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CN116769975B - Hpv检测引物组、试剂盒及其应用 - Google Patents

Hpv检测引物组、试剂盒及其应用 Download PDF

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CN116769975B CN202311020290.1A CN202311020290A CN116769975B CN 116769975 B CN116769975 B CN 116769975B CN 202311020290 A CN202311020290 A CN 202311020290A CN 116769975 B CN116769975 B CN 116769975B
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Abstract

本发明提供了HPV检测引物组、试剂盒及其应用，属于HPV病毒检测技术领域。本发明提供的HPV检测引物组包括如SEQ ID NO.1~27所示的引物，利用该引物组可对HPV16、HPV18、HPV33、HPV52、HPV58进行检测，且灵敏度高；本发明提供的含有该引物组的试剂盒，使用该试剂盒可实现对HPV的居家检测，便于及时进行干预治疗和控制病情，可在35min内完成检测反应，结果判断简便，仪器设备要求低，适用于基层医疗单位，具有发展为居家自测的潜力，同时保持了检测的低成本化，有助于宫颈癌的早筛早诊。

Description

HPV检测引物组、试剂盒及其应用
技术领域
本发明涉及HPV病毒检测技术领域，尤其涉及HPV检测引物组、试剂盒及其应用。
背景技术
宫颈癌（Cevical Cancer，CC）是女性最常见的癌症之一，而人乳头瘤病毒（Humanpapillomavirus，HPV）的持续感染是宫颈癌的主要危险因素之一。HPV是一种无包膜双链环状DNA病毒，属于乳头瘤病毒科，有核心单拷贝的病毒基因组DNA及病毒蛋白衣壳构成。目前发现的HPV约有200种型别，分为高危型和低危型，其中高危型HPV（high-risk HPV，HR-HPV）感染被认为是宫颈癌发病机制中最主要的因素。全世界传播的HR-HPV包括HPV16、18、26、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66、68、70、73、82。
宫颈癌发病率和致死率较高，究其原因，是宫颈癌隐匿性较高，其通常在晚期才被发现，据统计全世界仍有近50%的患者诊断为局部晚期，但宫颈癌预防性筛查在发展中国家并未普及，造成宫颈癌发病率和致死率居高不下。WHO于2021年发布的宫颈癌筛查指南推荐HPV-DNA检测作为宫颈癌筛查的首选筛查方法。因此，发展基于HPV-DNA的宫颈癌快捷筛查方法，特别是针对HR-HPV的识别，将宫颈病变的高危人群筛查出来，有助于个性化早筛早诊，对于提示宫颈癌风险，从而降低宫颈癌发病率和致死率具有重要意义。
传统的HPV的检测手段，如细胞学检测和镜检，存在场所（专业实验室）和人员（专业检测人员）的限制，且检测所需时间较长，不利于HPV筛查的推广。
现有技术中针对HPV的检测主要使用荧光定量PCR技术，其依赖于特定荧光仪器和专业人员的操作，不利于检测的推广和便捷化。并且现有产品存在灵敏度和特异性不高的问题，如专利CN112575123A，其检测灵敏度约1.25E+05 copies/mL，也可能会受其他病原体的干扰，在实际中可能导致出现漏检或假阳性现象。因此，HPV病毒检测的准确程度还需改进；另外，中国专利CN114107560A公开了一种使用LAMP技术进行HPV检测的引物组合及试剂盒，但其分别使用荧光法和染色体显色法进行检测，仍存在仪器要求高（荧光法）、在低浓度下判读困难及易出现假阴性（染色体显色法）的缺陷。
发明内容
本发明的目的在于提供HPV检测引物组，利用该引物组可对HPV进行检测，且灵敏度高；同时，本发明提供了含有该引物组的试剂盒，使用该试剂盒可实现对HPV的居家检测。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了HPV检测引物组，所述HPV检测引物组包括如下引物：
核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的引物HPV16 F3；
核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的引物HPV16 FIP；
核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的引物HPV16 LF；
核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示的引物HPV16 BIP；
核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示的引物HPV16 LB；
核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示的引物HPV16 B3；
和/或，所述HPV检测引物组包括如下引物：
核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示的引物HPV18 F3；
核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示的引物HPV18 FIP；
核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示的引物HPV18 LF；
核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示的引物HPV18 BIP；
核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示的引物HPV18 LB；
核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示的引物HPV18 B3；
和/或，所述HPV检测引物组包括如下引物：
核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示的引物HPV33 F3；
核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示的引物HPV33 FIP；
核苷酸序列如SEQ ID NO.15所示的引物HPV33 LF；
核苷酸序列如SEQ ID NO.16所示的引物HPV33 BIP；
核苷酸序列如SEQ ID NO.17所示的引物HPV33 B3；
和/或，所述HPV检测引物组包括如下引物：
核苷酸序列如SEQ ID NO.18所示的引物HPV52 F3；
核苷酸序列如SEQ ID NO.19所示的引物HPV52 FIP；
核苷酸序列如SEQ ID NO.20所示的引物HPV52 BIP；
核苷酸序列如SEQ ID NO.21所示的引物HPV52 LB；
核苷酸序列如SEQ ID NO.22所示的引物HPV52 B3；
和/或，所述HPV检测引物组包括如下引物：
核苷酸序列如SEQ ID NO.23所示的引物HPV58 F3；
核苷酸序列如SEQ ID NO.24所示的引物HPV58 FIP；
核苷酸序列如SEQ ID NO.25所示的引物HPV58 BIP；
核苷酸序列如SEQ ID NO.26所示的引物HPV58 LB；
核苷酸序列如SEQ ID NO.27所示的引物HPV58 B3；
和/或，所述HPV检测引物组包括如下引物：
具有SEQ ID NO.1~27任意所示的核苷酸序列经删除或增加一个或几个核苷酸，得到与所述核苷酸序列具有相同功能的核苷酸序列的衍生引物；
和/或，所述HPV检测引物组包括如下引物：
具有SEQ ID NO.1~27任意所示的核苷酸序列经核苷酸取代或修饰，得到与所述核苷酸序列具有相同功能的核苷酸序列的衍生引物；
和/或，所述HPV检测引物组包括如下引物：
与SEQ ID NO.1~27任意所示的核苷酸序列具有80%以上同源性或与与SEQ IDNO.1~27任意所示的核苷酸序列功能相似的衍生引物；
和/或，所述HPV检测引物组包括如下引物：
与SEQ ID NO.1~27任意所示的核苷酸序列互补的引物。
优选的，所述HPV16 BIP引物的5’端标记有荧光基团；
所述HPV16 LF引物的5’端标记有生物素；
所述HPV18 FIP引物的5’端标记有荧光基团；
所述HPV18 LF引物的5’端标记有生物素；
所述引物HPV33 LF的5’端标记有荧光基团；
所述引物HPV33 BIP的5’端标记有生物素；
所述引物HPV52 BIP的5’端标记有荧光基团；
所述引物HPV52 LB的5’端标记有生物素；
所述引物HPV58 BIP的5’端标记有荧光基团；
所述引物HPV58 LB的5’端标记有生物素。
优选的，所述荧光基团为FAM或FITC。
本发明还提供了上述HPV检测引物组在制备检测试剂盒中的应用。
优选的，所述HPV的分型包括HPV16、HPV18、HPV33、HPV52和HPV58中的一种或几种。
本发明还提供了一种检测HPV的试剂盒，包括上述HPV检测引物组和检测试剂。
优选的，所述试剂盒中引物HPV16 FIP、引物HPV16 BIP、引物HPV18 FIP、引物HPV18 BIP、引物HPV33 FIP、引物HPV33 BIP、引物HPV52 FIP、引物HPV52 BIP、引物HPV58FIP或引物HPV58 BIP的终浓度独立的为1.6~2.4μmol/L。
