JP4431798B2 - 尿中のアネキシンｖの分析方法及びその利用 - Google Patents

Description

技術分野
本発明は、ヒトおよび哺乳動物の尿中に存在する蛋白質アネキシンＶ（以下尿中のアネキシンＶという）の定性及び定量分析方法並びに定性分析及び定量分析用試薬並びにその利用に関する。
また、本発明は、ヒトおよび哺乳動物の蛋白質アネキシンＶの蛋白質上の抗原決定部位に対し結合特異性を有する抗アネキシンＶモノクローナル抗体およびポリクローナル抗体を用いて、尿中のアネキシンＶを定量分析し、得られた尿中のアネキシンＶの含有量により、例えば、ヒトでは播腫性血管内凝固症候群（ＤＩＣ）や敗血症に複合した腎臓、心臓、肺などの臓器障害の有無を検出し、特に播腫性血管内凝固症候群について早期に診断をすることができる分析方法及び診断薬に関する。
さらに、本発明は、実験的にラットの尿中のアネキシンＶ濃度を測定し、例えば血中濃度が上昇した際の尿中でのアネキシンＶ濃度を測定し、臓器障害の有無を診断することが動物でも可能とする、ヒトおよびラットなどの哺乳動物における尿中アネキシンＶの測定と並びにそれによる播腫性血管内凝固症候群の治療及びその有効な治療剤の開発への利用に関する。
さらにまた、本発明は、ヒトおよび哺乳動物の蛋白質アネキシンＶの蛋白質上の抗原決定部位に対し結合特異性を有する抗アネキシンＶモノクローナル抗体およびポリクローナル抗体を用いて、尿中のアネキシンＶを定量分析し、尿中のアネキシンＶの含有量により、特に、心筋梗塞及び狭心症の診断をする心筋梗塞及び狭心症の診断を行うことができる分析方法及び診断薬に関する。
背景技術
従来、臓器障害の有無を尿中の物質で測定することは、血液、血漿に比べて少ない。その理由は、尿中の各種物質やｐＨが測定系に影響を与えるからである。
本発明において、抗原であるアネキシンＶは、例えば３２〜３５Ｋダルトンの分子量を有する蛋白質であり、ヒトや種々の動物の組織及び細胞に存在するカルシウム結合蛋白質であって、細胞質の可溶成分に存在し、アミノ酸配列によりファミリーを形成しており、現在、アネキシンＩ〜XIIが知られており、また、リン脂質やアクチンとカルシウム濃度に依存して結合し、抗炎症作用及び抗血液凝固作用があることが知られている。
アネキシンファミリーの１メンバーであるアネキシンＶは、肺、心筋、腎臓の順に、その含有量が多く、脳、肝ではその含有量が少ないことが報告されている（文献：Ｈｅａｒｔ Ｖｅｓｓｅｌｓ １９９４ ９：１４８−１５４）。本発明者らは、例えば心筋梗塞では、アネキシンＶは血中に早期に逸脱することから、アネキシンＶの血中濃度の測定は、組織又は細胞が壊死を起こした場合、例えば、心筋梗塞の診断に有効であることを報告し（文献 ＣＣＡ １９９６）、抗アネキシンＶ抗体を使用する血中のアネキシンＶの分析方法を提案した（１９９６年５月２３日国際公開された国際公開第ＷＯ９６／１５１５２号公報参照）。
しかし、アネキシンＶの血中濃度の測定は、採血時に被検者に採血の苦痛を与え、また、採血後、短い時間内に測定しなければならないところ、採血された血液から血漿を分離するのに多くの手間を要して問題とされている。さらに測定段階で、血漿中に含まれる種々の蛋白質とカルシウムイオンの結合を抑制するために、ＥＤＴＡを加えなければならず、その溶液の調整や添加に多くの手間を要して問題とされている。
発明の開示
従来、尿中に含有される各種物質や変動が大きい尿のｐＨにより、測定系が大きな影響を受けるので、臓器障害の有無を尿中の物質で測定することは、血液、血漿に比べて少ないが、本発明者らは、その後の研究で、尿中のアネキシンＶが、尿中において、抗アネキシンＶモノクローナル抗体と、抗原抗体反応により抗原抗体複合体を化学量論的に形成することを発見した。
さらに本発明者らは、その後さらに研究を続けて、このヒトおよび哺乳動物の蛋白質アネキシンＶは、通常、健康人では尿中に２ｎｇ／ｍｌ前後しか存在しないが、臓器障害があり、臓器から逸脱するアネキシンＶ量が多い場合には、血中に出現したアネキシンＶは、尿中にも直ちに出現することを発見した。
さらにまた、本発明者らは、尿中に出現するアネキシンＶの濃度を定量的に測定できれば、逆に臓器障害の有無を診断することが可能となる点に着目し、尿中のアネキシンＶ濃度の測定を続けて、例えば、毛細血管の循環不全などによる臓器障害や腎臓の組織の破壊により、血中のアネキシンＶの濃度の上昇が起こった場合には、尿中にアネキシンＶが増加して来ることになることを発見し、播種性血管内凝固症候群による、例えば、肺、心筋、腎臓などの臓器傷害の程度及びこれらの治療の予後について、尿中のアネキシンＶ濃度の増減により、早期に診断できることを発見した。さらに本発明者らは、急性腎炎においては、尿中のアネキシンＶ濃度の上昇がみられるが、血液中のアネキシンＶ濃度の上昇がみられないことを発見した。
本発明は、測定段階で、検体について、種々の蛋白質とカルシウムイオンの結合の抑制及び検体溶液の調整等のための薬剤の添加等を要することなく、アネキシンＶの測定を簡単に行うことができるアネキシンＶの分析方法及び該分析方法に基づく臓器障害等の診断方法を提供することを目的としている。
即ち、本発明は、尿を抗アネキシンＶモノクローナル抗体と接触させて、尿中のアネキシンＶを抗アネキシンＶモノクローナル抗体と抗原抗体反応させて、アネキシンＶ抗原−抗アネキシンＶモノクローナル抗体複合体を形成し、この形成されたアネキシンＶ抗原−抗アネキシンＶモノクローナル抗体複合体を定量することを特徴とする尿中のアネキシンＶの分析方法にあり、また本発明は、尿を固相に固定されている第一の抗アネキシンＶモノクローナル抗体と接触させて、尿中のアネキシンＶを前記第一の抗アネキシンＶモノクローナル抗体と抗原抗体反応させて、アネキシンＶ抗原−第一の抗アネキシンＶモノクローナル抗体複合体を形成し、この形成された抗体複合体のアネキシンＶ抗原に、抗イヌアネキシンＶポリクローナル標識抗体又は第二の抗アネキシンＶモノクローナル標識抗体を結合させて、前記抗体複合体の抗アネキシンＶポリクローナル又は第二の抗アネキシンＶモノクローナル標識抗体結合体を形成し、この形成された標識抗体結合体を定量することを特徴とする尿中のアネキシンＶの分析方法にあり、さらに本発明は、固相に固定されているヒトアネキシンＶ抗原のタンパク質上の抗原決定部位に対して結合特異性を有する第一の抗ヒトアネキシンＶモノクローナル抗体と、ヒトアネキシンＶ抗原のタンパク質上の抗原決定部位に対して結合特異性を有する第二の抗ヒトアネキシンＶモノクローナル標識抗体又は抗イヌアネキシンＶポリクローナル標識抗体とを備えることを特徴とする尿中のアネキシンＶの分析試薬にある。さらに、本発明は、固相に固定されており、ヒトアネキシンＶ抗原のタンパク質上の抗原決定部位に対して結合特異性を有する第一の抗ヒトアネキシンＶモノクローナル抗体と、ヒトアネキシンＶ抗原のタンパク質上の抗原決定部位に対して結合特異性を有する第二の抗ヒトアネキシンＶモノクローナル標識抗体又は抗イヌアネキシンＶポリクローナル標識抗体を備えることを特徴とする尿による臓器障害の診断薬にある。さらにまた、本発明は、尿中のアネキシンＶの分析試薬と、血液中のアネキシンＶの分析試薬を備えることを特徴とする尿による急性腎炎の診断薬にある。
【図面の簡単な説明】
本発明の実施の態様について、添付の図面を参照して、以下に例を挙げて説明するが、本発明は以下の例示および説明によりなんら限定されるものではない。
