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KR102344129B1 - 메디토프를 위한 단일클론 항체 프레임워크 결합 계면, 메디토프 전달 시스템 및 이의 사용 방법 - Google Patents

메디토프를 위한 단일클론 항체 프레임워크 결합 계면, 메디토프 전달 시스템 및 이의 사용 방법 Download PDF

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KR102344129B1
KR102344129B1 KR1020197021655A KR20197021655A KR102344129B1 KR 102344129 B1 KR102344129 B1 KR 102344129B1 KR 1020197021655 A KR1020197021655 A KR 1020197021655A KR 20197021655 A KR20197021655 A KR 20197021655A KR 102344129 B1 KR102344129 B1 KR 102344129B1
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KR
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ser
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KR20190091368A (ko
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존 씨 윌리암스
죠슈아 마이클 도날드슨
데이비드 에이 혼
유에롱 마
신디 제어
크쉬슈토프 비지멕
켄드라 니콜 에버리
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시티 오브 호프
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Abstract

본원은 환형 메디토프 C-QFDLSTRRLK-C(cQFD; 서열 번호 1) 및 C-QYNLSSRALK-C(cQYN; 서열 번호 2)를 위한 항체 프레임워크 결합 계면 및 이의 사용 방법을 제공한다. 일 실시양태에서, 결합 계면은, 항체 또는 이의 기능성 단편의, 상보성 결정 영역(CDR)이 아닌 프레임워크 영역에 의해 형성된다. 또 다른 실시양태에서, 치료학적 인간 또는 인간화 항체는 1개 이상의 상응하는 뮤린 잔기로 대체된 1개 이상의 인간 프레임워크 잔기를 가져, 서열 cQFD 또는 cQYN을 갖는 메디토프가 1개 이상의 인간 프레임워크 잔기에 안정하게 결합하도록 한다.

Description

메디토프를 위한 단일클론 항체 프레임워크 결합 계면, 메디토프 전달 시스템 및 이의 사용 방법{A MONOCLONAL ANTIBODY FRAMEWORK BINDING INTERFACE FOR MEDITOPES, MEDITOPE DELIVERY SYSTEMS AND METHODS FOR THEIR USE}
우선권
본원은 2010년 10월 8일자에 출원된 미국 가출원 제61/391,558호의 이익을 주장하고, 이는 그 전문이 참조문헌으로 본원에 포함된다.
정부 이익
본 발명은 NCI 종합 암 센터(comprehensive Cancer Center) 승인 번호 CA0335752-28호의 정부 지원 하에 이루어졌다. 정부는 본 발명에 특정한 권한을 갖는다.
암은 면역계를 적극적으로 억제함으로써 면역 감시를 피한다. 이러한 면역억제에 대응하도록 고안된 한가지 방법은 종양 세포에 의해 독특하게 발현되거나 과발현되는 항원의 에피토프를 사용하는 백신접종에 의한 것이다. 예를 들면, 신호전달 경로를 차단하고/하거나, 성장 인자를 격리시키고/시키거나, 면역 반응을 유도하는 단일클론 항체(mAb)는 암 및 다른 질환을 처치하기 위해 클리닉에서 성공적으로 실행되고 있다. 이의 유리한 특성 및 임상 성공으로 인해, mAb는 집중적인 단백질 조작 노력의 대상이 되어왔고 계속해서 되고 있다. 이러한 노력은 표적화 개선을 위한 이중 특이적 mAb; 더 우수한 종양 침투 및 혈액 배출을 위한 단쇄 Fab 가변 단편(scFv), 이중항체 및 미니바디; 및 면역자극을 변경하거나 약동학적/약력학적 특성을 개선하기 위한 (돌연변이 또는 글리코실화를 통한) 변형 Fc를 생성시켰다. 마찬가지로, 전달 개선을 위해 소분자의 자리 특이적 접합을 허용하거나(예를 들면, ThioMAB), 이의 항원에 비가역적으로 결합하도록(예를 들면, 무한 친화도 mAb) mAb를 재조작하였다. MAb는 또한 생물활성 펩타이드 및 다른 생물물질(예를 들면, CovXbody)의 순환 및 제시를 개선하도록 개발되었다. 이종 다합체(hetero-multimeric) scFv 또는 아비딘에 융합된 scFv 또는 mAb는 또한 예비 표적화 치료에 그리고 종양 영상화를 위한 검출 한계를 개선하기 위해 개발되었다.
mAb가 효과적일 수 있고 소분자 접근법에 비해 여러 이점을 갖지만, 표적 이탈(off-target) 상호작용으로 인한 부작용 또는 방사성 핵종 접합 mAb의 긴 순환 시간으로 인한 부수적 손상과 같은 제한은 표적화 개선 및 시너지를 비롯한 이의 효능을 개선할 상당한 여지가 있다는 것을 나타낸다. 따라서, 항체 및 소분자 치료학적 효능의 증대는 암 및 다른 질환의 치료에서 유용하고 바람직할 것이다.
항체 결합 펩타이드 C-QFDLSTRRLK-C(cQFD; 서열 번호 1) 및 C-QYNLSSRALK-C(cQYN; 서열 번호 2)가 신규한 mAb 결합 특성을 갖는 것으로 밝혀졌다. 구체적으로, "메디토프(meditope)"라고도 칭하는 cQFD 및 cQYN은 항-EGFR mAb 세툭시맙의 Fab 프레임워크(framework)의 영역에 결합하고 항원에 결합하는 상보성 결정 영역(CDR)에 결합하지 않는 것으로 밝혀졌다. Fab 프레임워크에서의 결합 영역은 다른 프레임워크-결합 항원, 예컨대 슈퍼항원 스타필로코커스 단백질 A(SpA)(Graille et al., 2000) 및 펩토스트렙토코커스 매그너스 단백질 L(PpL)(Graille et al., 2001)과 구별되고, 이전에 공지되지 않았다. 따라서, 제1 실시양태는 서열 CQFDLSTRRLKC(서열 번호 1) 또는 CQYNLSSRALKC(서열 번호 2)를 갖는 환형 메디토프에 결합하는 독특한 뮤린(murine)-인간 항체 또는 이의 기능성 단편의 프레임워크 영역을 포함하는 프레임워크 결합 계면이다.
표면 플라스몬 공명에 의한 메디토프의 규명에 의하면 cQFD 및 cQYN이 각각 약 0.70∼0.95 내지 2∼5 μΜ의 해리 상수로 Fab에 결합한다는 것을 나타낸다. 특이적 상호작용을 방해하도록 설계된 점 돌연변이는 구조 모델을 추가로 지원한다. FACS 분석에 의하면 고농도의 cQFD 메디토프(60 μΜ)가 EGFR 수용체를 과발현하는 MDA-MB-468 세포에 결합하는 세툭시맙의 능력의 무시할만한 차이를 생성한다는 것을 보여준다. 따라서, 메디토프 결합은 항원 결합에 영향을 미치지 않는다. 또한, 메디토프는 형광 기와 접합되고, 세툭시맙으로 전처치된 MDA-MB-468 세포에 결합하지만, 뮤린 항-EGFR 항체, M425로 전처치된 MDA-MB-468 세포에 결합하지 않는다는 것을 보여준다(도 29). 총체적으로, 이러한 데이터는 Fab 프레임워크 내의 메디토프 결합 계면을 한정하고, 메디토프 결합이 항원 결합을 억제하지 않는다는 것(예를 들면, 알로스테릭 조절자로서 작용하지 않는다는 것)을 보여준다.
다른 실시양태에서, 상기 기재된 신규한 결합 특성을 갖는 메디토프(예를 들면, cQYN 또는 cQFD) 또는 이의 변이체는 치료학적 단일클론 항체("mAb")에 작용기를 추가하기 위해 사용될 수 있다. 추가의 실시양태에서, 단일클론 항체 및 이의 기능성 단편과 같은 치료 물질 또는 소분자와 같은 다른 물질의 효능에 영향을 미치도록 본원에 기재된 메디토프를 사용할 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 진단학적 또는 치료학적 용도를 위한 특정 유형의 세포 또는 조직의 확인을 위해 태그 또는 검출 가능한 라벨을 메디토프에 부착할 수 있다.
독립적인 실시양태에서, 메디토프는 메디토프 결합 자리에서 Fab에서의 시스테인에 공유 결합된 시스테인을 포함한다. 메디토프는 치료학적 분자, 예컨대 소분자 진단 분자, 예컨대 마커일 수 있는 임의의 물질, 분자 또는 화합물에 접합된다. "Cys 메디토프"는 접합체가 IgG로 향하게 하고, 공유 결합을 통해 결합한다.
도 1은 세툭시맙의 메디토프 펩타이드 결합 프레임워크 루프를 보여준다. 도 1a: 세툭시맙 Fab(경쇄는 VL 및 CL로 나타내고, 중쇄는 VH 및 CH로 나타냄) 및 환형 CQFDLSTRRLKC(음영 영역 내에 도시되고 "메디토프"라는 단어로 표지)(서열 번호 1)의 복합체는 메디토프가, 세툭시맙의 CDR 루프와 구별되는, Fab 프레임워크의 계면에 결합한다는 것을 나타낸다. 도 1b는 cQFD 메디토프의 막대 표현을 보여주고, 도 1c는 cQYN 메디토프의 막대 표현을 보여준다. N 말단 및 C 말단 시스테인은 용매 노출되고 높은 열 인자를 나타낸다.
도 2는 세툭시맙 Fab 결합 계면의 특정한 실시양태를 보여준다. 세툭시맙은 뮤린 키메라이고 따라서 뮤린 Ig 가변 도메인과 인간 불변 Ig 도메인의 혼합을 갖는다. 도 2a는 파지 '음성' 선택을 위한 상응하는 잔기, ch14.18, 및 메디토프와 접촉하는 인간화 트라스투주맙을 보여준다. 도 2b, 상부 패널은 세툭시맙의 뮤린 서열에 의해 코딩된 명확한 포켓을 점유하는 cQFD 메디토프의 Arg9의 입체뷰를 보여준다(전경). 트라스투주맙 Fab(1N8Z.pdb; 배경)은 중첩된다(Cho et al., 2003). Asp85로부터 메디토프 Arg9의 구아니디늄 기로의 염 브릿지 및 Leu10의 골격 아미드가 존재한다. 도 2b, 하부 패널은 메디토프 내의 F에서 Y로 인한 미묘한 효과를 나타내는 Fab 단편의 중첩을 그래프로 나타낸다. 구체적으로, 소수성 기, F/Y3 L5, 및 L10은 거의 동일하게 위치하지만, cQYN 메디토프 내의 Y5의 하이드록실 기는, cQFD 메디토프("입체 충동(steric clash)")에서 관찰되는 것처럼, R8이 Q111 골격과 상호작용하는 것을 막는다. 이러한 재정렬은 또한 β 회전("골격 회전")의 골격 잔기에서 수반되는 변화를 생성시킨다.
도 3은 cQFD 및 cQYN 및 Fab 단편의 표면 플라스몬 공명(SPR) 트레이스를 보여주는 2개의 선 그래프이다. 결정학 연구에 사용되는 세툭시맙 Fab는 저밀도로 CM5 칩에 커플링된다. 증가하는 농도의 cQFD(도 3a) 및 cQYN(도 3b) 메디토프에서의 트레이스가 도시되어 있다. 일련의 트레이스가 단순한 지수(예를 들면, 신호 = A*exp[kon*시간])를 사용하여 단일 결합 자리 모델에 핏팅된다. 핏의 잔차가 하기 각각 도시되어 있다.
도 4는 본 발명의 메디토프가 이전에 가설 세운 대로 CDR에 결합하지 않는다는 것을 보여준다. 도 4a는 2.0 Å 결정 구조를 보여주고, 여기서 메디토프가 세툭시맙 Fab의 중간 '홀'에 결합한다. 항원, EGFR 도메인 Ⅲ은 메디토프 결합 자리로부터 상당한 거리로 상보성 결정 영역에서 결합한다. 도 4b는 왼편 측에서는 겔 결과를 보여주고 오른편 측에서는 관련 크기 배제 크로마토그래피 결과를 보여준다. Fab, EGFR 도메인 Ⅲ 및 SMT-cQFD 메디토프의 개별 성분 및 모든 3종의 혼합물의 크기 배제 실험은 이종 삼합체(heterotrimeric) 복합체의 형성 및 공용리(coelute)를 나타낸다. 비환원 SDS-PAGE 겔은 처음 용리되는 분획을 보여주고, 이는 혼합물로부터 관찰되는 새로운 피크(연회색의 음영의 "복합체"에 대한 제일 왼쪽 피크) 내의 모든 3종 성분의 존재를 나타낸다. 도 4c는 FACS 분석의 결과를 보여주고, 이는 메디토프가 오직 세툭시맙의 존재 하에(화살표) EGFR 양성 MD-MBA-468 세포에 결합한다는 것을 나타낸다. 메디토프 단독 또는 M425, 뮤린 EGFR 항체의 존재 하의 메디토프는 결합하지 않는다. 도 4d 및 도 4e는 세툭시맙 scFv과 커플링된 센서 칩을 사용하는 표면 플라스몬 공명 실험의 결과를 보여준다. 실험은 scFv의 포화가 100 μΜ 만큼 높은 cQFD 메디토프의 농도에서 성취될 수 없다는 것을 나타낸다. 세툭시맙 Fab 커플링된 센서 칩을 사용하는 동일한 실험은 완전 포화를 나타낸다. 이 실험으로부터의 해리 상수는 660 nM이다. 대조군 SPR 실험은 세툭시맙 scFv가 가용성 EGFR 도메인 Ⅲ 단편에 용이하게 결합한다는 것을 보여주고, 이는 CDR 루프가 기능성이라는 것을 나타낸다.
도 5는 세포수와 비교된 형광 강도의 그래프이고, cQFD의 존재 하의 MDA-MB468 세포에 대한 형광 표지된 세툭시맙 결합을 보여준다. 세툭시맙은 펩타이드 부재 하에, 그리고 6 μΜ 및 60 μΜ의 펩타이드 및 아이소타입 대조군의 존재 하에 MDA-MB468 세포에 결합한다.
도 6은 어떻게 메디토프 및 EGFR이 명확한 자리에 결합하는지를 보여준다. 상부 이미지는 입체적으로 cQFD-Fab 복합체 및 EGFR-Fab 복합체(1YY8)의 중첩을 보여준다. 하부 이미지는 중쇄의 39-46번 잔기가 가요성이고 메디토프를 수용한다는 것을 보여준다.
도 7은 Fab 프레임워크 결합제를 보여준다. 메디토프, 단백질 A, 및 단백질 L에 결합된 Fab의 중첩은 각각 Fab 상의 독특한 자리에 결합한다는 것을 나타낸다.
도 8은 종양 치료를 증대하기 위한 하나의 작용 메커니즘을 예시한 것이다. 종양 세포 상의 항원(예를 들면, ErbB 수용체 패밀리)의 과발현은 2가 항체(왼쪽 패널)에 결합하고 수용체 신호전달을 차단하고/하거나, 엔도시토시스 및 수용체 재순환을 변경하고/하거나 면역 반응을 유발한다. 다가 메디토프의 첨가는 치료학적 mAb를 테더링/가교결합시키고, 이의 치료학적 가능성(오른쪽)을 증대시킬 수 있다. 오른쪽 패널은 3가 메디토프로부터 예상된 데이지 체인(daisy-chain) 결합을 도시한 것이다.
도 9는 scFv-메디토프 링커를 보여준다. scFv는 경쇄 가변 도메인을 중쇄 가변 도메인(또는 그 반대)에 12-20 아미노산 링커(통상적으로 {GGGS}3-5)를 통해 융합시킴으로써 생성된다.