优选的，所述检测试剂包括等温扩增缓冲液、dNTP和Bst DNA聚合酶。
优选的，所述等温扩增缓冲液包括Tris-HCl、(NH4)2SO4、KCl、MgSO4和Tween-20。
优选的，所述试剂盒还包括胶体金免疫层析试纸条，所述胶体金免疫层析试纸条包括底板、样品垫、判读区和吸水垫；所述样品垫、判读区和吸水垫设置于底板上；所述判读区上设置检测线和质控线；
所述检测线中包被有FAM抗体，FAM抗体的浓度为0.05~0.15mg/mL；
所述质控线中包被有biotin-BSA溶液，所述biotin-BSA溶液的浓度为1.5~3mg/mL。
本发明的技术效果和优点：
1、本发明组合灵敏度高，检测限低至500 copies/mL，有助于HPV16、HPV18、HPV33、HPV52、HPV58病毒感染的早筛早诊，便于及时进行干预治疗和控制病情；
2、本发明组合使用恒温扩增-核酸胶体金层析法，可在35min内完成检测反应，结果判断简便；
3、本发明组合使用恒温扩增-核酸胶体金层析法，仪器设备要求低，适用于基层医疗单位，具有发展为居家自测的潜力，同时保持了检测的低成本化，有助于宫颈癌的早筛早诊。
4、LAMP技术在配合相应的样本核酸释放剂时，可适用于居家自测，在降低检测费用的同时也有效提高了检测的便利性，对于HPV的早筛早诊、降低宫颈癌的发病率和致死率具有重要意义。
附图说明
图1为HPV16检测试剂盒的一致性测试结果；
图2为HPV18检测试剂盒的一致性测试结果；
图3为HPV33检测试剂盒的一致性测试结果；
图4为HPV52检测试剂盒的一致性测试结果；
图5为HPV58检测试剂盒的一致性测试结果；
图6为HPV16检测试剂盒的特异性测试结果；
图7为HPV18检测试剂盒的特异性测试结果；
图8为HPV33检测试剂盒的特异性测试结果；
图9为HPV52检测试剂盒的特异性测试结果；
图10为HPV58检测试剂盒的特异性测试结果。
具体实施方式
本发明提供了HPV检测引物组，所述HPV检测引物组包括如下引物：
核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的引物HPV16 F3；核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的引物HPV16 FIP；核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的引物HPV16 LF；核苷酸序列如SEQ IDNO.4所示的引物HPV16 BIP；核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示的引物HPV16 LB；核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示的引物HPV16 B3，所述引物组的靶标为L2基因CDS区域的第138-353位核酸序列；
和/或，所述HPV检测引物组包括如下引物：
核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示的引物HPV18 F3；核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示的引物HPV18 FIP；核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示的引物HPV18 LF；核苷酸序列如SEQ IDNO.10所示的引物HPV18 BIP；核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示的引物HPV18 LB；核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示的引物HPV18 B3，所述引物组的靶标为L1基因CDS区域的第568-769位核酸序列；
和/或，所述HPV检测引物组包括如下引物：
核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示的引物HPV33 F3；核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示的引物HPV33 FIP；核苷酸序列如SEQ ID NO.15所示的引物HPV33 LF；核苷酸序列如SEQID NO.16所示的引物HPV33 BIP；核苷酸序列如SEQ ID NO.17所示的引物HPV33 B3，所述引物组的靶标为L2基因上CDS区域中第441-634位核酸序列；
和/或，所述HPV检测引物组包括如下引物：
核苷酸序列如SEQ ID NO.18所示的引物HPV52 F3；核苷酸序列如SEQ ID NO.19所示的引物HPV52 FIP；核苷酸序列如SEQ ID NO.20所示的引物HPV52 BIP；核苷酸序列如SEQID NO.21所示的引物HPV52 LB；核苷酸序列如SEQ ID NO.22所示的引物HPV52 B3，所述引物组的靶标为L2基因上CDS区域中第252-462位核酸序列；
和/或，所述HPV检测引物组包括如下引物：
核苷酸序列如SEQ ID NO.23所示的引物HPV58 F3；核苷酸序列如SEQ ID NO.24所示的引物HPV58 FIP；核苷酸序列如SEQ ID NO.25所示的引物HPV58 BIP；核苷酸序列如SEQID NO.26所示的引物HPV58 LB；核苷酸序列如SEQ ID NO.27所示的引物HPV58 B3，所述引物组的靶标为L2基因上CDS区域中第1058-1268位核酸序列；
和/或，所述HPV检测引物组包括如下引物：具有SEQ ID NO.1~27任意所示的核苷酸序列经删除或增加一个或几个核苷酸，得到与所述核苷酸序列具有相同功能的核苷酸序列的衍生引物；
和/或，所述HPV检测引物组包括如下引物：具有SEQ ID NO.1~27任意所示的核苷酸序列经核苷酸取代或修饰，得到与所述核苷酸序列具有相同功能的核苷酸序列的衍生引物；
和/或，所述HPV检测引物组包括如下引物：与SEQ ID NO.1~27任意所示的核苷酸序列具有80%以上同源性或与与SEQ ID NO.1~27任意所示的核苷酸序列功能相似的衍生引物；
和/或，所述HPV检测引物组包括如下引物：与SEQ ID NO.1~27任意所示的核苷酸序列互补的引物。
所述HPV16 BIP引物的5’端优选标记有荧光基团；所述HPV16 LF引物的5’端优选标记有生物素；所述HPV18 FIP引物的5’端优选标记有荧光基团；所述HPV18 LF引物的5’端优选标记有生物素；所述引物HPV33 LF的5’端优选标记有荧光基团；所述引物HPV33 BIP的5’端优选标记有生物素；所述引物HPV52 BIP的5’端优选标记有荧光基团；所述引物HPV52LB的5’端优选标记有生物素；所述引物HPV58 BIP的5’端优选标记有荧光基团；所述引物HPV58 LB的5’端优选标记有生物素；所述荧光基团优选为FAM或FITC。
本发明还提供了上述HPV检测引物组在制备检测试剂盒中的应用，所述HPV的分型优选包括HPV16、HPV18、HPV33、HPV52和/或HPV58。
本发明还提供了一种检测HPV的试剂盒，包括上述HPV检测引物组和检测试剂，所述试剂盒中引物HPV16 FIP、引物HPV16 BIP、引物HPV18 FIP、引物HPV18 BIP、引物HPV33FIP、引物HPV33 BIP、引物HPV52 FIP、引物HPV52 BIP、引物HPV58 FIP或引物HPV58 BIP的终浓度独立的优选为1.6~2.4μmol/L。
在本发明中，所述检测试剂优选包括等温扩增缓冲液、dNTP和Bst DNA聚合酶，所述等温扩增缓冲液优选包括Tris-HCl、(NH4)2SO4、KCl、MgSO4和Tween-20，所述试剂盒中Tris-HCl的浓度优选为15~18mmol/L，进一步优选为16~17mmol/L；所述试剂盒中(NH4)2SO4的终浓度优选为7~9mmol/L，进一步优选为7.5~8.5mmol/L，所述试剂盒中KCl的终浓度优选为11~13mmol/L，进一步优选为11.5~12.5mmol/L，所述试剂盒中MgSO4的终浓度优选为1~3mmol/L，进一步优选为1.5~2.5mmol/L，所述试剂盒中Tween-20的终浓度优选为0.06~0.1%，进一步优选为0.07~0.09%，所述试剂盒中dNTP的终浓度优选为0.55~0.65mmol/L，进一步优选为0.58~0.62mmol/L，所述试剂盒中Bst DNA聚合酶的终酶活优选为0.2~0.3U，进一步优选为0.24~0.28U。
在本发明中，所述试剂盒的使用方法优选包括以下步骤：①采用基因组DNA提取试剂盒提取待测样品的DNA；②试剂配置：取1.5mL离心管(DNase/RNase-Free，灭菌)配制反应体系，将等温扩增PCR反应液和引物混合液加入后，涡旋振荡10秒，离心待用，20μL/管分装至PCR反应管中（无菌和DNase/RNase-Free）；③加样：将提取的核酸转移10μL到每个PCR反应管中，盖紧管盖、离心、转移至PCR检测区；④PCR扩增：将PCR反应管放入等温扩增的样品槽中，60℃反应30min，得到样本扩增产物，测定样本扩增产物是否含有HPV16病毒L2基因CDS区域的第138-353位核酸序列、HPV18病毒L1基因CDS区域的第568-769位核酸序列、HPV33病毒L2基因上CDS区域中第441-634位核酸序列、HPV52病毒L2基因上CDS区域中第252-462位核酸序列或HPV58病毒L2基因上CDS区域中第1058-1268位核酸序列，即可得知样品中是否含有HPV病毒。
