JP3681206B2

JP3681206B2 - 抗ファクターＸａ・ティシュファクターパスウェイインヒビター複合体モノクローナル抗体及びその使用

Info

Publication number: JP3681206B2
Application number: JP33922995A
Authority: JP
Inventors: 吉夫徐; 由美子伊藤; 幸介久米田; 勇一神窪
Original assignee: Chemo Sero Therapeutic Research Institute Kaketsuken
Current assignee: Chemo Sero Therapeutic Research Institute Kaketsuken
Priority date: 1995-12-26
Filing date: 1995-12-26
Publication date: 2005-08-10
Anticipated expiration: 2015-12-26
Also published as: KR100249314B1; DE69619226T2; EP0812859A4; KR19980702438A; ES2168521T3; AU706547B2; WO1997023509A1; AU1208997A; JPH09176199A; DE69619226D1; EP0812859A1; EP0812859B1

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、抗ファクターＸａ・ティシュファクターパスウェイインヒビター複合体モノクローナル抗体、前記モノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマ及び前記モノクローナル抗体を用いる、ファクターＸａ・ティシュファクターパスウェイインヒビター複合体の免疫学的測定方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
臨床分野において血中のプロトロンビンをトロンビンに変換させるファクターＸａ（以下、Ｘａともいう）を測定することは、播種性血管内凝固症候群（ＤＩＣ）や血栓症等の凝固亢進状態を知るうえで重要である。しかしながら、生成したＸａを直接測定することは非常に困難である。なぜなら、Ｘａは生成するやいなや阻害剤のティシュファクターパスウェイインヒビター〔組織因子凝固系阻害剤（ＴｉｓｓｕｅＦａｃｔｏｒＰａｔｈｗａｙＩｎｈｉｂｉｏｒ）、以下、ＴＦＰＩともいう〕と結合して、ファクターＸａ・ティシュファクターパスウェイインヒビター複合体（以下、Ｘａ・ＴＦＰＩともいう）を形成するからである。
【０００３】
それ故、血中で生成したＸａ量を測定するための最も簡便な方法は、生成したＸａ量を間接的に反映しているＸａ・ＴＦＰＩを定量することである。その量からＸａ量を推定して凝固活性化の指標とすることができる。
従来、Ｘａ・ＴＦＰＩを測定するには、ファクターＸ（以下、Ｘともいう）とＸａに対するポリクローナル抗体あるいはモノクローナル抗体と、ＴＦＰＩに対するポリクローナル抗体あるいはモノクローナル抗体の２種類を抗体を組み合わせたサンドイッチＥＩＡ法が用いられている。
