JPH11346782A - ヒトｐｌｔｐタンパク質に対するモノクローナル抗体、このモノクローナル抗体を用いたヒトｐｌｔｐの測定方法、及びこの測定方法を行うための測定キット - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】脂質代謝系において重要な役割を演じているヒ
トリン脂質転送タンパク質（ＰＬＴＰ）のモノクローナ
ル抗体を製造し、さらにこのモノクローナル抗体を用い
た、血液中のＰＬＴＰを、簡便かつ高感度に測定するこ
とが可能で、臨床において汎用することが可能なＰＬＴ
Ｐを測定する手段を確立し、脂質代謝系の異常に対して
より的確な判断を行い、適切な治療方針を決定する途を
提供すること。 【解決手段】ＰＬＴＰに対する優れた特異性を有するモ
ノクローナル抗体及びその製造工程において用いるハイ
ブリドーマ、並びに動脈硬化等の脂質代謝異常が深く関
わる疾病の重要な指標となり得る，このヒトリン脂質転
送タンパク質に対するモノクローナル抗体を用いたヒト
リン脂質転送タンパク質の測定方法、及びこの測定方法
を行うための測定キット等のＰＬＴＰに関する一連の測
定手段を提供することにより、上記の課題を解決し得る
ことを見出した。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、モノクローナル抗
体及びその製造工程において用いるハイブリドーマ、並
びにこのモノクローナル抗体を用いた測定方法に関する
技術分野の発明である。より具体的には、ヒトの脂質代
謝において重要な役割を担っているヒトリン脂質転送タ
ンパク質（ＰＬＴＰ：phospholipid transfer Protein)
に対するモノクローナル抗体及びその製造工程において
用いるハイブリドーマ、並びに動脈硬化等の脂質代謝異
常が深く関わる疾病の重要な指標となり得る，このヒト
リン脂質転送タンパク質に対するモノクローナル抗体を
用いたヒトリン脂質転送タンパク質の測定方法、及びこ
の測定方法を行うための測定キットに関する発明であ
る。

【０００２】

【従来の技術】血漿中に遊離脂肪酸と共に存在するエス
テル型コレステロール（以下、単にコレステロールとも
いう）は、細胞膜の構成成分や内分泌ホルモンの起源成
分として、生体において重要な役割を果たしている。生
体内のコレステロールは、一部は食物摂取に際しての小
腸からの取り込みにより供給されるが、その大半は、各
組織（特に、肝臓）の細胞における生合成に由来する。
この生合成によるコレステロールの生体内における末梢
細胞への供給経路としては、以下の経路が知られてい
る。

【０００３】すなわち、肝臓等において生合成された遊
離コレステロールは、超低比重リポ蛋白（ＶＬＤＬ）に
取り込まれて、血中に分泌され、さらに血中のリポ蛋白
リパーゼ（ＬＰＬ）及び肝性トリグリセライドリパーゼ
（ＨＴＧＬ）の作用により、中間比重リポ蛋白（ＩＤ
Ｌ）を経て、低比重リポ蛋白（ＬＤＬ）へと代謝され
る。次いで、このＬＤＬは、末梢細胞膜表面に存在する
ＬＤＬ受容体を介して細胞内に取り込まれ、これにより
細胞内に遊離コレステロールが供給されることが知られ
ている。このような、肝臓等から末梢細胞へのコレステ
ロールの転送系に対して、「コレステロール逆転送系」
と呼ばれる、余剰のコレステロールを、再び肝臓へと転
送する、末梢細胞から肝臓へのコレステロールの転送経
路が存在することが知られている。

【０００４】すなわち、肝臓から末梢細胞に供給された
余剰の遊離コレステロールが、血中の高比重リポ蛋白
（ＨＤＬ）によって引き抜かれ、レシチンコレステロー
ルアシルトランスフェラーゼ（ＬＣＡＴ）の作用によ
り、コレステロールエステル（ＣＥ）に転換されて、血
中のＨＤＬ中に蓄えられる。末梢細胞から引き抜かれた
ＨＤＬ中に蓄えられたＣＥが、コレステロールエステル
転送蛋白（ＣＥＴＰ）の作用により、血中のＶＬＤＬ，
ＩＤＬやＬＤＬに転送され、ＣＥを受け取ったこれらの
ＶＬＤＬ等から、肝臓のＬＤＬ受容体を介して間接的に
肝細胞に取り込まれることにより、コレステロールが肝
臓に逆転送される。また、ＣＥを引き抜いたＨＤＬは、
肝細胞のＨＤＬ受容体を介して、ＣＥを肝細胞に直接的
に取り込まれることにより、転送することもできる。

【０００５】このコレステロール逆転送系は、コレステ
ロールの末梢細胞への蓄積を防御し、しいては、動脈硬
化を防御する機構として注目されている。特に、コレス
テロール逆転送系において、コレステロールを末梢細胞
から引き抜くという、重要な役割を果たしているＨＤＬ
に関しては、血中ＨＤＬコレステロールの濃度と冠動脈
疾患の発症とが逆相関するという事実が、疫学的調査に
より数多く報告されている。これにより、ＨＤＬは抗動
脈硬化作用を発揮し得るリポ蛋白として広く認識される
ようになった。

【０００６】さらに、近年、ＨＤＬ中のコレステロール
エステルの血中ＬＤＬへの転送を媒介するＣＥＴＰの働
きの重要性が、ＣＥＴＰ欠損症、高脂血症、糖尿病ある
いはネフローゼ症候群等の、各疾患とＣＥＴＰとの関わ
りから明らかにされつつある。例えば、高脂血症発症群
では、正常のコントロール群と比べて、血中のＣＥＴＰ
活性が高いことが、実験的に確かめられている。また、
高ＨＤＬ血症を呈するＣＥＴＰ欠損症のＨＤＬ粒子は、
ＣＥに富み、大粒子化しているが、この大粒子化したＨ
ＤＬは、マクロファージに対する、抗泡沫化・脱泡沫化
作用を発揮しないことが明らかにされている。

【０００７】上述した、コレステロール逆転送に係わる
ＨＤＬの役割は、近年、特に積極的に研究され、ＨＤＬ
前駆体ともいえるpre β−ＨＤＬは、アポリポプロテイ
ンＡ１を主体とする脂質成分に乏しい小粒子ＨＤＬであ
り、末梢細胞からコレステロールを引き抜き、血中に循
環している球状のＨＤＬへと転換され、さらに、この球
状のＨＤＬが肝臓へと運ばれることが突き止められてい
る。

【０００８】また、ＨＤＬは、粒子サイズ、構成成分、
粒子密度、あるいは電気泳動の移動度における差によ
り、いくつかのサブポピュレーションに分けられ、これ
らのＨＤＬのサブポピュレーションは、それぞれ異なる
機能を有していると考えられている。

【０００９】これらＨＤＬのサブポピュレーションの分
布を制御している因子を解明することは、コレステロー
ルの代謝や、冠動脈疾患の発症機序を知り、これを予防
する上で重要である。 この点について、いくつかの血
漿因子が、ＨＤＬの構成成分、あるいは粒子サイズに影
響していることが知られている。

【００１０】例えば、ＬＣＡＴ，ＨＴＧＬ，ＬＰＬ及び
ＣＥＴＰや、リン脂質転送蛋白（ＰＬＴＰ）は血中に存
在し、リポ蛋白間における脂質の転送能を有する蛋白で
あるが、特にＰＬＴＰは、ＨＤＬと他のリポプロテイン
間において、リン脂質を転送する機能を有しており（To
llefson,Albers,Methods Enzymol,129,797-816,1986,Ta
ll,J Lipid Res,34,1255-1274,1993) 、さらにＨＤＬの
構成成分並びに粒子サイズを変化させることが、近年に
なり判明した(Lusa,Jauhiainen,Metso,Somerharju,Ehnh
olm,Biochem J,313,275-282,1996）。

【００１１】また、ＰＬＴＰによるＨＤＬサブポピュレ
ーション間での脂質の転送は、ＨＤＬと他のリポプロテ
イン間との脂質の転送と同様に重要である。試験管内で
ＨＤＬ３（コレステロールエステルを取り込んだ形態の
ＨＤＬ）に精製したＰＬＴＰを添加することにより、２
つの新たな粒子サイズの異なるサブポピュレーション
（ＨＤＬ３粒子とは異なる小粒子径及び大粒子径のサブ
ポピュレーション）を生じることが明らかにされている
(Jauhiainen,Metso,Pahlman,Blomqvist,van Tol,Ehnhol
m,J Biol Chem,268,4032-4036,1993,Tu,Nishida,J Biol
Chem,268,23098-23105,1993) 。この小粒子径のサブポ
ピュレーションは、原始ＨＤＬと考えられているpre β
1-ＨＤＬであり、細胞から余剰のコレステロールを引き
抜く能力を有している。さらに、血中のＣＥＴＰの作用
によりＴＧ−richとなったＨＤＬ粒子をＰＬＴＰは、大
粒子径及び小粒子径へのサブポピュレーションへ転換す
る効果が大きいことが知られている(Rye K-A,Jauhiaine
n M,BarterPJ,Ehnholm C,J Lipid Res,1998,39:613-62
2.) 。

【００１２】さらに、ヒトＰＬＴＰｃＤＮＡをアデノウ
イルスに組み込み〔ＰＬＴＰをコードする遺伝子も特定
されている(Joseph R, et al.,J Biol Chem,269:9388-9
391,1994.)〕、これをマウスに感染させることにより、
ヒトＰＬＴＰを発現させたマウスにおいては、血中のＰ
ＬＴＰ活性の上昇に伴い、血中のＨＤＬ及びアポＡ１の
減少が認められ、このヒトＰＬＴＰの発現によると考え
られるＨＤＬの減少は、肝臓へのＨＤＬの逆転送による
ことが知られている(Foger,Santamaria-Fujo,Shambure
k,Parrot,Talley,Brewer Jr.,J Biol Chem,43,27393-27
400,1997)。

【００１３】

【発明が解決しようとする課題】上述したように、ＰＬ
ＴＰは、生体内でコレステロール逆転送系において、非
常に重要な役割を果たしていることは、ほぼ明らかであ
る。ＰＬＴＰについては、上述したことの他に、下記
〜に示す事項がすでに明らかになっている：

