영동적 염색, 또는 면역조직화학적 염색을 수행할 수 있다. 전술한 것에 대해 대안적으로, 또는 부가적으로, 정제된 단백질을 사용하여 종양 또는 조직 샘플에 특이적인 항혈청을 생성시킬 수 있다.
더욱이, 임의의 상기 방법은 (iii) 균질물 또는 이의 일부분 또는 분획 상에서 유전체, 후성유전체, 전사체, 단백질체 및/또는 대사체적 분석을 수행하는 단계를 더 포함할 수 있다는 것을 고려한다.
게다가, 임의의 상기 방법은 (iii) 균질물 또는 이의 일부분 또는 분획으로부터 특이적 세포 유형을 친화도 정제하는 단계를 더 포함한다는 것을 고려한다. 특이적 세포 유형은 관심 바이오마커를 함유할 수 있다. 예시적인 관심 바이오마커는 Her2, bRaf, ERBB2 증폭, Pl3KCA 돌연변이, FGFR2 증폭, p53 돌연변이, BRCA 돌연변이, CCND1 증폭, MAP2K4 돌연변이, ATR 돌연변이, 또는 그 발현이 특이적 암과 상관있는 임의의 다른 바이오마커; AFP, ALK, BCR-ABL, BRCA1/BRCA2, BRAF, V600E, Ca-125, CA19.9, EGFR, Her-2, KIT, PSA, S100, KRAS, ER/Pr, UGT1A1, CD30,CD20, F1P1L1-PDGRFa, PDGFR, TMPT, 및 TMPRSS2 중 적어도 하나; 또는 ABCB5, AFP-L3, 알파-페토단백질, 알파-메틸 아실-CoA 라세마아제, BRCA1, BRCA2, CA 15-3, CA 242, Ca 27-29, CA-125, CA15-3, CA19-9, 칼시토닌, 암배아 항원, 암배아 항원 펩티드-1, Des-감마 카르복시 프로트롬빈, 데스민, 조기 전립선암 항원-2, 에스트로겐 수용체, 피브린 붕괴 산물, 글루코스-6-포스페이트 아이소머라제, HPV 항원 예컨대 vE6, E7, L1, L2 또는 p16INK4a 인간 융모막 고나도트로핀, IL-6, 케라틴 19, 락테이트 데하이드로게나제, 류실 아미노펩티다아제, 리포트로핀, 메타네프린, 네프릴리신, NMP22, 노르메타네프린, PCA3, 전립선-특이적 항원, 전립선 산 포스파타제, 시냅토파이신, 티로글로불린, TNF, ERG, ETV1(ER81), FLI1, ETS1, ETS2, ELK1, ETV6(TEL1), ETV7(TEL2), GABPa, ELF1, ETV4(E1AF; PEA3), ETV5(ERM), ERF, PEA3/E1AF, PU.1, ESE1/ESX, SAP1(ELK4), ETV3(METS), EWS/FLI1, ESE1, ESE2(ELF5), ESE3, PDEF, NET(ELK3; SAP2), NERF(ELF2), 또는 FEV, 종양-연관 당단백질 72, c-kit, SCF, pAKT, pc-kit, 및 비멘틴에서 선택되는 전사 인자에서 선택되는 적어도 하나의 바이오마커를 포함할 수 있다.
대안적으로, 또는 부가적으로, 관심 바이오마커는 면역 체크포인트 억제인자 예컨대, 제한없이 CTLA-4, PDL1, PDL2, PD1, B7-H3, B7-H4, BTLA, HVEM, KIR, TIM3, GAL9, GITR, LAG3, VISTA, KIR, 2B4, TRPO2, CD160, CGEN-15049, CHK1, CHK2, A2aR, TL1A, 및 B-7 패밀리 리간드 또는 이의 조합일 수 있거나 또는 CTLA-4, PDL1, PDL2, PD1, B7-H3, B7-H4, BTLA, HVEM, TIM3, GAL9, LAG3, VISTA, KIR, 2B4, CD160, CGEN-15049, CHK1, CHK2, A2aR, B-7 패밀리 리간드, 또는 이의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 체크포인트 단백질의 리간드이다.
본 개시 내용의 방법은 또한 급성 림프아구성 백혈병(etv6, am11, 사이클로필린 b), B 세포 림프종(Ig-이디오타입), 신경교종(E-카데린, 알파-카테닌, 베타-카테닌, 감마-카테닌, p120 ctn), 방광암(p21ras), 담관암(p21ras), 유방암(MUC 패밀리, HER2/neu, c-erbB-2), 자궁 암종(p53, p21ras), 대장 암종(p21ras, HER2/neu, c-erbB-2, MUC 패밀리), 직대장암(직대장 연관 항원(CRC)-C017-1A/GA733, APC), 융모막 암종(CEA), 상피세포 암(사이클로필린 b), 위암(HER2/neu, c-erbB-2, ga733 당단백질), 간세포암(α-페토단백질), 호지킨 림프종(Imp-1, EBNA-1), 폐암(CEA, MAGE-3, NY-ESO-1), 림프계 세포-유래된 백혈병(사이클로필린 b), 흑색종(p5 단백질, gp75, 종양태아성 항원, GM2 및 GD2 강글리오시드, Melan-A/MART-1, cdc27, MAGE-3, p21ras, gp100.sup.Pmel117), 골수종(MUC 패밀리, p21ras), 비-소세포 폐암종(HER2/neu, c-erbB-2), 비인두암(Imp-1, EBNA-1), 난소 암(MUC 패밀리, HER2/neu, c-erbB-2), 전립선암(전립선 특이적 항원(PSA) 및 이의 항원성 에피토프 PSA-1, PSA-2, 및 PSA-3, PSMA, HER2/neu, c-erbB- 2, ga733 당단백질), 신장 암(HER2/neu, c-erbB-2), 자궁경부 및 식도의 편평상피세포 암(바이러스 생성물 예컨대 인간 파필로마 바이러스 단백질), 고환암(NY- ESO-1), 및/또는 T 세포 백혈병(HTLV-1 에피토프)과 연관된 적어도 하나의 바이오마커의 검출을 포함하거나 또는 포괄한다.
본 개시 내용의 방법은 (iii) 균질물 또는 이의 일부분 또는 분획을 세포외 매트릭스를 파괴하는 콜라게나아제 또는 기타 효소 또는 화학물 또는 이의 조합으로 처리하는 단계, 균질물 또는 이의 일부분 또는 분획을 고온 조건 하에서 항온반응시키는 단계, 및/또는 균질물 또는 이의 일부분 또는 분획 내의 세포를 해리시키기 위해서 균질물 또는 이의 일부분 또는 분획을 기계적으로 교반시키는 단계를 더 포함한다. 일반적으로, 이들 방법은 개시된 분석적 또는 치료적 방법 또는 이의 조합에서 사용할 수 있는 대표 샘플로부터 세포의 소형 클러스터, 또는 개별 세포의 개체군을 생성시키게 될 것이다.
부가적으로 임의의 상기 언급된 방법은 (iii) 단일 세포 또는 소형 세포 클러스터, 예컨대 더블렛 또는 트리플렛을 수득할 수 있게 하는, 균질물 또는 이의 일부분 또는 분획을 여과시키거나 또는 크기분류하는 단계를 더 포함할 수 있다.
대표 샘플의 세포적 구성요소는 하나 또는 복수의 여과 단계를 통해 분리될 수 있다. 예를 들어, 물리적 및/또는 생화학적 수단을 통해 균질물의 균질화 및 해리 후, 해리된 샘플은 모든 온전한 세포 물질을 제거하기 위해 1 미크론 필터를 통해 여과될 수 있다. 비세포적 대표 샘플은 임상적 이용성이 있게 되는 종양 내에서 유래되는 정상 기질 및 종양 유래의 분비된 인자, 즉, 항체, 성장 인자, 면역조정인자, 및 다른 기지의 인자들을 함유하게 될 것으로 예상된다. 비세포적 대표 샘플은 ELISA, 질량 분광법, 차세대 시퀀싱, 및 다른 진단 방법으로 분석될 수 있다. 대표 샘플로부터 유래된 단일 세포가 여과 후 수득되는 정도로, 이러한 세포는 형광 활성화 세포 분류법(FACS) 및 유세포분석법을 사용해 분석될 수 있다.
개시된 방법으로 생성된 균질물의 대표적인 성질을 고려하면, 균질물 또는 이의 일부분 또는 분획은 낮은 출현율 유전자 사건(예컨대, 20% 출현율, 15% 출현율, 10% 출현율, 5% 출현율, 2% 출현율, 1% 출현율, 0.5% 출현율, 0.1% 출현율, 0.001% 출현율, 0.001% 출현율, 0.0001% 출현율, 0.00001% 출현율, 0.000001% 출현율 또는 그 이하로 발생되는 유전자 사건)을 검출하는데 사용될 수 있다. 예시적 유전자 사건은 점 돌연변이, 결실, 부가, 전위, 유전자 융합, 또는 유전자의 증폭을 포함한다. 유사하게, 방법은 또한 종양 샘플 또는 이의 일부 내에서 유전자 또는 후생유전자 불균질성을 검출하는 단계 및/또는 희귀 유전자 또는 후생유전자 변이를 포함하는 세포를 검출하는 단계를 포함할 수 있다. 이러한 세포는 5% 미만, 1% 미만, 0.5% 미만, 0.1% 미만, 0.05% 미만, 또는 0.01% 미만의 빈도로 종양 샘플에 존재할 수 있다.
검출된 희귀 세포는 전이를 촉진하고/하거나, 다른, 항암요법에 비해 요법에 대한 내성, 한 요법에 대한 감수성을 부여하는 하나 이상의 유전자 또는 후생유전자 차이를 포함할 수 있다. 그러므로, 일 양상에서, 이러한 세포의 검출은 암 예후를 비롯하여, 적당한 치료적 섭생법 예컨대 화학요법, 조합된 표적화 요법, 및/또는 생물제의 사용을 촉진하게 될 것이다.
전술한 방법은 또한 형광발광성 분자 또는 형광색소 예컨대 4-아세타미도-4'-이소티오시아나토스틸벤-2,2'디술폰산, 아크리딘 및 유도체 예컨대 아크리딘 및아크리딘 이소티오시아네이트, 5-(2'-아미노에틸)아미노나프탈렌-1-술폰산(EDANS), 4-아미노-N-[3-비닐술포닐)페닐]나프탈리미드-3,5 디술포네이트(루시퍼 옐로우 VS), N-(4-아닐리노-1-나프틸)말레이미드, 안트라닐아미드, 브릴리언트 옐로우, 쿠마린 및 유도체 예컨대 쿠마린, 7-아미노-4-메틸쿠마린(AMC, 쿠마린 120), 7-아미노-4-트리플루오로메틸쿨루아린(쿠마란 151); 시아노신; 4',6-디아미니디노-2- 페닐인돌(DAPI); 5',5''-디브로모피로갈롤-술폰프탈레인(프로모피로갈롤 레드); 7- 디에틸아미노-3-(4'-이소티오시아네이토페닐)-4-메틸쿠마린; 디에틸렌트리아민 펜타아세테이트; 4,4'-디이소티오시아네이토디히드로-스틸벤-2,2'-디술폰산; 4,4'-디이소티오시아나토스틸벤-2,2'-디술폰산; 5-[디메틸아미노]나프탈렌-1-술포닐 클로라이드(DNS, 단실 클로라이드); 4-(4'-디메틸아미노페닐아조)벤조산(DABCYL); 4-디메틸아미노페닐아조페닐-4'-이소티오시아네이트(DABITC); 에오신 및 유도체 예컨대 에오신 및 에오신 이소티오시아네이트; 에리트로신 및 유도체 예컨대 에리트로신 B 및 에리트로신 이소티오시아네이트; 에티듐; 플루오레세인 및 유도체 예컨대 5-카르복시플루오레세인(FAM), 5-(4,6-디클로로트리아진-2-일)아미노플루오레세인(DTAF), 2'7'-디메톡시-4'5'-디클로로-6-카르복시플루오레세인(JOE), 플루오레세인, 플루오레세인 이소티오시아네이트(FITC), 및 QFITC(XRITC); 2',7'-디플루오로플루오레세인(OREGON GREEN®); 플루오레사민; IR144; IR1446; 말라카이트 그린 이소티오시아네이트; 4-메틸엄벨리페론; 오르쏘 크레솔프탈레인; 니트로티로신; 파라로사닐린; 페놀 레드; B-피코에리쓰린; o-프탈디알데히드; 피렌 및 유도체 예컨대 피렌, 피렌 부티레이트 및 숙신이미딜 1-피렌 부티레이트; 리액티브 레드4(Cibacron.RTM. 브릴리언트 레드 3B-A); 로다민 및 유도체 예컨대 6-카르복시-X-로다민(ROX), 6-카르복시로다민(R6G), 리사민 로다민 B 술포닐 클로라이드, 로다민(Rhod), 로다민 B, 로다민 123, 로다민 X 이소티오시아네이트, 로다민 그린, 술포로다민 B, 술포로다민 101 및 술포로다민 101의 술포닐 클로라이드 유도체(텍사스 레드); N,N,N',N'-테트라메틸-6-카르복시로다민(TAMRA); 테트라메틸 로다민; 테트라메틸 로다민 이소티오시아네이트(TRITC); 리보플라빈; 로솔산 및 터븀 킬레이트 유도체, 대략 617 nm에서 발광하는 티올-반응성 유로퓸 킬레이트에서 선택되는 적어도 하나의 검출가능한 표지의 사용을 포함할 수 있다.
개시된 방법은 전체적으로 또는 부분적으로 자동화될 수 있다. 예를 들어, 단계 (i) 및 (ii)는 자동화될 수 있지만, 임의의 후속 단계, 예를 들어, 단계 (iii) 및 (iv)는 수동으로 한다. 대안적으로, 예로서, 단계 (i) 및 (ii)는 수동일 수 있는데 반해, 후속 단계, 예를 들어, 단계 (iii) 및 (iv)는 자동화이다. 부가적으로, 방법에 포함되는 모든 단계는 방법이 완전하게 자동화되도록, 자동화될 수 있다.
개시된 방법은 종양 병기화를 위해서, 단독으로 또는 다른 기지 방법(예컨대, TNM)과 조합하여 사용될 수 있다. 일 양상에서, 방법은 질환 재발 및/또는 진행의 가능성을 예측하기 위해서 절개된 림프절의 대표 샘플의 분석을 통해서 국소 림프절로 종양 세포가 확산되는 정도, 및 종양의 대표 샘플의 하나 이상의 양상을 평가하는 단계를 더 포함한다.
개시된 방법은 샘플링된 세포, 예를 들어 특이적 바이오마커가 있거나 또는 없는 종양 세포의 비율을 계산하기 위해 알고리즘을 적용하는 단계를 더 포함할 수 있다. 전이성(또는 악성 서브클론) 진행의 상대적 위험성은 특이적인 검출가능한 바이오마커, 또는 바이오마커의 조합에 의해 대표 종양 샘플 및/또는 대표 림프절 샘플 내 세포의 비율을 기반으로 결정할 수 있다.
개시된 방법은 대표 샘플에 함유된 바이오마커 프로파일, 항원 프로파일, 돌연변이 프로파일, 지질 프로파일, 단백질 프로파일, 및/또는 엑소솜 프로파일을 기반으로 개인화된 용량 또는 치료 섭생법의 개발을 더 포함할 수 있다. 예를 들어, 대표 샘플에 함유된 정보를 기반으로, 또는 대표 림프절 샘플로부터 수득된 정보와 조합하여, 하나 이상의 약물의 선택 및/또는 환자에게 투여되는 이러한 약물의 용량(양, 투여 길이 등)은 환자의 개별 조직 또는 암 프로파일을 기반으로 치료를 개인화하도록 변형될 수 있다.
개시된 방법은 대표 샘플의 게놈 프로파일을 샘플 환자 또는 기타 환자 유래의 대표 조직 샘플, 예를 들어, 림프절 샘플 유래의 대표 조직 샘플의 게놈 프로파일과 비교하는 단계, 및 더욱 임의로는 이들 프로파일을 임의의 원위 전이성 또는 대표 전이성 종양 샘플 유래의 순환 종양 DNA와 비교하는 단계를 더 포함할 수 있다.
개시된 방법은 대표 샘플에 함유되는 바이오마커 프로파일, 항원 프로파일, 돌연변이 프로파일, 지질 프로파일, 단백질 프로파일, 및/또는 엑소솜 프로파일을 기반으로 임상 실험을 위한 포함 기준의 개발을 더 포함할 수 있다.
본 공개는 또한 단독으로 또는 다른 조성물 및 담체와 조합하여, 임의의 전술한 방법으로 생산된 대표 균질물 조성물을 포함한다.
부가적으로, 임의 수의 표준 진단 검정법을 사용하여 추가 분석에 적합한 대표 샘플을 제조하기 위해 샘플, 예컨대 종양 샘플의 균질화를 포함하는, 전술한 방법 또는 전술한 임의 방법으로 생산된 조성물의 결과(예컨대, 희귀 유전자 및/또는 후생유전자 사건, 희귀 세포 등의 검출)는 암 환자에 적당한 치료적 섭생법의 선택에서 사용될 수 있다. 치료적 섭생법은 유전자 요법, 화학요법, 표적화 소형 분자, 다른 표적화 요법, 면역조정인자 투여, 방사선요법, 사이토카인 투여, 수술, 또는 이의 조합을 포함할 수 있다.
더욱이, 개시된 방법은 그 샘플 또는 종양이 제공된 방법으로 생성된 대표 샘플에 대한 공급원인 대상체에 사용하기 적합한 적어도 하나의 치료제(예컨대, 적어도 하나의 검출된 바이오마커의 발현 또는 기능적 활성을 길항하거나, 억제하거나, 또는 차단하는, 유전자 요법(예를 들어, CRISPR), T 세포 요법(예를 들어, CAR T 세포), 항체, 핵산, 소형 분자, 또는 폴리펩티드)를 선택하는데 사용될 수 있다.
부가적 양상에서, 본 공개는 분석을 위한 대표 샘플을 제조하기 위한 방법에 관한 것으로서, (1) 적어도 하나의 대상체로부터 수술적 절제 조직 샘플을 수득하는 단계; 및 (2) 수술적 절제 조직 샘플을 균질화하여 균질화된 샘플을 얻는 단계를 포함한다. 하나의 실시태양에서, 수술적 절제 조직 샘플의 적어도 일부는 고정된다. 부가적 실시태양에서, 방법은 수술적 절제 샘플의 제1 부분을 가공하여 하나 이상의 고정되고, 포매된 조직 블록을 생성하는 단계 및 추가로 나머지 수술적 조직 절제 샘플의 제2 부분을 균질화하는 단계를 더 포함한다. 하나 이상의 고정되고, 포매된 조직 블록의 일부분은 형태학적 분석을 위한 하나 이상의 조직 박편을 생성하도록 현미경절편제작법에 의해 가공될 수 있다. 또한, 하나 이상의 고정되고, 포매된 조직 블록의 적어도 하나는 균질화될 수 있다. 일 양상에서, 수술적 절제 조직 샘플은 조직의 하나 이상의 별개의 조각을 포함한다. 부가적 실시태양에서, 조직의 하나 이상의 별개의 조각은 수술적 절제 샘플을 수득하기 위해 대상체로부터 절제된 하나 이상의 원발성 고형 종양 조직 종괴의 적어도 일부분을 포함한다. 또다른 양상에서, 조직의 하나 이상의 별개의 조각은 대상체로부터 절제된 하나 이상의 림프절의 적어도 일부를 포함한다.
부가적 실시태양에서, 방법은 별개의 균질화된 샘플을 산출하기 위해 조직의 별개의 조각의 적어도 일부를 개별적으로 균질화시키는 단계를 더 포함한다. 부가적 실시태양에서, 수술적 절제 조직 샘플은 단일 조직 덩어리의 둘 이상의 조각으로 더 나뉠 수 있는 단일 조직 덩어리를 포함한다. 부가적으로, 단일 조직 덩어리의 둘 이상의 조각의 적어도 하나는 균질화되고 보존될 수 있다. 일 양상에서, 균질화는 물리적 분리, 예컨대 자르기, 썰기, 또는 갈기를 포함할 수 있다. 또다른 양상에서, 균질화는 기계적 해리, 예컨대 블렌딩 또는 즙내기를 포함할 수 있다. 또다른 양상에서, 균질화는 생화학적 해리, 예를 들어 프로테아제에 의해 수행된다.
부가적 양상에서, 하나 이상의 생체분자는 균질물의 적어도 일부로부터 정제될 수 있고, 이러한 생체분자는 DNA, RNA, 단백질, 지질, 및 대사물을 포함할 수 있다. 생체분자는 이후 예를 들어 PCR, 질량 분광법, 차세대 시퀀싱, 또는 ELISA를 통해 분석될 수 있다. 이러한 분석은 적어도 하나의 데이타세트를 발생시킨다.
부가적 실시태양에서, 균질화된 샘플의 적어도 일부분은 파라핀에 포매될 수 있다. 부가적 양상에서, 방법은 파라핀 포매된 균질화된 샘플의 하나 이상의 박편을 제조하는 단계 및 샘플에 대해 조직학적 분석을 수행하는 단계를 더 포함한다. 이러한 조직학적 분석은 H&E 염색, IHC 염색, ISH 염색, 및 FISH 염색을 포함할 수 있다. 조직학적 분석은 인간에 의해 해석될 수 있거나, 또는 자동화 디바이스 상에서 정량될 수 있다. 부가적 실시태양에서, 해석 또는 정량화는 적어도 하나의 데이타세트를 발생시킨다.
일 양상에서, 본 공개는 또한 세포 단편을 생성시키도록 균질물의 적어도 일부분을 더욱 가공하는 것에 관한 것이다. 이러한 가공은 물리적, 기계적, 화학적, 또는 효소적 방법을 포함할 수 있다. 이러한 세포 단편은 핵, 세포막, 및 세포 소기관을 포함한다. 또다른 양상에서, 세포 단편의 적어도 일부는 적어도 하나의 유리 슬라이드에 고정되고, 임의로는 조직학적 분석이 수행된다. 이러한 조직학적 분석은 H&E 염색, IHC 염색, ISH 염색, 또는 FISH 염색을 포함할 수 있다. 분석은 인간에 의해 해석될 수 있거나 또는 자동화 장치로 정량될 수 있다. 해석 또는 정량화는 적어도 하나의 데이타세트의 생성을 야기시킨다.
부가적 양상에서, 세포 단편의 적어도 일부는 유세포 분석, FACS, 또는 입자 분석기에 의해 분석되고, 이러한 분석은 데이타 세트를 생성시킨다. 일 양상에서, 세포 단편의 적어도 일부로부터 적어도 하나의 세포 단편이 정제된다. 이러한 정제는 예를 들어 FACS, 친화도 정제, 크기 배제 분별 원심분리, 여과, 또는 전기영동에 의해 발생될 수 있다. 또다른 실시태양에서, 생체분자는 세포 단편의 적어도 일부로부터 정제된 적어도 하나의 세포 단편으로부터 단리될 수 있다. 생체분자는 PCR, 질량 분광법, 차세대 시퀀싱, 또는 ELISA에 의해 분석될 수 있다. 일 양상에서 분석은 적어도 하나의 데이타세트를 생성시킨다.
또다른 실시태양에서, 본 개시 내용의 방법은 물리적, 기계적, 화학적, 또는 효소적으로, 적어도 하나의 해리된 세포를 생성시키기 위해 균질물의 적어도 일부를 추가 가공시키는 단계를 더 포함한다. 해리된 세포는 정상 세포, 암 세포, 또는 세균 세포이다. 일 양상에서, 해리된 세포는 적어도 하나의 유리 슬라이드에 고정되고 조직학적 분석이 수행된다. 이러한 분석은 예를 들어, H&E 염색, IHC 염색, ISH 염색, 또는 FISH 염색을 포함할 수 있다. 부가적 실시태양에서, 분석은 인간에 의해 해석되거나 또는 자동화 디바이스로 정량된다. 부가적 실시태양에서, 해석 또는 정량화는 적어도 하나의 데이타세트를 생성시킨다. 부가적 양상에서, 적어도 하나의 해리된 세포로부터 적어도 하나의 세포가 FACS, 친화도 정제, 크기 배제 분별 원심분리, 여과, 또는 전기영동과 같은 수단에 의해 정제된다. 부가적 실시태양에서, 생체분자는 적어도 하나의 해리된 세포로부터 정제된 적어도 하나의 세포로부터 단리될 수 있다. 부가적 양상에서, 생체분자는 PCR, 질량 분광법, 차세대 시퀀싱, 또는 ELISA에 의해 분석될 수 있다. 부가적 실시태양에서, 이러한 분석은 적어도 하나의 데이타세트를 생성시킨다.
부가적 양상에서, 적어도 하나의 해리된 세포로부터 정제된 적어도 하나의 세포는 적어도 하나의 유리 슬라이드에 고정되고, 임의로는 조직학적 분석이 수행된다. 부가적 실시태양에서, 조직학적 분석은 H&E 염색, IHC 염색, ISH 염색, 또는 FISH 염색이다. 이러한 분석은 인간에 의해 해석될 수 있거나 또는 자동화 디바이스로 정량된다. 부가적 양상에서, 분석 또는 해석은 적어도 하나의 데이타세트를 생성시킨다.
부가적 실시태양에서, 상기 개시된 방법으로 생성된 데이타세트는 더욱 분석된다. 일 양상에서, 분석은 바이오마커 다양성 또는 표현형 다양성의 결정을 포함한다. 부가적 실시태양에서, 분석은 적어도 하나의 임상적 판단의 결정을 포함한다. 이러한 임상적 판단은, 일 양상에서, 질환 예후의 결정, 질환 재발의 예측, 질환 요법의 표적의 예측, 임상 시험의 대상체의 포함, 또는 적어도 하나의 대상체의 치료적 치료 전략을 포함한다.
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도 1A-1C는 병리학에서 샘플 수득을 위한 개시된 방법의 개략적인 대표도이다. 도 1A는 대장의 샘플 수득을 예시하고, 도 1B는 폐 조직의 신호 수득을 예시하며, 도 1C는 신장 조직의 샘플 수득을 예시한다.
도 2A 및 2B는 본 개시 내용의 균질물의 개략적인 대표도를 예시한다. 도 2A는 개시된 균질화 방법이 서브클론을 그들이 고형 종양 내에 존재하는 비율로 함유하는 대표 샘플을 어떻게 생성시키는지에 관한 예시도이다. 도 2B는 균질물이 낮은출현율 서브클론을 어떻게 용이하게 검출하는지에 관한 예시도이다.
도 3은 종양 내 불균질성을 대표하는 대표 종양 샘플을 생성시키기 위한 물리적, 기계적, 생화학적 방법을 사용하는 개략적으로 개시된 프로토콜을 도시하는 흐름도이다.
도 4는 대표 샘플의 크기 분획화에 의한 결과를 도시하는 그래프이다.
도 5A-C는 생화학적으로 분해된 대표 샘플의 일련의 여과 이후 수집된 통과액 및 유지된 분획의 H&E 염색을 도시한다. 도 5A는 메쉬에 유지된 분획(상부) 및 미크론 메쉬의 통과액(하부)의 H&E 염색을 예시한다. 도 5C는 메쉬에 유지된 분획(상부) 및 미크론 메쉬의 통과액(하부)의 H&E 염색을 예시한다.
도 6A-6D는 균질화를 통하고 이후에 열 및 pH 조건화에 의한 생화학적 소화에 의한 동물 조직과 혼합된 인간 유방암 세포로부터 유래된 Her2 양성 이종이식편에서 생성된 대표 샘플 중 단백질 검출을 도시한다. 도 6A는 85℃에서 CC1 완충제 중 사전조건화를 예시한다. 도 6B는 85℃에서 CC1 완충제 중 사전조건화 이후에 적어도 30분간 콜라게나아제 H 소화를 예시한다. 도 6C는 기계적으로 해리시킨, CC1 사전조건화된, 콜라게나아제 H 소화된 샘플을 예시한다. 도 6D는 도 6A-6C에 도시된 바와 같이 분석된 대표 샘플을 생성시키기 위해 Her2 양성 이종이식편과 블렌딩된, 동물 조직, 즉 닭가슴, 생선살, 및 닭간의 이미지이다.
도 7A 및 7B는 열 및 pH 조건화에 의한 생화학적 소화를 사용해 인간 조직으로부터 생성된 대표 샘플을 도시한다. 도 7A는 CC1로 사전조건화 후 콜라게나아제 H에 의한 30분 소화를 예시한다. 도 7B는 CC1 사전조건화 후 연장된 콜라게나아제 H 소화 기간을 예시한다.
도 8A-8D는 인간 신장 샘플로부터 생성된 대표 샘플 중 단백질 검출을 도시한다. 도 8A는 기계적 해리, 사전조건화, 및 효소적 소화 이후 대표 인간 신장 샘플의 H&E 염색을 예시한다. 도 8B는 PD-L1을 검출하기 위한 대표 인간 신장 샘플의 DAB-IHC 분석을 예시한다. 도 8C는 CD8을 검출하기 위한 대표 인간 신장 샘플의 DAB-IHC 분석을 예시한다. 도 8D는 Ep-Cam을 검출하기 위한 대표 인간 신장 샘플의 DAB-IHC 분석을 예시한다. 좌측 컬럼은 대표 샘플을 함유하는 슬라이드의 10배 확대도를 도시하는 한편, 우측 컬럼은 대표 샘플을 함유하는 슬라이드의 20배 확대도를 도시한다.
도 9A-9D는 인간 폐 샘플로부터 생성된 대표 샘플 중 단백질 검출을 도시한다. 도 9A는 대표 샘플을 생성시키기 위한 공급 재료로서 사용된 대략 3 cm 폐종양 샘플의 이미지이고, 도 9B는 기계적 해리, 사전조건화, 및 효소적 소화 후 대표 인간 폐 샘플의 H&E 염색을 예시하며, 도 9C는 PD-L1을 검출하기 위한 대표 인간 폐 샘플의 DAB-IHC 분석을 예시하고, 도 9D는 CD8을 검출하기 위한 대표 인간 폐 샘플의 DAB-IHC 분석을 예시하며, 도 9E는 Ep-Cam을 검출하기 위한 대표 인간 폐 샘플의 DAB-IHC 분석을 예시한다.
도 10은 대표 샘플 중 단백질 검출을 위한, 단계 1-102로 기재된, 예시적 DAB ICC 프로토콜을 예시한다. 이러한 구체적인 예에서, 이 프로토콜을 사용해 Her2를 검출하였다.
도 11은 대표 샘플 중 단백질 검출을 위한 예시적인 형광발광 ICC 프로토콜(단계 1-38로 기재함)을 제공한다.
도 12는 동물 조직 및 인간 편도선 시료의 혼합물로부터 제조된 대표 샘플에서 자동화 DAB ICC를 사용한, B-세포를 구별짓는 CD20의 검출을 도시한다. CD20은 대표 샘플에 함유된 인간 편도선 조직 유래의 세포에서 검출되었다.
도 13A 및 13B는 형광발광 ICC를 사용한 Her-2 양성 이종이식 종양 및 편도선 조직으로부터 제조된 대표 샘플에 존재하는 Her2-양성 Calu-3 세포의 검출을 도시한다. 도 13A는 2차 항체만 항온반응시킨(음성 대조구) Calu-3 세포를 함유하는 대표 샘플을 예시한다. 2차 항체에 의해 발생된 Calu-3 세포 중 배경 신호는 파선 화살표로 표시하였다. 도 13B는 2차 항체의 첨가 이전 Her2 항체(4B5)와 항온반응시킨 Calu-3 세포를 함유하는 대표 샘플을 예시한다.
도 14는 대표 샘플 중 복수 단백질의 검출을 위한 예시적인 복합 발색성 ICC 프로토콜(단계 1-225로 기재)을 제공한다.
도 15는 인간 편도선 시료로부터 생성된 대표 샘플 중 복합 발색성 IHC를 사용한 Ki-67, CD20, 및 CD3의 검출을 도시한다.
도 16은 대표 편도선 샘플 중 약 0.015%의 출현율로 존재하는, b-Raf-양성 세포의 검출을 도시한다.
도 17 은 균질화된 편도선 조직의 5배 확대도를 도시한다. 기준자는 50 미크론 길이를 의미함을 주의한다.
도 18A 및 18B는 잔여의 외과적 재료의 이미지를 도시한다. 도 18A는 여전히 8 cm 대장 선암종을 함유하는 대장 절제물 유래의 재료를 예시하고, 도 18B는 유두상 요로상피 신장 종양을 함유하는 신장의 부분 신장절제술에 의한 잔여 조직을 예시한다.
도 19A-19C는 대장의 선암종으로부터 수득된 별개의 조직학적 절편의 H&E 염색을 도시한다. 도 19A는 대장의 선암종으로부터 수득된 제1 절편을 예시하는 한편, 도 19B 는 대장의 선암종 유래의 제2의 상이한 절편을 예시한다. 도 19A 및 19B의 각 절편은 병리학자가 각각 수득하였다. H&E 염색의 차이는 동일 종양 내에서 변이를 보여준다. 도 19C 는 대장의 선암종으로부터 제조된 대표 샘플의 H&E 염색을 예시한다.
도 20A-20C는 유두상 요로상피 신장 종양으로부터 수득된 별개의 조직학적 절편의 H&E 염색을 도시한다. 도 20A는 유두상 요로상피 신장 종양으로부터 채취된 제1 절편을 예시하고, 도 20B는 유두상 요로상피 신장 종양으로부터 채취된 제2의 상이한 절편을 예시한다. 도 20A 및 20B에 예시된 각 절편은 병리학자가 수득하였다. H&E 염색의 차이는 동일한 종양 내 변이를 보여준다. 도 20C는 유두상 요로상피 신장 종양으로부터 제조된 대표 샘플의 H&E 염색을 예시한다.
도 21A-21C 는 대장의 선암종으로부터 수득된 별개의 조직학적 절편의 Alk DAB 염색을 도시한다. 도 21A는 대장의 선암종으로부터 채취된 제1 절편을 예시하고, 도 21B는 대장의 선암종으로부터 채취된 제2의 상이한 절편을 예시한다. 도 21A 및 21B에 예시된 각 절편은 병리학자가 수득하였다. Alk DAB 염색의 차이는 동일한 종양 내 변이를 도시한다. 도 21C는 대장의 선암종으로부터 제조된 대표 샘플의 Alk DAB 염색을 예시한다.
도 22A-C는 유두상 요로상피 신장로부터 수득된 별개의 조직학적 절편의 Alk DAB 염색을 도시한다. 도 22A는 유두상 요로상피 신장 종양으로부터 채취된 제1 절편을 예시하고, 도 22B는 유두상 요로상피 신장 종양으로부터 채취된 제2의 상이한 절편을 예시한다. 도 22A 및 22B에 예시된 각 절편은 병리학자가 수득하였다. Alk DAB 염색의 차이는 동일한 종양 내 변이를 도시한다. 도 22C는 유두상 요로상피 신장 종양으로부터 제조된 대표 샘플의 Alk DAB 염색을 예시한다.
도 23은 원심분리에 의해 생화학적으로 소화된 대표 샘플로부터 단리한 종양-학습된 혈소판 및 다른 혈액 세포의 이미지이다. 인간 난소 장액성 암종 종양을 블렌딩하고 아큐맥스(Accumax) 및 콜라게나아제 H로 소화시키고 원심분리하여 그 결과 원심분리된 샘플의 상부에 혈소판 및 적혈 세포의 축적이 일어났다(적색선).
도 24는 파라핀 블록으로부터 회수된 조직으로 제조된 대표 샘플 중 Caski 세포 상의 HPV16 ISH의 염색을 도시한다. 이전에 파라핀 왁스에 포매된 조직을 회수하였고 IKA에서 균질화시켜 대표 샘플을 생성시켰다.
도 25A-D는 자르고 저민 편도선으로 만든 H&E 염색된 조직학적 슬라이스를 도시한다. 도 25A 및 25B는 손으로 자른 조직(∼2 ㎟)을 예시한데 반해 도 25C 및 25D는 "주서(juicer)"로 저민 조직(∼200 ㎛2)을 예시한다.
도 26A-26D는 기계적으로 블렌딩하고 여과시킨 대장 종양 샘플을 도시한다. 도 26A는 수집물 1의 명시야 이미지이고, 도 26B는 수집물 2의 명시야 이미지이며, 도 26C는 수집물 3의 명시야 이미지이고, 도 26D는 여과물의 명시야 이미지이다.
도 27A-도 27C는 기계적으로 해리되고 여과된 단일 세포의 크기 분포를 도시한다. 도 27A는 대장 종양 샘플 유래의 세포를 도시하고, 도 27B는 편도선 유래의 기계적으로 해리되고 여과된 면역 세포의 세포를 도시하며, 도 27C는 대장 종양 샘플에서 유래된 기계적으로 해리되고 여과된 세포에서 분류한 EpCAM 양성 세포(종양 세포)를 도시한다.
도 28은 대장 종양 샘플로부터 기계적으로 해리 및 여과시키고 Sony SH800 세포 분류기로 분류시킨 EpCAM 양성 종양 세포의 형광 이미지를 도시한다.
도 29A-29F는 CK8/18(도 29B), CD45(도 29C), CD8(도 29D), PD-L1(도 29E) 및 EGFR(29F) 세포 마커로 염색하고 어튠 어쿠스틱 포커싱(Attune acoustic focusing) 유세포분석기로 분석한 기계적으로 해리되어 여과시킨 대장 종양 세포를 도시하였다. 도 29A는 더블렛 구별에 어떻게 FSC-A 대비 FSC-H를 사용하는지를 예시한다. 적색: 양성 염색 세포 및 바이올렛: 대조군(1차 Ab없이 염색된 세포).
도 30A-30C는 Sony SH800 세포 분류기를 사용해 분류된 EpCAM 양성 세포의 분석을 도시한다. 도 30A는 텍사스 레드를 이용하였고, 도 30B는 DAPI를 이용하였으며, 도 30C는 DAPI를 이용하였다. EpCAM 양성 세포는 DAPI 강도 그래프를 기반으로 DNA 함량이 더 높은 세포에 해당된다.
도 31A 및 도 31B는 자성 비드를 사용해 분류된 편도선 해리 세포를 도시한다. 도 31A는 FSC-A 대비 FSC-H를 더블렛 구별에 사용하였음을 보여준다. 특정 한계치 이상의 형광발광성 세포를 비교에 사용하였다. 도 31B는 고갈 이전 및 이후 전체 세포 개체군 중 형광발광성 세포(CD3 또는 CD8 양성 세포)의 비율을 도시하는 막대 그래프를 예시한다.
도 32는 다세포 응집물의 초음파처리를 도시한다. 다세포 응집물(12 내지 18 ㎛의 개체군 크기)의 초음파처리로 단일 세포(5.5 내지 9.3 ㎛의 개체군 크기)가 제공된다. 생성된 단일 세포의 크기는 종양 세포의 그것에 상응한다.
도 33A-33D는 콜라게나아제로 처리후 초음파처리된 다세포 응집물을 도시한다. 도 33A는 초음파처리한 콜라게나아제 처리된 세포 응집물의 크기 분포를 도시하고, 도 34B는 초음파처리하지 않은 콜라게나아제 처리된 세포 응집물의 크기 분포를 도시한다. 도 33C는 도 33A에 표시된 샘플의 이미지를 예시하고, 도 33D는 도 33B에 표시된 샘플의 이미지를 예시한다.
도 34는 대표 샘플(Rep) 및 신선한(Trad) 편도선 조직으로 만들어진 균질물로부터 유리된 RNA 및 DNA를 도시한다.
도 35A-35D는 6개월 동안 상이한 저장 조건에서 RNA의 안정성을 도시한다. 도 35A는 췌장 고분화성 신경내분비 신생물 유래의 조직을 필요에 따라 표준 세포 저장 용액에 항온반응시킨 것을 예시하고, 도 35B는 유두상 요로상피 암종 유래의 조직을 필요에 따라 표준 세포 저장 용액에 항온반응시킨 것을 예시하며, 도 35C는 대장 선암종 유래 조직을 표시한 대로 표준 세포 저장 용액에 항온반응시킨 것을 예시한다.
도 36A 및 B는 6개월 동안 상이한 저장 조건에서 단백질 안정성을 도시한다. 도 36A는 C-met에 대해 IHC로 측정시, 단백질이 모든 저장 조건 및 온도에서 유두상 요로상피 암종에서 안정한 것을 예시하고, 도 36B는 C-met에 대한 IHC에 의해 측정시 단백질이 모든 저장 조건 및 온도에서 대장 선암종에서 안정함을 예시한다.
도 37 및 37B는 대장 선암종으로 만들어진 대표 샘플에 대한 반복적인 동결/해동 주기 동안 세포 및 단백질 안정성을 도시한다. 도 37A는 H&E 염색으로 검정시 세포 형태의 안정성을 예시하며, 도 37B는 C-met에 대해 세포를 염색하여 결정시 단백질 안정성을 예시한다.
도 38은 대장 선암종으로 만들어진 대표 샘플에 대한 반복적인 동결/해동 주기 동안 핵산(DNA 및 RNA) 안정성을 도시한다.
도 39는 Her2/Chr17 검출 스택(stack)의 예시도를 도시한다.
도 40은 탈파라핀화 실험을 도시한다. 대장 조직으로부터 제조되고 Her2(은) 및 염색체 17(적색)에 대해 염색된 단리된 핵의 이미지(40x). 실험된 탈파라핀화 선택안은 A LCS 탈파라핀화, B EZ 조제물 탈파라핀화, 및 C 탈파라핀화 위치에 습윤 적재 선택안이었다.
도 41은 하이브리드화 항온반응 실험을 도시한다. 대장 조직으로부터 제조되고 Her2(은) 및 염색체 17(적색)에 대해 염색된 단리된 핵의 이미지(40x). 실험된 하이브리드화 선택안은 A 1 시간 하이브리드화, B 2 시간 하이브리드화, 및 C 4 시간 하이브리드화였다.
도 42A 및 42B는 효소적 방법으로 해리된 편도선 조직 유래의 대표 샘플을 도시한다. 도 42A는 30분(좌측 패널) 또는 24시간(우측 패널) 동안 37℃에서, 5 mg/mL의 펩신으로 소화시킨 조직의 H&E 염색된 슬라이드를 예시한다. 도 42B는 30분(좌측 패널) 또는 24시간(우측 패널) 동안 37℃에서, 0.25% 트립신으로 소화시킨 조직의 H&E 염색된 슬라이드를 예시한다.
도 43은 표 6에 열거된 상이한 효소적 방법을 사용해 평행한 대표 편도선 샘플로부터 단리된 100 미크론 이하 입자의 그래프이다.
도 44A는 기계적 또는 프로테이나아제 K-펩신 방법으로 해리된 대표 편도선 샘플로부터 단리된 100 미크론 이하 입자를 예시하는 그래프를 도시한다. 에러바는 3회의 독립 실험의 S.D.를 나타낸다. ** 단측 T 검정을 사용하여 p=0.0037. 도 44B는 기계적 해리를 사용해 단리된 입자의 H&E 염색된 슬라이드의 명시야 이미지를 도시하고, 도 44C는 프로테이나아제 K 펩신 해리 방법을 사용하여 단리된 입자의 H&E 염색된 슬라이드의 명시야 이미지를 도시한다.
도 45A 및 45B는 핵 단리의 재현성을 도시한다. 도 45A는 대장(N=3) 및 폐 종양(N=4) 유래의 대표 샘플의 분취물로부터 단리된 핵 입자의 평균 수율을 도시하는 막대 그래프이다. 도 45B는 크기화 입자 빈으로 대표 대장 종양 샘플의 분취물로부터 제조된 핵 입자의 분포를 도시하는 그래프이다.
도 46A 및 46B는 기계적 및 효소적 처리와 연관된 세포 손상의 측정을 도시한다. 도 46A는 기계적(Mech) 또는 프로테이나아제 K(ProtK)-펩신 방법을 사용해 대표 편도선 샘플의 해리에 의해 방출된 DNA 평균 비율을 도시하는 막대 그래프이다. 도 46B는 대표 종양 샘플의 해리에 의해 방출된 DNA의 비율을 도시하는 막대 그래프이다.
도 47A 및 47B는 프로테이나아제 K-펩신 방법을 사용하여 포르말린 고정된 편도선 조직으로부터 단리된 입자의 응집물의 유세포측정 분석을 도시한다. 도 47A는 autoMACS 완충제를 사용해 제조된 샘플을 도시하고, 도 47B는 autoMACS과 1% Tween 20을 사용해 제조된 샘플을 도시한다.
도 48A-48D는 사이토케라틴 8/18(CK-8/18)에 대해 염색된 대장 선암종(ADC)을 도시한다. 도 48A는 면역조직화학(IHC)을 사용하여 CK-8/18에 대해 염색된 조직 절편의 명시야 이미지를 예시한다. CK-8/18로 가시화시킨 ADC 조직은 갈색으로 염색되었다. 도 48B는 기계적으로 해리시키고, 파라핀 왁스에 포매하여, 절편화시키고 IHC를 사용해 CK-8/18에 대해 염색시킨 대표 샘플의 명시야 이미지를 예시한다. CK-8/18-양성 조직은 갈색으로 염색되었다. 도 48C는 프로테이나아제 K-펩신 방법을 사용해 해리시키고 용액 중에서 DAPI 및 CK-8/18에 대해 염색시키고, Alexa 488로 가시화시킨 대표 샘플의 형광발광 이미지를 예시한다. 위색 이미지는 CK-8/18(녹색) 및 DAPI(파란색) 염색을 반영한다. 도 48D는 CK-8/18 항체없이 항온반응시킨, 도 48C에 기술된 조직의 음성 대조군 샘플을 예시한다. 모든 샘플은 동일한 대장 ADC 종양으로부터 제조되었다.
도 49A 및 49B는 티라미드 신호 증폭(Tyramid Signal Amplification: TSA)이 대표 샘플로부터 단리된 재료의 염색을 개선시킴을 보여준다. 도 49A는 표준 면역형광발광(IF, 상부 좌측 패널) 또는 TSA(상부 우측 패널) 방법에 의해 CD45(적색)에 대해 염색된 고정된 편도선 조직으로부터 기계적으로 단리된 세포의 이미지(20x)를 예시한다. DAPI 염색(파란색)은 핵을 표시한다. 100 ms 노출을 양쪽 이미지에 대해 사용하였다. 도 49B는 TSA를 사용해 염색된 고정된 종양 조직으로부터 단리된 핵의 이미지(40x)이다. 좌측 패널은 1차 항체없이 염색된 세포의 이미지(음성 대조군)를 도시하고, 우측 패널은 항-사이토케라틴(적색) 1차 항체에 의한 염색을 도시한다. DAPI 염색(파란색)은 핵을 표시한다. 2 ms 노출을 모든 이미지에 대해 사용하였다.
도 50은 양성 사이토케라틴(CK) 염색이 종양 핵을 정상과 구별한다는 것을 보여준다. 대장 종양(상부 패널) 또는 폐 종양(하부 패널) 대표 샘플로부터 단리된 핵에 대한 유세포분석 데이타의 히스토그램.
도 51A-51C는 종양의 세포 조성을 도시한다. 도 51A는 대장 선암종(389)으로부터 단리된 핵의 분획을 예시하고, 도 51B는 유세포분석을 사용해 정상 대 종양으로 표시된 폐 편평상피 암종(528)로부터 단리된 핵의 분획을 예시한다.
도 52는 대표 샘플로부터 단리된 핵으로부터의 DNA 수율의 정량화를 도시한 그래프를 예시한다.
도 53A 및 53B는 범-케라틴 항체로 염색된 온전한 편도선으로부터 채취된 조직학적 절편의 전체 슬라이드 이미지를 도시한다. 도 54A는 범-케라틴에 대해 DAB에 의해 검출된 정상 편도선의 전통적인 조직학적 절편을 도시한다. 도 54B는 범-케라틴에 대해 DAB에 의해 검출된 편도선의 대표 샘플 유래의 절편을 도시한다.
도 55A 및 55B는 균질화된 편도선을 파라핀에 포매하고 절편화시킨 샘플의 이미지이다. 도 55A는 CD8에 대해 DAB에 의해 검출된 정상 편도선의 전통적인 조직학적 절편을 도시한다. 도 55B는 CD8에 대해 DAB에 의해 검출된 편도선의 대표 샘플 유래의 절편을 도시한다.
도 56은 현 개시내용의 작업흐름의 다이아그램이다.
본 공개는 기술된 특정 양상에 제한된다기 보다는, 물론 변경될 수 있다는 것을 이해한다. 또한 본 명세서에서 사용되는 용어는 본 공개의 범주가 오직 첨부된 청구항에 의해서 제한될 것이므로 오직 특정 양성을 설명하려는 목적을 위한 것이고, 제한하려는 것이 아님을 이해한다.
달리 한정하지 않으면, 본 명세서에서 사용되는 모든 기술적 용어 및 과학 용어는 이 기술이 속하는 분야의 숙련가 중 한명이 통상적으로 이해하는 바와 동일한 의미를 갖는다. 본 명세서에 기술된 것과 유사하거나 또는 균등한 임의 방법 및 재료가 본 기술의 실시 또는 검사에서 사용될 수 있지만, 바람직한 방법, 디바이스 및 재료를 이제 설명한다. 본 명세서에서 인용하는 모든 기술 및 특허 공개물은 그들 전체로 참조로 본 명세서에 편입된다. 본 명세서의 어떠한 것도 본 기술이 이전 방법에 의해서 이러한 개시에 선행한다는 자격을 부여하지 않는다는 것을 인정하는 것으로 해석되지 않는다.
본 기술의 실시는 달리 표시되지 않으면, 당업자에게 속하는, 조직 배양, 면역학, 분자 생물학, 미생물학, 세포 생물학, 및 재조합 DNA의 통상의 기술을 적용할 것이다. 예를 들어, 하기 문헌들을 참조한다: Sambrook and Russell eds.(2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd edition; the series Ausubel et al. eds.(2007) Current Protocols in Molecular Biology; the series Methods in Enzymology(Academic Press, Inc., N.Y.); MacPherson et al.(1991) PCR 1: A Practical Approach(IRL Press at Oxford University Press); MacPherson et al.(1995) PCR 2: A Practical Approach; Harlow and Lane eds.(1999) Antibodies, A Laboratory Manual; Freshney(2005) Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique, 5th edition; Gait ed.(1984) Oligonucleotide Synthesis; U.S. Patent No. 4,683,195; Hames and Higgins eds.(1984) Nucleic Acid Hybridization; Anderson(1999) Nucleic Acid Hybridization; Hames and Higgins eds.(1984) Transcription and Translation; Immobilized Cell and Enzyme(IRL Press(1986)); Perbal(1984) A Practical Guide to Molecular Cloning; Miller and Calos eds.(1987) Gene Transfer Vectors for Mammalian Cell(Cold Spring Harbor Laboratory); Makrides ed.(2003) Gene Transfer and Expression in Mammalian Cell; Mayer and Walker eds.(1987) Immunochemical Methods in Cell and Molecular Biology(Academic Press, London); 및 Herzenberg et al. eds(1996) Weir's Handbook of Experimental Immunology.
모든 수치 표시, 예를 들어 범위를 포함하는 pH, 온도, 시간, 농도, 및 분자량은 적절하다면 1.0 또는 0.1의 증분에 의해, 또는 대안적으로 +/- 15 %, 또는 대안적으로 10%, 또는 대안적으로 5%의 변동, 또는 대안적으로 2%의 변동에 의해 (+) 또는 (-)로 변화되는 근사치이다. 항상 명확하게 명시되지 않더라도, 모든 수치 표시는 용어 "약"이 선행된다는 것을 이해한다. 항상 명확하게 명시되지 않더라도, 본 명세서에서 기술되는 시약은 단지 예시적이며 이들의 균들물이 당분야에 공지되어 있다는 것을 이해한다.
본 기술이 폴리펩티드, 단백질, 폴리뉴클레오티드 또는 항체에 관한 것일 때, 이의 균등물 또는 생물학적 균등물을 본 기술의 범주에 포함시키고자 한다는 것은 명확한 설명 없이 달리 의도하지 않더라도 추론된다.
명세서 및 청구항에서 사용시, 단수 형태 "한", "하나" 및 "그"는 내용에서 명학하게 달리 명시하지 않으면 복수 인용을 포함한다. 예를 들어, 용어 "한 세포" 는 이의 혼합물을 포함하는 복수의 세포를 포함한다.
본 명세서에서 사용시, 용어 "동물"은 예를 들어, 포유동물 및 조류를 포함하는 살아있는 다세포 척추동물 유기체를 의미한다. 용어 "포유동물"은 인간 및 인간이외의 포유동물 둘 모두를 포함한다.
용어 "대상체", "숙주", "개체" 및 "환자"는 인간 및 수의학적 대상체, 예를 들어 인간, 동물, 인간이외의 영장류, 개, 고양이, 양, 쥐, 말, 및 소를 언급하기 위해 본 명세서에서 상호교환적으로 사용된다. 일부 실시태양에서, 대상체는 인간이다.
"조성물"은 전형적으로 활성제, 예를 들어 화합물 또는 조성물, 및 천연 발생 또는 비천연 발생 담체, 불활성(예를 들어, 검출가능한 작용제 또는 표지) 또는 활성, 예컨대 보조제, 희석제, 결합제, 안정화제, 완충제, 염, 친지성 용매, 보존제, 보조제 등의 조합을 의도하며, 약학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 담체는 또한 중량 또는 부피 기준으로 1 내지 99.99%의 조합 또는 단독을 포함하여, 단독으로 또는 조합으로 존재할 수 있는 약학적으로 부형제 및 첨가제 단백질, 펩티드, 아미노산, 지질, 및 탄수화물(예를 들어, 단당류, 이올리고당, 삼올리고당, 사올리고당, 및 올리고당을 포함한 당류; 유도당 예컨대 알디톨, 알돈산, 에스테르화 당 등; 및 다당류 또는 당 중합체)을 포함한다. 예시적 단백질 부형제는 혈청 알부민 예컨대 인간 혈청 알부민(HSA), 재조합 인간 알부민(rHA), 젤라틴, 카세인 등을 포함한다. 또한 완충 능력으로 기능할 수 있는 대표 아미노산/항체 구성요소는 알라닌, 알르기닌, 글라이신, 아르기닌, 베타인, 히스티딘, 글루탐산, 아스파르트산, 시스테인, 리신, 류신, 이소류신, 발린, 메티오닌, 페닐알라닌, 아스파르탐 등을 포함한다. 탄수화물 부형제가 또한 이 기술의 범주에 포함하고자 하며, 이의 예에는 제한없이 단당류 예컨대 프룩토스, 말토스, 갈락토스, 글루코스, D-만노스, 솔보스 등; 이당류, 예컨대 락토스, 수크로스, 트레할로스, 셀로비오스 등; 다당류 예컨대 라피노스, 멜레지토스, 말토덱스트린, 덱스트란, 전분 등; 및 알디톨, 예컨대 만니톨, 자일리톨, 말티톨, 락티톨, 자일리톨 솔비톨(글루시톨) 및 미오이노시톨을 포함한다.
달리 정의하지 않으면, 본 명세서에서 사용하는 모든 기술 및 과학 용어는 본 개시 내용이 속하는 분야의 숙련가 중 한명이 통상적으로 이해하는 것과 동일한 의미를 갖는다.
본 공개에서 용어 "대표 샘플"은 전체의 구성요소를 정확하게 반영하는 샘플(또는 이의 서브셋)을 의미하고, 따라서 샘플은 전체 개체군의 비편향 지표이다. 샘플은 공간적으로 분리된 세포 구조로 본래 구성되고, 공간적으로 분리된 세포 유형으로 더욱 조직화된 고형 기관, 조직, 및 종양("OTT")으로부터 유래된다. 대표적인 샘플채취 기술 및 방법은 OTT의 공간적으로 계측화된 3차원 구조를 충분히 균질화, 혼합, 또는 아니면 파괴하여서 원래의 공간적으로 계층화된 OTT의 구성요소(세포 구조, 세포, 펩티드, 핵산, 지질, 대사물 등)가 그들이 원래의 장기, 조직 또는 종양에 존재하는 비율로 서브샘플(a.k.a-분석 샘플)에 존재하는 것이다. 일부 실시태양에서, 대표 샘플은 부착된 세포의 클러스터, 개별 세포, 세포의 단편, 소기관, 펩티드, 핵산, 지질, 대사물 등의 수준에서 OTT의 다양성을 대표하려는 목적을 접근하기 위해 OTT의 상당히 충분한 부분을 포함하거나 또는 OTT의 전체를 접근하는, 가능한 많은 OTT로 구성된 OTT의 샘플을 의미한다. 대표 샘플은 OTT의 다양성을 포괄하는데 필요한 온전한 OTT의 최소량을 함유할 수 있다. 부가적 실시태양에서, 대표 샘플은 복수의 절편 또는 입자를 포함할 수 있고 여기서 이들 입자의 적어도 일부는 파라핀에 포매되고 입자의 나머지의 적어도 일부는 균질화된다.
복수의 대표 샘플은 단일 OTT로부터 제조될 수 있다. 이러한 실시태양에서, 수술적으로 제거되거나 또는 절개된 OTT는 먼저 별개의 서브유닛으로 가공되거나 또는 아니면 조작되어서, 각 서브유닛은 공간적으로 계측화된 세포 구조, 세포, 펩티드, 핵산 등으로 구성된다. 각 서브유닛을 이후 충분하게 균질화시키거나, 혼합하거나 또는 아니면 파괴하여 OTT 서브유닛의 대표 샘플을 생성시킨다.
대표 샘플은 임의의 분석 샘플, 또는 대표 샘플의 일부분이 대표 샘플에 존재하는 재료의 무작위 샘플채취를 함유하는 지점까지 균질화되거나 또는 아니면 혼합되거나 또는 파괴될 수 있다. 분석 샘플은 적용되는 분석 검사의 의도하는 출력에 대해 대표 샘플의 다양성(즉, 세포 대 부착된 세포의 클러스터)을 포함하도록 충분히 큰 분획이다. 특이적 어세이에 사용되는 임의의 분석 샘플은 실험 오차 내에서, 동일한 어세이에 사용되는 또 다른 분석 샘플과 일관적인 데이타를 생성하게 될 것이다. 또한, 특이적 어세이에 선택된 임의의 분석 샘플은 동일한 대표 샘플, 또는 동일한 환자, 상이한 환자, 또는 환자 또는 대상체의 조합 유래의 OTT에서 만들어진 대표 샘플로부터 채취된 분석 샘플을 사용하는 상이한 어세이로 생성된 데이타를 교차 참조할 수 있는 정보를 제공한다. 원래의 생물학적 구성요소의 비율이 대표 샘플로부터 채취된 모든 분석 샘플에 존재하기 때문에, OTT의 생물학적 구성요소의 비율에 관련된 분석 샘플로부터 생성된 데이타는 환자 또는 환자의 조합 간에 비교할 수 있다.
분석 샘플보다 다양성 덜 함유하는 다른 샘플은 분석을 위한 대표 샘플, 예를 들어 단일 세포로부터 채취될 수 있다. 그러나, OTT의 대표 샘플로부터 채취된 수백만 단일 세포는 "대표 종양학 데이타"를 포함하는 "대표 데이타 세트"를 생성시킨다.
하나의 실시태양에서, 세포 또는 세포 구성요소는 대표 샘플 이의 일부 내에서 그들의 상대적 비율 또는 백분율이 전체의 온전한 조직 시료 내의 이들 세포 유형 또는 구성요소의 상대적 비율 또는 백분율을 정확하게 반영하거나 또는 모방하도록 대표 샘플 내에서 해리된다. 시료는 하나의 실시태양에서 고형 종양, 림프절, 전이물, 폴립, 낭포, 또는 이의 일부분 또는 임의의 전술한 것의 조합일 수 있다.
하나의 실시태양에서, 본 명세서에 개시된 대표 샘플은 대상체로부터 수득된 거대 부피의 온전한 조직 또는 종양 샘플(예컨대 임상적 종양 샘플) 또는 림프절 또는 전이 또는 이의 조합의 균질화에 의해 수득된다. 예를 들어, 전체 종양 또는 이의 실질적인 일부분, 예를 들어, 종양 또는 림프절의 적어도 50%, 적어도 75%, 또는 적어도 95%, 또는 바람직하게는 전부는 대표 샘플이 생성되는 입력 재료로서, 사용될 수 있다. 대표 샘플은 고형 종양 유래의 온전한 종양 생검 샘플로부터 생성될 수 있다. 하나의 실시태양에서, 샘플은 임의로 종양의 공간적으로 구별되는 영역 유래의, 적어도 약 100-200; 200-1,000; 1,000-5,000; 10,000-100,000; 100,000-1,000,000; 1,000,000-5,000,000; 5,000,000-1,000,000,000; 1,000,000,000-5,000,000,0000, 또는 그 이상의 세포를 포함한다. 일반적으로, 약 1 cm 직경을 갖는 종양 또는 이의 일부분에 약 십억개의 세포가 존재하며, 대부분의 부분에서 이러한 관련성은 선형적 규모로 진행된다. 예를 들어, 절제 샘플 예컨대 약 2 cm 직경을 갖는 생검은 3 내지 5십억개 세포를 포함할 수 있다. 또다른 실시태양에서, 본 명세서에 개시된 대표 샘플은 예를 들어 유전자 돌연변이 또는 이전 암의 결과로서 암이 발생될 위험성이 있는 대상체에서 유래되는 하나 이상의 추정 정상 조직 시료, 또는 대조군 샘플로서 사용을 위해 수술적 절제에 의한 인접한 정상 조직의 균질화에 의해 수득된다.
부가적 실시태양에서, 용어 "대표 종양 샘플"은 종양, 예를 들어, 절개된 종양, 또는 잠재적으로 암 세포를 함유하는 샘플, 또는 암 세포의 잠재적 존재에 대해 검사하려는 샘플, 예컨대 림프절로부터 제조된 대표 샘플을 의미한다. 유사하게, 어구 "종양 샘플"은 종양 또는 암 세포를 잠재적으로 함유하는 샘플, 또는 암 세포의 잠재적 존재에 대해 검사되는 샘플, 예컨대 림프절로부터 제조되는 샘플을 포함한다.
부가적 실시태양에서, 용어 "대표 정상 샘플"은 추정 정상 조직, 예를 들어, 환자로부터 수득된 생검, 폴립, 또는 낭포, 또는 면역 불규칙성을 시사하는 면역 세포 또는 전암성 세포 또는 암의 잠재적 존재에 대해 검사되는 샘플로부터 제조된 대표 샘플을 의미한다. 유사하게, 어구 "정상 샘플"은 추정 정상 조직, 예를 들어, 잠재적으로 암을 함유하거나, 또는 암 세포의 잠재적 존재에 대해 검사되는 생검, 폴립, 또는 낭포로부터 제조된 샘플을 포함한다. 부가적 실시태양에서, "정상 샘플"은 또한 종양 샘플이 질환 상태로 인해 표현형 변화를 동정하기 위해 비교할 수 있는 아마도 질환이 없는 조직을 의미할 수 있다.
본 명세서에서 사용시 용어 "대표 데이타"는 임의의 데이타 세트(예를 들어, 유전자의 발현, 특정 세포 유형(예를 들어, 면역 세포)의 백분율, 단백질 발현, SNP 발현 또는 이의 결여, 마이크로 RNA 발현의 수준, 분량, 또는 조직학적 아형의 수) 또는 그의 공급원이 조직, 장기 또는 종양의 대표 샘플로부터 유래된 것인, 전체 데이타 세트를 정확하게 반영하는 비교적 적은 분량의 데이타를 의미한다. 하나의 실시태양에서, 대표 데이타는 전체 조직, 장기 또는 종양의 다양성을 의미하는 편향되지 않은 데이타이다. 본 명세서에서 사용시, "데이타세트"는 데이타의 컬렉션이다. 하나의 실시태양에서, 데이타세트는 별개의 성분으로 구성되지만 유닛으로서 조작될 수 있다. 하나의 실시태양에서, 데이타세트는 바이오마커 다양성 또는 표현형 다양성에 관련된 정보를 포함할 수 있다.
본 명세서에서 사용시, 용어 "조직학적 분석"은 식물 및 동물의 세포 및 조직의 현미경적 해부학의 실험을 의미한다. 이러한 분석은 샘플의 생물학적 구성요소, 예를 들어 핵산(RNA, DNA), 단백질 지질 또는 대사물과 관련되어 정보를 수집하는데 도움이 된다. 조직학적 기술은 당업자에게 공지된 것을 포함하고, 일부 비제한적인 예는 PCR, 질량 분광법, 차세대 시퀀싱 및 ELISA를 포함한다. 또한, 조직학적 분석은 하나 초과의 생물학적 구성요소의 동시 검출, 즉 다중화를 포함할 수 있다.
본 명세서에서 사용시, "임상적 판단을 하다"는 진단적 결론을 도출하고 어떠한 치료를 환자에게 제공할지를 결정하기 위해 정보를 수집하고 이 정보를 통합하는 것을 의미한다. 이러한 진단적 결론은 환자가 앓는 질환 및 어떠한 검사를 환자에게 수행해야 하는지를 포함할 수 있다. 하나의 실시태양에서, 임상적 판단은 질환 예후의 결정, 질환 재발의 예측, 질환 요법의 표적 예측, 임상 시험의 대상체의 포함, 또는 적어도 하나의 대상체에 대한 치료적 치료 전략의 결정을 포함할 수 있다.
본 명세서에 사용시, 용어 "균질물"은 조직을 균질화시키거나 또는 가공시킨 후 수득된 생물량을 의미한다. 균질물은 제한없이 세포, 펩티드, 핵산, 지질, 대사물 등을 포함하는, 조직 유래의 임의의 세포 구성요소를 함유할 수 있다. 일 양상에서, 균질물은 그것이 유래되는 조직의 구성요소의 일부분, 비율, 또는 분획을 정확하게 반영하는 대표 샘플이다. 일부 실시태양에서, 균질물(또는 균질물의 일부 또는 각 서브셋)의 세포 구조, 세포 구성요소, 또는 임의의 구성성분(세포, 펩티드, 핵산, 지질, 대사물 등)의 비율은 원래의 온전한 조직 중 세포 구조, 세포 구성요소, 또는 임의 구성성분의 비율과 동일하거나, 유사하거나 또는 실질적으로 유사하다. 대표 샘플처럼, 균질물은 장기, 조직 또는 종양의 다양성을 포괄하는데 필요한 온전한 장기, 조직 또는 종양의 최소량을 함유할 수 있다.
균질물이 유래되는 조직(들)은 하나의 조직, 2종의 조직, 또는 복수의 조직으로부터 비롯될 수 있다. 일부 실시태양에서, 균질물은 하나의 대상체, 2종의 대상체, 또는 둘 초과의 대상체로부터 비롯될 수 있다. 일 양상에서, 둘 이상의 대상체는 유전적으로 균질한 대상체이다. 또다른 양상에서, 둘 이상의 대상체는 표현형적으로 균질한 대상체이다. 일부 양상에서, 둘 이상의 대상체는 유전적으로 다양한 대상체이다. 일 양상에서, 둘 이상의 대상체는 표현형적으로 다양한 대상체이다. 또다른 양상에서, 둘 이상의 대상체는 동일한 성별로부터 유래된다. 추가의 양상에서, 둘 이상의 대상체는 상이한 성별로부터 유래된다. 다른 양상에서, 둘 이상의 대상체는 상이한 인종 집단으로부터 유래된다. 일 양상에서, 둘 이상의 대상체는 동일한 인종 집단으로부터 유래된다. 또다른 양상에서, 대상체는 동물 또는 인간 대상체로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 명세서에서 사용시, 용어 "실질적으로"는 품질 또는 분량에서 높은 정도, 예를 들어, 적어도 약 60%, 또는 대안적으로 적어도 약 70%, 또는 대안적으로 약 80%, 또는 대안적으로 약 85%, 또는 대안적으로 약 90%, 또는 대안적으로 약 95%, 또는 대안적으로 약 98%의 동일성을 의미한다.
"유사한"은 100% 미만으로 동일하거나, 또는 대안적으로 98% 초과로 동일하거나, 또는 대안적으로 95% 초과로 동일하거나, 또는 대아적으로 90% 초과로 동일하거나, 또는 대안적으로 85% 초과로 동일하거나, 또는 대안적으로 80% 초과로 동일하거나, 또는 75% 초과로 동일한 것을 의미한다. 용어 "균질한"은 적어도 80%, 또는 대안적으로 적어도 85%, 또는 대안적으로 적어도 90%, 또는 대안적으로 적어도 95%, 또는 대안적으로 적어도 98%의 동일성, 또는 대안적으로 적어도 100%의 동일성을 의도한다. 비균질한은 80% 미만으로 동일한 것을 의도한다.
본 명세서에서 사용시 용어 "가공된"은 균질물 조성물에 대해서, 최소로, 물리적, 기계적, 또는 화학적 처리를 수행한 것을 의미한다. 일 양상에서, 최종적인 균질물 조성물에 대해서 둘 초과의 유형의 가공이 수행된다. 다른 양상에서, 균질물 조성물에 대해서 3가지 유형의 가공이 수행된다. 또다른 양상에서, 균질물에 대해 4가지 또는 그 이상의 유형의 가공이 수행된다.
용어 "∼로부터 유래되는"은 샘플이 공급원으로부터 수득되거나 또는 취득된 것을 의미한다.
용어 "서브셋"은 보다 큰 집단의 일 부분 또는 구성요소를 의미한다. "비율"은 구성요소 또는 일부분의 보다 큰 집단에 대한 일부분의 상대적인 정량적 값이다.
본 명세서에서 사용시, 용어 "세포 구조", "세포 구성요소," 또는 "성분"은 세포, 조직 또는 유기체 내의 임의의 물질 또는 재료, 또는 세포, 조직 또는 유기체가 가공되는 동안 및 그 이후에 생성된 임의의 물질 또는 재료를 의미하기 위해 상호교환적으로 사용될 수 있다. 물질 또는 재료는 세포, 조직 또는 유기체에 대해 선천적이거나 또는 외래의 것일 수 있다. 일부 양상에서, "세포 구조" 및 "세포 구성요소"는 또한 예를 들어 염료 또는 방사성 재료로 세포 또는 핵산을 변형시키거나 또는 가공시키는 임의의 물질 또는 재료를 포 함할 수 있다. 세포 구조 또는 세포 구성요소는 제한없이 세포, 수용체, 단백질, 지질, 세포 소기관, 막, 화학물, 핵산, 소형 분자, 세균, 원생동물, 바이러스, 기생동물 및/또는 이의 일부분 또는 분획을 포함한다. 본 명세서에서 사용시, "세포 단편"은 전체 세포, 예컨대 핵, 세포막 및 세포 소기관의 일부분을 포함한다.
본 명세서에서 사용시, 용어 "공간적으로 구별되는" 또는 "공간적으로 분리되는"은 3차원 공간의 상이한 영역에 분포된 성분을 의미한다. 하나의 실시태양에서, 대표 샘플은 종양 내에서 암 세포의 공간적으로 구별되는 하위개체군의 모두를 포획한다. 또다른 실시태양에서, 대표 샘플을 생성시키는데 사용되는 종양 샘플은 종양 샘플의 상이한 영역으로부터 채취된다. 예를 들어, 전체 종양 내에서 다양성을 포획하기 위한 노력으로, 종양의 근위 대 원위 영역, 종양의 상이한 면, 종양의 상이한 층 등.
용어 "균질화하는" 또는 "균질화"는 생물학적 샘플이, 샘플의 모든 분획이 조성물에서 동일한 상태가 되도록 하는 과정(예컨대, 기계적 과정 및/또는 생화학적 과정)을 의미한다. 대표적인 분석적 샘플은 균질화된 샘플의 일부분을 제거하여 제조될 수 있다. 일반적으로, 본 공개에서 "액화"로 언급되는 종양, 림프절, 또는 기타 샘플은 균질화되도록 충분하게 혼합하거나 또는 블렌딩된다는 것을 이해한다. 균질화된 샘플은 샘플의 일부의 제거(분취액)가 남아있는 샘플의 모든 구성을 실질적으로 변경시키지 않고 제거된 분취액의 구성요소가 나머지 샘플의 구성요소와 실질적으로 동일하도록 혼합된다. 본 공개에서, "균질화"은 일반적으로 샘플 내 대부분의 세포의 무결성을 보존하게 될 것이며, 예를 들어, 적어도 50, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99, 99.9% 또는 그 이상의 샘플 중 세포의 백분율은 균질화 과정의 결과로서 파열되거나 또는 용해되지 않을 것이다. 균질물은 개별 세포(또는 세포의 클러스터)로 실질적으로 해리될 수 있고 최종 균질물 또는 균질물들은 실질적으로 균질하다(전반적으로 유사한 성분 또는 균일성으로 이루어지거나 또는 구성됨). 하나의 실시태양에서, 용어 "균질화"는 조직 또는 생물학적 샘플이 조직의 임의의 서브셋, 일부분 또는 분획이 유사하거나, 일부 양상에서 실질적으로 유사하거나 또는 동일한 정도로 가공되는 과정을 의미한다.
하나의 실시태양에서, 용어 "기계적 균질화"는 기계적 수단에 의한 균질화를 의미한다.
본 명세서에서 사용시, 용어 "생화학적 해리"는 효소, 예컨대 프로테아제를 사용한 해리를 의미한다. 생화학적 해리는 프로테아제 농도, 항온반응 시간 및 온도에 의해 영향받을 수 있다.
본 명세서에서 사용시, 용어 조직 샘플의 "물리적 분리" 또는 "물리적 해리"는 기계적 수단에 의한 날카로운 물체를 사용한, 예를 들어 자르기, 갈기 또는 썰기에 의한 샘플의 균질화 또는 해리를 의미한다. "자르기"는 일반적으로 대략 1.0 mm 내지 5.0 mm 크기의 조직 절편을 야기한다. 갈기는 일반적으로 대략 0.5 내지 2.0 mm 크기의 조직 절편을 야기한다. 썰기는 일반적으로 대략 0.1 내지 1.0 mm 크기의 조직 절편을 야기한다.
본 명세서에서 사용시, 조직 샘플의 "기계적 분리" 또는 "기계적 해리"는 당업자에게 공지된 바와 같이, 기계적 공급원, 예컨대 전통적인 블렌더, 주서 또는 비드 비터를 사용한 샘플의 균질화 또는 해리를 의미한다.
본 명세서에서 사용시, "해리된 세포"는 조직 또는 장기의 일부였지만, 그 조직 또는 장기로부터 분리되지 않은 세포이다.
균질물을 생성시키기 위해 샘플에 적용되는 기계적 및/또는 생화학적 해리에 의존적으로, 세포 클러스터는 하나(1) 초과의 세포 내지 수천 세포를 포함할 수 있다. 클러스터는 대표 샘플을 사용해 수행되는 후속 어세이(예를 들어, 수십 내지 수천 세포를 함유하는 세포 클러스터를 필요로 하는 IHC, 또는 단일 세포 또는 세포의 단편을 필요로 하는 FACS 또는 유세포분석)에 의존적으로, 추가 가공 방법의 적용, 예를 들어 추가의 기계적 및/또는 생화학적 해리 및/또는 크기 배제에 의해 해리될 수 있다(그에 함유된 세포의 크기 및/또는 수가 감소됨).
현재 기술된 방법은 샘플 해리 정도와 관련하여 탄력적이다. 표적 세포 응집 크기는 클러스터가 샘플채취 방법의 해리 목적에 상응하도록 제1 기계적 수단(예컨대, 블렌딩 또는 균등물)의 적용 후 수득되는 세포 클로스터를 더욱 가공하여 제어될 수 있다. 일 양상에서, 표적 입자 크기에 도달하도록 더욱 가공하기 위한 거대 세포 클러스터를 보유하면서 특정 크기 또는 그 이하로 세포 클러스터를 제거시키기 위해 사용될 수 있다. 세포 클러스터 입자 크기의 최종 분포는 분포보다는 크기 평탄역에 도달하도록 해리 과정으로부터 특정 입자를 제거하는 크기 배제 기술에 의해 결정된다.
균질화 이후에, 최종 클러스터는 적어도 1-2, 2-100, 100-500, 500-1,000, 1,000-10,000, 10,000-50,000, 또는 그 이상의 세포를 함유할 수 있다. 일 양상에서, 클러스터는 단일 세포, 약 2-10 세포, 약 10-20 세포, 또는 약 20-40 세포를 함유한다. 최종 클러스터의 크기는 다양할 것이다. 예를 들어, 도 20을 참조한다.
샘플의 균질화 결과로서, 샘플 내 세포의 분포는 최종 균질물 또는 이의 일부분 또는 분획 내에서 실질적으로 균질하게 분포되어서, 균질물 또는 이의 임의 분획이 원래 샘플의 불균질성을 대표한다. 균질화된 샘플은 대부분 또는 많은 세포가 온전한 채로 남아있음에도 불구하고, 이의 유동 능력을 기반으로 액체 또는 액화 생플이라고 할 수 있다.
다른 모이어티가 이들 균질물 또는 대표 샘플, 예를 들어 다른 세포, 합텐 또는 표지에 첨가될 수 있다.
용어 "불균질성"은 다양성 또는 부조화, 예를 들어, 형태, 기능 및 거동의 변동, 상이하거나 또는 다른 부분의 조성을 의미한다. 용어 "불균질 조직 샘플"은 조성 또는 특징이 균질하지 않은, 예를 들어 형태, 기능 또는 거동이 다양한 샘플을 의도한다. 암과 관련하여, 용어 "종양 불균질성"은 세포 형태학, 유전자 발현, 유전자 돌연변이, 물질대사, 이동성, 즉식 및 전이 잠재성을 포함하는 별개의 형태학적, 표현형 및 유전자형 프로파일을 나타낼 수 있는 관찰을 설명한다. 불균질성은 종양 간(종양간 불균질성) 및 종양 내(종양내 불균질성) 사이에서 일어날 수 있다. 종양 불균질성은 제한없이 폐암, 백혈병, 유방암, 신장 암, 전립선암, 대장 암, 뇌 암, 식도 암, 두경부암, 방광암, 부인과 암종, 지방육종, 및 다발성 골수종을 포함하는 다양한 암에서 관찰되었다. 다음의 2가지 모델이 종양 세포의 불균질성을 설명하기 위해 제안되었다: 암 줄기 세포 모델 및 클론 진화 모델. 암 줄기 세포 모델은 종양 세포 사이에서 관찰되는 불균질성은 종양 세포가 기원하는 암 줄기 세포의 차이로 인한 것임을 제공한다. 클론 진화 모델은 종양이 단일한 돌연변이된 세포로부터 발생되지만 부가적 돌연변이(각각이 더욱 분열되고 돌연변이되는 능력을 갖는 부가적 하위개체군에 일어남)가 축적된다는 것을 제공하고, 이는 동일한 종양 유래의 암 세포에서 관찰되는 다양성을 설명한다. 이들 모델은 상호 배타적이라고 여겨지지 않으며, 따라서 둘 모두가 아마도 상이한 종양 유형에 걸쳐 다양한 양으로 불균질성에 기여하는 듯 하다. 종양 불균질성은 전체 변량(개체군 변량) 및 변동의 공간적 구조(개체군 공간 계층화)를 포함하고, 따라서 변동의 양쪽 성분은 샘플 디자인에 고려되어야 한다. 종양 불균질성은 유전자 불균질성(예를 들어, 이종성 인자, 게놈 불안정성, 요법 등에 의해 유발), 다른 불균질성(예를 들어, 후생유전), 및/또는 종양 미세환경(예를 들어, 종양의 국지적 차이, 예컨대 산소 이용능 또는 면역 감시는 종양 세포에 상이한 선택적 압력을 부과함)으로부터 발생될 수 있다.
종양 불균질성의 결과로서 발생되는 상이한 종양 세포 개체군은 클론에 발생된 돌연변이체 세포의 자손인, '서브클론'이라고 불린다.
종양 내 서브클론의 출현율은 다양할 수 있다. 특정 서브클론은 복수의 종양을 포함하지만 시간 경과 및/또는 특정 처리 후에 감소된다. 다른 서브클론은 초기에 검출불가능하지만, 이후에 풍부해진다. 복수의 서브클론이 동시에 존재할 수 있고 종양이 검출가능할 정도로 크게 성장하는데 걸리는 시간 동단 그들 출현율은 다양할 수 있다. 용어 종양 내 "낮은 출현율 사건" 또는 "낮은 출현율 유전자 사건"은 10-1%, 1-0.1%, 0.1-0.01%, 0.01-0.001%, 0.001-0.0001%, 0.0001-0.00001%, 0.00001-0.000001%, 또는 0.000001% 이하의 속도로 발생되는 희귀 사건 또는 희귀 유전자 사건(예컨대, 돌연변이)을 의미한다. 개시된 방법으로 생성된 샘플은 전체로서 종양을 대표(또는 실질적으로 대표)하므로, 더 높은 출현율로 존재하는 모든 다른 서브클론이외에도, 종양 또는 생물학적 샘플 중 낮은 출현율 서브클론(예컨대 낮은 출현율 서브클론(예컨대 적어도 0.000001%에 이름))이라도 검출될 수 있다.
용어 "생물학적 샘플" 또는 "조직 샘플"은 바이러스를 포함한 임의의 유기체로부터 수득되는 생체분자(예컨대 단백질, 펩티드, 핵산, 지질, 탄수화물, 또는 이의 조합)를 포함하는 임의 샘플을 의미한다. 유기체의 다른 예는 포유동물(예컨대, 인간, 수의학적 동물 예컨대 고양이, 개, 말, 소 및 돼지, 및 실험실 동물 예컨대 마우스, 래트 및 영장류), 곤충, 환형동물, 거미류, 유대동물, 파충류, 양서류, 세균 및 진균을 포함한다. 생물학적 샘플은 조직 샘플(예컨대, 조직 절편 및 조직의 바늘 생검), 세포 샘플(예컨대, 세포학적 도말시료 예컨대 파프 도말시료 또는 혈액 도말시료 또는 현미해부로 수득된 세포의 샘플), 또는 세포 분획, 단편 또는 소기관(예컨대 세포를 용해시키고 원심분리 등에 의해 그들 구성요소를 분리하여 수득함)을 포함한다. 생물학적 샘플의 다른 예는 혈액, 혈청, 소변, 정액, 대변, 뇌척수액, 사이질액, 점액, 눈물, 땀, 고름, 생검 조직(예를 들어, 외과적 생검 또는 바늘 생검으로 수득), 유두 흡인물, 귀지, 우휴, 질액, 타액, 스웹(예컨대, 구강 스웹), 또는 제1 생물학적 샘플로부터 유래된 생체분자를 함유하는 임의 재료를 포함한다. 특정 실시태양에서, 본 명세서에서 사용시 용어 "생물학적 샘플"은 대상체로부터 수득된 종양 또는 이의 일부로 제조된 샘플(예컨대, 균질화 또는 액화 샘플)을 의미한다.
본 명세서에서 사용시 "정상 조직"은 암, 악성종양과 관련되거나 또는 질환의 증가된 발병률과 추정적으로 관련되는 검출가능한 병변 또는 비정상성을 갖지 않는 조직을 의미한다. 이들 정상 샘플은 질환(유전자 등), 암 또는 약성 종양의 증가된 발병율과 관련되는 유전자 돌연변이 또는 병태를 갖는 환자로부터 유래될 수 있다. 정상 조직은 동일한 개체 또는 다른 개체 유래의 병리학적 조직과 관련없는(예를 들어, 신체의 상이한 위치에서 유래하거나 또는 상이한 조직학적 유형을 가짐) 정상 조직; 또는 동일한 개체 또는 상이한 개체 유래의 병리학적 조직에 상응하는 동일 유형의 조직일 수 있다.
본 명세서에서 사용시, "전암성 조직"은 암 또는 악성종양의 증가된 발병율과 추정적으로 관련되는 일부 병변 또는 비정상성을 함유하는 조직을 의미한다.
용어 "종양"은 일반적으로 정상 세포보다 더 빠르게 성장하고 치료하지 않으면 성장을 계속하여 때때로 인접한 구조에 손상을 야기하는 세포의 비정상적인 새로운 성장으로서 그 자체로 정의되는 덩어리 또는 신생물을 의미한다. 종양 크기는 광범위하게 다양할 수 있다. 종양은 고형일 수 있거나 또는 액체 충전될 수 있다. 종양은 양성(악성이 아님, 일반적으로 무해함), 또는 악성(전이할 수 있음) 성장이라고 언급할 수 있다. 일부 종양은 양성(예컨대, 인시츄 암종)이고, 동시에 악성 암세포(예컨대, 선암종)를 함유하는 신생물성 세포를 함유할 수 있다. 이는 신체 전반에서 복수의 위치에 위치되는 신생물을 포함하는 것으로 이해해야 한다. 그러므로, 본 개시의 목적을 위해, 종양은 원발성 종양, 림프절, 림프성 조직, 및 전이성 종양을 포함한다. 암성, 전암성 및 암성 성장 사이의 경계선은 항상 분명하지는 않지만, 성장의 각 유형의 일반적인 특성이 존재한다. 양성 종양은 비-악성 종양이다. 양성 종양은 일반적으로 국재하고, 신체의 다른 부분으로 확산(전이)되지 않는다. 대부분의 양성 종양은 치료에 충분히 반응한다. 그러나, 미처리된 채로 남아있으면, 일부 양성 종양은 더 크게 성장하여 그들 크기로 인해 심각한 상처 또는 손상을 초래할 수 있다. 이러한 방식으로 양성 종양은 악성 종양을 모방할 수 있으며, 따라서 때때로 치료된다. 종종 치료에 내성인 암성 성장은 신체의 다른 부분으로 확산될 수 있고, 때때로 제거 후 재발될 수 있다. "암"은 악성 성장(악성 종양 또는 신생물)의 또 다른 용어이다.
종양의 병독성은 다양할 수 있다. 특정 암은 치료 및/또는 치유가 비교적 쉬울 수 있지만, 다른 암은 보다 공격적이다. 종양 병독성은 적어도 부분적으로 차등적 유전자 발현에 의해 또는 게놈 변경의 특징규명에 의해 결정될 수 있다. 암성 세포에서, 세포가 유전자를 활성화시킬 수 있거나 또는 침묵시킬 수 있는 기전이 손상된다. 그 결과, 종종 다른 조직 및/또는 다른 발생기에 특이적인 유전자의 이상 활성화가 존재한다. 예를 들어, 폐암에서, 침묵되어야 하는, 정자의 생산에 특이적인 유전자를 발현하는 종양성 세포는 극도로 병독성이다(증가된 증식성 능력 및 신체 면역 시스템으로부터 숨는 기능을 나타내는 고위험성 암). 거의 모든 암에서, 배선의 수십개의 특이적 유전자가 이상적으로 활성화되는 것으로 확인되었다. 예를 들어, 문헌 [Rousseaux et al., Ectopic Activation of Germline and Placental Genes Identifies Aggressive Metastasis-Prone Lung Cancer. Science Translational Medicine(2013) 5(186): 186]을 참조한다. 따라서, 유전자의 상향조절 또는 하향조절은 특정 암의 병독성 형태와 연관될 수 있으므로, 진단적 검사 이후에, 종양이 이의 발생 초기에 적절하게 치료된 경우더라도, 어떠한 암이 높은 재발 위험성 및 치명적인 예후를 갖는지를 예측하는 것이 가능하다.
용어 "림프절"은 겨드랑이 및 위를 포함하는 신체 전반에 광범위하게 존재하고 림프관에 의해 연결된 림프계의 타원형 또는 신장 형상 장기를 의미한다. 림프절은 제한없이 B 세포 및 T 세포를 포함한, 다양한 수의 면역 세포를 함유한다. 림프절은 면역 시스템의 적절한 기능화에 중요하고 외래 입자 및 암 세포에 대한 필터로서 작용할 수 있다.
용어 "폴립" 또는 "폴립들"은 점막으로부터 돌출된 비정상적인 생물학적 덩어리를 의미한다. 폴립은 제한없이, 대장, 위, 코, 귀, 부비동(들), 방광 및 자궁을 포함한, 복수의 조직에 존재할 수 있다.
용어 "전이물" 또는 "전이성 종양"은 제한없이, 하나의 장기 또는 신체의 일부에서 다른 곳으로 확산되거나 또는 전개되는, 혈관, 뼈, 뇌척수막을 포함한 종양 및/또는 이의 회합된 구성요소를 의미한다.
용어 "낭포"는 인근 조직과 비교하여 별개의 막 및 구획을 갖는 원형 또는 타원형 형상의 폐쇄된 낭을 의미한다. 일부 양상에서, 낭포는 낭을 형성하도록 함께 그룹지어진 세포의 클러스터이다(물 분자 기가 함께 기포를 형성하는 방식과 다르지 않음). 일부 양상에서, 이러한 낭 또는 낭포의 "쉘"을 형성하는 세포는 그 소정 위치에서 모든 주변 세포와 비교시 분명하게 비정상이다. 낭포는 제한없이 공기, 유체, 또는 임의의 반고형 재료를 포함할 수 있다. 일부 종양은 낭포를 함유할 수 있거나, 또는 "낭포성"이라고 기술할 수 있다.
용어 "절제물"은 대상체로부터 제거되는 장기 또는 기타 신체 구조의 전부 또는 일부를 의미한다.
본 명세서에서 사용시 용어 "장기" 또는 "장기들"은 동물에서 특별한 기능을 갖는 임의의 해부학저거 부분 또는 조직을 의미한다. 이 용어은 해부학적 부분 또는 조직의 일부분 또는 전부, 예를 들어 폐의 엽을 포함한다. 이러한 기관은 제한없이, 부신, 맹장, 방광, 뇌, 귀, 식도, 눈, 담낭, 심장, 신장, 장(예를 들어, 대장 또는 소장), 간, 폐, 입, 근육, 코, 췌장, 부갑상선, 송과선, 뇌하수체, 피부, 비장, 위, 흉선, 갑상선, 자궁, 충수, 또는 이의 일부를 포함한다.
