KR101174299B1

KR101174299B1 - 카세인 가수분해물, 그 제조법 및 그 용도

Info

Publication number: KR101174299B1
Application number: KR1020067000142A
Authority: KR
Inventors: 나오유키 야마모토; 세이이치 미즈노; 신고 니시무라; 다카노부 고토우; 게이이치 마츠우라; 다다시 시노다
Original assignee: 칼피스가부시키가이샤
Priority date: 2003-08-01
Filing date: 2004-07-30
Publication date: 2012-08-16
Also published as: EA200600349A1; EP1669463B1; HK1093991A1; TW200507869A; CN1832958A; BRPI0413242A; PT1661909E; TWI349676B; DK1669463T3; EP1661909A4; WO2005012334A1; CN1833031A; KR20060120567A; KR101115560B1; JP5341300B2; CA2532537A1; NZ545340A; AU2004261855B2; US20070299014A1; KR101115557B1

Abstract

본 발명은, 생체 내에서의 효소 분해 작용을 최소한으로 억제한 생체 내 비분해성 펩티드 등의 펩티드 및 유리 아미노산을 포함하고, 특히, 생체 내에서의 혈압강하 작용 등의 기능 발현이 기대되는 카세인 가수분해물, 그 제조법 및 그 용도에 관한 것으로, 본 발명의 카세인 가수분해물은, 동물젖 카세인을 평균 쇄장이 아미노산 잔기수로서 2.1 이하로 가수분해해서 얻고, 유리 아미노산 및 Xaa Pro 및 Xaa Pro Pro 등의 생체 내 비분해성 펩티드 등의 펩티드를 포함하고, ACE 저해 활성 또는 혈압강하 작용을 나타낸다.

효소, 펩티드, 유리 아미노산, 혈압강하, 카세인, Xaa Pro, Xaa Pro Pro, ACE 저해 활성, 프로테아제.

Description

카세인 가수분해물, 그 제조법 및 그 용도{CASEIN HYDROLYZATE, PROCESS FOR PRODUCING THE SAME AND USE THEREOF}

본 발명은, 동물젖 카세인을 가수분해해서 얻고, 앤지오텐신변환 효소저해 활성, 혈압강하 작용을 비롯한 여러가지 기능을 기대할 수 있고, 각종 식품, 의약 등에 이용가능한 카세인 가수분해물, 그 제조법 및 그 용도에 관한 것이다.

종래부터, 혈압강하 작용, 항균활성, 칼슘 가용화 작용, 면역조절 작용 등의 여러 가지 기능을 갖는 펩티드가 다수 보고되고, 식품 및 의약 등에 이용되고 있다.

예를 들면, 혈압강하 작용을 갖는 펩티드로서는, 앤지오텐신변환 효소(이하, ACE로 생략한다) 저해 활성을 갖는 펩티드의 제안이 많다. ACE는, 생체 내에 있어서 전구체인 앤지오텐신Ⅰ로부터 혈관수축 활성을 갖는 앤지오텐신Ⅱ로 변환해서 혈압을 상승시킨다. 이 때문에, ACE저해 활성을 갖는 펩티드는, ACE를 저해함으로써 생체 내에 있어서 앤지오텐신Ⅱ의 생산을 억제하기 때문에 혈압강하 작용을 발휘하는 것이 기대되고 있다. 통상, 혈압강하 작용을 갖는 펩티드의 개발에 임해서는, 우선, ACE저해 활성을 나타내는 펩티드의 탐색이 행하여지는 경우가 많기 때문에 ACE저해 활성을 지표로 한 혈압강하 작용을 갖는 펩티드의 제안이 많아지고 있 다. 그리고, 이러한 ACE저해 활성을 지표로 한 혈압강하제가, 지금까지 많이 제안되어, 고혈압증의 예방이나 치료에 이용되고 있다.

상기 ACE저해 활성을 지표로 한 혈압강하 작용을 나타내는 펩티드 등의 기능성 펩티드의 제조에 있어서는, 예를 들면, 식품용 단백질을 효소 분해해서 기능성 펩티드를 제조할 경우, 기능 발현 효과 등을 높이기 위해서, 이 효소 분해 후에 그 분해물을 농축, 정제 또는 단리하는 등의 번잡한 공정을 행할 필요가 많다.

또, 일반적으로 소화관으로부터 혈액 중에 흡수되어, 생체 내 조직에 있어서 기능 발현하는 타입의 펩티드는, 생체 내로의 흡수 효율이 높고, 생체 내에서의 각종 분해 효소군에 의한 분해 저항성이 높은 생체 내 비분해성 펩티드가 유효하다고 추정된다. 그러나, 어떤 펩티드 등을 포함할 경우에 생체 내에서의 분해 저항성이 높아질지에 관한 상세한 내용은 알고 있지 않다. 그래서, 생체 내에서의 분해 저항성이 높고, 효소 분해 후에 그 분해물을 농축, 정제 또는 단리하는 등의 번잡한 공정을 반드시 행하지 않아도 원하는 기능을 유효하게 발현할 수 있는 식품용 또는 의약용 등의 효소 분해물, 및 그 제조법의 개발이 기대되고 있다.

예를 들면, 특허문헌 1에는, 대두 단백질을 원료로 하여, 엑소프로테아제 활성을 실질적으로 갖지 않고 엔도프로테아제 활성만을 갖는 효소의 2종 이상을 동시 또는 순차적으로 작용시켜, 생성하는 유리 아미노산이 5% 이하이며, 디펩티드 및 트리펩티드를 주성분으로 하는 평균 쇄장 3 이하의 장관흡수성이 우수한 저분자 펩티드 혼합물의 제조법이 제안되어 있다. 또, 특허문헌 2에는, 가열 변성시킨 대두 단백질을, 아스페르길루스?오리재 유래의 프로테아제 등의 효소에 의해 분해해서 이루어지고, Ala Tyr, Gly Tyr Tyr, Ala Asp Phe, Ser Asp Phe로 이루어지는 디펩티드 및 트리펩티드를 유효성분으로서 포함하고, 바람직하게는 평균 펩티드 쇄장 2～4이며, 유리 아미노산을 20～30중량% 함유하는 대두 단백질 분해물을 이용한 기능성 식품 및 그 제조법이 제안되어 있다.

그러나, 이들 대두 단백질을 원료로 하는 효소 분해물은, 동물젖 카세인을 원료로 하는 효소 분해물과는 그 내용물이 크게 다르다. 따라서, 상기 특허문헌에는, 동물젖 카세인을 원료로 했을 경우에 있어서의, 유효성분의 농도가 높고, 생체흡수성이 우수하고, 게다가 농축, 정제, 단리 등의 번잡한 공정을 반드시 행하지 않고 이용할 수 있는 카세인 분해물의 제조법, 및 카세인 가수분해물에 대해서는 시사되어 있지 않다.

한편, 특허문헌 3 및 4에는, 동물젖 카세인을 프로테아제 및 펩티다아제 등에 의해 효소 분해하는 각종 기능성을 갖는 펩티드의 제조법, 및 이 제조법으로 얻어진 기능성을 갖는 특정 펩티드가 제안되어 있다.

그러나, 이들 특허문헌에 기재되어 있는 효소 분해물은, 특정 유효성분인 펩티드를 얻기 위한 것이며, 동물젖 카세인을 평균 쇄장 2.1 이하로 가수분해하는 것, 그 구체적 방법, 또한 이러한 특정 평균 쇄장 등을 갖는 카세인 가수분해물의 유효성에 대해서는 교시되어 있지 않다.

