JP6950957B2 - イムノグロブリン結合ポリペプチド - Google Patents
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Description
本発明は、イムノグロブリン又はその断片に結合するポリペプチドに関する。より具体的には、本発明は、イムノグロブリン又はその断片のカッパ鎖に対する結合性が高く、アルカリ条件下での安定性（アルカリ安定性）に優れたポリペプチドに関する。更に、本発明は、当該ポリペプチドの製造方法、当該ポリペプチドの固定化物、及び当該ポリペプチドを利用したイムノグロブリン又はその断片の分離方法等に関する。
従来、イムノグロブリン（抗体とも称される）は、標的物質に対する結合特異性が高く、研究用試薬や臨床検査試薬として広く利用されている。また、近年では、遺伝子組換え技術の進歩によって、ヒト抗体やヒト化抗体の作製技術が確立され、イムノグロブリンは、抗体医薬としてリウマチや癌等の医療分野で実用化されるに至っている。
イムノグロブリンは、主に動物細胞培養により製造されており、その精製にはイムノグロブリン結合能を有するリガンドを使用したアフィニティークロマトグラフィーが広く利用されている。イムノグロブリンの精製に利用されるアフィニティークロマトグラフィーでは、イムノグロブリンに特異的に結合するリガンドとして、プロテインＡ、プロテインＬ、プロテインＧ等のポリペプチド、又はこれらのイムノグロブリン結合ドメインが用いられている。
一方、近年、イムノグロブリンの精製に使用されるリガンドの安定性の向上が求められるようになっている。特に、イムノグロブリンの精製では、ウイルス等の失活、リガンドを固定化した担体の洗浄等のためにアルカリ溶液が使用されており、イムノグロブリンの精製に使用されるリガンドには、アルカリに対して高い安定性を備えていることが１つの重要な要素になっている。
従来、プロテインＡのアルカリ安定性を向上させる技術については精力的に検討されている。例えば、特許文献１には、プロテインＡのＣドメインの特定のアミノ酸、又はプロテインＡのＺドメインの特定のアミノ酸残基を置換することにより、優れたイムノグロブリン結合能及びアルカリ安定性を備えさせ得ることが報告されている。また、特許文献２には、プロテインＡのアスパラギン残基を別のアミノ酸に置換することによってアルカリ安定性を備えさせ得ることが報告されている。
このように、プロテインＡについては、アルカリ安定性を付与する技術が種々報告されているものの、プロテインＬのアルカリ安定性を付与する技術については十分な検討がなされていないのが現状である。
プロテインＬは、Peptostreptococcus magnus（別名 Finegoldia magna）の細胞表面に局在しており、イムノグロブリンのカッパ鎖に特異的に結合できることが知られている。プロテインＬには、Peptostreptococcus magnus 312株由来のもの（非特許文献１）とPeptostreptococcus magnus 3316株由来のもの（非特許文献２及び特許文献３）が報告されている。Peptostreptococcus magnus 3316株由来のプロテインＬには、イムノグロブリンのカッパ鎖に結合する４つのドメインがあり（非特許文献２及び特許文献３）、これらのドメインは相互にアミノ酸配列の類似性が高く、しかもこれらの４つのドメインは単独でもイムノグロブリンに対する結合能を示すことが知られている。312株の５つのカッパ鎖結合ドメインのアミノ酸配列も3316株の各ドメインのアミノ酸配列に対して類似性が高い。しかしながら、Peptostreptococcus magnus 由来のプロテインＬの各ドメインのアミノ酸配列において、どのような改変が、アルカリ安定性に寄与するかについては一切明らかにされていない。
W. Kastern et al., J.Biol. Chem. (1992) 267, 12820-12825
J.P. Murphy et al., Mol. Microbiol. (1994)12, 911-920
本発明の目的は、Peptostreptococcus magnus由来のプロテインＬにおけるイムノグロブリン結合ドメインのアミノ酸配列を改変することにより、イムノグロブリンのカッパ鎖に対する結合能が高く、アルカリ安定性に優れたポリペプチドを提供することである。
本発明者は、前記課題を解決すべく鋭意検討を行ったところ、Peptostreptococcus magnus 3316株由来のプロテインＬの各イムノグロブリン結合ドメインにおいて、特定のリジン残基を塩基性アミノ酸又は水酸基を有するアミノ酸に置換することによって、イムノグロブリンのカッパ鎖に対する結合能が高く、しかもアルカリ安定性に優れたポリペプチドが得られることを見出した。本発明は、かかる知見に基づいて更に検討を重ねることにより完成したものである。
即ち、本発明は、下記に掲げる態様の発明を提供する。
項１． 下記(1-1)〜(1-4)、(2-1)〜(2-4)、及び(3-1)〜(3-4)のいずれかに示すイムノグロブリン結合ドメインを少なくとも１つ含むポリペプチド。
(1-1)配列番号１に示すアミノ酸配列において、第７位、第１３位、第２２位、及び第２９位よりなる群から選択される部位の少なくとも２個以上が、リジン以外の塩基性アミノ酸又は水酸基を有するアミノ酸に置換されているアミノ酸配列を含むイムノグロブリン結合ドメイン。
(1-2)配列番号２に示すアミノ酸配列において、第７位、第１３位、第２２位、及び第２９位よりなる群から選択される部位の少なくとも２個以上が、リジン以外の塩基性アミノ酸又は水酸基を有するアミノ酸に置換されているアミノ酸配列を含むイムノグロブリン結合ドメイン。
(1-3)配列番号３に示すアミノ酸配列において、第７位、第１３位、第２２位、及び第２９位よりなる群から選択される部位の少なくとも２個以上が、リジン以外の塩基性アミノ酸又は水酸基を有するアミノ酸に置換されているアミノ酸配列を含むイムノグロブリン結合ドメイン。
(1-4)配列番号４に示すアミノ酸配列において、第６位、第１２位、第２１位、及び第２８位よりなる群から選択される部位の少なくとも２個以上が、リジン以外の塩基性アミノ酸又は水酸基を有するアミノ酸に置換されているアミノ酸配列を含むイムノグロブリン結合ドメイン。
(2-1)配列番号１に示すアミノ酸配列における第７位、第１３位、第２２位、及び第２９位よりなる群から選択される少なくとも２つのアミノ酸が、リジン以外の塩基性アミノ酸又は水酸基を有するアミノ酸に置換されているアミノ酸配列において、前記アミノ酸置換部位以外のアミノ酸の１個又は数個が置換、付加、挿入又は欠失されてなり、且つ、イムノグロブリンに対する結合能を有し、配列番号１に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドと比較してアルカリ安定性が向上しているイムノグロブリン結合ドメイン。
(2-2)配列番号２に示すアミノ酸配列における第７位、第１３位、第２２位、及び第２９位よりなる群から選択される少なくとも２つのアミノ酸が、リジン以外の塩基性アミノ酸又は水酸基を有するアミノ酸に置換されているアミノ酸配列において、前記アミノ酸置換部位以外のアミノ酸の１個又は数個が置換、付加、挿入又は欠失されてなり、且つ、イムノグロブリンに対する結合能を有し、配列番号１に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドと比較してアルカリ安定性が向上しているイムノグロブリン結合ドメイン。
(2-3)配列番号３に示すアミノ酸配列における第７位、第１３位、第２２位、及び第２９位よりなる群から選択される少なくとも２つのアミノ酸が、リジン以外の塩基性アミノ酸又は水酸基を有するアミノ酸に置換されているアミノ酸配列において、前記アミノ酸置換部位以外のアミノ酸の１個又は数個が置換、付加、挿入又は欠失されてなり、且つ、イムノグロブリンに対する結合能を有し、配列番号１に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドと比較してアルカリ安定性が向上しているイムノグロブリン結合ドメイン。
(2-4)配列番号４に示すアミノ酸配列における第６位、第１２位、第２１位、及び第２８位よりなる群から選択される少なくとも２つのアミノ酸が、リジン以外の塩基性アミノ酸又は水酸基を有するアミノ酸に置換されているアミノ酸配列において、前記アミノ酸置換部位以外のアミノ酸の１個又は数個が置換、付加、挿入又は欠失されてなり、且つ、イムノグロブリンに対する結合能を有し、配列番号１に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドと比較してアルカリ安定性が向上しているイムノグロブリン結合ドメイン。
(3-1)配列番号１に示すアミノ酸配列における第７位、第１３位、第２２位、及び第２９位よりなる群から選択される少なくとも２つのアミノ酸が、リジン以外の塩基性アミノ酸又は水酸基を有するアミノ酸に置換されているアミノ酸配列において、配列番号１に示すアミノ酸配列に対する前記アミノ酸置換部位を除いた配列同一性が８０％以上であり、且つ、イムノグロブリンに対する結合能を有し、配列番号１に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドと比較してアルカリ安定性が向上しているイムノグロブリン結合ドメイン。
(3-2)配列番号２に示すアミノ酸配列における第７位、第１３位、第２２位、及び第２９位よりなる群から選択される少なくとも２つのアミノ酸が、リジン以外の塩基性アミノ酸又は水酸基を有するアミノ酸に置換されているアミノ酸配列において、配列番号２に示すアミノ酸配列に対する前記アミノ酸置換部位を除いた配列同一性が８０％以上であり、且つ、イムノグロブリンに対する結合能を有し、配列番号２に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドと比較してアルカリ安定性が向上しているイムノグロブリン結合ドメイン。
(3-3)配列番号３に示すアミノ酸配列における第７位、第１３位、第２２位、及び第２９位よりなる群から選択される少なくとも２つのアミノ酸が、リジン以外の塩基性アミノ酸又は水酸基を有するアミノ酸に置換されているアミノ酸配列において、配列番号３に示すアミノ酸配列に対する前記アミノ酸置換部位を除いた配列同一性が８０％以上であり、且つ、イムノグロブリンに対する結合能を有し、配列番号３に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドと比較してアルカリ安定性が向上しているイムノグロブリン結合ドメイン。
(3-4)配列番号４に示すアミノ酸配列における第６位、第１２位、第２１位、及び第２８位よりなる群から選択される少なくとも２つのアミノ酸が、リジン以外の塩基性アミノ酸又は水酸基を有するアミノ酸に置換されているアミノ酸配列において、配列番号４に示すアミノ酸配列に対する前記アミノ酸置換部位を除いた配列同一性が８０％以上であり、且つ、イムノグロブリンに対する結合能を有し、配列番号４に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドと比較してアルカリ安定性が向上しているイムノグロブリン結合ドメイン。
項２． 前記(1-1)〜(1-4)、(2-1)〜(2-4)、及び(3-1)〜(3-4)に示すイムノグロブリン結合ドメインの中から選択される１個のイムノグロブリン結合ドメインが含まれる単ドメイン型ペプチドである、項１に記載のポリペプチド。
項３． 前記 下記(1-1)〜(1-4)、(2-1)〜(2-4)、及び(3-1)〜(3-4)に示すイムノグロブリン結合ドメインから選択される２個以上のイムノグロブリン結合ドメインが連結されてなる複ドメイン型ペプチドである、項１に記載のポリペプチド。
項４． 前記(1-1)、(2-1)、及び(3-1)のイムノグロブリン結合ドメインのいずれか少なくとも１つを含み、
配列番号１に示すアミノ酸配列における第７位、第１３位、第２２位、及び第２９位の全てが、塩基性アミノ酸又は水酸基を有するアミノ酸に置換されている、項１〜３のいずれかに記載のポリペプチド。
項５． 前記(1-1)、(2-1)、及び(3-1)のイムノグロブリン結合ドメインのいずれか少なくとも１つを含み、
配列番号１に示すアミノ酸配列において、第７位、第１３位、第２２位、及び第２９位よりなる群から選択される部位の少なくとも２個以上が、アルギニン又はトレオニンに置換されている、項１〜４のいずれかに記載のポリペプチド。
項６． 前記(1-2)、(2-2)、及び(3-2)のイムノグロブリン結合ドメインのいずれか少なくとも１つを含み、
配列番号２に示すアミノ酸配列における第７位、第１３位、第２２位、及び第２９位の全てが、塩基性アミノ酸又は水酸基を有するアミノ酸に置換されている、項１〜３のいずれかに記載のポリペプチド。
項７． 前記(1-2)、(2-2)、及び(3-2)のイムノグロブリン結合ドメインのいずれか少なくとも１つを含み、
配列番号２に示すアミノ酸配列において、第７位、第１３位、第２２位、及び第２９位よりなる群から選択される部位の少なくとも２個以上が、アルギニン又はトレオニンに置換されている、項１〜３及び６のいずれかに記載のポリペプチド。
項８． 前記(1-3)、(2-3)、及び(3-3)のイムノグロブリン結合ドメインのいずれか少なくとも１つを含み、
配列番号３に示すアミノ酸配列における第７位、第１３位、第２２位、及び第２９位の全てが、塩基性アミノ酸又は水酸基を有するアミノ酸に置換されている、項１〜３のいずれかに記載のポリペプチド。
項９． 前記(1-3)、(2-3)、及び(3-3)のイムノグロブリン結合ドメインのいずれか少なくとも１つを含み、
配列番号３に示すアミノ酸配列において、第７位、第１３位、第２２位、及び第２９位よりなる群から選択される部位の少なくとも２個以上が、アルギニン又はトレオニンに置換されている、項１〜３及び８のいずれかに記載のポリペプチド。
項１０． 前記(1-4)、(2-4)、及び(3-4)のイムノグロブリン結合ドメインのいずれか少なくとも１つを含み、
配列番号４に示すアミノ酸配列における第６位、第１２位、第２１位、及び第２８位の全てが、塩基性アミノ酸又は水酸基を有するアミノ酸に置換されている、項１〜３のいずれかに記載のポリペプチド。
項１１． 前記(1-4)、(2-4)、及び(3-4)のイムノグロブリン結合ドメインのいずれか少なくとも１つを含み、
配列番号４に示すアミノ酸配列において、第６位、第１２位、第２１位、及び第２８位よりなる群から選択される部位の少なくとも２個以上が、アルギニン又はトレオニンに置換されている、項１〜３及び１０のいずれかに記載のポリペプチド。
項１２． 項１〜１１のいずれかに記載のポリペプチドをコードしているＤＮＡ。
項１３． 項１２に記載のＤＮＡを含む組換えベクター。
項１４． 項１３に記載の組換えベクターを用いて宿主を形質転換して得られる形質転換体。
項１５． 項１４に記載の形質転換体を培養する工程を含む、項１〜１１のいずれかに記載のポリペプチドの製造方法。
項１６． 項１〜１１のいずれかに記載のポリペプチドが不溶性担体に固定化されてなる、イムノグロブリン結合用担体。
項１７． 項１６に記載のイムノグロブリン結合用担体を用いて、イムノグロブリン又はそのカッパ鎖を含む断片の分離を行う、イムノグロブリン又はその断片の分離方法。
項１． 下記(1-1)〜(1-4)、(2-1)〜(2-4)、及び(3-1)〜(3-4)のいずれかに示すイムノグロブリン結合ドメインを少なくとも１つ含むポリペプチド。
(1-1)配列番号１に示すアミノ酸配列において、第７位、第１３位、第２２位、及び第２９位よりなる群から選択される部位の少なくとも２個以上が、リジン以外の塩基性アミノ酸又は水酸基を有するアミノ酸に置換されているアミノ酸配列を含むイムノグロブリン結合ドメイン。
(1-2)配列番号２に示すアミノ酸配列において、第７位、第１３位、第２２位、及び第２９位よりなる群から選択される部位の少なくとも２個以上が、リジン以外の塩基性アミノ酸又は水酸基を有するアミノ酸に置換されているアミノ酸配列を含むイムノグロブリン結合ドメイン。
(1-3)配列番号３に示すアミノ酸配列において、第７位、第１３位、第２２位、及び第２９位よりなる群から選択される部位の少なくとも２個以上が、リジン以外の塩基性アミノ酸又は水酸基を有するアミノ酸に置換されているアミノ酸配列を含むイムノグロブリン結合ドメイン。
(1-4)配列番号４に示すアミノ酸配列において、第６位、第１２位、第２１位、及び第２８位よりなる群から選択される部位の少なくとも２個以上が、リジン以外の塩基性アミノ酸又は水酸基を有するアミノ酸に置換されているアミノ酸配列を含むイムノグロブリン結合ドメイン。
(2-1)配列番号１に示すアミノ酸配列における第７位、第１３位、第２２位、及び第２９位よりなる群から選択される少なくとも２つのアミノ酸が、リジン以外の塩基性アミノ酸又は水酸基を有するアミノ酸に置換されているアミノ酸配列において、前記アミノ酸置換部位以外のアミノ酸の１個又は数個が置換、付加、挿入又は欠失されてなり、且つ、イムノグロブリンに対する結合能を有し、配列番号１に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドと比較してアルカリ安定性が向上しているイムノグロブリン結合ドメイン。
(2-2)配列番号２に示すアミノ酸配列における第７位、第１３位、第２２位、及び第２９位よりなる群から選択される少なくとも２つのアミノ酸が、リジン以外の塩基性アミノ酸又は水酸基を有するアミノ酸に置換されているアミノ酸配列において、前記アミノ酸置換部位以外のアミノ酸の１個又は数個が置換、付加、挿入又は欠失されてなり、且つ、イムノグロブリンに対する結合能を有し、配列番号１に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドと比較してアルカリ安定性が向上しているイムノグロブリン結合ドメイン。
(2-3)配列番号３に示すアミノ酸配列における第７位、第１３位、第２２位、及び第２９位よりなる群から選択される少なくとも２つのアミノ酸が、リジン以外の塩基性アミノ酸又は水酸基を有するアミノ酸に置換されているアミノ酸配列において、前記アミノ酸置換部位以外のアミノ酸の１個又は数個が置換、付加、挿入又は欠失されてなり、且つ、イムノグロブリンに対する結合能を有し、配列番号１に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドと比較してアルカリ安定性が向上しているイムノグロブリン結合ドメイン。
(2-4)配列番号４に示すアミノ酸配列における第６位、第１２位、第２１位、及び第２８位よりなる群から選択される少なくとも２つのアミノ酸が、リジン以外の塩基性アミノ酸又は水酸基を有するアミノ酸に置換されているアミノ酸配列において、前記アミノ酸置換部位以外のアミノ酸の１個又は数個が置換、付加、挿入又は欠失されてなり、且つ、イムノグロブリンに対する結合能を有し、配列番号１に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドと比較してアルカリ安定性が向上しているイムノグロブリン結合ドメイン。
