JPH0346116B2 - - Google Patents
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- JPH0346116B2 JPH0346116B2 JP61110233A JP11023386A JPH0346116B2 JP H0346116 B2 JPH0346116 B2 JP H0346116B2 JP 61110233 A JP61110233 A JP 61110233A JP 11023386 A JP11023386 A JP 11023386A JP H0346116 B2 JPH0346116 B2 JP H0346116B2
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Description
産業上の利用分野
本発明は、抗ヒト膵型α−アミラーゼ モノク
ローナル抗体(以下、抗P−Amyモノクローナ
ル抗体という)に関する。 本発明の抗P−Amyモノクローナル抗体はヒ
ト膵型α−アミラーゼ(以下、P−Amyという)
とヒト唾液腺型α−アミラーゼ(以下、S−
Amyという)との分別定量に有用である。血清
の如きヒト体液中のP−AmyとS−Amyを分別
定量すれば、種々の疾患、特に膵疾患の診断がで
きる。 従来技術および本発明が解決せんとする問題点 血清の如きヒト体液中のα−アミラーゼの増減
を知ることは種々の疾患、特に膵疾患の診断に有
用であるのでα−アミラーゼの測定は高頻度に実
施される臨床検査項目の一つとなつている。ヒト
α−アミラーゼには2種のアイソザイム、すなわ
ちP−AmyとS−Amyが知られており、総α−
アミラーゼ活性を測定するだけでは正確な診断が
できないこともあるので上記2種のアイソザイム
の分別定量が行われている。従来の分別定量法と
しては、例えば電気泳動法や阻害法などがある。 電気泳動法は、各種の支持体上に検体をスポツ
トして泳動を行い、分離したアイソザイムを染色
し、その濃さからP−AmyとS−Amyの活性を
知る方法である。しかし、この方法は、P−
AmyとS−Amyの分離が完全でないので正確な
分別定量ができない。しかも、この方法は全操作
に長時間を要するので多数の検体を処理するには
全く不都合である。 一方、阻害法は、小麦由来のS−Amy阻害剤
を用い、その阻害率の差からS−AmyとP−
Amyの活性化を計算する方法である。しかし、
この方法はS−Amyに対する特異的阻害度が低
いために厳密な定量法であるとはいえない。更に
この方法では阻害剤の阻害度にロツト間の差があ
るので標準曲線を作成しなければならず、その作
成に手間がかかる。 このように従来法は迅速性、定量性等の要請を
満足するものではない。 ところで、P−AmyとS−Amyとは極めて近
似したアミノ酸配列を有することが知られてお
り、その相同性(homology)は94%に達するこ
とが報告されている[ジーン(Gene)28 263−
270(1984)]。すなわち両者のアミノ酸配列の違い
は6%にすぎない。従つて、このようなP−
AmyまたはS−Amyに対するモノクローナル抗
体は、これら個々の抗原のわずかな違いを区別し
て認識し得るものでなければならない。またS−
Amyと特異的に結合する抗S−Amyモノクロー
ナル抗体が存在する場合、抗P−Amyモノクロ
ーナル抗体が認識すべきエピトープ(抗原決定
基)は更に狭い範囲から選択されなければならな
いことになる。このようにP−Amyと特異的に
結合する抗P−Amyモノクローナル抗体を得る
ことは極めて困難である。 さらに、S−Amyは市販されているがP−
Amyは市販されていないためP−Amyの入手は
S−Amyの場合よりも容易でなく、しかも本発
明者らの研究によればフロインド完全アジユバン
トと共にヒト膵液そのものを動物に投与しても十
分免疫されないことが見い出された。以上のこと
は抗P−Amyモノクローナル抗体の製造をより
一層困難なものにしている。 問題を解決するための手段 本発明は下記の性質を有する抗P−Amyモノ
クローナル抗体に関する: P−Amyを認識する、 実質的にS−Amyを認識しない、 抗原たるP−Amyとの免疫反応後において
も該酵素が失活しない。 本発明のモノクローナル抗体は、細胞融合技法
により製造できる。更に詳細には、本発明のモノ
クローナル抗体は次の(1)〜(4)の工程、すなわち、 (1) 抗原ならびにB細胞調製工程、 (2) 融合・スクリーニング・クローニング工程、 (3) ハイブリドーマ培養工程、および (4) 必要に応じて行われる精製工程、 を実施することにより得られる。以下、各工程に
ついて説明する。 (1) 抗原ならびにB細胞調製工程 B細胞は抗原たるP−Amyで十分免疫した
動物の脾臓より採取できる。 抗原たるP−Amyは高純度のものを大量に
用いるのが最も好ましい。しかし、P−Amy
の純度はそれ程高いものでなくとも十分に目的
は達成できる。例えば、ヒト膵液の部分精製物
が抗原として用いられる。ヒト膵液からのP−
Amyの部分精製は、例えば、硫安分画法によ
り行える。 免疫は、抗原たるP−Amyをマウスやラツ
トの如き哺乳動物に投与することにより行え
る。免疫条件、例えば抗原たるP−Amyの使
用量、投与部位、アジユバントの種類やその使
用量等の条件は、従来の抗血清を得る場合の条
件が採用される。通常、免疫は、フロインド完
全アジユバントとP−Amyを含む乳濁液をマ
ウスの如き哺乳動物に非経口投与し、同様にし
て約1週間の間隔をおいて追加免疫をすること
により行われる。この追加免疫は4〜7回行わ
れる。最終免疫後3〜5日に十分免疫した哺乳
動物の脾臓からB細胞を採取する。 (2) 融合・スクリーニング・クローニング工程融
合は、融合促進剤の存在下、上記B細胞ならび
に公知の骨髄腫細胞(以下ミエローマ細胞とい
う)を公知の融合用無血清培地に懸濁し、これ
を混合することにより行える。 一般的にミエローマ細胞は、工程(1)で用いた
被免疫動物と同種の動物由来のものであつてハ
