JP2003227837A - 血液中の低比重リポ蛋白（ｌｄｌ）もしくは変性低比重リポ蛋白の検出方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】動脈硬化症やアルツハイマー病の発症・進展と
深く関わる、ＬＤＬおよび変性ＬＤＬ（特に酸化ＬＤ
Ｌ）の新規な検出方法を提供する。 【解決手段】変性低比重リポ蛋白（特に酸化ＬＤＬ）
と、急性相反応物質、血液凝固・線溶系関連蛋白、もし
くはマクロフアージが産生する殺菌物質との複合体を測
定対象にする。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】この発明は、血液中に存在する変
性ＬＤＬ（特に酸化変性ＬＤＬ）が、生体内における急
性相反応の過程で産生される（急性相反応蛋白の一部は
マクロファージも産生する）ところの各種急性相反応物
質(acute phase reactants)や、各種の凝固・線溶系関
連蛋白、もしくはマクロフアージが産生する各種の殺菌
物質と複合体を形成して存在することを見出すととも
に、この点に着目した新規な変性ＬＤＬ（特に酸化変性
ＬＤＬ）の検出方法に関するもので、動脈硬化性病変や
アルツハイマー病などの早期診断や治療上での薬効評価
などに寄与せんとするものである。

【０００２】

【発明が解決しようとする課題】動脈硬化症は大動脈、
冠状動脈、脳動脈および頚動脈に多く発生し、心筋梗
塞、脳梗塞などの主因となる疾患である。また、最近で
はアルツハイマー病も動脈硬化症と関連性の大きい疾患
であることがわかってきた。従来、血液中で、これらの
生体内での動脈硬化症の状態を直接反映する測定対象が
なく、血清中あるいは血漿中のＬＤＬ、ＬＰ（ａ）、レ
ムナントリポ蛋白、Small，denseＬＤＬなど、ＬＤＬを
主体とした血管壁脂質蓄積と関わりの深い、動脈硬化性
病変に関わるリポ蛋白として測定されてきた。なかんず
く、酸化ＬＤＬと粥状動脈硬化病変の進展との関連がス
タインバーグ(Steinberg，D．et al．Engl．Med．320：
915，1989)により、一方、Ｒｏｓｓらが提唱した傷害反
応仮説(Ross，R．Nature．362：801，1993)によって指
摘されて以来、動脈硬化の進展における酸化ＬＤＬの関
与が注目されてきた。

【０００３】さらに、最近では、動脈硬化を炎症として
捉える立場の研究が盛んである(Ross，R．Ncw．Engl．
J．Med．340：115〜126，1999)。急性相反応と動脈硬化
の関連性に関して（西順一郎，他．動脈硬化．24：363
〜367，1996）によれば、生体は感染や外傷などの外か
らの刺激に対して、発熱、血管透過性亢進による浮腫、
血小板凝集と凝固亢進による止血、免疫担当細胞の活性
化を通じて、すみやかに病原体の排除や組織障害の回復
を図り恒常性を維持する。この生体反応を急性相反応(A
cute phase response)と呼んでいる。感染や外傷などの
外的刺激に対するこの生体反応は、人類の進化とともに
発達してきた重要な防御機構である。一方、今世紀に入
って、われわれ人類の生活環境の急激な変化は、この外
的刺激を減少させる一方で、高脂血症・高血糖などの内
部環境の変化を通じて、酸化変性ＬＤＬやAdvanced gly
cation endoproduct（ＡＧＥ）などの生体内修飾物質を
も増加させる結果を生んできた。マクロファージ系細胞
や血管内皮細胞には、これらの生体内修飾物質を認識す
る特異的レセプターが発現しており、生体はこれらの細
胞を通じて生体内修飾物質を処理する機構を有してい
る。このことは酸化ＬＤＬやＡＧＥが体内では異物とし
て作用していることを示しており、この‘異物処理過
程’で、はからずもマクロファージ・内皮細胞の活性化
がひきおこされる。即ちこの一連の過程は動脈硬化の成
立プロセスとみなすことが出来る。

【０００４】そして、上述の生体反応、即ち急性相反応
の過程で、血漿中に有意に増加してくる物質を急性相反
応物質あるいは急性相反応蛋白と呼び、表１に示すよう
な主な物質群からなっている(Steel DM，et al．Immuol
Today，15：81〜88，1994)。

【０００５】

【表１】

【０００６】一方、ヒト大動脈粥状硬化病変部に急性相
反応物質が局在することが免疫組織化学染色法やin sit
u hybridization法で確認されている。ＣＲＰ、ＳＡ
Ａ、ＳＡＰに関しては（畑中薫，他．動脈硬化．24：55
1〜555，1997）、fibrinogenおよびその分解産物に関し
て(Bini，A．et al．Arteriosclerosis．9：109〜121．
1989)、α１−アンチトリプシンに関して（竹屋元裕．
未発表，１９９９）が知られている。

【０００７】現状では動脈硬化における各種急性相反応
物質の役割分担については不明な点が多く、今後の研究
の進展が期待されている。また、動脈硬化病変には組織
因子（ＴＦ）の過剰発現とともに、血管内で生じたフイ
ブリン血栓の溶解に関与する組織プラスミノーゲンアク
チベーター（ｔ−ＰＡ）の阻害因子であるプラスミノー
ゲンアクチベーターインヒビター（ＰＡＩ）活性やトロ
ンビン受容体も同時に亢進しており、これらの因子も動
脈硬化内膜の凝固亢進に関与していることが知られてい
る（小川久雄．最新医学．54：1210〜1217，1999）。さ
らに、動脈硬化の発生進展に関連して動脈壁でおこる種
々の病的現象は、フイブリンを中心として凝固線溶系の
諸因子が複雑に関連して進展する、即ち、動脈硬化病変
部位は血栓形成の“場”となりやすいことも知られてい
る（田中健蔵．日本老年医学会雑誌．35：880〜890，19
98）。また、上述のごとくアテローム性動脈硬化におい
ては血液中のＬＤＬが血管壁に沈着すると、内皮細胞が
活性化され、血中の単球がもぐり込んできてマクロフア
ージとなり血管壁に沈着したＬＤＬを異物として処理す
る以外にも、最近の報告によると、動脈硬化の発症・進
展にクラミジアニューモニエやヘリコバクターピロリ菌
の感染が関与することも知られ（Murat V, et al. JID.
177：725〜729，1998）、（Patel P, et al. BMJ. 31
1：711〜714，1995）、また、動脈硬化病変部位におい
て、これらの病原菌の存在が確認されている。従って、
動脈硬化病変部位に浸潤したマクロフアージは、血管壁
に沈着したＬＤＬの処理以外に、これら病原菌の排除の
ためにも種々の殺菌物質を血管壁で放出する状況にある
といえる。

【０００８】一方、この様に、動脈硬化発症、進展に関
わる要因の解明が進む反面、変性ＬＤＬ（酸化変性ＬＤ
Ｌ）の測定法に関しては、血中で簡易に正確性をもって
測定する方法が存在しなかった。したがって本研究は、
動脈硬化症やアルツハイマー病の発症・進展と深く関わ
る、ＬＤＬおよび変性ＬＤＬ（特に酸化ＬＤＬ）の新規
な検出方法を提供することを課題とする。

【０００９】

【課題を解決するための手段】生体の主要な構成成分と
して蛋白質、脂質、糖質、核酸があげられるが、最も酸
化されやすいのは脂質であり、酸素添加反応が起こり、
いわゆる過酸化脂質が生成する。脂質が酸化されやすい
のは多くの脂質がリノール酸やアラキドン酸のような高
度不飽和脂肪酸のエステルとなっているためである。リ
ポ蛋白は脂質と蛋白質から構成されており、リポ蛋白が
酸化された場合には、脂質、蛋白質共に酸化変性を受け
る。

【００１０】この生体脂質が非酵素的に酸化される引き
金としては、活性酸素が考えられている。この過酸化脂
質の測定は順相ＨＰＬＣ法などの分析化学的手法が用い
られ、健常人の生体内でも確実に脂質の非酵素的酸化が
起きていることが証明されている（山本順寛，他．蛋白
質・核酸・酵素．44：1253，1999）。

【００１１】上述のごとく現状では、血液中の総過酸化
脂質量の把握は可能であるが、リポ蛋白個別の酸化変性
度を知る方法は現在のところ存在せず、ＬＤＬの酸化変
性体が血液中に存在することの実証は、本発明者らの特
願平８−３１７１６２号による方法によって初めて成さ
れた。さらに本発明者は、特願平１１−１０９００１
号、特願平１１−２０７９１３号に開示した手法によっ
ても血液中の酸化変性ＬＤＬの検出が可能であることを
発見した。