しかしながら、従来の測定方法では、検体中に共存する遊離のＸあるいは遊離のＴＦＰＩの干渉を受けてしまうため、正確にＸａ・ＴＦＰＩを測定することは困難であった。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明者は、血中に存在するＸａ・ＴＦＰＩの定量に用いられていた従来のサンドイッチＥＩＡ法において、検体中に共存する遊離のＸあるいは遊離のＴＦＰＩの干渉を受けるという欠点を解消するべく鋭意研究をした結果、ＸａとＴＦＰＩが結合して複合体を形成することによって、新たに生じる抗原決定基を認識するモノクローナル抗体を産生、分泌するハイブリドーマを得、このハイブリドーマの培養物を分離、精製してＸａ・ＴＦＰＩに特異性を示すモノクローナル抗体を見出した。従って、本発明は、新たに見出したモノクローナル抗体を利用して、Ｘａ・ＴＦＰＩを簡便に、正確にそして再現性よく測定する方法を提供するものである。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
即ち、本発明は、ファクターＸａ・ティシュファクターパスウェイインヒビター複合体（Ｘａ・ＴＦＰＩ）と特異的に反応するが、遊離のファクターＸ、遊離のファクターＸａ及び遊離のティシュファクターパスウェイインヒビター（ＴＦＰＩ）とは反応しないモノクローナル抗体に関する。
また、本発明は、ファクターＸａ・ティシュファクターパスウェイインヒビター複合体で免疫した哺乳動物の脾臓細胞と哺乳動物のミエローマ細胞との融合によって形成され、Ｘａ・ＴＦＰＩと特異的に反応するが、遊離のファクターＸ、遊離のファクターＸａ及び遊離のＴＦＰＩとは反応しないモノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマまたはそれに由来する細胞株に関する。
更に、本発明は、前記のモノクローナル抗体を用いることを特徴とする、ファクターＸａ・ティシュファクターパスウェイインヒビター複合体の免疫学的測定方法に関する。
【０００６】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
抗Ｘａ・ＴＦＰＩモノクローナル抗体は新規なマウス・ハイブリドーマを、それぞれ培地またはマウスの腹腔内で培養することによって製造できる。
ここで用いるマウス・ハイブリドーマは一般的にはＸａ・ＴＦＰＩで免疫したマウスの脾臓細胞とマウス骨髄腫細胞とを、Ｋｏｈｌｅｒ及びＭｉｌｉｓｔｅｉｎの細胞融合の基本方法［Ｎａｔｕｒｅ第２５６巻４９５頁（１９７５年）参照］により細胞融合して製造することが可能である。詳細には、下記実施例に述べる如くである。
【０００７】
また、上記のハイブリドーマを培養する培地としては、ハイブリドーマの培養に適した培地であればよく、好適にはダルベッコ氏変法イーグル氏最小必須培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓｍｏｄｉｆｉｅｄＥｅａｇｌｅ’ｓｍｉｎｉｍｕｍｅｓｓｅｎｔｉａｌｍｅｄｉｕｍ以下、ＤＭＥと記す）にウシ胎児血清、Ｌ−グルタミン、Ｌ−ピルビン酸および抗生物質（ペニシリンＧとストレプトマイシン）を含む培地が用いられる。
【０００８】
このようにして製造された培養液またはマウスの腹水から、蛋白質の単離、精製に一般的に用いられる方法により前述の抗Ｘａ・ＴＦＰＩモノクローナル抗体を分離、精製することが可能である。
そのような方法としては、硫安塩析、イオン交換セルロースを用いるイオン交換カラムクロマトグラフィー、分子節ゲルを用いる分子節カラムクロマトグラフィー、プロテインＡ結合多糖類を用いる親和性カラムクロマトグラフィー、透析、凍結乾燥等がある。
【０００９】
このようにして得られた抗Ｘａ・ＴＦＰＩモノクローナル抗体は、遊離のＸ、Ｘａ及びＴＦＰＩとは結合しないで、Ｘａ・ＴＦＰＩとだけ結合する能力を有し、Ｘａ・ＴＦＰＩの免疫定量用の試薬として有用である。この発明の抗Ｘａ・ＴＦＰＩモノクローナル抗体（例えば後述の実施例で得られたＸＴ−１）は、酵素免疫定量法（ＥＩＡ）、蛍光免疫定量法（ＦＩＡ）、発光免疫定量法（ＬＩＡ）あるいは放射能免疫定量法（ＲＩＡ）等ににおける試薬として使用できる。酵素免疫定量法としては、マイクロタイターあるいはプラスチックチューブを用いるワン・ステップ・サンドイッチ酵素免疫定量法が例として挙げられる。