【００１４】リポタンパク質におけるコレステロール
エステルやトリグリセライドの転送をしない。 ヒトコレステロールエステル転送タンパク質である
「ＬＴＰ−Ｉ」に対する抗体では認識されない。 このヒトコレステロールエステル転送タンパク質であ
る「ＬＴＰ−Ｉ」との間では、アミノ酸配列の相同性が
認められない。

【００１５】みかけ上の分子量が、セファクリルＳ２
００では、約７００００であり、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで
は、約６９０００である。 クロマトフォーカシングによるみかけ上の等電点は、
５．０である。 ５８℃，１時間の加熱処理により、活性がほぼ消失す
る。 ヘパリンセファロースに対して親和性を有する。

【００１６】本発明が解決すべき課題は、このような脂
質代謝系において重要な役割を演じているＰＬＴＰのモ
ノクローナル抗体を製造し、さらにこのモノクローナル
抗体を用いた、血液中のＰＬＴＰを、簡便かつ高感度に
測定することが可能で、臨床において汎用することが可
能なＰＬＴＰを測定する手段を確立し、脂質代謝系の異
常に対してより的確な判断を行い、適切な治療方針を決
定する途を提供することにある。なお、上記のＰＬＴＰ
に対するモノクローナル抗体は、臨床上のみならず、Ｐ
ＬＴＰ自体の分離・精製のための試薬としても極めて有
用であると考えられる。

【００１７】

【課題を解決するための手段】本発明者は、この課題の
解決に向けて鋭意検討を行った。その結果、所望するＰ
ＬＴＰに対するモノクローナル抗体と、このモノクロー
ナル抗体の製造に用いるハイブリドーマ、及びこのモノ
クローナル抗体を用いたＰＬＴＰの測定方法を確立し
た。特に、本発明者は、生物学的に活性である、組換え
ヒトＰＬＴＰを免疫源として用いることにより、ヒト由
来のＰＬＴＰ、特にヒト体液中に存在するＰＬＴＰに対
して、各々異なった高い結合特異性が認められる、抗ヒ
トＰＬＴＰモノクローナル抗体を製造することに成功
し、かかる抗ヒトＰＬＴＰモノクローナル抗体を、上記
のＰＬＴＰの測定方法において用いることにより、上記
の課題を極めて的確な形で解決することが可能であるこ
とを見出して、本発明を完成した。

【００１８】すなわち、本発明者は、以下の発明を本願
において提供する。第１に、ヒトＰＬＴＰに対するモノ
クローナル抗体、特に以下の性質を有するモノクローナ
ル抗体（その標識物質単独で又はその標識物質と他の物
質とを反応させることにより、検出可能なシグナルをも
たらす標識物質で標識されている「標識モノクローナル
抗体、並びに不溶性担体に固定化されている「固定化モ
ノクローナル抗体」を含む）を提供する。 ヒトＰＬＴＰに対して抗原抗体反応が認められる； 少なくともマウスＰＬＴＰに対しては、抗原抗体反応
が認められない；また、これらのモノクローナル抗体
は、ヒトＰＬＴＰの成熟アミノ酸配列の１６７−４７６
の領域、あるいは同１−１６５の領域を認識するモノク
ローナル抗体である。

【００１９】第２に、上記のヒトＰＬＴＰに対するモノ
クローナル抗体を産生するハイブリドーマを提供する
〔具体的に、mouse hybridoma PLTP113 （以下、＃１１
３ともいう；寄託番号：ＦＥＲＭ Ｐ−１６６０５）、
mouse hybridoma PLTP114 （以下、＃１１４ともいう；
寄託番号：ＦＥＲＭ Ｐ−１６６０６）及びmouse hybr
idoma PLTP110G（以下、＃１１０Ｇともいう；寄託番
号：ＦＥＲＭ Ｐ−１６６０７）からなる群から選ばれ
るいずれかのハイブリドーマが例示される〕。

【００２０】第３に、上記のヒトＰＬＴＰに対するモノ
クローナル抗体の１種又は２種以上と、エンザイムイム
ノアッセイ法等のごとく、検体中のヒトＰＬＴＰとの抗
原抗体反応を利用して、検体中のヒトリン脂質転送タン
パク質を測定する、ヒトリン脂質転送タンパク質の測定
方法を提供する。

【００２１】第４に、この測定方法を行うための測定キ
ットを提供する。

【００２２】なお、本発明者は、上記のハイブリドーマ
を製造する際の、免疫源として好ましい組換えヒトＰＬ
ＴＰを効率的に宿主内で発現させ、さらに培養上清中に
分泌させることが可能なベクターをも作出した。

【００２３】

【発明の実施の形態】以下、本発明の実施の形態につい
て説明する。本発明に関わるモノクローナル抗体（以
下、本発明モノクローナル抗体という）は、上記のよう
にＰＬＴＰに対するモノクローナル抗体である。

【００２４】Ａ．本発明モノクローナル抗体の製造 本発明モノクローナル抗体は、組換えヒトＰＬＴＰで免
疫した動物の免疫細胞と動物の骨髄腫細胞とのハイブリ
ドーマを作出し、これによりＰＬＴＰを認識する抗体を
産生するクローンを選択し、このクローンを培養するこ
とにより製造することができる。

【００２５】免疫抗原としてのＰＬＴＰは、以下のよう
にして得ることができる。ヒト又は必要な場合にはその
他の動物種の血漿より、常法、例えば超遠心法等により
得られる、リポ蛋白欠乏血清（密度：ｄ＞１．２１）な
どから、通常公知の分離・分画法、例えばゲル濾過クロ
マトグラーフィー、疎水クロマトグラフィー、イオン交
換クロマトグラフィー、ヘパリンアガロース等を用いた
アフィニティークロマトグラフィー等の操作を必要に応
じて組み合わせて用いて得ることができる（例えば、Jo
hn H Tollefson et al.,J Lipid Res,29,1593-1602,198
8 や、Pirkko Pussinen et al.,J Lipid Res,36,975-98
5,1995等参照のこと）。

【００２６】ここで使用される免疫抗原としてのＰＬＴ
Ｐは、特に限定されるものではなく、本発明で用いたよ
うにＰＬＴＰ遺伝子（その塩基配列の一部を改変したも
のも含む）がコードするＰＬＴＰを用い得ることは勿論
のこと、ＰＬＴＰ遺伝子の一部断片がコードするＰＬＴ
Ｐ断片やＰＬＴＰに酵素処理等を施して、又は化学合成
して得られるＰＬＴＰの部分ペプチドをも本発明モノク
ローナル抗体を製造する上での免疫抗原とすることがで
きる。

【００２７】また、免疫される動物も特に限定されるも
のではなく、マウス，ラット等を広く用いることができ
るが、モノクローナル抗体を製造する場合には、細胞融
合に用いる骨髄腫細胞との適合性を考慮して選択するこ
とが望ましい。

【００２８】免疫は一般的方法により、例えば上記免疫
抗原を免疫の対象とする動物に静脈内，皮内，皮下，腹
腔内注射等で投与することにより行うことができる。

【００２９】より具体的には、上記免疫抗原を所望によ
り通常のアジュバントと併用して、免疫の対象とする動
物に２〜１４日毎に上記手段により数回投与し、本発明
モノクローナル抗体製造のための免疫細胞、例えば免疫
後の脾臓細胞を得ることができる。

【００３０】モノクローナル抗体を製造する場合、この
免疫細胞と細胞融合する他方の親細胞としての骨髄腫細
胞としては、既に公知のもの、例えばＳＰ２／０−Ａｇ
１４，Ｐ３−ＮＳ１−１−Ａｇ４−１，ＭＰＣ11−４
５，６．ＴＧ１．７（以上、マウス由来）；２１０．Ｒ
ＣＹ．Ａｇ１．２．３（ラット由来）；ＳＫＯ−００
７，ＧＭ１５００６ＴＧ−Ａ１２（以上、ヒト由来）等
を用いることができる。

【００３１】上記免疫細胞とこの骨髄腫細胞との細胞融
合は、通常公知の方法、例えばケーラーとミルシュタイ
ンの方法（Kohler,G. and Milstein,C.,Nature,256,495
(1975)）等に準じて行うことができる。

【００３２】より具体的には、この細胞融合は、通常公
知の融合促進剤、例えばポリエチレングリコール（ＰＥ
Ｇ）又はセンダイウイルス（ＨＶＪ）等の存在下におい
て、融合効率を向上させるためにジメチルスルホキシド
等の補助剤を必要に応じて添加した通常の培養培地中で
行い、ハイブリドーマを調製する。

【００３３】所望のハイブリドーマの分離は、通常の選
別用培地、例えばＨＡＴ（ヒポキサンチン，アミノプテ
リン及びチミジン）培地で培養することにより行うこと
ができる。すなわち、この選別用培地において目的とす
るハイブリドーマ以外の細胞が死滅するのに十分な時間
をかけて培養することによりハイブリドーマの分離を行
うことができる。このようにして得られるハイブリドー
マは、通常の限界希釈法により目的とするモノクローナ
ル抗体の検索及び単一クローン化に供することができ
る。

【００３４】目的とするモノクローナル抗体産生株の検
索は、例えばＥＬＩＳＡ法，プラーク法，スポット法，
凝集反応法，オクタロニー法，ＲＩＡ法等の一般的な検
索法に従い行うことができる。

【００３５】このようにして得られるヒトＰＬＴＰを認
識する所望のモノクローナル抗体を産生するハイブリド
ーマは、通常の培地で継代培養することが可能であり、
さらに液体窒素中で長時間保存することもできる。

【００３６】このハイブリドーマからの所望のモノクロ
ーナル抗体の採取は、このハイブリドーマを常法に従っ
て培養して、その培養上清として得る方法や、ハイブリ
ドーマをこのハイブリドーマに適合性が認められる動物
に投与して増殖させ、その腹水として得る方法等を用い
ることができる。

【００３７】なお、インビトロで免疫細胞をＰＬＴＰ又
はその一部の存在下で培養し、一定期間後に上記細胞融
合手段を用いて、この免疫細胞と骨髄腫細胞とのハイブ
リドーマを調製し、抗体産生ハイブリドーマをスクリー
ニングすることで本発明モノクローナル抗体を得ること
もできる（Reading,C.L.,J.Immunol.Meth.,53, 261(198
2)；Pardue,R.L.,et al.,J.Cell Biol.,96,1149(198
3））。