イブリドーマ選択培地で生育できず、かつ、そ
れ自身が抗体を分泌しないものが好ましい。こ
のようなミエローマ細胞としては、例えば市販
されているマウスミエローマ細胞P3−X63−
Ag8−U1あるいはこれと同等物が挙げられる。 両細胞の混合比は、通常、ミエローマ細胞1
に対しB細胞1〜20である。細胞融合促進剤と
しては、例えばポリエチレングリコールが用い
られ、分子量1000〜7500のものが好ましい。 融合細胞、すなわちハイブリドーマの培養
は、融合促進剤を洗浄除去しミエローマ細胞用
培地に懸濁したハイブリドーマの0.1〜0.2mlず
つを96穴培養皿(以下穴ということもある)に
まき、約37℃において5%炭酸ガス−空気中で
温置することにより行える。培養中、HAT培
地の如き公知のハイブリドーマ選択培地を添加
し、その割合を徐々に高める。このような培地
交換によりハイブリドーマ以外の細胞は死滅す
る。最終的には同様にして、再びハイブリドー
マ選択培地をミエローマ細胞用培地、すなわち
ハイブリドーマ用培地と交換する。 目的とするハイブリドーマのスクリーニング
は、培養液中の抗体価および交差度を調べるこ
とにより行える。すなわち、培養液の一部にP
−AmyまたはS−Amyおよび後述の不溶化第
二抗体を加えて温置し、遠心し、得られるペレ
ツト中の酵素活性を後述の定量法で測定するこ
とによりその抗体価およびP−AmyとS−
Amyに対する交差の程度を知ことができる。 スクリーニングしたハイブリドーマについて
限界希釈法を適用することにより目的とする実
質的にP−Amyのみを認識するハイブリドー
マが創製できる。このハイブリドーマは継代培
養または凍結により半永久的に保存できる。 (3) ハイブリドーマの培養工程 前工程で得たハイブリドーマをin vitroまた
はin vivoで培養すれば目的のモノクローナル
抗体が生産できる。 in vitroの培養は、数個のハイブリドーマの
96穴培養皿中での培養から始め、徐々にスケー
ルアツプすることにより行える。またin vivo
での培養は、融合細胞の増殖を容易にさせるた
めのプリスタン(pristane)処理をしたマウス
にハイブリドーマを腹腔内に接種することによ
り実施でき、10〜20日後にはモノクローナル抗
体を含む腹水が蓄積される。 一般に、in vitroでの培養は高純度のモノク
ローナル抗体を得たいときに行われ、in vivo
での培養はモノクローナル抗体を大量に得たい
ときに行われる。通常in vivoでの培養により、
マウス1匹あたり10〜100mgの抗P−Amyモノ
クローナル抗体が得られる。免疫分析にはin
vivoでの培養で蓄積された腹水をそのまま利用
することもできるが、必要に応じ更に精製して
もよい。 (4) 精製工程 必要に応じて行われるin vitroでの培養物ま
たはin vivoの培養で蓄積された腹水からのモ
ノクローナル抗体の分離精製は、通常の物理化
学的手段、例えば塩析、遠心分離、透析、不溶
性担体と結合しているプロテインAを用いるア
フイニテイークロマトグラフイーの如き各種カ
ラムクロマトグラフイー等の手段を合理的に組
み合せることにより行える。 かくして得られる本発明の抗P−Amyモノ
クローナル抗体は、P−AmyとS−Amyとを
確実に識別できる。また、P−Amyは、本発
明のモノクローナル抗体との免疫反応後におい
ても、低分子のp−ニトロフエニルマルトヘプ
タオシド(以下PNPという)(ベーリンガーマ
ンハイムGmbH)や高分子の不溶性青色デン
プンポリマー(第一化学薬品株式会社)の如き
種々の分子量の基質を分解することができる。 本発明のモノクローナル抗体はP−AmyとS
−Amyの分別定量用試薬として有用である。 P−Amyの定量は、 検体に本発明のモノクローナル抗体を加えて
温置する工程(免疫反応工程)、 生成する抗原抗体複合物とそれ以外のものを
分離(通常遠心分離)する工程(抗原抗体複合
物分離工程)、および 分離した抗原抗体複合物(通常沈殿)中のα
−アミラーゼ活性を測定する工程(α−アミラ
ーゼ測定工程)、 を実施することにより行える。このように本方法
では直接P−Amyの活性を知ることができる。 P−AmyとS−Amyとの分別定量は、前記
の工程で分離した抗原抗体複合物およびそれ以外
のもの(通常は上清)のα−アミラーゼ活性を測
定するとか、別に求めた総α−アミラーゼ活性か
ら上記の方法により求めたP−Amyの活性を差
し引くことにより実施できる。 P−Amyの定量工程〜は、すべて約37℃
前後で行われる。工程における抗P−Amyモ
ノクローナル抗体は一般に、検体中のP−Amy
に対応する量よりも過剰に用いられる。工程
は、エンザイム イムノ アツセイ法における
B/F分離の技術を応用することにより行える。
例えば工程において抗P−Amyモノクローナ
ル抗体の代わりに不溶化抗P−Amyモノクロー
ナル抗体を用い免疫反応後に抗原抗体複合物を遠
心分離するとか、抗原抗体複合物に対する抗体を
不溶化したもの、すなわち不溶化第二抗体を工程
において更に反応せしめ生ずる複合物を遠心分
離することにより行える。ここにおける抗体の不
溶化は、常法により不溶性担体と抗P−Amyモ
ノクローナル抗体もしくは第二抗体とを結合させ
ることにより行える。不溶性担体としては公知の
ものがいずれも使えるが、米国特許第4166767号
記載の細菌細胞壁片が好ましく用いられる。工程
および総α−アミラーゼ活性の測定は公知の方
法、例えば市販されているα−アミラーゼ定量用
キツトを用いることにより実施できる。そのよう
なキツトの例としてはベーリンガーマンハイム−
山之内株式会社から発売されているオートパツク
α−アミラーゼキツトが挙げられる。このキツト
ではPNPおよびα−グルコシダーゼを含む溶液
(以下 PNP試薬という)を基質として用いてい
る。 P−AmyとS−Amyを分離する試薬は市販さ
れている総てのα−アミラーゼ定量用キツトと任
意に組み合わせることができる。P−AmyとS
−Amyとを分離するための試薬は、少くとも (1) 不溶性担体と結合した抗P−Amyモノクロ