図１は、本発明の尿中のヒトアネキシンＶの濃度を測定する一実施例において使用された検量線図であり、微生物の寄託の国際寄託当局（日本国茨城県つくば市東１丁目１番３号所在の通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所）の受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−５２８６の抗アネキシンＶモノクローナル抗体産生ハイブリドーマ細胞系クローンＨＤＡ−９０７により産生された抗アネキシンＶモノクローナル抗体のＨＲＰＯ標識抗体と、前記微生物の寄託の国際寄託当局の受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−５２８４の抗ヒトアネキシンＶモノクローナル抗体産生ハイブリドーマ細胞系クローンＨＣＡ−６２７により産生された抗ヒトアネキシンＶモノクローナル抗体の固相との組み合わせによるエライザ法により、尿中のヒトアネキシンＶの濃度を測定した際に使用された検量線図である。
本図において、縦軸に主波長４９２ｎｍの吸光度値から副波長６９０ｎｍの吸光度値を差し引いた吸光度を示し、横軸にネイテイブヒトアネキシンＶ濃度を示しており、○印は４回測定における差吸光度の平均値を示し、○印の上下に延びる線の長さは平均値±２ＳＤの値を示す。
図２は、本発明の尿中のヒトアネキシンＶの濃度を測定する一実施例において使用された検量線図であり、抗イヌアネキシンＶポリクローナルのＨＲＰＯ標識抗体と、前記微生物の寄託の国際寄託当局の受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−５２８４の抗ヒトアネキシンＶモノクローナル抗体産生ハイブリドーマ細胞系クローンＨＣＡ−６２７により産生された抗ヒトアネキシンＶモノクローナル抗体の固相との組み合わせによるエライザ法により、尿中のヒトアネキシンＶの濃度を測定した際に使用された検量線図である。
本図において縦軸に主波長４９２ｎｍの吸光度値から副波長６９０ｎｍの吸光度値を差し引いた差吸光度の値を示し、横軸にヒトアネキシンＶの濃度値を示しており、□印は差吸光度の平均値を示し、□印の上下に延びる線の長さは平均値±２ＳＤの値を示す。
発明を実施するための最良の形態
本発明において、アネキシンＶ蛋白質、即ち抗原蛋白質のアネキシンＶは、抗原蛋白質のアネキシンＶが存在する組織又は細胞から精製することができ、例えば、ヒト屍体の心臓組織から、結合組織及び脂肪などを除去し精製することができる。
本発明において、抗アネキシンＶモノクローナル抗体は、抗原蛋白質のアネキシンＶで免疫されたマウス等の他の動物種のリンパ系器官から取り出されたリンパ球の形質芽細胞球とミエローマ細胞とを融合させて、ハイブリドーマ細胞を形成し、この形成されたハイブリドーマ細胞を、例えばＨＡＴ培地を使用して培養することにより得ることができる。
本発明における抗アネキシンＶモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞系としては、例えば、国際出願（国際出願番号：ＰＣＴ／ＪＰ ９５／０２３０５（国際公開番号：ＷＯ９６／１５１５２））により開示され、微生物の寄託の国際寄託当局（日本国茨城県つくば市東１丁目１番３号所在の通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所）に、平成７年１１月６日に国際寄託された受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−５２８４のハイブリドーマ細胞系、及び同じく前記微生物の寄託の国際寄託当局（前記通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所）に、平成７年１１月７日に国際寄託された受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−５２８６のハイブリドーマ細胞系の二つのハイブリドーマ細胞系がある。本発明における抗アネキシンＶモノクローナル抗体は、これらのハイブリドーマ細胞系を夫々選択的に増殖することにより得ることができる。
本発明において、前記抗アネキシンＶモノクローナル抗体は、前記ハイブリドーマ細胞クローンを、通常の培養方法、例えば高密度培養方法又はスピンナーフラスコ培養方法等による培養し、その培養上清より、プロテインＡ結合担体又は抗マウスイムノグロブリン結合担体を用いたアフィニティークロマトグラフィーにより精製することにより得ることができる。
本発明において、ハイブリドーマ細胞系とは、細胞融合されたハイブリドーマ細胞はもとより、初代培養以後のハイブリドーマ細胞を意味する。
前記ヒト由来の抗アネキシンＶモノクローナル抗体を得るのと同様な方法で、イヌ等の哺乳動物のアネキシンＶ抗原を、哺乳動物に免疫し、このリンパ細胞とミエローマ細胞を融合させて、ハイブリドーマ細胞系を得ることにより、イヌ等の哺乳動物のアネキシンＶ抗原の抗原決定部位に対し特異的反応性を有する、イヌ等の哺乳動物由来の抗アネキシンＶモノクローナル抗体を得ることができる。本発明において、抗アネキシンＶモノクローナル抗体は、前記ヒト由来の抗アネキシンＶモノクローナル抗体以外に、これら哺乳動物由来の抗アネキシンＶモノクローナル抗体を意味する。
本発明において、エライザ法によるヒトの尿中アネキシンＶ濃度測定に、例えば固相に固定されて、１次抗体として用いられる抗ヒトアネキシンＶモノクローナル抗体は、例えば、前記国際寄託された受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−５２８４のハイブリドーマ細胞系、及び同じく前記国際寄託された受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−５２８６のハイブリドーマ細胞系の二つのハイブリドーマ細胞系を夫々培養することにより得ることができる。
また、前記ハイブリドーマ細胞系により製造される二つの抗ヒトアネキシンＶモノクローナル抗体は、エライザ法によるヒトの尿中アネキシンＶ濃度の測定において、一方の抗体が１次抗体として使用されるときは、他方の抗体は、標識抗体化されて、２次抗体として使用することができる。
エライザ法によるヒトの尿中アネキシンＶ濃度の測定において、主として、標識抗体として、即ち２次抗体として用いられるポリクローナル抗体は、例えば、前記国際出願（国際出願番号：ＰＣＴ／ＪＰ ９５／０２３０５（国際公開番号：ＷＯ９６／１５１５２）により開示された抗イヌ３２ＫＰポリクローナル抗体・Ｆａｂ’−ＨＲＰＯ標識抗体（以下、抗アネキシンＶポリクローナルＨＲＰＯ標識抗体という）である。
本発明は、尿を抗アネキシンＶモノクローナル抗体と接触させて、尿中のアネキシンＶを抗アネキシンＶモノクローナル抗体と抗原抗体反応させて、アネキシンＶ抗原−抗アネキシンＶモノクローナル抗体複合体を形成し、この形成されたアネキシンＶ抗原−抗アネキシンＶモノクローナル抗体複合体を定量するので、細胞から逸脱した蛋白質のアネキシンＶを、排泄された尿を採取して、エライザ法により簡単に測定することができ、狭心症及び心筋梗塞などの臓器障害はもとより、播種性血管内凝固症候群や敗血症に複合した腎臓、心臓、肺などの臓器障害の有無を、特に早期に簡単に診断することができる。この尿中のアネキシンＶの測定値の変動を、血液中のアネキシンＶの測定値の変動と対比して、急性腎炎の診断に使用することができる。
実施例
以下の実施例において、記号Ｍはモル濃度を意味し、混合物溶液においては、各Ｍ（モル濃度）は混合物溶液１リットル中のモル濃度を意味する。
例１．ハイブリドーマの作製方法
（１）ヒトアネキシンＶの精製
ヒト成人の屍体から心臓を摘出し、血液を除いた後、左心室心臓を取出し、結合組織及び脂肪を取り除いた。これらの操作は、氷上又は４℃の温度下で行われた。この心臓に、心臓１重量部につき１０重量部の、即ち重量で１０倍量の次の組成：