(3-1)配列番号１に示すアミノ酸配列における第７位、第１３位、第２２位、及び第２９位よりなる群から選択される少なくとも２つのアミノ酸が、リジン以外の塩基性アミノ酸又は水酸基を有するアミノ酸に置換されているアミノ酸配列において、配列番号１に示すアミノ酸配列に対する前記アミノ酸置換部位を除いた配列同一性が８０％以上であり、且つ、イムノグロブリンに対する結合能を有し、配列番号１に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドと比較してアルカリ安定性が向上しているイムノグロブリン結合ドメイン。
(3-2)配列番号２に示すアミノ酸配列における第７位、第１３位、第２２位、及び第２９位よりなる群から選択される少なくとも２つのアミノ酸が、リジン以外の塩基性アミノ酸又は水酸基を有するアミノ酸に置換されているアミノ酸配列において、配列番号２に示すアミノ酸配列に対する前記アミノ酸置換部位を除いた配列同一性が８０％以上であり、且つ、イムノグロブリンに対する結合能を有し、配列番号２に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドと比較してアルカリ安定性が向上しているイムノグロブリン結合ドメイン。
(3-3)配列番号３に示すアミノ酸配列における第７位、第１３位、第２２位、及び第２９位よりなる群から選択される少なくとも２つのアミノ酸が、リジン以外の塩基性アミノ酸又は水酸基を有するアミノ酸に置換されているアミノ酸配列において、配列番号３に示すアミノ酸配列に対する前記アミノ酸置換部位を除いた配列同一性が８０％以上であり、且つ、イムノグロブリンに対する結合能を有し、配列番号３に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドと比較してアルカリ安定性が向上しているイムノグロブリン結合ドメイン。
(3-4)配列番号４に示すアミノ酸配列における第６位、第１２位、第２１位、及び第２８位よりなる群から選択される少なくとも２つのアミノ酸が、リジン以外の塩基性アミノ酸又は水酸基を有するアミノ酸に置換されているアミノ酸配列において、配列番号４に示すアミノ酸配列に対する前記アミノ酸置換部位を除いた配列同一性が８０％以上であり、且つ、イムノグロブリンに対する結合能を有し、配列番号４に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドと比較してアルカリ安定性が向上しているイムノグロブリン結合ドメイン。
項２． 前記(1-1)〜(1-4)、(2-1)〜(2-4)、及び(3-1)〜(3-4)に示すイムノグロブリン結合ドメインの中から選択される１個のイムノグロブリン結合ドメインが含まれる単ドメイン型ペプチドである、項１に記載のポリペプチド。
項３． 前記 下記(1-1)〜(1-4)、(2-1)〜(2-4)、及び(3-1)〜(3-4)に示すイムノグロブリン結合ドメインから選択される２個以上のイムノグロブリン結合ドメインが連結されてなる複ドメイン型ペプチドである、項１に記載のポリペプチド。
項４． 前記(1-1)、(2-1)、及び(3-1)のイムノグロブリン結合ドメインのいずれか少なくとも１つを含み、
配列番号１に示すアミノ酸配列における第７位、第１３位、第２２位、及び第２９位の全てが、塩基性アミノ酸又は水酸基を有するアミノ酸に置換されている、項１〜３のいずれかに記載のポリペプチド。
項５． 前記(1-1)、(2-1)、及び(3-1)のイムノグロブリン結合ドメインのいずれか少なくとも１つを含み、
配列番号１に示すアミノ酸配列において、第７位、第１３位、第２２位、及び第２９位よりなる群から選択される部位の少なくとも２個以上が、アルギニン又はトレオニンに置換されている、項１〜４のいずれかに記載のポリペプチド。
項６． 前記(1-2)、(2-2)、及び(3-2)のイムノグロブリン結合ドメインのいずれか少なくとも１つを含み、
配列番号２に示すアミノ酸配列における第７位、第１３位、第２２位、及び第２９位の全てが、塩基性アミノ酸又は水酸基を有するアミノ酸に置換されている、項１〜３のいずれかに記載のポリペプチド。
項７． 前記(1-2)、(2-2)、及び(3-2)のイムノグロブリン結合ドメインのいずれか少なくとも１つを含み、
配列番号２に示すアミノ酸配列において、第７位、第１３位、第２２位、及び第２９位よりなる群から選択される部位の少なくとも２個以上が、アルギニン又はトレオニンに置換されている、項１〜３及び６のいずれかに記載のポリペプチド。
項８． 前記(1-3)、(2-3)、及び(3-3)のイムノグロブリン結合ドメインのいずれか少なくとも１つを含み、
配列番号３に示すアミノ酸配列における第７位、第１３位、第２２位、及び第２９位の全てが、塩基性アミノ酸又は水酸基を有するアミノ酸に置換されている、項１〜３のいずれかに記載のポリペプチド。
項９． 前記(1-3)、(2-3)、及び(3-3)のイムノグロブリン結合ドメインのいずれか少なくとも１つを含み、
配列番号３に示すアミノ酸配列において、第７位、第１３位、第２２位、及び第２９位よりなる群から選択される部位の少なくとも２個以上が、アルギニン又はトレオニンに置換されている、項１〜３及び８のいずれかに記載のポリペプチド。
項１０． 前記(1-4)、(2-4)、及び(3-4)のイムノグロブリン結合ドメインのいずれか少なくとも１つを含み、
配列番号４に示すアミノ酸配列における第６位、第１２位、第２１位、及び第２８位の全てが、塩基性アミノ酸又は水酸基を有するアミノ酸に置換されている、項１〜３のいずれかに記載のポリペプチド。
項１１． 前記(1-4)、(2-4)、及び(3-4)のイムノグロブリン結合ドメインのいずれか少なくとも１つを含み、
配列番号４に示すアミノ酸配列において、第６位、第１２位、第２１位、及び第２８位よりなる群から選択される部位の少なくとも２個以上が、アルギニン又はトレオニンに置換されている、項１〜３及び１０のいずれかに記載のポリペプチド。
項１２． 項１〜１１のいずれかに記載のポリペプチドをコードしているＤＮＡ。
項１３． 項１２に記載のＤＮＡを含む組換えベクター。
項１４． 項１３に記載の組換えベクターを用いて宿主を形質転換して得られる形質転換体。
項１５． 項１４に記載の形質転換体を培養する工程を含む、項１〜１１のいずれかに記載のポリペプチドの製造方法。
項１６． 項１〜１１のいずれかに記載のポリペプチドが不溶性担体に固定化されてなる、イムノグロブリン結合用担体。
項１７． 項１６に記載のイムノグロブリン結合用担体を用いて、イムノグロブリン又はそのカッパ鎖を含む断片の分離を行う、イムノグロブリン又はその断片の分離方法。
本発明のポリペプチドによれば、イムノグロブリン又はそのカッパ鎖を含む断片に対する結合能が高く、アルカリ条件下に晒されても、イムノグロブリン又はそのカッパ鎖を含む断片に対する結合能を維持できるので、アルカリ性溶液による溶出や洗浄を繰り返しても、イムノグロブリン又はそのカッパ鎖を含む断片に対する結合能の低下を抑制でき、イムノグロブリン又はそのカッパ鎖を含む断片の製造コストの低減と効率化を図ることができる。
以下、本発明を詳細に説明する。なお、配列表以外では、アミノ酸配列における２０種類のアミノ酸残基は、一文字略記で表現することがある。即ち、グリシン（Ｇｌｙ）はＧ、アラニン（Ａｌａ）はＡ、バリン（Ｖａｌ）はＶ、ロイシン（Ｌｅｕ）はＬ、イソロイシン（Ｉｌｅ）はＩ、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）はＦ、チロシン（Ｔｙｒ）はＹ、トリプトファン（Ｔｒｐ）はＷ、セリン（Ｓｅｒ）はＳ、トレオニン（Ｔｈｒ）はＴ、システイン（Ｃｙｓ）はＣ、メチオニン（Ｍｅｔ）はＭ、アスパラギン酸（Ａｓｐ）はＤ、グルタミン酸（Ｇｌｕ）はＥ、アスパラギン（Ａｓｎ）はＮ、グルタミン（Ｇｌｎ）はＱ、リジン（Ｌｙｓ）はＫ、アルギニン（Ａｒｇ）はＲ、ヒスチジン（Ｈｉｓ）はＨ、プロリン（Ｐｒｏ）はＰである。
本明細書において、「非極性アミノ酸」には、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、メチオニン、フェニルアラニン、及びトリプトファンが含まれる。また、「非電荷アミノ酸」には、グリシン、セリン、トレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、及びグルタミンが含まれる。また、「酸性アミノ酸」には、アスパラギン酸及びグルタミン酸が含まれる。また、「塩基性アミノ酸」には、リジン、アルギニン、及びヒスチジンが含まれる。
１．ポリペプチド
本発明のポリペプチドの一態様として、下記(1-1)〜(1-4)のいずれかに示すイムノグロブリン結合ドメインを少なくとも１つ含むポリペプチドが挙げられる。
(1-1)配列番号１に示すアミノ酸配列において、第７位、第１３位、第２２位、及び第２９位よりなる群から選択される部位の少なくとも２個以上が、リジン以外の塩基性アミノ酸又は水酸基を有するアミノ酸に置換されているアミノ酸配列を含むイムノグロブリン結合ドメイン。
(1-2)配列番号２に示すアミノ酸配列において、第７位、第１３位、第２２位、及び第２９位よりなる群から選択される部位の少なくとも２個以上が、リジン以外の塩基性アミノ酸又は水酸基を有するアミノ酸に置換されているアミノ酸配列を含むイムノグロブリン結合ドメイン。
(1-3)配列番号３に示すアミノ酸配列において、第７位、第１３位、第２２位、及び第２９位よりなる群から選択される部位の少なくとも２個以上が、リジン以外の塩基性アミノ酸又は水酸基を有するアミノ酸に置換されているアミノ酸配列を含むイムノグロブリン結合ドメイン。
(1-4)配列番号４に示すアミノ酸配列において、第６位、第１２位、第２１位、及び第２８位よりなる群から選択される部位の少なくとも２個以上が、リジン以外の塩基性アミノ酸又は水酸基を有するアミノ酸に置換されているアミノ酸配列を含むイムノグロブリン結合ドメイン。
本発明のポリペプチドの一態様として、下記(1-1)〜(1-4)のいずれかに示すイムノグロブリン結合ドメインを少なくとも１つ含むポリペプチドが挙げられる。
(1-1)配列番号１に示すアミノ酸配列において、第７位、第１３位、第２２位、及び第２９位よりなる群から選択される部位の少なくとも２個以上が、リジン以外の塩基性アミノ酸又は水酸基を有するアミノ酸に置換されているアミノ酸配列を含むイムノグロブリン結合ドメイン。
(1-2)配列番号２に示すアミノ酸配列において、第７位、第１３位、第２２位、及び第２９位よりなる群から選択される部位の少なくとも２個以上が、リジン以外の塩基性アミノ酸又は水酸基を有するアミノ酸に置換されているアミノ酸配列を含むイムノグロブリン結合ドメイン。
(1-3)配列番号３に示すアミノ酸配列において、第７位、第１３位、第２２位、及び第２９位よりなる群から選択される部位の少なくとも２個以上が、リジン以外の塩基性アミノ酸又は水酸基を有するアミノ酸に置換されているアミノ酸配列を含むイムノグロブリン結合ドメイン。
(1-4)配列番号４に示すアミノ酸配列において、第６位、第１２位、第２１位、及び第２８位よりなる群から選択される部位の少なくとも２個以上が、リジン以外の塩基性アミノ酸又は水酸基を有するアミノ酸に置換されているアミノ酸配列を含むイムノグロブリン結合ドメイン。
配列番号１〜４に示すアミノ酸配列は、それぞれPeptostreptococcus magunus 3316株由来のプロテインＬ（配列番号５に示すアミノ酸配列、ＤＤＢＪデータベースＩＤ番号Ｑ５１９１８）に含まれる４つのイムノグロブリン結合ドメインの各アミノ酸配列である。具体的には、配列番号１に示すアミノ酸配列は、配列番号５に示すアミノ酸配列における４６８〜５３７位の領域に存在するイムノグロブリン結合ドメイン（以下、「イムノグロブリン結合ドメイン４」と表記することもある。）に該当し、配列番号２に示すアミノ酸配列は、配列番号５に示すアミノ酸配列における３９４〜４６３位の領域に存在するイムノグロブリン結合ドメイン（以下、「イムノグロブリン結合ドメイン３」と表記することもある。）に該当し、配列番号３に示すアミノ酸配列は、配列番号５に示すアミノ酸配列における３２０〜３８９位の領域に存在するイムノグロブリン結合ドメイン（以下、「イムノグロブリン結合ドメイン２」と表記することもある。）に該当し、配列番号４に示すアミノ酸配列は、配列番号５に示すアミノ酸配列における２４９〜３１７位の領域に存在するイムノグロブリン結合ドメイン（以下、「イムノグロブリン結合ドメイン１」と表記することもある。）に該当する。
イムノグロブリン結合ドメイン１〜４は、図１に示すように、保存性が高く、相同性が高いアミノ酸配列を有している。
また、イムノグロブリン結合ドメイン１〜４は、図２に示すように、Ｎ末端側から、βシート構造（配列番号１〜３に示すアミノ酸配列における第９〜１７位；配列番号４に示すアミノ酸配列における第８〜１６位）（以下、βシート１又はβ１と表記することもある）、βシート構造（配列番号１〜３に示すアミノ酸配列における第２３〜３０位；配列番号４に示すアミノ酸配列における第２２〜２９位）（以下、βシート２又はβ２と表記することもある）、αへリックス構造（配列番号１〜３に示すアミノ酸配列における第３２〜５０位；配列番号４に示すアミノ酸配列における第３１〜４９位）（以下、αへリックス１又はα１と表記することもある）、βシート構造（配列番号１〜３に示すアミノ酸配列における第５３〜５８位；配列番号４に示すアミノ酸配列における第５２〜５７位）（以下、βシート３又はβ３と表記することもある）、及びβシート構造（配列番号１〜３に示すアミノ酸配列における第６３〜６８位；配列番号４に示すアミノ酸配列における第６２〜６７位）（以下、βシート４又はβ４と表記することもある）が連結した状態になっている。なお、図２は、便宜上、イムノグロブリン結合ドメイン４（配列番号１）が形成する三次元構造を示している。
配列番号１〜３に示すアミノ酸配列における第７位及び配列番号４に示すアミノ酸配列における第６位にあるアミノ酸は、βシート１よりもＮ末端側に存在しており、当該アミノ酸は、三次元構造上、αへリックス１中に存在する特定のアミノ酸（配列番号１〜３に示すアミノ酸配列の場合は第３３位のアミノ酸、配列番号４に示すアミノ酸配列の場合は第３２位のアミノ酸）と相互作用し易い場所に位置している。また、配列番号１〜３に示すアミノ酸配列における第１３位及び配列番号４に示すアミノ酸配列における第１２位にあるアミノ酸は、βシート１中に存在しており、当該アミノ酸は、三次元構造上、βシート２中に存在する特定のアミノ酸（配列番号１〜３に示すアミノ酸配列の場合は第２７位のアミノ酸、配列番号４に示すアミノ酸配列の場合は第２６位のアミノ酸）と相互作用し易い場所に位置している。また、配列番号１〜３に示すアミノ酸配列における第２２位及び配列番号４に示すアミノ酸配列における第２１位にあるアミノ酸は、βシート１とβシート２の間のループ領域に存在しており、当該アミノ酸は、三次元構造上、同ループ領域に存在する特定のアミノ酸（配列番号１〜３に示すアミノ酸配列の場合は第２０位のアミノ酸、配列番号４に示すアミノ酸配列の場合は第１９位のアミノ酸）と相互作用し易い位置に配されている。更に、配列番号１〜３に示すアミノ酸配列における第２９位及び配列番号４に示すアミノ酸配列における第２８位にあるアミノ酸は、βシート２中に存在しており、当該アミノ酸は、三次元構造上、βシート１中に存在する特定のアミノ酸（配列番号１〜３に示すアミノ酸配列の場合は第８位及び／又は１１位のアミノ酸、配列番号４に示すアミノ酸配列の場合は第７位及び／又は１０位のアミノ酸）と相互作用し易い位置に配されている。ここでの相互作用は、水素結合や静電的相互作用が考えられる。
本発明のポリペプチドでは、これらのイムノグロブリン結合ドメインのアミノ酸配列において、特定の４つの部位（配列番号１〜３のアミノ酸配列の場合は、第７位、第１３位、第２２位、及び第２９位；配列番号４のアミノ酸配列の場合は、第６位、第１２位、第２１位、及び第２８位）の内２つ以上の部位を特定のアミノ酸に置換することによって、それと相互作用し易い場所に位置している他のアミノ酸との作用によって構造上の安定性が向上し、優れたアルカリ安定性を備えることが可能になっていると考えられる。
前記(1-1)〜(1-3)のイムノグロブリン結合ドメインにおいて、配列番号１〜３に示す各アミノ酸配列における第７位、第１３位、第２２位、及び第２９位の内、アミノ酸置換を導入する部位数は２以上であればよいが、アルカリ安定性をより一層向上させるという観点から、好ましくは３以上、更に好ましくは４（即ち、全て）が挙げられる。
また、前記(1-1)〜(1-3)のイムノグロブリン結合ドメインにおいて、配列番号１〜３に示す各アミノ酸配列における第７位、第１３位、第２２位、及び第２９位の内、３か所についてアミノ酸置換を導入する場合、アミノ酸置換が導入される部位については、これらの４つの部位から任意に選択すればよいが、アルカリ安定性をより一層向上させるという観点から、好ましくは第１３位、第２２位及び第２９位の３つの部位、第７位、第２２位及び第２９位の３つの部位、又は第７位、第１３位及び第２２位の３つの部位；更に好ましくは第１３位、第２２位及び第２９位の３つの部位、又は第7位、第２２位及び第２９位の３つの部位が挙げられる。
前記(1-1)〜(1-3)のイムノグロブリン結合ドメインでは、配列番号１〜３に示す各アミノ酸配列における第７位、第１３位、第２２位、及び第２９位の内、２つ以上の部位に導入されるアミノ酸置換については、リジン以外の塩基性アミノ酸又は水酸基を有するアミノ酸への置換であればよい。置換される塩基性アミノ酸としては、具体的には、アルギニン、ヒスチジン、好ましくはアルギニンが挙げられる。また、置換される水酸基を有するアミノ酸としては、具体的には、トレオニン、セリン、チロシン、好ましくはトレオニンが挙げられる。アルカリ安定性をより一層向上させるという観点から、第７位、第１３位、第２２位、及び第２９位の内、２つ以上の部位に導入されるアミノ酸置換として、アルギニン又はトレオニンへの置換、更に好ましくは、アルギニンへの置換が挙げられる。
前記(1-1)〜(1-3)のイムノグロブリン結合ドメインにおいて、配列番号１〜３に示す各アミノ酸配列における第７位、第１３位、第２２位、及び第２９位の内、２つの部位にアミノ酸置換を導入する場合、アミノ酸置換は、２つともリジン以外の塩基性アミノ酸への置換であることが好ましく、２つともアルギニンへの置換であることが更に好ましい。また、前記(1-1)〜(1-3)のイムノグロブリン結合ドメインにおいて、配列番号１〜３に示す各アミノ酸配列における第７位、第１３位、第２２位、及び第２９位の内、３つの部位にアミノ酸置換を導入する場合、少なくとも２つはリジン以外の塩基性アミノ酸（特に、アルギニン）への置換であることが好ましく、３つともリジン以外の塩基性アミノ酸（特に、アルギニン）への置換であることが更に好ましい。更に、前記(1-1)〜(1-3)のイムノグロブリン結合ドメインにおいて、配列番号１〜３に示す各アミノ酸配列における第７位、第１３位、第２２位、及び第２９位の内、４つの部位にアミノ酸置換を導入する場合、少なくとも２つはリジン以外の塩基性アミノ酸（特に、アルギニン）への置換であることが好ましく、少なくとも３つはリジン以外の塩基性アミノ酸（特に、アルギニン）への置換であることが更に好ましく、４つともリジン以外の塩基性アミノ酸（特に、アルギニン）への置換であることが特に好ましい。