【００１２】そして、その後、更なる研究と検討を繰り
返した結果、循環血液中に酸化変性ＬＤＬが種々の急性
相反応物質や、血液凝固・線溶関連蛋白もしくは、マク
ロフアージが産生する各種殺菌物質（滝 寵雄．他．医
学のあゆみ．156：194〜197．1991）と複合体を形成し
て存在する事実を発見して本発明に至った。即ち、特願
平８−３１７１６２号、および、特願平１１−２０７９
１３号の手法を発展させて、血液中のＬＤＬおよび変性
ＬＤＬ（特に酸化変性ＬＤＬ）の検出方法を確立して本
発明を完成させたものである。

【００１３】より具体的に説明すると、本発明は、たと
えば、血管内壁下でＬＤＬが酸化変性を受けるとその局
所に血管腔から滲み込んだないしは、マクロフアージが
産生したところの表１に示すような代表的な急性相反応
蛋白（α１−アンチトリプシン、フイブリノーゲン、フ
イブロネクチン、ＣＲＰ、ＳＡＡ、ＳＰＡ、α１−アン
チキモトリプシン、α１−アシドグリコプロティン、α
２−マクログロブリン）と変性ＬＤＬ（特に酸化変性Ｌ
ＤＬ）が複合体を形成すること、さらに、動脈硬化内膜
での凝固亢進に関与する（組織因子、プラスミノーゲ
ン、プロトロンビン、トロンビン、アンチトロンビン
３、プラスミンアクチベーターインヒビター１など）蛋
白とも変性ＬＤＬ（特に酸化変性ＬＤＬ）が複合体を形
成することおよび、動脈硬化病変部位に浸潤してきたマ
クロフアージが、異物処理過程で放出するミエロペルオ
キシダーゼ、ラクトフェリン、リゾチーム、塩基性蛋白
などの殺菌物質ともＬＤＬおよび変性ＬＤＬ（特に酸化
変性ＬＤＬ）が複合体を形成することを見出した。これ
らのいずれの複合体も動脈硬化症の発症・進展と関連性
が高い点を見出して完成されたものである。

【００１４】なお典型的には、本発明は、酸化変性ＬＤ
Ｌとα１−アンチトリプシンの複合体を特異的に認識す
る抗体（特願平８−３１７１６２号）を作製したと同様
に、ＬＤＬおよび酸化変性ＬＤＬと複合体を形成してい
る各種抗原に対する特異抗体を作製、または、抗ヒトフ
イブリノーゲン抗体（ＤＡＫＯ）を固相抗体として用
い、ＬＤＬおよび酸化変性ＬＤＬと各種蛋白との複合体
を反応させた後に、酵素をはじめとする標識物をラベル
した抗ヒトＡｐｏＢ抗体を反応させて、血液中の酸化変
性ＬＤＬを検出する方法である。

【００１５】この場合、用いる試料は血液中のＬＤＬを
超遠心法や、デキストラン硫酸とカルシウムイオンなど
の化学物質を用いた沈澱法で分画したＬＤＬもしくは、
血清や血漿をそのまま試料として測定することも可能で
ある。また、これらの各種蛋白と複合体を形成したＬＤ
Ｌおよび酸化変性ＬＤＬの検出法の臨床応用としては、
動脈硬化症やアルツハイマー病の早期診断や、動脈硬化
症治療薬投与時の薬効評価などに好適である。

【００１６】

【発明の実施の形態】以下、本発明について具体的に説
明する。Ａ．急性相反応物質と複合体を形成したＬＤＬもしくは
酸化変性ＬＤＬの検出例 （Ａ−１）［超遠心または硫酸デキストラン／Ｃａ沈澱
法により調整したＬＤＬ中のＬＤＬもしくは変性ＬＤＬ
（酸化変性ＬＤＬ）／ＣＲＰ複合体の測定］

【００１７】１、抗ヒトＣＲＰポリクローナル抗体（Ｄ
ＡＫＯ社）を０．０５M Tris-HCl（０．１５M NaClを含
む、pH８．０）緩衝液に１０μg/mlの割合で加え、マイ
クロプレートに１００μl/wellで分注する。 ２、４℃下で一夜、物理吸着させた後、使用時に脱イオ
ン水で３回洗浄し、０．１％ショ糖および牛血清アルブ
ミン、０．０５％アジ化ナトリウムを含む０．０５M Tr
is-HCl緩衝液（pH７．５）を１０μl/wellで分注し、室
温で３０分以上静置した後、液を棄て４℃で乾燥させ
る。乾燥したマイクロプレートを脱イオン水２５０μl/
wellで３回洗浄する。 ３、マイクロプレートに５５mg/ml Mouse Gamma Globul
inとGoat Gamma Globulin含有１％ウシアルブミン溶液
を１００μl/well分注し、これに試料あるいは標準液を
５０μｌ添加する。 ４、３７℃で１．５時間反応させる。 ５、０．００５％Tween20溶液２５０μl/wellで５回洗
浄する。 ６、ビオチン標識Ｆａｂ′化IgG-apoB/427モノクローナ
ル抗体を１％ＢＳＡ溶液で１．６μg/mlとしたものを１
００μl/well分注する。 ７、３７℃で１．５時間反応させる。 ８、３、と同様に０．００５％Tween20溶液２５０μl/w
ellで５回洗浄する。

【００１８】９、ＨＲＰ標識アビジンＤ（Vector labor
atories社製）を１％カゼイン溶液で１５０００倍希釈
とし、１００μl/well分注する。 １０、３７℃下で３０分間反応させる。 １１、０．００５％Tween20溶液２５０μl/wellで５回
洗浄する。 １２、過酸化水素溶液とＴＭＢＺ溶液からなる呈色試薬
を１００μl/well分注し、室温下３０分間反応させる。 １３、１Ｍリン酸水溶液を１００μl/well分注し、反応
を停止させる。 １４、主波長４５０nm、副波長６３０nmで測光する。 １５、人工的に調整した変性ＬＤＬ（酸化ＬＤＬ）／Ｃ
ＲＰ複合体により求めた検量線から試料中の変性ＬＤＬ
（酸化ＬＤＬ）／ＣＲＰ複合体濃度を算出する。

【００１９】（Ａ−２）［超遠心または硫酸デキストラ
ン／Ｃａ沈澱法により調整したＬＤＬ中のＬＤＬもしく
は変性ＬＤＬ（酸化変性ＬＤＬ）／アミロイドＡ複合体
の測定］

【００２０】１、抗ヒトアミロイドＡポリクローナル抗
体（ＤＡＫＯ社）を０．０５M Tris-HCl（０．１５M Na
Clを含む、pH８．０）緩衝液に１０μg/mlの割合で加
え、マイクロプレートに１００μl/wellで分注する。 ２、４℃下で一夜、物理吸着させた後、使用時に脱イオ
ン水で３回洗浄し、０．１％ショ糖および牛血清アルブ
ミン、０．０５％アジ化ナトリウムを含む０．０５M Tr
is-HCl緩衝液（pH７．５）を１０μl/wellで分注し、室
温で３０分以上静置した後、液を棄て４℃で乾燥させ
る。乾燥したマイクロプレートを脱イオン水２５０μl/
wellで３回洗浄する。 ３、マイクロプレートに５５mg/ml Mouse Gamma Globul
inとGoat Gamma Globlin含有１％ウシアルブミン溶液を
１００μl/well分注し、これに試料あるいは標準液を５
０μｌ添加する。 ４、３７℃で１．５時間反応させる。 ５、０．００５％Tween20溶液２５０μl/wellで５回洗
浄する。 ６、ビオチン標識Ｆａｂ′化IgG-apoB/427モノクローナ
ル抗体を１％ＢＳＡ溶液で１．６μg/mlとしたものを１
００μl/well分注する。 ７、３７℃で１．５時間反応させる。 ８、３、と同様に０．００５％Tween20溶液２５０μl/w
ellで５回洗浄する。

【００２１】９、ＨＲＰ標識アビジンＤ（Vector labor
atories社製）を１％カゼイン溶液で１５０００倍希釈
とし、１００μl/well分注する。 １０、３７℃下で３０分間反応させる。 １１、０．００５％Tween20溶液２５０μl/wellで５回
洗浄する。 １２、過酸化水素溶液とＴＭＢＺ溶液からなる呈色試薬
を１００μl/well分注し、室温下３０分間反応させる。 １３、１Ｍリン酸水溶液を１００μl/well分注し、反応
を停止させる。 １４、主波長４５０nm、副波長６３０nmで測光する。 １５、人工的に調整した変性ＬＤＬ（酸化ＬＤＬ）／ア
ミロイドＡ複合体により求めた検量線から試料中の変性
ＬＤＬ（酸化ＬＤＬ）／アミロイドＡ複合体濃度を算出
する。