濃度２５０ｍＭ（ミリモル）のスクロース、
濃度０．５ｍＭのエチレングリコールビス（２−アミノエチルエーテル）四酢酸塩（ＥＧＴＡ）、
濃度１ｍＭのフェニルメタンスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）、及び
濃度１０ｍＭのトリス（トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン）ＨＣｌ、ｐＨ７．４
の緩衝液Ａを加えて、ホモジナイザーによりホモジナイズし、このホモジネートを３０００×ｇで１５分間遠心分離した。この分離された上清に、上清の最終濃度が２ｍＭになるように、濃度１ＭのＣａＣｌ₂溶液を加えて混合し、この混合後、２８，０００×ｇで、１時間遠心分離し、その沈殿に、濃度１０ｍＭのＥＤＴＡを２ｍｌ加えて、該沈殿を懸濁させた。この沈殿の懸濁液を２８，０００×ｇで１時間遠心分離した。
この上清を、ゲル濾過カラムのファーマシア（Pharmacia）社製のセファクリル（Sephacryl）Ｓ−３００（商品名）にかけて、濃度０．１ＭのＮａＣｌ及び濃度３０ｍＭのトリスＨＣｌを含むｐＨ７．４の緩衝液Ｂで溶出した。分子量が３５Ｋダルトン（Ｄａ）の蛋白質を含む画分を集めて、陰イオン交換カラム（バイオゲルアガロース：商品名）にかけ、濃度０乃至０．３Ｍの濃度範囲内のＮａＣｌを含有する濃度１０ｍＭのトリス塩酸溶液（ｐＨ：７．４）を溶離液として、ＮａＣｌ濃度に段階的に勾配をかけてグラジエント溶離することにより分離精製した。
このようにして精製されたヒトアネキシンＶは、凍結乾燥の後、濃度０．１Ｍのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．６）で溶解し、４℃で保存した。この精製ヒトアネキシンＶについては、ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）により純度を測定し、蛋白濃度を定量した。
また、このようにして精製された抗原蛋白質ヒトアネキシンＶを同定するために、リシルエンドペプチダーゼを加え、３７℃の温度下で、１５時間放置し、蛋白質ヒトアネキシンＶとリシルエンドペプチダーゼの反応により得られたペプチドを、島津製作所製ＰＰＳＱ−１０プロテインシークエンサー（protein sequencer）を使用して、エドマン法（Ｅｄｍａｎ Ｐ．著『Ａ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｔｈｅ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｉｎ ｐｅｐｔｉｄｅｓ』Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．、１９４９年発行、第２２巻、第４７５頁参照）によるアミノ酸配列分析を行い、二つのペプチド部分のアミノ酸配列を求めた。
前記精製された蛋白質のペプチドの二つの部分のアミノ酸配列は、一方が、Ｎ末端から、Ｇｌｕ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕのアミノ酸配列であり、他方が、Ｎ末端から、Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ｔｈｒ−Ｉｌｅ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒであるところから、アネキシンＶと同定した。
（２）免疫方法
上記例１で調製した精製ヒトアネキシンＶを１００μｇ／０．５ｍｌ取り、これに前記精製ヒトアネキシンＶと同量のフロイント完全アジュバント（Freund’s complete adjuvant）を混合して乳化した。この乳化状のヒトアネキシンＶを抗原として、５週令の４匹の雌のＢＡＬＢ／ｃマウスの腹腔に、精製ヒトアネキシンＶが１匹あたり１５〜４０μｇとなるように投与し、この投与を、２週間毎に、２カ月間続けて行いマウスを免疫した。この免疫の後、マウスの抗体価を測定し、抗体価の高いマウスを選んで、さらに３週間後に、精製ヒトアネキシンＶの５０μｇをマウス尾静脈より追加投与して最終免疫した。
（３）細胞融合
最終免疫から３日後に、ＢＡＬＢ／ｃマウスの摘脾を行い、この摘出した脾細胞をＥＭＥＭ培養液中に浮遊させて、脾細胞の浮遊液を作製した。ついで、この脾細胞をＥＭＥＭ培養液（日水社製）で４回洗浄した後、細胞数を算定した。得られた脾細胞の生細胞数は、７×１０⁸個であった。
細胞融合は、２−アミノ−６−オキシ−８−アザプリン（８−アザグアニン）（2-amino-6-oxy-8azapuraine（8-Azaguanine））耐性のＢＡＬＢ／ｃマウス骨髄腫由来の培養細胞株（Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８・６５３、以下、Ｘ６３細胞という）を親細胞株として用いた。
Ｘ６３細胞は、対数増殖期のＸ６３細胞を用い、非働化したウシ胎児血清（fetal calf serum）（インタジェン（Intergen）社製）（以下、ＦＣＳという）を濃度１０％で含むＲＰＭＩ−１６４０培養液（濃度２０μｇ／ｍｌで８−アザグアニン含有）（ギブコ（GIBCO）社製）で継代培養した。細胞融合の３日前より８−アザグアニンを含有しない濃度１０％のＦＣＳ含有ＲＰＭＩ−１６４０培養液でさらに培養した。この場合も、対数増殖期の細胞を用いた。Ｘ６３細胞はＲＰＭＩ−１６４０培養液で３回洗浄した後、細胞数を算定した。得られたＸ６３細胞の生細胞の細胞数は７×１０⁷個であった。
シグマ（Shigma）社製のポリエチレングリコールー４０００を、ＲＰＭＩ−１６４０培養液で、濃度が５０％（Ｗ／Ｖ）となるように溶解して、細胞融合に使用した。
脾細胞とＸ６３細胞の比が１０：１となるように、脾細胞とＸ６３細胞を混合し、１５００ｒｍｐの回転数で５分間遠心分離して、上清を除去し、細胞のペレットをよくほぐし、細胞融合に使用した。細胞融合は、前記調製の、３７℃に保温したポリエチレングリコールを用いて、ケーラー及びミルシュタイン共著：ネイチュア（Nature）第２５６巻、第４９５−４９７頁，１９７５年及びヨーロピアン ジャーナル オブ イムノロジ（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ）第６巻、第５１１−５１９頁，１９７６年）の方法により行われた。
ハイブリドーマが形成された細胞融合後の細胞系は、１０％濃度のＦＣＳを添加したＲＰＭＩ−１６４０培養液に濃度１×１０^-4Ｍのヒポキサンチン、濃度４×１０^-7Ｍのアミノプテリン及び濃度１．６×１０^-5Ｍのチミジンが含有されているＨＡＴ選択培地に、脾細胞が２．０×１０⁶個／ｍｌとなるように浮遊させた。ついで、この細胞浮遊液を５０μｌ宛、９６穴ウエルのマイクロテストプレートの各ウエルに分注した後、ＣＯ₂無菌培養器において、温度３７℃、湿度９５％、８％濃度のＣＯ₂雰囲気で培養を行った。
（４）スクリーニング