前記(1-1)〜(1-3)のイムノグロブリン結合ドメインのアミノ酸配列の好適な例として、配列番号１〜３における第７位、第１３位、第２２位、及び第２９位の４つの部位がリジン以外の塩基性アミノ酸（特に、アルギニン）に置換されているアミノ酸配列；配列番号１〜３における第７位、第２２位、及び第２９位の３つの部位がリジン以外の塩基性アミノ酸（特に、アルギニン）に置換されているアミノ酸配列；配列番号１〜３に示す各アミノ酸配列における第７位及び第１３位の２つの部位がリジン以外の塩基性アミノ酸（特に、アルギニン）に置換され、且つ第２２位がリジン以外の塩基性アミノ酸（特に、アルギニン又はヒスチジン）又は水酸基を有するアミノ酸（特に、トレオニン）に置換されているアミノ酸配列が挙げられる。これらの中でも、配列番号１〜３に示す各アミノ酸配列における第７位、第１３位、第２２位、及び第２９位の４つの部位がリジン以外の塩基性アミノ酸（特に、アルギニン）に置換されているアミノ酸配列は、卓越したアルカリ安定性を備えており、特に好適である。
前記(1-4)のイムノグロブリン結合ドメインにおいて、配列番号４に示すアミノ酸配列における、第６位、第１２位、第２１位、及び第２８位の内、アミノ酸置換を導入する部位数は２以上であればよいが、アルカリ安定性をより一層向上させるという観点から、好ましくは３以上、更に好ましくは４（即ち、全て）が挙げられる。
また、前記(1-4)のイムノグロブリン結合ドメインにおいて、配列番号４に示すアミノ酸配列における第６位、第１２位、第２１位、及び第２８位の内、３か所についてアミノ酸置換を導入する場合、アミノ酸置換が導入される部位については、これらの４つの部位から任意に選択すればよいが、アルカリ安定性をより一層向上させるという観点から、好ましくは第１２位、第２１位及び第２８位の３つの部位、第６位、第２１位及び第２８位の３つの部位、又は第６位、第１２位及び第２１位の３つの部位；更に好ましくは第１２位、第２１位及び第２８位の３つの部位、又は第６位、第２１位及び第２８位の３つの部位が挙げられる。
前記(1-4)のイムノグロブリン結合ドメインでは、配列番号４に示すアミノ酸配列における第６位、第１２位、第２１位、及び第２８位の内、２つ以上の部位に導入されるアミノ酸置換については、リジン以外の塩基性アミノ酸又は水酸基を有するアミノ酸への置換であればよく、置換される塩基性アミノ酸又は水酸基を有するアミノ酸の具体例、好ましいもの等については、前記(1-1)〜(1-3)のイムノグロブリン結合ドメインの場合と同様である。
前記(1-4)のイムノグロブリン結合ドメインにおいて、配列番号４に示すアミノ酸配列における第６位、第１２位、第２１位、及び第２８位の内、２つの部位にアミノ酸置換を導入する場合、アミノ酸置換は、２つともリジン以外の塩基性アミノ酸への置換であることが好ましく、２つともアルギニンへの置換であることが更に好ましい。また、前記(1-4)のイムノグロブリン結合ドメインにおいて、配列番号４に示すアミノ酸配列における第６位、第１２位、第２１位、及び第２８位の内、３つの部位にアミノ酸置換を導入する場合、少なくとも２つはリジン以外の塩基性アミノ酸（特に、アルギニン）への置換であることが好ましく、３つともリジン以外の塩基性アミノ酸（特に、アルギニン）への置換であることが更に好ましい。更に、前記(1-4)のイムノグロブリン結合ドメインにおいて、配列番号４に示す各アミノ酸配列における第６位、第１２位、第２１位、及び第２８位の内、４つの部位にアミノ酸置換を導入する場合、少なくとも２つはリジン以外の塩基性アミノ酸（特に、アルギニン）への置換であることが好ましく、少なくとも３つはリジン以外の塩基性アミノ酸（特に、アルギニン）への置換であることが更に好ましく、４つともリジン以外の塩基性アミノ酸（特に、アルギニン）への置換であることが特に好ましい。
前記記(1-4)のイムノグロブリン結合ドメインに含まれるアミノ酸配列の好適な例として、配列番号４に示すアミノ酸配列おける第６位、第１２位、第２１位、及び第２８位の４つの部位がリジン以外の塩基性アミノ酸（特に、アルギニン）に置換されているアミノ酸配列；配列番号４に示すアミノ酸配列における第６位、第１２位、及び第２１位の３つの部位がリジン以外の塩基性アミノ酸（特に、アルギニン）に置換されているアミノ酸配列；配列番号４に示すアミノ酸配列における第６位及び第１２位の２つの部位がリジン以外の塩基性アミノ酸（特に、アルギニン）に置換され、且つ第２１位がリジン以外の塩基性アミノ酸（特に、アルギニン又はヒスチジン）又は水酸基を有するアミノ酸（特に、トレオニン）に置換されているアミノ酸配列が挙げられる。これらの中でも、配列番号４に示すアミノ酸配列における第６位、第１２位、第２１位、及び第２８位の４つの部位がリジン以外の塩基性アミノ酸（特に、アルギニン）に置換されているアミノ酸配列は、卓越したアルカリ安定性を備えており、特に好適である。
また、本発明のポリペプチドの他の態様として、下記(2-1)〜(2-4)及び(3-1)〜(3-4)のいずれかに示すイムノグロブリン結合ドメインを少なくとも１つ含むポリペプチドが挙げられる。
(2-1)配列番号１に示すアミノ酸配列における第７位、第１３位、第２２位、及び第２９位よりなる群から選択される少なくとも２つのアミノ酸が、リジン以外の塩基性アミノ酸又は水酸基を有するアミノ酸に置換されているアミノ酸配列において、前記アミノ酸置換部位以外のアミノ酸の１個又は数個が置換、付加、挿入又は欠失されてなり、且つ、イムノグロブリンに対する結合能を有し、配列番号１に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドと比較してアルカリ安定性が向上しているイムノグロブリン結合ドメイン。
(2-2)配列番号２に示すアミノ酸配列における第７位、第１３位、第２２位、及び第２９位よりなる群から選択される少なくとも２つのアミノ酸が、リジン以外の塩基性アミノ酸又は水酸基を有するアミノ酸に置換されているアミノ酸配列において、前記アミノ酸置換部位以外のアミノ酸の１個又は数個が置換、付加、挿入又は欠失されてなり、且つ、イムノグロブリンに対する結合能を有し、配列番号１に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドと比較してアルカリ安定性が向上しているイムノグロブリン結合ドメイン。
(2-3)配列番号３に示すアミノ酸配列における第７位、第１３位、第２２位、及び第２９位よりなる群から選択される少なくとも２つのアミノ酸が、リジン以外の塩基性アミノ酸又は水酸基を有するアミノ酸に置換されているアミノ酸配列において、前記アミノ酸置換部位以外のアミノ酸の１個又は数個が置換、付加、挿入又は欠失されてなり、且つ、イムノグロブリンに対する結合能を有し、配列番号１に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドと比較してアルカリ安定性が向上しているイムノグロブリン結合ドメイン。
(2-4)配列番号４に示すアミノ酸配列における第６位、第１２位、第２１位、及び第２８位よりなる群から選択される少なくとも２つのアミノ酸が、リジン以外の塩基性アミノ酸又は水酸基を有するアミノ酸に置換されているアミノ酸配列において、前記アミノ酸置換部位以外のアミノ酸の１個又は数個が置換、付加、挿入又は欠失されてなり、且つ、イムノグロブリンに対する結合能を有し、配列番号１に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドと比較してアルカリ安定性が向上しているイムノグロブリン結合ドメイン。
(3-1)配列番号１に示すアミノ酸配列における第７位、第１３位、第２２位、及び第２９位よりなる群から選択される少なくとも２つのアミノ酸が、リジン以外の塩基性アミノ酸又は水酸基を有するアミノ酸に置換されているアミノ酸配列において、配列番号１に示すアミノ酸配列に対する前記アミノ酸置換部位を除いた配列同一性が８０％以上であり、且つ、イムノグロブリンに対する結合能を有し、配列番号１に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドと比較してアルカリ安定性が向上しているイムノグロブリン結合ドメイン。
(3-2)配列番号２に示すアミノ酸配列における第７位、第１３位、第２２位、及び第２９位よりなる群から選択される少なくとも２つのアミノ酸が、リジン以外の塩基性アミノ酸又は水酸基を有するアミノ酸に置換されているアミノ酸配列において、配列番号２に示すアミノ酸配列に対する前記アミノ酸置換部位を除いた配列同一性が８０％以上であり、且つ、イムノグロブリンに対する結合能を有し、配列番号２に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドと比較してアルカリ安定性が向上しているイムノグロブリン結合ドメイン。
(3-3)配列番号３に示すアミノ酸配列における第７位、第１３位、第２２位、及び第２９位よりなる群から選択される少なくとも２つのアミノ酸が、リジン以外の塩基性アミノ酸又は水酸基を有するアミノ酸に置換されているアミノ酸配列において、配列番号３に示すアミノ酸配列に対する前記アミノ酸置換部位を除いた配列同一性が８０％以上であり、且つ、イムノグロブリンに対する結合能を有し、配列番号３に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドと比較してアルカリ安定性が向上しているイムノグロブリン結合ドメイン。
(3-4)配列番号４に示すアミノ酸配列における第６位、第１２位、第２１位、及び第２８位よりなる群から選択される少なくとも２つのアミノ酸が、リジン以外の塩基性アミノ酸又は水酸基を有するアミノ酸に置換されているアミノ酸配列において、配列番号４に示すアミノ酸配列に対する前記アミノ酸置換部位を除いた配列同一性が８０％以上であり、且つ、イムノグロブリンに対する結合能を有し、配列番号４に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドと比較してアルカリ安定性が向上しているイムノグロブリン結合ドメイン。
(2-1)配列番号１に示すアミノ酸配列における第７位、第１３位、第２２位、及び第２９位よりなる群から選択される少なくとも２つのアミノ酸が、リジン以外の塩基性アミノ酸又は水酸基を有するアミノ酸に置換されているアミノ酸配列において、前記アミノ酸置換部位以外のアミノ酸の１個又は数個が置換、付加、挿入又は欠失されてなり、且つ、イムノグロブリンに対する結合能を有し、配列番号１に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドと比較してアルカリ安定性が向上しているイムノグロブリン結合ドメイン。
(2-2)配列番号２に示すアミノ酸配列における第７位、第１３位、第２２位、及び第２９位よりなる群から選択される少なくとも２つのアミノ酸が、リジン以外の塩基性アミノ酸又は水酸基を有するアミノ酸に置換されているアミノ酸配列において、前記アミノ酸置換部位以外のアミノ酸の１個又は数個が置換、付加、挿入又は欠失されてなり、且つ、イムノグロブリンに対する結合能を有し、配列番号１に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドと比較してアルカリ安定性が向上しているイムノグロブリン結合ドメイン。
(2-3)配列番号３に示すアミノ酸配列における第７位、第１３位、第２２位、及び第２９位よりなる群から選択される少なくとも２つのアミノ酸が、リジン以外の塩基性アミノ酸又は水酸基を有するアミノ酸に置換されているアミノ酸配列において、前記アミノ酸置換部位以外のアミノ酸の１個又は数個が置換、付加、挿入又は欠失されてなり、且つ、イムノグロブリンに対する結合能を有し、配列番号１に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドと比較してアルカリ安定性が向上しているイムノグロブリン結合ドメイン。
(2-4)配列番号４に示すアミノ酸配列における第６位、第１２位、第２１位、及び第２８位よりなる群から選択される少なくとも２つのアミノ酸が、リジン以外の塩基性アミノ酸又は水酸基を有するアミノ酸に置換されているアミノ酸配列において、前記アミノ酸置換部位以外のアミノ酸の１個又は数個が置換、付加、挿入又は欠失されてなり、且つ、イムノグロブリンに対する結合能を有し、配列番号１に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドと比較してアルカリ安定性が向上しているイムノグロブリン結合ドメイン。
(3-1)配列番号１に示すアミノ酸配列における第７位、第１３位、第２２位、及び第２９位よりなる群から選択される少なくとも２つのアミノ酸が、リジン以外の塩基性アミノ酸又は水酸基を有するアミノ酸に置換されているアミノ酸配列において、配列番号１に示すアミノ酸配列に対する前記アミノ酸置換部位を除いた配列同一性が８０％以上であり、且つ、イムノグロブリンに対する結合能を有し、配列番号１に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドと比較してアルカリ安定性が向上しているイムノグロブリン結合ドメイン。
(3-2)配列番号２に示すアミノ酸配列における第７位、第１３位、第２２位、及び第２９位よりなる群から選択される少なくとも２つのアミノ酸が、リジン以外の塩基性アミノ酸又は水酸基を有するアミノ酸に置換されているアミノ酸配列において、配列番号２に示すアミノ酸配列に対する前記アミノ酸置換部位を除いた配列同一性が８０％以上であり、且つ、イムノグロブリンに対する結合能を有し、配列番号２に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドと比較してアルカリ安定性が向上しているイムノグロブリン結合ドメイン。
(3-3)配列番号３に示すアミノ酸配列における第７位、第１３位、第２２位、及び第２９位よりなる群から選択される少なくとも２つのアミノ酸が、リジン以外の塩基性アミノ酸又は水酸基を有するアミノ酸に置換されているアミノ酸配列において、配列番号３に示すアミノ酸配列に対する前記アミノ酸置換部位を除いた配列同一性が８０％以上であり、且つ、イムノグロブリンに対する結合能を有し、配列番号３に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドと比較してアルカリ安定性が向上しているイムノグロブリン結合ドメイン。
(3-4)配列番号４に示すアミノ酸配列における第６位、第１２位、第２１位、及び第２８位よりなる群から選択される少なくとも２つのアミノ酸が、リジン以外の塩基性アミノ酸又は水酸基を有するアミノ酸に置換されているアミノ酸配列において、配列番号４に示すアミノ酸配列に対する前記アミノ酸置換部位を除いた配列同一性が８０％以上であり、且つ、イムノグロブリンに対する結合能を有し、配列番号４に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドと比較してアルカリ安定性が向上しているイムノグロブリン結合ドメイン。
以下、前記(2-1)〜(2-4)及び(3-1)〜(3-4)のイムノグロブリン結合ドメインにおいて、配列番号１〜３に示す各アミノ酸配列における第７位、第１３位、第２２位、及び第２９位以外のアミノ酸部位、配列番号４に示す各アミノ酸配列における第６位、第１２位、第２１位、及び第２８位以外のアミノ酸部位を、「任意改変部位」と表記することもある。
前記(2-1)及び(3-1)のイムノグロブリン結合ドメインは、前記(1-1)のイムノグロブリン結合ドメインの改変体であり、配列番号１に示すアミノ酸配列における第７位、第１３位、第２２位、及び第２９位の内、少なくとも２つのアミノ酸に導入されるアミノ酸置換の態様、好ましいアミノ酸置換部位等は、前記(1-1)のイムノグロブリン結合ドメインの場合と同様である。
前記(2-2)及び(3-2)のイムノグロブリン結合ドメインは、前記(1-2)のイムノグロブリン結合ドメインの改変体であり、配列番号２に示すアミノ酸配列における第７位、第１３位、第２２位、及び第２９位の内、少なくとも２つのアミノ酸に導入されるアミノ酸置換の態様、好ましいアミノ酸置換部位等は、前記(1-2)のイムノグロブリン結合ドメインの場合と同様である。
前記(2-3)及び(3-3)のイムノグロブリン結合ドメインは、前記(1-3)のイムノグロブリン結合ドメインの改変体であり、配列番号３に示すアミノ酸配列における第７位、第１３位、第２２位、及び第２９位の内、少なくとも２つのアミノ酸に導入されるアミノ酸置換の態様、好ましいアミノ酸置換部位等は、前記(1-3)のイムノグロブリン結合ドメインの場合と同様である。
前記(2-4)及び(3-4)のイムノグロブリン結合ドメインは、前記(1-4)のイムノグロブリン結合ドメインの改変体であり、配列番号４に示すアミノ酸配列における第６位、第１２位、第２１位、及び第２８位の内、少なくとも２つのアミノ酸に導入されるアミノ酸置換の態様、好ましいアミノ酸置換部位等は、前記(1-4)のイムノグロブリン結合ドメインの場合と同様である。
前記(2-1)〜(2-4)のイムノグロブリン結合ドメインの任意改変部位に導入されるアミノ酸の改変は、置換、付加、挿入、および欠失の中から１種類の改変（例えば置換）のみを含むものであってもよく、２種以上の改変（例えば、置換と挿入）を含んでいても良い。前記(2-1)〜(2-4)のイムノグロブリン結合ドメインにおいて、任意改変部位に置換、付加、挿入又は欠失されるアミノ酸は、１個又は複数個若しくは数個であればよく、例えば１〜１３個、好ましくは１〜６個、１〜５個、又は１〜４個、更に好ましくは１〜３個、特に好ましくは１又は２個或いは１個が挙げられる。
また、前記(3-1)〜(3-4)のイムノグロブリン結合ドメインにおいて、配列番号１〜４に示す各アミノ酸配列に対する前記アミノ酸置換部位を除いた配列同一性は、８０％以上であればよいが、好ましくは９０％以上、更に好ましくは９５％以上、特に好ましくは９９％以上が挙げられる。
ここで、前記(3-1)〜(3-4)のイムノグロブリン結合ドメインにおいて、配列番号１〜４に示す各アミノ酸配列に対する前記アミノ酸置換部位を除いた配列同一性とは、配列番号１〜４に示す各アミノ酸配列から前記任意改変部位のみを抜き出して、当該任意改変部位のみを比較して算出される配列同一性である。また、「配列同一性」とは、ＢＬＡＳＴ ＰＡＣＫＡＧＥ［ｓｇｉ３２ ｂｉｔ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｖｅｒｓｉｏｎ ２．０．１２；ａｖａｉｌａｂｌｅ ｆｒｏｍ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）］のｂｌ２ｓｅｑ ｐｒｏｇｒａｍ（Ｔａｔｉａｎａ Ａ．Ｔａｔｓｕｓｏｖａ，Ｔｈｏｍａｓ Ｌ．Ｍａｄｄｅｎ，ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．，Ｖｏｌ．１７４，ｐ２４７−２５０，１９９９）により得られるアミノ酸配列の同一性の値を示す。パラメーターは、Ｇａｐ ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ Ｃｏｓｔ ｖａｌｕｅ：１１、Ｇａｐ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ Ｃｏｓｔ ｖａｌｕｅ：１に設定すればよい。