【００１０】
この酵素免疫定量法の具体例は、下記実施例７に示す通りであるが、一般的には、抗Ｘａ・ＴＦＰＩモノクローナル抗体を用いて行い、まずマイクロタイター・プレートの穴（ウェル）あるいはプラスチックチューブを前もって一次抗体として、本願発明の抗Ｘａ・ＴＦＰＩモノクローナル抗体（ＸＴ−１）で感作させておき、次に、この穴あるいはプラスチックチューブにＸａ・ＴＦＰＩを含む被検体および二次抗体として酵素標識した抗ＴＦＰＩ抗体の溶液を入れ、約３０分間静置後清浄し、酵素基質溶液を加えて３０分間程度酵素反応を行う。反応終了後、比色法等により、被検体中のＸａ・ＴＦＰＩの量を定量することにより行うことが可能である。
【００１１】
または、一次抗体として抗ＴＦＰＩモノクローナル抗体［例えば、化学及血清療法研究所で取得したハイブリドーマＨＴＦＰＩ−Ｋ９（寄託番号：ＦＥＲＭ−Ｐ−１４４６７）が産生する抗ＴＦＰＩモノクローナル抗体］、二次抗体として酵素等で標識した本願発明の抗Ｘａ・ＴＦＰＩモノクローナル抗体（ＸＴ−１）を用いて前記と同様の操作を行っても血中のＸａ・ＴＦＰＩを定量することができる。
また、本発明のモノクローナル抗体は、後述するようにラテックス凝集免疫法にも使用できる。本発明のモノクローナル抗体を感作したラテックスと被検体を接触させ、それに伴う凝集の有無を測定することで、被検体中のＸａ・ＴＦＰＩを定量することができる。
【００１２】
【実施例】
次にこの発明の実施例により更に詳細に説明する。
実施例１．Ｘａ・ＴＦＰＩの調製
Ｘａ・ＴＦＰＩの調製は次のような操作で行った。精製したＸａ５ｍｇ（０．５ｍｇ／ｍｌのＸａ溶液、１０ｍｌ）と精製したＴＦＰＩ１５ｍｇ（５ｍｇ／ｍｌのＴＦＰＩ溶液、３ｍｌ）を混合し（モル比１：２）、３７℃で１時間反応後、１Ｍのジイソプロピルフルオロリン酸溶液を１３ｍｌ反応液に添加することによって反応を停止させた。この混合液を前もって０．１ＭＮａＣｌを含む２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）で平衡化したヘパリン−セファロースカラム（カラム容量１００ｍｌ）に充填した。
【００１３】
このカラムを上記の緩衝液約４００ｍｌで洗浄後、０．１ＭＮａＣｌを含む２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）と０．５ＭＮａＣｌを含む２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）による直線濃度勾配によって溶離する。溶出液は、５ｍｌずつ集めた。ポリアクリルアミドゲル電気泳動法によって、複合体の含まれている分画を測定した。Ｘａ・ＴＦＰＩが含まれている分画番号６１−１２０を集め、５０ｍＭＮａＣｌを含む２０ｍＭトリス塩酸緩衝液で透析した。
【００１４】
次に、前もって５０ｍＭＮａＣｌを含む２０ｍＭトリス塩酸緩衝液で平衡化してあるＤＥＡＥ−セファセルカラム（カラム容量５０ｍｌ、ファルマシャ社製）に充填する。このカラムを上記の緩衝液約２００ｍｌで洗浄後、０．０５ＭＮａＣｌを含む２０ｍＭトリス塩酸緩衝液による直線濃度勾配によって溶離した。溶出液は２ｍｌずつ集めた。上記の方法で調べたＸａ・ＴＦＰＩの含まれている分画を集め、限外濾過法によって濃縮し、Ａ２８０ｎｍ＝１．０のＸａ・ＴＦＰＩ、５ｍｌを得た。このようにして得たＸａ・ＴＦＰＩ溶液は、免疫原として、また抗Ｘａ・ＴＦＰＩ抗体産生ハイブリドーマを選別するためのＥＬＩＳＡ用抗原として使用した。