ーナル抗体、または (2) 抗P−Amyモノクローナル抗体および
不溶性担体と結合した第二抗体(不溶化第二抗
体) を含むものである。この試薬には更に緩衝剤、防
腐剤、安定化剤、賦形剤等が含まれ得る。上記(2)
の場合にはキツトの形にするのが好ましい。 具体例 次に実施例を挙げて更に詳細に説明する。 なお、以下では次の培地を用いた。 細胞融合用無血清培地、すなわちRPM1
1640培地(ギブコ ラボラトリー) ミエローマ細胞(またはハイブリドーマ)用
培地上記培地に以下のものを添加した培地。 10%ウシ胎児血清(FCS)、 4mMグルタミン、 50μMβ−メルカプトエタノール、 100U/mlペニシリンG、および100μg/ml
ストレプトマイシン。 HAT培地(ハイブリドーマ選択培地)上記
培地に以下のものを添加した培地。 0.1mM ヒポキサンチン、 0.4μM アミノプテリン、および16μMチミ
ジン。 また、以下ではリン酸緩衝液はPBSと、牛血
清アルブミンはBSAと略称する。 実施例 1 抗P−Amyモノクローナル抗体の製造 (1) ハイブリドーマの創製 抗原ならびに細胞の調製 4℃においてヒト膵液2mlに硫安554mgを加
え(飽和度45%)、0℃で3時間放置後、生ず
るペレツトを遠心分離(5000×g、30分)し、
このペレツトを生理食塩水0.5mlに溶解する。 この溶液に等量のフロインド完全アジユバン
ト(半井化学薬品株式会社)を加えて乳化した
もの0.5mlをBALB/cマウス(静岡実験動物
協同組合)の腹腔内に投与し、1週間後に同様
にして免疫する。更に1週間後に追加免疫(静
注)し、以後同様に6回の追加免疫を行い3日
後に脾臓を取り出してB細胞を採取する。 スクリーニング・クローニング 対数増殖期にあるマウスミエローマ細胞P3
−X63−Ag8−U1(ATGG カタログ番号GRL
1597)の1×107個と脾臓細胞の1×108個を混
合し、培地で遠心(400×g、10分)洗浄後、
37℃に保温した50%ポリエチレングリコール
1500(和光純薬工業株式会社)1mlを1分間か
けて加え、ゆつくり撹拌する。1分後、37℃に
保温した1mlの培地を同様にして加える。更
に20mlの培地を30秒毎に1mlずつ加えた後、
遠心(400×g、10分)し、上清を除去する。
得られるペレツトに12mlの培地を徐々に加え
る。この0.1mlずつを96穴培養皿にまき、37℃
において5%炭酸ガス−空気中で培養する。20
時間後、培地0.1mlずつを穴に加える。2日、
3日、5日、8日、11日、13日および15日後の
計7回にわたつて0.1mlの培地を捨て新しい
培地0.1mlを加える。この培地交換によりハイ
ブリドーマ以外の細胞は死滅する。16日以降は
再び培地に交換し、培養する。培養開始後7
日目にハイブリドーマの生育が始り、15日目に
は80%の穴に生育が認められる。 抗体価および交差度の検定 培養15日後の培養液の抗体価および交差度を
次のようにして調べた。 検定用試薬 (1) P−Amy溶液 膵液250μ(92000IU/)を下記緩衝液
Aで希釈し、全量を50mlとなしたもの。 (2) S−Amy溶液 1mgのS−Amy(シグマケミカル Co.)
を下記緩衝液Aで溶解・希釈し全量を50mlと
なしたもの。 (3) 緩衝液A(PH7.0) 0.1%BSA−0.9%NaCl−0.04M−PBS(PH
7.0)からなる緩衝液。 (4) 不溶化第二抗体の懸濁液 米国特許第4166767号明細書の実施例1の
方法により調製したもの。すなわち、ラクト
バチルスプランタルムATCC 8014の細胞壁
片125mgを水2.5mlに懸濁し、これにマイルス
−イエダ Ltd.社製の抗マウスIgGウサギ抗
体溶液[タンパク25mg/0.05M−PBS(PH
7.0)2.5ml]、水2.5mlおよび0.1M−PBS(PH
7.0)2.5mlを加えてよく混和する。これに撹
拌下、2.5%のグルタールアルデヒド溶液2.5
mlを滴下する。1時間撹拌後、遠心(2000×
g、10分)し、沈殿を5mlの0.9%NaC1−
0.02Mトリス緩衝液(PH7.0)で3回洗浄し、
目的とする不溶化第二抗体を得る。これを
5.2mlの0.2%BSA−0.9%NaC1−0.1%NaN3
トリス緩衝液(PH7.0)に懸濁し、さらに超
音波処理をする。 検定操作 抗体価は次のようにして検定した。 すなわち、ハイブリドーマ培養液50μ、P
−Amy溶液25μ、不溶化第二抗体懸濁液50μ
を混合し、37℃で30分間温置後、4mlの生理
食塩水を加え遠心(3000×g、5分)して上清
をすてる。ペレツトにPNP試薬1mlを加え撹
拌後37℃で温置する。30分後、2mlの反応停止
液[0.1M−PBS(PH11)]を加えて遠心し、上
清の吸光度(405nm)を測定する。吸光度が
高い穴に高抗体価を有する抗P−Amyモノク
ローナル抗体が含まれていると判定した。 交差度は抗体価が高い培養液について検討し
た。すなわち、P−Amy溶液の代わりにS−
Amy溶液を用いるほかは抗体価検定の場合と
同じ操作により交差度を検定した。405nmに
おける吸光度が低い検体ほど交差度が低いと判
定した。 すなわち、全部で768個の穴(ウエル)のな
かで615個のウエルにおいてハイブリドーマの
発育がみられ、そのなかで発育良好な307個の
ウエルを選択し、これらの内からP−Amy抗
体価が高い5個のウエルを選択した。これらに
ついて、再度、限界希釈培養(全ウエル数:
480)を行つた。培養10日後には全ウエルでハ
イブリドーマの発育が認められた。1ウエルあ
たり1個のコロニーをもち、良好にハイブリド
ーマが発育したウエルを1群4個ずつ合計20個
を選択し、その内からP−Amy抗体価が高い
5個のウエルを選択し、それらのS−Amy抗
体価を測定して次の結果を得た。
ローナル抗体(以下、抗P−Amyモノクローナ
ル抗体という)に関する。 本発明の抗P−Amyモノクローナル抗体はヒ
ト膵型α−アミラーゼ(以下、P−Amyという)
とヒト唾液腺型α−アミラーゼ(以下、S−
Amyという)との分別定量に有用である。血清