前記(2-1)〜(2-3)及び(3-1)〜(3-3)のイムノグロブリン結合ドメインにおいて、配列番号１〜３に示す各アミノ酸配列における第８位、第１１位、第２０位、第２７位、及び第３３位のアミノ酸は、前記アミノ酸置換部位に配されるリジン以外の塩基性アミノ酸又は水酸基を有するアミノ酸との相互作用によって、アルカリ安定性の向上に寄与していると考えられることから、これらの部位には置換又は欠失を導入しないことが望ましい。また、前記(2-4)及び(3-4)のイムノグロブリン結合ドメインについても、同様に、配列番号４に示す各アミノ酸配列における第７位、第１０位、第１９位、第２６位、及び第３２位のアミノ酸は、前記アミノ酸置換部位に配されるリジン以外の塩基性アミノ酸又は水酸基を有するアミノ酸との相互作用によって、アルカリ安定性の向上に寄与していると考えられることから、これらの部位には置換又は欠失を導入しないことが望ましい。
前記(2-1)〜(2-3)及び(3-1)〜(3-3)のイムノグロブリン結合ドメインの任意改変部位に導入されるアミノ酸置換の具体的態様として、配列番号１〜３に示す各アミノ酸配列における第２位のアミノ酸がリジンに置換、第４８位のアミノ酸がアルギニンに置換、第６７位のアミノ酸がアルギニンに置換等が挙げられる。また、前記(2-4)及び(3-4)のイムノグロブリン結合ドメインについても、同様に、任意改変部位に導入されるアミノ酸置換の具体的態様として、配列番号４に示すアミノ酸配列における第２位のアミノ酸がリジンに置換、第４７位のアミノ酸がアルギニンに置換、第６６位のアミノ酸がアルギニンに置換等が挙げられる。
また、前記(2-1)〜(2-4)及び(3-1)〜(3-4)のイムノグロブリン結合ドメインの任意改変部位に導入されるアミノ酸置換の他の態様として、保存的置換が挙げられる。即ち、前記任意改変部位における置換としては、例えば、置換前のアミノ酸が非極性アミノ酸であれば他の非極性アミノ酸への置換、置換前のアミノ酸が非荷電性アミノ酸であれば他の非荷電性アミノ酸への置換、置換前のアミノ酸が酸性アミノ酸であれば他の酸性アミノ酸への置換、及び置換前のアミノ酸が塩基性アミノ酸であれば他の塩基性アミノ酸への置換が挙げられる。
前記(2-1)のイムノグロブリン結合ドメインにおいて、「イムノグロブリンに対する結合能を有し、配列番号１に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドと比較してアルカリ安定性が向上している」とは、イムノグロブリンのカッパ鎖に対する結合能があり、且つポリペプチドをアガロースゲル担体に固定した状態で、下記条件で測定した残存活性が、同条件で測定した配列番号１に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドの残存活性よりも高いことを意味する。より具体的には、下記条件で測定したポリペプチドの残存活性が、同条件で測定した配列番号１に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドの残存活性に比べて１．８％以上、好ましくは８％以上、更に好ましくは１８％以上高いことを意味する。なお、前記(2-2)〜(2-4)及び(3-1)〜(3-4)のイムノグロブリン結合ドメインでも、同様である。
（測定条件）
アガロースゲル担体に固定化したポリペプチドに対して、０．１Ｍ ＮａＯＨ水溶液で３回洗浄して同アルカリ溶液に置換した後に２５℃にて１７時間保温する（アルカリ処理）。次いで、ＰＢＳで３回洗浄した後に、ヒトＩｇＧの結合量（ｍｇ/ｍｌゲル）を測定する。アルカリ処理しなかった場合についても、アガロースゲル担体に固定化したポリペプチドのヒトＩｇＧの結合量（ｍｇ/ｍｌゲル）を測定する。アルカリ処理しなかった場合のポリペプチドのヒトＩｇＧの結合量を１００％として、アルカリ処理後のポリペプチドのヒトＩｇＧの結合量の割合を残存活性（％）として算出する。
（測定条件）
アガロースゲル担体に固定化したポリペプチドに対して、０．１Ｍ ＮａＯＨ水溶液で３回洗浄して同アルカリ溶液に置換した後に２５℃にて１７時間保温する（アルカリ処理）。次いで、ＰＢＳで３回洗浄した後に、ヒトＩｇＧの結合量（ｍｇ/ｍｌゲル）を測定する。アルカリ処理しなかった場合についても、アガロースゲル担体に固定化したポリペプチドのヒトＩｇＧの結合量（ｍｇ/ｍｌゲル）を測定する。アルカリ処理しなかった場合のポリペプチドのヒトＩｇＧの結合量を１００％として、アルカリ処理後のポリペプチドのヒトＩｇＧの結合量の割合を残存活性（％）として算出する。
前記(1-1)〜(1-4)、(2-1)〜(2-4)及び(3-1)〜(3-4)のイムノグロブリン結合ドメインの中でも、前記(1-1)、(2-1)及び(3-1)のイムノグロブリン結合ドメインは、イムノグロブリンに対する結合能、及びアルカリ安定性が格段に優れており、本発明のポリペプチドに含まれるイムノグロブリン結合ドメインとして特に好適である。
本発明のポリペプチドは、イムノグロブリン結合ドメインを１個有する単ドメイン型ポリペプチドであってもよく、またイムノグロブリン結合ドメインを２個以上連結した複ドメイン型ポリペプチドであってもよい。本発明のポリペプチドが複ドメイン型ポリペプチドである場合には、イムノグロブリンのカッパ鎖含有断片の結合能が高くなるという利点がある。
本発明のポリペプチドが単ドメイン型ポリペプチドである場合には、前記(1-1)〜(1-4)、(2-1)〜(2-4)及び(3-1)〜(3-4)のイムノグロブリン結合ドメインの内の１個のドメインが含まれていればよい。
また、本発明のポリペプチドが複ドメイン型ポリペプチドである場合には、前記(1-1)〜(1-4)、(2-1)〜(2-4)及び(3-1)〜(3-4)のイムノグロブリン結合ドメインの内、少なくとも１個のドメインが含まれていればよく、前記(1-1)〜(1-4)、(2-1)〜(2-4)及び(3-1)〜(3-4)のイムノグロブリン結合ドメインの内、２個以上のドメインからなるものであってもよく、また、前記(1-1)〜(1-4)、(2-1)〜(2-4)及び(3-1)〜(3-4)のイムノグロブリン結合ドメインの内、１個以上のドメインと、プロテインＬを構成している野生型の各イムノグロブリン結合ドメイン（配列番号１〜４に示すアミノ酸配列）やプロテインＡを構成している各イムノグロブリン結合ドメインが１個以上含まれているものであってもよい。本発明のポリペプチドが複ドメイン型ポリペプチドである場合、より一層優れたアルカリ安定性を備えさせるという観点から、構成するイムノグロブリン結合ドメインの全てが、前記(1-1)〜(1-4)、(2-1)〜(2-4)及び(3-1)〜(3-4)のイムノグロブリン結合ドメインのいずれかであるものが好ましい。
本発明のポリペプチドを複ドメイン型ポリペプチドにする場合、連結されているイムノグロブリン結合ドメインの総数については、２個以上であればよいが、好ましくは２〜１０個、更に好ましくは２〜６個が挙げられる。
本発明のポリペプチドを複ドメイン型ポリペプチドにする場合、構成する各イムノグロブリン結合ドメインは、それぞれのＣ末端とＮ末端が直接連結されていてもよく、また各各イムノグロブリン結合ドメイン間が１〜４０個、好ましくは１〜１０個のアミノ酸残基を介して連結されていてもよい。
また、本発明のポリペプチドは、担体への結合性の付与、ポリペプチドの発現の向上、精製の容易性の付与等のために、他の機能を有するポリペプチド、ペプチドタグ等がＮ末端側又はＣ末端側に付加されていてもよい。このような目的で、本発明のポリペプチドのＮ末端側及び／又はＣ末端側に付加されるアミノ酸の数については、特に制限されないが、例えば１〜４００個、好ましくは１〜１００個、更に好ましくは１〜３０個が挙げられる。
２．ＤＮＡ
本発明のポリペプチドをコードしているＤＮＡ（以下、「本発明のＤＮＡ」と表記することもある）は、例えば、野生型のプロテインＬ（配列番号５）をコードしているＤＮＡを鋳型として、目的のイムノグロブリン結合ドメインをコードしているＤＮＡをＰＣＲ等によって取得し、当該ＤＮＡに前記アミノ酸置換が導入されるように変異を導入することにより得ることができる。また、本発明のＤＮＡは、遺伝子の合成法によって人工合成することもできる。
本発明のポリペプチドをコードしているＤＮＡ（以下、「本発明のＤＮＡ」と表記することもある）は、例えば、野生型のプロテインＬ（配列番号５）をコードしているＤＮＡを鋳型として、目的のイムノグロブリン結合ドメインをコードしているＤＮＡをＰＣＲ等によって取得し、当該ＤＮＡに前記アミノ酸置換が導入されるように変異を導入することにより得ることができる。また、本発明のＤＮＡは、遺伝子の合成法によって人工合成することもできる。
ここで、Peptostreptococcus magunus 3316株由来の野生型のプロテインＬ（配列番号５）をコードしているＤＮＡは、例えば、配列番号６に示す塩基配列として知られており、Peptostreptococcus magunus3316株からＰＣＲを用いた定法により単離することができる。また、Peptostreptococcus magunus 3316株由来の野生型のプロテインＬをコードしているＤＮＡは、遺伝子の合成法によって人工合成することもできる。
塩基配列の特定の部位に特定の変異を導入する方法は公知であり、例えばＤＮＡの部位特異的変異導入法等が利用できる。ＤＮＡ中の塩基を変換する具体的な方法としては、例えば、市販のキットを用いて行うこともできる。
塩基配列に変異を導入したＤＮＡは、ＤＮＡシーケンサーを用いて塩基配列を確認することができる。一旦、塩基配列が確定されると、その後は化学合成、クローニングされたプローブを鋳型としたＰＣＲ、又は当該塩基配列を有するＤＮＡ断片をプローブとするハイブリダイゼーションによって、前記ポリペプチドをコードするＤＮＡを得ることができる。
また、部位特異的突然変異誘発法等によって前記ペプチドをコードするＤＮＡの変異型であって変異前と同等の機能を有するものを合成することができる。なお、前記ペプチドをコードするＤＮＡに変異を導入するには、Ｋｕｎｋｅｌ法、Ｇａｐｐｅｄ ｄｕｐｌｅｘ法、メガプライマーＰＣＲ法等の公知の手法によって行うことができる。
本発明のＤＮＡの一例として、配列番号７に示す塩基配列が挙げられる。配列番号７に示す塩基配列からなるＤＮＡは、配列番号１に示すアミノ酸配列における第７位、第１３位、第２２位及び第２９位がアルギニンに置換されたアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードしているＤＮＡである。
また、本発明のＤＮＡには、イムノグロブリンに対する結合能を有し、配列番号１に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドと比較してアルカリ安定性が向上しているイムノグロブリン結合ドメインをコードし、且つ、配列番号７に示す塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列を含むＤＮＡと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡが包含される。
ここで、「ストリンジェントな条件下」とは、０．５％ＳＤＳ、５×デンハルツ〔Ｄｅｎｈａｒｔｚ’ｓ、０．１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、０．１％ポリビニルピロリドン、０．１％フィコール４００〕および１００μｇ／ｍｌサケ精子ＤＮＡを含む６×ＳＳＣ（１×ＳＳＣは、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．０１５Ｍ クエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）中で、５０℃〜６５℃で４時間〜一晩保温する条件をいう。
ストリンジェントな条件下でのハイブリダイゼーションは、具体的には、以下の手法によって行われる。即ち、ＤＮＡライブラリー又はｃＤＮＡライブラリーを固定化したナイロン膜を作成し、６×ＳＳＣ、０．５％ ＳＤＳ、５×デンハルツ、１００μｇ／ｍｌサケ精子ＤＮＡを含むプレハイブリダイゼーション溶液中、６５℃でナイロン膜をブロッキングする。その後、32Ｐでラベルした各プローブを加えて、６５℃で一晩保温する。このナイロン膜を６×ＳＳＣ中、室温で１０分間、０．１％ＳＤＳを含む２×ＳＳＣ中、室温で１０分間、０．１％ＳＤＳを含む０．２×ＳＳＣ中、４５℃で３０分間洗浄した後、オートラジオグラフィーをとり、プローブと特異的にハイブリダイズしているＤＮＡを検出することができる。
更に、本発明のＤＮＡには、イムノグロブリンに対する結合能を有し、配列番号１に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドと比較してアルカリ安定性が向上しているイムノグロブリン結合ドメインをコードし、且つ配列番号７に示す塩基配列からなるＤＮＡに８０％以上の相同性を有するＤＮＡも包含される。当該相同性として、好ましくは９０％以上、更に好ましくは９５％以上、特に好ましくは９８％以上が挙げられる。
ここで、ＤＮＡの「相同性」とは、ＢＬＡＳＴ ＰＡＣＫＡＧＥ［ｓｇｉ３２ ｂｉｔ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｖｅｒｓｉｏｎ ２．０．１２；ａｖａｉｌａｂｌｅ ｆｒｏｍ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）］のｂｌ２ｓｅｑ ｐｒｏｇｒａｍ（Ｔａｔｉａｎａ Ａ． Ｔａｔｓｕｓｏｖａ，Ｔｈｏｍａｓ Ｌ．Ｍａｄｄｅｎ，ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．，Ｖｏｌ．１７４，２４７−２５０，１９９９）により得られる同一性の値を示す。パラメーターは、Ｇａｐ ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ Ｃｏｓｔ ｖａｌｕｅ：１１、Ｇａｐ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ Ｃｏｓｔ ｖａｌｕｅ：１に設定すればよい。
本発明のＤＮＡは、コドン利用頻度を宿主に最適化したものが好ましい。例えば、宿主として大腸菌を使用する場合であれば、コドン利用頻度を大腸菌に最適化させたＤＮＡが好適である。
３．組換えベクター
本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡを含む組換えベクター（以下、「本発明の組換えベクター」と表記することもある）は、発現ベクターに本発明のＤＮＡを挿入することにより得ることができる。
本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡを含む組換えベクター（以下、「本発明の組換えベクター」と表記することもある）は、発現ベクターに本発明のＤＮＡを挿入することにより得ることができる。
本発明の組換えベクターには、本発明のＤＮＡに作動可能に連結されたプロモーター等の制御因子が含まれる。制御因子としては、代表的にはプロモーターが挙げられるが、更に必要に応じてエンハンサー、ＣＣＡＡＴボックス、ＴＡＴＡボックス、ＳＰＩ部位等の転写要素が含まれていてもよい。また、作動可能に連結とは、本発明のＤＮＡを調節するプロモーター、エンハンサー等の種々の制御因子と本発明のＤＮＡが、宿主細胞中で作動し得る状態で連結されることをいう。
発現ベクターとしては、宿主内で自律的に増殖し得るファージ、プラスミド、又はウイルスから遺伝子組換え用として構築されたものが好適である。このような発現ベクターは公知であり、例えば、商業的に入手可能な発現ベクターとしては、ｐＱＥ系ベクター（株式会社キアゲン）、ｐＤＲ５４０、ｐＲＩＴ２Ｔ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス株式会社）、ｐＥＴ系ベクター（メルク株式会社）等が挙げられる。発現ベクターは、宿主細胞との適切な組み合わせを選んで使用すればよく、例えば、大腸菌を宿主細胞とする場合には、ｐＥＴ系ベクターとＢＬ２１（ＤＥ３）大腸菌株の組み合わせ、又はｐＤＲ５４０ベクターとＪＭ１０９大腸菌株の組み合わせなどが好ましく挙げられる。
４．形質転換体
本発明の組換えベクターを用いて宿主を形質転換することによって形質転換体（以下、「本発明の形質転換体」と表記することもある）が得られる。
本発明の組換えベクターを用いて宿主を形質転換することによって形質転換体（以下、「本発明の形質転換体」と表記することもある）が得られる。
形質転換体の製造に使用される宿主としては、組換えベクターが安定であり、且つ自律増殖可能で外来性遺伝子の形質を発現できるのであれば特に制限されないが、例えば、大腸菌（Escherichia coli）等のエッシェリヒア属、バチルス・ズブチリス（Bacillus subtilis）等のバチルス属、シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）等のシュードモナス属等に属する細菌；酵母等が好適な例として挙げられるが、その他、動物細胞、昆虫細胞、植物等であってもよい。これらの中でも大腸菌が特に好ましい。
本発明の形質転換体は、宿主に本発明の組換えベクターを導入することによって得ることができ、宿主に組換えベクターを導入する条件は、宿主の種類等に応じて適宜設定すればよい。宿主が細菌の場合であれば、例えば、カルシウムイオン処理によるコンピテントセルを用いる方法及びエレクトロポレーション法等が挙げられる。宿主が酵母の場合であれば、例えば、電気穿孔法（エレクトロポレーション法）、スフェロプラスト法及び酢酸リチウム法等が挙げられる。宿主が動物細胞の場合であれば、例えば、エレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法及びリポフェクション法等が挙げられる。宿主が昆虫細胞の場合であれば、例えば、リン酸カルシウム法、リポフェクション法及びエレクトロポレーション法等が挙げられる。宿主が植物の場合であれば、例えば、エレクトロポレーション法、アグロバクテリウム法、パーティクルガン法及びＰＥＧ法等が挙げられる。
５．ポリペプチドの製造
本発明のポリペプチドは、前記形質転換体を培養することによって製造することができる。
本発明のポリペプチドは、前記形質転換体を培養することによって製造することができる。
形質転換体の培養条件は、宿主の栄養生理的性質を考慮して適宜設定すればよいが、好ましくは液体培養が挙げられる。また、工業的製造を行う場合であれば、通気攪拌培養が好ましい。
本発明の形質転換体を培養し、培養液を遠心分離等の方法により培養上清又は菌体を回収する。本発明のポリペプチドが菌体内に蓄積されている場合であれば、菌体を超音波、フレンチプレス等の機械的方法又はリゾチーム等の溶菌酵素により処理を施し、必要に応じてプロテアーゼ等の酵素やドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）等の界面活性剤を使用することにより可溶化し、本発明のポリペプチドを含む水溶性画分を得ることができる。
また、適当な発現ベクターと宿主を選択することにより、発現した本発明のポリペプチドを培養液中に分泌させることもできる。
上記のようにして得られた本発明のポリペプチドを含む培養液又は水溶性画分は、そのまま精製処理に供してもよいが、当該培養液又は水溶性画分中の本発明のポリペプチドを濃縮した後に精製処理に供してもよい。
濃縮は、例えば、減圧濃縮、膜濃縮、塩析処理、親水性有機溶媒（例えば、メタノール、エタノールおよびアセトン）による分別沈殿法等により行うことができる。
本発明のポリペプチドの精製処理は、例えば、ゲルろ過、疎水性クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等の方法を適宜組み合わせることによって行うことができる。