【００１５】
実施例２．
（ａ）免疫化した脾臓細胞の調製：
上記のＸａ・ＴＦＰＩ免疫原溶液（Ａ２８０ｎｍ＝０．１）を等量のフロインド氏完全アジュバンドと乳化するまで混合し、その混合液２００μｌをマウス腹腔内に投与することにより免疫を行った（第１回免疫）。３０日経過後、該マウスに上記の同様の方法でマウス腹腔内に投与した（第２免疫）。第２回免疫から２１日経過後、Ｘａ・ＴＦＰＩ免疫原溶液（Ａ２８０ｎｍ＝０．１）を等量の生理食塩水で希釈し、その希釈液２００μｌを、該マウスの静脈内に投与した（最終免疫）。最終免疫から３日経過後、脾臓細胞をマウスから取り出し、細胞融合に使用した。
【００１６】
（ｂ）細胞融合：
無菌的に摘出した上記の脾臓を、１０〜１５％ウシ胎児血清を含むＤＭＥ培地５ｍｌを入れたシャーレに入れる。次に脾臓を１０〜１５％ウシ胎児血清を含むＤＭＥ培地約１５ｍｌで還流して脾細胞を流出させた後、この脾細胞懸濁液をナイロンメッシュに通す。この脾細胞を５０ｍｌ遠心チューブに集めて５００×ｇ、１０分間遠心する。こうして得たペレットに３〜５ｍｌのヘモライジング溶液（１５５ｍＭＮＨ₄Ｃｌ、１０ｍＭＫＨＣＯ₃、１ｍＭＮａ２ＥＤＴＡ、ｐＨ７．０）を加え、懸濁させる。０℃で、５〜１０分間放置すると懸濁液中の赤血球は破壊される。１０〜２０ｍｌの１０〜１５％ウシ胎児血清を含むＤＭＥ培地を加えてから遠心分離する。このようにして得た細胞ペレットをＤＭＥ培地で遠心法によって洗浄し、生きている脾細胞数を測定する。
【００１７】
一方、予め培養しておいたマウス骨髄腫細胞（ミエローマ細胞）ＳＰ２／Ｏ−Ａｇ１４約２×１０⁷個に１×１０⁸個の上記脾細胞を加え、ＤＭＥ培地中でよく混合し、遠心分離を行った（５００×ｇ、１０分間）。その上清を吸引し、ペレットをよく解きほぐし、３８℃に保温しておいた４０％ポリエチレングリコール４０００溶液０．５ｍｌを滴下し、遠心チューブを、手で１分間穏やかに回転することによってポリエチレングリコール溶液と細胞ペレットを混合させた。次に、３８℃に保温しておいたＤＭＥ培地を、３０秒毎に１ｍｌ加えてチューブを穏やかに回転させる。
【００１８】
この操作を１０回繰り返した後、２０〜３０ｍｌの１０〜１５％ウシ胎児血清を含むＤＭＥ培地を加えて、遠心分離（５００×ｇ、１０分間）を行った。上清を除去した後、細胞ペレットを１０〜１５％ウシ胎児血清を含むＨＡＴ培地（ＤＭＥ培地にアミノプテリン４×１０^-7Ｍ、チミジン１．６×１０^-5Ｍ、ヒポキサンチン１×１０^-4Ｍになるように添加したのも）で、遠心法によって２回洗浄後、４０ｍｌの上記ＨＡＴ培地に懸濁した。この細胞懸濁液を９６ウエル細胞培養プレートの各ウエルに２００μｌずつ分注し、３７℃、５％炭酸ガスを含む炭酸ガス培養器で培養を開始した。
【００１９】
培養中、２〜３日間隔で各ウエルの培地を約１００μｌ除き、新たに上記のＨＡＴ培地を１００μｌ加えることによりＨＡＴ培地中で増殖するハイブリドーマを選択した。８日目頃から１０〜１５％ウシ胎児血清を含むＨＴ培地（ＤＭＥ培地にチミジン１．６×１０^-5Ｍ、ヒポキサンチン１×１０^-4Ｍになるように添加したもの）に交換し、ハイブリドーマの増殖を観察するとともに、約１０日目に、下述のＥＬＩＳＡ法により、抗Ｘａ・ＴＦＰＩ抗体産生ハイブリドーマをクスリーニングした。
【００２０】
（Ｃ）ハイブリドーマの樹立