용어 "세포 클러스터"(또는 "세포 클러스터들")는 세포, 예를 들어 악성 세포, 섬유아세포, 면역 세포, 줄기 세포, 또는 내피 세포의 응집체 또는 응집체들을 의미한다. 일 양상에서, 세포 클러스터는 1-10, 10-100, 100-200; 200-1,000; 1,000-5,000; 10,000-100,000; 100,000-1,000,000; 1,000,000-5,000,000; 5,000,000-1,000,000,000; 1,000,000,000-5,000,000,0000, 또는 그 이상의 세포를 포함한다. 용어 "복수의 세포 클러스터"는 하나 초과의 세포 클러스터를 의미한다. 세포 클러스터는 응집되거나 또는 별개로 존재한다. 세포 클러스터 내 세포는 단백잘, 예커대 카데린을 통해 서로 부착되며, 인테그린을 통해 주변 세포외 매트릭스에 부착된다. 그러므로, 세포 클러스터 내 세포는 아마도 가장 서로와 관련되어 있으며, 서브클론으로 고려될 수 있거나, 또는 서브클론으로부터 유래될 수 있다.
본 명세서에서 사용시, 용어 "소기관"은 세포막 결합된 구조, 예컨대 엽록체, 미토콘드리아 및 핵을 의미한다. 용어 "소기관"은 천연 및 합성 소기관을 포함한다.
본 명세서에서 사용시 용어 "펩티드"는 펩티드 결합에 의해 연결된 아미노산의 짧은 중합체를 의미한다. 모든 아미노산은 L-입체형태 또는 D-입체형태를 가질 수 있다.
본 명세서에서 사용시 용어 "핵산"은 퓨린 및 피리미딘 염기, 또는 기타 천연, 화학적 또는 생화학적으로 수식되거나, 또는 비천연, 또는 유도된 뉴클레오티드 염기를 포함하는, 리보뉴클레오티드, 데옥시리보뉴클레오티드, 또는 펩티드 핵산(PNA)인, 임의 길이의 뉴클레오티드의 중합체 형태를 의미한다. 폴리뉴클레오티드의 골격은 전형적으로 RNA 또는 DNA에 존재할 수 있는 바와 같은 당류 및 포스페이트 기, 또는 수식되거나 또는 치환된 당류 또는 포스페이트 기를 포함할 수 있다. 일 양상에서, 폴리뉴클레오티드는 수식된 뉴클레오티드, 예컨대 메틸화 뉴클레오티드 및 뉴클레오티드 유사체를 포함할 수 있다.
용어 "지질"은 물에 불용성인, 원형질의 알코올-에테르-가용성 구성성분인, 지질, 지방을 포함하는 일반 용어로서 이의 통상적 의미로 사용된다. 지질은 지방, 지방유, 정유, 왁스, 스테로이드, 스테롤, 인지질, 당지질, 술포지질, 아미노지질, 크로모지질(리포크롬), 및 지방산을 포함한다. 이 용어는 천연 발생 및 합성 생산 지질 둘 모두를 포함한다. 본 공개와 관련하여 바람직한 지질은 포스파티딜콜린 및 포스파티딜에탄올아민을 포함하는 인지질, 및 스핀고미엘린을 포함한다.
용어 "대사물"은 효소적 반응으로 인한 화합물, 단백질, 또는 임의 물질, 부산물, 또는 재료, 즉 효소가 관여하는 과정으로 합성된 화합물을 의미한다.
용어 "액체 조직"은 제한없이, 혈액, 혈장, 혈청, 타액, 정액, 자궁 분비물, 타액, 소변, 눈물, 땀, 유방 우유, 및 양수를 포함하는, 액체의 형태이거나 또는 액체의 형태일 수 있는 임의 조직을 의미한다. 용어 "비-액체 조직"은 액체가 아닌 임의 조직을 의미한다.
용어 "세포검사 바늘 흡인물"은 미세 바늘 흡인 생검(FNAB, FNA 또는 NAB), 또는 미세-바늘 흡인 세포학(FNAC)의 절차를 의미한다.
용어 "삼출"은 대상체로부터 유체를 수집하는 절차를 의미한다. 일부 양상에서, 삼출에 의해 수집된 유체는 비정상인 병리학적 병태, 질환, 징후 또는 증상을 갖는 것으로 설명할 수 있다. 또다른 양상에서, 삼출로 인한 유체는 체강, 또는 복막 공간 내 유체의 과도한 축적일 수 있다.
용어 "파프 도말시료"는 자궁암에 대한 스크리닝 절차를 의미한다. 자궁의 시작부분인 자궁경부 상에 전암성 또는 암성 세포의 존재에 대해 검사한다.
본 명세서에서 사용시, 용어 "비정상 조직"은 정상 조직에서 특징적인 것과 상이한 뚜렷한 특징을 전개하는 조직을 의도한다. 예를 들어, 유방암 조직은 일 양상에서, 표현적으로 암성이 아닌 유방 조직과 비교하여 "비정상"일 수 있지만, 그럼에도, 또 다른 특징, 예컨대 명시된 바이오마커의 유전자 발현에 대해 "정상"일 수 있다.
용어 "표현형적으로 정상인 조직"은 물리적 특징, 예를 들어 조직학적 외관이 정상으로 간주되는 특징과 동일하거나, 유사하거나 또는 실질적으로 유사한 조직을 의미한다. 용어 "표현형적으로 비정상인 조직"은 비정상으로 간주되는 특징과 동일한거나, 유사하거나 또는 실질적으로 유사한 물리적 특징을 갖는 조직을 의미한다.
용어 "표현형적으로 균질한"은 다른 집단의 구성원 또는 조직 유형, 예를 들어 유방, 대장, 폐와 동정된 특징(들)이 동일하거나, 유사하거나 또는 실질적으로 유사한, 적어도 하나 이상의 물리적 특징, 예를 들어 조직학적 외관을 의도한다.
용어 "유전자형적으로 정상인 조직"은 정상으로 간주되는 특징과 동일하거나, 유사하거나 또는 실질적으로 유사한, 게놈, 예를 들어 염색체, 미토콘드리아, RNA, 마이크로RNA, 및/또는 비코딘 RNA 특징, 예를 들어 유전자 서열을 갖는 조직을 의미한다. 용어 "유전자형적으로 비정상인 조직"은 비정상으로 간주되는 특징과 동일하거나, 유사하거나 또는 실질적으로 유사한 유전자 특징, 예를 들어 유전자 서열을 갖는 조직을 의미한다.
세포, 조직 또는 대상체와 관련시 용어 "유전적으로 다양한"은 집단의 게놈 수준, 예를 들어 염색체, 미토콘드리아, RNA, 마이크로RNA, 및/또는 비코딩 RNA에 대해 적어도 2종의 구성원이 서로 또는 적어도 또 다른 개체, 세포 또는 조직과 상이한 대상, 조직 또는 세포 개체군을 의미한다. 둘 이상의 개체와 관련시 용어 "유전적으로 균질한 대상체"는 게놈 수준, 예를 들어 염색체, 미토콘드리아, RNA, 마이크로RNA, 및/또는 비코딩 RNA에서, 실질적으로 동일한 특정 마커 또는 특징으로 나타내는 개체를 의미한다.
"인종 집단"은 공통의 국가적 또는 문화적 전통을 갖는 사회 집단을 의미한다. 일 양상에서, 이 용어는 공통이거나 또는 밀접하게 관련된 유전자 기원으로부터 유래된 집단의 구성을 포함한다.
용어 "소형 분자"는 생물학적 과정을 조절하는데 사용될 수 있는 저분자량 유기 재료를 의미한다. 일 양상에서, 분자량은 0-100 달톤, 100-200 달톤, 200-300 달톤, 300-400 달톤, 400-500 달톤, 500-600 달톤, 600-700 달톤, 700-800 달톤, 800-900 달톤, 또는 900-1000 달톤 범위이다. 또다른 양상에서, 분자량은 1000 달톤 이하이다. 소형 분자는 제한없이, 유기 화합물, 펩티드, 대사물 및 지질을 포함한다.
용어 "염료"는 빛의 선택적 흡광에 의해 대상체에 색상을 부여할 수 있는 물질을 의미한다. 일부 실시태양에서, 염료는 가용성이거나 또는 고형이다. 또다른 실시태양에서, 염료는 흡수, 용액 및 기계적 체류, 또는 이온 또는 공유 화학 결합에 의해 물질에 유지된다. 추가의 실시태양에서, 염료는 예를 들어 선택된 파장에서, 전자기 방사선을 흡수하는 임의의 유기 또는 무기 분자 또는 모이어티이다.
본 명세서에서 사용시, 용어 "정량적 데이타"는 측정 유닛과 연관된 특정 분량, 양 또는 범위를 표시하는 데이타를 의미한다. 예를 들어, 종양에 대한 정량적 데이타는 제한없이 종양의 크기, 또는 바이오마커의 발현 수준을 포함한다.
본 명세서에서 사용시, 용어 "정성적 데이타"는 대상의 물체의 특성, 특징 또는 기타 성질을 설명하는 정보를 의미한다. 예를 들어, 암에 대한 정성적 데이타는 제한없이, 종양의 병기, 외관, 및 다른 물리적 특징을 포함한다.
본 명세서에서 사용시, 측정된 값과 관련된 용어 "정규화된"은 개념상 공통 척도에 대한 상이한 척도로 측정된 값의 조정을 의도한다.
유전자는 암 바이오마커의 단지 하나의 유형이다. 본 명세서에서 사용시, 용어 "바이오마커" 또는 "마커"는 정상적 또는 비정상적 과정, 또는 병태 또는 질환(예컨대, 암)의 징후인 혈액, 다른 체액, 또는 조직에 존재하는 생물학적 분자를 의미한다. 바이오마커는 대상체가 질환 또는 병태에 걸릴 성향이 있는지 또는 질환 또는 병태에 대한 치료에 신체가 충분히 잘 반응하는지를 결정하는데 사용될 수 있다. 암의 경우, 바이오마커는 신체 내에 암의 존재를 의미하는 생물학적 물질을 의미한다. 바이오마커는 암의 존재에 대한 신체의 특이적 응답 또는 종양에 의해 분비되는 분자일 수 있다. 유전자, 후생유전자, 단백체, 당질체, 및 이미지화 바이오마커가 암 진단, 예후 및 전염병학에 사용될 수 있다. 이러한 바이오마커는 비침습적으로 수집된 생체유체 예컨대 혈액 또는 혈청에서 어세이될 수 있다. AFP(간암), BCR- ABL(만성 골수성 백혈병), BRCA1/BRCA2(유방/난소암), BRAF V600E(흑색종/직대장암), CA-125(난소암), CA19.9(췌장암 암), CEA(직대장암), EGFR(비소세포 폐암종), HER-2(유방암), KIT(위장 기질 종양), PSA(전립선 특이적 항원), S100(흑색종), 및 많은 다른 것들을 포함하여, 몇몇 유전자 및 단백질 기반 바이오마커가 이미 환자에서 사용되고 있다. 바이오마커는 진단적(초기 암 동정) 및/또는 예후적(암이 얼마나 공격적인지 예상 및/또는 대상체가 특정 치료에 어떻게 반응할 것인지 및/또는 암이 재발할 가능성이 얼마나 있는지 예측)으로 유용할 수 있다.
본 명세서에서 사용시, 용어 "임상적으로 관련된 마커"는 임상적 결과 또는 상태, 예를 들어 질환 또는 병태, 예를 들어 암의 존재 또는 부재와 관련된 마커 또는 바이오마커를 의도한다.
본 명세서에서 사용시, 용어 "암성 조직"은 종양 세포를 보유하는 임의 조직을 의미한다. 암성 조직은 제한없이, 근육, 피부, 뇌, 폐, 간, 비장, 골수, 흉선, 심장, 림프, 혈액, 뼈, 연골, 췌장, 신장, 담낭, 위, 장, 고환, 난소, 자궁, 직장, 신경계, 눈, 샘 또는 연결 조직을 포함한다.
"예후"는 환자에서 암의 전이 및/또는 암의 재발의 가능성을 포함하는, 대상체의 현재 병태의 예측 또는 적당한 결과를 포함한다.
본 명세서에서 사용시, 용어 "보존하다" 또는 "고정하다"는 생물학적 샘플, 예를 들어 조직학적 절편의 제조에서의 단계를 의미한다. 보존 또는 고정 방법은 제한없이, 화학적 고정, 가열 고정, 함침, 관류 및/또는 동결건조를 포함한다. 따라서, "고정된 샘플"은 상기 언급한 바와 같이 가공된 샘플이다.
용어 "생세포"는 고정되지 않았거나 또는 보존되지 않은 임의 세포를 의미한다. 일부 실시태양에서, 용어 "생세포"는 기능성 세포를 포함한다. 당업자는 본 공개의 목적을 위해 생세포 및 죽은 세포를 쉽게 구별할 수 있다.
본 명세서에서 사용시, 용어 "왁스 포매" 또는 "파라핀 포매"는 조직 시료에 파라핀 왁스가 주입되어 마이크로톰을 사용해 절편화될 때 이의 세포 구조를 보존시키고, 장기간 저장에 적합한 추가적인 이득을 갖는 과정에 사용된다.
본 명세서에서 사용시, 용어 "하나 이상의 조직"은 하나 이상의 대상체 유래의 조직, 또는 동일한 대상체 유래의 하나 이상의 조직을 의미한다. 용어 "둘 이상의 조직"은 둘 이상의 대상체 유래의 조직, 또는 동일한 대상체 또는 환자 유래의 둘 이상의 조직에 사용된다.
본 명세서에서 사용시, 용어 "전악성 또는 악성 세포"는 악성 형질전환을 겪었거나 또는 악성 형질전환을 겪을 준비가 된 임의 세포를 설명하는데 사용된다. 전악성 또는 악성 세포의 특징은 제한없이, 비제어적인 증식, 전이, 비정상적 세포 물질대사, 세포자멸사의 회피, 성장 신호의 자족, 및 지속적인 혈관생성을 포함한다. 예를 들어, 대장 폴립은 대장암에 대해 전악성일 수 있다.
본 명세서에서 사용시, 용어 "순환 종양 세포"는 혈관구조, 림프관, 또는 기체 유체 내에서 순환하는 종양 또는 암 세포를 의미한다. 순환 종양 세포는 제한없이 백혈병 세포를 포함한다.
본 명세서에서 사용시, 용어 "정상 인접 조직"은 종양 세포 또는 종양 조직에 인접한 정상 조직을 의미한다.
균질화된 샘플을 재구성하는 것과 관련시 용어 "재구성"은 혼합 또는 조합을 의도한다.
균질물과 관련시 용어 "구성성분의 추출"은 세포 구조의 구성요소의 단리 또는 정제를 포함한다.
본 명세서에서 사용시, 용어 "FFPE 샘플"은 포르말린-고정된 파라핀-포매된 샘플을 의도한다. FFPE 샘플은 제한없이 진단, IHC, 및 유전자 발현 또는 질환의 기원의 프로파일링을 포함하는, 복수의 의학적 연구에 사용될 수 있다.
여기서, 용어 "사전결정된 값"은 일반적으로 데이타의 변동을 계산하는데 사용되는 값을 의미한다. 일 양상에서, 사전결정된 값은 역사적인 데이타, 또는 상이한 샘플군, 또는 실험되는 데이타와 유사한 샘플군을 기반으로 계산된다.
용어 "위험값"은 위험성과 연관된 정량적 또는 정성적 값을 의미한다. 예를 들어, 암 위험값은 암이 발생될 위험을 정량하거나 또는 정성한 값이다.
용어 "염색체 전위"는 비상동성 염색체 사이에서 부분의 재배열에 의해 야기되는 염생체 비정상성을 의미한다.
용어 "염색체내 역위"는 염색체의 절편이 말단에서 말단으로 반전되는 염색체 재배열을 의미한다. 일 양상에서, 역위는 단일 염색체가 그 자체 내에서 파괴 및 재배열을 겪을 때 일어난다.
용어 "치료적 섭생법"은 당분야에 잘 알려진 의미에 따라 사용된다. 예를 들어, 용어는 제한없이 환자에게 투여되는 작용제 또는 작용제들, 이러한 작용제(들)의 용량 및 치료의 스케쥴 및 지속기간을 포함하는 인자들을 특정하는 병리학적 병태(예를 들어, 만성 C형 간염 감염 또는 암)를 앓는 개체에 대한 치료 계획을 의미한다. 개인화된 용량 또는 처리 섭생법은 환자 또는 대상체의 개별 특징, 예를 들어 유전자 구성, 약리 유전학, 인종, 치료 이력, 가족력, 임상 화학 또는 기타 관련 특징 또는 척도를 고려하여 정밀 의료의 개념을 기반으로 하는 요법 또는 용량 섭생법이다.
용어 "화학요법"은 화학작용제에에 의한 치료를 의미한다. 화학요법은 질환있는 세포를 표적화하고/하거나, 방지하고/하거나 파괴하도록 특별하게 디자인된 약학제의 활용으로 정의될 수 있다. 화학요법으로 치료할 수 있는 질환의 비제한적인 예는 암, 자가면역 질환 예컨대 전신 경화증, 홍반선 루푸스, 류마티스성 관절염, 혈관염, 및 바이러스 감염을 포함한다. 일 양상에서, 화학요법제는 체내에서 빠르게 분열하는 세포를 표적으로 하여 암 세포를 파괴한다. 암 세포에 대한 특이성의 결여로 인해, 화학요법의 독성 효과가 또한 다른 빠르게 분열하는 비암성 세포에서 확인된다. 혈액 세포, 입, 장관, 코, 손톱 및 모발의 세포가 체내에서 빠르게 분열되는 세포의 일부이다. 체내 정상 세포의 파괴는 탈모증, 악액질, 빈혈, 백혈구감소증 및 호중구감소증과 같은 부작용을 유발한다. 이들 부작용은 화학요법의유효성을 제한하고 용량 감소의 위험성을 증가시켜, 환자 생존에 직접적으로 영향을 미친다.
용어 "면역요법"은 특이적 면역 응답 및/또는 면역 이펙터 기능(들)의 활성화 또는 불활성화를 포함하는 치료를 의미한다.
용어 "방사선" 또는 "방사선 요법"은 질환(예를 들어, 암) 또는 병리학적 병태를 치료하기 위해 제한없이, x-선, 감마선, 전자빔, 또는 양자를 포함하는, 고에너지 입자 또는 파장의 사용을 포함하는 치료에 관한 것이다.
용어 "수술"은 환자에 대해 장비를 사용하거나 또는 없이, 치유 또는 교정 효과를 발생시키기 위한, 임의의 방법론적 조치에 관한 것이다.
용어 "유전자 요법"은 바람직하게는, 대상체 또는 환자에서 치료적 효과를 야기시키려는 목적을 위한, 유전자 전달 과정 또는 유전자 편집 과정(예를 들어, CRISPR)의 사용에 관한 것이다.
본 명세서에서 사용시 용어 "호르몬 요법"은 호르몬을 조정하는 것에 관한 치료로서 정의된다. 호르몬 요법은 제한없이, 호르몬 또는 프로호르몬을 합성하는 샘의 제거, 호르몬 합성의 차단 또는 억제, 또는 호르몬과 이의 수용체의 결합 방지, 또는 호르몬 수용체의 하향 조절 또는 분해를 포함할 수 있다.
본 명세서에서 사용시 용어 "줄기 세포 요법"은 질환 또는 병리학적 병태를 치료하거나 또는 예방하기 위한 줄기 세포를 사용하는 치료이다.
용어 "수혈"은 정맥내 라인을 통해 혈액을 수용하는 과정에 관한 것이다.
본 명세서에서 사용시, 용어 "물리적 요법"은 정상 기능 또는 발생을 복원하거나 또는 촉진하고자 하는 의도로, 치료적 활동의 사용 및 양식의 적용에 의한 물리적 이상기능 또는 상처의 치료를 의미한다.
본 명세서에서 사용시, 용어 "광역학적 요법"은 특이적 파장의 빛을 광반응제 또는 감광제의 투여를 통해 감광성을 야기시킨 연구 또는 처리를 겪은 조직 또는 세포로 유도시키는 과정을 의미한다. 하나의 실시태양에서, 목적은 진단적일 수 있고, 광파장은 광반응제가 형광발광하여서, 조직을 손상시키지 않고 조직에 관한 정보를 산출하도록 선택된다. 목적은 또한 치료적일 수 있으며, 치료 하의 표적 조직에 전달되는 광파장은 광반응제가 산소와 광화학적 상호작용을 겪도록 하여 고에너지 종, 예컨대 단일항 산소를 산출하여, 국소 조직 용해 또는 파괴를 야기시키거나, 또는 감광된 조직 또는 세포의 면역반응을 촉발시킨다.
본 명세서에서 사용시, 용어 "차등 발현"은 둘 이상의 샘플의 유전자 또는 단백질 발현 수준의 차이를 의미한다. 일 양상에서, 차등 발현 결과는 병리학적 병태와 연관될 수 있는 질환, 바이오마커, 또는 임의 패턴을 동정하는데 사용될 수 있다.
본 명세서에서 사용시, 용어 "제1 프로파일"은 대상체 또는 대상체 집단의 데이타세트를 의미한다. 일 양상에서, 제1 프로파일은 후속 프로파일(들)에서 변화를 결정하기 위한 기준선으로서 사용될 수 있다. 또다른 양상에서, 제1 프로파일의 데이타는 후속 프로파일을 생성시키는 과정 또는 후속 분석에 도입될 수 있다.
본 명세서에서 사용시, 용어 "사전결정된 프로파일"은 병리학적 병태와 연관된 데이타세트 또는 데이타세트의 패널을 의미한다. 사전결정된 프로파일은 대상체 또는 대상체 집단으로부터 유래될 수 있다. 일 양상에서, 사전결정된 프로파일은 생리학적 병태의 조직학적 또는 기지 데이타세트를 포함할 수 있다. 또다른 양상에서, 사전결정된 프로파일은 병리학적 병태의 변화(예를 들어, 종양 진행)를 결정하기 위한 기준선으로서 사용된다.
본 명세서에서 사용시, 용어 "정량적 점수"는 병리학적 병태의 수치적 표시(예를 들어, 질환 위험성)를 의미한다.
본 명세서에서 사용시, 용어 "증식"은 세포의 성장 및 분열을 의미한다. 일부 실시태양에서, 세포와 관련하여 본 명세서에서 사용시 용어 "증식"은 일정 기간 동안 수가 증가될 수 있는 세포군을 의미한다.
용어 "세포자멸사"는 프로그램된 세포 사멸의 과정을 의미한다. 일부 양상에서, 세포자멸사는 세포의 형태학적 변화 및 세포 생존능의 상실을 수반한다.
용어 "괴사"는 세포 괴사 상태뿐만 아니라, 괴사 및 세포자멸사 특징을 나타내는 중간 상태를 포함한다.
본 명세서에서 사용시 용어 "세포 이주"는 생리학적으로 활성인 물질에 의해 유도되거나 또는 생리학적 변화(예를 들어, 형질전환)에 의해 야기되는 세포의 이주를 의미한다.
용어 "상피-간엽 전이" 또는 "EMT(Epithelial-Mesenchymal-transition)"는 정상적으로는 비증식성 및 비이동성인 상피 세포가 증식성 및 이동성 표현형을 특징으로 하는 간엽 세포로의 전이를 겪는 과정을 의미한다. EMT는 복합 조직에 존재하는 세포를 다양화시키기 위한 중심 기전이며, 따라서 신체 계획의 공식을 조직화시키는데 관여하는 과정이다(Kalluri and Nelson J Clin Invest 112(12):1776-1784, 2003). 상피 세포가 말기에 분화되는 것으로 한때 간주되었지만, 상피가 이동성 간엽 세포로 전이할 수 있는 가소성의 성분을 보유한다고 인지된다(Boyer et al. Biochem Pharmacol 60:1099, 2000; Nieto Nat Rev Mol Cell Biol 3:155-166, 2002). 그러므로, EMT는 성체 조직에서 손상된 조직에 섬유아세포을 형성시킬 수 있고(Strutz et al. J Cell Biol 130:393-405, 1995; Iwano et al. J Clin Invest 110:341-350, 2002) 상피암에서 전이를 개시하기 위해서(Kiermer et al. Oncogene 20:6679-6688, 2001; Janda et al. J Cell Biol 156:299-313, 2002; Xue et al. Cancer Res 63:3386-3394, 2003) 필요하다.
일 양상에서, EMT는 간엽 세포의 형성에서 이동을 위해 상피 유닛을 탈응집시키고 상피를 재형상화시키는 과정이다. 전이는 일반적으로 다양한 사이토카인, 메탈로프로테이나아제 및 막 조립 억제인자에 의한 것으로 간주되는, 상피의 분자 재프로그래밍을 필요로 한다(Kalluri and Neilson 2003 supra; Yang and Liu Am J Pathol 159:1465-1475, 2001; Zeisberg et al. Am J Pathol 159:1313-1321, 2001; Fan Kindney Int 56:1455-1467, 1999).
본 명세서에서 사용시, 용어 "유사분열"은 용어 "세포 분열"과 상호교환적으로 사용될 수 있다. 일부 실시태양에서, 유사분열은 세포 분열 과정의 오직 한 시기를 의미하는데, 자매 염색분체가 균등하게 2개의 딸 세포로 분할되는 과정이다. 진핵생물 세포에서, 유사분열은 세포 세포질이 2개의 구별되지만 유전적으로 동일한 딸 세포로 쪼개지는 과정인 세포질분열이 후속된다.
유사분열의 개시 시에, 주요 구성요소가 튜불린이라고 불리는 단백질인, 세포질 마이크로튜불이라고 알려진 소형 세포내 섬유상 구조가 튜불린 분자로 분해된다. 이후에 튜블린은 "유사분열 방추체"라고 알려진 세포내 구조를 형성하는 마이크로튜블로 재조립된다. 유사분열 방추체는 2개의 딸 핵 사이에서 정밀하게 분열되는 세포 내에 염색체를 분포시키는데서 핵심적인 역할을 한다. 암 세포는 대부분의 건강한 세포에서 관찰되는 것보다 더 빠른 세포 분열 및 증식을 특징으로 하고, 많은 항암제는 세포 분열을 억제하여 작동한다. 암 세포가 건강한 세포보다 더 빠르게 분열되므로, 암 세포는 유사분열을 억제하는 항암제에 의해 우선적으로 사멸된다. 이러한 화합물을 "항유사분열제"라고 한다.
용어 "세포 주기 정지"는 세포가 복제 및 분열을 둘러싼 과정 중이 아닌 세포 주기의 정지 지점을 의미한다. 자연적인 세포 주기는 분열을 진행할 것인지 또는 중지할 것인지 여부를 세포가 결정할 수 있게 하는 복수의 체크포인트를 포함한다. 이들 중단은 또한 세포 성장을 제어하는데 사용되는 방사선 또는 약물에 노출과 같은 외부 인자에 의해 유도될 수 있다.
세포 주기의 제1기는 G1으로서, 세포가 복제를 준비한다. 세포 유전 물질은 S기 동안 복제된다. 세포 손상은 M, 유사분열로 이동하기 전 G2 기 동안 복구된다. 유사분열 이후, 세포는 다시 G1으로 진입할 수 있거나, 또는 휴지기인 G0로 이동할 수 있다. 체크포인트는 계속되어야만 하는지를 세포가 판단할 수 있도록 각 시기에 세포 주기를 일시적으로 중단한다. 일부 세포가 드물게 복제되도록 프로그래밍되었지만, 손상된 세포는 복구 또는 파괴를 위해 시간이 필요할 수 있다.
일부 실시태양에서, 세포 주기 정지는 세포자멸사, 또는 세포 사멸이 선행된다. 이는 세포가 DNA 손상때문에 더 이상 기능하지 않을 때 일어난다. 세포는 파괴를 표적으로 삼는다. 세포 주기 정지는 세포가 세포에 대해 기능적 문제를 초래하거나 또는 종양의 발생을 야기할 수 있는 DNA 파괴의 징후에 대해 주기적으로 검토할 수 있게 한다.
용어 "S-기"는 DNA가 복제되는 세포 주기 동안의 기간을 의미한다. S-기는 G1 기와 G2 기 사이에서 정상적으로 일어난다. S-기 동안 정밀하고 정확한 DNA 복제가 유전자 비정상성을 방지하는데 필요하다.
본 명세서에서 사용시 용어 "노쇠"는 성장 인자에 의해 가열적이지 않은 세포 성장 및 DNA 복제의 영구적인 중지를 의미한다. 이러한 현상은 세포독성 약물, DNA 손상에 대응하는 정상 또는 종양 세포에서 또는 정상 세포의 증식성 수명의 종료시에 일어날 수 있다. 노쇠는 제한없이, 증가된 세포 크기, 편평해진 세포 형태, 증가된 입상도, 및 노쇠-연관 β-갈락토시다제 활성(SA-β-gal)의 존재를 포함하는 특정 형태학적 특성을 특징으로 한다.
본 명세서에서 사용시, 용어 "분화"는 세포의 구조 또는 기능이 이의 분열, 증식 및 성장 동안 특수화되는 과정을 의미한다. 일반적으로, 분화는 비교적 단순한 시스템이 둘 이상의 정성적으로 상이한 부분 시스템으로 나뉘는 현상을 의미한다.
본 명세서에서 사용시, 용어 "검출"은 특이적 분자의 존재를 동정하는 활동 또는 과정을 의미한다. 하나의 실시태양에서, 바이오마커의 검출은 바이오마커의 발현을 동정하는 것을 의미할 수 있다.
본 명세서에서 사용시, 용어 "정착제"는 제한없이 전달, 저장, 조직학적 실험, 및 가공을 포함하는, 복수의 목적을 위해 조직의 고정에 사용되는 작용제를 의미한다.
본 명세서에서 사용시, 용어 "핵산 서열" 및 "폴리뉴클레오티드"는 리보뉴클레오티드 또는 데옥시리보뉴클레오티드인, 임의 길이의 뉴클레오티드의 중합체 형태를 의미하는데 상호교환적으로 사용된다. 따라서, 이 용어는 제한없이, 퓨린 및 피리미딘 염기 또는 기타 천연, 화학적 또는 생화학적 수식된, 비천연 또는 유도체화된 뉴클레오티드 염기를 포함한다.
핵산 서열에 적용시 용어 "코딩하다"는 선천적 상태일 때 또는 당업자가 잘 아는 방법으로 조작할 때 폴리뉴클레오티드가 전사되고/되거나 번역되어 mRNA를 생성시킬 수 있는 것을 의미한다. 안티센스 가닥은 이러한 핵산에 상보적이고, 코딩 서열은 그로부터 추론될 수 있다.
본 명세서에서 사용시, 용어 "벡터"는 제한없이, 플라스미드, 바이러스, 코스미드, 파지, BAC, YAC 등을 포함하는, 상이한 숙주 간에 전달되도록 디자인된 핵산 구성체를 의미한다. 일부 실시태양에서, 플라스미드 벡터는 상업적으로 입수할 수 있는 벡터로부터 제조될 수 있다. 다른 실시태양에서, 바이러스 벡터는 당분야에 공지된 기술에 따라서 배큘로바이러스, 레트로바이러스, 아데노바이러스, AAV 등으로부터 생성될 수 있다. 하나의 실시태양에서, 바이러스 벡터는 렌티바이러스 벡터이다.
본 명세서에서 사용시 용어 "프로모터"는 코딩 서열, 예컨대 유전자의 발현을 조절하는 임의의 서열을 의미한다. 프로모터는 예를 들어, 항상성, 유도성 또는 조직 특이성일 수 있다. "프로모터"는 전사의 개시 및 속도가 제어되는 폴리뉴클레오티드 서열의 영역인 제어 서열이다. 조절성 단백질 및 분자가 예컨대 RNA 중합효소 및 다른 전사 인자에 결합할 수 있는 유전자 성분을 함유할 수 있다.
본 명세서에서 사용시, 용어 "단리된 세포"는 일반적으로 조직의 다른 세포로부터 실질적으로 분리된 세포를 의미한다.
"유효량" 또는 "효과적인 양"은 환자, 포유동물 또는 기타 대상체의 치료를 위해 투여 시, 질환에 대한 이러한 치료를 실시하는데 충분한 한 작용제의 양 또는 둘 이상의 작용제의 조합량을 의미한다. "유효량"은 작용제(들), 질환 및 이의 중증도 및 치료하려는 대상체의 연령, 체중 등에 좌우되어 다양해 질 것이다.
본 명세서에서 사용시 용어 "검출가능한 마커 또는 표지"는 검출가능한 신호를 직접적으로 또는 간접적으로 생성할 수 있는 적어도 하나의 마커를 의미한다. 마커의 비배타적인 목록은 예를 들어 비색, 형광발광, 발광에 의해 검출가능한 신호를 생성하는 효소, 예컨대 홀스래디쉬 퍼옥시다제, 알칼리 포스파타제, β-갈락토시다제, 글루코스-6-포스페이트 데하이드로게나제, 발색단 예컨대 형광, 발광 염료, 전자 현미경관찰 또는 그들의 전기적 특성 예컨대 전도성, 전류법, 전압전류법, 임피던스에 의해 검출되는 전자 밀도를 갖는 기, 검출가능한 기, 예를 들어 그 분자가 그들 물리적 및/또는 화학적 특성에서 검출가능한 수식을 유도하기에 충분한 크기인 것을 포함하고, 이러한 검출은 광학적 방법 예컨대 회절, 표면 플라스몬 공명, 표면 변동, 접촉각 변화 또는 물리적 방법 예컨대 원자력 분광학, 터널 효과, 또는 방사성 분자 예컨대 32P, 35S 또는 125I에 의해 수행될 수 있다.
본 명세서에서 사용시, 용어 "정제 마커"는 정제 또는 동정에 유용한 적어도 하나의 마커를 의미한다. 마커의 비배타적인 목록은 His, lacZ, GST, 말토스-결합 단백질, NusA, BCCP, c-myc, CaM, FLAG, GFP, YFP, 체리, 티오레독신, 폴리(NANP), V5, Snap, HA, 키틴-결합 단백질, Softag 1, Softag 3, Strep, 또는 S-단백질을 포함한다. 적합한 직접 또는 간접 형광발광 마커는 FLAG, GFP, YFP, RFP, dTomato, cherry, Cy3, Cy 5, Cy 5.5, Cy 7, DNP, AMCA, 비오틴, 익옥시게닌, Tamra, 텍사스 레드, 로다민, 알렉사 플루오르, FITC, TRITC 또는 임의의 다른 형광 염료 또는 합텐을 포함한다.
본 명세서에서 사용시, 용어 "발현"은 폴리뉴클레오티드가 mRNA로 전사되는 과정 및/또는 전사된 mRNA가 후속하여 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질로 번역되는 과정을 의미한다. 폴리뉴클레오티드가 게놈 DNA로부터 유래되면, 발현은 진핵생물 세포에서 mRNA의 스플라이싱을 포함할 수 있다. 유전자의 발현 수준은 세포 또는 조직 샘플 중 mRAN 또는 단백질의 양을 측정하여 결정할 수 있다. 일 양상에서, 하나의 샘플로부터 유전자의 발현 수준은 대조군 또는 기준 샘플로부터의 그 유전자의 발현 수준과 직접적으로 비교될 수 있다. 또다른 양상에서, 하나의 샘플로부터 유전자의 발현 수준은 화합물의 투여 후 동일한 샘플로부터 그 유전자의 발현 수준과 직접적으로 비교될 수 있다.
둘 이상의 핵산 또는 폴리펩티드 서열과 관련하여 사용하는 경우, 본 명세서에서 사용시, "상동성" 또는 "동일한", "동일성 비율" 또는 "유사성은 동일하거나 또는 동일한 뉴클레오티드 또는 아미노산 잔기의 특정 백분율, 예를 들어 적어도 60% 동일성, 바람직하게는 특정한 영역(예를 들어, 본 명세서에서 기술된 항체를 코딩하는 뉴클레오티드 서열 또는 본 명세서에서 기술하는 항체의 아미노산 서열) 상에서 적어도 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 그 이상의 동일성을 갖는 둘 이상의 서열 또는 하위서열을 의미한다. 상동성은 비교의 목적을 위해 정렬될 수 있는 각 서열 내 위치를 비교하여 결정될 수 있다. 비교된 서열에서의 위치가 동일한 염기 또는 아미노산으로 채워진 경우라면, 분자는 그 위치에서 상동성이다. 서열간 상동성 정도는 서열에 의해 공유되는 일치되거나 또는 상동성인 위치의 개수의 함수이다. 정렬 및 상동성 또는 서열 동일성의 비율은 당분야에 공지된 소프트웨어 프로그램, 예를 들어 문헌 [Current Protocols in Molecular Biology(Ausubel et al., eds. 1987) Supplement 30, 섹션 7.7.18, 표 7.7.1]에 기술된 것들을 사용하여 결정될 수 있다. 바람직하게는, 디폴트 변수가 정렬을 위해 사용된다. 바람직한 정렬 프로그램은 디폴트 변수를 사용하는 BLAST이다. 특히, 바람직한 프로그램은 다음의 디폴트 변수를 사용하는, BLASTN 및 BLASTP이다: 유전차 코드 = 표준; 필터 = 없음; 가닥 = 양쪽 모두; 컷오프 = 60; 기대치 = 10; 매트릭스 = BLOSUM62; 서술 = 50 서열; 분류 = 높은 점수; 데이타베이스 = 비-중복 유전자은행 + EMBL + DDBJ + PDB + 유전자은행 CDS 변역 + SwissProtein + SPupdate + PIR. 이들 프로그램의 상세사항은 하기 인터넷 주소에서 확인할 수 있다: ncbi.nlm.nih.gov/cgi-bin/BLAST. 용어 "상동성" 또는 "동일한", "동일성 비율" 또는 "유사성"은 또한 시험 서열의 상보체를 의미하거나, 또는 그에 적용될 수 있다. 용어는 또한 결실 및/또는 첨가를 갖는 서열뿐만 아니라 치환을 갖는 서열을 포함한다. 본 명세서에서 사용시, 바람직한 알고리즘은 갭 등을 설명할 수 있다. 바람직하게는, 동일성은 길이가 적어도 약 25개 아미노산 또는 뉴클레오티드인 영역, 또는 더욱 바람직하게는 길이가 적어도 50-100개 아미노산 또는 뉴클레오티드인 영역에 존재한다. "비관련" 또는 "비상동성" 서열은 본 명세서에 개시된 서열 중 하나와, 40% 미만의 동일성, 또는 대안적으로 25% 미만의 동일성을 공유한다.
일 양상에서, 용어 항체의 "등가물" 또는 "생물학적 등가물"은 ELISA 또는 기타 적합한 방법으로 측정시 이의 에피토프 단백질 또는 이의 단편에 선택적으로 결합하는 항체의 능력을 의미한다. 생물학적으로 균등한 항체는 제한없이, 기준 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 그들 항체, 펩티드, 항체 단편, 항체 변이체, 항체 유도체 및 항체 모방체를 포함한다.
본 공개가 폴리펩티드, 단백질, 폴리뉴클레오티드 또는 항체와 관련될 때, 이의 등가물 또는 생물학적으로 등가물은 본 개시의 범주 내로 의도한다는 것은 달리 의도하지 않으면 명백한 언급없이 추론될 것이다. 본 명세서에서 사용시, 용어 "이의 생물학적 등가물"은 기준 단백질, 항체, 폴리펩티드 또는 핵산에 대해 언급 시 "이의 등가물"과 동의어로 의도되며 여전히 바람직한 구조 또는 작용성을 유지하면서 최소의 상동성을 갖는 것들을 의도한다. 본 명세서에서 특별히 언급하지 않으면, 본 명세서에서 언급한 임의의 폴리뉴클레오티드, 폴리펩티드 또는 단백질은 또한 이의 등가물을 포함한다는 것을 고려한다. 예를 들어, 등가물은 적어도 약 70% 상동성 또는 동일성, 또는 적어도 80% 상동성 또는 동일성 및 대안적으로, 또는 적어도 약 85%, 또는 대안적으로 적어도 약 90%, 또는 대안적으로 적어도 약 95%, 또는 대안적으로 98% 비율의 상동성 또는 동일성을 의도하며 기준 단백질, 폴리펩티드 또는 핵산과 실질적으로 등가인 생물학적 활성을 나타낸다. 대안적으로, 폴리뉴클레오티드에 대해 언급시, 이의 등가물은 기준 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보체와 엄격 조건 하에서 혼성화하는 폴리뉴클레오티드이다.
또 다른 서열에 대해 "서열 동일성"의 특정 백분율(예를 들어, 80%, 85%, 90%, 또는 95%)을 갖는 폴리뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드 영역(또는 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 영역)은 정렬시, 염기(또는 아미노산)의 백분율이 2개 서열의 비교에서 동일한 것을 의미한다. 정렬 및 상동성 또는 서열 동일성의 백분율은 당분야에 공지된 소프트웨어 프로그램, 예를 들어 문헌 [Current Protocols in Molecular Biology(Ausubel et al., eds. 1987) Supplement 30, 섹션 7.7.18, 표 7.7.1]에 기술된 것들을 사용해 결정할 수 있다. 바람직하게는, 디폴트 변수가 정렬에 사용된다. 바람직한 정렬 프로그램은 디폴트 변수를 사용하는, BLAST이다. 특히 바람직한 프로그램은 하기의 디폴트 변수를 사용하는, BLASTN 및 BLASTP이다: 유전자 코드 = 표준; 필터 = 없음; 가닥 = 양쪽 모두; 컷오프 = 60; 예상치 = 10; 매트릭스 = BLOSUM62; 서술 = 50 서열; 분류 = 높은 점수; 데이타베이서 = 비중폭, 유전자은행 + EMBL + DDBJ + PDB + 유전자은행 CDS 번역 + SwissProtein + SPupdate + PIR. 이들 프로그램의 상세설명은 다음의 인터넷 주소에서 확인할 수 있다: ncbi.nlm.nih.gov/cgi-bin/BLAST.
"하이브리드화"는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드가 뉴클레오티드 잔기의 염기 간 수소 결합을 통해 안정화되는 복합체를 형성하도록 반응하는 반응을 의미한다. 수소 결합은 왓슨-크릭 염기 쌍형성, 후그슈타인 결합, 또는 임의의 다른 서열 특이적 방식에 의해 발생될 수 있다. 복합체는 듀플렉스 구조를 형성하는 2개 가닥, 복수 가닥 복합체를 형성하는 세개 이상의 가닥, 단일 자가 홍성화 가닥, 또는 그들의 임의 조합을 포함할 수 있다. 하이브리드화 반응은 보다 광범위한 과정의 단계, 예컨대 PCR 반응의 개시, 또는 리보자임에 의한 폴리뉴클레오티드의 효소적 절단으로 구성될 수 있다.
엄격한 하이브리드화 조건의 예는 약 25℃ 내지 약 37℃의 항온반응 온도; 약 6x SSC 내지 약 10x SSC의 하이브리드화 완충제 농도; 약 0% 내지 약 25%의 포름아마이드 농도; 및 약 4x SSC 내지 약 8x SSC의 세척 용액을 포함한다. 중간 하이브리드화 조건의 예는 약 40℃ 내지 약 50℃의 항온반응 온도; 약 9x SSC 내지 약 2x SSC의 완충제 농도; 약 30% 내지 약 50%의 포름아마이드 농도; 및 약 5x SSC 내지 약 2x SSC의 세척 용액을 포함한다. 고엄격 조건의 예는 약 55℃ 내지 약 68℃의 항온반응 온도; 약 1x SSC 내지 약 0.1x SSC의 완충제 농도; 약 55% 내지 약 75%의 호름아마이드 농도; 및 약 1x SSC, 0.1x SSC, 또는 탈이온수의 세척 용액을 포함한다. 대체로, 하이브리드화 항온반응 시간은 5분 내지 24시간이고, 1, 2 또는 그 이상의 세척 단계를 갖고, 세척 항온반응 시간은 약 1, 2, 또는 15분이다. SSC는 0.15 M NaCl 및 15 mM 시트레이트 완충제이다. 다른 완충제 시스템을 사용하는 SSC의 등가물이 적용될 수 있다는 것을 이해한다.
본 명세서에서 사용시 용어 "단리된"은 실질적으로 다른 재료가 없는 분자, 세포, 또는 생물제 또는 세포 재료를 의미한다. 일 양상에서, 용어 "단리된"은 천연 공급원에 존재하는 각각 다른 DNA 또는 RNA, 또는 단백질 또는 폴리펩티드, 또는 세포 또는 세포 소기관, 또는 조직 또는 기관으로부터 분리된, 핵산, 예컨대 DNA 또는 RNA, 또는 단백질 또는 폴리펩티드(예를 들어, 항체 또는 이의 유도체), 또는 세포 또는 세포 소기관, 또는 조직 또는 장기를 의미한다. 용어 "단리된"은 또한 화학적으로 합성시 재조합 DNA 기술, 또는 화학적 전구체 또는 기타 화학물에 의해 생성될 때 세포 재료, 바이러스 재료, 또는 배양 매질이 실질적으로 없는 핵산 또는 펩티드를 의미한다. 더욱이, "단리된 핵산"은 단편으로서 천연적으로 발생되지 않고 천연 상태에서 존재하지 않을 수 있는 핵산 단편을 포함한다는 의미이다. 용어 "단리된"은 또한 다른 세포 단백질로부터 단리된 폴리펩티드를 의미하기 위해 본 명세서에서 사용되며 정제 및 재조합 폴리펩티드 둘 모두를 포괄한다는 의미이다. 용어 "단리된"은 또한 본 명세서에서 사용시 다른 세포 조직으로부터 단리된 세포 또는 조직을 의미하고 배양된 것 및 조작된 것 둘 모두를 포괄하려는 의미이다.
용어 "개별 세포" 또는 "단일 세포"는 유기체의 구조적 및/또는 기능적 유닛을 의미한다. 일부 양상에서, 개별 세포는 제한없이 세포질, 핵 또는 세포막을 포함한다.
본 명세서에서 사용시, 용어 "단일클론 항체"는 단일 항체의 경쇄 및 중쇄 유전자가 형질감염된 세포 또는 B-림프구의 단일 클론에 의해 생성되는 항체를 의미한다. 단일클론 항체는 예를 들어, 면역 비장 세포와 골수종 세포의 융합에 의해 하이브리드 항체-형성 세포를 제조하여, 당업자에게 공지된 방법을 통해 생성된다. 단일클론 항체는 인간화 단일클론 항체를 포함한다.
용어 "단백질", "펩티드" 및 "폴리펩티드"는 상호교환적으로 사용되고 그들의 광의에서 둘 이상의 서브유닛 아미노산, 아미노산 유사체 또는 펩티드모방체의 화합물을 의미한다. 서브유닛은 펩티드 결합에 의해 연결될 수 있다. 또다른 양상에서, 서브유닛은 다른 결합, 예를 들어 에스테르, 에테르 등에 의해 연결될 수 있다. 단백질 또는 펩티드는 적어도 두개의 아미노산을 함유해야만 하고 단백질 또는 펩티드 서열을 포함할 수 있는 아미노산의 최대 개수에 제한이 없다. 본 명세서에서 사용시, 용어 "아미노산"은 글라이신 및 D 및 L 광학 이성질체 둘 모두, 아미노산 유사체 및 펩티드모방체를 포함하는, 천연 및/또는 비천연 합성 아미노산을 의미한다.
본 명세서에서 사용시, 용어 "정제된"은 절대 순도를 요구하지 않지만, 대신, 상대적인 용어로서 의도된다. 따라서, 예를 들어, 정제된 핵산, 펩티드, 단백질, 생물학적 복합체 또는 기타 활성 화합물은 단백질 또는 기타 오염물로부터 전체로 또는 부분적으로 단리된 것이다. 일반적으로, 본 공개에서 사용을 위한 실질적으로 정제된 펩티드, 단백질, 생물학적 복합체, 또는 기타 활성 화합물은 치료적 투여를 위한 완전한 약학 제제 중에서 약학적 담체, 부형제, 완충제, 흡수 향상제, 안정화제, 보존제, 보조제 또는 기타 공통 성분과 펩티드, 단백질, 생물학적 복합체 또는 기타 활성 화합물의 혼합물 또는 제제 이전에 조제물에 존재하는 모든 거대분자 종의 80% 초과를 포함한다. 보다 전형적으로, 펩티드, 단백질, 생물학적 복합체 또는 기타 활성 화합물은 다른 제제 성분과 혼합물 이전에 정제된 조제물에 존재하는 모든 거대분자 종의 90% 초과, 흔히 95% 초과에 해당되도록 정제된다. 다른 경우에서, 정제된 조제물은 본질적으로 균질할 수 있고, 다른 거대분자 종은 통상의 기술에 의해 검출가능하지 않다.
본 명세서에서 사용시, 용어 "재조합 단백질"은 재조합 DNA 기술에 의해 생성되는 폴리펩티드를 의미하고, 일반적으로 폴리펩티드를 코딩하는 DNA는 적합한 발현 벡터로 삽입되고 이어서 숙주 세포를 형질전환시키는데 사용되어 불균질한 단백질을 생성시킨다.
본 명세서에서 사용시, 용어 "초음파처리"는 액체 매질을 통해 전달되는 음파(음향 에너지)의 적용을 의미한다. 음파는 입자(예를 들어, 세포 또는 세포 클러스터)가 그들 평균 위치에 대해서 진동하도록 할 수 있다. 일 양상에서, 초음파처리는 단일 세포 현탁물로 세포 클러스터의 해리를 초래한다.
본 명세서에서 사용시, 대상체에서 질환을 "치료하는" 또는 "치료"는 (1) 질환의 증상이 아직 발현되지 않았거나 또는 성향이 있는 대상체에서 증상 또는 질환의 발생의 예방; 및/또는 (2) 질환의 억제 또는 이의 발생의 정지; 및/또는 (3) 질환의 증상 또는 질환의 퇴행 야기 또는 개선을 의미한다. 당분야에서 이해하는 바와 같이, "치료"는 임상적 결과를 포함하는, 유리하거나 또는 바람직한 결과를 수득하기 위한 접근법이다. 본 기술의 목적을 위해서, 유리하거나 또는 바람직한 결과는 제한없이, 검출가능하건 또는 검출불가능하건 하나 이상의 증상의 경감 또는 개선, 병태(질환 포함)의 정도의 감소, 병태(질환 포함)의 안정화된(즉, 악화되지 않음) 상태, 병태(질환 포함)의 지연 또는 완화, 병태(질환 포함)의 진행, 개선 또는 완화, 상태 및 차도(부분적이건 또는 전체이건)를 포함한다.
대표되는 실질적으로 균질한 샘플
본 공개는 대표 샘플을 제공하는데 실패한 종래의 임상적 샘플채취 방법의 한계를 해결한다. 대표 샘플의 특징은 거대한 독립체 또는 샘플의 핵심 변수 및 특징과 유사하다. 선택적인 샘플채취의 현재 관행은 TNM 병기화 시스템의 요건을 충족하도록 조직 샘플을 수집하는 것이 목적이다. TNM 병기화 시스템을 위한 샘플은 종양을 함유하는 제거된 장기의 정상적인 해부학을 반영하도록 특별하게 채취된다. TNM 시스템의 예후적 병기화에 중요한 한편, 이러한 선택적 샘플채취 방법은 종괴 전반에서 발견되는 유전자 및 표현형 다양성을 함유하지 않는 편향된 샘플, 또는 종양 샘플을 생성시킨다.
본 공개는 실질적으로 균질하게 분포된 세포 구조를 포함하는, 불균질 조직 샘플로부터 유래된 가공된 균질물 조성물을 제공하고, 여기서 대표 샘플의 각각 및/또는 임의의 서브셋 중 세포 구조의 비율은 공급되는 불균질 조직 샘플에서 세포 구조의 비율과 실질적으로 유사하다. 균질물 조성물은 원래의 공급된 불균질 조직 샘플의 핵심 특징을 또한 대표하는 신규하고, 독특한 조직 샘플이다. 본 명세서에서 기술된 바와 같은 조성물 및 조성물의 제조 방법은 임상 샘플, 특히 임상적 분야, 예를 들어 임상 종양학에서 사용을 위한, 임상 샘플의 조직 불균질성 문제를 해명하기 위해 종래 방법의 실패를 극복한다.
본 공개의 대표 샘플은 도 2A 및 2B에 예시되어 있는데, 본 개시의 균질물의 개략적인 대표도를 도시한다. 도 2A는 상이한 비율로 존재하는 3종의 서브클론을 갖는 종양을 도시한다. 개시된 균질화 방법은 고형 종양에 그들이 존재하는 비율로 서브클론을 함유하는 대표 샘플을 생성시킨다. 균질물로부터 채취된 임의 샘플은 원래의 종양에 존재하는 바와 동일한 비율로 각 서브클론을 함유할 것이다. 도 2B는 낮은 출현율 서브클론의 검출을 균질물이 어떻게 촉진하는지에 대한 예시이다.
본 공개의 대표 샘플은 조직의 공간적으로 계측화된 3차원 구조에 의해 부여되는 샘플채취의 도전을 극복한다. 대표 샘플에서 원래의 공간적으로 계층화된 장기, 종양 또는 조직("OTT")의 구성요소(세포 구조, 세포, 펩티드, 핵산, 지질, 대사물 등)는 그들이 원래 OTT에 존재하는 비율로 샘플의 서브셋 또는 하위샘플에 존재한다. 일부 실시태양에서, 대표 샘플은 부착된 세포, 개별 세포, 세포의 단편, 소기관, 펩티드, 핵산, 지질, 대사물 등의 클러스터 수준에서 OTT의 다양성을 대표하는 목표를 접근하기 위해 OTT의 상당히 충분한 부분을 포괄하거나 또는 OTT의 전체에 접근하게, 가능한 많은 OTT로 구성된 OTT의 샘플을 의미한다. 대표 샘플은 OTT의 다양성을 포괄하는데 요구되는 온전한 OTT의 최소량을 함유할 수 있다.
복수의 대표 샘플은 단일한 OTT로부터 만들어 질 수 있다. 이러한 실시태양에서, 수술적으로 제거된 OTT는 먼저 가공되거나 또는 아니면 별개의 서브유닛으로 조작되어, 각각의 서브유닛은 공간적으로 계층화된 세포 구조, 세포, 펩티드, 핵산 등으로 구성된다. 다음으로, 각각의 서브유닛은 충분히 균질화되거나, 혼합되거나 또는 아니면 파괴되어 OTT의 서브유닛의 대표 샘플을 생성시킨다.
대표 샘플은 임의의 분석 샘플, 또는 대표 샘플의 일부분이 대표 샘플에 존재하는 재료의 무작위 샘플채취를 함유하는 지점까지 균질화되거나 또는 아니면 혼합되거나 또는 파괴될 수 있다. 적용하려는 분석 검사의 의도하는 출력값에 대해서, 대표 샘플의 다양성을 포괄하는 대표 샘플의 충분히 큰 분획의 분석 샘플의 특징이다(즉, 세포 대 상당량의 세포). 대표 샘플에서, 특별한 어세이에 사용되는 임의의 분석 샘플은 특정 어세이에 사용되는 임의의 분석 샘플은 실험 오차 내에서, 동일한 어세이에 사용되는 또 다른 분석 샘플과 일관된 데이타를 생성하게 된다. 더욱이, 특별한 어세이에 선택된 대표 샘플의 임의의 서브셋은 동일한 대표 샘플, 또는 동일한 환자 유래의 OTT로부터 만든 다른 대표 샘플로부터 채취된 분석 샘플을 사용하여 상이한 어세이로 생성된 데이타를 교차 참조할 수 있다는 것을 고려한다. 원래의 생물학적 구성요소의 원래 비율이 모든 분석 서브샘플에 존재하므로, OTT의 생물학적 구성요소의 비율에 관계된 분석적 서브샘플로부터 생성된 데이타를 환자 사이에서 비교할 수 있다는 것을 또한 고려한다.
하나의 실시태양에서, 대표 샘플은 불균질 조직 샘플로부터 유래된 가공된 균질물 조성물이다. 균질물 조성물은 실질적으로 균질하게 분포된 세포 구조를 포함하거나, 또는 대안적으로 그로 본질적으로 이루어지거나, 또는 더욱 그로 이루어지며, 균질물의 각각의 서브셋에서의 세포 구조의 비율은 조직 샘플 중 세포 구조의 비율과 실질적으로 유사하다. 하나의 실시태양에서, 조직 샘플은 종양, 림프절, 전이물, 폴립, 낭포, 절제물, 장기 또는 이의 분획의 군으로부터 선택된다. 또다른 실시태양에서, 조직 샘플은 공강적으로 분리된 세포 구조를 포함하거나, 또는 대안적으로 그로 본질적으로 이루어지거나, 또는 더욱 그로 이루어진다. 또다른 양상에서, 세포 구조는 세포 클러스터, 개별 세포, 세포의 단편, 소기관, 펩티드, 핵산, 지질, 대사물, 또는 이의 조합을 포함하거나, 또는 대안적으로 그로 본질적으로 이루어지거나, 또는 더욱 그로 이루어진다. 일 양상에서, 균질물은 조직 샘플 유래의 세포 구조의 25% 이하를 포함하거나, 또는 대안적으로 그로 본질적으로 이루어지거나, 또는 그로 더욱 이루어진다. 일 양상에서, 균질물은 조직 샘플 유래의 세포 구조의 50% 이하를 포함하거나, 또는 대안적으로 그로 본질적으로 이루어지거나, 또는 그로 더욱 이루어진다. 또다른 양상에서, 균질물은 조직 샘플 유래의 세포 구조의 7% 이하를 포함하거나, 또는 대안적으로 그로 이루어졌거나, 또는 그로 더욱 이루어지니다. 상이한 양상에서, 균질물은 조직 샘플 유래의 세포 구조 100% 이하를 포함하거나, 또는 대안적으로 그로 본질적으로 이루어지거나, 또는 그로 더욱 이루어진다. 또다른 양상에서, 균질물은 조직 샘플 유래의 세포 구조의 100%를 포함하거나, 또는 대안적으로 그로 본질적으로 이루어지거나, 또는 그로 더욱 이루어진다.
또다른 실시태양에서, 균질물은 조직 샘플 유래의 세포 구조의 100%를 포함하거나, 또는 대안적으로 그로 본질적으로 이루어지거나, 또는 그로 더욱 이루어진다. 일 양상에서, 조직 샘플은 비-액체 조직 샘플을 포함하거나, 또는 대안적으로 그로 본질적으로 이루어지거나, 또는 그로 더욱 이루어진다. 또다른 양상에서, 조직 샘플은 액체 조직 샘플을 포함하거나, 또는 대안적으로 그로 본질적으로 이루어지거나, 또는 그로 더욱 이루어진다. 일 양상에서, 액체 조직 샘플은 수술적 절제, 세포검사 바늘 흡인물, 삼출 샘플, 또는 파프 도말시료의 하나 이상에 의해 단리된 조직을 포함하거나, 또는 대안적으로 그로 본질적으로 이루어지거나, 또는 그로 더욱 이루어진다.
또다른 실시태양에서, 실질적으로 균질한 세포 구조는 복수의 단일 세포 또는 복수의 세포 클러스터를 포함하거나, 또는 대안적으로 그로 본질적으로 이루어지거나, 또는 그로 더욱 이루어진다. 일 양상에서, 세포 구조는 정상 조직으로부터 단리된다. 또다른 양상에서, 세포 구조는 표현형적으로 또는 유전자형적으로 정상인 조직으로부터 단리된다. 또다른 양상에서, 세포 구조는 비정상 조직으로부터 단리된다. 일 양상에서, 세포 구조는 표현형적으로 또는 유전자형적으로 비정상인 조직으로부터 단리된다.
하나의 실시태양에서, 조직 샘플은 줄기 세포, 상피 세포, 혈액 세포, 지방 세포, 피부 세포, 내피 세포, 종양 세포, 또는 면역 세포를 포함하거나, 또는 대안적으로 그로 본질적으로 이루어지거나, 또는 그로 더욱 이루어진다. 일 양상에서, 종양 세포는 폐암, 백혈병, 유방암, 전립선암, 대장 암, 뇌 암, 식도 암, 두경부암, 방광암, 부인과 암종, 난소 암, 자궁 암, 지방육종, 흑색종, 림프종, 형질세포종, 육종, 신경교종, 흉선종, 간세포암, 및 골수종의 군으로부터 선택된 암성 조직으로부터 유도된다. 또다른 양상에서, 면역 세포는 호중구, 단핵구, 수지상 세포, 마크로파지, 림프구, T-세포, B-세포, 또는 자연 살해 세포의 군으로부터 선택된 세포이다.
또다른 실시태양에서, 조직 샘플은 보존되지 않았거나 또는 고정되지 않는다. 일 양상에서, 조직 샘플은 생세포 또는 대상체로부터 최근에 단리된 세포를 포함한다. 또다른 실시태양에서, 조직 샘플은 보존되거나 또는 고정된다. 일 양상에서, 보존되거나 또는 고정된 조직 샘플은 동결, 동결-건조 및 왁스 포매의 군의 방법에 의해 동결되거나 또는 고정된 샘플을 포함한다.
하나의 실시태양에서, 불균질 조직 샘플은 동일하거나 또는 상이한 대상체 유래의 하나 이상의 조직으로부터 단리된다. 일 양상에서, 조직 샘플은 하나의 대상체로부터 단리된다. 또다른 양상에서, 조직 샘플은 둘 이상의 대상체 및 동일하거나 또는 유사한 조직 유형 또는 상이한 조직 유형으로부터 단리된 조직을 포함하거나, 또는 대안적으로 그로 본질적으로 이루어지거나, 또는 그로 더욱 이루어진다. 추가의 양상에서, 둘 이상의 대상체는 유전적으로 균질한 대상체이다. 또다른 양상에서, 둘 이상의 대상체는 표현형적으로 균질한 대상체이다. 추가의 양상에서, 둘 이상의 대상체는 유전적으로 다양한 대상체이다. 일 양상에서, 둘 이상의 대상체는 표현형적으로 다양한 대상체이다. 또다른 양상에서, 둘 이상의 대상체는 동일한 성별이거나 또는 상이한 성별에서 유래된다.
추가의 양상에서, 둘 이상의 대상체는 상이한 성별로부터 유래된다. 또다른 양상에서, 둘 이상의 대상체는 상이한 인종 집단으로부터 유래된다. 일 양상에서, 둘 이상의 대상체는 동일한 인종 집단으로부터 유래된다. 또다른 양상에서, 대상체는 동물, 농장 동물, 애완동물, 인간 대상체로 이루어진 군으로부터 선택된다.
하나의 실시태양에서, 균질물은 비-인간 세포, 인간 세포, 검출가능한 표지, 정제 표지, 비-선천 단백질, 핵산 또는 폴리뉴클레오티드, 소형 분자, 염료, 바이러스, 세균, 기생동물, 원생동물, 또는 화학물질 중 하나 이상을 더 포함하거나, 또는 대안적으로 그로 본질적으로 이루어지거나, 또는 그로 더욱 이루어진다. 일 양상에서, 소형 분자는 합텐, 펩티드 태그, 단백질 태그, 형광 태그, 핵산 태그, 및 이의 조합을 포함하거나, 또는 대안적으로 그로 본질적으로 이루어지거나, 또는 그로 더욱 이루어진다.
대표 데이타를 생성시키는 방법
본 개시는 또한 본 명세서에 기술된 대표 샘플 또는 균질물 조성물로부터 대표 데이타를 생성시키는 것에 관한 것이다. 일 양상에서, 대표 데이타를 생성시키기 위한 방법은 본 명세서에 개시된 바와 같은 균질물 조성물을 분석하는 단계를 포함한다. 추가의 양상에서, 분석 단계는 균질물 조성물 중 마커에 대한 정량적 및/또는 정성적 데이타를 생성시키는 단계를 포함한다. 마커와 관련된 데이타를 수득하기 위한 임의의 적합한 방법이 사용될 수 있는데, 이의 비제한적인 예는 단일-세포 시퀀싱, 단일-핵 시퀀싱, 유세포 분석, 면역조직화학 염색, 헤마톡실린 및 에오신 염색, 전체 게놈시퀀싱, 고수율 시퀀싱, 질량 분광법, DNA 마이크로어레이, 또는 이의 조합에 의한 측정을 포함한다.
현재 기술된 방법은 부분적으로 본 개시의 독특한 샘플채취 기술 및 조성물 때문에 데이타 세트를 생성하는 강력한 도구이다. 대표 샘플의 세포 구조 및/또는 별개의 구성요소는 본질적으로 정확하게 전체 조직 시료, 일반적으로 고형 종양, 림프절, 전이물, 폴립, 낭포, 또는 이의 일부분 또는 전술한 임의의 조합 내에서 이들 세포 구조(제한없이, 유형, 구성 및 변이 포함)의 상대적 비율 또는 백분율을 반영하거나 또는 모방한다. 그러므로, 대표 샘플(또는 균질물 조성물)의 분석에 의한 데이타의 세트 또는 이의 서브셋은 대표 샘플이 유래되는 전체 조직 또는 생물학적 샘플의 개별 정보를 정확하게 반영할 것이다. 일부 실시태양에서, 대표 데이타는 대표 샘플이 유래된 원래 장기, 조직 또는 종양의 전체 개체군의 모든 특징을 의미한다.
상기에 언급한 바와 같이, 대표 데이타를 생성하기 위한 방법은 균질물 조성물 중 마커에 대한 정량적 또는 정성적 데이타를 생성하는 단계를 포함하거나, 또는 대안적으로 그로 본질적으로 이루어지거나, 또는 그로 더욱 이루어진다.
이러한 방법 및 조성물과 관련하여, 마커는 폴리뉴클레오티드, DNA, 단백질, RNA, 지질, 세포 소기관, 대사물, 또는 세포를 포함하거나, 또는 대안적으로 그로 본질적으로 이루어지거나, 또는 그로 더욱 이루어진다. 일 양상에서, 단백질은 수직을 포함하고, 상기 수식은 아세틸화, ADP-리보실화, 아실화, ADP-리보실화, 아미드화, 플라빈의 공유적 부착, 헴의 공유적 부착, 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 유도체의 공유적 부착, 지질 또는 지질 유도체의 공유적 부착, 포스파티딜이노시톨의 공유적 부착, 교차결합, 고리화, 다이설파이드 결합 형성, 탈메틸화, 공유적 교차결합의 형성, 시스틴의 형성, 파이로글루타메이트의 형성, 포르밀화, 감마-카르복실화, 당화, GPI 앵커 형성, 히드록실화, 요오드화, 메틸화, 미리스토일화, 산화, 단백질가수분해 가공, 인산화, 프레닐화, 라세미화, 셀레노일화, 황산화, 아르기닐화, 및 유비퀴틴화로 이루어진 군으로부터 선택된다. 또다른 양상에서, 마커는 게놈 다형성, 약리유전체학 단일 뉴클레오티드 다형성(SNP), 게놈 SNP, 체세포 다형성, 및 단백질, 지질, 및/또는 세포 소기관의 차등 발현을 포함하거나, 또는 대안적으로 그로 본질적으로 이루어지거나, 또는 그로 더욱 이루어진다. 추가의 양상에서, 마커는 단일 뉴클레오티드 위치; 유전자내 영역 또는 유전자간 영역; 엑손 또는 인트론, 또는 그의 단편; 코딩 영역 또는 비-코딩 영역; 프로모터, 인핸서, 5' 미번역 영역(5' UTR), 또는 3' 미번역 영역(3' UTR), 또는 그의 단편; cDNA 또는 그의 단편; SNP; 체세포 돌연변이, 생식 계열 돌연변이 또는 둘모두; 점 또는 단일 돌연변이; 결실 돌연변이; 인-프레임 결실, 유전자내 결실, 전체 유전자 결실; 삽입 돌연변이; 유전자내 삽입; 역위 돌연변이; 염색체내 역위; 연관 돌연변이; 연관된 삽입 돌연변이; 역방위 중복 돌연변이; 탠덤 중복; 염색체내 탠덤 중복; 전위; 염색체 전위, 비-상호 전위; 재배열; 게놈 재배열; 하나 이상의 인트론, 또는 그의 단편의 재배열; 재배열된 인트론; 5'-UTR 또는 3'-UTR, 또는 이의 조합을 포함하거나, 또는 대안적으로 그로 본질적으로 이루어지거나, 또는 그로 더욱 이루어진다. 상이한 양상에서, 마커는 정상, 건강 조직 또는 세포와 비교하여, 암 조직 또는 암 세포에서의 변경된 아미노산 서열을 코딩하는 변경된 뉴클레오티드 서열, 염색체 전위, 염색체내 역위, 카피수의 변화, 발현 수준의 변화, 단백질 수준의 변화, 단백질 활성의 변화, 또는 메틸화 상태의 변화를 포함하거나, 또는 대안적으로 그로 본질적으로 이루어지거나, 또는 그로 더욱 이루어진다.
또다른 양상에서, 마커는 단백질, 항원, 효소, 호르몬, DNA, RNA, 마이크로RNA, 또는 탄수화물로 이루어진 군으로부터 선택되는 종양 마커이다. 추가의 양상에서, 마커는 Her2, bRaf, ERBB2, Pl3KCA, FGFR2, p53, BRCA, CCND1, MAP2K4, ATR, AFP, ALK, BCR-ABL, BRCA1/BRCA2, BRAF, V600E, Ca-125, CA19.9, EGFR, Her-2, KIT, PSA, S100, KRAS, ER/Pr, UGT1A1, CD30, CD20, F1P1L1-PDGRFα, PDGFR, TMPT, TMPRSS2; ABCB5, AFP-L3, 알파-페토단백질, 알파-메틸 아실-CoA 라세마아제, BRCA1, BRCA2, CA 15-3, CA 242, Ca 27-29, CA-125, CA15-3, CA19-9, 칼시토닌, 암배아 항원, 암배아 항원 펩티드-1, Des-감마 카르복시 프로트롬빈, 데스민, 조기 전립선암 항원-2, 에스트로겐 수용체, 피브린 붕괴 산물, 글루코스-6-포스페이트 아이소머라제, vE6, E7, L1, L2 또는 p16INK4a, 인간 융모막 고나도트로핀, IL-6, 케라틴 19, 락테이트 데하이드로게나제, 류실 아미노펩티다아제, 리포트로핀, 메타네프린, 네프릴리신, NMP22, 노르메타네프린, PCA3, 전립선-특이적 항원, 전립선 산 포스파타제, 시냅토파이신, 티로글로불린, TNF, ERG, ETV1(ER81), FLI1, EST1, EST2, ELK1, ETV6, ETV7, GABPα, ELF1, ETV4, ETV5, ERF, PEA3/E1AF, PU.1, ESE1/ESX, SAP1(ELK4), ETV3(METS), EWS/FLI1, ESE1, ESE2(ELF5), ESE3, PDEF, NET(ELK3; SAP2), NERF(ELF2), 또는 FEV.XXX에서 선택되는 전사 인자, 종양 관련 당단백질 72, c-kit, SCF, pAKT, pc-kit, 비멘틴, CTLA-4, PDL1, PDL2, PD1, B7-H3, B7-H4, BTLA, HVEM, KIR, TIM3, GAL9, GITR, LAG3, VISTA, KIR, 2B4, TRPO2, CD160, CGEN-15049, CHK1, CHK2, A2aR, TL1A, CTLA-4, PDL1, PDL2, PD1, B7-H3, B7-H4, BTLA, HVEM, TIM3, GAL9, LAG3, VISTA, KIR, 2B4, CD160, CGEN-15049, CHK1, CHK2, A2aR, B-7 패밀리, 또는 이의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 종양 마커이다. 일 양상에서, 마커는 게놈 다형성, 약리유전체학 단일 뉴클레오티드 다형성(SNP), 게놈 SNP, 체세포 다형성, 및 단백질, 지질, 및 세포 소기관의 차등적 발현의 군으로부터 선택된 하나 이상의 마커를 포함하거나, 또는 대안적으로 그로 본질적으로 이루어지거나, 또는 그로 더욱 이루어진 종양 마커이다. 또다른 양상에서, 종양 마커는 단일 뉴클레오티드 위치; 유전자내 영역 또는 유전자간 영역; 엑손 또는 인트론, 또는 그의 단편; 코딩 영역 또는 비-코딩 영역; 프로모터, 인핸서, 5' 미번역 영역(5' UTR), 또는 3' 미번역 영역(3' UTR), 또는 그의 단편; cDNA 또는 그의 단편; SNP; 체세포 돌연변이, 생식 계열 돌연변이 또는 둘모두; 점 또는 단일 돌연변이; 결실 돌연변이; 인-프레임 결실, 유전자내 결실, 전체 유전자 결실; 삽입 돌연변이; 유전자내 삽입; 역위 돌연변이; 염색체내 역위; 연관 돌연변이; 연관된 삽입 돌연변이; 역방위 중복 돌연변이; 탠덤 중복; 염색체내 탠덤 중복; 전위; 염색체 전위, 비-상호 전위; 재배열; 게놈 재배열; 하나 이상의 인트론, 또는 그의 단편의 재배열; 재배열된 인트론; 5'-UTR 또는 3'-UTR, 또는 이의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 상이한 양상에서, 마커는 암 조직 또는 암 세포에서, 정상, 건강 조직 또는 세포와 비교하여 각각 "변경된" 변경된 뉴클레오티드 서열 that encodes 변경된 아미노산 서열을 코딩하는 변경된 뉴클레오티드 서열, 염색체 전위, 염색체내 역위, 카피수의 변화, 발현 수준의 변화, 단백질 수준의 변화, 단백질 활성의 변화, 및 메틸화 상태의 변화의 군으로부터의 마커를 포함하거나, 또는 대안적으로 그로 본질적으로 이루어지거나, 또는 그로 더욱 이루어진다.
데이타는 본 명세서에서 기술된 바와 같이 균질물 조성물을 분석하여 생성된다. 분석을 위한 조직의 비제한적인 예는 하나 이상의 전악성 또는 악성 세포, 고형 종양, 연조직 종양 또는 전이성 병변 유래의 세포, 수술 변연부 유래의 조직 또는 세포, 조직학적 정상 조직, 하나 이상의 순환 종양 세포(CTC), 정상 인접 조직(NAT), 종양을 갖거나 가질 위험에 처한 동일한 대상체 유래의 혈액 샘플, 또는 FFPE-샘플의 군으로부터 선택된 샘플이다.
하나의 실시태양에서, 대표 데이타는 단일 마커로부터 생성된 정성적 및 정량적 데이타를 포함한다. 일 양상에서, 대표 데이타는 둘 이상의 상이한 마커로부터 생성된 정성적 및/또는 정량적 데이타를 포함한다. 추가의 양상에서, 대표 데이타는 상이한 시점, 예를 들어 요법 이전 및 이후에 동일하거나 또는 복수의 마커를 측정하여 생성되며, 일 양상에서, 치료 과정 동안 요법 또는 환자의 상태를 모니터링하기 위해 사용될 수 있다.
하나의 실시태양에서, 대표 데이타를 생성하기 위한 방법은 정성적 및/또는 정량적 데이타에 내부값을 지정하는 단계를 더 포함하거나, 또는 대안적으로 그로 본질적으로 이루어지거나, 또는 그로 더욱 이루얼진다. 또다른 실시태양에서, 대표 데이타를 생성하기 위한 방법은 데이타에 대한 사전결정된 값과 대표 데이타를 비교하는 단계를 더 포함하거나, 또는 대안적으로 그로 본질적으로 이루어지거나, 또는 그로 더욱 이 루어진다. 추가의 양상에서, 마커의 측정된 값은 졍규화되고 종합 점수가 마커의 정규화된 측정값을 기반으로 수득된다. 종합 점수는 사전결정된 점수와 더욱 비교할 수 있다. 암의 경우에서, 또다른 실시태양에서, 대표 데이타를 생성하기 위한 방법은 (a) 제1 생물학적 샘플에서 종양 마커를 측정하는 단계로서, 종양 마커의 측정된 값은 정규화되는 것인 단계; (b) 정규화된 측정 값을 기반으로 종합 점수를 수득하는 단계; 및 (c) 종합 점수를 사전결정된 점수와 비교하여 대상체의 암 위험값을 결정하는 단계를 더 포함하거나, 또는 대안적으로 그로 본질적으로 이루어지거나, 또는 그로 더욱 이루어진다.
또다른 실시태양에서, 사전결정된 값은 임상 시험 데이타, 대상체에 대한 데이타, 과학 문헌 유래의 데이타, 및 임상 개발 중인 생물제 또는 소형 분자에 대한 데이타로부터 선택된다. 일 양상에서, 대표 데이타는 대표 종양학 데이타를 포함하거나, 또는 대안적으로 그로 본질적으로 이루어지거나, 또는 그로 더욱 이루어지며, 대표 종양학 데이타는 제1 생물학적 샘플 유래의 적어도 하나의 종양 마커의 정량적 및/또는 정성적 데이타를 포함하거나, 또는 대안적으로 그로 본질적으로 이루어지거나, 또는 그로 더욱 이루어지고, 상기 종양 마커는 종양의 존재와 연관된다.
하나의 실시태양에서, 사전결정된 점수는 임상 시험 데이타, 제2 생물학적 샘플로부터 유래된 대표 종양학 데이타, 생물학적 샘플의 군으로부터 유래된 대표 종양학 데이타, 생물제 또는 소형 분자의 임상적 개발에 대한 데이타의 군으로부터 유래된다.
표현형 프로파일을 결정하기 위한 방법
하나의 실시태양에서, 본 공개는 조직 샘플의 표현형 프로파일을 결정하는 방법에 관한 것이고, 상기 방법은 균질물 조성물의 세포 구조를 분석하는 단계를 포함하거나, 또는 대안적으로 그로 본질적으로 이루어지거나, 또는 그로 더욱 이루어진다. 일 양상에서, 표현형 프로파일에 대해 분석될 수 있는 세포 구조는 세포 클러스터, 개별 세포, 세포의 단편, 소기관, 펩티드, 핵산, 지질, 대사물, 또는 이의 조합을 포함하거나, 또는 대안적으로 그로 본질적으로 이루어지거나, 또는 그로 더욱 이루어진다. 또다른 양상에서, 세포 구조는 단일 세포 또는 핵을 포함하고, 단일 세포 또는 핵은 온전하다. 일부 실시태양에서, 분석 단계는 세포 구조의 수, 유형, 상태, 백분율 및/또는 발현을 분석하는 단계를 포함하거나, 또는 대안적으로 그로 본질적으로 이루어지거나, 또는 그로 더욱 이루어진다. 또다른 양상에서, 분석 단계는 단일-세포 분석, 단일-핵 분석, 단일 소기관 분석, 또는 이의 조합을 포함하거나, 또는 대안적으로 그로 본질적으로 이루어지거나, 또는 그로 더욱 이루어진다. 일 양상에서, 세포 구조의 상태는 증식, 세포자멸사, 괴사, 이주, 상피-간엽 전이("EMT"), 유사분열, 세포 주기 정지, S-기, 노쇠, 및/또는 분화를 포함하거나, 또는 대안적으로 그로 본질적으로 이루어지거나, 또는 그로 더욱 이루어진다. 또다른 양상에서, 분석 단계는 균질물 유래의 마커의 분석 단계를 포함하거나, 또는 대안적으로 그로 본질적으로 이루어지거나, 또는 그로 더욱 이루어진다.
하나의 실시태양에서, 마커는 DNA, 단백질, RNA, 지질, 세포 소기관, 대사물, 또는 세포로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일 양상에서, 마커의 분석은 마커의 검출을 포함하거나, 또는 대안적으로 그로 본질적으로 이루어지거나, 또는 그로 더욱 이루어진다. 또다른 양상에서, 마커의 분석은 단일 세포 또는 단일 핵 유래의 마커의 분석을 포함한다.
질환을 치료하는 방법
또 다른 양상에서, 본 개시는 본 개시의 방법을 사용하여 생성된 대표 데이타를 기반으로 유효한 치료적 섭생법을 선택하여 질환을 치료하는 방법에 관한 것이다. 환자 유래의 정보의 올바른 양 또는 유형에 의해, 치료적 섭생법은 환자를 위한 결과를 획득하도록 최고 응답 및 최고 안정성 보장 여유를 위해 제단될 수 있다. 더욱이, 정보는 또한 환자가 많은 다른 이득, 예를 들어, 초기 진단, 위험성 평가, 및 효과적인 치료를 수용하여서, 건강관리의 품질을 상당히 개선시킬 수 있게 한다.
효과적인 치료적 섭생법의 선택은 몇몇 인자들에 의존적이다. 먼저, 질환 또는 의학적 병태의 신뢰할만한 진단을 획득해야 한다. 감염성 질환, 암 또는 기타 급성의 생명 위협 질환의 경우에서, 이러한 진단은 빠르고 유효해야만 하는데, 시간이 그들 질환을 앓는 환자의 생존률에서 핵심적인 역할을 하기 때문이다. 두번째, 개별 환자의 치료적 치료는 진단이 정밀하다면 보다 효과적이 된다. 예를 들어, 암이 때때로 항암 약물의 표준 "칵테일"로 치료되는 경우, 칵테일은 종종 환자에게 심각한 부작용을 나타낸다. 암(또는 다른 지환)의 유형이 정밀하게 결정되지 않았다면, 질환의 이러한 유형에 대한 개별 치료 섭생법은 임의의 다른 치료 섭생법보다 이례적으로 효과적이지 않을 것이다. 따라서, 효능은 치료하려는 환자로부터 획득된 데이타 또는 정보에 직접적으로 의존한다. 치료 섭생법이 조기 섭생법에 대한 생리학적 반응을 기반으로 이 환자 또는 기타 환자에게 이미 성공적으로 적용된 섭생법과 교차 검토하게 된다면, 보다 효과적인 치료가 가능할 것이다. 또한, 질환의 정밀한 진단은 개별 치료 섭생법에 대해 비용 절감을 유도시킬 수 있는데, 불필요하고 비효율적인 약물을 피하기 때문이다. 그러나, 최신 치료 정보에 현재 있는 이들이더라도 그 정보를 소화하고 환자에게 최고의 이용가능한 치료를 제공하기 위해 다른 치료 정보와 그것이 어떻게 관련되는지를 이해하는데 시간이 필요하다.
그러므로, 본 공개는 대상체에서 질환을 치료하는 방법을 제공하고, 대표 데이타를 기반으로 적당한 치료적 섭생법을 선택하는 단계를 포함하거나, 또는 대안적으로 그로 본질적으로 이루어지거나, 또는 그로 더욱 이루어지고, 대표 데이타는 대상체의 제1 프로파일을 포함한다.
일 양상에서, 제1 프로파일의 비제한적인 예는 마커 프로파일, 항원 프로파일, 단백질 프로파일, 돌연변이 프로파일, 지질 프로파일, 엑소솜 프로파일, 또는 이의 조합의 군으로부터의 프로파일을 포함하거나, 또는 대안적으로 그로 본질적으로 이루어지거나, 또는 그로 더욱 이루어진다. 또다른 양상에서, 마커는 Her2, bRaf, ERBB2, Pl3KCA, FGFR2, p53, BRCA, CCND1, MAP2K4, ATR, AFP, ALK, BCR-ABL, BRCA1/BRCA2, BRAF, V600E, Ca-125, CA19.9, EGFR, Her-2, KIT, PSA, S100, KRAS, ER/Pr, UGT1A1, CD30, CD20, F1P1L1-PDGRFα, PDGFR, TMPT, TMPRSS2; ABCB5, AFP-L3, 알파-페토단백질, 알파-메틸 아실-CoA 라세마아제, BRCA1, BRCA2, CA 15-3, CA 242, Ca 27-29, CA-125, CA15-3, CA19-9, 칼시토닌, 암배아 항원, 암배아 항원 펩티드-1, Des-감마 카르복시 프로트롬빈, 데스민, 조기 전립선암 항원-2, 에스트로겐 수용체, 피브린 붕괴 산물, 글루코스-6-포스페이트 아이소머라제, vE6, E7, L1, L2 또는 p16INK4a, 인간 융모막 고나도트로핀, IL-6, 케라틴 19, 락테이트 데하이드로게나제, 류실 아미노펩티다아제, 리포트로핀, 메타네프린, 네프릴리신, NMP22, 노르메타네프린, PCA3, 전립선-특이적 항원, 전립선 산 포스파타제, 시냅토파이신, 티로글로불린, TNF, ERG, ETV1(ER81), FLI1, EST1, EST2, ELK1, ETV6, ETV7, GABPα, ELF1, ETV4, ETV5, ERF, PEA3/E1AF, PU.1, ESE1/ESX, SAP1(ELK4), ETV3(METS), EWS/FLI1, ESE1, ESE2(ELF5), ESE3, PDEF, NET(ELK3; SAP2), NERF(ELF2), 또는 FEV.XXX에서 선택되는 전사 인자, 종양 관련 당단백질 72, c-kit, SCF, pAKT, pc-kit, 비멘틴, CTLA-4, PDL1, PDL2, PD1, B7-H3, B7-H4, BTLA, HVEM, KIR, TIM3, GAL9, GITR, LAG3, VISTA, KIR, 2B4, TRPO2, CD160, CGEN-15049, CHK1, CHK2, A2aR, TL1A, CTLA-4, PDL1, PDL2, PD1, B7-H3, B7-H4, BTLA, HVEM, TIM3, GAL9, LAG3, VISTA, KIR, 2B4, CD160, CGEN-15049, CHK1, CHK2, A2aR, B-7 패밀리, 및 이의 조합의 군으로부터의 하나 이상을 포함하거나, 또는 대안적으로 그로 본질적으로 이루어지거나, 또는 그로 더욱 이루어진다. 일부 양상에서, 제1 프로파일은 하나 이상의 마커, 하나 이상의 항원, 하나 이상의 단백질, 하나 이상의 돌연변이, 하나 이상의 지질, 하나 이상의 엑소솜, 또는 이의 조합의 군으로부터 생성되는 프로파일을 포함한다.
일부 실시태양에서, 방법의 마커는 게놈 다형성, 약리유전체학 단일 뉴클레오티드 다형성(SNP), 게놈 SNP, 체세포 다형성, 및 단백질, 지질, 및 세포 소기관의 차등적 발현으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일 양상에서, 마커는 단일 뉴클레오티드 위치; 유전자내 영역 또는 유전자간 영역; 엑손 또는 인트론, 또는 그의 단편; 코딩 영역 또는 비-코딩 영역; 프로모터, 인핸서, 5' 미번역 영역(5' UTR), 또는 3' 미번역 영역(3' UTR), 또는 그의 단편; cDNA 또는 그의 단편; SNP; 체세포 돌연변이, 생식 계열 돌연변이 또는 둘모두; 점 또는 단일 돌연변이; 결실 돌연변이; 인-프레임 결실, 유전자내 결실, 전체 유전자 결실; 삽입 돌연변이; 유전자내 삽입; 역위 돌연변이; 염색체내 역위; 연관 돌연변이; 연관된 삽입 돌연변이; 역방위 중복 돌연변이; 탠덤 중복; 염색체내 탠덤 중복; 전위; 염색체 전위, 비-상호 전위; 재배열; 게놈 재배열; 하나 이상의 인트론, 또는 그의 단편의 재배열; 재배열된 인트론; 5'- 또는 3'-UTR, 및 이의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
방법은 개인화된 용량 섭생법을 포함하거나, 또는 대안적으로 그로 본질적으로 이루어지거나, 또는 그로 더욱 이루어진 치료적 섭생법의 사용을 결정하기 위해 사용된다. 일 양상에서, 치료적 섭생법은 화학요법, 면역요법, 방사선요법, 수술, 유전자 요법, 호르몬 요법, 줄기 세포 요법, 수혈, 물리적 요법, 광역학적 요법, 및 이의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
또다른 실시태양에서, 대상체에서 질환을 치료하는 방법은 치료적 섭생법이 대상체에 적당한지 여부를 결정하기 위해 사전결정된 프로파일과 대상체의 제1 프로파일을 비교하기 위한 단계를 더 포함하거나 또는 대안적으로 그로 본질적으로 이루어지거나, 또는 그로 더욱 이루어진다. 일 양상에서, 사전결정된 프로파일은 임상 시험 데이타, 대상체의 제2 프로파일, 상이한 생물학적 샘플 또는 생물학적 샘플군의 프로파일, 상이한 대상체 또는 대상체군의 프로파일, 생물제 또는 소형분자에 대한 데이타, 및 이의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 데이타를 기반으로 결정된다.
추가의 양상에서, 치료는 하나 이상의 약물 및/또는 환자의 개별 조직 또는 암 프로파일을 기반으로 치료를 개인화하기 위해 환자에게 투여되는 이러한 약물의 용량(투여량, 투여 시간 등)의 선택을 포함한다. 예를 들어, 대표 샘플의 2종의 바이오마커가 특정한 약물 X 및 상이한 약물 Y에 대한 응답을 예측하고, 단일 대표 샘플에 존재하면, 양쪽 약물은 환자에게 제공될 수 있다. 약물 X에 대한 바이오마커가 75%로 존재하고 약물 Y에 대한 바이오마커가 25%로 존재하면, 약물 X가 우선적으로 처리되어 먼저 전달된 후 약물 Y가 후속될 수 있다. 대안적으로, 약물 Y는 약물 X에 선행될 수 있다.
방법은 용법의 상이한 시간 과정으로 반복될 수 있고 프로파일의 변화하는 마커 발현을 기반으로 변형될 수 있다. 이러한 양상에서, 방법은 환자 또는 동일하거나 또는 상이한 요법을 받은 동일하거나 또는 유사한 질환을 갖는 상이한 환자에 걸쳐 요법 및 질환 진행을 모니터링하는데 유용하다.
임상적으로 관련된 마커의 동정 방법
임상적으로 관련된 마커 또는 바이오마커에 관한 데이타 또는 정보는 병리학적 병태의 가능성에 관한 지표를 제공한다. 본 개시의 대표 데이타는 임상적 관련 마커, 특히 임의의 병리학적 병태와 이전에 연관된 것들을 동정하는데 사용될 수 있다.