도 10은 메디토프가 뮤린 세툭시맙에 선택적으로 결합한다는 것을 보여주는 겔이다. 비오틴화 cQFD 펩타이드를 아비딘 커플링 비드에 첨가하고, 완전히 세척하고, PBS 중에 평형화시킨다. 이후, 세툭시맙을 비드에 첨가하고(1 레인), 세척하고(2∼4 레인), 이후 용리시킨다(5 레인). 상부 밴드는 IgG 중쇄이고, 하부 밴드는 IgG 경쇄이다.
도 11은 입체 마스크의 도식이다. 메디토프는 종양 관련 프로테아제 자리를 포함하는 가요성 링커를 통해 Fab 경쇄 또는 중쇄의 N 말단에 융합될 수 있다. 분자간 상호작용은, 도시된 바대로, 항원 결합 자리를 입체적으로 폐쇄할 것이다.
도 12는 세툭시맙 상의 아비딘-펩타이드 마스크에 대한 등급 이탈(off-rate) 결정을 보여준다. 왼쪽 패널은 비오틴화 cQFD 메디토프의 결합 동역학을 고정화 세툭시맙 IgG를 사용하여 SPR에 의해 측정하였다는 것을 보여준다. 표면 플라스몬 공명 트레이스 위의 박스 패널은 2가 IgG를 통과하는 1가 메디토프의 카툰을 도시한 것이다. 오른쪽 패널에 도시된 바대로, 아비딘은 비오틴화 메디토프로 포화되고 동일한 고정화 세툭시맙 IgG를 통과한다. 다가 메디토프의 등급 이탈이 36 배 이상 감소하였다. (2회 실험 사이의 시간 스케일이 다르다는 것에 유의한다.) SPR 트레이스 위의 박스 패널은 4가 메디토프와 2가 IgG 사이의 "2가-2가 상호작용"을 도시한 것이다.
도 13은 몇몇 실시양태에 따른 2합체 및 3합체 메디토프의 합성을 예시한 것이다.
도 14는 플루오레세인 이소티오시아네이트(FITC) 표지된 메디토프 2합체 7의 특성규명을 예시한 것이다. 왼쪽 패널은 최종 2가 메디토프의 HPLC 트레이스를 보여주고, 오른쪽 패널은 이의 질량 스펙트럼을 보여준다.
도 15는 몇몇 실시양태에 따른 메디토프-Fc 테더링제에 대한 핵산 서열(서열 번호 3) 및 상응하는 아미노산 서열(서열 번호 4)을 보여준다.
도 16은 2가 메디토프의 구조를 보여준다. 메디토프는 IgG의 Fc 영역에 바로 융합된 펩타이드 링커의 N 말단에 바로 융합된다. Fc는 천연 동종 2합체이다. 따라서, 메디토프-Fc 구성체는 2가이다.
도 17은 예시적 FACS 분석으로부터의 결과를 보여준다. EGFR 수용체를 과발현하는 MDA-MB-468 세포를 10 nM의 세툭시맙으로 30 분 동안 전처리하고, 세정하고, 이후 4 농도에서 메디토프-Fc 구성체 또는 단량체 메디토프로 처리하였다. 하부 트레이스는 음성 대조군(항체 무)이다. 다음 4개의 트레이스는 단량체 메디토프가 농도 의존 방식으로 세툭시맙으로 전처리된 세포에 결합한다는 것을 보여준다. 또한, 상부 4개의 트레이스는 2가, 메디토프 Fc가 농도 의존 방식으로, 그러나 더 높은 친화도(예를 들면, 오른쪽으로 이동)로, 세툭시맙으로 전처리된 세포에 결합한다는 것을 보여준다. 이는 예상되었고 다가 상호작용과 일치한다.
도 18은 특정한 실시양태에 따라 사용될 수 있는 코일형 코일을 비롯한 대안적인 링커이다.
도 19는 NMR에 의한 단편 스크리닝이다. 세툭시맙 첨가 전(적색 트레이스) 및 후(청색 트레이스)의 단편 풀의 대표적인 NMR 스펙트럼. 상기 방법을 사용하여, 선두 화합물을 확인하였고, 회절 연구를 이용하여 결합 자리를 결정하였다.
도 20은 지시된 랜덤 라이브러리를 이용하는 메디토프 자리에서의 메디토프 또는 화합물 결합에 대한 mAb의 결합 친화도를 변경하고/하거나 증대시키는 단계를 예시한 것이다. 구체적으로, 메디토프 결합 자리에 줄지은 mAb 잔기에 대한 코돈이 NNK(여기서, N은 임의의 뉴클레오타이드이고, K는 티민 또는 구아노신임)로 대체되는 유전자 라이브러리를 FAC 분류(여기서, 메디토프 및 항원은 명확한 발색단으로 표지됨)를 이용하여 선택할 수 있다. GPI 링커는 선택된 mAb가 유전자 서열을 코딩하는 세포와 회합되어 남아 있는 것을 보장한다. 선택된 세포로부터 경쇄 및 중쇄를 코딩하는 유전자를 서열 결정하는 것은 높은 친화도 mAb를 확인할 것이다. 상기 방법을 더 높은 친화도 메디토프 또는 메디토프 동족체에 대해 선택하도록 반복할 수 있다.
도 21은 서열 차이의 3D 표면 표시를 보여준다. 상부 패널에서의 진회색 영역은 세툭시맙과 완전 인간 트라스투주맙 프레임워크 사이의 아미노산 차이를 나타낸다. 박스 내의 잔기가 트라스투주맙 프레임워크로 돌연변이되었다. 트라스투주맙의 CDR 루프가 확인되었고(어두운 영역; 하부 패널), 세툭시맙 프레임워크에 그래프팅되었다.
도 22는 메디토프 이용 가능(meditope-enabled) 트라스투주맙이 메디토프-Fc에 결합한다는 것을 예시한 것이다. 상부 그래프에서, 메디토프 결합 자리가 종양 항원, Her2에 결합하는 트라스투주맙, 완전 인간 mAb 상에 생성되었다. FACS 분석에 의하면 메디토프 이용 가능 트라스투주맙이 Her2를 과발현하는 SKBR3 세포에 결합한다는 것을 보여준다(상부 2개의 트레이스). 하부 그래프에서, 메디토프-Fc가 메디토프 이용 가능 트라스투주맙(상부 2개의 트레이스 - 오른쪽으로 이동된 피크)에 결합하지만, 야생형 트라스투주맙(하부에서 2번째) 또는 음성 대조군(하부 트레이스)에 결합하지 않는다.
도 23a는 메디토프 이용 가능 트라스투주맙 중쇄 서열의 핵산(서열 번호 5)의 서열을 보여준다. 신호 펩타이드 서열은 회색으로 음영이다. 도 23b는 야생형(서열 번호 7)과 비교된 메디토프 이용 가능 트라스투주맙 중쇄 서열의 아미노산(서열 번호 6) 서열을 보여준다. 차이가 회색으로 강조된다. 도 23b에 도시된 아미노산 후, 중쇄의 인간 서열에 남은 차이가 없다. 도 23c는 메디토프 이용 가능 트라스투주맙 경쇄 서열의 핵산(서열 번호 8) 서열을 보여준다. 신호 펩타이드 서열은 회색으로 음영이다. 도 23d는 야생형(서열 번호 10)과 비교된 메디토프 이용 가능 트라스투주맙 경쇄 서열의 아미노산(서열 번호 9) 서열을 보여준다. 차이가 회색으로 강조된다.
도 24는 세툭시맙 프레임워크에 그래프팅된 Her2 CDR 루프가 메디토프-Fc에 결합한다는 것을 보여준다. 도 24a에서, 트라스투주맙의 Her2 CDR 루프는 메디토프에 결합하는 세툭시맙에 그래프팅된다. FACS 분석은 Her2-CDR 그래프팅된 메디토프 이용 가능 mAb가 Her2를 과발현하는 SKBR3 세포에 결합한다는 것을 보여준다(상이한 농도에서의 상부 3개의 트레이스). 도 24b는 메디토프-Fc가 Her2-CDR 그래프팅된 메디토프 이용 가능 mAb(상부 3개의 트레이스 - 농도 의존 방식으로 오른쪽으로 이동된 피크)에 결합하지만, 야생형 트라스투주맙(하부에서 2번째) 또는 음성 대조군(하부 트레이스)에 결합하지 않는다는 것을 보여준다.
도 25a는 분비 서열 및 제한 자리를 갖는 Her2 CDR 그래프팅된 메디토프 결합 mAb의 중쇄에 대한 핵산(서열 번호 11) 및 아미노산(서열 번호 12) 서열 을 보여준다. 도 25b는 분비 서열 및 제한 자리를 갖는 Her2 CDR 그래프팅된 메디토프 결합 mAb의 경쇄에 대한 핵산(서열 번호 13) 및 아미노산(서열 번호 14) 서열을 보여준다. 밑줄 및 음영 영역은 메디토프 결합이 가능하도록 사용된 변화를 나타낸다. 메디토프의 특이성을 증대시키거나 변경하는 추가의 변화가 유사한 방식으로 그래프팅될 수 있다.
도 26은 서열의 예를 도시한 것이고, IgG(서열 번호 15) 및 IgE(서열 번호 16) Fab 도메인의 구조 정렬은 메디토프 결합 자리 근처의 IgE 상의 잔기를 나타낸다.
도 27은 표면 플라스몬 공명(SPR) 연구를 보여주는 그래프이다. 세툭시맙(cQFD, cQYN, 및 cQYD)에 대한 상이한 메디토프의 결합 친화도를 상이한 pH에서 결정하였다.
도 28은 2가 메디토프-Fc의 효능을 단량체 메디토프의 효능에 비교하는 MTT 검정의 결과를 예시한 것이다. 도 28a는 단량체 메디토프가 아닌 메디토프-Fc만이 세툭시맙과 조합될 때 세포 성장을 억제할 수 있다는 것을 보여준다. 도 28b는 메디토프-Fc가 세툭시맙의 세포사 능력을 증대시킨다는 것을 보여준다.
도 29는 메디토프가 독특한 세툭시맙 프레임워크에 결합하지만, 인간 프레임워크 또는 다른 뮤린-키메라 프레임워크에 결합하지 않는다는 것을 예시한 것이다. 야생형 메디토프를 표면 플라스몬 공명 연구를 위해 CM5 칩에 접합하고, 세툭시맙(메디토프 결합 Fab), 트라스투주맙(완전 인간 프레임워크) 및 리툭시맙(뮤린-인간 키메라 프레임워크)을 0.01, 0.05, 0.1, 0.5 및 1 μM 농도에서 시험하였다. 세툭시맙만이 메디토프 접합 칩에 결합하였다. 메디토프 결합 세툭시맙 Fab 구조에 대한 트라스투주맙(1N8Z; Cho et al. 2003) 및 리툭시맙(2OSL;Du et al. 2007) Fab의 분자 구조의 중첩은 프레임워크의 독특함을 추가로 부각시킨다. 더욱이, 이 구조 비교는 세툭시맙 Fab로부터 생기는 잔기가 메디토프 결합에 기여하는지의 명확한 표시 및 이것이 다른 Fab 프레임워크 영역에 어떻게 그래프팅될 수 있는지를 제공한다.
본원은 치료제 또는 영상화제를 표적 조직에 선택적으로 전달하는 항체 전달 시스템, 및 이의 사용 방법을 제공한다. 항체 전달 시스템은 항체-메디토프 복합체를 형성하기 위해 항체 결합 분자(또는 "메디토프")에 결합된 항체 프레임워크 결합 계면("프레임워크 결합 계면" 또는 "결합 계면")을 포함할 수 있다. 항체-메디토프 복합체는 하기 추가로 기재된 방법에 사용하기 위해 1종 이상의 추가의 항체-메디토프 복합체, 치료제, 영상화제 또는 이들의 조합에 추가로 접합될 수 있다.
몇몇 실시양태에 따르면, 메디토프에 결합할 수 있는 항체 프레임워크 결합 계면이 항체 또는 이의 기능성 단편의 상보성 결정 영역(CDR)에 의해서가 아니라 프레임워크 영역에 의해 형성된다. 본원에 사용되는 "항체 또는 이의 기능성 단편"은 특이적으로 결합하거나, 특정 항원 또는 에피토프와 면역학적으로 반응하고, 다중클론 및 단일클론 항체 둘 다를 포함하는 면역글로불린 분자를 의미한다. "항체"라는 용어는 유전 조작되거나, 그렇지 않으면 변형된 형태의 면역글로불린, 예컨대 인트라바디, 펩티바디, 키메라 항체, 완전 인간 항체, 인간화 항체, 메디토프 이용 가능 항체 및 이종 접합 항체(예를 들면, 이중 특이적 항체, 이중항체, 3중항체, 4중항체, 템덤 di-scFv, 템덤 트리-scFv)를 포함한다. "작용성 항체 단편"이라는 용어는 단편 항원 결합(Fab) 단편, F(ab')2 단편, Fab' 단편, Fv 단편, 재조합 IgG(rlgG) 단편, 단쇄 가변 단편(scFv) 및 단일 도메인 항체(예를 들면, sdAb, sdFv, 나노바디) 단편(이들로 제한되지는 않음)을 비롯한 항체의 항원 결합 단편을 포함한다.
몇몇 실시양태에 따르면, 항체 또는 이의 기능성 단편의 결합 및 영상화를 증대시키기 위해 결합 계면을 이용하거나 최적화할 수 있다. 독립적인 실시양태에서, 메디토프는 메디토프 결합 자리(예를 들면, ThioMAb)에서의 Fab에서 조작된 시스테인에 결합하는 시스테인 잔기를 포함할 수 있다. 메디토프는 이에 의해 임의의 진단 및/또는 치료 물질, 분자 또는 화합물에 접합된다. 예를 들면, 상기 물질은 소분자 진단 분자, 예컨대 마커일 수 있다. "Cys 메디토프"는 접합체가 IgG로 향하게 하고 공유 결합을 통해 결합한다. 대안적으로, 메디토프는 메디토프 결합 자리에 도입된 1종 이상의 비천연 아미노산으로 Fab에 접합될 수 있다. 비천연 아미노산과 만들 수 있는 결합의 예로는 (ⅰ) p-아세틸페닐알라닌, m-아세틸페닐알라닌, p-(3-옥소부타보일)-1-페닐알라닌 및 p-(2-아미노-3-히드록시에틸) 페닐알라닌의 도입에 의한 안정한 히드라존 및 옥심 결합, (ⅱ) 페닐셀레니딜알라닌의 도입에 의해 반응성인 티올, (ⅲ) p-벤조일-1-페닐알라닌의 도입에 의한 벤조페논을 포함하는 UV 가교결합제, (ⅳ) p-이소프로필티오카보닐-페닐알라닌 또는 p-에틸티오카보닐-페닐알라닌의 도입에 의해 반응성인 아민, (ⅴ) p-프로파길옥시페닐알라닌 또는 p-아지도페닐알라닌 또는 당해 분야에 공지된 임의의 다른 적합한 비천연 아미노산의 도입에 의한 아지드 알킨 Huisgen 부가 환화를 들 수 있다. 일 실시양태에서, 메디토프는 반응성 기가 p-아세틸페닐알라닌과 같은 Fab에 도입된 비천연 아미노산으로 향하게 할 수 있다.