【００２２】（Ａ−３）［超遠心または硫酸デキストラ
ン／Ｃａ沈澱法により調整したＬＤＬ中のＬＤＬもしく
は変性ＬＤＬ（酸化変性ＬＤＬ）／α２−マクログロブ
リン複合体の測定］

【００２３】１、抗ヒトα２−マクログロブリンポリク
ローナル抗体（ＤＡＫＯ社）を０．０５M Tris-HCl
（０．１５M NaClを含む、pH８．０）緩衝液に１０μg/
mlの割合で加え、マイクロプレートに１００μl/wellで
分注する。 ２、４℃下で一夜、物理吸着させた後、使用時に脱イオ
ン水で３回洗浄し、０．１％ショ糖および牛血清アルブ
ミン、０．０５％アジ化ナトリウムを含む０．０５M Tr
is-HCl緩衝液（pH７．５）を１０μl/wellで分注し、室
温で３０分以上静置した後、液を棄て４℃で乾燥させ
る。乾燥したマイクロプレートを脱イオン水２５０μl/
wellで３回洗浄する。 ３、マイクロプレートに５５mg/mlMouse Gamma Globuli
nとGoat Gamma Globulin含有１％ウシアルブミン溶液を
１００μl/well分注し、これに試料あるいは標準液を５
０μｌ添加する。 ４、３７℃で１．５時間反応させる。 ５、０．００５％Tween20溶液２５０μl/wellで５回洗
浄する。 ６、ビオチン標識Ｆａｂ′化IgG-apoB/427モノクローナ
ル抗体を１％ＢＳＡ溶液で１．６μg/mlとしたものを１
００μl/well分注する。 ７、３７℃で１．５時間反応させる。 ８、３、と同様に０．００５％Tween20溶液２５０μl/w
ellで５回洗浄する。

【００２４】９、ＨＲＰ標識アビジンＤ（Vector labor
atories社製）を１％カゼイン溶液で１５０００倍希釈
とし、１００μl/well分注する。 １０、３７℃下で３０分間反応させる。 １１、０．００５％Tween20溶液２５０μl/wellで５回
洗浄する。 １２、過酸化水素溶液とＴＭＢＺ溶液からなる呈色試薬
を１００μl/well分注し、室温下３０分間反応させる。 １３、１Ｍリン酸水溶液を１００μl/well分注し、反応
を停止させる。 １４、主波長４５０nm、副波長６３０nmで測光する。 １５、人工的に調整した変性ＬＤＬ（酸化ＬＤＬ）／α
２−マクログロブリン複合体により求めた検量線から試
料中の変性ＬＤＬ（酸化ＬＤＬ）／α２−マクログロブ
リン複合体濃度を算出する。

【００２５】（Ａ−４）［超遠心または硫酸デキストラ
ン／Ｃａ沈澱法により調整したＬＤＬ中のＬＤＬもしく
は変性ＬＤＬ（酸化変性ＬＤＬ）／α１−アンチキモト
リプシン複合体の測定］

【００２６】１、抗ヒトα１−アンチキモトリプシンポ
リクローナル抗体（ＤＡＫＯ社）を０．０５M Tris-HCl
（０．１５M NaClを含む、pH８．０）緩衝液に１０μg/
mlの割合で加え、マイクロプレートに１００μl/wellで
分注する。 ２、４℃下で一夜、物理吸着させた後、使用時に脱イオ
ン水で３回洗浄し、０．１％ショ糖および牛血清アルブ
ミン、０．０５％アジ化ナトリウムを含む０．０５M Tr
is-HCl緩衝液（pH７．５）を１０μl/wellで分注し、室
温で３０分以上静置した後、液を棄て４℃で乾燥させ
る。乾燥したマイクロプレートを脱イオン水２５０μl/
wellで３回洗浄する。 ３、マイクロプレートに５５mg/ml Mouse Gamma Globul
inとGoat Gamma Globulin含有１％ウシアルブミン溶液
を１００μl/well分注し、これに試料あるいは標準液を
５０μｌ添加する。 ４、３７℃で１．５時間反応させる。 ５、０．００５％Tween20溶液２５０μl/wellで５回洗
浄する。 ６、ビオチン標識Ｆａｂ′化IgG-apoB/427モノクローナ
ル抗体を１％ＢＳＡ溶液で１．６μg/mlとしたものを１
００μl/well分注する。 ７、３７℃で１．５時間反応させる。 ８、３、と同様に０．００５％Tween20溶液２５０μl/w
ellで５回洗浄する。

【００２７】９、ＨＲＰ標識アビジンＤ（Vector labor
atories社製）を１％カゼイン溶液で１５０００倍希釈
とし、１００μl/well分注する。 １０、３７℃下で３０分間反応させる。 １１、０．００５％Tween20溶液２５０μl/wellで５回
洗浄する。 １２、過酸化水素溶液とＴＭＢＺ溶液からなる呈色試薬
を１００μl/well分注し、室温下３０分間反応させる。 １３、１Ｍリン酸水溶液を１００μl/well分注し、反応
を停止させる。 １４、主波長４５０nm、副波長６３０nmで測光する。 １５、人工的に調整した変性ＬＤＬ（酸化ＬＤＬ）／α
１−アンチキモトリプシン複合体により求めた検量線か
ら試料中の変性ＬＤＬ（酸化ＬＤＬ）／α１−アンチキ
モトリプシン複合体濃度を算出する。

【００２８】（Ａ−５）［超遠心または硫酸デキストラ
ン／Ｃａ沈澱法により調整したＬＤＬ中のＬＤＬもしく
は変性ＬＤＬ（酸化変性ＬＤＬ）／α１−アシドグリコ
プロテイン複合体の測定］

【００２９】１、抗ヒトα１−アシドグリコプロテイン
ポリクローナル抗体（ＤＡＫＯ社）を０．０５M Tris-H
Cl（０．１５M NaClを含む、pH８．０）緩衝液に１０μ
g/mlの割合で加え、マイクロプレートに１００μl/well
で分注する。 ２、４℃下で一夜、物理吸着させた後、使用時に脱イオ
ン水で３回洗浄し、０．１％ショ糖および牛血清アルブ
ミン、０．０５％アジ化ナトリウムを含む０．０５M Tr
is-HCl緩衝液（pH７．５）を１０μl/wellで分注し、室
温で３０分以上静置した後、液を棄て４℃で乾燥させ
る。乾燥したマイクロプレートを脱イオン水２５０μl/
wellで３回洗浄する。 ３、マイクロプレートに５５mg/ml Mouse Gamma Globul
inとGoat Gamma Globulin含有１％ウシアルブミン溶液
を１００μl/well分注し、これに試料あるいは標準液を
５０μｌ添加する。 ４、３７℃で１．５時間反応させる。 ５、０．００５％Tween20溶液２５０μl/wellで５回洗
浄する。 ６、ビオチン標識Ｆａｂ′化IgG-apoB/427モノクローナ
ル抗体を１％ＢＳＡ溶液で１．６μg/mlとしたものを１
００μl/well分注する。 ７、３７℃で１．５時間反応させる。 ８、３、と同様に０．００５％Tween20溶液２５０μl/w
ellで５回洗浄する。

【００３０】９、ＨＲＰ標識アビジンＤ（Vector labor
atories社製）を１％カゼイン溶液で１５０００倍希釈
とし、１００μl/well分注する。 １０、３７℃下で３０分間反応させる。 １１、０．００５％Tween20溶液２５０μl/wellで５回
洗浄する。 １２、過酸化水素溶液とＴＭＢＺ溶液からなる呈色試薬
を１００μl/well分注し、室温下３０分間反応させる。 １３、１Ｍリン酸水溶液を１００μl/well分注し、反応
を停止させる。 １４、主波長４５０nm、副波長６３０nmで測光する。 １５、人工的に調整した変性ＬＤＬ（酸化ＬＤＬ）／α
１−アシドグリコプロテイン複合体により求めた検量線
から試料中の変性ＬＤＬ（酸化ＬＤＬ）／α１−アシド
グリコプロテイン複合体濃度を算出する。