培養開始後、１日目と２日目に、ＨＡＴ培地を各ウエルに１滴ずつ添加し、また培養開始後７日目と９日目に、ＨＡＴ培地を各ウエルに２滴ずつ添加してさらに培養を行った。その後、ＨＡＴを含まない培養液で育成させた。培養開始後１０日目に、細胞のクローンが出現した。培養開始後約１０日乃至１３日後に、細胞のクローンが出現した前記ハイブリドーマ細胞系の各ウエルの培養上清５０μｌと、ヒトアネキシンＶ抗原液（１００ｎｇ／ｍｌ）５０μｌとを、マイクロタイタープレートのＵボトムに入れ、さらにこのマイクロタイタープレートのＵボートに、抗マウスイムノグロブリン抗体を結合させたセファロース４Ｂの２０％懸濁液を５０μｌ加えて、室温で１時間撹拌し、撹拌後１０分間静置した。静置後、抗マウスイムノグロブリン抗体結合セファロース４Ｂがウェルの底に完全に沈むのを確認して、その上清５０μｌを採取して該上清中に残存するヒトアネキシンＶ抗原蛋白質の濃度を、アネキシンＶ−エライザ（ELISA）法で測定して、前記国際寄託された受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−５２８４のハイブリドーマ細胞株クローンＨＣＡ−６２７及び受託番号 ＢＰ−５２８６のハイブリドーマ細胞株クローンＨＤＡ−９０７を得た。
これらの得られた国際寄託された受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−５２８４のハイブリドーマ細胞株、クローンＨＣＡ−６２７及び前記国際寄託された受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−５２８６のハイブリドーマ細胞株、クローンＨＤＡ−９０７から産生される抗アネキシンＶモノクローナル抗体は、何れもヒトアネキシンＶ及びイヌアネキシンＶに対し特異性を有するものであることが確認された。
（５）ヒトアネキシンＶ測定用分析系
（ｉ）抗ヒトアネキシンＶモノクローナル抗体のＨＲＰＯ標識抗体の調製
（Ａ）抗ヒトアネキシンＶモノクローナル抗体Ｆ（ａｂ′）₂の調製
前記国際寄託された受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−５２８４のハイブリドーマ細胞株クローンＨＣＡ−６２７及び前記国際寄託された受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−５２８６のハイブリドーマ細胞株クローンＨＤＡ−９０７からのアネキシンＶモノクローナル抗体のＩｇＧ画分を標識に用いるために、各抗ヒトアネキシンＶモノクローナル抗体１０ｍｇを、遠心分離機型濃縮器（セントリコン（Centricon）１０（アミコン社製））を用いて、容量が１ｍｌになるように、遠心濾過により濃縮した。次いで、濃縮された抗体を、濃度０．２ＭのＮａＣｌを含む濃度０．１Ｍの酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．０）を溶媒にして透析した。
この透析されたＩｇＧ溶液に、濃度０．２ＭのＮａＣｌを含む濃度０．１Ｍの酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．０）に溶解したペプシン（シグマ社製）溶液を、ペプシンがＩｇＧ量の４％になるように添加し、３７℃の温度下で、６乃至１６時間反応させた。反応終了後、濃度０．１Ｍのホウ酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．０）で平衡化されている、直径１．６ｃｍで、長さ６３ｃｍの平衡ゲル濾過用のセファデックス（Sephadex）Ｇ−１５０カラム（ファルマシア社製）を用いて、分子篩クロマトグラフィーにより、抗ヒトアネキシンＶモノクローナル抗体のＦ（ａｂ’）₂のフラグメントを得た。
（Ｂ）抗ヒトアネキシンＶモノクローナルＦａｂ’−ＳＨの調製
前記例１の（５）の（Ａ）により調製した抗ヒトアネキシンＶモノクローナル抗体Ｆ（ａｂ’）₂フラグメントを、さらに、遠心分離機型濃縮器のセントリコン１０を用いて、遠心分離により濃縮し、抗ヒトアネキシンＶモノクローナル抗体Ｆ（ａｂ’）₂フラグメントの濃縮画分を調製した。
この濃縮画分１ｍｌに、濃度１００ｍＭの２−メルカプトエチルアミン塩酸塩（キシダ化学社製）溶液を０．１ｍｌ添加し、３７℃で９０分反応させた。反応終了後、濃度１ｍＭのＥＤＴＡを含む濃度０．１Ｍのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）で平衡化した、直径１．６ｃｍ、長さ２０ｃｍの平衡ゲル濾過用のセファデックス（Sephadex）Ｇ−２５カラム（ファルマシア社製）を用いて、Ｆａｂ’−ＳＨフラクションを分画精製し、遠心分離機用濃縮器セントリコン１０を用いて、容量が１ｍｌになるように遠心分離により濃縮し、クローンＨＣＡ−６２７及びクローンＨＤＡ−９０７の抗ヒトアネキシンＶモノクローナル抗体Ｆａｂ’−ＳＨフラクション濃縮画分を調製した。
（Ｃ）ＨＲＰＯマレイミドの調製方法
一方、ＨＲＰＯ（ワサビ大根のペルオキシダーゼ）（ベーリンガー社製）を、蛋白質量として１０ｍｇ秤量し、濃度０．１Ｍのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）の１ｍｌに溶解した。この溶液に、最終濃度が２５ｍｇ／ｍｌになるように、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）（キシダ化学社製）に、Ｎ−ヒドロキシサクシニイミドエステル（N-Hydroxysuccinimide ester）（ジーベンケミカル社製）を溶解した溶液の１００μｌを添加し、３０℃で６０分間反応させることによって、ＨＲＰＯをマレイミド化した。この反応後、溶液を３０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、その上清を、濃度０．１Ｍのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）で平衡化した、直径１．６ｃｍ、長さ２０ｃｍの平衡ゲル濾過用セファデックス（Sephadex）Ｇ−２５カラム（ファルマシア社製）を用いて、ＨＲＰＯマレイミドを精製した。このＨＲＰＯマレイミドの精製画分を、さらに遠心分離機型濃縮器のセントリコン１０を用いて、遠心分離により濃縮し、ＨＲＰＯマレイミド濃縮画分を調製した。
（Ｄ）抗ヒトアネキシンＶモノクローナルＦａｂ’−ＨＲＰＯ標識抗体の調製方法
前記例１の（５）の（Ｂ）により得られた抗ヒトアネキシンＶモノクローナル抗体Ｆａｂ’−ＳＨの濃縮画分と、前記例１の（４）の（Ｃ）により得られたＨＲＰＯマレイミドの画分とを、モル比で１：１となるように混合し、４℃の温度下で１５ないし２４時間反応させた。反応後、２−メルカプトエチルアミン塩酸塩を反応液中に２ｍＭの濃度になるように添加し、３７℃の温度下で２０分間反応することによって、未反応のＨＲＰＯマレイミドのブロックを行った。次に、濃度０．１５ＭのＮａＣｌ及び濃度２．５ｍＭのＥＤＴＡを含む濃度２０ｍＭのリン酸ナトリウムークエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．６）で平衡化した、直径１．６ｃｍ及び長さ６５ｃｍのウルトロゲル（Ultrogel）ＡＣＡ４４カラム（ファルマシア社製）を用いた分子篩ゲルクロマトグラフィにより、未反応の抗ヒトアネキシンＶモノクローナル抗体Ｆａｂ’−ＳＨ及びＨＲＰＯマレイミドを除去し、抗ヒトアネキシンＶモノクローナルＦａｂ’−ＨＲＰＯ標識抗体（以下、抗ヒトアネキシンＶモノクローナルＨＲＰＯ標識抗体という）の精製を行った。
（ii）ＨＲＰＯ標識抗イヌアネキシンＶポリクローナル抗体の調製
（Ａ）抗イヌポリクローナル抗体ＩｇＧの画分の調製