또한, 메디토프 프레임워크 결합 계면은 다른 mAb에 그래프팅되어 메디토프 이용 가능 mAb를 생성할 수 있다. 메디토프 결합 자리가 다른 mAb에 그래프팅될 수 있으므로, 결합 계면은 EGFR 표적 조건에 대해 세툭시맙과 사용되지 않고, 임의의 단일클론 항체와 사용될 수 있는 광범위하게 유용한 플랫폼 기술을 나타낸다. "메디토프 이용 가능" 항체, 단일클론 항체 또는 치료학적 항체라는 용어는 세툭시맙을 비롯하여 이의 프레임워크 결합 계면에서 메디토프에 결합할 수 있는 임의의 항체를 의미한다. 따라서, 플랫폼은 (예를 들면, 알렘투주맙, 벡투무맙, 겜투주맙, FBTA05, 이브리투모맙 티우제탄, 오파투무맙, 리툭시맙, 토시투모맙을 사용하여 치료되거나 영상화될 수 있는) 백혈병 및 림프종, (예를 들면, 트라스투주맙, 아데카투무맙, 에트루막소맙을 사용하여 치료되거나 영상화될 수 있는) 유방암, (예를 들면, 아데카투무맙, 카프로맙 펜데타이드, 에타라시주맙을 사용하여 치료되거나 영상화될 수 있는) 전립선암, (예를 들면, 라베투주맙, 파니투무맙, 알투무맙 펜테테이트, 보투무맙을 사용하여 치료되거나 영상화될 수 있는) 결장암, (예를 들면, 아르시투무맙, 카투막소맙을 사용하여 치료되거나 영상화될 수 있는) 위장관암, (예를 들면, 아바고보맙, 카투막소맙, 에타라시주맙, 이고보맙, 오레고보맙을 사용하여 치료되거나 영상화될 수 있는) 난소암, (예를 들면, 아나투무맙 마페나톡스를 사용하여 치료되거나 영상화될 수 있는) 폐암, (예를 들면, 클리바투주맙 테트라세탄을 사용하여 치료되거나 영상화될 수 있는) 췌장암, (예를 들면, 기렌툭시맙을 사용하여 치료되거나 영상화될 수 있는) 신장암, (에타라시주맙, 이필리무맙, TRBS07을 사용하여 치료되거나 영상화될 수 있는) 흑색종 암, (예를 들면, 니모투주맙을 사용하여 치료되거나 영상화될 수 있는) 신경교종, (예를 들면, 데노수맙을 사용하여 치료되거나 영상화될 수 있는) 골 전이, (예를 들면, 잘루투무맙을 사용하여 치료되거나 영상화될 수 있는) 두경부암, (예를 들면, 압식시맙을 사용하여 치료되거나 영상화될 수 있는) 심혈관 질환, (예를 들면, 아달리무맙, 인플릭시맙을 사용하여 치료되거나 영상화될 수 있는) 자가면역 장애, (예를 들면, 아틀리주맙, 골리무맙, 인플릭시맙을 사용하여 치료되거나 영상화될 수 있는) 류마티스성 관절염, (예를 들면, 바실릭시맙, 다클리주맙, 무로모납-CD3을 사용하여 치료되거나 영상화될 수 있는) 이식 거부, (예를 들면, 세르톨리주맙, 폰톨리주맙, 나탈리주맙, 인플릭시맙, 비실리주맙을 사용하여 치료되거나 영상화될 수 있는) 크론씨병, (에쿨리주맙을 사용하여 치료되거나 영상화될 수 있는) 헤모글로빈뇨증, (예를 들면, 에팔리주맙, 인플릭시맙, 우스테키누맙을 사용하여 치료되거나 영상화될 수 있는) 건선, (예를 들면, 나탈리주맙, 우스테키누맙을 사용하여 치료되거나 영상화될 수 있는) 다발성 경화증, (예를 들면, 벤랄리주맙, 메폴리주맙, 오말리주맙을 사용하여 치료되거나 영상화될 수 있는) 천식, (예를 들면, 팔리비주맙을 사용하여 치료되거나 영상화될 수 있는) 호흡기 세포융합 바이러스(RSV), (예를 들면 라니비주맙을 사용하여 치료되거나 영상화될 수 있는) 황반변성, (예를 들면, 파놀레소맙을 사용하여 치료되거나 영상화될 수 있는) 충수염 및 항체에 의해 표적화되거나 처치될 수 있는 임의의 다른 병증(이들로 제한되지는 않음)을 비롯하여 치료학적 항체를 사용하여 처치되거나 표적화될 수 있는 임의의 암, 질환 또는 다른 병증의 치료, 진단 또는 영상화에 사용하기 위해 확장될 수 있다. 상기 기재된 항체 및 관련 질환 또는 장애는 오직 예이고 플랫폼을 제한하지 않는다.
일 실시양태에서, 환형 항체 결합 펩타이드 C-QFDLSTRRLK-C(cQFD; 서열 번호 1) 및 C-QYNLSSRALK-C(cQYN; 서열 번호 2)는 비공유 결합 상호작용을 통해 항체 프레임워크 결합 계면에 결합할 수 있다. 결합 상호작용의 이러한 비공유 성질은 프레임워크 결합 계면, 펩타이드 또는 둘 다를 변형하기 위한 새로운 대안적인 방법을 열어, 매우 특이적인 메디토프 변이체를 생성하는 가능성을 확장시킨다. 일 실시양태에서, cQFD 및 cQYN 펩타이드는, 하기 기재된 바와 같은 회절 및 생물물리학적 데이터로 보이는 것처럼, CDR 영역이 아니라 세툭시맙의 Fab 영역의 프레임워크 영역에 결합한다. 이 결합 자리는 슈퍼항원 스타필로코커스 단백질 A(SpA) 및 펩토스트렙토코커스 매그너스 단백질 L(PpL)과 같은 다른 프레임워크-결합 항원의 결합 자리와 구별된다(도 7). 또한, 단백질 A 및 단백질 L은 환자에서 존재하는 IgG에 결합할 것이다. 따라서, 상호작용은 특이적이다.
X선 결정학적 분석에 의하면 펩타이드가 약 700 nM의 결합 상수로, 중쇄 및 경쇄(도 1 및 도 4a 참조)에 의해 한정되는 것처럼, Fab 공간 내에 결합하는 것으로 밝혀졌다. 이러한 상호작용은, 무엇보다도, 순수한 mAb의 치료학적 효능을 개선하고, 영상화제 또는 치료제의 표적 전달을 증대시키고, mAb 기반 영상화 방법을 개선하기 위해 이용될 수 있다.
cQFD 및 cQYN 메디토프는 세툭시맙에서 발견되는 것과 같은 키메라 프레임워크 결합 영역에 결합한다. 본원에 사용되는 "메디토프"라는 용어(라틴어로 중간(middle)을 뜻하고 그리스어로 위치(place)를 뜻하는 medius와 topos를 합한 용어)는 항체의 Fab 경쇄와 중쇄 사이에 결합하는 cQFD 및 cQYN 펩타이드 또는 이의 변이체와 같은 항체 결합 펩타이드를 의미한다. 또한, 다른 분자가 메디토프의 작용기와 유사한 프레임워크 결합 작용기를 갖는 항체의 Fab 경쇄와 중쇄와 사이에 결합할 수 있다. 이러한 분자로는 소분자, 압타머, 핵산 분자, 펩티바디 및 메디토프와 동일한 결합 계면에 결합하는 임의의 다른 물질을 들 수 있지만, 이들로 제한되지는 않는다. 본원에 기재된 프레임워크 결합 계면은 항원 에피토프에 결합하는 CDR과 구별되고 멀리 있다(도 4). 추가로, 생화학 및 세포 기반 검정은 cQFD 및 cQYN 환형 펩타이드가 EGFR에 미리 결합된 뮤린 키메라 세툭시맙에 결합할 수 있다는 것을 보여준다(도 4).
세툭시맙은 독특한 뮤린-인간 키메라이고, cQFD 및 cQYN 메디토프와 세툭시맙 Fab 사이의 여러 상호작용은 본원에 기재된 원자 모델에 의해 결정되는 바대로 이러한 뮤린-인간 키메라 IgG 프레임워크 잔기에 특이적이다. 추가로, 메디토프는 인간 IgG 프레임워크(예를 들면, 트라스투주맙)에 결합하지 못하고, 이는 이러한 상호작용이 이러한 뮤린-키메라 항체에 특이적이지만, 리툭시맙과 같은 다른 뮤린 키메라에 특이적이지 않다는 것을 나타낸다(도 29). 이는 세툭시맙 프레임워크가 매우 특이적이라는 것을 지지한다. 세툭시맙-환형 펩타이드 구조로의 다수의 인간 및 뮤린 Fab의 중첩은 이러한 펩타이드와 뮤린-인간 키메라 Fab 사이의 중요한 상호작용이 인간 단독 및 뮤린 단독의 IgG 구조 둘 다에서 부재한다는 것을 나타낸다. 환형 펩타이드 내의 중요한 잔기의 점 돌연변이는 Fab에 대한 이의 결합 친화도를 감소시키고, 이는 추가로 고 특이성 및 구조 모델을 확인시켜 준다(데이터 비도시). 따라서, 상호작용은 이러한 특이적 뮤린-인간 키메라 Fab 및 선택된 메디토프의 중앙 공간에 특이적인 것으로 보인다. 반대로, PpL 및 SpA는 뮤린 특이적이 아니다. PpL은 약 66%의 뮤린 및 약 50%의 인간 IgG Kappa 경쇄에 결합하고, SpA는 12%의 뮤린 및 50%의 인간 가변 중쇄에 결합한다(Graille et al., 2002).
세툭시맙은 EGFR 발현 전이 결장암 및 두경부암의 치료에 현재 사용된다. 세툭시맙은 입체구조적 에피토프(예를 들면, 폴딩된 EGFR 도메인 Ⅲ)를 인지한다. 소분자 항원, 펩타이드 및 단백질 에피토프를 인지하는 항체를 비교하면 계면이 상이한 특징을 보유하는 경향이 있다는 것을 보여준다(Collis et al., 2003). 소분자는 작은 포켓 내에 안기는 경향이 있고; 펩타이드는 직선 홈에 핏팅되고; 단백질은 넓은 표면과 접촉한다. 따라서, 세툭시맙-EGFR에서처럼 단백질-항체 상호작용을 성공적으로 재생성하는 펩타이드는 일반적으로 넓은 접촉 표면적을 갖는 폴딩되지 않은 도메인을 갖는 단백질 항원을 갖는 것이다. 예를 들면, 트라스투주맙은 단백질 항원(입체구조적 에피토프)를 인지하지만, 다수의 기하학적으로 구속된 루프와 주로 접촉한다(Du et al., 2007; Cho et al., 2003). 이러한 유형의 생물학적 인지는 펩타이드 모방체와 더 상용성이다.
cQFD 및 cQYN 메디토프는 원래 세툭시맙의 CDR 영역을 결합하기 위한 후보 펩타이드로서 확인되었다. 펩타이드가 항원에 대한 면역 반응을 인공적으로 자극하는 항원 에피토프를 모방할 것이라는 가정 하에, 확립된 치료학적 항체의 상보성 결정 영역(CDR)에 결합하는 펩타이드를 확인하기 위해 파지 디스플레이 라이브러리를 이용하였다(Riemer et al., 2004; Riemer et al., 2005; Li et al., 2006). 미모토프 또는 항-이디오타입으로도 칭하는 이러한 펩타이드 모방체는 화학적으로 합성될 수 있어서, 잠재적 생물학적 오염을 제거하고 비용을 감소시킨다. 그러나, 이러한 설계에 기초한 백신은 부분 반응을 생성시키고, 종양 항원에 대한 면역 반응의 손실 없이 종종 차후 질환 재발이 뒤따른다(Sharav et al., 2007).
cQFD 및 cQYN 메디토프가 프레임워크에 결합하고 CDR 영역에 결합하지 않으므로, 상기 메디토프는 백신으로서 사용하기 위한 특이적 세툭시맙양 항체 면역원에 대한 후보물질이 아닐 것이다. 라이너(Reimer) 등이 KLH 커플링된 메디토프로 면역화된 마우스로부터 수집된 혈청이 A431 세포에 결합하고 이의 증식을 차단하는 항체를 생성한다는 것을 관찰하였지만(Riemer et al., 2005), 본원에 기재된 연구에 의하면 아쥬번트에 커플링된 다수의 카피의 메디토프가 백신이 (슈퍼항원과 유사한) 뮤린 IgG의 잡다한 가교결합제로 된다는 것을 보여준다. 이러한 실시양태를 지지하여, 유사한 생식선 또는 B 세포 유래 프레임워크 서열이 BLAST를 이용하여 마우스 경쇄 및 마우스 중쇄 및 인간 중쇄 둘 다에서 관찰되었다. 따라서, 아쥬번트에 테더링될 때, 메디토프 펩타이드는 보존된 프레임워크 영역을 갖는 B 세포 집단을 활성화하고 백신에 필요한 특이적 면역 반응과 반대로 일반화된 면역 반응을 생성시키도록 작용할 수 있다. 보고된 ELISA 경쟁 검정에 의하면 EGFR의 특이적 결합 자리도 나타내지 않고 있고, 다중클론 혈청이 EGFR 상의 세툭시맙 에피토프에 특이적인 정도도 나타내지 않고 있다(예를 들면, 보고서는 혈청 유래 IgG가 비표지된 세툭시맙에 의해 차단되는지에 대해 나타내지 않았다). 회절 및 생화학 연구는 인간에서 백신으로서의 cQYN 또는 cQFD 메디토프를 사용하는 것을 지지하지 않는다.
본원에 기재된 실시양태에 따라 사용될 수 있는 추가의 메디토프는 세툭시맙 또는 임의의 다른 치료학적 항체의 항체 프레임워크 결합 계면(즉, Fab 경쇄와 중쇄 사이)에 결합하는 임의의 작은 펩타이드를 포함한다. 예를 들면, 환형 펩타이드 cQFD 및 cQYN 이외에, 몇몇 실시양태는 cQFD 및 cQYN의 1종 이상의 변이체를 포함한다. 또한, 메디토프는 선형일 수 있다.
구조적 및 생물물리학적 방법 또는 변형은 비변형 메디토프, cQFD 및 cQYN와 비교하여 (예를 들면, 하기 실시예에 기재된 바와 같은 pH 변화로 인해) 세툭시맙에 대한 친화도가 증가되거나 변경된 메디토프 변이체를 개발하기 위해 화학 합성과 협력하여 사용될 수 있다. 더욱이, 다가 테더링체(tethering entity) 또는 스캐폴드에 대한 비변형 메디토프 또는 변이체 메디토프의 접합은 종양 관련 항원에 결합된 메디토프 이용 가능 mAb에 대한 다가 메디토프의 표적화 및 전체 친화도를 상당히 개선할 수 있다. 친화도가 높은 메디토프 변이체를 생성하기 위해 사용될 수 있는 cQFD 및 cQYN 메디토프의 변형은 당해 분야에 공지된 펩타이드를 변형하기 위한 임의의 방법을 포함할 수 있다. 각각의 아미노산 위치는 비천연 아미노산으로 변경되거나 단편으로 화학적으로 접합될 수 있다.
특정한 실시양태에서, 하나 이상의 메디토프, 메디토프 변이체, 다가 메디토프 테더링제 또는 다가 메디토프 변이체 테더링제는 1종 이상의 영상화제, 치료학적 유효량의 치료학적으로 효과적인 물질 또는 화합물 또는 둘 다에 접합될 수 있어, 치료학적으로 효과적인 화합물과 1종 이상의 메디토프 이용 가능 항체에 대한 메디토프 또는 이의 변이체의 결합은 질환 또는 병증을 치료하거나, 예방하거나, 진단하거나, 모니터할 수 있다. 메디토프 이용 가능 mAb에 커플링되는 고친화도 및/또는 다가 메디토프의 이러한 접합은 질환을 치료하고 검출하기 위한 치료 및 영상화 방법에 기초하여 mAb를 상당히 개선하는 매우 다양한 플랫폼 기술을 제공한다(도 8 참조).