【００３８】また、上記のようにして得られるポリクロ
ーナル抗体及びモノクローナル抗体は、更に塩析，ゲル
濾過法，アフィニティクロマトグラフィー等の通常の手
段により精製することができる。

【００３９】このようにして得られる本発明モノクロー
ナル抗体は、ＰＬＴＰに特異反応性を有する抗体であ
る。この本発明モノクローナル抗体は、後述するよう
に、臨床において用い得ることは勿論のこと、ＰＬＴＰ
自体の分離・精製のための試薬としても極めて有用であ
る。

【００４０】本発明モノクローナル抗体のより具体的な
内容は、実施例において後述する。このようにして得ら
れる本発明モノクローナル抗体を、必要に応じて標識物
質で標識して、後述する本発明に係わる測定方法等にお
いて用いることができる。

【００４１】かかる標識物質は、その標識物質単独で又
はその標識物質と他の物質とを反応させることにより、
検出可能なシグナルをもたらす標識物質であり、具体的
には、例えば西洋ワサビペルオキシダーゼ，アルカリホ
スファターゼ，β−Ｄ−ガラクトシダーゼ，グルコース
オキシダーゼ，グルコース−６−ホスフェートデヒドロ
ゲナーゼ，アルコール脱水素酵素，リンゴ酸脱水素酵
素，ペニシリナーゼ，カタラーゼ，アポグルコースオキ
シダーゼ，ウレアーゼ，ルシフェラーゼ若しくはアセチ
ルコリンエステラーゼ等の酵素、フルオレスセインイソ
チオシアネート，フィコビリタンパク，希土類金属キレ
ート，ダンシルクロライド若しくはテトラメチルローダ
ミンイソチオシアネート等の蛍光物質、¹²⁵Ｉ，¹⁴Ｃ，³
Ｈ等の放射性同位体、ビオチン，アビジン若しくはジゴ
ケシゲニン等の化学物質、又は化学発光物質等を挙げる
ことができる。

【００４２】これらの標識物質による、本発明モノクロ
ーナル抗体の標識方法は、選択すべき標識物質の種類に
応じて、既に公知となっている標識方法を適宜用いるこ
とができる。

【００４３】また、本発明モノクローナル抗体（標識さ
れたものを含む）を、不溶性担体に固定化した、固定化
モノクローナル抗体として、後述する本発明に係わる測
定方法等に用いることもできる。

【００４４】かかる不溶性担体としては、抗体の不溶性
担体として既に用いられている各種の不溶性担体を用い
ることができる。具体的には、例えば、マイクロプレー
トに代表されるプレート、試験管、チューブ、ビーズ、
ボール、フィルター、メンブレン、あるいはセルロース
系担体、アガロース系担体、ポリアクリルアミド系担
体、デキストラン系担体、ポリスチレン系担体、ポリビ
ニルアルコール系担体、ポリアミノ酸系担体、あるいは
多孔性シリカ系担体等のアフィニティークロマトグラフ
ィーにおいて用いられる不溶性担体等が挙げられる。

【００４５】これらの不溶性担体における、本発明モノ
クローナル抗体の固定化方法は、各種の不溶性担体にお
いて既に確立している抗体の固定化方法を、選択すべき
不溶性担体の種類に応じて、適宜選択することができ
る。

【００４６】Ｂ．本発明に係わる測定方法 本発明に係わる測定方法（以下、本発明測定方法とい
う）は、本発明モノクローナル抗体と検体中のＰＬＴＰ
との抗原抗体反応を利用して、検体中のＰＬＴＰを測定
する、ＰＬＴＰの測定方法である。

【００４７】この抗原抗体反応を利用した、本発明測定
方法の態様としては、例えばエンザイムイムノアッセイ
法、ラジオイムノアッセイ法、フローサイトメトリーに
よる解析、ウエスタンブロット法等を挙げることができ
るが、一般的には、その取扱いの簡便性と測定感度を考
慮するとエンザイムイムノアッセイ法を選択することが
好ましい。

【００４８】このエンザイムイムノアッセイ法は、酵素
免疫定量法ともいい、標識イムノアッセイ法のうち酵素
を標識物質として用いる測定方法である。エンザイムイ
ムノアッセイ法には、いわゆるＢ／Ｆ分離を必要とする
"heterogeneous enzyme immunoassay"と、このＢ／Ｆ分
離を必要としない"homogeneous enzyme immunoassay"と
に大別される。

【００４９】本発明においては、これらのうち、一般的
に測定感度が高いといわれる前者の"heterogeneous enz
yme immunoassay"を選択することがより好ましく、イム
ノソルベントを用いる"enzyme-linked immunosorbent a
ssay（ＥＬＩＳＡ）" を選択することがさらに好まし
い。

【００５０】より具体的な測定態様として、いわゆるサ
ンドイッチ法によるエンザイムイムノアッセイ法（以
下、サンドイッチ法ともいう）を例示することができ
る。かかるサンドイッチ法は、特に操作上の簡便性，経
済上の利便性、とりわけ臨床検査としての汎用性を考慮
すると、特に好ましい測定態様の一つである。

【００５１】このサンドイッチ法を行うに際しては、本
発明モノクローナル抗体が、９６穴マイクロプレートに
代表されるような、多数のウエルを有するマイクロプレ
ートに固定化された、固定化モノクローナル抗体と、上
述した西洋ワサビペルオキシダーゼ等の酵素又はビオチ
ンにより標識された、本発明モノクローナル抗体を用い
ることが好ましい。

【００５２】サンドイッチ法は、少なくとも、下記(a)
及び(b) の工程を含む、エンザイムイムノアッセイ法で
ある。 (a)不溶性担体に本発明モノクローナル抗体を固定化し
た、固定化モノクローナル抗体に、ヒト血漿等の血液検
体に代表される検体を反応させる工程。この工程(a) に
おいては、通常は、反応後、用いたマイクロプレートを
洗浄し、未反応の検体は、固定化モノクローナル抗体か
ら除去される。

【００５３】(b)固定化モノクローナル抗体と、試料中
のヒトＰＬＴＰとの結合により形成される、抗原抗体複
合体に、西洋ワサビペルオキシダーゼやビオチン等によ
り標識された本発明モノクローナル抗体を反応させる工
程。

【００５４】この工程(b) においては、通常は、反応
後、用いたマイクロプレートを洗浄し、未反応の標識さ
れた本発明モノクローナル抗体は、固定化モノクローナ
ル抗体から除去される。

【００５５】また、この工程(b) においては、反応させ
た第２抗体における標識物質の種類に応じた、標識シグ
ナルの発現手段を用いて、標識シグナルを顕在化させる
ことが必要である。例えば、標識物質としてビオチンを
用いた場合には、アビジン等を用いて標識シグナルを顕
在化させることができる。また、例えば、標識物質とし
て、西洋ワサビペルオキシダーゼを選択した場合には、
その基質を必要に応じて発色物質と共に添加して、標識
シグナルを顕在化することができる。

【００５６】このようにして、顕在化させた発色シグナ
ルを、その発色シグナルの種類に応じた、シグナルの特
定手段を用いて測定することで、所望する検体中のヒト
ＰＬＴＰの測定を行うことができる。

【００５７】上記の本発明測定方法によって、血漿等の
血液検体等の検体中のＰＬＴＰを簡便に、かつ高感度に
測定することができる。このようにして、検体中のＰＬ
ＴＰを測定することにより、特に、低ＨＤＬ血症や高Ｈ
ＤＬ血症等に代表されるＨＤＬ値異常患者の詳細な病状
解析が可能になり、脂質代謝異常による動脈硬化症等の
患者に対して適切な治療を施す指標とすることができ
る。

【００５８】本発明においては、本発明モノクローナル
抗体を、本発明測定方法において用いるための、本発明
モノクローナル抗体を含むＰＬＴＰ測定用キットも提供
される（以下、本発明測定用キットという）。

【００５９】本発明測定用キットにおいては、本発明モ
ノクローナル抗体を検体中のＰＬＴＰの測定のために供
するための要素、例えば、前記の標識された本発明モノ
クローナル抗体や固定化した本発明モノクローナル抗体
等が含まれ得る。

【００６０】本発明測定用キットも、上記の本発明測定
方法に対応して、その測定原理がエンザイムイムノアッ
セイ法である、殊にサンドイッチ法を行い得る、ＰＬＴ
Ｐ測定用キットであることが好ましい。

【００６１】

【実施例】以下、本発明を実施例等を用いてより具体的
に説明するが、これらの実施例等により、本発明の技術
的範囲が限定的に解釈されるものではない。

【００６２】〔ＰＬＴＰ活性測定系の構築〕本実施例に
おいては、的確なＰＬＴＰ活性（リン脂質転送活性）の
測定系を確立することが、適切な実験結果の評価等を行
う上で不可欠である。

【００６３】本実施例においては、特に断わらない限
り、ＰＬＴＰ活性（リン脂質転送活性）の測定は、以下
のように構築した系で行った。この測定系は、Cheungら
の方法(Biochim Biophys Acta,1303,103-110,1996)に準
じて行った。

【００６４】すなわち、まず、放射性標識されたホス
ファチジルコリン（ＰＣ）を含むリポソーム（ＰＣリポ
ソーム）からなるドナーリポソーム、高比重リポ蛋白
（ＨＤＬ３）からなるアクセプターリポ蛋白、及びＰ
ＬＴＰを含有する測定試料を混合し、生理的条件下に反
応させ、

【００６５】次いで、ドナーリポソームからアクセプタ
ーリポ蛋白への標識ＰＣの、転送量を、ドナーリポソー
ムの放射活性の減少、あるいはアクセプターリポ蛋白の
放射活性の増加を測定することにより、試料中のＰＬＴ
ＰのＰＣ転送活性を測定しＰＬＴＰ活性とした。 以
下、測定系について、順次説明する。

【００６６】ドナーリポソームの調製 ＰＣリポソームは１０μmol egg ＰＣ (シグマ社製）、
２．５μmolホスファチジルセリン（ＰＳ，ナカライテ
スク社製）、１μCi[¹⁴Ｃ]ＤＰＰＣ（ジパルミトイルホ
スファチジルコリン、ＮＥＮ Research Product社製）
及び１００nM