イヌ心筋由来の精製アネキシンＶ抗原を免疫して得られたウザギ抗イヌアネキシンアネキシンＶポリクローナル抗血清３ｍｌに等量のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を加え、無水硫酸ナトリウムを最終濃度２０％になるように撹拌しながら加えた後、室温でさらに１時間撹拌した。次に、１２，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、得られた沈殿画分を約３ｍｌのＰＢＳで溶解した。この溶液を、濃度２０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）を溶媒にして透析した。透析終了後、透析された溶液を、濃度２０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化した、直径１．５ｃｍ及び長さ６ｃｍのＤＥＡＥセルロースＤＥ−５２カラム（ワットマン社製）を用いたイオン交換クロマトグラフィーにかけて、抗イヌアネキシンＶポリクローナル抗体のＩｇＧ画分の精製を行った。３ｍｌの抗イヌアネキシンＶポリクローナル抗体抗血清より精製ＩｇＧ画分が１３ｍｇ得られた。
（Ｂ）抗イヌアネキシンＶポリクローナル抗体Ｆ（ａｂ’）₂の調製
抗イヌアネキシンＶポリクローナル抗体の精製ＩｇＧ画分を標識用に用いるために、該抗体１２ｍｇを、遠心分離機用濃縮器のセントリコン１０（アミコン社製）を用いて、容量が１ｍｌに濃縮した後、濃度０．２ＭのＮａＣｌを含む濃度０．１Ｍの酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．５）を溶媒にして透析した。
この透析により得られた抗体溶液に、濃度０．２ＭのＮａＣｌを含む濃度０．１Ｍの酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．５）に溶解したペプシン（シグマ社製）を、ＩｇＧ量に対して４％になるように添加し、３７℃で１６時間反応させた。反応終了後、濃度０．１Ｍのホウ酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．０）で平衡化した直径１．６ｃｍ及び長さ６５ｃｍの平衡ゲル濾過用セファデックスＧ−１５０カラム（ファルマシア社製）を用いた分子篩クロマトグラフィーにより、該抗体のＦ（ａｂ’）₂のフラクションを分画し精製した。得られたフラクションを、濃度１ｍＭのＥＤＴＡを含む濃度０．１Ｍのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）を溶媒にして透析した。透析後この透析された溶液を、遠心分離機用濃縮器のセントリコン１０を用いて、容量が１ｍｌになるように遠心分離により濃縮した。この濃縮液を、抗イヌアネキシンＶポリクローナル抗体Ｆ（ａｂ’）₂としての標識抗体の作製に用いた。このようにして得られた１２ｍｇの抗イヌアネキシンＶポリクローナル抗体のＩｇＧ画分より、約７ｍｇのＦ（ａｂ’）₂画分を調製した。
（Ｃ）抗イヌアネキシンＶポリクローナルＦａｂ’−ＳＨの調製方法
前記例１の（５−２）の（Ｂ）の方法で調製した抗イヌポリクローナル抗体Ｆ（ａｂ’）₂画分の濃度７ｍｇ／１ｍｌの溶液に、濃度１００ｍＭの２−メルカプトエチルアミン塩酸塩（キシダ化学社製）溶液を０．１ｍｌ添加し、３７℃で９０分反応させた。反応終了後、濃度１ｍＭのＥＤＴＡを含む濃度０．１Ｍのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）で平衡化した直径１．６ｃｍ及び長さ２０ｃｍの平衡ゲル濾過用セファデックスＧ−２５カラム（ファルマシア社製）を用い、Ｆａｂ’−ＳＨフラクションを精製し、遠心分離機用濃縮器１０を用いて容量が１ｍｌになるように遠心分離により濃縮して、抗イヌアネキシンＶポリクローナル抗体Ｆａｂ’−ＳＨ濃縮画分を調製した。該抗体７ｍｇのＦ（ａｂ’）₂より、６．１ｍｇのＦａｂ’−ＳＨ画分を得た。
（Ｄ）抗イヌアネキシンＶポリクローナルＦａｂ’−ＨＲＰＯ標識抗体の調製方法
このようにして得られた抗イヌアネキシンＶポリクローナル抗体Ｆａｂ’−ＳＨ画分と、前記例１の（５−１）の（Ｃ）で調製したＨＲＰＯマレイミド画分とを、モル比で１：１となるように混合し、４℃の温度下で１５ないし２４時間反応させた。その後、２−メルカプトエチルアミン塩酸塩を反応液中に２ｍＭの濃度になるように添加し、３７℃の温度下で２０分間反応することによって、未反応のＨＲＰＯマレイミドのブロックを行った。次に、濃度０．１５ＭのＮａＣｌ及び濃度２．５ｍＭのＥＤＴＡを含む濃度２０ｍＭのリン酸ナトリウムークエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．６）で平衡化した、直径１．６及び長さ６５ｃｍのウルトロゲル（Ultrogel）ＡＣＡ４４カラム（ファルマシア社製）を用いたゲルクロマトグラフィにより、未反応の抗イヌアネキシンＶポリクローナル抗体Ｆａｂ’−ＳＨ及びＨＲＰＯマレイミドを除去し、抗イヌアネキシンＶポリクローナルＦａｂ’−ＨＲＰＯ標識抗体（以下、イヌＨＲＰＯ標識抗体という）の精製を行った。
（iii）ＨＲＰＯの活性測定法
前記抗ヒトアネキシンＶモノクローナルＨＲＰＯ標識抗体及びイヌＨＲＰＯ標識抗体の夫々のＨＲＰＯ酵素活性の測定は、濃度０．２％のフェノール、濃度０．５ｍＭの過酸化水素及び濃度０．１５ｍｇ／ｍｌの４−アミノアンチピリンを含む濃度０．１Ｍのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）２．９８ｍｌにＨＲＰＯ標識抗体２０μｌを加えて、合計３．０ｍｌとし、３７℃の温度下で５分間反応させ、波長４９２ｎｍ及び波長６９２における吸光度を、夫々、レート法（Rate Assay）による二波長測光法により測定する。１分間当たりの波長４９２ｎｍ及び波長６９２における吸光度の差（ΔＡｂｓ）を測定することによりＨＲＰＯ活性を求めることができる。
（iv）固相調製法
抗ヒトアネキシンＶモノクローナル抗体固相の調製
ヒトアネキシンＶ測定用エライザ法を用いる固相用のモノクローナル抗体は、クローンＨＣＡ−６２７及びクローンＨＤＡ９０７ののＩｇＧ画分を精製した。この各抗ヒトアネキシンＶモノクローナル抗体のＩｇＧ画分を、０．１％濃度のアジ化ナトリウムを含む濃度０．１Ｍのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．５）を用いて３０μｇ／ｍｌの濃度に調製し、エライザ法用マイクロタイタープレート（ヌンク社製）の各ウエルに１００μｌずつ分注し、４℃の温度下で一晩感作した。次に、このマイクロタイタープレートの各ウエルを、界面活性剤Ｔｗｅｅｎ２０を０．０５％濃度で含むリン酸緩衝生理緩衝液（ＰＢＳ）を洗浄液として使用して、３回洗浄し、１％濃度でＢＳＡを含むＰＢＳ（ブロッキング液）を各ウエルに３００μｌ分注した後、４℃の温度下でさらに一晩ブロッキングし、抗ヒトアネキシンＶモノクローナル抗体感作抗体プレート（以下、抗ヒトアネキシンＶモノクローナル抗体プレートという）を調製した。
例２
例１の（５）−（iv）に示したように調製した前記ハイブリドーマ細胞系クローンＨＣＡ−６２７により産生された抗ヒトアネキシンＶモノクローナル抗体固相プレートのブロッキング液を捨て、濃度１％のＢＳＡ、濃度０．１５ＭのＮａＣｌ及び濃度５ｍＭのＥＤＴＡを含む濃度１０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）１００μｌを各ウエルに分注した後、採取した尿中のヒトアネキシンＶ抗原を、１．５６２５ｎｇ／ｍｌ、３．１２５ｎｇ／ｍｌ、６．２５ｎｇ／ｍｌ、１２．５ｎｇ／ｍｌ、２５ｎｇ／ｍｌ、５０ｎｇ／ｍｌ及び１００ｎｇ／ｍｌとなるように調製し、夫々、標準抗原液を、各ウエルに２０μｌずつ加え混和し、室温で１時間反応させた。