따라서, 본 개시의 또다른 양상은 임상적으로 관련된 마커를 동정하는 방법에 관한 것으로서, 대표 데이타를 사전결정된 데이타와 비교하는 단계를 포함한다. 마커의 비제한적인 예는 상기에 언급하였다. 일 양상에서, 마커는 단백질, 항원, 효소, 호르몬, DNA, RNA, 마이크로RNA, 또는 탄수화물로 이루어진 군으로부터 선택된다. 또다른 양상에서, 마커는 게놈 다형성, 약리유전체학 단일 뉴클레오티드 다형성(SNP), 게놈 SNP, 체세포 다형성, 및 단백질, 지질, 단백질 수식 및 세포 소기관의 차등적 발현을 포함하거나, 또는 대안적으로 그로 본질적으로 이루어지거나, 또는 그로 더욱 이루어진다. 일부 양상에서, 마커는 단일 뉴클레오티드 위치; 유전자내 영역 또는 유전자간 영역; 엑손 또는 인트론, 또는 그의 단편; 코딩 영역 또는 비-코딩 영역; 프로모터, 인핸서, 5' 미번역 영역(5' UTR), 또는 3' 미번역 영역(3' UTR), 또는 그의 단편; cDNA 또는 그의 단편; SNP; 체세포 돌연변이, 생식 계열 돌연변이 또는 둘모두; 점 또는 단일 돌연변이; 결실 돌연변이; 인-프레임 결실, 유전자내 결실, 전체 유전자 결실; 삽입 돌연변이; 유전자내 삽입; 역위 돌연변이; 염색체내 역위; 연관 돌연변이; 연관된 삽입 돌연변이; 역방위 중복 돌연변이; 탠덤 중복; 염색체내 탠덤 중복; 전위; 염색체 전위, 비-상호 전위; 재배열; 게놈 재배열; 하나 이상의 인트론, 또는 그의 단편의 재배열; 재배열된 인트론; 5'- 또는 3'-UTR, 및 이의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일 양상에서, 마커는 암 조직 또는 암 세포에서, 각각 정상, 건강 조직 또는 세포와 비교하여, 변경된 아미노산 서열을 코딩하는 변경된 뉴클레오티드 서열, 염색체 전위, 염색체내 역위, 카피수의 변화, 발현 수준의 변화, 단백질 수준의 변화, 단백질 활성의 변화, 및 메틸화 상태의 변화의 군으로부터 선택된다.
하나의 실시태양에서, 사전결정된 데이타는 임상 시험 데이타, 대상체 또는 대상체군의 데이타, 조직 샘플 또는 조직 샘플군의 데이타, 임상 개발 중인 생물제 또는 소형 분자의 데이타, 또는 이의 조합의 군으로부터 선택되는 데이타로부터 생성된다.
일부 양상에서, 대상체에서 암의 예후를 결정하는 방법이 제공되고, 이 방법은 대상체로부터 대표 데이타를 평가하는 단계를 포함한다. 하나의 실시태양에서, 암의 예후를 결정하는 방법으로서 암의 예후에 대한 정량적 점수를 계산하는 단계를 더 포함하거나, 또는 대안적으로 그로 본질적으로 이루어지거나, 또는 그로 더욱 이루어지며, 예후는 정량적 점수를 기반으로 분류된다.
하나의 실시태양에서, 대표 데이타는 균질물 중 세포 구조의 수, 유형, 상태 및/또는 백분율에 관한 정보를 포함한다. 또다른 실시태양에서, 세포 구조는 줄기 세포, 상피 세포, 혈액 세포, 지방 세포, 피부 세포, 내피 세포, 암 세포, 또는 면역 세포를 포함하거나, 또는 대안적으로 그로 본질적으로 이루어지거나, 또는 그로 더욱 이루어진다. 하나의 실시태양에서, 면역 세포는 호중구, 단핵구, 마크로파지, 수지상 세포, 자연 살해 세포, T-세포, 및/또는 B-세포를 포함하거나, 또는 대안적으로 그로 본질적으로 이루어지거나, 또는 그로 더욱 이루어진다. 일부 실시태양에서, T-세포는 킬러 T 세포, 헬퍼 T 세포, 조절성 T 세포, 범 T 세포, 나이브 T 세포, 활성화된 T 세포, 및/또는 감마 델타 T-세포를 포함하거나, 또는 대안적으로 그로 본질적으로 이루어지거나, 또는 그로 더욱 이루어진다.
하나의 실시태양에서, 세포 구조의 상태는 증식, 세포자멸사, 괴사, 이주, 상피-간엽 전이("EMT"), 유사분열, 세포 주기 정지, S-기, 노쇠, 및/또는 분화를 포함하거나, 또는 대안적으로 그로 본질적으로 이루어지거나, 또는 그로 더욱 이루어진다. 하나의 실시태양에서, 대표 데이타는 균질물 중 마커에 관한 정보를 포함한다. 또다른 실시태양에서, 마커는 DNA, 단백질, RNA, 지질, 세포 소기관, 대사물, 또는 세포의 군으로부터 선택된다. 일부 실시태양에서, 마커는 Her2, bRaf, ERBB2, Pl3KCA, FGFR2, p53, BRCA, CCND1, MAP2K4, ATR, AFP, ALK, BCR-ABL, BRCA1/BRCA2, BRAF, V600E, Ca-125, CA19.9, EGFR, Her-2, KIT, PSA, S100, KRAS, ER/Pr, UGT1A1, CD30, CD20, F1P1L1-PDGRFα, PDGFR, TMPT, TMPRSS2; ABCB5, AFP-L3, 알파-페토단백질, 알파-메틸 아실-CoA 라세마아제, BRCA1, BRCA2, CA 15-3, CA 242, Ca 27-29, CA-125, CA15-3, CA19-9, 칼시토닌, 암배아 항원, 암배아 항원 펩티드-1, Des-감마 카르복시 프로트롬빈, 데스민, 조기 전립선암 항원-2, 에스트로겐 수용체, 피브린 붕괴 산물, 글루코스-6-포스페이트 아이소머라제, vE6, E7, L1, L2 또는 p16INK4a, 인간 융모막 고나도트로핀, IL-6, 케라틴 19, 락테이트 데하이드로게나제, 류실 아미노펩티다아제, 리포트로핀, 메타네프린, 네프릴리신, NMP22, 노르메타네프린, PCA3, 전립선-특이적 항원, 전립선 산 포스파타제, 시냅토파이신, 티로글로불린, TNF, ERG, ETV1(ER81), FLI1, EST1, EST2, ELK1, ETV6, ETV7, GABPα, ELF1, ETV4, ETV5, ERF, PEA3/E1AF, PU.1, ESE1/ESX, SAP1(ELK4), ETV3(METS), EWS/FLI1, ESE1, ESE2(ELF5), ESE3, PDEF, NET(ELK3; SAP2), NERF(ELF2), 또는 FEV.XXX로부터 선택되는 전사 인자, 종양 관련 당단백질 72, c-kit, SCF, pAKT, pc-kit, 비멘틴, CTLA-4, PDL1, PDL2, PD1, B7-H3, B7-H4, BTLA, HVEM, KIR, TIM3, GAL9, GITR, LAG3, VISTA, KIR, 2B4, TRPO2, CD160, CGEN-15049, CHK1, CHK2, A2aR, TL1A, CTLA-4, PDL1, PDL2, PD1, B7-H3, B7-H4, BTLA, HVEM, TIM3, GAL9, LAG3, VISTA, KIR, 2B4, CD160, CGEN-15049, CHK1, CHK2, A2aR, B-7 패밀리, 및 이의 조합 중 하나 이상을 포함하거나, 또는 대안적으로 그로 본질적으로 이루어지거나, 또는 그로 더욱 이루어진다. 또다른 실시태양에서, 마커는 단백질 수식으로 이루어진 군으로부터 선택되고, 상기 수식은 아세틸화, ADP-리보실화, 아실화, ADP-리보실화, 아미드화, 플라빈의 공유적 부착, 헴의 공유적 부착, 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 유도체의 공유적 부착, 지질 또는 지질 유도체의 공유적 부착, 포스파티딜이노시톨의 공유적 부착, 교차결합, 고리화, 다이설파이드 결합 형성, 탈메틸화, 공유적 교차결합의 형성, 시스틴의 형성, 파이로글루타메이트의 형성, 포르밀화, 감마-카르복실화, 당화, GPI 앵커 형성, 히드록실화, 요오드화, 메틸화, 미리스토일화, 산화, 단백질가수분해 가공, 인산화, 프레닐화, 라세미화, 셀레노일화, 황산화, 아르기닐화, 및 유비퀴틴화로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 양상에서, 마커는 게놈 다형성, 약리유전체학 단일 뉴클레오티드 다형성(SNP), 게놈 SNP, 체세포 다형성, 및 단백질, 지질, 및/또는 세포 소기관의 차등 발현, 단일 뉴클레오티드 위치; 유전자내 영역 또는 유전자간 영역; 엑손 또는 인트론, 또는 그의 단편; 코딩 영역 또는 비-코딩 영역; 프로모터, 인핸서, 5' 미번역 영역(5' UTR), 또는 3' 미번역 영역(3' UTR), 또는 그의 단편; cDNA 또는 그의 단편; SNP; 체세포 돌연변이, 생식 계열 돌연변이 또는 둘모두; 점 또는 단일 돌연변이; 결실 돌연변이; 인-프레임 결실, 유전자내 결실, 전체 유전자 결실; 삽입 돌연변이; 유전자내 삽입; 역위 돌연변이; 염색체내 역위; 연관 돌연변이; 연관된 삽입 돌연변이; 역방위 중복 돌연변이; 탠덤 중복; 염색체내 탠덤 중복; 전위; 염색체 전위, 비-상호 전위; 재배열; 게놈 재배열; 하나 이상의 인트론, 또는 그의 단편의 재배열; 재배열된 인트론; 정상, 건강 조직 또는 세포와 비교시, 암 조직 또는 암 세포에서의, 5'-UTR 또는 3'-UTR, 변경된 아미노산 서열을 코딩하는 변경된 아미노산 서열, 염색체 전위, 염색체내 역위, 카피수의 변화, 발현 수준의 변화, 단백질 수준의 변화, 단백질 활성의 변화, 또는 메틸화 상태의 변화로 이루어진 군으로부터 선택된다.
또 다른 양상에서, 본 공개는 환자에서 질환을 모니터링하는 방법에 관한 것이고, 임상적으로 관련된 마커의 분석 단계를 포함하거나, 또는 대안적으로 그로 본질적으로 이루어지거나, 또는 그로 더욱 이루어지고, 임상적으로 관련된 마커는 대표 데이타를 기반으로 동정된다. 일 양상에서, 마커는 단백질, 항원, 효소, 호르몬, DNA, RNA, 마이크로RNA, 또는 탄수화물의 군으로부터 선택된다. 또다른 양상에서, 마커는 하나 이상의 전악성 또는 악성 세포, 고형 종양, 연조직 종양 또는 전이성 병변 유래의 세포, 수술 변연부 유래의 조직 또는 세포, 조직학적 정상 조직, 하나 이상의 순환 종양 세포(CTC), 정상 인접 조직(NAT), 종양을 갖거나 가질 위험에 처한 동일한 대상체 유래의 혈액 샘플, 또는 FFPE-샘플의 군으로부터 선택되는 샘플로부터 단리된 DNA 또는 RNA이다. 일 양상에서, 질환은 암이다.
대표 샘플(또는 균질물 조성물)의 저장 방법
대표 샘플이 구축되면, 샘플을 추가 가공 및/또는 분석을 위해 수송할 수 있다. 그러므로, 본 개시는 일부 실시형태에서, 또한 균질물 조성물을 저장하는 방법에 관한 것이고, 본 명세서에 비제한적인 예가 제공된 저장 시약의 유효량을 조성물과 혼합하는 단계를 포함하거나, 또는 대안적으로 그로 본질적으로 이루어지거나, 또는 그로 더욱 이루어진다.
하나의 실시태양에서, 저장 시약은 보존제, 카오트로프, 세제, 환원제, 킬레이터, 완충제, 또는 이의 조합을 포함하거나, 또는 대안적으로 그로 본질적으로 이루어지거나, 또는 그로 더욱 이루어진다. 일 양상에서, 혼합된 조성물은 저장 시약과의 혼합물 이전에 조성물의 특징적인 표현형 및 유전자형을 유지한다. 또다른 양상에서, 혼합된 조성물은 변성된 단백질, 불활성화된 뉴클레아제, 불활성화된 프로테아제, 불활성화된 병원체, 비-붕괴된 핵산, 또는 이의 조합을 포함하거나, 또는 대안적으로 그로 본질적으로 이루어지거나, 또는 그로 더욱 이루어진다. 일부 양상에서, 카오트로프는 구아니딘 티오시아네이트, 구아니딘 이소시아네이트, 구아니딘 하이드로클로라이드, 또는 이의 조합을 포함하거나, 또는 대안적으로 그로 본질적으로 이루어지거나, 또는 그로 더욱 이루어진다. 일 양상에서, 세제는 소듐 도데실 설페이트, 리튬 도데실 설페이트, 소듐 타우로데옥시콜레이트, 소듐 타우로콜레이트, 소듐 글리코콜레이트, 소듐 데옥시콜레이트, 소듐 콜레이트, 소듐 알킬벤젠 술포네이트, N-라우로일 사르코신, 또는 이의 조합을 포함하거나, 또는 대안적으로 그로 본질적으로 이루어지거나, 또는 그로 더욱 이루어진다. 또다른 양상에서, 환원 시약은 메르캅토에탄올, 트리스(2-카르복시에틸)포스핀, 디티오트레이톨, 디메틸술폭시드, 트리스(2-카르복시에틸)포스핀, 또는 이의 조합을 포함하거나, 또는 대안적으로 그로 본질적으로 이루어지거나, 또는 그로 더욱 이루어진다. 추가의 양상에서, 킬레이터는 에틸렌 글리콜 테트라 아세트산, 히드록시에틸에틸렌디아민트리아세트산, 디에틸렌 트리아민 펜타 아세트산, N,N-비스(카르복시메틸)글라이신, 에틸렌디아민테트라아세틱, 무수 시트레이트, 소듐 시트레이트, 칼슘 시트레이트, 암모늄 시트레이트, 암모늄 바이시트레이트, 시트르산, 디암모늄 시트레이트, 제이철 암모늄 시트레이트, 리튬 시트레이트, 또는 이의 조합을 포함하거나, 또는 대안적으로 그로 본질적으로 이루어지거나, 또는 그로 더욱 이루어진다. 상이한 양상에서, 완충제는 트리스(히드록시메틸)아미노메탄, 시트레이트, 2-(N-모르폴리노)에탄술폰산, N,N-비스(2-히드록시에틸)-2-아미노에탄술폰산, 1,3-비스(트리스(히드록시메틸)메틸 아미노)프로판, 4-(2-히드록시에틸)-1-피페라진 에탄술폰산, 3-(N-모르폴린)프로판술폰산, 바이카르보네이트, 포스페이트, 또는 이의 조합을 포함하거나, 또는 대안적으로 그로 본질적으로 이루어지거나, 또는 그로 더욱 이루어진다.
대표 샘플의 생성 방법
본 공개는 일반적으로, 임상 시료, 특히 임상 종양학에서 사용을 위한 임상 시료에서 불균질성, 예를 들어 종양 불균질성의 문제를 해결하기 위한, 예를 들어, 전체 기관, 종양, 림프절, 전이물, 또는 이의 조합의 대표 조직 샘플을 생성시키기 위한 방법론의 개발, 및 다양한 진단적 및 치료적 방법에서 이러한 대표 샘플 또는 이의 일부분의 용도를 비롯하여 진단 및 요법, 특히 종양학에서 사용을 위한 이러한 대표 샘플을 포함하는 조성물에 관한 것이다.
본 출원은 진단적 검사를 위한 종양의 적은 샘플을 이용하는, 암 진단을 위해 허용되는 샘플채취 방법이 진단 병리학 및 종양학에서 심각한 샘플채취 편향성을 야기시킬 수 있다는 것을 보여준다. 예후적(예를 들어, 환자 생존 시간의 예상) 및 예측적(예를 들어, 환자가 특정 요법에 반응할지 여부) 둘 모두에 있어서, 환자 치유와 관련된 판단은 종종 통상의 방법을 사용하여 "작은", 즉 2 센티미터 덩어리로 간주되는 종양의 단일 FFPE 조직 절편을 사용해 이루어지며 모든 진단적 데이타는 전형적으로 0.03% 미만의 종양 부피로부터 채취된다(즉, FFPE 블록 유래의 단일 절편). 또한, 종양 유래의 이들 조직 샘플은 통상적으로 종양의 아주 별개의 영역으로부터 채취되어, 종양의 나머지에 존재하는 불균질성에 대해 알기 어려운 채로 진단적 종양학을 남겨둔다. 그 결과로서, 데이타 세트는 작고(개체군 대비) 결과적으로 편향적이다.
유사하게, 고형 종양 내에서 유전자가 다른 암 세포의 작은 하위개체군을 검출할 낮은 확률과 유사하게, 원발성 종양 부위 주변의 림프절 내 작은 전이성 종양은 통상의 조직학적 검사를 사용해 검출되지 않을 수 있다. 림프절은 그 크기가 직경이 밀리미터 내지 센티미터 범위이다. 림프절 내 종양 세포의 존재는 종양 세포 이동 및 침습을 야기하는 DNA 돌연변이뿐만 아니라, 새로운 환경(즉, 유방 대 림프절)에서 생존하는 능력을 부여하는 돌연변이에 의존적이다. 림프절 내 전이성 종양의 크기는 전이성 종양이 림프절 내에서 성장하는 시간 기간 및 종양의 증식률에 의존적이다. 림프절 내에서 종양 세포의 존재에 대한 진단적 검사는 FFPE 블록으로부터의 조직의 하나 또는 2개 박편(전형적으로 두께가 4 미크론)을 이용한다. 이러한 방법을 사용하는 경우, 검출을 위해 핵심적인 인자는 림프절의 크기에 대한 종양의 크기이다. 직경이 0.1 mm인 전이성 종양이 작은 림프절 부피의 10%를 채울수 있고 타당한 검출 확률을 갖지만, 동일한 크기 종양은 직경이 2 센티미터인 림프절의 오직 0.005%만을 포함하고 현행 조직학적 기술을 사용하여 매우 낮은 검출 확률을 갖는다. 통상의 기술을 사용해 절 음성인 것으로 거짓 표지되는 상당수의 환자가 본 명세서에 개시된 방법을 사용해 검출될 수 있고 보다 적절하게 치료될 수 있다. 예를 들어, 절 양성 환자의 보다 민감한 검출은 보조적인 화학요법을 투여할 지 여부의 판단을 보다 잘 알아낼 수 있다.
림프절 조직(예를 들어, 수술적으로 제거된 림프절로부터 제조) 유래의 대표 샘플의 IHC 분석은 증식 마커와 조합된 상피 마커에 대한 염색을 통해 극도로 작은 종양 미세전이를 검출할 수 있다(예를 들어, Ki67에 의한 사이토케라틴 8/18 듀얼 IHC). 이는 전이성 세포의 다른 마커와 원발성 종양에서 양성인 마커, 또는 기타 진단적 마커를 사용하여 수행될 수 있다. 전이성 종양 세포는 또한 예를 들어 원발성 종양에 존재하는 돌연변이를 포함하여, 암-연관된 돌연변이를 동정하기 위해 차세대 시퀀싱 패널을 이용하여, 핵산을 동정해서 검출될 수 있다. 이들 방법은 전이성 종양 세포를 동정할 것이다. 또한, 각 환자에 대한 질환의 자연 진화적 과정을 요법에 대해 표적으로 삼을 수 있는 특이적 돌연변이에 대해 결정하여 상관지을 수 있다.
종양을 평가하기 위한 현행의 임상적 관례는 포매를 위한 오직 작은 부분의 종양 조직을 획득하고 절편화하는 것을 포함한다. 기본 시나리오에서, 관심 서브클론을 함유하는 종양 내 영역의 위치는 무작위 사건으로 추정될 수 있다. 그러므로, 현행 관행이 어떤 영역을 샘플채취하고 TNM 병기화를 위한 가장 적절한 정보를 획득하는가에 관해 조심스럽게 지시하지만, 종양의 서브클론 영역의 위치 발견에 반드시 유익한 것은 아니다. 또한 서브클론이 존재하는지를 결정하는 것이 전체 점검으로 가능하지 않다.
본 방법의 실시태양은 환자의 전체 림프절, 종양 또는 종양들을 대표하는 세포 샘플의 효율적이고 재현가능한 생산을 위한 방법을 제공하여 임상 종양학 배경에서 종양 불균질성을 처리할 수 있다. 도 2A에 도시된 바와 같이, 본 공개에 따른 "대표" 샘플은 이의 크기와 무관하게, 종양 내에 포함된 암 세포의 상이한 하위개체군을 포함한다. 본 공개에 따른 "대표" 샘플은 대안적으로 정상 또는 대조 개체군 내에 상이한 하위개체군을 포함할 수 있거나, 또는 종양 세포 및 정상 세포의 혼합된 샘플을 포함할 수 있다.
여전히 대안적으로, 본 공개에 따른 대표 샘플은 전체 종양, 림프절 또는 전이부로부터 유래된 대표 또는 균질한 생체분자를 포함할 수 있고, 출발 조직, 예를 들어 전체 종양, 림프절 또는 전이부에 존재하는 단백질, 지질, 핵산 또는 기타 모이어티를 포함하는 분획이 샘플 또는 이의 분획을 유래시키는데 사용되었고, 이러한 치환체의 상대적 비율은 역시 출발 조직을 대표한다. 예를 들어, 이러한 생체분자는 샘플의 추가 해리 또는 화학적 또는 효소적 처리 및/또는 샘플의 특별한 부분을 단리하거나 또는 제거하는 방법의 사용, 예컨대 특정한 크기 또는 분자량의 분자를 단리하거나 또는 제거하기 위한 크기 배제, 예를 들어, 체질, 대표 샘플로부터 특정 유형의 분자를 단리하거나 또는 제거하는 친화도 정제 방법의 사용 등에 의해 유래될 수 있다. 따라서, 이러한 방법은 본질적으로 본 개시에 따른 대표 샘플의 다른 유형, 예를 들어 출발 샘플, 예를 들어 전체 종양, 림프절, 전기 또는 장기의 단백질, 핵산 또는 지질의 전부를 포함하는 균질하거나 또는 대표의 샘플을 유발시키며, 대표 샘플은 단백질, 핵산 및/또는 지질 분석 방법에 사용될 수 있고, 전체 종양 샘플을 반영한다.
그러므로, 기원과 무관하게, 이러한 대표 샘플에서, 종양 또는 종양들, 또는 출발 조직, 예를 들어, 종양 또는 림프절 전이 또는 장기 내에 존재하는 기타 특이적 모이어티 내에서 세포 하위개체군의 상대적 백분율은 샘플에서 정확하게 반영된다. 또한, 이들 대표 샘플은, 통상의 진단적 방법으로 수득된 샘플과 달리, 전통적인 진단적 어세이에서 시료를 사용하는 능력을 악화시키지 않고, 복수의 어세이 방법에서 사용될 수 있다. 더욱이, 본 공개에 따라 생산되는 대표 샘플은 소수의 서브클론 개체군 또는 기타 모이어티 예컨대 샘플, 예를 들어 종양, 림프절 또는 전이 내의 종양 항원 또는 핵산의 존재를 검출하기 위해 개별적으로 또는 동시에 몇몇 상이한 어세이에서 사용될 수 있다(그리고 잠재적으로 재사용될 수 있음).
더욱이, 앞서 기술한 바와 같이, 상이한 환자 유래의 대표 샘플 또는 단일하거나 또는 상이한 환자의 상이한 조직은 독특한 동정 표지, 예를 들어 합텐으로 각각 표지될 수 있고 상이한 환자 또는 조직의 표지된 샘플은 조합되어 바람직한 어세이 방법에서 사용될 수 있다. 본질적으로, 이는 상이한 환자 샘플의 다중화를 제공한다.
이를 기반으로, 현재 기술된 방법의 예시적인 실시태양에 의해 유래된 대표 샘플은 종양 조직 유형, 위치, 크기 또는 부피와 무관하게, 종양의 상이한 유형, 즉 상이한 고형 종양의 검출, 진단 및/또는 병기화의 정확성을 촉진시켜야 하고 실질적으로 개선시켜야 한다. 또한, 본 방법은 질환의 임의 징후가 분명해지기 전이더라도 존재할 수 있는 희귀 세포 유형 예컨대 암 줄기 라인을 동정하기 위해서 가정된 정상 조직 샘플 또는 추정 전암성 조직(예를 들어, 유전적 위험성 또는 이전 암때문에 암이 발병될 보다 높은 위험성의 대상체로부터 수득)으로부터 대표 샘플을 생성시키는데 사용될 수 있다.
추가의 실시태양에서, 본 공개는 불균질 세포 구조를 함유하는 조직 또는 생물학적 샘플을 제조하는 방법에 관한 것으로서, (a) 샘플을 균질화시키는 단계; (b) 균질화된 샘플을 균질물로 재구성시키는 단계로서, 상기 균질물은 실질적으로 균질한 세포 구조를 포함하고, 균질물의 서브셋에서의 세포 구조의 비율은 조직 샘플에서의 세포 구조의 비율과 실질적으로 유사한 것인 단계를 포함한다. 일 양상에서, 균질물은 복수의 단일 세포 또는 복수의 세포 클러스터를 포함하거나, 또는 대안적으로 그로 본질적으로 이루어지거나, 또는 그로 더욱 이루어진다.
하나의 실시태양에서, 조직 샘플의 제조 방법은 균질물을 정착제로 고정시키는 단계를 더 포함하거나, 또는 대안적으로 그로 본질적으로 이루어지거나, 또는 그로 더욱 이루어진다. 또다른 양상에서, 정착제는 포르말린, 칼슘, 아세트산, 염분, 알코올, 우레아, 브로모폴, 물, 또는 이의 조합을 포함하거나, 또는 대안적으로 그로 본질적으로 이루어지거나, 또는 그로 더욱 이루어진다. 상이한 양상에서, 고정된 균질물은 슬라이드에 장착된다.
일부 실시태양에서, 조직 샘플의 제조 방법은 균질물로부터 구성성분을 추출하는 단계를 더 포함하거나, 또는 대안적으로 그로 본질적으로 이루어지거나, 또는 그로 더욱 이루어진다. 일 양상에서, 구성성분은 DNA, RNA, 단백질, 지질, 세포 소기관, 엑소솜, 세포, 또는 이의 조합이다. 또다른 실시태양에서, 조직 샘플의 제조 방법은 균질물로부터 세포 구조 또는 구성성분을 단리하는 단계를 더 포함하거나, 또는 대안적으로 그로 본질적으로 이루어지거나, 또는 그로 더욱 이루어진다. 일 양상에서, 세포 구조 또는 구성성분은 단일 세포 또는 단일 핵을 포함하거나, 또는 대안적으로 그로 본질적으로 이루어지거나, 또는 그로 더욱 이루어진다. 일 양상에서, 단리는 단일-세포 단리 또는 단일-핵 단리를 포함하거나, 또는 대안적으로 그로 본질적으로 이루어지거나, 또는 그로 더욱 이루어진다. 또다른 양상에서, 단일-세포 단리는 유세포 분석, 레이저 미세절제, 수동 세포 채집, 무작위 파종 및 희석, 미소유체 디바이스, 랩온어칩 디바이스, 또는 이의 조합에 의해 수행된다. 일 양상에서, 단일-핵 단리는 유세포 분석에 의해 수행된다.
하나의 실시태양에서, 균질화는 화학적 및/또는 생화학적 해리, 및/또는 임의로는, 기계적 균질화를 포함하거나, 또는 대안적으로 그로 본질적으로 이루어지거나, 또는 그로 더욱 이루어진다. 일 양상에서, 균질화 과정은 세포를 용해하지 않는다. 또다른 양상에서, 샘플의 화학적 처리는 샘플의 효소적 소화를 포함하거나, 또는 대안적으로 그로 본질적으로 이루어지거나, 또는 그로 더욱 이루어지고, 상기 효소적 소화는 사이질 콜라게나아제, 젤라니타아제-A, 스트로멜리신 1, 마트릴리신, 호중구 콜라게나아제, 젤라니타아제-B, 스트로멜리신 2, 스트로멜리신 3, 마크로파지 메탈로엘라스타아제, 콜라게나아제 3, MT1-MMP, MT2-MMP, MT3-MMP, MT4-MMP, 콜라게나아제 4, 에나멜리신, X-MMP, CA-MMP, MT5-MMP, MT6-MMP, 마트릴리신-2, MMP-22, 엔도프로테이나아제, 트립신, 키모트립신, 엔도프로테이나아제 Asp-N, 엔도프로테이나아제 Arg-C, 엔도프로테이나아제 Glu-C(V8 프로테아제), 엔도프로테이나아제 Lys-C, 펩신, 서몰리신, 엘라스타아제, 파파인, 프로테이나아제 K, 서브틸리신, 클로스트리파인, 엑소펩티다아제, 카르복시펩티다아제 A, 카르복시펩티다아제 B, 카르복시펩티다아제 P, 카르복시펩티다아제 Y, 카텝신 C, 아실아미노-산-방출 효소, 및 파이로글루타메이트 아미노펩티다아제로 이루어진 군으로부터 선택된 효소의 사용을 포함한다. 일 양상에서, 기계적 균질화는 블렌더, 해리기, 추출기, 모르타르, 페슬, 다운스 호모지나이저, 조직 그라인더, 회전식 블레이드 조직 호모지나이저, 및 비드 비팅 호모지나이저로 이루어진 군으로부터 선택되는 디바이스에 의해 수행된다. 또다른 양상에서, 균질물은 스캘펄 또는 나이프를 사용한 수동 썰기에 의해 생성된다. 하나의 실시태양에서, 균질화는 세포 조건화를 더 포함하거나, 또는 대안적으로 그로 본질적으로 이루어지거나, 또는 그로 더욱 이루어지고, 상기 세포 조건화는 pH 및/ 열 조정 단계, 또는 샘플을 세포 조건화 완충제로 처리하는 단계를 포함한다.
일부 양상에서, 샘플을 균질화시키기 이전 또는 이후에, 샘플은 균질화 이전 또는 이후에 호르몬, 단백질, 효소, 지질, 세제, 초음파처리, 물리적 진탕, 또는 이의 조합으로 처리된다.
추가의 양상에서, 균질화된 샘플은 세포 및/또는 세포 클러스터를 포함하거나, 또는 대안적으로 그로 본질적으로 이루어지거나, 또는 그로 더욱 이루어진다. 일부 양상에서, 균질화된 샘플은 균일한 크기의 세포 클러스터를 포함하거나, 또는 대안적으로 그로 본질적으로 이루어지거나, 또는 그로 더욱 이루어진다. 또다른 양상에서, 균질화된 샘플은 불균일한 크기의 세포 클러스터를 포함하거나, 또는 대안적으로 그로 본질적으로 이루어지거나, 또는 그로 더욱 이루어진다. 일부 양상에서, 세포 클러스터는 1-100 세포, 또는 100-1,000 세포, 1,000-10,000 세포, 또는 10,000-100,000 세포를 포함하거나, 또는 대안적으로 그로 본질적으로 이루어지거나, 또는 그로 더욱 이루어진다. 부가적 양상에서, 세포 클러스터는 100,000 세포 초과를 포함하거나, 또는 대안적으로 그로 본질적으로 이루어지거나, 또는 그로 더욱 이루어진다.
하나의 실시태양에서, 조직 샘플의 제조 방법은 메쉬, 필터, 또는 일련의 메쉬 또는 필터를 통해 균질화된 샘플을 통과시키는 단계를 더 포함하거나, 또는 대안적으로 그로 본질적으로 이루어지거나, 또는 그로 더욱 이루어진다. 일 양상에서, 메쉬 또는 필터는 약 1 미크론 내지 약 500 미크론 범위의 공극 크기를 갖는다. 또다른 양상에서, 메쉬 또는 필터는 1 미크론 미만의 공극 크기를 갖는다. 일부 양상에서, 메쉬 또는 필터는 약 1 미크론 내지 약 100 미크론, 약 100 미크론 내지 약 200 미크론, 약 200 미크론 내지 약 300 미크론, 약 300 미크론 내지 약 400 미크론, 또는 약 400 미크론 내지 약 500 미크론 범위의 공극 크기를 갖는다. 부가적 양상에서, 메쉬 또는 필터는 500 미크론 초과의 공극 크기를 갖는다.
부가적 실시태양에서, 조직 샘플은 종양, 림프절, 전이물, 폴립, 낭포, 생검, 전체 기관, 및 이의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 조직으로부터 수집된다. 일 양상에서, 조직 샘플은 고형 샘플 또는 액체 샘플이다. 또다른 양상에서, 액체 샘플은 세포검사 바늘 흡인물, 삼출 샘플, 또는 파프 도말시료를 포함하거나, 또는 대안적으로 그로 본질적으로 이루어지거나, 또는 그로 더욱 이루어진다. 일 양상에서, 균질물의 세포 구조는 적어도 하나의 세포를 포함하거나, 또는 대안적으로 그로 본질적으로 이루어지거나, 또는 그로 더욱 이루어진다. 상이한 양상에서, 균질물의 세포 구조는 적어도 100개 세포를 포함하거나, 또는 대안적으로 그로 본질적으로 이루어지거나, 또는 그로 더욱 이루어진다. 또다른 양상에서, 균질물의 세포 구조는 약 100-약 200개 세포, 약 200-약 1,000개 세포, 약 1,000-약 5,000개 세포, 또는 약 10,000-약 100,000개 세포를 포함한다. 상이한 양상에서, 균질물의 세포 구조는 약 100,000-약 1,000,000개 세포; 약 1,000,000-약 5,000,000개 세포, 약 5,000,000-약 1,000,000,000개 세포, 또는 약 1,000,000,000-약 5,000,000,000개 세포를 포함하거나, 또는 대안적으로 그로 본질적으로 이루어지거나, 또는 그로 더욱 이루어진다. 추가의 양상에서, 균질물의 세포 구조는 약 5,000,000,000개 세포 초과를 포함하거나, 또는 대안적으로 그로 본질적으로 이루어지거나, 또는 그로 더욱 이루어진다.
하나의 실시태양에서, 균질물은 보존되지 않거나 또는 고정되지 않는다. 일 양상에서, 균질물은 생세포를 포함하거나, 또는 대안적으로 그로 본질적으로 이루어지거나, 또는 그로 더욱 이루어진다. 또다른 양상에서, 균질물은 보존되거나 또는 고정된다. 일 양상에서, 균질물은 동결되거나, 동결 건조되거나, 또는 포매 매질에 포매된다. 추가의 양상에서, 균질물은 하나 이상의 조직, 및/또는 하나 이상의 대상체 유래의 세포를 포함한다.
하나의 실시태양에서, 조직 샘플은 종양, 림프절, 전이물, 폴립, 낭포, 절제물, 전체 기관, 또는 이의 조합으로부터 단리된다. 일 양상에서, 균질물은 비-인간 세포, 인간 세포, 비-선천 단백질, 핵산, 또는 소형 분자를 더 포함하거나, 또는 대안적으로 그로 본질적으로 이루어지거나, 또는 그로 더욱 이루어진다. 하나의 실시태양에서, 소형 분자는 합텐, 펩티드 태그, 단백질 태그, 형광 태그, 핵산 태그, 및 이의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 부가적 양상에서, 소형 분자는 합텐, 펩티드 태그, 단백질 태그, 형광 태그, 핵산 태그, 발광 태그, 비오틴, 및 이의 조합을 포함하거나, 또는 대안적으로 그로 본질적으로 이루어지거나, 또는 그로 더욱 이루어진다.
부가적 실시태양에서에서, 조직 샘플의 제조 방법은 균질물 내의 실질적으로 균질한 세포 구조를 평가하는 단계를 더 포함하거나, 또는 대안적으로 그로 본질적으로 이루어지거나, 또는 그로 더욱 이루어진다. 일 양상에서, 실질적으로 균질한 세포 구조는 균질물 내의 내부 대조군의 분포를 측정하여 평가된다. 또다른 양상에서, 내부 대조군은 비-인간 세포, 인간 세포, 비-선천 단백질, 핵산, 소형 분자, 염료, 화학물질, 및 이의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
또 다른 양상에서, 본 공개는 샘플(예컨대, 종양 샘플 또는 림프절 또는 전이 또는 이의 조합) 내 세포의 불균질성의 평가 및/또는 대상체에서 특정 암성 병태의 예후의 평가에 적합한 생물학적 샘플을 생성시키기 위한 방법을 제공하고, (i) 고형 종양 또는 림프절로부터 하나 이상의 온전한 생검 샘플을 수득하는 단계로서, 바람직하게는 각각의 생검 샘플은 적어도 약 100-200; 200-1,000; 1,000-5,000; 10,000-100,000; 100,000-1,000,000; 1,000,000-5,000,000; 5,000,000-1,000,000,000; 1,000,000,000-5,000,000,0000, 또는 그 이상의 세포를 포함하고, 임의로는 고정되거나 또는 보존(예컨대 포르말린, 파라핀, 또는 에탄올 고정된 또는 보존된 샘플)되는 것인 단계, 및 (ii) 하나 이상의 생검 샘플을 개별적으로 또는 조합하여 균질화시키는 단계로서, 하나 이상의 균질물은 각각 실질적으로 균질하게 개별 생검 샘플 또는 샘플들의 불균질성을 발현하는 것인 단계를 포함한다.
언급한 바와 같이, 이들 대표 샘플 임의로는 더욱 해리되고/되거나 처리되어 특정 유형의 분자 예컨대 특별한 세포 유형, 단백질, 핵산 또는 지질 등을 제거하거나 또는 단리하여, 진단적 및 치료적 방법에서 사용할 수 있는 다른 대표 샘플을 생성시킬 수 있다.
또 다른 양상에서, 본 공개는 종양 또는 림프절 또는 전이 또는 이의 조합 내의 세포의 불균질성을 평가하기에 적합한 생물학적 샘플을 제조하기 위한 방법을 제공하고, (i) 고형 종양 또는 림프절 또는 전이로부터 하나 이상의 생검 샘플을 수득하는 단계로서, 바람직하게는 각각의 생검 샘플은 적어도 약 100-200; 200-1,000; 1,000-5,000; 10,000-100,000; 100,000-1,000,000; 1,000,000-5,000,000; 5,000,000-1,000,000,000; 1,000,000,000-5,000,000,0000, 또는 그 이상의 세포를 포함하고, 임의로는 고정되거나 또는 보존(예컨대 포르말린, 파라핀, 또는 에탄올 고정된 또는 보존된 샘플)되는 것인 단계, 및 (ii) 최종 균질물 또는 균질물이 실질적으로 개별 세포로 해리되고 최종 균질물 또는 균질물들이 실질적으로 균질한 조건 하에서, 하나 이상의 생검 샘플을 개별적으로 또는 조합하여 균질화시키는 단계를 포함한다.
다시, 이들 대표 샘플은 임의로는 더욱 해리되고/되거나 처리되어 특별한 유형의 분자 예컨대 특별한 세포 유형, 단백질, 핵산, 또는 지질 등을 제거하거나 또는 단리하여서, 진단적 및 치료적 방법에서 사용할 수 있는 다른 대표 샘플을 생성시킬 수 있다.
또 다른 양상에서, 본 공개는 대상체가 특정 암의 병독성 형태가 발병될 위험성을 포함하거나 또는 위험이 있는지 여부 및/또는 암을 갖는 대상체가 특정 암의 병독성 형태를 포함하는지 여부를 평가하는데 적합한 생물학적 샘플을 제조하는 방법을 제공하고, (i) 고형 종양 또는 림프절 또는 전이 또는 전암성 낭포로부터 하나 이상의 온전한 생검 샘플을 수득하는 단계로서, 바람직하게는 각각의 생검 샘플은 적어도 약 100-200; 200-1,000; 1,000-5,000; 10,000-100,000; 100,000-1,000,000; 1,000,000-5,000,000; 5,000,000-1,000,000,000; 1,000,000,000-5,000,000,0000, 또는 그 이상의 세포를 포함하고, 임의로는 고정되거나 또는 보존(예컨대 포르말린, 파라핀, 또는 에탄올 고정된 또는 보존된 샘플)된 것인 단계, 및 (ii) 하나 이상의 생검 샘플을 개별적으로 또는 조합하여 균질화시키는 단계로서, 최종적인 하나 이상의 균질물은 각각 실질적으로 균질하게 개별 생검 샘플 또는 샘플들의 임의 불균질성을 발현하고, 임의로는 적어도 하나의 바이오마커의 발현을 단리하거나 또는 검출하는 것인 단계를 포함한다. 바이오마커의 상향조절 또는 하향조절은 특정 암의 병독성 형태와 연관된다.
또 다른 양상에서, 본 공개는 불균질 종양, 림프절 또는 전이 또는 전암성 낭포에서 표현형 다양성의 특징규명 및/또는 불균질 종양 림프절 또는 전이 또는 전암성 낭포에서 유전적으로 별개의 서브클론의 검출 및/또는 종양 림프절 또는 전이 또는 전암성 낭포에서 낮은 출현율 사건의 동정 및/또는 종양 림프절 또는 전이 또는 전암성 낭포에서 표적의 출현율의 결정을 위한 방법을 제공하고, (i) 균질화 이전에 임의로는 예를 들어 포르말린, 파라핀 및/또는 에탄올로 고정되거나 또는 보존된 종양 림프절 또는 전이 또는 전암성 낭포의 공간적으로 구별되는 영역을 포함하는 종양 림프절 또는 전이 또는 전암성 낭포의 샘플 또는 샘플들을 수득하는 단계, 및 (ii) 종양 림프절 또는 전이 또는 전암성 낭포 샘플 또는 샘플들을 균질화하여, 불균질 종양 림프절 또는 전이 또는 전암성 낭포의 표현형 다양성을 대표하고 종양의 경관의 특징규명 및/또는 불균질 종양 림프절 또는 전이 또는 전암성 낭포에서 유전적으로 구별되는 서브클론의 검출 및/또는 종양 림프절 또는 전이 또는 전암성 낭포에서 낮은 출현율 사건의 동정 및/또는 종양 림프절 또는 전이 또는 전암성 낭포에서 표적의 출현율의 결정에 적합한 균질물을 생성시키는 단계를 포함한다.
또 다른 양상에서, 본 공개는 환자, 예를 들어, 유전자 돌연변이 또는 이전 암때문에 암이 발병될 위험이 있는 환자, 또는 전암성 낭포 또는 폴립을 갖는 환자에서 가정되는 정상 조직 또는 추정되는 전암성 조직에서 전암성 세포 또는 암성 세포를 검출하기 위한 방법을 제공하고, (i) 균질화 이전에 임의로는 포르말린, 파라핀 및/또는 에탄올로 고정되거나 또는 보존된, 환자의 가정되는 정상 조직 또는 추정되는 전암성 조직의 공간적으로 구별되는 영역을 포함하는 가정되는 정상 조직 또는 추정되는 전암성 조직의 샘플 또는 샘플들을 수득하는 단계, 및 (ii) 샘플 또는 샘플들을 균질화하여 가정되는 정상 조직 또는 추정되는 전암성 조직을 대표하고 예를 들어 질환의 임의 징후가 환자에서 명확해지기 이전이라도, 희귀 암성 세포 또는 암 줄기 세포를 검출하는데 적합한 균질물을 생성시키는 단계를 포함한다.
또 다른 양상에서, 본 공개는 상이한 어세이 형식에서 전술한 임의 방법에 의해 생성된 대표 샘플 및 이의 일부를 사용하는 방법을 제공하고, 이들 어세이는 고수율로 실시될 수 있고, 동시에 또는 상이한 시점 또는 상이한 위치 및/또는 자동화(완전 자동화 또는 반자동화)에 의해 수행될 수 있다.
또 다른 양상에서, 본 공개는 전술한 임의 방법에 의해 생성되는 대표 샘플 또는 이의 일부분을 향후 사용을 위해, 저장, 예를 들어 동결하거나 또는 동결 건조한다.
또 다른 양상에서, 본 공개는 전술한 임의 방법으로 생성된 대표 샘플 또는 이의 일부분을 사용하여 환자 샘플의 암 세포 또는 세포 유형 유래의 특정 항원에 특이적인 항체 또는 항원을 유래(및 임의로는 정제)하며, 이러한 항체 또는 항원은 개인화된 약물, 즉 치료적 또는 예방적 암 백신의 생산에서 사용할 수 있다.
모든 상기 언급된 방법의 균질화 단계는 샘플 내 세포의 무결성을 보존하는 방법으로 실시될 수 있으며, 즉 균질화된 샘플 또는 샘플들 내 대량의 세포가 용해되지 않아서 최종 균질물 이의 일부가 샘플 또는 샘플들을 "대표"한다. 다시, 이는 샘플 또는 이의 일부의 세포가 조직 샘플 또는 샘플들의 전체, 예를 들어, 고형 종양 또는 림프절 내 상이한 세포 유형의 백분율을 반영한다는 의미이다. 이는 예를 들어, 종양 샘플 또는 이의 일부의 기계적 해리(예컨대, 종양 샘플 또는 이의 일부에 액체를 첨가하거나 또는 첨가하지 않고 수행되는 기계적 해리) 및/또는 종양 샘플 또는 이의 일부의 화학적 또는 효소적 해리(예컨대, 막회합된 단백질과 비교하여 세포외 매트릭스 단백질에 선택적으로 또는 우선적으로 또는 주로 작용하는 효소로 처리)에 의해 실시될 수 있다. 대안적으로, 균질화 방법은 출발 조직, 예를 들어 전체 종양을 대표하는 샘플을 여전히 생성시키면서 세포의 해리를 야기시킬 수 있다. 또한, 균질화된 대표 샘플은 임의로는 더욱 해리되고/되거나 처리되어 특별한 유형의 분자, 예컨대 특이적 세포 유형, 단백질, 핵산 또는 지질 등을 제거하거나 또는 단리할 수 있어서 진단적 및 치료적 방법에서 사용할 수 있는 다른 대표 샘플을 생성시킬 수 있다.
임의의 상기 방법은 균질물 또는 이의 일부분 또는 분획에서 적어도 하나의 바이오마커, 예를 들어, 적어도 하나의 지질, 단백질, 또는 핵산 바이오마커의 발현을 검출하는 단계를 포함할 수 있다. 부가적으로, 방법은 특정 바이오마커 또는 바이오마커의 조합을 발현하는 균질물 또는 이의 일부분 또는 분획에서 종양 세포의 백분율을 검출하는 단계를 더 포함할 수 있다. 임의로는, 종양 줄기 세포 및/또는 균질물 또는 이의 일부분 또는 분획 중 종양 서브클론의 상대적 빈도 또는 백분율을 검출하고/하거나 단리한다. 부가적으로, 방법은 또한 유전자 표적(예컨대, 점 돌연변이, 결실, 첨가, 전위, 유전자 융합, 또는 유전자의 증폭)을 검출하는 단계를 포함할 수 있다.
임의의 상기 방법은 또는 가치있는 임상적 정보, 예를 들어 면역 상태 및 질환 상태를 제공하고, 또한 적합한 처리 프로토콜, 예컨대 체크포인트 억제인자, 사이토카인 또는 기타 명역 조정인자를 선택하기 위해서, 균질물 또는 이의 일부분 또는 분획에 존재하는 특이적 면역 세포(예컨대 B 림프구, T 림프구, 마크로파지, NK 세포, 단핵구, 또는 이의 조합)를 검출, 단리 및/또는 정량하는데 사용될 수 있다.
최종 균질물 또는 대표 샘플은 적어도 1,000; 10,000; 100,000; 1,000,000; 5,000,000; 10,000,000; 50,000,000; 100,000,000; 500,000,000; 1,000,000,000; 5,000,000,000; 10,000,000,000; 50,000,000,000; 100,000,000,000, 1,000,000,000,000 또는 그 이상의 세포를 포함할 수 있다.
최종 균질물 또는 그의 분획 또는 일부는 임의로는 동결되거나 또는 동결건조되거나 또는 왁스(예컨대, 파라핀)에 포매될 수 있거나, 또는 대안적으로 균질물 또는 그의 분획 또는 일부는 임의로는 이러한 동결 또는 동결-건조 또는 왁스없이 후속 단계(이의 일부는 하기에 기술함)에 사용할 수 있다. 예를 들어, 대표 파라핀 블록, 즉 파라핀에 포매된 최종 균질물 또는 그의 분획 또는 일부는 현행 해부 병리학 작업흐름, 예를 들어, 절편화, 슬라이드 준비, 염색, 현미경관찰, 항원 회수에 사용하기 적합하다.
균질물은 하나 이상의 대상체로부터 채취된 둘 이상의 종양으로부터 유래될 수 있고 각 종양의 최종 균질물 또는 이의 분획은 상이한 환자의 둘 이상의 종양 또는 질환 병태의 유사성 및/또는 차이를 평가하는데 사용될 수 있다.
또한, 균질물은 대상체, 예를 들어 BRCA 돌연변이를 갖는 대상체로부터 수득된 둘 이상의 추정되는 정상 또는 전암성 조직, 예를 들어, 유방, 자궁경부, 직대장, 또는 전암성 낭포 또는 폴립으로부터 유래될 수 있고, 최종 균질물 또는 그의 분획은 임의의 비정상 세포 또는 질환 바이오마커가 존재하는지 여부를 평가하는데 사용된다.
또한, 비-인간 세포(예컨대 곤충 세포 및/또는 마우스 세포) 또는 기타 외래 단백질, 핵산, 또는 소형 분자가 균질물에 첨가되어 양성 단백질 또는 핵산 검출을 위한 내부 대조군을 생성시킬 수 있다.
또한, 소형 분자(예컨대, 합텐, 펩티드 태그, 단백질 태그, 형광 태그, 및/또는 핵산 태그)가 샘플에 첨가되어 대표 샘플의 공간적 정보를 제공하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 샘플(예컨대, 종양 또는 림프절)은 절편화될 수 있는데, 예를 들어 사분면으로 절단되고, 상이한 합텐(또는 다른 적합한 소형 분자)이 대표 샘플을 생성시키기 위해 절편을 균질화하기 전에 각 절편에 "도핑"될 수 있다. 균질화 이전에 "도핑"을 위해 각 샘플을 생성시킬 수 있는 절편의 수는 제한되지 않지만, 그보다는 아마도 샘플의 크기에 따라 일정 비율로 선택될 수 있는데, 즉 샘플이 클수로, 균질화 이전에 소형 분자로 "태그화"될 수 있는 절편의 수가 크다는 것을 이해해야 한다. 이러한 방식으로, 공간적 정보는 최종 균질물 또는 이의 분획에 유지될 수 있다.
소형 분자는 또한 또 다른 환자 또는 동일한 환자로부터의 상이한 샘플과 샘플을 조합하기 전에 샘플에 첨가되어서, 다중 어세이 형식으로 작업시 샘플을 분화시키는 수단을 제공한다.
균질화된 샘플은 임의로는 균질화 이전 또는 이후에 포르말린 고정되거나 또는 보존될 수 있다. 안정성 우려때문에 조직 샘플은 일반적으로 병리학 또는 진단적 방법에서 사용 이전에 포르말린이나 또는 다른 것으로 고정된다. 포르말린 또는 기타 고정 방법은 일반적으로 당분야에 공지되어 있다. 예시적인 방법이 하기에 개시된아. 이러한 경우에서, 포르말린 고정된 종양 샘플은 단계 (ii)에서 균질화 이전에 물 또는 완충된 염 용액(예컨대, PBS)에 침지될 수 있다.
대안적으로, 또는 부가적으로, 개시된 방법에 사용되는 종양 샘플은 균질화 이전에 에탄올에 보존될 수 있다. 그러나, 포르말린 고정 또는 에탄올 등의 보존 과정은 주제 방법에 필수적이지 않고, 최종 균질화 대표 샘플의 적합성을 악화시키지 않고 제거시킬 수 있다는 것을 강조한다.
미고정된 조직의 균질화는 대표 생 샘플을 생성시키는데 사용될 수 있다. 생 대표 샘플을 배양하여 개별 환자 유래의 대표 조직 배양 샘플을 생성시킬 수 있다. 이러한 대표 샘플은 여러번 분열하여 복수의 대표 배양 샘플을 생성시킬 수 있고, 이는 화학 요법(에컨대, 적어도 하나의 기지 또는 미지의 바이오마커의 발현 또는 기능적 활성을 길항하거나, 억제하거나 또는 차단하는 항체, 핵산, 소형 분자, 또는 폴리펩티드)의 효능을 결정하는데 사용될 수 있다. 더욱이, 특이적 세포 유형(예컨대, 면역 세포 또는 종양 세포)는 FACS 분석을 사용해 선택될 수 있다. 예를 들어, 종양 침윤된 면역 세포를 선택해서 배양하여 면역 시스템이 분비하는 종양 특이적 항체를 결정할 수 있다.
또한, 본 명세서에 표시된 바와 같이, 대표 샘플을 유래시키는 개시된 방법 및 진단적 및 치료적 방법에서 그들의 용도는 고정 및 미고정 조직 샘플 둘 모두에 적합하다.
임의의 개시된 대표 샘플(종양 생검 샘플로부터 제조된 균질물)의 제조 방법은 적어도 하나의 콜라게나아제 또는 기타 적합한 효소 또는 효소 조합 또는 기타 화학적 예컨대 균질화 이전, 그 동안 또는 그 이후에 그 자체가 분해되거나 또는 세포외 매트릭스의 분해를 촉진하는 염의 첨가; 상승된 온도 및/또는 완충 조건 예컨대 세포 조건화 완충제, 예를 들어, 세포 교차결합을 파괴하는 CC1 또는 CC2의 사용; 및/또는 기계적 전단을 위한 디바이스(예컨대, IKA 블렌더, gentleMACs 해리기, 또는 기능적 등가물)의 사용을 포함할 수 있다. 이들 방법은 예를 들어, 세포가 실질적으로 용해되지 않는 일부 균질화 조건 하에서, 샘플 내 세포의 생존능 및 무결성을 유지하는 조건 하에서 수행될 수 있거나 또는 그렇지 않을 수 있다.
일 양상에서, 균질화는 임의로는 회전식 호모지나이저의 경우 약 100 내지 약 75,000 RPM의 속도 또는 비드 비터의 경우 약 0.5 m/s 내지 약 2.5 m/s의 속도, 및 약 30초 내지 약 5분, 약 5분 내지 약 10분, 약 10분 내지 약 30분, 또는 약 30분 내지 약 60분의 시간 동안, 막자 및 막자사발, 다운스 호모지나이저 또는 조직 그라인더, 수동 전자 회전식 블레이드 조직 호모지나이저(예컨대, Thomas Scientific에서 입수할 수 있는 Omni-TH), 비드 비팅 호모지나이저(예컨대, OMNI에서 입수할 수 있는 불렛 블렌더 또는 버톤 프리셀리스(Burton Precellys) 24 조직 호모지나이저 또는 비드 럽터)의 사용을 포함한다.
또다른 실시태양에서, 균질화는 임의로는 약 0.001 ㎍/mL 내지 약 1000 mg/mL의 농도, 및 약 1분 내지 약 120분의 시간 동안, 사이질 콜라게나아제, 젤라니타아제-A, 스트로멜리신 1, 마트릴리신, 호중구 콜라게나아제, 젤라니타아제-B, 스트로멜리신 2, 스트로멜리신 3, 마크로파지 메탈로엘라스타아제, 콜라게나아제 3, MT1-MMP, MT2-MMP, MT3-MMP, MT4-MMP, 콜라게나아제 4, 에나멜리신, X-MMP, CA-MMP, MT5-MMP, MT6-MMP, 마트릴리신-2, MMP-22, 엔도프로테이나아제, 트립신, 키모트립신, 엔도프로테이나아제 Asp-N, 엔도프로테이나아제 Arg-C, 엔도프로테이나아제 Glu-C(V8 프로테아제), 엔도프로테이나아제 Lys-C, 펩신, 서몰리신, 엘라스타아제, 파파인, 프로테이나아제 K, 서브틸리신, 클로스트리파인, 엑소펩티다아제, 카르복시펩티다아제 A, 카르복시펩티다아제 B, 카르복시펩티다아제 P, 카르복시펩티다아제 Y, 카텝신 C, 아실아미노-산-방출 효소, 파이로글루타메이트 아미노펩티다아제, 또는 임의의 이의 조합의 사용을 포함한다.
종양 또는 기타 조직의 공간적으로 구별되는 영역을 포함하는 개시된 방법에서 사용되는 종양 샘플은 환자로부터 수술적으로 제거된 종양의 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 적어도 85%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는, 바람직하게는, 전체를 포함할 수 있다. 종양 샘플은 직경이 적어도 1, 5, 10, 20, 50, 100 또는 그 이상의 밀리미터(mm) 또는 센티미터(cm)일 수 있다.
주제 방법에서 사용되는 샘플은 일반적으로 고형 종양 또는 종양(원발성 종양 및 전이성 종양), 림프절, 전이물, 또는 전암성 조직 예컨대 낭포 또는 폴립으로부터 유래될 것이다. 대안적으로, 또는 부가적으로, 방법은 잠재적으로 비-고형 종양, 예를 들어, 혈액 암으로 실시될 수 있다. 예를 들어, 균질화된 고형 종양 샘플은 임의로는 액체 환자 샘플, 예를 들어, 환자 유래의 혈액, 림프액, 삼출 시료, 뇌척수액, 담즙, 점액, 및/또는 소변 샘플과 조합될 수 있다. 균질화된 샘플은 추가로 또는 대안적으로 예를 들어, 질환 징후 이전에 질환 세포를 검출하기 위해, 생검된 "정상" 또는 전암성 조직을 포함할 수 있다.
개시된 방법에서 사용되는 이러한 종양 또는 기타 조직 샘플 또는 샘플들은 유방, 대장, 폐, 췌장, 담낭, 피부, 뼈, 근육, 간, 신장, 자궁경부, 난소, 전립선, 식도, 위, 또는 기타 기관, 예를 들어, 유방암 종양, 폐암 종양, 간 종양, 전립선암 종양, 대장 암 종양, 방광암 종양, 또는 신장 암 종양으로부터 유래된, 임의 공급원에서 유래될 수 있다. 일반적으로, 개시된 방법에 사용되는 종양 샘플 또는 기타 조직은 인간 기원이다.
개시된 방법에서 사용되는 종양 또는 기타 조직 샘플은 적어도 1 ㎤, 적어도 2 ㎤, 적어도 3 ㎤, 적어도 4 ㎤, 적어도 5 ㎤, 적어도 6 ㎤, 적어도 7 ㎤, 적어도 8 ㎤, 적어도 9 ㎤, 적어도 10 ㎤, 적어도 15 ㎤, 적어도 20 ㎤, 적어도 25 ㎤, 적어도 50 ㎤, 적어도 100 ㎤, 적어도 250 ㎤, 적어도 500 ㎤, 적어도 1,000 ㎤, 적어도 2,500 ㎤, 적어도 5,000 ㎤, 적어도 7,500 ㎤, 적어도 10,000 ㎤ 또는 그 보다 큰 부피를 가질 수 있다.
개시된 방법에서 사용되는 종양 또는 기타 조직 샘플은 적어도 0.5 cm, 적어도 1 cm, 적어도 1.5 cm, 적어도 2 cm, 적어도 2.5 cm, 적어도 3 cm, 적어도 3.5 cm, 적어도 4 cm, 적어도 4.5 cm, 적어도 5 cm, 적어도 6 cm, 적어도 7 cm, 적어도 10 cm, 적어도 25 cm, 적어도 50 cm 또는 그 이상의 최대 너비 지점에서의 너비를 가질 수 있다.
부가적으로, 일부 실시태양에서, 대표 샘플은 이전에 포리말린 고정되고 파라핀 왁스에 포매된 조직으로 만들 수 있다. 특히 왁스를 용융시키고, 조직을 회수하여 수화시킨 후, 본 명세서에 기술된 방법, 즉 균질화를 임의 수의 어세이에 사용하기 적합한, 샘플에 적용할 수 있다(예를 들어, 도 24 참조). 도 24는 파라핀 블록으로부터 회수된 조직으로 제조된 대표 샘플 중 Caski 세포 상의 HPV16 ISH 염색을 도시한다. 이전에 파라핀 왁스에 포매된 조직은 회수되어 IKA에서 균질화되어 대표 샘플을 생성시켰다. 이러한 방식으로, 개시된 방법은 왁스를 용해시키고, 샘플을 회수하여, 조직을 재수화시키고 그에 따라 균질화시켜서, TNM 병기화를 위해 이미 제조된 샘플 또는 샘플들을 사용해 대표 샘플을 생성시키는데 사용될 수 있다.
임의의 상기 방법은 (iii) 하나 이상의 슬라이드 또는 기타 고형 지지체에 균질물 또는 이의 일부분 또는 분획을 분포시키는 단계, 및 임의로는, 균질물 또는 이의 일부분 또는 분획을 함유하는 하나 이상의 슬라이드 또는 기타 고형 지지체를 헤마톡실린 및 에오신 착색제로 염색하는 단계; 균질물 또는 이의 일부분 또는 분획을 함유하는 슬라이드 또는 기타 고형 지지체 상에서 면역조직화학적 염색을 수행하는 단계; 또는 균질물 또는 이의 일부분 또는 분획을 함유하는 슬라이드 또는 기타 고형 지지체 상에서 인시츄 하이브리드화를 수행하는 단계를 더 포함할 수 있으며, 이들 중 어느 하나는 방법에서 단계 (iv)로 간주될 수 있다.
더욱이, 임의의 상기 방법은 (iii) 균질물 또는 이의 일부분 또는 분획으로부터 핵산(예컨대 DNA 또는 mRNA)을 정제하는 단계를 더 포함할 수 있다. 정제된 핵산에 대해서 노던 블롯, DNA 시퀀싱, PCR, RT-PCR, 마이크로어레이 프로파일링, 차등적 디스플레이, 또는 인시츄 하이브리드화를 수행할 수 있다. 대신, 정제된 핵산은 나노입자(예컨대 양자점, 상자성 나노입자, 초상자성 나노입자, 및 금속 나노입자, 바람직하게는 합금 양자점로서, 예로서 제한없이 CdSe, ZnSSe, ZnSeTe, ZnSTe, CdSSe, CdSeTe, ScSTe, HgSSe, HgSeTe, HgSTe, ZnCdS, ZnCdSe, ZnCdTe, ZnHgS, ZnHgSe, ZnHgTe, CdHgS, CdHgSe, CdHgTe, ZnCdSSe, ZnHgSSe, ZnCdSeTe, ZnHgSeTe, CdHgSSe, CdHgSeTe, InGaAs, GaAlAs, 및 InGaN을 포함함)에 접합될 수 있다.
균질물 또는 이의 일부분 또는 분획으로부터 지질 또는 엑소솜 또는 기타 소기관을 정제하는 단계를 더 포함할 수 있다는 것을 또한 고려한다. 정제된 지질에 대해서 질량 분광법 또는 조직화학을 수행할 수 있다.
부가적으로, 임의의 상기 방법은 균질물 또는 이의 일부분 또는 분획으로부터 단백질을 정제하는 단계를 더 포함할 수 있다는 것을 또한 고려한다. 정제된 단백질에 대해서 웨스턴 블롯, ELISA, 면역침전법, 크로마토그래피, 질량 분광법, 마이크로어레이 프로파일링, 간섭계법, 전기영동적 염색, 또는 면역조직화학적 염색을 수행할 수 있다. 전술한 것에 대안적으로 또는 부가적으로, 정제된 단백질은 종양에 특이적인 항혈청을 생성하는데 사용될 수 있다.
더욱이, 임의의 상기 방법은 (iii) 균질물 또는 이의 일부분 또는 분획에 대해서 유전체, 전사체, 단백체 및/또는 대사체학적 분석을 수행하는 단계를 더 포함한다는 것을 고려한다.
게다가, 임의의 상기 방법은 (iii) 균질물 또는 이의 일부분 또는 분획으로부터 특이적 세포 유형을 친화도 정제하는 단계를 더 포함한다는 것을 고려한다. 특이적 세포 유형은 관심 바이오마커를 함유할 수 있다. 예시적인 관심 바이오마커는 Her2, bRaf, ERBB2 증폭, Pl3KCA 돌연변이, FGFR2 증폭, p53 돌연변이, BRCA 돌연변이, CCND1 증폭, MAP2K4 돌연변이, ATR 돌연변이, 또는 그의 발현이 특이적 암과 관련된 임의의 다른 바이오마커; AFP, ALK, BCR-ABL, BRCA1/BRCA2, BRAF, V600E, Ca-125, CA19.9, EGFR, Her-2, KIT, PSA, S100, KRAS, ER/Pr, UGT1A1, CD30,CD20, F1P1L1-PDGRFa, PDGFR, TMPT, 및 TMPRSS2 중 적어도 하나; 또는 ABCB5, AFP-L3, 알파- 페토단백질, 알파-메틸 아실-CoA 라세마아제, BRCA1, BRCA2, CA 15-3, CA 242, Ca 27-29, CA-125, CA15-3, CA19-9, 칼시토닌, 암배아 항원, 암배아 항원 펩티드-1, Des-감마 카르복시 프로트롬빈, 데스민, 조기 전립선암 항원-2, 에스트로겐 수용체, 피브린 붕괴 산물, 글루코스-6-포스페이트 아이소머라제, HPV 항원 예컨대 vE6, E7, L1, L2 또는 p16INK4a 인간 융모막 고나도트로핀, IL-6, 케라틴 19, 락테이트 데하이드로게나제, 류실 아미노펩티다아제, 리포트로핀, 메타네프린, 네프릴리신, NMP22, 노르메타네프린, PCA3, 전립선-특이적 항원, 전립선 산 포스파타제, 시냅토파이신, 티로글로불린, TNF, ERG, ETV1(ER81), FLI1, ETS1, ETS2, ELK1, ETV6(TEL1), ETV7(TEL2), GABPa, ELF1, ETV4(E1AF; PEA3), ETV5(ERM), ERF, PEA3/E1AF, PU.1, ESE1/ESX, SAP1(ELK4), ETV3(METS), EWS/FLI1, ESE1, ESE2(ELF5), ESE3, PDEF, NET(ELK3; SAP2), NERF(ELF2)에서 선택된 전사 인자, 또는 종양-연관된 당단백질 72, c-kit, SCF, pAKT, pc-kit, 및 비멘틴에서 선택된 적어도 하나의 바이오마커를 포함할 수 있다.
대안적으로, 또는 부가적으로 관심 바이오마커는 면역 체크포인트 억제인자 예컨대 제한없이 CTLA-4, PDL1, PDL2, PD1, B7-H3, B7-H4, BTLA, HVEM, KIR, TIM3, GAL9, GITR, LAG3, VISTA, KIR, 2B4, TRPO2, CD160, CGEN-15049, CHK1, CHK2, A2aR, TL1A, 및 B-7 패밀리 리간드 또는 이의 조합일 수 있거나 또는 CTLA-4, PDL1, PDL2, PD1, B7-H3, B7-H4, BTLA, HVEM, TIM3, GAL9, LAG3, VISTA, KIR, 2B4, CD160, CGEN-15049, CHK1, CHK2, A2aR, B-7 패밀리 리간드, 또는 이의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 체크포인트 단백질의 리간드이다.
청구된 전술한 어느 하나의 방법은 급성 림프아구성 백혈병(etv6, am11, 사이클로필린 b), B 세포 림프종(Ig-이디오타입), 신경교종(E-카데린, 알파-카테닌, 베타-카테닌, 감마-카테닌, p120 ctn), 방광암(p21ras), 담관암(p21ras), 유방암(MUC 패밀리, HER2/neu, c-erbB-2), 자궁 암종(p53, p21ras), 대장 암종(p21ras, HER2/neu, c-erbB-2, MUC 패밀리), 직대장암(직대장 연관 항원(CRC)-C017-1A/GA733, APC), 융모막 암종(CEA), 상피세포 암(사이클로필린 b), 위암(HER2/neu, c-erbB-2, ga733 당단백질), 간세포암(알파-페토단백질), 호지킨 림프종(Imp-1, EBNA-1), 폐암(CEA, MAGE-3, NY-ESO-1), 림프계 세포-유래된 백혈병(사이클로필린 b), 흑색종(p5 단백질, gp75, 종양태아성 항원, GM2 및 GD2 강글리오시드, Melan-A/MART-1, cdc27, MAGE-3, p21ras, gp100.sup.Pmel117), 골수종(MUC 패밀리, p21ras), 비-소세포 폐암종(HER2/neu, c-erbB-2), 비인두암(Imp-1, EBNA-1), 난소 암(MUC 패밀리, HER2/neu, c-erbB-2), 전립선암(전립선 특이적 항원(PSA) 및 이의 항원성 에피토프 PSA-1, PSA-2, 및 PSA-3, PSMA, HER2/neu, c-erbB-2, ga733 당단백질), 신장 암(HER2/neu, c-erbB-2), 자궁경부 및 식도의 편평상피세포 암(바이러스 생성물 예컨대 인간 파필로마 바이러스 단백질), 고환암(NY- ESO-1), 및/또는 T 세포 백혈병(HTLV-1 에피토프)과 연관된 적어도 하나의 바이오마커의 검출 단계를 포함한다.
임의의 언급된 상기 방법은 (iii) 균질물 또는 이의 일부분 또는 분획을 세포외 매트릭스를 분해하는 콜라게나아제 또는 기타 효소 또는 화학물 또는 이의 조합으로 처리하는 단계, 균질물 또는 이의 일부분 또는 분획을 고온 조건 하에서 항온반응시키는 단계, 및/또는 균질물 또는 이의 일부분 또는 분획 중 세포를 해리시키기 위해 균질물 또는 이의 일부분 또는 분획을 기계적으로 교반시키는 단계를 더 포함한다는 것을 고려한다. 일반적으로, 이들 방법은 개시된 분석적 또는 치료적 방법 또는 이의 조합에서 사용할 수 있는 또 다른 대표 샘플을 생성할 것이다.
부가적으로, 임의의 상기 기술된 방법은 (iii) 균질물 또는 이의 일부분 또는 분획을 여과 또는 크기분류하여, 그 결과 단일 세포 또는 소형 세포 클러스터, 예컨대 더블렛 또는 트리플렛을 수득할 수 있는 단계를 더 포함한다는 것을 고려한다.
대표 샘플의 세포 구성요소는 하나 또는 복수의 여과 단계에 의해 분리될 수 있다. 예를 들어, 물리적 및/또는 생화학적 수단을 통해 균질물의 균질화 및 해리이후, 해리된 샘플은 1 미크론 필터를 통해 여과되어 모든 온전한 세포 재료가 제거될 수 있다. 비세포 대표 샘플은 임상적으로 유용하게 되는 종양 내 유래의 종양 및 정상 기질로부터 분비되는 인자, 즉 항체, 성장 인자, 면역조정제 및 다른 미지의 인자를 함유할 것으로 예상된다. 비세포 대표 샘플은 ELISA, 질량 분광법, 차세대 시퀀싱, 및 다른 진단적 방법으로 분석될 수 있다. 대표 샘플로부터 유래된 단일 세포가 여과 후에 수득되는 정도로, 이 세포는 형광 활성화 세포 분류법(FACS) 및 유세포 분석을 사용해 분석될 수 있다.
개시된 방법으로 생성된 균질물의 대표 성질을 고려하면, 균질물 또는 이의 일부분 또는 분획은 낮은 출현율 유전자 사건(예컨대, 20% 출현율, 15% 출현율, 10% 출현율, 5% 출현율, 2% 출현율, 1% 출현율, 0.5% 출현율, 0.1% 출현율, 0.001% 출현율, 0.0001% 출현율, 0.00001% 출현율, 0.000001% 출현율 또는 그 이하로 발생하는 유전자 사건)을 검출하는데 사용될 수 있다. 예시적 유전자 사건은 점 돌연변이, 결실, 첨가, 전위, 유전자 융합, 또는 유전자의 증폭을 포함한다. 유사하게, 방법은 또한 종양 샘플 또는 이의 일부 내 세포의 유전자 또는 후생유전자 불균질성을 검출하는 단계 및/또는 희귀 유전자 또는 후성유전자 변이를 포함하는 세포를 검출하는 단계를 포함할 수 있다. 이러한 세포는 5% 미만, 1% 미만, 0.5% 미만, 0.1% 미만, 0.05% 미만, 또는 0.01% 미만의 빈도로 종양 샘플에 존재할 수 있다.
검출된 희귀 세포는 항암 요법에 내성을 부여하고/하거나 전이를 촉진하는 하나 이상의 유전자 또는 후생유전자 차이를 포함할 수 있다. 그러므로, 이러한 세포의 검출은 암 예후 뿐만 아니라, 적당한 치료적 섭생법 예컨대 수술, 화학요법의 선택 및/또는 생물제의 사용을 촉진할 것이다.
전술한 방법은 또한 형광발광성 분자 또는 형광 색소(예컨대 인비트로젠(Invitrogen)에서 판매하는 것, 예를 들어 [The Handbook--A Guide to Fluorescent Probes and Labeling Technologies, Invitrogen Detection Technologies, Molecular Probes, Eugene, Oreg]를 참조하거나, 또는 미국 특허 제5,866,366호(Nazarenko et al.)에 기술된 것들, 예컨대 4-아세타미도-4'-이소티오시아나토스틸벤-2,2'디술폰산, 아크리딘 및 유도체 예컨대 아크리딘 및 아크리딘 이소티오시아네이트, 5-(2'-아미노에틸)아미노나프탈렌-1-술폰산(EDANS), 4-아미노-N-[3-비닐술포닐)페닐]나프탈리미드-3,5 디술포네이트(루시퍼 옐로우 VS), N-(4-아닐리노-1-나프틸)말레이미드, 안트라닐아미드, 브릴리언트 옐로우, 쿠마린 및 유도체 예컨대 쿠마린, 7-아미노-4-메틸쿠마린(AMC, 쿠마린 120), 7-아미노-4-트리플루오로메틸쿨루아린(쿠마란 151); 시아노신; 4',6-디아미니디노-2-페닐인돌(DAPI); 5',5''-디브로모피로갈롤-술폰프탈레인(프로모피로갈롤 레드); 7-디에틸아미노-3-(4'-이소티오시아네이토페닐)-4-메틸쿠마린; 디에틸렌트리아민 펜타아세테이트; 4,4'-디이소티오시아네이토디히드로-스틸벤-2,2'-디술폰산; 4,4'-디이소티오시아나토스틸벤-2,2'-디술폰산; 5-[디메틸아미노]나프탈렌-1-술포닐 클로라이드(DNS, 단실 클로라이드); 4-(4'-디메틸아미노페닐아조)벤조산(DABCYL); 4-디메틸아미노페닐아조페닐-4'-이소티오시아네이트(DABITC); 에오신 및 유도체 예컨대 에오신 및 에오신 이소티오시아네이트; 에리트로신 및 유도체 예컨대 에리트로신 B 및 에리트로신 이소티오시아네이트; 에티듐; 플루오레세인 및 유도체 예컨대 5-카르복시플루오레세인(FAM), 5-(4,6-디클로로트리아진-2-일)아미노플루오레세인(DTAF), 2'7'-디메톡시-4'5'-디클로로-6-카르복시플루오레세인(JOE), 플루오레세인, 플루오레세인 이소티오시아네이트(FITC), 및 QFITC(XRITC); 2',7'-디플루오로플루오레세인(OREGON GREEN®); 플루오레사민; IR144; IR1446; 말라카이트 그린 이소티오시아네이트; 4- 메틸엄벨리페론; 오르쏘 크레솔프탈레인; 니트로티로신; 파라로사닐린; 페놀 레드; B-피코에리쓰린; o-프탈디알데히드; 피렌 및 유도체 예컨대 피렌, 피렌 부티레이트 및 숙신이미딜 1-피렌 부티레이트; 리액티브 레드4(Cibacron.RTM. 브릴리언트 레드 3B-A); 로다민 및 유도체 예컨대 6-카르복시-X-로다민(ROX), 6-카르복시로다민(R6G), 리사민 로다민 B 술포닐 클로라이드, 로다민(Rhod), 로다민 B, 로다민 123, 로다민 X 이소티오시아네이트, 로다민 그린, 술포로다민 B, 술포로다민 101 및 술포로다민 101(텍사스 레드)의 술포닐 클로라이드 유도체; N,N,N',N'-테트라메틸-6- 카르복시로다민(TAMRA); 테트라메틸 로다민; 테트라메틸 로다민 이소티오시아네이트(TRITC); 리보플라빈; 로솔산 및 터븀 킬레이트 유도체, 대략 617 nm에서 방출되는 티올-반응성 유로퓸 킬레이트(Heyduk and Heyduk, Analyt. Biochem. 248:216- 27, 1997; J. Biol. Chem. 274:3315-22, 1999), 뿐만 아니라 GFP, 리사민(Lissamine)™, 디에틸아미노쿠마린, 플루오레세인 클로로트리아지닐, 나프토플루오레세인, 4,7-디클로로로다민 및 잔텐(미국 특허 제5,800,996호(Lee et al.)에 기술된 바와 같음) 및 이의 유도체)로부터 선택되는 적어도 하나의 검출가능한 표지의 사용을 포함한다. 예를 들어 인비트로젠 디텍션 테크놀로지스(Invitrogen Detection Technologie)s에서 입수할 수 있는 것, 분자 프로브(Eugene, Oreg.) 및 플렉사 플루오르(ALEXA FLUOR)™ 시리즈의 염료(예를 들어, 미국 특허 제5,696,157호, 제6,130,101호 및 제6,716,979호에 기술), BODIPY 시리즈의 염료(예를 들어, 미국 특허 제4,774,339호, 제5,187,288호, 제5,248,782호, 제5,274,113호, 제5,338,854호, 제5,451,663호 및 제5,433,896호에 기술된 바와 같은 디피로메텐보론 디플루오라이드 염료), 캐스캐이드 블루(미국 특허 제5,132,432호에 기술된 술포네이트화 피렌의 아민 반응성 유도체) 및 마리나 블루(미국 특허 제5,830,912호), 형광 나노입자, 예컨대 반도체 나노크리스탈, 예를 들어, 양자점(Quantum Dot)™(예를 들어 QuantumDot Corp, Invitrogen Nanocrystal Technologies, Eugene, Oreg.에서 수득; 또한, 미국 특허 제6,815,064호, 제6,682,596호 및 제6,649,138호 참조)를 포함하여, 당업자에게 공지된 다른 형광단을 또한 사용할 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 제6,602,671호, 문헌 [Bruchez et. al.(1998) Science 281:2013-6], [Chan et al.(1998) Science 281:2016-8], 및 미국 특허 제6,274,323호, 미국 특허 제6,927,069호; 제6,914,256호; 제6,855,202호; 제6,709,929호; 제6,689,338호; 제6,500,622호; 제6,306,736호; 제6,225,198호; 제6,207,392호; 제6,114,038호; 제6,048,616호; 제5,990,479호; 제5,690,807호; 제5,571,018호; 제5,505,928호; 제5,262,357호 및 미국 공개 특허 출원 제2003/0165951호 뿐만 아니라 PCT 공개 특허 출원 제99/26299호(1999년 5월 27일 공개)에 기술된 반도체 나노결정, 방사성 동위원소(예컨대 3H), 금속 킬레이트 예컨대 방사성 또는 상자성 금속 이온의 DOTA 및 DPTA 킬레이트 예컨대 Gd3+, 및 리포솜, 효소, 예를 들어 홀스래디쉬 퍼옥시다제, 알칼리 포스파타제, 산 포스파타제, 글루코스 옥시다제, β-갈락토시다제, β-글루쿠로니다제 또는 β-락타마제, 검출가능한 신호를 발생하는 발색체, 형광성 또는 발광성 화합물과 조합한 효소 예를 들어, 인비트로젠 코포레이션(Invitrogen Corporation)(Eugene Oreg.)에서 판매하는 것. 발색성 화합물의 특정 예는 다른 것들 중에서, 디아미노벤지딘(DAB), 4-니트로페닐포스페이트(pNPP), 패스트 레드, 브로모클로로인돌릴 포스페이트(BCIP), 니트로 블루 테트라졸륨(NBT), BCIP/NBT, 패스트 레드, AP 오렌지, AP 블루, 테트라메틸벤지딘(TMB), 2,2'-아지노-디-[3-에틸벤조티아졸린 술폰네이트](ABTS), o-디아니시딘, 4-클로로나프톨(4-CN), 니트로페닐-베타-D-갈락토피라노시드(ONPG), o-페닐렌디아민(OPD), 5-브로모-4-클로로-3-인돌릴-베타-갈락토피라노시드(X-Gal), 메틸엄벨리페릴-베타-D-갈락토피라노시드(MU-Gal), p-니트로페닐-알파-D-갈락토피라노시드(PNP), 5-브로모-4-클로로-3-인돌릴-베타-D-글루쿠로니드(X-Gluc), 3-아미노-9-에틸 카르바졸(AEC), 푹신, 요오도니트로테트라졸륨(INT), 테트라졸륨 블루 및 테트라졸륨 바이올렛을 포함한다.
개시된 방법는 전체로 또는 부분으로 자동화될 수 있다. 예를 들어, 단계 (i) 및 (ii)는 자동화될 수 있지만, 임의의 후속 단계, 예를 들어 단계 (iii) 및 (iv)는 수동이다. 대안적으로, 예로서, 단계 (i) 및 (ii)는 수동일 수 있지만, 후속 단계, 예를 들어, 단계 (iii) 및 (iv)는 자동화된다. 부가적으로, 방법이 포괄하는 모든 단계가 자동화될 수 있다.
개시된 방법은 종양 병기화를 위해, 다른 공지의 방법(예컨대, TNM)과 조합하거나, 또는 단독으로 사용할 수 있다. 일 양상에서, 방법은 종양의 형태학적 양상, 종양 세포가 국부 림프절 및/또는 림프계로 확산되는 정도, 및 종양이 대표 샘플에 함유된 유전체, 단백체 및/또는 지질체학적 정보를 기반으로 먼 기관으로 전이하는지 여부 중 하나 이상을 평가하는 단계를 더 포함한다.
개시된 방법은 특정 바이오마커가 있거나 또는 없는 종양 세포의 백분율을 계산하기 위해 알고리즘을 적용하는 단계를 더 포함할 수 있다. 전이(또는 병독성 서브클론) 진행의 상대적 위험성은 특이적인 대표 종양 샘플 및/또는 대표 림프절 샘플 중 세포의 백분율을 기반으로 결정될 수 있다.
개시된 방법은 대표 샘플에 함유된 바이오마커 프로파일, 항원 프로파일, 돌연변이 프로파일, 지질 프로파일, 단백질 프로파일, 및/또는 엑소솜 프로파일을 기반으로 개인화된 용량 섭생법을 개발하는 단계를 더 포함할 수 있다. 예를 들어, 대표 샘플에 함유된 정보(또는 대표 림프절 샘플 및/또는 순환 DAN 프로파일과 비교하는 이러한 정보)를 기반으로, 약물의 선택 및/또는 환자에게 투여되는 이러한 약물의 용량(양, 투여 시간 등)은 환자의 개별 암 프로파일을 기반으로 치료를 개인화하도록 변형될 수 있다.
개시된 방법은 대표 샘플의 게놈 프로파일을 대표 림프절 샘플의 게놈 프로파일과 비교하는 단계, 및 또한 임의로 이들 프로파일을 임의의 먼 전이부 또는 대표 전이성 종양 샘플 유래의 순환 종양 DNA와 비교하는 단계를 더 포함할 수 있다.
본 공개는 또한 본 개시의 임의의 방법으로 생성된 조성물을 포괄한다.
대표 샘플의 분석
부가적으로, 본 공개는 대상체를 치료하기 위한 적당한 치료적 섭생법의 선택에서, 임의 수의 표준 진단적 어세이를 사용한 추가 분석에 적합한 대표 샘플을 제조하기 위한 종양 샘플의 균질화를 포함하는, 전술한 방법의 결과(예컨대, 희귀 유전자 및/또는 후생유전자 사건, 희귀 세포 등의 검출) 또는 전술한 이의 방법으로 생성된 조성물의 사용을 고려한다. 치료적 섭생법은 임의의 화학요법, 면역조정인자 투여, 방사선요법, 사이토카인 투여, 수술, 또는 이의 조합을 포함할 수 있다.
더욱이, 개시된 방법은 그 종양이 제공된 방법으로 생성된 대표 샘플에 대한 공급원인 대상체에서 사용하기 적합한 적어도 하나의 치료제(예컨대, 적어도 하나의 검출된 바이오마커의 발현 또는 기능적 활성을 길항하거나, 억제하거나 또는 차단하는 항체, 핵산, 소형 분자, 또는 폴리펩티드)를 선택하는데 사용될 수 있다.
암 생물학 분야의 최근 진보는 종양 생리학과 관련하여 오랫동안 유지된 믿음이 서서히 약화되고 있다. 이전에, 우세한 생각은 종양 내 모든 세포가 암 병기와 무관하게, 서로 유사하다는 것이었다. 그러나, 새로은 기술, 예컨대 단일 세포 시퀀싱의 출현으로, 종양 내 세포가 고도로 다양할 수 있다는 것을 이제 이해하게 되었다. 예를 들어, 문헌 [Campbell et al. Subclonal phylogenetic structures in cancer revealed by ultra-deep sequencing. PNAS 2008; 105:13081-13086]; 및 Navin et al. Tumor evolution inferred by single-cell sequencing. Nature. 2011; 472:90-94]을 참조한다. 종양내 불균질성의 발견은 암 진단학을 포함한, 임상 종양학에서 처리할 필요가 있는 새로운 복잡성을 강조한다.
현행 병리학적 방법은 종양으로부터 소수의 작은 영역만을 자르고, 파라핀 블록에 그들을 위치시켜서, 암 바이오마커에 대해 검사된 블록으로부터 소형 절편을 자르는 것을 기반으로 한다. 예를 들어, 문헌 [Westra et al. Surgical Pathology Dissection: An Illustrated Guide. New York: Springer. 2003]을 참조한다. 이러한 방법은 암을 병기화하는데는 유용하지만, 전체 종양의 오직 작은 분획의 샘플채취에 대한 의존은 진단적 결과가 아마도 전체를 대표할 것 같지 않게 만들었다. 그 결과, 현행 방법은 1) 중요한 질환 특징을 동정하는데 실패하였고, 2) 종종 질환 진행 및/또는 결과를 결정하지 않거나 또는 영향을 주지않는 소수의 질환 특성을 과샘플링한다.
이들 문제는 종양의 크기가 증가함에 따라 증폭되어서, 그 결과, 암 환자의 장기간 생존률이 종종 부정적으로 영향받았다. 예를 들어, 암 병기와 무관하게, 종양 크기가 증가함에 따라, 5년 생존 평균이 떨어졌다. 하기 문헌들을 참조한다: Lopez-Encuentra et al. Staing in lung cancer: is 3cm a prognostic threshold in pathological stage 1 non-small cell lung cancer? A multicenter study of 1,020 patient. Chest. 2002; 121(5):1515-1520; Miller and Grigsby. Measurement of tumor volume by PET to evaluate prognosis in patients with advanced cervical cancer treated by radiation therapy. Int J Radiat Oncol Biol Phys. 2002; 53(2): 353-359; Elkin et al. The effect of Changes in tumor size on breast carcinoma survival in the U.S.: 1975-1999. Cancer. 2005; 104(6): 1149-1157; Brookman-May et al. Difference between clinical and pathological renal tumor size, correlation with survival, and implications for patient counseling regarding nephron-sparing surgery. AJR. 2011; 197(5): 1137-1145; and Kornprat et al. Value of tumor size as a prognostic variable in colorectal: a critical reappraisal. Am J Clin Oncol. 2011; 34(1): 43-49).
따라서, 특히 거대 고형 종양을 갖는 환자들에 대한, 임상 종양학에서의 종양 불균질성 문제를 처리하는 것이 필요하다. 또한 양호한 치료적 결과의 가능성을 향상시키기 위해 질환 징후 이전에 비정상 세포를 함유하는 환자 샘플을 동정하기 위한 개선된 방법이 필요하다.
종양 불균질성의 문제를 처리하기 위해서, 종양학 분야의 일부 전문가들은 복수 영역을 검사하여, 한번에 샘플채취되는 종양의 양을 증가시키는 것을 제안하였다. 예를 들어, 문헌 [Alizadeh et al. Toward understanding and exploiting tumor heterogeneity. Nature Medicine. 2015; 21: 846-853]을 참조한다. 상기 확률적 모델로 입증된 바와 같이, 이 기술은 종양 불균질성의 문제를 완전하게 처리할 수 없다. 환자 당 이러한 수의 샘플을 가공하는 것으로 채워진 병리학 실험실의 작업량 증가는 이렇게 제안된 방법을 억제하게 만든다.
대표되는 샘플을 위해서, 출발 재료의 모든 상이한 단편은 샘플에서 종결없이 균등한 기회를 가져야 하며 이는 모든 샘플에 걸쳐 일관적이어야 한다. 문헌 [Petersen et al. 2005]을 참조한다. 그러나, 현행 절편화 과정의 경우, 종양의 큰 부분은 파라핀 블록을 생성시킨 후에는 소각된다. 문헌 [Westra et al. 2003]을 참조한다. 그러므로, 지금까지, 대표 종양 샘플이 만들어지지 않았고, 현행 병리학적 관례는 좌절시키고 심지어 그들 생성을 막는다.
부가적 양상에서, 기계적 방법, 예를 들어, 전단 및/또는 생화학적 방법, 예를 들어, 열 및 pH 조건화 및 세포외 매트릭스의 효소적 소화의 사용은 종양으로부터 대표 샘플을 생성시키는데 사용될 수 있다. 이들 접근법의 커플링은 전통적인 조직 기반 어세이, 예를 들어, 헤마톡실린 및 에오신 염색, 면역조직화학적 분석, 및 핵산 단리에서 시료를 사용하는 능력을 악화시키지 않고, 조직 샘플 또는 샘플들, 예를 들어 전체 종양 또는 이의 실질적인 부분의 대표 샘플을 유발시킨다. 또한 각 대표 샘플은 복수의 상이한 어세이에서 동시에 사용될 수 있다. 부가적으로, 장기, 조직 또는 종양의 균질화는 향후 약학 및 진단적 방법 및 개인화된 약물에 중요할 수 있는, 부가적인 진단적 검사, 예컨대 전체 게놈시퀀싱에 사용하는데 적합하게 한다. 또한, 균질물은 혈액 유래의 진단적 검사에 이용되는 것과 유사한 자동화 방법으로 처리할 수 있다. 그러므로, 대표 샘플은 희귀 종양 서브클론을 동정하기 위해 다양한 진단적 프로토콜에서 사용할 수 있고 더 나아가서 임상 진단적 및 개인화된 암 치료를 개선한다. 또한, 최종 대표 샘플은 치료적 또는 예방적 종양 백신의 개발에 유용한 항원 또는 항체를 유래시키는데 사용될 수 있다.