の如きヒト体液中のP−AmyとS−Amyを分別
定量すれば、種々の疾患、特に膵疾患の診断がで
きる。 従来技術および本発明が解決せんとする問題点 血清の如きヒト体液中のα−アミラーゼの増減
を知ることは種々の疾患、特に膵疾患の診断に有
用であるのでα−アミラーゼの測定は高頻度に実
施される臨床検査項目の一つとなつている。ヒト
α−アミラーゼには2種のアイソザイム、すなわ
ちP−AmyとS−Amyが知られており、総α−
アミラーゼ活性を測定するだけでは正確な診断が
できないこともあるので上記2種のアイソザイム
の分別定量が行われている。従来の分別定量法と
しては、例えば電気泳動法や阻害法などがある。 電気泳動法は、各種の支持体上に検体をスポツ
トして泳動を行い、分離したアイソザイムを染色
し、その濃さからP−AmyとS−Amyの活性を
知る方法である。しかし、この方法は、P−
AmyとS−Amyの分離が完全でないので正確な
分別定量ができない。しかも、この方法は全操作
に長時間を要するので多数の検体を処理するには
全く不都合である。 一方、阻害法は、小麦由来のS−Amy阻害剤
を用い、その阻害率の差からS−AmyとP−
Amyの活性化を計算する方法である。しかし、
この方法はS−Amyに対する特異的阻害度が低
いために厳密な定量法であるとはいえない。更に
この方法では阻害剤の阻害度にロツト間の差があ
るので標準曲線を作成しなければならず、その作
成に手間がかかる。 このように従来法は迅速性、定量性等の要請を
満足するものではない。 ところで、P−AmyとS−Amyとは極めて近
似したアミノ酸配列を有することが知られてお
り、その相同性(homology)は94%に達するこ
とが報告されている[ジーン(Gene)28 263−
270(1984)]。すなわち両者のアミノ酸配列の違い
は6%にすぎない。従つて、このようなP−
AmyまたはS−Amyに対するモノクローナル抗
体は、これら個々の抗原のわずかな違いを区別し
て認識し得るものでなければならない。またS−
Amyと特異的に結合する抗S−Amyモノクロー
ナル抗体が存在する場合、抗P−Amyモノクロ
ーナル抗体が認識すべきエピトープ(抗原決定
基)は更に狭い範囲から選択されなければならな
いことになる。このようにP−Amyと特異的に
結合する抗P−Amyモノクローナル抗体を得る
ことは極めて困難である。 さらに、S−Amyは市販されているがP−
Amyは市販されていないためP−Amyの入手は
S−Amyの場合よりも容易でなく、しかも本発
明者らの研究によればフロインド完全アジユバン
トと共にヒト膵液そのものを動物に投与しても十
分免疫されないことが見い出された。以上のこと
は抗P−Amyモノクローナル抗体の製造をより
一層困難なものにしている。 問題を解決するための手段 本発明は下記の性質を有する抗P−Amyモノ
クローナル抗体に関する: P−Amyを認識する、 実質的にS−Amyを認識しない、 抗原たるP−Amyとの免疫反応後において
も該酵素が失活しない。 本発明のモノクローナル抗体は、細胞融合技法
により製造できる。更に詳細には、本発明のモノ
クローナル抗体は次の(1)〜(4)の工程、すなわち、 (1) 抗原ならびにB細胞調製工程、 (2) 融合・スクリーニング・クローニング工程、 (3) ハイブリドーマ培養工程、および (4) 必要に応じて行われる精製工程、 を実施することにより得られる。以下、各工程に
ついて説明する。 (1) 抗原ならびにB細胞調製工程 B細胞は抗原たるP−Amyで十分免疫した
動物の脾臓より採取できる。 抗原たるP−Amyは高純度のものを大量に
用いるのが最も好ましい。しかし、P−Amy
の純度はそれ程高いものでなくとも十分に目的
は達成できる。例えば、ヒト膵液の部分精製物
が抗原として用いられる。ヒト膵液からのP−
Amyの部分精製は、例えば、硫安分画法によ
り行える。 免疫は、抗原たるP−Amyをマウスやラツ
トの如き哺乳動物に投与することにより行え
る。免疫条件、例えば抗原たるP−Amyの使
用量、投与部位、アジユバントの種類やその使
用量等の条件は、従来の抗血清を得る場合の条
件が採用される。通常、免疫は、フロインド完
全アジユバントとP−Amyを含む乳濁液をマ
ウスの如き哺乳動物に非経口投与し、同様にし
て約1週間の間隔をおいて追加免疫をすること
により行われる。この追加免疫は4〜7回行わ
れる。最終免疫後3〜5日に十分免疫した哺乳
動物の脾臓からB細胞を採取する。 (2) 融合・スクリーニング・クローニング工程融
合は、融合促進剤の存在下、上記B細胞ならび
に公知の骨髄腫細胞(以下ミエローマ細胞とい
う)を公知の融合用無血清培地に懸濁し、これ
を混合することにより行える。 一般的にミエローマ細胞は、工程(1)で用いた
被免疫動物と同種の動物由来のものであつてハ
イブリドーマ選択培地で生育できず、かつ、そ
れ自身が抗体を分泌しないものが好ましい。こ
のようなミエローマ細胞としては、例えば市販
されているマウスミエローマ細胞P3−X63−
Ag8−U1あるいはこれと同等物が挙げられる。 両細胞の混合比は、通常、ミエローマ細胞1
に対しB細胞1〜20である。細胞融合促進剤と
しては、例えばポリエチレングリコールが用い
られ、分子量1000〜7500のものが好ましい。 融合細胞、すなわちハイブリドーマの培養
は、融合促進剤を洗浄除去しミエローマ細胞用
培地に懸濁したハイブリドーマの0.1〜0.2mlず
つを96穴培養皿(以下穴ということもある)に
まき、約37℃において5%炭酸ガス−空気中で
温置することにより行える。培養中、HAT培
地の如き公知のハイブリドーマ選択培地を添加
し、その割合を徐々に高める。このような培地
交換によりハイブリドーマ以外の細胞は死滅す
る。最終的には同様にして、再びハイブリドー
マ選択培地をミエローマ細胞用培地、すなわち
ハイブリドーマ用培地と交換する。 目的とするハイブリドーマのスクリーニング
は、培養液中の抗体価および交差度を調べるこ
とにより行える。すなわち、培養液の一部にP