反応後、各ウエルを洗浄液で３回洗浄した。この洗浄された各ウエルに、至適濃度に調製した前記クローンＨＤＡ−９０７の抗ヒトアネキシンＶモノクローナルＦａｂ’−ＨＲＰＯ標識抗体を各々１００μｌずつ各ウエルに添加し、室温で３０分間反応させた。反応後、各ウエルを洗浄液で６回洗浄した。次に、濃度０．１Ｍのリン酸クエン酸緩衝液に、ｏ−フェニレンジアミンを２ｍｇ／ｍｌの濃度で含み、また濃度４ｍＭのＨ₂Ｏ₂を含むＯＰＤ基質溶液を１００μｌ加えて、３０分間反応させた後、濃度２ＮのＨ₂ＳＯ₄溶液を各ウエルに１００μｌずつ加えて反応を止め、主波長４９２ｎｍ，副波長６９０ｎｍとして、エライザ用プレートリーダーにより、二波長測光法により吸光度の差を測定した。
二波長法による吸光度の差、即ち差吸光度は、主波長４９２ｎｍの吸光度より副波長６２９ｎｍの吸光度を差し引くことにより求めた。尿中のヒトアネキシンＶ抗原濃度と差吸光度の関係を示す検量線を図１に示す。
図１に示す検量線は、クローンＨＣＡ−６２７の抗ヒトアネキシンＶモノクローナル抗体及びクローンＨＤＡ−９０７の抗ヒトアネキシンＶモノクローナルＨＲＰＯ標識抗体によるエライザ法による尿中のヒトアネキシンＶ標準抗原濃度に対する二波長法による差の吸光度を、尿標準液のアネキシンＶ濃度毎にプロットして作成されたものであり、差吸光度は、尿中のヒトアネキシンＶ抗原濃度に依存し良好であった。この検量線は、ヒトアネキシンＶの濃度に依存して吸光度が上昇し、１００ｎｇ／ｍｌの濃度までほぼ直線を示す良好な検量線である。
この検量線を用いることにより尿検体中のアネキシンＶ濃度を正確に読み取ることができる。また、図１からも明らかなように尿中のヒトアネキシンＶ濃度は、１ｎｇ／ｍｌの低い濃度値においても再現性が良く、その濃度を測定することができ、尿中のアネキシンＶ濃度測定用エライザ系に充分応用可能である。
例３
ＨＣＡ−６２７株により産生された抗ヒトアネキシンＶモノクローナル抗体は、ヒトアネキシンＶ、イヌアネキシンＶ、ラットアネキシンＶ及びウシアネキシンＶに対し特異性を有している。
本実施例においては、ハイブリドーマ細胞系クローンのＨＣＡ−６２７株により産生された抗ヒトアネキシンＶモノクローナル抗体と抗イヌアネキシンＶポリクローナル抗体との組み合わせによるエライザ法により、尿中のヒトアネキシンＶの濃度測定を行った。
ハイブリドーマ細胞系ＨＣＡ−６２７から産生した抗ヒトアネキシンＶモノクローナル抗体の３０μｇ／ｍｌの１００μｌを個々のウエルに分注して、該抗ヒトアネキシンＶモノクローナル抗体の固相ウエルを形成する。
この固相ウエルに１０ｍＭの０．１Ｍ濃度のリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．５）、０．１５ＭのＮａＣｌ、１％濃度のＢＳＡ、５ｍＭのＥＤＴＡ及び４５６ｍｇの硫酸ゲンタマイシンを含有し、ｐＨ７．０の反応緩衝液を１００μｌ分注する。
反応緩衝液が分注された固相ウエルに、標準液２０μｌを分注する。本例において、標準液としては、採取した尿中のヒトアネキシンＶ抗原標準液が使用された。
標準液分注後、室温において、１時間撹拌して、各ウエル内で抗原抗体反応を行わせる。この抗原抗体反応時間が経過したところで、洗浄液で４回洗浄する。洗浄後、この洗浄された各ウエルに、夫々、イヌＨＲＰＯ標識抗体（反応緩衝液１ｍｌ当たり１００ｍＵ）を１００μｌ加え、室温において、３０分間撹拌して抗原抗体反応を行わせる。この抗原抗体反応時間が経過したところで、洗浄液で８回洗浄する。洗浄後、この洗浄された各ウエルに、夫々ＯＰＤ基質溶液（０．１Ｍのリン酸クエン酸緩衝液に、ｏ−フェニレンジアミンを２ｍｇ／ｍｌ及び４ｍＭのＨ₂Ｏ₂を含む）を１００μｌ加えて、３０分間反応させた後、濃度２ＮのＨ₂ＳＯ₄溶液を各ウエルに１００μｌずつ加えて発色反応を止め、主波長４９２ｎｍ，副波長６９０ｎｍとして、エライザ用プレートリーダーにより、二波長測光法により吸光度の差を測定した。
抗ヒトアネキシンＶモノクローナル抗体ＨＣＡ−６２７及びイヌＨＲＰＯ標識抗体によるエライザ法による尿中のヒトアネキシンＶ標準抗原濃度に対する二波長法による差の吸光度を、尿標準液のアネキシンＶ濃度毎にプロットして検量線を作成した。ここで得られた検量線は、尿中のヒトアネキシンＶ抗原濃度に依存し良好であり、その検量線を図２に示す。
例４
本実施例は、前記例２について、標準液を採取尿に代えて、尿中のアネキシンＶ濃度の測定を行うものである。差吸光度は、主波長４９２ｎｍの吸光度より副波長６９０ｎｍ吸光度を差し引くことにより求められており、図１に示す検量線に基づいて、尿検体中のアネキシンＶ濃度が求められた。
本例において、前記国際寄託された受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−５２８４のハイブリドーマ細胞系クローンＨＣＡ−６２７の培養上清から得られる抗ヒトアネキシンＶモノクローナル抗体が固相に固定されたタイタープレートが使用された。本例において、尿中のアネキシンＶの測定は、前記クローンＨＣＡ６２７由来の抗ヒトアネキシンＶモノクローナル抗体及び前記クローンＨＤＡ−９０７由来の抗ヒトアネキシンＶモノクローナル抗体Ｆａｂ’−ＨＲＰＯ標識抗体によるエライザ法により行われた。このエライザ法は、尿検体のｐＨが５乃至８で測定可能であった。尿中のアネキシンＶを測定する場合には、Ｃａ²⁺の結合を抑制するためのＥＤＴＡ等のキレート剤の尿への添加による尿の前処理は不要である。
前記抗ヒトアネキシンＶモノクローナル抗体固相プレートのブロッキング液を捨て、濃度１％のＢＳＡ、濃度０．１５ＭのＮａＣｌ及び濃度５ｍＭのＥＤＴＡを含む濃度１０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）１００μｌを各ウエルに分注した後、採取された尿についての尿中のアネキシンＶの測定が、採取された尿検体２０μｌを、抗ヒトアネキシンＶモノクローナル抗体が固相に固定されたタイタープレートの各ウエルに分注して行われた。
採取された尿検体分注後、室温において、１時間撹拌して、各ウエル内で抗原抗体反応を行わせた。この抗原抗体反応時間が経過したところで、洗浄液で３回洗浄した。この洗浄された各ウエルに、至適濃度に調製した前記クローンＨＤＡ−９０７抗ヒトアネキシンＶモノクローナル抗体Ｆａｂ’−ＨＲＰＯ標識抗体を各々１００μｌずつ各ウエルに添加し、室温で３０分間反応させた。反応後、各ウエルを洗浄液で６回洗浄した。次に、濃度０．１Ｍのリン酸クエン酸緩衝液に、ｏ−フェニレンジアミンを２ｍｇ／ｍｌの濃度で含み、また濃度４ｍＭのＨ₂Ｏ₂を含むＯＰＤ基質液を１００μｌ加えて、３０分間反応させた後、濃度２ＮのＨ₂ＳＯ₄溶液を各ウエルに１００μｌずつ加えて発色反応を止め、主波長４９２ｎｍ，副波長６９０ｎｍとして、エライザ用プレートリーダーにより、二波長測光法により吸光度の差を測定した。この差吸光度により、図１に示す検量線に基づいて、尿検体中のアネキシンＶ濃度が求められた。
例５
本実施例は、前記例３について、標準液を採取尿に代えて、尿中のアネキシンＶ濃度の測定を行うものである。差吸光度は、主波長４９２ｎｍの吸光度より副波長６９０ｎｍ吸光度を差し引くことにより求められており、図２に示す検量線に基づいて、尿検体中のアネキシンＶ濃度が求められた。
本例において、前記国際寄託された受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−５２８４のハイブリドーマ細胞系クローンＨＣＡ−６２７の培養上清から得られる抗アネキシンＶモノクローナル抗体が固相に固定されたタイタープレートが使用された。
本例において、尿中のアネキシンＶの測定は、抗ヒトアネキシンＶモノクローナル抗体ＨＣＡ−６２７及びイヌＨＲＰＯ標識抗体によるエライザ法により行われた。このエライザ法は尿検体のｐＨが５乃至８で測定可能であった。尿中のアネキシンＶを測定する場合には、Ｃａ²⁺の結合を抑制するためのＥＤＴＡ等のキレート剤の尿への添加による尿の前処理は不要である。