특허문헌 1:일본국 특개평5-252979호 공보

특허문헌 2:일본국 특개2003-210138호 공보

특허문헌 3:일본국 특개평6-128287호 공보

특허문헌 4:일본국 특개2001-136995호 공보

(발명이 해결하고자 하는 과제)

본 발명의 과제는, 생체 내에서의 효소 분해 작용을 최소한으로 억제한 생체 내 비분해성 펩티드 및 유리 아미노산을 포함하고, 특히, 생체 내에서의 혈압강하 작용 등의 기능 발현이 기대되는 카세인 가수분해물을 제공하는 것에 있다.

본 발명의 다른 과제는, 상기 카세인 가수분해물을, 용이하게, 게다가 번잡한 공정을 반드시 행하지 않고 효율적으로 얻는 것이 가능한 카세인 가수분해물의 제조법을 제공하는 것에 있다.

본 발명의 다른 과제는, 생체 내 비분해성 펩티드 및 유리 아미노산을 포함하고, 생체에 있어서의 우수한 혈압강하 작용을 기대할 수 있고, 각종 기능성 식품 또는 의약에 이용가능한 ACE저해 활성 또는 혈압강하 활성을 갖는 제제를 제공하는 것에 있다.

(과제를 해결하기 위한 수단)

본 발명자들은, 상기 과제를 해결하기 위해서 예의 검토한 결과, 동물젖 카세인을 평균 쇄장이 아미노산 잔기수로 2.1 이하까지 가수분해함으로써, 트리펩티드 및 디펩티드 등의 저분자 펩티드 및 유리 아미노산을 포함하는 카세인 가수분해물을 얻을 수 있고, 이 가수분해물 중에는, 카르복시 말단에 Pro잔기를 갖는 생체 내 비분해성 펩티드 분자 및 유리 아미노산을 효율적으로 함유시킬 수 있는 것을 찾아내었다.

그리고, 이 카르복시 말단에 Pro잔기를 갖는 생체 내 비분해성 펩티드는, 생체 내 펩티다아제군에 대하여 분해 저항성이 높은 것을 기대할 수 있기 때문에, 그 자체의 기능을 생체 내에 있어서 충분히 발휘할 수 있는 가능성이 높고, 더욱이, 디펩티드 및 트리펩티드 등의 생체흡수성이 양호한 펩티드의 비율이 높으므로, 상기 카세인 가수분해물이, 생체에 있어서의 혈압강하 작용 등의 각종 기능을 충분히 발현할 수 있는 것을 찾아내어 본 발명을 완성하였다.

더욱이, 본 발명자들은, 공지의 각종 효소군으로부터 본 발명의 카세인 가수분해물을 효율적으로 얻을 수 있는 효소를 탐색한 결과, 특히, 특정 효소군이, 본 발명의 카세인 가수분해물을 보다 효율적으로 생산할 수 있는 것도 찾아내었다.

본 발명에 의하면, 동물젖 카세인을 평균 쇄장이 아미노산 잔기수로서 2.1 이하로 가수분해해서 얻고, 유리 아미노산 및 펩티드를 포함하는 카세인 가수분해물이 제공된다. 특히, 상기 펩티드가, Xaa Pro배열을 갖는 디펩티드 및 Xaa Pro Pro배열을 갖는 트리펩티드로 이루어지는 생체 내 비분해성 펩티드를 포함하고, 또한 Xaa Pro배열을 갖는 디펩티드의 함유 비율이 분해물 중의 펩티드 및 유리 아미노산의 합계에 대하여 5중량% 이상이며, Xaa Pro Pro배열을 갖는 트리펩티드의 함유 비율이 분해물 중의 펩티드 및 유리 아미노산의 합계에 대하여 1중량% 이상인 카세인 가수분해물이 제공된다. 한편, Xaa는 임의의 아미노산을 의미한다.

또 본 발명에 의하면, 상기 카세인 가수분해물의 제조법으로, 카세인 가수분해물의 평균 쇄장이 아미노산 잔기수로서 2.1 이하로 분해할 수 있는 효소군을 이용하여, 동물젖 카세인을, 이 평균 쇄장 2.1 이하로 가수분해하는 공정(A)을 포함하는 카세인 가수분해물의 제조법이 제공된다.

더욱이 본 발명에 의하면, 상기 카세인 가수분해물을 유효성분으로서 포함하고, ACE저해 활성 또는 혈압강하 작용을 갖는 제제가 제공된다.

또한 본 발명에 의하면, ACE저해 활성 또는 혈압강하 작용을 갖는 기능성 식품 또는 의약을 제조하기 위한, 상기 카세인 가수분해물의 사용이 제공된다.

(발명의 효과)

본 발명의 카세인 가수분해물은, 동물젖 카세인을 평균 쇄장이 아미노산 잔기수로서 2.1 이하로 가수분해해서 얻고, 유리 아미노산 및 생체 내 비분해성 펩티드 등의 저분자 펩티드를 함유하므로, 예를 들면, 경구에 의해 우수한 생체 내 흡수성 및 생체에 있어서의 각종 기능 발현을 기대할 수 있다. 따라서, 여러 가지 기능성 식품, 의약품, 식품첨가물로의 이용을 기대할 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 가수분해물을 유효성분으로 하고, ACE저해 활성 또는 혈압강하 작용을 갖는 제제로의 사용을 기대할 수 있다.

본 발명의 제조법은, 카세인 가수분해물의 평균 쇄장이 아미노산 잔기수로서 2.1 이하로 분해할 수 있는 효소군을 이용하여, 동물젖 카세인을, 이 평균 쇄장 2.1 이하로 가수분해하는 공정(A)을 포함하므로, 본 발명의 카세인 가수분해물을 용이하게, 게다가 효율적으로 얻을 수 있다. 따라서, 본 발명의 카세인 가수분해물의 공업적 생산에 유효하다.

도 1은, 실시예 1에서 행한 Xaa Pro, Xaa Pro Pro의 생체 내 소화 흡수성 및 분해 저항성 평가 결과를 도시한 그래프이다.

도 2는, 실시예 1에서 조제한 카세인 가수분해물 분말의 용량 의존적인 혈압강하 작용의 실험 결과를 도시한 그래프이다.

도 3은, 분석예 1에 있어서 행한 0～0.6M의 직선 농도구배에 의한 결합 단백질의 용출 패턴과 단백질 분해 활성과의 관계를 도시한 그래프이다.

도 4는, 실시예 3에서 행한 카세인의 효소군에 의한 분해 시간과 얻어진 카세인 가수분해물의 ACE저해 활성과의 관계를 도시한 그래프이다.

도 5는, 실시예 3에서 행한 카세인의 효소군에 의한 카세인 가수분해물의 평균 쇄장과 ACE저해 활성과의 관계를 도시한 그래프이다.

(발명을 실시하기 위한 최선의 형태)

이하, 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다.

본 발명의 카세인 가수분해물은, 동물젖 카세인을 아미노산 잔기수로서 평균 쇄장이 특정 범위가 되도록 가수분해해서 얻고, 유리 아미노산 및 펩티드를, 바람직하게는 카세인 가수분해물 전체량에 대하여 80중량% 이상, 바람직하게는 80～90중량% 포함한다. 특히, 이 가수분해물이, 펩티드로서, Xaa Pro배열을 갖는 디펩티드 및 Xaa Pro Pro배열을 갖는 트리펩티드로 이루어지는 생체 내 비분해성 펩티드를 특정 비율로 포함하는 것이 바람직하다. 단, 펩티드는 펩티드염이여도 좋다.