−AmyまたはS−Amyおよび後述の不溶化第
二抗体を加えて温置し、遠心し、得られるペレ
ツト中の酵素活性を後述の定量法で測定するこ
とによりその抗体価およびP−AmyとS−
Amyに対する交差の程度を知ことができる。 スクリーニングしたハイブリドーマについて
限界希釈法を適用することにより目的とする実
質的にP−Amyのみを認識するハイブリドー
マが創製できる。このハイブリドーマは継代培
養または凍結により半永久的に保存できる。 (3) ハイブリドーマの培養工程 前工程で得たハイブリドーマをin vitroまた
はin vivoで培養すれば目的のモノクローナル
抗体が生産できる。 in vitroの培養は、数個のハイブリドーマの
96穴培養皿中での培養から始め、徐々にスケー
ルアツプすることにより行える。またin vivo
での培養は、融合細胞の増殖を容易にさせるた
めのプリスタン(pristane)処理をしたマウス
にハイブリドーマを腹腔内に接種することによ
り実施でき、10〜20日後にはモノクローナル抗
体を含む腹水が蓄積される。 一般に、in vitroでの培養は高純度のモノク
ローナル抗体を得たいときに行われ、in vivo
での培養はモノクローナル抗体を大量に得たい
ときに行われる。通常in vivoでの培養により、
マウス1匹あたり10〜100mgの抗P−Amyモノ
クローナル抗体が得られる。免疫分析にはin
vivoでの培養で蓄積された腹水をそのまま利用
することもできるが、必要に応じ更に精製して
もよい。 (4) 精製工程 必要に応じて行われるin vitroでの培養物ま
たはin vivoの培養で蓄積された腹水からのモ
ノクローナル抗体の分離精製は、通常の物理化
学的手段、例えば塩析、遠心分離、透析、不溶
性担体と結合しているプロテインAを用いるア
フイニテイークロマトグラフイーの如き各種カ
ラムクロマトグラフイー等の手段を合理的に組
み合せることにより行える。 かくして得られる本発明の抗P−Amyモノ
クローナル抗体は、P−AmyとS−Amyとを
確実に識別できる。また、P−Amyは、本発
明のモノクローナル抗体との免疫反応後におい
ても、低分子のp−ニトロフエニルマルトヘプ
タオシド(以下PNPという)(ベーリンガーマ
ンハイムGmbH)や高分子の不溶性青色デン
プンポリマー(第一化学薬品株式会社)の如き
種々の分子量の基質を分解することができる。 本発明のモノクローナル抗体はP−AmyとS
−Amyの分別定量用試薬として有用である。 P−Amyの定量は、 検体に本発明のモノクローナル抗体を加えて
温置する工程(免疫反応工程)、 生成する抗原抗体複合物とそれ以外のものを
分離(通常遠心分離)する工程(抗原抗体複合
物分離工程)、および 分離した抗原抗体複合物(通常沈殿)中のα
−アミラーゼ活性を測定する工程(α−アミラ
ーゼ測定工程)、 を実施することにより行える。このように本方法
では直接P−Amyの活性を知ることができる。 P−AmyとS−Amyとの分別定量は、前記
の工程で分離した抗原抗体複合物およびそれ以外
のもの(通常は上清)のα−アミラーゼ活性を測
定するとか、別に求めた総α−アミラーゼ活性か
ら上記の方法により求めたP−Amyの活性を差
し引くことにより実施できる。 P−Amyの定量工程〜は、すべて約37℃
前後で行われる。工程における抗P−Amyモ
ノクローナル抗体は一般に、検体中のP−Amy
に対応する量よりも過剰に用いられる。工程
は、エンザイム イムノ アツセイ法における
B/F分離の技術を応用することにより行える。
例えば工程において抗P−Amyモノクローナ
ル抗体の代わりに不溶化抗P−Amyモノクロー
ナル抗体を用い免疫反応後に抗原抗体複合物を遠
心分離するとか、抗原抗体複合物に対する抗体を
不溶化したもの、すなわち不溶化第二抗体を工程
において更に反応せしめ生ずる複合物を遠心分
離することにより行える。ここにおける抗体の不
溶化は、常法により不溶性担体と抗P−Amyモ
ノクローナル抗体もしくは第二抗体とを結合させ
ることにより行える。不溶性担体としては公知の
ものがいずれも使えるが、米国特許第4166767号
記載の細菌細胞壁片が好ましく用いられる。工程
および総α−アミラーゼ活性の測定は公知の方
法、例えば市販されているα−アミラーゼ定量用
キツトを用いることにより実施できる。そのよう
なキツトの例としてはベーリンガーマンハイム−
山之内株式会社から発売されているオートパツク
α−アミラーゼキツトが挙げられる。このキツト
ではPNPおよびα−グルコシダーゼを含む溶液
(以下 PNP試薬という)を基質として用いてい
る。 P−AmyとS−Amyを分離する試薬は市販さ
れている総てのα−アミラーゼ定量用キツトと任
意に組み合わせることができる。P−AmyとS
−Amyとを分離するための試薬は、少くとも (1) 不溶性担体と結合した抗P−Amyモノクロ
ーナル抗体、または (2) 抗P−Amyモノクローナル抗体および
不溶性担体と結合した第二抗体(不溶化第二抗
体) を含むものである。この試薬には更に緩衝剤、防
腐剤、安定化剤、賦形剤等が含まれ得る。上記(2)
の場合にはキツトの形にするのが好ましい。 具体例 次に実施例を挙げて更に詳細に説明する。 なお、以下では次の培地を用いた。 細胞融合用無血清培地、すなわちRPM1
1640培地(ギブコ ラボラトリー) ミエローマ細胞(またはハイブリドーマ)用
培地上記培地に以下のものを添加した培地。 10%ウシ胎児血清(FCS)、 4mMグルタミン、 50μMβ−メルカプトエタノール、 100U/mlペニシリンG、および100μg/ml
ストレプトマイシン。 HAT培地(ハイブリドーマ選択培地)上記
培地に以下のものを添加した培地。 0.1mM ヒポキサンチン、 0.4μM アミノプテリン、および16μMチミ
ジン。 また、以下ではリン酸緩衝液はPBSと、牛血
清アルブミンはBSAと略称する。 実施例 1 抗P−Amyモノクローナル抗体の製造 (1) ハイブリドーマの創製 抗原ならびに細胞の調製 4℃においてヒト膵液2mlに硫安554mgを加