【００３１】Ｂ．血液凝固・線溶系関連蛋白と複合体を
形成したＬＤＬもしくは酸化変性ＬＤＬの検出例 （Ｂ−１）［超遠心または硫酸デキストラン／Ｃａ沈澱
法により調整したＬＤＬ中のＬＤＬもしくは変性ＬＤＬ
（酸化変性ＬＤＬ）／トロンビン複合体の測定］

【００３２】１、抗ヒトトロンビンポリクローナル抗体
（ＤＡＫＯ社）を０．０５M Tris-HCl（０．１５M NaCl
を含む、pH８．０）緩衝液に１０μg/mlの割合で加え、
マイクロプレートに１００μl/wellで分注する。 ２、４℃下で一夜、物理吸着させた後、使用時に脱イオ
ン水で３回洗浄し、０．１％ショ糖および牛血清アルブ
ミン、０．０５％アジ化ナトリウムを含む０．０５M Tr
is-HCl緩衝液（pH７．５）を１０μl/wellで分注し、室
温で３０分以上静置した後、液を棄て４℃で乾燥させ
る。乾焼したマイクロプレートを脱イオン水２５０μl/
wellで３回洗浄する。 ３、マイクロプレートに５５mg/ml Mouse Gamma Globul
inとGoat Gamma Globulin含有１％ウシアルブミン溶液
を１００μl/well分注し、これに試料あるいは標準液を
５０μｌ添加する。 ４、３７℃で１．５時間反応させる。 ５、０．００５％Tween20溶液２５０μl/wellで５回洗
浄する。 ６、ビオチン標識Ｆａｂ′化IgG-apoB/427モノクローナ
ル抗体を１％ＢＳＡ溶液で１．６μg/mlとしたものを１
００μl/well分注する。 ７、３７℃で１．５時間反応させる。 ８、３、と同様に０．００５％Tween20溶液２５０μl/w
ellで５回洗浄する。

【００３３】９、ＨＲＰ標識アビジンＤ（Vector labor
atories社製）を１％カゼイン溶液で１５０００倍希釈
とし、１００μl/well分注する。 １０、３７℃下で３０分間反応させる。 １１、０．００５％Tween20溶液２５０μl/wellで５回
洗浄する。 １２、過酸化水素溶液とＴＭＢＺ溶液からなる呈色試薬
を１００μl/well分注し、室温下３０分間反応させる。 １３、１Ｍリン酸水溶液を１００μl/well分注し、反応
を停止させる。 １４、主波長４５０nm、副波長６３０nmで測光する。 １５、人工的に調整した変性ＬＤＬ（酸化ＬＤＬ）／ト
ロンビン複合体により求めた検量線から試料中の変性Ｌ
ＤＬ（酸化ＬＤＬ）／トロンビン複合体濃度を算出す
る。

【００３４】（Ｂ−２）［超遠心または硫酸デキストラ
ン／Ｃａ沈澱法により調整したＬＤＬ中のＬＤＬもしく
は変性ＬＤＬ（酸化変性ＬＤＬ）／アンチトロンビン３
複合体の測定］

【００３５】１、抗ヒトアンチトロンビン３ポリクロー
ナル抗体（ＤＡＫＯ社）を０．０５ＭTris-HCl（０．１
５M NaClを含む、pH８．０）緩衝液に１０μg/mlの割合
で加え、マイクロプレートに１００μl/wellで分注す
る。 ２、４℃下で一夜、物理吸着させた後、使用時に脱イオ
ン水で３回洗浄し、０．１％ショ糖および牛血清アルブ
ミン、０．０５％アジ化ナトリウムを含む０．０５M Tr
is-HCl緩衝液（pH７．５）を１０μl/wellで分注し、室
温で３０分以上静置した後、液を棄て４℃で乾燥させ
る。乾燥したマイクロプレートを脱イオン水２５０μl/
wellで３回洗浄する。 ３、マイクロプレートに５５mg/ml Mouse Gamma Globu
linとGoat Gamma Globulin含有１％ウシアルブミン溶液
を１００μl/well分注し、これに試料あるいは標準液を
５０μｌ添加する。 ４、３７℃で１．５時間反応させる。 ５、０．００５％Tween20溶液２５０μl/wellで５回洗
浄する。 ６、ビオチン標識Ｆａｂ′化IgG-apoB/427モノクローナ
ル抗体を１％ＢＳＡ溶液で１．６μg/mlとしたものを１
００μl/well分注する。 ７、３７℃で１．５時間反応させる。 ８、３、と同様に０．００５％Tween20溶液２５０μl/w
ellで５回洗浄する。

【００３６】９、ＨＲＰ標識アビジンＤ（Vector labor
atories社製）を１％カゼイン溶液で１５０００倍希釈
とし、１００μl/well分注する。 １０、３７℃下で３０分間反応させる。 １１、０．００５％Tween20溶液２５０μl/wellで５回
洗浄する。 １２、過酸化水素溶液とＴＭＢＺ溶液からなる呈色試薬
を１００μl/well分注し、室温下３０分間反応させる。 １３、１Ｍリン酸水溶液を１００μl/well分注し、反応
を停止させる。 １４、主波長４５０nm、副波長６３０nmで測光する。 １５、人工的に調整した変性ＬＤＬ（酸化ＬＤＬ）／ア
ンチトロンビン３複合体により求めた検量線から試料中
の変性ＬＤＬ（酸化ＬＤＬ）／アンチトロンビン３複合
体濃度を算出する。

【００３７】（Ｂ−３）［超遠心または硫酸デキストラ
ン／Ｃａ沈澱法により調整したＬＤＬ中のＬＤＬもしく
は変性ＬＤＬ（酸化変性ＬＤＬ）／プラスミノーゲンア
クチベータインヒビター１複合体の測定］

【００３８】１、抗ヒトプラスミノーゲンアクチベータ
インヒビター１ポリクローナル抗体（ＤＡＫＯ社）を
０．０５M Tris-HCl（０．１５M NaClを含む、pH８．
０）緩衝液に１０μg/mlの割合で加え、マイクロプレー
トに１００μl/wellで分注する。 ２、４℃下で一夜、物理吸着させた後、使用時に脱イオ
ン水で３回洗浄し、０．１％ショ糖および牛血清アルブ
ミン、０．０５％アジ化ナトリウムを含む０．０５M Tr
is-HCl緩衝液（pH７．５）を１０μl/wellで分注し、室
温で３０分以上静置した後、液を棄て４℃で乾燥させ
る。乾燥したマイクロプレートを脱イオン水２５０μl/
wellで３回洗浄する。 ３、マイクロプレートに５５mg/ml Mouse Gamma Globul
inとGoat Gamma Globulin含有１％ウシアルブミン溶液
を１００μl/well分注し、これに試料あるいは標準液を
５０μｌ添加する。 ４、３７℃で１．５時間反応させる。 ５、０．００５％Tween20溶液２５０μl/wellで５回洗
浄する。 ６、ビオチン標識Ｆａｂ′化IgG-apoB/427モノクローナ
ル抗体を１％ＢＳＡ溶液で１．６μg/mlとしたものを１
００μl/well分注する。 ７、３７℃で１．５時間反応させる。 ８、３、と同様に０．００５％Tween20溶液２５０μl/w
ellで５回洗浄する。

【００３９】９、ＨＲＰ標識アビジンＤ（Vector labor
atories社製）を１％カゼイン溶液で１５０００倍希釈
とし、１００μl/well分注する。 １０、３７℃下で３０分間反応させる。 １１、０．００５％Tween20溶液２５０μl/wellで５回
洗浄する。 １２、過酸化水素溶液とＴＭＢＺ溶液からなる呈色試薬
を１００μl/well分注し、室温下３０分間反応させる。 １３、１Ｍリン酸水溶液を１００μl/well分注し、反応
を停止させる。 １４、主波長４５０nm、副波長６３０nmで測光する。 １５、人工的に調整した変性ＬＤＬ（酸化ＬＤＬ）／プ
ラスミノーゲンアクチベータインヒビター１複合体によ
り求めた検量線から試料中の変性ＬＤＬ（酸化ＬＤＬ）
／プラスミノーゲンアクチベータインヒビター１複合体
濃度を算出する。

【００４０】Ｃ．マクロファージが産生する殺菌物質と
複合体を形成したＬＤＬもしくは酸化変性ＬＤＬの検出
例 （Ｃ−１）［超遠心または硫酸デキストラン／Ｃａ沈澱
法により調整したＬＤＬ中のＬＤＬもしくは変性ＬＤＬ
（酸化変性ＬＤＬ）／ミエロペルオキシダーゼ複合体の
測定］