在本发明中，所述试剂盒还优选包括胶体金免疫层析试纸条，所述胶体金免疫层析试纸条优选包括底板、样品垫、判读区和吸水垫；所述样品垫、判读区和吸水垫设置于底板上；所述判读区上设置检测线（T线）和质控线（C线），所述检测线中包被有FAM抗体，FAM抗体的浓度优选为0.05~0.15mg/mL，所述FAM抗体优选为兔抗；所述质控线中包被有biotin-BSA溶液，所述biotin-BSA溶液的浓度为1.5~3mg/mL。
在本发明中，所述胶体金免疫层析试纸条的使用方法优选包括以下步骤：使用移液器取20μL样本扩增产物至试纸条样本垫区域中，再加入80~120μL层析缓冲液，2~3min内读取结果，判断试纸条检测结果的标准如下：
C线出现红色线，同时T线出现红色线，说明被检样品为阳性；
C线出现红色线，同时T线没有出现红色线，说明被检样品为阴性；
C线没有出现红色线，说明试纸条失效。
在本发明中，所述胶体金免疫层析试纸条的检测原理为：判读区内结合垫上喷涂有链霉亲和素标记的示踪标志物，示踪标志物为包括胶体金、乳胶微球、荧光微球在内的纳米颗粒，硝酸纤维素膜上C线包被biotin-BSA，T线包被兔抗FAM抗体；同时带有FITC/FAM和生物素标记的双链扩增产物流经试纸条时，可以被胶体金标记抗体和硝酸纤维素膜上特定的抗体识别和捕获，在相应的T线区（检测线）形成红色条带，而未结合的胶体金标记抗体随缓冲液层析至C线（质控线）区，被膜上固定的特定抗原识别和捕获，形成红色条带，从而完成对试纸条的质控。
本试剂盒还配置有常规的DNA提取试剂盒、层析缓冲液及备用的一次性移液管和反应管各五支以上。
上述环介导等温扩增反应液，引物混合液和层析缓冲液各放置在独立的反应管中无菌密封。
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1 引物设计与合成
本实施例选择HPV16病毒基因组中L2基因CDS区域的第138-353位作为检测HPV16的特异性检测靶标，并根据靶标区域序列设计筛选引物：
HPV16 F3引物：5’-ACAATATGGAAGTATGGGTGTA-3’，如SEQ ID NO.1所示，位置为L2基因中CDS区域上第138-159位；
HPV16 FIP引物：5’-CAATGGAATATACCCAGTGCGTCTTTGGTGGGTTAGGAATTGG-3’，如SEQID NO.2所示，包含两个在CDS上相间隔的片段，分别位于CDS区域上第163-182和第203-225位；
HPV16 LF引物：5’-CCTGTACCCGACCCTGTT-3’，如SEQ ID NO.3所示，位于CDS区域第183-200位；
HPV16 BIP引物：5’-CCTCCCACAGCTACAGATACAAGAAGGATCAGAAGGGCC-3’，如SEQ IDNO.4所示，由位于CDS区域上第235-255和第295-312位的两段序列相连接组成；
HPV16 LB引物：5’-CTCCTGTAAGACCCCCTTTAACAGT-3’，如SEQ ID NO.5所示，位于CDS区域上第260-284位；
HPV16 B3引物：5’-CCAGCATCAATAAAACTAGTTTCT-3’，如SEQ ID NO.6所示，位于CDS区域上第330-353位；
其中，HPV16 BIP引物的5’端标记FAM基团，HPV16 LF引物的5’端标记生物素（Biotin）。
实施例2 引物设计与合成
与实施例1的不同之处仅在于，修饰方案采用：HPV16 FIP引物5’端标记有FITC基团，HPV16 LF引物5’端标记有生物素。
实施例3 引物设计与合成
以HPV18病毒L1基因CDS区域的第568-769位核酸序列作为检测HPV18的特异性检测靶标，并根据靶标区域序列设计筛选引物：
HPV18 F3引物为：5’-ACTGAAAGTTCCCATGCC-3’，如SEQ ID NO.7所示，位置为L1基因CDS区域上第568-585位；
HPV18 FIP引物为：5’-CAGCCCAAAATACATAACTGTGTCTGCCACGTCTAATGTTTCTGA-3’，如SEQ ID NO.8所示，由两个CDS上相间隔的片段组合而成，分别位于CDS上第586-605和第641-665位；
HPV18 LF引物为：5’-GACACATTGTCCCTAACGTCC-3’，如SEQ ID NO.9所示，位于CDS区域第606-626位；
HPV18 BIP引物为：5’-CTGCTATTGGGGAACACTGGGCGCCCTGTGATAAAGGAC-3’，如SEQID NO.10所示，同FIP引物相似，也由两个在CDS上相间隔的片段组成，分别位于CDS上第671-691位和第716-733位；
HPV18 LB引物为：5’-CTAAAGGCACTGCTTGTAAATC-3’，如SEQ ID NO.11所示，位于CDS区域上第692-713位；
HPV18 B3引物为：5’-CCAAAACTGTGTTTTTAAGTTCT-3’，如SEQ ID NO.12所示，位于CDS区域上第747-769位；
其中，HPV18 FIP引物 5’端标记有FAM基团，HPV18 LF引物 5’端标记有生物素。
实施例4 引物设计与合成
与实施例1的不同之处仅在于，修饰方案采用：HPV18 FIP引物 5’端标记有FITC基团，HPV18 LF引物 5’端标记有生物素。
实施例5 引物设计与合成
以HPV33病毒基因组中L2基因CDS区域的第441-634位作为检测HPV33的特异性检测靶标，并根据靶标区域序列设计筛选引物：
F3引物：5’-TGGGGAGTCATCTATTCAAAC-3’，如SEQ ID NO.13所示，位置为L2基因CDS区域上第441-461位；
FIP引物：5’-ATGTCCAGAGGCTTCTGCAGTTTAAATCCCACATTTACTGAACC-3’，如SEQ IDNO.14所示，由两个CDS上相间隔的片段组合而成，分别位于CDS上第474-497和第521-540位；
LF引物：5’-GCTGGAGGGTGTAGTACAGAT-3’，如SEQ ID NO.15所示，位于CDS区域第498-518位；
BIP引物：5’-ATTTTCTTCCCCTACTGTTAGCACGAAACAACAAAGGTATCCATTG-3’，如SEQ IDNO.16所示，同FIP引物相似，也由两个在CDS上相间隔的片段组成，分别位于CDS上第546-569位和第590-611位；
B3引物：5’-ATGTTACATTACTACTGTCTGTG-3’，如SEQ ID NO.17所示，位于CDS区域上第612-634位。
其中，FIP引物 5’端标记有FAM基团，LF引物 5’端标记有生物素。
实施例6 引物设计与合成
与实施例1的不同之处仅在于，修饰方案采用：FIP引物 5’端标记有FITC基团，LF引物 5’端标记有生物素。
实施例7 引物设计与合成
以HPV52病毒基因组中L2基因CDS区域的第252-462位作为检测HPV52的特异性检测靶标，并根据靶标区域序列设计筛选引物：
F3引物：5’-CACGTCCACTATTCGTCC-3’，如SEQ ID NO.18所示，位置为L2基因CDS区域上第252-269位；
FIP引物：5’-CGCCAGACTCAATAAATGTTGTTTCGTAGAACCCATTGGTCCCT-3’，如SEQ IDNO.19所示，由两个CDS上相间隔的片段组合而成，分别位于CDS上第280-298和第328-352位；
BIP引物：5’-CTGCTCCATCTATTCCATCAGCGATGTTACATTAATTATTGCAGGAG-3’，如SEQID NO.20所示，同FIP引物相似，也由两个在CDS上相间隔的片段组成，分别位于CDS上第356-377位和第413-437位；
LB引物：5’-CAGGGTTTGATGTTACAACATCTGC-3’，如SEQ ID NO.21所示，位于CDS区域第380-404位；
B3引物：5’-TGATTGTACAGATGATTCACCTA-3’，如SEQ ID NO.22所示，位于CDS区域上第440-462位。
其中，BIP引物 5’端标记有FAM基团，LB引物 5’端标记有生物素。
实施例8 引物设计与合成
与实施例1的不同之处仅在于，修饰方案采用：BIP引物 5’端标记有FITC基团，BF引物 5’端标记有生物素。
实施例9 引物设计与合成
以HPV58病毒基因组中L2基因CDS区域的第1058-1268位作为检测HPV58的特异性检测靶标，并根据靶标区域序列设计筛选引物：
F3引物：5’-TTTCTCCCTATAGTATTAATGATGG-3’，如SEQ ID NO.23所示，位置为L2基因CDS区域上第1058-1082位；
FIP引物：5’-TGGCAAAGGAGGTATGTGAGTGACGATGCTGATACTATACATGA-3’，如SEQ IDNO.24所示，由两个CDS上相间隔的片段组合而成，分别位于CDS上第1102-1124和第1142-1162位；
BIP引物：5’-CCACACGTACCAGTAATGTGTCCAATGTCTGGACCAGGTTC-3’，如SEQ IDNO.25所示，同FIP引物相似，也由两个在CDS上相间隔的片段组成，分别位于CDS上第1163-1185位和第1228-1245位；
LB引物：5’-ACTGGATTTGACACTCCTCTTGT-3’，如SEQ ID NO.26所示，位于CDS区域第1198-1220位；
B3引物：5’-GACATAGATGTTACAGAAGATGT-3’，如SEQ ID NO.27所示，位于CDS区域上第1246-1268位。
其中，BIP引物 5’端标记有FAM基团，LB引物 5’端标记有生物素。