몇몇 실시양태에서, 뮤린 특이적 cQFD 및 cQYN 메디토프 또는 이의 유도체는 2종 이상의 항체 또는 이의 기능성 단편을 테더링하기 위해 사용될 수 있다. 하기 기재된 테더링 방법에 사용될 때, 메디토프는 암 또는 종양 치료 및 영상화를 증대시키기 위한 다가 테더링제("메디토프 스캐폴드" 또는 "스캐폴드"라고도 칭함)의 일부일 수 있다.
다가 테더링제는 2종 이상의 cQFD 및 cQYN 메디토프, 또는 다가 메디토프 테더링체를 생성하기 위해 긴 링커 및 비오틴을 통해 스트렙타비딘에 커플링된 임의의 다른 새로운 메디토프 변이체를 포함할 수 있다. 일 실시양태에서, 다가 메디토프 테더링체는 4가 메디토프 테더링제이다. 4합체 테더링체가 1가 펩타이드와 비교하여 IgG에 대해 증대된 결합을 갖는 것으로 표면 플라스몬 공명에 의해 나타나고, 이는 다가 상호작용과 일치한다. 또한, 4가 메디토프는 FACS 분석에 의해 EGFR 양성 세포에서 세툭시맙의 결합 친화도를 증대시킨다.
다가 메디토프 스캐폴드는 리간드 길항작용을 증대시키고/시키거나, 수용체 엔도시토시스를 변경하고/하거나 ADCC/CDC를 통한 면역 반응을 개선하는 종양 관련 항원에 결합된 메디토프 이용 가능 mAb를 스캐폴드 또는 "데이지 체인"하기 위해 사용될 수 있다(도 8). 단일클론 항체(mAb)는 2합체 Fc에 커플링된 2개의 Fab 도메인을 코딩한다. 그러므로, 이러한 2가 IgG는 고밀도로 항원을 발현하는 세포에 우선적으로 결합한다. 동일한 항원 상의 독특한 에피토프에 결합하는 제2 mAb가 수용체를 클러스터링하고 더 효과적으로 종양 세포를 죽일 수 있다는 것이 입증되었다. 이러한 클러스터링은 다가 메디토프의 사용을 통해 재언급될 수 있다. 다가 메디토프의 사용은 제 2 mAb를 확인할 필요성 및 이의 개발과 관련된 상당한 비용을 피한다.
메디토프, 메디토프 변이체, 다가 메디토프 테더링제 및 다가 메디토프 변이체 테더링제의 특이성 및 결합은 1종 이상의 메디토프 이용 가능 단일클론 항체와 조합되어 투여될 때 질환 또는 병증을 치료, 진단 또는 영상화하기 위해 치료제, 진단제(예를 들면, 영상화제), 또는 이의 조합을 전달하기 위해 사용될 수 있다. 따라서, 다가 메디토프는 메디토프, 메디토프 변이체, 다가 메디토프 테더링제 또는 다가 메디토프 변이체 테더링제를 투여하기 전에 메디토프 이용 가능 단일클론 항체를 투여함으로써 하기 추가로 기재된 바대로 사전 표적화 치료 및 영상화에 사용될 수 있다. 추가로, 다가 메디토프의 사용은 조작된 scFv 또는 화학적으로 접합된 mAb에 대해 입증된 바대로 선택도를 증대시키고 종양 검출을 개선할 수 있지만, 이러한 비인간 구성체에 고유한 잠재적 면역원성을 피한다.
몇몇 실시양태에서, 메디토프 이용 가능 항체와 조합되어 투여되는 메디토프, 항체-메디토프 복합체, 메디토프 이용 가능 항체와 조합되어 투여되는 다가 테더링제, 또는 이들의 조합은 1종 이상의 영상화제에 접합될 수 있다. 일 양태에서, 영상화제로는 형광, 발광, 또는 자기 단백질, 펩타이드 또는 이의 유도체(예를 들면, 유전 조작 변이체)를 들 수 있지만, 이들로 제한되지는 않는다. mRNA 성분에 의해 발현될 수 있는 형광 단백질로는 그린 형광 단백질(GFP), 인핸스드 GFP(EGFP), 레드, 블루, 옐로우, 시안 및 사파이어 형광 단백질, 및 초산화 형광 단백질을 들 수 있다. mRNA 성분에 의해 발현될 수 있는 발광 단백질로는 루시퍼라제, 에쿼린 및 이의 유도체를 들 수 있다. 다양한 형광 및 발광 염료 및 단백질이 당해 분야에 공지되어 있다(예를 들면, 미국 특허 출원 공보 제2004/0067503호; Valeur, B., "Molecular Fluorescence: Principles and Applications," John Wiley and Sons, 2002; Handbook of Fluorescent Probes and Research Products, Molecular Probes, 9.sup.th edition, 2002; The Handbook--A Guide to Fluorescent Probes and Labeling Technologies, Invitrogen, 10th edition 참조, Invitrogen 웹사이트에서 입수 가능; 이들 둘 다 본원에 완전히 기재된 것처럼 본원에 참조문헌으로 포함됨.)
다른 양태에서, 메디토프 이용 가능 항체와 조합되어 투여되는 메디토프, 항체-메디토프 복합체, 메디토프 이용 가능 항체와 조합되어 투여되는 다가 테더링제, 또는 이들의 조합은 추가로 접합될 수 있거나, 그렇지 않으면 비 단백질 영상화제 또는 전달 비히클, 예컨대 나노입자, 방사성 물질(예를 들면, 방사성 동위원소, 방사성 핵종, 방사능 표지 또는 방사성 트레이서), 염료, 조영제, 형광 화합물 또는 분자, 생물발광 화합물 또는 분자, 효소 및 증강제(예를 들면, 상자성 이온)와 회합될 수 있다. 또한, 여러 나노입자, 예를 들면 양자점 및 (하기 기재된) 금속 나노입자가 또한 (예를 들면, 고열발생 및 광역학 치료제 및 형광 및 또는 MRI 조영을 통한 영상화제를 사용하여) 영상화제 또는 치료제로서 사용하기에 적합할 수 있다는 것에 유의해야 한다.
본 개시내용의 실시양태에 따라 추가의 영상화제로서 사용될 수 있는 형광 및 발광 물질로는 "염료", "표지" 또는 "표시자"로 흔히 칭하는 다양한 유기 또는 무기 소분자를 들 수 있지만, 이들로 제한되지는 않는다. 예로는 플루오레세인, 로다민, 아크리딘 염료, Alexa 염료 및 시아닌 염료를 들 수 있다.
본 개시내용의 실시양태에 따라 추가의 영상화제로서 사용될 수 있는 효소로는 겨자무 과산화효소, 알칼리 포스파타제, 산 포스파타제, 글루코스 옥시다제, β-갈락토시다제, β-글루코로니다제 또는 β-락타마제를 들 수 있지만, 이들로 제한되지는 않는다. 이러한 효소는 검출 가능한 신호를 생성하는 발색체, 형광성 화합물 또는 발광성 화합물과 조합되어 사용될 수 있다.
본 개시내용의 실시양태에 따라 추가의 영상화제로서 사용될 수 있는 방사성 물질로는 18F, 32P, 33P, 45Ti, 47Sc, 52Fe, 59Fe, 62Cu, 64Cu, 67Cu, 67Ga, 68Ga, 77As, 86Y, 90Y. 89Sr, 89Zr, 94Tc, 94Tc, 99mTc, 99Mo, 105Pd, 105Rh, 111Ag, 111In, 123I, 124I, 125I, 131I, 142Pr, 143Pr, 149Pm, 153Sm, 154-1581Gd, 161Tb, 166Dy, 166Ho, 169Er, 175Lu, 177Lu, 186Re, 188Re, 189Re, 194Ir, 198Au, 199Au, 211At, 211Pb, 212Bi, 212Pb, 213Bi, 223Ra 및 225Ac를 들 수 있지만, 이들로 제한되지는 않는다. 본 개시내용의 실시양태에 따라 추가의 영상화제로서 사용될 수 있는 상자성 이온으로는 전이 금속 및 란탄족 금속(예를 들면 원자가가 21∼29, 42, 43, 44, 또는 57∼71인 금속)의 이온을 들 수 있지만, 이들로 제한되지는 않는다. 이러한 금속으로는 Cr, V, Mn, Fe, Co, Ni, Cu, La, Ce, Pr, Nd, Pm, Sm, Eu, Gd, Tb, Dy, Ho, Er, Tm, Yb 및 Lu의 이온을 들 수 있다.
영상화제가 방사성 금속 또는 상자성 이온일 때, 상기 제제는 이러한 이온을 결합시키기 위한 긴 꼬리에 부착된 1개 이상의 킬레이팅 기를 갖는 긴 꼬리를 갖는 다른 긴 꼬리 시약과 반응할 수 있다. 긴 꼬리는 폴리리신, 폴리사카라이드, 또는 금속 또는 이온에 결합하기 위해 첨가될 수 있는 펜던트 기를 갖는 다른 유도된 쇄 또는 유도체화 쇄와 같은 중합체일 수 있다. 본 개시내용에 따라 사용될 수 있는 킬레이팅 기의 예로는 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA), 디에틸렌트리아민펜타아세트산(DTPA), DOTA, NOTA, NETA, 포르피린, 폴리아민, 크라운 에테르, 비스-티오세미카르바존, 폴리옥심 및 유사 기를 들 수 있지만, 이들로 제한되지는 않는다. 킬레이트는 면역 반응성의 최소 손실 및 최소 응집으로 분자에 대한 결합 형성 및/또는 내부 가교결합이 가능하게 하는 기에 의해 PSMA 항체 또는 기능성 항체 단편에 통상 연결된다. 동일한 킬레이트는, 망간, 철 및 가돌리늄과 같은 비 방사성 금속과 복합체될 때, 본원에 기재된 항체 및 담체와 함께 사용될 때, MRI에 유용하다. NOTA, DOTA, 및 TETA와 같은 거대고리 킬레이트는 각각 갈륨, 이트륨 및 구리의 방사성 핵종(이들로 제한되지는 않음)을 비롯한 다양한 금속 및 방사성 금속을 사용한다. RAIT에 대한 223Ra와 같은 안정하게 결합하는 핵종에 중요한 거대고리 폴리에테르와 같은 다른 고리 유형의 킬레이트를 사용할 수 있다. 특정한 실시양태에서, 킬레이팅 모이어티는 PET 분석에 사용하기 위한 표적 분자에 AI-18F 복합체와 같은 PET 영상화제를 부착시키기 위해 사용될 수 있다.
몇몇 실시양태에서, 메디토프, 항체-메디토프 복합체, 다가 테더링제, 또는 이들의 조합은 1종 이상의 치료제에 접합될 수 있다.
본원에 사용되는 "치료제"는 본원에 기재된 암 또는 다른 병증의 치료에 유용한 원자, 분자, 또는 화합물이다. 항체-메디토프 복합체, 다가 테더링제, 다가 테더링제 또는 이들의 조합에 접합될 수 있는 치료제의 예로는 약물, 화학치료제, 치료학적 항체 및 항체 단편, 독소, 방사성 동위원소, 효소(예를 들면, 종양의 자리에서 프로드럭을 세포독성 물질로 분할하는 효소), 뉴클레아제, 호르몬, 면역조절제, 안티센스 올리고뉴클레오타이드, RNAi 분자(예를 들면, siRNA 또는 shRNA), 킬레이터, 붕소 화합물, 광활성제 및 염료를 들 수 있지만, 이들로 제한되지는 않는다. 치료제는 또한 표적된 세포가 건강한 세포와 비교하여 방사선 치료에 더 민감하게 되도록 방사선증감제로서 작용하는 킬레이터에 결합된 코어-셀 나노입자, 금속간 화합물, 금속 합금 또는 금속을 포함할 수 있다. 추가로, 치료제는 MRI 조영제를 위한 상자성 나노입자(예를 들면, 자철석 또는 Fe3O4)를 포함할 수 있고, 다른 유형의 치료(예를 들면, 광역학 및 고열발생 치료) 및 영상화(예를 들면, 형광 영상화(Au 및 CdSe))와 사용될 수 있다.
화학치료제는 종종 성질상 세포독성 또는 세포 증식 억제이고, 알킬화제, 대사길항제, 항-종양 항생제, 토포아이소머라제 억제제, 핵분열 억제제 호르몬 치료제, 표적 치료제 및 면역 치료제를 포함할 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 본 개시내용의 실시양태에 따라 치료제로서 사용될 수 있는 화학치료제로는 13-시스-레티노산, 2-클로로데옥시아데노신, 5-아자시티딘, 5-플루오로우라실, 6-머캅토푸린, 6-티오구아닌, 악티노마이신-D, 아드리아마이신, 알데스류킨, 알렘투주맙, 알리트레티노인, 올-트랜스레티노산, 알파 인터페론, 알트레타민, 아메톱테린, 아미포스틴, 아나그렐리드, 아나스트로졸, 아라비노실시토신, 삼산화비소, 암사크린, 아미노캄프토테신, 아미노글루테티미드, 아스파라기나제, 아자시티딘, 바실루스 칼메트-게렝(BCG), 벤다무스틴, 베바시주맙, 벡사로텐, 비칼루타미드, 보르테조밉, 블레오마이신, 부술판, 칼슘 류코보린, 시트로보룸 인자, 카페시타빈, 카네르티닙, 카르보플라틴, 카르무스틴, 세툭시맙, 클로람부실, 시스플라틴, 클라드리빈, 코티손, 시클로포스파미드, 시타라빈, 다르베포에틴 알파, 다사티닙, 다우노마이신, 데시타빈, 데닐류킨 디프티톡스, 덱사메타손, 덱사손, 덱스라족산, 닥티노마이신, 다우노루비신, 데카르바진, 도세탁셀, 독소루비신, 독시플루리딘, 에닐우라실, 에피루비신, 에포에틴 알파, 에를로티닙, 에버롤리무스, 엑세메스탄, 에스트라무스틴, 에토포사이드, 필그라스팀, 플루옥시메스테론, 풀베스트란트, 플라보피리돌, 플록수리딘, 플루다라빈, 플루오로우라실, 플루타미드, 게피티닙, 겜시타빈, 겜투주맙 오조가마이신, 고세렐린, 과립구-콜로니 자극 인자, 과립구 대식세포-콜로니 자극 인자, 헥사메틸멜라민, 히드로코티손 히드록시우레아, 이브리투모맙, 인터페론 알파, 인터류킨-2, 인터류킨-11, 이소트레티노인, 익사베필론, 이다루비신, 이마티닙 메실레이트, 이포스파미드, 이리노테칸, 라파티닙, 레날리도마이드, 레트로졸, 류코보린, 류프롤라이드, 리포솜 Ara-C, 로무스틴, 메클로레타민, 메게스트롤, 멜팔란, 머캅토푸린, 메스나, 메토트렉세이트, 메틸프레드니솔론, 미토마이신 C, 미토탄, 미톡산트론, 넬라라빈, 닐루타미드, 옥트레오타이드, 오프렐베킨, 옥살리플라틴, 파클리탁셀, 파미드로네이트, 페메트렉세드, 파니투무맙, PEG 인터페론, 페가스파르가세, 페그필그라스팀, PEG-L-아스파라기나제, 펜토스타틴, 플리카마이신, 프레드니솔론, 프레드니손, 프로카르바진, 랄록시펜, 리툭시맙, 로미플로스팀, 랄리트렉세드, 사파시타빈, 사르그라모스팀, 사트라플라틴, 소라페닙, 수니티닙, 세무스틴, 스트렙토조신, 타목시펜, 테가푸르, 테가푸르-우라실, 템시롤리무스, 테모졸라미드, 테니포사이드, 탈리도마이드, 티오구아닌, 티오테파, 토포테칸, 토레미펜, 토시투모맙, 트라스투주맙, 트레티노인, 트리미트렉세이트, 알루비신, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 빈데스틴, 비노렐빈, 보리노스타트 또는 졸레드론산을 들 수 있지만, 이들로 제한되지는 않는다.