前記抗ヒトアネキシンＶモノクローナル抗体固相プレートのブロッキング液を捨て、濃度１％のＢＳＡ、濃度０．１５ＭのＮａＣｌ及び濃度５ｍＭのＥＤＴＡを含む濃度１０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）１００μｌを各ウエルに分注した後、採取された尿についての尿中のアネキシンＶの測定は、採取された尿検体２０μｌを、抗アネキシンＶモノクローナル抗体が固相に固定されたタイタープレートの各ウエルに分注して行われた。
採取された尿検体分注後、室温において、１時間撹拌して、各ウエル内で抗原抗体反応を行わせた。この抗原抗体反応時間が経過したところで、洗浄液で４回洗浄し、洗浄後、この洗浄された各ウエルに、夫々、イヌＨＲＰＯ標識抗体（反応緩衝液１ｍｌ当たり１００ｍＵ）を１００μｌ加え、室温において、３０分間撹拌して抗原抗体反応を行わせた。この抗原抗体反応時間が経過したところで、洗浄液で８回洗浄し、洗浄後、この洗浄された各ウエルに、夫々ＯＰＤ基質液を１００μｌ加えて、室温で３０分間発色反応を行わせる。得られた発色について、主波長４９２ｎｍの吸光度及び副波長６９０ｎｍ吸光度を測定し、主波長４９２ｎｍの吸光度より副波長６９０ｎｍ吸光度を差し引くことにより差吸光度を求め、図２に示す検量線によりアネキシンＶ濃度を求めた。
例６
採取尿について、例４に記載の方法で尿中のアネキシンＶ濃度の測定を行った。発色反応時間が経過したところで、各ウエルに、夫々、反応停止液（２Ｎ濃度のＨ₂ＳＯ₄溶液）を１００μｌを加えて発色反応を停止させ、主波長４９２ｎｍ及び副波長６９０ｎｍの二波長法で、エライザ用プレートリーダにより、夫々の吸光度を測定して、図１に示す検量線により尿検体中の抗原蛋白質のアネキシンＶ濃度を求めた。
本例は５２歳の男性で、５年前に大動脈弁置換術を受けている。２週間発熱が続き、感染性心内膜炎の疑いがあった。
尿中のアネキシンＶ濃度を測定するために、直ちに採尿して第１日目の尿検体１とした。以下、第２日目、第３日目、第４日目、第６日目及び第８日目に採尿して、夫々第２日目、第３日目、第４日目、第６日目及び第８日目の尿検体とし、各尿検体について、採尿した日に尿中のアネキシンＶ濃度の測定を、前記例４に示した尿中のアネキシンＶの分析法により測定した。各尿検体中のアネキシンＶ濃度は次の表１のとおりであった。

尿中のアネキシンＶ濃度は、測定開始第１日目の尿検体のアネキシンＶ濃度は１．２ｎｇ／ｍｌと正常範囲であったが、第２日目の尿検体中のアネキシンＶ濃度は１０．６ｎｇ／ｍｌと上昇し、その後さらに上昇した。血中のアネキシンＶ濃度にも上昇が見られ、臓器障害の合併があると診断された。
測定開始後第２日目の血小板数は、３８，０００であり、測定開始後第３日目の血小板数は、さらに低下し２９，０００となり、ＦＤＰの低下を認め、ＤＩＣと診断された。測定開始後第２日目のアネキシンＶは１０．６ｎｇ／ｍｌで、臓器障害が合併していると診断された。測定開始後第３日目の尿素窒素、クレアチニンの上昇を認め、腎臓傷害の併発が明確となった。血小板輸血、抗生物質の投与を開始し、全身状態の改善、食欲の回復、ベッド周囲歩行まで軽快した。
この症例は尿中のアネキシンＶ濃度の測定によって、臓器障害の存在が早期に診断できた例である。
なお、正常健康人の尿中アネキシンＶ濃度は、年齢２２〜６５歳までの男１０例、女１０例、計２０例の尿中のアネキシンＶ濃度を調べた結果、最大値２．３ｎｇ／ｍｌ、最低値０．３ｎｇ／ｍｌ、平均１．６ｎｇ／ｍｌであった。
例７
本実施例のラットにおける尿中アネキシンＶ濃度の測定を、前記例５により行った。吸光度は、主波長４９２ｎｍの吸光度より副波長６９０ｎｍ吸光度を差し引くことにより求められており。図２に示す検量線に基づいて、尿検体中のアネキシンＶ濃度が求められた。
一定のアネキシンＶを静脈内に注入し、尿中に出現するアネキシンＶ濃度を測定した。この実験で、血中にアネキシンＶが増加すると、尿中にアネキシンＶが増加することがわかった。
即ち、体重３５０ｇのラットの右大腿静脈よりアネキシンＶ（リコンビナントアネキシンＶ）５μｇを注射し、経時的に尿中のアネキシンＶを測定した。その結果を以下の表２に示す。

回収試験
３例についてアネキシンＶの回収試験を行った。その試験結果を次の表３に示す。表３に示されるように、アネキシンＶ値が１．８〜２．９ｎｇ／ｍｌである尿に、１２．５および２５．０ｎｇ／ｍｌのアネキシンＶ蛋白質を添加した場合に、抗原抗体反応により尿中で分離回収されるアネキシンＶの回収率は、何れも９２．８〜９９．２％を示し、きわめて良好な成績であった。

添加回収率＝〔（Ｃ−Ａ）／Ｂ〕×１００で求めた。
尿中のアネキシンＶ濃度の測定におけるｐＨの影響についての試験は、尿に適当な量の１Ｎ塩酸溶液および適当な量の１Ｎ水酸化ナトリウム溶液を加えることによって、尿中のｐＨを４〜８に調整して、尿中のアネキシンＶ濃度を測定した。その結果を以下の表４に示す。なお、該表中＊印は症例自身の尿中アネキシンＶ値である。

本例は、本発明の尿中のアネキシンＶの測定が、ｐＨ５乃至ｐＨ８の間で測定可能であることを示している。
例８
実験的にラットに急性腎炎を発生させ、尿中のアネキシンＶ濃度を、抗アネキシンＶモノクローナル抗体及び抗アネキシンＶポリクローナル抗体を用いたサンドウイッチ・エライザ法で測定した。
実験急性腎炎は、ウシ腎臓皮質から、糸球体基底膜を分離し、可溶化処理後、ゲル濾過カラムクロマトグフィにかけ、腎炎惹起抗原溶出画分を採取した。その３０μｇと等量のフロイド完全アジュバンドとの混合物を１匹のラット（Ｗｉｓｔａｒ−Ｋｙｏｔｏ系ラット）の足裏に皮内注射し、ヒトと類似の急性腎炎を作製した。
尿中のアネキシンＶ濃度を測定するために、前記皮内注射後、１周後に採尿して１週後の尿検体１とした。以下、第２週後、第３週後、第４週後及び第５週後採尿して、夫々第１週後、第２週後、第３週後、第４週後及び第５週後の尿検体とし、各尿検体について、採尿した日に尿中のアネキシンＶ濃度の測定を、前記例４に示した尿中のアネキシンＶの分析法により測定した。各尿検体中のアネキシンＶ濃度は次の表５のとおりであった。

表５に示されるように、尿中のアネキシンＶ濃度は、３週までに急激に上昇し、尿中のたんぱく量よりも先に最大値を示した。尿中のアネキシンＶ濃度の測定は、実験急性腎炎の診断に有効である。
血中のアネキシンＶの濃度は、各週後において上昇がみられなかった。このような血中及び尿中のアネキシンＶ濃度の挙動は急性腎炎の特徴の一とみられる。
例９
本例は、ネフローゼ症候群として診断された２０歳男性の患者の例である。患者は、倦怠感を訴え、全身の著しい浮腫及び１２．７ｇ／日のんぱく尿が認められて、ネフローゼ症候群として診断された。患者の尿中アネキシンＶ濃度と１日の尿中たんぱく量が測定された。ここで、患者の尿中アネキシンＶ濃度は、前記例４に示した尿中のアネキシンＶの分析法により測定した。測定結果は次の表６のとおりであった。

上の表にみられるように、治療第１日目では、患者の尿中のアネキシンＶの濃度は６３．７ｎｇ／ｍｌであり、また同じく患者の１日の尿中のたんぱく量は１２．７ｇ／日であり、夫々高い値を示したが、治療第２０日目では、患者の尿中のアネキシンＶ濃度は、１３．４ｎｇ／ｍｌとかなり下がった値となり、また、１日の尿中のたんぱく量も、７．５ｇ／日とかなり下がった値を示し、患者の浮腫も取れ、治療の効果による改善がみられた。