实施例10 引物设计与合成
与实施例1的不同之处仅在于，修饰方案采用：BIP引物 5’端标记有FITC基团，BF引物 5’端标记有生物素。
实施例11 检测试剂盒的制备
1）采用实施例1中得到的引物组配制混合液，各引物浓度为：HPV16 F3 0.2μmol/L；HPV16 FIP 1.6μmol/L；HPV16 LF 0.67μmol/L；HPV16 BIP 1.6μmol/L；HPV16 B3 0.2μmol/L；HPV16 LB 0.67μmol/L。
2) 配制环介导等温扩增反应液，各组分的含量为：dNTP 0.58mmol/L；Tris-HCl16.67mmol/L；(NH4)2SO48.33mmol/L；KCl 12.5mmol/L；MgSO41.67mmol/L；Tween-20 0.08%；Bst聚合酶 0.27U/L。
3）制备检测卡（可选用江苏猎阵，HDu01），检测卡包括试纸条和外壳；
试纸条的结构包括样品垫、判读区和吸水垫；
判读区包括结合垫和硝酸纤维素膜；样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫依次互相交错搭接成长条状后粘贴在底板上，底板为PVC板；结合垫上喷涂有链霉亲和素标记的示踪标志物，示踪标志物为包括胶体金、乳胶微球、荧光微球在内的纳米颗粒，在硝酸纤维素膜上从吸水纸往结合垫方向依次设有C线（质控线）和T线（检测线），其中C线区包被有biotin-BSA溶液，T线区包被有兔抗FAM抗体。所述biotin-BSA溶液的浓度为1.5-3mg/mL，兔抗FAM抗体的浓度为0.05-0.15mg/mL。把试纸条装配进外壳中即制备成检测卡。
其检测原理为：判读区内结合垫上喷涂有链霉亲和素标记的示踪标志物，示踪标志物为包括胶体金、乳胶微球、荧光微球在内的纳米颗粒，硝酸纤维素膜上C线包被biotin-BSA，T线包被兔抗FAM抗体；同时带有FITC/FAM和生物素标记的双链扩增产物流经试纸条时，可以被胶体金标记抗体和硝酸纤维素膜上特定的抗体识别和捕获，在相应的T线区（检测线）形成红色条带，而未结合的胶体金标记抗体随缓冲液层析至C线（质控线）区，被膜上固定的特定抗原识别和捕获，形成红色条带，从而完成对试纸条的质控。
4）本试剂盒还配置有常规的DNA提取试剂盒、层析缓冲液及备用的一次性移液管和反应管各五支以上。
上述环介导等温扩增反应液，引物混合液和层析缓冲液各放置在独立的反应管中无菌密封。
实施例12 检测试剂盒的制备
1）采用实施例3中得到的引物组配制混合液，各引物浓度为：HPV18 F3 0.2μmol/L；HPV18 FIP 1.6μmol/L；HPV18 LF 0.67μmol/L；HPV18 BIP 1.6μmol/L；HPV18 B3 0.2μmol/L；HPV18 LB 0.67μmol/L。
2) 配制环介导等温扩增反应液，各组分的含量为：dNTP 0.58mmol/L；Tris-HCl16.67mmol/L；(NH4)2SO48.33mmol/L；KCl 12.5mmol/L；MgSO41.67mmol/L；Tween-20 0.08%；Bst聚合酶 0.27U/L。
3）制备检测卡（可选用江苏猎阵，HDu01），检测卡包括试纸条和外壳；
试纸条的结构包括样品垫、判读区和吸水垫；
判读区包括结合垫和硝酸纤维素膜；样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫依次互相交错搭接成长条状后粘贴在底板上，底板为PVC板；结合垫上喷涂有链霉亲和素标记的示踪标志物，示踪标志物为包括胶体金、乳胶微球、荧光微球在内的纳米颗粒，在硝酸纤维素膜上从吸水纸往结合垫方向依次设有C线（质控线）和T线（检测线），其中C线区包被有biotin-BSA溶液，T线区包被有兔抗FAM抗体。所述biotin-BSA溶液的浓度为1.5-3mg/mL，兔抗FAM抗体的浓度为0.05-0.15mg/mL。把试纸条装配进外壳中即制备成检测卡。
其检测原理为：判读区内结合垫上喷涂有链霉亲和素标记的示踪标志物，示踪标志物为包括胶体金、乳胶微球、荧光微球在内的纳米颗粒，硝酸纤维素膜上C线包被biotin-BSA，T线包被兔抗FAM抗体；同时带有FITC/FAM和生物素标记的双链扩增产物流经试纸条时，可以被胶体金标记抗体和硝酸纤维素膜上特定的抗体识别和捕获，在相应的T线区（检测线）形成红色条带，而未结合的胶体金标记抗体随缓冲液层析至C线（质控线）区，被膜上固定的特定抗原识别和捕获，形成红色条带，从而完成对试纸条的质控。
4）本试剂盒还配置有常规的DNA提取试剂盒、层析缓冲液及备用的一次性移液管和反应管各五支以上。
上述环介导等温扩增反应液，引物混合液和层析缓冲液各放置在独立的反应管中无菌密封。
实施例13 检测试剂盒的制备
1）采用实施例5中得到的引物组配制混合液，各引物浓度为：HPV33 F3 0.2μmol/L；HPV33 FIP 1.6μmol/L；HPV33 LF 0.67μmol/L；HPV33 BIP 1.6μmol/L；HPV33 B3 0.2μmol/L。
2) 配制环介导等温扩增反应液，各组分的含量为：dNTP 0.58mmol/L；Tris-HCl16.67mmol/L；(NH4)2SO48.33mmol/L；KCl 12.5mmol/L；MgSO41.67mmol/L；Tween-20 0.08%；Bst聚合酶 0.27U/L。
3）制备检测卡（可选用江苏猎阵，HDu01），检测卡包括试纸条和外壳；
试纸条的结构包括样品垫、判读区和吸水垫；
判读区包括结合垫和硝酸纤维素膜；样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫依次互相交错搭接成长条状后粘贴在底板上，底板为PVC板；结合垫上喷涂有链霉亲和素标记的示踪标志物，示踪标志物为包括胶体金、乳胶微球、荧光微球在内的纳米颗粒，在硝酸纤维素膜上从吸水纸往结合垫方向依次设有C线（质控线）和T线（检测线），其中C线区包被有biotin-BSA溶液，T线区包被有兔抗FAM抗体。所述biotin-BSA溶液的浓度为1.5-3mg/mL，兔抗FAM抗体的浓度为0.05-0.15mg/mL。把试纸条装配进外壳中即制备成检测卡。
其检测原理为：判读区内结合垫上喷涂有链霉亲和素标记的示踪标志物，示踪标志物为包括胶体金、乳胶微球、荧光微球在内的纳米颗粒，硝酸纤维素膜上C线包被biotin-BSA，T线包被兔抗FAM抗体；同时带有FITC/FAM和生物素标记的双链扩增产物流经试纸条时，可以被胶体金标记抗体和硝酸纤维素膜上特定的抗体识别和捕获，在相应的T线区（检测线）形成红色条带，而未结合的胶体金标记抗体随缓冲液层析至C线（质控线）区，被膜上固定的特定抗原识别和捕获，形成红色条带，从而完成对试纸条的质控。
4）本试剂盒还配置有常规的DNA提取试剂盒、层析缓冲液及备用的一次性移液管和反应管各五支以上。
上述环介导等温扩增反应液，引物混合液和层析缓冲液各放置在独立的反应管中无菌密封。
实施例14 检测试剂盒的制备
1）采用实施例7中得到的引物组配制混合液，各引物浓度为：HPV52 F3 0.2μmol/L；HPV52 FIP 1.6μmol/L；HPV52 BIP 1.6μmol/L；HPV52 B3 0.2μmol/L；HPV52 LB 0.67μmol/L。
2) 配制环介导等温扩增反应液，各组分的含量为：dNTP 0.58mmol/L；Tris-HCl16.67mmol/L；(NH4)2SO48.33mmol/L；KCl 12.5mmol/L；MgSO41.67mmol/L；Tween-20 0.08%；Bst聚合酶 0.27U/L。
3）制备检测卡（可选用江苏猎阵，HDu01），检测卡包括试纸条和外壳；
试纸条的结构包括样品垫、判读区和吸水垫；
判读区包括结合垫和硝酸纤维素膜；样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫依次互相交错搭接成长条状后粘贴在底板上，底板为PVC板；结合垫上喷涂有链霉亲和素标记的示踪标志物，示踪标志物为包括胶体金、乳胶微球、荧光微球在内的纳米颗粒，在硝酸纤维素膜上从吸水纸往结合垫方向依次设有C线（质控线）和T线（检测线），其中C线区包被有biotin-BSA溶液，T线区包被有兔抗FAM抗体。所述biotin-BSA溶液的浓度为1.5-3mg/mL，兔抗FAM抗体的浓度为0.05-0.15mg/mL。把试纸条装配进外壳中即制备成检测卡。
其检测原理为：判读区内结合垫上喷涂有链霉亲和素标记的示踪标志物，示踪标志物为包括胶体金、乳胶微球、荧光微球在内的纳米颗粒，硝酸纤维素膜上C线包被biotin-BSA，T线包被兔抗FAM抗体；同时带有FITC/FAM和生物素标记的双链扩增产物流经试纸条时，可以被胶体金标记抗体和硝酸纤维素膜上特定的抗体识别和捕获，在相应的T线区（检测线）形成红色条带，而未结合的胶体金标记抗体随缓冲液层析至C线（质控线）区，被膜上固定的特定抗原识别和捕获，形成红色条带，从而完成对试纸条的质控。
4）本试剂盒还配置有常规的DNA提取试剂盒、层析缓冲液及备用的一次性移液管和反应管各五支以上。
上述环介导等温扩增反应液，引物混合液和层析缓冲液各放置在独立的反应管中无菌密封。
实施例15 检测试剂盒的制备
1）采用实施例9中得到的引物组配制混合液，各引物浓度为：HPV58 F3引物：0.2μmol/L；HPV58 FIP引物：1.6μmol/L；HPV58 BIP引物：1.6μmol/L；HPV58 LB引物：0.67μmol/L；HPV58 B3引物：0.2μmol/L。