본 개시내용의 실시양태에 따라 치료제로서 사용될 수 있는 치료학적 항체 및 이의 기능성 단편으로는 알렘투주맙, 베바시주맙, 세툭시맙, 에드레콜로맙, 겜투주맙, 이브리투모맙 티욱세탄, 파니투무맙, 리툭시맙, 토시투모맙, 및 트라스투주맙 및 본원에 기재된 특정 질환과 관련된 다른 항체를 들 수 있지만, 이들로 제한되지는 않는다.
본 개시내용의 실시양태에 따라 치료제로서 사용될 수 있는 독소로는 리신, 아브린, 리보뉴클레아제(RNase), DNase I, 스타필로코커스 장내독소-A, 미국자리공 항바이러스 단백질, 젤로닌, 디프테리아 독소, 슈도모나스 외독소 및 슈도모나스 내독소를 들 수 있지만, 이들로 제한되지는 않는다.
본 개시내용의 실시양태에 따라 치료제로서 사용될 수 있는 방사성 동위원소로는 32P, 89Sr, 90Y, 99mTc, 99Mo, 131I, 153Sm, 177Lu, 186Re, 213Bi, 223Ra 및 225Ac를 들 수 있지만, 이들로 제한되지는 않는다.
메디토프-mAb 기술은 메디토프 이용 가능 항체, 치료제, 영상화제 또는 이들의 조합 중 하나 이상에 추가로 접합될 수 있는 항체-메디토프 복합체를 생성하도록 사용될 수 있는 시스템을 허용한다. 따라서, 독특한 세포독성제 또는 영상화제에 각각 접합된 일련의 메디토프 또는 고친화도 메디토프 변이체는 치료를 위해 원하는 메디토프 접합체 및 메디토프 이용 가능 mAb의 병용 투여를 허용할 것이다. 메디토프 접합체는 페이로드(payload) 방출 또는 화학 변형으로 인한 특이성 감소와 같은 단점을 갖는 현재의 항체-약물 접합체에 대한 개량품이다.
이러한 플랫폼 기술은 mAb 전달 장에 광범위한 영향을 갖고, 결장 및 편평 세포 암종, 두경부암(여기서, 세툭시맙이 적응증을 가짐)을 비롯한 EGFR 양성 암의 치료 및 진단에 유용한 방법을 제공한다. 추가로, 다른 치료학적 항체에 대한 프레임워크 결합 계면의 그래프팅은 플랫폼 기술이 상기 기재된 바와 같은 여러 다른 암, 질환 및 다른 병증의 치료 및 진단을 위한 방법에 사용되게 한다.
본원은 치료학적 항체 또는 이의 기능성 단편의 결합 친화도를 증대시키는 방법을 제공한다. 이러한 방법은 임의의 적합한 투여 경로를 통해 치료학적 유효량의 약학 조성물을 피험체에게 투여하는 것을 포함할 수 있다. 약학 조성물은 메디토프 이용 가능 항체와 조합된 메디토프 또는 메디토프 변이체, 메디토프 이용 가능 항체와 조합된 다가 메디토프 또는 메디토프 변이체 테더링체, 메디토프 이용 가능 치료학적 항체 또는 이의 기능성 단편, 약학적으로 허용되는 담체, 및 임의의 이들의 조합을 포함할 수 있다. 다가 메디토프의 결합 친화도 증대는 세포 표면에 결합된 IgG의 다가 가교결합이 원인일 수 있다. (양친 뮤린 425 항체를 통해 또는 항-lgG IgM을 사용하여) IgG를 가교결합하는 것은 신호전달, 수용체 엔도시토시스 및 재생 및 세포사에 상당히 영향을 미친다. 따라서, 다가 펩타이드는 이의 치료학적 효능을 증대시키기 위해 치료학적 단일클론 항체와 시너지로 작용할 수 있다.
몇몇 실시양태에서, 메디토프는, 단독으로 또는 테더링체의 일부로서, 시스테인 또는 결합 자리에서 Fab 시스테인에 결합하여, 시스테인-시스테인 상호작용을 생성하는 다른 적합한 알킬화제를 포함할 수 있다. 대안적으로, 메디토프는 비천연 아미노산(예를 들면, p-아세틸페닐알라닌)에서 Fab에 결합할 수 있다. Cys 메디토프는 임의의 물질에 접합되고 접합체가 IgG를 향하게 한다.
또한, 항체-메디토프 복합체를 치료학적 항체가 표적화될 수 있는 질환 또는 병증에서의 특정 유형의 세포 또는 세포 집단에 치료를 지시하는 방법에 사용할 수 있다. 이러한 치료 방법은 임의의 적합한 투여 경로를 통해 질환 또는 병증을 앓고 있는 피험체에게 치료학적 유효량의 약학 조성물을 투여하는 것을 포함할 수 있다. 약학 조성물은 메디토프 이용 가능 항체와 조합된 메디토프 또는 메디토프 변이체, 메디토프 이용 가능 항체와 조합된 다가 메디토프 또는 메디토프 변이체 테더링체, 메디토프 이용 가능 치료학적 항체 또는 이의 기능성 단편을 포함할 수 있다.
다른 실시양태에서, 종양 또는 다른 조직을 영상화하는 방법을 제공한다. 이러한 방법에서, 상응하는 항원을 과발현하는 종양 또는 다른 조직을 표적화하기 위해 비변형 치료학적 항체를 투여할 수 있다. 이후, 영상화제로 표지된 다가 메디토프 테더링체는 임의의 적합한 투여 경로를 통해 투여되고, 표적 종양 또는 조직에 결합하는 치료학적 항체에 결합할 것이다. 도 8 참조. 영상화제의 예로는 방사능 표지(예를 들면, 3H, 14C, 35S, 90Y, 99mTc, 125I, 131I, 177Lu, 166Ho, 및 153Sm), 금속 또는 자기 표지(예를 들면, 금, 철, 가돌리늄), 비오틴, 킬레이트화제(예를 들면, 1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-N,N',,N'',N'''-테트라아세트산("DOTA")) 또는 상기 기재된 임의의 제제를 들 수 있지만, 이들로 제한되지는 않는다. 일 실시양태에서, 본원에 기재된 방법과 사용되는 영상화제는 DOTA이다.
상기 기재된 영상화 또는 치료 방법에 공지된 방법에 비해 여러 이점이 존재한다. 우선, 치료학적 단일클론 항체 IgG의 2가 특성은 종양의 선택도를 증대시킨다. 하기 추가로 기재된 바대로, 이러한 선택도 증대는 scFv 및 다른 미니바디의 사용에 의해 손실되고 친화도 증대를 통해 이루어질 수 없다. 둘째로, 표지된 다가 메디토프 테더링체의 질량은 여과를 위해 신역치보다 낮을 수 있어서(60 kD 미만, 약 10 kD 만큼 낮을 수 있음), 체내로부터 용이하게 여과되게 허용한다. 반대로, 영상화제 또는 다른 치료제에 의한 치료학적 항체 IgG의 직접 표지화는 연장된 기간 동안 체내에서 순환할 것이기 때문에 통상적으로 회피된다. 따라서, 종양 또는 다른 질환 있는 기관의 영상화를 종종 덜 선택적인 scFv를 사용하여 수행한다.
추가의 실시양태에서, cQFD 및 cQYN 메디토프 또는 이의 변이체는 암, 자가면역 질환 또는 다른 병증의 치료를 위해, 피험체에게 치료학적 유효량으로, 약학 조성물의 일부로서, 투여될 수 있는 약학 화합물을 형성하기 위해, 2종 이상의 치료학적 분자를 연결하기 위해 사용될 수 있다. 2종 이상의 치료학적 분자로는 상기 기재된 것과 같은 종양 또는 질환 특이적 수용체를 표적화할 수 있는 기능성 항체 단편(예를 들면, F(ab')2 또는 Fab 단편), 펩타이드 또는 다른 소분자를 들 수 있지만, 이들로 제한되지는 않는다. 치료학적 분자는 2종 이상의 동일한 치료학적 분자일 수 있거나, 대안적으로 동일한 종양 또는 질환이 있는 조직을 표적화하는 2 이상의 상이한 분자일 수 있다.
몇몇 실시양태에서, 약학 화합물은 CovX-Body™와 같은 독점적 항체, 또는 이의 일부분의 사용을 포함할 수 있다. 예를 들면, 메디토프는 2종 이상의 치료학적 분자를 특수 설계된 CovX 항체의 결합 계면 또는 결합 자리에 연결하는 링커로서 사용할 수 있다. CovX 특이적 링커로서 작용하는 메디토프와 회합되는 소분자, 펩타이드 또는 scFv는 CovX 항체의 활성 결합 자리인 이의 프레임워크 결합 계면에 의해 인지된다. 이러한 성분이 조합될 때, 생성된 2가 CovX-Body™는 소분자, 펩타이드 또는 scFv의 생물학적 작용을 보유하면서 또한 항체의 연장된 반감기를 보유한다.
치료학적 단일클론 항체와 관련하여 상기 기재된 이점 이외에, 치료학적 분자에 테더링되거나 결합되는 링커로서 사용되는 메디토프는 합성될 수 있고 단일클론 항체보다 생성하기에 더 비용 효과적이다. 예를 들면, 여러 전임상/임상 실험이 2종의 단일클론 항체의 동시 투여에 대해 조사 중이지만, 이러한 치료제를 제조하고 시판하는 비용은 엄두도 못 낼 정도로 비쌀 것이다.
세툭시맙 Fab의 scFv(단쇄 Fab 가변 단편) 포맷은, 임상적으로 관심 있는 다른 scFv와 유사한, Fab 그 자체보다 실질적으로 더 낮은 친화도로 EGFR 도메인 Ⅲ에 결합한다. 이는, 적어도 부분적으로, 배향에 직접적으로 영향을 미치는 Fab 불변 도메인의 부재, Fv 도메인의 입체구조적 변동 및 가능하게는 빈약한 링커 설계가 원인이다.
따라서, 몇몇 실시양태에서, scFv의 안정성 및 친화도를 개선하는 방법이 제공된다. 상기 방법은 scFv 링커에서 펩타이드 메디토프를 도입하여 scFv를 안정화시키는 것을 포함한다. 이는 가변 도메인의 적절한 배향을 실시하고 따라서 친화도를 증대시키는 것을 도울 것이다(도 9).
상기 기재된 실시양태는 1개 이상의 인간 프레임워크 잔기(즉, 1 이상의 점 돌연변이를 생성시키는)를 이의 상응하는 뮤린 잔기로 대체함으로써 인간 또는 인간화 항체(예를 들면, 트라스투주맙)에 적용될 수 있다. 상응하는 뮤린 잔기에 의해 대체되는 인간 잔기는 인간 프레임워크의 중앙 Fab 공간 내에 발견되고 따라서 면역계(예를 들면, 이것은 항원성이 아니어야 함)에 노출되지 않는다. 또한, 점 돌연변이를 갖는 인간 서열이 항원성이 아니어야 한다는 것을 나타내도록 항원성 예측 알고리즘을 추가로 사용할 수 있다.
몇몇 실시양태에서, 상응하는 뮤린 잔기에 의해 대체된 1개 이상의 인간 프레임워크 잔기는 경쇄 프레임워크 잔기 10, 39-43, 83, 85, 100 및 104(카바트 수) 및/또는 중쇄 프레임워크 잔기 번호 40, 89 및 111(카바트 수)로부터 선택될 수 있다(도 2 참조). 일 실시양태에서, 상응하는 뮤린 잔기에 의해 대체된 1개 이상의 인간 프레임워크 잔기는 40, 41, 83 및 85(이들로 제한되지는 않음)를 비롯한 경쇄 프레임워크 잔기이다. 구체적으로, 일 실시양태에서, 경쇄 프레임워크 Pro40은 Thr(P40T) 또는 Ser(P40S)로 대체되고, 경쇄 프레임워크 Gly41은 Asn(G41N)로 대체되고, 경쇄 프레임워크 잔기 Phe83은 Ile(F83I) 또는 Val(F83V)로 대체되고, 경쇄 프레임워크 잔기 Thr85는 Asp(T85D) 또는 Asn(T85N)으로 대체된다. 인간 단일클론 항체 내의 이러한 Fab 공간의 이러한 메디토프 자리 그래프팅(또는 "뮤린화" 또는 "마우스화")은 메디토프 결합에 대한 독특한 취급을 생성하기 위해 사용될 수 있고 이전에 개시된 기술과 함께 사용될 수 있다. 또한, 약리단(pharmacophore) 결합 모델을 생성함으로써 추가의 점 돌연변이를 조작할 수 있어서 메디토프의 친화도를 추가로 증대시킬 수 있다.
본원에 기재된 실시양태는 Fab 프레임워크 내의 새로운 계면을 확인하고 규명하며, 이것이 EGFR 결합의 알로스테릭 길항제로서 작용하거나 항원에 대한 Fab의 결합을 방해하지 않는다는 것을 입증한다. 또한, 2개의 펩타이드 메디토프는 세툭시맙 CDR에 결합하지 않고, 따라서 항원(EGFR)을 모방하지 않는다.
"치료학적 유효량", "치료학적으로 효과적인 농도" 또는 "치료학적으로 효과적인 용량"은 표적 병증을 예방하거나 치료하는 것, 병증과 관련된 증상을 완화하는 것, 원하는 생리학적 효과를 생성하는 것, 또는 질환 또는 병증의 치료를 발생시키는 병증의 영상화 또는 진단을 허용하는 것과 같은 피험체에서 원하는 치료 효과를 생성하는 화합물의 양을 의미한다. 정확한 치료학적 유효량은 소정의 피험체에서 치료의 효능의 면에서 가장 효과적인 결과를 생성시키는 조성물의 양이다. 이 양은 (활성, 약동학, 약력학, 및 생체이용율을 비롯한) 치료학적 화합물의 규명, (연령, 성별, 질환 유형 및 단계, 일반적인 신체 상태, 소정의 용량에 대한 반응성, 및 약제 유형을 비롯한) 피험체의 생리학적 상태, 제제 내의 약학적으로 허용되는 담체 또는 담체들의 성질 및 투여 경로(이들로 제한되지는 않음)를 비롯한 다양한 인자에 따라 달라질 것이다. 임상 및 약리 기술의 당업자는 일상적인 실험을 통해, 즉 화합물의 투여에 대한 피험체의 반응을 모니터하고 따라서 용량을 조정함으로써 치료학적 유효량을 결정할 수 있을 것이다. 추가의 가이드를 위해, 문헌[Remington: The Science and Practice of Pharmacy 21st Edition, Univ. of Sciences in Philadelphia(USIP), Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, PA, 2005]을 참조한다.