본 명세서에 예시된 바와 같이, 본 발명자는 임상 시료, 예를 들어 인간 종양 임상 시료로부터 대표 샘플을 생성시키는 능력을 입증하였고 전통적인 종양 절편화를 사용해서는 아마도 인식되지 않던 희귀 표현형을 본 명세서에 개시된 방법으로 생성된 대표 샘플 내에서 검출할 수 있다는 것을 더욱 보여주었다. 더욱이, 본 발명자는 개시된 방법이 다양한 상이한 조직 유형, 고정되거나 또는 고정되지 않은 조직으로 부터 대표 샘플을 생성시키는데 사용될 수 있고, 최종 대표 샘플는 IHC 및 핵산 단리를 포함하는 다양한 진단적 검사에 사용할 수 있다.
균질물을 생성시키기 위해 샘플에 적용되는 기계적 및/또는 생화학적 해리 과정에 의존적으로, 세포 클러스터는 하나(1) 초과의 세포 내지 수천개 세포를 포함할 수 있다. 클럼프는 대표 샘플을 사용해 수행하려는 후속 어세이(예를 들어, FACS 및 유세포 분석은 단일 세포를 요구함)에 의존적으로, 추가 방법, 예를 들어 추가의 기계적 및/또는 생화학적 해리 및/또는 크기 배제의 적용에 의해 해리될 수 있다(크기 및/또는 그에 함유된 세포수의 감소).
방법은 샘플 해리 정도에 대해 탄력적이다. 따라서, 예를 들어 클러스터가 샘플채취 방법의 해리 목표(예컨대, 단일 세포)에 상응할 때까지 제1 기계적 수단(예컨대, 블렌딩 또는 등가물)의 적용 후 수득된 세포 클러스터를 더욱 가공하여, 표적 세포 응집 크기를 수득하기 위해 기계적 과정(들)을 제어하는 것이 가능할 수 있다. 일 양상에서, 기계적 전단 및 크기 배제, 예를 들어 일련의 메쉬에 의한 체질을 사용하여 특정 크기 또는 그 이하로 세포 클러스터를 분리하는 한편 목표 입자 크기에 도달하도록 더욱 가공하기 위해 보다 큰 세포 클러스터를 유지한다. 이러한 방식으로, 크기 범위가 정상 분포처럼 보일 수 있는 한편, 세포 클러스터 입자 크기의 최종 분포는 해리 과정으로부터 특정 입자를 분리시키고, 따라서 분포보다는 크기 평탄역에 도달하도록, 크기 배제, 예를 들어 체질 크기의 사용에 의해 조작된다.
균질화 이후, 최종 클로스터는 적어도 1-2, 2-100, 100-500, 500-1,000, 1,000-10,000, 10,000-50,000, 또는 그 이상을 함유할 수 있다. 일 양상에서, 클러스터는 단일 세포, 약 2-10 세포, 약 10-20 세포, 또는 약 20-40 세포를 함유한다. 최종 클러스터의 크기는 다양할 것이다. 예를 들어 도 17을 참조한다.
종양 및/또는 림프절 샘플의 균질화(또는 종양 샘플의 균질화)의 결과로서, 샘플, 예를 들어 종양 또는 림프절 내 세포의 임의 불균질성은 균질물 또는 이의 일부분 또는 분획 내에서 실질적으로 균질하게(균일하게) 분포되어서, 균질물(또는 이의 임의 분획)이 종양 생검 샘플의 불균질성을 실질적으로 균질하게 발현시킨다. 이의 전체에서 종양을 대표하는 샘플(또는 균질물)을 생성시키기 위해 종양을 균질화함으로써, 종양의 표현형 다양성(예를 들어, 특이적 유전자 돌연변이를 갖는 세포의 백분율)을 특징규명하는 것이 가능하다. 균질화된 샘플은 많거나 또는 대부분의 세포가 온전하게 유지됨에도 불구하고, 이의 유동성 또는 부어지는 능력을 기반으로 액체 또는 액화 샘플이라고 할 수 있다. 일부 예에서, 대표 샘플은 액체 샘플(예컨대, 세포검사 바늘 흡인물, 삼출 샘플, 또는 파프 도말시료)일 수 있다.
언급한 바와 같이, 다른 모이어티를 이들 균질물 또는 대표 샘플 예컨대 다른 세포, 합텐 또는 표지에 첨가할 수 있다.
대표 샘플의 시퀀싱
개인화된 약물의 궁극적 목표를 위해, 종양학자들은 종양 내에서 특이적 변화와 표적화 요법을 연결시킬 수 있도록 종양으로부터 핵심 돌연변이를 검출하는 진단에 의존한다. 고형 종양으로부터 차세대 시퀀싱(NGS)을 통한 서열 정보의 포착은, 종양 세포가 요법에 대해 시간 경과에 따라 변함없이 내성이 될 수 있으므로, 임상 종양학 작업흐름의 핵심 구성요소이다. 모든 현행 임상적 NGS 작업흐름에 고유한 가장 중요한 장애 중 하나는 임상의가 종양의 모든 부분에서 종양 성장을 구동시키는 돌연변이를 검출할 수 없거나, 임상의가 현존하는 요법 내성을 부여하는 돌연변이를 검출할 수 없다는 것이다. 더욱이, 돌연변이의 일부가 종양 내에서 높은 출현율로 존재할 수 있지만, 다른 돌연변이(구동자 돌연변이 및 내성 돌연변이 포함)가 종양의 작은 분획에만 존재할 수 있다. 전형적으로, 이러한 문제의 뿌리는 임상의가 원발성 종양으로부터 채취된 샘플 유래의 포르말린 고정되고, 파라핀 포매된(FFPE) 조직 절편을 이용한다는 사실이다. 샘플채취 문제는 대표 샘플채취 과정을 통해 철저하게 해결될 수 있지만, 여전히 완전히 개인화된 약물을 실현하기 위한 임상적 NGS 작업흐럼에서 해결해야만 하는 일부 중요한 문제들이 여전히 존재한다.
오늘날, 클리닉에서 NGS는 대부분의 종양에 존재하는 표적화가능한 돌연변이(즉, 표적화 요법과 연관된 돌연변이)를 검출하기 위해서만 이용될 수 있다. 임상의 및 연구자들은 NGS 기술에 의해 생성되는 데이타의 부피로 인해 주로 표적화가능한 돌연변이에 집중하였다. 조직 샘플의 전체 엑솜 분석에서, 수만개의 유전자가 조사될 것이며, 각 유전자는 수천개의 소형 절편으로 서열분석된다. 임상적 판달을 위해서 데이타의 전부를 사용하기 보다는, 많은 그룹들이 방대한 대부분의 데이타를 보지 못하고 요법과 연관된 것으로 알려진 돌연변이만을 보고한다.
그러나, 충족되지 않은 기술적 및 임상적 요구는 그들이 "표적가능한"것인지 그렇지 않은것인지 간에 고형 종양에 존재하는 모든 돌연변이를 검출하는 것이다. 더욱이, 특이적 돌연변이를 함유하는 종양 세포의 백분율을 결정하는 것이 임상의에게 필수적이다. 방대한 대부분의 종양의 게놈 다양성을 포획한 데이타를 사용해서 임상의는 복수의 "표적화가능한" 또는 "약물가능한" 돌연변이를 갖는 환자를 어떻게 치료하는지 이해라 수 있다. 예를 들어, 고형 종양이 55% 출현율로 EGFR 유전자 돌연변이, 20% 출현율로 bRaf 돌연변이, 및 5% 출현율로 KIT 돌연변이를 함유하면, 임상의는 임상적 반응이 이미지화를 통해 보일때까지, 또는 특정 시간 동안 또는 특정 시간 기간 동안 EGFR 억제인자(예를 들어, 세툭시맙, 패니투무맙)로 대량의 종양을 표적화하고자 원한다. EGFR 억제인자가 이후에 중단되면, 다음으로 가장 우세한 요법의 표적, 이 경우에는 bRaf 억제인자(예를 들어, 베무라페님)가 투여될 것이다. 이 지점에서 임상의는 이미지화를 통해 임상적 반응을 볼 수 있거나, 또는 볼수없을 것이다. bRaf 억제인자가 중단되면, 최소 빈도의 표적 요법, 즉 KIT 억제인자(예를 들어, 이마티닙, 수니티닙)가 제공될 것이다. 이러한 3종의 약물 섭생법이 이후에 반복될 수 있다. 약물이 함께 내성일 수 있으면, 조합 요법은 또 다른 가능성일 수 있다. 대안적으로, 약물은 반대 순서, KIT 억제인자, bRaf 억제인자, 이후에 EGFR 억제인자로 투여될 수 있다.
이러한 약물 스케쥴의 핵심 구성요소는 NGS 기술 또는 억제인자가 아니라, 대표 샘플채취 기술을 사용하여 종양 내에서 모든 잠재적인 표적 및 그들의 상대적 출현율의 존재 둘 모두를 결정하는 것이다. 상기 예에서, KIT 돌연변이 및 bRaf 돌연변이 둘 모두는 그들이 낮은 출현율로 존재하기 때문에 누락되었다. bRaf 돌연변이체의 높은 백분율을 함유하는 종양 영역을 샘플채취한 경우, bRaf 돌연변이가 대부분의 종양을 구동하는 것으로 나타나면 bRaf 억제인자가 단일 작용제로서 제공된다. 상기 예에서 3개 돌연변이 중 오직 하나의 표적화는 나머지 2개 돌연변이를 함유하는 종양 세포가 단일 작용제에 반응하지 않았으므로 요법 내성을 초래하였다.
원발성 종양으로부터 NGS 데이타의 다른 사용은 종양 세포가 면역 시스템, 즉 면역요법의 사용에 의해 표적화될 수 있는지 여부를 결정하려고 시도한다. 이는 면역 시스템에 의해 표적화될 수 있는 신생항원의 예측을 포함한다. 종양의 엑솜 시퀀싱은 발현된 단백질에 변화를 일으킬 것으로 에측되는 돌연변이를 검출할 수 있다.
고형 종양 내 돌연변이의 출현율을 결정하는 핵심 인자는 종양 및 정상 세포의 혼합 개체군으로부터 종양 세포를 농축/정제하는 것이다. 종양 세포의 높은 백분율을 포획하는데 사용될 수 있는 한 가지 방법은 형광발광 활성화된 세포 분류법(FACS)이다. 대표 샘플에 이 기술을 적용하여, 균질화된 고형 종양은 단일 세포, 또는 소형 다세포 조직 단편으로 먼저 해리되어야만 한다. 단일 세포는 종양 마커의 형광 검출이외에도, 세포 및 핵 크기를 기반으로 분류될 수 있다. 종양 세포로부터 정상 세포의 음성 선택은 또한 종양 세포를 주로 구성하는 샘플을 야기할 것이다. 다세포 조직 단편 분류법(MTFS)은 음성 선택 정상 마커의 경우에, 또는 종양 마커의 형광 검출을 통해 농축될 수 있다. 이 기술이 NGS 데이타의 해석을 보다 쉽게 만들뿐만 아니라, 종양에서 극도로 낮은 출현율 돌연변이의 검출을 가능하게 한다.
부가적으로, FACS 또는 MTFS는 종양으로부터 복수의 별개 개체군을 구별하는데 사용될 수 있는데, 이들 각각은 독특한 샘플로서 처리될 수 있고 서로 독립적으로 분석될 수 있다. 이의 예는 종양 세포, 정상 상피 세포, 내피 세포, 및 면역 세포의 분화일 수 있다.
대표 샘플로부터 NGS의 또 다른 적용은 면역 시스템으로 검출가능할 수 있는 신생항원 검출이다. 항종양 치료적 섭생법에서 신생항원을 효과적으로 이용하기 위해서, 임상의는 종양으로부터 모든 잠재적 항원성 돌연변이를 검출해야만 한다. 표적화 요법과 유사하게, 키메라 항원 수용체 요법(CAR-T)에 대한 대부분의 신생항원을 검출하는 것이 핵심적이다.
또한, 유세포 분석은 임상의가 특이적 바이오마커에 대해 양성인 종양, 정상, 이배체 종양 또는 종양 세포의 다양한 개체군인 샘플의 백분율에 대해, 대표 샘플의 조성을 결정하기 위해 유?W포분석으로부터 데이타를 사용할 수 있는 진단적 작업흐름의 중요한 구성요소이다. 이러한 작업흐름의 예는 대표 샘플 중 종양의 백분율을 계산하여, 1,000개 양성 세포를 요구하는 IHC 어세이를 통계적으로 작동시키는데 필요한 최소의 세포수를 계산하는 것이다.
종양 또는 이의 일부분의 균질화
본 공개는 조직, 예를 들어 종양, 림프절, 전이물, 폴립, 낭포, 생검, 전체 기관, 또는 전술한 것의 임의 조합의 전체를 비편향적으로 나타내는 "대표 샘플"을 생성시키기 위해, 임의로는, 예를 들어 포르말린, 파라핀 및/또는 에탄올을 사용해 균질화 이전 또는 이후에 보존되거나 또는 고정될 수 있는, 종양 또는 기타 조직 샘플, 예를 들어, 전암성 또는 추정되는 정상 조직을 균질화하는 방법에 관한 것이다. 다시, 이들 방법은 샘플 내에서 세포의 무결성 및/또는 생존능을 보존할 수 있다. 이러한 대표 샘플은 대부분의 클론(50% 초과의 출현율을 가짐), 일차 서브-클론(약 20% 내지 약 50%의 출현율을 가짐), 이차 서브클론(약 10% 내지 약 20%의 출현율을 가짐), 및 소수의 서브클론(10% 미만의 출현율, 바람직하게는 5% 미만의 출현율, 더욱 바람직하게는 1% 미만의 출현율, 및 가장 바람직하게는 0.1% 미만의 출현율을 가짐)을 포함할 수 있다. 상기에 기술된 바와 같이, 대표 샘플은 낮은 출현율 사건, 즉 0.000001%에 이르거나 또는 그 이하의 출현의 검출을 촉진한다. 그들이 조직 샘플, 예를 들어, 고형 종양 또는 림프절의 전체를 반영하므로 대표 샘플은 현행 방법(예컨대, FFPE 슬라이드 염색)을 사용해 신뢰할만하게 수행할 수 없는, 조직, 일반적으로 종양 또는 림프절/림프계 조직에서 그들 출현에 비례하여 돌연변이의 검출을 허용한다.
균질화 임상 시료, 예를 들어, 인간 종양의 개념은 병리학 및 종양학의 역사적 샘플채취 방법에 반대된다. 전체 인간 종양, 또는 심지어 인간 종양의 거대 부분에 대한 역사적 선례가 존재하지 않는다. 또한, TNM 병기화를 위한 샘플이 채취되면, 나머지 종양 재료는 파괴된다(모든 의학적 관련 정보가 TNM 병기화로부터 수집된 절편 내에 있다고 받아들여지기 때문).
그러나, 본 발명자들은 잔여 종양 재료를 파괴하기 보다는 이용가능한 종양의 전부(또는 실질적으로 전부)가 단일 샘플로서 보존되고 균질화되면, 암 세포의 작은 하위개체군으로부터의 정포를 검출하고 분석할 수 있다는 것을 확인하였다.
많은 경우에서, 샘플(예컨대, 종양, 림프절, 또는 전이)은 덩어리 크기에 의존적으로 단일 블록으로 또는 복수 블록으로, 전체로 제출된다. 예를 들어, 직경이 2 cm 미만인 많은 유방 종양은 대부분의 흑색종처럼 전체로 제출된다. 2015년 암 사례로 추정된 대략 935,000 사례에서, 종양 샘플의 적어도 1/3이 균질화될 수 있는 것으로 추정된다. 특히 균질화될 수 있는 종양은 대장 종양 및 신장 종양을 포함한다.
균질화된 종양의 액체 성질은 종양의 세포 개체군의 통계적 분석을 가능하게 한다. 예를 들어, 파워 분석은 낮은 출현율의 서브클론을 검출할 확률이 샘플의 증가된 백분율의 분석에 따라 증가된다는 것을 시사한다. 예를 들어, 약 95 세포의 샘플 크기는 약 20% 출현율의 서브클론의 검출을 가능하게 하고, 약 200 세포의 샘플 크기는 약 0.1% 출현율의 서브클론의 검출을 가능하게 하며, 약 2,000 세포의 샘플 크기는 약 0.01% 출현율의 서브클론의 검출을 가능하게 하며, 약 20,000 세포의 샘플 크기는 약 0.001% 출현율의 서브클론의 검출을 가능하게 한다. 클리닉 유래의 종양 샘플은 아마도 종양의 공간적으로 구별되는 영역 유래의 적어도 약 100-200; 200-1,000; 1,000-5,000; 10,000-100,000; 100,000-1,000,000; 1,000,000-5,000,000; 5,000,000-1,000,000,000; 1,000,000,000-5,000,000,0000, 또는 그 이상의 세포(즉, 1조의 세포)를 포함하고, 이들 종양으로부터 생성된 대표 샘플은 서브클론의 적절한 검출을 허용하도록 충분한 세포 계측치를 가지게 될 것이라는 것을 예상하는 것이 타당하다. 그러므로, 각 진단적 어세이를 개시된 방법에 따라 획득한 대표 종양 샘플로부터의 충분한 수의 세포수로 처리하는 것은 종양 내 희귀 서브클론의 검출을 가능하게 하고, 따라서 암의 돌연변이 경관의 비편향적인 결정을 촉진한다.
대표 샘플을 제조하는 개시된 방법은 세포 용해를 요구하지 않으며, 일부 실시태양에서, 세포 구조를 유지한다. 그 결과로서, 세포의 무결성이 유지된 개시된 방법에 따라 생성된 대표 샘플은 예를 들어, ICC, IHC 및 유세포 분석에서 사용될 수 있다. 대안적으로, 또는 부가적으로, 샘플 또는 대표 샘플 또는 이의 일부분은 임의로는 세포를 파괴(용해)하도록 처리될 수 있고, 따라서 예를 들어, PCR, 차세대 시퀀싱(NGS), 및 질량 분광법을 사용해 세포 구성요소의 분석이 가능하다.
전체 종양 샘플채취 또는 추정되는 정상 또는 전암성 조직에서 희귀 세포 유형의 동정에서 초기 단계는 조직, 예를 들어 종양 조직의 충분한 양을 획득한다. 일반적으로, 균질화에 이용할 수 있는 종양 조직이 많을수록, 희귀 종양 하위개체군을 검출할 확률이 높다. 이상적으로, 대표 샘플을 생성시키는데 이용할 수 있는 종양 재료의 총량은 100% 미만일 것이다(종양으로부터 이미 제거된 TNM 병기화 시스템에 대한 샘플의 결과로서). 그러나, 미리보면, 즉 현재 방법이 표준 치료가 되면, 전체 종양(또는 적어도 보다 많은 잔류 종양)이 클리닉에서 균질화에 이용가능하게 될 것이다. 현행 관례는 외과 병리학자가 전체 점검 및 샘플채취 이전에 포르말린에 전체의 수술적 절제물을 고정시키는 것이고, 고정 및 미고정 조직이 대표 샘플채취에 이용될 수 있다. 그러나, 포르말린 고정이 예를 들어, 본 발명이 표준 치료가 되면, 제거되거나, 또는 단계적으로 폐지될 것으로 계획된다. 그렇지만, 본 명세서에 개시된 대표 샘플채취 방법과 조합하여 현행 TNM 병기화 방법을 사용하는 것이 또한 가능하다.
종양 또는 기타 조직이 획득되면, 가능한 많은 종양 또는 기타 조직이 블렌더(또는 다른 적합한 디바이스)에 넣어져서, 일반적으로 기계적 전단(화학적 및/또는 생화학적, 예를 들어 효소적 해리가 또한 균질화에 기여할 수 있지만)의 결과로서 균질화된다.
순수하게 기계적 수단, 예를 들어 블렌딩에 의한 균질화는 아마도 정상 분포헤 적합되는, 수천 내지 수백의 각 세포로부터의 조직 단편의 범위를 생성시킨다. 그러나, 다른 균질화 방법 단독 또는 기계적 수단과의 조합, 예를 들어 생화학적/화학적 해리 방법 단독 또는 기계적 수단과의 조합의 적용이 정상 분포로부터 조직 단편의 분포를 왜곡시킬 수 있다.
부가적으로, 샘플, 예를 들어, 종양 또는 림프절을 조직 단편(예컨대, 단일 세포 및 세포 클러스터)으로 해리하고 균질화시키는, 병행하거나 또는 연속하여 사용되는 기계적 수단의 조합이 세포 샘플을 생성하는 동안 또는 그 이후에 바이오마커 샘플을 생성시키는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 온전한 세포를 포함하는 대표 샘플은 상기 기술된 대로 샘플을 블렌딩하여 생성될 수 있고, 최종 "세포 샘플"은 온전한 세포를 분석하는데 사용될 수 있지만, 세포 샘플은 또다른 기계적 수단, 예를 들어 초음파처리에 의해 더욱 가공되어, 바이오마커 샘플을 생성시킬 수 있으며, 즉 온전한 세포의 파괴(용해)가 샘플 중 단백질 및/또는 DNA 바이오마커의 분석을 가능하게 한다.
조직 단편 크기의 중간값은 블렌드(또는 다른 적합한 디바이스)의 에너지와 역으로 관련있어서, 높은 에너지에서 조직 단편은 매우 작다. 블렌더 에너지와 가장 관련있는 조직의 구성요소는 콜라겐 함량인데, 피부가 완전한 해리를 위해 상당한 에너지를 요구하기 때문이다. 블렌딩 시간이 또한 중요하지만, 대부분의 효과적인 임상적 적용은 전체 종양을 분 단위에 해리할 것을 요구한다. 블렌딩의 시간이 고정되면, 바람직한 시간 제한 하에서 종양 해리에 도달하는데 필요한 에너지는 쉽게 결정될 수 있다.
전체 종양을 해리하기 위한 충분한 기계적 전단(블렌딩 또는 기타 적합한 힘을 통함) 이후, 본래 공간적으로 분리된 종양 세포의 모든 하위개체군은 새롭게 액화된 종양 샘플 전체에 분포된다. 시험 샘플을 균질화된 샘프로부터 채취할 수 있고 종양 하위개체군(희귀 또는 낮은 출현율 또는 소수의 하위개체군 포함)은 상이한 검사 양식을 사용해 검출될 수 있다.
예를 들어, 액화된 전체 종양 샘플의 분취액을 채취하여, 용해시켜 세포 구성요소를 방출시키고, 핵산을 PCR 또는 NGS에 의한 분석을 위해 정제시킬 수 있다. 예를 들어, 세포는 당분야에 공지된 미세유동화기를 사용하고/하거나, 분쇄, 밀링, 화학적 또는 효소적 용해 및/또는 기타 당분야에 공지된 기술에 의해 용해될 수 있다. 대안적으로, 또는 부가적으로, 종양 세포의 단백질 구성요소는 단백체 분석 방법, 예컨대 질량 분광법(MS)을 위해 정제될 수 있다. 더욱이, 조직 단편은 파라핀 왁스에 포매되고 현행 병리학 작업흐름을 사용해 샘플채취될 수 있다. 장기간 저장을 위해, 액화 종양을 포함하는 대표 샘플은 적합한 완충제에 저장되어, 동결 또는 동결되거나 또는 저장을 위해 왁스(예컨대, 파라핀)에 포매될 수 있다.
일반적으로, 어세이 예컨대 초기에 블렌딩된 전체 종양 샘플(세포의 클러스터 함유)을 효과적으로 이용할 수 있는 상기에 언급된 것들(예컨대, PCR, NGS, MS, IHC, ICC 등)은 기계적 힘(전달을 유도하는 블렌더 또는 초음파처리기 또는 기타 적합한 디바이스)의 적용 이후에, 생화학적(효소적) 가공없이 수행될 수 있다. 그러나, 보다 작은 세포군(예컨대, 2-20 세포 또는 심지어 단일 세포)을 요구하는 어세이가 또한 대표 샘플을 분석하는데 사용될 수 있지만, 샘플의 부가적인 가공이 수술적으로 제거된 조직의 포르말린 고정 동안 유도된 단백질-단백질 가교를 제거하기 위해 요구된다. 특히, 블렌딩된 종양 조직의 효소적 소화가 특정 어세이, 예를 들어 세포 분류법에 사용하기 적합한 단일 세포 및 소형 세포 클러스터로 이루어진 대표 샘플을 생성시키는데 요구된다.
상기에 기술된 바와 같이, 균질화는 단지 기계적 수단(예컨대, 블렌딩을 단독으로 사용하거나 또는 다른 기계적 수단과 연속하여 또는 동시에 사용), 단지 생화학적/화학적 수단(예컨대 효소적 소화), 또는 이의 조합을 사용해 수행될 수 있다. 조직 단편의 물리적 및 생화학적(효소적) 파괴의 조합은 온전한 세포를 요구하는 진단적 어세이에 적합한 샘플을 생성시킬 수 있다. 단백질 가교의 파괴를 개시하는 제1 물리적 방법은 약 80 내지 약 85℃에서 낮은 pH 완충제 중에 조직 단편을 항온반응시키는 것이다. 항온반응 단계는 조직 단편을 비특이적으로 "오픈업(open up)하여 시작되어, 그들을 조직 단편을 함께 유지시키는 세포-세포외 매트릭스 연결부의 생화학적 절단인, 과정의 다음 단계를 위해 제조한다. 적합한 조건 하에서, 효소 예컨대 비-단백질 특이적 프로테아제, 예를 들어, 펩신, 트립신, 프로테이나아제 K, 퓨린, 엔도프로테이나아제(예컨대 Asp-N 및 Glu-C, NEB, Sigma-Aldrich, Thermo Fisher, Promega 등에서 입수가능), 엔테로키나제, 및 서브틸리신; 단백질 특이적 프로테아제, 예를 들어, 콜라게나아제(예컨대 콜라게나아제 유형 I-S, I-A, IA-S, II, II-S, IV, IV-S, VIII, V, V-S, XI, XI-S, III, VII, VII-S, S, F, H, 및 L(NEB, Sigma-Aldrich, Thermo Fisher, Promega 등에서 입수가능), 젤라니타아제, 스트로멜리신, 마트릴리신, 에나멜리신, 및 애드맷(예컨대, 프로테오글리칸-분해 효소); 및/또는 비-포유동물/비박테리아 효소 대체물, 예를 들어 진균 효소, 예를 들어, 아큐타제(Accutase)® 및 아큐맥스(Accumax)®(Innovative Cell Technologies, San Diego, CA) 또는 임의의 전술한 것의 조합과의 항온반응은 이들 연결을 절단하기 위해 실시될 수 있다. 예시적 효소는 제한없이, 사이질 콜라게나아제, 젤라니타아제-A, 스트로멜리신 1, 마트릴리신, 호중구 콜라게나아제, 젤라니타아제-B, 스트로멜리신 2, 스트로멜리신 3, 마크로파지 메탈로엘라스타아제, 콜라게나아제 3, MT1-MMP, MT2-MMP, MT3-MMP, MT4-MMP, 콜라게나아제 4, 에나멜리신, X-MMP, CA-MMP, MT5-MMP, MT6-MMP, 마트릴리신-2, MMP-22, 엔도프로테이나아제, 트립신, 키모트립신, 엔도프로테이나아제 Asp-N, 엔도프로테이나아제 Arg-C, 엔도프로테이나아제 Glu-C(V8 프로테아제), 엔도프로테이나아제 Lys-C, 펩신, 서몰리신, 엘라스타아제, 파파인, 프로테이나아제 K, 서브틸리신, 클로스트리파인, 엑소펩티다아제, 카르복시펩티다아제 A, 카르복시펩티다아제 B, 카르복시펩티다아제 P, 카르복시펩티다아제 Y, 카텝신 C, 아실아미노-산-방출 효소, 파이로글루타메이트 아미노펩티다아제를 포함하고, 적합한 조건 하에서 이들 연결을 절단하기 위해 실시될 수 있다. 효소는 예를 들어, 콜라게나아제(예컨대 콜라게나아제 H) 및 또다른 효소(예컨대, 아큐맥스®), 복수의 콜라게나아제, 복수의 다른 효소 등과 조합하여 또는 단독으로 사용될 수 있다.
대안적으로 또는 부가적으로, 조직 단편은 대표 샘플의 생화학적 소화 이전, 및 대안적으로 또는 부가적으로 이후에, 기계적 힘(예컨대 막자 및 막자사발, 소세지 생산에 사용되는 고기 그라이더와 유사한 분쇄 장비, 또는 초음파처리)을 적용하여 전단된다.
유사하게, 생화학적으로 분해된 대표 샘플은 부가적 분석을 위해 샘플로부터 특정 세포 또는 기타 재료를 단리하는데 사용할 수 있는, 원심불리를 실시하여, 더욱 가공될 수 있다. 예를 들어, 블렌딩되고 아큐맥스® 및 콜라게나아제로 소화된 인간 난소 장액성 암종 종양으로부터 제조된 대표 샘플의 원심분리 결과 종양-학습된 혈소판 및 다른 혈액 세포가 단리된다(도 23). 도 23은 원심분리에 의해 생화학적으로 소화된 대표 샘플로부터 단리된 종양-학습된 혈소판 및 다른 혈액 세포의 이미지이다. 인간 난소 장액성 암종 종양을 블렌딩하고 아큐맥스 및 콜라게나아제 H로 소화시키고 원심분리하여 원심분리된 샘플의 상부에 적혈 세포 및 혈소판이 축적된다(적색선).
본 발명자들은 본 명세서에서 pH 및 가열과 효소적 소화의 사용하는 세포 조건화의 커플링이 효과적으로 해리된 대표 샘플 생성을 제공한다는 것을 보여준다. 분자 표적에 대한 착색제(생물학적 또는 화학적)의 접근성을 개선시키는 방법은 본 명세서에서 "세포 조건화"라고 한다. 높은 온도(70-100℃)에서 예를 들어, CC1 완충제 또는 CC2 완충제(Ventana) 중 세포 조건화는 종양 조직의 효소적 소화를 돕는다. 시트레이트 완충제에 대한 많은 대안물이 세포 조건화 용액으로서 적용될 수 있다.
부가적 가공 이후 조직 단편의 크기의 한가지 효과적인 측정은 기지의 공극 크기, 예를 들어, 1 미크론 미만(예를 들어, 약 0.5 미크론), 약 1-6 미크론, 약 6-10 미크론, 약 10-20 미크론, 약 20-30 미크론, 약 30-40 미크론, 약 40-100 미크론, 약 100-300 미크론, 약 300-500 미크론, 또는 500 미크론 초과인 메쉬 또는 필터(또는 일련의 이러한 메쉬 또는 필터)를 통해 액체 샘플이 잘 통과하는지를 평가하는 단계를 포함한다. 일 양상에서, 약 1 미크론 내지 약 500 미크론 크기의 범위인 일련의 필터가 균질물 내 세포를 분리시키는데 사용된다. 보다 작은 공극 크기, 예를 들어 1 미크론 미만, 예를 들어 약 0.45 ㎛의 필터를 대표 세포 분획을 생성시킨 후 샘플의 세포 부분 유래의 바이오마커 샘플의 세포하 부분을 분리시키기 위해 사용하는 것이 가능하다. 그러므로, 크기 배제 방법, 예를 들어, 체질이, 기계적 해리 방법(예컨대, 블렌딩 또는 등가물) 이후에, 세포 샘플로부터 바이오마커 샘플을 분리하기 위한 신속한 방법으로서 사용될 수 있다.
대표 샘플 또는 균질물 조성물의 분석
대표 샘플, 예를 들어, 개시된 방법으로 생성된 종양 샘플은 병리학 및 진단에서 사용되는 전통적인 종양 샘플보다 몇몇 장점을 제공하는데, 다음을 포함한다: (i) 그 일부가 고형 조직과 상용성일 수 없는, 몇몇 상이한 진단적 어세이를 위해 대표 샘플을 사용하는 능력; (ii) 낮은 출현율 서브클론을 검출하는 강화된 능력, 즉 전체 종양의 대표 샘플의 생성이 낮은 출현율 서브클론 발견을 억제하는 샘플채취 편향성 이하로 제거시킴; 그리고 (iii) 진단 종양학 실험실에서 샘플 증식을 제거하여, 보다 효율적인 실험식 작업흐름을 생성시킴, 즉 현행 관례는 하나의 블록만을 검사하지만 종양당 3-10개 블록 정도로 많이 만들도록 지시한다.
그러므로, 본 공개는 또한 대표 샘플 또는 균질몰 조성물의 분석 방법에 관한 것이다. 일 양상에서, 분석은 핵산 분석, 단백질 분석, 지질 분석, 세포 분석, 대사물 분석, 게놈 분석, 전사체 분석, 단백체 분석, 대사체학적 분석, 지질체학적 분석, 면역학적 분석, 세포화학적 분석, 유전자형 분석, 표현형 분석, 또는 이의 조합을 포함하거나, 또는 대안적으로 그로 본질적으로 이루어지거나, 또는 그로 더욱 이루어진다. 일 양상에서, 핵산 분석은 DNA 분석 또는 RNA 분석을 포함하거나, 또는 대안적으로 그로 본질적으로 이루어지거나, 또는 그로 더욱 이루어진다. 또다른 양상에서, RNA 분석은 마이크로RNA 분석을 포함하거나, 또는 대안적으로 그로 본질적으로 이루어지거나, 또는 그로 더욱 이루어진다. 상이한 양상에서, 균질물의 분석은 핵산, 단백질, 소기관, 대사물, 화학물질, 비-세포 구성요소, 또는 이의 조합을 정제하는 단계를 포함하거나, 또는 대안적으로 그로 본질적으로 이루어지거나, 또는 그로 더욱 이루어진다.
또다른 실시태양에서, 균질물의 분석은 결합제를 균질물의 구성요소와 결합시키는 단계를 포함하거나, 또는 대안적으로 그로 본질적으로 이루어지거나, 또는 그로 더욱 이루어진다. 일부 양상에서, 결합제는 항체, 방사성 표지, 형광색소, 합텐, 효소, 핵산, 단백질, 화학물질, 프라이머, 리간드, 세포, 펩티드, 프로브, 형광 염료, 비-형광 염료, 효소, 비오틴, 또는 이의 조합을 포함하거나, 또는 대안적으로 그로 본질적으로 이루어지거나, 또는 그로 더욱 이루어진다. 하나의 실시태양에서, 균질물의 구성요소는 핵산, 단백질, 소기관, 대사물, 화학물질, 비-세포 구성요소, 또는 이의 조합을 포함하거나, 또는 대안적으로 그로 본질적으로 이루어지거나, 또는 그로 더욱 이루어진다.
하나의 실시태양에서, 균질물의 분석은 결합제 또는 구성요소로부터 신호를 검출하는 단계를 더 포함하거나, 또는 대안적으로 그로 본질적으로 이루어지거나, 또는 그로 더욱 이루어진다. 일 양상에서, 신호는 방사성 신호 또는 비-방사성 신호를 포함하거나, 또는 대안적으로 그로 본질적으로 이루어지거나, 또는 그로 더욱 이루어진다. 또다른 양상에서, 비방사성 신호는 형광 신호, 화학형광 신호, 또는 발광 신호를 포함하거나, 또는 대안적으로 그로 본질적으로 이루어지거나, 또는 그로 더욱 이루어진다. 추가의 양상에서, 균질물의 분석은 시퀀싱 분석, 조직학 분석, 또는 이미지 분석을 포함하거나, 또는 대안적으로 그로 본질적으로 이루어지거나, 또는 그로 더욱 이루어진다. 일 양상에서, 시퀀싱 분석은 차세대 시퀀싱 분석, 단일-세포 시퀀싱 분석, 및/또는 단일-핵 시퀀싱을 포함하거나, 또는 대안적으로 그로 본질적으로 이루어지거나, 또는 그로 더욱 이루어진다. 또다른 양상에서, 조직학 분석은 차세대 조직학 분석을 포함하거나, 또는 대안적으로 그로 본질적으로 이루어지거나, 또는 그로 더욱 이루어진다. 일 양상에서, 이미지 분석은 차세대 분석을 포함하거나, 또는 대안적으로 그로 본질적으로 이루어지거나, 또는 그로 더욱 이루어진다.
하나의 실시태양에서, 조직 샘플의 제조 방법은 균질물의 구성요소를 검출하거나 또는 정량하는 단계를 더 포함하거나, 또는 대안적으로 그로 본질적으로 이루어지거나, 또는 그로 더욱 이루어지며, 구성요소는 세포, 핵산, 단백질, 소기관, 대사물, 화학물질, 비-세포 구성요소, 또는 이의 조합을 포함한다. 일 양상에서, 세포는 면역 세포, 종양 세포, 줄기 세포, 선조 세포, 혈액 세포, 생식 세포, 및 체세포를 포함하거나, 또는 대안적으로 그로 본질적으로 이루어지거나, 또는 그로 더욱 이루어진다. 또다른 양상에서, 균질물의 분석은 균질물로부터 반사된 편광의 분석을 포함하거나, 또는 대안적으로 그로 본질적으로 이루어지거나, 또는 그로 더욱 이루어진다. 일 양상에서, 균질물의 분석은 균질물의 음향적 특성, 기계적 특성, 또는 광학적 특성의 분석을 포함하거나, 또는 대안적으로 그로 본질적으로 이루어지거나, 또는 그로 더욱 이루어진다. 추가의 양상에서, 균질물은 유세포 분석, 헤마톡실린 및 에오신 염색, 또는 면역조직화학으로 분석된다.
하나의 실시태양에서, 전체 종양 유래의 세포가 바람직한 정도로 해리된 경우, 대표 샘플은 염색, 예를 들어, ISH 또는 ICC 또는 IHC를 위한 준비에서 유리 슬라이드 상에 침착될 수 있다.
모두 세포를 슬라이드 상에 건조시키는 것을 포함하는, 유리 슬라이드 상에 세포를 두는 복수의 방식이 존재한다. 유리 슬라이드 상에 세포의 침착을 가능하게 하는 완충제는 유기 용매(예컨대, 에탄올, 메탄올, 리모넨, 포르말린, 및 아세톤), 비수성 용매(프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 글리세롤, 식물성 오일 예컨대 올리브유, 및 주사용 유기 에스테르 예컨대 에틸 올레에이트), 무기 비수성 용매(예컨대, 액체 암모니아, 액체 이산화황, 설퍼릴 클로라이드 및 설퍼릴 클로라이드 플루오라이드, 포스포릴 클로라이드, 디니트로겐 테트록시드, 안티모니 트리클로라이드, 브로민 펜타플루오라이드, 수소 플루오라이드, 순수 황산 및 다른 무기산), 통상의 완충제(예컨대 PBS, HEPES, MES, PIPES, 시트르산, TAPS, 비신, 트리스, 트리신, TAPSO, TES, MOPS, PIPES, CHES, 카코딜레이트, 카본산, 바이카르보네이트, 또는 TE)에서 물에 이르는 범위이다. 예를 들어, 세포는 유리 슬라이드 상에 균질한 분산을 촉진하고 빠르게 증발되는, 메탄올에 희석될 수 있다.
부가적으로, 다른 고휘발성 용매(예컨대, 아세토니트릴, 옥타놀, 클로로부탄, 또는 기타 HPLC 용매) 및 냉매 액체(예컨대, 카본 테트라클로라이드, 트리클로로플루오로메탄, 디브로모디플루오로메탄, 및 거의 실온의 비등점(예를 들어, 25℃)을 갖는 다른 것들)가 알콜의 용매 효과없이 유리 슬라이드에 세포-기반 대표 세포를 수득하는데 사용될 수 있다.
전형적인 H&E 염색, ISH, 인시츄 PCR, 면역조직화학적(IHC), 조직화학적(HC), 또는 효소-조직화학적(EHC) 방법이 표준 방법을 사용해 수행될 수 있고, 바람직하게 방법을 본 명세서에 기재한다(도 10, 도 11 및 도 14 참조). 본 공개에 따라서 검출 반응에 적용가능한 형식은 블롯팅 기술, 예컨대 웨스턴 블롯, 서던 블롯, 노던 블롯, 면역세포화학적 또는 면역조직화학적 과정일 수 있다. 블롯팅 기술은 당업자에게 공지되어 있고, 전기-블롯, 반건조-블롯, 진공 블롯 또는 도트 블롯으로서 수행될 수 있다. 면역세포화학적/조직화학적 염색 절차는 당업자에게 공지되어 있고, 폴리펩티드의 결합제 매개 검출을 비롯하여 인시츄 하이브리드화 기술을 포함할 수 있다. 양쪽의 상이한 기술은 동시에 적용될 수도 있다. 특정 실시태양에서, 핵산의 하이브리드 포획이 검출에 사용될 수 있다. 증폭 반응이 또한 예를 들어 핵산 분자의 검출에 적용될 수 있다.
인시츄 하이브리드화(ISH)는 ISH의 많은 단계들이 정밀한 시간 동안 조심스럽게 온도 제어되어야 하므로, 다른 기술과 조합하거나, 또는 단독으로 본 공개에 유리하게 적용될 수 있는 기술이다. 특정 시간 동안 정확한 열의 양이 DNA를 충분히 변성시키는데 필요하여서 후속 하이브리드화가 과열없이 세포 형상이 분해되는 지점까지 일어날 수 있다. 상이한 시료는 조직을 어떻게 준비하고 고정하였는지에 따라 상이한 온도를 사용해 변성될 수 있다. 변성, 하이브리드화, 및 하이브리드화후 세척의 단계는 시험하려는 특정 프로브 및 조직에 좌우될 수 있는 상이한 온도에서 실시될 수 있다. 이들 온도는 이전에 기술된 바와 같이, 가열기의 개별 제어를 통해 제어될 수 있다. DNA 프로브는 전형적으로 30℃ 내지 55℃에서 혼성화되는 한편, RNA 프로브는 표적 카피수, 프로브 크기 및 시료 유형에 따라 30분 내지 24시간 동안 다양하게 하이브리드화를 위한 시간으로 높은 온도에서 하이브리드화된다. 세포유전학적 제조를 위한 표준 변성은 2분간 약 72℃에서 수행되는 반면, 조직 절편의 경우 조건은 2분 내지 30분간 55℃ 내지 95℃로 다양할 수 있다. 하이브리드화후 세척 온도는 2분 내지 15분간 약 37℃ 내지 72℃로 다양할 수 있다. 염 농도는 0.1x 내지 2x SSC로 다양할 수 있다. 프로브 검출 온도는 2분 내지 30분간 대기 온도 내지 42℃로 다양할 수 있다.
ISH는 DNA, cDNA, 및 고카피수 mRNA를 검출하는데 적용될 수 있다. 이는 도말시료, 조직, 세포주 및 동결 절편, 및 본 공개에서, 개시된 방법에 따라 생성된 대표 샘플뿐만 아니라 대표 방법을 포함하는 조성물에도 적용될 수 있다. 전형적으로 시료는 1" x 3" 유리 슬라이드에 장착된다.
바이오마커의 IHC-기반 검출의 한가지 장점은 DAB 검출의 민감도이다. 이 방법을 사용하여 혼합된 세포 개체군중 매위 희귀한 사건을 검출할 수 있다. 예를 들어, 본 발명자들은 전체 샘플의 공간적으로 구별되는 구성요소인 소수의 서브클론(즉, 전체 조직 부피의 0.1% 보다 약간 더 존재하는 Her-2 양성 세포)을 20x 배율에서 이미지화 시 개시된 방법에 따라 생성된 대표 샘플에서 명확하게 볼수있었다는 것을 보여주었다. 실시예 1 및 도 6A-6D를 참조한다. 더욱이, 본 발명자들은 소수의 서브클론(전체 샘플의 0.015% 수준으로 해리된 편도선 조직의 대량 샘플에 존재하는 bRaf 돌연변이체 발현 이종이식 종양)이 또한 명확하게 검출되었음을 보여주었다. 실시예 4 및 도 16을 참조한다.
DAB-기반 IHC 염색이외에도, 모든 표준 슬라이드 기반 어세이가 균질화된 종양 샘플의 사용에 적합하다. 예를 들어, 본 발명자들은 다중 IHC(단일 염색 과정에서 검출된 3개 항체 사용), RNA-기반 ISH 및 DNA ISH가 개시된 방법에 따라 생성된 대표 샘플을 분석하는데 사용될 수 있다는 것을 보여주었다. 실시예 3 및 도 11 및 12를 참조한다.
본 공개에 따른 검출 과정은 세포 또는 세포 구획의 발색 또는 형광발광 염색을 일으키는 세포화학적 염색 과정을 더 포함한다. 이러한 염색 과정은 당업자에게 공지되어 있고, 예를 들어 세포학적 시료 중 특이적 분자(염색체, 지질, 당단백질, 다당류 등)의 하위 세포 영역(예를 들어, 핵, 미토콘드리아, 골지, 세포질 등)의 호산성 또는 호염기성 구조에 대한 염색을 포함할 수 있다. 형광발광 염료, 예컨대 DAPI, 퀴나크린, 크로모마이신 등이 적용될 수 있다. 게다가, 발색성 염료 예컨대 아잔, 아크리딘-오렌지, 헤마톡실린, 에오신, 수단-레드, 티아진-착색제(톨루이딘-블루, 티오닌)가 적용될 수 있다. 다른 실시태양 염색 과정, 파프-염색, 김자(Giemsa)-염색, 헤마톡실린-에오신 염색, 반-기손(van-Gieson) 염색, 쉬프(Schiff)-염색(쉬프 시약 사용), 금속의 침전을 적용하는 염색 과정(예컨대, 예를 들어 은 나이트레이트를 적용하는 염색 과정의 은) 또는 불용성 착색제 예컨대 예를 들어 턴불스-블루(turnbulls-blue)(또는 다른 불용성 금속 시아나이드) 등이 본 명세서에 개시된 바와 같은 방법의 과정에서 사용될 수 있다. 지명된 염료 및 염색 방법은 적용가능한 방법의 예이며 당분야에 공지된 임의의 다른 방법이 본 명세서에 개시된 바와 같은 방법에 적용될 수 있다는 것을 이해해야 한다.
염색 과정은 광학 현미경 조사를 위한 발색성 착색제 또는 현광 현미경 조건 하에서 조사를 위한 형광 착색제를 생성시킬 수 있다. 본 공개의 또다른 실시태양에서, 방사성 방출 과정, 샘플 중 세포학적 상태의 이미지화를 위해 방사선 또는 기타 대비 매질의 투과를 손상시키는 물질을 적용하는 과정(예를 들어, 수단, 예컨대(미세) 방사선사진촬영 또는 (미세)방사선 사진 생성에 의한 광학적 인상의 생성)이 본 공개에 따른 방법을 위해 사용될 수 있다.
모든 염색 및 이미지화 과정은 현미경적 과정을 비롯하여 자동화 분석 과정 예컨대 유세포분석, 자동화 현미경(컴퓨터 또는 컴퓨터 보조, 예컨대 전체 슬라이드 스캐너) 분석 또는 세포학적 지표의 분석을 위한 임의의 다른 방법에서의 분석을 위해 사용될 수 있다. "자동화" 또는 "자동"은 실질적으로 컴퓨터 또는 기계가 구동되고 실질적으로 인간 중재가 없는 활동을 의미한다.
추가적 진단 방법은 제한없이, 단백질의 ELISA-기반 검출, 특이적 세포 유형의 친화도 정제 등을 포함하여, 대표 샘플 및 대표 샘플을 포함하는 조성물에 적용될 수 있다. 본 공개의 수많은 진단적 및 치료적 적용을 더욱 예시하기 위해서, 본 공개는 본 발명의 대표 샘플 및 그로부터 단리된 하위샘플 또는 구성요소, 예를 들어 세포, 핵산 단백질, 지질 등으로 실시할 수 있는 다양한 기술의 추가적인 개요를 하기에 제공한다.
대표 샘플 또는 균질물 조성물을 사용한 다중화 및 뱃칭 접근법
일 양상에서, 단일 환자로부터 수득된 단일 샘플로부터 제조된 대표 샘플은 본 명세서에 개시된 임의의 방법 및/또는 당분야에 공지된 기타 유사한 방법을 사용하여 후속 진단적 분석에 사용될 수 있다. 환자로부터 수득된 샘플은 균질화 및 선택적 추가 가공, 예를 들어 체질 이전에 소형 분자로 표지될 수 있다. 샘플에 소형 분자 표지를 도입하여, 샘플이 이제 동일환자 유래의 다른 조직 및/또는 종양 샘플뿐만 아니라 상이한 환자로부터 수득된 조직 및/또는 종양 샘플을 포함하는 다른 샘플과 구별될 수 있고, 따라서 이러한 표지 접근법을 사용해, 상이한 대표 샘플이 다중 어세이 형식에서 사용될 수 있다.
예를 들어, 제1 종양, 제2 종양, 및 제3 종양이 제1 환자로부터 수득될 수 있다. 제1 종양은 제1 소형 분자로 표지될 수 있고, 제2 종양은 제2 소형 분자로 표지될 수 있으며, 제3 종양은 제3 소형 분자로 표지될 수 있어서, 이러한 소형 분자가 서로 구별가능하다. 표지된 제1 종양, 제2 종양 및 제3 종양은 이후, 단독으로 또는 조합하여 균질화될 수 있고, 최종 "혼합" 균질물은 각 종양의 대표 샘플을 함유한다.
동일한 "뱃칭" 접근법은 동일한 환자 유래의 복수 림프절 샘플 및/또는 동일한 환자 유래의 종양 및 림프절 샘플의 조합을 사용한 다중 어세이를 수행하는데 사용될 수 있다.
또다른 양상에서, 환자로부터 수득된, 샘플, 예를 들어, 종양 또는 림프절은 절편화되고 각 절편은 공간적 정보를 갖는 대표 샘플을 생성시키기 위해 절편을 조합하여 집합적으로 균질화시키기 전에 소형 분자로 처리된다. 예를 들어, 샘플(예컨대 종양 또는 림프절)은 사분면으로 절단될 수 있고 상이한 합텐(또는 다른 적합한 소형 분자)은 절편을 집합적으로 균질화하기 전에 각 사분면에 "도핑"될 수 있는데, 예를 들어 각 표지된 절편을 블렌더에 넣고 균질화시켜 공간적 정보를 갖는 대표 샘플을 생성시킨다. 균질화 이전에 "도핑"을 위한 각 샘플로부터 생성될 수 있는 절편의 수는 제한되지 않으나, 아마도 샘플의 크기에 비례하여 선택되며, 즉 샘플이 클수록, 균질화 이전에 소형 분자가 "태그화"될 수 있는 절편의 수가 크다는 것을 이해해야 한다. 예를 들어, 종양 및/또는 림프절 샘플은 2 절편, 3 절편, 4 절편, 5 절편, 6 절편, 7 절편, 8 절편, 10 절편, 15 절편, 20 절편, 25 절편, 30 절편, 35 절편, 40 절편, 45 절편, 50 절편, 55 절편, 60 절편, 65 절편, 70 절편, 75 절편, 80 절편, 85 절편, 90 절편, 95 절편, 100 절편, 또는 그 이상을 형성하도록 절편화될 수 있다. 다시, 각 샘플로부터 제조된 절편의 수는 샘플 크기에 따라 다양할 수 있다. 예를 들어, 대략 2 cm 종양 샘플이 사분면으로 절편화될 수 있고, 이들 각각은 상이한 소형 분자로 표지되는 한편, 50 cm 종양(예컨대, 위 종양)은 100 절편으로 절편화될 수 있으며, 각각은 상이한 소형 분자로 표지된다.
동일한 환자 또는 상이한 환자 유래의 상이한 샘플의 임의 수를 조합하고 다중화시키고, 각 샘플이 상이한 표지, 예를 들어, 적어도 2 표지, 적어도 3 표지, 적어도 4 표지, 적어도 5 표지, 적어도 6 표지, 적어도 7 표지, 적어도 8 표지, 적어도 10 표지, 적어도 15 표지, 적어도 20 표지, 적어도 25 표지, 적어도 50 표지, 적어도 75 표지, 적어도 100 표지 등으로 처리될 수 있다는 것을 이해해야 한다.
샘플, 예컨대 단일 또는 복수 대상체로부터 유래된 전체 종양으로부터 제공된 종양 샘플, 또는 단일 또는 복수 대상체로부터 유래된 종양의 절편은 조사 중인 종양 샘플의 기원을 동정하기 위해 소형 분자(들)(예컨대, 제한없이 예를 들어 합텐, 펩티드 태그, 단백질 태그, 형광 태그, 또는 핵산 태그)에 접합될 수 있다.
접합은 문헌 [Lemus and Karol, Method Mol Med. 2008;138:167-82](그 전체가 참조로 본 명세서에 포함됨)에 상세히 기술된 바와 같이 다양한 기전의 사용을 통해 일어날 수 있다. 이러한 접합 방법은 제한없이, 이소시아네이트 또는 언하이드라이드로서 특징되는 합텐이 관여하는 자발적 화학 반응, 카르복실기를 보유하는 합텐이 관여하는 활성화된 화학 반응, 합텐 및 카르보이미드 또는 합텐 및 글루타르알데히드가 관여하는 가교 반응을 포함할 수 있다. 접합의 부가적 수단은 디이소시아네이트 및 다음의 반응 기 중 하나: α-NH2, ε-NH2Lys, α-COOH, SH-Cys; 산 언하이드라이드 및 다음의 반응기 중 하나: α-NH2, ε-NH2Lys, α-COOH, SH-Cys; 2,4,6 트리니트로벤젠 술폰산(TNBS) 및 다음의 반응기 중 하나: α-NH2 및 ε-NH2Lys; 방향족 아미노산 및 티로신(방향족 아미노산이 디아조늄 기로 전환됨); 탄수화물 및 α-NH2 또는 ε-NH2Lys(커플링이 산성 탄수화물의 카르복실 기인, 환원 말단을 통해서, 또는 히드록실 기를 통해 일어날 수 있음); 시아노겐 브로마이드 및 α-NH2 또는 ε-NH2Lys(시아노겐 프로바이드에 의해 활성화된 탄수화물이 자발적으로 아미노기와 커플링됨); 또는 혼합된 언하이드라이드 및 α-NH2 또는 ε-NH2Lys(R-COOH가 이소부틸클로로카르보네이트와 언하이드라이드로 전환됨)의 사용을 통해 일어날 수 있다.
종양 또는 종양 절편 샘플에 소형 분자의 접합의 추가 형태는 제한없이 NHS-에스테르 반응(아민 결합이 형성), 발레이미드 반응(티오에테르 결합이 형성), 히드라지드 반응(히드라존 연결이 형성됨), 또는 EDC 커플링 반응(아미드 결합을 형성)과 같은 화학적 반응을 통해 일어날 수 있다. 부가적으로, 종양 또는 종양 절편 샘플 또는 림프절 또는 림프절 절편에 소형 분자의 접합은 동종이작용성 또는 이종이작용성 가교제(이의 예는 제한없이, 술포-SMCC, DSS, 또는 술포-SBED)의 사용을 통해 일어날 수 있다.
식별자로서 사용할 수 있는 소형 분자의 예는 합텐을 포함할 수 있다. 전형적으로 사용되는 합테의 예는 딕옥시게닌, 2,4-디니트로페닐, 비오틴, 또는 아비딘이거나, 또는 아졸, 니트로아릴 화합물, 벤조푸라잔, 트리터펜, 우레아, 티오우레아, 로테논, 옥사졸, 티아졸, 쿠마린, 시클로리그난, 헤테로비아릴 화합물, 아조아릴 화합물 또는 벤조디아제핀으로부터 선택되는 합텐이다. 합텐의 추가 예는 제한없이, 2,4-디니트로페닐, 니트로피라졸 및 티아졸 술폰아미드를 포함할 수 있다. 그 전체가 참조로 본 명세서에 편입되는 WO2014139979를 참조한다. 사용할 수 있는 합텐의 부가적 예는 제한없이, 아졸(예를 들어, 옥사졸, 피라졸, 티아졸), 벤조푸라잔, 트리터펜, 우레아, 로다민 티오우레아 이외의 티오우레아, 디니트로페닐 또는 트리니트로페닐 이외의 니트로아릴, 로테노이드, 시클로리그난, 헤테로비아릴, 아조아릴, 벤조디아제핀, 또는 쿠마린(예를 들어, 2,3,6,7-테트라히드로-11-옥소-1H,5H,11H-[l]벤조피라노[6,7,8-ij]퀴놀리진-10-카르복실산 또는 7-디에틸아미노-3-카르복시쿠마린)으로부터 선택된 것을 포함한다. 그들 전체로 참조로 본 명세서에 편입되는 WO2012003476 및 WO2008063378을 참조한다. 사용할 수 있는 합텐의 다른 예는 제한없이 비오틴, 우루시올, 히드랄라진, 플루오레세인, 딕옥시게닌, 디니트로페놀, 2,4-디클로로페녹시아세트산, 2-클로로-4-(에틸아미노)-6-(이소프로필아미노)-s-트리아진, 니코틴, 몰핀, 구조적으로 관련된 s-트리아진, 설코푸론, 플루코푸론, 아가타레시놀, 세퀴린 C, 서지레시놀, 히드록시서지레시놀, 히노키레시놀, 코니페릴 알코올, p-쿠마르산, 히노키닌, 구아이아실글리세롤-베타-구아이아실 에테르, 몰핀-3-글루쿠로니드(M3G), 코데인, 노르-코데인, 6-모노아세틸몰핀,(+) 메탐페타민, 세프타지딤, 페노바비탈, p-히드록시페노바비탈, p-아미노페노바비탈, 헥사메틸렌 디이소시아네이트, 시클로바비탈, 3'-케토시클로바비탈, 3'-히드록시시클로바비탈, 세코바비탈, 바비탈, 메탈비탈, 바비투르산, 티오펜탈, 티오바비투르산, 프리미돈, 글루테티미드, 펜토바비탈, 디아세틸몰핀, 몰핀-6-글루쿠로니드(M6G), L-11-알릴-1,2,3,9,10,10a-헥사히드로-4H-10,4a-이미노에타노펜안트렌-6-올, 날록손, 페티딘, 벤조일렉고닌, 5-벤지미다졸카르복실산, 덱사메타손, 플루메타손, 베타메타손, 9-알파-플루로프레드니솔론, 데속시메타손, 트리암시놀론, 프레드니솔론, 플루오콜톨론, 콜티솔, 프레드니손, 콜티손, 메틸프레드니솔론, 트리암시놀론 헥사세토니드, 카르보퓨란, BFNP(3-[[(2,3-디히드로-2,2-디메틸-7-벤조푸라닐옥시)카르보닐]아미노]프로판산), 2,3-디히드로-2,2-디메틸-7-벤조푸라놀, 벤디오카브, 카르바릴, 메티오카르브, 프로폭술, 알디캅, 메토밀, 베날아실, Bn-Ba(4-[2-(N-페닐아세틸-N-2,6-자일릴아미노)프로피온아미도]부티르산), Bn-COOH(4-[2-(N-페닐아세틸-N-2,6-자일릴-DL-알라닌), Bn-HG, 푸랄락실, 메탈락실, 아세토클롤, 디메타클롤, 메토라크롤, 디에타틸-에틸, 벤조일프로프-에틸, 프로파클롤, 2,4,5-트리클로로페녹시아세트산, 2,4-디클로로페녹시부티르산(2,4-DB), MCPA, 디클로르프로프(2,4-DP), 1-[(2-클로로)페닐술포닐]모노아미도숙신산, 클로르설푸론 클로르브로무론, 아미도설푸론, 클로르톨루론, 이소프로투론, 디우론, 리누론, O-메틸-O-(4-니트로페닐)-N-(4-카르복시부틸)-포스포르아미도티오에이트, 파라티온-메틸, 파라티온-에틸, 페니트로티온, 펜티온, 프로보포스, 클로르피리포스-메틸, 산화 파라티온-메틸, 파라옥손, 디아지논, 아진포스-메틸, 피리미포스-메틸, 메티다티온, 디메틸클로로로티오포스페이트, 4-니트로페놀, 2-니트로페놀, 2-클로로페놀, 4-클로로-3-메틸페놀, 페니트록손, 3-메틸-4-니트로페놀, 노닐페놀, HOM(3-[2-히드록시-5니트로 벤질티오] 프로피온산, 델로르 103, 2,4,4'-트리클로로비페닐, 2-(5- 카르복시펜타노일아미노)-4,4'-디클로로비페닐, 4-클로로페녹시아세트산, 2- 클로로페녹시아세트산, 1,1,1-트리클로로-2, 2-비스-(p-클로로페닐)에탄, 1,1-디클로로-2, 2-비스(p-클로로페닐)에틸렌, 비타민 D2, 비타민D3, 데에틸히드록시아트라진(DEHA), 플루오레세인 이소티오시아네이트, 메타네프린, 프로파진, 터부틸라진, 아메트린(2-에틸아미노-4-이소프로필아미노-6-메틸티오-1,3,5-트리아진, 시아나진, OH-터부틸라진 히드록시트리아진(EQ-0027), 아트라톤, 아트라진 머캅투르산(AM), N4-아세틸-설파메타진, 2,4-디클로로페놀, 4-브로모페놀, 아목시실린, 6-아미노-페니실란산(6-APA), 아즐로실린, 바캄피실린, 카르베니실린, 페니실린, 1-벤질-3-(4-니트로페닐)우레아, 1-(3-클로로페닐)-3-(2-메톡시-5-니트로페닐)우레아, 1-(3-클로로페닐)-3-(4-메톡시-3-니트로페닐)우레아, 1-(4-클로로페닐)-3-(4-니트로페닐)우레아, 카르보퓨란-페놀, 카르보설판, 벤푸라캅, 엔드린, 넨드린, 헵타클롤, 클로르단, 엔도설판, 알드린, 디엘드린, 펜발레레이트 이성질체, 티아벤다졸, 티아벤다졸 유도체, 알벤다졸, 메벤다졸, 펜벤다졸, 캄벤다졸, 펜발레레이트 합텐, 피리미포스-에틸, 4-(메틸티오)-m-크레소, 클로르피리포스-옥손, 펜클로르포스, 트리클로로네이트, 디클로펜티온, 파라티온, 트리아디메폰, 디플루벤주론, 메톨라존, 퍼푸릴 벤조에이트, 파라콰트, 디에틸카르바마진, 2,4,6-트리페닐-N-(4-히드록시페닐)-피리디늄, o-DNCP, PCB 콘제너, 1-2-디클로로벤젠, 레트로네신, 디코폴, 테트라코나졸, 2-(2,4-디클로로페닐)-3-(1H-1,2,4-트리아졸-1-일)프로판올, 이마잘릴, 페나리몰, 및 루파닌 대사물을 포함한다. 추가의 예는 그들 전체로 참조로 둘 모두가 본 명세서에 편입되는, 하기 문헌들을 참조한다: Singh M.K., Srivastava S., Raghava G.P.S. and Varsheny G.C.(2004) HaptenDB. Nucleic Acid Research, and Singh M. et. al. HaptenDB: a comprehensive database of haptens, carrier protein and anti-hapten antibodies. Bioinformatics. 2006, 22: 253-255.
추가의 소형 분자 식별자는 제한없이, 형광발광성 분자 또는 형광색소(예컨대 Invitrogen에서 판매하는 것, 예를 들어, 문헌 [The Handbook--A Guide to Fluorescent Probes and Labeling Technologies, Invitrogen Detection Technologies, Molecular Probes, Eugene, Oreg], 또는 미국 특허 제5,866,366호(Nazarenko et al.)에 개시된 것, 예컨대 4-아세타미도-4'-이소티오시아나토스틸벤-2,2'디술폰산, 아크리딘 및 유도체 예컨대 아크리딘 및 아크리딘 이소티오시아네이트, 5-(2'-아미노에틸)아미노나프탈렌-1-술폰산(EDANS), 4- 아미노-N-[3-비닐술포닐)페닐]나프탈리미드-3,5 디술포네이트(루시퍼 옐로우 VS), N-(4- 아닐리노-1-나프틸)말레이미드, 안트라닐아미드, 브릴리언트 옐로우, 쿠마린 및 유도체 예컨대 쿠마린, 7-아미노-4-메틸쿠마린(AMC, 쿠마린 120), 7-아미노-4-트리플루오로메틸쿨루아린(쿠마란 151); 시아노신; 4',6-디아미니디노-2-페닐인돌(DAPI); 5',5''-디브로모피로갈롤-술폰프탈레인(프로모피로갈롤 레드); 7-디에틸아미노-3-(4'-이소티오시아네이토페닐)-4-메틸쿠마린; 디에틸렌트리아민 펜타아세테이트; 4,4'-디이소티오시아네이토디히드로-스틸벤-2,2'-디술폰산; 4,4'-디이소티오시아나토스틸벤-2,2'-디술폰산; 5-[디메틸아미노]나프탈렌-1-술포닐 클로라이드(DNS, 단실 클로라이드); 4-(4'-디메틸아미노페닐아조)벤조산(DABCYL); 4-디메틸아미노페닐아조페닐-4'-이소티오시아네이트(DABITC); 에오신 및 유도체 예컨대 에오신 및 에오신 이소티오시아네이트; 에리트로신 및 유도체 예컨대 에리트로신 B 및 에리트로신 이소티오시아네이트; 에티듐; 플루오레세인 및 유도체 예컨대 5-카르복시플루오레세인(FAM), 5-(4,6-디클로로트리아진-2-일)아미노플루오레세인(DTAF), 2'7'-디메톡시-4'5'-디클로로-6-카르복시플루오레세인(JOE), 플루오레세인, 플루오레세인 이소티오시아네이트(FITC), 및 QFITC(XRITC); 2',7'-디플루오로플루오레세인(OREGON GREEN®); 플루오레사민; IR144; IR1446; 말라카이트 그린 이소티오시아네이트; 4-메틸엄벨리페론; 오르쏘 크레솔프탈레인; 니트로티로신; 파라로사닐린; 페놀 레드; B-피코에리쓰린; o-프탈디알데히드; 피렌 및 유도체 예컨대 피렌, 피렌 부티레이트 및 숙신이미딜 1-피렌 부티레이트; 리액티브 레드4(Cibacron®. 브릴리언트 레드 3B-A); 로다민 및 유도체 예컨대 6-카르복시-X-로다민(ROX), 6-카르복시로다민(R6G), 리사민 로다민 B 술포닐 클로라이드, 로다민(Rhod), 로다민 B, 로다민 123, 로다민 X 이소티오시아네이트, 로다민 그린, 술포로다민 B, 술포로다민 101 및 술포로다민 101의 술포닐 클로라이드 유도체(텍사스 레드); N,N,N',N'-테트라메틸-6-카르복시로다민(TAMRA); 테트라메틸 로다민; 테트라메틸 로다민 이소티오시아네이트(TRITC); 리보플라빈; 로솔산 및 터븀 킬레이트 유도체, 대략 617 nm에서 발광하는 티올-반응성 유로퓸 킬레이트(Heyduk and Heyduk, Analyt. Biochem. 248:216-27, 1997; J. Biol. Chem. 274:3315-22, 1999), 뿐만 아니라 GFP, 리사민TM, 디에틸아미노쿠마린, 플루오레세인 클로로트리아지닐, 나프토플루오레세인, 4,7-디클로로로다민 및 잔텐(미국 특허 제5,800,996호(Lee et al.)에 기술된 바와 같음) 및 이의 유도체, 알렉사 플루오르 시리즈의 염료(예를 들어, 미국 특허 제5,696,157호, 제6,130,101호 및 제6, 716,979호에 기술된 것), BODIPY 시리즈의 염료(디피로메텐보론 디플루오라이드 염료, 예를 들어, 미국 특허 제4,774,339호, 제5,187,288호, 제5,248,782호, 제5,274,113호, 제5,338,854호, 제5,451,663호 및 제5,433,896호에 기술된 것), 캐스캐이드 블루(미국 특허 제5,132,432호에 기술된 술포네이트된 피렌의 아민 반응성 유도체) 및 마리나 블루(미국 특허 제5,830,912호), 형광 나노입자(예컨대, 반도체 나노결정, 예를 들어, 양자점™(예를 들어, QuantumDot Corp, Invitrogen Nanocrystal Technologies, Eugene, Oreg.에서 수득; 또한 미국 특허 제6,815,064호, 제6,682,596호 및 제6,649,138호 참조), 나노입자(예컨대 양자점, 상자성 나노입자, 초상자성 나노입자, 및 금속 나노입자, 바람직하게는 합금 양자점으로서, 예로서 제한없이, CdSe, ZnSSe, ZnSeTe, ZnSTe, CdSSe, CdSeTe, ScSTe, HgSSe, HgSeTe, HgSTe, ZnCdS, ZnCdSe, ZnCdTe, ZnHgS, ZnHgSe, ZnHgTe, CdHgS, CdHgSe, CdHgTe, ZnCdSSe, ZnHgSSe, ZnCdSeTe, ZnHgSeTe, CdHgSSe, CdHgSeTe, InGaAs, GaAlAs, 및 InGaN을 예로 포함함), 미국 특허 제6,602,671호, [Bruchez et. al.(1998) Science 281:2013-6], [Chan et al.(1998) Science 281:2016-8], 및 미국 특허 제6,274,323호, 미국 특허 제6,927,069호; 제6,914,256호; 제6,855,202호; 제6,709,929호; 제6,689,338호; 제6,500,622호; 제6,306,736호; 제6,225,198호; 제6,207,392호; 제6,114,038호; 제6,048,616호; 제5,990,479호; 제5,690,807호; 제5,571,018호; 제5,505,928호; 제5,262,357호 및 미국 공개 특허 출원 제2003/0165951호 뿐만 아니라 PCT 공개 특허 출원 제99/26299호(1999년 5월 27일 공개)에 기술된 반도체 나노결정, 방사성 동위원소(예컨대 3H), 금속 킬레이트 예컨대 방사성 또는 상자성 금속 이온의 DOTA 및 DPTA 킬레이트 예컨대 Gd3+,및 리포솜, 효소, 예를 들어 홀스래디쉬 퍼옥시다제, 알칼리 포스파타제, 산 포스파타제, 글루코스 옥시다제, β-갈락토시다제, β-글루쿠로니다제 또는 β-락타마제, 검출가능한 신호를 발생시키는 발색제, 형광발광제 또는 발광제와 조합된 효소, 예를 들어, 인비트로젠 코포레이션(Eugene Oreg.)에서 판매하는 것, 발색성 화합물(디아미노벤지딘(DAB), 4-니트로페닐포스페이트(pNPP), 패스트 레드, 브로모클로로인돌릴 포스페이트(BCIP), 니트로 블루 테트라졸륨(NBT), BCIP/NBT, 패스트 레드, AP 오렌지, AP 블루, 테트라메틸벤지딘(TMB), 2,2'-아지노-디-[3-에틸벤조티아졸린 술포네이트](ABTS), o-디아니시딘, 4-클로로나프톨(4-CN), 니트로페닐-베타-D-갈락토피라노시드(ONPG), o-페닐렌디아민(OPD), 5-브로모-4-클로로-3-인돌릴-베타-갈락토피라노시드(X-Gal), 메틸엄벨리페릴-베타-D-갈락토피라노시드(MU-Gal), p-니트로페닐-알파-D-갈락토피라노시드(PNP), 5-브로모-4-클로로-3-인돌릴-베타-D-글루쿠로니드(X-Gluc), 3-아미노-9-에틸 카르바졸(AEC), 푹신, 요오도니트로테트라졸륨(INT), 테트라졸륨 블루 및 테트라졸륨 바이올렛을 포함한다.
소형 분자는 서로 조합하여 검출되거나 또는 직접적으로 검출될 수 있다. 예를 들어, 합텐이 양자점에 결합되면, 양자점은 특징적인 파장에서 이의 형광발광에 의해 검출될 수 있다. 다른 예에서, 합텐의 검출은 샘플과 항합텐 항체 및 검출가능한 표지를 접촉시키는 단계, 및 표지를 검출하는 단계를 포함한다. 특정 실시태양에서, 검출가능한 표지는 항합텐 항체에 접합되어 항합텐 항체-표지 접합체를 형성시키고, 접합체는 합텐에 결합한다. 다른 예에서, 샘플은 합텐에 결합하는 항합텐 항체와 접촉한다. 다음으로, 샘플을 항합텐 항체에 결합할 수 있는 항체 접합체와 접촉시키고, 항체 접합체는 검출가능한 표지 또는 검출가능한 표지 시스템의 구성요소를 포함한다. 특정 예에서, 검출가능한 표지 시스템의 구성요소는 효소, 예컨대 홀스래디쉬 퍼옥시다제 또는 알칼리 포스파타제로서, 발색성 기질 또는 기질/발색제 복합체와 반응하여 검출가능한 발색성 침착물을 생성시킨다. 다른 예에서, 표지는 형광 표지, 예컨대 양자점이다. 그 전체로 본 명세서에 편입되는 WO2012003476을 참조한다.
상이한 대상체로부터 유래된 종양 샘플을 포함하는 혼합 균질물 내에서 종양 샘플 기원의 동정을 위한 추가 수단은 DNA 바코딩의 사용을 포함할 수 있다. DNA 바코딩은 이를 동정하기 위해 유기체의 DNA 내 짧은 유전자 마커를 사용하는 분류 방법이다. 차세대 DNA 시퀀싱 방법과 조합하여, 기원하는 대상체에 특이적인 DNA 서열의 검출을 통해 기원한 이의 대상체와 관련하여 샘플의 정체를 결정하는 것이 가능할 수 있다. 부가적으로, 대상체로부터 직접적으로 유래되지 않은 독특한, 인공 DNA 서열을 상이한 기원의 다른 종양 샘플과 조합하기 전에 대상체로부터 유래된 샘플에 접합시킬 수 있고, 이러한 독특한 인공 DNA 바코드는 조사 중인 샘플의 기원을 동정하기 위해 DNA 서열 분석으로 이후에 판독될 수 있다는 것이 가능하다.
유사하게, 동일한 대상체로부터 유래된 상이한 샘플 또는 상이한 대상체로부터 유래된 종양 샘플을 포함하는 혼합된 균질물에서 대상체 동정을 위한 부가적인 수단은 종양 절편 샘플에 접합된 친화도 태그(예를 들어, 제한없이 펩티드 태그 및 단백질 태그를 포함할 수 있는 단백질 정제 실험실 과정 동안 일반적으로 사용되는 것)의 사용을 포함할 수 있다. 친화도 태그는 DNA 바코딩의 원리와 유사하게, 조사 중인 샘플의 기원을 결정하기 위해 샘플 분석의 바람직한 시점에 동정될 수 있다. 이러한 친화도 태그는 제한없이 펩티드 태그 또는 단백질 태그 예컨대 펜타-히스티딘, 테트라-히스티딘, 글루타티온 세파로스 트랜스퍼라제, CBP, CYD(공유적이지만 해리가능한 NorpD 펩티드), Strep II, FLAG, HPC(단백질 C의 중쇄), SUMO, AviTag, 칼모듈린-태그, 폴리글루타메이트 태그, E-태그, HA- 태그, Myc-태그, S-태그, SBP-태그, Softag 1, Softag 3, TC 태그, V5 태그, VSV-태그, Xpress 태그, Isopeptag, MBP, SpyTag, BCCP, 그린 형광 단백질 태그, 할로-태그, Nus-태그, 티오레독신-태그, Fc-태그, 및 Ty 태그를 포함한다.
제한없이, 염색, 면역조직화학적 염색, 유세포 분석, FACS, 형광발광-활성화 액적 분류법, 이미지 분석, 하이브리드화, DASH, 분자 비콘, 프라이머 연장법마이크로어레이, CISH, FISH, 파이버 FISH, 정량적 FISH, 유동성 FISH, 비교 게놈 하이브리드화, 블롯팅, 웨스턴 블롯팅, 서던 블롯팅, 이스턴 블롯팅, 파-웨스턴 블롯팅, 사우쓰웨스턴 블롯팅, 노쓰웨스턴 블롯팅, 및 노던 블롯팅, 효소적 어세이, ELISA, 리간드 결합 어세이, 면역침전법, 염색질 면역침전법(ChIP), ChIP-seq, ChIP-ChiP, 방사성면역어세이, 형광발광 편광법, FRET, 표면 플라스몬 공명, 필터 결합 어세이, 친화도 크로마토그래피, 면역세포화학, 전기영동적 어세이, 핵산 전기영동, 폴리아크릴아미드 겔 전기영동, 자연 겔 방법, 자유 유동성 전기영동, 등전점 포커싱법, 면역전기영동, 전기영동적 이동성 이동 어세이, 제한 단편 길이 다형성 분석, 자이모그라피, 유전자 발현 프로파일링, PCR에 의한 DNA 프로파일링, DNA 마이크로어레이, 유전자 발현의 연속 분석, 실시간 중합효소 연쇄 반응, 차등적 디스플레이 PCR, RNA-seq, 질량 분광법, DNA 메틸화 검출, 음향 에너지, 지질체학-기반 분석, 면역 세포의 정량화, 암-연관 마커의 검출, 특이적 세포 유형의 친화도 정제, DNA 시퀀싱, 차세대 시퀀싱, 암-연관 융합 단백질의 검출, 및 화학요법 내성-연관 마커의 검출을 포함하는 임의 수의 분석 어세이가 "혼합된" 균질물을 사용하여 실시될 수 있다.
다중 어세이가 종종 반드시는 아니지만, 고수율 스크리닝 어세이에 사용된다. 예시적 다중 어세이 기술은 핵산-기반 다중 방법(예컨대, 유전자 발현 또는 SNP 검출 어세이에 사용되는 DNA 마이크로어레이; 유전자 발현을 위한 SAGE; 고수율 시퀀싱(예컨대 NGS); 다중 PCR; 다중 결찰-의존적 프로브 증폭(MLPA); 결찰에 의한 DNA 시퀀싱; 및 비드-기반 다중화(예컨대, 루미넥스/LAMP)) 및 단백질-기반 다중 방법(예컨대 단백질 마이크로어레이, 항체 마이크로어레이, 항원 마이크로어레이, 항체 프로파일링, 및 비드-기반 다중화(예컨대, 루미넥스/LAMP)) 뿐만 아니라 다른 다중 방법(예컨대 조직 마이크로어레이, 세포 마이크로어레이, 화학적 화합물 마이크로어레이, 바이오마커 분석, 및 ELISA)을 포함한다.
추가 분석 기술의 개요
예를 들어, 본 명세서에 기술된 임의 방법으로 생성된, 본 공개의 샘플은 추가의 가공 단계가 수행될 수 있고, 이들은 제한없이, 추가의 분석 기술, 예컨대 대표 종양 샘플에 함유된 불균질 재료를 분석하는데 적용할 수 있는 추가의 진단적 어세이를 포함하여, 본 출원에 상세히 기술된 것들을 포함한다. 다음의 방법론은 본 개시의 샘플과 함께 사용되어, 불균질 종양 세포 개체군 내에 함유된 세포의 정체 및 생물학적 특성에 관한 정보를 생성시킬 수 있다. 본 공개에 의해 제공되는 조합 분석 및 하기 기술된 기술은 종양 내 소수인 서브클론 개체군의 동정, 검출 또는 특징규명을 가능하게 할 수 있다. 이들 결과는 진단, 치료 방법의 선택, 및 환자 관리에 유용할 수 있다.
예시적 실시태양에서, 본 공개의 대표 샘플은 다음의 방법 또는 단계 중 하나 이상의 수행될 수 있다: 염색, 면역조직화학적 염색, 유세포 분석, FACS, 형광발광-활성화 액적 분류법, 이미지 분석, 하이브리드화, DASH, 분자 비콘, 프라이머 연장법, 마이크로어레이, CISH, FISH, 파이버 FISH, 정량적 FISH, 유동성 FISH, 비교 게놈 하이브리드화, 블롯팅, 웨스턴 블롯팅, 서던 블롯팅, 이스턴 블롯팅, 파-웨스턴 블롯팅, 사우쓰웨스턴 블롯팅, 노쓰웨스턴 블롯팅, 및 노던 블롯팅, 효소적 어세이, ELISA, 리간드 결합 어세이, 면역침전법, ChIP, ChIP-seq, ChIP-ChiP, 방사성면역어세이, 형광발광 편광법, FRET, 표면 플라스몬 공명, 필터 결합 어세이, 친화도 크로마토그래피, 면역세포화학, 전기영동적 어세이, 핵산 전기영동, 폴리아크릴아미드 겔 전기영동, 자연 겔 방법, 자유 유동성 전기영동, 등전점 포커싱, 면역전기영동, 전기영동적 이동성 이동 어세이, 제한 단편 길이 다형성 분석, 자이모그라피, 유전자 발현 프로파일링, PCR에 의한 DNA 프로파일링, DNA 마이크로어레이, 유전자 발현의 연속 분석, 실시간 중합효소 연쇄 반응, 차등적 디스플레이 PCR, RNA-seq, 질량 분광법, DNA 메틸화 검출, 음향 에너지, 지질체학-기반 분석, 면역 세포의 정량화, 암 연관 마커의 검출, 특이적 세포 유형의 친화도 정제, 드랍렛-온-써모커플 실루엣(droplet-on-thermocouple silhouette) 정량적 PCR, DNA 시퀀싱, 차세대 시퀀싱, 암-연관 융합 단백질의 검출, 화학요법 내성-연관 마커의 검출, 및 Ki67, DNA 배수성, 또는 기타 유전자형 또는 표현형 분석. 이들 방법의 예시적 실시태양를 하기에 기술하며, 이들 기술을 예시하려는 의도이다. 그러나, 이들 방법론의 변이 및 변경, 및 다른 방법론이 이용될 수 있다는 것을 이해해야 한다.
염색 기술
유체는 전처리(예를 들어, 단백질-가교, 핵산 노출 등), 변성, 하이브리드화, 세척(예를 들어, 엄격 세척), 검출(예를 들어,시각 또는 마커 분자를 프로브에 연결), 증폭(예를 들어, 단백질, 유전자 증폭 등), 대비염색 등에 적용될 수 있다. 다양한 실시태양에서, 물질은 제한없이, 착색제(예를 들어, 헤마톡실린 용액, 에오신 용액 등), 습윤제, 프로브, 항체(예를 들어, 단일클론 항체, 다클론 항체 등), 항원 회수 유체(예를 들어, 수성 또는 비수성 기반 항체 회수 용액, 항원 회복 완충제 등), 용매(예를 들어, 알코올, 리모넨 등) 등을 포함한다. 착색제는 제한없이, 염료, 헤마톡실린 착색제, 에오신 착색제, 검출가능한 표지 예컨대 합텐, 효소 또는 형광 모이어티와 항체 또는 핵산의 접합, 또는 색상을 부여하고/하거나 대비를 강화시키기 위한 물질의 기타 유형을 포함한다. WO2015197742 및 WO2015150278을 참조하고, 이들 각각은 그 전체로 참조로 본 명세서에 편입된다.
염색 기술은 관심의 하나 이상의 특징에 대한 문의와 함께 복수의 어세이 정보를 수용하고, 해부학적 어세이 유래의 해부학적 정보를 염색 어세이, 예를 들어, 해부학적 어세이로 통상적으로 등록된 면역조직화학적(IHC) 어세이의 이미지에 투사하여, 분석에 적당한 특징을 국재화시키거나 또는 결정하기 위한 시스템 및 방법을 적용할 수 있다. 해부학적 정보를 사용하여 하나 이상의 통상적으로 등록된 염색 또는 IHC 어세이 상에 투사된 마스크를 생성시키는데 사용될 수 있다. IHC 어세이에서 관심 특징의 위치는 분석에 적당한 것으로 선택되거나 또는 표시된 해부학적 마스크와 일치하는 임의의 관심 특징을 마스크에 의해 제공하는 해부학적 상황과 관련될 수 있다. 게다가, 해부학적 마스크는 복수 영역으로 분할될 수 있고, 복수의 IHC 어세이 유래의 복수의 관심 특징이 개별적으로 이들 영역 각각과 상관될 수 있다. 그러므로, 개시된 시스템 및 방법은 포괄적인 복수-어세이 분석을 위한 체계적, 정량적, 및 직관적 접근법을 제공하여, 종래의 제한적인 애드-호크 또는 주관적 육안 분석 단계를 극복한다. 그 전체로 참조로 본 명세서에 편입되는, WO2015052128을 참조한다.
전형적으로, 암 샘플은 세포를 현미경 슬라이드 상에 고정시키고 다양한 염색 방법(예를 들어, 형태학적 또는 세포유전자 염색)을 사용해 염색하여 병리학적으로 조사된다. 염색된 시료는 비정상 또는 암성 세포의 존재 또는 부재 및 세포 형태에 대해 평가된다. 일반적인 정보만을 제공하더라도, 조직학적 염색 방법은 생물학적 샘플에서 암성 세포의 검출을 위해 현재 실시되는 가장 일반적인 방법이다. 종종 암 검출에 사용되는 다른 염색 방법은 면역조직화학 및 활성 염색을 포함한다. 이들 방법은 암성 세포에서 특이적 항원 또는 효소적 활성의 존재 또는 부재를 기반으로 한다. 그 전체로 참조로 본 명세서에 편입되는 WO2012152747을 참조한다.
애매한 안료를 함유하는 샘플을 처리하기 위한 방법, 키트, 및 시스템이 개시되어 있다. 그 방법은 샘플 내 난독성 안료를 탈색시키기 위해서 샘플에 정화 시약을 적용하는 단계를 포함한다. 난독성 안료의 탈색은 샘플을 조사하는 병리학자의 능력을 향상시킨다. 예시적인 실시태양에서, 샘플 내 안료와 연관된 염색 난독성을 경감시키기 위해 기질 상에 장착된 샘플을 처리하는 자동화 방법이 개시된다. 그 방법은 기질을 샘플이 자동화 장비 상에 장착된 곳에 위치시키고 정화 시약을 적용하여 정화 시약을 샘플과 접촉시켜 샘플 내 안료가 탈생되는 것을 포함한다. 방법은 세정 시약을 적용하여 정화 시약이 실질적으로 샘플로부터 제거되고 발색 시약을 적용하여 샘플이 특이적으로 염색되게 하는 것을 포함한다. 샘플 내 안료는 정화 시약에 의해 탈색되어서 특이적으로 염색된 샘플이 정량화 판독기를 통해 해석가능하다. 다른 예시적인 실시태양에서, 샘플에 난독성 안료를 탈색시키기 위한 키트가 개시된다. 키트는 시약병 및 시약병에 배치된 정화 시약을 포함한다. 정화 시약은 과산화수소의 수용액을 포함하고 시약병은 자동화 슬라이드 염색 장치에 작동적으로 연결되도록 구성되어 자동화 슬라이드 염색 장치가 정화 시약의 적용을 제어하여 정화 시약이 샘플과 접촉한다. 추가의 예시적인 실시태양에서, 안료를 함유하는 조직병리학적 샘플에 대한 특이적 신호 난독성을 경감시키기 위한 시스템을 개시한다. 시스템은 자동화 장비, 정화 시약, 및 발색 시약을 포함한다. 자동화 장비는 기질에 부착된 조직병리학적 샘플을 수용하고, 정화 시약 및 발색 시약을 샘플에 전달하여, 샘플에 전달된 정화 시약 및 발색 시양에 가열 및 혼합을 제공하도록 구성된다. 정화 시약은 조직병리학적 샘플과 접촉하여 난독성 안료가 탈색되게 구성된다. 발색 시약은 조직병리학적 샘플과 접촉하여 특별한 신호를 침착시키도록 구성된다. 그 전체로 참조로 본 명세서에 편입되는 WO2014056812를 참조한다.
면역염색 및 인시츄 DNA 분석은 조직학적 진단에 유용한 도구일 수 있다. 면역염색은 샘플 중 에피토프와 항체의 특이적 결합 친화도, 및 질환 세포의 특정 유형에만 때때로 존재하는 독특한 에피토프와 특이적으로 결합하는 항체의 증가된 이용능에 의존할 수 있다. 면역염색은 질환 상태의 특정 형태학적 지시자를 선택적으로 강조하도록 유리 슬라이드 상에 장착된 샘플에 대해 수행되는 일련의 처리 단계를 포함할 수 있다. 일부 예에서, 처리 단계는 비특이적 결합을 감소시키기 위한 샘플의 전처리, 항체 처리 및 항온반응, 효소 표지된 2차 항체 처리 및 항온반응, 효소 및 대비착색제와 기질 반응을 포함할 수 있다. 결과는 항체와 결합하는 에피토프를 갖는 샘플의 형광 또는 발색 강조된 영역을 생성시킬 수 있다. 일부 예에서, 인시츄 DNA 분석은 세포 또는 샘플 중 뉴클레오티드 서열과 프로브의 특이적 결합 친화도에 의존적이다. 면역조직화학(IHC) 또는 면역세포화학(ICC)는 항체가 가시화 마커로 태그화된 경우에 특이적 항체-항원 상호작용을 검출하여 인시츄에서 세포 구성요소의 가시화를 포함할 수 있다. IHC는 때때로 조직 중 항원의 검출이라고 하는데 반해, ICC는 때때로 배양된 세포 내 또는 세포 상에서 항원의 검출이라고 한다(JAVOIS, Methods in Molecular Medicine, V. 115: Immunocytochemical Methods and Protocols, 2nd edition,(1999) Humana Press, Totowa, New Jersey, 이를 전체로 참조로 본 명세서에 편입시킴). 그러나 IHC 또는 ICC로서 기술된 방법은 본 공개에 균등하게 적용될 수 있다. 가시화 마커는 형광 염료, 콜로이드 금속, 합텐, 방사성 마커 또는 효소일 수 있다. 제조 방법과 무관하게, 최소의 배경값 또는 비특이적 염색의 최대 신호 강도가 항원 가시화를 제공하는데 바람직할 수 있다. 그 전체로 참조로 본 명세서에 편입되는 WO2013139555를 참조한다.