2) 配制环介导等温扩增反应液，各组分的含量为：dNTP 0.58mmol/L；Tris-HCl16.67mmol/L；(NH4)2SO48.33mmol/L；KCl 12.5mmol/L；MgSO41.67mmol/L；Tween-20 0.08%；Bst聚合酶 0.27U/L。
3）制备检测卡（可选用江苏猎阵，HDu01），检测卡包括试纸条和外壳；
试纸条的结构包括样品垫、判读区和吸水垫；
判读区包括结合垫和硝酸纤维素膜；样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫依次互相交错搭接成长条状后粘贴在底板上，底板为PVC板；结合垫上喷涂有链霉亲和素标记的示踪标志物，示踪标志物为包括胶体金、乳胶微球、荧光微球在内的纳米颗粒，在硝酸纤维素膜上从吸水纸往结合垫方向依次设有C线（质控线）和T线（检测线），其中C线区包被有biotin-BSA溶液，T线区包被有兔抗FAM抗体。所述biotin-BSA溶液的浓度为1.5-3mg/mL，兔抗FAM抗体的浓度为0.05-0.15mg/mL。把试纸条装配进外壳中即制备成检测卡。
其检测原理为：判读区内结合垫上喷涂有链霉亲和素标记的示踪标志物，示踪标志物为包括胶体金、乳胶微球、荧光微球在内的纳米颗粒，硝酸纤维素膜上C线包被biotin-BSA，T线包被兔抗FAM抗体；同时带有FITC/FAM和生物素标记的双链扩增产物流经试纸条时，可以被胶体金标记抗体和硝酸纤维素膜上特定的抗体识别和捕获，在相应的T线区（检测线）形成红色条带，而未结合的胶体金标记抗体随缓冲液层析至C线（质控线）区，被膜上固定的特定抗原识别和捕获，形成红色条带，从而完成对试纸条的质控。
4）本试剂盒还配置有常规的DNA提取试剂盒、层析缓冲液及备用的一次性移液管和反应管各五支以上。
上述环介导等温扩增反应液，引物混合液和层析缓冲液各放置在独立的反应管中无菌密封。
实验例1 HPV的检测过程
1. 取患者宫颈液，采用基因组DNA提取试剂盒提取，得到待测样品的DNA；
2. 试剂配置：取环介导等温扩增反应液和引物混合液，在离心管中混合，涡旋振荡摇匀，取20μL/管分装至PCR反应管中；
3. 加样：将待测样品的DNA 溶液10μL转移到上述PCR反应管中；
4. PCR扩增：将PCR反应管放入等温扩增的样品槽中，60℃反应30min，居家检测可采用家庭内任意常规恒温设备或方法保持60℃恒温。
5. 准备检测卡：将检测卡从铝箔袋中取出，放置于干燥的水平台面上。
6. 加样检测：移取20μL样本扩增产物至检测卡的加样孔中，再加入80-120μL层析缓冲液，2-3min内读取结果。
7. 检测及结果判定：
结果判定标准：
C线出现红色的线，同时T线出现红色的线，说明待测样品为HPV16阳性；
C线出现红色的线，同时T线没有出现红色的线，说明待测样品为HPV16阴性；
C线没有出现红色的线，说明检测卡失效。
利用实施例11中的试剂盒，采用上述方法HPV16参考品进行验证检测，HPV16样本的浓度约为5000 copies/mL，重复检测10次，检测结果如图1所示。由图1可以看出，10次检测的结果均为HPV16阳性，且显色均一，表明本发明提供的引物组具有良好的检测一致性。
利用实施例12中的试剂盒，采用上述方法HPV18参考品进行验证检测，HPV18样本的浓度约为2500 copies/mL，重复检测10次，检测结果如图2所示。由图2可以看出，10次检测的结果均为HPV18阳性，且显色均一，表明本发明提供的引物组具有良好的检测一致性。
利用实施例13中的试剂盒，采用上述方法HPV33参考品进行验证检测，HPV33样本的浓度约为5000 copies/mL，重复检测10次，检测结果如图3所示。由图3可以看出，10次检测的结果均为HPV33阳性，且显色均一，表明本发明提供的引物组具有良好的检测一致性。
利用实施例14中的试剂盒，采用上述方法HPV52参考品进行验证检测，HPV52样本的浓度约为5000 copies/mL，重复检测10次，检测结果如图4所示。由图4可以看出，10次检测的结果均为HPV52阳性，且显色均一，表明本发明提供的引物组具有良好的检测一致性。
利用实施例15中的试剂盒，采用上述方法HPV58参考品进行验证检测，HPV58样本的浓度约为5000 copies/mL，重复检测10次，检测结果如图5所示。由图5可以看出，10次检测的结果均为HPV58阳性，且显色均一，表明本发明提供的引物组具有良好的检测一致性。
实验例2 灵敏度测试
HPV16病毒检测试剂盒的检测灵敏度：将HPV16病毒制备成浓度为2500 copies/mL、1000 copies/mL、500 copies/mL、250 copies/mL和100 copies/mL的待测样本，采用实施例11的试剂盒对每个梯度重复测试5次，记录结果，以全部检出时的样本浓度为检测限，结果如下表1所示：
表1 HPV16病毒检测限检测结果
结果如表1所示，2500 copies/mL、1000 copies/mL和500 copies/mL浓度样本全部检出，250 copies/mL和100 copies/mL浓度样本概率检出。由此可以看出，本发明的组合试剂，对于HPV16的检出限为500 copies/mL，灵敏度较高，可以用于HPV16核酸检测的试剂盒。
HPV18病毒检测试剂盒的检测灵敏度：将HPV18病毒制备成浓度为2500 copies/mL、1000 copies/mL、500 copies/mL、250 copies/mL和100 copies/mL的待测样本，采用实施例12的试剂盒对每个梯度重复测试5次，记录结果，以全部检出时的样本浓度为检测限，结果如下表2所示：
表2 HPV18病毒检测限检测结果
结果如表2所示，2500 copies/mL、1000 copies/mL和500 copies/mL浓度样本全部检出，250 copies/mL和100 copies/mL浓度样本概率检出。由此可以看出，本发明的组合试剂，对于HPV18的检出限为500 copies/mL，灵敏度较高，可以用于HPV18核酸检测的试剂盒。
将HPV33病毒制备成浓度为2500 copies/mL、1000 copies/mL、500 copies/mL、250 copies/mL和100 copies/mL的待测样本，采用实施例13的试剂盒对每个梯度重复测试5次，记录结果，以全部检出时的样本浓度为检测限，结果如表3所示（“+”为阳性，“-”为阴性）：
表3 检测限检测结果
由表3可知，2500 copies/mL、1000 copies/mL和500 copies/mL浓度样本全部检出，250 copies/mL和100 copies/mL浓度样本概率检出。由此可以看出，本发明的组合试剂，对于HPV33的检出限为500 copies/mL，灵敏度较高，可以用于HPV33核酸检测的试剂盒。
将HPV52病毒制备成浓度为2500 copies/mL、1000 copies/mL、500 copies/mL、250 copies/mL和100 copies/mL的待测样本，采用实施例14的试剂盒对每个梯度重复测试5次，记录结果，以全部检出时的样本浓度为检测限，结果如表4所示（“+”为阳性，“-”为阴性）：
表4 检测限检测结果
由表4可知，2500 copies/mL、1000 copies/mL和500 copies/mL浓度样本全部检出，250 copies/mL和100 copies/mL浓度样本概率检出。由此可以看出，本发明的组合试剂，对于HPV52的检出限为500 copies/mL，灵敏度较高，可以用于HPV52核酸检测的试剂盒。
将HPV58病毒制备成浓度为2500 copies/mL、1000 copies/mL、500 copies/mL、250 copies/mL和100 copies/mL的待测样本，采用实施例15的试剂盒对每个梯度重复测试5次，记录结果，以全部检出时的样本浓度为检测限，结果如表5所示（“+”为阳性，“-”为阴性）：
表5 检测限检测结果
由表5可知，2500 copies/mL、1000 copies/mL和500 copies/mL浓度样本全部检出，250 copies/mL和100 copies/mL浓度样本概率检出。由此可以看出，本发明的组合试剂，对于HPV58的检出限为500 copies/mL，灵敏度较高，可以用于HPV58核酸检测的试剂盒。
实验例3 特异性测试
选取13例HR-HPV型别（HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68）、1例白色念珠菌（Candida albicans，CA；购自美国ATCC保藏中心，No.ATCC 10231）、1例阴道毛滴虫（Trichomonas vaginalis，TV；购自美国ATCC保藏中心，No.ATCC 30184）和1例加德纳菌（Gardnerella vaginalis，GV；购自美国ATCC保藏中心，No.ATCC 14018），共16例样本进行特异性检测，各待测样本的浓度为2500copies/mL，分别采用实施例11~15中的试剂盒进行检测，检测方法同实验例1，检测结果如图6~10所示。
由图6可知，采用实施例11中的试剂盒对13例HR-HPV样本的检测结果中，仅HPV16为阳性，其余型别皆为阴性，1例白色念珠菌、1例阴道毛滴虫和1例加德纳菌的检测结果均为阴性，说明本发明提供的试剂盒可以排除不同病原体的干扰，精准检测出HPV16。
由图7可知，采用实施例12中的试剂盒对13例HR-HPV样本的检测结果中，仅HPV18为阳性，其余型别皆为阴性，1例白色念珠菌、1例阴道毛滴虫和1例加德纳菌的检测结果均为阴性，说明本发明提供的试剂盒可以排除不同病原体的干扰，精准检测出HPV18。