ハイブリドーマ培養上清中の産生抗体の有無はＥＬＩＳＡ法により測定した。９６ウエルＥＬＩＳＡ用プレート（Ｉｍｍｕｌｏｎ、日本ダイナテック株式会社）の各ウエルに、前述の精製Ｘａ・ＴＦＰＩ溶液（Ａ２８０ｎｍ＝０．０５、生理食塩水で希釈したもの）を５０μｌずつ分注し、２５℃で２時間放置した。次に、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０（ＩＣＩ社の登録商標）−生理食塩水で３回洗浄した後、各ウエルに培養上清を５０μｌ加え、２５℃で１時間反応させた。
【００２１】
次に、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０−生理食塩水で２００倍希釈したペルオキシダーゼ結合抗マウス抗体（ダコ社、デンマーク）５０μｌを各ウエルに加えた。反応終了後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０−生理食塩水で各ウエルを３回洗浄し、０．５ｍＭアミノアンチピリン、１０ｍＭフェノール、及び０．００５％過酸化水素水を含む溶液２５０μｌを各ウエルに加え、２５℃で３０分間反応させ、各ウエルの４９０ｎｍにおける吸光度を測定した。その結果、１９２ウエル中、２３ウエルに抗体産生が認められた。
【００２２】
上記のＥＬＩＳＡ法によって認められた培養上清中の抗Ｘａ・ＴＦＰＩ抗体が、ＴＦＰＩ及びＸａと反応するか否かを、ＴＦＰＩ及びＸａを感作した９６ウエルＥＬＩＳＡ用プレートを用いて上記と同様の方法で測定した。その結果、Ｘａ・ＴＦＰＩと反応した２３ウエルの培養上清中、１８ウエルの培養上清がＴＦＰＩとも反応した。一方、Ｘａとは全く反応しなかった。
ＴＦＰＩ及びＸａとは反応しないで、Ｘａ・ＴＦＰＩのみに特異的に反応する１ウエル中のハイブリドーマは２４ウエルプレートに移し、１０〜１５％ウシ胎児血清を含むＨＴ培養で４〜５日間培養した。
【００２３】
その後、再度ＥＬＩＳＡ法によって抗Ｘａ・ＴＦＰＩ特異的抗体（以下単に抗Ｘａ・ＴＦＰＩ抗体という）の産生の有無を確認してから限界希釈法によりクローニングした。限界希釈法は、ＨＴ培地でハイブリドーマが５個／ｍｌとなるように希釈した細胞浮遊液を、予め正常ＢＡＬＢ／Ｃ系マウスの腹腔細胞がウエルあたり２×１０⁴個分注してある９６ウエルプレートの各ウエルに１００μｌずつ分注した。約１０日後、ＥＬＩＳＡ法によって、抗Ｘａ・ＴＦＰＩ抗体を産生するハイブリドーマのクローンをスクリーニングした。その結果、各ハイブリドーマにつき、２０〜４０個の抗体産生クローンが得られた。
【００２４】
これらのクローンの中から、増殖のよい、抗体分泌能の高い、しかも安定なクローンを選び、前述と同様の方法で再クローン化を行い、抗Ｘａ・ＴＦＰＩ特異的抗体産生ハイブリドーマＸＴ−１を樹立した。
なお、ハイブリドーマＸＴ−１は、工業技術院生命工学工業技術研究所にＦＥＲＭＰ−１５３５７として、平成７年１２月２０日に寄託された。
【００２５】
実施例３．モノクローナル抗体の製造
イン・ビトロ法
マウスハイブリドーマＸＴ−１を１５％ウシ胎児血清を含むＤＭＥ培地中で３７℃、５％二酸化炭素雰囲気中７２〜９６時間培養した。培養物を遠心分離（１００００×ｇ、１０分）後、上清に固形の硫酸アンモニウムを５０％最終濃度となるように徐々に加えた。混合物を氷冷下３０分間撹拌した後６０分間放置し、遠心分離（１００００×ｇ、１０分）後、得られた沈渣を少量の１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）に溶解し、１０００倍量の１０ｍＭリン酸緩衝液に対して透析した。
【００２６】