え(飽和度45%)、0℃で3時間放置後、生ず
るペレツトを遠心分離(5000×g、30分)し、
このペレツトを生理食塩水0.5mlに溶解する。 この溶液に等量のフロインド完全アジユバン
ト(半井化学薬品株式会社)を加えて乳化した
もの0.5mlをBALB/cマウス(静岡実験動物
協同組合)の腹腔内に投与し、1週間後に同様
にして免疫する。更に1週間後に追加免疫(静
注)し、以後同様に6回の追加免疫を行い3日
後に脾臓を取り出してB細胞を採取する。 スクリーニング・クローニング 対数増殖期にあるマウスミエローマ細胞P3
−X63−Ag8−U1(ATGG カタログ番号GRL
1597)の1×107個と脾臓細胞の1×108個を混
合し、培地で遠心(400×g、10分)洗浄後、
37℃に保温した50%ポリエチレングリコール
1500(和光純薬工業株式会社)1mlを1分間か
けて加え、ゆつくり撹拌する。1分後、37℃に
保温した1mlの培地を同様にして加える。更
に20mlの培地を30秒毎に1mlずつ加えた後、
遠心(400×g、10分)し、上清を除去する。
得られるペレツトに12mlの培地を徐々に加え
る。この0.1mlずつを96穴培養皿にまき、37℃
において5%炭酸ガス−空気中で培養する。20
時間後、培地0.1mlずつを穴に加える。2日、
3日、5日、8日、11日、13日および15日後の
計7回にわたつて0.1mlの培地を捨て新しい
培地0.1mlを加える。この培地交換によりハイ
ブリドーマ以外の細胞は死滅する。16日以降は
再び培地に交換し、培養する。培養開始後7
日目にハイブリドーマの生育が始り、15日目に
は80%の穴に生育が認められる。 抗体価および交差度の検定 培養15日後の培養液の抗体価および交差度を
次のようにして調べた。 検定用試薬 (1) P−Amy溶液 膵液250μ(92000IU/)を下記緩衝液
Aで希釈し、全量を50mlとなしたもの。 (2) S−Amy溶液 1mgのS−Amy(シグマケミカル Co.)
を下記緩衝液Aで溶解・希釈し全量を50mlと
なしたもの。 (3) 緩衝液A(PH7.0) 0.1%BSA−0.9%NaCl−0.04M−PBS(PH
7.0)からなる緩衝液。 (4) 不溶化第二抗体の懸濁液 米国特許第4166767号明細書の実施例1の
方法により調製したもの。すなわち、ラクト
バチルスプランタルムATCC 8014の細胞壁
片125mgを水2.5mlに懸濁し、これにマイルス
−イエダ Ltd.社製の抗マウスIgGウサギ抗
体溶液[タンパク25mg/0.05M−PBS(PH
7.0)2.5ml]、水2.5mlおよび0.1M−PBS(PH
7.0)2.5mlを加えてよく混和する。これに撹
拌下、2.5%のグルタールアルデヒド溶液2.5
mlを滴下する。1時間撹拌後、遠心(2000×
g、10分)し、沈殿を5mlの0.9%NaC1−
0.02Mトリス緩衝液(PH7.0)で3回洗浄し、
目的とする不溶化第二抗体を得る。これを
5.2mlの0.2%BSA−0.9%NaC1−0.1%NaN3
トリス緩衝液(PH7.0)に懸濁し、さらに超
音波処理をする。 検定操作 抗体価は次のようにして検定した。 すなわち、ハイブリドーマ培養液50μ、P
−Amy溶液25μ、不溶化第二抗体懸濁液50μ
を混合し、37℃で30分間温置後、4mlの生理
食塩水を加え遠心(3000×g、5分)して上清
をすてる。ペレツトにPNP試薬1mlを加え撹
拌後37℃で温置する。30分後、2mlの反応停止
液[0.1M−PBS(PH11)]を加えて遠心し、上
清の吸光度(405nm)を測定する。吸光度が
高い穴に高抗体価を有する抗P−Amyモノク
ローナル抗体が含まれていると判定した。 交差度は抗体価が高い培養液について検討し
た。すなわち、P−Amy溶液の代わりにS−
Amy溶液を用いるほかは抗体価検定の場合と
同じ操作により交差度を検定した。405nmに
おける吸光度が低い検体ほど交差度が低いと判
定した。 すなわち、全部で768個の穴(ウエル)のな
かで615個のウエルにおいてハイブリドーマの
発育がみられ、そのなかで発育良好な307個の
ウエルを選択し、これらの内からP−Amy抗
体価が高い5個のウエルを選択した。これらに
ついて、再度、限界希釈培養(全ウエル数:
480)を行つた。培養10日後には全ウエルでハ
イブリドーマの発育が認められた。1ウエルあ
たり1個のコロニーをもち、良好にハイブリド
ーマが発育したウエルを1群4個ずつ合計20個
を選択し、その内からP−Amy抗体価が高い
5個のウエルを選択し、それらのS−Amy抗
体価を測定して次の結果を得た。
【表】
上記の結果から、P−Amy抗体価が高く、
かつ、S−Amy抗体価が低い(すなわち交差
性が低い)ものとして、ウエル番号96のハイブ
リドーマを最終的に選択した。 このハイブリドーマは凍結または継代培養に
より保存できる。 (2) モノクローナル抗体の製造 予めプリスタン(pristane)0.5mlを腹腔内
投与したBALB/cマウスの腹腔内に、前項
で得たハイブリドーマ1×107個を接種する。
15日目に目的とするモノクローナル抗体を含む
腹水3ml/マウスを得る。次に4℃において、
腹水に等量の飽和硫安溶液を加え30分間撹拌
後、遠心(5000×g、30分)し上清をすてる。
ペレツトを0.05M−PBS(PH7.4)−0.14M塩化ナ
トリウム溶液に溶解後、4℃で一夜透析し、30
分遠心(5000×g)し、上清を凍結乾燥して目
的の粗モノクローナル抗体を得る。 免疫拡散法による検定によれば、このモノク
ローナル抗体はIgG1サブクラスに属し、その
L鎖はカツパーに属するものであつた。 実施例 2 分別定量 P−AmyとS−Amyを等量含む溶液を倍数希
釈したものを検体とし、以下の方法により分別定
量を行う。 総α−アミラーゼ活性の定量 検体25μにPNP試薬1mlを加え37℃で温置し
30分後、2mlの0.1M−PBS(PH11)(反応停止液)
を加え405nmにおける吸光度を測定する。 P−Amyの定量 検体25μ、抗P−Amyモノクローナル抗体