【００４１】１、抗ヒトミエロペルオキシダーゼポリク
ローナル抗体（ＤＡＫＯ社）を０．０５M Tris-HCl
（０．１５M NaClを含む、pH８．０）緩衝液に１０μg/
mlの割合で加え、マイクロプレートに１００μl/wellで
分注する。 ２、４℃下で一夜、物理吸着させた後、使用時に脱イオ
ン水で３回洗浄し、０．１％ショ糖および牛血清アルブ
ミン、０．０５％アジ化ナトリウムを含む０．０５M Tr
is HCl緩衝液（pH７．５）を１０μl/wellで分注し、室
温で３０分以上静置した後、液を棄て４℃で乾焼させ
る。乾燥したマイクロプレートを脱イオン水２５０μl/
wellで３回洗浄する。 ３、マイクロプレートに５５mg/ml Mouse Gamma Globu
linとGoat Gamma Globulin含有１％ウシアルブミン溶液
を１００μl/well分注し、これに試料あるいは標準液を
５０μｌ添加する。 ４、３７℃で１．５時間反応させる。 ５、０．００５％Tween20溶液２５０μl/wellで５回洗
浄する。 ６、ビオチン標識Ｆａｂ′化IgG-apoB/427モノクローナ
ル抗体を１％ＢＳＡ溶液で１．６μg/mlとしたものを１
００μl/well分注する。 ７、３７℃で１．５時間反応させる。 ８、３、と同様に０．００５％Tween20溶液２５０μl/w
ellで５回洗浄する。

【００４２】９、ＨＲＰ標識アビジンＤ（Vector labor
atories社製）を１％カゼイン溶液で１５０００倍希釈
とし、１００μl/well分注する。 １０、３７℃下で３０分間反応させる。 １１、０．００５％Tween20溶液２５０μl/wellで５回
洗浄する。 １２、過酸化水素溶液とＴＭＢＺ溶液からなる呈色試薬
を１００μl/well分注し、室温下３０分間反応させる。 １３、１Ｍリン酸水溶液を１００μl/well分注し、反応
を停止させる。 １４、主波長４５０nm、副波長６３０nmで測光する。 １５、人工的に調整した変性ＬＤＬ（酸化ＬＤＬ）／ミ
エロペルオキシダーゼ複合体により求めた検量線から試
料中の変性ＬＤＬ（酸化ＬＤＬ）／ミエロペルオキシダ
ーゼ複合体濃度を算出する。

【００４３】（Ｃ−２）［超遠心または硫酸デキストラ
ン／Ｃａ沈澱法により調整したＬＤＬ中のＬＤＬもしく
は変性ＬＤＬ（酸化変性ＬＤＬ）／ラクトフェリン複合
体の測定］

【００４４】１、抗ヒトラクトフェリンポリクローナル
抗体（ＤＡＫＯ社）を０．０５M Tris-HCl（０．１５M
NaClを含む、pH８．０）緩衝液に１０μg/mlの割合で加
え、マイクロプレートに１００μl/wellで分注する。 ２、４℃下で一夜、物理吸着させた後、使用時に脱イオ
ン水で３回洗浄し、０．１％ショ糖および牛血清アルブ
ミン、０．０５％アジ化ナトリウムを含む０．０５M Tr
is-HCl緩衝液（pH７．５）を１０μl/wellで分注し、室
温で３０分以上静置した後、液を棄て４℃で乾燥させ
る。乾操したマイクロプレートを脱イオン水２５０μl/
wellで３回洗浄する。 ３、マイクロプレートに５５mg/ml Mouse Gamma Globu
linとGoat Gamma Globulin含有１％ウシアルブミン溶液
を１００μl/well分注し、これに試料あるいは標準液を
５０μ１添加する。 ４、３７℃で１．５時間反応させる。 ５、０．００５％Tween20溶液２５０μl/wellで５回洗
浄する。 ６、ビオチン標識Ｆａｂ′化IgG-apoB/427モノクローナ
ル抗体を１％ＢＳＡ溶液で１．６μg/mlとしたものを１
００μl/well分注する。 ７、３７℃で１．５時間反応させる。 ８、３、と同様に０．００５％Tween20溶液２５０μl/w
ellで５回洗浄する。

【００４５】９、ＨＲＰ標識アビジンＤ（Vector labor
atories社製）を１％カゼイン溶液で１５０００倍希釈
とし、１００μl/well分注する。 １０、３７℃下で３０分間反応させる。 １１、０．００５％Tween20溶液２５０μl/wellで５回
洗浄する。 １２、過酸化水素溶液とＴＭＢＺ溶液からなる呈色試薬
を１００μl/well分注し、室温下３０分間反応させる。 １３、１Ｍリン酸水溶液を１００μl/well分注し、反応
を停止させる。 １４、主波長４５０nm、副波長６３０nmで測光する。 １５、人工的に調整した変性ＬＤＬ（酸化ＬＤＬ）／ラ
クトフェリン複合体により求めた検量線から試料中の変
性ＬＤＬ（酸化ＬＤＬ）／ラクトフェリン複合体濃度を
算出する。

【００４６】Ｄ．各種脂質濃度別血清中のＬＤＬもしく
は変性ＬＤＬ（酸化ＬＤＬ）と急性相反応蛋白または、
凝固・線溶系蛋白または、殺菌蛋白との複合体濃度の比
較 血清中脂質条件１群（コレステロールｌ６０mg/dl＞，
中性脂肪１００mg/dl＞，ＨＤＬコレステロール４０〜
９０mg/dl）、脂肪条件２群（コレステロールｌ６１〜
２１９mg/dl＞，中性脂肪１０１〜１３９mg/dl＞，ＨＤ
Ｌコレステロール４０〜９０mg/dl）、脂肪条件３群
（コレステロール２２０mg/dl＜，中性脂肪１４０mg/dl
＜，ＨＤＬコレステロール４０mg/dl＞）、の３群につ
いて、ＬＤＬもしくは変性ＬＤＬ（酸化ＬＤＬ）と急性
相反応蛋白複合体の測定例として（アミロイドＡ蛋白と
α２−マクログロブリン）、ＬＤＬもしくは変性ＬＤＬ
（酸化変性）と凝固・線溶系蛋白複合体の測定例として
（プロトロンビン、アンチトロンビン３）、マクロフア
ージが産生する殺菌物質とＬＤＬもしくは変性ＬＤＬ
（酸化ＬＤＬ）との複合体の測定例として（ミエロペル
オキシダーゼ、ラクトフェリン）の血清中濃度を比較し
たところ、いずれの複合体濃度も第３群（高脂質血症
群）において最も高値を示した（図１）。

【００４７】Ｅ．先の出願（特願平１１−２０７９１３
号） （Ｅ−１）先の発明に至る経緯

【００４８】先の出願に先立って、本発明者は、ＬＤＬ
とフィブリノーゲンおよびＬＤＬとフィブロネクチンの
複合体形成を試み、人工的に酸化変性を受けたＬＤＬに
より複合体が形成されることを確認した。即ち、native
ＬＤＬ、糖化ＬＤＬおよび、酸化ＬＤＬに精製品フィブ
リノーゲン又はフィブロネクチンを添加し、いずれのＬ
ＤＬがフィブリノーゲン又はフィブロネクチンと複合体
を形成するかを検討した。各ＬＤＬとフィブリノーゲン
又はフィブロネクチンの混合試料をアガロース電気泳動
後、ファットレッド(Fat red)７Ｂによる脂質染色およ
びイムノブロット(immunoblot)法によるフィブリノーゲ
ン又はフィブロネクチン染色を行った。

【００４９】その結果、nativeＬＤＬおよび糖化ＬＤＬ
とフィブリノーゲン又はフィブロネクチンの混合試料で
は複合体形成を認めなかったが、血管内皮細胞処理か硫
酸銅処理により調整した酸化ＬＤＬとフィブリノーゲン
又はフィブロネクチンの混合試料では複合体（酸化ＬＤ
Ｌ−フィブリノーゲン複合体、酸化ＬＤＬ−フィブロネ
クチン複合体）の形成を認めた。さらに、糖尿病や心筋
梗塞患者血清を用いて、超遠心分離により得たＬＤＬ
（１．００６g/ml＜ｄ＜１．０６３g/ml）を抗ヒトフィ
ブロネクチンイムノアフイニテイクロマト手法によっ
て、ＬＤＬ−フィブリノーゲン複合体、ＬＤＬ−フィブ
ロネクチン複合体を単離精製した。このＬＤＬ−フィブ
リノーゲン複合体、ＬＤＬ−フィブロネクチン複合体を
形成するＬＤＬの性質として、酸化ＬＤＬに特徴的な脂
質過酸化物の増加、ＡｐｏＢ蛋白の崩壊、そしてＬＤＬ
粒子全体の陰性荷電の増加を認めた。さらに、ゲル濾過
分析にて得た各画分を用いたＥＬＩＳＡから、ＬＤＬ画
分中にＬＤＬ−フィブリノーゲン複合体、ＬＤＬ−フィ
ブロネクチン複合体の存在が確認された。