これを、１０ｍＭリン酸緩衝液で既に平衡化したＤＥＡＥ−セルロースのカラムに充填した。モノクローナル抗体の溶出は１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）と０．２ＭＮａＣｌを含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）の間で濃度勾配法により行った。溶出されたモノクローナル抗体を限外濾過法で濃縮し、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）に対して透析した。ウシ血清ＩｇＧを除くために、透析物をヤギ抗ウシ血清ＩｇＧ−セファロース４Ｂのカラムに通した。次に通過液を０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）で平衡化したプロテインＡ−セファロース４Ｂのカラムに充填した。カラムをｐＨ３．５の緩衝液で溶出して精製した抗Ｘａ・ＴＦＰＩ抗体ＸＴ−１の溶液を得た。
【００２７】
イン・ビボ法
プリスタン（２，６，１，１４−テトラメチルペンタデカン）０．５ｍｌを１０から１２週齢のＢＡＬＢ／Ｃ系マウスの腹腔内に投与後１４〜２０日目のマウス腹腔内にインビトロで増殖させたハイブリドーマＸＴ−１をマウス一匹あたり２×１０⁶細胞となるように接種した。
各ハイブリドーマにつき一匹のマウスから約１０〜１５ｍｌの腹水が得られた。その抗体濃度は、２〜１０ｍｇ／ｍｌであった。腹水中のモノクローナル抗体の精製（但し、ヤギ抗ウシ血清ＩｇＧ−セファロース４Ｂのカラムを通す操作は除く。）は、上記のインビトロ精製法と同様の方法で行った。
【００２８】
実施例４．モノクローナル抗体の免疫グロブリンクラス及び特異性の同定
抗Ｘａ・ＴＦＰＩモノクローナル抗体ＸＴ−１の免疫グロブリン・クラス、及び特異性の同定は、各々オクテロニー免疫拡散法、及びエンザイムイムノアッセイ法により行った。その結果、モノクローナル抗体ＸＴ−１の免疫グロブブリン・クラスは「ＩｇＧ2a」であった。また、特異性はマウスの腹水の希釈列を用いて行った結果を図１に示す。
【００２９】
実施例５．ラテックス凝集免疫定量法
抗Ｘａ・ＴＦＰＩモノクローナル抗体によるラテックス（日本合成ゴム社製、０．４９７μｍ）の感作は次のような操作で行った。
モノクローナル抗体ＸＴ−１の濃度が０．１ｍｇ／ｍｌの溶液１０ｍｌに、ラテックス濃度が１％（ｗ／ｖ）になるようにラテックスを加え、２５℃で１時間激しく撹拌した。次に、牛アルブミン溶液（１０ｍｇ／ｍｌ）を０．２ｍｌ添加し、２５℃で３０分間激しく撹拌後、遠心分離（２００００×ｇ、３０分間）を行う。沈渣を５０ｍｌの水に懸濁し、抗Ｘａ・ＴＦＰＩモノクローナル抗体感作ラテックス液を得た。
【００３０】
上記抗Ｘａ・ＴＦＰＩモノクローナル抗体に代えて、抗ＴＦＰＩモノクローナル抗体［ハイブリドーマＨＴＦＰＩ−Ｋ９（寄託番号：ＦＥＲＭ−Ｐ−１４４６７）より得られたモノクローナル抗体］を用いて同様の操作を行い、抗ＴＦＰＩモノクローナル抗体感作ラテックス液を得た。これらを以下のラテックス凝集反応に用いた。
上記の２種類の抗体感作ラテックス液を等量混合し、この混合液ラテックスとＸａ・ＴＦＰＩを含む検体とを混合して反応させ、分光学的に凝集反応速度をＬＰＩＡ−１００（商品名、三菱化学製）を用いて測定した。エピトープを２個もつＸａ・ＴＦＰＩは凝集するが、エピトープを１個しかもたないＸ及びＴＦＰＩは凝集しないため、正確に検体中のＸａ・ＴＦＰＩを測定することができた。図２にＸａ・ＴＦＰＩ濃度と凝集反応速度との関係（検量線）を示す。
【００３１】
実施例６．ワンステップ・サンドイッチ酵素免疫定量法
西洋ワサビ・ペルオキシダーゼを抗Ｘａ・ＴＦＰＩモノクローナル抗体ＸＴ−１に結合させる方法は、ナカネ及びカワオイ［ジャーナル・オブ・ヒストケミストリー・アンド・サイトケミストリー第２２巻１０８４〜１０９１頁（１９７４年）］の方法に準じて行った。この酵素ラベル抗体を用いてＸａ・ＴＦＰＩのサンドイッチ酵素免疫定量を次のようにして行った。