"약학적으로 허용되는 담체"는 1의 조직, 기관 또는 신체의 일부분으로부터 다른 조직, 기관 또는 신체의 일부분으로 관심 있는 화합물의 운반 또는 수송에 관여하는 약학적으로 허용되는 물질, 조성물, 또는 비히클을 의미한다. 예를 들면, 담체는 액체 또는 고체 충전제, 희석제, 부형제, 용매 또는 캡슐화 물질, 또는 몇몇 이들의 조합일 수 있다. 담체의 각각의 성분은 제제의 다른 성분과 상용성이어야 한다는 점에서 "약학적으로 허용되어야" 한다. 이것은 또한 이것이 부딪칠 수 있는 임의의 조직, 기관 또는 신체의 일부분과 접촉하기에 적합해야 하고, 이는 독성, 자극, 알레르기 반응, 면역원성 또는 이의 치료 이익보다 해가 과도하게 많은 임의의 다른 합병증의 위험을 보유하지 않아야 한다는 것을 의미한다.
"투여 경로"는 에어로졸, 경장, 비강, 안내, 경구, 비경구, 직장, 경피 또는 질내(이들로 제한되지는 않음)를 비롯한 당해 분야에 공지된 임의의 투여 경로를 의미한다. "경피" 투여는 국소 크림 또는 연고를 사용하여 또는 경피 패취에 의해 수행할 수 있다. "비경구"는 일반적으로 안와하, 점적주사, 동맥내, 관절낭내, 심장내, 피내, 근육내, 복강내, 폐내, 척수내, 흉골내, 척수강내, 자궁내, 정맥내, 지주막하, 피막하, 피하, 경점막 또는 경기관을 비롯한 주사와 관련되는 투여 경로를 의미한다.
본원에 사용되는 "조합된" 또는 "와 조합된"은, 임의의 순서의, 2종 이상의 제제, 약물, 치료 섭생, 치료 지침 또는 이들의 조합(예를 들면, 메디토프 또는 다가 테더링제와 조합된 항체)을 사용하여 피험체에서 동일한 질환 또는 병증을 치료하는 과정에서 의미한다. 이는 동시 투여(또는 "병용 투여"), 제2 제제의 투여 전 또는 후, 그리고 여러 일까지 떨어진 일시적으로 간격 있는 순서의, 제1 제제의 투여를 포함한다. 이러한 병용 치료는 또한 임의의 1종 이상의 제제, 약물, 치료 섭생 또는 치료 지침의 단일 투여 초과의 투여를 포함할 수 있다. 추가로, 2종 이상의 제제, 약물, 치료 섭생, 치료 지침 또는 이들의 조합의 투여는 동일하거나 상이한 투여 경로에 의할 수 있다.
"치료학적 항체"는 본원에 기재된 것과 같은 암, 자가면역 질환, 이식 거부, 심혈관 질환 또는 다른 질환 또는 병증을 치료하기 위해 사용되는 임의의 항체 또는 이의 기능성 단편을 의미할 수 있다. 본원에 기재된 실시양태에 따라 사용될 수 있는 치료학적 항체의 예로는 에르비툭스(Erbitux)(세툭시맙), 레오르포(ReoPro)(압식시맙), 시물렉트(Simulect)(바실릭시맙), 레미카데(Remicade)(인플릭시맙); 오르토클론(Orthoclone) OKT3(무로모납-CD3); 리툭산(Rituxan)(리툭시맙), 벡사르(Bexxar)(토시투모맙) 휴미라(Humira)(아달리무맙), 카마쓰(Campath)(알렘투주맙), 시물렉트(Simulect)(바실릭시맙), 아바스틴(Avastin)(베바시주맙), 심지아(Cimzia)(세르톨리주맙 페골), 제나팍스(Zenapax)(다클리주맙), Soliris(에쿨리주맙), 랍티바(Raptiva)(에팔리주맙), 마일로타그(Mylotarg)(겜투주맙), 제발린(Zevalin)(이브리투모맙 티욱세탄), 티사브리(Tysabri)(나탈리주맙), 졸레어(Xolair)(오말리주맙), 시나지스(Synagis)(팔리비주맙), 벡티빅스(Vectibix)(파니투무맙), 루센티스(Lucentis)(라니비주맙) 및 헤르셉틴(Herceptin)(트라스투주맙)(이들로 제한되지는 않음)을 비롯한 뮤린 항체, 뮤린화 또는 인간화 키메라 항체 또는 인간 항체를 들 수 있지만, 이들로 제한되지는 않는다.
병증을 "치료하는" 또는 병증의 "치료"는 병증을 예방하는 것, 병증의 개시 또는 이의 진행 속도를 느리게 하는 것, 병증을 진행시킬 위험을 감소시키는 것, 병증과 관련된 증상의 진행을 예방하거나 지연시키는 것, 병증과 관련된 증상을 감소시키거나 종결시키는 것, 병증의 완전 또는 부분 회복을 생성하는 것, 또는 몇몇 이들의 조합을 의미할 수 있다.
일 실시양태에서, 본원은 메디토프의 프레임워크 결합 작용기와 유사한 프레임워크 결합 작용기를 갖는 신규한 메디토프 또는 소분자를 스크리닝하는 방법을 제공한다. 이러한 방법은 추정상 메디토프 또는 소분자의 라이브러리를 메디토프 이용 가능 항체와 접촉시키는 단계; 추정상 메디토프 또는 소분자가 프레임워크 결합 계면에서 메디토프 이용 가능 항체에 결합하는지를 결정하는 단계; 1종 이상의 후보물질인 메디토프 또는 메디토프의 프레임워크 결합 작용기와 유사한 프레임워크 결합 작용기를 갖는 소분자를 확인하는 단계; 1종 이상의 후보물질의 결합 친화도를 측정하는 단계; 및 결합 해리 상수가 0.70 μΜ 이상일 때, 메디토프 또는 메디토프의 프레임워크 결합 작용기와 유사한 프레임워크 결합 작용기를 갖는 소분자로서의 1종 이상의 후보물질을 확인하는 단계를 포함할 수 있지만, 이들로 제한되지는 않는다. 추가로, 새로운 프레임워크 결합 계면을 스크리닝하는 방법이 또한 제공되고, 하기 실시예에 추가로 기재되어 있다.
본 발명이 실시양태 및 예시적인 실시예에 의해 기재되어 있지만, 당해 분야의 당업자는, 본 명세서에 개시된 본 발명의 정신 및 범위를 벗어나지 않는 기재되고 예시된 바와 같은, 본 발명에 대한 변경을 이해할 것이다. 실시예는 본 발명을 이해하는 데 도움을 주고자 기재되어 있지만, 어떠한 방식으로든 이의 범위를 제한하고자 의도되지 않고, 그렇게 해석되어서는 안 된다. 실시예는 종래 방법의 상세한 설명을 포함하지 않는다. 이러한 방법이 당해 분야의 당업자에게 널리 공지되어 있고, 다양한 공보에 기재되어 있다. 추가로, 상기 및 하기 실시예에 인용된 모든 참조문헌은, 본원에 완전히 기재된 것처럼, 그 전문이 참조문헌으로 포함된다.
실시예 1: 결정 구조의 결정
물질 및 방법
시약. 세툭시맙의 항원 결합 단편[F(ab)'](또는 "Fab")을 고정화 파파인(Pierce)으로 IgG의 소화에 의해 얻고, 이후 단백질 A에 의해 역 정제하고 Superdex 75 칼럼(GE Healthcare) 상에서 크기 배제 크로마토그래피(SEC)하였다. 세툭시맙의 단쇄 결합 단편(scFvC225)을 경쇄와 중쇄 사이의 20개의 아미노산 링커로 합성하였다. ScFvC225 및 가용성 상피 성장 인자 수용체 도메인 Ⅲ(sEGFRdIII)을 Sf9 세포에서 발현하고 상기 기재된 바대로 정제하였다(Donaldson et al., 2009).
상기 기재된 바대로(Riemer et al. 2005) 파지 디스플레이로부터 단리된 메디토프 CQFDLSTRRLKC(cQFD; 서열 번호 1) 및 CQYNLSSRALKC(cQYN; 서열 번호 2)를 시티 오브 호프 신써틱 앤드 폴리머 케미스트리 코어 퍼실리티(City of Hope Synthetic and Polymer Chemistry Core Facility)에서 합성하고, 산화시키고, 정제하였다.
결정화 및 회절 데이터. 세툭시맙의 Fab 단편(5 ㎎/㎖)을 1:10 몰비로 각각의 메디토프와 혼합하고, 20℃에서 Qiagen JCSG Core Suites(IIV)를 사용하여 스크리닝하였다. 2.2 Å를 넘어 회절된 공결정을 100 mM 인산/시트르산 나트륨(pH 4.5), 2.5 M 인산 나트륨/칼륨 및 1.6% w/v 메조에리스리톨 중에 성장시켰다. 상기 결정을 14% w/v 메조에리스리톨을 통해 위킹(wick)하고 액체 질소 중에 급속 냉동하였다. 결정화 실험 및 초기 스크리닝 연구를 시티 오브 호프(City of Hope)에서의 X선 시설에서 수행하였다. 회절 데이터를 스탠포드 신크로트론 라디에이션 랩(Stanford Synchrotron Radiation Lab)(빔 라인 9.1 및 1 1.1)에서 수집하였다. 초기 파지를 세툭시맙의 리간드되지 않은 구조(pdb:1YY8 사슬 A 및 B)로 프로그램 Phaser(McCoy et al., 2007)을 사용하여 분자 대체에 의해 결정하였다(Li et al., 2005). 2개의 Fab를 3.26의 매튜(Matthews) 계수 및 62.4%의 용매 상수로 비대칭 단위 셀에 위치시켰다. Z 점수(평균에 대한 용액의 표준 편차)는 회전 조사의 경우 27 및 25이고, 병진 조사의 경우 38 및 71이었다. 제3 Fab 단편은 위치시키지 않았다(비대칭 단위 셀에서의 3개의 Fab는 43% 용매에서 2.18의 합당한 매튜 계수를 생성시킨다). 메디토프를 Coot(Emsley et al., 2004) 및 Phenix(Adams et al., 2002)를 사용하여 수동으로 여러 반복을 통해 밀도로 구축하였다.
결정화 및 구조 결정
세툭시맙 상의 메디토프의 결합 자리를 확인하기 위해, Fab 단편을 생성하고, 정제하고, 1:10 비로 cQFD 메디토프와 혼합하고, 결정 형성에 대해 스크리닝하도록 상업용 시설을 사용하였다. 20℃에서 1일 내지 3일 후 결정이 형성되었다. 이러한 결정의 초기 회절 분석에 의하면 단위 셀이 단백질 데이터 Bank(1YY8.pdb)에 이미 배치된 세툭시맙 Fab과 유사하다는 것을 나타내고(Li et al., 2005), 결정 팩킹(예를 들면, CDR이 배제됨)은 펩타이드가 CDR 루프에서 존재하지 않는다는 것을 제시한다. 그럼에도 불구하고, 그 구조는 분자 대체에 의해 풀리지 않았고, 메디토프와 일치하는 모델링되지 않은 전자 밀도를 확인하기 위해 실험 맵을 조사하였다. 초기 Fo-Fc 맵은 잠재적 결합 자리로서의 Fab 단편의 중간에서의 영역을 명확히 나타낸다(도 1). Fab 모델 단독을 사용한 초기 정제 실행 후, 메디토프와 일치하는 모델링되지 않은 밀도의 연속 신장이 관찰되었다. 메디토프를 밀도로 구축하였고, R 및 RFree가 따라서 하강하였다. 물 분자를 Phenix를 사용한 정제 동안 첨가하였다(Adams et al., 2002). 회절 데이터 및 정제 통계가 하기 표 3에 기재되어 있다.
Figure 112019075675105-pat00001
이러한 관찰에 기초하여 그리고 비교의 관점으로서, 파지 디스플레이에 의해 확인된 제2 메디토프, cQYN에 결합된 세툭시맙 Fab의 결정이 생성되었다. 상기와 같이, 명확한 모델링되지 않은 전자 밀도가 Fab의 중앙에서 관찰되었다. 제1 구조를 사용하여, 서열 차이가 따라서 모델링되었고, 다수의 정제 횟수를 수행하였다. 메디토프 둘 다의 대표적인 전자 밀도 맵이 도 1b 및 도 1c에 도시되어 있다.
실시예 2: 메디토프는 세툭시맙 FAB의 뮤린 프레임워크 영역에 특이적이다.
물질 및 방법
상기 실시예 1에 기재된 것 이외에, 하기 물질 및 방법을 사용하였다.
메디토프 및 점 돌연변이. 상기 기재된 바대로, CQFDLSTRRLKC(cQFD; 서열 번호 1) 및 CQYNLSSRALKC(cQYN; 서열 번호 2)를 합성하고, 산화하고, 시티 오브 호프 신써틱 앤드 폴리머 케미스트리 코어 퍼실리티에서 정제하였다. cQFD 메디토프에서의 알라닌 점 돌연변이가 3번 잔기(Phe3에서 Ala로), 5번 잔기(Leu5에서 Ala로), 8번 잔기(Arg8에서 Ala로) 및 10번 잔기(Leu10에서 Ala로)에서 생성되었고, SMT3의 C 말단에서 펩타이드를 코딩함으로써 박테리아식으로 생성되었다(Mossessova et al., 2000). 표면 플라스몬 공명(SPR) 분석 전에, 유비퀴틴양 프로테아제(Ulp1)를 샘플에 첨가하여 펩타이드를 방출시켰다.
메디토프-Fab 계면의 규명. SPR에 의한 친화도 분석을 상기 기재된 바대로 수행하였다(Donaldson et al., 2009; Li et al., 2005). 간단히 말하면, scFvC225 또는 FabC225를 아민 화학을 사용하여 CM5 칩에 고정화시켰다. 펩타이드 또는 sEGFRdIII 친화도를 20℃에서 평형 방법에 의해 평가하고, 방정식 RU = {Rmax*[L]}/{[L]*Kd} + Roffset에 핏팅하였다. SEC를 Superdex 200 10/30 칼럼(GE Healthcare)을 사용하여 수행하였다. 단백질을 혼합하고, 20 분 동안 실온에서 항온처리하고, 4℃에서 칼럼에 적용하였다.
펩타이드 메디토프의 존재 하에 세툭시맙 결합을 시험하기 위해 MDA-MB-468 세포주를 사용하였다. 표지된 세툭시맙(AF488, Invitrogen)을 4℃에서 60 μΜ의 cQFD 펩타이드의 존재 또는 부재 하에 20 분 동안 첨가하였다. 표지된 MOPS-21을 동위원소 대조군으로서 사용하였다. 세포 형광을 FACS Calibur 장치(BD Biosciences)를 사용하여 결정하였다.
메디토프/Fab 계면의 분석
메디토프와 본원에서 확인된 Fab 사이의 결합 자리의 계면을 IgG의 모든 4개의 도메인(예를 들면, 중쇄 및 경쇄의 가변 및 불변 도메인)에 의해 형성하였다. PISA 서버를 사용하여, cQFD 또는 cQYN 메디토프-Fab 계면에서의 파인 표면 영역은 각각 904(±28)Å2 및 787(±42)Å2이었고, 경쇄와 중쇄 사이에 동등하게 분포시켰다. 도 2 및 도 4는 메디토프와 접촉하는 Fab로부터의 잔기 및 루프를 보여준다.