このようにして精製された本発明のポリペプチは、必要に応じて、凍結乾燥、真空乾燥、スプレードライ等により粉末化してもよい。
６．イムノグロブリン結合担体
本発明のポリペプチドは、イムノグロブリンの回収や精製を簡便に行うために、不溶性担体に固定化され、イムノグロブリン結合担体として使用される。本発明のポリペプチドの固定化に使用される不溶性担体としては、特に制限されないが、例えば、キトサン、デキストラン、セルロース、アガロースなどの天然由来の高分子材料；ビニルアルコール、ポリイミド、メタクリレートなどの合成有機材料；ガラス、シリカ等の無機材料等が挙げられる。
本発明のポリペプチドは、イムノグロブリンの回収や精製を簡便に行うために、不溶性担体に固定化され、イムノグロブリン結合担体として使用される。本発明のポリペプチドの固定化に使用される不溶性担体としては、特に制限されないが、例えば、キトサン、デキストラン、セルロース、アガロースなどの天然由来の高分子材料；ビニルアルコール、ポリイミド、メタクリレートなどの合成有機材料；ガラス、シリカ等の無機材料等が挙げられる。
不溶性担体の形状については、特に制限されず、中空糸膜状、モノリス状、ビーズ状等のいずれの形状のものであってもよい。これらの形状の中でも、ビーズ状は、一般的に、体積当たりの表面積が比較的大きく、イムノグロブリン結合能の高いアフィニティー担体の製造に適しているので、好適である。
本発明のポリペプチドを不溶性担体に固定化するには、例えば、本発明のポリペプチド中のアミノ基、カルボキシル基、又はチオール基を不溶性担体とカップリング反応させればよい。具体的には、不溶性担体に対して、シアノゲンブロミド、エピクロロヒドリン、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、トシルクロリド、トレシルクロリド、カルボジイミド、グルタルアルデヒド、ヒドラジン等のカップリング剤と反応させて活性化したり、或は担体にカルボキシル基やチオール基等の反応性官能基を導入したりした後に、本発明のポリペプチドとカップリング反応を行う固定化方法が挙げられる。このようなカップリング反応は、当該技術分野において周知であり（例えば、Ｊａｎｓｏｎ, Ｊ.-Ｃ., 編集［Ｐｒｏｔｅｉｎ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ］、第３版、２２１−２５８頁、ＩＳＢＮ ９７８−０−４７１−７４６６１−４）、慣用されている方法に従って行うことができる。
また、本発明のポリペプチド中のアミノ基を介して不溶性担体に固定化する場合であれば、アミノ基と反応して共有結合を形成できる反応性官能基（トレシル基、エポキシ基、カルボキシル基、ホルミル基等）を有する担体を用いることが望ましい。このような不溶性担体としては、トヨパールＡＦ−トレシル−６５０、トヨパールＡＦ−エポキシ−６５０、トヨパールＡＦ−カルボキシ−６５０、トヨパールＡＦ−ホルミル−６５０（以上、東ソー株式会社）、ＮＨＳ活性化セファロース、臭化シアン活性化セファロース、エポキシ活性化セファロース（以上、ＧＥヘルスケアバイオサイエンス株式会社）、プロフィニティエポキシド（バイオラッド株式会社）、グリオキサール−アガロース（アガロースビーズテクノロジーズ株式会社）、セルファインホルミル（ＪＮＣ株式会社）等として市販されており、これらの市販品を使用することができる。
更に、本発明のポリペプチドと不溶性担体が共存する系に、カルボジイミドやグルタルアルデヒド等の縮合又は架橋試薬を加えることによって、本発明のポリペプチドを不溶性担体に固定化することもできる。
７．イムノグロブリン又はその断片の分離方法
本発明のポリペプチドは、イムノグロブリンのカッパ鎖に結合するので、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ等のイムノグロブリン、及びこれらのカッパ鎖含有断片（Ｆａｂ断片等）等の分離に使用できる。
本発明のポリペプチドは、イムノグロブリンのカッパ鎖に結合するので、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ等のイムノグロブリン、及びこれらのカッパ鎖含有断片（Ｆａｂ断片等）等の分離に使用できる。
本発明のポリペプチドを用いてイムノグロブリン又はその断片を分離するには、本発明のポリペプチドを固定化した不溶性担体を使用すればよい。具体的には、本発明のポリペプチドを固定化した不溶性担体を用いたイムノグロブリンの分離は、アフィニティーカラム・クロマトグラフィー法によって行うことができる。
アフィニティーカラム・クロマトグラフィー法によってイムノグロブリンを分離するには、本発明のポリペプチドを固定化した不溶性担体を充填したカラムに、イムノグロブリン又はその断片を含む溶液を通液させた後に、カラム内部を洗浄し、次いで、適切なｐＨに調整した溶出液をカラムに通液することによって、イムノグロブリンを溶出させればよい。
以下、実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定して解釈されるものではない。
参考例１：ペプトストレプトコッカスマグナス由来プロテインＬのイムノグロブリン結合ドメインタンパク質の製造と結合活性及びアルカリ安定性の評価
［各イムノグロブリン結合ドメインの製造］
［設計と改変体の構築］
イムノグロブリン結合ドメイン１を含むキメラタンパク質をＰＬ−０２１、イムノグロブリン結合ドメイン２を含むキメラタンパク質をＰＬ−０２２、イムノグロブリン結合ドメイン３を含むキメラタンパク質をＰＬ−０２３、及びイムノグロブリン結合ドメイン４を含むキメラタンパク質をＰＬ−０１４と命名した。
［各イムノグロブリン結合ドメインの製造］
［設計と改変体の構築］
イムノグロブリン結合ドメイン１を含むキメラタンパク質をＰＬ−０２１、イムノグロブリン結合ドメイン２を含むキメラタンパク質をＰＬ−０２２、イムノグロブリン結合ドメイン３を含むキメラタンパク質をＰＬ−０２３、及びイムノグロブリン結合ドメイン４を含むキメラタンパク質をＰＬ−０１４と命名した。
［ＰＬ−０１４の発現プラスミド作成］
まず互いの３’末端側の約１５塩基が相補的な合成オリゴＤＮＡ oligo-166（配列番号８）及びoligo-167（配列番号９）を互いの鋳型にしたPCRにより、ＤＮＡフラグメントA1（イムノグロブリンカッパ軽鎖結合ドメイン４の前半部分）を作成した。同様にして合成オリゴＤＮＡ oligo-168（配列番号１０）及びoligo-169（配列番号１１）を用いたPCRにより、ＤＮＡフラグメントA2（イムノグロブリンカッパ軽鎖結合ドメイン４の後半部分）を作成した。次に、ＤＮＡフラグメントA1及びＤＮＡフラグメントA2を制限酵素ＥｃｏＲＩで切断し、ライゲーション反応により互いに連結してＤＮＡフラグメントA3を得た。次いで、ＤＮＡフラグメントA3を鋳型とし、ＮｄｅＩ認識配列を持つ翻訳開始コドンと人工Ｎ末端配列「ＭＡＱＨＤＥＡＧＬＡＬ」（配列番号１２）をコードする配列を含んだ合成オリゴＤＮＡ oligo-178（配列番号１３）をフォワードプライマー、人工配列「ＮＩＫＦＡＧＡＬ」をコードする配列内にＥｃｏＯ１０９Ｉ認識配列を含んだ合成オリゴＤＮＡ oligo-170（配列番号１４）をリバースプライマーとしたPCRにより、ＤＮＡフラグメントA4を作成した。また別に、人工配列「ＦＡＧＡＬＰＳＫＳ」をコードする配列内にＥｃｏＯ１０９Ｉ認識配列を含んだ合成オリゴＤＮＡ oligo-189（配列番号１５）をフォワードプライマー、人工Ｃ末端配列「ＡＱＡＰＫＫＫＫ」をコードする配列内に続いて翻訳終止コドンとＢａｍＨＩ認識配列を含んだ合成オリゴＤＮＡ oligo-191（配列番号１６）をリバースプライマーとして用い、特許文献１に示されている改変プロテインＡ由来イムノグロブリンＦｃ結合Ｃドメインの第３αへリックス部分配列（８個のリジンを含む２１残基のαへリックス部分配列；配列番号１７）とそれに続く３残基のリジンからなる配列（配列番号１８）をコードするＤＮＡフラグメント5を作成した。ＤＮＡフラグメントA4をＮｄｅＩ及びＥｃｏＯ１０９Ｉにて切断し、ＤＮＡフラグメント5をＥｃｏＯ１０９Ｉ及びＢａｍＨＩにて切断して、一度にｐＥＴ−９ａプラスミド（ノバジェン、メルク株式会社）上のＮｄｅＩ−ＢａｍＨＩ部分に組み込むことにより、Ｎ末端側から、人工Ｎ末端配列１１残基（配列番号１２）、プロテインＬのイムノグロブリンカッパ軽鎖結合ドメイン４の７０残基（配列番号１）、アラニン−ロイシンからなる連結配列２残基、プロテインＡ由来イムノグロブリンＦｃ結合Ｃドメイン第３αへリックスの改変Ｃ末端配列２１残基（配列番号１７）、及び人工Ｃ末端配列３残基（配列番号１８）がこの順で連結されたキメラタンパク質ＰＬ−０１４の発現プラスミドを得た。
まず互いの３’末端側の約１５塩基が相補的な合成オリゴＤＮＡ oligo-166（配列番号８）及びoligo-167（配列番号９）を互いの鋳型にしたPCRにより、ＤＮＡフラグメントA1（イムノグロブリンカッパ軽鎖結合ドメイン４の前半部分）を作成した。同様にして合成オリゴＤＮＡ oligo-168（配列番号１０）及びoligo-169（配列番号１１）を用いたPCRにより、ＤＮＡフラグメントA2（イムノグロブリンカッパ軽鎖結合ドメイン４の後半部分）を作成した。次に、ＤＮＡフラグメントA1及びＤＮＡフラグメントA2を制限酵素ＥｃｏＲＩで切断し、ライゲーション反応により互いに連結してＤＮＡフラグメントA3を得た。次いで、ＤＮＡフラグメントA3を鋳型とし、ＮｄｅＩ認識配列を持つ翻訳開始コドンと人工Ｎ末端配列「ＭＡＱＨＤＥＡＧＬＡＬ」（配列番号１２）をコードする配列を含んだ合成オリゴＤＮＡ oligo-178（配列番号１３）をフォワードプライマー、人工配列「ＮＩＫＦＡＧＡＬ」をコードする配列内にＥｃｏＯ１０９Ｉ認識配列を含んだ合成オリゴＤＮＡ oligo-170（配列番号１４）をリバースプライマーとしたPCRにより、ＤＮＡフラグメントA4を作成した。また別に、人工配列「ＦＡＧＡＬＰＳＫＳ」をコードする配列内にＥｃｏＯ１０９Ｉ認識配列を含んだ合成オリゴＤＮＡ oligo-189（配列番号１５）をフォワードプライマー、人工Ｃ末端配列「ＡＱＡＰＫＫＫＫ」をコードする配列内に続いて翻訳終止コドンとＢａｍＨＩ認識配列を含んだ合成オリゴＤＮＡ oligo-191（配列番号１６）をリバースプライマーとして用い、特許文献１に示されている改変プロテインＡ由来イムノグロブリンＦｃ結合Ｃドメインの第３αへリックス部分配列（８個のリジンを含む２１残基のαへリックス部分配列；配列番号１７）とそれに続く３残基のリジンからなる配列（配列番号１８）をコードするＤＮＡフラグメント5を作成した。ＤＮＡフラグメントA4をＮｄｅＩ及びＥｃｏＯ１０９Ｉにて切断し、ＤＮＡフラグメント5をＥｃｏＯ１０９Ｉ及びＢａｍＨＩにて切断して、一度にｐＥＴ−９ａプラスミド（ノバジェン、メルク株式会社）上のＮｄｅＩ−ＢａｍＨＩ部分に組み込むことにより、Ｎ末端側から、人工Ｎ末端配列１１残基（配列番号１２）、プロテインＬのイムノグロブリンカッパ軽鎖結合ドメイン４の７０残基（配列番号１）、アラニン−ロイシンからなる連結配列２残基、プロテインＡ由来イムノグロブリンＦｃ結合Ｃドメイン第３αへリックスの改変Ｃ末端配列２１残基（配列番号１７）、及び人工Ｃ末端配列３残基（配列番号１８）がこの順で連結されたキメラタンパク質ＰＬ−０１４の発現プラスミドを得た。
［ＰＬ−０２１の発現プラスミド作成］
ＰＬ−０１４の発現プラスミド作成と同様に、まず互いの３’末端側の約１５塩基が相補的な合成オリゴＤＮＡ oligo-193（配列番号１９）及びoligo-194（配列番号２０）を互いの鋳型にしたPCRにより、ＤＮＡフラグメントB１を作成した。同様にして合成オリゴＤＮＡ oligo-195（配列番号２１）及びoligo-196（配列番号２２）を用いたPCRにより、ＤＮＡフラグメントB2を作成した。次にＤＮＡフラグメントB１及びＤＮＡフラグメントB2を鋳型とし、合成オリゴＤＮＡ oligo-178（配列番号１３）及びoligo-196（配列番号２１）をプライマーとしたPCRによりＤＮＡフラグメントB3を得た。ＤＮＡフラグメントB3をＮｄｅＩ及びＥｃｏＯ１０９Ｉにて切断し、ＥｃｏＯ１０９Ｉ及びＢａｍＨＩにて切断したＤＮＡフラグメント5とともに一度にｐＥＴ−９ａプラスミド上のＮｄｅＩ−ＢａｍＨＩ部分に組み込むことにより、Ｎ末端側から、人工Ｎ末端配列１１残基（配列番号１２）、プロテインＬのイムノグロブリンカッパ軽鎖結合ドメイン１の６９残基（配列番号４）、アラニン−ロイシンからなる連結配列２残基、プロテインＡ由来イムノグロブリンＦｃ結合Ｃドメイン第３αへリックスの改変Ｃ末端配列２１残基（配列番号１７）、及び人工Ｃ末端配列３残基（配列番号１８）がこの順で連結されたキメラタンパク質ＰＬ−０２１の発現プラスミドを得た。
ＰＬ−０１４の発現プラスミド作成と同様に、まず互いの３’末端側の約１５塩基が相補的な合成オリゴＤＮＡ oligo-193（配列番号１９）及びoligo-194（配列番号２０）を互いの鋳型にしたPCRにより、ＤＮＡフラグメントB１を作成した。同様にして合成オリゴＤＮＡ oligo-195（配列番号２１）及びoligo-196（配列番号２２）を用いたPCRにより、ＤＮＡフラグメントB2を作成した。次にＤＮＡフラグメントB１及びＤＮＡフラグメントB2を鋳型とし、合成オリゴＤＮＡ oligo-178（配列番号１３）及びoligo-196（配列番号２１）をプライマーとしたPCRによりＤＮＡフラグメントB3を得た。ＤＮＡフラグメントB3をＮｄｅＩ及びＥｃｏＯ１０９Ｉにて切断し、ＥｃｏＯ１０９Ｉ及びＢａｍＨＩにて切断したＤＮＡフラグメント5とともに一度にｐＥＴ−９ａプラスミド上のＮｄｅＩ−ＢａｍＨＩ部分に組み込むことにより、Ｎ末端側から、人工Ｎ末端配列１１残基（配列番号１２）、プロテインＬのイムノグロブリンカッパ軽鎖結合ドメイン１の６９残基（配列番号４）、アラニン−ロイシンからなる連結配列２残基、プロテインＡ由来イムノグロブリンＦｃ結合Ｃドメイン第３αへリックスの改変Ｃ末端配列２１残基（配列番号１７）、及び人工Ｃ末端配列３残基（配列番号１８）がこの順で連結されたキメラタンパク質ＰＬ−０２１の発現プラスミドを得た。
［ＰＬ−０２２の発現プラスミド作成］
プロテインＬのイムノグロブリンカッパ軽鎖結合ドメイン２はドメイン４とＮ末端から37残基が同一配列であるので、先に作成したＤＮＡフラグメントA１をそのまま使用した。また互いの３’末端側の約１５塩基が相補的な合成オリゴＤＮＡ oligo-199（配列番号２３）及びoligo-201（配列番号２４）を互いの鋳型にしたPCRにより、ＤＮＡフラグメントC2を作成した。次にＤＮＡフラグメントA１及びフラグメントC2を制限酵素ＥｃｏＲＩで切断し、ライゲーション反応により互いに連結してＤＮＡフラグメントC3を得た。ＰＬ−０１４の発現プラスミドを鋳型として、合成オリゴＤＮＡ oligo-200（配列番号２５）及びoligo-191（配列番号１６）をプライマーとしたPCRにより、ＤＮＡフラグメントC4を作成した。ＤＮＡフラグメントC3及びＤＮＡフラグメントC4は部分的に重複する配列を持つように設計されており、これらを鋳型として合成オリゴＤＮＡ oligo-178（配列番号１３）及びoligo-191（配列番号１６）をプライマーとしたPCRにより、ＰＬ−０２２をコードするｃＤＮＡが得られた。このｃＤＮＡをＮｄｅＩ及びＢａｍＨＩにて切断し、ｐＥＴ−９ａプラスミド上のＮｄｅＩ−ＢａｍＨＩ部分に組み込むことにより、Ｎ末端側から、人工Ｎ末端配列１１残基（配列番号１２）、プロテインＬのイムノグロブリンカッパ軽鎖結合ドメイン２の７０残基（配列番号３）、アラニン−ロイシンからなる連結配列２残基、プロテインＡ由来イムノグロブリンＦｃ結合Ｃドメイン第３αへリックスの改変Ｃ末端配列２１残基（配列番号１７）、及び人工Ｃ末端配列３残基（配列番号１８）がこの順で連結されたキメラタンパク質ＰＬ−０２２の発現プラスミドを得た。
プロテインＬのイムノグロブリンカッパ軽鎖結合ドメイン２はドメイン４とＮ末端から37残基が同一配列であるので、先に作成したＤＮＡフラグメントA１をそのまま使用した。また互いの３’末端側の約１５塩基が相補的な合成オリゴＤＮＡ oligo-199（配列番号２３）及びoligo-201（配列番号２４）を互いの鋳型にしたPCRにより、ＤＮＡフラグメントC2を作成した。次にＤＮＡフラグメントA１及びフラグメントC2を制限酵素ＥｃｏＲＩで切断し、ライゲーション反応により互いに連結してＤＮＡフラグメントC3を得た。ＰＬ−０１４の発現プラスミドを鋳型として、合成オリゴＤＮＡ oligo-200（配列番号２５）及びoligo-191（配列番号１６）をプライマーとしたPCRにより、ＤＮＡフラグメントC4を作成した。ＤＮＡフラグメントC3及びＤＮＡフラグメントC4は部分的に重複する配列を持つように設計されており、これらを鋳型として合成オリゴＤＮＡ oligo-178（配列番号１３）及びoligo-191（配列番号１６）をプライマーとしたPCRにより、ＰＬ−０２２をコードするｃＤＮＡが得られた。このｃＤＮＡをＮｄｅＩ及びＢａｍＨＩにて切断し、ｐＥＴ−９ａプラスミド上のＮｄｅＩ−ＢａｍＨＩ部分に組み込むことにより、Ｎ末端側から、人工Ｎ末端配列１１残基（配列番号１２）、プロテインＬのイムノグロブリンカッパ軽鎖結合ドメイン２の７０残基（配列番号３）、アラニン−ロイシンからなる連結配列２残基、プロテインＡ由来イムノグロブリンＦｃ結合Ｃドメイン第３αへリックスの改変Ｃ末端配列２１残基（配列番号１７）、及び人工Ｃ末端配列３残基（配列番号１８）がこの順で連結されたキメラタンパク質ＰＬ−０２２の発現プラスミドを得た。
［ＰＬ−０２３の発現プラスミド作成］
ＰＬ−０１４の発現プラスミドを鋳型とし、合成オリゴＤＮＡ oligo-197（配列番号２６）及びoligo-198（配列番号２７）をプライマーとしたPCRによりＤＮＡフラグメントD1を作成した。また互いの３’末端側の約１５塩基が相補的な合成オリゴＤＮＡ oligo-199（配列番号２３）及びoligo-202（配列番号２８）を互いの鋳型にしたPCRにより、ＤＮＡフラグメントD2を作成した。次にＤＮＡフラグメントD1及びＤＮＡフラグメントD2を鋳型とし、合成オリゴＤＮＡ oligo-197（配列番号２６）及びoligo-202（配列番号２８）をプライマーとしたPCRによりＤＮＡフラグメントD3を作成した。プロテインＬのイムノグロブリンカッパ軽鎖結合ドメイン3はＣ末端側から26残基がドメイン2と同一配列であるので、先に作成したＤＮＡフラグメントC4をそのまま使用し、ＤＮＡフラグメントD3及びＤＮＡフラグメントC4を鋳型として合成オリゴＤＮＡ oligo-178（配列番号１３）及びoligo-191（配列番号１６）をプライマーとしたPCRにより、ＰＬ−０２３をコードするｃＤＮＡが得られた。このｃＤＮＡをＮｄｅＩ及びＢａｍＨＩにて切断し、ｐＥＴ−９ａプラスミド上のＮｄｅＩ−ＢａｍＨＩ部分に組み込むことにより、Ｎ末端側から、人工Ｎ末端配列１１残基（配列番号１２）、プロテインＬのイムノグロブリンカッパ軽鎖結合ドメイン３の７０残基（配列番号２）、アラニン−ロイシンからなる連結配列２残基、プロテインＡ由来イムノグロブリンＦｃ結合Ｃドメイン第３αへリックスの改変Ｃ末端配列２１残基（配列番号１７）、及び人工Ｃ末端配列３残基（配列番号１８）がこの順で連結されたキメラタンパク質ＰＬ−０２３の発現プラスミドを得た。