【００３２】
抗ＴＦＰＩモノクローナル抗体（前記実施例５で用いたモノクローナル抗体）を２０ｍＭ炭酸緩衝液中に１０μｇ／ｍｌの濃度にした溶液を、９６ウエル平底型ポリスチレン製マイクロタイター・プレートに、１００μｌ入れて２５℃で３０分間静置した。そのプレートを０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０を含む生理食塩水で３回洗浄した。このようにして得た抗体を感作したプレートのウエルに、５０μｌの被検体、及び上記で調製したペルオキシダーゼ標識抗Ｘａ・ＴＦＰＩモノクローナル抗体、０．１５ＭＮａＣｌ、及び２％ウシアルブミンを含む２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）１００μｌを加えた。
【００３３】
２５℃で３０分間静置後、プレートを０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０を含む生理食塩水で３回洗浄した。次いで、酵素基質液（１０ｍＭフェノール、２０ｍＭ４−アミノアンチピリン、及び０．００５％過酸化水素を含む液）２００μｌずつをプレートのそれぞれのウエルに添加した。２５℃で３０分反応後、各ウエルの４９０ｎｍにおける吸光度をＭＰ−５９０型マイクロエライザ・ミニリーダー（ダイナテック社製）で測定した被検体中のＸａ・ＴＦＰＩの量は、同時に測定した検量用複合体の４９０ｎｍにおける吸光度から描いた検量線から求めた。図３にそのときの検量線を示す。
【００３４】
【発明の効果】
この発明は遊離のＴＦＰＩ、Ｘａとは反応せず、Ｘａ・ＴＦＰＩに特異的に反応する抗Ｘａ・ＴＦＰＩモノクローナル抗体を新規に得、これを使用すれば、上述の如く、Ｘａ・ＴＦＰＩを感度よく定量することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】抗Ｘａ・ＴＦＰＩモノクローナル抗体（ＸＴ−１）のＸａ、ＴＦＰＩ及びＸａ・ＴＦＰＩとの結合力を、抗原を直接９６ウエルマイクロタイター・プレートにコートして、腹水中のＸＴ−１との反応性により、エンザイムイムノアッセイ法で測定した結果を表すグラフ図である。
【図２】ＬＰＩＡ−１００を用いて測定したラテックス凝集反応速度とＸａ・ＴＦＰＩの濃度との検量線のグラフ図である。
【図３】抗ＴＦＰＩモノクローナル抗体を一次抗体とし、抗Ｘａ・ＴＦＰＩモノクローナル抗体（ＸＴ−１）を酵素標識二次抗体として行った、Ｘａ・ＴＦＰＩなどのサンドイッチエンザイムイムノアッセイの結果を表すグラフ図である。

Claims

ファクターＸａ・ティシュファクターパスウェイインヒビター複合体（Ｘａ・ＴＦＰＩ）と特異的に反応するが、遊離のファクターＸ、遊離のファクターＸａ及び遊離のティシュファクターパスウェイインヒビター（ＴＦＰＩ）とは反応しないモノクローナル抗体。
ファクターＸａ・ティシュファクターパスウェイインヒビター複合体で免疫したヒト以外の哺乳動物の脾臓細胞と哺乳動物のミエローマ細胞との融合によって形成され、Ｘａ・ＴＦＰＩと特異的に反応するが、遊離ファクターＸ、遊離のファクターＸａ及び遊離のＴＦＰＩとは反応しないモノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマまたはそれに由来する、当該モノクローナル抗体を分泌する細胞株。
請求項１記載のモノクローナル抗体を用いることを特徴とする、ファクターＸａ・ティシュファクターパスウェイインヒビター複合体の免疫学的測定方法。