由图8可知，采用实施例13中的试剂盒对13例HR-HPV样本的检测结果中，仅HPV33为阳性，其余型别皆为阴性，1例白色念珠菌、1例阴道毛滴虫和1例加德纳菌的检测结果均为阴性，说明本发明提供的试剂盒可以排除不同病原体的干扰，精准检测出HPV33。
由图9可知，采用实施例14中的试剂盒对13例HR-HPV样本的检测结果中，仅HPV52为阳性，其余型别皆为阴性，1例白色念珠菌、1例阴道毛滴虫和1例加德纳菌的检测结果均为阴性，说明本发明提供的试剂盒可以排除不同病原体的干扰，精准检测出HPV52。
由图10可知，采用实施例15中的试剂盒对13例HR-HPV样本的检测结果中，仅HPV58为阳性，其余型别皆为阴性，1例白色念珠菌、1例阴道毛滴虫和1例加德纳菌的检测结果均为阴性，说明本发明提供的试剂盒可以排除不同病原体的干扰，精准检测出HPV58。
实验例4 引物组合对比实验
引物组合（核酸序列和修饰方式）是影响核酸检测平台检测能力的关键性因素，要求所用引物组合具有较高的特异性和灵敏度，故优选引物组合尤为重要。在本发明试剂盒的研发阶段，分别进行了不同引物组合的比较和不同修饰位点的比较。
针对HPV16，本发明设计了以下备选引物：
HPV16备选引物组合1选择位于L2基因CDS区域第176-395位序列设计引物，具体地：
HPV16 F3-1引物的位置为L2基因CDS区域上第176-193位，序列为：GAATTGGAACAGGGTCGG，如SEQ ID NO.28所示；
HPV16 FIP-1引物由两个CDS上相间隔的片段组合而成，分别位于CDS上第208-228和第248-271位，序列为：GTCTTACAGGAGCAAGTGTATCTGACTGGGTATATTCCATTGGGA，如SEQ IDNO.29所示；
HPV16 LF-1引物位于CDS区域第229-247位，序列为：TAGCTGTGGGAGGCCTTGT，如SEQID NO.30所示；
HPV16 BIP-1引物同FIP引物相似，也由两个在CDS上相间隔的片段组成，分别位于CDS上第293-315位和第357-375位，序列为：TGGGCCCTTCTGATCCTTCTATAGGAAGGTACAGATGTTGGT，如SEQ ID NO.31所示；
HPV16 B3-1引物位于CDS区域上第377-395位，序列为：CCTGATACATCTGGGGGAA，如SEQ ID NO.32所示。
HPV16备选引物组合2选择位于 L2基因CDS区域第111-297位设计引物序列，具体地：
HPV16 F3-2引物的位置为L2基因CDS区域上第111-130位，序列为：AGGCAAAACTATTGCTGATC，如SEQ ID NO.33所示；
HPV16 FIP-2引物由两个CDS上相间隔的片段组合而成，分别位于CDS上第135-159和第176-195位，序列为：ACCCGACCCTGTTCCAATTCATTACAATATGGAAGTATGGGTGTA，如SEQ IDNO.34所示；
HPV16 BIP-2引物同FIP引物相似，也由两个在CDS上相间隔的片段组成，分别位于CDS上第200-219位和第243-262位，序列为：GCGGACGCACTGGGTATATTGAGCAAGTGTATCTGTAGCT，如SEQ ID NO.35所示；
HPV16 LF-2引物位于CDS区域第221-239位，序列为：CATTGGGAACAAGGCCTCC，如SEQID NO.36所示；
HPV16 B3-2引物位于CDS区域上第280-297位，序列为：GCCCACAGGATCTACTGT，如SEQ ID NO.37所示。
上述对比组合反应体系中F3引物和B3引物浓度都为0.2μM、FIP引物和BIP引物浓度都为1.6μM，LF引物（如果有）和LB引物（如果有）浓度都为0.67μM；反应体系中用到的其它组分及浓度同实施例11。
除了上述靶点、引物的变化，本实施例还进行了不同修饰位点的比较，包括本发明实施例1引物组合、备选修饰1和备选修饰2，是在本发明实施例1引物序列组合不变的基础上叠加不同的修饰方案，分别为：
BIP 5’端（FAM）+ LF 5’端（Biotin）修饰（本发明实施例1）；
FIP 5’端（FAM）+ LF 5’端（Biotin）修饰（备选修饰1）；
BIP 5’端（FAM）+ LB 5’端（Biotin）修饰（备选修饰2）。
上述各组合以制备的HPV16参考品作为待测样本进行检测，并制备成浓度为2500copies/mL、1000 copies/mL、500 copies/mL、250 copies/mL和100 copies/mL的待测样本，检测方法参照实验例1，结果如表6所示。
表6 HPV16各引物组合检测限检测结果
从表6可知，相比不同引物组合和修饰方式，本发明实施例1中的引物组合和修饰方法不但检测限最低，而且灵敏度最高。
针对HPV18，本发明设计了以下备选引物：
HPV18备选引物组合1位于L1基因CDS区域第569-769位核酸序列，具体地：
HPV18 F3-1引物的位置为L2基因CDS区域上第569-586位，序列为：CTGAAAGTTCCCATGCCG，如SEQ ID NO.38所示；
HPV18 FIP-1引物由两个CDS上相间隔的片段组合而成，分别位于CDS上第596-615和第641-665位，序列为：CAGCCCAAAATACATAACTGTGTCTATGTTTCTGAGGACGTTAGG，如SEQ IDNO.39所示；
HPV18 BIP-1引物同FIP引物相似，也由两个在CDS上相间隔的片段组成，分别位于CDS上第671-691位和第714-731位，序列为：CTGCTATTGGGGAACACTGGGCCCTGTGATAAAGGACGC，如SEQ ID NO.40所示；
HPV18 B3-1引物位于CDS区域上第747-769位，序列为：CCAAAACTGTGTTTTTAAGTTCT，如SEQ ID NO.41所示。
HPV18备选引物组合2位于L1基因CDS区域第569-769位核酸序列，具体地：
HPV18 F3-2引物的位置为L2基因CDS区域上第569-586位，序列为：CTGAAAGTTCCCATGCCG，如SEQ ID NO.42所示；
HPV18 FIP-2引物由两个CDS上相间隔的片段组合而成，分别位于CDS上第606-623和第646-669位，序列为：GGCACAGCCCAAAATACATAACTGGGACGTTAGGGACAATGT，如SEQ IDNO.43所示；
HPV18 BIP-2引物同FIP引物相似，也由两个在CDS上相间隔的片段组成，分别位于CDS上第671-691位和第714-731位，序列为：CTGCTATTGGGGAACACTGGGCCCTGTGATAAAGGACGC，如SEQ ID NO.44所示；
HPV18 B3-2引物位于CDS区域上第747-769位，序列为：CCAAAACTGTGTTTTTAAGTTCT，如SEQ ID NO.45所示。
其中，各对比组合反应体系中F3引物和B3引物浓度都为0.2μM、FIP引物和BIP引物浓度都为1.6μM，LF引物（如果有）和LB引物（如果有）浓度都为0.67μM；反应体系中用到的其它组分及浓度同实施例12。
不同修饰位点的比较包括 本发明实施例3引物组合、备选修饰1和备选修饰2，是在 本发明实施例3引物序列组合不变的基础上叠加不同的修饰方案，分别为：
FIP 5’端（FAM）+ LF 5’端（Biotin）修饰（本发明实施例3）；
BIP 5’端（FAM）+ LF 5’端（Biotin）修饰（备选修饰1）；
BIP 5’端（FAM）+ LB 5’端（Biotin）修饰（备选修饰2）。
各组合以制备的HPV18参考品作为待测样本进行检测，结果如表7所示：
表7 HPV18各引物组合检测限检测结果
从表7可知，备选修饰1、备选修饰2和备选引物组1的检出限都为1000copies/mL，备选引物组2的检出限为2500copies/mL。综上，本发明实施例3中的引物组合和修饰方法检测限最低、灵敏度最高。
针对HPV33，本发明设计了以下备选引物：
HPV33备选引物组合1位于L2基因CDS区域的第246-491位核酸序列，具体地：
HPV33 F3-1引物的位置为CDS区域上第246-263位，序列为：AATCCCCTTGCAGCCTAT，如SEQ ID NO.46所示；
HPV33 FIP-1引物由两个CDS上相间隔的片段组合而成，分别位于CDS上第270-289和第329-353位，序列为：GCACCTGCCTCTATAAAACTTGTTTTCCGGTTACTGTAGACACTG，如SEQ IDNO.47所示；
HPV33 LF-1引物位于CDS区域第294-318位，序列为：TGACACTATAGACGAGTCTAAAGGT，如SEQ ID NO.48所示；
HPV33 BIP-1引物同FIP引物相似，也由两个在CDS上相间隔的片段组成，分别位于CDS上第367-390位和第430-448位，序列为：ATTCCTACACCATCAGGTTTTGATACTCCCCAACAGATGAAAC，如SEQ ID NO.49所示；
HPV33 B3-1引物位于CDS区域上第469-491位，序列为：GTAAATGTGGGATTTAAATGTGT，如SEQ ID NO.50所示。
HPV33备选引物组合2位于L2基因CDS区域的第270-491位核酸序列，具体地：
HPV33 F3-2引物的位置为CDS区域上第270-288位，序列为：TCCGGTTACTGTAGACACT，如SEQ ID NO.51所示；
HPV33 FIP-2引物由两个CDS上相间隔的片段组合而成，分别位于CDS上第295-316和第335-357位，序列为：TGGTGCACCTGCCTCTATAAAACCCTTTAGACTCGTCTATAGTGT，如SEQ IDNO.52所示；