【００６７】ＢＨＴ（和光純薬社製）を、ガラス製の試
験管内で混和し、窒素気流下で溶媒を気化させた後、１
５０mM 塩化ナトリウム及び１mM ＥＤＴＡ（エチレン
ジアミン四酢酸）を含有する１０mMトリス緩衝液（ｐＨ
７．４）１．５mLに懸濁した。更に、この懸濁液を、超
音波処理（５分間、３回）し、同１０mMトリス緩衝液
（ｐＨ７．４）で１０mLとし、遠心処理を施し（１５０
００rpm、１０分間）、上清の透明な層（[¹⁴ Ｃ]ＰＣリ
ポソーム）をドナーリポソームとしてＰＬＴＰ活性測定
に用いた。

【００６８】アクセプターリポ蛋白の調製 健常人血漿（４００mL）に臭化カリウム（ＫＢｒ）を加
え、比重ｄ＝１．１２５g ／mLに調製し、超遠心分離処
理を施し（１００,０００×ｇ、１２℃、４０時間）、
比重ｄ＞１．１２５ｇの画分を採取した。このようにし
て得られた画分を、比重ｄ＝１．２１ｇ／mLに、ＫＢｒ
で調整し、超遠心分離処理（１００，０００×ｇ、１２
℃、４０時間）を施し、比重１．１２５＜ｄ＜１．２１
の画分を得た。このＨＤＬ３画分を、更に比重ｄ＝１．
２１ｇ／mLに調整した生理食塩水を用いて、超遠心分離
処理（１００,０００×ｇ、４℃、４０時間）を施し
て、洗浄ＨＤＬ３画分を採取した。得られた洗浄ＨＤＬ
３画分を、１５０mM 塩化ナトリウム及び１mM ＥＤＴ
Ａを含有する１０mMトリス緩衝液（ｐＨ７．４）で透析
した。

【００６９】このようにして得られた洗浄ＨＤＬ３画分
（比重ｄ＝１．１２５〜１．２１）をアクセプターリポ
蛋白とした。この洗浄ＨＤＬ３画分には、下記のＰＬＴ
Ｐ活性測定法による、ＰＣの転送活性は認められなかっ
た。

【００７０】ＰＬＴＰ活性の測定法 上述のようにして得た、ドナーリポソーム（[¹⁴Ｃ]ＰＣ
リポソーム）、アクセプターリポ蛋白（洗浄ＨＤＬ３）
及び測定試料を、ドナーリポソームのＰＣ量が７５nmo
l、アクセプターリポ蛋白の蛋白量が２５０μｇとなる
ようにマイクロチューブに加えて、総量を１５０mM 塩
化ナトリウム及び１mM ＥＤＴＡ含有１０mM トリス緩
衝液（ｐＨ７．４）にて４００μL ／チューブに調整
し、２秒間激しく攪拌後、このマイクロチューブを、３
７℃湯浴中で９０分間インキュベートする。次いで、こ
のインキュベート後、氷上にマイクロチューブを移し、
反応を停止させ、マイクロチューブに、３６３mM 塩化
マンガン及び５２単位 ヘパリン含有５３６mM 塩化ナ
トリウム溶液０．３mLを加え、１０秒間激しく攪拌し、
室温で１０分間放置する。次いで、このマイクロチュー
ブを、室温で、卓上遠心機（エッペンドルフ社製）を用
いて、１５,０００rpm，１０分間遠心分離処理を施し、
遠心上清０．５mLの放射活性を、液体シンチレーション
カウンターを用いて測定する。測定試料に含まれるＰＬ
ＴＰのＰＬＴＰ活性は、測定試料の放射活性と測定試料
の代わりに上記のトリス緩衝液を同量加えて、上記と同
様に操作した対照（ブランク）の放射活性との差に基づ
く放射活性の増加から決定し、単位時間あたりにリン脂
質（ＰＣ）を転送するＰＬＴＰ活性をnmol/ml/hr、ある
いは％転送率で表わす。

【００７１】〔精製ヒトＰＬＴＰの調製〕以下の精製等
の操作は、常法に従い行い、全て４℃又は氷浴上で行っ
た。疎水クロマトグラフィーによる精製 複数の健常人から採取した末梢血を、常法に従い、遠心
分離処理により、血球系細胞を除去して、ヒト血漿（１
L ）を採取した。得られたヒト血漿（１L ）に、ＫＢｒ
を加え、超遠心分離処理により、比重ｄ＞１．２１の下
層（リポ蛋白欠乏血清）を得た。このリポ蛋白欠乏血清
を、予め２Ｍ ＮａＣｌ及び１mM ＥＤＴＡを含有する
１０mMトリス緩衝液（ｐＨ７．４）で平衡化したブチル
トヨパール６５０（５．０×１５cm）カラムに加えた。
このカラムを、１mM ＥＤＴＡを含む５０mM トリス緩
衝液(ｐＨ７．４) ５００mLで洗浄し、更に、５０−３
mMトリス緩衝液（ｐＨ７．４）の濃度勾配で溶出させ
た。そして、この溶出パターンを、波長２８０nmでの吸
光度により測定した。この溶出パターンに従い、さらに
各溶出分画のＰＬＴＰ活性を、上記の方法で測定し、ヒ
トＰＬＴＰを含む画分を回収した。

【００７２】ＣＭセファロースカラムクロマトグラフィ
ーによる精製 上記の疎水クロマトグラフィーにより得た、ＰＬＴＰ活
性を有する画分を、１０mMクエン酸ナトリウム緩衝液
（ｐＨ５．５）で透析を行い、予め１０mM クエン酸ナ
トリウム緩衝液（ｐＨ５．５）で平衡化したＣＭトヨパ
ール６５０（２．５×２４cm）カラムに加えた。このカ
ラムに１０mM クエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．
５）を加えて洗浄し、濃度勾配が０−１．２Ｍの塩化ナ
トリウム溶液で溶出した。溶出パターンを、波長２８０
nmでの吸光度により測定した。この溶出パターンに従
い、各溶出画分のＰＬＴＰ活性を上記の方法で測定し、
ヒトＰＬＴＰを含む分画（塩濃度０．１５〜０．３５Ｍ
の塩化ナトリウム溶出画分）を回収した。

【００７３】ヘパリンセファロースカラムクロマトグラ
フィーによる精製 上記のＣＭセファロースカラムクロマトグラフィーによ
り得た、ＰＬＴＰ活性を有する画分を、５０mM 塩化ナ
トリウム含有１０mM トリス緩衝液（ｐＨ７．４）で透
析を行い、ヘパリンセファロースカラム（１．５×８．
５cm）に加えた。このカラムを、５０mM 塩化ナトリウ
ム含有１０mM トリス緩衝液（ｐＨ７．４）を加えて洗
浄し、０．５Ｍ 塩化ナトリウム含有１０mM トリス緩
衝液（ｐＨ７．４）を加え溶出した。この溶出パターン
を、波長２８０nmでの吸光度により測定した。この溶出
パターンに従い、各溶出画分のＰＬＴＰ活性を、上記の
方法を用いて測定し、ヒトＰＬＴＰを含む分画（塩濃度
０．５Ｍの塩化ナトリウム溶出画分，フラクションＮ
ｏ．３６〜４０）を回収した。

【００７４】Ｍｏｎｏ Ｑカラムクロマトグラフィーに
よる精製 上記のヘパリンセファロースカラムクロマトグラフィー
により得た、ＰＬＴＰ活性を有する画分を、１mM ＥＤ
ＴＡ含有２５mM トリス緩衝液（ｐＨ７．４）で透析を
行い、Ｍｏｎｏ ＱＨＲ ５／５カラム（１．５×８．
５cm）に加えた。このカラムを、１mM ＥＤＴＡ含有２
５mM トリス緩衝液（ｐＨ７．４）で洗浄後、０〜１Ｍ
塩化ナトリウムの濃度勾配で溶出した。この溶出パタ
ーンを、波長２８０nmでの吸光度により測定した。この
溶出パターンに従い、各溶出画分のＰＬＴＰ活性を、上
記の方法を用いて測定し、ヒトＰＬＴＰを含む分画（塩
濃度２００mMの塩化ナトリウム溶出画分）を回収した。

【００７５】ゲルろ過クロマトグラフィーによる精製 上記のＭｏｎｏ Ｑカラムクロマトグラフィーで得た、
実施例で回収し得たＰＬＴＰ活性を有する画分を、予め
１mM ＥＤＴＡ含有２５mM トリス緩衝液（ｐＨ７．
４）で平衡化した、スーパーロース６ＨＲカラムに加
え、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）で溶出した。この溶出パター
ンを、波長２８０nmでの吸光度により測定した。この溶
出パターンに従い、各溶出画分のＰＬＴＰ活性を上記の
方法を用いて測定し、ヒトＰＬＴＰを含む分画（フラク
ションＮｏ．２９〜３４溶出画分）を回収し、これを精
製ヒトＰＬＴＰとした。

【００７６】このようなステップにより、ヒト血漿から
精製された精製ヒトＰＬＴＰは、７．５％ポリアクリル
アミドゲルを用いたＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ドデシル硫酸ポ
リアクリルアミドゲルナトリウム電気泳動）により、分
子量が約８０，０００であり、また、４２００nmol／mL
／hrのＰＬＴＰ活性を有していた（第１図）。

【００７７】〔組換えヒトＰＬＴＰ蛋白の製造〕ヒトＰＬＴＰをコードするｃＤＮＡの調製 ヒト肝臓由来のｃＤＮＡを鋳型として、特異的プライマ
ー〔センスプライマー：５’−ＣＡＧＣＴＣＣＡＣＣＧ
ＣＴＧＡＧＣＣＣＧＣＴＣ−３’（配列番号１）、アン
チセンスプライマー：５’−ＡＣＡＧＣＴＧＣＣＡＧＣ
ＴＴＧＧＧＧＡＴＴＧＡＧＧ−３’（配列番号２）〕を
用いて、ＲＴ−ＰＣＲを行い、ＰＬＴＰのｃＤＮＡをク
ローニングした。

【００７８】すなわち、特異的プライマーを用いて、Ｒ
Ｔ−ＰＣＲにより増幅したＤＮＡ断片を、常法により、
アガロース電気泳動により分離し、約１．５Kbp のＤＮ
Ａ断片をゲルごと切り出した後、QIAEX II gel extract
ion キット（ＱＩＡＧＥＮ社製）で抽出し、目的とする
ｃＤＮＡ断片を得た。

【００７９】このようにして得られた、約１．５Kbp の
ＤＮＡ断片を、ＤＮＡライゲーションキット（宝酒造
製）を用いて、pT7 Blueベクター（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥ
Ｎ社製）に挿入した。