여기에서, 평균 쇄장이란, 카세인산 가수분해물의 총 아미노산의 몰수에 대한, 같은 중량의 동물젖 카세인을 가수분해했을 때에 생산되는 펩티드 및 유리 아 미노산의 합계 몰수의 비로 나타낼 수 있다. 카세인산 가수분해물이란, 카세인 단백질을 아미노산으로까지 분해한 것이다.

이 평균 쇄장은, 예를 들면, 아미노기에 반응해서 발광하는 OPA(o-프탈알데히드)시약을 이용한 OPA법에 의해, 가수분해물 중의 몰 농도를 평가하고, 평균 쇄장=(카세인산 가수분해물 중의 몰수)/(카세인 효소 가수분해물 중의 몰수)로서 구할 수 있다.

또, 생체 내 비분해성 펩티드란, 생체의 장관으로부터 흡수되었을 때에, 생체 내 펩티다아제군에 대하여 분해 저항성이 높고, 카르복시 말단에 Pro를 갖는 디펩티드 Xaa Pro 및 트리펩티드 Xaa Pro Pro를 의미한다.

본 발명에 있어서, 동물젖 카세인을 가수분해해서 얻어지는 분해물의 평균 쇄장은, 아미노산 잔기수로서 2.1 이하, 바람직하게는 1.1～2.1, 특히 바람직하게는 1.3～2.1이다. 이 평균 쇄장이 2.1을 넘을 경우에는, 원하는 디펩티드 및 트리펩티드, 또한 유리 아미노산의 비율이 저하하고, 원하는 생체흡수성, 또한 생체 내 비분해성 펩티드의 함유 비율이 저하한다.

본 발명의 카세인 가수분해물 중에 포함되는 Xaa Pro배열을 갖는 디펩티드의 함유 비율은, 분해물 중의 펩티드 및 유리 아미노산의 합계에 대하여 통상 5중량% 이상, 바람직하게는 5～25중량%이다. 이 함유 비율이 5중량% 미만인 경우에는, 원하는 생체 내 흡수성 및 기능 발현이 저하할 우려가 있어 바람직하지 못하다.

본 발명의 카세인 가수분해물 중에 포함되는 Xaa Pro Pro배열을 갖는 트리펩티드의 함유 비율은, 분해물 중의 펩티드 및 유리 아미노산의 합계에 대하여 통상 1중량% 이상, 바람직하게는 1～5중량%이다. 이 함유 비율이 1중량% 미만인 경우에는, 원하는 생체 내 흡수성 및 기능 발현이 저하할 우려가 있어 바람직하지 못하다.

본 발명의 카세인 가수분해물에 있어서, 상기 Xaa Pro배열을 갖는 디펩티드 및 Xaa Pro Pro배열을 갖는 트리펩티드의 Xaa는, 임의의 아미노산으로 좋다.

본 발명의 카세인 가수분해물은, 예를 들면, Xaa Pro배열을 갖는 디펩티드로서, Ile Pro, Glu Pro, Arg Pro, Gln Pro, Met Pro 및 Tyr Pro를 포함하고, Xaa Pro Pro배열을 갖는 트리펩티드로서, Ser Pro Pro, Ile Pro Pro 및 Val Pro Pro를 포함하는 카세인 가수분해물을 바람직하게 들 수 있다.

본 발명의 카세인 가수분해물에 있어서는, 이러한 디펩티드 및 트리펩티드를 포함함으로써, 특히, ACE저해 활성 또는 혈압강하 작용이 유효하게 발현된다.

본 발명의 카세인 가수분해물은, 펩티드 이외에 유리 아미노산을 포함하지만, 유리 아미노산의 함유 비율은, 분해물 중의 펩티드 및 유리 아미노산의 합계에 대하여 통상 35～50중량%, 바람직하게는 40～45중량%이다.

본 발명의 카세인 가수분해물에는, 상기 펩티드 및 유리 아미노산 이외에, 예를 들면 시판의 동물젖 카세인 등에 통상 포함되는, 지질, 회분, 탄수화물, 식물섬유, 수분 등이 10～20중량%정도 포함되어 있어도 좋고, 또, 필요에 따라 이들 중의 적당한 성분의 일부 혹은 전부를 제거해도 좋다.

본 발명의 카세인 가수분해물을 제조하기 위해서는, 예를 들면, 카세인 가수분해물의 평균 쇄장이 아미노산 잔기수로서 2.1 이하로 분해할 수 있는 효소군을 이용하여, 동물젖 카세인을, 이 평균 쇄장 2,1 이하로 가수분해하는 공정(A)을 포함하는 본 발명의 제조법에 의해 얻을 수 있다.

동물젖 카세인은, Pro를 많이 포함하는 식품 등에 이용되는 안전성이 확인된 단백질이며, 예를 들면, 우유, 말젖, 산양젖, 양젖 등의 카세인을 들 수 있고, 특히 우유 카세인을 바람직하게 사용할 수 있다.

동물젖 카세인을 가수분해할 때의 카세인 농도는, 특별히 한정되지 않지만 본 발명의 상기 가수분해물을 효율적으로 생산하기 위해서, 3～19중량%가 바람직하다.

본 발명의 제조법에 이용하는 상기 효소군으로서는, 카세인 분해물의 평균 쇄장이 아미노산 잔기수로서 2.1 이하로 분해할 수 있는 효소를 적당히 선택해서 조합한 효소군이라면 좋고, 예를 들면, Xaa Pro Xaa 또는 Xaa Pro Pro Xaa의 카르복시 말단의 Pro Xaa배열이 절단 가능한 펩티다아제를 포함하는 효소군(X)을 바람직하게 들 수 있다.

상기 효소군(X)은, 활성 중심에 세린을 갖고, 세린 타입의 프로테이나아제 혹은, 활성 중심에 금속을 갖는 금속 프로테이나아제를 포함하는 것이 바람직하다. 금속 프로테이나아제로서는, 중성 프로테아제Ⅰ, 중성 프로테아제Ⅱ 및 류신아미노펩티다아제 등을 들 수 있고, 이들의 적어도 1종을 또한 포함하는 것이, 원하는 가수분해물을 효율적으로, 또한 단시간으로, 더욱이 1단계 반응으로 얻을 수 있는 점에서 바람직하다. 또 상기 Pro Xaa배열이 절단 가능한 펩티다아제로서는, 등전점이 산성영역을 나타내는 효소인 것이 바람직하다.

상기 효소군 또는 효소군(X)으로서는, 예를 들면, 아스페르길루스?오리재(Aspergillus oryzae) 등의 누룩균 유래의 균체외 효소군을 들 수 있다. 이러한 균체외 효소군은, 적당한 배지에서 균체를 배양하고, 균체외에 생산되는 효소를 수추출한 효소군 등을 들 수 있고, 특히, 아스페르길루스?오리재 유래의 균체외 효소군 중 등전점이 산성역을 나타내는 효소군을 바람직하게 들 수 있다.

상기 아스페르길루스?오리재 유래의 균체외 효소군으로서는, 시판품을 이용할 수 있고, 예를 들면, 스미짐FP, LP 또는 MP(이상, 등록상표, 신니폰가가쿠(주)제), 우마미자임(등록상표, 아마노 엔자임(주)제), Sternzyme B11024, PROHIDROXYAMPL(이상, 상품명, 가부시키가이샤 히구치쇼카이제), 오리엔타제 ONS(등록상표, 한큐 바이오인더스트리(주)제), 데나짐AP(등록상표, 나가세세이가가쿠사제) 등을 들 수 있고, 특히, 스미짐FP(등록상표, 신니폰가가쿠(주)제)의 사용이 바람직하다.