HPV33 BIP-2引物同FIP引物相似，也由两个在CDS上相间隔的片段组成，分别位于CDS上第367-390位和第430-448位，序列为：ATTCCTACACCATCAGGTTTTGATACTCCCCAACAGATGAAAC，如SEQ ID NO.53所示；
HPV33 LB-2引物位于CDS区域第398-422位，序列为：CATCTGCAGATACTACACCTGCAAT，如SEQ ID NO.54所示；
HPV33 B3-2引物位于CDS区域上第469-491位，序列为：GTAAATGTGGGATTTAAATGTGT，如SEQ ID NO.55所示。
其中，各对比组合反应体系中F3引物和B3引物浓度都为0.2μM、FIP引物和BIP引物浓度都为1.6μM，LF引物（如果有）和LB引物（如果有）浓度都为0.67μM；反应体系中用到的其它组分及浓度同实施例13。
不同修饰位点的比较包括本发明实施例5引物组合、备选修饰1和备选修饰2，是在本发明实施例5引物序列组合不变的基础上叠加不同的修饰方案，分别为：
FIP 5’端（FAM）+ LF 5’端（Biotin）修饰（本发明实施例5）；
BIP 5’端（FAM）+ LF 5’端（Biotin）修饰（备选修饰1）；
FIP 5’端（FAM）+ BIP 5’端（Biotin）修饰（备选修饰2）。
各组合以制备的HPV33参考品作为待测样本进行检测，结果如表8所示：
表8 HPV33各引物组合检测限检测结果
从表8可知，备选修饰1、备选修饰2、备选引物组1和备选引物组2的检出限都为1000 copies/mL。综上，本发明实施例5的检测限最低，灵敏度最高。
针对HPV52，本发明设计了以下备选引物：
HPV52备选引物组合1位于L2基因CDS区域的第252-462位核酸序列，具体地：
HPV52 F3-1引物的位置为CDS区域上第252-269位，序列为：CACGTCCACTATTCGTCC，如SEQ ID NO.56所示；
HPV52 FIP-1引物由两个CDS上相间隔的片段组合而成，分别位于CDS上第270-289和第328-352位，序列为：CGCCAGACTCAATAAATGTTGTTTCCCCTGTAACTGTAGAACCCA，如SEQ IDNO.57所示；
HPV52 LF-1引物位于CDS区域第291-314位，序列为：ACTATAGATGGTTCTAAGGGACCA，如SEQ ID NO.58所示；
HPV52 BIP-1引物同FIP引物相似，也由两个在CDS上相间隔的片段组成，分别位于CDS上第356-377位和第413-437位，序列为：CTGCTCCATCTATTCCATCAGCGATGTTACATTAATTATTGCAGGAG，如SEQ ID NO.59所示；
HPV52 LB-1引物位于CDS区域第380-404位，序列为：CAGGGTTTGATGTTACAACATCTGC，如SEQ ID NO.60所示；
HPV52 B3-1引物位于CDS区域上第440-462位，序列为：TGATTGTACAGATGATTCACCTA，如SEQ ID NO.61所示。
HPV52备选引物组合2位于L2基因CDS区域的第402-614位核酸序列，具体地：
HPV52 F3-2引物的位置为CDS区域上第402-423位，序列为：TGCAAATAATACTCCTGCAATA，如SEQ ID NO.62所示；
HPV52 FIP-2引物由两个CDS上相间隔的片段组合而成，分别位于CDS上第433-455和第493-516位，序列为：CGGGGGCTGTATTATAGATGGTTCACATCTATAGGTGAATCATCTGT，如SEQ IDNO.63所示；
HPV52 LF-2引物位于CDS区域第467-492位，序列为：AGTGAATGTAGGATTTAAATGTGTAG，如SEQ ID NO.64所示；
HPV52 BIP-2引物同FIP引物相似，也由两个在CDS上相间隔的片段组成，分别位于CDS上第523-544位和第571-591位，序列为：GCAGAAGCATCTGGTCATGTATAGGGATTTCTTCATAGGTGTG，如SEQ ID NO.65所示；
HPV52 B3-2引物位于CDS区域上第592-614位，序列为：GTAGAGGTAACAAATGTATCCAT，如SEQ ID NO.66所示。
其中，各对比组合反应体系中F3引物和B3引物浓度都为0.2μM、FIP引物和BIP引物浓度都为1.6μM，LF引物（如果有）和LB引物（如果有）浓度都为0.67μM；反应体系中用到的其它组分及浓度同实施例14。
不同修饰位点的比较包括 本发明实施例7引物组合、备选修饰1和备选修饰2，是在本发明实施例7引物序列组合不变的基础上叠加不同的修饰方案，分别为：
BIP 5’端（FAM）+ LB 5’端（Biotin）修饰（本发明实施例7）；
FIP 5’端（FAM）+ LB 5’端（Biotin）修饰（备选修饰1）；
BIP 5’端（FAM）+ FIP 5’端（Biotin）修饰（备选修饰2）。
各组合以制备的HPV52参考品作为待测样本进行检测，结果如表9所示：
表9 HPV52各引物组合检测限检测结果
从表9可知，备选修饰1、备选修饰2和备选引物组1的检出限都为1000 copies/mL，备选引物组2的检出限为2500 copies/mL。综上，本发明实施例7中的引物组合和修饰方法检测限最低、灵敏度最高。
针对HPV58，本发明设计了以下备选引物：
HPV58备选引物组合1位于L2基因CDS区域第1044-1244位核酸序列，具体地：
HPV58 F3-1引物的位置为L2基因CDS区域上第1044-1066位，序列为：TTTAAATACTTCTGTTTCTCCCT，如SEQ ID NO.67所示；
HPV58 FIP-1引物由两个CDS上相间隔的片段组合而成，分别位于CDS上第1080-1104和第1120-1142位，序列为：TGCAGAGGACTCTGAAAATCATGTGGACTTTATGATATTTATGCTGAC，如SEQ ID NO.68所示；
HPV58 BIP-1引物同FIP引物相似，也由两个在CDS上相间隔的片段组成，分别位于CDS上第1143-1163位和第1205-1223位，序列为：CTCACATACCTCCTTTGCCACGACACAAGAGGAGTGTCAA，如SEQ ID NO.69所示；
HPV58 LB-1引物位于CDS区域第1164-1185位，序列为：CACACGTACCAGTAATGTGTCC，如SEQ ID NO.70所示；
HPV58 B3-1引物位于CDS区域上第1227-1244位，序列为：ATGTCTGGACCAGGTTCC，如SEQ ID NO.71所示。
HPV58备选引物组合2位于 L2基因CDS区域第1108-1332位核酸序列，具体地：
HPV58 F3-2引物的位置为L2基因CDS区域上第1108-1132位，序列为：GCTGATACTATACATGATTTTCAGA，如SEQ ID NO.72所示；
HPV58 FIP-2引物由两个CDS上相间隔的片段组合而成，分别位于CDS上第1136-1154和第1194-1218位，序列为：AAGAGGAGTGTCAAATCCAGTATTTCTCTGCACTCACATACCTC，如SEQID NO.73所示；
HPV58 LF-2引物位于CDS区域第1158-1176位，序列为：ACTGGTACGTGTGGTGGCA，如SEQ ID NO.74所示；
HPV58 BIP-2引物同FIP引物相似，也由两个在CDS上相间隔的片段组成，分别位于CDS上第1221-1241位和第1279-1301位，序列为：GTCATTGGAACCTGGTCCAGAGGAGTTAGTGGAGATATAGGAAT，如SEQ ID NO.75所示；
HPV58 B3-2引物位于CDS区域上第1315-1332位，序列为：ATCAGCACCATCCACAAT，如SEQ ID NO.76所示。
其中，各对比组合反应体系中F3引物和B3引物浓度都为0.2μM、FIP引物和BIP引物浓度都为1.6μM，LF引物（如果有）和LB引物（如果有）浓度都为0.67μM；反应体系中用到的其它组分及浓度同实施例15。
不同修饰位点的比较包括本发明实施例9引物组合、备选修饰1和备选修饰2，是在本发明实施例9引物序列组合不变的基础上叠加不同的修饰方案，分别为：
BIP 5’端（FAM）+ LB 5’端（Biotin）修饰（本发明实施例9）；
FIP 5’端（FAM）+ LB 5’端（Biotin）修饰（备选修饰1）；
BIP 5’端（FAM）+ FIP 5’端（Biotin）修饰（备选修饰2）。
各组合以制备的HPV58参考品作为待测样本进行检测，结果如表10所示：
表10 HPV58各引物组合检测限检测结果
从表10可知，备选修饰1、备选引物组1和备选引物组2的检出限都为1000 copies/mL，备选修饰2的检测限为2500 copies/mL。综上，本发明实施例9中的引物组合和修饰方法检测限最低、灵敏度最高。
实验例5 引物浓度对比实验
鉴于LAMP反应体系中FIP和BIP的引物浓度对检测灵敏度影响较大，本发明的引物组合进行FIP和BIP的不同浓度检测对比实验，以获得最适反应浓度。
针对HPV16的检测试剂盒，对比实验设计详见下表11，反应体系中其它组分及浓度同实施例11。
表11 HPV16不同引物浓度反应体系对比实验设计
各组合以制备的HPV16参考品（500 copies/mL） 作为待测样本进行检测，重复检测10次，结果如表12所示：
表12 HPV16不同引物浓度反应体系检测结果