【００８０】次いで、pT7 Blueベクターを、大腸菌ＪＭ
１０９コンピテントセル（東洋紡社製）に導入した。さ
らに、この大腸菌より、プラスミドＤＮＡを抽出し、プ
ラスミドＤＮＡのシーケンスを行い、約１．５Kbp の目
的とするｃＤＮＡ断片の塩基配列を確認した。このよう
にして得られた、約１．５Kbp のＰＣＲ産物は、目的と
するヒトＰＬＴＰをコードするｃＤＮＡであることが確
認された。

【００８１】組換えヒトＰＬＴＰ蛋白発現系の構築 上述のようにして得られた、ヒトＰＬＴＰをコードする
ｃＤＮＡを、動物細胞発現ベクターpEF321-3.1.1ベクタ
ーに組み込んだ。

【００８２】すなわち、得られたヒトＰＬＴＰをコード
するｃＤＮＡを鋳型とし、プライマー〔センスプライマ
ー：５’−ＧＧＣＡＧＧＣＧＣＡＣＡＴＡＴＧＧＡＧＴ
ＴＣＣＣＡＧＧＣＴＧＣＡＡＧＡＴＣ−３’（配列番号
３）、アンチセンスプライマー：５’−ＡＣＡＧＣＴＧ
ＣＣＡＧＣＴＴＧＧＧＧＡＴＴＧＡＧＧ−３’（配列番
号２）〕を用いて、ＰＣＲを行った。このＰＣＲにより
増幅されたＤＮＡ断片を、常法によりアガロース電気泳
動により分離し、約１．５Kbp のＤＮＡ断片を、ゲルご
と切り出した後、QIAEX II gel extraction キット（Ｑ
ＩＡＧＥＮ社製）で抽出し、目的とするｃＤＮＡ断片を
得た。

【００８３】このようにして得られた、約１．５Kbp の
ＤＮＡ断片を、ＤＮＡライゲーションキット（宝酒造
製）を用いて、pBluescript II KS(-)ベクター（ＳＴＲ
ＡＴＡＧＥＮＥ社製）に挿入した。

【００８４】次いで、このpBluescript II KS(-)ベクタ
ーを、大腸菌ＪＭ１０９コンピテントセル（東洋紡社
製）に導入した。さらに、この大腸菌より、プラスミド
ＤＮＡを抽出し、プラスミドＤＮＡのシーケンスを行
い、約１．５Kbp の目的とするｃＤＮＡ断片の塩基配列
を確認した。

【００８５】このようにして得られた、ヒトＰＬＴＰを
コードするｃＤＮＡを、pEF321-3.1.1ベクター〔ヒトＥ
Ｆ１αプロモーターを有するベクターｐＥＦ３２１（Ki
m DGet al,Gene,91,217-223,1990）に、更にＣＨＯ細胞
において細胞外への分泌を円滑にするためのインヒビン
αシグナルシークエンス、及び組換え蛋白の精製を容易
にするためのヒスチジンタッグを附加した新規の発現用
ベクター：第２図に、その構築図を示す〕に、ＤＮＡラ
イゲーションキット（宝酒造社製）を用いて挿入し、ベ
クターpEF321-3.1.1／PLTPを得た。

【００８６】リポフェクチン試薬（ギブコ(Gibco）社
製)を用いて、pEF321-3.1.1／PLTP及び薬剤耐性遺伝子
を含むpEF321/neo（前記のｐＥＦ３２１ベクターに、常
法によりネオマイシン耐性遺伝子を導入したもの）を、
同時にＣＨＯ細胞（５×１０⁵cells）に導入し、１０％
牛胎児血清含有Ｆ１２培地で、３日間培養した。次い
で、培養したＣＨＯ細胞を、トリプシン／ＥＤＴＡで処
理し、培地を、１mg／mLのゲネチシン（シグマ社製）含
有上記Ｆ１２培地１２mLに置き換え、９６ウエルプレー
トに０．１mL／ウエルの割合で播き、培養した。２日毎
にゲネチシンを含有する上記Ｆ１２培地で交換し、１０
日間選択培養を行った。かかる選択培養において、増殖
が認められた細胞について、常法に従ってＲＮＡを抽出
した。

【００８７】得られたＲＮＡを用いて、ヒトＰＬＴＰｃ
ＤＮＡをプロープとしたノーザンプロットを行い、pEF3
21-3.1.1／PLTPを導入したＣＨＯ細胞での、ヒトＰＬＴ
Ｐの特異的な転写発現を確認した。

【００８８】培地をＣＨＯ−Ｓ−ＳＦＭII（ギブコ社
製）に換えて培養し、組換えヒトＰＬＴＰを含む培養上
清を収集した。収集した組換えヒトＰＬＴＰ培養上清
を、Ｎｉ−ＮＴＡアガロース（ＱＩＡＧＥＮ社製）と、
４℃で一晩転倒混和し、翌日に、反応後のＮｉ−ＮＴＡ
アガロースをカラムに充填し、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）及
びＰＢＳ（ｐＨ６．０）で、順次洗浄後、１００mM Ｅ
ＤＴＡを含むＰＢＳで溶出し、精製組換えヒトＰＬＴＰ
タンパク質画分を得た。

【００８９】組換えヒトＰＬＴＰの性状 上述のようにして得られた、精製組換えヒトＰＬＴＰの
分子量を、常法に従って、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ドデシル
硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動）によ
り解析した。その結果を、第３図に示す。この結果か
ら、上記の組換えヒトＰＬＴＰは、分子量が約８０kDa
であることが確認された。

【００９０】ヒトＰＬＴＰの精製はこれまでも多くの研
究者によって試みられ、その分子量が報告されている
〔Jauhiainen M et al.,J Biol Chem,268:4032-4036(19
93) 、Tu A-Y et al.,J Biol Chem,268:23098-23105(19
93) 、Tollefson JH et al.,JLipid Res,29:1593-1602
(1988)等〕。報告された値は精製方法、あるいは分子量
分析方法等の違いにより、完全には一致していないが、
いずれも概ね７０〜８０kDa である。

【００９１】これらの既に報告されている分子量との比
較から、上記の組換えヒトＰＬＴＰは、同等の分子量を
有しており、また、上記の組換えヒトＰＬＴＰは、6500
nmol/mL/hrのＰＬＴＰ活性を有していることから、ヒト
精製ＰＬＴＰと同等のＰＬＴＰ蛋白としての生物学的活
性を有していることが示された。

【００９２】〔本発明に係わるハイブリドーマの調製〕
上記の組換えヒトＰＬＴＰ（１９０μg /mL ）を、等量
のフロイント完全アジュバンドと混和し、その０．４mL
を７週齢のＢａｌｂ/ｃマウス（雌、日本ＳＬＣ社）の
腹腔に免疫した。２週間後、フロイント不完全アジュバ
ントを使用して同様に免疫を行い、それ以降は２週間に
一回、計３回免疫した。

【００９３】最終免疫３日後のマウスの脾細胞４×１０
⁸ 個を、マウスミエローマ細胞〔SP2/0-Ag14(4×10
⁷ 個)]と混和し、５０％ポリエチレングリコール（平均
分子量１５００：ベーリンガーマンハイム社製）ＰＢＳ
溶液を用いて細胞融合を行った。処理後の細胞を、ＲＰ
ＭＩ１６４０培地（ＧＩＢＣＯ社製）中に、９６ウエル
プレートにウエル当り５×１０⁵ 個の割合になるように
播き、翌日からＨＡＴ試薬（シグマ社製）を添加し、７
日間選択培養を行ったところ、ほぼ全ウエルにハイブリ
ドーマの増殖が認められた。

【００９４】各ハイブリドーマの培養上清中のヒトＰＬ
ＴＰに対して特異的なモノクローナル抗体の有無は、精
製組換えヒトＰＬＴＰを抗原としたＥＬＩＳＡ法でスク
リーニングした。すなわち、精製組換えヒトＰＬＴＰタ
ンパク質をウエル当り１００ngずつ固相化した９６ウエ
ルプレート（固定化精製組換えヒトＰＬＴＰプレート）
にハイブリドーマの培養上清を５０μl 添加し、室温下
で２時間反応させた（１次反応）。

【００９５】次いで、プレートを０．１％Ｔｗｅｅｎ２
０を含むＰＢＳで 6回洗浄した後、同ＰＢＳで４０００
倍に希釈したパーオキシダーゼ標識ウサギ抗マウスＩｇ
Ｇ抗体（Zymed Laboratories社製）加え、室温で 1時間
反応させた（２次反応）。プレートを上記ＰＢＳにて６
回洗浄後、０．０１５％過酸化水素を含む０．２５mg／
ml ＯＰＤ溶液（シグマ社製）を各ウェルに１００μl
加え、室温で３０分間反応した（基質反応）。反応後、
さらに各ウェルに２Ｎ硫酸を５０μl 加えて反応を停止
した。そして、波長４９２nmでの吸光度をマイクロプレ
ートリーダー（ラボシステム社製）で測定した。この結
果、吸光度が１．０以上のハイブリドーマ培養上清を陽
性とした。上記のスクリーニング方法で陽性であったハ
イブリドーマ培養上清について、さらにウエスタンブロ
ット法でヒト血漿から調製した高比重リポタンパク（Ｈ
ＤＬ，１．０６３＜ｄ＜１．２１０）分画中のＰＬＴＰ
との反応性を確認し、上記組換えヒトＰＬＴＰを抗原と
したＥＬＩＳＡ法、及びヒトＨＤＬ画分のウエスタンブ
ロット法にて特異性が認められたクローンを選別した。

【００９６】このようにして、特異性が確認されたハイ
ブリドーマについて、ＨＴ試薬（シグマ社製）を添加し
たＲＰＭＩ１６４０培地において、９６ウエルプレート
に、ウエル当り０．５個の細胞を播く操作を３回繰り返
してクローニングし、モノクローナル抗体産生ハイブリ
ドーマ（＃１１３，＃１１４，＃１１０Ｇ）が得られ
た。

【００９７】なお、これらのハイブリドーマは、工業技
術院微生物工業技術研究所に寄託されている〔mouse hy
bridoma PLTP113 （寄託番号：ＦＥＲＭ Ｐ−１６６０
５）、mouse hybridoma PLTP114 （寄託番号：ＦＥＲＭ
Ｐ−１６６０６）、mousehybridoma PLTP110G（寄託
番号：ＦＥＲＭ Ｐ−１６６０７）〕。