ＰＬ−０１４の発現プラスミドを鋳型とし、合成オリゴＤＮＡ oligo-197（配列番号２６）及びoligo-198（配列番号２７）をプライマーとしたPCRによりＤＮＡフラグメントD1を作成した。また互いの３’末端側の約１５塩基が相補的な合成オリゴＤＮＡ oligo-199（配列番号２３）及びoligo-202（配列番号２８）を互いの鋳型にしたPCRにより、ＤＮＡフラグメントD2を作成した。次にＤＮＡフラグメントD1及びＤＮＡフラグメントD2を鋳型とし、合成オリゴＤＮＡ oligo-197（配列番号２６）及びoligo-202（配列番号２８）をプライマーとしたPCRによりＤＮＡフラグメントD3を作成した。プロテインＬのイムノグロブリンカッパ軽鎖結合ドメイン3はＣ末端側から26残基がドメイン2と同一配列であるので、先に作成したＤＮＡフラグメントC4をそのまま使用し、ＤＮＡフラグメントD3及びＤＮＡフラグメントC4を鋳型として合成オリゴＤＮＡ oligo-178（配列番号１３）及びoligo-191（配列番号１６）をプライマーとしたPCRにより、ＰＬ−０２３をコードするｃＤＮＡが得られた。このｃＤＮＡをＮｄｅＩ及びＢａｍＨＩにて切断し、ｐＥＴ−９ａプラスミド上のＮｄｅＩ−ＢａｍＨＩ部分に組み込むことにより、Ｎ末端側から、人工Ｎ末端配列１１残基（配列番号１２）、プロテインＬのイムノグロブリンカッパ軽鎖結合ドメイン３の７０残基（配列番号２）、アラニン−ロイシンからなる連結配列２残基、プロテインＡ由来イムノグロブリンＦｃ結合Ｃドメイン第３αへリックスの改変Ｃ末端配列２１残基（配列番号１７）、及び人工Ｃ末端配列３残基（配列番号１８）がこの順で連結されたキメラタンパク質ＰＬ−０２３の発現プラスミドを得た。
以上のようにして得た各イムノグロブリン結合ドメインの発現プラスミドの核酸配列を、ＣＥＱ８０００型ＤＮＡシークエンサー（ベックマンコールター株式会社）を用いて解析し、設計どおりの配列であることを確認した。次に各発現プラスミドにてＢＬ２１（ＤＥ３）コンピーテントセル（メルク株式会社）を形質転換することで、各タンパク質の発現株を得た。
それぞれのイムノグロブリン結合ドメインの発現大腸菌株を、２５ｍｇ／Ｌのカナマイシン及び２．０％グルコースを含むＬＢ培地にて１２時間種培養した。得られた種培養液を、２５ｍｇ／Ｌのカナマイシン及び０．８％グルコースを含む２×ＴＹ培地に接種し、３７℃にて１６時間培養して目的とするイムノグロブリン結合ドメインを発現させた後、遠心分離によって大腸菌を回収した。次に、回収した大腸菌を５０ｍＭ リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．５）に懸濁し、超音波処理して大腸菌を破砕し、更に遠心分離によって目的のイムノグロブリン結合ドメインを上清に回収した。得られた各上清を菌体抽出液としてドデシル硫酸ナトリウム−１５％ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）に供したところ、各分子量の位置に目的のイムノグロブリン結合ドメインが生産されていることが確認できた。
［各イムノグロブリン結合ドメインの精製と純度検定］
各イムノグロブリン結合ドメインの菌体抽出液をｐＨ６．０に調整したのちに、陽イオン交換体ＳＰ−セファロースファストフロー（ＧＥヘルスケア株式会社）カラムにアプライした。２０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ６．０）にて洗浄後、０．５Ｍ ＮａＣｌの直線的濃度勾配によりカラムからタンパク質を溶出した。溶出液をＳＤＳ−ＰＡＧＥにて確認したところ、目的となるイムノグロブリン結合ドメインは０．１から０．２Ｍ ＮａＣｌ間に溶出していた。次に、イムノグロブリン結合ドメインを含む同溶出液のｐＨを９に調整した後に陰イオン交換体ギガキャップＱ（東ソー株式会社）カラムに添加した。２０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７．８）にて洗浄後、０．３Ｍ ＮａＣｌ直線的濃度勾配にてイムノグロブリン結合ドメインを分離溶出した。各溶出液をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供して純度を確認した結果、各イムノグロブリン結合ドメインは理論値の分子量の位置に単一バンドとして精製されていることを確認した。
各イムノグロブリン結合ドメインの菌体抽出液をｐＨ６．０に調整したのちに、陽イオン交換体ＳＰ−セファロースファストフロー（ＧＥヘルスケア株式会社）カラムにアプライした。２０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ６．０）にて洗浄後、０．５Ｍ ＮａＣｌの直線的濃度勾配によりカラムからタンパク質を溶出した。溶出液をＳＤＳ−ＰＡＧＥにて確認したところ、目的となるイムノグロブリン結合ドメインは０．１から０．２Ｍ ＮａＣｌ間に溶出していた。次に、イムノグロブリン結合ドメインを含む同溶出液のｐＨを９に調整した後に陰イオン交換体ギガキャップＱ（東ソー株式会社）カラムに添加した。２０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７．８）にて洗浄後、０．３Ｍ ＮａＣｌ直線的濃度勾配にてイムノグロブリン結合ドメインを分離溶出した。各溶出液をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供して純度を確認した結果、各イムノグロブリン結合ドメインは理論値の分子量の位置に単一バンドとして精製されていることを確認した。
［ゲル担体への固定化とイムノグロブリン結合活性測定による評価］
精製した各イムノグロブリン結合ドメインを、ホルミル活性化アガロースゲル担体に１０ｍｇ／ｍＬゲルの濃度で常法に従って、それぞれ固定化した。固定化後の反応溶液を回収し、固定化率を測定したところ、すべての各イムノグロブリン結合ドメインにおいて固定化効率が９０％以上であった。更に固定化反応後のゲル担体をＰＢＳ溶液で洗浄後、４０ｍｇ／ｍＬのヒトＩｇＧ（化学及血清療法研究所より入手）を含むＰＢＳ溶液を加えて1時間振とうした後に、ＰＢＳで洗浄したゲル担体から０．１Ｍ グリシン塩酸バッファー（ｐＨ２．５）でゲル担体に結合したヒトＩｇＧを溶出した。その溶出液を分光光度計にて２８０ｎｍの吸収を測定し、１３．８（１ｇ-1ｃｍ-1）の比吸光係数をもとに結合したイムノグロブリン量（ＩｇＧ結合活性）を求めた。
精製した各イムノグロブリン結合ドメインを、ホルミル活性化アガロースゲル担体に１０ｍｇ／ｍＬゲルの濃度で常法に従って、それぞれ固定化した。固定化後の反応溶液を回収し、固定化率を測定したところ、すべての各イムノグロブリン結合ドメインにおいて固定化効率が９０％以上であった。更に固定化反応後のゲル担体をＰＢＳ溶液で洗浄後、４０ｍｇ／ｍＬのヒトＩｇＧ（化学及血清療法研究所より入手）を含むＰＢＳ溶液を加えて1時間振とうした後に、ＰＢＳで洗浄したゲル担体から０．１Ｍ グリシン塩酸バッファー（ｐＨ２．５）でゲル担体に結合したヒトＩｇＧを溶出した。その溶出液を分光光度計にて２８０ｎｍの吸収を測定し、１３．８（１ｇ-1ｃｍ-1）の比吸光係数をもとに結合したイムノグロブリン量（ＩｇＧ結合活性）を求めた。
各イムノグロブリン結合ドメインのゲルへの固定化量及びＩｇＧ結合活性を表１に示す。この結果より、プロテインLの４つのドメイン中で、ドメイン４が最も高いＩｇＧ結合活性を有することが分かった。
［各イムノグロブリン結合ドメインとヒトＩｇＧ及びヒトＦａｂとの分子間相互作用解析］
分子間相互作用解析装置ＢＬＩｔｚ（ポール社製）を用いて溶液中の各イムノグロブリン結合ドメインとヒトＩｇＧ及びヒトＦａｂ断片との相互作用を解析した。ビオチン化ヒトＩｇＧはビオチン化キット（EZ-Link Biotinylation Kit、サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）を用いて調製した。０．１％ ＢＳＡ（牛血清アルブミン）含有２０ｍＭ ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６．５）で０．１ｍｇ／ｍＬに調製したビオチン化ＩｇＧとストレプトアビジンセンサーチップを室温で６０分間インキュベートすることにより、ＩｇＧ固定化チップを作製した。その後、２０ｍＭ ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６．５）で洗浄した同センサーチップを精製イムノグロブリン結合ドメインＰＬ−０２１、ＰＬ−０２２、ＰＬ−０２３、及びＰＬ−０１４の各１．６μｇ／ｍＬ濃度を含む０．１％ＢＳＡ含有２０ｍＭ ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６．５）に添加し、５０秒後の各イムノグロブリン結合ドメインの結合量をそれぞれ測定した。その結果、ＰＬ−０１４＞ＰＬ−０２３＝ＰＬ−０２２＞ＰＬ−０２１の順位で結合活性が高かった。
分子間相互作用解析装置ＢＬＩｔｚ（ポール社製）を用いて溶液中の各イムノグロブリン結合ドメインとヒトＩｇＧ及びヒトＦａｂ断片との相互作用を解析した。ビオチン化ヒトＩｇＧはビオチン化キット（EZ-Link Biotinylation Kit、サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）を用いて調製した。０．１％ ＢＳＡ（牛血清アルブミン）含有２０ｍＭ ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６．５）で０．１ｍｇ／ｍＬに調製したビオチン化ＩｇＧとストレプトアビジンセンサーチップを室温で６０分間インキュベートすることにより、ＩｇＧ固定化チップを作製した。その後、２０ｍＭ ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６．５）で洗浄した同センサーチップを精製イムノグロブリン結合ドメインＰＬ−０２１、ＰＬ−０２２、ＰＬ−０２３、及びＰＬ−０１４の各１．６μｇ／ｍＬ濃度を含む０．１％ＢＳＡ含有２０ｍＭ ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６．５）に添加し、５０秒後の各イムノグロブリン結合ドメインの結合量をそれぞれ測定した。その結果、ＰＬ−０１４＞ＰＬ−０２３＝ＰＬ−０２２＞ＰＬ−０２１の順位で結合活性が高かった。
次に、ヒトＩｇＧをパパイン処理して調製したＦａｂを同様の方法でビオチン化したのちにストレプトアビジンセンサーチップに固定化して、各イムノグロブリン結合ドメインの結合量を測定した結果、Ｆａｂに対してもドメイン４のＰＬ−０１４が最も高い結合活性を示した。
以上の結果から、溶液中においてもイムノグロブリン結合ドメイン４はＩｇＧのカッパ軽鎖に対して最も高い結合能を示すことが分かった。
［固定化ゲル担体のアルカリｐＨ条件での安定性の評価］
次に、４つのイムノグロブリン結合ドメイン固定化ゲル担体を０．１Ｍ ＮａＯＨ水溶液で３回洗浄して同アルカリ溶液に置換した後に２５℃にて１７時間保温した。その後、ＰＢＳで３回洗浄し、前記と同条件でヒトＩｇＧ結合活性を測定した。アルカリ処理前のそれぞれのＩｇＧ結合量を１００％としたときの１７時間処理後の残存ＩｇＧ結合量の割合をアルカリ処理後の残存活性（％）として求めた。得られた結果を表２に示す。
次に、４つのイムノグロブリン結合ドメイン固定化ゲル担体を０．１Ｍ ＮａＯＨ水溶液で３回洗浄して同アルカリ溶液に置換した後に２５℃にて１７時間保温した。その後、ＰＢＳで３回洗浄し、前記と同条件でヒトＩｇＧ結合活性を測定した。アルカリ処理前のそれぞれのＩｇＧ結合量を１００％としたときの１７時間処理後の残存ＩｇＧ結合量の割合をアルカリ処理後の残存活性（％）として求めた。得られた結果を表２に示す。
この結果から、ＰＬ−０１４＞ＰＬ−０２３＞ＰＬ−０２２＞ＰＬ−０２１の順位で高いアルカリ安定性を示した。これより、プロテインＬの４つのドメインの中でも、ドメイン４が最もアルカリ安定性が高いことが明らかとなった。以後、このドメイン４を基本設計として更にアルカリ安定性の高い改変体の創出を試みた。
実施例１：イムノグロブリン結合ドメイン４の改変体の製造と結合活性及びアルカリ安定性評価
［改変体の製造］
イムノグロブリン結合活性とアルカリ安定性が高いイムノグロブリン結合ドメイン４を基本配列として、更なるアルカリ安定性の向上を目指して、イムノグロブリン結合ドメイン４における２位のトレオニン残基と、７位、１３位、２２位、２９位、４８位、及び６７位の６個のリジン残基の合計７個のアミノ酸残基に注目してアミノ酸を置換した改変体を作製した。
［改変体の製造］
イムノグロブリン結合活性とアルカリ安定性が高いイムノグロブリン結合ドメイン４を基本配列として、更なるアルカリ安定性の向上を目指して、イムノグロブリン結合ドメイン４における２位のトレオニン残基と、７位、１３位、２２位、２９位、４８位、及び６７位の６個のリジン残基の合計７個のアミノ酸残基に注目してアミノ酸を置換した改変体を作製した。
［設計と改変体の構築］
ドメイン４を基本配列として、表３に示す２位のトレオニン残基と、７位、１３位、２２位、２９位、４８位、及び６７位の６個のリジン残基を各々置換した改変体を作製した。
ドメイン４を基本配列として、表３に示す２位のトレオニン残基と、７位、１３位、２２位、２９位、４８位、及び６７位の６個のリジン残基を各々置換した改変体を作製した。
［ＰＬ−０２４の発現プラスミド作成］
まず、ＰＬ−０１４の配列上に存在するイムノグロブリン結合ドメイン４領域（配列番号１）における７位、１３位、２２位、２９位、４８位、及び６７位の６箇所のリジン残基をアルギニン残基にそれぞれ置換した改変体ＰＬ−０２４の発現プラスミドを構築した。
まず、ＰＬ−０１４の配列上に存在するイムノグロブリン結合ドメイン４領域（配列番号１）における７位、１３位、２２位、２９位、４８位、及び６７位の６箇所のリジン残基をアルギニン残基にそれぞれ置換した改変体ＰＬ−０２４の発現プラスミドを構築した。
ＰＬ−０２３の発現プラスミドを鋳型とし、合成オリゴＤＮＡ oligo-178（配列番号１３）及びoligo-203（配列番号２９）をプライマーとしたPCRによりＤＮＡフラグメントE1を作成した。またＰＬ−０１４の発現プラスミドを鋳型とし、合成オリゴＤＮＡ oligo-204（配列番号３０）及びoligo-205（配列番号３１）をプライマーとしたPCRによりＤＮＡフラグメントE2を作成した。同様にＰＬ−０１４の発現プラスミドを鋳型とし、合成オリゴＤＮＡ oligo-206（配列番号３２）及びoligo-207（配列番号３３）をプライマーとしたPCRによりＤＮＡフラグメントE3を作成した。次に、ＤＮＡフラグメントE1及びＤＮＡフラグメントE2を鋳型として、oligo-178（配列番号１３）及びoligo-205（配列番号３１）をプライマーとしたPCRによりＰＬ−０２４の前半のＤＮＡフラグメントE4を、フラグメントE3及びフラグメント5を鋳型として合成オリゴＤＮＡ oligo-206及びoligo-191をプライマーとしたPCRによりＰＬ−０２４の後半のＤＮＡフラグメントE5を作成した。最後にＤＮＡフラグメントE4及びＤＮＡフラグメントE5を鋳型として合成オリゴＤＮＡ oligo-178（配列番号１３）及びoligo-191（配列番号１６）をプライマーとしたPCRによりＰＬ−０２４のｃＤＮＡフラグメント全体を作成し、このｃＤＮＡをＮｄｅＩ及びＢａｍＨＩにて切断して、ｐＥＴ−９ａプラスミド上のＮｄｅＩ−ＢａｍＨＩ部分に組み込むことにより、キメラタンパク質ＰＬ−０２４の発現プラスミドを得た。
［２位、７位、１３位、２２位、２９位、４８位、及び６７位の７個のアミノ酸残基の置換の組み合わせを持つキメラタンパク質の発現プラスミド作成］
次に、イムノグロブリン結合ドメイン４領域（配列番号１）における２位、７位、１３位、２２位、２９位、４８位、及び６７位の７箇所のアミノ酸残基の複数の置換の組み合わせを持つ変異体をコードするｃＤＮＡを調製した。具体的には、ＰＬ−０１４のｃＤＮＡを鋳型とし、それぞれの位置の塩基配列を変異させたオリゴＤＮＡを準備し、オーバーラップ伸張法（二段階ＰＣＲ法）にてまず２位、７位、１３位、２２位、２９位、４８位、６７位それぞれの位置の一アミノ酸置換体をコードするｃＤＮＡフラグメントを作成した。次に、一アミノ酸置換体のｃＤＮＡを鋳型として同様のオーバーラップ伸張法（二段階ＰＣＲ法）にて別の位置の変異を導入した。更に、得られた変異体プラスミドを鋳型とし、別の位置に変異をもたらすプライマーを用いたＰＣＲによって、種々の組み合わせの複数の部位にアミノ酸置換を含む変異体のｃＤＮＡフラグメントを調製した。
次に、イムノグロブリン結合ドメイン４領域（配列番号１）における２位、７位、１３位、２２位、２９位、４８位、及び６７位の７箇所のアミノ酸残基の複数の置換の組み合わせを持つ変異体をコードするｃＤＮＡを調製した。具体的には、ＰＬ−０１４のｃＤＮＡを鋳型とし、それぞれの位置の塩基配列を変異させたオリゴＤＮＡを準備し、オーバーラップ伸張法（二段階ＰＣＲ法）にてまず２位、７位、１３位、２２位、２９位、４８位、６７位それぞれの位置の一アミノ酸置換体をコードするｃＤＮＡフラグメントを作成した。次に、一アミノ酸置換体のｃＤＮＡを鋳型として同様のオーバーラップ伸張法（二段階ＰＣＲ法）にて別の位置の変異を導入した。更に、得られた変異体プラスミドを鋳型とし、別の位置に変異をもたらすプライマーを用いたＰＣＲによって、種々の組み合わせの複数の部位にアミノ酸置換を含む変異体のｃＤＮＡフラグメントを調製した。
以上のようにして得た各改変体ｃＤＮＡを実施例１と同様に大腸菌発現ベクターｐＥＴ９ａ上に挿入して発現プラスミドを構築した。得られた各改変体の置換パターンを表３に示す。
斯くして得た発現プラスミドの核酸配列を、ＣＥＱ８０００型ＤＮＡシークエンサー（ベックマンコールター株式会社）を用いて解析し、設計通りの配列であることを確認した。次に、各発現プラスミドにてＢＬ２１（ＤＥ３）コンピーテントセル（メルク株式会社）を形質転換することにより、各イムノグロブリン結合ドメイン４改変体の発現株を得た。
それぞれのイムノグロブリン結合ドメイン４の改変体を発現する大腸菌株を、前記参考例１と同様の手法で、３７℃にて１６時間培養して目的とするイムノグロブリン結合ドメイン４改変体を発現させた後、遠心分離によって大腸菌を回収した。次に回収した大腸菌を５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．５）に懸濁し、超音波処理して大腸菌を破砕し、更に遠心分離によって目的のイムノグロブリン結合ドメイン４改変体を上清に回収した。得られた各上清を菌体抽出液としてＳＤＳ−ＰＡＧＥに供したところ、各分子量の位置に目的となるイムノグロブリン結合ドメイン４の改変体が生産されていることが確認できた。
［各改変体の精製と純度検定］
各改変体の菌体抽出液をｐＨ６．０に調整した後に、参考例１と同様の手法で陽イオン交換体ＳＰ−セファロースファストフロー（ＧＥヘルスケア株式会社）カラムにアプライし、２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）にて洗浄後、０．５Ｍ ＮａＣｌの直線的濃度勾配にてタンパク質を溶出した。目的の改変体が含まれる溶出画分を集めてｐＨを９に調整した後に陰イオン交換体ギガキャップＱ（東ソー株式会社）カラムに添加した。２０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７．８）にて洗浄後、０．３Ｍ ＮａＣｌ直線的濃度勾配にて目的の改変体を溶出した。各溶出液をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供して純度を確認した結果、各改変体は理論値の分子量の位置に単一バンドとして精製されていることを確認した。