由表12可知，组合1、2、3、4、7的重复性较差，均出现了无法检测的情况，而组合5、6、8、9，在HPV16参考品的浓度为500 copies/mL的情况下，检测结果均为阳性，重复性较好。从而，当反应体系中FIP和BIP浓度均不低于1.6μM时，才能稳定检出500 copies/mL的HPV16参考品，达到灵敏度的要求。因此，结合检测结果和试剂成本考虑，将反应体系中FIP和BIP引物浓度定为1.6μM。
针对HPV18的检测试剂盒，对比实验设计详见下表13，反应体系中其它组分及浓度同实施例12。
表13 HPV18不同引物浓度反应体系对比实验设计
各组合以制备的HPV18参考品（500 copies/mL） 作为待测样本进行检测，重复检测10次，结果如表14所示：
表14 HPV18不同引物浓度反应体系检测结果
由表14可知，组合5、6、8、9，即反应体系中FIP和BIP浓度均不低于1.6μM时，才能稳定检出500 copies/mL的HPV18参考品，因此，结合试剂成本考虑，反应体系中FIP和BIP引物浓度定为1.6μM。
针对HPV33的检测试剂盒，对比实验设计详见下表15，反应体系中其它组分及浓度同实施例13。
表15 HPV33不同引物浓度反应体系对比实验设计
各组合以制备的HPV33参考品（500 copies/mL） 作为待测样本进行检测，重复检测10次，结果如表16所示：
表16 HPV33不同引物浓度反应体系检测结果
由表16可知，组合5、6、8、9，即反应体系中FIP和BIP浓度均不低于1.6μM时，才能稳定检出500 copies/mL的HPV33参考品，因此，结合试剂成本考虑，反应体系中FIP和BIP引物浓度定为1.6μM。
针对HPV52的检测试剂盒，对比实验设计详见下表17，反应体系中其它组分及浓度同实施例14。
表17 HPV52不同引物浓度反应体系对比实验设计
各组合以制备的HPV52参考品（500 copies/mL） 作为待测样本进行检测，重复检测10次，结果如表18所示：
表18 HPV52不同引物浓度反应体系检测结果
由表18可知，组合5、6、8、9，即反应体系中FIP和BIP浓度均不低于1.6μM时，才能稳定检出500 copies/mL的HPV52参考品，因此，结合试剂成本考虑，反应体系中FIP和BIP引物浓度定为1.6μM。
针对HPV58的检测试剂盒，对比实验设计详见下表19，反应体系中其它组分及浓度同实施例15。
表19 HPV58不同引物浓度反应体系对比实验设计
各组合以制备的HPV58参考品（500 copies/mL）作为待测样本进行检测，重复检测10次，结果如表20所示：
表20 HPV58不同引物浓度反应体系检测结果
由表20可知，组合5、6、8、9，即反应体系中FIP和BIP浓度均不低于1.6μM时，才能稳定检出500 copies/mL的HPV58参考品，因此，结合试剂成本考虑，反应体系中FIP和BIP引物浓度定为1.6μM。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (9)

1.HPV检测引物组，其特征在于，所述HPV检测引物组包括如下引物：
核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的引物HPV16 F3；
核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的引物HPV16 FIP；
核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的引物HPV16 LF；
核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示的引物HPV16 BIP；
核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示的引物HPV16 LB；
核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示的引物HPV16 B3；
和，所述HPV检测引物组包括如下引物：
核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示的引物HPV18 F3；
核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示的引物HPV18 FIP；
核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示的引物HPV18 LF；
核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示的引物HPV18 BIP；
核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示的引物HPV18 LB；
核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示的引物HPV18 B3；
和，所述HPV检测引物组包括如下引物：
核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示的引物HPV33 F3；
核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示的引物HPV33 FIP；
核苷酸序列如SEQ ID NO.15所示的引物HPV33 LF；
核苷酸序列如SEQ ID NO.16所示的引物HPV33 BIP；
核苷酸序列如SEQ ID NO.17所示的引物HPV33 B3；
和，所述HPV检测引物组包括如下引物：
核苷酸序列如SEQ ID NO.18所示的引物HPV52 F3；
核苷酸序列如SEQ ID NO.19所示的引物HPV52 FIP；
核苷酸序列如SEQ ID NO.20所示的引物HPV52 BIP；
核苷酸序列如SEQ ID NO.21所示的引物HPV52 LB；
核苷酸序列如SEQ ID NO.22所示的引物HPV52 B3；
和，所述HPV检测引物组包括如下引物：
核苷酸序列如SEQ ID NO.23所示的引物HPV58 F3；
核苷酸序列如SEQ ID NO.24所示的引物HPV58 FIP；
核苷酸序列如SEQ ID NO.25所示的引物HPV58 BIP；
核苷酸序列如SEQ ID NO.26所示的引物HPV58 LB；
核苷酸序列如SEQ ID NO.27所示的引物HPV58 B3。
2.根据权利要求1所述的HPV检测引物组，其特征在于，所述HPV16 BIP引物的5’端标记有荧光基团；
所述HPV16 LF引物的5’端标记有生物素；
所述HPV18 FIP引物的5’端标记有荧光基团；
所述HPV18 LF引物的5’端标记有生物素；
所述引物HPV33 LF的5’端标记有荧光基团；
所述引物HPV33 BIP的5’端标记有生物素；
所述引物HPV52 BIP的5’端标记有荧光基团；
所述引物HPV52 LB的5’端标记有生物素；
所述引物HPV58 BIP的5’端标记有荧光基团；
所述引物HPV58 LB的5’端标记有生物素。
3.根据权利要求2所述的HPV检测引物组，其特征在于，所述荧光基团为FAM或FITC。
4.权利要求1~3任一项所述的HPV检测引物组在制备检测试剂盒中的应用。
5.一种检测HPV的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1~3任一项所述的HPV检测引物组和检测试剂。
6.根据权利要求5所述的检测HPV的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中引物HPV16FIP、引物HPV16 BIP、引物HPV18 FIP、引物HPV18 BIP、引物HPV33 FIP、引物HPV33 BIP、引物HPV52 FIP、引物HPV52 BIP、引物HPV58 FIP或引物HPV58 BIP的终浓度独立的为1.6~2.4μmol/L。
7.根据权利要求5所述的检测HPV的试剂盒，其特征在于，所述检测试剂包括等温扩增缓冲液、dNTP和Bst DNA聚合酶。
8.根据权利要求7所述的检测HPV的试剂盒，其特征在于，所述等温扩增缓冲液包括Tris-HCl、(NH4)2SO4、KCl、MgSO4和Tween-20。
9.根据权利要求5所述的检测HPV的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括胶体金免疫层析试纸条，所述胶体金免疫层析试纸条包括底板、样品垫、判读区和吸水垫；所述样品垫、判读区和吸水垫设置于底板上；所述判读区上设置检测线和质控线；
所述检测线中包被有FAM抗体，FAM抗体的浓度为0.05~0.15mg/mL；
所述质控线中包被有biotin-BSA溶液，所述biotin-BSA溶液的浓度为1.5~3mg/mL。
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Denomination of invention: HPV detection primer set, kit and their applications

Granted publication date: 20231124

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Pledgor: JIANGSU MICS MEDICAL TECHNOLOGY Co.,Ltd.

Registration number: Y2024980038867

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