【００９８】〔本発明モノクローナル抗体の調製〕モノクローナル抗体の大量精製 Ｂａｌｂ/ｃマウス（雌、８週齢、１０匹、日本ＳＬＣ
社）に、上述のようにして得られたハイブリドーマ〔＃
１１３，＃１１４，＃１１０Ｇ（各々１０⁶ 〜１０⁷ 個
／０．５mL／マウス）〕の各々を、腹腔内注射により導
入した。導入１０日後、マウスを麻酔下で開腹し、常法
により採取した腹水からモノクローナル抗体（＃１１
３、＃１１４、＃１１０Ｇ）を、それぞれ大量に調製し
た。

【００９９】アイソタイプの決定 マウスモノクローナル抗体アイソタイプ決定用キット
（サングスタットメディカル社製）を用い、このキット
に添付の実験操作プロトコールに従って操作を行い、モ
ノクローナル抗体（＃１１３、＃１１４、＃１１０Ｇ）
のアイソタイプを決定した。その結果、モノクローナル
抗体＃１１３のアイソタイプがＩｇＧ２ｂで、同＃１１
４及び＃１１０ＧがＩｇＧ１であった。

【０１００】モノクローナル抗体の精製 上述のモノクローナル抗体（＃１１３、＃１１４、＃１
１０Ｇ）を、各々の遠心上清（各々５mL）を、飽和硫酸
アンモニウム溶液５mLと混和したものを氷冷し、２時間
放置した後、４℃，１００００×g で１０分間遠心処理
を行った。遠心処理後、沈殿物を、バインディングバッ
ファー（３Ｍ 塩化ナトリウム／１．５Ｍ グリシン溶
液、ｐＨ８．９）に溶解し、プロテインＡセファロース
（ファルマシア社製）１mLと混合し、４℃で一晩転倒混
和した。翌日、プロテインＡセファロースをカラムに充
填し、バインディングバッファー６mL で６回洗浄後、
溶出バッファー（０．１Ｍクエン酸溶液、ｐＨ４．０）
２mLずつで溶出し、溶出回収した各々の溶液を、２Ｍト
リス溶液（ｐＨ１０．０）０．２mLで中和した。各フラ
クションの吸光度（２８０nm）を測定し、モノクローナ
ル抗体の溶出画分を回収し、リン酸緩衝液（ｐＨ７．
４）で透析（４℃、２４時間）し、精製モノクローナル
抗体（＃１１３、＃１１４、＃１１０Ｇ）を得た。

【０１０１】本発明に係わるヒトＰＬＴＰモノクローナ
ル抗体の性状解析 ヒトＰＬＴＰに対する反応性 上述のようにして得られた精製モノクローナル抗体（＃
１１３、＃１１４、＃１１０Ｇ）のヒトＰＬＴＰに対す
る反応性は、ヒト血漿及びヒト血漿から精製した精製ヒ
トＰＬＴＰ（上述した）を用いたウエスタンブロット法
にて確認した。

【０１０２】ヒト血漿試料は２μL ／レーン、精製ヒト
ＰＬＴＰは６０ng／レーン、ヒトＨＤＬ画分は１５μg
／レーン、マウスＨＤＬ画分は６０μg ／レーンの濃度
で、７．５％，１０％，あるいは５〜２０％ＳＤＳポリ
アクリルアミドゲル（アトー社製）を用いて、ＳＤＳ−
ＰＡＧＥ電気泳動を行った。次いで、ゲルをＰＶＤＦ膜
に転写した。更に、転写膜をブロッキング試薬〔５％ス
キムミルク含有ＰＢＳ(ｐＨ７．４)〕中で、４℃で一晩
インキュベートした。

【０１０３】転写膜を０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０含有Ｐ
ＢＳ（ｐＨ７．４）で５回洗浄後、０．１％Ｔｗｅｅｎ
２０含有ＰＢＳ（ｐＨ７．４）で１μｇ／mLの濃度に調
製した各精製モノクローナル抗体（＃１１３、＃１１
４、＃１１０Ｇ）を室温で２時間反応させた。反応後、
膜を０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳ（ｐＨ７．
４）で５回洗浄し、０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢ
Ｓ（ｐＨ７．４）で、４０００倍希釈した２次抗体（Ｈ
ＲＰ標識抗マウスＩｇＧ抗体：ザイメット製）を室温で
１時間反応させた。反応後、膜を、０．１％ Ｔｗｅｅ
ｎ２０含有ＰＢＳ（ｐＨ７．４）で５回洗浄し、ケミル
ミ試薬（ＮＥＮライフサイエンスプロダクト製）を１分
間反応させた。次いで、ケミルミ試薬を取り除き、Ｘ線
フィルムに感光後、フィルムを現像し反応バンドを検出
した。

【０１０４】この結果、各精製モノクローナル抗体（＃
１１３、＃１１４、＃１１０Ｇ）の、精製ヒトＰＬＴＰ
に対する反応性は、分子量約８０kDaの、上記の精製ヒ
トＰＬＴＰに反応することが確認された（第４図）。ま
た、これらの各精製モノクローナル抗体（＃１１３、＃
１１４、＃１１０Ｇ）のヒト血漿及びＨＤＬ画分に対す
る反応性は、精製ヒトＰＬＴＰの場合と同様に、分子量
約８０kDaの単一蛋白を認識しており、血漿中及びＨＤ
Ｌ画分中のヒトＰＬＴＰ蛋白を特異的に認識しているこ
とが示された（第５図，第６図）。さらに、マウスＨＤ
Ｌ画分に対する反応性から、各精製モノクローナル抗体
（＃１１３、＃１１４、＃１１０Ｇ）は、マウス由来の
ＰＬＴＰには反応しないことが示された（第７図）。

【０１０５】固定化精製組換えヒトＰＬＴＰに対する
反応性 上述のように得られた、各精製モノクローナル抗体（＃
１１３、＃１１４、＃１１０Ｇ）の組換えヒトＰＬＴＰ
に対する反応性を、固定化精製組換えヒトＰＬＴＰマイ
クロプレートにて検討した。すなわち、上記した方法で
精製した組換えヒトＰＬＴＰ（１００ng／ウェル）をマ
イクロプレートに、４℃，２４時間インキュベートし、
マイクロプレートに固相化した。

【０１０６】インキュベート後、マイクロプレートをリ
ン酸緩衝液（２００μL ）で、４回洗浄した。この洗浄
液を捨て、各ウェルに、ブロッキング試薬〔２００μL
の１％ブロックエース粉末（大日本製薬社製）含有リン
酸緩衝液（２００μL ）〕を加え、室温で２時間インキ
ュベートし、組換えヒトＰＬＴＰが結合していない部位
をブロックした。次いで、各ウェルを０．１％Ｔｗｅｅ
ｎ２０含有リン酸緩衝液（２００μl ）で４回洗浄し
た。さらに各ウェルに、各濃度の精製モノクローナル抗
体（０〜１．２５μg ／mLの濃度）を１００μl ずつ加
え、室温で２時間反応させた。

【０１０７】反応後、各ウェルを、０．１％Ｔｗｅｅｎ
２０含有リン酸緩衝液（２００μL）で４回洗浄した。
洗浄後、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳ（ｐＨ７．
４）で、４０００倍に希釈した２次抗体（ＨＲＰ標識抗
マウスＩｇＧ抗体：ザイメット社製）を、室温で１時間
反応させた。反応後、各ウェルを０．１％Ｔｗｅｅｎ２
０含有リン酸緩衝液（２００μl ）で５回洗浄し、０．
０１５％過酸化水素を含む０．２５mg／ml ＯＰＤ溶液
（シグマ社製）を１００μl 加え、室温で３０分間反応
した。さらに、各ウェルに、２Ｎ硫酸（５０μL ）を加
え、反応を停止した。

【０１０８】そして、波長４９２nmでの吸光度をマイク
ロプレートリーダー（ラボシステム社製）で測定した。
この結果、精製モノクローナル抗体（＃１１３、＃１１
４、＃１１０Ｇ）は、マイクロプレートに固定化された
組換えヒトＰＬＴＰ（１００ng）に対して、０．０６〜
０．３μg ／mLの濃度で反応することが示された（第８
図）。

【０１０９】モノクローナル抗体のエピトープ解析 大腸菌による組換えＰＬＴＰ蛋白発現系の構築 各精製モノクローナル抗体のＰＬＴＰ蛋白に対して反応
するエピトープを解析するために、以下に示す方法で、
ＰＬＴＰのＮＨ₂ 末端を有する部分組換えＰＬＴＰ及び
同ＣＯＯＨ末端を有する部分組換えＰＬＴＰを、大腸菌
を用いて発現させた。

【０１１０】すなわち、上述のように得られた、ヒトＰ
ＬＴＰをコードするｃＤＮＡを鋳型とし、プライマー
〔センスプライマー：５’−ＧＣＡＧＧＣＧＣＧＣＡＴ
ＧＣＡＧＡＧＴＴＣＣＣＡＧＧＣＴＧＣＡＡ−３’（配
列番号４）、アンチセンスプライマー：５’−ＧＡＣＡ
ＧＧＧＣＡＡＡＧＣＴＴＣＴＧＧＴＴＧＡＧＧＡＧＧＡ
ＡＧＣＧＣＡＴ−３’（配列番号５）〕を用いて、ＰＣ
Ｒを行った。このＰＣＲにより増幅されたＤＮＡ断片
を、常法により、アガロース電気泳動で分離し、約０．
５Kbp のＤＮＡ断片を、ゲルごと切り出した後、QIAEX
II gel extractionキット（ＱＩＡＧＥＮ社製）でゲル
を溶かし、目的とする約０．５Kbp のＤＮＡ断片を得
た。

【０１１１】このようにして得られた、約０．５Kbp の
ＤＮＡ断片を、ＤＮＡライゲーションキット（宝酒造社
製）を用いて、ｐＱＥ３１ベクター（ＱＩＡＧＥＮ社
製）に挿入した。次いで、このｐＱＥ３１ベクターを、
大腸菌ＪＭ１０９コンピテントセル（東洋紡社製）に導
入した。さらに、この大腸菌からプラスミドＤＮＡを抽
出し、プラスミドＤＮＡのシーケンスを行い、約０．５
Kbp のｃＤＮＡ断片の塩基配列を確認した。