また、測定された尿中のアネキシンＶ濃度の値は、尿中たんぱく量の変動と対応しており、尿中のアネキシンＶ濃度により、又は尿中のアネキシンＶ濃度と１日の尿中たんぱく量との双方により、ネフローゼ症候群の診断並びに治療の予後を調べることができることが分かった。本例にみられるように、尿中のアネキシンＶ濃度は、ネフローゼ症候群の診断並びに治療の予後を調べる上で有用である。
産業上の利用可能性
本発明は、尿を抗アネキシンＶモノクローナル抗体と接触させて、尿中のアネキシンＶを抗アネキシンＶモノクローナル抗体と抗原抗体反応させて、アネキシンＶ抗原−抗アネキシンＶモノクローナル抗体複合体を形成し、この形成されたアネキシンＶ抗原−抗アネキシンＶモノクローナル抗体複合体を定量するので、従来法に比して、細胞から逸脱し、尿中に排泄された蛋白質のアネキシンＶを、採取した尿から、エライザ法により簡単に測定することができる。
しかも、本発明は、播種性血管内凝固症候群や敗血症に複合した腎臓、心臓、肺などの臓器障害の有無の診断に利用でき、特に、これら臓器障害の早期において、簡単にその診断をすることができ、したがって、播種性血管内凝固症候群や敗血症に複合した腎臓、心臓、肺などの臓器障害の治療法、治療薬、診断薬及び診断法の開発やその臨床試験の結果を求める手段として有用である。

Claims (12)

1. 尿を抗アネキシンＶモノクローナル抗体と接触させて、尿中のアネキシンＶを抗アネキシンＶモノクローナル抗体と抗原抗体反応させて、アネキシンＶ抗原−抗アネキシンＶモノクローナル抗体複合体を形成し、この形成されたアネキシンＶ抗原−抗アネキシンＶモノクローナル抗体複合体を定量することを特徴とする尿中のアネキシンＶの分析方法。
2. 抗アネキシンＶモノクローナル抗体が、微生物の寄託の国際寄託当局の受託番号がＦＥＲＭ ＢＰ−５２８４のハイブリドーマ細胞系又はＦＥＲＭ ＢＰ−５２８６のハイブリドーマ細胞系により産生されるものであることを特徴とする請求項１に記載の尿中のアネキシンＶの分析方法。
3. 尿を固相に固定されている第一の抗アネキシンＶモノクローナル抗体と接触させて、尿中のアネキシンＶを前記第一の抗アネキシンＶモノクローナル抗体と抗原抗体反応させて、アネキシンＶ抗原−第一の抗アネキシンＶモノクローナル抗体複合体を形成し、この形成された抗体複合体のアネキシンＶ抗原に、抗イヌアネキシンＶポリクローナル標識抗体又は第二の抗アネキシンＶモノクローナル標識抗体を結合させて、前記抗体複合体の抗アネキシンＶポリクローナル又は第二の抗アネキシンＶモノクローナル標識抗体結合体を形成し、この形成された標識抗体結合体を定量することを特徴とする尿中のアネキシンＶの分析方法。
4. 第一の抗アネキシンＶモノクローナル抗体が、微生物の寄託の国際寄託当局の受託番号がＦＥＲＭ ＢＰ−５２８４又はＦＥＲＭ ＢＰ−５２８６ハイブリドーマ細胞系により産生されたものであり、第二の抗アネキシンＶモノクローナル標識抗体が、微生物の寄託の国際寄託当局の受託番号がＦＥＲＭ ＢＰ−５２８４又はＦＥＲＭ ＢＰ−５２８６のハイブリドーマ細胞系により産生されたもので形成されており、前記第一の抗アネキシンＶモノクローナル抗体と、前記第二の抗アネキシンＶモノクローナル標識抗体を形成する第二の抗アネキシンＶモノクローナル抗体は異なる抗体であることを特徴とする請求項３に記載の尿中のアネキシンＶの分析方法。
5. 固相に固定されているヒトアネキシンＶ抗原のタンパク質上の抗原決定部位に対して結合特異性を有する第一の抗ヒトアネキシンＶモノクローナル抗体と、ヒトアネキシンＶ抗原のタンパク質上の抗原決定部位に対して結合特異性を有する第二の抗ヒトアネキシンＶモノクローナル標識抗体又は抗イヌアネキシンＶポリクローナル標識抗体とを備えることを特徴とする尿中のアネキシンＶの分析試薬。
6. 第一の抗アネキシンＶモノクローナル抗体が、微生物の寄託の国際寄託当局の寄託番号がＦＥＲＭ ＢＰ−５２８４又はＦＥＲＭ ＢＰ−５２８６のハイブリドーマ細胞系により産生されたものであり、第二の抗アネキシンＶモノクローナル標識抗体が、微生物の寄託の国際寄託当局の寄託番号がＦＥＲＭ ＢＰ−５２８４又はＦＥＲＭ ＢＰ−５２８６のハイブリドーマ細胞系により産生されたもので形成されており、前記第一の抗アネキシンＶモノクローナル抗体と前記第二の抗アネキシンＶモノクローナル標識抗体を形成する第二の抗アネキシンＶモノクローナル抗体は異なる抗体であることを特徴とする請求項５に記載の尿中のアネキシンＶの分析試薬。
7. 固相に固定されており、ヒトアネキシンＶ抗原のタンパク質上の抗原決定部位に対して結合特異性を有する第一の抗ヒトアネキシンＶモノクローナル抗体と、ヒトアネキシンＶ抗原のタンパク質上の抗原決定部位に対して結合特異性を有する第二の抗ヒトアネキシンＶモノクローナル標識抗体又は抗イヌアネキシンＶポリクローナル標識抗体を備えることを特徴とする尿による臓器障害の診断薬。
8. 第一の抗アネキシンＶモノクローナル抗体が、微生物の寄託の国際寄託当局の受託番号がＦＥＲＭ ＢＰ−５２８４又はＦＥＲＭ ＢＰ−５２８６のハイブリドーマ細胞系により産生されたものであり、第二抗アネキシンＶモノクローナル標識抗体が、微生物の寄託の国際寄託当局の受託番号がＦＥＲＭ ＢＰ−５２８４又はＦＥＲＭ ＢＰ−５２８６のハイブリドーマ細胞系により産生されたものにより形成されものであって、前記第一の抗アネキシンＶモノクローナル抗体と前記第二の抗アネキシンＶモノクローナル標識抗体を形成する第二の抗アネキシンＶモノクローナル抗体は異なる抗体であることを特徴とする請求項７に記載の尿による臓器障害の診断薬。
9. 臓器障害が播種性血管内凝固症候群に併発のものであることを特徴とする請求項７又は８に記載の尿による臓器障害の診断薬。
10. 尿中のアネキシンＶの分析試薬と、血液中のアネキシンＶの分析試薬を備えることを特徴とする尿による急性腎炎の診断薬。
11. 尿中のアネキシンＶの分析試薬が、固相に固定された第一の抗アネキシンＶモノクローナル抗体と、第二の抗アネキシンＶモノクローナル標識抗体又は抗アネキシンＶポリクローナル標識抗体を含んでおり、血液中のアネキシンＶの分析試薬が、固相に固定された第三の抗アネキシンＶモノクローナル抗体と、第四の抗アネキシンＶモノクローナル標識抗体又は抗アネキシンＶポリクローナル標識抗体と、ＥＤＴＡとを含んでいることを特徴とする請求項１０に記載の尿による急性腎炎の診断薬。
12. 尿中のアネキシンＶの分析試薬において、第一の抗アネキシンＶモノクローナル抗体は、微生物の寄託の国際寄託当局の寄託番号がＦＥＲＭ ＢＰ−５２８４又はＦＥＲＭ ＢＰ−５２８６のハイブリドーマ細胞系により産生されたものであり、第二の抗アネキシンＶモノクローナル標識抗体は、微生物の寄託の国際寄託当局の寄託番号がＦＥＲＭ ＢＰ−５２８４又はＦＥＲＭ ＢＰ−５２８６のハイブリドーマ細胞系により産生されたもので形成されており、前記第一の抗アネキシンＶモノクローナル抗体と第二の抗アネキシンＶモノクローナル抗体は、異なる抗体であり、血液中のアネキシンＶの分析試薬において、第一の抗アネキシンＶモノクローナル抗体は、微生物の寄託の国際寄託当局の寄託番号がＦＥＲＭ ＢＰ−５２８４又はＦＥＲＭ ＢＰ−５２８６のハイブリドーマ細胞系により産生されたものであり、第二の抗アネキシンＶモノクローナル標識抗体が、微生物の寄託の国際寄託当局の寄託番号がＦＥＲＭ ＢＰ−５２８４又はＦＥＲＭ ＢＰ−５２８４のハイブリドーマ細胞系により産生されたもので形成されており、前記第一の抗アネキシンＶモノクローナル抗体と第二の抗アネキシンＶモノクローナル抗体は、異なる抗体であることを特徴とする請求項１１に記載の尿による急性腎炎の診断薬。

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