이들 시판의 효소군을 이용할 경우에는, 통상, 지적조건이 설정되어 있지만, 상기 본 발명의 카세인 가수분해물을 얻을 수 있도록 조건, 예를 들면, 사용 효소량이나 반응 시간 등을 이용하는 효소군에 따라 적당히 변경해서 행할 수 있다.

상기 효소군에 의해 가수분해할 때의 효소군은, 예를 들면, 동물젖 카세인을 용해한 수용액에, 효소군/동물젖 카세인이 중량비로 1/1000이상, 바람직하게는 1/10～1/1000, 특히 바람직하게는 1/10～1/100, 더욱 바람직하게는 1/10～1/40의 비율로 첨가할 수 있다.

반응 조건은, 효소군에 따라 목적으로 하는 카세인 가수분해물을 얻을 수 있 도록 적당히 선택할 수 있지만, 통상 25～60℃, 바람직하게는 45～55℃에 있어서, pH를 3～10, 바람직하게는 5～9, 특히 바람직하게는 5～8로 조정해서 행할 수 있다. 또, 효소반응 시간은, 통상 2～48시간, 바람직하게는 7～15시간으로 행할 수 있다.

상기 효소반응의 종료는, 효소를 실활시킴으로써 행할 수 있고, 통상, 60～110℃에서 효소를 실활시켜, 반응을 정지시킬 수 있다.

상기 효소반응 정지 후, 필요에 따라 침전물을, 원심분리 제거나 각종 필터 처리에 의해 제거하는 것이 바람직하다.

또, 필요에 따라, 얻어지는 가수분해물로부터 쓴 맛이나 구린내를 갖는 펩티드를 제거할 수도 있다. 이러한 쓴 맛 성분이나 구린내 성분의 제거는, 활성탄 또는 소수성 수지 등을 이용하여 행할 수 있다. 예를 들면, 활성탄을, 사용한 카세인량에 대하여 1～20중량% 얻어진 가수분해물 중에 첨가하고, 1～10시간 반응시킴으로써 행할 수 있다. 사용한 활성탄의 제거는, 원심분리나 막처리 조작 등의 공지의 방법에 의해 행할 수 있다.

상기 공정(A)에 의해 얻어지는 카세인 가수분해물을 포함하는 반응액은, 그대로 음료 등의 액체제품에 첨가 이용할 수 있다. 또, 본 발명의 카세인 가수분해물의 범용성을 높이기 위해서, 상기 반응액을 농축 후, 건조해 분말의 형태로 하는 것이 바람직하다.

이러한 분말은, 각종 기능성 식품, 그 첨가물, 의약 또는 그 유효성분으로서 이용할 수 있다. 또, 상기 분말에는, 영양적 밸런스나 풍미 등을 개선하기 위해 서, 각종 보조 첨가제를 함유시킬 수도 있다. 예를 들면, 각종 탄수화물, 지질, 비타민류, 미네랄류, 감미료, 향료, 색소, 텍스처 개선제 등을 들 수 있다.

이러한 본 발명의 카세인 가수분해물을 포함하는 분말은, 예를 들면, 음료, 요구르트, 유동식, 젤리, 캔디, 레토르트 식품, 정과(錠菓), 쿠키, 카스테라, 빵, 비스켓, 초콜렛 등에 첨가해서 사용할 수 있는 것 외에, 캡슐, 정제 등의 형태로 성형 등 해서 이용할 수도 있다.

본 발명의 카세인 가수분해물은, 상기의 사용법이 가능하므로, 각종 스포츠 음료, 일반음료, 일반식품, 영양보조 식품, 영양기능 식품 등에 보건효과를 부여한 기능성 식품의 제조에, 더욱이 의약의 제조에 유효하게 이용할 수 있다.

예를 들면, 본 발명의 카세인 가수분해물은, 후술하는 실시예에 있어서, ACE저해 활성 및 혈압강하 작용을 갖는 것을 확인하고 있으므로, 이들을 갖는 기능성 식품의 제조용 또는 의약의 제조용 등의 제제로서 사용할 수 있다.

본 발명의 카세인 가수분해물을 ACE저해 활성 및 혈압강하 작용을 갖는 제제로서 이용할 경우의 투여량은, 통상, 경구투여에 의한 사람인 경우, 본 발명의 카세인 가수분해물 중의 펩티드 및 유리 아미노산량으로, 1회당 0.1～100㎎/㎏, 바람직하게는 1～20㎎/㎏ 섭취할 수 있는 양이 바람직하다. 따라서, 본 발명의 카세인 가수분해물이나 ACE저해 활성 및 혈압강하 작용을 갖는 제제를 각종 음료, 식품, 의약에 첨가해서 사용할 경우에는, 상기 투여량을 목표로 적당히 선택할 수 있다.

본 발명의 상기 제조법으로 있어서, 상기 효소군(X)을 포함하는 효소군을 이용해서 동물젖 카세인을 1단계 반응에 의해 가수분해하는 방법은, 동물젖 카세인에 포함되는 Xaa Pro Pro, 특히, 혈압강하 작용, 항스트레스 작용 등의 각종 기능이 이미 확인되어 있는 Ile Pro Pro 및/또는 Val Pro Pro가 종래의 제조법에 비해서 1단계 반응에 의해 이론회수율에 가깝고, 예를 들면, 60% 이상, 바람직하게는 70% 이상의 고효율로 얻을 수 있다. 따라서, 이러한 제조법은, 본 발명의 카세인 가수분해물의 제조법의 이외에, 동물젖 카세인, 혹은 Xaa Pro Pro배열을 많이 포함하는 식품 단백질로부터, 목적으로 하는 Xaa Pro Pro를 많이 포함하는 분해물 또는 그 정제물의 제조법으로서도 유효한 방법이다.

(실시예)

이하, 본 발명을 실시예, 분석예 및 비교예에 의해 더욱 상세하게 설명하지만, 본 발명의 범위는 이들로 한정되지 않는다.

실시예 1, 비교예 1～8

우유 유래 카세인(니폰NZMP사제) 1g을 약 80℃로 조정한 증류수 99g에 더해서 충분히 교반한 후, 1N수산화 나트륨(와코쥰야쿠사제)용액을 첨가해서 pH7.0으로 하고, 또 온도를 20℃로 조정해서 기질용액을 조제하였다.

얻어진 기질용액에 표 1에 나타낸 시판의 각종 효소를, 효소/카세인의 중량비가 1/25가 되도록 첨가하고, 50℃에서 14시간 반응시키고, 이어서 110℃에서 10분간의 오토클레이브를 행하여 효소를 실활시켜, 카세인 효소 분해물 용액을 얻었다. 그 다음에, 얻어진 효소 분해물 용액을 스프레이 드라이어에 의해 건조하고, 분말을 조제하였다.

상기와 같이 얻어진 분말 중의 함유 성분의 분석을 행하였다. 단백질은 켈 달법으로 측정하고, 아미노산에 대해서는 아미노산 분석 장치로 측정하였다. 또, 이 단백질량으로부터 아미노산을 뺀 양을 펩티드량으로 하였다. 또한, 지질은 산분해법으로, 회분은 직접 회화(灰化)법으로, 수분은 상압가열 건조법으로 각각 측정하였다. 한편, 100%에서 각 성분을 뺀 나머지를 탄수화물량으로 하였다. 그 결과, 아미노산은 35.8중량%, 펩티드는 45.7중량%, 수분은 6.6중량%, 지질은 0.2중량%, 회분은 4.1중량% 및 탄수화물은 7.6중량%이었다.