各改変体の菌体抽出液をｐＨ６．０に調整した後に、参考例１と同様の手法で陽イオン交換体ＳＰ−セファロースファストフロー（ＧＥヘルスケア株式会社）カラムにアプライし、２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）にて洗浄後、０．５Ｍ ＮａＣｌの直線的濃度勾配にてタンパク質を溶出した。目的の改変体が含まれる溶出画分を集めてｐＨを９に調整した後に陰イオン交換体ギガキャップＱ（東ソー株式会社）カラムに添加した。２０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７．８）にて洗浄後、０．３Ｍ ＮａＣｌ直線的濃度勾配にて目的の改変体を溶出した。各溶出液をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供して純度を確認した結果、各改変体は理論値の分子量の位置に単一バンドとして精製されていることを確認した。
［ゲル担体への固定化とイムノグロブリン結合活性測定による評価］
精製した各改変体を、ホルミル活性化アガロースゲル担体に１０ｍｇ／ｍＬゲルの濃度で常法に従って、それぞれ固定化した。固定化後の反応溶液を回収し、固定化率を測定したところ、すべての改変体の固定化効率が９５％以上であることを確認した。次に、参考例１と同様の方法で各固定化ゲル担体のヒトＩｇＧ結合活性を測定した。
精製した各改変体を、ホルミル活性化アガロースゲル担体に１０ｍｇ／ｍＬゲルの濃度で常法に従って、それぞれ固定化した。固定化後の反応溶液を回収し、固定化率を測定したところ、すべての改変体の固定化効率が９５％以上であることを確認した。次に、参考例１と同様の方法で各固定化ゲル担体のヒトＩｇＧ結合活性を測定した。
得られた結果を表４に示す。この結果から、配列番号１に示すアミノ酸配列において、７位、１３位、２２位、２９位、４８位、及び６７位の６つのリジン残基全てを置換したＰＬ−０２４とＰＬ−０３８は、ＰＬ−０１４よりも１１％高い活性を示した。配列番号１に示すアミノ酸配列における２９位、４８位、及び６７位をアルギニンに置換すると、５％活性が高くなった。また、配列番号１に示すアミノ酸配列における７位、１３位、２２位、２９位、４８位、及び６７位のリジン残基のアルギニンへの置換数が多いほど、活性が高くなる傾向が認められた。
［ゲル担体に固定化した各改変体のアルカリ条件での安定性の評価］
各改変体を固定化したゲル担体を０．１Ｍ ＮａＯＨ水溶液に置換した後に、２５℃にて１７時間保温した。その後、ＰＢＳで３回洗浄し、前記と同条件でヒトＩｇＧ結合活性を測定した。アルカリ処理前のそれぞれのＩｇＧ結合量を１００％としたときの１７時間処理後の残存ＩｇＧ結合量の割合をアルカリ処理後の残存活性（％）として求めた。得られた結果を表５に示す。
各改変体を固定化したゲル担体を０．１Ｍ ＮａＯＨ水溶液に置換した後に、２５℃にて１７時間保温した。その後、ＰＢＳで３回洗浄し、前記と同条件でヒトＩｇＧ結合活性を測定した。アルカリ処理前のそれぞれのＩｇＧ結合量を１００％としたときの１７時間処理後の残存ＩｇＧ結合量の割合をアルカリ処理後の残存活性（％）として求めた。得られた結果を表５に示す。
表５から分かるように、配列番号１に示すアミノ酸配列における２位のトレオニン残基をリジン又はアルギニンに置換しても、アルカリ安定性に影響は与えなかった。
また、配列番号１に示すアミノ酸配列における７位、１３位、２２位、２９位、４８位、及び６７位のリジン残基の全てをアルギニンに置換した場合には、格段に高いアルカリ安定性が認められた（PL-024及びPL-038）。
更に、配列番号１に示すアミノ酸配列における７位、１３位、２２位、及び２９位の４か所のリジン残基をアルギニンに置換した場合（PL-049）では、最も高いアルカリ安定性が認められ、７位、１３位、及び２２位の３か所のリジン残基をアルギニンに置換した場合（PL-027、PL-036）、並びに１３位、２２位、及び２９位の３か所のリジン残基をアルギニンに置換した場合（PL-048）、７位、１３位、及び２９位の３か所のリジン残基をアルギニンに置換した場合（PL-057）、７位、２２位、及び２９位の３か所のリジン残基をアルギニンに置換した場合（PL-058）でも、優れたアルカリ安定性を備えていた。また、配列番号１に示すアミノ酸配列における７位、１３位、２２位、及び２９位のリジン残基の内、２つをアルギニンに置換した場合（PL-026、PL-035、PL-046、PL-047、PL-059）でも、野生型（PL-014）に比して、アルカリ安定性の向上が認められた。一方、配列番号１に示すアミノ酸配列における７位、１３位、２２位、及び２９位のリジン残基の内、１つのリジン残基のみを置換した場合（PL-044）では、アルカリ安定性の向上は認められなかった。
一方、配列番号１に示すアミノ酸配列における７位及び１３位のリジン残基をアルギニンに置換し、且つ２２位のリジン残基をトレオニンに置換した場合（PL-050）には、アルカリ安定性の向上が認められた。同じく２２位をヒスチジンに置換した場合（PL-052）は、変異を導入していない２２位がリジン残基の場合（PL-026、PL-035）と同等のアルカリ安定性を示したが、２２位のリジン残基をロイシン、グルタミン酸、グルタミン、フェニルアラニン、又はアラニンに置換した場合には、アルカリ安定性の低下が認められた。以上の結果から、２２位のリジン残基は、塩基性アミノ酸又は水酸基を有するアミノ酸の置換が望ましいことが確認された。
イムノグロブリン結合ドメイン４（配列番号１に示すアミノ酸配列からなるポリペプチド）の三次元構造（図２）において、７位のリジン残基は、αへリックス構造１中の３３位のグルタミン酸残基と相互作用し易い位置に配置されている。そのため、７位のリジン残基を、グルタミン酸とイオン結合又は水素結合をするアミノ酸（即ち、塩基性アミノ酸又は水酸基を有するアミノ酸）に置換すると、３３位のグルタミン酸残基との相互作用によって、アルカリ安定性の向上が図られると推測される。
また、同様のことが、配列番号１に示すアミノ酸配列における１３位、２２位、及び２９位のリジン残基でも当てはまる。具体的には、配列番号１に示すアミノ酸配列における１３位のリジン残基はβシート１中に存在しており、これはβシート２中に存在する２７位のグルタミン酸と相互作用し易い位置に配置されている。また、配列番号１に示すアミノ酸配列における２２位のリジン残基はβシート１とβシート２の間のループ部分に存在しており、これは同ループ部分に存在する２０位のアスパラギン酸と相互作用し易い位置に配置されている。更に、配列番号１に示すアミノ酸配列における２９位のリジン残基はβシート１中に存在する８位のグルタミン酸及び／又は１１位のトレオニンと相互作用し易い位置に配置されている。そのため、配列番号１に示すアミノ酸配列における１３位、２２位、及び２９位のリジン残基を、グルタミン酸、アスパラギン酸及び／又は１１位のトレオニンとイオン結合又は水素結合をするアミノ酸（即ち、塩基性アミノ酸又は水酸基を有するアミノ酸）に置換することにより、これらのアミノ酸間の相互作用によってアルカリ安定性の向上が図られると推測される。このことは、PL-050とPL-052ではアルカリ安定性の向上が認められたが、PL-051、PL-053〜PL-056ではアルカリ安定性の向上が認められなかった前記実験結果と符合している。
即ち、以上の結果から、配列番号１に示すアミノ酸配列における７位、１３位、２２位、及び２９位のリジン残基の内、少なくとも２個以上を塩基性アミノ酸又は水酸基を有するアミノ酸に置換することによって、アルカリ安定性の向上が図れることが明らかとなった。
実施例２：イムノグロブリン結合ドメイン４改変体の複ドメイン型ポリペプチドの製造と結合活性及びアルカリ安定性評価
［複ドメイン型ポリペプチド発現プラスミドの構築とタンパク質発現］
改変体ＰＬ−０２４キメラタンパク質のＤＮＡ配列は、ＮｄｅＩ認識配列を持つ翻訳開始コドン（ＣＡＴＡＴＧ）と人工Ｎ末端配列「ＭＡＱＨＤＥＡＧＬＡＬ」をコードする配列にプロテインＬのイムノグロブリンカッパ軽鎖結合ドメイン改変ドメインをコードする配列が続き、そのＣ末端部分の人工配列「ＮＩＫＦＡＧＡＬ」をコードする配列内にＥｃｏＯ１０９Ｉ認識配列（ＧＧＧＧＣＣＴ）を有し、更にプロテインＡのイムノグロブリンＦｃ結合Ｃドメイン第３アルファへリックスの改変Ｃ末端配列２１残基が続き、最後に人工Ｃ末端配列「ＫＫＫ」をコードする配列と翻訳終止コドン及びＢａｍＨＩ認識配列を含んでいる。このＰＬ−０２４キメラタンパク質のｃＤＮＡを予めプラスミド上のＥｃｏＯ１０９I切断部位を削除したｐＵＣ１９プラスミドのクローニングサイトに挿入して得られたプラスミドを複ドメイン型ポリペプチドｃＤＮＡの構築に用いた。
［複ドメイン型ポリペプチド発現プラスミドの構築とタンパク質発現］
改変体ＰＬ−０２４キメラタンパク質のＤＮＡ配列は、ＮｄｅＩ認識配列を持つ翻訳開始コドン（ＣＡＴＡＴＧ）と人工Ｎ末端配列「ＭＡＱＨＤＥＡＧＬＡＬ」をコードする配列にプロテインＬのイムノグロブリンカッパ軽鎖結合ドメイン改変ドメインをコードする配列が続き、そのＣ末端部分の人工配列「ＮＩＫＦＡＧＡＬ」をコードする配列内にＥｃｏＯ１０９Ｉ認識配列（ＧＧＧＧＣＣＴ）を有し、更にプロテインＡのイムノグロブリンＦｃ結合Ｃドメイン第３アルファへリックスの改変Ｃ末端配列２１残基が続き、最後に人工Ｃ末端配列「ＫＫＫ」をコードする配列と翻訳終止コドン及びＢａｍＨＩ認識配列を含んでいる。このＰＬ−０２４キメラタンパク質のｃＤＮＡを予めプラスミド上のＥｃｏＯ１０９I切断部位を削除したｐＵＣ１９プラスミドのクローニングサイトに挿入して得られたプラスミドを複ドメイン型ポリペプチドｃＤＮＡの構築に用いた。
改変体ＰＬ−０２４のｃＤＮＡを鋳型とし、合成オリゴＤＮＡ oligo210（配列番号３４）及びoligo211（配列番号３５）をプライマーとしたＰＣＲによりＮ及びＣ両末端にＥｃｏＯ１０９Ｉ認識配列を持つプロテインＬのイムノグロブリンカッパ軽鎖結合ドメイン改変ドメイン部分のみのｃＤＮＡフラグメントを調製し、このフラグメントの両端をＥｃｏＯ１０９Ｉにて切断した。次に、上記ＰＬ−０２４キメラタンパク質のｃＤＮＡをサブクローニングしたｐＵＣ１９プラスミドをＥｃｏＯ１０９Ｉで切断し、切断部位をアルカリフォスファターゼにより脱リン酸化した後、この部位にライゲーション反応により上記ＰＣＲフラグメントを挿入した。この反応によってフラグメントが１個挿入されたクローンでは、Ｎ末端側から、プロテインＬのイムノグロブリンカッパ軽鎖結合ドメイン改変ドメインが２個連結された後ろにプロテインＡのイムノグロブリンＦｃ結合Ｃドメイン第３αへリックスの改変Ｃ末端配列２１残基（配列番号１７）、及び人工Ｃ末端配列（配列番号１８）がこの順で続く形の２量体のキメラタンパク質のｃＤＮＡとして得られ、同様にフラグメントが３個挿入されたクローンでは４量体のキメラタンパク質のｃＤＮＡとして、フラグメントが５個挿入されたクローンでは６量体のキメラタンパク質のｃＤＮＡとして得られた。
なお、プロテインＡのイムノグロブリンＦｃ結合Ｃドメイン第３αへリックスの改変Ｃ末端配列２１残基が「ＰＫ」の２残基または「ＰＫＫＫＫＫ」の６残基といったより短い配列であってもよく、付加するＣ末端配列が改変体の複ドメイン型ポリペプチドのアルカリ安定性に影響を及ぼさないことを確認している。このように付加するＣ末端配列は、プロテインＡのイムノグロブリンＦｃ結合Ｃドメイン第３αへリックスの改変配列に限定されるものではなく、ゲル担体の固定化において反応しやすいアミノ酸残基を多く含む配列とすることにより、改変体を配向制御してゲルへ固定化することが可能である。
以上の様にして得た４量体ＰＬ−４２４と６量体ＰＬ−６２４のｃＤＮＡをサブクローニングしたｐＵＣ１９プラスミドから制限酵素 ＮｄｅＩ及びＢａｍＨＩにより各ｃＤＮＡを切り出し、これを大腸菌発現ベクターであるｐＥＴ９ａ上のＮｄｅＩ―ＢａｍＨＩサイトに挿入して発現プラスミドを構築し、それぞれの発現プラスミドの核酸配列を、ＣＥＱ８０００型ＤＮＡシークエンサー（ベックマンコールター株式会社）を用いて解析し、設計通りの配列であることを確認した。次に各発現プラスミドにてＢＬ２１（ＤＥ３）コンピーテントセル（メルク株式会社）を形質転換することで、各複ドメイン型ポリペプチドの発現株を得た。
各発現株を、２５ｍｇ／Ｌのカナマイシンと２．０％グルコースを含むＬＢ培地にて１２時間種培養し、この種培養液を２５ｍｇ／Ｌのカナマイシンと０．８％グルコースを含む２×ＴＹ培地に接種し、３７℃にて１６時間培養して目的とする複ドメイン型ポリペプチドを発現させた後、遠心分離によって大腸菌を集めた。次に集めた大腸菌を５０ｍＭ ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６．０）に懸濁し、超音波処理して大腸菌を破砕し、遠心分離によって目的の複ドメイン型ポリペプチドを上清に回収した。得られた各上清を菌体抽出液としてＳＤＳ−ＰＡＧＥに供したところ、それぞれの分子量の位置に目的の複ドメイン型ポリペプチドが生産されていることが確認できた。なお、得られた４量体ＰＬ−４２４のアミノ酸配列を配列番号３６に示し、得られた６量体ＰＬ−６２４のアミノ酸配列を配列番号３７に示す。
［複ドメイン型ポリペプチドの精製と純度検定］
複ドメイン型ポリペプチドＰＬ−４２４とＰＬ−６２４の菌体抽出液をそれぞれｐＨ６．０に調整したのちに、前記参考例１と同様の方法で陽イオン交換体ＳＰ−セファロースファストフロー（ＧＥヘルスケア株式会社）カラムにアプライし、２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）にて洗浄後、０．２Ｍ ＮａＣｌの直線濃度勾配にてタンパク質を溶出した。目的の多量体が含まれる溶出画分を集めてｐＨを８に調整した後に陰イオン交換体ギガキャップＱ（東ソー株式会社）カラムに添加した。２０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７．８）にて洗浄後、０．３５Ｍ ＮａＣｌ直線濃度勾配にて目的の複ドメイン型ポリペプチドを溶出させた。各溶出液をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供して純度を確認した結果、各複ドメイン型ポリペプチドは理論値の分子量の位置に単一バンドとして精製されていることを確認した。
複ドメイン型ポリペプチドＰＬ−４２４とＰＬ−６２４の菌体抽出液をそれぞれｐＨ６．０に調整したのちに、前記参考例１と同様の方法で陽イオン交換体ＳＰ−セファロースファストフロー（ＧＥヘルスケア株式会社）カラムにアプライし、２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）にて洗浄後、０．２Ｍ ＮａＣｌの直線濃度勾配にてタンパク質を溶出した。目的の多量体が含まれる溶出画分を集めてｐＨを８に調整した後に陰イオン交換体ギガキャップＱ（東ソー株式会社）カラムに添加した。２０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７．８）にて洗浄後、０．３５Ｍ ＮａＣｌ直線濃度勾配にて目的の複ドメイン型ポリペプチドを溶出させた。各溶出液をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供して純度を確認した結果、各複ドメイン型ポリペプチドは理論値の分子量の位置に単一バンドとして精製されていることを確認した。
［ゲル担体への固定化とイムノグロブリン結合活性測定による評価］
精製した複ドメイン型ポリペプチドＰＬ−４２４とＰＬ−６２４を、ホルミル活性化アガロースゲル担体に１０ｍｇ／ｍＬゲルの濃度で、常法に従ってそれぞれ固定化した。固定化後の反応溶液を回収して固定化率を測定したところ、ＰＬ−４２４とＰＬ−６２４は、それぞれ９７．３％と９８．０％の固定化率であった。次に、前記参考例１と同様の方法で各固定化ゲル担体のヒトＩｇＧ結合活性を測定した。更に、比較のために、天然配列の４量体（プロテインＬ）が１０ｍｇ／ｍＬゲルで固定化されているＣａｐｔｏＬ（ＧＥヘルスケア社）を使用して、同様にヒトＩｇＧ結合活性を測定した。その結果を表６に示す。さらに、ヒトＩｇＧをパパイン処理して調製した精製Ｆａｂを２０ｍｇ／ｍＬ濃度含むＰＢＳ溶液を各固定化ゲルに加えて１時間振とうした後に、ヒトＩｇＧの場合と同様の方法で結合活性を測定した。なおＦａｂ量は１３．５（１ｇ-1ｃｍ-1）の比吸光係数を用いて求めた。
精製した複ドメイン型ポリペプチドＰＬ−４２４とＰＬ−６２４を、ホルミル活性化アガロースゲル担体に１０ｍｇ／ｍＬゲルの濃度で、常法に従ってそれぞれ固定化した。固定化後の反応溶液を回収して固定化率を測定したところ、ＰＬ−４２４とＰＬ−６２４は、それぞれ９７．３％と９８．０％の固定化率であった。次に、前記参考例１と同様の方法で各固定化ゲル担体のヒトＩｇＧ結合活性を測定した。更に、比較のために、天然配列の４量体（プロテインＬ）が１０ｍｇ／ｍＬゲルで固定化されているＣａｐｔｏＬ（ＧＥヘルスケア社）を使用して、同様にヒトＩｇＧ結合活性を測定した。その結果を表６に示す。さらに、ヒトＩｇＧをパパイン処理して調製した精製Ｆａｂを２０ｍｇ／ｍＬ濃度含むＰＢＳ溶液を各固定化ゲルに加えて１時間振とうした後に、ヒトＩｇＧの場合と同様の方法で結合活性を測定した。なおＦａｂ量は１３．５（１ｇ-1ｃｍ-1）の比吸光係数を用いて求めた。
ヒトＩｇＧ結合活性は、単ドメイン型ポリペプチドＰＬ−０２４と比べると複ドメイン型ポリペプチドＰＬ−４２４（ドメイン数４）は１４４％、複ドメイン型ポリペプチドＰＬ−６２４（ドメイン数６）は１５１％とそれぞれ単ドメイン型ポリペプチドよりも高い活性を示すことが分かった。分子量が１４５ｋＤａのＩｇＧに対して４７ｋＤａのＦａｂ断片がＩｇＧに近い結合量であることは注目すべき点である。それぞれの分子量に基づいてモル数を計算すると、ＰＬ−４２４（ドメイン数４）１０ｍｇで６３２ｎｍｏｌ、ＰＬ−６２４（ドメイン数６）１０ｍｇで６６１ｎｍｏｌのＩｇＧが結合したことになる。一方、Ｆａｂ断片は、ＰＬ−４２４（ドメイン数４）１０ｍｇで１５４０ｎｍｏｌ、６ＰＬ−６２４（ドメイン数６）１０ｍｇで１６１５ｎｍｏｌが結合した。即ち、発明の複ドメイン型ポリペプチドには、ＩｇＧに対する結合能よりも、Ｆａｂ断片に対する結合能の方が格段に高いことが明らかとなった。これは、Ｆａｂは分子サイズが小さいので結合において立体障害が起こりにくいからであると考えられる。
一方、天然配列の複ドメイン型ポリペプチド（ドメイン数４）（プロテインＬ）が１０ｍｇ／ｍＬゲルで固定化されているＣａｐｔｏＬ（ＧＥヘルスケア社）と比較すると、本発明の多量体は、Ｆａｂ断片で約２．４倍、ＩｇＧで２．２倍の結合量であった。
［ゲル担体に固定化した複ドメイン型ポリペプチドのアルカリｐＨ条件での安定性の評価］
各ドメイン型ポリペプチドを固定化したゲル担体を０．１Ｍ ＮａＯＨ水溶液に置換した後に、２５℃にて１７時間保温した。その後、ＰＢＳで３回洗浄し、前記と同条件でヒトＩｇＧ結合活性を測定した。アルカリ処理前のそれぞれのＩｇＧ結合量を１００％としたときの１７時間処理後の残存ＩｇＧ結合量の割合をアルカリ処理後の残存活性（％）として求めた。得られた結果を表７に示す。