【００５０】そこで本発明者らは、ＬＤＬないしは酸化
ＬＤＬがフィブロネクチンという好都合な標識を付けて
存在する事実に着目し、酸化ＬＤＬと複合体を形成する
フィブロネクチンを特異的に認識するモノクローナル抗
体を作製できれば、この抗体を用いて血液中のＬＤＬな
いしは酸化ＬＤＬとフィブロネクチンの複合体を認識、
測定、単離精製することが可能と考えた。

【００５１】抗体作製時の抗原には、人工的に調整した
酸化ＬＤＬ−フィブロネクチン複合体を用いた。得られ
た抗体のフィブロネクチンに対する反応特異性は、nati
veフィブロネクチンには反応性を示さないが、酸化ＬＤ
Ｌと複合体を形成するフィブロネクチンを認識した。ま
た、本抗体は、ＡｐｏＢ蛋白は認識しないことも判明し
た。

【００５２】（Ｅ−２）抗ヒト酸化ＬＤＬ結合フィブロ
ネクチンモノクローナル抗体の作製法 （モノクローナル抗体作製法の一例） 〔抗原の調整〕ヒト血清から超遠心分離により得たＬＤ
Ｌ（１．００６ｇ／ｍｌ＜ｄ＜１．０６３ｇ／ｍｌ）を
抗ヒトα１アンチトリプシンポリクローナル抗体を用い
たイムノアフィニティーカラムを通し、ＬＤＬ−α１ア
ンチトリプシン複合体を除去する。このα１アンチトリ
プシンフリーのＬＤＬに精製ヒトフィブロネクチンを添
加し、硫酸銅液を加え、３７℃に１夜放置して、酸化Ｌ
ＤＬ−フィブロネクチン複合体を形成させた。

【００５３】ＬＤＬとフィブロネクチンの複合体形成の
確認は、複合体を試料としてゲル濾過分析により得た各
画分についてＥＬＩＳＡ（固相抗体として抗ヒトフィブ
ロネクチン抗体、酵素標識抗体に抗ヒトＡｐｏＢ抗体を
用いる。）を実施することにより確認できる。

【００５４】〔動物への免疫〕この複合体（抗原）をリ
ン酸緩衝生理食塩水で蛋白濃度として１mg/ml溶液とな
るように調整し、この溶液をフロインドアジュバンドを
等量混合して得られるエマルジョンを、６週令のマウス
（Ｂａｌｂ／Ｃ系マウス）の腹腔内に５００μｌ投与し
た。この作業を２週間おきに計３回免疫を行った。

【００５５】〔細胞融合〕最終免疫後４日目に、このマ
ウスの脾臓から採取した脾リンパ球細胞をマウス骨髄腫
細胞(P3-X63-Ag8-Ul)と融合させた。融合方法は、常法
に従い、５０％ポリエチレングリコール４０００溶液を
融合促進剤として用い、融合促進剤の添加、混合および
希釈の各操作からなる融合時間を１０分間、３７℃で行
った。次に、ＨＡＴ培地（ヒポキサンチン・チミジン・
１０％ウシ胎児血清を含むＲＰＭＩ培地）を各ウェルに
分注し、２〜３日後、抗体産生ハイブリドーマの選択を
行った。

【００５６】選択方法は、酸化ＬＤＬ−ＩｇＡ複合体、
nativeＩｇＡ、nativeａｐｏＢを各々固定化した９６穴
マイクロプレートに、各ウェルのハイブリドーマ形成コ
ロニーの培養上清を１００μｌ分注して反応させ、つい
で洗浄後、ペルオキシダーゼ標識抗マウスイムノグロブ
リン抗体を１００μｌ添加して、抗原抗体反応させ、洗
浄、呈色とＥＬＩＳＡの常法に従って操作し、目的とす
る抗体（酸化ＬＤＬ結合フィブロネクチンに反応性を示
すが、nativeフィブロネクチン、nativeａｐｏＢには反
応しない抗体）産生ハイブリドーマを複数個選択した。
次に、目的とする抗体産生を示したコロニーを回収し、
限界希釈法によってハイブリドーマの単一コロニーを得
るようにクローニングを行った。この方法は、回収した
コロニーをＨＴ培地で希釈し、９６穴マイクロプレート
の各ウェルにハイブリドーマがウェル当たり１個以下と
なるようにフイーダー細胞と共に散布した。以上の操作
を２回行い、モノクローン化された抗ヒト酸化ＬＤＬ結
合フィブロネクチン抗体産生ハイブリドーマを複数個得
た。

【００５７】〔抗ヒト酸化ＬＤＬ結合フィブロネクチン
モノクローナル抗体の腹水化〕８週令のマウス（Ｂａｌ
ｂ／Ｃ系マウス）の腹腔内にプリスタン（免疫抑制剤）
を投与した。３〜７日後に抗体産生ハイブリドーマを腹
腔内に投与し、約７日後にマウス腹腔から腹水化された
抗体を回収した。

【００５８】〔抗体の精製〕腹水化して得られたそれぞ
れの抗体を５０％硫酸アンモニウムで２回塩析分離を行
い、リン酸緩衝生理食塩液にて透析して精製し、複数個
の抗ヒト酸化ＬＤＬ結合フィブロネクチンモノクローナ
ル抗体と人工的に調整した酸化ＬＤＬ−フィブロネクチ
ン複合体をそれぞれ反応させ、二次抗体として抗ヒトＡ
ｐｏＢ酵素標識抗体を用いたＥＬＩＳＡにおいて感度に
優れた、抗ヒト酸化ＬＤＬ結合フィブロネクチンモノク
ローナル抗体（ＯＦＮ−１と命名）を選定した。

【００５９】（Ｅ−３）本発明によれば、被検体の血液
成分を本発明の抗体と接触させ、該抗体と特異的に反応
した抗原量を定量することにより、血液中に含まれるＬ
ＤＬないしは酸化ＬＤＬ−フィブロネクチン複合体を測
定することができる。測定法はラジオイムノアッセイ、
酵素免疫法、イムノブロット法、免疫沈降法、蛍光イム
ノアッセイ、化学若しくは生物発光イムノアッセイなど
の公知法によって行われる。

【００６０】酵素免疫法（ＥＬＩＳＡ）によるＬＤＬな
いしは酸化ＬＤＬ−フィブロネクチン複合体の測定法を
例にとり、以下に具体的に説明する。 〔マイクロプレートヘの抗体の固定化〕マイクロプレー
ト（ＮＵＮＣ社製）の各ウェルに、抗ヒト酸化ＬＤＬ結
合フィブロネクチンモノクローナル抗体（ＯＦＮ−１）
５μg/ml）を含む０．１Ｍトリス緩衝液（pH８．４）を
１００μｌずつ分注し、一夜４℃で放置して抗体を固相
に吸着させる。

【００６１】〔酵素標識抗体の調整〕別途、抗ヒトＡｐ
ｏＢポリクローナル抗体、あるいは抗ヒトＡｐｏＢモノ
クローナル抗体（酸化ＬＤＬを抗原として作製したも
の）をペプシンと２−メルカプトエタノールアミンによ
りＦａｂ′に標識して酵素標識抗体を調整する。

【００６２】〔血清中あるいは血漿中ＬＤＬないしは酸
化ＬＤＬ−フィブロネクチン複合体の測定〕各ウェルに
１００μｌの１％ウシアルブミンを含むトリス緩衝液
（０．１Ｍ、pH８．０）を分注、次いで血清もしくは血
漿５０μｌを加えて混和した後、３７℃で２時間反応さ
せる。次に洗浄液（Tween20を終濃度０．００５％含む
リン酸緩衝液：０．０２Ｍ：pH７．４）で３回洗浄す
る。

【００６３】その後、ペルオキシダーゼ標識抗ヒトＡｐ
ｏＢＦａｂ′抗体溶液（１％ウシアルブミンを含むトリ
ス緩衝液）を各ウェルに１００μｌずつ加え混合した
後、３７℃で１時間反応させ、先と同様に３回洗浄す
る。基質発色液は、１．６６ｍＭＴＭＢＺ（同仁化学）
をメタノールで溶解後、メタノール濃度が５０％になる
ように０．２Ｍトリス緩衝液を加えた基質溶液と、０．
０２％過酸化水素を含む３５ｍＭクエン酸溶液とを等量
ずつ混和した溶液１００μｌを各ウェルに加え、室温で
１０分間放置後、反応停止液（２．５Ｍリン酸溶液）１
００μｌを各ウェルに加える。