<평균 쇄장의 측정>

얻어진 각 분말에 포함되는 아미노산 및 펩티드의 평균 쇄장은, 그것에 포함되는 유리 아미노산 및 펩티드의 아미노기에 반응하는 OPA시약으로 몰수를 측정하고, 동일하게 측정한 카세인산 가수분해물의 몰수와의 비로 평가하였다. 결과를 표 1에 나타낸다.

메탄올 1ml에 o-프탈알데히드(형광분석용 특급시약, 나칼라이 테스크사제) 40㎎을 용해시켜, β-메르캅토에탄올 100μl을 더하였다. 미리 조제해 둔 100mM의 4붕산 나트륨 용액 25ml에, 20% 도데실 황산 나트륨 2.5ml을 더한 것을 이용하여, 상기 용해한 o-프탈알데히드를 25ml로 희석하고, 다시 증류수로 50ml로 함으로써 OPA시약을 조제하였다.

상기 각 효소를 반응시킨 1% 카세인 효소가수분해물 분말시료(표 1)를, 적당한 용매에 적당한 농도로 용해하고, 15000rpm으로 10분간 원심분리를 행하여, 상청 50μl을 분취하였다. 계속해서, 상기 OPA시약을 1ml 더해, 잘 교반하고, 실온에서 5분간 방치한 후, 흡광광도계(상품명Ubest-35, 니폰분코(주)제)로 340nm의 흡수를 측정하였다.

검량선은 1%의 카세인산 가수분해물을 조제하고, 적절하게 희석한 것을 이용해서 동일하게 측정한 결과로부터, 흡광도와 몰농도의 관계를 구하였다. 그리고, 평균 쇄장은 이하의 식에 따라서 계산하였다.

평균 쇄장=(1% 카세인산 가수분해물의 몰 농도)/(각 시료 1% 카세인 효소 가수분해물의 몰 농도)

<펩티드 구성 아미노산의 측정>

실시예 1에서 조제한 분말을 적량의 증류수에 용해하고, 자동 펩티드 분석기 (상품명 PPSQ-10(주)시마즈세이사쿠쇼제)를 이용해 해석하여, 분말 중에 있어서 N말단측으로부터 순서대로 어떠한 아미노산이 위치하는가를 조사하였다. 결과를 표 2에 나타낸다. 한편, 자동 펩티드 분석기는 유리 아미노산을 검출하지 않는다.

또, 제 5 잔기의 아미노산의 합계는 120pmol, 제 6 잔기의 아미노산의 합계는 100pmol이었다. 이들의 결과로부터, 상기 분말 중에 포함되는 펩티드의 대부분이 디펩티드 및 트리펩티드인 것을 알 수 있었다. 또, 제 2 잔기의 아미노산이 Pro인 펩티드의 비율이 49.5%으로 현저하게 상승하고 있었다. 더욱이 제 3 잔기의 아미노산이 Pro인 펩티드의 비율도 29.8%로 많았다.

따라서, 상기 분말에는, Xaa Pro 또는 Xaa Pro Pro가 많이 포함되고, 이들 펩티드는 생체 내 프로테아제에 의한 효소 분해 작용에 대한 저항성이 높고, 기능성 펩티드로서의 이용에 최적인 것으로 추정할 수 있다.

표 1에 나타낸 실시예 1에서 조제한 카세인 효소 분해물의 분말 중에 포함되는 Xaa Pro 및 Xaa Pro Pro배열을 갖는 펩티드의 생체 내에서의 소화 흡수성 및 분해 저항성을 확인하기 위해서 래트에 있어서의 경구투여 후의 혈액 중 이행성을 다음과 같이 시험하였다.

우선, 6주령의 SD래트 2마리에, Xaa Pro Pro의 예로서 Val Pro Pro를, 또 Pro를 갖지 않은 디펩티드로서 Gly Gly를 각각 500㎎/마리로 경구 투여하고, 문맥으로부터의 경시 채혈에 있어서의 각종 펩티드의 혈액 중 이행성을 측정하였다. 결과를 도 1에 나타낸다.

도 1에서, Gly Gly는 용이하게 생체 내에서 분해를 받아 Gly가 검출되었지만, Val Pro Pro는 비교적 안정적으로 혈액 중에 흡수되는 것이 확인되었다. 이 결과로부터, Xaa Pro 및 Xaa Pro Pro배열의 디펩티드 및 트리펩티드는, 생체 내에서의 소화 흡수성 및 분해 저항성이 높은 것으로 추정할 수 있다.

<혈압강하 작용의 평가>

표 1에 나타낸 실시예 및 비교예에서 조제한 카세인 가수분해물 분말을, 27주령의 자연발증 고혈압 래트 SHR(수컷) 각 5마리에 체중 1㎏당 32㎎ 경구 투여하였다. 투여 전과 투여 5시간 후의 혈압을, Tail-cuff PB-98(Softron사제)을 이용해서 꼬리 부분 맥압을 측정함으로써 행하여, 혈압의 변동을 평가하였다. 또, 컨트롤로서 상기 각 분말 대신에 카세인을 투여해서 동일한 평가를 행하였다. 한편, 혈압측정 전에는 프리히트 박스(CSI JAPAN사제)로 래트를 45℃에서 8분간 가온하였다. 결과를 표 3에 나타낸다.

표 3의 결과로부터, 컨트롤로서 사용한 카세인에서는 전혀 혈압의 변동이 관측되지 않은 것에 비해, 실시예 1의 분말투여에 의해 혈압강하 작용이 확인되었다. 한편, 비교예의 분말에서는, 모두 혈압값의 변동은 관측되지 않았다. 따라서, Xaa Pro 및 Xaa Pro Pro를 특정량 포함하는 평균 쇄장이 2.1 이하인 실시예 1의 카세인 가수분해물은, 혈압강하 작용이 우수한 것을 알 수 있었다.

또, 실시예 1에서 조제한 카세인 가수분해물 분말을 이용해서 상기 방법에 준하여, 이 분말의 용량 의존적인 혈압강하 작용의 실험을 행하였다. 결과를 표 4 및 도 2에 나타낸다.

<ACE저해 활성의 평가>

소 폐 유래의 ACE(와코쥰야쿠 가부시키가이샤제)를 0.1U가 되도록 pH8.3, 0.1M붕산 완충액에 용해하여, ACE용액을 조제하였다. 표 1에 나타낸 각 효소 분해물의 분말을 증류수에서 50배로 희석한 희석 효소 분해 용액 80μl와, 5mM 히푸릴히스티딜류신(시그마사제) 200μl의 용액과, 상기에서 조제한 ACE용액 20μl을 시험관에 첨가하고, 37℃에서 30분간 반응시켰다. 그 후, 1N염산 250μl을 첨가해서 반응을 정지시킨 후, 아세트산 에틸 1.7ml을 더하고, 교반 후, 아세트산 에틸층 1.4ml를 시험관에 채취하고, 120℃에서 약 60분간 증발 건조시켰다. 건조물에 1ml의 증류수를 첨가하고, 아세트산 에틸 중에 추출된 히푸르산의 228nm에서의 흡광도를 측정하였다. 또, 대조로서, 희석 효소 분해 용액을 첨가하지 않은 것, 및 희석 효소 분해 용액 및 ACE용액을 첨가하지 않은 것에 대해서도 흡광도를 측정하였다. 이들의 흡광도로부터 ACE저해 활성을 이하의 식으로 산출하였다. 결과를 표 3에 나타낸다.