조기의 연구들을 기반으로, mRNA는 포유동물에서 발생 조절 및 세포 분화뿐만 아니라, 심장발생 및 림프구 발생에서 역할을 한다. 또한, miRNA는 다른 생물학적 과정 예컨대 저산소증, 세포자멸사, 줄기 세포 분화, 증식, 염증 및 감염에 대한 반응에 관여된다. miRNA는 종양형성의 핵심 특징인 세포 분화, 증식 및 생존에 관여하는 경로의 복수의 이펙터를 동시에 표적으로 삼는데 사용될 수 있다. 몇몇 miRNA는 암과 연관되었다. 그 결과, miRNA의 인시츄 분석은 암 진단 및 치료제로 유용하며, miRNA가 종양유전자 또는 종양 억제제로서 작용하는 것으로 보이기 때문이다. 예를 들어, 많은 종양 세포는 정상 조직과 비교하는 경우 구별되는 miRNA 발현을 갖는다. 과도한 c-Myc- 몇몇 암에 연루된 돌연변이된 형태의 단백질-을 생성하도록 유전자 변경된 마우스를 사용한 연구는 mRNA가 암 발생에 영향을 준다는 것을 공고히 하였다. miRNA뿐만 아니라 miRNA에 의해 전사되거나 또는 아니면 조절되는 단백질을 검출하는 방밥은 특히 효율적이고 신속한 검출을 위한 자동화 방법에서, 매우 바람직하다. miRNA를 검출하는 이전 방법은 동일한 샘플에서 miRNA 및 이의 단백질 발현 표적(miRNA에 의해 잠재적으로 제어됨) 둘 모두를 검출하지 못한다. 예시적인 방법은 전형적으로 핵산 표적을 노출시키기 위해 세포 구성요소를 소화시키기 위한 프로테아제-기반 세포 조건화를 사용한다. 게다가, 예시적 방법은 노던 및 웨스턴 블롯을 사용해 miRNA의 수준 및 단백질 수준을 관련시킨다. 또한, 샘플을 "분쇄 및 결합"하는 분자적 접근법이 이용될 수 있다. 조직-기반 접근법이 이전에 입증되었다. 이들 방법은 일반적으로 효소적 단계를 포함한다. 그 전체로 참조로 본 명세서에 편입되는 WO2013079606을 참조한다.
개시된 실시태양은 miRNA 및 단백질의 다중화 검출을 위해 특히 적합화된 자동화 방법을 이용할 수 있다. 예시적인 실시태양에서, 하나 이상의 단백질의 발현이 miRNA에 의해 조절될 수 있다. 또다른 실시태양에서, 방법은 miRNA 및 단백질 사이의 세포 상황을 동정할 수 있게 한다. 방법은 예를 들어, (a) iRNA 표적을 검출하는데 적합한 시약, (b) 단백질 표적을 검출하는데 적합한 시약, 및 (c) miRNA 표적 및 단백질 표적을 염색하는데 적합한 시약을 샘플에 적용하기 위한 자동화 시스템을 이용하는 단계를 포함한다. 본 실시태양의 일 양상은 비효소적 세포 조건화의 사용, 즉 단백질 표적을 보존하기 위해 프로테아제-기반 세포 조건화의 회피를 고려한다. 세포 조건화 단계는 샘플을 세포 조건화 용액, 예컨대 주위보다 높은 온도, 예컨대 80℃ 내지 약 95℃의 온도에서, 약 7.7 내지 약 9의 pH를 갖는 Tris-기반 완충제를 포함하는 약 염기성 pH를 갖는 완충제로 처리하는 단계를 포함할 수 있다. 자동화 방법은 동시에 또는 순차적으로 miRNA 및 단백질 표적을 검출할 수 있지만, 보다 나은 염색 결과는 전형적으로 먼저 miRNA를 검출하고 염색한 후 단백질 표적을 검출하고 염색하여 수득된다. 더욱 구체적인 개시된 실시태양은 먼저 비효소적 세포 조건화를 샘플에 대해 수행하는 단계를 포함한다. 다음으로, 샘플을 특정 miRNA 표적을 위해 선택된 핵산 특이적 결합 모이어티와 접촉시킨 후, miRNA 특이적 결합 모이어티를 검출한다. 다음으로, 샘플을 단백질 표적을 위해 선택된 단백질 특이적 결합 모이어티와 접촉시킨 후, 단백질 특이적 결합 모이어티를 검출한다. 특정 실시태양에서, 핵산 특이적 결합 모이어티는 검출가능한 모이어티. 예컨대, 효소, 형광단, 발광단, 합텐, 형광 나노입자 또는 이의 조합에 접합된 잠금 핵산(Locked Nucleic Acid) 프로브이다. 특히 접합한 합텐은 당분야에서 일반적인데, 예컨대 딕옥시게닌, 디니트로페닐, 비오틴, 플루오레세인, 로다민, 브로모데옥시우리딘, 마우스 면역글로불린, 또는 이의 조합이다. 다른 적합한 합텐은 옥사졸, 피라졸, 티아졸, 벤조푸라잔, 트리터펜, 우레아, 티오우레아, 로테노이드, 쿠마린, 시클로리그난, 헤테로비아릴, 아조아릴, 벤조디아제핀, 및 이의 조합으로부터 선택된 합텐을 포함하여, 벤타다 메디칼 시스템즈에서 특별히 개발되었다. 합텐은 항합텐 항체를 사용해 검출될 수 있다. 특정 개시된 실시태야에서, 항합텐 항체는 항-종 항체-효소 접합체에 의해 검출되고, 효소는 임의의 적합한 효소, 예컨대 알칼리 포스파타제 또는 홀르래디?? 퍼옥시다제이다. 그 전체로 참조로 본 명세서에 편입되는 WO2013079606을 참조한다.
대비염색은 그들 구조가 현미경 하에서 보다 쉽게 가시화될 수 있게, 그들이 하나 이상의 표적을 검출하도록 작용제로 이미 염색된 후 샘플을 후처리하는 방법이다. 예를 들어, 대비염색은 면역조직화학적 염색이 더욱 구별되도록 오버슬립핑 이전에 임의로 사용된다. 대비염색은 1차 염색과 색상이 다른다. 다양한 대비염색제가 알려져 있는데, 예컨대 헤마톡실린, 에오신, 메틸 그린, 메틸렌 블루, 김자, 알시안 블루, DAPI, 및 핵 패스트 레드가 있다. 일부 예에서, 하나 초과의 염색제가 함께 혼합되어 대비염색을 생성시킬 수 있다. 이는 염색제를 선택하는 능력 및 탄력성을 제공한다. 예를 들어, 제1 염색제는 특정 속성을 갖지만, 상이한 바람직하나 속성을 갖지 않는 혼합물을 위해 선택될 수 있다. 제2 염색제는 누락된 바람직한 속성을 나타내는 것이 혼합물에 첨가될 수 있다. 예를 들어, 톨루이딘 블루, DAPI, 및 폰타민 스카이 블루를 함께 혼합하여 대비염색을 형성시킨다. 그 전체로 참조로 본 명세서에 편입되는 WO2012116949를 참조한다.
헤마톡실린은 헤마톡실론(Hematoxylon) 속의 나무의 붉은 심재에 존재하는 천연 발생 화합물이다. 헤마톡실린 그 자체는 수용액 중에서 무색이고 조직 구성요소를 염색하는 활성 성분이 아니다. 대신, 헤마톡실린의 산화 산물, 헤마테인이 특히 매염제와의 착화시, 헤마톡실린 염료의 활성 염색 구성요소가 된다. 헤마테인은 공기 및 햇빛에 노출을 통해 자연적으로 생성된다. 자연적인 과정은 "숙성"이라고 하며, 세포를 염색하기에 적합한 용액을 제공하는데 3개월 또는 그 이상이 걸릴 수 있다. 자동화 염색 과정 및 시스템은 생물학적 샘플에 염색 용액을 전달하는 기계적 시스템을 사용한다. 표준 헤마테인 염색 과정은 헤마톡실린/헤마테인 및 매염제 둘 모두를 함유하는 사전혼합된 스톡을 이용하였다. 본 명세서에 전체로 참조로 편입되는 WO2012096842를 참조한다.
면역염색은 전형적으로 질환 상태의 특정 형태학적 지시자의 선택적 염색에 의해 강조되도록 유리 슬라이드 상에 장착된 샘플에 대해 수행되는 일련의 처리 단계를 이용한다. 전형적인 단계는 비특이적 결합을 감소시키기 위한 샘플의 전처리, 항체 처리 및 항온반응, 효소 표지된 2차 항체 처리 및 항온반응. 항체와 결합하는 에피토프를 갖는 샘플의 형광단 또는 발색단 강조 영역을 생성하도록 효소와 기질 반응, 대비염색 등을 포함한다. 이들 단계 각각은 이전 단계에서 미반응된 잔류 시약을 제거하기 위해 복수의 세정 단계에 의해 분리된다. 항온반응은 상승 온도, 일반적으로 대략 40℃에서 수행되고, 샘플은 전형적으로 탈수로부터 연속적으로 보호된다. 인시츄 DNA 분석은 샘플 중 독특한 뉴클레오티드 서열을 갖는 프로브의 특이적 결합 친화도을 사용하고 유사하게, 다양한 시약 및 과정 온도로, 일련의 과정 단계를 포함한다. 그 전체로 본 명세서에 참조로 편입되는 WO2011139976을 참조한다.
면역조직화학(IHC) 염색
샘플의 면역조직화학 또는 IHC 염색(또는 세포의 염색인 면역세포화학)은 아마도 가장 일반적으로 적용되는 면역염색 기술이다. IHC 염색의 제1 사례는 형광염료(면역형광발광 참조)를 사용하지만 효소 예컨대 퍼옥시다제(면역퍼옥시다제 염색 참조) 및 알칼리 포스파타제를 사용하는 다른 비형광 방법이 이제는 사용된다. 이들 효소는 광학 현미경관찰로 쉽게 검출가능한 착색 생성물을 제공하는 반응을 촉매할 수 있다. 대안적으로, 방사성 성분이 표지로서 사용될 수 있고, 면역반응은 방사능사진법에 의해 가시화될 수 있다. 제조 또는 고정은 세포 형상 및 구조의 보존에 기여할 수 있다. 부적절하거나 또는 장기간의 고정은 항체 결합 능력을 상당히 감소시킬 수 있다. 많은 항원은 성공적으로 포르말린-고정 샘플에서 입증될 수 있다. 많은 항원의 검출은 숨겨진 항원 부위가 드러나도록 고정에 의해 형성된 단백질 교차 결합의 일부를 파괴하여 작용하는 항원 회수 방법으로 개선될 수 있다. 이는 시간 길이를 다양화하여 가열(열 유도된 에피토프 회수 또는 HIER)에 의하거나 또는 효소 소화(단백질가수분해 유도된 에피토프 회수 또는 PIER)에 의해 수행될 수 있다.
면역조직화학(IHC)은 특이적 결합제, 예컨대 항체와 항원의 상호작용을 검출하여 샘플(예컨대, 췌장 암 샘플)에서 항원(예컨대, 단백질)의 존재 또는 분포를 결정하는 방법에 관한 것이다. 항원(예컨대, 표적 항원)을 포함하는 샘플은 항체-항원 결합을 허용하는 조건 하에서 항체와 항온반응된다. 항체-항원 결합은 항체에 접합된 검출가능한 표지의 수단(직접 검출) 또는 1차 항원에 의해 발생된, 2차 항원에 접합된 검출가능한 표지의 수단(예를 들어, 간접 검출)에 의해 검출될 수 있다. IHC에 사용될 수 있는 예시적 검출가능한 표지는 제한없이, 방사성 동위원소, 형광색소(예컨대 플루오레세인, 플루오레세인 이소티오시아네이트, 및 로다민), 합텐, 효소(예컨대, 홀스래디쉬 퍼옥시다제 또는 알칼리 포스파타제), 및 발색제(예컨대 3,3'-디아미노벤지딘 또는 패스트 레드)를 포함한다. 일부 예에서, IHC는 샘플, 예를 들어 췌장암 샘플 중 하나 이상의 단백질의 양을 결정하거나 또는 그 존재를 검출하는데 이용된다. 그 전체로 참조로 본 명세서에 편입되는 WO2013019945를 참조한다.
면역조직화학, 또는 IHC는 샘플의 세포에서 항원, 예컨대 단백질을 국재화시키고 항원을 사용해 특정 항원과 항체의 특이적 결합을 촉진하는 과정을 의미한다. 이러한 검출 기술은 주어진 단백질이 샘플 내에 정확하게 어디에 위치하는지를 보여줄 수 있는 장점을 갖는다. 또한 샘플 자체를 조사하는 효과적인 방식이다. 항원 및 핵산을 검출하기 위해 소형 분자, 예컨대 합테의 사용은 IHC에서 중요한 방법이 되었다. 항합텐 항체와 조합한 합텐은 특정 분자 표적을 검출하는데 유용하다. 예를 들어, 특이적 결합 모이어티, 예컨대 1차 항체 및 핵산 프로브는 하나 이상의 합테 분자로 표지될 수 있고, 이들 특이적 결합 모이어티가 그들의 분자 표적에 결합되면 그들은 검출 시스템 또는 검출가능한 표지 예컨대 형광 표지를 기반으로 발색제의 일부로서 효소를 포함하는 항합텐 항체 접합체를 사용하여 검출할 수 있다. 샘플에 대한 검출가능한 항합텐 항체 접합체의 결합은 샘플 중 표적의 존재를 의미한다. 2차 대사물로서 디지탈리스(Digitalis) 식물에서만 존재하는 딕옥시게닌은 다양한 분자 어세이에서 이용되는 합텐의 예이다. 미국 특허 제4,469,797호는 시험 샘플 중 약물에 대한 항-딕옥신 항체의 특이적 결합을 기반으로 혈액 샘플 중 딕옥신 농도를 결정하기 위해 면역어세이를 사용하는 것을 개시한다. 미국 특허 제5,198,537호는 면역학적 검사, 예컨대 면역어세이에서 사용하는 복수의 부가적 딕옥시게닌 유도체를 기술한다. 샘플의 인시츄 어세이 예컨대 면역조직화학적(IHC) 어세이 및 인시츄 하이브리드화(ISH) 어세이, 특히 이러한 샘플의 다중화 어세이에서, 배경 간섭없이 바람직한 결과를 제공하는 방법을 동정하고 개발하는 것이 매우 바람직하다. 하나의 이러한 방법은 특허된 촉매화 리포터 침착(catalyzed reporter deposition: CARD)을 기반으로, 티라미드 신호 증폭(TSA)의 사용을 포함한다. 그 전체로 본 명세서에 참조로 편입되는 미국 특허 제6,593,100호는 효소와 표지된 페놀 접합체를 반영시켜 CARD 또는 티라미드 신호 증폭(TSA) 방법에서 효소의 촉매반응을 향상시키는 것을 개시하며, 여기서 반응은 강화 시약의 존재에서 수행된다. 전술한 공개물로서, 그 전체로 참조로 본 명세서에 편입되는 WO2012003476을 참조한다.
합텐 접합체를 사용하기 위한 방법의 실시태양이 이용될 수 있다. 일반적으로, 방법은 a) 샘플 중 표적에 퍼옥시다제를 고정시키는 단계로서, 퍼옥시다제는 퍼옥시다제-활성화가능한 아릴 모이어티, 예를 들어 티라민 또는 티라민 유도체와 반응할 수 있는 것인 단계, b) 합텐 접합체를 포함하는 용액과 샘플을 접촉시키는 단계로서, 합텐 접합체는 상기 기술된 바와 같은 퍼옥시다제-활성화가능한 아릴 모이어티에 결합된 합텐을 포함하는 것인 단계, 및 c) 샘플을 퍼옥시드를 포함하는 용액과 접촉시켜, 합텐 접합체가 퍼옥시다제 및 퍼옥시드와 반응하여서, 고정된 퍼옥시다제에 인접하거나 또는 고정된 퍼옥시다제와 공유 결합을 형성하는 것인 단계; 및 d) 합텐을 검출하기 위해 샘플 중 표적을 국재시키는 단계를 포함할 수 있다. 그 전체로 참조로 본 명세서에 편입되는 WO2012003476을 참조한다.
확대 현미경관찰
확대 현미경관찰(ExM)은 고전적인 현미경관찰 회절 한계와 비교하여 증가된 해상도로, 제한없이, 세포, 조직, DNA, RNA, 또는 지질을 포함하는, 관심 생물학적 샘플의 광학적 이미지화 방법을 제공한다. ExM은 보존된 생물학적 샘플의 물리적 확대를 가능하게 하는데, 여기서 관심 샘플은 조성물이 관심 샘플에 포매되는 정도로 조성물(예를 들어, 중합체 겔 또는 히드로겔)로 주입된다. 조성물이 등방성으로 확대될 때, 샘플에 부착된 생물학적 샘플 또는 염료(또는 형광단)는 확대될 것이고, 따라서 높은 해상도로 생물학적 샘플 또는 형광단의 광학적 이미지화가 가능하다. ExM 하에서, 생물학적 샘플은 당업자에게 공지된 표준 기술, 예를 들어, FISH, 면역조직화학 염색을 사용해 태그로 먼저 염색된다. 다음으로, 샘플은 하나 이상의 젤라틴 용액, 예를 들어 단량체, 가교제 또는 개시제가 관류된다. 하나의 실시태양에서, 젤라틴 용액은 팽윤성 재료를 포함한다. 젤라틴 과정이 완료되면, 생물학적 샘플은 임의로는 프로테아제 또는 기타 화학적 처리로 소화된다. 겔은 외부 인자, 예컨대 물 또는 열과의 접촉을 통해 수행될 수 있는, 팽윤 시 확대된다. 겔의 확대는 겔 내에 포매된 샘플 또는 태그를 물리적으로 확장시키거나 또는 확대시킨다. 샘플 또는 태그의 확장 및/또는 확대는 훨씬 높은 해상도(예를 들어, 나노규모)로 광학적 이미지화를 가능하게 한다. ExM은 제한없이 단백질, RNA, DNA, 지질을 포함하는, 복수의 생물학적 샘플에 적용가능하고, 이들은 고전적인 현미경 관찰 하에서 고 해상도로 동정 및 국재화할 수 없다. 그 전체로 참조로 편입되는 미국 특허 출원 제14/627,310호를 참조한다.
본 공개는 팽윤성 재료에 대표 샘플(예를 들어, 균질물 조성물) 또는 이의 일부를 포함하거나, 또는 대안적으로 그로 본질적으로 이루어지거나, 또는 그로 더욱 이루어지는, 현미경 관찰을 위한 대표 샘플을 제조하는 방법을 제공한다. 본 명세서에서 사용시 용어 "팽윤성 재료"는 제한없이, 물, 온도(예를 들어, 열), 물리적 스트렛치, 및 습도와 접촉을 포함하여, 물리적 영향 시 확장되는 재료를 의미한다. 팽윤성 재료는 1 크기 또는 2 크기 또는 3 크기로 확대될 수 있다. 하나의 실시태양에서, 팽윤성 재료는 확대 시, 빛이 샘플을 통해 통과할 수 있도록 투명하다. 하나의 실시태양에서 팽윤성 재료는 팽윤성 중합체 또는 히드로겔이다. 하나의 실시태양에서, 팽윤성 재료는 이의 전구체로부터 인시츄에서 형성된다. 예를 들어, 하나 이상의 중합성 재료, 단량체 또는 올리고머는 중합성 에틸렌계 불포화 기를 함유하는 수용성 기로 이루어진 군으로부터 선택되는, 예컨대 단량체를 사용할 수 있다. 바람직한 실시태양에서, 팽윤성 중합체는 폴리아크릴레이트 및 공중합체 또는 이의 가교된 공중합체이다. 대안적으로 또는 부가적으로, 팽윤성 재료는 수용성 올리고머 또는 중합체를 화학적으로 가교시켜 인시츄에서 형성시킬 수 있다.
용어 "중합성 재료"는 제한없이 단량체 및 올리고머를 포함하는, 중합할 수 있는 재료를 의미한다. 용어 "가교제"는 단백질 또는 기타 분자 상의 특정 작용기(1차 아민, 설프히드릴 등)에 화학적으로 부착할 수 있는 둘 이상의 반응성 말단을 함유하는 분자를 의미한다. 하나의 실시태양에서, 가교제는 올리고머 또는 단량체의 중합을 야기한다. 용어 "중합 개시제"는 이의 중합체를 생성시키는 방식으로 에틸렌 옥시드와 반응하는 화합물, 또는 이의 음이온을 의미한다. 특정 실시태양에서, 중합 개시제는 에틸렌 옥시드의 중합츨 개시하는 작용기의 음이온이다.
하나의 실시태양에서, 방법은 팽윤성 재료를 팽윤시켜 균질물 조성물을 확대시키는 단계를 더 포함하거나, 또는 그로 더욱 이루어진다. 또다른 실시태양에서, 포매 과정은 팽윤성 재료의 전구체를 포함하는 조성물로 균질물을 투과시키는 단계 및 팽윤성 재료를 인시츄에서 형성시키는 단계, 및 균질물 조성물을 팽윤성 재료에 앵커링시키는 단계를 포함하거나, 또는 대안적으로 그로 본질적으로 이루어지거나, 또는 그로 더욱 이루어진다. 일 양상에서, 팽윤성 재료는 팽윤성 재료의 전구체로부터 형성되고, 전구체는 중합성 재료, 중합 개시제, 또는 가교제를 포함한다. 또다른 양상에서, 중합성 재료는 단량체 또는 올리고머이다. 추가의 실시태양에서, 단량체 또는 올리고머는 치환 또는 미치환된 메타크릴레이트, 아크릴레이트, 아크릴아미드, 메타크릴아미드, 비닐알코올, 비닐아민, 알릴아민, 알릴알코올, 또는 그의 디비닐 가교제(예를 들어, N,N-알킬렌 비스아크릴아미드)를 포함한다.
유세포 분석
유세포 분석은 세포를 유체 스트림에 현탁시키고 그들을 전자 검출 장치를 통해 통과시킴으로서, 세포 계측, 세포 분류, 바이오마커 검출 및 단백질 조작에 적용되는 레이저 기반, 생물물리적 기술이다. 이는 초 당 수천 입자 이하의 물리적 및 화학적 특징의 동시적 다항목 분석이 가능하다. 유세포 분석은 건강 장애, 특히 혈액암의 진단에서 통상적으로 사용되지만, 기초 연구, 임상적 관행 및 임상 시험에서 많은 다른 적용성을 갖는다. 통상의 변이는 관심 개체군의 정제를 위해서, 그들 특성을 기반으로 입자를 물리적으로 분류하는 것이다.
형광발광-활성화된 세포 분류법(FACS)
형광발광-활성화된 세포 분류법(FACS)는 유세포분석의 특수 유형이다. 특별한 광산란 및 각 세포에 특징적인 형광을 기반으로, 한번에 한 세포를, 둘 이상의 용기로 세포의 불균질 혼합물을 분류시키는 방법을 제공한다. 개별 세포뿐만 아니라 특정 관심의 세포의 물리적 분리로부터 형광 신호를 신속하고, 객관적이며 정량적으로 기록하는 것을 제공하는 유용한 과학 장비이다. 세포 현탁물을 액체의 좁고, 신속하게 흐르는 스트림의 중심에 혼입시킨다. 흐름은 그들의 직경에 따라 세포 사이의 큰 분리가 존재하도록 배열된다. 진동 기전은 세포의 스트림을 개별 액적으로 파괴되도록 한다. 시스템은 액적 당 하나 초과의 세포의 낮은 확률이 존재하도록 조정된다. 스트림이 액적으로 분리되기 직전에, 흐름은 각 세포의 관심 형광 특징이 측정되는 형광발광 측정 스테이션을 통해 통과한다. 전기 하전 고리가 스트림이 액적으로 분리되는 바로 그 지점에 위치된다. 전하는 형광발광 강도 측정 바로 앞을 기반으로 고리 상에 위치되고, 반대 전하가 스트림으로부터 분리되는 액적에 포집된다. 다음으로 하전된 액적은 액적으로 그들의 전하를 기초로 용기로 우회시키는 정전 편향 시스템을 통해 강하한다. 일부 시스템에서 전하가 직접적으로 스트림에 적용되고, 분리된 액적은 스트림과 동일한 표시의 전하를 보유한다. 스트림은 이후 액적 분쇄 후 중성으로 되돌아간다.
단일 세포의 형광발광-활성화된 액적 분류
액적 중 단일 세포의 구획화는 세포에 의해 방출되거나 또는 분비되는 단백질의 분석을 가능하게 하여 전통적인 유세포 분석 및 형광발광 활성화 세포 분류의 주요 한계 중 하나를 극복하였다. 이러한 접근법의 예는 단일 마우스 하이브리도마 세포로부터 분비되는 항체를 검출하기 위한 결합 어세이이다. 분비된 항체는 50-pl 액적 중에 단일 마우스 하이브리도마 세포, 형광 프로브 및 항-마우스 IgG 항체를 코딩한 단일 비드를 공동구획화하여 오직 15분 후에 검출된다. 비드는 분비된 항체를 포획하고, 포획된 항체가 프로브에 결합시, 형광발광이 비드 상에 국재화되어서, ∼200 Hz에서 액적 분류뿐만 아니라 세포 농축을 할 수 있게 하는 분명하게 구별가능한 형광발광 신호를 생성시킨다. 기술된 미소유체 시스템은 다른 세포내, 세포 표면 또는 분비된 단백질을 스크리닝하고 촉매성 또는 조절성 활성을 정량하기 위해 쉽게 조정된다. ∼1백만 세포를 스크리닝하기 위해서, 미소유체 작업은 2 내지 6시간 내에 완료될 수 있고, 미소유체 디바이스의 제조 및 포유동물 세포를 포함한 전체 과정은 5-7일 내에 완료될 수 있다. 문헌 [Mazutis et al.(2013). "Single-cell analysis and sorting using droplet-based microfluidics". Nat. Protoc. 8: 870- 891]을 참조하며, 이를 그 전체로 참조로 본 명세서에 편입시킨다.
이미지 분석
샘플은 임상적 면역 프로파일 실험의 보조인 자동화 면역 세포 검출을 위한 시스템 및 컴퓨터-시행 방법에 의해 분석될 수 있다. 자동 면역 세포 검출 방법은 복수 채널 이미지 예컨대 RGB 이미지 또는 생물학적으로 의미있는 비혼합 이미지로부터 복수의 이미지 채널을 회수하는 것을 포함한다. 그 전체로 참조로 본 명세서에 편입되는 WO2015177268을 참조한다.
이미지 분석 알고리즘 및/또는 시스템은 다중 IHC 슬라이드 및/또는 형광 염색 슬라이드의 세트 이미지로부터 면역 점수를 자동적으로 산출하는 것을 이용할 수 있다. 이미지 분석 알고리즘은 다중 어세이로 염색된 단일 샘플 중 세포의 복수의 유형을 계측하기 위한 컴퓨터 실행 방법을 포함하고, 이 방법은 림프구 마커 CD3, CD8, CD20, FoxP3, 및 종양 검출 마커를 포함하는 다중 어세이로 염색된 샘플을 이미지화하는 단계; 다중 어세이의 각 마커에 대해 별개의 이미지 채널로 다중 어세이로 염색된 단일 샘플의 이미지를 불혼합하는 단계; 각 채널에서 강도 정보를 기반으로 각 이미지 채널에서 관심 영역을 동정하는 단계로서, 각 채널에서 낮은 강도의 영역을 제거하고, 높은 강도의 영역은 세포 신호를 나타내는 것인 단계; 단일 대리 이미지를 생성시키는 단계로서, 대리 이미지는 모든 림프구 마커의 이미지 채널 정보의 조합인 단계; 세포 검출 알고리즘을 적용하는 단계로서, 세포 검출 알고리즘은 막 발견 알고리즘 또는 핵 발견 알고리즘인 단계; 각각의 이미지 채널 또는 조합된 채널의 이미지, 또는 전환된 이미지, 예컨대 그레이스케일 또는 흡광 이미지 또는 대리 이미지에서 림프구 및 림프구의 조합의 특성을 동정하는 단계; 기지의 림프구 및 림프구 조합의 특성을 기반으로 분류 알고리즘을 훈련하는 단계; 거짓 양성 세포, CD3 단독 T-세포, CD3 및 CD8 T-세포, FP3 T-세포; 및 CD20 B-세포 중 적어도 하나로서 검출된 세포를 분류하여 동정하는, 각 이미지 채널 또는 조합된 채널의 각 이미지, 또는 전환된 이미지 예컨대 그레이스케일 또는 흡광 이미지, 또는 대리 이미지 중 림프구 및 림프구의 조합의 특성에 훈련된 알고리즘을 적용하는 단계; 분류된 복수의 각 상이한 유형의 세포를 계측하는 단계; 샘플의 점수를 생성시키는 단계로서, 점수는 계측된 세포의 각 유형의 수를 기반으로 하는 것인 단계를 포함한다. 그 전체로 참조로 본 명세서에 편입되는 WO2015124737을 참조한다.
본 개시의 예시적 실시태양은 2단계 분류 방법을 포함하는 시스템 및 방법을 이용하는 것을 포함할 수 있다. 본 명세서에 개시된 운용은 WS 이미지를 복수의 팻치로 분할하는 단계, 및 "소프트" 분류, 예컨대 SVM을 사용해 각 팻츠를 제1 분류하는 단계, 및 각 팻치에 대해 신뢰 점수 및 표지를 생성시키는 단계를 포함한다. 분류 결과로서 수득된 각 팻치의 위치, 이의 특성 및 이의 유형, 및 이의 신뢰 점수는 데이타베이스에 저장될 수 있다. 제2 분류 단계는 데이타베이스에서 고신뢰 팻치와 저신뢰 팻치를 비교하는 단계 및 데이타베이스의 팻치의 공간 일관성을 증강시키도록 유사한 팻치를 사용하는 단계를 포함한다. 다시 말해서, 각 저신뢰 팻치의 경우, 이웃하는 고신뢰 팻치가 저신뢰 팻치에서 분할 정확도를 개선시키는 각 팻치에 대한 표지의 세련을 향해 보다 큰 기여를 한다. 증가되는 훈련 데이타베이스에 대한 현행 조정/활성 학습 기술과 대조적으로, 개시된 운용법은 증가되는 단일 훈련 데이타베이스를 덜 신경쓰고 대신 분석 중인 이미지에 대한 표지된 신뢰 정보를 기반으로 분류 정확도를 적정하게 개선시키면서 독립적으로 각 시험 이미지를 처리하는데 집중한다. 달리 말하면, 신뢰 표지 팻치 데이타베이스가 각 이미지에 대해 생성되고, 유사성 회수 운용이 이미지 내에서 수행되어 저신뢰 팻치에 대한 분류 결과를 세련시킨다. 그 전체로 참조로 본 명세서에 편입되는 WO2015113895를 참조한다.
본 공개의 예시적 실시태양은 메소테린(MSLN) 발현, 예컨대 MSLN 단백질 발현을 검출하고 점수화하는 이용 방법을 포함할 수 있다. 특정 예에서, 방법은 MSLN 단백질-특이적 결합제(예컨대, 항체)와 종양 세포를 포함하는 샘플을 접촉시키는 단계를 포함한다. MSLN을 발현하는 예시적 종양은 제한없이, 난소암, 폐암(예를 들어, 비-소세포 폐암종, NSCLCs), 췌장암 및 중피종을 포함한다. 종양 세포 중 MSLN 단백질의 발현은 예를 들어 현미경관찰 및 면역조직화학(IHC)을 사용해 검출되거나 또는 측정된다. 샘플은 MSLN 단백질 발현에 대해 0 내지 3+의 규모로 점수화된다. 예를 들어, 샘플 중 종양 세포의 적어도 10%(예컨대, 종양 세포의 적어도 약 10%)가 단백질-특이적 결합제(예를 들어, 검출가능한 MSLN 단백질 발현을 가짐)로 염색되었는지 여부를 결정한다. 샘플은 종양 세포의 10% > 미만(예컨대, 약 10% > 미만)이 특정 결합제로 염색되면 MSLN 단백질 발현에 대해 0의 점수가 지정된다. 샘플은 샘플 중 종양 세포의 적어도 10%가 단백질 특이적 결합제(예를 들어, 검출가능한 MSLN 단백질 발현을 가짐)로 염색되지만, 종양 세포의 10% > 미만(예컨대 약 10% 미만)이 2+ 또는 그 이상의 강도에서 특정 결합제로 염색되면 MSLN 단백질 발현에 대해 1+의 점수를 지정한다. 샘플은 샘플 중 종양 세포의 적어도 10%(예컨대, 종양 세포의 적어도 약 10%)가 2+ 또는 그 이상의 강도로 단백질-특이적 결합제(예를 들어, 검출가능한 MSLN 단백질 발현을 가짐)로 염색되고 대부분의 염색된 종양 세포가 2+ 강도로 염색되면 MSLN 단백질 발현에 대해 2+의 점수로 지정된다. 샘플은 샘플 중 종양 세포의 적어도 10%(예컨대, 종양 세포의 적어도 약 10%)가 2+ 또는 그 이상의 강도에서 단백질-특이적 결합제(예를 들어, 검출가능한 MSLN 단백질 발현을 가짐)로 염색되고 염색된 종양 세포의 대부분이 3+ 강도로 염색되며 샘플 중 종양 세포의 적어도 10%(예컨대, 종양 세포의 적어도 약 10%)가 3+ 강도로 단백질-특이적 결합제(예를 들어, 검출가능한 MSLN 단백질 발현)로 염색되면 샘플은 MSLN 단백질 발현에 대해 3+의 점수로 지정된다. 개요는 그 전체로 참조로 본 명세서에 편입되는 WO2015032695의 표 13 및 도 20에 제공된다.
하이브리드화
인시츄 하이브리드화(ISH)는 표적 핵산에 특이적이거나 또는 특이적으로 하이브리드화할 수 있는 표지된 프로브(예를 들어, 본 명세서에 개시된 프로브 중 하나 이상)와 중기 또는 간기 염색체 조제물과 관련된 표적 핵산, 게놈 표적 핵산)을 함유하는 샘플(예컨대, 슬라이드 상에 장착된 샘플)을 접촉시키는 것을 포함한다. 슬라이드는 임의로는 예를 들어, 균질한 하이브리드화를 방해할 수 있는 재료를 제거하기 위해 전처리된다. 염색체 샘플 및 프로브는 둘 모두, 예를 들어 이중 가닥 핵산을 변성시키기 위해 가열에 의해 처리된다. 프로브(적합한 하이브리드화 완충제에 제제화됨) 및 샘플은 하이브리드화가 일어나도록 하는 충분한 시간 및 조건 하에서 조합된다(전형적으로 평형에 도달함). 염색체 조제물을 세척하여 과량의 프로브를 제거하고, 표적의 특이적 표지의 검출은 표준 기술을 사용해 수행된다. 그 전체로 참조로 본 명세서에 편입되는 WO2015124702를 참조한다.
암성 세포를 검출하는 다른 방법은 암 세포에서 염색체 이상의 존재를 이용한다. 전체 게놈 또는 염색체 절편의 카피의 결실 또는 다중화, 및 게놈의 특이적 영역의 증폭의 고수준이 암에서 일반적으로 발생한다. 염색체 이상은 종종 세포유전 방법 예컨대 김자-염색 염색체(G-밴딩) 또는 형광 인시츄 하이브리드화(FISH)를 사용해 검출된다. 그 전체로 참조로 본 명세서에 편입되는 WO2012152747을 참조한다.
현재 개시된 기술은 암의 분자 기전을 분석하는데 있어 증가된 특이성을 위한 개선된 방법을 제공한다. 따라서, 특정 실시태양에서, 기술은 다변수 암 진단 방법에 관한 것이고 상기 방법은 단일 세포 또는 세포를 함유하는 단일 샘플 중 세포 수준에서 분자 마커 및 표현형 형태 마커 줄 모두의 존재를 결정하며, 상기 방법은 a) 단일 세포 또는 세포들을 포함하는 대상체 유래의 단일 샘플로부터 분자 마커 데이타를 수득하는 단계; b) 단계 (a)에서 사용된 것과 동일한 단일 세포 또는 세포들로부터 정량적 세포 형태 데이타를 수득하여 상기 단일 샘플의 다변량 분석을 제공하는 단계로서, 다변량 데이타 세트는 단계 (b)로부터의 정량적 세포 형태 데이타 및 단계 (a)로부터의 분자 마커 데이타 둘 모두를 포함하는 것인 단계; 및 c) 단계 (b)에서 수득된 다변량 분석 데이타 세트를 기지의 임상적 결과를 갖는 개체로부터 채취된 암 및 비암성 세포 샘플로부터의 분자 마커 데이타 및 정량적 세포 형태 데이타 둘 모두를 수득하여 생성된 기준 다변량 분석 데이타 세트와 비교하는 단계를 포함한다.
단계 (c)의 비교 결과는 암 진행, 발생, 전이 또는 기준 다변량 분석 데이타 세트에서 확인된 임상적 결과의 기타 특징과 통계적으로 연관된 특성 및 마커의 특정 조합에 의해 정의되는 대상체로부터의 임상적 결과의 예측을 제공한다. 그 전체로 참조로 본 명세서에 편입되는 WO2012152747을 참조한다.
본 공개의 예시적 실시태양은 스펙트럼 분해 검출 및 데이타 사전가공을 포함하는 특수 이미지화 접근법과 함게 분자 마커의 형광 표지화를 사용하여 암의 병리학적 예후 상태를 결정하기 위한 정보를 제공하는 기술을 이용하는 것을 포함할 수 있다. 기술은 단일 데이타 획득 주기 내에서 샘플에 대한 분자 특이적 프로브의 검출을 위해 제조되는 샘플에 대한 핵 형태를 획득하고 분석할 수 있는 이미지화 접근법을 제공한다. 이러한 이미지화 접근법은 표지화, 획득, 사전 가공 및 분석 기술의 조합을 적용한다. 다차원 이미지를 수집하고 분석하여 발광 파장에 의해 관심있는 상이한 분석물 채널을 분리하고 구별한다. 후속 분석물 채널은 세포의 형태 및 유전자 재배열, 유전자 발현 및/또는 단백질 발현을 정량하는 데이타의 상이한 양상을 나타낸다. 그 전체로 참조로 본 명세서에 편입되는 WO2012152747를 참조한다.
본 공 개의 예시적 실시태양은 핵을 가시화하기 위한 시스템, 방법 및 키트의 이용을 포함할 수 있다. 샘플은 핵을 투과하기 위해 프로테아제로 전처리된 후 나노입자/DNA 결합 모이어티 접합체와 항온반응될 수 있다. DNA-결합 모이어티는 적어도 하나의 DNA-결합 분자를 포함한다. 접합체는 핵 내의 DNA에 결합하고, 나노입자는 가시화되어 핵을 가시화한다. 컴퓨터 및 이미지 분석 기술을 사용하여 핵 특성 예컨대 염색체 분포, 배수성, 형상, 크기, 질감 특성 및/또는 문맥적 특성을 평가한다. 이 방법은 형광발광 인시츄 하이브리드화를 포함하는, 샘플에 대한 다른 다중화 검사와 조합하여 사용될 수 있다. 그 전체로 참조로 본 명세서에 편입되는 WO2012116949를 참조한다.
형광발광 인시츄 하이브리드화(FISH)는 염색체 상에 특정 DNA 서열의 존재 또는 부재를 검출하고 국재화시키는데 사용될 수 있는 기술이다. FISH는 그들이 높은 정도의 서열 유사성을 보이는 염색체의 일부분에만 결합하는 형광 프로브이다. FISH 또한 샘플 내 특정 mRNA 서열을 검출하는데 사용된다. 그 전체로 참조로 본 명세서에 편입되는 WO2012116949를 참조한다.
FISH, CISH, 및 SISH에 대한 수많은 절차가 당분야에 공지되어 있다. 예를 들어, FISH를 수행하는 절차는 미국 특허 제5,447,841호; 제5,472,842호; 및 제5,427,932호에 기술되어 있고; CISH는 미국 특허 제6,942,970호에 기술되어 있으며, 부가적 검출 방법이 미국 특허 제6,280,929호에 기술되어 있고, 이의 개시내용을 그들 전체로 참조로 본 명세서에 편입시킨다. 수많은 시약 및 검출 계획이 FISH, CISH, 및 SISH 절차와 함께 적용되어 감도, 해상도, 또는 기타 바람직한 특성을 개선시킬 수 있다. 상기에 기술된 바와 같이, 형광단(형광 염료 및 양자점 포함)으로 표지된 프로브는 FISH를 수행할 때 직접적으로 광학적으로 검출될 수 있다. 대안적으로, 프로브는 비-형광발광성 분자, 예컨대 합텐 [예컨대 하기의 비제한적인 예: 비오틴, 딕옥시게닌, DNP, 및 다양한 옥사졸, 피라졸, 티아졸, 니트로아릴, 벤조푸라잔, 트리터펜, 우레아, 티오우레아, 로테논, 쿠마린, 쿠마린 기반 화합물, 포도필로톡신, 포도필로톡신-기반 화합물, 및 이의 조합), 리간드 또는 기타 간접적으로 검출가능한 모이어티로 표지될 수 있다. 이러한 비-형광발광성 분자로 표지된 프로브(및 그들에 결합하는 표적 핵산 서열)는 샘플(예를 들어, 프로브가 결합되는 세포 샘플)을 표지된 검출 시약, 예컨대 선택된 합텐 또는 리간드에 특이적인 항체(또는 수용체 또는 기타 특이적 결합 파트너)와 접촉하여 검출될 수 있다. 검출 시약은 형광단(예를 들어, 양자점) 또는 또다른 간접적으로 검출가능한 모이어티로 표지될 수 있거나, 또는 이후에 형광단으로 표지될 수 있는 하나 이상의 부가적인 특이적 결합제(예를 들어, 2차 또는 특이적 항체)와 접촉될 수 있다. 임의로는, 검출가능한 표지는 항체, 수용체(또는 다른 특이적 결합제)에 직접적으로 부착된다. 대안적으로, 검출가능한 표지는 링커, 예컨대 히드라지드 티올 링커, 폴리에틸렌 글리콜 링커, 또는 비슷한 반응성을 갖는 임의의 다른 탄성 부착 모이어티를 통해 결합제에 부착된다. 예를 들어, 특이적 결합제, 예컨대 항체, 수용체(또는 다른 항-리간드), 아비딘 등은 이종이기능성 폴리알킬렌글리콜 링커 예컨대 이종이기능성 폴리에틸렌글리콜(PEG) 링커를 통해 형광단(또는 다른 표지)으로 공유적으로 변형될 수 있다. 이종이기능성 링커는 예를 들어, 카보닐 반응성기, 아민 반응성기, 티올 반응성 기 및 광반응성 기로부터 선택되는 2종의 상이한 반응성 기를 조합하며, 그 중 첫번째는 표지에 부착되고 두번째는 특이적 결합제에 부착된다. 다른 예에서, 프로브 또는 특이적 결합제(예컨대, 항체, 예를 들어, 1차 항체, 수용체 또는 기타 결합제)는 검출가능한 형광, 착색 또는 기타 검출가능한 신호(예를 들어, SISH의 검출가능한 금속 입자의 침착)로 형광성 또는 발색성 조성물을 전환시킬 수 있는 효소로 표지된다. 상기 기술된 바와 같이, 효소는 관련 프로브 또는 검출 시약에 링커를 통해 간접적으로 또는 직접적으로 부착될 수 있다. 적합한 시약(예를 들어, 결합 시약) 및 화학물[(예를 들어, 링커 및 부착 화합물)의 예는 미국 공개 특허 출원 제2006/0246524호; 제2006/0246523호, 및 제2007/0117153호에 기술되어 있고, 그들 개시 내용은 그들 전체로 참조로 본 명세서에 편입된다. WO2015124702를 참조하며, 그 전체로 참조로 본 명세서에 편입된다.
본 공개의 방법은 하나 초과(예를 들어, 2, 3, 4 등)의 상이한 표적의 검출을 가능하게 할 수 있다. 일부 실시태양에서, 상이한 검출가능한 표지 및/또는 검출 시스템은 각각이 단일 샘플에서 개별적으로 검출될 수 있도록 각 표적에 대해 사용될 수 있다. 임의의 적당한 검출가능한 표지 및/또는 검출 시스템이 사용될 수 있다. 본 공개는 명시야 인시츄 하이브리드화에 대한 시스템을 특징으로 한다. 일부 실시태양에서, 시스템은 표적 RNA에 특이적인 X 독특한 2'-0-메틸 RNA 프로브를 세트를 포함하며, 여기서 X > 2(예를 들어, X = 2, X = 3, X = 4, X = 5 등)고, 프로브는 표적 RNA 내에 X 상이한 부분을 표적으로 한다. 각각의 2'-0-메틸 RNA 프로브는 적어도 하나의 검출가능한 모이어티와 접합될 수 있다. 검출가능한 모이어티는 신호 증폭을 위해 반응성 발색제 접합 시스템(예를 들어, 티라미드 발색제 접합 시스템)에 결합하도록 적합화될 수 있다. 일부 실시태양에서, 2'-0-메틸 RNA 프로브는 각각 15 내지 30 뉴클레오티드, 20 내지 50 뉴클레오티드, 40 내지 80 뉴클레오티드, 20 내지 100 뉴클레오티드, 또는 20 내지 200 뉴클레오티드의 길이를 포함하며, 그 전체로 참조로 본 명세서에 편입되는 WO2015124738을 참조한다.
시료는 인시츄 하이브리드화(ISH) 프로토콜에 따라 가공된 유방 세포 샘플일 수 있다. ISH 프로토콜은 관심 서열에 뉴클레오티드의 상보적 가닥(예를 들어, 프로브)을 혼성화시켜 세포 조제물 중 특이적 핵산 서열(예를 들어, DNA, mRNA 등)의 가시화를 제공할 수 있다. ISH 프로토콜은 제한없이, 듀얼 SISH 및 레드 ISH 프로토콜, 단일 Red ISH 프로토콜, 단일 SISH 프로토콜 등을 포함한다. 그 전체로 참조로 본 명세서에 편입되는 O2013113707을 참조한다.
동적 대립유전자-특이적 하이브리드화(Dynamic allele-specific hybridization; DASH)
동적 대립유전자-특이적 하이브리드화(DASH) 유전자형 분석은 불일치된 염기쌍의 불안정성으로 인한 DNA 내 용융 온도의 차이를 이용한다. 이 과정은 대단히 자동화될 수 있고 소수의 단순한 원리를 포괄한다. 제1 단계에서, 게놈 절편을 증폭시키고 비오틴화된 프라이머와의 PCR 반응을 통해 비드에 부착시킨다. 제2 단계에서 증폭된 생성물을 스트렙타비딘 컬럼에 부착시키고 NaOH로 세척하여 비바이오틴화 가닥을 제거한다. 다음으로 대립유전자-특이적 올리고뉴클레오티드를 이중 가닥 DNA에 부착시 형광을 발광하는 분자의 존재 하에서 첨가한다. 용융 온도(Tm)가 결정될 수 있을 때까지 온도를 상승시키면서 강도를 측정한다. SNP는 예상 Tm보다 낮아 질 것이다. DASH 유전자형분석이 Tm의 정량가능한 변화를 측정하기 때문에, 단지 SNP만이 아닌 모든 유형의 돌연변이를 측정할 수 있다. DASH의 다른 이득은 표지 무함유 프로브를 사용해 작업하는 능력 및 이의 단순 디자인 및 수행 조건을 포함한다.
분자 비콘
분자 비콘은 특별하게 조작된 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용한다. 올리고뉴클레오티드는 각 말단에 상보적 영역 및 그 사이에 위치하는 프로브 서열이 존재하도록 디자인된다. 이러한 디자인은 이의 선천적, 단리된 상태인 헤어핀, 또는 스템-루프, 구조를 프로브가 취할 수 있게 한다. 프로브의 한 말단에는 형광단이 부착되고 다른 말단에는 형광 소광제가 부착된다. 프로브의 스템-루프 구조 때문에, 형광단은 소광제에 매우 가깝게 존재해서, 분자가 임의의 형광을 발광하는 것을 방지한다. 분자는 또한 오직 프로브 서열이 어세이에 사용될 게놈 DNA에 상보적이도록 조작된다(Abravaya et al.(April 2003). "Molecular beacons as diagnostic tools: technology and applications". Clin. Chem. Lab. Med. 41(4): 468-74). 분자 비콘의 프로브 서열이 어세이 동안 이의 표적 게놈 DNA와 만나면, 어닐링되고 하이브리드화될 것이다. 프로브 서열의 길이 때문에, 프로브의 헤어핀 절편은 보다 긴, 더욱 안정한 프로브-표적 하이브리드를 형성하는 것을 위해 변성될 것이다. 이러한 입체형태 변화는 형광단과 소광제가 헤어핀 회합으로 인해 그들의 친밀한 인접성에서 자유롭게 하여, 분자가 형광발광되게 한다. 다른 한편으로 프로브 서열이 하나의 비상보적 뉴클레오티드만큼 적게 표적 서열을 만나면, 분자 비콘은 이의 선천적 헤어핀 상태에서 우선적으로 머무를 것이고 형광단이 소광된 채로 남으므로 형광발광이 관찰되지 않을 것이다.
프라이머 연장
프라이머 연장은 먼저 SNP 뉴클레오티드의 바로 상류의 염기와 프로브의 하이브리드화와 이후 DNA 중합효소가 SNP 뉴클레오티드에 상보적인 염기를 첨가하여 하이브리드화된 프라이머를 연장시키는 '미니-시퀀싱' 반응을 포함하는 2단계 과정이다. 이렇게 도입되는 염기는 SNP 대립유전자를 검출하고 결정한다(Syvanen, Nat Rev Genet. 2001 Dec;2(12):930-42). 프라이머 연장이 고도로 정확한 DNA 중합효소를 기반으로 하므로, 이 방법은 일반적으로 매우 신뢰할만하다. 프라이머 연장은 또한 고도로 탄력적이게 하는 매우 유사한 반응 하에서 대부분의 SNP를 유전자분석할 수 있다. 프라이머 연장 방법은 복수의 어세이 형식에 사용된다. 이들 형식은 MALDI-TOF 질량 분광법(시쿼놈(Sequenom) 참조) 및 ELISA-유사 방법을 포함하는 광범위한 검출 기술을 사용한다. 일반적으로, 형광 표지된 디데옥시뉴클레오티드(ddNTP) 또는 형광 표지된 데옥시뉴클레오티드(dNTP)의 도입을 사용하는 2가지 접근법이 존재한다. ddNTP인 경우, 프로브는 SNP 뉴클레오티드의 바로 상류의 표적 DNA와 하이브리드화되고, SNP 대립유전자에 상보적인 단일, ddNTP는 프로브의 3' 말단에 첨가된다(디디옥시뉴클레오티드 내 누락된 3'-히드록실은 추가 뉴클레오티드가 첨가되는 것을 방지함). 각각의 ddNTP는 동일한 반응에서 모든 4종의 대립유전자의 검출을 가능하게 하는 상이한 형광 신호로 표지된다. dNTP의 경우, 대립유전자-특이적 프로브는 조사되는 SNP 대립유전자 각각에 상보적인 3' 염기를 갖는다. 표적 DNA가 프로브의 3' 염기에 상보적인 대립유전자를 함유하면, 표적 DNA는 프로브와 완전하게 하이브리드화되어 DNA 중합효소가 프로브의 3' 말단으로부터 연장되도록 한다. 이는 프로브의 말단 상에 형광 표지된 dNTP의 도입에 의해 검출된다. 표적 DNA가 프로브의 3' 염기에 상보적인 대립유전자를 함유하지 않으면, 표적 DNA는 프로브의 3' 말단에서 미스매치를 생성시킬 것이고 DNA 중합체는 프로브의 3' 말단으로부터 연장될 수 없을 것이다. 제2 접근법의 이득은 몇몇 표지된 dNTP가 성장하는 가닥에 도입될 것이고, 증가된 신호를 가능하게 한다는 것이다.
마이크로어레이
마이크로어레이 배후의 핵심 원리는 2개 DNA 가닥 사이의 하이브리드화로서, 상보성 뉴클레오티드 염기쌍 사이에 수소 결합을 형성하여 서로 서로 특이적으로 쌍을 형성하는 상보성 핵산 서열의 특성이다. 뉴클레오티드 서열의 높은 수의 상보성 염기쌍은 2개 가닥 사이에 보다 단단한 비공유적 결합을 야기시킨다. 비특이적 결합 서열을 씻겨낸 후, 오직 강력하게 쌍형성된 가닥이 하이브리드화된 채로 남게될 것이다. 프로브 서열에 결합하는 형광 표지된 표적 서열은 하이브리드화 조건(예컨대, 온도), 및 하이브리드화 후 세척에 의존하는 신호를 발생시킨다. 스폿(피처)으로부터의 신호의 전체 강도는 그 스폿에 존재하는 프로브에 결합된 표적 샘플의 양에 의존적이다. 마이크로어레이는 피처의 강도가 상이한 조건 하에서 동일한 피처의 강도와 비교되는 상대적 정량화를 사용하며, 피처의 정체는 그 위치에 의하 알게 된다.
핵산 어레이(또한 올리고뉴클레오티드 어레이, DNA 마이크로어레이, DNA 칩, 유전자 칩 또는 바이오칩이라고도 함)는 강력한 분석 도구가 되었다. 핵산 어레이는 본질적으로 표면 상에, 예를 들어, 열과 줄로, 올리고뉴클레오티드의 체계적 분포이다. 올리고뉴클레오티드는 물리적으로 또는 공유적으로 표면에 부착될 수 있다. 표면에 올리고뉴클레오티드를 물리적으로 부착시키기 위한 한가지 방법은 그들이 표면에 접착하면 올리고뉴클레오티드 용액을 건조시키는 것을 포함한다. 건조 또는 기타 고정 후, 올리고뉴클레오티드는 표면 상의 "스폿"에 국한된다. 건조 접근법은 "도트 블롯"이라고 하는 매우 낮은 밀도 어레이의 생산으로 시작된다. 도트 블롯은 수동으로 고형 표면에 올리고뉴클레오티드의 액적을 침착시키고 건조시켜 만들 수 있다. 대부분으 도트 블롯은 열과 줄로 배열된 약 20개보다 적은 상이한 올리고뉴클레오티드 스폿을 포함한다. 도트 블롯의 지난 진보로, 미세-스폿팅 접근법은 기계적 또는 로봇 시스템을 사용하여 복수의 미시적 스폿을 생성시켰다. 작은 크기의 스폿은 훨씬 더 높은 도트 밀도를 가능하게 하였다. 예를 들어, 미세-스폿팅을 사용하여 현미경 슬라이드 상에 수만개의 스폿을 침착시켰다. 상이한 접근법에 따라서, 올리고뉴클레오티드는 기재 또는 지지체 상에서 직접 합성되었다. 마스크리스 포토리쏘그라피 및 디지탈 광학적 화학 기술은 지지체 상에서 핵산을 직접 합성하기 위한 기술이고, 이들 접근법을 사용하여 매우 높은 밀도 어레이를 생성시켰다(예를 들어, 그 전체로 참조로 본 명세서에 편입되는 미국 특허 제7,785,863호를 참조함). 유사하게, 마스크리스 포토리쏘그라피를 사용하여 펩티드 어레이를 제작하였다(예를 들어, 그 전체로 참조로 본 명세서에 편입되는 하기 문헌을 참조함: Singh-Gasson et al. Maskless fabrication of light-directed oligonucleotide microarray using a digital micromirror array. Nat Biotechnol 1999, 17:974-978). 디지탈 광학적 화학을 사용하여 독특한 올리고뉴클레오티드의 개체군을 각각 함유하는 수백만개의 개별 영역을 갖는 어레이를 생성시켰다. 핵산 및 펩티드 어레이는 기재 표면 상에 어레이 영역(본 명세서에서 "도트"라고 함)을 포함하며, 각각의 영역은 특정 올리고뉴클레오티드 또는 펩티드에 대해 디자인되었다. "어레이 밀도"는 본질적으로 소정 영역에 분포된 도트의 복수의 열과 줄을 갖는다. 고밀도 어레이는 소정 영역 내에 복수의 열과 줄을 갖는다. 핵산과 펩티드 어레이 산업이 발전됨에 따라서, 고밀도 어레이의 이용성 또한 증가되었다. 소정 영역 내 도트의 수가 증가되면서, 각 도트의 크기는 감소된다. 예를 들어, 현미경 슬라이드의 영역에 걸쳐 분포된 수백만개의 독특한 올리고뉴클레오티드 또는 펩티드를 갖는 어레이의 한 도트는 대략 100 pm2이다. 이러한 도트의 작은 크기는 어레이를 사용한 결과를 판독하고 이해하는데 기술적 도전을 일으킨다. 예를 들어, 100 pm2 도트는 고립된 상태로 육안으로 관찰될 수 있지만, 인간은 확대하지 않고 밀접하게 있는 둘 이상의 100 pm2 도트를 육안으로 분해할 수 없다. 따라서, 고밀도 어레이의 제작 및 이용은 사용자가 더이상 어레이를 육안으로 판독하지 못하는 단계까지 진보하였다. 어레이가 작은 영역에 방대한 수(수백만)의 밀접하게 어레이된 도트를 포함하기 때문에, 정교한 이미지화 디바이스가 어레이로부터의 신호를 검출하고 소프트웨어를 사용해 데이타를 해석한다. 게다가, 고도로 민감한 검출 방법이 이용될 수 있다. 고도로 민감한 기술인 형광발광 이미지화는 하이브리드화 사건을 검출하기 위한 표준 접근법이 되었다. 이들 어레이의 형광발광 이미지화는 필터 및 카메라가 장착된 현미경을 일반적으로 사용한다. 형광발광은 일반적으로 이들 디바이스의 도움없이 육안으로 분해될 수 없다. 고도로 복잡한 형광발광 이미지는 데이타의 부피가 크고 이의 프레젠테이션을 인지할 수 없기 때문에 소프트웨어를 사용해 처리된다. 예를 들어, 미국 특허 제6,090,555호(Fiekowsky, et al.)는 핵산 어레이로부터 획득된 형광발광 이미지의 컴퓨터 보조 정렬 및 디콘볼루션을 포함하는 복잡한 과정을 기술한다. 대량 병렬 게놈 또는 단백체 조사를 수행하는 능력이 상당히 가치있지만, 핵산 및 펩티드 어레이는 결합 사건을 검출하여 해독하는데 있어 어려움으로 인해 적용성이 제한적이었다. 게다가. 형광발광의 사용은 시간 경과에 따라 분해되는 형광발광 신호로 인해 어레이의 일반적인 적용성에 많은 장애 및 수반되는 형광발광 검출 하드웨어의 복잡성을 일으켰다. 본 공개는 표적 분자를 검출하기 위한 디바이스 및 디바이스의 사용 방법에 관한 것으로서, 디바이스는 올리고뉴클레오티드 또는 펩티드 어레이를 포함한다. 디바이스는 기재 표면에 결합하는 복수의 결합 분자를 포함한다. 결합 분자는 표적 분자에 결합하도록 디자인된다. 표적 및 결합 분자의 결합은 디바이스의 조사를 통해 동정될 수 있다. 일부 실시태양에서, 디바이스는 표적 핵산과 고정된 올리고뉴클레오티드 사이의 하이브리드화 사건의 검출을 할 수 있다. 다른 실시태양에서, 디바이스는 표적 폴리펩티드와 고정된 펩티드 사이에 결합 사건의 검출을 가능하게 한다. 예시적인 실시태양에서, 디바이스는 적어도 하나의 기재 표면을 갖는 기재, 및 기제 표면에 결합하는 복수의 고정된 올리고뉴클레오티드 또는 펩티드를 포함하며, 복수의 고정된 올리고뉴클레오티드 또는 펩티드는 적어도 하나의 광학적으로 해석가능한 패턴을 형성하도록 기재 상에 패턴화된다. 그 전체로 참조로 본 명세서에 편입되는 WO2013110574를 참조한다.
본 공개의 예시적 실시태양는 하나 이상의 표적 화합물의 검출을 위해 디바이스를 이용하는 것을 포함할 수 있다. 특히 관심있는 표적 화합물의 한 유형은 표적 핵산 또는 표적 올리고뉴클레오티드이다. 특히 관심있는 또 다른 유형의 표적 화합물은 표적 폴리펩티드이다. 고정된 올리고뉴클레오티드를 포함하는 본 공개의 실시태양에서, 표적 핵산은 표적 분자 유형인 것으로 통상적으로 이해된다. 그러나, 당업자는 고정된 올리고뉴클레오티드가 다양한 다른 표적 화합물을 검출할 수 있는 올리고뉴클레오티드-결합 모이어티 접합체에 결합 파트너를 제공한다는 것을 이해한다. 예를 들어, 고정된 올리고뉴클레오티드를 사용하여, 항체-올리고뉴클레오티드 접합체를 디바이스 상에 고정시켜서 디바이스를 항체 마이크로어레이로 전환시킬 수 있다. 항체 마이크로어레이를 사용하여 관심 단백질 표적을 검출할 수 있다. 유사하게, 고정된 펩티드를 포함하는 실시태양에서, 표적 분자 유형은 항체, 단백질, 또는 효소를 포함할 수 있다. 그러나, 기본 펩티드가 또한 펩티드 결합 모이어티 및 분자 표적화 모이어티의 접합체를 사용하여 수식될 수 있다. 게다가, 본 공개가 특히 고정된 올리고뉴클레오티드 및 펩티드를 개시하지만, 그들은 단지 예시적인 고정된 검출 모이어티이다. 본 명세서에 개시된 바와 같은 개념에서 벗어나지 않고, 본 명세서에 기술된 바와 같은 디바이스로 도입될 수 있는 많은 다른 유용한 고정된 검출 모이어티가 존재한다. 예를 들어, 검출 모이어티는 압타머, 리간드, 킬레이터, 탄수화물, 및 인간이 만든 이의 등가물을 포함할 수 있다. 그 전체로 참조로 본 명세서에 편입되는 WO2013110574를 참조한다.
CTC를 단리하는 방법은 EpCAM, ERG, PSMA, 또는 이의 조합에 특이적인 항체의 사용을 포함할 수 있다. 단리된 CTC는 유리 슬라이드 또는 기타 기재에 도포되어 고정된다(예를 들어, 당분야에 공지된 방법을 사용). 본 명세서에 기술된 바와 같은 전립선 특이적 항체를 사용한 신규한 확산 방법이 또한 CTC를 단리하고 그들을 고정 전에, 기재, 예컨대 유리 슬라이드에 적용하는 데 사용할 수 있다. 장착되고 고정된 CTC는 예를 들어, CTC에서 그들의 상보성 서열과 하이브리드화하도록 핵산 프로브에 충분한 조건 하에서, ERG, PTEN, 및 CEN-10에 특이적인 하나 이상의 핵산 프로브와 접촉된다. 핵산 프로브는 예를 들어 하나 이상의 양자점으로 표지된다. 예를 들어, ERG,PTEN, 및 CEN-10에 특이적인 핵산 프로브(들)는 프로브를 서로 구별할 수 있도록, 상이한 양자점으로 각각 표지될 수 있다. 핵산 프로브가 ERG, PTEN, 및 CEN-10에 하이브리드화될 수 있게 한 후, 하나 이항의 핵산 프로브 상의 하나 이상의 양자점으로부터의 신호를 예를 들어, 스펙트럼 이미지화를 사용해 검출한다. 다음으로, 신호를 분석하여, 단리된 CTC에서, 하나 이상의 ERG가 재배열되는지 여부, 하나 이상의 PTEN 유전자가 결실되었는지 여부, 및 CEN-10이 검출되었는지 여부를 결정한다. 하나 이상의 ERG가 재배열되었는지 여부, 하나 이상의 PTEN 유전자가 결실되었는지 여부, 및 CEN-10이 검출되었는지 여부를 기반으로, 전립선암을 특징규명한다. 그 전체로 참조로 본 명세서에 편입되는 WO2013101989를 참조한다.
발색성 인시츄 하이브리드화(Chromogenic in situ Hybridization; CISH)
발색성 인시츄 하이브리드화(CISH)는 인시츄 하이브리드 기술과 면역조직화학(IHC)의 발색성 신호 검출 방법을 조합한 세포유전학적 기술이다. 이것은 HER-2/neu 종양유전자 증폭의 검출을 위해 형광발광 인시츄 하이브리드화(FISH)의 대안으로서 대략 2000년에 개발되었다. CISH는 그들이 DNA의 특이적 영역의 존재 또는 부재를 검출하는데 사용되는 인시츄 하이브리드화 기술이라는 점에서 FISH와 유사하다. 그러나, CISH는 진단 실험실에서 훨씬 더 실용적인데 FISH에서 사용되는 보다 값비싸고 복잡한 형광 현미경보다는 명시야 현미경을 이용하기 때문이다.
CISH를 위한 프로브 디자인은 표지화 및 검출에 차이가 있는 FISH에 대한 것과 매우 유사할 수 있다. FISH 프로브는 일반적으로 다양한 상이한 형광 태그로 표지되며 오직 형광 현미경 하에서만 검출될 수 있는데 반해, CISH 프로브는 비오틴 또는 딕옥시게닌으로 표지되어 다른 처리 단계가 적용된 후 명시야 현미경을 사용해 검출될 수 있다. CISH 프로브는 길이가 대략 20 뉴클레오티드이고, DNA 표적을 위해 디자인된다. 그들은 표적화 서열에 상보적이고 변성 및 하이브리드화 단계 후 그에 결합된다. 오직 소수의 CISH 프로브가 상업적으로 입수가능하며, 그래서 대부분의 적용분야에서 그들은 박테리아 인공 염색체(bacterial artificial chromosome; BAC)로부터 추출, 증폭, 서열분석, 표지화 및 지도화되어야 한다. BAC은 시퀀싱 목적을 위해 인간 DNA의 짧은 단편을 단리하고 증폭하는데 필요하였기 때문에 인간 게놈 프로젝트 동안 개발되었다. 요즘에는, BAC은 공공 데이타베이스 예컨대 UCSc 게놈 브라우저를 사용해 인간 게놈 상에서 선택되고 위치될 수 있다. 이는 상보성 및 서열 특이성을 보장한다. DNA는 BAC 클론으로부터 추출되어 중합효소 기반 기술, 예컨대 축퇴성 올리고뉴클레오티드 프라이밍된(DOP)-PCR을 사용해 증폭된다. 다음으로, 클론은 서열분석되어 게놈 상의 그들 위치가 입증된다. 프로브 표지화는 비오틴 또는 딕옥시게닌을 도입시키기 위한 닉 번역 또는 무작위 프라이밍을 사용해 수행될 수 있다.
샘플의 제조, 프로브의 하이브리드화 및 검출: 샘플은 간기 또는 중기인 염색체를 포함할 수 있다. 샘플은 단단하게 표면, 예컨대 유리 슬라이드에 부착된다. 샘플은 표적이 접근가능하도록 보장하기 위해 펩신 소화를 겪을 수 있다. 10-20 ㎕ 의 프로브를 첨가하고, 샘플을 고무 시멘트로 밀봉된 커버슬립으로 덮고, 슬라이드를 97℃로 5 내지 10분간 가열하여 DNA를 변성시켰다. 이후 슬라이드를 37℃ 오븐에 밤새 위치시켜서 프로브가 하이브리드화할 수 있게 한다. 다음 날, 샘플을 세척하고 비특이적 단백질 결합 부위에 대한 차단제를 적용한다. 홀스래디쉬 퍼옥시다제(HRP)를 사용하려고 한다면, 샘플은 내생성 퍼옥시다제 활성을 억제하기 위해 과산화수소 중에서 항온반응되어야만 한다. 딕옥시게닌이 프로브 표지로서 사용되면, 항-딕옥시게닌 플루오레세인 1차 항체와 이어서 HRP-접합된 항-플루오레세인 2차 항체가 적용된다. 비오틴이 프로브로 사용되면, 비특이적 결합 부위가 먼저 소 혈청 알부민(BSA)를 사용해 차단되어야만 한다. 다음으로, HRP-접합된 스트렙타비딘을 검출에 사용한다. 다음으로, HRP는 아미노벤지딘(DAB)을, 40배 내지 60배 배율에서 명시야 현미경으로 검출할 수 있는 불용성 갈색 생성물로 전환시킨다. 대비염색 예컨대 헤마톡실린 및 에오신을 사용하여 생성물을 더욱 가시화시킬 수 있다.
분자 세포유전학적 기술, 예컨대 발색성 인시츄 하이브리드화(CISH)은 분자 기술과 염색체의 육안 평가(핵형 분석)를 조합한다. 분자 세포유전학 방법은 세포 내에서 이의 상보성 핵산과 핵산 프로브의 하이브리드화를 기반으로 한다. 특이적 염색체 영역에 대한 프로브가 중기 염색체 상에서 또는 간기 핵(예를 들어, 샘플 내)에서 이의 상보성 서열을 인식하여 하이브리드화될 것이다. 프로브는 다양한 진단 및 연구 목적을 위해 개발되었다. 서열 프로브는 특이적 염색체 영역 또는 유전자 내 단일 카피 DNA 서열에 하이브리드화한다. 이들은 관심 증후군 또는 병태와 연관된 염색체의 핵심 영역 또는 유전자를 동정하는데 사용되는 프로브이다. 중기 염색체에서, 이러한 프로브는 각각의 염색질에 하이브리드화 되어, 일반적으로 염색체 당 2개의 작은, 별개의 신호를 제공한다. 서열 프로브, 예컨대 반복 고갈된 프로브 또는 독특한 서열 프로브의 하이브리드화는 항상성 유전자 이상, 예컨대 미세결실 증후군, 염색체 전위, 유전자 증폭 및 이수성 증후군, 신생물성 질환 뿐만 아니라 병원체 감염을 포함하는, 수많은 질환 및 증후군과 연관된 염색체 비정상성의 검출을 가능하게 하였다. 가장 일반적인 이들 기술이 현미경 슬라이드 상의 표준 세포유전학적 조제물에 적용된다. 또한, 이들 과정은 고정된 세포 또는 기타 핵 단리물의 슬라이드 상에서 사용될 수 있다. 예를 들어, 이들 기술은 암의 진단과 예후 둘 모두를 위해 종양 세포를 특징규명하는데 빈번하게 사용된다. 수많은 염색체 비정상성은 암의 발생과 연관되어 있다(예를 들어, 특정 골수성 장애와 연관된 이수성 예컨대 삼염색체 8; 전위 예컨대 만성 골수형성성 백혈병에서 BCR/ABL 재배열; 및 신생물성 형질전환과 연관된 특정 핵산 서열의 증폭). 분자 기술은 이렇게 획득된 염색체 이상의 검출 및 특징규명에서 표준 세포유전학적 검사를 증강시켰다. 이중 색상 CISH를 위한 시스템이 도입되었다. 이들은 Dako DuoCISH™ 시스템 및 Zyto Vision ZytoDot® 2C 시스템을 포함한다. 이들 시스템 둘 모두는 2색상 검출 단계를 위해 별개의 효소(알칼리 포스파타제 및 홀스래디쉬 퍼옥시다제)를 사용한다.
본 공개는 발색성 인시츄 하이브리드화(CISH)를 위한 시스템 및 방법에 관한 것으로서, 특히 단일 어세이로 둘 이상의 색상 검출 시스템 사이의 간섭을 방지하는 방법에 관한 것이며, 해체 프로브를 이용하여 어세이를 점수매김하는 방법에 관한 것이다. 그 전체로 참조로 본 명세서에 편입되는 WO2011133625를 참조한다.
형광발광 인시츄 하이브리드화(Fluorescence in situ hybridizaiton; FISH)
형광발광 인시츄 하이브리드화(FISH)는 높은 정도의 서열 상보성으로 염색체의 오직 일부에만 결합하는 형광 프로브를 사용하는 세포유전학적 기술이다. 이는 1980년 초에 생물의학 연구자들에 의해 개발되어서 염색체 상에 특정 DNA 서열의 존재 또는 부재를 검출하고 국재화시키는데 사용되었다. 형광발광 현미경 관찰을 사용하여 어디서 형광 프로브가 염색체에 결합하는 가를 확인할 수 있다. FISH는 종종 유전자 상담, 약물 및 종 동정에 사용을 위한 DNA의 특별한 특성을 찾는데 사용된다. FISH는 세포, 순환 종양 세포, 및 샘플에서 특정 RNA 표적(예컨대 mRNA, lncRNA 및 miRNA)을 검출하고 국재화시키는데 사용될 수 있다. 이러한 문맥에서, 세포 내 유전자 발현의 공간적-일시적 패턴을 한정하는데 도움이 될 수 있다.
프로브: RNA 및 DNA: RNA 프로브는 세포내 mRNA, lncRNA 및 miRNA의 가시화를 위해서 임의의 유전자 또는 유전자내 임의 서열에 대해 디자인될 수 있다. FISH는 임의의 염색체 비정상성에 대해 세포 재생산 주기, 특히 핵의 간기를 조사하여 사용된다. 이러한 기술 [FISH]은 유사한 염색체를 끌어모으는 인공 염색체 파운데이션으로 프로브를 생성시켜 정확한 염색체를 동정하기 위해 방대한 일련의 문서 사례의 분석을 훨씬 쉽게 한다. 핵 비정상일 때 각 프로브에 대한 하이브리드화 신호가 검출된다. mRNA 및 lncRNA의 검출을 위한 각 프로브는 20 올리고뉴클레오티드 쌍으로 구성되고, 각 쌍은 40 내지 50 bp의 공간을 포괄한다. miRNA 검출의 경우, miRNA의 특이적 검출을 위한 전매 화학을 사용하고 전체 miRNA 서열을 포괄한다. 프로브는 종종 인간 게놈 프로젝트에서 사용을 위해 단리, 정제 및 증폭된 DNA의 단편으로부터 유래된다. 인간 게놈의 크기는 직접 서열분석할 수 있는 길이와 비교하여, 너무 커서, 게놈을 단편으로 나누는 것이 필요하였다(궁극적인 분석에서, 이들 단편은 서열 특이적 엔도뉴클레아제를 사용해 여전히 보다 작은 단편으로 각 단편의 카피를 소화시키고, 크기 배제 크로마토그래피를 사용해 각각의 소형 단편의 크기를 측정하고, 어디서 거대 단편이 다른 것과 중복되는가를 결정하기 위해 정보를 사용하여 정리됨). 그들의 개별 DNA 서열을 갖는 단편을 보존하기 위해서, 단편을 연속 복제 박테리아의 시스템으로 첨가시킨다. 각 개체군이 단일 인공 염색체를 유지하는, 박테리아의 클론 개체군은 전세계의 다양한 실험실에서 저장되고 있다. 인공 염색체(BAC)은 임의 실험실에서 성장, 추출 및 표지될 수 있다. 이들 단편은 대략 100,000개의 염기쌍이고, 대부분의 FISH 프로브의 기초이다.
제조 및 하이브리드화 방법 - RNA: 세포는 표적 접근성이 가능하도록 투과될 수 있다. FISH는 또한 미고정된 세포에서 성공적으로 수행되었다. 20 올리고뉴클레오티드 쌍으로 구성된 표적 특이적 프로브가 표적 RNA(들)에 하이브리드화된다. 별개이지만 상용성인 신호 증폭 시스템은 다중 어세이(어세이 당 최대 2개 표적)를 가능하게 한다. 신호 증폭은 일련의 순차적 하이브리드화 단계를 통해 획득된다. 어세이 종료시, 샘플은 형광 현미경 하에서 가시화된다.
제조 및 하이브리드화 과정 - DNA: 먼저, 프로브를 제작한다. 프로브는 이의 표적과 특이적으로 하이브리드화되기에 충분하게 커야만 하지만 하이브리드화 과정을 방해할 정도로 커서는 안된다. 프로브는 형광단, 항체에 대한 표적 또는 비오틴으로 직접 태그화된다. 태그화는 다양항 방식, 예컨대 닉 번역, 또는 태그화 뉴클레오티드를 사용한 PCR로 수행될 수 있다. 다음으로, 간기 또는 중기 염색체 조제물을 생성시킨다. 염색체를 기재, 일반적으로 유리에 확고하게 부착시킨다. 반복성 DNA 서열은 샘플에 DNA의 짧은 단편을 첨가하여 차단시켜야 한다. 프로브를 염색체 DNA에 적용하고 하이브리드화하면서 대략 12시간 동안 항온반응시킨다. 몇몇 세척 단계가 모든 비하이브리드화되거나 또는 부분 하이브리드화된 프로브를 제거한다. 결과는 염료를 여기시키고 이미지를 기록할 수 있는 현미경을 사용해 가시화하고 정량한다. 형광 신호가 약하면, 현미경의 검출 한계치를 넘기 위해서 신호의 증폭이 필요할 수 있다. 형광 신호 강도는 프로브 표지화 효율, 프로브의 유형, 및 염료의 유형과 같은 많은 인자들에 의존적이다. 형광 태그화된 항체 또는 스트렙타비딘이 염료 분자에 결합된다. 이들 이차 구성요소는 그들이 강력한 신호를 갖도록 선택된다.
섬유 FISH
간기 또는 중기 제조에 대한 대안적 기술인, 섬유 FISH에서, 간기 염색체가, 그들이 통상의 FISH에서 처럼 단단하게 나선으로 꼬이거나, 또는 간기 FISH에서 처럼 염색체 지역 입체형태를 채택하기보다는, 직선으로 신장되는 방식으로 슬라이드에 부착된다. 이것은 슬라이드에 고정되어 용해시킨 세포, 또는 정제된 DNA의 용액에 대해, 슬라이드의 길이를 따라 기계적 전달을 가하여 수행된다. 염색체 코빙으로 알려진 기술은 이러한 목적으로 갈수록 더 사용된다. 염색체의 연장된 입체형태는 수 킬로베이스에 이르지만 극적으로 더 높은 해상도를 가능하게 한다.
정량적 FISH(Q-FISH)
정량적 형광 인시츄 하이브리드화(Q-FISH)는 전통적인 FISH 방법론을 기반으로 하는 세포유전학적 기술이다. Q-FISH에서, 이 기술은 형광 현미경관찰 및 분석 소프트웨어를 사용하여 염색체 DNA에서 표적 서열을 정량하기 위해 펩티드 핵산(PNA) 올리고뉴클레오티드라고 불리는 표지된(Cy3 또는 FITC) 합성 DNA 모방체를 사용한다.
유동 FISH
유동-FISH는 세포유전학적 형광 인시츄 하이브리드화 염색 프로토콜과 유세포분석의 조합을 통해 전체 세포 개체군의 게놈 DNA 중 특이적 반복 성분의 카피수를 정량하기 위한 세포유전학적 기술이다. 유동-FISH는 콜세미드, 저장성 쇼크, 및 메탄올/아세트산 처리를 통한 슬라이드로의 고정으로 처리된 세포의 제조된 중기 스프레드 상에서 텔로미어 반복부를 염색하기 위해 플루오레세인 형광단으로 표지된 3'-CCCTAACCCTAACCCTAA-5' 서열의 펩티드 핵산 프로브를 적용하는, Q-FISH, 텔로미어 길이를 분석하기 위한 또 다른 기술의 변형으로서, Rufer 등이 1998년에 처음 공개하였다(프로토콜은 온라인에서 입수가능). 최종 형광 스폿의 이미지는 이후에 특수 컴퓨터 프로그램(Flintbox Network에서 입수할 수 있는 방법 및 소프트웨어)을 통해 분석되어 실제 텔로미어 길이를 추산하는데 사용될 수 있는 정량적 형광발광 값을 산출한다. 프로브 염색으로 산출된 형광발광성은 정량적인 것으로 간주되는데 PNA가 저이온 염 농도 및 포름아마이드의 존재 하에서 DNA에 우선적으로 결합하여, DNA 듀플렉스가 용융되어 PNA 프로브에 어닐링되면 재형성될 수 없어서, 프로브가 이의 표적 반복 서열을 포화시킬 수 있게 되어(상보성 가닥 상에서 안티 센스 DAN와 경쟁하여 표적 DNA로부터 교체되지 않기때문), 미결합 프로브를 세척한 후 소정 염색체 부위에서 PNA 프로브 표적의 빈도에 대한 신뢰할만하고 정량할 수 있는 판독치를 산출하기 때문이다.
비교 게놈 하이브리드화
비교 게놈 하이브리드화는 세포를 배양시킬 필요없이, 기준 샘플과 비교한 시험 샘플의 DNA에서 배수성 수준에 대해 카피부 변동(CNV)을 분석하기 위한 분자 세포유전학적 방법이다. 이 기술의 목적은 종종 가장 밀접하게 관련된, 2개 공급원으로부터 발생된 2개 게놈 DNA 샘플을 신속하고 효율적으로 비교하는 것인데, 그들이 전체 염색체 또는 하위 염색체 영역(전체 염색체의 일부분)의 획득 또는 상실에 있어서 차이를 함유한다고 의심되기 때문이다. 이 기술은 본래 고형 종양과 정상 조직 샘플의 염색체 상보성 간 차이의 평가를 위해 개발되었고, 이용되는 현미경의 해상도에 의헤 제한되는 형광 인시츄 하이브리드화(FISH) 및 김자 밴딩(g-banding)의 보다 전통적인 세포유전학적 분석 기술과 비교해 5-10 메카베이스의 개선된 해상도를 갖는다.
블롯팅
이하 부문에서 더욱 설명하고 당분야에 공지된 바와 같이, 이용할 수 있는 예시적인 블롯팅 기술은 웨스턴, 서던, 이스턴, 파-웨스턴, 사우쓰웨스턴, 노던웨스턴 및 노던 블롯팅이다.
웨스턴 블롯팅
웨스턴 블롯(때때로 단백질 면역블롯이라고 함)은 샘플 균질물 또는 추출물에서 특정 단백질을 검출하는데 사용되는 광범위하게 사용되는 분석 기술이다. 이는 폴리펩티드의 길이에 의해 변성된 단백질 또는 3-D 구조에 의해 선천 단백질을 분리하기 위해 겔 전기영동을 사용한다. 이후 단백질을 막(전형적으로 니트로셀룰로스 또는 PVDF)으로 옮기고 여기서 그들을 표적 단백질에 특이적인 항체로 염색한다. 겔 전기영동 단계는 항체의 교차 반응 문제를 해결하기 위해 웨스턴 블롯 분석에 포함된다.
서던 블롯팅
서던 블롯팅은 필터 막으로 전기영동 분리된 DNA 단편의 전달 및 프로브 하이브리드화에 의한 후속 단편 검출을 조합한다. 필터 막 상의 특정 DNA 단편과 프로브의 하이브리드화는 이 단편이 프로브에 상보적인 DNA 서열을 함유한다는 것을 의미한다. 전기영동 겔에서 막으로 DNA의 전달 단계는 크기 분획된 DNA와 표지된 하이브리드화 프로브의 쉬운 결합을 가능케 한다. 또한 방사능 사진촬영 또는 기타 검출 방법에 의한 분석에 이용할 수 있는, 표적-프로브 하이브리드의 고정을 가능하게 한다. 제한 효소 소화된 게놈 DNA로 수행된 서던 블롯을 사용하여 게놈 내 서열의 수(예를 들어, 유전자 카피)를 결정할 수 있다. 제한효소에 의해 절단되지 않은 단일 DNA 절편에만 하이브리드화하는 프로브는 서던 블롯 상에 단일 밴드를 생성시킬 것이지만, 다수 밴드가 아마도 프로브가 몇몇 고도로 유사한 서열(예를 들어, 서열 중복의 결과일 수 있는 것)과 하이브리드화될 경우 관찰될 수도 있다. 하이브리드화 조건의 변형(예를 들어, 하이브리드화 온도의 상승 또는 염 농도의 감소)을 사용하여 100% 미만으로 유사한 서열과 프로브의 하이브리드화를 감소시키고 특이성을 증가시킬 수 있다.
이스턴 블롯팅
이스턴 블롯팅은 단백질 번역 후 수식(PTM) 예컨대 지질, 포스포-모이어티, 및 당접합체를 분석하는데 사용되는 생화학적 기술이다. 탄수화물 에피토프를 검출하는데 가장 흔히 사용된다. 따라서, 이스턴 블롯팅은 웨스턴 블롯팅의 생화학적 기술의 연장으로 간주될 수 있다. 복수의 기술이 용어 이스턴 블롯팅으로 설명되었고, 대부분은 PVDF 또는 니트로셀룰로서 상의 SDS-PAGE 겔로부터 블롯팅된 단백질을 사용한다. 전달된 단백질은 지질, 탄수화물, 인산화 또는 임의의 다른 단백질 수식을 검출할 수 있는 프로브를 사용해 번역 후 수식에 대해 분석된다. 이스턴 블롯팅은 표준 파-웨스턴 블롯과 그들을 구별하는, PTM과 프로브의 특이적 상호작용을 통해 그들 표적을 검출하는 방법이라고 한다. 이론적으로 이스턴 블롯팅은 렉틴 블롯팅과 유사하다(즉, 단백질 또는 지질 상의 탄수화물 에피토프의 검출).
파-웨스턴 블롯팅
파-웨스턴 블롯팅은 블롯 상에 광심 단백질(들)을 프로빙하기 위해 비단백질을 적용한다. 이러한 방식으로 프로브(또는 블롯팅된) 단백질의 결합 파트너가 동정될 수 있다. 프로브 단백질은 종종 발현 클로닝 벡터를 사용해 이. 콜라이에서 생산된다. 먹이 단백질을 함유하는 세포 용해물 내 단백질은 먼저 SDS 또는 선천 PAGE에 의해 분리되고, 표준 WB에서 처럼 막으로 전달된다. 막에서 단백질이 변성되고 재생된다. 막을 차단하고 일반적으로 정제된 미끼 단백질(들)로 프로빙한다. 미끼 단백질 및 먹이 단백질이 함께 복합체를 형성하면, 미끼 단백질은 먹이 단백질이 위치하는 스폿 상에서 검출된다. 프로브 단백질을 일반적인 방법을 통해 가시화할 수 있는데, 방사성표지될 수 있거나, 항체가 존재하는 His 또는 FLAG와 같은 특이적 친화도 태그를 보유할 수 있거나, 또는 단백질 특이적 항체(프로브 단백질에 대함)가 존재할 수 있다.
서던웨스턴 블롯팅
서던 블롯팅(에드윈 서던(Edwin Southern)이 만듬)의 라인을 기반으로 하고 1980년에 B. Bowen, J. Steinberg 및 동료들이 먼저 기술한, 서던웨스턴 블롯팅은 특이적 올리고뉴클레오티드 프로브에 결합하는 그들 능력에 의해 DNA-결합 단백질(DNA에 결합하는 단백질)을 동정하고 특징규명하는 것을 포함하는 실험실 기술이다. 단백질은 겔 전기영동으로 분리시키고 이후에 다른 유형의 블롯팅과 유사한 니트로셀룰로스 막으로 전달한다. "사우쓰웨스턴 블롯 맵핑"은 DNA-결합 단백질 및 그들의 게놈 DNA 상의 특이적 부위 둘 모두를 신속하게 특징규명하기 위해 수행된다. 단백질은 소듐 도데실 설페이트(SDS)를 함유하는 폴리아크릴아미드 겔(PAGE) 상에서 분리하고, 우레아 존재 하에서 SDS를 제거하여 재생시키고, 확산에 의해 니트로셀룰로스 상에 블롯팅한다. 관심 게놈 DNA 영역을 적당하지만 상이한 크기의 단편을 생성하도록 선택된 제한 효소로 소화시키고, 이를 이후에 말단 표지하여 분리된 단백질에 결합되게 한다. 특이적으로 결합된 DNA를 각각의 개별 단백질-DNA 복합체로부터 용리하고 폴리아크릴아미드 겔 전기영동으로 분석한다. 특이적 DNA 결합 단백질이 이 기술로 검출될 수 있다는 증거가 존재하였다. 더욱이, 그들 서열-특이적 결합은 상응하는 선택적으로 결합된 DNA 단편의 정제를 가능하게 하고 DNA 조절성 서열의 단백질-매개 클로닝을 개선시킬 수 있다.
노쓰웨스턴 블롯팅
노쓰웨스턴 블롯의 실시는 그들 크기 및 전하를 기반으로 RNA 결합 단백질을 분리시키는, 겔 전기영동에 의해 RNA 결합 단백질을 분리하는 것을 포함한다. 개별 샘플은 동시에 복수 샘플을 분석하기 위해 아가로스 또는 폴리아크릴아미드 겔(일반적으로, SDS-PAGE)에 적재시킬 수 있다. 겔 전기영동이 완료되면, 겔과 회합된 RNA 결합 단백질을 니트로셀룰로스 전달 종이로 전달한다. 새롭게 전달된 블롯을 이후 차단 용액 중에 침지시키며, 탈지 분유 및 소혈청 알부민이 일반적인 차단 완충제이다. 차단 용액은 니트로셀룰로스 막에 1차 및/또는 2차 항체의 비특이적 결합을 방지하는 것을 보조한다. 차단 용액이 블롯과 적당한 접촉 시간을 가지면, 특이적 경쟁인자 RNA를 적용하고 실온에서 항온반응하는 시간을 제공한다. 이 시간 동안, 경쟁인자 RNA가 블롯 항의 샘플 중 RNA 결합 단백질에 결합한다. 이 과정 동안 항온반응 시간은 적용되는 경쟁인자 RNA의 농도에 따라 다양할 수 있지만, 항온반응 시간은 전형적으로 1시간이다. 항온반응이 완료된 후, 블롯은 용액 중 RNA를 희석하기 위해서, 일반적으로 적어도 3회 각 세척 당 5분 간 세척된다.일반적인 세척 완충제는 포스페이트 완충 염(PBS) 또는 10% Tween 20 용액을 포함한다. 부적절하고 부적당한 세척은 블롯의 현상의 명확성에 영향을 미칠것이다. 세척이 완료되면 블롯을 전형적으로 X선 또는 유사한 방사선촬영법으로 현상시킨다.