各ドメイン型ポリペプチドを固定化したゲル担体を０．１Ｍ ＮａＯＨ水溶液に置換した後に、２５℃にて１７時間保温した。その後、ＰＢＳで３回洗浄し、前記と同条件でヒトＩｇＧ結合活性を測定した。アルカリ処理前のそれぞれのＩｇＧ結合量を１００％としたときの１７時間処理後の残存ＩｇＧ結合量の割合をアルカリ処理後の残存活性（％）として求めた。得られた結果を表７に示す。
複ドメイン型ポリペプチドＰＬ−４２４（ドメイン数４）とＰＬ−６２４（ドメイン数６）は単ドメイン型ポリペプチドＰＬ−０２４とほぼ同様のアルカリ安定性を示すことが分かった。天然配列の複ドメイン型ポリペプチド（ドメイン数４）のＣａｐｔｏＬと比較すると、ＰＬ−４２４で１．４倍、ＰＬ−６２４で１．５倍の高いアルカリ安定性を備えていることがわかった。
実施例３：イムノグロブリン結合ドメイン３の改変体の製造と結合活性及びアルカリ安定性評価
［改変体の製造］
次に、イムノグロブリン結合ドメイン３を基本配列として、アルカリ安定性の向上を目指して、イムノグロブリン結合ドメイン３（配列番号２）における７位、１３位、２２位、及び２９位の４個のリジン残基をアルギニンに置換した改変体を作製した。
［改変体の製造］
次に、イムノグロブリン結合ドメイン３を基本配列として、アルカリ安定性の向上を目指して、イムノグロブリン結合ドメイン３（配列番号２）における７位、１３位、２２位、及び２９位の４個のリジン残基をアルギニンに置換した改変体を作製した。
［ＰＬ−０６１の発現プラスミド作成］
ＰＬ−０２４の発現プラスミドを鋳型とし、合成オリゴＤＮＡ oligo-178（配列番号１３）及びoligo-334（配列番号３８）をプライマーとしたPCRにより７位、１３位、及び２２位のリジン残基がアルギニンに置換され、２３位がイソロイシンとなった２８位までの配列をコードするｃＤＮＡフラグメントを作成した。またＰＬ−０２４の発現プラスミドを鋳型とし、oligo-335（配列番号３９）及びoligo-191（配列番号１６）をプライマーとしたPCRにより２９位のリジン残基がアルギニンに置換された２４位以降のイムノグロブリン結合ドメイン３の配列をコードするｃＤＮＡフラグメントを作成した。これら二つのＤＮＡフラグメントを鋳型として合成オリゴＤＮＡ oligo-178（配列番号１３）及びoligo-191（配列番号１６）をプライマーとしたPCRにより、ＰＬ−０６１をコードするｃＤＮＡが得られた。このｃＤＮＡをＮｄｅＩ及びＢａｍＨＩにて切断し、ｐＥＴ−９ａプラスミド上のＮｄｅＩ−ＢａｍＨＩ部分に組み込むことにより、Ｎ末端側から、人工Ｎ末端配列１１残基（配列番号１２）、配列番号２における７位、１３位、２２位、及び２９位のリジン残基がアルギニンに置換されたプロテインＬのイムノグロブリンカッパ軽鎖結合ドメイン３の７０残基、アラニン−ロイシンからなる連結配列２残基、プロテインＡ由来イムノグロブリンＦｃ結合Ｃドメイン第３αへリックスの改変Ｃ末端配列２１残基（配列番号１７）、及び人工Ｃ末端配列３残基（配列番号１８）がこの順で連結されたキメラタンパク質ＰＬ−０６１の発現プラスミドを得た。
ＰＬ−０２４の発現プラスミドを鋳型とし、合成オリゴＤＮＡ oligo-178（配列番号１３）及びoligo-334（配列番号３８）をプライマーとしたPCRにより７位、１３位、及び２２位のリジン残基がアルギニンに置換され、２３位がイソロイシンとなった２８位までの配列をコードするｃＤＮＡフラグメントを作成した。またＰＬ−０２４の発現プラスミドを鋳型とし、oligo-335（配列番号３９）及びoligo-191（配列番号１６）をプライマーとしたPCRにより２９位のリジン残基がアルギニンに置換された２４位以降のイムノグロブリン結合ドメイン３の配列をコードするｃＤＮＡフラグメントを作成した。これら二つのＤＮＡフラグメントを鋳型として合成オリゴＤＮＡ oligo-178（配列番号１３）及びoligo-191（配列番号１６）をプライマーとしたPCRにより、ＰＬ−０６１をコードするｃＤＮＡが得られた。このｃＤＮＡをＮｄｅＩ及びＢａｍＨＩにて切断し、ｐＥＴ−９ａプラスミド上のＮｄｅＩ−ＢａｍＨＩ部分に組み込むことにより、Ｎ末端側から、人工Ｎ末端配列１１残基（配列番号１２）、配列番号２における７位、１３位、２２位、及び２９位のリジン残基がアルギニンに置換されたプロテインＬのイムノグロブリンカッパ軽鎖結合ドメイン３の７０残基、アラニン−ロイシンからなる連結配列２残基、プロテインＡ由来イムノグロブリンＦｃ結合Ｃドメイン第３αへリックスの改変Ｃ末端配列２１残基（配列番号１７）、及び人工Ｃ末端配列３残基（配列番号１８）がこの順で連結されたキメラタンパク質ＰＬ−０６１の発現プラスミドを得た。
［改変体の精製と純度検定］
改変体ＰＬ−０６１の菌体抽出液をｐＨ６．０に調整した後に、参考例１と同様の手法で陽イオン交換体ＳＰ−セファロースファストフロー（ＧＥヘルスケア株式会社）カラムにアプライし、２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）にて洗浄後、０．５Ｍ ＮａＣｌの直線的濃度勾配にてタンパク質を溶出した。目的の改変体が含まれる溶出画分を集めてｐＨを９に調整した後に陰イオン交換体ギガキャップＱ（東ソー株式会社）カラムに添加した。２０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７．８）にて洗浄後、０．３Ｍ ＮａＣｌ直線的濃度勾配にて目的の改変体を溶出した。各溶出液をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供して純度を確認した結果、各改変体は理論値の分子量の位置に単一バンドとして精製されていることを確認した。
改変体ＰＬ−０６１の菌体抽出液をｐＨ６．０に調整した後に、参考例１と同様の手法で陽イオン交換体ＳＰ−セファロースファストフロー（ＧＥヘルスケア株式会社）カラムにアプライし、２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）にて洗浄後、０．５Ｍ ＮａＣｌの直線的濃度勾配にてタンパク質を溶出した。目的の改変体が含まれる溶出画分を集めてｐＨを９に調整した後に陰イオン交換体ギガキャップＱ（東ソー株式会社）カラムに添加した。２０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７．８）にて洗浄後、０．３Ｍ ＮａＣｌ直線的濃度勾配にて目的の改変体を溶出した。各溶出液をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供して純度を確認した結果、各改変体は理論値の分子量の位置に単一バンドとして精製されていることを確認した。
［ゲル担体への固定化とイムノグロブリン結合活性測定による評価］
精製した改変体ＰＬ−０６１を、ホルミル活性化アガロースゲル担体に１０ｍｇ／ｍＬゲルの濃度で常法に従って、それぞれ固定化した。固定化後の反応溶液を回収し、固定化率を測定したところ、固定化効率が９５％以上であることを確認した。次に、参考例１と同様の方法で各固定化ゲル担体のヒトＩｇＧ結合活性を測定した。
精製した改変体ＰＬ−０６１を、ホルミル活性化アガロースゲル担体に１０ｍｇ／ｍＬゲルの濃度で常法に従って、それぞれ固定化した。固定化後の反応溶液を回収し、固定化率を測定したところ、固定化効率が９５％以上であることを確認した。次に、参考例１と同様の方法で各固定化ゲル担体のヒトＩｇＧ結合活性を測定した。
得られた結果を表８に示す。この結果から、配列番号２における７位、１３位、２２位、及び２９位の４個のリジン残基をアルギニンに置換した場合であっても、前記イムノグロブリン結合ドメイン４の場合と同様に、ヒトＩｇＧ結合活性の向上が認められた。
［ゲル担体に固定化した改変体のアルカリｐＨ条件での安定性の評価］
改変体ＰＬ−０６１を固定化したゲル担体を０．１Ｍ ＮａＯＨ水溶液に置換した後に、２５℃にて１７時間保温した。その後、ＰＢＳで３回洗浄し、前記と同条件でヒトＩｇＧ結合活性を測定した。アルカリ処理前のそれぞれのＩｇＧ結合量を１００％としたときの１７時間処理後の残存ＩｇＧ結合量の割合をアルカリ処理後の残存活性（％）として求めた。得られた結果を表９に示す。
改変体ＰＬ−０６１を固定化したゲル担体を０．１Ｍ ＮａＯＨ水溶液に置換した後に、２５℃にて１７時間保温した。その後、ＰＢＳで３回洗浄し、前記と同条件でヒトＩｇＧ結合活性を測定した。アルカリ処理前のそれぞれのＩｇＧ結合量を１００％としたときの１７時間処理後の残存ＩｇＧ結合量の割合をアルカリ処理後の残存活性（％）として求めた。得られた結果を表９に示す。
この結果から、配列番号２における７位、１３位、２２位、及び２９位の４個のリジン残基をアルギニンに置換することによっても、アルカリ安定性が向上することが確認された。
なお、Peptostreptococcus magnus 3316株由来のプロテインＬにおけるイムノグロブリン結合ドメインのアミノ酸配列は、Peptostreptococcus magnus 312株由来のものと配列相同性が高いが、本発明者によって、Peptostreptococcus magnus 312株由来のプロテインＬにおけるイムノグロブリン結合ドメインに対して、前記と同様の変異を施しても、アルカリ安定性の向上が図れないことが確認されている。即ち、前記実施例１〜３で実証されたアルカリ安定性を向上させ得る変異は、Peptostreptococcus magnus 3316株由来のプロテインＬにおけるイムノグロブリン結合ドメインに特有のものであるといえる。
Claims (13)
- 下記(1-1)〜(1-4)、(2-1)〜(2-4)、及び(3-1)〜(3-4)のいずれかに示すイムノグロブリン結合ドメインを少なくとも１つ含むポリペプチド。
(1-1)配列番号１に示すアミノ酸配列において、第７位がアルギニン又はトレオニンに置換、第１３位がアルギニンに置換、第２２位がアルギニン又はトレオニンに置換、及び第２９位がアルギニンに置換よりなる群から選択される少なくとも３個以上のアミノ酸置換がなされているアミノ酸配列を含むイムノグロブリン結合ドメイン。
(1-2)配列番号２に示すアミノ酸配列において、第７位がアルギニン又はトレオニンに置換、第１３位がアルギニンに置換、第２２位がアルギニン又はトレオニンに置換、及び第２９位がアルギニンに置換よりなる群から選択される少なくとも３個以上のアミノ酸置換がなされているアミノ酸配列を含むイムノグロブリン結合ドメイン。
(1-3)配列番号３に示すアミノ酸配列において、第７位がアルギニン又はトレオニンに置換、第１３位がアルギニンに置換、第２２位がアルギニン又はトレオニンに置換、及び第２９位がアルギニンに置換よりなる群から選択される少なくとも３個以上のアミノ酸置換がなされているアミノ酸配列を含むイムノグロブリン結合ドメイン。
(1-4)配列番号４に示すアミノ酸配列において、第６位がアルギニン又はトレオニンに置換、第１２位がアルギニンに置換、第２１位がアルギニン又はトレオニンに置換、及び第２８位がアルギニンに置換よりなる群から選択される少なくとも３個以上のアミノ酸置換がなされているアミノ酸配列を含むイムノグロブリン結合ドメイン。
(2-1)配列番号１に示すアミノ酸配列における、第７位がアルギニン又はトレオニンに置換、第１３位がアルギニンに置換、第２２位がアルギニン又はトレオニンに置換、及び第２９位がアルギニンに置換よりなる群から選択される少なくとも３個以上のアミノ酸置換がなされているアミノ酸配列において、前記アミノ酸置換部位以外のアミノ酸の１〜６個が置換、付加、挿入又は欠失されてなり、且つ、イムノグロブリンに対する結合能を有し、配列番号１に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドと比較してアルカリ安定性が向上しているイムノグロブリン結合ドメイン。
(2-2)配列番号２に示すアミノ酸配列における、第７位がアルギニン又はトレオニンに置換、第１３位がアルギニンに置換、第２２位がアルギニン又はトレオニンに置換、及び第２９位がアルギニンに置換よりなる群から選択される少なくとも３個以上のアミノ酸置換がなされている酸配列において、前記アミノ酸置換部位以外のアミノ酸の１〜６個が置換、付加、挿入又は欠失されてなり、且つ、イムノグロブリンに対する結合能を有し、配列番号２に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドと比較してアルカリ安定性が向上しているイムノグロブリン結合ドメイン。
(2-3)配列番号３に示すアミノ酸配列における、第７位がアルギニン又はトレオニンに置換、第１３位がアルギニンに置換、第２２位がアルギニン又はトレオニンに置換、及び第２９位がアルギニンに置換よりなる群から選択される少なくとも３個以上のアミノ酸置換がなされているアミノ酸配列において、前記アミノ酸置換部位以外のアミノ酸の１〜６個が置換、付加、挿入又は欠失されてなり、且つ、イムノグロブリンに対する結合能を有し、配列番号３に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドと比較してアルカリ安定性が向上しているイムノグロブリン結合ドメイン。
(2-4)配列番号４に示すアミノ酸配列における、第６位がアルギニン又はトレオニンに置換、第１２位がアルギニンに置換、第２１位がアルギニン又はトレオニンに置換、及び第２８位がアルギニンに置換よりなる群から選択される少なくとも３個以上のアミノ酸置換がなされているアミノ酸配列において、前記アミノ酸置換部位以外のアミノ酸の１〜６個が置換、付加、挿入又は欠失されてなり、且つ、イムノグロブリンに対する結合能を有し、配列番号４に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドと比較してアルカリ安定性が向上しているイムノグロブリン結合ドメイン。
(3-1)配列番号１に示すアミノ酸配列における、第７位がアルギニン又はトレオニンに置換、第１３位がアルギニンに置換、第２２位がアルギニン又はトレオニンに置換、及び第２９位がアルギニンに置換よりなる群から選択される少なくとも３個以上のアミノ酸置換がなされているアミノ酸配列において、配列番号１に示すアミノ酸配列に対する前記アミノ酸置換部位を除いた配列同一性が９０％以上であり、且つ、イムノグロブリンに対する結合能を有し、配列番号１に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドと比較してアルカリ安定性が向上しているイムノグロブリン結合ドメイン。
(3-2)配列番号２に示すアミノ酸配列における、第７位がアルギニン又はトレオニンに置換、第１３位がアルギニンに置換、第２２位がアルギニン又はトレオニンに置換、及び第２９位がアルギニンに置換よりなる群から選択される少なくとも３個以上のアミノ酸置換がなされているアミノ酸配列において、配列番号２に示すアミノ酸配列に対する前記アミノ酸置換部位を除いた配列同一性が９０％以上であり、且つ、イムノグロブリンに対する結合能を有し、配列番号２に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドと比較してアルカリ安定性が向上しているイムノグロブリン結合ドメイン。
(3-3)配列番号３に示すアミノ酸配列における、第７位がアルギニン又はトレオニンに置換、第１３位がアルギニンに置換、第２２位がアルギニン又はトレオニンに置換、及び第２９位がアルギニンに置換よりなる群から選択される少なくとも３個以上のアミノ酸置換がなされているアミノ酸配列において、配列番号３に示すアミノ酸配列に対する前記アミノ酸置換部位を除いた配列同一性が９０％以上であり、且つ、イムノグロブリンに対する結合能を有し、配列番号３に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドと比較してアルカリ安定性が向上しているイムノグロブリン結合ドメイン。
(3-4)配列番号４に示すアミノ酸配列における、第６位がアルギニン又はトレオニンに置換、第１２位がアルギニンに置換、第２１位がアルギニン又はトレオニンに置換、及び第２８位がアルギニンに置換よりなる群から選択される少なくとも３個以上のアミノ酸置換がなされているアミノ酸配列において、配列番号４に示すアミノ酸配列に対する前記アミノ酸置換部位を除いた配列同一性が９０％以上であり、且つ、イムノグロブリンに対する結合能を有し、配列番号４に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドと比較してアルカリ安定性が向上しているイムノグロブリン結合ドメイン。 - 前記(1-1)〜(1-4)、(2-1)〜(2-4)、及び(3-1)〜(3-4)に示すイムノグロブリン結合ドメインの中から選択される１個のイムノグロブリン結合ドメインが含まれる単ドメイン型ペプチドである、請求項１に記載のポリペプチド。
- 前記(1-1)〜(1-4)、(2-1)〜(2-4)、及び(3-1)〜(3-4)に示すイムノグロブリン結合ドメインから選択される２個以上のイムノグロブリン結合ドメインが連結されてなる複ドメイン型ペプチドである、請求項１に記載のポリペプチド。
- 前記(1-1)、(2-1)、及び(3-1)のイムノグロブリン結合ドメインのいずれか少なくとも１つを含み、
配列番号１に示すアミノ酸配列における第７位がアルギニン又はトレオニンに置換、第１３位がアルギニンに置換、第２２位がアルギニン又はトレオニンに置換、且つ第２９位がアルギニンに置換されている、請求項１〜３のいずれかに記載のポリペプチド。 - 前記(1-2)、(2-2)、及び(3-2)のイムノグロブリン結合ドメインのいずれか少なくとも１つを含み、
配列番号２に示すアミノ酸配列における第７位がアルギニン又はトレオニンに置換、第１３位がアルギニンに置換、第２２位がアルギニン又はトレオニンに置換、且つ第２９位がアルギニンに置換されている、請求項１〜３のいずれかに記載のポリペプチド。 - 前記(1-3)、(2-3)、及び(3-3)のイムノグロブリン結合ドメインのいずれか少なくとも１つを含み、
配列番号３に示すアミノ酸配列における第７位がアルギニン又はトレオニンに置換、第１３位がアルギニンに置換、第２２位がアルギニン又はトレオニンに置換、且つ第２９位がアルギニンに置換されている、請求項１〜３のいずれかに記載のポリペプチド。 - 前記(1-4)、(2-4)、及び(3-4)のイムノグロブリン結合ドメインのいずれか少なくとも１つを含み、
配列番号４に示すアミノ酸配列における第６位がアルギニン又はトレオニンに置換、第１２位がアルギニンに置換、第２１位がアルギニン又はトレオニンに置換、且つ第２８位がアルギニンに置換されている、請求項１〜３のいずれかに記載のポリペプチド。 - 請求項１〜７のいずれかに記載のポリペプチドをコードしているＤＮＡ。
- 請求項８に記載のＤＮＡを含む組換えベクター。
- 請求項９に記載の組換えベクターを用いて宿主を形質転換して得られる形質転換体。
- 請求項１０に記載の形質転換体を培養する工程を含む、請求項１〜７のいずれかに記載のポリペプチドの製造方法。
- 請求項１〜７のいずれかに記載のポリペプチドが不溶性担体に固定化されてなる、イムノグロブリン結合用担体。
- 請求項１２に記載のイムノグロブリン結合用担体を用いて、イムノグロブリン又はそのカッパ鎖を含む断片の分離を行う、イムノグロブリン又はその断片の分離方法。
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