ACE저해 활성(%)＝[(A－B)/A]×100

A:(희석 효소 분해 용액을 첨가하지 않고 ACE용액을 첨가한 것에 있어서의 흡광도)－(희석 효소 분해 용액 및 ACE용액을 첨가하지 않은 것에 있어서의 흡광도)

B:(희석 효소 분해 용액 및 ACE용액을 첨가한 것에 있어서의 흡광도)－(희석 효소 분해 용액을 첨가하고, ACE용액을 첨가하지 않은 것에 있어서의 흡광도)

<효소 분해물 중에 포함되는 펩티드의 측정>

표 1에 나타낸 실시예 1의 효소 분해물의 분말을, 10㎎/ml이 되도록 증류수에 희석 용해하였다. 한편, 표 5에 나타낸 배열을 갖는 각종 화학 합성 표준 펩티드의 25μg/ml, 50μg/ml 및 100μg/ml용액을 작성하고, 이들을 하기 측정 조건에 의한 LC/MS에 의해 분석하였다. 상기 분말용액의 분석에 있어서의 피크 중, 표준 펩티드와 분자량 및 리텐션 타임이 일치하는 것을, 표준 펩티드와 동일한 배열로 하여 동정하였다. 표준 펩티드의 피크와 대비함으로써, 상기 분말 용액 중에 표 4에 나타낸 각종 펩티드가 포함되는 비율을 구하였다. 결과를 표 5에 나타낸다.

또, 상기 분말을 증류수로 희석 용해한 용액 중의 펩티드 및 유리 아미노산량이 8.15mg/ml이며, 펩티드량이 4.57mg/ml이며, 이펩티드 중의 Xaa Pro량이 514.5μg이었으므로, 분말 중의 펩티드 및 유리 아미노산의 합계량에 대한 Xaa Pro의 비율은 6.3중량%이며, 이 펩티드 중의 Xaa Pro Pro량이 116.5μg이었으므로, 분말 중의 펩티드 및 유리 아미노산의 합계량에 대한 Xaa Pro Pro의 비율은 1.4중량%이었다.

<사용 기기>

고속액체 크로마토그래프 질량분석계:LCMS-2010, 시스템 컨트롤러:SCL-10Advp, 오토 인젝터:SIL-10Advp, 송액 펌프:LC-10Advp×2, 컬럼 오븐:CTO-10Avp, 포토다이오드 어레이 검출기:SPD-M10AVP, 온라인 디가서(degasser):DGU-14A(이상, 상품명, (주)시마즈세이사쿠쇼제), 컬럼:Develosil C30-UG-3(2.0㎜I.D.×150㎜L)(노무라가가쿠(주)제).

<측정 조건>

이동상A:0.1중량% 포름산수용액, 이동상B:100% 아세토니드릴 용액, 타임 프로그램:0%B(0분)-7.5%B(30분)-80%B(30.01분)-100%B(35분)-0%B(35.1분)-STOP(45분), 시료주입량:5μl, 컬럼 온도:50℃, 검출 파장:200～300nm, 이온화 모드:ESI(+), 연무화 가스 유량:4.5L/분, 인가 전압:+4.5kV, CDL온도:250℃, 블록 히터 온도:200℃, CDL전압:0.0V, Q-array전압:SCAN, 분석 모드:SIM측정, 분석 범위:EP(m/z=245.2), IP(m/z=229.3), MP(m/z=247.3), QP(m/z=244.2), RP(m/z=272.3), SPP(m/z=300.3), VPP(m/z=312.1), IPP(m/z=326.1), 흡입 시간:0.5초/Ch.

분석예 1

<효소의 특정>

실시예 1에서 사용한 아스페르길루스?오리재 유래의 균체외 효소에 있어서, 본 발명의 카세인 가수분해물을 얻기 위해서 필요한 효소를 이하의 방법에 의해 분석하였다. 한편, 이하의 조작은 특별히 양해가 없는 한 모두 4℃에서 행하였다. 또 특별히 지정이 없는 시약은 모두 와코쥰야쿠(주)제의 특급시약을 사용하였다.

(각종 저해제에 의한 효소군에의 영향)

스미짐FP(등록상표, 신니폰가가쿠고교사제) 2000㎎을, pH7.2의 50mM 인산완충액 10ml에 용해하고, 셀룰로오스 아세테이트막(DISMIC-25cs, 포어 직경 0.45μm, Advantec(주)제)에 의해 불용물을 제거한 것을 미정제 효소용액으로 하였다.

이 미정제 효소용액을 실시예 1과 동일하게 1% 카세인과 반응시켰다. 이 때, 금속 프로테아제의 저해제인, EDTA(에틸렌디아민 4아세트산) 혹은, 세린프로테아제의 저해제인, PMSF(페닐메탄술폰산풀루오리드)를 더해서 반응시키면, 평균 쇄장이 커져, 목적으로 하는 가수분해물은 얻을 수 없었다. 이 때문에, 본 발명의 카세인 가수분해물의 생성에는, 금속 프로테아제 혹은 세린 프로테아제가 중요한 작용을 하고 있는 것으로 여겨진다.

(이온교환 수지에 의한 분리)

음이온 교환 수지인 DEAE sephacel(아머샴바이오사이엔스(주)제) 20ml를 활성화하고, pH7.2의 50mM 인산 완충액에 의해 평형화를 행하고, 직경 1.5㎝×12㎝의 유리 컬럼에 충전하였다. 용출하는 시료는 모두 미흡착 시료로서 회수하면서, 1.0ml/분의 유속으로 상기의 미정제 효소용액을 흡착시키고, pH7.2의 50mM 인산 완충액을 겔 체적의 10배량 사용하여 충분히 세정한 후, 0～600mM NaCl을 포함하는 pH7.2의 50mM 인산 완충액 200ml로 직선 농도구배 용출하였다. 용출액은 5ml씩 100개에 나누어서 분 하고, 각 획분의 280nm의 흡수와 프로테이나아제 활성측정, ACE저해 활성을 각각 평가하였다.

(프로테이나아제 활성의 측정 방법)

형광물질인 카세인 플루오레세인 이소티오시아네이트(FITC-카세인, 시그마사제) 25㎎을 pH7.2의 50mM 인산 완충액 5ml에 용해시킨 것을 기질용액으로서 이용하였다. 각 획분 10μl 및 기질용액 20μl을 더하고, 55℃에서 10분간 반응시킨 후, 5% 트리클로로 아세트산용액 120μl를 더해서 반응을 정지시켰다. 1500rpm으로 원심분리에 의해 상청 60μl를 회수하고, pH8.5의 0.5M 트리스 염산염 3ml에 더해서, 형광측정기(F-1300, 히다치세이사쿠쇼(주)제)를 이용해서 여기파장 485nm 및 형광파장 525nm을 측정하였다.

DEAE sephacel의 각 획분의 280nm의 흡광도측정의 결과로부터, 약 73%정도의 단백질이 음이온 교환 수지에 흡착하고 있는 것이 확인되었다. 도 3에, 0에서 0.6M의 직선 농도구배에 의한 결합 단백질의 용출 패턴과 단백질 분해 활성을 나타낸다.

특히 획분 21～60에, 많은 단백질이 용출되었다. 또 각 획분에 용출된 효소액을 이용해서 카세인을 분해시켰을 경우의 ACE저해 성분의 생성 활성을 평가하였다. 그 결과, 주로 ACE저해 성분의 생성 활성은 획분 20～60에 확인되었다.

한편, FITC-카세인을 기질로 한 프로테이나아제 활성은 주로 획분 19～27(NaCl로 0.1M～0.2M)에 용출되고 있어, ACE저해 성분의 생성에 프로테이나아제 활성이 중요한 활동을 하고 있는 것이 나타나 있다. 이상의 결과로부터, 카세인으로부터 ACE저해 성분을 정제하는 효소활성에 프로테이나아제 활성이 중요한 역할을 하고 있는 것을 알 수 있었다.