노던 블롯팅
일반적인 노던 블롯팅은 균질화된 샘플 또는 세포로부터 전체 RNA의 추출로 시작된다. 진핵생물 mRNA는 폴리(A) 꼬리부를 갖는 RNA만을 단리하기 위해 올리고(dT) 셀룰로스 크로마토그래피의 사용을 통해 단리될 수 있다. RNA 샘플은 겔 전기영동을 통해 분리된다. 겔이 약하고 프로브가 매트릭스로 들어갈 수 없을 수 있으므로, 크기에 의해 분리된, RNA 샘플은 모세관 또는 진공 블롯팅 시스템을 통해 나이론 막으로 전달된다. 양전하를 갖는 나일론막은 음으로 하전된 핵산이 그들에 대해 높은 친화도를 가지므로 노던 블롯팅에서 사용하는데 가장 효과적이다. 블롯팅을 위해 사용된 전달 완충제는 일반적으로 포름아마이드를 함유하는데 프로브-RNA 상호작용의 어닐링 온도를 낮추어서, RNA 붕괴를 초래할 수 있는 고온의 필요성을 제거하기 때문이다. RNA가 막으로 전달되면, UV 광 또는 열에 의해 막과 공유 연결을 통해 고정시킨다. 프로브를 표지시킨 후, 막 상의 RNA와 하이브리드화된다. 하이브리드화의 특이성 및 효율성에 영향을 미칠 수 있는 실험 조건은 이온 강도, 점도, 듀플렉스 길이, 미스매치 염기쌍, 및 염기 조성을 포함한다. 막을 세척하여 프로브가 특이적으로 결합하고 발생될 배경 신호를 방지하도록 보장한다. 하이브리드 신호는 X선 필름으로 검출하며 농도계로 정량화할 수 있다. 노던 블롯 샘플에서 비교를 위한 대조군을 생성하기 위해, 관심 유전자 생성물을 보이지 않는 것을 마이크로어레이 또는 RT-PCR에 의해 결정 후 사용할 수 있다.
효소적
자동화 염색 플랫폼을 사용하여 잠재적으로 샘플 중 표적을 검출하기 위해 효소적 비오틴화를 이용하는 근접성 검출 방법이 기술된다. 개시된 일 실시태양은 제1 표적에 근접하여 결합하는 제1 특이적 결합 모이어티 및 비오틴 리가제를 포함하는 제1 접합체와 샘플을 접촉시키는 단계; 제2 표적에 근접하여 결합하는 제2 특이적 결합 모이어티 및 비오틴 리가제 기질을 포함하는 제2 접합체와 샘플을 접촉시키는 단계; 제1 표적 및 제2 표적이 근위 배열을 갖는 경우, 비오틴 리가제에 의해 비오틴 리가제 기질의 비오틴화를 가능하게 하는 조건을 샘플에 대해 가하는 단계; 및 비오틴 리가제 기질의 비오틴화를 검출하는 단계를 포함한다. 기질의 비오틴화를 가능하게 하는 조건은 비오틴 및 ATP의 첨가를 포함한다. 방법은 또한 스트렙타비딘-효소 접합체와 샘플을 접촉시키는 단계를 포함할 수 있다. 신호 증폭이 또한 사용될 수 있다. 그 전체로 참조로 본 명세서에 편입되는 WO2014139980을 참조한다.
효소-연결 면역수착 어세이(ELISA)
ELISA?? 수행은 특정 항원에 대한 특이성을 갖는 적어도 하나의 항체를 포함한다. 미지량의 항원을 갖는 샘플을 비특이적(표면에 대한 흡착을 통함)으로 또는 특이적("샌드위치" ELISA에서 동일한 항원에 특이적인 또다른 항체에 의한 포획을 통함)으로 고형 지지체(일반적으로 폴리스티렌 마이크로타이터 플레이트) 상에 고정시킨다. 항원이 고정된 후, 검출 항체를 첨가하여 항원과 복합체를 형성한다. 검출 항체는 효소에 공유적으로 연결될 수 있거나 생물-접합을 통해 효소에 연결되는 2차 항체에 의해 그 자체가 검출될 수 있다. 각 단계 사이에, 플레이트는 약한 세제 용액으로 세척하여 비특이적으로 결합된 임의의 단백질 또는 항체를 제거한다. 최종 세척 단계 후, 플레이트는 샘플 중 항원의 분량을 표시하는 가시적 신호를 생성시키도록 효소적 기질을 첨가하여 발색시킨다.
리간드 결합 어세이
순환 CTC를 함유하는 것으로 알려지거나 또는 의심되는 샘플을 분석하는 방법은 이미지화 단계를 포함할 수 있다. 일례에서, 이미지화는 CTC 동정 시약의 면역형광발광 이미지화를 포함한다(예를 들어, 사용되는 각 항체와 회합된 표지를 검출함). 또 다른 예에서, 이미지화는 복수-스펙트럼 통과대역 필터의 사용을 포함한다. 면역형광발광은 형광단에 의해 간접적으로 또는 직접적으로 표지된 항체로부터 발산될 수 있거나 또는 면역형광발광은 스펙트럼으로 여과된 가시광으로 형광단을 여기시켜 발생될 수 있다. 하나의 실시태양에서, 스펙트럼으로 여과된 가시광은 제1 형광단을 여기시키는 제1 선택 범위 및 제2 형광단을 여기시키는 제2 선택 범위를 포함하고, 제1 선택 범위는 제2 형광단을 유의하게 여기시키지 않고 제2 선택 범위는 제1 형광단을 유의하게 여기시키지 않는다. 샘플의 이미지화는 제1 선택 범위에 의해 여기된 샘플의 제1 면역형광발광 이미지 및 제2 선택 범위로 여기된 샘플의 제2 면역형광발광 이미지의 획득(및 둘 초과의 CTC 동정을 사용하면 각 표지에 대한 부가적 면역형광발광 이미지 획득) 및 제1 면역형광발광 이미지 및 제2 면역형광발광 이미지(및 수득된 경우 부가적 이미지)를 비교하거나 또는 중첩시키는 것을 포함하는, CTC 동정 시약을 국재화시키거나 또는 가시화시켜서 CTC를 국재화 또는 동정하는 단계를 포함한다. 예를 들어, 제1 면역형광발광 이미지의 이미지화는 CK+ 세포를 동정할 수 있고, 제2 면역형광발광 이미지는 CD45+ 세포를 동정할 수 있으며, 비교 또는 중첩은 CK+ 및 CD45-인 세포의 동정을 포함한다. 또다른 실시태양에서, CTC 동정 시약을 국재화시켜 CTC를 국재화시키는 것은 컴퓨터를 사용하여 제1 면역형광발광 이미지 및 제2 면역형광발광 이미지(및 수득되면 부가적 면역형광발광 이미지)를 알고리즘으로 분석하는 것을 포함한다. 하나의 실시태양에서, 알고리즘으로 분석하는 것은 세포 크기, 마커의 세포 구획 국재화, 및/또는 마커 발현의 강도를 측정하기 위해 이미지를 디지탈로 조사하는 것을 포함한다. 그 전체로 참조로 본 명세서에 편입되는 WO2013101989를 참조한다.
면역침전법(IP)
면역침전법(IP)의 액체상 리간드 결합 어세이는 복합체 혼합물로부터의 항체를 사용하여, 특이적 단백질, 또는 단백질 집단을 정제하거나 또는 농축시키는데 사용하는 방법이다. 파괴된 세포 또는 샘플의 추출물은 항원-항체 복합체를 생성하는, 관심 항원에 대한 항체와 혼합될 수 있다. 항원 농도가 낮은 경우, 항원-항체 복합체 침전은 수시간 또는 수일이 걸릴 수 있고 형성된 소량의 침전물을 단리하는 것이 어렵게 된다. 효소-연결 면역수착 어세이(ELISA) 또는 웨스턴 블롯팅은 정제된 항원(또는 복수 항원)을 수득하고 분석할 수 있는 2종의 상이한 방식이다. 이 방법은 고형(비딩된) 지지체, 예컨대 아가로즈 레진 상에 부착된 항체의 도움을 통해 항원을 정제하는 것을 포함한다. 고정된 단백질 복합체는 단일 단계 또는 연속적으로 수행될 수 있다. IP는 또한 생합성 방사선동위원소 표지화와 함께 사용될 수 있다. 이러한 기술 조합을 사용하여, 샘플 또는 세포에 의해 특이적 항원이 합성되는지 여부를 결정할 수 있다.
염색질 면역침전법(ChIP)
염색질 면역침전법(ChIP)은 세포 내 단백질과 DNA 사이의 상호작용을 조사하기 위해 사용되는 면역침전 실험 기술의 한 유형이다. 특이적 단백질이 특이적 게놈 영역과 회합되는지 여부, 예컨대 프로모터 또는 기타 DNA 결합 부위, 및 가능하게는 한정된 시스트롬 상의 전사 인자를 결정하는 것이 목적이다. ChIP은 또한 히스톤 수식자의 표적을 의미하는, 다양한 히스톤 수식이 회합된 게놈 내 특이적 위치를 결정하는 것이 목적이다.
염색질 면역침전법 시퀀싱(ChIP-seq)
ChIP-seq으로도 알려진, ChIP-시퀀싱은 DNA와 단백질 상호작용을 분석하는데 사용되는 방법이다. ChIP-seq는 염색질 면역침전법(ChIP)과 대량 병렬 DNA 시퀀싱을 조합하여 DNA 회합된 단백질의 결합 위치를 동정한다. 임의의 관심 단백질에 대해 정밀하게 전반적인 결합 부위를 맵핑하는데 사용될 수 있다. ChIP-seq는 전사 인자 및 다른 염색질-회합 단백질이 어떻게 표현형-영향 기전에 영향을 미치는지 여부를 주로 결정하는데 사용된다. 유전자 발현을 조절하기 위해 DNA와 단백질이 어떻게 상호작용하는지의 결정은 많은 생물학적 과정과 질환 상태를 완전하게 이해하는데 필수적이다. 이러한 후생유전적 정보는 유전자형 및 발현 분석과 상보적이다. ChIP-seq 기술은 하이브리드화 어레이를 이용할 수 있는 ChIP-칩의 대안으로서 주로 현재 확인된다. 이는 필수적으로 일부 편향성을 도입하는데, 어레이가 고정된 개수의 프로브에 제한되기 때문이다. 대조적으로, 시퀀싱은 덜 편향성을 갖는 것으로 여겨지지만, 상이한 시퀀싱 기술의 시퀀싱 편향성은 여전히 완전하게 이해되지 않는다. 전사 인자 및 다른 단백질과 직접적인 물리적 상호작용에서 특이적 DNA 부위는 염색질 면역침전법으로 단리할 수 있다. ChIP은 생체내에서 관심 단백질에 결합한 표적 DNA 부위의 라이브러리를 생성시킨다. 대량 병렬 서열 분석은 DNA와 임의 단백질의 상호작용 패턴, 또는 임의의 후생유전적 염색질 수직의 패턴을 분석하기 위해 전체 게놈 서열 데이타베이스와 함께 사용된다. 이는 ChIP-가능한 단백질 및 수식의 세트, 예컨대 전사 인자, 중합효소 및 전사 기구, 구조 단백질, 단백질 수식 및 DNA 수식의 세트에 적용될 수 있다. 특이적 항체에 대한 의존성의 대안으로서, 상이한 방법이 개발되어 DNase-Seq 및 FAIRE-Seq 처럼, 게놈에서 모든 뉴클레오솜-고갈 또는 뉴클레오솜 파괴 활성 조절 영역의 수퍼세트를 발견하였다.
ChIP-온-칩(ChIP-ChIP)
ChIP-온-칩(ChIP-칩이라고도 알려짐)은 염색질 면역침전법('ChIP')과 DNA 마이크로어레이("chip")를 조합한 기술이다. 정규의 ChIP와 유사하게, ChIP-온-칩은 생체내에서 단백질과 DNA의 상호작용을 조사하는데 사용된다. 특히, 게놈-전체 기반으로 DNA 결합 단백질에 대해, 결합 부위의 합인, 시스트롬의 동정을 가능하게 한다. 전체-게놈 분석은 거의 임의의 관심 단백질에 대한 결합 위치의 위치들을 결정하기 위해 수행될 수 있다. 기술 명칭이 제안되었으므로, 이러한 단백질은 일반적으로 염색질에서 작동되는 것들이다. 이러한 부류의 가장 두드러진 대표는 전사인자, 복제 관련 단백질, 예컨대 ORC(Origin Recognition Complex) 단백질(ORC), 히스톤, 그들의 변이체 및 히스톤 수식이다. ChIP-온-칩의 목표는 게놈에서 기능성 성분을 동정하는데 도움을 줄 수 있는 단백질 결합 부위를 국재화시키는 것이다. 예를 들어, 관심 단백질로서 전사 인자의 경우, 게놈 전반에서 이의 전사 인자 결합 부위를 결정할 수 있다. 다른 단백질은 프로모터 영역, 인핸서, 억제인자 및 침묵화 성분, 절연인자, 경계 성분, 및 DNA 복제를 제어하는 서열의 동정을 가능하게 한다. 히스톤이 관심 대상이면, 수식의 분포 및 그들의 국재화는 조절 기전에 새로운 통찰력을 제공할 것이다. ChIP-온-칩의 장기 목표 중 하나는 다양한 생리학적 조건 하에서 모든 단백질-DNA 상호작용을 열거하는 (선택된) 유기체의 카탈로그를 확립하는 것이다. 이러한 지식은 궁극적으로 유전자 조절, 세포 증식 및 질환 진행을 뒷받침하는 기구의 이해를 도울 것이다. 따라서, ChIP-온-칩은 뉴클레오티드 수준 상에서 게놈의 조직화에 대한 우리의 지식을 보충할 상당한 가능성뿐만 아니라 후생유전학에 대한 조사로 전파되는 바와 같은 높은 수준의 정보 및 조절을 제공할 것이다.
방사성면역어세이
방사성면역어세이(RIA)는 항체의 사용에 의해 항원(예를 들어, 혈액 중 호르몬 수준)의 농도를 측정하는데 사용되는 매우 민감한 시험관내 어세이 기술이다. 이와 같이, 상응하는 항원의 사용에 의해 항체를 정량하는 방사성결합 어세이의 역으로서 이해할 수 있다. 고전적으로, 방사성면역어세이를 수행하기 위해, 기지량으 항원을 티로신에 부착되는 요오드의 감마 방사성 동위원소, 예컨대 125-I로 빈번하게 표지화하여, 방사능으로 만든다. 이러한 방사능표지된 항원을 그 항원에 대한 항체의 기지량과 혼합하고, 그 결과로서 둘이 서로 특이적으로 결합한다. 다음으로, 동일 항원의 미지량을 함유하는 환자 유래의 혈청 샘플을 첨가한다. 이는 미표지된(또는 "콜드") 혈청 유래 항원이 항체 결합 부위에 대해 방사능표지된 항원("핫")과 경쟁하도록 한다. "콜드" 항원의 농도가 증가되면, 항체에 더 결합하여, 방사능 표지된 변이체를 치환하여, 자유 방사능표지된 항원에 대한 항체 결합된 방사능표지된 항원의 비율을 감소시킨다. 결합된 항원을 미결합된 것과 분리시키고, 상청액에 남아있는 결합된 항원의 방사능을 감마 계측기를 사용해 측정한다.
이 방법은 원칙적으로 임의의 생물학적 분자에 대해 사용할 수 있지만, 혈청 항원에 제한되거나, 또는 포획된 항원을 직접 측정하는 대신 자유 항원을 측정하는 간접 방법의 사용을 필요로 하지 않는다. 예를 들어, 관심 항원 또는 표적 분자가 방사능표지되는 것이 바람직하지 않거나 또는 가능하지 않으면, RIA는 표적을 인식하는 두개의 상이한 항체가 이용가능하고 표적이 항체에 대한 복수 에피토프가 존재할 정도로 충분히 크다면(예를 들어, 단백질) 수행될 수 있다. 한 항체가 상기와 같이 방사능표지되는 반면 나머지는 비수식된 채로 남을 수 있다. RIA는 용액 중 표적 분자와 상호작용하여 결합할 수 있는 "콜드" 미표지 항체에서 시작된다. 바람직하게, 이러한 미표지된 항체는 일정 방식으로, 예컨대 아가로스비드와 결합, 표면에 코팅 등으로 고정된다. 다음으로, "핫" 방사능표지된 항체는 제1 항체-표적 분자 복합체와 상호작용하는 것을 가능하게 한다. 광범위 세척 후, 결합된 방사성 항체의 직접적인 양을 측정하고 동일한 시점에 어세이된 기준량과 비교하여 표적 분자의 양을 정량한다. 이 방법은 원칙적으로 비방사성 샌드위치 ELISA 방법과 유사하다.
형광 편광법
형광 편광법은 형광 이방성과 동의어이다. 이 방법은 수용체에 결합하면 형광 표지된 리간드의 회전 속도의 변화를 측정한다. 편광은 리간드를 여기시키기 위해 사용되고, 발광되는 빛의 양을 측정한다. 발광된 빛의 편광소멸은 존재하는 리간드의 크기에 의존적이다. 소형 리간드가 사용되면, 큰 편광소멸을 가지게 되어서, 빛이 신속하게 회전하게 될 것이다. 이용된 리간드가 보다 큰 크기이면, 최종 편광소멸은 감소될 것이다. 이 방법의 장점은 오직 한번의 표지화 단계를 포함할 수 있다는 것이다. 그러나, 이 방법을 낮은 나노몰 농도에서 사용하면, 결과가 정밀해질 것이다.
포스터 공명 에너지 전이법(Forster Resonance Energy Transfer; (FRET)
포스터 공명 에너지 전이(또한 형광 공명 에너지 전이)는 매우 근접하여 있는, 예를 들어 도너- 및 억셉터-형광단, 또는 형광단 및 소광제인 도너와 억셉터 분자 사이에 전달되는 에너지를 이용한다. FRET는 FP와 같은 형광표지된 리간드를 사용한다. FRET 내 에너지 전이는 도너를 여기시켜 시작된다. 도너와 억셉터 분자 사이의 쌍극자-쌍극장 상호작용은 도너로부터 억셉터 분자로 에너지를 전달한다. 도너와 억셉터인 분자들 간 또는 그중에서의 상호작용은 에너지 전이, 또는 이의 분자와 연관된 형광 스펙트럼을 검출하여 모니터링할 수 있다. 예를 들어, 리간드가 수용체-항체 복합체에 결합하면, 억셉터는 빛을 발광할 것이다. 에너지 전이는 도너와 억셉터 사이의 거리에 의존적이어서, 전이의 존재 또는 부재는 분자 거리를 의미한다. 전형적으로 10 nm보다 작은 거리는 억셉터와 도너 사이의 효율적인 에너지 전이를 가능하게 하지만, 그보다 크거나 또는 작은 거리가 관여되는 특정 분자에 따라서 사용될 수 있다.
표면 플라즈몬 공명법(Surface plasmon resonance; SPR)
표면 플라즈몬 공명(SPR)은 리간드의 표지화를 요구하지 않는다. 대신, 편광이 표면으로부터 반사되는 각에서의 변화(굴절률)를 측정하여 작동된다. 각은 반사광을 증가시키는, 공명각을 변화시키는 리간드의 고정과 같이, 두께의 층 또는 질량의 변화와 관련된다. SPR이 유래된 디바이스는 센서 칩, 유세포, 광원, 프리즘, 및 고정각 위치 검출기를 포함한다.
필터-결합 어세이
필터 어세이는 2개 분자 사이의 친화도를 측정하기 위해 필터를 사용하는 고형 리간드 결합 어세이이다. 필터 결합 어세이에서, 필터는 그들을 통해 매질을 빨아들여 세포막을 포획하는데 사용된다. 이러한 신속한 방법은 여과 및 회수가 발견된 분획에 대해 획득될 수 있는 빠른 속도로 일어난다. 완충제를 사용한 필터 세척은 잔류하는 미결합된 리간드 및 결합 부위로부터 세척해 버릴 수 있는 존재하는 임의의 다른 리간드를 제거한다. 필터를 세척하는 동안 존재하는 수용체-리간드 복합체는 상당히 해리되지 않는데 그들이 필터를 통해 완전하게 포획될 것이기 때문이다. 필터의 특징은 각 작업을 수행하는데 중요하다. 두꺼운 필터가 작은 막 조각의 보다 완전한 회수에 유용하지만, 장기간의 세척 시간이 요구될 수 있다. 음으로 하전된 막 조각의 포획을 돕기위해 필터를 전처리하는 것을 추천한다. 필터에게 양성 표면 전하를 제공하는 용액 중 필터의 침지는 음으로 하전된 막 단편을 끌어들일 것이다.
친화도 크로마토그래피
친화도 크로마토그래피는 예컨대 항원과 항체, 효소와 기질, 또는 수용체와 리간드 사이 고도로 특이적인 상호작용을 기반으로 생화학적 혼합물을 분리하는 방법이다. 정지층은 전형적으로 조류로부터 유래돈 선형 당 분자인, 종종 아가로스의 겔 메트릭스이다. 일반적으로 출발점은 용액, 예컨대 세포 용해물, 성장 매질 또는 혈액 혈청 중 분자의 미확정된 불균질 군이다. 관심 분자는 잘알려지고 정의된 특성을 가질 것이며, 친화도 정제 과정 동안 이용된다. 과정 자체는 표적 분자가 고형 또는 정지층 또는 매칠에 포획되는, 포집으로 여겨질 수 있다. 이동층의 다른 분자는 그들이 이러한 특성을 보유하지 않으므로 포획되지 않을 것이다. 정지층은 혼합물로부터 이후 제거되어, 세척되고 표적 분자는 용리액으로 알려진 과정에서 포집으로부터 방출될 것이다. 친화도 크로마토그래피의 아마도 가장 일반적인 사용은 재조합 단백질의 정제를 위한 것이다.
면역친화도: 과정을 위한 또 다른 사용은 혈액 혈청 유래의 항체의 친화도 정제이다. 혈청이 특이적 항원에 대항하는 항체를 함유하는 것으로 알려져 있으면(예를 들어, 혈청이 고려되는 항원에 대해 면역화된 유기체로붙 온 것이면), 그 항원의 친화도 정제에 사용될 수 있다. 이는 또한 면역친화도 크로마토그래피로 알려져 있다. 예를 들어, 유기체가 GST-융합 단백질에 대해 면역화되면, 융합 단백질에 대한 항체를 생산할 것이고, 아마도 GST 태그에 대한 항체도 생산할 것이다. 이후에 단백질을 고형 지지체 예컨대 아가로스와 공유 결합시키고 면역 혈청으로부터 항체의 정제에서 친화도 리간드로서 사용할 수 있다. 철저하기 위해서, GST 단백질 및 GST-융합 단백질은 각각 별개로 결합될 수 있다. 혈청은 초기에 GST 친화도 매트릭스에 결합될 수 있게 한다. 이는 융합 단백질의 GST 부분에 대한 항체를 제거하게 된다. 다음으로 혈청을 고형 지지체로부터 분리하고 GST-융합 단백질 매트릭스에 결합될 수 있게 한다. 이는 항원을 인식하는 임의 항체가 고형 지지체 상에 포획될 수 있게 한다. 관심 항체의 용리액은 대체로 낮은 pH 완충제 예컨대 글라이신 pH 2.8을 사용해 획득된다. 용리물은 중성 트리스 또는 포스페이트 완충제에서 수집하여 낮은 pH 용리 완충제를 중화시키고, 항체 활성의 임의 붕괴를 중단시킨다. 이는 친화도 정제가 초기 GST-융합 단백질을 정제하고, 혈청으로부터 바람직하지 않은 항-GST 항체를 제거하여 표적 항체를 정제하므로 좋은 예이다. 펩티드 항원에 대해 생성된 항체를 정제하도록 단순한 전략이 종종 적용된다. 펩티드 항원이 합성적으로 생산될 경우, 말단 시스테인 잔기가 펩티드의 N 말단 또는 C 말단에 첨가된다. 이러한 시스테인 잔기는 담체 단백질(예를 들어, 키홀 림펫 헤모시아닌(keyhole Limpet Hemocyanin; KLH))에 펩티드가 쉽게 접합될 수 있게 하는 설프히드릴 작용기를 함유한다. 동일한 시스테인-함유 펩티드가 또한 시스테인 잔기를 통해 아가로스 레진에 고정되어 항체를 정제하는데 사용된다. 대부분의 단일클론 항체는 박테리아로부터 유래된, 면역글로불린-특이적 단백질 A 또는 단백질 G를 기반으로 친화도 크로마토그래피를 사용해 정제되었다.
면역세포화학(ICC)
면역세포화학(ICC)은 결합하는 특이적 1차 항체를 사용하여 세포에서 특이적 단백질 또는 항원의 국재화를 해부학적으로 가시화하는데 사용되는 통상의 실험실 기술이다. 1차 항체는 접합된 형광단을 갖는 2차 항체가 결합시 형광 현미경 하에서 단백질의 가시화를 가능하게 한다. ICC는 특정 샘플 중 세포가 대상 항원을 발현하는지 여부를 연구자들이 평가할 수 있게 한다. 면역양성 신호가 발견된 경우, ICC는 또한 어떠한 세포하 구획이 항원을 발현하는지를 연구자들이 결정할 수 있게 한다. 1차 항체 또는 항혈청에 직접 결합된 것을 포함하여, 샘플 상에서 면역학적 검출을 수득하기 위한 많은 방법이 존재한다. 직접 방법은 세포 중 항원(예를 들어, 단백질)에 결합할 수 있게 하는 항체에 대한 직접적으로 검출가능한 태그(예를 들어, 형광발광성 분자, 금 입자 등)의 사용을 포함한다. 대안적으로, 많은 간접 방법이 존재한다. 이러한 한 방법에서, 항원은 1차 항원이 결합된 후 1차 항체에 결합하는 2차 항체의 사용에 의해 증폭된다. 다음으로, 효소적 모이어티를 함유하는 3차 시약이 적용되어 2차 항체에 결합한다. 4차 시약, 또는 기질이 적용되는 경우, 3차 시약의 효소적 말단은 기질에 안료 반응 생성물로 전환되어, 원래의 1차 항원이 관심 항원을 인식한 동일한 위치에서 색상(많은 색상들이 가능함; 갈색, 검정색, 적색 등)을 발생시킨다. 사용되는 기질(또한 발색제로도 알려짐)의 일부 예는 AEC(3-아미노-9-에틸카바졸), 또는 DAB(3,3'-디아미노벤지딘)이다. 필수 효소(예를 들어, 항체 시약에 접합된 홀스래디쉬 퍼옥시다제)에 노출 후 이들 시약 중 하나의 사용은 양성 면역반응 생성물을 생산한다. 관심의 특이적 항원의 면역세포화학적 가시화는 H&E(헤마톡실린 및 에오신)과 같이 덜 특이적 염색제가 치료에 관한 부가적 예측 정보를 만들거나 또는 제공하기 위해 진단에 사용될 수 없을 경우(예를 들어, 일부 암에서) 사용될 수 있다. 대안적으로, 2차 항체는 형광 또는 공초점 현미경에서 검출되는 형광단(FITC 및 로다민이 가장 일반적)에 공유적으로 연결될 수 있다. 형광의 위치는 표적 분자, 막 단백질에 대해 외부 및 세포질 단백질에 대해 내부에 따라 다양할 것이다. 이러한 방식으로 면역형광발광은 단백질의 위치 및 동적 과정(엑소사이토시스, 엔도사이토시스 등)을 연구하기 위해 공초점 현미경관찰과 조합시 강력한 기술이 된다.
전기영동적 어세이
이용할 수 있는 예시적 전기영동적 어세이는 당분야에 공지되고 이하에 더욱 설명하는 바와 같은 핵산 전기영동, PAGE, 선천 겔 방법, 자유 유동성 전기영동, IEF, EMSA, RFLP 분석, 및 자이모그라피를 포함한다.
핵산 전기영동
핵산 전기영동은 크기 및 반응성에 의해 DNA 또는 RNA 단편을 분리하는데 사용되는 분석 기술이다. 분석하려는 핵산 분자는 점성 매질, 겔 상에서 설정되는데, 여기서 전계가 핵산 사슬의 당-포스페이트 골격의 순 음전하로 인해, 애노드 쪽으로 핵산이 이동하게 유도한다. 이들 단편의 분리는 상이한 크기 분자가 겔을 통해 통과할 수 있는 이동성을 이용해 수행된다. 보다 긴 분자는 더 느리게 이동하는데 그들이 겔 내에서 더 많은 저항성을 경험하기 때문이다. 분자의 크기가 이의 이동성에 영향을 미치므로, 작은 단편은 주어진 기간 내에서 긴것보다 애노드에 더 가까워지게 된다. 일정 시간 이후, 전압을 제거하고 단편 구배를 분석한다. 유사한 크기 단편 사이의 보다 큰 분리를 위해, 전압 또는 작업 시간을 증가시킬 수 있다. 낮은 전압 겔에서 연장된 작업은 가장 정확한 분해를 산출한다. 그러나, 전압이 핵산의 전기영동을 결정하는 유일한 인자는 아니다.
폴리아크릴아미드 겔 전기영동(PAGE)
폴리아크릴아미드 겔 전기영동(PAGE)은 그들의 전기영동적 이동성에 따라서, 생물학적 거대분자, 일반적으로 단백질 또는 핵산을 분리하기 위해 생화학, 포렌식, 유전학, 분자 생물학 및 생명공학에서 광범위하게 사용되는 기술로 설명된다. 이동성은 분자의 길이, 입체형태 및 전하의 함수이다.
SDS-PAGE: 소듐 도데실 설페이트(SDS)는 단백질을 선형화시키고 선형화된 단백질에 음전하를 부여하기 위해 단백질 샘플에 적용되는 음이온성 세제이다. 이러한 과정을 SDS-PAGE라고 한다. 대부분의 단백질에서, 폴리펩티드 사슬에 SDS의 결합은 단위 질량 당 전하의 균일한 분포를 부여하여, 전기영동 동안 크기를 추정하여 분획화를 일으킨다. 보다 큰 소수성 내용물, 예를 들어 많은 막 단백질을 갖는 단백질, 및 그들의 자연 환경에서 계면활성제와 상호작용하는 것들은 결합된 SDS의 비율의 더 큰 가변성으로 인해, 이 방법을 사용해 정확하게 처리하는 것이 본래 힘들다.
2차원 겔 전기영동: 2-D 전기영동은 1-D 전기영동으로 시작하지만 처음에서 90도 방향으로 제2 특성에 의해 분자를 분리한다. 1-D 전기영동에서, 단백질(또는 다른 분자)은 1차원으로 분리되어서, 모든 단백질/분자가 레인을 따라 위치되지만 분자가 2-D 겔에 걸쳐서 확산된다. 2개 분자가 2가지 상이한 특성에서 유사할 것으로 보이지 않기 때문에, 분자는 1-D 전기영동보다 2-D 전기영동에서 더 효과적으로 분리된다. 이 기술을 사용해 단백질이 분리되는 2차원은 등전점, 자연 상태의 단백질 복합체 질량, 및 단백질 질량일 수 있다. 이의 결과는 단백질이 그 표면에 확산된 겔이다. 이들 단백질은 다양한 수단으로 검출할 수 있지만, 가장 일반적으로 사용되는 염색은 은 및 쿠마시 브릴리언트 블루 염색이다.
선천 겔 방법
비변성 겔이라고도 하는 선천 겔은 여전히 그들의 폴딩된 상태인 단백질을 분석한다. 따라서, 전기영동적 이동성은 전하 대 질량 비율뿐만 아니라 단백질의 물리적 형상 및 크기에 의존한다. 하기는 선천 겔의 상이한 형태의 예이다.
투명 선천 겔 전기영동: CN-PAGE(통상 선천 PAGE라고 함)는 폴리아크릴아마이드 구배 겔에서 산성 수용성 및 막 단백질을 분리한다. 이는 CN-PAGE(전하 이동 기술 BN-PAGE와 대도적)에서 단백질의 전기영동적 이동성이 단백질의 고유한 전하와 관련되어서 하전되지 않은 염료를 사용한다. 이동 거리는 단백질 전하, 이의 크기 및 겔의 공극 크기에 의존적이다. 많은 경우에서, 이 방법은 BN-PAGE 보다 낮은 해상도를 갖지만, CN-PAGE는 쿠마시 염료가 추가 분석 기술을 방해할때마다 장점을 제공하는데, 예를 들어 FRET 분석을 위한 매우 효율적인 마이크로규모 분리 기술로서 기술되었다. 또한 CN-PAGE는 BN-PAGE보다 약해서 BN-PAGE 조건 하에서 해리되는 막 단백질 복합체의 불안정한 초분자 조립체를 유지할 수 있다.
청색 선천 PAGE: BN-PAGE는 쿠마시 브릴리언트 블루 염색이 전기영동적 분리를 위해 단백질 복합체에 필요한 전하를 제공하는, 선천 PAGE 기술이다. 쿠마시의 단점은 단백질에 결합하는 경우 세제처럼 작용하여 복합체를 해리시킬 수 있다는 것이다. 또 다른 단점은 보결분자단(예를 들어, 헴 또는 클로로필)을 갖거나 형광염료로 표지된 단백질의 형광발광 또는 화학발광(예를 들어, 후속 웨스턴 블롯 검출 또는 활성 어세이)의 잠재적 소광이다.
정량적 분취용 선천적 연속 폴리아크릴아미드 겔 전기영동: QPNC-PAGE, 또는 정량적 분취용 선천적 연속 폴리아크릴아미드 겔 전기영동은 등전점에 의해 단백질을 분리시키기 위해 생화학 및 생무기 화학에 적용되는 고해상 기술이다. 선천 겔 전기 영동의 표준화된 이형을 생물학자들이 사용하여 생물학적 샘플 중 활성 또는 선천 메탈로단백질을 단리하고 복합 단백질 혼합물 중에서 적절하게 그리고 부적절하게 폴딩된 금속 보조인자-함유 단백질 또는 단백질 이소폼을 분해시킨다. 생의학 접근법에 대한 오믹스 플랫폼으로서, QPNC-PAGE는 단백질-미스폴딩 질환에 대한 금속 기반 약물의 개발, 및 생물기반 경제학에 기여한다.
자유 유동 전기영동
자유 흐름 전기영동(FFE)은 또한, 담체 무함유 전기영동이라고도 하는, 연속적인 전기영동 및 액체 기반 분리 기술이다. 전형적으로 단백질, 펩티드, 소기관, 세포, DNA 오리가미 및 입자의 정량적 및 반정량적 분리에 사용된다. FFE의 장점은 분리가 겔 전기영동의 폴리아크릴아미드처럼, 고형 매트릭스에서의 임의 상호작용없이, 신속하고 조심스러운 액체 기반 방식으로 수행된다는 것이다. 이는 분석물을 손실하지 않기 때문에 매우 높은 회수율을 보장한다. FFE 분리는 연속적이고, 분취용 적용을 위한 고수율의 분석물을 보장한다. 게다가, 분리는 선천 또는 변성 조건 하에서 수행될 수 있다. 균일한 층류 액체 필름이 2개 판 사이에서 전도되어, 병행하여 분획화 튜브를 분할하고 마이크로타이터 플레이트에 수집시킨다. 고전압 전계가 층류 흐름에 수직으로 적용된다. 층류 흐름의 분석물은 전하 밀도 및 등전점에 의해 분리된다.
등전점 포커싱
등전점 포커싱(IEF)은, 또한 전기포커싱이라고도 알려져 있는, 그들의 등전점(pI)의 차이에 의해 상이한 분자를 분리하는 기술이다. IEF는 고정된 pH 구배(IPG) 겔로 양쪽성 용액을 첨가하는 것을 포함한다. IPG는 pH 구배로 아크릴아미드 겔 매트릭스 공중합되어서, 최고 알칼리(> 12) pH 값을 제외하고 완전하게 안정한 구배를 일으킨다. 고정된 pH 구배는 이모빌린의 비율의 연속 변화에 의해 획득된다. 이모빌린은 이의 pK 값으로 정의되는 약한 산 또는 염기이다. 이의 등전점(pI) 이하의 pH 영역에서 단백질은 양으로 하전되어서 캐쏘드(음으로 하전된 전극)쪽으로 이동한다. 그러나, 증가되는 pH의 구배를 통해 이동함에 따라, 단백질의 전체 전하는 단백질이 이의 pI에 상응하는 pH 영역에 도달할 때까지 감소될 것이다. 이 지점에서 순 전하가 없고 이동이 중지된다(양쪽 전극을 향한 전기적 끌림이 없으므로). 그 결과, 단백질은 이의 pI에 상응하는 pH 구배 내 지점에 위치된 각 단백질과 날카로운 정지상 밴드로 집중된다. 이 기술은 별개의 밴드로 분획화되는 단일 전하가 상이한 단백질의 고도로 높은 분해를 할 수 있다. 포커싱되는 분자는 pH 구배(일반적으로 지방족 양쪽성 물질에 의해 생성)를 갖는 매질 상에 분포된다. 전류가 매질을 통해 통과하여 "양성 "애노드 및 "음성" 캐쏘드를 생성시킨다. 음으로 하전된 분자는 매질의 pH 구배를 통해 "양성" 말단쪽으로 이동하는 한편 양으로 하전된 분자는 "음성" 말단쪽으로 이동한다. 입자가 이의 전하의 반대극으로 이동하므로 pH가 분자의 등전점에 도달하는 지점에 도달할 때까지 변화하는 pH 구배를 통해 이동한다. 그 지점에서 분자는 더이상 순전하를 갖지 않고(연관된 작용기의 양자하 또는 탈양자화로 인함) 이와 같이 겔 내에서 임의로 더욱 진행하지 않을 것이다. 구배는 먼저 소형 분자의 용액 예컨대 pI 값이 다양한 폴리앰폴라이트를 전기영동에 가하여 관심 입자를 첨가하기 전에 확정한다.
면역전기영동
면역전기영동은 전기영동 및 항체와의 반응을 기반으로 하는 단백질의 분리 및 특징규명을 위한 다수의 생화학적 방법의 일반명이다. 면역전기영동의 이형은 전형적으로 분리하거나 또는 특징규명하려는 단백질과 반응하는, 항체로도 알려진, 면역글로불린을 이용한다. 높은 pH(대략 8.6)에서 완충된 약 1 mm 두께의 1% 겔 슬랩으로서 아가로스가 전통적으로 전기영동뿐만 아니라 항체와의 반응에서 바람직하다. 아가로스는 단백질의 자유 통로 및 분리를 가능하게 하는 거대한 공극을 가지지만, 단백질과 특이적 항체의 면역침전을 위한 앵커를 제공하므로 겔 매트릭스로서 선택되었다. 높은 pH는 항체가 실제로 높은 pH에서 이동성이므로 선택되었다. 수평 냉각 플레이트가 구비된 전기영동 장치가 정상적으로 전기영동에 추천된다. 면역침전물이 습윤 아가로스 겔에서 보일 수 있지만, 건조된 겔에서 쿠마시 브릴리언트 블루와 같은 단백질 염색제로 염색된다. SDS-gel 전기영동과 대조적으로, 아가로스에서의 전기영동은 선천 조건을 가능하게 하여, 조사 중인 단백질의 선천 구조 및 활성을 보존하므로, 면역전기영동은 전기영동적 분리이외에도, 효소 활성 및 리간드 결합 등의 특징규명을 가능하게 한다.
친화도 면역전기영동은 다른 거대분자 또는 리간드와 특이적 상호작용 또는 복합체 형성을 통한 단백질의 전기영동적 패턴 변화를 기반으로 한다. 친화도 면역전기영동은 예를 들어, 렉틴과의 결합 상수의 추산 또는 글리칸 함량 또는 리간드 결합과 같은 특이적 특성의 단백질의 특징규명을 위해 사용되었다. 친화도 면역전기영동의 일부 이형은 고정된 리간드의 사용에 의한 친화도 크로마토그래피와 유사한다. 아가로스 겔에서 면역침전물의 개방 구조는 특이적 단백질을 밝히기 위해 방사능으로 표지된 항체의 부가적 결합을 가능하게 할 것이다. 이러한 이형은 IgE와의 반응을 통한 알레르겐의 동정에 사용되었다.
전기영동적 이동성 이동 어세이(EMSA)
전기영동적 이동성 이동 어세이(EMSA) 또는 이동성 이동 전기영동은, 또한 겔 이동 어세이, 겔 이동성 이동 어세이, 밴드 이동 어세이, 또는 겔 지연 어세이라고도 하는, 단백질-DNA 또는 단백질-RNA 상호작용을 연구하는데 사용되는 통상의 친화도 전기영동 기술이다. 이 과정은 단백질 또는 단백질의 혼합물이 주어진 DNA 또는 RNA 서열에 결합할 수 있는지 여부를 결정할 수 있고, 때때로 하나 초과의 단백질 분자가 결합 복합체에 관여하는지를 보여줄 수 있다. 겔 이동 어세이는 종종 전사 개시, DNA 복제, DNA 복구 또는 RNA 가공 및 성숙화 동안 DNase 풋프린팅, 프라이머 연장, 프로모터-프로브 실험과 동시에 시험관내에서 수행된다. 선행법이 초기 문헌에서 확인될 수 있지만, 가장 최근의 어세이는 문헌 [Garner and Revzin and Fried and Crothers]에 기술된 방법을 기반으로 한다.
제한 단편 길이 다형성 분석
RFLP 분석. DNA는 세포, 예컨대 혈액 샘플로부터 수집하여 제한효소를 사용해 작은 조각으로 절단한다. 이는 상이한 개체의 DNA 서열 간 변이의 결과로서 크기가 다른 수천개의 DNA 단편을 발생시킨다. 단편을 겔 전기영동을 사용해 크기를 기반으로 분리한다. 분리된 단편을 니트로셀룰로스 또는 나일론 필터로 전달하며, 이 과정을 서던 블롯이라고 한다. 블롯 내 DNA 단편을 영구적으로 필터에 고정시키고, DNA 가닥을 변성시킨다. 반복 서열을 함유하는 게놈 내 서열에 상보적인 방사성표지된 프로브 분자를 첨가한다. 이들 반복 서열은 상이한 개체 간에 길이가 다양한 경향이 있고 가변수 탠덤 반복 서열(variable number tandem repeat sequence) 또는 VNTR이라고 한다. 프로브 분자는 반복 서열을 함유하는 DNA 단편과 하이브리드화하고 과량의 프로브 분자는 세척해 버린다. 블롯을 X-선 필름에 노출시킨다. 프로브 분자에 결합된 DNA의 단편은 필름 상에서 어두운 밴드로서 나타난다.
자이모그라피
자이모그라피는 효소의 기질 레퍼토리를 기반으로 가수분해 효소의 검출을 위한 전기영동 기술이다. 겔 자이모그라피에서, 샘플은 SDS-PAGE를 위한 표준, 비환원 적재 완충제에 제조된다. 환원제 또는 끓이기가 필수적이지 않은데, 효소의 리폴딩을 이들이 방해하기 때문이다. 적합한 기질(통상 젤라틴 또는 카제인)이 아크릴아미드 겔의 제조 동안 분해 겔에 삽입된다. 전기영동 후, SDS는 미완충 Triton X-100에서 항온반응시키고 37℃의 시간 동안, 적당한 소화 완충제 중에서 항온반응시켜 겔(또는 자이모그램)으로부터 제거된다. 자이모그램은 이후 염색(통상 아미도 블랙 또는 쿠마시 브릴리언트 블루에 의함)되어, 소화 영역은 기질이 효소에 의해 분해된, 어둡게 염색된 배경 대비 투명한 밴드로서 나타난다.
유전자 발현 프로파일링
이용할 수 있는 예시적인 유전자 발현 프로파일링 기술은 다음의 부문에 더욱 상세히 기술하고 당분야에 공지된 바와 같이, PCR, DNA 마이크로어레이, SAGE, 실시간 PCR, 차등적 디스플레이 PCR 및 RNA-seq에 의한 DNA 프로파일링을 포함한다.
PCR에 의한 DNA 프로파일링
중합효소 사슬 반응(PCR) 과정은 DNA 복제의 생물학적 과정을 모방하지만 특이적 관심 DNA 서열에 한정된다. PCR 기술의 본 공개에서, DNA 프로파일링은 식별력 및 매우 소량(또는 분해된) 출발 샘플로부터 정보를 회수하는 능력에 있어 엄청나게 진보되었다. PCR을 DNA의 특이적 영역의 양을 상당히 증폭시킨다. PCR 과정에서, DNA 샘플은 가열을 통해 별개의 개별 폴리뉴클레오티드 가닥으로 변성된다. 2개의 올리고뉴클레오티드 DNA 프라이머는 각 프라이머의 활성 말단(즉, 3' 말단)의 정상적인 효소적 연장이 다른 프라이머를 향해 가게 하는 방식으로 반대 DNA 가닥 상의 2개의 상응하는 인접한 부위와 하이브리드화되는데 사용된다. PCR은 고온에 내성인 복제 효소, 예컨대 열안정성 Taq 중합효소를 사용한다. 이러한 방식으로, 관심 서열의 2개의 새로운 카피가 생성된다. 이러한 방식으로 반복된 변성, 하이브리드화 및 연장은 관심 DNA의 카피 카피수의 기하급수적인 증가를 일으킨다. 열 사이클링을 수행하는 장비는 이제 상업적 공급처로부터 쉽게 입수할 수 있다. 이 과정은 2시간 또는 그 이하에서 바람직한 영역을 백만배 또는 그 이상의 증폭을 일으킬 수 있다.
DNA 마이크로어레이
마이크로어레이를 뒷받침하는 핵심 원리는 2개 DNA 가닥 사이의 하이브리드화로서, 상보성 뉴클레오티드 염기쌍 사이에 수소 결합을 형성하여 서로 특이적으로 쌍형성하는 상보성 핵산 서열의 특성이다. 뉴클레오티드 서열 내 높은 수의 상보성 염기쌍은 2개 가닥 사이에 보다 단단한 비공유 결합을 의미한다. 비특이적 결합 서열을 세척한 후, 오직 강력하게 쌍형성된 가닥만이 하이브리드화된 채로 남을 것이다. 프로브 서열에 결합된 형광 표지된 표적 서열은 하이브리드화 조건(예컨대, 온도), 및 하이브리드화 후 세척에 의존하는 신호를 생성시킨다. 스폿(피처)으로부터의 신호의 전체 강도는 스폿 상에 존재하는 프로브에 결합하는 표적 샘플의 양에 의존적이다. 마이크로어레이는 피처의 강도를 상이한 조건 하에 동일한 피처의 강도와 비교하고, 피처의 정체는 그 위치에 의해 알게되는 상대적 정량화를 사용한다.
유전자 발현의 연속 분석(SAGE)
유전자 발현의 연속 분석(SAGE)은 전사물의 단편에 상응하는 소형 태그의 형태로 관심 샘플에서 메신저 RNA 개체군의 스냅샷을 생성하기 위해 분자 생물학자가 사용하는 기술이다. 간략하게, SAGE 실험은 다음과 같이 진행된다:
입력 샘플(예를 들어, 종양)의 mRNA를 단리하고 역전사효소 및 비오틴화 프라이버를 사용하여 mRNA로부터 DNA를 합성한다.
cDNA가 프라이머에 부착된 비오틴과의 상호작용을 통해 스트렙타비딘 비드에 결합하며, 앵커링 효소(AE)라고 하는 제한 엔도뉴클레아제를 사용해 절단한다. 절단 부위의 위치 및 따라서 비드에 결합된 나머지 cDNA의 길이는 각각의 개별 cDNA(mRNA)에 대해 다양할 것이다.
절단 부위로부터 하류의 절단된 cDNA를 폐기하고, 절단 부위로부터 상류의 나머지 고정된 cDNA 단편을 절반으로 나누고 부착 부위로부터 상류에서 다음의 순서대로 몇몇 구성요소를 함유하는 2개 어댑터 올리고뉴클레오티드(A 또는 B) 중 하나에 노출시킨다: 1) 절단된 cDNA에 부착을 허용하도록 AE 절단 부위를 갖는 점착성 말단; 2) 이의 인식 부위(원래의 cDNA/mRNA 서열 내)의 하류에 약 15 뉴클레오티드를 절단하는 태그화 효소(TE)로 알려진 제한 엔도뉴클레아제에 대한 인식 부위; 3) 이후에 PCR을 통한 추가 증폭에 사용하려는 어댑터 A 또는 B에 독특한 짧은 라이머 서열.
어댑터 결찰 후, cDNA를 TE를 사용해 절단하여 비드로부터 그들을 제거하고, 본래 cDNA의 약 11 뉴클레오티드(AE 인식 부위에 상응하는 4개를 15 뉴클레오티드에서 뺌)의 짧은 "태그"만을 남긴다.
절단된 cDNA 태그를 이후에 DNA 중합효소로 복구하여 블런트 말단 cDNA 단편을 생성시킨다.
이들 cDNA 태그 단편(어댑터 프라이머 및 AE 및 TE 인식 부위 부착됨)을 결찰하고, 2개 태그 서열을 함께 샌드위치시키고, 양쪽 말단에 어댑터 A 및 B를 측접시킨다. 이들 새로운 구성체를 디태그라고 하며, 이후 앵커 A 및 B 특이적 프라이머를 사용해 PCR 증폭된다.
디지태그를 원래의 AE를 사용해 절단하고 다른 디태그와 함께 연결되게 하여 각 디태그가 AE 인식 부위에 의해 이격된 cDNA 콘카테머를 생성시킨다.
이들 콘카테머는 박테리아 복제를 통한 증폭을 위해 박테리아에 형질전환된다.
cDNA 콘카테머를 단리하여 현대적인 고수율 DNA 서열분석기를 사용해 서열분석하고, 이들 서열은 개별 태그의 재현을 정량화하는 컴퓨터 프로그램으로 분석할 수 있다.
실시간 중합효소 사슬 반응
실시간 중합효소 사슬 반응은 중합효소 사슬 반응(PCR)을 기반으로 하는 분자 생물학의 실험실 기술이다. 통상의 PCR처럼 종료시가 아닌, PCR 동안, 즉 실시간으로 표적 DNA 분자의 증폭을 모니터링한다. 실시간 PCR은 정량적(정량적 실시간 PCR), 반정량적, 즉 DNA 분자의 특정량 이상/이하로(반정량적 실시간 PCR) 또는 정성적(정성적 실시간 PCR)으로 사용될 수 있다. 실시간 PCR에서 PCR 생성물의 검출을 위한 2가지 통상적인 방법은 (1) 임의의 이중 가닥 DNA를 삽입하는 비-특이적 형광 염료, 및 (2) 이의 상보성 서열과 프로브의 하이브리드화 이후에만 검출가능한 형광 리포터로 표지된 올리고뉴클레오티드로 이루어진 서열-특이적 DNA 프로브이다. 실시간 PCR은 적어도 하나의 특정 파장의 광선으로 각 샘플을 조사하고 여기된 형광단에 의해 방출되는 형광을 검출하는 능력으로 열 사이클러에서 수행된다. 열 사이클러는 또한 샘플을 신속하게 가열 및 냉각시킬 수 있어서, 핵산 및 DNA 중합효소의 물리화학적 특성을 이용한다. PCR 과정은 일반적으로 25 내지 50회 반복되는 일련의 온도 변화로 이루어진다. 이들 주기는 정상적으로 3 단계로 이루어진다: 첫번째, 대략 95℃에서, 이중 사슬의 분리를 가능하게 하고, 두번째, 대략 50-60℃의 온도에서 DNA 주형과 프라이머의 결합을 가능하게 하고, 세번째, 68 내지 72℃에서, DNA 중합효소에 의해 수행되는 중합을 촉진한다. 단편의 작은 크기로 인해 마지막 단계는 이러한 유형의 PCR에서 생략되는데 효소가 정렬 단계 및 변성 단계 사이의 변화 동안 그들의 수를 증가시킬 수 있기 때문이다. 또한, 4 단계 PCR에서, 비특이적 염료가 사용되는 경우 프라이머 이량체의 존재에 의해 야기되는 신호를 감소시키기 위해서, 예를 들어 80℃의 온도로, 각 주기에서 오직 수 초간 지속되는 짧은 온도 시기 동안 형광을 특정한다. 각 주기에 사용되는 온도 및 시간은 광범위하게 다양한 변수, 예컨대 DNA를 합성하는데 사용되는 효소, 반응 중 2가 이온 및 데옥시리보뉴클레오티드(dNTP)의 농도 및 프라이머의 결합 온도에 의해 좌우된다.
차등적 디스플레이 PCR
차등적 디스플레이(또한 DDRT-PCR 또는 DD-PCR라고도 함)는 연구자가 진핵생물 세포 샘플의 임의 쌍 사이의 mRNa 수준에서 유전자 발현의 변화를 비교하고 동정할 수 있는 기술이다. 이 어세이는 필요하다면 하나 초과의 쌍으로 확장될 수 있다. 쌍형성된 샘플은 실험에 의해 영향받는 특이적 유전자 또는 특정 차이의 근본 원인을 밝히고자 희망하면서, 연구자들이 유전자 발현 패턴을 연구하고자 하는, 형태학적, 유전적, 또는 기타 실험적 차이를 가질 것이다. 차등적 디스플레이의 개념은 세포 내 대부분의 mRNA를 체계적으로 증폭하여 가시화시키기 위해 앵커링된 올리고-dT 프라이머와 조합하여 제한된 수의 짧은 임의 프라이머를 사용하는 것이다. 1990년대 초에 이의 개시 후, 차등적 디스플레이는 mRNA 수준에서 차등적으로 발현되는 유전자를 동정하기 위한 일반적 기술이 되었다. 높은 정확도 및 판독치를 제공하는, 형광 DD 과정을 비롯하여 방사성 표지화를 포함한, 상이한 최신식 DD-PCR 프로토콜이 제안되었다.
RNA-시퀀싱(RNA-seq)
RNA 시퀀싱(RNA-seq)은 또한 전체 전사체 샷건 시퀀싱(WTSS)이라고도 하는, 주어진 시점에 게놈으로부터 RNA 존재 및 분량을 밝히기 위한 차세대 시퀀싱의 능력을 이용하는 기술이다.
RNA '폴리(A)' 라이브러리 RNA-seq: 서열 라이브러리의 생성은 고수율 시퀀싱으로 플랫폼에서 플랫폼으로 변화될 수 있고, 여기서 각각은 라이브러리의 상이한 유형을 구축하고 그들 장비의 특정 요건에 최종 서열을 적합화하게 디자인된 몇몇 키트를 갖는다. 그러나, 분석하려는 주형의 성질로 인해, 각 기술 내에 공통성이 존재한다 빈번하게, mRNA 분석에서 3' 폴리아데닐화(폴리(A)) 꼬리부는 코딩 RNA를 비코딩 RNA로부터 분리하도록 보장하기 위해 표적이 된다. 이는 주어진 기질에 공유적으로 부착된 폴리(T) 올리고를 사용해 단순히 수행할 수 있다. 현재 많은 연구들이 이 단계를 위해 자성 비드를 이용한다. 폴리(A) RNA 밖 전사체의 일부분을 포함하는 연구들은 폴리(T) 자성 비드를 사용할 경우, 통과 RNA(비-폴리(A) RNA)가 그렇지 않으면 인식하지 않고 지나버릴 중요한 비코딩 RNA 유전자 발견을 일으킬 수 있다는 것을 확인하였다. 또한, 리보솜 RNA가 소정 세포 내 RNA의 90%를 나타내므로, 연구들은 프로브 하이브리드를 통한 이의 제거가 전사체의 나머지 부분으로부터 데이타를 회수하는 능력을 증가시킨다는 것을 보여주었다. 다음 단계는 역전사이다. 무작위 프라이밍된 역전사의 5' 편향성뿐만 아니라 프라이머 결합 부위에 영향을 미치는 2차 구조로 인해, 역전사 전에 200 내지 300 뉴클레오티드로 RNA의 가수분해는 양쪽 문제를 동시에 감소시킨다. 그러나, 전사물의 전체가 효율적으로 DNA로 전환되지만, 5' 및 3' 말단은 덜 그러한 경우 이 방법과의 균형이 존재한다. 연구의 목적에 따라서, 연구자들은 이 단계를 적용하거나 또는 무시하는 것을 선택할 수 있다.
소형 RNA/비-코딩 RNA 시퀀싱: mRNA보다는 RNA를 시퀀싱할 때 라이브러리 조제물은 변형된다. 세포 RNA는 바람직한 크기 범위를 기반으로 선택된다. 소형 RNA 표적, 예컨대 miRNA의 경우, RNA는 크기 선택을 통해 단리된다. 이는 크기 배제 겔을 사용하거나, 크기 선택 자성 비드를 통하거나, 또는 상업적으로 개발된 키트를 사용하여 수행될 수 있다. 단리되면, 링커를 3' 및 5' 말단에 부착한 후 정제한다. 최종 단계는 역전사를 통한 cDNA의 생성이다.
직접 RNA 시퀀싱: 역전사효소를 사용하여 cDNA로 RNA의 전환이 전사물의 적절한 특징규명 및 정량화를 방해할 수 있는 편향성 및 인공물을 도입하는 것으로 확인되었으므로, 단일 분자 직접 RNA 시퀀싱(DRSTM) 기술이 헬리코스(현재는 파산)에 의해 개발중이었다. DRSTM은 cDNA로 RNA의 전환 또는 기타 편향된 샘플 조작 예컨대 결찰 및 증폭없이 대량 병렬 방식으로 직접적으로 RNA 분자를 서열분석한다. cDNA가 합성되면 시퀀싱 시스템의 바람직한 단편 길이에 도달할 때까지 더욱 단편화시킬 수 있다.
(단백질) 질량 분광법
단백질 질량 분광법은 단백질 연구에 질량 분광법의 적용을 의미한다. 질량 분광법은 단백질의 특징규명을 위해 중요하게 출현된 방법이다. 전체 단백질의 이온화를 위한 2가지 주요 방법은 전자분무 이온화(ESI) 및 매트릭스-보조 레이저 탈착/이온화(matrix-assisted laser desorption/ionization; MALDI)이다. 이용가능한 질량 분광법의 성능 및 질량 범위를 유지하면서, 2가지 접근법이 단백질을 특징규명하는데 사용된다. 먼저, 온전한 단백질이 상기 기술된 2가지 기술 중 하나에 의해 이온화되고 질량 분석기에 도입된다. 이러한 접근법을 단백질 분석의 "톱-다운(top-down)" 전략이라고 한다. 두번째에서, 단백질은 프로테아제 예컨대 트립신을 사용해 더 작은 펩티드로 효소적으로 분해된다. 후속하여 이들 펩티드를 질량 분광계에 도입시키고 펩티드 질량 핑거프린팅 또는 탠덤 질량 분광법으로 동정한다. 따라서, 이러한 후자의 접근법(또한 "상향식" 단백체)은 단백질의 존재를 추론하기 위해 펩티드 수준에서의 동정을 사용한다. 전체 단백질 질량 분석은 주로 비행시간(TOF) MS 또는 푸리에 변환 이온 사이클로트론 공명법(Fourier transform ion cyclotron resonance; FT-ICR)을 사용해 수행된다. 이들 2가지 유형의 장비가 여기서 바람직한데 그들의 광범위한 질량 범위와, FT-ICR의 경우, 이의 높은 질량 정확도때문이다. 단백질가수분해 펩티드의 질량 분석은 보다 저렴한 장비 디자인이 특징규명에 사용될 수 있으므로, 단백질 특징규명의 보다 더 대중적인 방법이다. 부가적으로, 샘플 제조는 전체 단백질이 보다 작은 펩티드 단편으로 소화되면 더 쉽다. 펩티드 질량 분석을 위해 가장 광범위하게 사용되는 장비는 MALDI 비행시간 장비인데 그들이 높은 페이스(1 PFM는 대략 10초에 분석할 수 있음)에서 펩티드 질량 핑거프린트(PMF)의 획득을 허용하기 때문이다. 복수 단계 사중극자-비행시간 및 사중극자 이온 포획이 또한 이 용도에서 사용된다.
질량 분광법 CMS는 생물분석적 분석에 점차적으로 사용되고 있다. 질량 분광법은 대량 분화가 많은 동시적 검출 채널을 가능하게 하기 때문에 다중화를 위해 적합화된다. 그러나, 복합 생체분자, 예컨대 DNA는 복합 질량 스펙트럼을 갖고 비교적 좋지 않은 감소로 인해 매트릭스에서 검출이 어려울 수 있다. MS는 하전된 종의 질량 대 전하 비율을 측정하는 분석 기술이다. 이는 샘플 또는 분자의 화학 조성을 결정하는데 사용될 수 있다. 질량 분광법으로 분석된 샘플을 이온화시켜서 하전된 분자 또는 원자를 생성시키고 그들의 질량 대 전하 비율에 따라 분리하여 검출한다. 이 기술은 다양한 용도에 따라 정량적으로 정성적으로 사용된다. 유도 결합 플라즈마(OCP)는 전자기 유도, 즉 시간-변화 자기장에 의해 생성되는 전류에 의해 에너지가 공급되는 플라스마 공급원의 한 유형이다. ICP는 질량 분광법의 이온화 공급원으로서 사용될 수 있다. 유도 결합 플라즈마 및 질량분광법의 조합을 ICP-MS라고 한다. 질량 스펙트럼 이미지화(MSI)는 화학적 정보가 화학적 이미지 도는 지도로서 가시화될 수 있도록 공간적 정보와 화학적 정보를 분석하는 것을 포함하는 질량 분광법의 적용분야이다. 화학적 지도를 생성시켜서, 샘플 표면의 조성 차이를 밝힐 수 있다. 레이저 절제는 레이저 빔을 조사하여 고형 표면으로부터 재료를 제겅하는 방법이다. 레이저 절제는 질량 분광법, 특히 질량 스펙트럼 이미지화를 위해 재료를 샘플채취하는 수단으로서 사용되었다. 일 실시태양에 따라서, 샘플 질량 스펙트럼 이미지화를 위한 시스템은 레이저 절제 샘플러, 유도 결합 플라즈마 이오나이저, 질량 분광계, 및 컴퓨터를 포함한다. 예시적으로, 레이저 절제 샘플러는 레이저, 레이저 절제 챔버 및 레이저가 샘플 플랫폼에 위치된 샘플을 조사하여 절제된 샘플을 형성시킬 수 있는 샘플 플렛폼을 포함하고, 레이저 및 샘플 플랫폼은 컴퓨터에 의해 조정된다. 레이저 절제 샘플러 및 유도 결합 플라즈마 이오나이저는 작동적으로 연결되어 절제된 샘플이 레이저 절제 샘플러에서 유도 결합 플라즈마 이오나이저로 수송되어, 절제된 샘플을 증발, 기화, 미립화, 및 이온화시켜 질량 대 전하 비율 분포를 갖는 원자 이온 개체군을 형성시킨다. 질량 분광계는 유도 결합 플라스마 이오나이저에 작동적으로 연결되어 이온 개체군이 유도 결합 플라즈마 이오나이저에서 질량 분광계로 수송될 수 있으며, 여기서 질량 분광계는 질량 대 전하 비율 분포에 따라 이온 개체군을 분리하여, 질량 대 전하 비율 데이타를 생성시킨다. 컴퓨터는 위치 입력에 따라 샘플을 절제하도록 위치 입력을 허용하고 레이저 절제 샘플러와 통신하도록 구성되며, 위치 입력에 따라 샘플 상의 위치와 질량 대 전하 비율 데이타를 관련시키도록 구성된다. 실시태양에서, 시스템은 샘플의 위치를 결정하도록 구성된 등록 시스템을 더 포함하여서, 레이저가 조사되도록 구성된 샘플 상의 위치와 위치 입력의 자동으로 관련시킬 수 있다. 예시적인 실시태양에서, 다중 샘플 LA-ICP-MS 어세이를 위한 조성물은 질량 태그 및 질량 태그에 접합된 특이적 결합 모이어티를 포함한다. 질량 태그는 샘플에 내생성인 성분과 검출가능하게 상이한 제1 종류의 원자의 개체군을 포함한다. 하나의 실시태양에서, 제1 종류의 원자의 개체군은 성분의 비내생성의 안정한 동위원소이다. 또다른 실시태양에서, 원자 개체군은 콜로이드 입자로서 구성된다. 그 전체로 참조로 본 명세서에 편입되는 WO2014079802를 참조한다.
샘플 중 표적을 검출하기 위한 방법은 표적을 인식하도록 선택된 효소 특이적 결합 모이어티 접합체와 샘플을 접촉시키는 단계를 포함한다. 다음으로 샘플은 질량 태그 전구체 및 효소 기질, 티라민 모이어티, 또는 티라민 유도체, 및 선택적 링커를 포함하는, 질량 태그 전구체 접합체와 접촉된다. 질량 태그 전구체 접합체는 효소 또는 효소적 반응의 생성물과의 반응을 겪어서 침전된 질량 태그, 공유 결합된 질량 태그, 또는 비공유 결합된 질량 태그를 생성시킨다. 샘플은 질량 태그로부터 질량 코드를 생성시키기 위해 충분한 에너지를 제공하는, 에너지원에 노출된다. 이온화 후, 질량 코드는 검출 방법, 예컨대 질량 분광법을 사용해 검출될 수 있다. 일부 실시태양에서, 샘플은 효소-특이적 결합 모이어티 접합체를 포함하는 제1 용액 및 질량 태그 전구체 접합체를 포함하는 제2 용액에 노출된다. 효소-특이적 결합 모이어티의 효소 모이어티는 옥시도-리덕타제 효소(예를 들어 퍼옥시다제), 포스파타제(예를 들어 알칼리 포스파타제), 락타마제(예를 들어 β-락타마제), 및 갈락토시다제(예를 들어, β-D-갈락토시다제, β-갈락토시다제)로부터 선택될 수 있다. 특이적 결합 모이어티는 단백질, 폴리펩티드, 올리고펩티드, 펩티드, 핵산, DNA, RNA, 올리고당, 다당류 및 이의 단량체로부터 선택될 수 있다. 특히 개시된 실시태양은 알칼리 포스파타제-항체 접합체 및 홀스래디쉬 퍼옥시다제-항체 접합체의 사용을 고려한다. 일부 개시된 실시태양에서, 특이적 결합 모이어티는 표적을 인식한다. 다른 개시된 실시태양에서, 특이적 결합 모이어티는 표적에 결합된 1차 항체를 인식한다. 일부 실시태양에서, 질량 태그의 침착은 표적에 효소의 고정, 및 샘플과 효소 기질 모이어티 및 질량 태그 전구체의 접촉을 포함한다. 효소 기질 모이어티는 효소 및 질량 태그 전구체와 반응하여 표적에 질량 태그를 생성 및 침착시킨다. 둘 이상의 표적이 샘플에 존재하면, 질량 태그는 상기에 기술된 바와 같이 각 표적에 순차적으로 침착된다. 질량 태그가 침착된 후, 상응하는 효소는 후속 표적에서 후속 질량 태그의 침착 이전에 탈활성화된다. 다른 개시된 실시태양에서, 효소는 질량 태그 전구체-티라민 접합체 또는 질량 태그 전구체-티라민 유도체 접합체와 반응하여 전형적으로 공유적으로 표적에 가깝에 질량 태그를 침착시킨다. 일부 실시태양에서, 표적에 효소의 고정은 샘플을 특이적 결합 모이어티 및 효소를 포함하는 접합체외 접촉시키는 것을 포함한다. 특정 실시태양에서, 특이적 결합 모이어티는 항체이다. 특이적 결합 모이어티는 표적 또는 표적에 이전에 결합된 또 다른 특이적 결합 모이어티를 인식하여 직접 결합할 수 있다. 특정 실시태양에서, 제1 효소, 제2 효소, 및 임의의 부가적 효소는 동일하다. 그 전체로 참조로 본 명세서에 편입되는 WO2012003478를 참조한다.
DNA 메틸화 검출
최근에, DNA 메틸화의 측정을 통해 암을 진단하는 방법이 제안되었다. DNA 메틸화는 전사 인자의 결합을 방해하여 유전자의 발현을 침묵시키도록 특정 유전자의 프로모터 영역 중 CpG 섬의 시토신 상에서 주로 일어난다. 따라서, 종양 억제인자 유전자의 프로모터 내 CpG 섬의 메틸화의 검출이 암 연구에 상당히 도움을 준다. 최근에 암의 진단 및 스크리닝을 위해, 방법 예컨대 메틸화-특이적 PCR(이하 MSP라고 함) 또는 자동화 DNA 시퀀싱을 통해 프로모터 메틸화를 결정하려는 활발한 시도가 있어왔다. 그 전체로 참조로 본 명세서에 편입되는 WO2009069984A2를 참조한다.
음향 에너지
적어도 일부 실시태양은 시료를 분석하기 위한 방법 및 시스템에 관한 것이다. 시료는 이의 특성을 기반으로 분석될 수 있다. 이들 특성은 가공 동안 정적 또는 동적일 수 있는 음향적 특성, 기계적 특성, 광학적 특성 등을 포함한다. 일부 실시태양에서, 시료의 특성은 연속적으로 또는 주기적으로 가공 동안 모니터링되어서 시료의 상태 및 조건을 평가한다. 수득된 정보를 기반으로 가공은 가공 일관성을 향상시키거나, 가공 시간을 단축하거나, 가공 품질을 개선시키는 등을 위해 제어될 수 있다. 음향학을 사용하여 연성 물체, 예컨대 샘플을 분석하는데 사용될 수 있다. 음향적 신호가 샘플과 상호반응할 때, 전송된 신호는 샘플의 몇몇 기계적 특성, 예컨대 탄성 및 경도에 의존한다. 고정제(예를 들어, 포르말린)에 위치된 샘플은 보다 강하게 교차결합되므로, 전송 속도는 샘플의 특성에 따라 변화될 것이다. 일부 실시태양에서, 생물학적 샘플의 상태는 음파의 전파 시간을 기반으로 모니터링될 수 있다. 그 상태는 밀도 상태, 고정 상태, 염색 상태 등일 수 있다. 모니터링은 제한없이, 샘플 밀도, 교차결합, 탈회, 염색제 착색 등의 변화의 측정을 포함할 수 있다. 생물학적 샘플은 비유동 샘플, 예컨대 뼈, 또는 샘플의 기타 유형일 수 있다. 실시태양에서, 방법 및 시스템은 시료를 모니터링하기 위해 음향 에너지를 사용하도록 지정된다. 반사 및/또는 전송 모드인 음향 에너지 사이의 상호작용을 기반으로, 시료에 대한 정보를 수득할 수 있다. 음향 측정을 수행할 수 있다. 측정의 예는 음향 신호 진폭, 감쇠, 산란, 흡수, 시료에서 비행 시간(TOF), 음파의 상이동, 또는 이의 조합을 포함한다. 시료는, 일부 실시태양에서, 가공 동안 변화되는 특성을 갖는다. 일부 실시태양에서, 고정제가 시료에 적용된다. 시료가 보다 고정되면, 기계적 특성(예를 들어, 탄성, 강성 등)은 분자 교차결합으로 인해 변화된다. 이들 변화는 TOF를 통한 소리 속도 측정을 사용해 모니터링될 수 있다. 측정을 기반으로, 시료의 고정 상태 또는 기타 조직학적 상태를 결정할 수 있다. 저고정 또는 과고정을 피하기 위해, 샘플의 정적 특성, 샘플의 동적 특성, 또는 둘 모두를 모니터링할 수 있다. 샘플의 특징은 전송 특징, 반사 특징, 흡수 특징, 감쇠 특징 등을 포함할 수 있다. 특정 실시태양에서에서, 샘플을 평가하기 위한 방법은 샘플 가공 이전, 그 동안 및/또는 이후에 음파 속도를 분석하는 단계를 포함한다. 이는 먼저 대상체로부터 채취된 트랜스미터로부터 음파를 전달하여 신선하고, 미고정된 샘플에 대한 기준 측정을 확정하는 것에 의해 수행된다. 기준 TOF 음파는 리시버에 의해 검출된다. 샘플의 가공 이후 또는 그 동안 제2의 음파가 트랜스미터로부터 샘플로 전달된다. 제2의 TOF 음파는 제2의 음파가 샘플을 통해 이동한 후 리시버를 사용해 검출한다. 샘플 중 소리 속도는 제1 TOF 및 제2 TOF를 기준으로 비교하여 속도의 변화를 결정한다. 이들 측정은 분석되는 각 샘플에 대해 독특할 수 있으므로 각 샘플에 대한 기준선을 확정하는데 사용된다. 부가적 TOF 측정은 매질, 측정 채널 등에 기여하는 TOF 기여도를 결정하는데 사용될 수 있다. 일부 실시태양에서, 매질의 TOF는 매질의 기준 TOF를 결정하기 위한 시료가 존재하지 않을 때 측정된다. 그 전체로 참조로 본 명세서에 편입되는 WO2011109769를 참조한다.
지질체학적
지질체학적 연구는 수천개의 세포 지질 분자 종의 동정 및 정량화 및 다른 지질, 단백질 및 다른 대사물과 그들의 상호작용을 포함한다. 지질체학에서 조사자는 세포 지질의 구조, 기능, 상호작용 및 역학, 및 시스템의 섭동 동안 발생하는 변화를 조사한다. 지질체학적 분석 기술은 질량 분광법(MS), 핵 자기 공명(NMR) 분광법, 형광 분광법, 이중 편광 간섭계법 및 컴퓨터 방법을 포함할 수 있다. 지질체학적 조사에서, 상이한 지질 분자 종의 함량 및 조성의 공간적 및 일시적 변경을 정량적으로 기술하는 데이타는 이의 생리학적 또는 병리학적 상태의 변화를 통해 세포의 섭동 후 누적된다. 이들로부터 수득된 정보는 세포 기능에서의 변화에 대한 기계론적 통찰을 용이하게 한다.
면역 세포의 정량화
샘플 중 면역 세포 정량화는 후생유전-기반, 정량적 실시간 PCR 보조 세포 계측법(qPACC)을 사용해 수행할 수 있다. 활성적으로 발현되거나 또는 침묵된 유전자의 염색질 구조의 메틸화 상태는 후생유전-기반 세포 동정 및 정량화 기술의 기초이다. 디뉴클레오티드 시토신 포스페이트 구아닌의 시토신 염기의 5'-탄소로부터 메틸기의 세포 유형 특이적 제거(탈메틸화)의 발견은 오직 소량의 인간 혈액 또는 조직 샘플로부터 면역 세포의 정밀하고 확고한 정량화를 가능하게 한다. 게놈 DNA 상에 위치하는 이들 후생유전적 바이오마커는 관심 세포와 안정적으로 연관된다. Kleen and Yuan(November 2015). "Quantitative real-time PCR assisted cell counting(qPACC) for epigenetic - based immune cell quantification in blodd and tissue". J. Immunother. Cancer 46(3).
암-연관된 마커의 검출
예컨대 제한없이 RNA, DNA 또는 단백질 시퀀싱을 사용하여, 암의 존재와 연관된 단백질, 항원, 효소, 호르몬, DNA 돌연변이, 및 탄수화물을 포함하는 "종양 마커"의 검출은 암 유형의 올바른 진단, 및 적당한 치료 방법의 선택에 중요하다. 이러한 마커는 제한없이 알파 페토단백질(종종 제한없이 생식 세포 종양 및 간세포암종과 연관됨), CA 15-3(종종 제한없이 유방암과 연관됨), CA27-29(종종 제한없이 유방암과 연관됨), CA19-9(종종 제한없이 췌장암, 직대장암 및 다른 위장암 유형과 연관됨), CA-125(종종 제한없이, 난소암, 자궁내막암, 나팔관암, 폐암, 유방암 및 위장암과 연관됨), 칼시토닌(종종 제한없이 수질 갑상선 암종과 연관됨), 칼레티닌(종종 제한없이, 중피종, 성삭-생식선 기질 종양, 부신피질 암종, 활액 육종과 연관됨), 암배아 항원(종종 제한없이 위장암, 자궁경부 암, 폐암, 난소 암, 유방암, 비뇨기관 암과 연관됨), CD34(종종 제한없이 혈관주위세포종/고립성 섬유 종양, 다형성 지방종, 위장 기징 종양, 융기성 피부섬유육종과 연관됨), CD99MIC 2(종종 제한없이 유잉육종, 원시 신경외배엽 종양, 혈관주위세포종/고립성 섬유 종양, 활액 육종, 림프종, 백혈병, 성삭-생식선 기질 종양과 연관됨), CD117(종종 제한없이 위장 기질 종양, 비만세포종, 정상피종과 연관됨), 크로모그라닌(종종 제한없이 신경내분비 종양과 연관됨), 염색체 3, 7, 17 및 9p21(종종 제한없이 방광암과 연관됨), 다양한 유형의 사이토케라틴(종종 제한없이 많은 유형의 암종 및 일부 유형의 육종과 연관됨), 데스민(종종 제한없이 평활근 육종, 골격근 육종, 및 자궁내막 기질 육종과 연관됨), 상피 막 항원(종종 제한없이 다양한 유형의 암종, 뇌수막종, 및 일부 유형의 육종과 연관됨), 인자 VIII/CD31 FL1(종종 제한없이 혈관 육종과 연관됨), 신경교섬유질 산성 단백질(종종 제한없이 신경교종(성상세포종, 상의세포종)과 연관됨), 육안적 낭포 질환 유체 단백질(종종 제한없이 유방암과 연관됨, 난소 암, 및 타액선 암과 연관됨), HMB-45(종종 제한없이 흑색종, PEComa(예를 들어 혈관근지방종), 투명 세포 암종, 부신피질 암종과 연관됨), 인간 융모막 고나도트로핀(종종 제한없이 임신융모 질환, 생식 세포 종양, 및 융모막 암종과 연관됨), 면역글로불린(종종 제한없이 림프종, 백혈병과 연관됨), 인히빈(종종 제한없이 성삭-생식선 기질 종양, 부신피질 암종, 혈관아세포종과 연관됨), 케라틴의 다양한 유형(종종 제한없이 암종, 육종의 일부 유형과 연관됨), 다양한 유형의 림프구 마커(종종 제한없이 림프종, 백혈병과 연관됨), MART-1(Melan-A)(종종 제한없이 흑색종, 스테로이드 생성 종양(부신피질 암종, 생식선 종양)과 연관됨), Myo D1(종종 제한없이 횡문근육종, 소형, 원형, 청색 세포 종양과 연관됨), 근육-특이적 액틴(MSA)(종종 제한없이 근육종(평활근육종, 횡문근육종)과 연관됨), 신경사상체(종종 제한없이 신경내분비 종양, 폐의 소세포 암종과 연관됨), 뉴런-특이적 에놀라제(종종 제한없이 신경내분비 종양, 폐의 소세포 암종, 유방암과 연관됨), 태반 알칼리 포스파타제(PLAP)(종종 제한없이 정상피종, 미분화배세포종, 배아 암종과 연관됨), 전립선-특이적 항원(종종 제한없이 전립선암과 연관됨), PTPRC(CD45)(종종 제한없이 림프종, 백혈병, 조직구 종양과 연관됨), S100 단백질(종종 제한없이 흑색종, 육종(신경육종, 지방종, 연골육종), 성상세포종, 위장 기질 종양, 타액선암, 선암종의 일부 유형, 조직구 종양(수지상 세포, 마크로파지)과 연관됨), 평활근육 액틴(SMA)(종종 제한없이 위장 기질 종양, 평활근육종, PEComa와 연관됨), 시냅토파이신(종종 제한없이 신경내분비 종양과 연관됨), 티로글로불린(종종 제한없이 갑상선암의 수술후 마커와 연관됨), 갑상선 전사 인자-1(종종 제한없이 모든 유형의 갑상선 암, 폐암과 연관됨), 종양 M2-PK(종종 제한없이 직대장암, 유방암, 신장 세포 암종, 폐암, 췌장암, 식도암, 위암, 자궁암, 난소암과 연관됨), 비멘틴(종종 제한없이 육종, 신장 세포 암종, 자궁내막암, 폐암종, 림프종, 백혈병, 흑색종과 연관됨), ALK 유전자 재배열(종종 제한없이 비소세포 폐암 및 악성 거대 세포 림프종과 연관됨), 베타-2-마이크로글로불린(B2M)(종종 제한없이 연관됨다발성 골수종, 만성 림프성 백혈병 및 일부 림프종과 연관됨), 베타-인간 융모막 고나도트로핀(Beta-hCG)(종종 제한없이 융모막 암종 및 생식 세포 종양과 연관됨), BRCA1 및 BRCA2 유전자 돌연변이(종종 제한없이 난소암과 연관됨), BCR-ABL 융합 유전자(필라델피아 염색체)(종종 제한없이 만성 골수성 백혈병, 급성 림프아구성 백혈병, 및 급성 골수성 백혈병과 연관됨), BRAF V600 돌연변이(종종 제한없이 피부 흑색종 및 직대장암과 연관됨), CD20(종종 제한없이 비호지킨 림프종과 연관됨), 크로모그라닌 A(CgA)(종종 제한없이, 신경냉분비 종양), 상피 기원의 순환 종양 세포(CELLSEARCH®)(종종 제한없이 전이성 유방, 전립선, 및 직대장암과 연관됨), 사이토케라틴 단편 21-1(종종 제한없이, 런치암과 연관됨), EGFR 유전자 돌연변이 분석(종종 제한없이 비소세포 폐암과 연관됨), 에스트로겐 수용체(ER)/프로게스테론 수용체(PR)(종종 제한없이 유방암과 연관됨), HE4(종종 제한없이 난소암과 연관됨), KRAS 유전자 돌연변이 분석(종종 제한없이 직대장암 및 비-소세포 폐암과 연관됨), 락테이트 데하이드로게나제(종종 제한없이 생식 세포 종양, 림프종, 백혈병, 흑색종, 및 신경아세포종과 연관됨), 뉴런-특이적 에놀라제(NSE)(종종 소세포 폐암 및 신경아세포종과 연관됨), 핵 매트릭스 단백질 22(종종 제한없이 방광암과 연관됨), 프로그램된 사멸 리간드 1(PD-L1)(종종 비소세포 폐암과 연관됨), 유로키나제 플라스미노겐 활성인자(uPA) 및 플라스미노겐 활성인자 억제인자(PAI-1)(종종 제한없이 유방암과 연관됨), 5-단백질 서명(OVA1®)(종종 제한없이 난소암과 연관됨), 21-유전자 서명(Oncotype DX®)(종종 유방암과 연관됨), 70-유전자 서명(Mammaprint®)(종종 제한없이 유방암과 연관됨), 및 HER2/neu 유전자 증폭 또는 과발현(종종 유방암, 난소암, 위식도 연결부 선암종, 위암, 비-소세포 폐암 및 자궁암과 연관됨)을 포함한다. 종양과 연관된 부가적 바이오마커는 제한없이, Pl3KCA 돌연변이, FGFR2 증폭, p53 돌연변이, BRCA 돌연변이, CCND1 증폭, MAP2K4 돌연변이, ATR 돌연변이, 또는 발현이 특정 암과 상관된 임의의 다른 바이오마커; AFP, ALK, BCR-ABL, BRCA1/BRCA2, BRAF, V600E, Ca-125, CA19.9, EGFR, Her-2, KIT, PSA, S100, KRAS, ER/Pr, UGT1A1, CD30,CD20, F1P1L1-PDGRFa, PDGFR, TMPT, 및 TMPRSS2 중 적어도 하나; 또는 ABCB5, AFP-L3, 알파-페토단백질, 알파-메틸 아실-CoA 라세마아제, BRCA1, BRCA2, CA 15-3, CA 242, Ca 27-29, CA-125, CA15-3, CA19-9, 칼시토닌, 암배아 항원, 암배아 항원 펩티드-1, Des-감마 카르복시 프로트롬빈, 데스민, 조기 전립선암 항원-2, 에스트로겐 수용체, 피브린 붕괴 산물, 글루코스-6-포스페이트 아이소머라제, HPV 항원 예컨대 vE6, E7, L1, L2 또는 p16INK4a 인간 융모막 고나도트로핀, IL-6, 케라틴 19, 락테이트 데하이드로게나제, 류실 아미노펩티다아제, 리포트로핀, 메타네프린, 네프릴리신, NMP22, 노르메타네프린, PCA3, 전립선-특이적 항원, 전립선 산 포스파타제, 시냅토파이신, 티로글로불린, TNF, ERG, ETV1(ER81), FLI1, ETS1, ETS2, ELK1, ETV6(TEL1), ETV7(TEL2), GABPa, ELF1, ETV4(E1AF; PEA3), ETV5(ERM), ERF, PEA3/E1AF, PU.1, ESE1/ESX, SAP1(ELK4), ETV3(METS), EWS/FLI1, ESE1, ESE2(ELF5), ESE3, PDEF, NET(ELK3; SAP2), NERF(ELF2), 또는 FEV에서 선택되는 전사 인자, 종양-연관된 당단백질 72, c-kit, SCF, pAKT, pc-kit, 및 비멘틴에서 선택되는 적어도 하나의 바이오마커를 포함할 수 있다. 대안적으로, 또는 부가적으로 관심 바이오마커는 면역 체크포인트 억제인자 예컨대, 제한없이, CTLA-4, PDL1, PDL2, PD1, B7-H3, B7-H4, BTLA, HVEM, KIR, TIM3, GAL9, GITR, LAG3, VISTA, KIR, 2B4, TRPO2, CD160, CGEN-15049, CHK1, CHK2, A2aR, TL1A, 및 B-7 패밀리 리간드 또는 이의 조합일 수 있거나, 또는 CTLA-4, PDL1, PDL2, PD1, B7-H3, B7-H4, BTLA, HVEM, TIM3, GAL9, LAG3, VISTA, KIR, 2B4, CD160, CGEN-15049, CHK1, CHK2, A2aR, B-7 패밀리 리간드, 또는 이의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 체크포인트 단백질의 리간드이다. 부가적 마커는 제한없이 급성 림프아구성 백혈병(etv6, am11, 사이클로필린 b), B 세포 림프종(Ig-이디오타입), 신경교종(E-카데린, 알파-카테닌, 베타-카테닌, 감마-카테닌, p120 ctn), 방광암(p21ras), 담관암(p21ras), 유방암(MUC 패밀리, HER2/neu, c-erbB-2), 자궁 암종(p53, p21ras), 대장 암종(p21ras, HER2/neu, c-erbB-2, MUC 패밀리), 직대장암(직대장 연관 항원(CRC)-C017-1A/GA733, APC), 융모막 암종(CEA), 상피세포 암(사이클로필린 b), 위암(HER2/neu, c-erbB-2, ga733 당단백질), 간세포암(알파- 페토단백질), 호지킨 림프종(Imp-1, EBNA-1), 폐암(CEA, MAGE-3, NY-ESO-1), 림프계 세포-유래된 백혈병(사이클로필린 b), 흑색종(p5 단백질, gp75, 종양태아성 항원, GM2 및 GD2 강글리오시드, Melan-A/MART-1, cdc27, MAGE-3, p21ras, gp100.sup.Pmel117), 골수종(MUC 패밀리, p21ras), 비-소세포 폐암종(HER2/neu, c-erbB-2), 비인두암(Imp-1, EBNA-1), 난소 암(MUC 패밀리, HER2/neu, c-erbB-2), 전립선암(전립선 특이적 항원(PSA) 및 이의 항원성 에피토프 PSA-1, PSA-2, 및 PSA-3, PSMA, HER2/neu, c-erbB-2, ga733 당단백질), 신장 암(HER2/neu, c-erbB-2), 자궁경부 및 식도의 편평상피세포 암(바이러스 생성물, 예컨대 인간 파필로마 바이러스 단백질), 고환암(NY-ESO-1), 및/또는 T 세포 백혈병(HTLV-1 에피토프)와 연관된 적어도 하나의 바이오마커의 검출을 포함할 수 있다.
키나제 캐스캐이드의 특정 양상의 정밀한 표적화가 이제 질환 요법에 대해 이전에 얻을 수 없었던 돌파구를 제공하는 거으로 알려졌다. 단백질 키나제 패밀리의 중요성은 키타제 활성의 이상조절에 기인해 발생되는 수많은 질환 상태에 의해 강조되었다. 많은 이들 단백질 및 지질 키나제에 의한 비정상적인 세포 신호전달은 질환, 예컨대 암을 유발시킬 수 있다. 몇몇 단백질 세리/트레오닌 및 티로신 키나제는 암 세포에서 활성화되어 종양 성장 및 진행을 구동시키는 것으로 알려져 있다. 본 명세서에 기술된 기술은 하나 이상의 키나제 포획제를 이용하여, 키나제, 예를 들어 ATP-의존적 키나제를 농축(또는 단리)하기 위한 방법을 제공한다. 키나제 포획제의 예는 제한없이, 비교적 비선택적 단백질 억제인자, 기질 또는 슈도기질을 포함한다. 이 방법은 탠덤 질량 분광법에 의한 예를 들어, 키놈(kinome)의 프로파일링을 위해 유용하다. 많은 고도로 선택적이고 강력한 소형 분자 키나제 억제인자가 이전에 동정되었지만, 상기 본 명세서에 기술된 바와 같이, 대량의 비교적 비선택적 소형 분자 키나제 억제인자가 또한 동정되었다. 본 명세서에 기술된 방법의 경우, 비교적 비선택적인 소형 분자 키나제 억제인자의 사용은 개별 키나제에 대한 정제 과정을 재단하는 필요성을 감소시키고, 오직 촉매적 농도로 세포, 조직 및 체액에 정상적으로 존재하는 효소를 농축시켜 수득되는 신호를 증폭시킨다. 그러나, 선택적 소형 분자 키나제 억제인자가 또한 이들 키나제 분석 방법에서 유용할 수 있다는 것을 인식할 것이다. 또한, 비선택적 및 선택적 소형 분자 키나제 억제인자의 조합이 이들 방법에서 유용할 수 있다. 게다가, 키나제 포획제(또는 하나 초과의 키나제 포획제)가 포스파타제 포획제와 조합되어 키나제 및 포스파타제를 동시에 농축(또는 단리)시킬 수 있다. 본 명세서에서 기술된 방법은 또한 단일 또는 복수 시료로부터 탠덤 질량 분광법에 의해 단백질 키나제 및/또는 포스파타제의 다중 분석에 적용될 수 있다. 본 명세서에 기술된 기술은 키나제의 개체군, 예컨대 키놈을 분석하기 위한 방법을 제공한다. 이 방법은 하나 이상의 키나제 포획제를 사용해 샘플로부터 키나제를 분리하는 단계, 단백질 샘플을 구성성분 펩티드로 단백질가수분해적으로 소화(예를 들어, 프로테아제 예컨대 트립신 사용)시키는 단계, 잘리기 쉬운 아스파테이트-프롤린(DP) 결합을 함유하는 특정 단백질 키나제 펩티드 서열과 관련된 합리적으로 디자인된 보정기 펩티드를 수득된 펩티드에 보충하는 단계, 및 탠덤 질량 분광법에 의해 키나제 개체군으로부터 유래된 선천 펩티드를 정량하는 단계를 포함한다. 잘리기 쉬운 DP 결합을 함유하는 등압 펩티드 태그를 사용한 복수 샘플 중 단백질 및 지질 키나제의 상대적 풍부함을 프로파일링하기 위한 전략이 또한 기술되어 있다. 당업자는 유사한 방법론을 포스파타제 또는 키나제와 포스파타제의 조합을 분석하는데 적용할 수 있다는 것을 인식할 것이다. 그 전체로 참조로 본 명세서에 편입되는 WO2007131191을 참조한다.