메디토프 둘 다 세툭시맙 Fab와의 복수의 수소 결합 및 소수성 접촉을 만들었다. 도 2a는 세툭시맙 Fab(뮤린 키메라 IgG), 파지 디스플레이 실험에서 아이소타입 대조군으로서 사용된 인간화 단일클론 IgG(ch14.18)와 인간화 트라스투주맙 Fab의 중앙 공간 결합 계면의 잔기 사이의 미묘한 차이를 보여준다. 세툭시맙 Fab 상의 인간화 트라스투주맙 Fab의 중첩은 cQFD 메디토프의 Arg9가 마우스 가변 경쇄에 의해 생성된 독특한 공간에 결합한다는 것을 나타낸다. 구체적으로, 마우스 가변 경쇄의 Asp85, Ile83 및 Thr40은 cQFD 메디토프의 Arg9 잔기에 대한 결합과 관련하여 중요하다(도 2b). 뮤린 프레임워크에서의 Asp85은 cQFD 메디토프의 Arg9의 구아니디늄 기에 염 브릿지(dNE…OD1 = 2.8 Å 및 dNH1/2…OD2 = 3.0 Å)를 만들었다. 또한, Asp85의 카복실 기는 cQFD 메디토프의 Leu10의 골격 아미드에 수소 결합(dOD2…HN = 2.7 Å)을 만들었다. 또한, 경쇄로부터의 Thr40의 하이드록실 기는 메디토프 Arg9의 구아니디늄 기에 수소 결합(dOG1…NH1 = 3.1 Å)을 만들었다. Phe83에서의 페닐 고리 및 인간 Fab에서의 Pro40의 피롤리딘 고리는 Arg9의 측쇄를 입체적으로 폐쇄한다.
cQFD 메디토프에서의 Arg9 측쇄의 선택이 뮤린 Fab 서열과 인간 Fab 서열 사이의 차이에 맵핑되지만, 또한 cQYN 메디토프가 cQFD 메디토프에서의 Arg9와 동일한 위치에서 알라닌을 코딩하고, 따라서 가능하게는 인간 Fab에 결합한다는 것에 유의한다. hu14.18 항체로 파지 라이브러리를 전처치하였음에도 cQYN 메디토프가 왜 선택되었는지를 알아내기 위해, cQFD 메디토프와 cQYN 메디토프 사이의 차이 및 세툭시맙 Fab와의 이의 상호작용을 결정하였다. cQFD 및 cQYN 구조로부터의 Fab 중쇄 및 경쇄의 Cα 원자의 중첩은 각각의 메디토프로부터의 Phe/Tyr3, Leu5 및 Leu10 잔기의 소수성 측쇄가 동일하게 근처에 위치한다는 것을 보여준다(도 2b). 그러나, cQFD 및 cQYN 펩타이드의 골격 트레이스가 상당히 일탈하였다. 구체적으로, cQFD 메디토프의 Arg8 측쇄 구조가 확장되고 Fab 중쇄의 Gln111의 골격 카보닐에 강한 골격 수소 결합(dNH…0=C = 2.8 Å)을 만들었다. 그러나, cQYN 펩타이드에서의 Tyr3의 하이드록실 기는 Arg8 측쇄를 입체적으로 간섭하고(도 2b), cQYN 메디토프의 Arg8과 중쇄의 Asn111 사이의 상호작용을 차단하였다. 이러한 관찰과 일치하게, cQYN 복합체에서의 Arg8 측쇄 둘 다 전자 밀도 맵에서 빈약하게 한정되고 2개 이상의 상이한 회전이성질체를 취했다. (비대칭 단위 셀 내에 2개의 Fab-메디토프 복합체가 존재한다.) 이러한 변화에 부수적으로, 골격 수소 결합 패턴의 이동이 관찰되었다. cQFD 메디토프에서의 Thr7의 아미드 카보닐은 세툭시맙 Fab 경쇄에서의 아미드 Asn41에 수소 결합(dNH…C = 2.7 Å)을 만들었다. 이 수소 결합은 cQYN 펩타이드에서의 Asn41의 골격의 아미드에서 Arg8 골격의 카보닐로 이동하였다(dC=0…HN = 3.0 Å).
총체적으로, cQFD와 cQYN 사이의 차이(예를 들면, R8과 중쇄 Fab 사이의 염 브릿지의 결여) 및 cQFD에서의 Arg9가 결합하는 Fab 경쇄에서의 서열 차이(예를 들면, 메디토프 어느 하나에 대한 Asp85과 Leu10의 아미드 사이의 수소 결합의 결여)는 뮤린 키메라에 결합하도록 선택된 메디토프가 인간 Fab 프레임워크와 실질적으로 더 약한 상호작용을 갖고, 선택 동안 세척액 중에 제거된다는 것을 나타낸다.
메디토프는 Fab에서 큰 입체구조적 변화를 유도하지 않는다.
메디토프-Fab 계면의 위치에 기초하여, 메디토프가 비결찰 및/또는 결찰 구조에 대한 IgG 도메인의 상대 배향을 방해하는지를 결정하였다. 처음에, 메디토프 복합체 둘 다의 비대칭 구조 셀 내의 경쇄 및 중쇄를 비교하고, 이후 각각의 쇄를 비결찰 및 EGFR 결찰 구조와 비교하였다. 메디토프 중 어느 하나에 결합된 경쇄의 가변 도메인은 세툭시맙의 비결찰 구조와 실질적으로 동일하였다(r.m.s.d. 평균: cQFD, 0.231 ±0.014 Å, cQYN, 0.18 ±0.01 Å). 그러나, 중쇄의 가변 도메인은 상당히 더 높은 발산을 보여준다(r.m.s.d. 평균: cQFD, 0.85 ±0.01 Å, cQYN, 0.88 ±0.01 Å). 이러한 발산이 주로 프레임워크 루프 2의 위치(39-46번 잔기)로부터 생기는데, 왜냐하면 이 루프에서의 잔기의 결실 및 r.m.s.d.의 재계산이 훨씬 더 낮은 값(cQFD, 0.18 ±0.01 Å; cQYN, 0.31 ±0.01 Å)을 생성시키기 때문이라는 것에 유의한다(도 6). 게다가, 이 루프는 또한 Fab C225-EGFR 공결정 구조에서 대체되고, 이의 상대 B 인자 값은 이것이 가요성이라는 것을 제시한다(도 6). 마지막으로, 메디토프의 존재는 EGFR 결합 또는 비결합 구조에 비해 CDR 구조에 상당한 변화를 생성시키지 않는다. EGFR 결찰 구조의 중쇄 CDR 루프 3에서의 Tyr101의 골격이 메디토프 중 어느 하나에 결합된 Fab 구조에 비해 플리핑되더라도, 이러한 플리핑이 또한 비결찰 세툭시맙 Fab 구조에서 관찰되었다(Li et al., 2005).
계면에 대한 메디토프 잔기의 기여
cQFD 메디토프-Fab 복합체의 구조 및 cQFD에 대한 cQYN의 서열 유사성에 기초하여, 메디토프의 전체 결합 친화도에 대한 이 잔기의 역할을 규명하기 위해 cQFD 메디토프에서의 여러 점 돌연변이를 생성시켰다(Phe3→Ala, Leu5→Ala, Arg8→Ala 및 Leu10→Ala). 결합 친화도를 평가하기 위해, Fab 단편을 표준 아민 화학을 이용하여 CM5 칩에 커플링하였다. 다음에, 세툭시맙 Fab에 대한 합성 cQFD 및 cQYN 메디토프의 친화도를 측정하였다. cQFD 메디토프는 950 ±30 nM의 친화도로 Fab에 결합하는 반면, cQYN 메디토프는 3.5 ±0.1 μΜ의 친화도로 결합하였다(n=3). 결합 동역학을 또한 측정하였다(도 3). 이분자 상호작용으로서 모델링된 회합 상수는 cQFD 및 cQYN 각각에 대해 4.2(±0.1)×104 M-1s-1 및 1.8(±0.1) ×104 M-1s-1이었다. 해리 상수는 cQFD 및 cQYN 각각에 대해 2.5(±0.1)×10-2s-1 및 8.6(±0.1)×10-2s-1이었다. cQFD의 경우 430(±30) nM이고, cQYN의 경우 3.5(±0.1) μΜ인 이러한 측정에 기초한 KD 값은 평형 측정과 매우 일치하였다.
다음에, 각각 돌연변이된 cQFD 메디토프의 친화도를 측정하였다. 점 돌연변이 및 야생형 cQFD 메디토프를 SMT3에 대한 C 말단 융합으로서 생성시키고, 분석 전에 Ulp1로 절단하였다. 생물학적으로 생성된 야생형 cQFD 메디토프는 합성으로 생성된 cQFD와 유사하게 770 nM의 친화도로 결합한 반면, Phe3→Ala, Leu5→Ala 및 Arg8→Ala의 돌연변이는 Fab에 대한 친화도를 상당히 감소시켰다(하기 표 4). 특히, Arg8→Ala 돌연변이는 결합 친화도의 140배 손실을 발생시켰다.
Figure 112019075675105-pat00002
마지막으로, 인간 프레임워크에 대한 cQFD 및 cQYN 메디토프의 친화도를 규명하기 위해 인간화 치료학적 단일클론 항체인 트라스투주맙의 Fab를 CM5 칩에 커플링시켰다. 평형 측정에 의하면 메디토프 중 어느 하나에 대한 해리 상수가 150 μΜ를 초과한다는 것을 나타낸다.
실시예 3: 세툭시맙 FAB는 메디토프 및 EGFR에 동시에 결합한다.
물질 및 방법
상기 실시예 1 및 2에 기재된 것 이외에, 하기 물질 및 방법을 사용하였다.
시약. 세툭시맙의 단쇄 결합 단편(scFvC225)을 경쇄와 중쇄 사이의 20개의 아미노산 링커로 합성하였다. ScFvC225 및 가용성 상피 성장 인자 수용체 도메인 Ⅲ(sEGFRdIII)을 Sf9 세포에서 발현시키고, 상기 기재된 바대로 정제하였다(Donaldson et al., 2009).
메디토프 및 점 돌연변이. 상기 기재된 바대로, CQFDLSTRRLKC(cQFD; 서열 번호 1) 및 CQYNLSSRALKC(cQYN; 서열 번호 2)를 합성하고, 산화하고, 시티 오브 호프 신써틱 앤드 폴리머 케미스트리 코어 퍼실리티에서 정제하였다. cQFD 메디토프에서의 알라닌 점 돌연변이가 3번 잔기(Phe3에서 Ala로), 5번 잔기(Leu5에서 Ala로), 8번 잔기(Arg8에서 Ala로) 및 10번 잔기(Leu10에서 Ala로)에서 생성되었고, SMT3의 C 말단에서 펩타이드를 코딩함으로써 박테리아식으로 생성되었다(Mossessova et al., 2000). 표면 플라스몬 공명(SPR) 분석 전에, 유비퀴틴양 프로테아제(Ulp1)를 샘플에 첨가하여 펩타이드를 방출시켰다.
Fab에 대한 EGFR 및 메디토프의 동시 결합
회절 데이터는 이 펩타이드가 백신으로서 효과적이라는 가설과 충돌한다. 구체적으로, 원자 모델은 메디토프가 CDR에 바로 결합하지 않고, 따라서 모방체 항원 에피토프에 바로 결합하지 않는다는 것을 보여준다. 그러나, cQYN 메디토프로 접종된 마우스로부터 수집된 혈청은 세포 증식을 차단하였다(Riemer et al., 2005). 따라서, 항원 결합을 폐쇄하는지를 시험하기 위해, 세툭시맙 Fab를 EGFR-도메인 Ⅲ 및 cQFD와 항온처리하고, 분석 SEC 칼럼에 적용하였다. 13.9 ㎖에서의 피크가 관찰되었고, 피크의 비환원 SDS-PAGE는 모든 3종의 성분의 존재를 나타낸다(도 4b). 각각의 성분은 15.2 ㎖(Fab C225), 15.6 ㎖(sEGFRdIII) 및 16.3 ㎖(SMT-CQFDLSTRRLKC; 서열 번호 1)에서 용리되었다.
또한, 메디토프가 세툭시맙의 scFv에 결합하는지를 결정하였다. scFv에서, CDR 루프는 온전하게 남아있지만, Fab 가변 도메인은 짧은 펩타이드 링커를 통해 바로 연결되어, Fab 불변 도메인을 제거한다. 즉, 메디토프 결합 포켓은 scFv에서 제거되는 반면, CDR은 최소로 영향을 받는다. SPR은 EGFR 도메인 Ⅲ 및 cQFD 메디토프가 CM5 칩에 테더링된 세툭시맙 Fab에 결합한다는 것을 나타낸다(도 4b 참조). 또한, EGFR 도메인 Ⅲ은 제2 CM5 칩에 테더링된 scFv에 최소 친화도 손실로 결합한다. 그러나, Fab 결합에 비해, cQFD 메디토프는 100 μΜ 만큼 높은 메디토프의 농도에서 scFv를 포화시키지 않았다. 이는 결정학 연구와 일치하는 CDR에 대한 메디토프의, 존재한다면, 최소의 친화도를 나타낸다.
메디토프는 EGFR 발현 세포에 대한 세툭시맙 결합에 영향을 미치지 않는다
Fab가 메디토프 및 EGFR 도메인 Ⅲ에 동시에 결합할 수 있더라도, 완전 IgG로서 EGFR 발현 세포에 대한 세툭시맙 결합에 영향을 미칠 수 있는지를 결정하였다. 이를 시험하기 위해, 메디토프 농도의 함수로서, EGFR을 과발현하는 MDA MB-468 세포에 대한 IgG의 결합에 뒤따르는 FACS 분석을 이용하였다. 세포를 증가하는 cQFD 메디토프 농도의 존재 하에 세툭시맙과 항온처리하였다. 메디토프 농도가 60 μΜ보다 높더라도, 세포에 대한 세툭시맙 결합의 상당한 변화가 관찰되지 않았다(도 5). 이러한 관찰은 상기 기재된 SEC 연구와 일치하고, 메디토프가 항원 결합의 알로스테릭 조절자로서 작용하지 않는다는 것을 나타낸다.
메디토프 및 EGFR 도메인 Ⅲ의 Fab에 대한 동시 결합은 메디토프의 KD보다 상당히 높은 농도에서 나타난다. cQFD 및 cQYN 메디토프와 같이, 슈퍼항원 SpA 및 PpL은 Fab 프레임워크 영역에 결합하고, 항원 결합에 영향을 미치지 않는다(Graille et al., 2000; Graille et all., 2001; Graille et al., 2002; Young et al., 1984).
또한, 뮤린 키메라 세툭시맙을 정제하기 위해 고체 지지체에 커플링된 메디토프 화학물질을 사용하였고, 이는 뮤린 키메라 IgG 및 메디토프 그래프팅 gG를 정제하기 위한 새로운 방법을 나타낸다. 도 10 참조. 이러한 정제 접근법에 대한 여러 이점이 존재한다. 우선, 메디토프를 용이하게 합성하고, (자기 비드를 비롯한) 통상의 고체 지지체에 용이하게 첨가할 수 있다. 둘째로, 메디토프의 친화도를 점 돌연변이에 의해 용이하게 조절하고, 이는 정제 절차의 미세한 조율이 가능하게 하고, 항체를 용리하기 위해 흔히 사용되는 낮은 pH와 같은 가혹한 조건을 피한다. 마지막으로, 본원에 기재된 바대로, 메디토프는 2가 또는 다가를 만들 수 있고(예컨대 하기 실시예 4에 기재된 것), 온전한 뮤린 또는 마우스화 인간 IgG를 추출하기 위해 사용될 수 있다. 펩타이드의 사용은 또한 단백질 A 또는 단백질 L의 생성과 관련된 높은 비용, 제한된 생활사 및 박테리아 병원균과 같은 외인성 생물학적 물질의 잠재적 도입을 비롯하여 단백질 A 또는 단백질 L를 사용하는 현재의 정제 방법에 비해 추가의 이점을 가질 것이다.