(함유프로테이나아제의 특정)

상기 DEAE sephacel 용출획분 중, 프로테이나아제 활성이 있었던 획분 21～35을 모아, pH7.2의 5mM 인산 완충액 5리터에 대하여 투석을 행하였다. Sephacryl S-300 HR(아머샴바이오사이엔스(주)제)을, 200mM의 NaCl을 포함하는 pH7.2의 50mM 인산 완충액에 현탁하고, 충분히 탈기한 후, 직경 18㎝×100㎝의 유리 컬럼에 충전하였다. 이 컬럼은 2ml/분의 유속을 유지하고, 200mM의 NaCl을 포함하는 pH7.2의 50mM 인산 완충액으로 충분히 평형화하였다. 이 컬럼에 투석 후의 시료를 제공하고, 10ml씩 100개의 획분을 회수하였다. 이들 획분은 280nm의 흡수와 FITC-카세인을 기질로 한 프로테이나아제 활성측정을 행하였다.

(폴리아크릴아미드겔 전기 영동(泳動))

각 획분을 10μl 분취하고, pH6.8의 0.125M 트리스버퍼, 3% SDS, 5% β-메르캅토에탄올, 10% 글리세롤, 0.01% 브로모페놀 블루로 이루어지는 시료 버퍼 10μl를 더하고, 95℃에서 5분간 가온하고, 실온에서 냉각하였다. 이 시료를 Laemmli의 방법(Nature, 227,680(1970))을 따라서, 미니슬랩(아토사제)으로 지정 농도의 폴리아크릴아미드겔에 제공해서 30mA/장의 조건으로 전기 영동을 행하였다. 영동 종료 후의 겔은, 0.25% 쿠마시 브릴리언트 블루 R-250, 50% 메탄올 및 7.5% 아세트산으로 이루어지는 쿠마시 브릴리언트 블루 염색액에 10분간 담그고, 5% 메탄올 및 7.5% 아세트산으로 이루어지는 탈색액으로 배경이 완전히 탈색할 때까지 침투하였다. 분자량의 추정에는 분자량 마커(아머샴바이오사이엔스(주)제)를 사용하여, 각 단백질 밴드의 이동도로부터 산출하였다.

음이온 교환 수지에 흡착한 ACE저해 성분의 생성 활성을 나타내는 획분을 Sephacryl S-300수지로 겔 여과 분리를 행해 분자량 약 45kDa에 상당하는 획분에 활성이 확인되고, 이 획분을 12.5% 겔에 의한 SDS-폴리아크릴아미드겔 전기 영동법으로 분석한 바, 44kDa와 40kDa에 거의 단일의 밴드가 얻어지고, 이 밴드를 잘라 내어 N말단 배열 해석을 행한 바, 44kDa의 밴드에서는 기지의 누룩균의 중성프로테아제Ⅰ에 상동성이 높은 배열이었다. 또, 40kDa의 밴드에서는 누룩균의 중성프로테아제Ⅱ에 상동성이 높은 배열이었다.

이상의 결과로부터, 음이온 교환 수지에 흡착한 카세인으로부터 ACE저해 성분을 생성하는 프로테이나아제 활성에는, 적어도 중성프로테아제Ⅰ과 중성프로테아제Ⅱ의 2종류의 프로테이나아제가 포함되어 있는 것을 알 수 있었다.

프로테이나아제에 의해 카세인으로부터 분해 생산된 성분을 더욱 분해하기 위해서, 펩티드에 작용하는 펩티다아제에 대해서 아래와 같이 분석하였다.

본 발명의 특징인 Xaa Pro 및 Xaa Pro Pro를 많이 포함하는 펩티드를 생산하기 위한 효소를 특정하기 위해서, 여기에서는 Val Pro Pro의 각종 전구 펩티드를 합성하고, Val Pro Pro에의 가공 활성을 평가하였다.

(아미노 말단가공 효소의 정제)

DEAE sephacel 용출 획분 중, ACE저해 성분의 생성 활성이 있었던 획분 21～37을 모으고, pH7.2의 5mM 인산 완충액 5리터에 대하여 투석을 행하였다. 히드록시아파타이트(와코쥰야쿠(주)제)를 pH7.2의 5mM 인산 완충액에 현탁하고, 잘 탈기한 후, 직경 1.5㎝×12㎝의 플라스틱 컬럼에 충전하고, pH7.2의 5mM 인산 완충액을 10배량 이상 흘려보내서 세정하였다. 이 히드록시아파타이트 컬럼에, 투석한 ACE저해 성분의 생성 활성획분을 제공하고, 그냥 지나친 획분을 모두 회수하였다.

(아미노 펩티다아제 활성의 측정)

아미노 펩티다아제 활성의 측정은 다음과 같이 행하였다. 합성한 펩티드Val Val Val Pro Pro를 50μg/ml이 되도록, pH7.2의 50mM 인산 완충액에 용해하고, 기질용액으로 하였다. 이 기질용액 45μl와 효소획분 5μl를 섞어, 55℃의 인큐베이터에서 30분간 반응시키고, 98℃에서 5분간 가열해서 반응을 정지시켰다. 이 반응액으로부터 적량을 분취하고, 질량분석 장치부착 고속액체 크로마토그래프 장치((주) 시마즈세이사쿠쇼제)에 제공해서 생성하는 Val Pro Pro량을 평가하였다.

음이온 교환 수지에 흡착한 ACE저해 성분의 생성 활성 획분에 포함되는 32kDa의 주요 단백질을, 10% 겔을 이용한 SDS-폴리아크릴아미드겔 전기영동법을 행하고, 해당하는 밴드를 잘라내어 단백질을 추출하고, 32kDa의 거의 단일 단백질을 정제하여, N말단배열 해석을 행한 바, 기지의 누룩균의 류신아미노펩티다아제와 10잔기에 걸쳐서 상동성을 유지하고 있었기 때문에, ACE저해 성분의 생성 활성이 확인된 획분에는, 류신아미노펩티다아제가 포함된다고 결론지을 수 있었다.

이상의 결과로부터, 음이온 교환 수지에 흡착하는 ACE저해 성분의 생성 활성을 나타내는 획분에는, ACE저해 성분의 생성 활성에 중요한 역할을 하고 있는 아미노 펩티다아제 활성을 나타내고, 류신아미노펩티다아제가 적어도 포함되어 있는 것을 알 수 있었다.

(카르복시말단가공 효소활성의 측정)

합성 펩티드 Val Pro Pro Phe Leu를 45μg/ml이 되도록, pH7.2의 50mM 인산 완충액에 용해한 것을 기질용액으로 하였다. 이 기질용액 50μl와 효소를 포함하는 용액 5μl를 섞고, 55℃의 인큐베이터에서 30분간 반응시키고, 98℃에서 5분간 가열하여 반응을 정지시켰다. 이 반응액으로부터 적량을 분취하고, 질량분석 장치부착 고속액체 크로마토그래프 장치((주)시마즈세이사쿠쇼제)에 제공해서 생성하는 Val Pro Pro농도를 정량하였다.

각 DEAE sephacel 용액획분의 카르복시말단가공 활성의 평가를 행한 바, 획분 30～50에 Val Pro Pro Phe Leu를 Val Pro Pro로 변환하는 효소활성이 포함되는 것이 명확하게 되었다.