특이적 세포 유형의 친화도 정제
추정되는 순환 종양 세포는 AML, CML, 다발성 골수종, 뇌 종양, 유방 종양, 흑색종, 및 전립선암, 대장 암, 및 위암을 포함하여 복수의 인간 종양에서 현재 보고되었다. 이론적으로, 순환 종양 세포는 몇몇 실험 전략에 의해 동정될 수 있다. 많은 순환 종양 세포는 그들 정상 대응물을 동정하는 세포 표면 마커를 발현하는 것으로 보인다. 이러한 관찰은 유세포 분석-기반 세포 분류 또는 세포의 미세비드-기반 친화도 정제를 이용하는 비교적 단순한 농축 과정을 제공한다. 문헌 [Schawb, M. Encyclopedia of Cancer, 3rd edition, Springer- Verlag Berlin Heidelberg, 2011]을 참조한다.
DNA 시퀀싱
추가의 예시적 실시태양에서, 샘플, 또는 하나 이상의 이의 세포는 DNA 시퀀싱이 수행될 수 있다. DNA 시퀀싱은 예를 들어, 특정 유전자, 영역, 조절성 서열, 인트론, 엑손, SNP, 잠재적 융합체 등을 표적으로 하여, 암과 연관된 서열 또는 이의 진단과 관련된 서열을 검출할 수 있다. DNA 시퀀싱은 또는 전체 게놈 또는 이의 상당한 부분에 대해 수행될 수 있다. 이용할 수 있는 예시적 시퀀싱 방법은 제한없이, 생어(Sanger) 시퀀싱 및 염료-종결부위 시퀀싱, 뿐만 아니라 차세대 시퀀싱(NGS) 기술 예컨대 파이로시퀀싱, 나노포어 시퀀싱, 마이크로포어-기반 시퀀싱, 나노볼 시퀀싱, MPSS, 고형, 솔렉사(Solexa), 이온 토렌트(Ion Torrent), 스타라이트(Starlite), SMRT, tSMS, 합성에 의한시퀀싱, 결찰에 의한 시퀀싱, 질량 분광법 시퀀싱, 중합효소 시퀀싱, RNA 중합효소(RNAP) 시퀀싱, 현미경관찰-기반 시퀀싱, 비소유체 생어 시퀀싱, 현미경관찰-기반 시퀀싱, RNAP 시퀀싱, 터널링 커렌츠(tunnelling currents) DNA 시퀀싱, 및 시험관내 바이러스 시퀀싱을 포함한다. 각각 그 전체로 참조로 본 명세서에 편입되는 WO2014144478, WO2015058093, WO2014106076 및 WO2013068528을 참조한다.
DNA 시퀀싱 기술은 기하급수적으로 진보하였다. 가장 최근에, 고수율 시퀀싱(또는 차세대 시퀀싱) 기술은 한번에 수천 또는 수백만 서열을 생성하는 시퀀싱 과정을 대비시킨다. 합성에 의한 500,000 시퀀싱 정도로 많은 초고수율 시퀀싱에서, 작업은 평행하게 운영될 수 있다. 차세대 시퀀싱은 비용을 절감시켰고 산업 표준 염료-종결부위 방법에 대한 속도를 상당히 증가시켰다.
파이로시퀀싱은 오일 용액 중 물 액적 내부에서 DNA를 증폭시키고(에멀션 PCR), 단일 DNA 주형을 함유하는 각 액적은 클론 콜로니를 형성하는 단일 프라이머-코팅된 비드에 부착된다. 시퀀싱 기계는 각각 단일 비드 및 시퀀싱 효소를 함유하는 피코 리터 부피의 웰을 함유한다. 파이로시퀀싱은 초기 DNA에 첨가되는 개별 뉴클레오티드의 검출을 위해 빛을 발생하도록 루시퍼라제를 이용하며, 조합된 데이타를 사용하여 서열 판독치를 생성시킨다. 문헌 [Margulies, M et al. 2005, Nature, 437, 376-380]을 참조하며, 이를 전체로 참조로 본 명세서에 편입시킨다. 파이로시퀀싱 시퀀싱은 파이로시퀀싱을 또한 이용하는 합성에 의한 시퀀싱 기술이다. DNA의 파이로시퀀싱 시퀀싱은 2단계를 포함한다. 제1 단계에서, DNA를 대략 300 내지 800 염기쌍의 단편으로 전단시키고 단편은 블런트 말단이다. 올리고뉴클레오티드 어댑터를 단편의 말단에 결찰시킨다. 어댑터는 증폭 및 단편의 스퀀싱을 위한 프라이머로서 제공된다. 단편은 DNA 포획 비드, 예를 들어 5'-비오틴 태그를 함유하는, 예를 들어 어댑터 B를 사용하는 스트렙타비딘 코팅된 비드에 부착된다. 비드에 부착된 단편은 오일-물 에멀션의 액적 내에서 PCR 증폭된다. 결과는 각 비드 상에서 클론 증폭된 DNA 단편의 복수 카피이다. 제2 단계에서, 비드는 웰(피코-리터 크기)에 포획된다. 파이로시퀀싱은 각 DNA 단편에 대해 동시에 수행된다. 하나 이상의 뉴클레오티드의 첨가는 시퀀싱 장비에서 CCD 카메라에 의해 기록되는 광신호를 생성시킨다. 신호 강도는 도입되는 뉴클레오티드의 수에 비례한다. 파이로시퀀싱은 뉴클레오티드 첨가 시 발생되는 파이로포스페이트(PPi)를 이용한다. PPi는 아데노신 5' 포스포설페이트의 존재에서 ATP 설퍼릴라제에 의해 ATP로 전환된다. 루시퍼라제는 ATP를 사용하여 루시페린을 옥시루시페린으로 전환시키고, 이러한 반응은 검출 및 분석되는 빛을 발생시킨다. 또다른 실시태양에서, 파이로시퀀싱은 유전자 발현을 측정하는데 사용된다. RNA의 파이로시퀀싱은 DNA의 파이로시퀀싱과 유사하게 적용되며, 부분 rRNA 유전자 시퀀싱의 어플리케이션을 현미경 비드에 부착시킨 후 개별 웰에 부착물을 위치시켜 수행된다. 부착된 부분 rRNA 서열이 유전자 발현 프로파일을 결정하기 위해 증폭된다.[Sharon Marsh, Pyrosequencing® Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol. 373, 15-23(2007)].
본 개시에 제공되는 방법에서 사용할 수 있는 시퀀싱 기술의 다른 예는 나노포어 시퀀싱(그 전체로 참조로 본 명세서에 편입되는, 문헌 [Soni G V and Meller, AClin Chem 53: 1996-2001, 2007])이다. 나노포어는 직경이 1 나노미터인 작은 구멍이다. I전도성 유체 중에 나노포어의 함침 및 그에 걸쳐 전위의 인가가 나노포어를 통한 이온의 전도로 인해 약간의 전류를 발생시킨다. 흐르는 전류의 양은 나노포어의 크기에 민감하다. DNA 분자가 나노포어를 통해 통과함에 따라, DNA 분자 상의 각 뉴클레오티드는 상이한 정도로 나노포어를 방해한다. 따라서, DNA 분자가 나노포어를 통해 통과함에 따라 나노포어를 통해 통과하는 전류의 변화는 DNA 서열의 판독치를 나타낸다. 그 전체로 참조로 본 명세서에 편입되는 문헌 [Bayley, Clin Chem. 2015 Jan; 61(1):25-31]을 참조한다.
제공된 개시의 방법에서 사용될 수 있는 DNA 및 RNA 검출의 다른 예는 SOLiD™ 기술(Applied Biosystems)이다. SOLiD™ 기술 시스템은 대량으로 동시에 DNA 및 RNA 둘 모두의 차세대 시퀀싱을 운영하는데 사용될 수 있는 결찰 기반 시퀀싱 기술이다. DNA SOLiD™ 시퀀싱에서, 게놈 DNA가 단편으로 전단되고, 어댑터가 단편의 5' 및 3' 말단에 부착되어 단편 라이브러리를 생성시킨다. 대안적으로, 내부 어댑터는 어댑터를 단편의 5' 및 3' 말단에 결찰시키고, 단편을 원형화시키고, 원형화된 단편을 소화시켜 내부 어댑터를 생성시키며, 어댑터를 최종 단편의 5' 및 3' 말단에 부착시켜 메이트-쌍형성 라이브러리를 생성시키는 것에 의해 도입된다. 다음으로, 클론 비드 개체군은 비드, 프라이머, 주형 및 PCR 구성요소를 함유하는 미소 반응기에서 제조된다. PCR 이후, 주형을 변성시키고 비드는 주형을 연장시키는 비드를 분리하여 농축시킨다. 선택된 비드 상의 주형에 대해서 유리 슬라이드와 결합할 수 있는 3' 수식을 수행한다. 서열은 특이적 형광단에 의해 동정된 중심 결정 염기(또는 염기의 쌍)과 부분적 무작위 올리고뉴클레오티드의 순차적 하이브리드화 및 결찰에 의해 결정된다. 색상이 기록된 후, 결찰된 올리고뉴클레오티드가 절단되고 제거되면 과정이 반복된다.
다른 실시태양에서, SOLiD™ 유전자 발현의 연속 분석(Serial Analysis of Gene Expression; SAGE)을 사용하여 유전자 발현을 측정한다. 유전자 발현의 연속 분석(SAGE)은 각 전사물에 대한 개별 하이브리드화 프로브를 제공할 필요없이, 전대량의 유전자 전사물의 동시적 및 정량적 분석을 가능하게 하는 방법이다. 먼저, 전사물을 독특하게 동정하는데 충분한 정보를 함유하는 짧은 서열 태그(약 10-14 bp)을 생성시키는데, 단 태그는 각 전사물 내 독특한 위치로부터 수득된다. 다음으로, 많은 전사물을 함께 연결시켜, 서열분석할 수 있는 긴 연속 분자를 형성시키고, 복수 태크의 정체를 동시에 밝혀준다. 전사물의 임의 개체군의 발현 패턴은 개별 태그의 풍부함을 결정하고, 각 태그에 상응하는 유전자를 동정하여 정량적으로 평가할 수 있다. 보다 상세하게는 예를 들어, 하기 문헌들을 참조한다: [Velculescu et al., Science 270:484 487(1995)]; 및 [Velculescu et al., Cell 88:243 51(1997)](각 문헌의 내용을 그 전체로 참조로 본 명세서에 편입시킴).
제공된 개시의 방법에서 사용될 수 있는 다른 시퀀싱 기술은 예를 들어, 헬리코스 트루(Helicos True) 단일 분자 시퀀싱(tSMS)(Harris T. D. et al.(2008) Science 320: 106-109)을 포함한다. tSMS 기술에서, DNA 샘플은 대략 100 내지 200 뉴클레오티드의 가닥으로 절단되고, 폴리A 서열이 각 DNA 가닥의 3' 말단에 첨가된다. 각각의 가닥은 형광 표지된 아데노신 뉴클레오티드의 첨가에 의해 표지된다. 다음으로, DNA 가닥은 유세포 표면에 고정된 수백만개의 올리고-T 포획 부위를 함유하는 유세포에 하이브리드된다. 주형은 약 1억개/cm의 밀도로 존재할 수 있다. 유세포를 장비, 예를 들어 헬리스코프 서열분석기(HeliScope Sequencer)에 적재하고 유세포의 표면에 레이저를 조사하여, 각 주형의 위치를 밝혔다. CCD 카메라는 유세포 표면 상의 주형의 위치를 지도화할 수 있다. 주형 형광 표지를 절단하고 세척한다. 시퀀싱 반응은 DNA 중합효소 및 형광 표지된 뉴클레오티드를 도입하여 시작된다. 올리고-T 핵산은 프라이머로서 제공된다. 중합효소는 주형 지정 방식으로 프라이머에 표지된 뉴클레오티드를 도입시킨다. 중합효소 및 미도입된 뉴클레오티드를 제거한다. 형광표지된 뉴클레오티드의 도입을 지정하는 주형은 유세포 표면을 이미지화하여 검출된다. 이미지화 이후, 절단 단계는 형광 표지를 제거하고, 과정을 다른 형광 표지된 뉴클레오티드로, 바람직한 판독 길이가 획득될 때까지 반복한다. 서열 정보는 각 뉴클레오티드 첨가 단계에서 수집된다. tSMS의 추가 설명은 예를 들어, 하기 문헌들을 참조하며, 이들 각각을 그 전체로 참조로 본 명세서에 편입시킨다; Lapidus et al.(미국 특허 제7,169,560호), Lapidus et al.(미국 특허 출원 제2009/0191565호), Quake et al.(미국 특허 제6,818,395호), Harris(미국 특허 제7,282,337호), Quake et al.(미국 특허 출원 제2002/0164629호), 및 Braslavsky, et al., PNAS(USA), 100: 3960-3964(2003).
제공되는 개시의 방법에서 사용할 수 있는 시퀀싱 기술의 다른 예는 DNA 및 RNA 서열 둘 모두에 대한 퍼시픽 바이오사이언시즈(Pacific Biosciences)의 단일 분자, 실시간(single molecule, real-time; SMRT) 기술을 포함한다. SMRT에서, 4개 DNA 염기 중 하나를 4개의 상이한 형광 염료 중 하나에 부착시킨다. 이들 염료는 포스포연결된다. 단일 DNA 중합효소는 제로 방식 도파관(Zero-mode wavequide; ZMW)에서 주형 단일 가닥 DNA의 단일 분자로 고정된다. ZMW는 ZMW(마이크로초)의 밖으로 신속하게 확산되는 형광 뉴클레오티드의 배경에 대해 DNA 중합효소에 의한 단일 뉴클레오티드의 도입을 관찰할 수 있는 제한 구조이다. 성장하는 가닥에 뉴클레오티드를 도입시키는데 수 밀리초가 걸린다. 이 시간 동안, 형광 표지는 여기되어 형광 신호를 생성하며, 형광 태그가 절단된다. 염료의 상응하는 형광발광의 검출은 염기가 도입되었음을 의미한다. 과정을 반복한다. RNA를 서열분석하기 위해서, DNA 중합효소는 ZMW에서 역전사효소로 교체되며, 그에 따라 과정을 후속한다.
제공된 개시의 방법에서 사용할 수 있는 시퀀싱 기술의 다른 예는 DNA를 서열분석하기 위해 화학적-민감성 전계 효과 트랜지스터(chemical-sensitive field effect transistor; chemFET)를 사용하는 것을 포함한다(예를 들어, 미국 공개 특허 출원 제20090026082호에 기술된 바와 같음). 기술의 일례에서, DNA 분자를 반응 챔버에 위치시킬 수 있고, 주형 분자를 중합효소에 결합된 시퀀싱 프라이머와 하이브리드시킬 수 있다. 시퀀싱 프라이머의 3' 말단에서 새로운 핵산 가닥으로 트리포스페이트의 도입은 chemFET에 의한 전류의 변화를 통해 검출할 수 있다. 어레이는 복수의 chemFET 센서를 가질 수 있다. 또 다른 예에서, 단일 핵산은 비드에 부착될 수 있고, 핵산은 비드 상에서 증폭될 수 있으며, 개별 비드는, 각 챔버가 chemFET 센서를 구비하는, chemFET 어레이 상의 개별 반응 챔버로 수송될 수 있고, 핵산이 서열분석될 수 있다.
제공된 개시의 방법에서 사용할 수 있는 시퀀싱 기술의 다른 예는 전사 현미경을 사용하는 것을 포함한다(Moudrianakis E. N. and Beer M. Proc Natl Acad Sci USA. 1965 March; 53:564-71). 이 기술의 일례에서, 개별 DNA 분자는 전자 현미경을 사용해 구별가능한 금속성 표지로 표지된다. 이들 분자를 평면 상에 스트렛칭시키고 전자 현미경을 사용해 이미지화하여 서열을 측정한다.
DNA 나노볼 시퀀싱은 유기체의 전체 게놈 서열을 결정하는데 사용되는 고수율 시퀀싱 기술의 한 유형이다. 이 방법은 게놈 DNA의 소형 단편을 DNA 나노볼로 증폭시키기 위해 롤링 서클 복제를 이용한다. 결찰에 의한 언체인드 시퀀싱이 뉴클레오티드 서열을 결정하는데 사용된다. DNA 시퀀싱의 이러한 방법은 대량의 DNA 나노볼을 작업 당 서열분석할 수 있게 한다. 다음의 문헌들을 참조하며, 이들을 그 전체로 참조로 본 명세서에 편입시킨다: WO2014122548; [Drmanac et al., Science. 2010 Jan 1;327(5961):78-81]; [Porreca, Nat Biotechnol. 2010 Jan;28(1):43-4].
대량 병렬 서명 시퀀싱(Massively Parallel Signature Sequencing; MPSS)은 초기 차세대 시퀀싱 기술 중 하나이다. MPSS는 4개 뉴클레오티드의 증분에서 서열을 판독하는, 어댑터 디코딩이 후속되는 어댑터 결찰의 복잡한 접근법을 사용한다.
폴로니(Polony) 시퀀싱은 이. 콜라이 게놈을 서열분석하기 위해 에멀션 PCR, 자동화 현미경, 및 결찰 기반 시퀀싱 화학과 시험관내 쌍형성-태그 라이브러리를 조합시킨다. 이 기술은 또한 어플라이드 바이오시스템즈 솔리드 플랫폼(Applied Biosystems SOLiD platform)에 도입되었다.
솔렉사(Solexa) 시퀀싱에서, DNA 분자 및 프라이머가 먼저 슬라이드 상에 부착되고 중합효소로 증폭되어 초기에 만들어진 "DNA 콜로니"인, 국소 클론 콜로니가 형성된다. 서열을 결정하기 위해서, 가역적인 종결인자 염기(RT-염기)의 4개 유형이 첨가되고 도입되지 않은 뉴클레오티드는 세척해 버린다. 파이로시퀀싱과 달리, DNA 사슬은 한번에 한 뉴클레오티드가 연장되며 이미지 획득은 지연된 순간에 수행되어서, DNA 콜로니의 대량 어레이가 단일 카메라로 촬영되는 순차적 이미지에 의해 포획될 수 있다. SOLiD 기술은 결찰에 의한 시퀀싱을 적용한다. 여기서, 고정된 길이의 모든 가능한 올리고뉴클레오티드의 풀이 서열분석된 위치에 따라 표지된다.
올리고뉴클레오티드가 어닐링되고 결찰되며, 서열을 일치시키기 위해 DNA 리가제에 의한 우선적인 결찰은 그 위치에서 뉴클레오티드의 유익한 신호를 발생시킨다. 시퀀싱 전에, DNA는 에멀션 PCR에 의해 증폭된다. 각각 동일한 DNA 분자의 단일 카피를 함유하는, 최종 비드가 유리 슬라이드 상에 침착된다. 결과는 솔렉사 시퀀싱과 비슷한 분량 및 길이의 서열이다.
이온 토렌트™ 시퀀싱에서, DNA는 대략 300 내지 800 염기쌍의 단편으로 전단되며, 단편은 블런트 말단이다. 올리고뉴클레오티드 어댑터를 단편의 말단에 결찰시킨다. 어댑터는 단편의 증폭 및 시퀀싱을 위한 프라이머로 제공된다. 단편은 표면에 부착될 수 있고 단편이 개별적으로 분해되게 하는 해상도로 부착된다. 하나 이상의 뉴클레오티드의 첨가는 양자(H+)를 방출하고, 그 신호를 시퀀싱 장비에서 검출하고 기록한다. 신호 강도는 도입된 뉴클레오티드의 수에 비례한다. 이온 토렌트 데이타가 또한 FASTQ 파일로서 출력될 수 있다. 그 전체로 참조로 본 명세서에 편입되는 다음의 미국 공개 특허 출원을 참조한다: 미국 공개 특허 출원 제2009/0026082호, 제2009/0127589호, 제2010/0035252호, 제2010/0137143호, 제2010/0188073호, 제2010/0197507호, 제2010/0282617호, 제2010/0300559호, 제2010/0300895호, 제2010/0301398호, 및 제2010/0304982호.
암-연관된 융합 단백질의 검출
융합 유전자는 융합 유전자가 비융합 단백질보다 훨씬 더 활성인 비정상 단백질을 생산할 수 있으므로 종양 형성의 원인이 될 수 있다. 종종, 융합 유전자는 암을 유발하는 종양유전자이고, 이들은 전립선암에서 종종 발생하는, BCR-ABL, TEL-AML1(ALL with t(12 ; 21)), AML1-ETO(t(8 ; 21)를 갖는 M2 AML), 및 염색체 21상의 사이질 결실을 갖는 TMPRSS2-ERG를 포함한다. TMPRSS2-ERG의 경우, 안드로겐 수용체(AR) 신호전달을 파괴하고 종양형성성 ETS 전사 인자에 의해 AR 발현을 억제함으로써, 융합 생성물이 전립선암을 조절한다. 대부분의 융합 유전자는 혈액학적 암, 육종 및 전립선암에서 발견된다. 종양형성성 융합 유전자는 2종의 융합 파트너로부터 새롭거나 또는 상이한 기능을 갖는 유전자 생성물을 초래할 수 있다. 대안적으로, 프로토-종양유전자가 강력한 프로모터에 융합되어 종양형성성 기능이 상류의 융합 파트너의 강력한 프로토콜에 의해 초래되는 상향조절에 의해 기능하도록 설정된다. 후자는 림프종에서 일반적인데, 여기서 종양유전자가 면역글로불린 유전자의 프로모터와 병치된다. 종양형성성 융합 전사물은 또한 트랜스-스플라이싱 또는 리드-쓰루 사건에 의해 야기될 수 있다. 특정 염색체 이상의 존재 및 그들의 최종 융합 유전자는 정밀한 진단을 설정하기 위해 암 진단에서 통용된다. 염색체 밴딩 분석, 형광발광 인시츄 하이브리드화(FISH), 역전사 중합효소 사슬 반응(RT- PCR), 및 차세대 시퀀싱(엑솜 및/또는 전사체)이 암 연관 융합 단백질의 동정을 위한 진단 실험에세서 적용하는 통상의 방법이다.
화학요법 내성 마커의 검출
약물 내성은 악성 종양의 화학요법의 실패의 원인이며, 내성은 이미 존재(고유 내성)하였거나 또는 약물에 의해 유도된다(획득 내성). 내성 마커의 검출은 제한없이 면역조직화학 및 유세포 분석을 통한 암종-연관 섬유아세포의 동정, 면역조직화학적 염색을 사용한 알데히드 데하이드로게나제 1, 절단된 캐스파제 3, 시클로옥시게나제 2, 인산화 Akt, Ki-67, 및 H2AX 단백질, P-당단백질 발현, 히알루로난(세포외 매트릭스의 주요 글리코사미노글리칸 구성요소), 전체 게놈어레이 비교 게놈 하이브리드화를 통해 동정시 3q26.2의 획득, 및 6q11.2-12, 9p22.3, 9p22.2-22.1, 9p22.1-21.3, Xp22.2-22.12, Xp22.11-11.3, 및 Xp11.23-11.1의 상실, 면역염색을 통해 동정된 LRP 과발현, RNA 시퀀싱을 사용하여 마이크로RNA MiR-193a-5p와 관련된 유전자 생성물인 HGF 및 c-MET, 세포 분류를 통해 동정된 CD44 과발현, 및 히스톤 디아세틸라제의 강력한 억제인자인 트리코스타틴 A를 기반으로 한다. 화학요법 내성 마커는 종종 단백질의 과발현 형태를 취할 수 있고, DNA, RNA, 또는 단백질 수준에서 이러한 과발현의 동정은 예컨대 제한없이 DNA, RNA, 또는 단백질 수준에서 DNA 시퀀싱, RNA 시퀀싱, 및 단백질 시퀀싱과 같은 기술을 사용한다. 일부 화학요법 내성 마커는 후생유전자 변화의 형태를 취하고, DNA 파이로시퀀싱을 통한 이들 변경의 동정은 화학요법 내성 마커의 동정을 특히 사용할 수 있다. 부가적으로, 유전자에 대한 돌연변이는 유전자 생성물의 발현에 직접적으로 영향을 주어서, 암성 세포의 형성을 잠재적으로 초래할 수 있고, DNA 시퀀싱을 통한 유전자 돌연변이의 동정은 매우 유용하다. 현재, 내성은 일반적으로 장기간의 약물 투여 후 치료 동안 진단된다. 시간 경과에 따라, 티로신 키나제 억제인자, 예를 들어 상피 성장 인자 수용체(EGFR)의 억제인자에 내성을 부여하는 특이적 돌연변이가 발견될 수 있다. PCR 또는 DNA 시퀀싱을 사용하여 EGFR 유전자에서 돌연변이, 예컨대 T790M의 검출은 EGFR 티로신 키나제 억제에 내성을 의미하고 특히 비소세포 폐암 사례에서, 이러한 억제인자로 환자를 치료할 확률을 제거한다. 약물 내성의 신속한 평가를 위한 방법이 현재 존재한다. 신선한 종양 세포 배양 검사, 암 바이오마커 검사 및 포지트론 방출 단층촬영(positron emission tomography; PET)의 3가지 시험 과정이 일반적으로 사용된다. 약물 내성은 신선한 종양 세포 배앙 검사로 시험관내 처리 이전, 및 PET 검사로 생체내 단시간 처리 이후에 진단될 수 있다. 문헌 [Lippert, T. et al.(2011). "Current status of methods to assess cancer drug resistance". Int. J. Med. Sci. 8(3): 245-253]을 참조한다.
더욱이, 누수되는 림프절에서 종양 세포의 존재가 암의 전이 가능성을 의미하므로, 이미 원발성 종양을 탈출한 종양 세포의 내성 프로파일의 결정이 절대적으로 중요하다. 치료적 내성을 평가하기 위한 상기 방법이 후속되는 절개된 림프절(또는 다른 림프 조직)의 대표 샘플채취가 매우 유용할 것이다. 림프계는 림프절(예컨대 자궁 림프절, 요추 림프절, 골반 림프절, 서혜부 림프절, 및 보조 림프절)뿐만 아니라 림프계 조직으로 구성된 다른 기관(예컨대, 비장 및 흉선)을 포함하고, 유미조, 유선의 림프관, 하지, 흉관의 림프관, 및 상지의 림프관을 포함한다는 것을 또한 이해해야 한다. 현재, 림프절 및 림프 조직 중 내성 마커의 분석은 샘플의 한정된 양때문에 실시되지 않는다. 그러나, 본 명세서에 개시된 대표 샘플채취 방법은 이러한 조직의 게놈 프로파일을 특징규명하기 위한 방식을 제공한다.
종양 특이적 항원 또는 종양 특이적 항체 및 항종양 백신의 생산을 위한 대표 샘플의 용도
상기에 언급한 바와 같이, 대상체 샘플의 또다른 적용은 종양 특이적 항체의 생산 또는 암 또는 종양 백신의 제조에서 사용할 수 있는 종양 세포 및 그로부터 유래된 항원의 단리를 위한 것이다.
암 백신화에 대한 한 가지 접근법은 암 세포를 사멸시킬 수 있는 면역 반응을 자극시키고자, 암 세포로부터 단백질을 분리하고 그들 단백질로 암 환자를 면역화시키는 것이다. 치료적 암 백신은 유방, 폐, 대장, 피부, 신장, 전립선, 및 다른 암의 치료를 위해 개발되었다. 사실, 전립선암을 치료하기 위해 덴드레온 코포레이션(Dendreon Corporation)이 개발한 이러한 한 백신이 2010년 4월 29일자로 진행성 전립선암 환자의 치료에 사용을 위해 미국 식품 의약청(U.S. Food and Drug Administration; FDA)의 승인을 받았다. 이러한 백신 프로벤지(Provenge)®의 승인은 이러한 유형의 요법에 대한 이 유형의 요법에서 새로운 관심을 자극시켰다.
예를 들어, 본 공개에 따라서 균질화된 종양 샘플에서 동정된 종양 세포 또는 종양 세포로부터 유래된 단백질가수분해적으로 절단된 세포 표면 항원은 효과적인 치료적 또는 예방적 종양 백신을 개발하는데 사용될 수 있다. 이들 항원은 나형이거나 또는 다중화되거나 또는 다른 모이어티, 예를 들어 다른 단백질, 보조제에 접합되거나 또는 세포, 예를 들어 수지상 세포에 적재될 수 있다. 생 암 세포의 단백질가수분해 처리는 시험관내에서 미처리 암세포의 반응을 초과하는 항암 면역 반응을 유도하기에 충분한 항원성 표적을 방출시킬 수 있다(Lokhov et al., J Cancer 2010 1:230-241).
특히, 본 공개는 특정 환자 샘플로부터 단리된 종양 세포로부터 유래된 항이한 항원의 칵테일 또는 하나를 함유하는 종양 백신, 본직절으로 그들 특정 종양 유형에 특이적인 면역 자극 모이어티로 환자를 치료할 수 있는 "개인화된 암 백신"의 생성을 고려한다. 일반적으로, 이들 백신은 효과적인 면역 반응, 예를 들어 특정 항원을 발현하는 종양 세포에 대한 항원 특이적 CTL 반응을 생성시키기 위한 이러한 항원의 유효량을 포함하게 된다. 언급한 바와 같이, 일부 예에서, 이들 항원은 다른 모이어티, 예를 들어 수지상 세포 상에 적재될 수 있다. 일반적으로, 이러한 백신은 또한 다른 면역 보조제, 예를 들어, 사이토카인, TLR 효현제, TNF/R 효현제 또는 길항제, 체크포인트 억제인자를 조정하는 작용제 등을 포함할 것이다. 비록, 가장 기본적인 수준에서, 대표 샘플 자체는 치료제로서 직접적으로 사용될 수 있다. 예를 들어, 환자로부터 제거된 원발성 종양은 본 명세서에 개시된 방법에 따라 균질화될 수 있고 대표 샘플은 환자에게 재주사되어 샘플에 함유된 종양 항원에 대응하는 면역 반응을 생성시킨다. 대표 샘플 자체는 그것이 모든 서브클론(예를 들어, 주요, 원발성, 속발성, 저출현율 등)을 포함하므로 가장 다양한 종양 항원 프로파일을 함유할 것으로 기대된다.
또한, 본 공개는 항혈청 및 단일클론 항체의 생산을 위한 이로한 항원의 용도를 더욱 고려한다. 이들 항체는 진단적 목적, 즉 샘플에서 종양 세포 또는 항원의 검출을 위해 사용될 수 있다. 대안적으로 이러한 항체, 특히 이러한 종양 항원에 특이적인 인간 또는 인간화 항체를 이들 항원을 발현하는 암의 치료에서 치료적으로 사용할 수 있다. 요법에서 잠재적 사용을 위해 항체를 제조하는 방법은 당분야에 충분히 공지되어 있다.
더욱이, 본 공개는 이후에 전략적 백신 생성에 정보를 제공하는데 사용할 수 있는, B 세포 수용체 및/또는 T 세포 수용체 개체군을 동정하기 위한 대상체 대표 샘플의 사용을 더 고려한다.
게다가, 주제 방법으로 생성된 대표 샘플은 또한 CAR-T 시스템을 개발하는데 사용될 수도 있다.
신생항원의 검출을 위한 대표 샘플의 용도
단리된 종양 세포로부터 신생항원의 동정은 암(들)을 갖는 대상체의 치료를 위해 최고로 중요하다. 이와 같이, 본 공개를 사용해 생성시킨 샘플에 대해서 임의의 관련 진단적 방법, 예컨대 제한없이, 종양 샘플로 신생항원 바이오마커의 동정을 위한 본 출원에 기술된 것을 수행할 수 있다.
신생항원은 종양 성장 동안 발생한 돌연변이로부터 비롯되었고 면역 시스템이 내성인 선천적 항원과를 다르다. 표본제작 증거는 종양의 면역 거부, 예를 들어, 체크포인트 조정인가로 보여지는 것이 신생항원의 인식에 의해 매개될 수 있다는 것을 시사하였다. 신생항원은 다음에 대한 가능성을 갖는다: (1) 예를 들어, 면역 시스템에 의한 인식 및 파괴를 위한 종양의 독특한 마킹(비종양 세포 대비)(전체로 참조로 본 명세서에 편입되는, 문헌 [Lennerz et al., 2005, Proc Natl Acad Sci USA. 102(44):16013-8] 참조); 및 (2) 중추 및 때때로 말초 내성을 피해서, 표적화된 암치료를 인식(그 전체로 본 명세서에 편입되는, 문헌 [Gotter et al. "Medullary Epithelial Cell of the Human Thymus Express a Highly Diverse Selection of Tissue-specific Genes Colocalized in Chromosomal Clusters." J. Exp. Med. 199.2(2004):155-166]을 참조함). 그 전체로 참조로 본 명세서에 편입되는 US 20110293637 A1을 참조한다.
최근의 기술적 진보는 종양 특이적 돌연변이의 결과로서 발생하는 환자 특이적 신생항원에 대한 면역 반응을 해부하는 것을 가능하게 하고, 최근에 생긴 데이타는 이러한 신생항원의 인식이 임상적 면역요법의 활성에서 주요 인자라는 것을 시사한다. 이들 관찰은 신생항원 적재량이 암 면역요법에서 바이오마커를 형성할 수 있고 신규한 치료적 접근법의 개발을 위한 동기를 제공한다는 것을 의미한다. 그 전체로 참조로 본 명세서에 편입되는 문헌 [Schumacher, T.N. and Schreiber, R.D.(2015) Neoantigens in cancer immunotherapy. Science 348:6230. 69-74]을 참조한다.
지난 수년간 수득된 데이타를 기반으로, 신생항원 특이적 반응성이 성공적인 암 면역요법의 주요 "활성 성분"을 형성하는 것은 타당하다. 달리 말해서, 한편으로 종양형성성 과성장을 초래하는 유전자 손상이 또한 악성종양을 제어하기 위해 면역 시스템에 의해 표적이 될 수 있다. 이러한 발견을 기반으로, 신생항원 특이적 반응성을 선택적으로 향상시켜서 치료적 중재술을 조작하는 것이 중요할 것이다. 표적이 되는 항원의 종양 제한적 발현때문에, 이들 개인화된 암 면역요법은 높은 특이성 및 안정성의 가능성을 제공한다. 생각컨대, 이러한 개인화된 면역요법으로 획득될 수 있는 신생항원 특이적 반응의 부스팅은 암 면역요법에 반응하는 인간 악성종양의 스펙트럼을 더욱 증가시킬 것이다. 전체로 참조로 본 명세서에 편입되는 문헌 [Schumacher, T.N. and Schreiber, R.D.(2015) Neoantigen in cancer immunotherapy. Science 348:6230. 69-74]을 참조한다.
신생항원은 각 환자에 독특한 개인 돌연변이를 포함할 수 있고 종양유전자에 대한 돌연변이보다 극적으로 수적으로 우세하다. 단백질 코딩 서열을 변경시키는 그들 돌연변이의 서브셋이 또한, 암 면역요법에 필요한 "외래" 신호를 제공할 수 있는 개인의 신규한 항원 - 신생항원을 생성시키다. 문헌 [Hacohen et al. Getting Personal with Neoantigen- based Therapeutic Cancer VAccines. Cancer Immunol Res; 1(1); 11-15. ⓒ2013 AACR.]을 참조한다.
상기에 기술된 바와 같이, 암 펩티드 백신은 항종양 면역 반응을 유발시키고 부스팅시키기 위한 또 다른 접근법으로 구성된다. 신생물 형질전환 동안 종양 세포에서 발생하는 유전자 돌연벼이로부터 생성된 종양-특이적 항원을 표적으로 하는 접근법은 개인화된 환자 치료에 도움을 줄 것이다. 이들 소위 "암 신생항원"에 대한 면역 반응은 흉선에서 숙주 중추 내성에 의해 약화될 수 있지 않고 자가면역 반응을 촉발하지 않는다. 대량 병렬 시퀀싱(MPS) 및 에피토프 예측 알고리즘을 포함하는, 유전체학 및 생물정보학에서의 최근의 발전은 표적 항원의 보다 종합적이고 효율적인 동정을 가능하게하는 주요 돌파구를 제공한다. 그 전체로 참조로 본 명세서에 편입되는, 문헌 [Kitano, I.A. et al.(2015) Cancer Neoantigen: A Promising Source of Immunogens for Cancer Immunotherapy. J Clin Cell Immunol 6:322]을 참조한다.
환자 자신의 면역 시스템으로 암성 세포를 표적화하려는 암 요법(예를 들어, 암 백신)에 대한 관심이 점점 증가하고 있는데 이러한 요법은 본 명세서에 기술된 단점의 일부를 경감/제거시킬 수 있기 때문이다. 암 백신은 전형적으로 종양 세포를 표적으로 하여 파괴하는 항원 특이적 세포독성 T 세포를 유도하도록 함께 작용하는 면역자극성 분자(예를 들어, 사이토카인 또는 TLR 리간드) 및 종양 항원으로 구성된다. 현행 암 백신은 전형적으로 많은 개체에서 발견되는 종양에서 선택적으로 발현되거나 또는 과발현되는 선천 단백질(즉, 개체에서 모든 정상 세포의 DNA에 의해 코딩되는 단백질)인, 공유된 종양 항원을 함유한다. 종양 특이적 및 환자 특이적 신생항원을 함유하는 백신은 암을 앓는 대상체를 치료하기 위한 잠재적으로 유용한 치료적 방안이다. 그 전체로 참조로 본 명세서에 편입되는 WO 2015095811 A2를 참조한다.
따라서, 암 환자로부터 수득된 조직, 예를 들어 종양 또는 림프절로부터 제조된 대표 샘플을 사용하여 암 면역 요법에서 바이오마커를 형성시키는 신생항원 적재량을 동정하는데 사용될 수 있고, 따라서 동정된 부류 또는 부류들의 항원에 대항한 T 세포 반응을 선택적으로 향상시키는 신규한 치료적 접근법의 개발을 제공한다.
진단적 병리학 실험실에서 현행 샘플채취 기술은 수술적으로 절제된 조직 상의 특이적 해부학적 위치로부터 샘플을 규정하는 것에 집중된다. 도 56의 파선 박스에 표시된 바와 같이, 역사적 표준 관행은 TNM 병기화 시스템의 요건을 충족하도록 절제된 종양의 5-7개의 작은 영역을 획득한다. 해부된 샘플을 파라핀 포매된 조직 블록으로 더욱 가공하여, 조직학적 절편을 얻고, 종양을 병기화하며 임의로는 통상의 염색 기술을 사용해 바이오마커에 대해 분석한다. 모든 진단적 정부가 취합되어 해부 병리학자가 고찰하면, 임의의 잔여 종양 조직을 포함하는 잔류하는 수술적 조직은 소각으로 파괴된다.
이러한 작업의 본 발명의 양상은 1950년대 중반에 TNM 병기화 시스템의 전세계적 채택이래로 보편적으로 파괴시켰던 조직의 공급원인, 잔여의 수술적으로 절제된 재료의 이용을 포함한다. 현행 작업흐름의 복수 지점에서, 수술적으로 절제된 조직은 복수의 조직 해리 방법(제한없이, 블렌딩, 갈기/썰기, 및 즙내기 포함)을 통해 파괴를 위해 가공될 수 있다. 도 Z에 도시된 바와 같이, 조직은 수술적 제거(신선한 조직) 후, 조직의 고정 후, TNM 샘플 획득 후, 또는 조직 샘플을 파라핀 왁스에 포매시킨 후 즉시 해리될 수 있다. 충분히 균질화되면, 그 해리된 조직을 "대표 샘플"이라고 한다. 대표 샘플의 독특하고 기대하지 않았던 속성은 이것이 원래의 수술적으로 절제된 조직에 존재하는 모든 다양성, 예컨대 조직, 세포 및 모든 생체분자의 다양성을 함유한다는 것이다.
이러한 적용의 다른 본 발명의 양상은 신선 및 고정된 대표 샘플의 모든 후속 가공을 포함하는데, 이러한 인간 잔여 수술 재료의 많은 분량이 1950년 이래로 이 재료를 파괴하였기 때문에 진단적 종양학에서 전혀 샘플채취되지 않았기 때문이다. 도 56에 표시된 바와 같이, 일부 실시태양에서, 생체분자는 신규 기술을 사용해 대표 샘플로부터 직접적으로 단리될 수 있고, 현행, 및 향후 분석 도구를 사용해 더욱 분석될 수 있다. 생체분자 예컨대 DNA는 단리되어 NGS를 사용해 서열분석되며, 최종 데이타는 특이적으로 표적화된 돌연변이를 함유하는 종양의 백분율을 계산하는데 사용될 수 있다. 더욱이, 돌연변이율은 절제된 종양 내에 함유된 종양 서브클론의 다양성을 결정하는데 더욱 사용될 수 있다. ELISA, 면역침전법, 또는 대량 분광광도법을 사용하는 단백질 분석을 사용하여 종양 내 티로신 키나제의 활성화 상태, 또는 표적가능한 단백질 복합체의 존재를 결정하는데 사용될 수 있다.
또다른 실시태양에서, 균질물 형태인, 대표 샘플의 일부분은 독특하게 가공되어 파라핀 왁스에 포매되어서 현행 조직학적 방법론을 사용해 분석될 수 있다. 포매된 대표 샘플의 염색은 해부 병리학자가 판독 및 해석할 수 있거나, 또는 디지탈 이미지화 시스템을 사용해 이미지화될 수 있다. 디지탈 이미지화되면, 염색 결과의 불균질성을 정량할 수 있고 단백질 발현, 유전자 카피수 변경, 또는 mRNA 발현의 공간 불균질성을 수학적으로 표시하는데 사용될 수 있다.
또다른 실시태양에서, 대표 샘플의 일부분은 신규한 기계적 및 효소적 해리 방법을 사용해 더욱 가공되어 개별 핵의 현탁액을 생성시킬 수 있다. 대표 샘플로부터 단리된 핵은 특정 핵 전사 인자 및 표현형 변화의 다른 지시자를 발현하는 세포의 백분율을 결정하기 위해 유세포분석을 사용한 추가 분석을 위해 신규 염색 방법을 사용해 염색할 수 있다. 대안적으로, 염색된 핵은 FACS(형광발광 활성화 세포 분류법) 또는 자성 비드 친화도 제거를 사용해 단리시킨 후, DNA 단리 및 NGS 또는 PCR 분석을 할 수 있다. 단리된 핵은 대안적으로 유리 슬라이드 상에 위치시키고 조직학적 기술 예컨대 IHC 및 ISH를 수행할 수 있다.
또다른 실시태양에서, 대표 샘플의 일부분을 신규한 기계적 및 효소적 해리 방법을 사용해 더욱 가공하여 개별 세포의 개체군을 생성시킬 수 있다. 절제된 조직의 대표 샘플로부터 생성된 세포는 세포 유형, 표현형, 및 다른 바이오마커 예컨대 종양 세포 중 표적화가능한 종양유전자 및 면역조정인자의 다양성을 조사하기 위한 유세포분석, 및 종양으로부터 제거된 면역 세포의 면역표현형판독에 의해 더욱 분석된다. 세포는 FACS를 위해 더욱 가공되어 특이적 바이오마커를 발현하는 세포를 단리한다. FACS 분류된 세포 유래의 생체분자는 추가의 분석 검사를 위해 단리될 수 있거나, 또는 세포는 IHC 및 ISH를 포함하는 조직학적 검출 방법을 위해 유리 슬라이드 상에 위치될 수 있다.
잔여 수술 조직은 특히 고형 종양 종양학에서, 지난 ∼50여년간 파괴되었기 때문에, 신규한 대표 샘플채취 및 분석 기술에 의한 데이타는 전례없는 임상 종양학 데이타를 생성할 것이다. 이러한 "대표 종양학 데이타"(도 56)는 처음으로, 종양 세포에서 돌연변이 및 표현형 다양성을 비롯하여 항종양 면역 반응 및 다른 정상 조직의 상태를 계산하는 능력을 가능하게 할 것이다. 신규한 "대표 종양학 데이타"는 암 환자의 예후를 개선하고, 수술 또는 원격 전위의 부위에서 재발성을 예측하고, 모든 이용가능한 "표적화가능한" 변경을 검출하고, 임상 시험에서 포함을 위해 선택하며, 조합 요법 표적, 용량 및 시기를 결정하는데 사용될 것이다.
본 공개를 상세하게 기술하였다. 본 공개 및 이의 고유한 이득을 더욱 예시하기 위해서 본 발명자가 수행한 실험을 설명하는 하기 실시예를 제공한다.
하기 실시예는 예시를 위해 제공되며, 청구된 개시를 제한하려는 것이 아니다.
실시예
실시예 1: 대표 조직 샘플의 제조
대표 조직 샘플은 본 명세서에서 기술되고 도 3에 개략적으로 도시된 균질화 방법론을 사용해 포르말린 고정된 종양 샘플로부터 유래시켰다. 대체로, 종양 샘플, 즉 포르말린 고정된 종양 샘플은 임의로 주변의 인접한 정상 조직으로부터 제거하였고, 기계적으로 해리시켜서, 원래 절개된 종양의 모든 구성요소를 함유하는 대표 샘플을 생성시켰다. 이후에 대표 샘플은 후속하는 분석을 위해 더욱 가공할 수 있다. 이러한 가공에는 60 mg/mL 콜라게나아제 H 및 1 mM CaCl2 을 함유하는 완충제(예를 들어, PBS)로 옮기기 전에 85℃에서 CC1 완충제 중 사전조건화를 포함하였다. 다음으로 최종 효소 처리된 균질화된 조직을 CC1 완충제로 복귀시키기 전에 콜라게나아제 H와 적어도 약 30 분 동안 40℃에서 항온반응시키고, 임의의 잔류 콜라게나아제 효소를 불활성화시키기 위해서 85℃에서 약 10분 동안 가열하였다. 이후 대표 샘플을 사용해 다양한 진단적 어세이에 사용을 위해 서브샘플을 유래시켰다.
방법
재료: 조직의 기계적 전단은 해밀톤 비치(Hamilton Beach) 단일 서브 블렌더(Walmart, Tucson, AZ) 또는 IKA-웍스(Works)(Staufen in Breisgau, Germany)의 IKA 웍스 튜브 밀 컨트롤 시스템(Works Tube Mill Control System)(0004180001) 및 밀테니이 바이오테크(Miltenyi Biotec)의 gentleMACS 해리기(Teterow, Germany)를 사용해 수행하였다. 균질화 후 다양한 크기의 조직 단편은 소수의 세포부터 수천 처만의 세포를 함유하는 클러스터 범위에 이른다는 것을 주목한다(도 15). 가열 및 pH 세포 조건화는 벤타나 메티칼 시스템즈(Ventana Medical Systems)(Tucson, AZ; 카탈로그 #950-124)의 세포 조건화(Cell Conditioning 1: CC1) 완충제에서 수행하였다. 아큐맥스(AccuMax)(등록상표)는 이노베이티브 셀 테크놀로지스(Innovative Cell Technologies)(San Diego, CA)에서 수득하였다. 콜라게나아제 H(11074032001)는 로슈(Roche)(Basel, Switzerland)에서 수득하였다. 벤타나 메티칼 시스템즈(Tucson, AZ)의 하기 항체를 사용하였다: 항 PD-L1(SP263) 토끼, 단일클론 1차 항체(790-4905); 항 Ber-EP4 마우스, 단일클론 항체(760-4383); 항 CD8(SP57) 토끼, 단일클론 1차 항체(790-4460); 항 HER-2/neu(4B5) 토끼, 단일클론 1차 항체(790-2991).
조직 샘플: 모든 조직 샘플 및 고기를 벤타나 메티칼 시스템즈에서 24시간 동안 10% 중성 완충 폴말린에 고정시켰다. HER2-양성 이종이식편을 벤타나 메티칼 시스템즈에서 생성시켰다. 닭고기 및 생선살은 월마트(Warlmart)(Tucson, AZ)에서 수득하였다. 인간 편도선은 노쓰웨스트 의료 센터()(Tucson, AZ)에서 수득하였다.
소화 및 분석: 샘플은 CC1 완충제 중 85℃에서 사전조건화시켰고 이후에 1 mg/mL 콜라게나아제 H를 함유하는 어큐맥스®로 1시간 동안 실온에서 처리한 후, 1시간 동안 40℃에서 항온반응시켰다. 조직의 생화학적 소화는 순서대로 다음의 미크론 메쉬를 통해 소화된 샘플을 러닝시켜 분석하였다: 500, 300, 100, 40, 20, 10, 6, 및 1 미크론, 통과액 및 유지된 분획을 각 메쉬에 대해 칭량하였다.
헤마톡실린 및 에오신 염색: 대표 샘플은 VWR 플러스 슬라이드상에 70 ㎕ 중에 플레이팅하였다. 헤마톡실린 및 에오신(H&E) 염색은 벤타나 메티칼 시스템즈 심포니 플랫폼(Ventana Medical Systems, Tucson, AZ) 및 상응하는 H&E 심포니 시약(Ventana Medical Systems, Tucson, AZ)을 사용해 수행하였다.
면역조직화학: 대표 샘플은 VWR 플러스 슬라이드 상에 70 ㎕ 메탄올에 위치시켰다. 명시약 DAB-기반 면역조직화학(IHC)를 벤타나 메티칼 시스템즈 벤치마크 XT 플랫폼(Ventana Medical Systems, Tucson, AZ)을 사용해 수행하였다. 바이오마커의 가시화는 벤타나(Ventana)의 옵티뷰 DAV 검출 키트(OptiView DAB Detection Kit)(760-700)를 사용해 수행하였다. 항체를 4분간 항온반응시켰다.
RNA 단리: RNA는 문헌 [Chen et al. 2007]에 이전에 기술된 산 페놀 방법을 사용해 인간 편도선의 대표 샘플로부터 단리하였다.
결과 및 고찰
상기 기술된 방법을 사용하여, 고정된 동물 조직 및 인간 종양의 임상적 조직 시료를 포함하는, 상이한 샘플 유형 유래의 대표 샘플을 생성시켰다.
85℃에서 CC1 완충제 중 세포 사전조건화는 세포외 매트릭스의 효소적 소화와 커플링되어 단일 세포에서 소형 세포 클럼프에 이르는 크기 범위의 샘플이 생성되었다.
조직의 생화학적 소화 동안 막 회합된 바이오마커의 손실을 최소화하기 위해서 세포외 매트릭스 단백질에 특이적인 효소, 즉 콜라게나아제 H를 일반적인 프로테아제, 예를 들어 트립신 대신 사용하였다.
샘플의 대부분을 100 미크론 크기의 단편 및 그 보다 작게 소화시켰다(도 4). 여기서, 소화된 샘플의 중량 비율은 일련의 미크론 메쉬를 통한 여과 후 생화학적으로 소화된 대표 샘플 중 상이한 크기 단편을 특징규명하는데 사용되었다.
비-종양 세포는 H&E 염색으로 보이는 바와 같이 6 미크론및 그 보다 작은 메쉬 필터를 통해 샘플을 흘려주어 여과시켰다. 도 5A 내지 5C는 생화학적으로 소화된 대표 샘플의 일련의 여과 후 수집된 통과액 및 유지된 분획의 H&E 염색을 보여준다. 도 7A는 500, 300, 100, 및 40 미크론 메쉬의 통과액(하부) 및 메쉬에 유지된 분획(상부)의 H&E 염색을 예시한다. 도 7B는 30, 20, 및 10 미크론 메쉬의 통과액(하부) 및 메쉬(상부)에 유지된 분획의 H&E 염색을 예시한다. 도 7C 는 6 및 1 미크론 메쉬의 통과액(하부) 및 메쉬(상부)에 유지된 분획의 H&E 염색을 예시한다.
6 미크론 및 1 미크론 필터로부터의 통과액의 H&E 염색(특히 도 5C)은 종양 세포를 의미하는 거대 핵이 보이지 않았다. 따라서, 이러한 접근법은 대표 샘플 중 종양 세포의 농축뿐만 아니라 샘플로부터 종양-학습된 혈소판 및 다른 혈액 세포의 단리에 사용될 수 있다.
상기 기술된 방법은 닭가슴, 닭간, 및 생선살을 포함한 300 그램의 다양한 고정된 동물 조직을 포함하는 조직 샘플에서 처음 검사되었다. 희귀 종양 서브클론을 모델로 하기 위해서, 소형(0.4 그램) HER-2 양성 이종이식편을 조직 샘플에 첨가하였다. 조직은 이 실험에 사용하기 전에 프렌치 프레스를 사용해 기계적으로 해리시키고 여과시켰다. 다음으로, 조직 샘플을 CC1 완충제 중에서 15분간 85℃에서 사전조적화시켰다. 사전 조건화된 조직 샘플을 gentleMACS 해리기를 사용해 균질화시켰고(도 6D) 1 mL 샘플을 5분마다 수집하였다. 각각의 수집된 샘플을 600pcs 메쉬를 통해 러닝시켜서 조직의 해리를 측정하였다. 사전조건화 단독은 일부 소화를 촉징할 수 있었지만, 반응이 10분 후에 평탄역에 도달하였다(도 6A). 샘플을 해리시키기 위해 CC1 사전조건화와 조합한 콜라게나아제 H 대비 콜라게나아제 H 단독의 능력을 비교하여, CC1 사전조건화가 콜라게나아제 H 소화를 촉진할 수 있다고 결정하였다. 특히, 적어도 30분간 콜라게나아제 H 소화가 후속된 CC1 조건화는 600pcs 스트레이너에 의해 측정시 입자 크기의 최고 감소가 일어났다(도 6B). 샘플의 대표성은 몇몇 분취액을 플레이팅하고 DAB-IHC를 사용해 HER-2 양성 세포에 대해 각각을 분석하여 검사하였다. HER-2 양성 세포는 생성된 모든 슬라이드 상에서 검출하였다(도 6C). 중량비를 고려하여(0.4 그램의 HER-2 양성 이종이식편 대 300 그램의 고기), 상기 기술된 방법은 적어도 0.1%의 출현율로 서브클론의 검출을 허용하는 대표 샘플을 생성시켰다.
다음으로, 프로토콜을 인간 림프절(편도선) 조직에서 검사하였다. 절개된 편도선을 IKA 튜브 밀에서 기계적으로 해리시켜서 대포 림프정 샘플을 생성시켰다. CC1로 사전조건화 후 콜라게나아제 H에 의한 30분 소화를 후속하여 편도선 조직을 해리시켰다(도 7A). 콜라게나아제 H 소화의 시간 과정은 90분까지 연장하였고, 효소적 반응은 대략 60분에 평탄역에 도달한 것으로 관찰되었다(도 7B). 따라서, 대부분의 인간 조직은 오직 약 30분 내지 약 60분, 그러나 약 90분을 넘지 않는 동안 콜라게나아제 H로 소화되는 것을 필요로 하는 것으로 예상된다.
다음으로, 해리된 인간 편도선 조직 샘플의 4개의 500 ㎕ 분취액을 사용하여 핵산을 단리하였다. 2개의 500 ㎕ 분취액은 -20℃에서 세포 펠렛으로서 저장하였고, 그에 반해 나머지 2개의 500 ㎕ 분취액은 파라핀 포매하였다. RNA는 모든 분취액으로부터 단리되었지만, 수율은 비파라핀 포매된 분취액에서 훨씬 더 높았다(표 1).
표 1: 포르말린 고정(FF), 및 포르말린 고정 파라핀 포매(FFPE)된, 해리된 인간 편도선 조직 샘플로부터 단리된 전체 RNA.
이들 결과는 대표 샘플이 진단적 검사, 예컨대 게놈 및 전사체 시퀀싱에 적합하고, 더욱이 본 명세서에 기술된 방법을 사용해 생성된 대표 샘플이 전통적인 파라핀 포매된 조직 샘플보다 더 양호한 재료 공급원이라는 것을 의미한다.
실시예 2: 대표 종양 샘플의 제조
대표 종양 샘플을 신장 샘플 및 폐 샘플로부터 생성시켰다.
방법
재료: 조직의 기계적 전단은 IKA-웍스(Staufen im Breisgau, Germany)의 IKA 웍스 튜브 밀 컨트롤 시스템(0004180001) 및 밀테니이 바이오테크(Teterow, Germany)의 gentleMACS 해리기를 사용해 수행하였다. 가열 및 pH 세포 조건화는 벤타나 메디칼 시스템즈(Tucson, AZ; catalog #950-124)의 세포 조건화 1(CC1) 완충제에서 수행하였다. 콜라게나아제 H(11074032001)는 로슈(Basel, Switzerland)에서 수득하였다. 벤타나 메디칼 시스템즈(Tucson, AZ)의 하기 항체를 사용하였다: 항 PD-L1(SP263) 토끼, 단일클론 1차 항체(790-4905); 항 Ber-EP4 마우스, 단일클론 항체(760-4383); 항 CD8(SP57) 토끼, 단일클론 1차 항체(790-4460); 항 HER-2/neu(4B5) 토끼, 단일클론 1차 항체(790-2991).
임상 샘플: 조직 샘플은 투싼 메디칼 센터, 및 반더빌트 메디칼 센터에서 24시간 내지 72시간 동안 10% 중성 완충 포르말린에 고정시켰다. 폐 종양 생검은 투싼 메디칼 센터(Tucson, AZ)로부터 수득하였다. 신장 종양 생검 단편은 반더빌트 유니버시트(Nashville, TN)로부터 수득하였다.
소화 분석: 조직의 생화학적 소화는 600pcs 스트레이너를 통해 1 mL 샘플을 러닝시키고 메쉬 상에 수집된 재료를 칭량하여 분석하였다.
헤마톡실린 및 에오신 염색: 대표 샘플은 VWR 플러스 슬라이드 상에서 70 ㎕ 메탄올 중에 플레이팅시켰다. 헤마톡실린 및 에오신(H&E) 염색은 벤타나 메디칼 시스템즈 심포니 플랫폼(Ventana Medical Systems, Tucson, AZ)과 상응하는 H&E 심포니 시약(Ventana Medical Systems, Tucson, AZ)을 사용해 수행하였다.
면역조직화학: 대표 샘플은 VWR 플러스 슬라이드 상의 70 ㎕ 메탄올 중에 플레이팅시켰다. 명시야 DAB-기반 면역조직화학(IHC)을 벤타나 메디칼 시스템즈 벤치마크XT 플랫폼(Ventana Medical System, Tucson, AZ)을 사용해 수행였다. 바이오마커의 가시화는 벤타나의 옵티뷰 DAB 검출 키트(760-700)를 사용해 수행하였다. 항체는 4분간 항온반응시켰다.
RNA 단리: RNA는 문헌 [Chen et al. 2007]에 이전에 기술된 산 페놀 방법을 사용해 인간 편도선의 대표 샘플로부터 단리하였다.
결과 및 고찰
특히, 대표 샘플은 본 명세서에 기술되고 도 3에 도시된 방법론에 따라서 61세 남성 유래의 야구공 크기의 신장 종양으로부터 생성시켰다. 표준 H&E 염색을 사용하여 기계적 해리, 사전조건화, 및 효소적 소화 이후에 신장 샘플의 조직 단편 크기를 가시화시켰다(도 8A). 다음으로, 샘플에 대해 다음의 3종의 상이한 바이오마커에 대한 DAB-IHC 분석을 수행하였다: PD-L1(도 8B), CD8(도 8C), 및 Ep-Cam(도 8D). 모든 3종의 단백질을 대표 신장 종양 임상 샘플에서 검출하였다.
부가적으로, 대표 샘플은 87세 여성 유래의 50센트 크기의 폐 종양의 일부분으로부터 생성시켰다(도 9A). 소형 절편을 임상적 조직 샘플로부터 절단하였고(도 9A) 표준 병리학 관례에 따라 가공하였다. 나머지 조직을 사용하여 본 명세서에 기술되고 도 1에 도시된 방법론에 따라 대표 샘플을 생성시켰다. 표준 H&E 염색을 사용해 기계적 해리, 사전조건화, 및 효소적 소화 후 폐 샘플의 조직 단편 크기를 가시화하였다(도 9B).
대표 샘플 및 전통적인 조직 절편("조직 블록")에 대해서 이후 다음의 3종의 상이한 바이오마커에 대한 DAB-IHC 분석을 수행하였다: PD-L1(도 9C), CD8(도 9D), 및 Ep-Cam(도 9E). 유사한 양의 염색이 대표 샘플 및 전통적인 조직 절편에서 관찰되어, 본 발명의 방법을 사용하여 큰 출현율의 서브클론에 대한 신호 손실이 존재하지 않았음을 의미한다.
이들 결과는 생화학적 소화와 조직의 기계적 조작의 커플링이 다양한 종양 유형에서 불균질성 및 다양성을 대표하는 샘플을 생성시킬 수 있다는 것을 입증한다. 더욱이, 대표 샘플은 다양한 진단적 검사, 예컨대 헤마톡실린 및 에오신 염색, 면역조직화학적 분석, 핵산 단리 및 시퀀싱에 사용하기 적합하고, 희귀 종양 서브클론의 검출을 용이하게 하여, 임상 진단적인 개인화되니 암처리를 개선시킨다.
실시예 3: 온전한 포르말린 고정된 시료로부터 유래된 대표 샘플 중 단백질의 면역세포화학적 검출
대표 조직 및 종양 샘플은 본 명세서에 기술되고, 도 3에 개략적으로 도시한 균질화 방법론을 사용해 고정된 조직 또는 종양 시료로부터 생성되었고, 관심 단백질, 예를 들어 생물학적 및/또는 의학적 예후 또는 예측 마커는 면역세포화학(immunocytochemistry: ICC)을 사용해 대표 샘플에서 검출하였다.
고정된 생물학적 샘플의 조직학적 절편 유래의 단백질의 면역조직화학적(IHC) 검출은 특히 고형 종양의 종양학에서, 의학적 판단에 영향을 미치는 해부 병리학의 일반적인 관례이다. 고정된 시료 유래의 단백질의 면역세포화학적(ICC) 검출 역시, 예를 들어 전이성 암종 유래의 흉막 삼출액의 세포학적 검사에서의 의학적 판단에 영향을 미치고, 샘플이 원래 조직학적 구성이 결여된 점에서 IHC와 상이하다. ICC는 세포학적 시료, 예를 들어 파프 도말시료 또는 박층 프렙을 통한 자궁 세포학이 예약된다. 조직학적 절편은 고형 종양 병리학의 오늘날의 관례에 중요한 않은 특성들, 예컨대 기질 대 종양 구성을 유지하면서, 종양의 세포 내용물의 분획, 및 생물정보 내용의 확장에 의해, 전체 고정된 생물학적 시료의 분획을 대표한다. 종양의 전체를 대표하는 샘플을 산출하기 위해 온전하고 고정된 종양 시료의 리포맷팅, 및 잠재적인 의학적 가치를 갖는 통계적으로 영향력있는 정보를 제공할 수 있는 것은 전략적인 개인화된 약물의 미래에 결정적이다.
방법
항체: 표 2 는 이 실험에서 사용된 항체 및 고정된 시료를 열거한다. 항체는 벤타나 메디칼 시스템즈, 인코포레이션(Ventana Medical Systems, Inc.)에서 판매한다.
표 2: 대표 샘플의 ICC 분석에 사용된 항체.
조직 샘플: 모든 조직 샘플은 벤타나 메디칼 시스템즈에서 24시간 동안 10% 중성 완충 포르말린에 고정시켰다. 인간 편도선은 노쓰웨스트 메디칼 센터(Tucson, AZ)에서 수득하였다. 동물 조직은 상업적 공급원으로부터 구하였는데, 예를 들어 닭간은 가게에서 수득하였다.
재료: 조직의 기계적 전단은 IKA-웍스(Staufen in Breisgau, Germany)의 IKA 웍스 튜브 밀을 사용하고 밀테니이 바이오테크(Teterow, Germany)의 gentleMACS 해리기를 사용해 수행하였다. 열 및 pH 세포 조건화는 벤타나 메디칼 시스템즈(Tucson, AZ; 카탈로그 #950-124)의 세포 조건화 1(CC1) 완충제에서 수행하였다.
블렌딩. 200 ㎕의 미네랄 오일을 IKA 튜브 밀(Part# MT 40.100) 블렌딩 개스켓에 첨가하여 균질화 동안 누수를 방지하였다. 5 그램의 조직을 1x 조직 부피의 PBS와 함께 밀에 첨가하였다. 샘플을 15000 rpm에서 2분(10초 스피닝, 스피닝 사이에 2초 휴식) 동안 스피닝하였다. 균질화된 샘플을 밀로부터 제거해 내고 PBS 부피의 2배와 함께 GentleMACS 해리기(Part# 30-093-237)에 첨가하였다. 샘플을 프로그램 h_tumor_01(36초의 회전)을 사용해 블렌딩하였고, 이를 샘플을 50 mL의 코니칼 튜브에 붓기 전에 총 3회 반복하였고 300 x g에서 3분간 원심분리하였다. PBS 수성층은 조건화를 위해 제거하였다.
세포 조건화: 1 부피의 사전 예열된 세포 조건화 용액(CC1)을 첨가하였다. 다음으로, 샘플을 85℃로 설정된 가열 블록에 5분간 위치시켰다. 이후에, 샘플을 GentleMACS 해리기(3 x 프로그램 h_tumor_02)를 사용해 블렌딩하였다. 가열 단계 및 블렌딩 단계는 샘플을 300 x g에서 3분간 원심분리하기 전에, 각각 2회 부가적인 횟수로 수행하였다.
플레이팅: 100 ㎕의 샘플 분취액을 에피튜브에 이전시키고, 1부피와 균등한 100% 메탄올을 첨가하였다. VWR 수퍼프로스트 슬라이드 당 70 ㎕의 메탄올/샘플을 플레이팅 및 파라핀 포매에 사용하였다.
자동화 면역세포화학: 명시야 DAB-기반 면역세포화학(ICC)을 연구 소프트웨어가 구비된 벤타나 메디칼 시스템즈, 인코포레이션의 벤치마크XT 플랫폼(Ventana Medical Systems, Inc, Tucson, AZ)을 사용해 양으로 하전된 유리 슬라이드 상에 배치된 대표 샘플에 대해 수행하였다. 각 항체의 DAB 검출은 옵티뷰 AMP 키트(VMSI Cat# 760-099) 존재 및 부재 하에서 옵티뷰 DAB 검출 키트(VMSI Cat# 760-700)를 사용해 수행하였다. 증폭을 사용해 시료내 배경값을 낮은 수준으로 산출시켰고 1차 항체 항온반응시간을 낮출 수 있었다. 모든 검출은 완전 자동화되었고 4분으로 2회 동안 CC1 완충제(VMSI Cat# 950-124) 중 시료의 세포 조건화 후 벤치마크 XT 자동스테이너(VMSI) 상에서 수행하였다. 모든 1차 항체 항온반응은 4분 동안 37℃에서 수행하여(결과 및 고찰 참조), 총 작동 시간을 2시간 20분 아래로 유지시킬 수 있었다. 단일 DAB ICC는 도 10에 도시된 프로토콜을 사용해 수행하였다. 도 10은 대표 샘플 중 단백질 검출을 위해, 단계 1-102로 설정된, 예시적 DAB ICC 프로토콜을 제공한다. 이러한 특정 실시형태에서, 프로토콜을 사용해 Her2를 검출하였다.
발색체 복합 검출을 다음의 순서로, 도 11에 기술된 대로 수행하였다: Ki-67→CD20→CD3. 효소의 열 변성 및 1차 항체 멜트 오프는 교차 반응을 방지하기 위해 12분 동안 세포 조건화 2(CC2) 완충제(VMSI Cat#950-123) 중에서 90℃ 항온반응을 통해 Ki-67과 CD20 및 CD20과 CD3 사이에서 수행하였다.
결과 및 고찰
유리 슬라이드 상에 침착된 대표 샘플이 자동화 ICC를 사용해 염색될 수 있는지 여부를 결정하기 위해서, 동물 조직 및 편도선 시료의 제조된 혼합물 유래의 샘플을 단일 바이오마커 DAB ICC에 대해 염색하였다(도 12). 도 12는 동물 조직 및 인간 편도선 시료의 혼합물로부터 제조된 대표 샘플 중 자동화 DAB ICC를 사용하여, B-세포를 구별하는, CD20의 검출을 도시한다. CD20은 대표 샘플에 함유된 인간 편도선 조직 유래의 세포에서 검출되었다.
배경값 및 작동 시간을 최소화하기 위해 증폭과 4분 1차 항체 항온반응을 선택하였다(예를 들어, Rep Dia-Her2 DAB 프로토콜, 도 10). 검사된 모든 항체(표 2 참조)는 이러한 프로토콜과 호환되도록 결정하였다.
형광발광 ICC를 사용하여 단일 마커를 검출하는 실현가능성을 검사하기 위한 프로토콜을 또한 개발하였다(도 11 참조). 예를 들어, Her2는 형광발광 ICC를 사용해 검출하였다(도 13A 및 13B). 여기서, 도 13A 및 13B는 형광발광 ICC를 사용하여 Her-2 양성 이종이식 종양 및 편도선 조직으로부터 제조된 대표 샘플에 존재하는 Her2-양성 Calu-3 세포의 검출을 도시한다. 도 13A는 2차 항체만으로 항온반응시킨 Calu-3 세포를 함유하는 대표 샘플을 예시한다(음성 대조군). 2차 항체에 의해 발생된 Calu-3 세포 중 배경 신호는 파선 화살표로 표시하였다. 도 13B는 2차 항체의 첨가 전 Her2 항체(4B5)와 항온반응시킨 Calu-3 세포를 함유하는 대표 샘플을 예시한다. Calu-3 세포 중 Her-2 신호는 실선 화살표로 표시하였다. 편도선에서 유래된 보다 작은 비특이적 세포로부터의 신호는 Her2 항체(4B5) 첨가 부재(도 13A) 및 Her2 항체(4B5) 첨가 존재(도 13B)에서 확인되었다.
다음으로, 편도선 시료로부터 제조된 대표 샘플을 제조하였고 유리 슬라이드 상에 위치시켜서 다중 발색성 ICC에 의한 분석을 검사하였다. 대표 편도선 시료를 3종의 면역 마커에 대해 염색하였는데, 각각은 도 14에 도시된 프로토콜에 따라서 별개의 색상을 사용하여 검출되었다. 도 14는 대표 샘플 중 복수 단백질의 검출을 위한 예시적인 다중 발색성 ICC 프로토콜(단계 1-225에 기재됨)을 제공한다. 이러한 특정 실시예에서, Ki-67, CD20, 및 CD3에 대한 종-특이적 항체 및 발색체의 항-종-효소 접합체-유도 침착을 사용해 3종의 면역 마커를 검출하였다.
예를 들어, 문헌 [Wenjun Zang et al., "Quantum dot in situ hybridization", WO2014139979]에 기술된 바와 같이, 발색체 다중화를 대표 편도선 시료 상에서 수행하여 종-특이적 2차 항체를 사용한 후 착색제의 항-종-효소 접합체-유도 침착과 효소 활성 제거를 위한 열 변성 단계를 후속하여 Ki-67, CD20, 및 CD3을 검출하였다. 생물학적으로 적당한 검출 및 색상의 오버레이가 발색체 다중화가 수행된 대표 편도선 시료에서 관찰되었다(도 15).
다음으로, ICC를 임상 시료로부터 제조된 대표 샘플에 대해 수행하였다. 특히, 포르말린 고정된 폐 종양 또는 포르말린 고정된 신장 종양으로부터 제조된 대표 샘플을 제조하였고 PDL-1(항종양 면역성을 차단하기 위한 종양에 의해 생성되는 마커 및 면역요법에 영향을 미치는 표적), CD8(항종양 면역성 수준을 이해하기 위한 핵심 T-세포 마커), 및 Ep-Cam(상피암을 의미하는 마커)에 대해 검사하였다. 시험된 검사한 바이오마커 각각(PDL-1, CD8, 및 Ep-Cam)은 임상적 종양 시료로부터 제조된 대표 샘플에서 다양한 수준으로 검출되었다(도 8A-8D 및 도 9A-9D 참조).
이들 결과는 온전한 포르말린 고정된 조직 시료로부터 유래된 대표 샘플 중 마커의 완전하게 자동화 단일 및 다중 ICC 검출을 입증하고, 더욱이, 온전한 고정된 조직 시료를 대표하는 샘플이 샘플 중 세포의 희귀 서브개체군을 검출하는 능력을 제공한다는 것을 보여준다.
실시예 4: 림프절로부터 대표 샘플의 제조 및 희귀 서브클론을 검출하기 위한 이의 용도
이 실시예는 종양 전이로부터 일어날 수 있는 암 세포의 민감한 검출을 허용하는, 림프절 조직 유래의 대표 샘플의 생성을 기술한다. 대표 조직 샘플을 본 명세서에 기술되고 도 3에 개략적으로 도시한 균질화 방법론을 사용하여 포르말린 고정된 종양 샘플로부터 유래시켰다. 대체로, 종양 샘플, 즉, 포르말린-고정된 종양 샘플을 초기에 기계적으로 해리시킨 후, 완충제 1x PBS 완충제로 옮기기 전에, 85℃에서 CC1 완충제 중에 사전조건화시켰다.
방법
항체: 항-BRAFV600E 마우스 단일클론 항체(카탈로그 790-4855, Ventana Medical Systems, Inc.)를 사용해 b-Raf를 검출하였다.
조직 샘플: 모든 조직 샘플을 벤타나 메디칼 시스템즈에서 24시간 동안 10% 중성 완충 포르말린에 고정시켰다. HER2-양성 또는 BRAF 이종이식편을 벤타나 메티칼 시스템즈에서 생성시켰다. 인간 편도선은 노쓰웨스트 메디칼 센터(Tucson, AZ)에서 수득하였다.
재료: 조직의 기계적 전단은 IKA-웍스(Staufen in Breisgau, Germany)의 IKA 웍스 튜브 밀 컨트롤 시스템(0004180001)을 사용하고 밀테니 바이오테크(Teterow, Germany)의 gentleMACS 해리기를 사용해 수행하였다. 가열 및 pH 조건화는 벤타나 메디칼 시스템즈의 세포 조건화 1(CC1) 완충제(Tucson, AZ; 카탈로그 #950-124)에서 수행하였다.
블렌딩: 200 ㎕의 미네랄유를 IKA 튜브 밀(Part# MT 40.100) 블렌딩 가스켓에 첨가하여 균질화 동안 누수를 방지하였다. 5 그램의 조직을 1x 조직 부피 PBS와 함께 밀에 첨가하였다. 샘플을 15000 rpm에서 2분(10초 스피닝, 스피닝 사이에 2초 정지) 동안 스피닝하였다. 균질화된 샘플을 밀로부터 제거하여 PBS 부피의 2배와 함께 GentleMACS 해리기(Part# 30-093-237)에 첨가하였다. 샘플을 프로그램 h_tumor_01(36초의 회전)를 사용해 블렌딩하였고, 이를 샘플을 50 mL 코니칼 튜브에 붓기 전에 총 3회 반복하고 3분간 300 x g에서 원심분리하였다. PBS 수성층을 조건화를 위해 제거하였다.
세포 조건화: 1 부피의 예열된 세포 조건화 용액(CC1)을 첨가하였다. 다음으로, 샘플을 5분간 85℃로 설정된 가열 블록에 위치시켰다. 이후에, 샘플을 GentleMACS 해리기(3 x 프로그램 h_tumor_02)를 사용해 블렌딩하였다. 가열 단계 및 블렌딩 단계는 샘플을 3분간 300 x g에서 원심분리하기 전에 각각 2회 부가적인 횟수로 수행하였다.
플레이팅: 샘플의 100 ㎕의 분취액을 에피튜브로 이전시키고, 1 부피의 균등한 100% 메탄올을 첨가하였다. VWR 수퍼프로스트 슬라이드 당 70 ㎕의 메탄올/샘플을 플레이?v에 사용하였다.
자동화 면역세포화학: 명시야 DAB-기반 면역조직화학(ICC)을 조사 소프트웨어가 구비된 벤타나 메디칼 시스템즈, 인코포레이션의 벤치마크XT 플랫폼(Ventana Medical Systems, Inc, Tucson, AZ)을 사용해 양으로 하전된 유리 슬라이드 상에 침착된 대표 샘플에 대해 수행하였다. 항체의 DAB 검출은 옵티뷰 AMP 키트(VMSI Cat# 760-099) 존재 및 부재에서 옵티뷰 DAB 검출 키트(VMSI Cat# 760-700)를 사용해 수행하였다. 증폭을 사용해 시료 내 배경값을 낮은 수준으로 산출하였고 1차 항체 항온반응 시간을 낮출 수 있었다. 모든 검출은 완전 자동화였고 4분으로 2회 동안 CC1 완충제(VMSI Cat# 950-124) 중 시료의 세포 조건화 후 벤치마크 XT 오토스테이너(VMSI)에서 수행하였다.
결과 및 고찰
림프절(예컨대, 편도선) 유래의 대표 샘플 중 낮은 출현율 사건이 검출될 수 있는지 여부를 결정하기 위해서, 대표 림프절 샘플을 유리 슬라이드 상에 침착시키고 도 10에 기재된 대로 자동화 ICC를 사용해 염색하였다.
림프절의 대표 샘플 중 종양 세포의 검출의 감수성을 검사하기 위해서, bRaf V600E 양성 인간 이종이식편의 대표 샘플의 감소된 양을 림프절 균질물에 섞었다. 다음의 세포 백분율(샘플의 총 부피 중 BRAFV600E-양성 세포의 출현율)을 사용하였다: 50%, 25%, 12.5%, 6.25%, 3.12%, 1.5%, 0.15%, 0,015%, 0.0015%, 및 0.00015%. bRaf-양성 세포는 0.015%로 낮은 출현율로 검출되었고(도 16), ICC가 치료적으로 작용가능할 수 있는 극도로 희귀한 세포 하위개체군을 찾기 위해 림프절로부터 제조된 대표 조직 샘플에 사용될 수 있다는 것을 입증한다(예를 들어, BRAFV600E+의 경우 베무라피닙).
유사한 희석 연속 실험을 또한 다음의 세포 백분율을 산출하도록 대표 편도선 샘플에 감소 비율로 첨가시킨, Her2-양성 세포를 사용해 수행하였다: 50%, 25%, 12.5%, 6.25%, 3.12%, 1.5%, 0.15%, 0,015%, 0.0015%, 및 0.00015%. b-Raf-양성 세포와 유사하게, Her2-양성 세포가 또한 매우 낮은 수준, 즉 약 0.015%(데이타 도시하지 않음)에서 검출될 수 있어서, 다시 대표 샘플의 ICC 분석이 치료적으로 작용할 수 있는 극도의 희귀 세포 하위개체군을 찾는데 사용될 수 있다는 것을 시사한다(예를 들어, Her2+에 대해 허셉틴).
실시예 5: 전체 종양으로부터 대표 샘플의 제조
이 실시예는 외과적으로 절제된 원발성 종양으로부터 생성된 대표 샘플을 기술한다.
방법
대표 조직 샘플은 포르말린 고정된 직경이 대략 8 cm인 외과적으로 절개된 대장, 및 신장의 부분 절제로부터 유도되었다(GLAS Tissue Consultants(Winston-Salem, NC)로부터 입수)(도 18A 및 18B). 여기서, 도 18A는 여전히 8 cm의 대장 선암종을 함유하는 대장 절제물 유래의 재료를 예시하는 한편 도 18B는 유두상 요로상피 신장 종양을 함유하는 신장의 부분 신장절제술에 의한 잔여 조직을 예시한다.
종양의 샘플을 획득하고 TNM 샘플채취 과정을 모방하도록 조직학적 검사를 위해 가공하였다(즉, 파라핀 포매, 조직학적 절편화). 나머지 종양 조직은 스캘펄을 사용해 병리학자가 해부하였고, 종양 조직을 IKA-웍스(Staufen im Breisgau, Germany)의 IKA 웍스 튜브 밀 컨트롤 시스템(0004180001) 또는 해밀톤 비치 단일 서브 블렌더를 사용해 균질화하였다. 균질물의 샘플을 이후 기계적으로 해리시킨 후, 아큐맥스 완충제 중에 1 mg/mL 콜라게나아제 H와 아큐맥스를 함유하는 완충제(예를 들어, PBS)로 옮기기 전에 85℃에서 CC1 완충제 중에 사전조건화하였다. 최종 효소 처리된 균질화된 조직을 CC1 완충제로 돌아가기 전에 적어도 약 30분간 40℃에서 콜라게나아제 H와 항온반응시키고 임의의 나머지 콜라게나아제 효소를 불활성화시키기 위해서 약 10분 동안 85℃에서 가열하였다. 다양한 진단적 어세이에 사용을 위한 서브샘플을 유래시키는데 대표 샘플을 사용하였다.
샘플을 H&E 뿐만 아니라 벤타나 염색 플랫폼 상에서 ALK IHC로 염색하였다.
결과 및 고찰
세포 유형의 다양성이 원래의 샘플 내에 함유되었는지 여부를 결정하기 위해서, 조직학적 절편과 대표 샘플 둘 모두를 H&E로 염색하였다(도 19 및 20. 및 23). 여기서, 도 19A는 대장의 선암종으로부터 수득된 제1 절편을 예시하는 한편, 도 19B는 대장의 선암종 유래의 제2의 상이한 절편을 예시한다. 도 19A 및 19B의 절편 각각은 각각 병리학자가 수득하였다. H&E 염색의 차이는 동일한 종양 내에서 변이를 보여준다. 도 19C는 결장의 선암종으로부터 제조된 대표 샘플의 H&E 염색을 예시한다. 도 20A 내지 20C는 유두상 요로상피 신장 종양로부터 수득된 별개의 조직학적 절편의 H&E 염색을 도시한다. 도 20A는 유두상 요로상피 신장 종양으로부터 채취된 제1 절편을 예시하고, 도 20B는 유두상 요로상피 신장 종양으로부터 채취된 제2의 상이한 절편을 예시한다. 도 10A 및 20B에 예시된 절편 각각은 병리학자가 수득하였다. H&E 염색의 차이는 동일한 종양 내에서 변이를 도시한다. 도 20C는 유두상 요로상피 신장 종양으로부터 제조된 대표 샘플의 H&E 염색을 예시한다.
도 19 및 20에서 분명하듯이, 절개된 종양의 상이한 영역에서 채취된 조직학적 절ㄹ편의 형상은 상이한 조직학적 외관을 갖는데 반해(A, B), 대표 샘플(C)은 각각의 종양 유형(즉, 종양, 정상, 면역)으로 구성된 세포의 불균질성을 요약한다.
바이오마커 발현의 임의의 불균질성이 대표 샘플에 요약된 조직학적 조직에 존재하는지 여부를 결정하기 위해서, 모든 샘플을 아마도 EML4와 게놈 재배열로 인한, Alk 발현에 대해 분석하였다. 모든 슬라이드는 Alk DAB 염색의 음성 발현 대비 양성을 결정하는 병리학자가 고찰하였다. 도 21A 내지 21C 및 도 22A 내지 22C는 신장 및 대장 둘 모두에 대해서 하나의 조직학적 절편이 Alk에 대해 반점의 드문 양성을 입증하는 한편, 하나의 절편은 음성이었음을 보여준다. 놀랍지만 블록 간 염색의 이러한 불일치는 TNM 병기화 시스템에서 고유한 샘플채취 편향성을 의미한다. Alk 양성의 불균질성(즉, 전체 종양 크기 대비 낮은 출현율)은 Alk DAB에 대해 양성인 작은 클러스터 또는 단일 세포가 존재하므로, Alk IHC로 염색된 대표 샘플에서는 분명하였다. 도 21A 내지 21C는 대장의 선암종으로부터 수득된 별개의 조직학적 절편의 Alk DAB 염색을 보여준다. 도 21A는 유두상 요로상피 신장 종양으로부터 채취된 제1 절편을 예시하고, 도 21B는 유두상 요로상피 신장 종양으로부터 채취된 제2의 상이한 절편을 예시한다. 도 21A 및 21B에 예시된 각각의 절편은 병리학자가 수득하였다. Alk DAB 염색의 차이는 동일한 종양 내에 변이를 보여준다. 도 21C는 대장의 선암종으로부터 제조된 대표 샘플의 Alk DAB 염색을 예시한다.
도 21C는 Alk에 대해 양성인 3종의 대장 선암종 세포의 소형 클러스터(화살표)를 도시하고, 도 25C는 6종의 유두상 요로상피 신장 암 세포의 소형 클러스터(화살표) 및 양성인 대조구 림프구(화살표 머리)를 도시한다. 도 22A 내지 C는 유두상 요로상피 신장으로부터 수득된 별개의 조직학적 절편의 Alk DAB 염색을 도시한다. 도 22A는 유두상 요로상피 신장 종양으로부터 채취된 제1 절편을 예시하고, 도 22B는 유두상 요로상피 신장 종양으로부터 채취된 제2의 상이한 절편을 예시한다. 도 22A 및 22B에 예시된 절편 각각은 병리학자가 수득하였다. Alk DAB 염색의 차이는 동일한 종양 내에서 변이를 보여준다. 도 22C는 유두상 요로상피 신장 종양으로부터 제조된 대표 샘플의 Alk DAB 염색을 예시한다.
실시예 6: 조직 샘플의 기계적 해리 및 균질화
이 실시예는 대표 샘플을 생성시키기 위한 조직 샘플의 기계적 해리 및 균질화의 단계를 기술한다. 방법은 조직 샘플의 자르기 및 갈기 및 단일 세포 해리를 포함한다.
방법
조직을 손으로 자르거나(도 25A) 또는 적당한 음식 가공 장치 예컨대 "주서"를 사용해 갈았다(도 25B). 이 방법이 포르말린 고정된 편도선 조직을 이용하지만(도 25A-25B에 도시됨), 다른 조 직 유형이 또한 사용될 수 있다. 편도선은 24시간 동안 10% 중성 완충 포르말린 중에 정돈되어 신선하게, 고정된 후 순수 에탄올에 저장되었다. 편도선은 스캘펄을 사용해 손으로 네모지게 썰거나, 또는 주서에서 기계적으로 해리되었다. 이어서 최종 균질물을 탈수시키고 조직 프로세서(PROCESSOR NAME)에서 파라핀 왁스로 관류시켰다. 4 미크론 절편을 샘플에서 채취하였고, H&E 염색을 사용해 조직 단편의 크기 분포를 가시화시켰다.
결과 및 고찰
갈기, 자르기 및 즙내기가 조직 단편의 균질한 분포를 생성시켰는지 여부를 결정하기 위해서, 림프절(편도선)을 손으로 네모지게 썰거나 또는 주서를 사용해 기계적으로 해리시켰다. 도 25A 및 도 25B에서 명확한 바와 같이, 손으로 고정된 편도선의 썰기는 매우 균일한 크기 분포를 갖는 조직 단편의 혼합물을 야기시켰다. 조직 단편은 수만 내지 수십만 세포를 함유하고, 조직학적으로 인식가능한 방식으로 장기의 구조를 유지하였다.
주서를 사용한 림프절의 해리는 수십만 세포를 함유하는 조직의 보다 작은 단편을 야기시켰다(도 25C 및 도 25D). 주서에 의해 생성된 조직 단편은 세포 대 세포 상호작용을 해부 병리학자가 평가할 수 있는 방식으로 조직 균질물에 존재하였다.
갈기, 즙내기, 및 블렌딩은 독립적으로, 또는 조합하여 사용될 수 있다는 것을 고려한다. 예를 들어, 절개된 종양은 먼저 갈아서 파라핀 포매 및 조직학적 검사를 위한 조직 단편의 균질한 개체군을 생성할 수 있다. 갈아진 균질물의 샘플은 이어서 단일 세포 또는 단일 핵 단리를 목적으로 하는 추가적인 효소적 해리를 위해 조제물 중 조직을 더욱 해리하기 위해 즙내지거나 또는 블렌딩될 수 있다.
실시예 7: 단일 세포로 균질물(또는 대표 샘플)의 해리
이 실시예는 정량화, 단리 및 바이오마커 분석을 위해 단일 세포로 기관, 조직, 또는 종양에서 유래된 대표 샘플의 추가 가공(블렌딩, 즙내기, 또는 갈기를 통함)을 기술한다. 방법은 기계적 해리, 여과, 효소적 해리, 및 초음파처리를 포함한다.
기계적 해리 및 여과 방법:
이 실시예에서 사용된 임상적 종양 샘플은 GLAS 조직 컨설턴트로부터 수득한 상기 언급된 거대 대장 선암종이다. 림프절(편도선), 및 대장 선암종 균질물은 상기 기술된 대로 제조하였다. 균질물의 샘플을 1 mm 체(Advantech Manufacturing, New Berlin, WI)를 사용해 여과하였고 체를 통과할 수 없는 재료를 수집하였다. 다음으로 1 mm 체를 통해 통과하는 균질물 샘플을 20 미크론 필터(Pluriselect, San Diego, CA)를 사용해 여과하였다. 20 미크론 필터를 통해 통과할 수 없는 재료를 수집하였다. 20 미크론 필터를 통해 통과할 수 있는 균질물을 10 미크론 필터를 통과시켰고 통과된 단일 세포를 수집하였다. 10 미크론 필터를 통과한 단일 세포를 5분간 800 g에서 원심분리시켰고, 3% BSA 및 0.09% 소듐 아자이드를 포함하는 PBS에 재현탁시키고, 3회 반복하였으며, 상청액을 폐기하였다. 단일 세포를 4℃에 저장하였다.