【００６４】マイクロプレート用比色計を用いて４５０
／６３０nmの波長で比色し吸光度を算出する。人工的に
調整した酸化ＬＤＬ−フィブロネクチン複合体を上述と
同様の操作にて反応させ、作製した検量線から試料中の
ＬＤＬないしは酸化ＬＤＬ−フィブロネクチン複合体濃
度を算出する。

【００６５】（Ｅ−４）また、本発明によれば、ＬＤＬ
もしくは酸化ＬＤＬとフィブロネクチン複合体を含む動
脈硬化性疾患に関わる新規なリポ蛋白は、細胞外基質成
分に対して沈着性が強力であることから、固相に細胞外
基質蛋白を固定化し、この蛋白に結合させたＬＤＬない
しは酸化ＬＤＬとフィブリノーゲンもしくはフィブリン
（又はそれぞれの分解産物）との複合体、およびＬＤＬ
ないしは酸化ＬＤＬとフィブロネクチンの複合体を含む
動脈硬化性病変に関わる新規なリポ蛋白を検出する方法
について述べる。固相化に細胞外基質蛋白として、血管
をはじめ皮膚、骨、腱、筋などの生体のほとんどすべて
の組織に存在するコラーゲンを用いた測定法を例にと
り、以下に具体的に説明する。

【００６６】〔マイクロプレートヘの細胞外基質蛋白の
固定化〕マイクロプレート（ＮＵＮＣ社製）の各ウェル
にＩ型コラーゲンを１０μg/mlを含む０．１Ｍトリス緩
衝液（pH８．４）を１００μｌずつ分注し、３７℃で放
置して蒸発乾固させてコラーゲンを固相に吸着させる。

【００６７】〔酵素標識抗体の調整〕別途、抗ヒトＡｐ
ｏＢポリクローナル抗体、あるいは抗ヒトＡｐｏＢモノ
クローナル抗体（酸化ＬＤＬを抗原として作製したも
の）をペプシンと２−メルカプトエタノールアミンによ
りＦａｂ′として、ぺルオキシダーゼをこのＦａｂ′に
標識して酵素標識抗体を調整する。

【００６８】〔血清中あるいは血漿中のコラーゲン結合
性リポ蛋白の測定〕各ウェルに１００μｌの１％ウシア
ルブミンを含むトリス緩衝液（０．１Ｍ、pH８．０）を
分注、次いで血清もしくは血漿５０μｌを加えて混和し
た後、３７℃で２時間反応させる。次に洗浄液（Tween2
0を終濃度０．００５％含むリン酸緩衝液：０．０２
Ｍ：pH７．４）で３回洗浄する。その後、ぺルオキシダ
ーゼ標識抗ヒトＡｐｏＢＦａｂ′抗体溶液（１％ウシア
ルブミンを含むトリス緩衝液）を各ウェルに１００μｌ
ずつ加え混和した後、３７℃で１時間反応させ、先と同
様に３回洗浄する。

【００６９】基質発色液は１．６６ｍＭＴＭＢＺ（同仁
化学）をメタノールで溶解後、メタノール濃度が５０％
になるように０．２Ｍトリス緩衝液を加えた基質溶液
と、０．０２％過酸化水素を含む３５ｍＭクエン酸溶液
とを等量ずつ混和した溶液１００μｌを各ウェルに加
え、室温で１０分間放置後、反応停止液（２．５Ｍリン
酸溶液）１００μｌを各ウェルに加える。マイクロプレ
ート用比色計を用いて４５０／６３０nmの波長で比色し
吸光度を測定する。ヒト血清からコラーゲンを固定化し
たアフィニティーカラムで単離・精製したコラーゲン結
合性リポ蛋白について上述と同様の操作にて反応させ、
作成した検量線から試料中のコラーゲン結合性リポ蛋白
濃度を算出する。

【００７０】（Ｅ−５）さらに、本発明によればＬＤＬ
か酸化ＬＤＬとフィブリノーゲンやフィブリン（又はそ
れぞれの分解産物）もしくは、フィブロネクチンとの複
合体を含む動脈硬化性病変に関わる新規なリポ蛋白はポ
リスチレンやナイロンなどの高分子化合物に対して結合
性が強力であることから、固相法によっても該リポ蛋白
を測定することができる。固相にポリスチレン製マイク
ロプレートを用いた方法を例にとり、具体的に説明す
る。

【００７１】〔酵素標識抗体の調整〕別途、抗ヒトＡｐ
ｏＢポリクローナル抗体、あるいは抗ヒトＡｐｏＢモノ
クローナル抗体（酸化ＬＤＬを抗原として作製したも
の）をペプシンと２−メルカプトエタノールアミンによ
りＦａｂ′として、ペルオキシダーゼをこのＦａｂ′に
標識して酵素標識抗体を調整する。

【００７２】〔血清中あるいは血漿中の動脈硬化性病変
に関わる新規なリポ蛋白の固相法による測定〕無処理の
ポリスチレン製マイクロプレート（ＮＵＮＣ社製）の各
ウェルに１００μｌの１％ウシアルブミンを含むトリス
緩衝液（０．１Ｍ、pH８．０）を分注、次いで血清もし
くは血漿５０μｌを加えて混和した後、３７℃で２時間
反応させる。次に洗浄液（Tween20を終濃度０．００５
％含むリン酸緩衝液：０．０２Ｍ：pH７．４）で３回洗
浄する。

【００７３】その後、ペルオキシダーゼ標識抗ヒトＡｐ
ｏＢＦａｂ′抗体溶液（１％ウシアルブミンを含むトリ
ス緩衝液）を各ウェルに１００μｌずつ加え混和した
後、３７℃で１時間反応させ、先と同様に３回洗浄す
る。基質発色液は１．６６ｍＭＴＭＢＺ（同仁化学）を
メタノールで溶解後、メタノール濃度が５０％になるよ
うに０．２Ｍトリス緩衝液とを等量ずつ混和した溶液１
００μｌを各ウェルに加え、室温で１０分間放置後、反
応停止液（２．５Ｍリン酸溶液）１００μｌを各ウェル
に加える。マイクロプレート用比色計を用いて４５０／
６３０nmの波長で比色し吸光度を算出する。ヒト血清か
らコラーゲンを固定化したアフィニティーカラムで単離
・精製したＬＤＬか酸化ＬＤＬとフィブリノーゲンやフ
ィブリン（又はそれぞれの分解産物）との複合体、ＬＤ
Ｌもしくは酸化ＬＤＬ−フィブロネクチン複合体を含む
動脈硬化性病変に関わる新規なリポ蛋白を上述と同様の
操作にて反応させ、作成した検量線から試料中の該リポ
蛋白濃度を算出する。

【００７４】また、本発明によればＬＤＬもしくは酸化
ＬＤＬとフィブリノーゲンもしくはフィブリン（又はそ
れぞれの分解産物）との複合体を含む動脈硬化性病変に
関わる新規なリポ蛋白の検出方法についても以下に具体
的に説明する。

【００７５】〔マイクロプレートヘの抗体の固定化〕マ
イクロプレート（ＮＵＮＣ社製）の各ウェルに、抗ヒト
フィブリノーゲン抗体（ＤＡＫＯ）５μg/mlを含む０．
１Ｍトリス緩衝液（pH８．４）を１００μｌずつ分注
し、一夜４℃で放置して抗体を固相に吸着させる。

【００７６】〔酵素標識抗体の調整〕別途、抗ヒトＡｐ
ｏＢポリクローナル抗体、あるいは抗ヒトＡｐｏＢモノ
クローナル抗体をペプシンと２−メルカプトエタノール
アミンによりＦａｂ′に標識して酵素標識抗体を調整す
る。

【００７７】〔血清中のＬＤＬないしは酸化ＬＤＬ／フ
ィブリノーゲンもしくはフィブリン（又はそれぞれの分
解産物）複合体（ＬＤＬ−フィブリノーゲン関連物質複
合体と略記することがある）の測定〕各ウェルに１００
μｌの１％ウシアルブミンを含むトリス緩衝液（０．１
Ｍ、pH８．０）を分注、次いで血清５０μｌを加えて混
和した後、３７℃で１時間反応させる。次に洗浄液（Tw
een20を終濃度０．００５％含むリン酸緩衝液：０．０
２Ｍ：pH７．４）で３回洗浄する。その後、ペルオキシ
ダーゼ標識抗ヒトＡｐｏＢＦａｂ′抗体溶液（１％ウシ
アルブミンを含むトリス緩衝液）を各ウエルに１００μ
ｌずつ加え混合した後、３７℃で１時間反応させ、先と
同様に３回洗浄する。