실시예 2

(정제 효소의 조합에 의한 카세인 가수분해물의 ACE저해 활성의 확인)

분석예 1로부터 아스페르길루스?오리재 유래의 균체외효소(스미짐FP(등록상표, 신니폰가가쿠고교사제))의 음이온 교환 수지에 흡착한 ACE저해 성분의 생성 활성에는, 적어도 중성프로테아제Ⅰ 및 Ⅱ를 포함하는 프로테이나아제활성과, 류신아미노펩티다아제를 포함하는 아미노 펩티다아제 활성과, 카르복시말단을 프롤린 직후까지 분해하는 활성의 4개의 효소활성이 포함되어 있는 것을 알 수 있었다.

상기 흡착한 획분(도 3 참조) 중, 프로테이나아제 활성을 많이 포함하는 획분Ⅰ(도 3의 획분 1～35)과, 카르복시말단을 프롤린 직후까지 분해하는 활성을 많이 포함하는 획분Ⅱ(도 3의 획분번호 36～55)와, 그 이후의 획분Ⅲ(도 3의 획분번호 56～100)과, 프로테이나아제 활성을 나타낸 미흡착 획분을 각각 준비하였다.

준비한 각각의 획분을, 표 6에 나타낸 것 같이, 단독 또는 조합하여, 1% 우유 유래 카세인 용액 1ml에 더해서 55℃에서 13시간 반응시켜서 카세인 가수분해물을 조제하였다. 반응 종료 후, 얻어진 각 카세인 가수분해물에 대해서, 실시예 1과 동일한 측정 방법에 준해서 ACE저해 활성 및 평균 쇄장을 측정하였다. 또, 대상으로서 미정제 효소용액을 정제에 이용한 양의 1/10000양을 분취해서 동일한 측정을 행하였다. 이들의 결과를 표 6에 나타낸다.

표 6에서, 미흡착 획분, 프로테이나아제 활성을 많이 포함하는 획분, 카르복시말단을 프롤린 직후까지 분해하는 활성을 많이 포함하는 획분까지 ACE저해 활성이 강한 성분을 얻을 수 있는 것을 알 수 있다. 또, 약 300mM NaCl로 용출되는 효소군에 의해 ACE저해 성분이 생성되는 것이 명백하게 되고, 획분Ⅲ은 불필요하다는 것을 알 수 있었다.

더욱이, 강한 ACE저해 성분의 생성 활성을 나타낸 각 획분으로 분해한 카세인 가수분해물의 평균 쇄장을 비교하면, 미흡착 획분, 획분Ⅰ, 획분Ⅱ에서는 평균 쇄장이 2.1을 넘고 있었지만, 각각을 조합함으로써 평균 쇄장 2.1 이하의 카세인 가수분해물을 얻을 수 있는 것을 알 수 있었다.

실시예 3

우유 유래 카세인(니폰NZMP사제) 15g을 약 80℃로 조정한 증류수 85g에 더해서 충분히 교반한 후, 1N수산화 나트륨 용액을 첨가해서 pH7.0으로 하고, 또 온도를 20℃로 조정해서 기질용액을 조제하였다.

얻어진 기질용액에 효소군으로서 아스페르길루스?오리재 유래의 균체외효소인 스미짐FP(등록상표, 신니폰가가쿠고교사제)를, 효소/카세인의 중량비가 1/25이 되도록 첨가하고, 50℃에서 20시간 반응시켜, 경시적으로 반응액을 샘플링하고, 경시적인 ACE저해 활성 및 평균 쇄장을 실시예 1과 동일한 방법으로 평가하였다. 결과를 도 4 및 도 5에 나타낸다. 또, ACE활성이 최대값을 나타낸 반응 시간 12시간의 효소 분해액을 스프레이 드라이어로 건조하고, 펩티드 혼합물의 분말을 얻었다.

도 4 및 도 5에서, 반응 시간의 증가에 따라 ACE저해 활성은 증가하고, 반응 12시간 이후에 감소하였다. 또, 펩티드량의 평가로부터 평균 쇄장이 약 1.3～2.1에 있어서 ACE저해 활성이 증가하는 것이 확인되었다.

SEQUENCE LISTING <110> CALPIS CO., LTD. <120> CASEIN HYDROLYZATE, PROCESS FOR PRODUCING THE SAME AND USE THEREOF <130> 10237 <140> JP2003-285007 <141> 2003-08-01 <160> 2 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 5 <212> PRT <213> Bos taurus <400> 1 Val Val Val Pro Pro 1 5 <210> 2 <211> 5 <212> PRT <213> Bos taurus <400> 2 Val Pro Pro Phe Leu 1 5

Claims

동물젖 카세인을 평균 쇄장이 아미노산 잔기수로서 2.1 이하로 가수분해하여 얻어지며, 유리 아미노산 및 펩티드를 포함하는 카세인 가수분해물로서,

상기 펩티드로서, Xaa Pro배열을 갖는 디펩티드 및 Xaa Pro Pro배열을 갖는 트리펩티드로 이루어지는 생체 내 비분해성 펩티드를 포함하고, 또한 Xaa Pro배열을 갖는 디펩티드의 함유 비율이 분해물 중의 펩티드 및 유리 아미노산의 합계에 대하여 5중량% 이상이며, Xaa Pro Pro배열을 갖는 트리펩티드의 함유 비율이 분해물 중의 펩티드 및 유리 아미노산의 합계에 대하여 1중량% 이상인 것을 특징으로 하는 카세인 가수분해물.
삭제
제 1 항에 있어서, 식품첨가용 또는 의약용인 것을 특징으로 하는 카세인 가수분해물.
제 1 항에 있어서, Xaa Pro배열을 갖는 디펩티드로서, Ile Pro, Glu Pro, Arg Pro, Gln Pro, Met Pro 및 Tyr Pro를 포함하고, Xaa Pro Pro배열을 갖는 트리펩티드로서, Ser Pro Pro, Ile Pro Pro 및 Val Pro Pro를 포함하는 것을 특징으로 하는 카세인 가수분해물.
제 1 항에 기재된 카세인 가수분해물의 제조법으로서, 동물젖 카세인의 Pro Xaa 및 동물젖 카세인의 Pro Xaa를 포함하는 펩티드의 Pro와 Xaa를 절단 가능한 펩티다아제와, 류신아미노펩티다아제와, 또한, 중성 프로테아제 I 및 중성 프로테아제 Ⅱ에서 선택되는 하나 이상을 포함하는 효소군을 사용하여, 동물젖 카세인을 평균 쇄장이 아미노산 잔기수로서 2.1 이하로 가수분해하는 공정(A)을 포함하며, 상기 효소군은 아스페르길루스?오리재 유래의 균체외 효소인 것을 특징으로 하는 카세인 가수분해물의 제조법.
삭제
제 5 항에 있어서, 상기 가수분해를, 상기 효소군에 의해 1단계 반응에 의해 행하는 것을 특징으로 하는 제조법.
삭제
제 5 항에 있어서, 상기 효소군이, 금속프로테아제 및 세린프로테아제 중 적어도 1종을 또한 포함하는 것을 특징으로 하는 제조법.
삭제
삭제
제 5 항에 있어서, 상기 Pro와 Xaa를 절단가능한 펩티다아제가, 등전점이 산성역을 나타내는 효소군인 것을 특징으로 하는 제조법.
제 5 항에 있어서, 공정(A)에 있어서, 동물젖 카세인의 가수분해 때의 카세인 농도가 3～19중량%이며, 또한 효소군/동물젖 카세인의 비율이 질량비로 1/100이상인 것을 특징으로 하는 제조법.
제 1 항에 기재된 카세인 가수분해물을 유효성분으로서 포함하고, 앤지오텐신변환 효소저해 활성 또는 혈압강하 작용을 갖는 것을 특징으로 하는 제제.