【０１１２】このようにして、ＮＨ₂ 末端を有する、部
分組換えヒトＰＬＴＰを発現させるための、約０．５Kb
p のｃＤＮＡ（ヒトＰＬＴＰの成熟アミノ酸配列１−１
６５に対応）を得た。

【０１１３】また、ＣＯＯＨ末端を有する、部分組換え
ヒトＰＬＴＰのｃＤＮＡは、上述のようにして得られた
ヒトＰＬＴＰｃＤＮＡを含むプラスミドを、制限酵素Ｂ
ｇｌII （宝酒造社製）と、制限酵素Ｈｉｎｄ III（宝
酒造社製）で消化し、これにより切断されたＤＮＡ断片
を、アガロース電気泳動を用いて分離し、目的とする約
１．０Kbp のＤＮＡ断片をゲルごと切り出した後、QIAE
X II gel extractionキット（ＱＩＡＧＥＮ社製）でゲ
ルを溶かし、目的とする、制限酵素Ｂｇｌ II（宝酒造
社製）と制限酵素Ｈｉｎｄ III（宝酒造社製）で切断さ
れた、約１．０Kbp のＤＮＡ断片を得た。

【０１１４】このようにして得られた、約１．０Kbp の
ＤＮＡ断片を、ＤＮＡライゲーションキット（宝酒造社
製）を用いて、ｐＱＥ３２ベクター（ＱＩＡＧＥＮ社
製）に挿入した。

【０１１５】次いで、このｐＱＥ３２ベクターを、大腸
菌ＪＭ１０９コンピテントセル（東洋紡社製）に導入し
た。さらに、この大腸菌からプラスミドＤＮＡを抽出
し、プラスミドＤＮＡのシーケンスを行い、約１．０Kb
p のｃＤＮＡ断片の塩基配列を確認した。

【０１１６】このようにして、ＣＯＯＨ末端を有する、
部分組換えヒトＰＬＴＰを発現させるための、約１．０
Kbp のｃＤＮＡ（ヒトＰＬＴＰの成熟アミノ酸配列１６
７−４７６に対応）を得た。

【０１１７】大腸菌による部分組換えヒトＰＬＴＰの
発現 上述の方法により得られた、ＮＨ₂ 末端又はＣＯＯＨ末
端を有する部分組換えヒトＰＬＴＰｃＤＮＡを挿入した
プラスミドを含むクローンを、常法により、５０μg ／
mLのアンピシリン含有ＴＢ培地で培養した。さらに、終
濃度が０．３mMとなるように、ＩＰＴＧ(Isopropyl β
-D-Thiogalactopyranoside) （シグマ社製）を加え、３
７℃，３時間培養して、部分組換えヒトＰＬＴＰ蛋白の
発現を誘導した。

【０１１８】誘導培養後、それぞれの菌体を回収し、超
音波処理を施した後、Ｎｉ−ＮＴＡアガロース（ＱＩＡ
ＧＥＮ社製）を用いて、各々のＮＨ₂ 末端を有する部分
組換えヒトＰＬＴＰ蛋白部分（組換えヒトＰＬＴＰ１−
１６５）及びＣＯＯＨ末端を有する部分組換えヒトＰＬ
ＴＰ蛋白部分（組換えヒトＰＬＴＰ１６７−４７６）を
精製した。さらに、精製したＮＨ₂ 末端およびＣＯＯＨ
末端を有する部分組換えヒトＰＬＴＰを１２．５％ポリ
アクリルアミドゲルを用い、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにて確認
したところ、ＮＨ₂ 末端およびＣＯＯＨ末端を有する部
分組換えヒトＰＬＴＰの分子量は、それぞれ約２２，０
００および約３８，０００であった（第９図）。

【０１１９】モノクローナル抗体のエピトープ解析 上記の方法により精製した、各々のＮＨ₂ 末端を有する
部分組換えヒトＰＬＴＰ蛋白部分（組換えヒトＰＬＴＰ
１−１６５）及びＣＯＯＨ末端を有する部分組換えヒト
ＰＬＴＰ蛋白部分（組換えヒトＰＬＴＰ１６７−４７
６）を、１００ng／レーンの濃度で、１２．５％ポリア
クリルアミドゲルを用いて、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動
を行った。

【０１２０】次いで、ゲルをＰＶＤＦ膜に転写し、転写
膜をブロッキング試薬〔５％スキムミルク含有ＰＢＳ
（ｐＨ７．４）〕で、４℃，一晩インキュベートした。
さらに、転写膜を０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳ
（ｐＨ７．４）で５回洗浄し、０．１％ Ｔｗｅｅｎ２
０含有ＰＢＳ（ｐＨ７．４）で１μg ／mLの濃度に調製
した、各精製モノクローナル抗体（＃１１３、＃１１
４、＃１１０Ｇ）を、室温で２時間反応させた。

【０１２１】反応後、膜を、０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０
含有ＰＢＳ（ｐＨ７．４）で５回洗浄し、０．１％ Ｔ
ｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳ（ｐＨ７．４）で、４０００倍
に希釈した２次抗体（ＨＲＰ標識マウスＩｇＧ抗体：ザ
イメット社製）を、室温で１時間反応させた。反応後、
転写膜を０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳ（ｐＨ
７．４）で、５回洗浄し、ケミルミ試薬（ＮＥＮライフ
サイエンスプロダクト社製）で１分間反応させた。

【０１２２】次いで、膜からケミルミ試薬を除去し、膜
でＸ線フィルムを感光後、このフィルムを現像し、フィ
ルム上に現れたバンドを検出した。この結果、各精製モ
ノクローナル抗体（＃１１３、＃１１４、＃１１０Ｇ）
のうち、＃１１３及び＃１１４は、ＣＯＯＨ末端を有す
る部分組換えヒトＰＬＴＰ蛋白（組換えヒトＰＬＴＰ１
６７−４７６）に対して、分子量約３８０００に相当す
るバンドが認められ、

【０１２３】＃１１０Ｇは、ＮＨ₂ 末端を有する部分組
換えヒトＰＬＴＰ蛋白（組換えヒトＰＬＴＰ１−１６
５）に対して、分子量約２２０００に相当するバンドが
認められた（第１０図）。これらの結果から、精製モノ
クローナル抗体＃１１３及び＃１１４は、ヒトＰＬＴＰ
の成熟アミノ酸配列の１６７−４７６の領域を認識し、
＃１１０Ｇは、ヒトＰＬＴＰの成熟アミノ酸配列の１−
１６５の領域を認識することが示された。

【０１２４】〔サンドイッチＥＬＩＳＡによるヒトＰＬ
ＴＰの定量法の確立〕固相化モノクローナル抗体の調製 上記の各精製モノクローナル抗体（＃１１３、＃１１
４、＃１１０Ｇ）を、リン酸緩衝液で希釈（１０ng／ウ
ェル〜１μｇ／ウェル、ｐＨ７．４）し、これらの各々
のモノクローナル抗体溶液（１００μL）を、ＥＬＩＳ
Ａ用９６穴マイクロプレート（ヌンク社製）の各ウェル
に加え、４℃で２４時間インキュベートし、各々のモノ
クローナル抗体をマイクロプレートに吸着させた。次い
で、各ウェルをリン酸緩衝液２００μLで４回洗浄し
た。この洗浄液を捨て、各ウェルにブロッキング試薬
〔２００μLの１％ ブロックエース粉末（大日本製薬
社製）含有リン酸緩衝液〕を加え、室温で２時間インキ
ュベートし、モノクローナル抗体が結合していない部位
をブロックした。次いで、各ウェルを、０．１％ Ｔｗ
ｅｅｎ２０含有リン酸緩衝液（２００μL）で４回洗浄
した。このようにして、所望する固相化モノクローナル
抗体を調製した。

【０１２５】標識モノクローナル抗体の作製 上記の各精製モノクローナル抗体（＃１１３、＃１１
４、＃１１０Ｇ：１mg／mLを１mL）を、０．１ＭのＮａ
ＨＣＯ₃ （ｐＨ８．２〜８．３）溶液で透析（４℃，２
４時間）した。次いで、ＮＨＳ−ビオチン（１mg／mLを
６０μL、ピアス社製）を加え、激しく攪拌した後、室
温下で４時間インキュベートした。次いで、リン酸緩衝
液で透析（４℃，２４時間）して、各々のモノクローナ
ル抗体において、所望するビオチン標識モノクローナル
抗体（以下、標識モノクローナル抗体という）を調製し
た。

【０１２６】このように調製した標識モノクローナル抗
体の、精製組換えヒトＰＬＴＰに対する反応性を、上述
の固定化精製組換えヒトＰＬＴＰマイクロプレートで、
同様に検討した。その結果、各々の標識モノクローナル
抗体は、０．３〜０．６μg ／mLの濃度で、固定化精製
組換えヒトＰＬＴＰ（１００ng）に反応することが示さ
れた（第１１図，第１２図）。

【０１２７】サンドイッチＥＬＩＳＡによる定量法の確
立 上記の各固定化モノクローナル抗体（＃１１３、＃１１
４、＃１１０Ｇ：５００ng／ウェル〜０．５μｇ／ウェ
ルの濃度で固定化した。以下、「固定化マイクロプレー
ト」ともいう。）の各々を、０．１％ Ｔｗｅｅｎ ２
０含有リン酸緩衝液で５回洗浄した。各々の固定化マイ
クロプレートの各ウェルに、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０含
有リン酸緩衝液で希釈した測定試料〔健常人の血漿、
ヒト組換えＰＬＴＰ含有培地）を１００μL加え、室
温で２時間インキュベートした。

【０１２８】インキュベート後、固定化マイクロプレー
トを０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０含有リン酸緩衝液で５回
洗浄後、各ウェルに０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０含有リン
酸緩衝液で希釈した、上記のビオチン標識モノクローナ
ル抗体を加え（１μg/mLを１００μL ）、室温下で２時
間インキュベートした。

【０１２９】次いで、固定化マイクロプレートを、０．
１％ Ｔｗｅｅｎ２０含有リン酸緩衝液で５回洗浄後、
０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０含有リン酸緩衝液で、２００
０倍に希釈したＨＲＰ標識ストレプトアビジン（１mg／
mL：Vector Laboratories社製）１００μLを各ウェル
に加え、室温下で３０分間インキュベートした。