[実施例1の(2)項で得た腹水を緩衝液Aで1000倍
希釈したもの]50μおよび不溶化第二抗体懸濁
液50μを混合し、37℃で温置し、30分後に生理
食塩水4mlを加えて遠心(3000×g、5分)す
る。得られるペレツトにPNP試薬1mlを加え37
℃で温置し、30分後、2mlの反応停止液を加え不
溶化第二抗体を遠心分離(3000×g、5分)し、
その上清について405nmにおける吸光度を光路
1cmのキユベツト中で測定する。 S−Amyの算出 総α−アミラーゼ活性からP−Amy活性を差
し引いたものをS−Amy活性とした。 定量結果 第1表に定量結果を示す。
かつ、S−Amy抗体価が低い(すなわち交差
性が低い)ものとして、ウエル番号96のハイブ
リドーマを最終的に選択した。 このハイブリドーマは凍結または継代培養に
より保存できる。 (2) モノクローナル抗体の製造 予めプリスタン(pristane)0.5mlを腹腔内
投与したBALB/cマウスの腹腔内に、前項
で得たハイブリドーマ1×107個を接種する。
15日目に目的とするモノクローナル抗体を含む
腹水3ml/マウスを得る。次に4℃において、
腹水に等量の飽和硫安溶液を加え30分間撹拌
後、遠心(5000×g、30分)し上清をすてる。
ペレツトを0.05M−PBS(PH7.4)−0.14M塩化ナ
トリウム溶液に溶解後、4℃で一夜透析し、30
分遠心(5000×g)し、上清を凍結乾燥して目
的の粗モノクローナル抗体を得る。 免疫拡散法による検定によれば、このモノク
ローナル抗体はIgG1サブクラスに属し、その
L鎖はカツパーに属するものであつた。 実施例 2 分別定量 P−AmyとS−Amyを等量含む溶液を倍数希
釈したものを検体とし、以下の方法により分別定
量を行う。 総α−アミラーゼ活性の定量 検体25μにPNP試薬1mlを加え37℃で温置し
30分後、2mlの0.1M−PBS(PH11)(反応停止液)
を加え405nmにおける吸光度を測定する。 P−Amyの定量 検体25μ、抗P−Amyモノクローナル抗体
[実施例1の(2)項で得た腹水を緩衝液Aで1000倍
希釈したもの]50μおよび不溶化第二抗体懸濁
液50μを混合し、37℃で温置し、30分後に生理
食塩水4mlを加えて遠心(3000×g、5分)す
る。得られるペレツトにPNP試薬1mlを加え37
℃で温置し、30分後、2mlの反応停止液を加え不
溶化第二抗体を遠心分離(3000×g、5分)し、
その上清について405nmにおける吸光度を光路
1cmのキユベツト中で測定する。 S−Amyの算出 総α−アミラーゼ活性からP−Amy活性を差
し引いたものをS−Amy活性とした。 定量結果 第1表に定量結果を示す。
【表】
第1表に示すようにP−AmyとS−Amyとの
比、すなわちb/aは常にほぼ1.00であり、本法
は両者の分別定量法として極めて優れている。 実施例 3 分別定量 P−Amy単独、S−Amy単独および両者の混
合物(混合比は後記第2表に示す)を検体とし以
下の方法により分別定量を行い第2表に示す結果
を得た。 総α−アミラーゼ活性の定量 40μの検体に緩衝液Aの150μを加え37℃で
10分間温置する。その25μをとり、これにPNP
試薬1mlを加え37℃で温置し、30分後、2mlの反
応停止液を加え405nmにおける吸光度を光路1
cmのキユベツト中で測定する。 S−Amyの定量 40μの検体に、抗体価検定の項で述べたのと
同じ方法で調製した不溶化抗P−Amyモノクロ
ーナル抗体懸濁液150μを加え37℃で10分間温
置後遠心(3000×g、5分)する。上清の25μ
をとり、これにPNP試薬1mlを加え37℃で温置
し30分後、2mlの反応停止液を加え405nmにお
ける吸光度を光路1cmのキユベツト中で測定す
る。 定量結果 第2表に定量結果を示す。
比、すなわちb/aは常にほぼ1.00であり、本法
は両者の分別定量法として極めて優れている。 実施例 3 分別定量 P−Amy単独、S−Amy単独および両者の混
合物(混合比は後記第2表に示す)を検体とし以
下の方法により分別定量を行い第2表に示す結果
を得た。 総α−アミラーゼ活性の定量 40μの検体に緩衝液Aの150μを加え37℃で
10分間温置する。その25μをとり、これにPNP
試薬1mlを加え37℃で温置し、30分後、2mlの反
応停止液を加え405nmにおける吸光度を光路1
cmのキユベツト中で測定する。 S−Amyの定量 40μの検体に、抗体価検定の項で述べたのと
同じ方法で調製した不溶化抗P−Amyモノクロ
ーナル抗体懸濁液150μを加え37℃で10分間温
置後遠心(3000×g、5分)する。上清の25μ
をとり、これにPNP試薬1mlを加え37℃で温置
し30分後、2mlの反応停止液を加え405nmにお
ける吸光度を光路1cmのキユベツト中で測定す
る。 定量結果 第2表に定量結果を示す。
【表】
検体中のP−Amyは不溶化抗P−Amyモノク
ローナル抗体によつて系から沈殿として除かれて
いる。従つて第2表に示すようにP−Amyのみ
を含有する検体(1)、(4)および(7)の(b)値(S−
Amy活性に相当)は総てほぼゼロである。一方、
S−Amyは系から除かれないのでS−Amyのみ
を含有する検体(2)、(5)および(8)の(b)値(S−
Amy活性に相当)は、(a)値(総α−アミラーゼ
活性)とほぼ等しい。また第2表に示すように、
P−AmyとS−Amyの混合比[P/(P+S)]
とb/aの値はほぼ一致している。このように本
法の分別定量法は極めて優れている。 実施例 4 ヒト血清の分別定量 膵疾患々者および健常人の血清を検体とし、実
施例2と同様にしてP−Amyの定量を行い第3
表の結果を得た。
ローナル抗体によつて系から沈殿として除かれて
いる。従つて第2表に示すようにP−Amyのみ
を含有する検体(1)、(4)および(7)の(b)値(S−
Amy活性に相当)は総てほぼゼロである。一方、
S−Amyは系から除かれないのでS−Amyのみ
を含有する検体(2)、(5)および(8)の(b)値(S−
Amy活性に相当)は、(a)値(総α−アミラーゼ