멀티 사이저 4e 쿨터 카운터(Multisizer 4e Coulter Counter)(Beckman Coulter, Indianapolis IN)를 사용하여 여과 단계에서 수집된 단일 세포의 크기 분포를 특징규명하엿다. 어튠 포커싱 유세포측정기(Attune focusing flow cytometer)(ThermoFisher Scientific)를 사용하여 모든 단일 세포를 특징규명하고, 분류하고, 단일 세포를 수집하였다. 초음파처리기를 사용하여 다세포 클러스터를 단일 세포로 기계적으로 해리시켰다. 일부 경우에서, 행크스 평형 염 완충제 중에서 1시간 동안 37℃에서 항온반응시켜서 250 유닛의 콜라게나아제(TYPE & COMPANY)를 사용해 다세포 클러스터를 생화학적으로 해리시켰다. 항온반응 후, 혼합물을 1분간 800 g에서 원심분리하였고 PBS에 재현탁시켰다.
EpCam 항체(Ventana Medical Systems, Inc., Tucson, AZ)를 사용하여 여과물 유래의 상피 세포를 염색하였다. 1차 항체를 샘플 핵과 1시간 동안 37℃ 또는 24시간 동안 4℃에서 항온반응시켰다. 대조군 샘플은 1차 항체를 받지 않았다. 항온반응 후, 샘플을 EZ 프렙 완충제로 6x 세척한 후, 0.5 내지 1시간 동안 37℃에서 MACS 완충액 중 염소-항-마우스 Alexa-488 항체(1:500)에 재현탁시켰다. 일부 샘플을 또한 10분간 3 μM DAPI로 염색하였다. 염색된 샘플을 4℃에서 반응 완충액으로 4x 세척하였다. 50 ㎕의 샘플을 VWR 플러스 슬라이드 상에 분산시켰고 즉히 유리 커버슬립을 통해 이미지화시켰다. 염색된 세포의 이미지는 인하우스 소프트웨어에 의해 제어되는 차이스 액시오(Zeiss Axio) 에피형광 현미경 상에서 획득하였고, 이미지를 ImageJ를 사용해 분석하였다. 염색된 핵은 4℃에 MACS-T-STC 중에서 저장하였다.
결과 및 고찰
순차적 여과 단계의 목표는 균질물을 포함하는 다양한 크기 입자의 조성물을 결정하는 것이다. 각 단계에서, 필터를 통과할 수 없는 조직을 광학 현미경 관찰을 통해 주의깊게 분석하였다(도 29). 도 26A에 도시된 바와 같이, 1 mm 체를 통과할 수 없는 재료는 주로 연결 조직 및 근육 섬유로 구성되었다. 이 재료는 세포질이 결여되었으므로, 폐기하였다. 20 미크론 필터를 통과할 수 없는 재료는 주로 큰 다세포 클러스터로 구성되었다(도 26B). 10 미크론 필터를 통과할 수 없는 재료는 종양 세포의 작은 다세포 클러스터로 구성된데 반해(도 26C), 10 미크론 필터를 통과하는 재료는 균질화 과정 동안 방출되었던 단일 세포였다(도 26D). 그러므로, 대표 샘플을 생성시키기 위한 인간 종양의 균질화는 큰 다세포 클러스터부터 개별 세포에 걸친 범위의 조직 단편 크기의 분포를 생성시킨다.
멀티사이저 4e 쿨터 카운터(Beckman Coulter, Indianapolis IN)를 사용하여 수율(균질화된 조직 그램 당 단일 세포의 수)뿐만 아니라 대장 선암종에서 단리된 해리된 단일 세포의 크기를 측정하였다. 4 내지 10 ㎛의 입자를 계측하였고 단일 세포로서 간주하였다. 여과 방법을 사용한 종양 균질물 그램 당 수율은 대략 320,106 세포/그램이었다. 종양 균질물로부터 단리된 세포는 다음의 2가지 별개의 개체군으로 분포되었다: 4 내지 5.5 미크론 직경 범위의 세포, 및 5.5 내지 9.3 미크론 직경의 세포(도 27A). 동일한 분석을 균질화된 편도선에서 정제된 세포에 대해 수행하였고, 편도선에서 단리된 복수의 세포는 4 내지 5.5 미크론 직경이었다(도 27B).
대장 종양 및 편도선으로부터 단리된 단일 세포의 크기 분포는 직경이 4 내지 5.5 미크론인 세포는 면역 세포인 한편, 5.5 내지 9.3 미크론의 세포는 종양 세포라는 것을 시사한다. 이러한 발견을 확증하기 위해서, 대장 종양으로부터 단리된 개별 종양 세포를 EpCam에 대해 형광으로 염색하여 종양 세포 구성요소의 크기를 결정하였다. 형광 염색된 세포는 먼제 현미경 슬라이드 상에 위치시켰고 형광 현미경을 사용해 이미지화시켜 염색 과정을 평가하였다(도 28). 어튠 유세포 분류(Attune Flow Sorting) 장비 상에서 분류 후, 분류된 EpCam 양성 세포의 크기를 쿨터 카운터를 사용해 재평가하였다. 따라서, EpCam 양성 종양 세포의 크기 분포는 비종양 함유 편도선에서는 부재하지만, 균질화된 대장 종양 유래의 단일 세포에 존재하는 세포 개체군과 상관있다.
이들 데이타는 균질화된 대장 종양으로부터 기계적으로 해리되고 여과된 세포가 다음의 2가지 별개의 개체군으로 구성됨을 시사한다: 정상 면역 세포 및 종양 세포. 이들 2종의 개체군은 입자 크기 분석기를 사용해 쉽게 구별할 수 있고 단리된 세포는 유세포 분석 및 분류를 사용해 더욱 분석될 수 있다. 데이타는 키그 기반 분리 방법(크기-배제 컬럼, 미세유체 디바이스, 밀도 원심분리 등)을 농축된 종양 또는 면역 세포 샘플을 산출하는 별개의 2종의 개체군에 채택할 수 있다는 것을 더욱 시사한다.
복수 세포 단편의 해리
20 및 10 미크론 필터를 통과하지 않은 복수세포 단편(또는 클러스터)은 단일 세포를 생성하도록 더욱 가공하였다. 프로브 초음파처리기가 초음파 처리를 사용해 복수세포 단편을 단일 세포로 물리적으로 해리시키려는 시도에 사용되었다. 복수세포 단편을 증가량의 초음파 에너지에 노출시켰고, 종양 세포의 유리를 쿨터 카운터를 사용해 입자의 크기를 분석하여 평가하였다. 도 35에 도시된 바와 같이, 증가량의 초음파 에너지는 5.5 내지 9.3 미크론 직경의 입자의 방출을 유발시킨다(245J 패널의 화살표). 물리적으로 유리된 세포는 상기 실시예로부터의 균질물에서 단리된 종양 세포와 상관성이 있어서, 복수세포 단편이 주로 종양 세포로 구성된다는 것을 시사한다.
단일 세포로 복수세포 단편의 해리를 더욱 강화시키기 위해서, 복수세포 단편의 샘플을 콜라게나아제와 항온반응시켰다. 1형 콜라게나아제와 72시간 항온반응 후, 콜라게나아제 처리된 복수세포 단편의 크기 분포를 분석하였다. 도 33A 및 33C에 도시된 바와 같이, 콜라게나아제 단독은 복수세포 단편으로부터 단일 세포의 유리를 일으키지 않았다. 초음파처리가 콜라게나아제 처리 후 첨가된 경우, 대부분의 복수세포 단편이 정상 면역 세포(4 내지 5.5 미크론 직경) 및 종양 세포(5.5 내지 9.3 미크론 직경)의 크기 범위 내의 단일 입자로 해리되었다. 이들 데이타는 인간 기관, 조직, 및 종양으로부터 유래된 대표 샘플이 기계적, 물리적, 및 생화학적 방법을 사용해 단일 세포로 더욱 가공될 수 있다는 것을 입증한다.
대표 샘플 유래 단일 세포의 바이오마커 특징규명
대장 종양의 대표 샘플 유래의 단일 세포를 형광 염색 및 유세포 분석 분석을 통해 바이오마커 발현에 대해 더욱 특징규명하였다. 유세포 분석은 생검 샘플로부터 채취된 생 세포에 대한 일반적인 진단적 분석 방법이다. 수천 내지 수십만 세포가 바이오마커의 존재 또는 부재에 대해 조사될 수 있고, 동시에 세포의 수 및 각 세포에 대한 바이오마커 발현 수준을 정량할 수 있다. 당업자는 절개된 기관, 조직, 또는 종양으로부터 유래된 포르말린 고정된 조직 샘플이 포르말린 고정된 샘플에 대한 현행 분석 방법이 단일 세포로의 해리보다는, 파라핀 포매 및 조직학적 절편화를 포함하므로 유세포 분석으로 처리할 수 없다는 것은 인식할 것이다. 대장 종양으로부터 생성된 가공된 세포가 유세포 분석에 의해 분석될 수 있는지 여부를 결정하는 것이 하기 실시예의 목적이었다.
방법:
세포를 벤타나 메디칼 시스템즈의 CD3, CD8, CD45, CK8/18, EGFR, 및 PD-L1 항체로 염색하였다. 일부 경우에서, 티라미드 신호 증폭을 사용하여 형광 염색을 개선시켰다. 세포(튜브 당 대략 3 x 107 세포)를 0.3 mL의 3% H2O2에 재현탁시키기 전에 2분 동안 300 x g에서 원심분리하였다. 15분 항온반응 후, 세포를 3회 PBS 중 0.1% Tween 20, 0.1% BSA로 세척하였다. TSA 차단 완충제(0.3 mL)를 5분 동안 첨가한 후, 37℃에서 30분간 0.2 mL 1차 항체 중에서 항온반응하였다. 다음으로, 세포를 3회 PBS 중 0.1% Tween 20, 0.1% BSA로 세척한 후 37℃에서 30분간 0.2 mL의 홀스래디쉬 퍼옥시다제에 접합된 염소 항-종 항체에 재현탁시켰다. 다음으로, 세포를 1.2 mL의 20 μM 티라미드-로다민 101에 희석하였고 5분간 항온반응 후 30분간 1.2 mL의 TSA H2O2를 후속하였다. 세포를 PBS 중 0.5% 덱스트란, 0.1% Tween20, 0.1% BSA로 세척하였고 저장을 위해 MACS-T-STC에 재현탁시켰다. 이미지화 또는 유세포 분석 이전에, 세포를 10분간 3 μM DAPI로 염색하였다.
유세포 분석에 의한 바이오마커 분석
어튠 유세포 분석 시스템(ThermoFisher Scientific)이 다양한 바이오마커를 발현하는 세포의 백분율을 정량하는데 사용되었다. 대조군(일차 Ab로 염색되지 않은 세포)과 샘플(일차 Ab로 염색된 세포) 사이의 형광발광 강도 이동성은 전체 세포 개체군 내 표적 세포의 존재비에 비례하며 개체군 중 양성 세포의 백분율을 계산하는데 사용되었다. 도 29A 내지 29E에 도시된 바와 같이, 배경값 이상의 형광 신호가 검사된 모든 바이오마커에 대해 검출되었다. 면역 시스템 및 종양의 구성요소는 동일한 샘플로부터 검출되었는데, CK8/18 및 EGFR과 비교하여 CD45 및 CD8이었다(도 29A-29C). 일부 경우에서, 면역 세포 및 종양 세포 둘 모두는 동시에 염색될 수 있다(도 29E PD-L1). 더욱이, 유세포 분석에서 양성으로 염색된 세포의 백분율은 동일한 임상 사례 유래의 포매된 대표 샘플의 IHC 염색과 유사하였다(도 29A-29E).
이들 데이타와 함께, 본 발명자들은 유세포 분석을 통한 바이오마커 분석을 위해 단일 세포로 기간, 조직 및 종양에서 유래된 균질물을 더욱 해리시키는데 필요한 방법 및 작업흐름을 입증하였다. 당업자는 유세포 분석으로 생성된 데이타의 정량적 성질을 인식할 것이다. 이 데이타와 함께, 이제 각 세포 유형의 상대적 존재비를 평가함으로써, 절개된 종양으로부터 세포 구성요소의 백분율을 계산하는 것이 가능하다. 예를 들어, 상기 데이타로부터, 이 실시예에서 분석된 대장 종양 중 세포의 33%가 종양 세포였다. 또한, 종양 세포의 대략 33%가 PD-L1 양성(PD-L1 유세포분석에서 DAPI의 이동, 도 29E)이었고, 심지어 세포의 보다 적은 백분율은 EGFR 양성이었다(EGFR 양성 세포, 도 29F). 대장 종양 중에서 세포의 20%가 면역 세포(CD45 양성 세포, 도 29C-)였고, 그들 세포 중 오직 한 분획이 CD8 양성(도 29D)이었다.
단일 세포의 단리 및 포획
대장 종양의 대표 샘플 유래의 단일 세포를 특이적 세포 개체군의 생체분자 분석을 할 수 있도록 단리하고 포획하였다. 이 실시예에서, 단리 및 포획의 2가지 유형, 유세포 분류 및 자성 비드를 통한 친화도 분류를 사용하였다.
대장 선암종의 대표 샘플로부터 해리된 단일 세포 유래의 종양 세포를 동정하고 포획하기 위해서, 세포를 로다민 1010을 침착시키고 DAN를 DAPI로 염색시키기 위해, 이전에 기술한 티라미드 염색 방법을 사용하여 EpCAM(상피 세포 부착 분자)에 대해 염색하였다. 소니(Sony) SH800 세포 분류기에서 분석하는 경우, EpCAM 양성 종양 세포(도 30A의 녹색 개체군)는 DAPI 강도 그래프에 대해 백게이팅시 더 높은 DNS 함량을 보인다(도 30B). 이배체 DAPI 강도를 갖는 EpCAM 음성 세포가 정상 세포이다. 이 실시예에서, EpCAM 양성이고 높은 DAPI 수준을 함유하는 세포를 분류하였다. 다음으로 분류된 세포는 쿨터 카운터 상에서 크기에 대해 분석되는 경우, 크기 범위는 직경이 5.5 내지 9.3 미크론이다(도 27C). 당업자는 이배체 DAPI 염색된 EpCAM 음성 세포가 또한 분류될 수 있다는 것을 인식할 것이다. 이들 데이타는 유세포 분류기를 사용한 기관, 조직 및 종양에서 유래된 대표 샘플로부터 세포의 별개 개체군을 단리하고 포획하는 능력을 입증하였다.
특이적 세포 개체군의 단리 및 포획의 별개 방법은 자성 비드를 사용한 친화도를 통해 특이적 세포 표면 마커를 발현하는 세포의 개체군을 제거하는 것이다. 이러한 실시예에서, 림프절 유래의 단일 세포를 CD3 또는 CD8 1차 항체에 커플링된 자성 비드(Dynabeads, ThermoFisher Scientific)와 항온반응시켰다. 세포를 제조사 프로토콜에 따라 항체 접합된 자성 비드와 항온반응시켰다. 항온반응 후, 자성 비드를 자력을 통해 튜브 바닥으로 옮기고, 미결합된 세포를 함유하는 액체를 튜브로부터 제거하였다. 유세포 분석을 사용하여 도 31A의 분석과 유사하게, 샘플로부터 CD3 또는 CD8 양성 세포의 고갈을 입증하였다. 특이적 세포 유형의 고갈은 도 34B에서 확인할 수 있는데, 여기서 CD3 또는 CD8을 발현하는 세포의 백분율은 상응하는 항체 접합된 자성 비드와 항온반응 후 감소되었다.
이들 데이타와 함께, 본 발명자들은 기관, 조직, 및 종양으로부터 유래된 대표 샘플로부터 생성된 단일 세포를 추가의 진단적 조사를 위해 단리하고 포획할 수 있다는 것을 입증하였다. 당업자는 임의 수의 진단적 방법이 PCR, NGS, 유세포 분석, 단일 세포 시퀀싱 또는 전사체, 질량 분광법 기반 단백질체 분석, 및 다른 진단적 방법과 같은 정제된 세포 개체군을 분석하는데 사용할 수 있다는 것을 이해할 것이다.
실시예 8: 조직 샘플의 생존능 및 안정성 연구
신선한 조직 생존능
신선한 편도선은 2분 동안 3000 rpm에서 마그네슘이 없고 칼슘이 없는 1:1(w:v) DPBS 중 IKA 블렌더에서 블렌딩시켰고(Rep) 스캘펄로 조직을 갈기한 다음 초대 세포 배양을 위해 콜라게나아제로 소화시켜 준비된 편도선(Trad)(Donnenberg, et al., Methods Mol Biol., 568: 261-279, 2009)과 비교하였다.
조직 손상은 상청액으로 RNA(세포질 손상) 및 DNA(핵 손상)의 방출을 측정하여 평가하였다(도 34). 편도선 조직의 균질화는 균질화가 임의의 효소적 처리를 요구하지 않으므로, 콜라게나아제 소화가 후속되는 전통적인 갈기 방법보다 더욱 더 신속하다. 도 37에 표시된 바와 같이, 신선한 편도선의 균질화는 상청액으로 DNA 및 RNA 유리에 의해 측정시 전통적인 방법보다 손상을 덜 발생시킨다. 오차 막대는 2회 실험의 표준 오차를 나타낸다.
포르말린 고정된 조직 유래의 핵산, 단백질 및 세포의 안정성 실험
췌장 고분화성 신경내분비 신생물, 유두상 요로상피 암종, 및 대장 선암종(각각 도 35A, 35B 및 35C) 유래의 조직을 6개월 동안 표시된 온도에서 표준 세포 저장 용액(20% 글리세롤, 10% DMSO, 5% MeOH, 및 100% MeOH) 중에서 항온반응시켰다. RNA는 애질런트(Agilent) 바이오분석기 상에서 단리하였고 분석하였다. 도 35A, 35B 및 35C에 표시된 바와 같이, 바이오분석기 추적에서 18S RNA 피크의 강도에 미세한 차이로 표시되는 바와 같이 상이한 수준일지라도, 모든 저장 방법은 RNA 무결성을 보존하였다(도 38A의 20% 글리세롤 샘플). 이들 데이타는 포르말린 고정된 대표 샘플에 대한 복수의 저장 방법이 시간 경과에 따라 RNA의 무결성을 보존한다는 것을 의미한다.
c-MET에 대한 IHC 염색에 의해 측정시 단백질은 6개월 시험 기간 전반에서 모든 저장 조건 및 모든 온도에서 유두상 요로상피 암종 및 대장 선암종(각각 도 36A 및 36B) 둘 모두의 경우 상당히 안정하였다. 6개월 저장 기간 이후, 샘플을 유리 슬라이드 상에 위치시켰고, c-Met에 대해 염색시키고, 명시야 현미경을 사용해 이미지화시켰다. 샘플의 일부 응집이 일어나고, 세포의 형상이 시간경과에 따라 악화될 수 있지만, 양성 및 음성 염색 세포 둘 모두는 모든 완충제 조성물 중에 안정성 시간 과정 전반에서 검출될 수 있다.
대표 샘플의 저장은 PBS 중 "순간 동결"을 평가하여 더욱 조사하였다. 30 밀리리터의 대장 선암종 대표 샘플을 드라이아이스/알콜 배쓰 중 PBS에서 순간 동결하였고 -80℃에서 저장하였다. 이후 그들을 37℃에서 해동하였고 분취액을 10회의 후속 동결-해동 주기에서 채취하였다. 동결-해동 주기 후 채취된 모든 샘플을 유기 슬라이드 상에 위치시켜서 H&E 염색을 사용해 세포 형상의 안정성을 평가하였고, c-Met IHC를 사용해 단백질의 안정성을 평가하였다. 도 37A에 도시된 바와 같이, 세포 형상은 단백질 기반 바이오마커로서, 샘플을 신속 동결하여 -80℃에서 저장시, 모든 동결-해동 주기에 걸쳐 매우 안정하였다(도 37B).
RNA 및 DNA의 안정성은 10회 동결-해동 주기 동안 동일한 샘플에서 평가하였다. 전체 DNA 및 RNA는 표준 페놀/클로로포름 방법을 사용해 샘플로부터 추출하였고 애질런트 바이오분석기를 사용해 분석하였다. DNA 및 RNA 둘 모두는 동결-해동 주기 과정 동안 안정하였고, DNA가 RNA 보다 더 탄력적이었다(도 38).
이들 데이타로, 본 발명자들은 기관, 조직, 및 종양으로부터 만들어진 대표 샘플에 대한 복수 저장 방법을 입증하였다.
실시예 9: 대표 샘플로부터 종양 핵의 농축
이 실시예는 정량화, 단리, 및 바이오마커 분석을 위해 개별 핵으로 기관, 조직, 또는 종양으로부터 유래된 포르말린 고정된 대표 샘플의 추가 가공(블렌딩, 즙내기, 또는 갈기를 통함)을 기술한다. 방법은 기계적 해리, 여과 및 효소적 해리를 포함한다. 방법의 독특한 양상은 1) 포르말린 고정된 대표 샘플로부터 핵을 함유하는 단일 입자를 추출하고 탈응집시키기 위한 방법의 확립; 2) 동일한 대표 샘플의 상이한 분취액으로부터 입자 단리의 재현성의 평가; 3) 기계적 해리 및 핵 추출 방법에 의해 샘플에 가해지는 세포 파괴 정도를 모니터링하기 위한 접근법의 확립; 4) 종양 및 정상 하위개체군을 구별하도록 제공되는 대표 샘플로부터 추출되는 핵과 회합되어 남아있는 마커의 동정; 5) 유세포 분석에 의한 고정된 대표 샘플 유래의 추출되고, 염색된 재료를 분석하기 위한 방법론의 확립; 6) a) 시퀀싱을 위한 충분한 DNA의 수득, 및 b) 저출현율 서브클론에 대한 분석적 감수성의 유지에 필요할 종양 입자 수의 확립을 포함한다.
방법 & 재료
기계적 해리는 IKA-웍스의 IKA 웍스 튜브 밀 컨트롤 시스템(0004180001; Staufen im Breisgau, Germany) 및 밀테니 바이오테크의 gentleMACS 해리기(Teterow, Germany)로 수행하였다. 사용된 모든 필터는 플루리셀렉트(Pluriselect)(San Diego, CA)로부터 입수하였다. 사용된 완충제는 다음의 회사로부터 입수하였다: CC1(950-124; Ventana Medical Systems, Tucson, AZ), EZ prep(950-102; Ventana Medical Systems), 반응 완충제(950-300; Ventana Medical Systems), autoMACS 완충제(130-091-221, Miltenyi Biotech), dPBS(14190, Fisher Scientific, USA). Tween 20은 패셔 사이언티픽, 유에스에이(Fisher Scientific, USA)(AC233362500)에서 구매하였다. 다음의 시약은 시그마, 유에스에이(Sigma, USA)에서 구매하였다: NP40(74385), DNAse(AMPD1), 스퍼민 테트라클로라이드(S2876), DAPI(D9542), 트립신(59427C), 펩신(P7012), 프로나제(P5147). 다음의 효소는 다음의 회사로부터 입수하였다: 프로테이나아제 K(0706, VWR, USA), 아큐맥스(AM105, Innovative Cell Technologies, San Diego, CA), 콜라게나아제 H(11074032001, Roche, Basel, Switzerland). 티라미드-로다민 101은 시그마에서 구매한 화학물을 사용해 사내에서 합성하였다. 마우스 항-사이토케라틴 8/18 항체(760-4344), 마우스 항-CD45 항체(760-2505), 및 염소 항-마우스 HRP-접합된 항체(760-4310)는 벤타나 메디칼 시스템즈로부터 입수하였다. Alexa 488로 접합된 염소-항-마우스를 인비트로젠(Invitrogen)(A-11001)에서 구매하였다.
조직 모델 및 임상 샘플
인간 편도선는 노쓰웨스트 메디칼 센터(Tucson, AZ)에서 입수하였고 벤타나 메디칼 시스템즈에서 24시간 동안 10% 중성 완충 포르말린에 고정시켰다. 종양 샘플은 GLAS/(Winston-Salem, NC http://glaswpcopy.wpengine.com/)에서 수득하였고 이전에 포르말린에 고정시켰다.
헤마톡실린 및 에오신 염색
대표 샘플은 VWR 플러스 슬라이드 상의 autoMACS 완충제에 위치시켰다. 헤마톡실린 및 에오신(H&E) 염색은 벤타나 메디칼 시스템즈 심포니 플랫폼(Ventana Medical Systems, Tucson, AZ) 및 상응하는 H&E 심포니 시약(Ventana Medical Systems, Tucson, AZ)을 사용해 수행하였다.
면역조직화학
조직 절편 또는 파라핀 포매된 대표 샘플에 대해 벤타나 메디칼 시스템즈 벤치마크XT 플랫폼(Ventana Medical Systems, Tucson, AZ)을 사용해 명시야 DAB-기반 면역조직화학(IHC)을 수행하였다. 바이오마커의 가시화는 벤타나의 옵티뷰 DAB 검출 키트(760-700)를 사용해 수행하였다. 항체는 4분간 항온반응시켰다. 이미지는 차이스 액시오 명시야 현미경 상에서 획득하였다.
유세포 분석
응집 분석을 위해, 샘플을 어튠 어쿠스틱 포커싱 유세포측정기(Thermo Fisher Scientific, USA) 상에서 분석하기 전에 40 μm 필터를 통해 여과시켰다. 입자는 여과 전 10분간 DAPI(3 μM)와 항온반응시켰다. 유속은 분 당 4,000 사건 보다 큰 경우면, 샘플을 희석하였다.
유세포 분류를 위해, 샘플을 염색 전에 40 μm 필터를 통해 여과시켰고(하기 참조), 소니 SH800 세포 분류기 상에서 분석하였다. 더블렛 구별은 DAPI 펄스 너비 및 높이를 사용해 수행하였다.
대표 샘플로부터 단일 핵-함유 입자를 추출하기 위한 방법
모델 시스템으로서 포르말린 고정된 편도선을 사용하여, 대표 샘플의 분취액의 단일 입자로의 해리에 대해 다양한 효소적 방법을 조사하였다. 효소적 단계 이전에, 편도선 재료는 먼저 IKA 블렌더에서 autoMACS 완충제 중에 기계적으로 해리시키고, 85℃로 가열된 CC1 완충제에서 1:1로 희석시켰으며, gentleMACS 해리기를 사용해 gentleMACS 튜브에서 더욱 블렌딩하였다. 샘플은 85℃에서 5분간 2회 가열을 겪은 후 블렌딩되었다. 기계적 해리에 후속하여, 상이한 효소적 조건을 소화시키고 100 μm 필터를 통해 여과시킨 H&E 염색된 재료를 시각적으로 모니터링하여 정성적으로 평가하였다. 효소 불활성화는 임의의 불활성화 단계 이후에 24시간 동안 4℃에서 재료를 항온반응시키고, VWR 플러스 슬라이드 상에 재료를 플레이팅하고, H&E로 염색한 후, 세포의 형상, 또는 핵의 무결성을 모니터링하여 검사하였다. 검사된 조건은 표 3에 요약하였다.
표 3: 기계적 및 효소적 소화 방법을 위해 검사된 상이한 조건
각 해리 방법으로부터의 입자의 수율 비교
상이한 효소적 및 기계적 해리 방법은 대표 편도선 샘플의 순차적인 분취액으로부터 나란히 비교하였다. 비교된 방법은 표 6에 요약하였다. 각 방법의 유효성은 혈구게측기를 사용해 출발 재료 그램 당 각 방법에 의해 유리되는 입자의 수를 계측하여 평가하였다. 생물학적 삼중 샘플이 표시된 경우에 분석되었다.
세포 파괴의 측정
해리 준비 동안 각 단계의 상청액을 유지시키고 핵 파괴의 표시자로서 용액으로 유리되는 DNA에 대해 분석하였다. 상청액을 기술적 복제를 위해 3개로 분할하였다. 필요한 경우, 샘플은 진백(GeneVac)(SP Scientific)을 사용해 농축시켰다. DNA는 제조사의 설명서에 따라서 로슈 하이 퓨어(Roche High pure) FFPE 키트를 사용해 나머지 잔류물로부터 추출하였다. 또한 DNA는 기준 샘플로서 제공하기 위해 대량 균질물로부터 채취된, 보존 가공 액체와 함께, 0.1 g 분취액으로부터 추출하였다. DNA 수율은 나노드롭-1000 분광광도계(Thermo Scientific)를 사용해 평가하였다. 가공 액체로부터 추출된 DNA는 세포 핵에 대한 손상을 대용으로서 제공되는 기준 샘플로부터 추출된 DNA의 백분율로서 표시되며, 방출된 DNA의 백분율은 손상된 핵의 백분율에 비례한다고 가정한다.
입자 응집의 최소화
프로테이나아제 K-펩신 방법을 사용하여 대표 편도선 샘플로부터 단리된 입자를 DAPI(3 μM, 10분)로 염색하여 DNA 함량을 가시화시키고, 유세포분석으로 분석하였다. 응집은 더블렌, 트리플렛, 및 > 트리플렛 DNA 수준을 함유하는 입자에 의해 입증되었다. 다음의 조건을 사용하여 입자의 탈응집을 보조하는 첨가제를 결정하였다: 1% Tween 20, 1% NP40, DNAse, 1.5 mM 스퍼미딘 테트라클로라이드, 5 mM CaCl2. 유세포 분석은 각 첨가제의 존재 하에서 정상 편도선 조제물로부터 DAPI 히스토그램을 사용해 싱글렛, 더블렛, 및 > 트리플렛 DNA 수준의 백분율을 평가하는데 사용하였다.
프로테이나아제 K-펩신 소화 방법을 사용하여 대표 샘플로부터 핵의 단리
편도선 조직으로부터 제조된 대표 샘플은 상기 기술된 바와 같이 CC1 완충제를 사용해 기계적 해리가 수행되었다. 종양 조직의 경우, 대량 기계적 해리는 먼저 1:1 종양:MACS 비율로 IKA 블렌더에서 MACS 완충제 중에 수행된 후, 전체 균질물의 분취액을 채취하고 1 g 종양 조직: 5 mL 용액 비율로 IKA 블렌더에서 더욱 블렌딩하였다. 희석된 블렌딩 재료를 1 mm x 1 mm 금속체를 통해 여과시켰고, 여과된 재료를 상기 기술된 바와 같이 1 g 종양 조직: 5 mL CC1 완충제 비율로 CC1 조건화시켰다. 편도선 및 종양 샘플 둘 모두의 경우, CC1 완충제는 벤치탑 미세원심분리기(Eppendorf)에서 1분 동안 300 x g로 원심분리하여 dPBS(1:1)에 대해 교환시키고, 모든 후속 액체 교환은 동일한 방식으로 수행하였다. 원심분리 후, 펠렛은 1 mg/mL 프로테이나아제 K를 함유하는 dPBS 중에 1:1로 재현탁시키고 50℃에서 10분간 항온반응시켰다. 프로테이나아제 K를 켄칭시키고 추가의 해리를 위해, 샘플은 150 mM NaCl, pH 1.5 중 5 mg/mL 펩신으로 교환하였다. 용액의 pH는 pH 스트립으로 검사하고 필요에 따라 5 M HCl을 사용해 1.5 내지 2로 재조정하였다. 샘플을 10분마다 부드럽게 혼합하면서, 37℃에서 30분간 항온반응시켰다.
종양 조직의 경우, 수율은 효소적 소화 단계 둘 모두 동안 써모믹서(ThermoMixer) F1.5(Eppendorf)에서 600 rpm으로 튜브의 진탕을 통해 개선되었다. 펩신은 5 M NaOH를 사용해 8 이상의 pH로 조정하여 불활성화시키고 펩신을 함유하는 용액은 autoMACS 완충제, 1% Tween 20 및 1.5 mM 스퍼미딘 테트라클로라이드(MACS-T-STC)에 대해 교환시켰다. 소화된 샘플은 10 mL의 MACS-T-STC를 사용하여 40 미크론 필터를 통해 여과시키고, 원심분리로 수집하고 후속 적용 이전에 저장을 위해 500 ㎕의 MACS-T-STC에 재현탁시켰다. 종양 핵 프렙의 재현성은 동일한 종양에 대한 복수의 프렙에 걸쳐서, 멀티사이저(Multisizer) 4e(Beckman Coulter)에서 측정하고, 종양 조직의 출발 "건조" 중량에 대해 정규화시킨, 3 내지 30 미크론 범위의 입자의 수율을 모니터링하여 평가하였다. 재현성은 동일한 종양에 대한 상이한 프렙 유래의 입자의 크기 분포를 모니터링하여 더욱 평가하였다.
대표 샘플로부터 단리된 재료 염색
표준 면역형광발광
프로테이나아제 K-펩신 방법을 사용해 대표 종양 샘플 1 g으로부터 제조된 핵은 200 ㎕의 마우스 항-사이토케라틴 8/18 1차 항체에 재현탁시키기 전 1분간 300 x g에서 원심분리에 의해 수집하였다. 1차 항체를 1시간 동안 37℃에서 또는 24시간 동안 4℃에서 샘플 핵과 항온반응시켰다. 대조군 샘플은 1차 항체를 받지 않았다. 항온반응 후, 샘플을 EZ 프렙 완충제로 6x로 세척한 후, 0.5 내지 1시간 동안 37℃에서 MACS 완충제 중 염소-항-마우스 Alexa-488 항체(1:500)에 재현탁시켰다. 일부 샘플을 또한 10분간 3 μM DAPI로 염색하였다. 염색된 샘플은 4℃에서 반응 완충제를 사용해 4x로 세척하였다. 50 ㎕의 샘플을 VWR 플러스 슬라이드 상에 확산시키고 즉시 유리 커버슬립을 통해 이미지화하였다. 염색된 세포의 이미지는 사내 소프트웨어에 의해 제어되는 차이스 액시오 에피형광 현미경 상에서 획득하였고, 이미지를 ImageJ를 사용해 분석하였다. 염색된 핵은 4℃에서 MACS-T-STC 중에 저장하였다.
티라미드 신호 증폭(TSA)을 사용한 염색
기계적 균질화 또는 프로테이나아제 k-펩신 방법에 의해 단리된 입자 핵(튜브 당 3 x 107 입자)은 0.3 mL의 3% H2O2.에 재현탁전에 2분간 300 x g에서 원심분리하였다. 15분 항온반응 후, 핵을 PBS 중 0.1% Tween 20, 0.1% BSA로 3회 세척하였다. TSA 차단 완충제(0.3 ml)를 5분간 첨가한 후, 0.2 mL의 1차 항체에서 30분간 37℃에서 항온반응시켰다. 핵은 PBS 중 0.1% Tween 20, 0.1% BSA로 3회 세척한 후 30분간 37℃에서 0.2 mL의 홀스래디쉬 퍼옥시다제 접합된 염소 항-종 항체에 재현탁하였다. 핵은 1.2 mL의 20 μM 티라미드-로다민 101에 희석하였고 5분간 항온반응시키고, 1.2 mL의 TSA H2O2를 30분간 후속하였다. 핵은 PBS 중 0.5% 덱스트란, 0.1% Tween20, 0.1% BSA로 3x 세척하였고 저장을 위해 MACS-T-STC에 재현탁시켰다. 이미지화 또는 유세포 분석 이전에, 핵을 10분간 3 μM DAPI로 염색하였다. 염색된 핵의 이미지는 올리푸스(Olympus) BX63 에피형광 현미경 상에서 획득하였고 ImageJ를 사용해 분석하였다.
기계적 및 효소적 방법에 의해 단리된 입자의 수 당 DNA 수율의 보정
핵은 상기 기술된 바와 같이 프로테이나아제 K-펩신 방법을 사용해 편도선으로부터 단리하였다. 입자를 혈구계측기를 사용해 계측하였다. DNA는 제조사의 설명서에 따라서 로슈 하이 퓨어 FFPE 키트를 사용해 105, 106, 및 107 입자로부터 제조하였다. DNA 수율은 나노드롭(Nanodrop)-1000 분광광도계(Thermo Scientific)를 사용해 평가하였다.
결과
개별 핵으로 대표 샘플의 추가 가공
개별 핵으로 대표 샘플의 추가 가공은 세포막의 제거를 필요로 한다. 신선한 세포에 대한 현행 핵 단리 방법은 핵을 유리시키기 위해 효소를 필요로 하지 않고, 포르말린 고정된 샘플로부터 핵 단리는 일반적인 방법이 아니다. 정상과 종양 핵 사이를 구별할 수 있는 세포골격 마커를 유지하면서, 개별 핵을 효율적으로 단리하기 위해, 효소적 방법이 처리된 핵으로부터 DNA를 유리시키는 과도한 손상없이 핵을 드러내도록 개발되었다.
프로나제, 프로테이나아제 K, 펩신, 트립신, 어큐맥스, 콜라게나아제 H를 포함한, 복수 효소가 핵으로부터 멀리 세포막을 소화시키는 그들 능력에 대해 평가되었다. 도 43은 상이한 조건 하에서 펩신 또는 트립신으로 소화된 샘플의 예를 도시한다. 아래 우측 패널에 존재하는 팽윤되고, 단편화된 핵은 과도한 소화를 의미한다.
각 효소에 대한 조건의 결정 및 켄칭 후, 각 방법의 병렬 비교를 포르말린 고정된 편도선 조직으로부터의 대표 샘플 유래의 평행 분취액에 대해 수행하였다. 표 3을 참조한다. 각 방법은 방법 부문에서 기술한 바와 같이 기계적 균질화 단독과도 비교되었다. 도 43은 프로테이나아제 K 처리와 이후 펩신에 의한 소화가 대표 샘플로부터 대부분의 입자를 유리시킴을 보여준다. 이러한 실험이 0.1 mg/mL 내지 1 mg/mL 프로테이나아제 K 사이에 약간의 차이를 보이지만, 종양 샘플에 의한 추가 실험은 1 mg/mL 프로테이나아제 K가 가장 일관적인 결과를 산출한다는 것을 입증하였다(도시하지 않음).
효소적 해리는 기계적 해리와 비교하여 입자 수율을 증가시킨다
프로테이나아제 K-펩신의 해리 방법은 3개의 독립적인 편도선 샘플에 대해 기계적 해리 단독과 함께 비교되었다. 도 44A 내지 44C는 프로테이나아제 K-펩신 방법이 대표 샘플로부터 유리되는 입자의 수를 상당히 개선시킴을 보여준다. 흥미롭게, H&E 염색 결과는 프로테이나아제 K-펩신 방법에 의해 유리된 많은 입자가 부착된 세포질 단편이 있거나 또는 없는 핵으로 이루어지는 한편, 기계적으로 해리된 샘플은 보다 온전한 세포 재료를 함유한다는 것을 보여준다(도 48, 아래 패널).
종양으로부터의 핵 프렙은 수율 및 크기 분포에서 재현가능하다
동일한 대표 종양 샘플로부터의 핵 프렙의 재현성을 결정하기 위해서, 개별 분취액에 존재하는 개체군의 일관성 및 방법의 일관성을 평가하였다. 전체 균질물로부터 채취한 상이한 분취액(∼1 그램)으로부터, 핵을 상기 기술된 대로 프로테이나아제 K-펩신 방법을 사용해 제조하였다. 도 45A는 2종의 상이한 종양(대장 및 폐)으로부터 제조된 핵의 수율이 동일한 대표 샘플로부터 채취된 복수의 분취액에 걸쳐 고도로 일관적이라는 것을 보여준다. 대장 종양으로부터 단리된 입자의 크기 분포는 3종의 상이한 프렙에 걸쳐 매우 재현가능하고 특징적인 크기 분포를 동정하기 위해 더욱 분석되었다(도 45B). 특히, 핵은 특징적인 크기의 2개 개체군으로 분포된다(도 45B). 이들 데이타는 동일한 대표 샘플의 상이한 분취액이 일관적인 세포 조성물을 함유하고, 핵을 추출하기 위해 개발된 방법이 일관적인 수율의 2종의 상이한 핵 개체군을 생성시킨다는 것을 뒷받침한다.
해리로 인한 세포 손상의 평가
개별 핵으로 대표 샘플의 추가 가공은 핵 구획으로부터 DNA의 유리를 초래할 수 있다. 상청액으로 DNA의 방출은 핵에 대한 손상의 잠재적인 판독값이다. 도 46은 기계적 또는 프로테이나아제 K-펩신 방법에 의해 편도선 재료의 가공동안 총 DNA의 대략 4%가 방출된다는 것을 보여준다. 3종의 상이한 종양의 가공 결과 10% 미만의 DNA가 방출되었다(도 46). 흥미롭게, 유사한 백분율의 핵 손상이 기계적 및 효소적 방법 둘 모두에서 일어나서, 프로테이나아제 K-펩신 방법이 그들을 손상시키지 않고 온전한 핵을 단리한다는 것을 뒷받침한다.
핵의 응집 감소
초기 유세포 분석 실험은 더 높은 DAPI 염색 강도의 피크에서 입자의 존재로 입증된 바와 같이, 입자의 ∼35%가 응집된 상태로 존재한다는 것을 밝혀주었다(도 47, 패널(ii), R2(녹색) 및 R3(분홍색)). 측면 산란 대 전방 산란의 점도표 상으로 백게이팅시(패널(i), 녹색 및 분홍색 개체군), 더 높은 DAPI 강도의 피크에 속하는 이들 입자는 더 높은 전방 및 측면 산란의 영역으로 맵핑되어, 더 큰 크기를 의미하엿다. 통상의 더블렛 구별이 싱글렛 핵(R1, 적색)을 특별히 분석하는 것을 가능하게 할 수 있지만, 샘플에 존재하는 싱글렛 핵의 개수는 증가되었다. 몇몇 첨가제(방법 참조)를 첨가하여 단리된 핵의 응집을 감소시켰다. 1% Tween 20의 첨가가 응집된 입자의 수를 ∼35% 내지 ∼23%로 감소시킨다는 것을 발견하였다(B의 그래프의 R2+R3을 A 그래프의 동일한 영역과 비교). 다른 첨가제는 응집된 입자의 수를 감소시키는데는 비효과적이었지만, 1.5 mM 스퍼민 테트라클로라이드의 첨가는 시간 경과 동안 핵의 무결성을 유지시켰다(도시하지 않음). 특히, 신선한 조직과 달리, DNAse가 세포에서 핵 DNA로 접근하는 것을 방지하고 그것을 파괴하는 기능성 세포 또는 핵 막이 존재하지 않으므로, DNAse는 고정된 조직을 탈응집시키는데 사용될 수 없다.
사이토케라틴은 대표 종양 샘플로부터 단리된 핵과 회합된 채로 남아있는다
대표 샘플로부터 단리된 핵을 분류하기 위해서, 핵과 회합된 채로 남아있는 마커를 동정하여 종양을 정상과 구별하였다. 중간 필라멘트(사이토케라틴, 비메틴)는 종종 핵과 친밀하게 회합되어 있으며, 그들은 또한 종종 주변 정상 기질로부터 암종을 동정하는데 사용된다. 이들이 프로테이나아제 K-펩신 방법을 사용해 수집된 단리된 핵 입자에서 염색될 수 있는 계통-특이적 마커일 수 있다고 가정하였다. 도 48A는 사이토케라틴 8/18에 대해 특징적인 강력한 면역조직화학 염색이 되는 대장 선암종 유래의 절편을 도시하며, 파라핀 왁스에 포매된 동일한 고정된 종양 유래의 대표 샘플로부터 채취된 절편은 유사한 염색을 보여준다(도 52B). 도 48C는 프로테이나아제 K-펩신 방법을 사용해 이 종양의 대표 샘플로부터 단리되고, CK8/18에 대해 염색되어 형광 접합된 2차 항체로 가시화된 재료를 보여준다. 특히, 이 마커는 샘플이 프로테이나아제 K-펩신 방법으로 해리되었을 때 유지되었고, 1차 항체 없이 항온반응된 음성 대조군 샘플은 적은 배경 염색을 보였다(도 48D). 비멘틴은 편도선으로부터 단리된 많은 핵과 회합된 채로 남아있는다. 그러나, 기계적으로 해리된 샘플에서 양성으로 염색되는 표면 마커 CD45는 프로테이나아제 K-펩신 처리로 손실된다(도시되지 않음). 따라서, 사이토케라틴 및 비멘틴은 표면 마커가 파괴된 경우더라도, 유세포분석 및 세포 분류를 위한 계통-특이적 핵-회합된 마커로서 제공될 것이다. 다른 핵 마커, 예컨대 계통 특이적 전사 인자가 또한 특이적 종양 유형의 경우 염색될 수 있다. 이는 포르말린 고정된 샘플로부터 핵 단리의 독특한 특성이다.
티라미드 신호 증폭을 사용한 마커 염색의 개선
통상의 면역형광발광(IF) 염색(도 48C)은 유세포분석에 의해 양성으로 염색된 개체군을 일관적으로 분해시키기에 충분한 밝고 안정한 신호를 제공하지 않았다(도시하지 않음). 유세포분석에 의한 염색된 샘플의 분석은 종종 보다 안정한 신호를 획득하기 위해 형광단에 직접적으로 접합된 항체의 사용을 요구한다. 대표 샘플로부터 단리된 재료에 대한 도전은 종종 과하게 포르말린 고정된 종양으로부터 유래되는 것이다. 유세포분석에 의한 고정된 대표 샘플의 통상의 분석을 가능하게 하기 위해, 티라미드 신호 증폭(TSA)은 포르말린 고정된 조직에 대해 사용된 항체를 사용하는 항체 염색에 사용되었다. TSA의 경우, 티라미드-접합된 형광단은 마커-특이적 1차 항체에 결합된 2차 항체에 접합된 HRP에 의해 활성화된다. 활성화된 형광 염료는 1차 항체에 의해 인식되는 마커에 인접하여 단백질에 공유적으로 연결되어, 밝고 안정한 신호를 생성시킨다. 도 53A는 TSA 대비 통상의 면역형광발광을 사용하여 CD45에 대해 염색된 기계적으로 해리된 편도선의 비교를 도시한다. 도 53B는 TSA에 의해 증폭된 2종의 상이한 종양 유형에 대한 사이토케라틴 염색을 보여준다. 사이토케라틴 염색된 샘플 내에 DAPI 염색된 사이토케라틴-음성 세포의 존재는 용액 중에서 TSA에 대한 특이성을 보여줌을 주목한다.
사이토케라틴 염색은 유세포분석에 의해 종양 및 정상 핵의 구별을 가능하게 한다.
다음으로, 유세포분석을 사용한 대장 및 폐 종양 유래의 사이토케라틴(CK)-염색 및 DAPI-염색 핵을 분석하였다(도 50). 양쪽 경우에서, CK-양성(청록색) 및 CK-음성(분홍색) 개체군이 포착되었다(도 50, 패널 i). CK-음성 개체군은 2배체 DNA 함량과 연관되어서(도 50, 패널 ii), 이들이 종양 내에 존재하는 정상 세포의 개체군(아마도 면역 세포)으로부터 유래된 핵이라는 것을 입증한다. CK-양성 개체군의 경우, DAPI 염색은 이수성 DNA를 갖는 핵의 분획을 밝혀주어서(도 50, 패널 iii), 이들이 아마도 종양 세포로부터 유래된 듯하다는 것을 뒷받침한다. 각 샘플의 경우, 핵은 정상 핵(도 50, 패널 iv) 또는 종양 핵(패널 v)에 대해 농축된 분획으로 성공적으로 분류되었다. DNA는 이들 수집된 개체군으로부터 성공적으로 추출되었고 차세대 시퀀싱(NGS), PCR, 인시츄 하이브리드화, 또는 기타 후속 분석으로 분석할 수 있다.
또한, 도 51A 및 51B는 상이한 종양 유래의 종양 및 정상 핵의 백분율이 다양하다는 것을 보여준다. 대장 종양 샘플의 경우, 전체 종양은 상이한 빈에 지정되었다. 미확정 분획(회색)은 여과(방법 참조)에 의해 제거된 재료의 중량%에 상응한다. 적혈 세포의 백분율은 효소적 소화 이전에 전체 입자 계측으로부터, 적혈 세포를 파괴하는, 효소적 소화 후 전체 입자 계측을 빼서 추산하였다. 나머지 분획은 종양 핵의 유세포분석에 따라 종양 및 정상으로 지정되었다. 세포 수준에서 종양 조성물의 분석은 특히 종양 균질물에 존재하는 면역 세포의 개체군을 동정하고자 시도할 때, 진단적으로 관련있을 수 있다.
대표 샘플로부터 단리된 입자로부터 DNA 수율의 확립
특이적 특징을 갖는 정해진 수의 입자를 유세포 분석을 사용해 수집하였다. 상이한 수의 입자로부터 DNA 수율의 보정은 특별한 후속 분석, 예컨대 NGS를 위해 얼마나 많은 재료가 대표 샘플로부터 수집되는가를 결정하게 될 것이다. 도 52는대표 편도선 샘플로부터의 기계적으로 해리 및 프로테이나아제 K-펩신 해리된 입자 유래의 DNA 수율을 보여준다. 중요하게, 이들 데이타는 프로테이나아제 K-펩신 방법으로 단리된 입자가 기계적 해리 단독으로 단리된 입자와 유사한 DNA 수율을 제공한다는 것을 보여주어, 효소적 방법이 DNA 무결성을 유지한다는 것을 의미한다. 또한, 입자의 수는 5% 출현율로 존재하는 클론을 검출하는데 필요한 수를 결정하기 위해 계산되었다(표 8). 이들 결과는 후속 시퀀싱 적용에서 이형 검출을 촉진하도록 대표 샘플 유래의 특이적 개체군으로부터 충분한 수의 입자를 수집하는 노력을 이끌게 될 것이다.
표 4: 5% 출현율 서브-클론을 동정하는데 필요한 입자 개수의 계산
실시예 10: 단리된 핵에 대한 인시츄 하이브리드화
배경
대표 샘플로부터 핵의 단리는 벤타나 벤치마크 자동화 스테이너 플랫폼에서 자동화 방식으로, 전체 종양의 다양성을 대표하는 종양 샘플에 대한 인시츄 하이브리드화(ISH)를 수행하는 기회를 가능하게 한다. 단리된 핵의 ISH 염색의 해석은 파리판 포매된 조직의 결여로 인해 비특이적 배경값이 적어, 아마도 보다 더 쉬운 듯 하다.
재료
기계적 해리는 실시예 9에 기술된 대로 수행하였다.
임상 샘플
임상 샘플은 실시예 9에 기술하였다.
헤마톡실린 및 에오신 염색
대표 샘플을 VWR 플러스 슬라이드 상의 autoMACS 완충제에 위치시켰다. 헤마톡실린 및 에오신(H&E) 염색은 벤타나 메디칼 시스템즈 심포니 플랫폼(Ventana Medical Systems, Tucson, AZ) 및 상응하는 H&E 심포니 시약(Ventana Medical Systems, Tucson, AZ)을 사용해 수행하였다.
인시츄 하이브리드화
단리된 핵을 실시예 8에 따라 제조하여, mL 당 2x107 입자로 슬라이드 상에 위치시키고 밤새 공기 건조되게 하였다. 샘플은 벤타나 메디칼 시스템즈 벤치마크 XT 플랫폼(Ventana Medical Systems, Tucson, AZ)을 사용한 Her2/Chr17 듀얼 인시츄 하이브리드화(ISH) 프로토콜을 사용해 어세이하였다. 바이오마커의 가시화는 각각 은 HRP 검출 및 알칼리 포스파타제(AP) 레드 검출을 사용해 수행하였다. 칵테일된 항체를 8분간 항온반응시켰다. 이미지는 차이스 액시오 명시야 현미경 상에서 획득하였다.
결과
대장 및 폐 종양으로부터 핵의 단리는 포르말린 고정된 조직 샘플의 ISH 분석을 위한 신규한 샘플을 생성시켰다. 핵의 단리는 주변 조직 신호 획득 및 해석을 복잡하게 만들지 않으므로, 유전자 카피수의 신속한 평가를 가능하게 하며, 검출 계획은 도 39에 도시하였다. 도 39에 도시된 바와 같이, Her2/Chr17 DNA 올리고 프로브를 대장 종양으로부터 유래된 대표 샘플에서 단리된 핵과 하이브리드화시키는 경우, 2종의 Her2 유전자 및 2개의 염색체 17 알파 위성 영역(검은색 Her2 SISH 및 적색 Chr17 알칼리 포스파타제 신호, 각각 파선 화살표 및 화살표)은 쉽게 검출가능하다. 흥미롭게, 폐 종양으로부터 유래된 대표 샘플에서 단리된 핵의 분획은 핵 중 백분율로 풍부한 SISH 신호로 입증된 바와 같이, Her2 유전자좌의 증폭을 가졌다(도 40, 파선 화살표의 Her2 SISH 신호).
이들 데이타에 의해, 본 발명자들은 ISH를 사용해 포르말린 고정된 인간 종양의 대표 샘플로부터 유래된 개별 핵을 조사하는 능력을 입증하였다. 단리된 핵은 ISH 절차에서 배경 염색의 공통 이유인, 조직 내 잔류 파라핀 왁스가 존재하지 않으므로 ISH에 대한 개선된 기질을 제공한다.
실시예 11: 대표 샘플의 차세대 시퀀싱 분석
배경
차세대 시퀀싱(NGS)은 수백만 내지 십억개의 DNA 단편의 동시 분석을 가능하게 하는 고수율 DNA 시퀀싱 기술이다. 지난 수십년간, NGS 기술의 상당한 진보는 연구자와 임상자가 종양 불균질성, 표적 요법에 대한 내성, 및 암 면역요법의 효능을 DNA 돌연변이와 연관시킬 수 있게 하였다. 클리닉에서 NGS에 사용되는 종양 샘플은 상기 기술된 바와 같이 편향된 배타적인 FFPE 조직이다. 종양 유래의 대표 샘플의 NGS 분석은 NGS 데이타의 임상적 관련성을 상당히 개선시키게 될 것이다.
재료 및 방법
종양의 기계적 해리는 월마트(Tucson, AZ)에서 구매한 해밀톤 싱글 서브 블렌더 또는 IKA-웍스(Staufen im Breisgau, Germany)의 IKA 웍스 튜브 밀 컨트롤 시스템(0004180001)을 사용해 수행하였다. 모든 라이브러리 제조(TruSeq Amplicon Cancer Panel) 및 MiSeq 시약 키트(MiSeq Reagent Kit V2)는 일루미나 인코포레이션(Illumina Inc)(San Diego, CA)에서 구매하였다. 시퀀싱은 MiSeq(Illumina, San Diego, CA)에서 수행하였다.
대장, 폐 및 유두상 요로상피 암종의 조직 샘플은 GLAS(Winston-Salem, NC)에서 수득하였고, 투명 세포 신장 암종은 노쓰웨스트 병원(Tucson, AZ)에서 수득하였으며, 전위 신장 암종 샘플은 챈들러 지역 병원(Chandler, AZ)에서 수득하였다. 모든 조직은 10% 중성 완충 포르말린 중에서 벤타나 메디칼 시스템즈에 도착하였다.
모든 조직은 포장 재료로부터 제거시키고 병리학자가 조사하였다. 조직은 정상으로부터 별개의 종양으로 해부되었고, 블록은 전통적인 조직학적 조사가 수행되었다. 각 임상 샘플을 위한 종양 및 정상 시료는 먼저 조직을 칭량하고 MACS PBS(Miltenyi Biotec; Teterow, Germany)의 1:1 또는 1:1.25(중량:부피) 용액에서 블렌딩하여 기계적으로 해리되었다. 대표 샘플은 4℃의 MACS PBS에 저장하였다.
트리졸(TRIzol)(Thermo-Fisher; Waltham, MA)을 사용해 한가지 변형시킨 표준 프로토콜에 따라 대표 샘플로부터 DNA를 단리하였다. 샘플을 밤새 60℃에서 2 mg/mL 프로테이나아제 K(VWR; Radnor, PA)가 포함된 트리졸에서 항온반응시켰다. 일부 경우에서, FFPE 블록에서 채취된 조직학적 절편을 대표 샘플채취와 현행 샘플채취 방법론을 비교하는데 사용하였다. FFPE 조직 블록을 생성시키는 경우, 헤마톡실린 및 에오신(H&E)에 대해 염색시킨 단일 4μM 절편과 함께 5개의 10 μM 절편을 대장, 폐, 및 전위 신장 시료의 블록으로 부터 잘라내었다. H&E 염색된 슬라이드는 종양 영역을 동정한 병리학자가 고찰하였다. 종양 영역은 밀리섹 메소디섹션(Millisect mesodissection) 장비(Roche; Basel, Switzerland)를 사용하여 나머지 슬라이드로부터 단리하였다. 다음으로 DNA는 하이 퓨어 FFPET DNA 단리 키트(Roche; Basel, Switzerland)를 사용해 단리하였다.
DNA 농도는 콴트-iT 피코그린 dsDNA 키트(Quant-iT PicoGreen dsDNA kit)(Thermo-Fisher; Waltham, MA)를 사용해 결정하였다. DNA 품질은 일루미나 트루섹 FFPE DNA 라이브러리 프렙(Illumina TruSeq FFPE DNA Library Prep) QC 키트(San Diego, CA)를 사용해 평가하였다. 각 샘플의 경우, 400 ng의 DNA를 제조사의 프로토콜에 따라서 트루섹 앰플리콘-암 패널 라이브러리 프렙 키트(Illumina; San Diego, CA)를 위한 주형으로 사용하였다. 증폭 후 PCR 반응물을 퀴아퀵(Qiaquick) PCR 정제 키트(Qiagen; Duesseldorf, Germany)를 사용해 세정하였다. 이후 DNA 농도는 콴트-iT 피코그린 dsDNA 키트(Thermo-Fisher; Waltham, MA)를 사용해 측정하였다. 라이브러리를 동량으로 혼합하여 4 nM 풀링된 라이브러리를 생성시켰다. 다음으로 라이브러리는 동량의 0.2 N NaOH를 사용해 변성시키고, HT1 완충제(Illumina; San Diego, CA) 중 20 pM로 희석하였다. 이어서 각 라이브러리는 시퀀싱 카트리지 상에 적재하기 전에 HT1 완충제 중에 15 pM로 더욱 희석하였다.
시퀀싱은 MiSeq V2 시약 키트(Illumina; San Diego, CA)를 사용하여 600 ㎕의 15 pM 풀링된 라이브러리를 적재하여 MiSeq 장비에서 수행하였다. 페어드 엔드 시퀀싱(Paired end Sequencing)을 제조사의 프로토콜에 따라 수행하였다.
미가공 시퀀싱 데이타는 일루미나의 트루섹 앰플리콘 앱(San Diego, CA)을 사용하고 변형된 CAVA(Clinical Annotation of Variants)(The Wellcome Trust Center for Human Genetics; Oxford, UK) 데이타베이스를 통해 분석하였다. 5% 출현율 이상의 변이체만을 데이타 세트에 포함시켰는데, 5% 돌연변이체 대립유전자 빈도가 NGS 데이타를 보고하는 통상의 컷오프이기 때문이다.
결과 및 고찰
48개 기지 암 유전자의 소형의, 표적화 유전자 패널을 사용해 포르말린 고정된 인간 종양으로부터 유래된 대표 샘플을 심층 서열분석하는데 사용하였다. 암 조직으로부터 돌연변이의 검출에서 상당한 개선을 입증하기 위해, 대표 샘플은 동일한 종양으로부터 채취된 조직학적 단편과 비교하였다. 모든 경우에서, 대표 샘플은 작은, FFPE 블록을 획득하는 현행의 역사적 샘플채취 방법보다 상당히 더욱 종양 돌연변이를 전달하였다.
표 5: 종양 샘플의 목록
표 5는 이 실시예의 NGS 분석을 위해 대표 샘플을 생성시키는데 사용된 임상 샘플을 요약한다. NGS 데이타는 면저 변이체를 동정하기 위해 일루미나의 TRUSeq 앰플리콘 앱을 사용해 분석하였다. 이 프로그램은 5% 출현율 한계치 또는 그 이상으로 존재하는 점 돌연변이 및 결실을 동정하기 위해 호모 사피언스 hg19 기준 게놈과 시퀀싱 판독치를 정렬시킨다. 이러한 초기 데이타 분석이후, 동일한 종양으로부터 채취된 임의의 FFPE 블록에 존재하지 않는 대표 샘플에서 동정된 모든 돌연변이는 대표 샘플에 독특한 것으로 주석을 달았고, 검사된 각 종양에 대해 표 6 내지 11에 열거하였다. 검사된 모든 종양의 경우, 대표 샘플은 동일한 종양으로부터 채취된 FFPE 블록보다 보다 더 많은 돌연변이를 함유하였다.
표 6: 대장 선암종의 대표 샘플 중 독특한 돌연변이
표 7: 전위 신장 암종의 대표 샘플 중 독특한 돌연변이
표 8: 폐 편평상피 세포 암종의 대표 샘플 중 독특한 돌연변이
돌연변이는 대표 샘플에 존재하지 않는 FFPE 블록에 존재하였지만, 대표 샘플과 비교하여 블록에 독특한 매우 소수의 돌연변이가 존재하였다(표 9-12).
표 9: 대장 선암종 중 블록 단독 돌연변이
표 10: 전위 신장 세포 암종 중 블록 단독 돌연변이
표 11: 폐 편평상피 세포 암종의 FFPE 블록에 독특한 돌연변이
표 12: 샘플 유형 당 독특한 돌연변이의 개수
NGS 데이타는 코딩 영역 변화(예를 들어, 아미노산 변화를 초래하는 미스센스 돌연변이)를 야기하는 돌연변이의 수를 결정하기 위해 CAVA 데이타베이스를 사용해 대장 선암종, 전위 신장 세포 암종, 및 폐 편평상피세포 암종에 대해 더욱 분석하였다. 표 13-15는 코딩 변화를 야기하는 돌연변이를 보여주며, 이들 돌연변이가 연구 및/또는 임상적으로 중요할 수 있다는 것을 시사한다.
표 13: 대장 선암종의 대표 샘플 중 병원성 돌연변이
표 14: 전위 신장 암종의 대표 샘플 중 병원성 돌연변이
표 15: 폐 편평상피 세포 암종의 대표 샘플 중 병원성 돌연변이
이들 데이타에 의해, 본 발명자들은 대표 샘플이 임상 병리학 및 종양학에서 현행 샘플채취 기술보다 더 우수하다는 것을 입증하였다. 더욱이, 돌연변이의 출현율은 다양한 것은 종양의 대표 샘플로부터의 NGS 분석이 인간 종양 내에서 클론 및 서브클론 돌연변이를 검출할 수 있게 한다는 것을 입증한다. 이와 함께, 이들 데이타는 인간 절제된 종양 유래의 대표 샘플이 암의 게놈 다양성을 조사하는데 사용될 수 있다는 것을 입증한다.
실시예 12: 파라핀 왁스로 대표 샘플의 포매 조직학적 분석
배경:
기관, 조직, 또는 종양 유래의 대표 샘플을 파라핀 왁스에 포매시켜 조직의 세포 단편을 함유하는 샘플 유형을 생성시켜서, 원래의 장기, 조직 또는 종양에 함유되는 구조 사이의 해부학적 관계를 보존시킬 수 있다. 포매된 대표 샘플로부터 채취된 조직학적 절편는 해부 병리학자에 의해서, 또는 디지탈 현미경 스캐닝 시스템을 사용해 분석할 수 있다. 디지탈 스캐닝 시스템으로부터의 데이타는 바이오마커 사이, 또는 환자 사이의 불균질성 수준을 정량하기 위해 더욱 조사될 수 있다. 더욱이, 스캐닝 시스템으로부터의 출력값을 하기 예시한 바와 같이 불균질성의 수학적 분석에 대한 입력값으로서 사용할 수 있다.
재료 및 방법:
신선한 편도선은 노쓰웨스트 병원(Oro Valley, AZ)에서 획득하였고 도착 시 10% 중성 완충 포르말린에 고정시켰다. 일부 편도선 샘플은 조직 카세트에 전체 편도선을 위치시킨 후, 탈수 및 파라핀 관류하여 FFPE 블록으로 가공하였다. 편도선의 대표 샘플은 앞선 실시예들에 기술된 바와 같이 수행하였다. 인간 폐 및 대장 종양으로부터 유래된 대표 샘플은 실시예 11에 기술된 바와 동일한 샘플이었다. 편도선, 대장 종양, 및 폐 종양 유래의 대표 샘플의 샘플을 현미경 렌즈 종이에 싸서 조직 카세트에 위치시켰다. 조직 카세트를 자일렌에 위치시켰고 조직 프로세서(Leica Biosystems, Wetzlar, Germany)에서 탈수시키고 왁수에 포매시켰다. 4 미크론 절편을 모든 분석되는 샘플로부터 채취하였다.
IHC의 경우, 슬라이드는 벤타나 메디칼 시스템즈 벤치마크 XT 플랫폼(Ventana Medical Systems, Tucson, AZ)을 사용하여 옵티뷰 DAB IHC 프로토콜을 사용해 염색하였다. 항체의 가시화는 옵티뷰 DAB 검출 키트를 사용해 수행하였다. 항체는 포장 삽입 설명서에 따라 항온반응시켰다.
디지탈 이미지 분석을 위해서, 전체 슬라이드 스캔을 아페리오(이미지 분석을 위해, 전체 슬라이드 스캔을 아페리오 상에서 획득함) AT2 스캐너에서 획득하였고 이미지 분석은 아페리오 이미지스코프 알고리즘 '포지티브 픽셀 카운트(Positive Pixel Count) v9'을 사용해 수행하였다.
결과 및 고찰
많은 조직학적 염색의 해석은 조직 구성, 예를 들어 종양 세포로 면역 세포의 배향성의 보존을 요구한다. 그러므로, 개별 세포로 종양의 해리는 모든 조직학적 어세이에서 작용하지 않을 수 있다. 온전한 장기로부터 유래된 기계적으로 해리된 대표 샘플이 왁스에 포매되어, 조직학적으로 절편화되어, 특이적 구성 특성에 대해 평가될 수 있는지 여부를 결정하기 위해서, 전체 편도선을 IKA 튜브 밀에서 기계적으로 해리하였다. 편도선 균질물의 샘플을 탈수시키고, 왁스에 포매하여, 4 미크론 절편을 채취해 유리 슬라이드에 위치시켰고, 벤타나 메치마크 XT 상에서 다양한 바이오마커에 대해 염색하였다.
도 53A 및 53B는 범케라틴 항체로 염색된 온전한 편도선으로부터 채취된 조직학적 절편의 전체 슬라이드 이미지이다. 도 53A는 범케라틴에 대한 DAB로 검출된 정상 편도선의 전통적인 조직학적 절편을 도시한다. 도 53B는 범케라틴에 대한 DAB에 의해 검출된 편도선의 대표 샘플 유래의 절편이다. 편도선의 조직체계 및 구조는 도 53A의 박스에서 더욱 강조하였으며, 여기서 갈색의 상피 조직은 많은 상이한 유형의 림프구를 함유하는 복수의 배중심에 인접한다. 이러한 조직의 조직체계는 균질화된 편도선의 샘플을 파라핀에 포매시켜 절편화시키는 경우에 보존된다(도 54A 및 54B). 도 54A는 CD8에 대한 DAB에 의해 검출된 정상 편도선의 전통적인 조직학적 절편을 도시한다. 도 54B는 CD8에 대한 DAB에 의해 검출된 편도선의 대표 샘플 유래의 절편을 도시한다. CD8 양성 세포의 존재에 대해 염색된 경우, 전체 편도선 및 균질화된 편도선의 절편 둘 모두는 원형 배중심을 둘러싼 CD8 양성 세포를 입증하였다. 이들 데이타는 추가 분석을 위해 해부학적 및 조직의 조직체계를 보존하는 조직학적 샘플을 생성하는 기관, 조직 및 종양 유래의 파라핀 포매된 대표 샘플의 능력을 입증한다.
실시예 9의 대장 및 폐 종야에서 유래된 2가지 대표 샘플을 조직학적 분석을 위한 파라핀 왁스에 포매하였다. ?湛? 4 미크론 절편을 절단하여 복수의 종양 및 면역 특이적 바이오마커(Met, Alk, bRaf, EGFR, PD-L1, CD8, 및 CK 8/18에 대해 염색하였다. 슬라이드 판독치 및 강도 점수는 해부 병리학자에 의해 분석되었다. 현행 TNM 병기화 시스템을 모방하기 위해 채취된 샘플로 만들어진 표준 FFPE 블록을 이 분석에 포함시켰다(표 16의 블록). 표 16에서 볼 수 있듯이, 해부 병리학자는 FFPE 블록 및 대표 샘플 둘 모두에 대한 염색을 판독하고 해석할 수 있다.
표 16. IHC의 병리학자 점수
병리학자에 의한 대표 샘플의 해석은 전체 슬라이드에 걸쳐 신호 강도 및 염색의 불균질성을 해결한 것으로 보이지 않았다. 대표 샘플로부터 IHC 염색의 불균질성에 관한 수학적 표시를 생성시키기 위해서, IHC 염색된 슬라이드를 디지탈 슬라이드 스캐너를 사용해 분석하였다. 전체 슬라이드 스캐닝 후, DAB 강도는 아페리오 이미지스코프 알고리즘 '포지티브 픽셀 카운트 v9'를 사용해 정량하였다. 모든 블록 및 대표 샘플의 경우, CD8, PD-L1, EGFR, 및 MET 신호 강도는 종양 함량에 대해, 바이오마커 신호의 불균질성을 수학적으로 표시하기 위해 CK 8/18의 신호 강도로 나누었다. 표 16 내지 23에 표시된 바와 같이, 대장 및 폐 종양으로부터의 조직학적 블록에 대한 CK 8/18에 관한 CD8의 평균이 대표 샘플의 것과 동일하지만,PD-L1, EGFR, 및 MET으로 염색된 샘플 사이의 상대적 신호 강도의 평균에는 상당한 차이가 존재한다. 이들 데이타는 대표 샘플의 샘플로부터 만든 조직학적 절편의 IHC 염색이 바이오마커 신호의 불균질성을 보다 잘 대표하고, 서로 간에 블록이 상당히 다양하므로 IHC 결과의 변동을 감소시킨다는 것을 시사한다.
표 17. 대장 샘플로부터 CD8 IHC의 디지털 이미지화 및 분석
표 18. 대장 샘플로부터 PD-L1 IHC의 디지털 이미지화 및 분석
표 19. 대장 샘플로부터 EGFR IHC의 디지털 이미지화 및 분석
표 20. 대장 샘플로부터 MET IHC의 디지털 이미지화 및 분석
표 21. 폐 샘플로부터 CD8 IHC의 디지털 이미지화 및 분석
표 22. 폐 샘플로부터 PD-L1 IHC의 디지털 이미지화 및 분석
표 23. 폐 샘플로부터 EGFR IHC의 디지털 이미지화 및 분석
표 24. 폐 샘플로부터 MET IHC의 디지털 이미지화 및 분석
본 명세서에 인용된 모든 특허 및 특허 이외의 참조문헌은 그들 전체로 참조로 편입된다.
본 공개가 상기 실시태양과 함께 설명되었지만, 전술한 설명 및 실시예는 예시를 위한 것이며 본 공개의 범주를 한정하는 것이 아님을 이해한다. 본 공개의 범주 내의 다른 양상, 장점 및 수식이 본 공개가 속하는 분야의 당업자에게 자명할 것이다.
본 명세서에 예시적으로 기술된 내용은 본 명세서에 특별히 개시되지 않은, 임의의 성분 또는 성분들, 제한 또는 제한들의 부재 하에서 적합하게 실행될 수 있다. 따라서, 예를 들어, 용어 "포함하는", "포괄하는", "함유하는" 등은 광범위하게 제한없이 이해되어야 한다. 부가적으로, 본 명세서에 적용되는 용어 및 표현은 제한이 아닌 설명에 관해 사용되었으며, 도시되고 설명된 특징의 임의 균등물 또는 이의 일부분을 배제하는 이러한 용어 및 표현의 사용을 의도하는 것이 아니며, 청구하는 본 공개의 범주 내에서 다양한 수식이 가능하다는 것을 인식할 것이다.
따라서, 본 공개가 바람직한 실시태양 및 선택적 특징에 의해 특별히 개시되었지만, 본 명세서에 개시된 본 명세서에 포함된 개시의 수식, 개선 및 변이는 당업자에게 의지되며, 그러한 수식, 개선 및 변이는 본 명세서의 범주 내로 고려된다는 것을 이해해야 한다. 여기 제공된 재료, 방법, 및 예는 바람직한 실시태양을 의미하며, 예시적인 것이고, 본 명세서의 범주를 한정하려는 것이 아니다.
본 공개는 광범위하고 총칭적으로 본 명세서에 기술되었다. 포괄적인 본 개시 내에 속하는 협의의 종 및 아속 그룹 각각은 또한 본 개시의 일부를 형성한다. 이는 삭제된 재료가 특히 본 명세서에서 언급되건 되지 않건 무관하게, 속에서 임의 주제를 제거한다는 부정적 한정 또는 단서가 있는 한 본 공개의 일반 설명을 포함한다.
또한, 본 공개의 특성 또는 양상이 마쿠쉬 그룹으로 기술된 경우, 당업자는 본 공개가 또한 임의의 개별 구성원 또는 마쿠쉬 그룹의 구성원의 하위군으로 설명된다는 것을 인식할 것이다.
다른 실시태양
1. 분석을 위한 대표 샘플의 제조 방법으로서,
a. 적어도 하나의 대상체로부터 수술적 절제 조직 샘플을 수득하는 단계; 및,
b. 수술적 절제 조직 샘플을 균질화하여 균질화된 샘플을 수득하는 단계
를 포함하는 제조 방법.
2. 실시태양 1의 방법으로서, 수술적 절제 조직 샘플의 적어도 일부를 고정하는 단계를 더 포함하는 방법.
3. 실시태양 1의 방법으로서, 수술적 절제 샘플의 제1 부분을 가공하는 단계 및 하나 이상의 고정되고, 포매된 조직 블록을 생성하는 단계를 더 포함하는 방법.
4. 실시태양 3의 방법으로서, 나머지 수술적 조직 절제 샘플의 제 2 부분을 균질화하는 단계를 더 포함하는 방법.
5. 실시태양 3 또는 4의 방법으로서, 하나 이상의 고정되고, 포매된 조직 블록의 적어도 일부를 현미경절편제작법에 의해 가공하여 형태학적 분석을 위한 하나 이상의 조직 박편을 생성하는 단계를 더 포함하는 방법.
6. 실시태양 5의 방법으로서, 하나 이상의 고정되고, 포매된 조직 블록 중 적어도 하나를 탈파라핀화시키는 단계 및 하나 이상의 탈파라핀화된 고정되고, 포매된 조직 블록으로부터 조직을 균질화하는 단계를 더 포함하는 방법.
7. 실시태양 1의 방법으로서, 수술적 절제 조직 샘플은 조직의 하나 이상의 별개의 조각을 포함하는 방법.
8. 실시태양 7의 방법으로서, 조직의 하나 이상의 별개의 조각은 수술절 절제 샘플을 수득하기 위해 대상체로부터 절제된 하나 이상의 원발성 고형 종양 조직 덩어리의 적어도 일부를 포함하는 방법.
9. 실시태양 8의 방법으로서, 조직의 하나 이상의 별개의 조각은 대상체로부터 절제된 하나 이상의 림프절의 적어도 일부를 포함하는 방법.
10. 실시태양 7, 8 또는 9의 방법으로서, 조직의 별개의 조각의 적어도 일부를 별개로 균질화하여 별개의 균질화된 샘플을 산출하는 단계를 더 포함하는 방법.
11. 실시태양 1의 방법으로서, 수술적 절제 조직 샘플은 단일 조직 덩어리를 포함하는 방법.
12. 실시태양 11의 방법으로서, 단일 조직 덩어리는 단일 조직 덩어리의 둘 이상의 조각으로 더 나뉘는 방법.
13. 실시태양 12의 방법으로서, 단일 조직 덩어리의 둘 이상의 조각 중 적어도 하나를 균질화하는 단계 및 나머지 단일 조직 덩어리의 둘 이상의 조각의 적어도 하나를 보존하는 단계를 더 포함하는 방법.
14. 실시태양 1의 방법으로서, 균질화는 물리적 분리를 포함하는 방법.
15. 실시태양 14의 방법으로서, 물리적 분리는 자르기, 썰기, 또는 갈기에 의한 것인 방법.
16. 실시태양 1의 방법으로서, 균질화는 기계적 해리를 포함하는 방법.
17. 실시태양 16의 방법으로서, 기계적 해리는 블렌딩 또는 즙내기에 의한 것인 방법.
18. 실시태양 1의 방법으로서, 균질화는 생화학적 해리에 의한 것인 방법.
19. 실시태양 18의 방법으로서, 생화학적 해리는 프로테아제에 의한 것인 방법.
20. 실시태양 1의 방법으로서, 균질물의 적어도 일부로부터 하나 이상의 생체분자를 정제하는 단계를 더 포함하는 방법.
21. 실시태양 20의 방법으로서, 하나 이상의 생체분자는 DNA, RNA, 단백질, 지질, 및 대사물로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
22. 실시태양 21의 방법으로서, 하나 이상의 생체분자를 분석하는 단계를 더 포함하는 방법.
23. 실시태양 22의 방법으로서, 하나 이상의 생체분자의 분석은 PCR, 질량 분광법, 차세대 시퀀싱, 또는 ELISA에 의한 것인 방법.
24. 실시태양 22의 방법으로서, 분석은 적어도 하나의 데이타세트를 생성하는 방법.
25. 실시태양 1의 방법으로서, 균질화된 샘플의 적어도 일부를 파라핀에 포매시키는 단계를 더 포함하는 방법.
26. 실시태양 25의 방법으로서, 파라핀 포매된 균질화된 샘플의 하나 이상의 박편을 제조하는 단계를 더 포함하는 방법.
27. 실시태양 26의 방법으로서, 파라핀 포매된 균질화된 샘플의 박편에 대해 조직학적 분석을 수행하는 단계를 더 포함하는 방법.
28. 실시태양 27의 방법으로서, 조직학적 분석은 H&E 염색, IHC 염색, ISH 염색, 및 FISH 염색에 의한 것인 방법.
29. 실시태양 27의 방법으로서, 파라핀 포매된 균질화된 샘플의 박편에 대한 조직학적 분석은 인간에 의해 해석되는 방법.
30. 실시태양 27의 방법으로서, 파라핀 포매된 균질화된 샘플의 박편에 대한 조직학적 분석은 자동화 디바이스에 의해 정량화되는 방법.
31. 실시태양 29의 방법으로서, 해석은 적어도 하나의 데이타세트를 생성시키는 방법.
32. 실시태양 30의 방법으로서, 정량화는 적어도 하나의 데이타세트를 생성시키는 방법.
33. 실시태양 1의 방법으로서, 세포 단편을 생성시키기 위해 균질물의 적어도 일부를 추가로 가공하는 단계를 더 포함하는 방법.
34. 실시태양 32의 방법으로서, 균질물의 적어도 일부의 가공은 물리적, 기계적, 화학적, 또는 효소적 방법에 의한 것인 방법.
35. 실시태양 33의 방법으로서, 세포 단편은 핵, 세포막, 및 세포 소기관으로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
36. 실시태양 33의 방법으로서, 세포 단편의 적어도 일부는 적어도 하나의 유리 슬라이드에 고정되는 방법.
37. 실시태양 36의 방법으로서, 적어도 하나의 유리 슬라이드에 고정된 세포 단편의 적어도 일부는 조직학적 분석이 수행되는 방법.
38. 실시태양 37의 방법으로서, 조직학적 분석은 H&E 염색, IHC 염색, ISH 염색, 또는 FISH 염색에 의한 것인 방법.
39. 실시태양 36의 방법으로서, 적어도 하나의 유리 슬라이드에 고정된 세포 단편의 적어도 일부에 대한 조직학적 분석은 인간에 의해 해석되는 방법.
40. 실시태양 36의 방법으로서, 적어도 하나의 유리 슬라이드에 고정된 세포 단편의 적어도 일부에 대한 조직학적 분석은 자동화 디바이스에 의해 정량화되는 방법.
41. 실시태양 39의 방법으로서, 해석은 적어도 하나의 데이타세트를 생성시키는 방법.
42. 실시태양 40의 방법으로서, 정량화는 적어도 하나의 데이타세트를 생성시키는 방법.
43. 실시태양 33의 방법으로서, 세포 단편의 적어도 일부는 유세포 분석, FACS, 또는 입자 분석기에 의해 분석되는 방법.
44. 실시태양 43의 방법으로서, 분석은 데이타 세트를 생성시키는 방법.
45. 실시태양 33의 방법으로서, 세포 단편의 적어도 일부로부터 적어도 하나의 세포 단편을 정제하는 단계를 더 포함하는 방법.
46. 실시태양 45의 방법으로서, 정제는 FACS, 친화도 정제, 크기 배제 분별 원심분리, 여과, 또는 전기영동에 의한 것인 방법.
47. 실시태양 45의 방법으로서, 세포 단편의 적어도 일부로부터 정제된 적어도 하나의 세포 단편으로부터 생체분자를 단리하는 단계를 더 포함하는 방법.
48. 실시태양 47의 방법으로서, 세포 단편의 적어도 일부로부터 정제된 적어도 하나의 세포 단편으로부터 생체분자를 분석하는 단계를 더 포함하는 방법.
49. 실시태양 48의 방법으로서, 분석은 PCR, 질량 분광법, 차세대 시퀀싱, 또는 ELISA를 포함하는 방법.
50. 실시태양 49의 방법으로서, 분석은 적어도 하나의 데이타세트를 생성시키는 방법.
51. 실시태양 1의 방법으로서, 적어도 하나의 해리된 세포를 생성시키기 위해 균질물의 적어도 일부를 추가로 가공하는 단계를 더 포함하는 방법.
52. 실시태양 51의 방법으로서, 균질물의 적어도 일부의 가공은 물리적, 기계적, 화학적, 또는 효소적인 방법.
53. 실시태양 51의 방법으로서, 적어도 하나의 해리된 세포는 정상 세포, 암 세포, 또는 세균 세포인 방법.
54. 실시태양 51의 방법으로서, 적어도 하나의 해리된 세포는 적어도 하나의 유리 슬라이드에 고정되는 방법.
55. 실시태양 54의 방법으로서, 적어도 하나의 유리 슬라이드에 고정된 적어도 하나의 해리된 세포는 조직학적 분석이 수행되는 방법.
56. 실시태양 55의 방법으로서, 조직학적 분석은 H&E 염색, IHC 염색, ISH 염색, 또는 FISH 염색인 방법.
57. 실시태양 55의 방법으로서, 적어도 하나의 유리 슬라이드에 고정된 적어도 하나의 해리된 세포에 대한 조직학적 분석은 인간에 의해 해석되는 방법.
58. 실시태양 55의 방법으로서, 적어도 하나의 유리 슬라이드에 고정된 적어도 하나의 해리된 세포에 대한 조직학적 분석은 자동화 디바이스에 의해 정량화되는 방법.
59. 실시태양 57의 방법으로서, 해석은 적어도 하나의 데이타세트를 생성시키는 방법.
60. 실시태양 58의 방법으로서, 정량화는 적어도 하나의 데이타세트를 생성시키는 방법.
61. 실시태양 51의 방법으로서, 적어도 하나의 해리된 세포는 유세포 분석, FACS, 또는 입자 분석기에 의해 분석되는 방법.
62. 실시태양 61의 방법으로서, 분석은 데이타 세트를 생성시키는 방법.
63. 실시태양 51의 방법으로서, 적어도 하나의 해리된 세포로부터 적어도 하나의 세포를 정제하는 단계를 더 포함하는 방법.
64. 실시태양 63의 방법으로서, 정제는 FACS, 친화도 정제, 크기 배제 분별 원심분리, 여과, 또는 전기영동인 방법.
65. 실시태양 63의 방법으로서, 적어도 하나의 해리된 세포로부터 정제된 적어도 하나의 세포로부터 생체분자를 단리하는 단계를 더 포함하는 방법.
66. 실시태양 65의 방법으로서, 적어도 하나의 해리된 세포로부터 정제된 적어도 하나의 세포로부터 생체분자를 분석하는 단계를 더 포함하는 방법.
67. 실시태양 66의 방법으로서, 분석은 PCR, 질량 분광법, 차세대 시퀀싱, 또는 ELISA인 방법.
68. 실시태양 67의 방법으로서, 분석은 적어도 하나의 데이타세트를 생성시키는 방법.
69. 실시태양 63의 방법으로서, 적어도 하나의 해리된 세포로부터 정제된 적어도 하나의 세포는 적어도 하나의 유리 슬라이드에 고정된 방법.
70. 실시태양 69의 방법으로서, 적어도 하나의 유리 슬라이드에 고정된 적어도 하나의 해리된 세포로부터 정제된 적어도 하나의 세포는 조직학적 분석이 수행되는 방법.
71. 실시태양 70의 방법으로서, 조직학적 분석은 H&E 염색, IHC 염색, ISH 염색, 또는 FISH 염색인 방법.
72. 실시태양 70의 방법으로서, 적어도 하나의 유리 슬라이드에 고정된 적어도 하나의 해리된 세포로부터 정제된 적어도 하나의 세포에 대한 조직학적 분석은 인간에 의해 해석되는 방법.
73. 실시태양 70의 방법으로서, 적어도 하나의 유리 슬라이드에 고정된 적어도 하나의 해리된 세포로부터 정제된 적어도 하나의 세포에 대한 조직학적 분석은 자동화 디바이스에 의해 정량화되는 방법.
74. 실시태양 72의 방법으로서, 해석은 적어도 하나의 데이타세트를 생성시키는 방법.
75. 실시태양 73의 방법으로서, 정량화는 적어도 하나의 데이타세트를 생성시키는 방법.
76. 실시태양 24, 31, 32, 41, 42, 44, 50, 59, 60, 62, 68, 74 및 75 중 어느 하나의 방법으로서, 적어도 하나의 대상체로부터 적어도 하나의 데이타세트를 분석하는 단계를 더 포함하는 방법.
77. 제76항의 방법으로서, 분석은 바이오마커 다양성 또는 표현형 다양성 데이타 세트의 결정을 포함하는 방법.
78. 실시태양 76의 방법으로서, 분석은 적어도 하나의 별개의 바이오마커 또는 표현형의 출현율의 결정을 포함하는 방법.
79. 실시태양 76의 방법으로서, 분석은 적어도 하나의 임상적 판단의 결정을 포함하는 방법.
80. 실시태양 79의 방법으로서, 임상적 판단은 질환 예후의 결정, 질환 재발의 예측, 질환의 요법의 표적 예측, 임상 시험의 대상체의 포함, 또는 적어도 하나의 대상체에 대한 치료적 처리 전략인 방법.

Claims (17)

  1. 인간 대상체에서 암 진단을 위한 분석용 대표 샘플을 제조하는 시험관내 방법으로서,
    a. 적어도 하나의 대상체로부터 수술적 절제 조직 샘플을 제공하는 단계;
    b. 수술적 절제 조직 샘플을 기계적 전단을 위한 디바이스를 사용하여 기계적 해리시킴으로써 복수의 세포 클러스터를 수득하는 단계; 및
    c. 복수의 세포 클러스터를 분석하는 단계
    를 포함하고,
    상기 분석은,
    수득된 복수의 세포 클러스터를 대표 샘플로서 제공하는 단계,
    (i) 대표 샘플; 또는 (ii) 특정 바이오마커 또는 바이오마커의 조합을 발현하는 대표 샘플의 일부분 또는 분획에서
    (i) 샘플링된 세포의 비율, (ii) 종양 세포의 비율, (iii) 종양 줄기 세포, 및/또는 (iv) 종양 서브클론의 상대적 빈도 또는 비율을 검출하는 단계
    를 포함하는, 방법.
  2. 제1항에 있어서, 수술적 절제 조직 샘플은 조직의 하나 이상의 별개의 조각을 포함하는 방법.
  3. 제2항에 있어서, 조직의 하나 이상의 별개의 조각은 수술적 절제 샘플을 수득하기 위해 대상체로부터 절제된 하나 이상의 원발성 고형 종양 조직 덩어리의 적어도 일부를 포함하는 방법.
  4. 제3항에 있어서, 조직의 하나 이상의 별개의 조각은 대상체로부터 절제된 하나 이상의 림프절의 적어도 일부를 포함하는 방법.
  5. 제1항에 있어서, 수술적 절제 조직 샘플의 적어도 일부를 고정하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  6. 제1항에 있어서, 수술적 절제 샘플의 제1 부분을 가공하는 단계 및 하나 이상의 고정되고, 포매된 조직 블록을 생성시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  7. 제6항에 있어서, 하나 이상의 고정되고, 포매된 조직 블록의 적어도 일부를 현미경절편제작법에 의해 가공하여 형태학적 분석을 위한 하나 이상의 조직 박편을 생성하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  8. 제7항에 있어서, 하나 이상의 고정되고, 포매된 조직 블록의 적어도 하나를 탈파라핀화하는 단계 및 하나 이상의 탈파라핀화된 고정되고, 포매된 조직 블록으로부터 조직을 균질화하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  9. 제6항에 있어서, 나머지 수술적 조직 절제 샘플의 제2 부분으로부터 복수의 세포 클러스터를 수득하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  10. 제1항에 있어서, 수술적 절제 조직 샘플은 단일 조직 덩어리를 포함하는 방법.
  11. 제10항에 있어서, 단일 조직 덩어리는 단일 조직 덩어리의 둘 이상의 조각으로 더 나뉘는 방법.
  12. 제11항에 있어서, 단일 조직 덩어리의 둘 이상의 조각 중 적어도 하나를 균질화하는 단계 및 나머지 단일 조직 덩어리의 둘 이상의 조각 중 적어도 하나를 보존하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  13. 제1항에 있어서, 균질물의 적어도 일부로부터 하나 이상의 생체 분자를 정제하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  14. 제13항에 있어서, 하나 이상의 생체분자는 DNA, RNA, 단백질, 지질, 및 대사물로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
  15. 제14항에 있어서, 하나 이상의 생체분자를 분석하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  16. 제15항에 있어서, 하나 이상의 생체분자의 분석은 PCR, 질량 분광법, 차세대 시퀀싱, 또는 ELISA에 의한 것인 방법.
  17. 제16항에 있어서, 분석은 적어도 하나의 데이타세트를 생성하는 방법.
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