【００７８】基質発色液は、１．６６ｍＭＴＭＢＺ（同
仁化学）をメタノールで溶解後、メタノール濃度が５０
％になるように０．２Ｍトリス緩衝液を加えた基質溶液
と、０．０２％過酸化水素を含む３５ｍＭクエン酸溶液
とを等量ずつ混和した溶液１００μｌを各ウェルに加
え、室温で１０分間放置後、反応停止液（２．５Ｍリン
酸）１００μｌを各ウェルに加える。

【００７９】マイクロプレート用比色計を用いて４５０
／６３０nmの波長で比色し吸光度を算出する。人工的に
調整した酸化ＬＤＬ−フィブリノーゲン複合体を上述と
同様の操作にて反応させ、作成した検量線から試料中の
ＬＤＬ−フィブリノーゲン関連物質複合体濃度を算出す
る。

【００８０】（Ｅ−６）ＬＤＬ画分中に存在するＬＤＬ
−フィブリノーゲン関連物質複合体、ＬＤＬ−フィブロ
ネクチン複合体およびコラーゲン結合性ＬＤＬの確認 ヒト血清を超遠心分離し、得られたＬＤＬ（１．００６
＜ｄ＜１．０６３g/ml）画分を用いてゲル濾過分析を行
い、各フラクションについて以下の如き組み合わせでＥ
ＬＩＳＡを実施した。即ち、ＬＤＬ（抗ヒトＡｐｏＢ／
抗ヒトＡｐｏＢ）、ＬＤＬ／フィブロネクチン複合体
（抗ヒトフィブロネクチン／抗ヒトＡｐｏＢ）、ＬＤＬ
／フィブリノーゲン複合体（抗ヒトフィブリノーゲン／
抗ヒトＡｐｏＢ）、コラーゲン接着性ＬＤＬ（コラーゲ
ン／抗ヒトＡｐｏＢ）を測定した結果、図２に示すごと
くＬＤＬ画分中にＬＤＬ／フィブロネクチン複合体、Ｌ
ＤＬ／フィブリノーゲン複合体、コラーゲン接着性ＬＤ
Ｌの存在を認めた。

【００８１】（Ｅ−７）血中Ｌｐ（ａ）濃度とコラーゲ
ン結合性Ｌｐ（ａ）濃度の関係および、血中ＬＤＬ／フ
ィブリノーゲン関連物質との複合体濃度とコラーゲン結
合性ＬＤＬ濃度の関係 細胞外基質成分への結合性を示すが由に動脈硬化症の危
険因子とされているＬｐ（ａ）は、血中のＬｐ（ａ）濃
度依存性にコラーゲン結合性Ｌｐ（ａ）として検出され
る。即ち、血中に存在するＬｐ（ａ）はすべて細胞外基
質成分への結合特性を有することが示唆される（図３
ａ）。Cushingらはアポ蛋白（ａ）が細胞外基質蛋白と
結合しやすい可能性を示唆している(Arteriosclenosi
s．，9：593，1989)。ＬＤＬではその一部が細胞外基質
成分への結合性を示すにすぎず（図３ｂ）、血中のＬＤ
Ｌ総量から細胞外基質成分結合性のリポ蛋白量を推定す
ることはできない。しかし、血中のＬＤＬ／フィブリノ
ーゲン複合体濃度とコラーゲン結合性ＬＤＬ濃度の相関
性は（図３ｃ）のごとく良好であることから、ＬＤＬ／
フィブリノーゲン複合体とコラーゲン結合性ＬＤＬは同
一物質である可能性が示唆される。従って、ＬＤＬが細
胞外基質蛋白と結合性を示すのはＬＤＬに結合している
フィブリノーゲン関連蛋白に依存している可能性が示唆
される。つまり、血中ＬＤＬ中にＬｐ（ａ）と同様の細
胞外基質成分結合性のリポ蛋白（動脈硬化症惹起性リポ
蛋白）が存在する。

【００８２】（Ｅ−８）健常者血清中のＬＤＬ−フィブ
リノーゲン関連物質複合体濃度の分布 健常者血清中のＬＤＬ−フィブリノーゲン関連物質の濃
度は図４の如くである。

【００８３】（Ｅ−９）健常者、糖尿病患者およびマル
チプルリスクファクター症候群患者血清中のＬＤＬ−フ
ィブリノーゲン関連物質複合体量 図５に示すごとく糖尿病患者およびマルチプルリスクフ
ァクター症候群患者血清中のＬＤＬ−フィブリノーゲン
関連物質複合体量は健常者に比べて有意に高値であっ
た。

【図面の簡単な説明】

【図１】血中脂質濃度が異なる３群間におけるＬＤＬも
しくは変性ＬＤＬと急性相反応蛋白（Ａ）、凝固・線溶
系蛋白（Ｂ）、殺菌蛋白（Ｃ）との複合体濃度の比較を
図示したものである。

【図２】LDL画分中に存在するLDL−フィブリノーゲン関
連物質複合体、LDL−フィブロネクチン複合体およびコ
ラーゲン結合性リポ蛋白を示したものである。

【図３】血中Lｐ（a）濃度と細胞外基質蛋白（コラーゲ
ン）結合性Lｐ（ａ）濃度の関係、血中LDL−コレステロ
ール濃度と動脈硬化性病変に関わる新規なリポ蛋白濃
度、および、LDL−フィブリノーゲン関連物質複合体濃
度とコラーゲン結合性LDL濃度の関係を示したものであ
る。

【図４】健常者血清中のLDL−フィブリノーゲン関連物
質複合体濃度の分布を示したものである。

【図５】健常者、糖尿病患者およびマルチプルリスクフ
ァクター症候群患者血清中のLDL−フィブリノーゲン関
連物質複合体量の比較を示したものである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） // Ｃ１２Ｎ 15/02 Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ｃ Ｆターム(参考） 2G045 BB10 BB14 BB29 BB41 BB46 BB51 DA64 FA29 FB01 FB03 FB07 GC12 JA01 4B024 AA11 BA43 DA02 GA05 HA15 4B064 AG27 CA20 CC24 DA13 4H045 AA11 CA40 DA76 EA50 FA72

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 フィブリノーゲン、フィブロネクチン、
   リポ蛋白（a）、C-reactive protein（CRP）、Serum am
   yloid A（SAA）、Serum amyloid P component（SAP）、
   α２−マクログロブリン、α１−アンチキモトリプシ
   ン、α１−アシドグリコプロテイン、補体成分などの急
   性相反応物質と、 低比重リポ蛋白（ＬＤＬ）、もしくはＬＤＬが酸化変性
   されてなる変性低比重リポ蛋白（変性ＬＤＬ：酸化ＬＤ
   Ｌを含む）との複合体を測定対象とする血液中のＬＤＬ
   もしくは変性ＬＤＬの検出方法。
2. 【請求項２】 酵素免疫法、ラテックス凝集法、免疫発
   光分析法、イムノクロマト法などの免疫学的測定法を用
   いる請求項１に記載のＬＤＬもしくは変性ＬＤＬの検出
   方法。
3. 【請求項３】 抗ヒトフィブリノーゲン抗体と、酵素を
   はじめとする標識物質を標識した抗ヒトＡｐｏＢ抗体な
   どの免疫反応検出試薬を用いる請求項１に記載の動脈硬
   化性病変に関わる新規なリポ蛋白の検出方法。
4. 【請求項４】 抗ヒトフィブロネクチン抗体と、酵素を
   はじめとする標識物質を標識した抗ヒトＡｐｏＢ抗体な
   どの免疫反応検出試薬を用いる請求項１に記載の動脈硬
   化性病変に関わる新規なリポ蛋白の検出方法。
5. 【請求項５】 マウス骨髄腫細胞と、ＬＤＬ／フィブロ
   ネクチン複合体で免疫された哺乳類の脾臓細胞とを融合
   させて得られるハイブリドーマにより産生されるモノク
   ローナル抗体であって、nativeなフィブロネクチンやＡ
   ｐｏＢ（nativeおよび変性ＡｐｏＢ）には反応せず、Ｌ
   ＤＬ／フィブロネクチン複合体を特異的に認識するモノ
   クローナル抗体。