活性)とほぼ等しい。また第2表に示すように、
P−AmyとS−Amyの混合比[P/(P+S)]
とb/aの値はほぼ一致している。このように本
法の分別定量法は極めて優れている。 実施例 4 ヒト血清の分別定量 膵疾患々者および健常人の血清を検体とし、実
施例2と同様にしてP−Amyの定量を行い第3
表の結果を得た。
【表】
第3表に示すように、総α−アミラーゼに対す
るP−Amyの割合(b/a)は、膵炎患者血清
(NO、GO、NI)の方が健常人よりも高く、また
唾液腺炎患者(SN)では逆に低い成積が得られ
た。
るP−Amyの割合(b/a)は、膵炎患者血清
(NO、GO、NI)の方が健常人よりも高く、また
唾液腺炎患者(SN)では逆に低い成積が得られ
た。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 1 下記の性質を有することを特徴とする抗ヒト
膵型α−アミラーゼ モノクローナル抗体: ヒト膵型α−アミラーゼを認識する、 実質的にヒト唾液型α−アミラーゼを認識し
ない、 抗原たるヒト膵型α−アミラーゼとの免疫反
応後においても該酵素が失活しない。 2 不溶性担体が結合した特許請求の範囲第1項
記載の抗ヒト膵型α−アミラーゼ モノクローナ
ル抗体。 3 不溶性担体が細菌細胞壁片である特許請求の
範囲第2項記載の抗ヒト膵型α−アミラーゼ モ
ノクローナル抗体。 4 不溶性担体がラクトバチルス プランタラム
の細菌細胞壁片である特許請求の範囲第2または
3項記載の抗ヒト膵型α−アミラーゼ モノクロ
ーナル抗体。 5 細胞融合技法によつて製造された特許請求の
範囲第1項記載の抗ヒト膵型α−アミラーゼ モ
ノクローナル抗体。
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP60-106573 | 1985-05-17 | ||
JP10657385 | 1985-05-17 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPS6270399A JPS6270399A (ja) | 1987-03-31 |
JPH0346116B2 true JPH0346116B2 (ja) | 1991-07-15 |
Family
ID=14436982
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP61110233A Granted JPS6270399A (ja) | 1985-05-17 | 1986-05-13 | モノクロ−ナル抗体 |
Country Status (3)
Country | Link |
---|---|
EP (1) | EP0222923A1 (ja) |
JP (1) | JPS6270399A (ja) |
WO (1) | WO1986006636A1 (ja) |
Families Citing this family (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
DK630886A (da) * | 1986-10-17 | 1988-04-18 | Kohjin Co | Monoklonalt antistof mod human pancreas-amylase, fremgangsmaade til fremstilling deraf og fremgangsmaade til bestemmelse af human pancreas-amylase ved hjaelp af antistoffet |
JPH11299498A (ja) | 1998-02-19 | 1999-11-02 | Toyobo Co Ltd | アミラ―ゼアイソザイム活性測定用試薬 |
Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4166767A (en) * | 1976-03-25 | 1979-09-04 | Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd. | Insolubilized antibody |
Family Cites Families (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS58183098A (ja) * | 1982-04-20 | 1983-10-26 | Wako Pure Chem Ind Ltd | アイソザイム分別定量法 |
-
1986
- 1986-05-13 JP JP61110233A patent/JPS6270399A/ja active Granted
- 1986-05-15 WO PCT/JP1986/000247 patent/WO1986006636A1/ja not_active Application Discontinuation
- 1986-05-15 EP EP19860903550 patent/EP0222923A1/en not_active Withdrawn
Patent Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4166767A (en) * | 1976-03-25 | 1979-09-04 | Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd. | Insolubilized antibody |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JPS6270399A (ja) | 1987-03-31 |
WO1986006636A1 (en) | 1986-11-20 |
EP0222923A1 (en) | 1987-05-27 |
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