【０１３０】インキュベート後、固定化マイクロプレー
トを、０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０含有リン酸緩衝液で５
回洗浄後、固定化マイクロプレートに０．０１５％過酸
化水素を含む０．２５mg／mL ＯＰＤ（シグマ社製）溶
液を１００μＬ加え、室温で３０分間インキュベートし
た。更に、固定化マイクロプレートを２N硫酸（５０μ
L）を各ウェルに加え、反応を停止した。

【０１３１】そして、波長４９２nmでの吸光度を、マイ
クロプレートリーダー（ラボシステム社製）で測定し
た。このような、サンドイッチＥＬＩＳＡによる測定試
料中のＰＬＴＰ測定では、実施例で示したように、健常
人の血漿や組換えヒトＰＬＴＰ含有培地中のＰＬＴＰ
を、濃度依存的に測定がなされており、本発明のサンド
イッチＥＬＩＳＡによる測定試料中のＰＬＴＰ量を定量
することが十分に可能であることが示された（第１３
図，第１４図）。

【０１３２】この結果、標識モノクローナル抗体及び固
定化モノクローナル抗体の組み合わせのうち、特に、固
定化モノクローナル抗体＃１１４と標識モノクローナル
抗体＃１１３、あるいは固定化モノクローナル抗体＃１
１０Ｇと標識モノクローナル抗体＃１１３のいずれかの
組み合わせにより、測定試料中のＰＬＴＰ量を測定する
のが好ましい。

【０１３３】また、このような測定試料中のＰＬＴＰを
測定するのに最適な固定化モノクローナル抗体及び標識
モノクローナル抗体の濃度は、固定化モノクローナル抗
体の濃度が０．５μg ／ウェルであり、標識モノクロー
ナル抗体の濃度が０．１μg／ウェルであることが、上
記の実施例により示された。

【０１３４】

【発明の効果】本発明により、ヒトの脂質代謝において
重要な役割を担っているヒトリン脂質転送タンパク質
（ＰＬＴＰ：phospholipid transfer Protein)に対する
モノクローナル抗体及びその製造工程において用いるハ
イブリドーマ、並びに動脈硬化等の脂質代謝異常が深く
関わる疾病の重要な指標となり得る，このヒトリン脂質
転送タンパク質に対するモノクローナル抗体を用いたヒ
トリン脂質転送タンパク質の測定方法、及びこの測定方
法を行うための測定キットが提供される。

【０１３５】

【配列表】

【０１３６】 配列番号：１ 配列の長さ：２３ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直線状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 CAGCTCCACC GCTGAGCCCG CTC 23

【０１３７】 配列番号：２ 配列の長さ：２５ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直線状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 ACAGCTGCCA GCTTGGGGAT TGAGG 25

【０１３８】 配列番号：３ 配列の長さ：３７ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直線状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 GGCAGGCGCA CATATGGAGT TCCCAGGCTG CAAGATC 37

【０１３９】 配列番号：４ 配列の長さ：３２ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直線状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 GCAGGCGCGC ATGCAGAGTT CCCAGGCTGC AA 32

【０１４０】 配列番号：５ 配列の長さ：３６ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直線状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 GACAGGGCAA AGCTTCTGGT TGAGGAGGAA GCGCAT 36

【図面の簡単な説明】

【図１】ヒトの血漿中より精製したＰＬＴＰの分子量を
示す電気泳動像である。

【図２】ＣＨＯ細胞発現ベクターpEF321-3.1.1の構築図
である。

【図３】Ｎｉ−ＮＴＡアガロースカラムにより精製し
た、組換えヒトＰＬＴＰの分子量を示す電気泳動像であ
る。

【図４】各精製モノクローナル抗体＃１１３，＃１１４
及び＃１１０Ｇの、精製ヒトＰＬＴＰに対する反応性を
示す電気泳動像である。

【図５】各精製モノクローナル抗体＃１１３，＃１１４
及び＃１１０Ｇの、ヒト血漿中のＰＬＴＰに対する反応
性を示す電気泳動像である。

【図６】各精製モノクローナル抗体＃１１３，＃１１４
及び＃１１０Ｇの、ヒトＨＤＬ画分中のＰＬＴＰに対す
る反応性を示す電気泳動像である。

【図７】各精製モノクローナル抗体＃１１３，＃１１４
及び＃１１０Ｇの、マウスＨＤＬ画分中のＰＬＴＰに対
する反応性を示す電気泳動像である。

【図８】各精製モノクローナル抗体＃１１３，＃１１４
及び＃１１０Ｇの、固定化組換えヒトＰＬＴＰに対する
反応性を示す図面である。

【図９】各精製ＮＨ₂ 末端およびＣＯＯＨ末端を有する
部分組換えＰＬＴＰの分子量を示す電気泳動像である。

【図１０】各精製モノクローナル抗体＃１１３，＃１１
４及び＃１１０Ｇの、エピトープ解析の結果を示す電気
泳動像である。

【図１１】ビオチン標識モノクローナル抗体＃１１３
の、固定化組換えヒトＰＬＴＰに対する反応性を示す図
面である。

【図１２】ビオチン標識モノクローナル抗体＃１１４及
び＃１１０Ｇの、固定化組換えヒトＰＬＴＰに対する反
応性を示す図面である。

【図１３】標識モノクローナル抗体＃１１３と固定化モ
ノクローナル抗体＃１１０Ｇとの組み合わせによる、サ
ンドイッチＥＬＩＳＡ系における反応性を示す図面であ
る。

【図１４】標識モノクローナル抗体＃１１３と固定化モ
ノクローナル抗体＃１１４との組み合わせによる、サン
ドイッチＥＬＩＳＡ系における反応性を示す図面であ
る。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ｃ (72)発明者 出口 武夫 埼玉県川越市的場1361番地１ 株式会社ビ ー・エム・エル総合研究所内

Claims (18)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】ヒトリン脂質転送タンパク質に対するモノ
   クローナル抗体。
2. 【請求項２】モノクローナル抗体が、以下の性質を有す
   るモノクローナル抗体である、請求項１記載のモノクロ
   ーナル抗体： ヒトＰＬＴＰに対して抗原抗体反応が認められる； 少なくともマウスＰＬＴＰに対しては、抗原抗体反応
   が認められない。
3. 【請求項３】ヒトＰＬＴＰの成熟アミノ酸配列の１６７
   −４７６の領域を認識する、請求項１又は２記載のモノ
   クローナル抗体。
4. 【請求項４】ヒトＰＬＴＰの成熟アミノ酸配列の１−１
   ６５の領域を認識する、請求項１又は２記載のモノクロ
   ーナル抗体。
5. 【請求項５】モノクローナル抗体が、mouse hybridoma
   PLTP113 （寄託番号：ＦＥＲＭ Ｐ−１６６０５）、mo
   use hybridoma PLTP114 （寄託番号：ＦＥＲＭＰ−１６
   ６０６）及びmouse hybridoma PLTP110G（寄託番号：Ｆ
   ＥＲＭ Ｐ−１６６０７）からなる群から選ばれるいず
   れかのハイブリドーマから産生されるモノクローナル抗
   体である、請求項１又は２記載のモノクローナル抗体。
6. 【請求項６】モノクローナル抗体が、その標識物質単独
   で又はその標識物質と他の物質とを反応させることによ
   り、検出可能なシグナルをもたらす標識物質で標識され
   ている、請求項１乃至５のいずれかの請求項記載のモノ
   クローナル抗体。
7. 【請求項７】標識物質が、酵素、蛍光物質、化学発光物
   質、ビオチン、アビジン及び放射性同位体からなる群の
   標識物質から選ばれるいずれかの標識物質である、請求
   項６記載のモノクローナル抗体。
8. 【請求項８】請求項１乃至７のいずれかの請求項記載の
   モノクローナル抗体が、不溶性担体に固定化されてい
   る、固定化モノクローナル抗体。
9. 【請求項９】不溶性担体が、プレート、試験管、チュー
   ブ、ビーズ、ボール、フィルター、メンブレン及びアフ
   ィニティークロマトグラフィーにおいて用いられる不溶
   性担体からなる群から選ばれる、いずれかの不溶性担体
   である、請求項８記載の固定化モノクローナル抗体。
10. 【請求項１０】不溶性担体が、フィルター、メンブレン
    及びアフィニティークロマトグラフィーにおいて用いら
    れる不溶性担体からなる群から選ばれるいずれかの不溶
    性担体である、請求項８記載の固定化モノクローナル抗
    体。
11. 【請求項１１】ヒトリン脂質転送タンパク質で動物を免
    疫した、その免疫動物に由来するハイブリドーマ。
12. 【請求項１２】ヒトリン脂質転送タンパク質が、組換え
    ヒトリン脂質転送タンパク質である、請求項１１記載の
    ハイブリドーマ。
13. 【請求項１３】ハイブリドーマが、mouse hybridoma PL
    TP113 （寄託番号：ＦＥＲＭ Ｐ−１６６０５）、mous
    e hybridoma PLTP114 （寄託番号：ＦＥＲＭＰ−１６６
    ０６）及びmouse hybridoma PLTP110G（寄託番号：ＦＥ
    ＲＭ Ｐ−１６６０７）からなる群から選ばれるいずれ
    かのハイブリドーマである、請求項１１又は１２記載の
    ハイブリドーマ。
14. 【請求項１４】請求項１乃至１０のいずれかの請求項記
    載のモノクローナル抗体の１種又は２種以上と、検体中
    のヒトリン脂質転送タンパク質との抗原抗体反応を利用
    して、検体中のヒトリン脂質転送タンパク質を測定す
    る、ヒトリン脂質転送タンパク質の測定方法。
15. 【請求項１５】請求項１４記載のヒトリン脂質転送タン
    パク質の測定手法が、エンザイムイムノアッセイ法であ
    る、ヒトリン脂質転送タンパク質の測定方法。
16. 【請求項１６】請求項１乃至１０のいずれかの請求項記
    載のモノクローナル抗体を、１種又は２種以上含む、ヒ
    トリン脂質転送タンパク質測定キット。
17. 【請求項１７】請求項８乃至１０のいずれかの請求項記
    載の固定化モノクローナル抗体を含む、請求項１６記載
    のヒトリン脂質転送タンパク質測定キット。
18. 【請求項１８】そのキットにおいてヒトリン脂質転送タ
    ンパク質を測定する測定原理がエンザイムイムノアッセ
    イ法である、請求項１７記載のヒトリン脂質転送タンパ
    ク質測定キット。