입체 마스크
메디토프는 가요성 링커를 통해 뮤린 키메라 또는 마우스화 인간 mAb의 경쇄 또는 중쇄 중 어느 하나의 N 말단에 테더링될 수 있다(도 11). mAb IgG의 N 말단은 항원 결합 자리에 병치되고, 가용성 링커를 통한 N 말단으로부터의 확장은 항원 결합을 입체적으로 방해할 것이다. 링커에서 종양 특이적 프로테아제 자리(예를 들면, MMP9, MMP14, 전립선 특이 항원(PSA) 혈청 프로테아제 또는 다른 적합한 자리)를 코딩함으로써, 분자간 '마스킹된' IgG 구성체의 입체 구속은 종양 자리에서 제공되고 항체 결합을 허용할 것이다. 이러한 설계 원칙은 건강한 조직에 대한 분자간 '마스크된' IgG의 결합을 피하고, 표적 이탈 결합으로 인한 부작용을 피할 것이다. 세툭시맙 상의 아비딘-펩타이드 마스크에 대한 등급 이탈 결정이 도 12에 도시되어 있다. 이 도면은 다가 메디토프가 1가 메디토프보다 더 높은 친화도로 결합하지만, 마스킹하지 않다는 것을 보여준다.
실시예 4: 다가 메디토프의 생성
동일한 항원(예를 들면, EGFR) 상의 독특한 에피토프를 인지하는 단일클론 항체(mAb)의 조합이 세포사를 증대시키고 종양 성장을 억제하는 것으로 나타났다. 이러한 증대된 세포사의 정확한 메커니즘이 논의될 여지가 있지만(면역학적 반응 대 수용체 하향 조절 대 리간드 길항작용 증대), 선행 연구는 Mab 둘 다 증대된 세포사를 성취하기 위해 다가(예를 들면, 완전 IgG 또는 F(ab)'2)이어야 한다는 것을 나타낸다. 그러므로, 다가 메디토프는 하기 기재된 바대로 제2 항체로서 치환될 수 있다. 따라서, 본원에 기재된 메디토프는 증대된 선택도 및 결합 친화도를 위해 다가 메디토프를 생성하기 위해 스캐폴드에 테더링될 수 있다.
특이성 및 친화도는 다가를 통해 종종 성취된다. 이는 2가 리간드에 대해 AGTotal = AG1 + AG2 - ΔGlinker로서 표시될 수 있고, 이는 KTotal = K1*K2/Klinker와 동등하다. 링커가 자유 에너지에 기여하지 않는 경우(Klinker 약 1), 2가 표적에 대한 2가 리간드의 겉보기 친화도는 단량체 결합 상수의 곱이다. 따라서, 친화도의 상당한 이득을 성취할 수 있다(예를 들면, KD = 1 μΜ인 메디토프의 경우, '이론적' 2가 메디토프의 친화도는 1 pM임). 그러나, 이러한 이득은 주로 2가/3가/다가 수용체의 기하구조로 인해 거의 볼 수 없다. 수용체의 기하구조는 링커를 엄격히 구속하지만, 이는 또한 특이성을 보장하여, 표적 전달에 중요한 목표이다.
링커에서의 수용체 구속을 다루기 위해, 비변형 또는 최적화 메디토프를 다가 스캐폴드에 커플링할 수 있다. 이를 수행하기 위해, 링커를 최적화하였다. 종양 세포가 높은 항원 밀도를 가지므로, 다가 메디토프는 "데이지 체인"양 화살표를 형성하기 위해 인접한 IgG에 "달라 붙어야(latch-on)" 한다(도 8). 2가 메디토프 및 IgG의 분자간 회합이 가능하지만, IgG의 C2 대칭은 이러한 상호작용에 대해 링커를 심각히 기하학적으로 구속할 것이다. 3가 또는 더 높은 원자가의 스캐폴드는 1개 초과의 항체가 "데이지 체인"되는 것을 보장한다. 제3 메디토프 암(arm)을 포함함으로써, 항원 결합 항체에 대한 3가 메디토프의 초기 접촉의 수명이 증가할 것이다. 이는, 결국, 추가의 암이 이웃하는 항원 결합 항체에 결합하는 확률을 증가시키고, 따라서 전체 복합체를 안정화시킨다.
스캐폴드 합성
FITC 표지된 2가 메디토프의 합성을 (화합물 2)를 사용한 "클릭(Click)" 화학에 기초하여 개발하였다(도 13). 주형 4 및 5(도 13)의 사용은 각각 2가 및 3가 메디토프 둘 다의 형성을 허용한다. 본 발명이 다가 메디토프의 제조를 위해 개발된 화학을 기재하고 최적 결합을 위해 길이가 다른 폴리에틸렌 글리콜(PEG)(및 다른) 링커를 조사하는 데에 초점을 두는 것을 허용하므로, 이러한 합성은 흥미로운 진전을 나타낸다. 합성 접근법은 또한 방사성 핵종 영상화를 위해 DOTA 도입에 적용 가능하다. 예를 들면, 30 Å PEG 이작용성 암은 FITC 표지된 2가 메디토프, 즉 화합물 13의 합성에 도입된다(도 13). IgG 내의 CDR 영역 내의 거리는 약 130 Å이다. 따라서, PEG 링커의 길이는 이러한 접근법이 최적이게 보장하도록 시스템상으로 변할 수 있다. 상업적으로 구입 가능한 PEG의 말단 대 말단 거리는 90 Å(Pierce)로 확장되고, 이는 IgG 거리를 초과할 것이다.
다가 규명
다가 스캐폴드에 대한 접합이 메디토프-lgG 상호작용에 영향을 미치지 않는다는 것을 보장하기 위해 각각의 다가 메디토프를 SPR 및 ITC에 의해 규명하였다. 그러나, IgG가 종양 표면에 결합하지 않으므로, 이러한 측정은 다가를 결정하는 데 있어서의 이의 효과에서 제한된다. 대신에, 바로 EGFR을 과발현하는 세포에 대한 다가 메디토프의 효과를 정량하기 위해 FACS 분석 및 세포 생존율 분석을 이용할 수 있다.
FACS 분석을 위해, EGFR(MDA-MB-468 및 A431)을 과발현하는 세포주를 다양한 농도(1 nM 내지 100 nM)에서 세툭시맙과 항온처리한다. 다음에, 세툭시맙 처치 세포를 증가하는 농도(0.1 nM 내지 1 μΜ)에서 표지된 다가 메디토프(도 17; 메디토프-Fc)와 항온처리하고, CyAn FACS 분류기를 사용하여 결합 특성을 분석하였다. 1가 메디토프에 관찰된 것보다 훨씬 더 낮은 농도에서의 이동(도 17) 및/또는 이동하는 세포의 백분율의 증가를 관찰할 수 있다. 다가 메디토프에 예상된 추가의 효과를 추가로 확인하기 위해, 항원 결합 세툭시맙에 대한 표지된 다가 메디토프로 완성하기 위해 비표지된 1가 메디토프를 사용할 수 있다.
세포 생존율 검정을 이용한 세툭시맙 매개 세포사를 증대시키는 데 있어서의 다가 메디토프의 효능을 또한 측정할 수 있다. 간단히 말하면, MDA-MB-468 및 A431 세포주를 플레이팅하고, 다양한 농도의 세툭시맙 및 다가 메디토프로 처치하였다. 대조군으로서, 세툭시맙 단독과 유사한 결과를 생성시키는 1가 메디토프를 사용한다. 생존 세포의 수를 정량하기 위해 MTT, 3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐테트라졸륨 브로마이드를 사용할 수 있다. 활성을 입증하는 다가 메디토프의 경우, EGFR, 및 EGFR 신호전달 경로의 일부인 AKT 및 MAP의 인산화 상태에 뒤따르는 웨스턴 블롯(Western blot) 분석을 수행할 수 있다. 이후, 이 데이터를 세툭시맙만으로 처치된 세포 및 티로신 키나제 억제제(AG1478)로 처치된 세포로부터 얻은 데이터와 비교하였다. 총체적으로, 이는 다가 메디토프 농도의 함수로서 세포사를 증가시켜야 한다.
MTT 검정
세툭시맙과 함께 세포사를 유도하는 데에 단량체 메디토프 또는 2가 메디토프-Fc의 효과를 MTT 검정을 이용하여 조사하였다. 4000 MDA-MB-468 세포를 80 ㎕의 배지 중에 96 웰 플레이트의 각각의 웰에 위치시켰다. 10 ㎕의 1 μΜ 세툭시맙을, 0.1 μΜ 세툭시맙 및 0.01, 0.1 및 1 μΜ 메디토프 또는 메디토프-Fc의 최종 농도로, 10 ㎕의 0.1, 1 또는 10 μΜ의 메디토프 또는 메디토프-Fc과 함께 첨가하였다. 또한, 각각의 성분을 대조군으로서 PBS와 단독 첨가하였다. 48 시간 항온처리 후, 10 ㎕의 MTT 시약을 첨가하고 추가로 4 시간 동안 항온처리하였다. 이후, 배양 상청액을 제거하고, 100 ㎕의 MTT 결정 용해 시약을 첨가하고, 플레이트를 630 ㎚에서 판독하였다. 메디토프 또는 메디토프-Fc 단독은 세포 성장을 상당히 변경시키지 않았지만, 메디토프-Fc 뿐만 아니라 단량체 메디토프가 세툭시맙과 함께 세포 성장을 억제할 수 있다(도 28a).
다가 메디토프가 세툭시맙 이외의 제2 항-EGFR 항체의 효과에 유사한 세포사를 증대시키는 데 있어서의 효능을 갖는지를 보여주기 위해, 세툭시맙과 메티도-Fc 또는 세툭시맙과 M425 중 어느 하나에 의한 종양 세포 성장 억제의 효과를 비교하였다. 4000 MDA-MB-468 세포를 80 ㎕의 배지 중에 96 웰 플레이트의 각각의 웰에 위치시켰다. 10 ㎕의 1 μΜ 세툭시맙을, 0.1 μΜ 세툭시맙 및 0.2, 0.4 또는 0.8 μΜ 메디토프-Fc 또는 M425의 최종 농도로, 10 ㎕의 2, 4 또는 8 μΜ 메디토프-Fc 또는 M425와 함께 첨가하였다. PBS와 함께 첨가된 세툭시맙을 대조군으로서 사용하였다. 48 시간 항온처리 후, 10 ㎕의 MTT 시약을 첨가하고 추가로 4 시간 동안 항온처리하였다. 이후, 배양 상청액을 제거하고, 100 ㎕의 MTT 결정 용해 시약을 첨가하고, 플레이트를 630 ㎚에서 판독하였다. 메디토프-Fc는 세툭시맙의 세포사 능력을 증대시키는 것으로 보이지만, M425 만큼 강력하지 않다(도 28b).
대안적인 접근법으로서, 고친화도 다가 메디토프를 생성하기 위해 상이한 스캐폴드 및 링커를 사용할 수 있다. 예를 들면, 더 경질인 스캐폴드를 생성하기 위해 메디토프에 대한 스캐폴드로서 DNA를 사용할 수 있다.
메디토프(야생형)를 가요성 펩타이드 링커("메디토프-Fc")(도 15; 서열 번호 3-4)를 통해 IgG의 Fc 영역의 N 말단에 융합하였다. 메디토프-Fc의 서열 및 구조가 각각 도 15 및 도 16에 도시되어 있다. 리간드를 '2합체화'하는 Fc 영역의 사용이 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/18215087)에 잘 확립되어 있다. 이 실시예에서, 글리신 및 세린으로 이루어지는 17개 아미노산 길이의 링커를 선택하였지만, 임의의 적합한 길이의 링커를 사용할 수 있다. 다가로 인한 결합 증대를 입증하기 위해, 0.5×106 MDA-MB-468 세포를 실온에서 30 분 동안 10 nM의 세툭시맙으로 표지하고, 세척하고, 이후 0.1, 0.3, 1 및 3 μΜ의 2가 메디토프-Fc 또는 단량체 메디토프와 30 분 동안 실온에서 항온처리하고, 세척하고, FACS에 의해 분석하였다. 도 17에 도시된 바대로, FACS 분석에 의하면 화학량론에 대해 보정된 메디토프-Fc가 상당히 더 높은 친화도로 세툭시맙으로 전처치된 세포에 결합한다는 것을 나타낸다. 더욱이, 본 발명자들은 이 상호작용이 메디토프 이용 가능 mAb(세툭시맙)에 특이적이라는 것을 입증한다. 이 데이터는 메디토프 이용 가능 mAb와 조합된 메디토프-Fc가 상승적이고 제2 항체에 대해 치환될 수 있다는 것을 나타낸다.
다가를 성취하기 위해 생물 및 화학 기관의 상이한 스캐폴드를 또한 사용할 수 있다. 이로는 스트렙타비딘 또는 콜라겐(http://ip.com/patapp/EP2065402A1)을 사용한 2가 또는 3가 스캐폴드, 4가 스캐폴드로서의 스트렙타비딘, 독특한 스캐폴드(http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0022283611000283), Origami DNA(http://www.nature.eom/nnano/iournal/v4/n4/abs/nnano.2009.5.html) 및 기타 등등을 구성하는 것을 들 수 있지만, 이들로 제한되지는 않는다. DNA(단일 가닥, 듀플렉스, Holliday 접합부, 압타머 및 기타 등등), RNA(단일 가닥, 헤어핀, 줄기 루프, 압타머 및 기타 등등), PNA(펩타이드 핵산), 경질을 위해 DNA/PNA 듀플렉스 및 트리플렉스, 나노입자(바로 커플링되거나 PEG와 같은 유기 중합체를 통해 커플링됨), 그 자체 및/또는 DNA 또는 PNA와 듀플렉스를 형성할 수 있는 유기 중합체를 비롯한 분자를 사용하여 화학 스캐폴드를 또한 생성할 수 있다. 예를 들면, 도 13에서, 3가 메디토프를 성공적으로 합성하였다. 도 14는 플루오레세인 이소티오시아네이트(FITC) 표지된 메디토프 2합체 7의 규명을 예시한 것이다.
또한, Fc 및 메디토프의 조성 및 Fc와 메디토프 사이의 거리를 시스템상으로 친화도 및 특이성을 최적화하기 위해 이용할 수 있다. 일 실시양태에서, 각각의 천연 또는 비천연 잔기는 최적화를 위해 링커 내에 임의의 위치에서 치환될 수 있다. 또한, 2개의 잔기와 100개 이상의 잔기 사이의 링커가 가능하다(예를 들면, 현재 및 미래의 DNA 합성장치에 의해 생성될 수 있고, 메디토프와 Fc 영역 사이에 삽입될 수 있다). 선회 반경을 제한하고 Fc-메디토프에 대한 친화도 및 특이성을 증대시키기 위해 링커는 또한 '경질'될 수 있다. 예를 들면, 코일형 코일 도메인이 메디토프와 Fc 사이에 위치할 수 있다(도 18). 대안적으로, 불활성 단백질 도메인(예를 들면, 면역글로불린 폴드)이 링커에 치환될 수 있다. 복수의 면역글로불린 폴드가 메디토프와 Fc 도메인 사이에 위치할 수 있다. 특정한 실시양태에서, 링커의 조성은 잠재적 항원성을 완화하기 위해 인간 유래이다.
실시예 5: 메디토프 포켓의 변형
메디토프 또는 메디토프 동족체의 특이성을 증대시키고/시키거나 변경시키기 위해 메디토프 자리에 줄지은 잔기를 시스템상으로 또는 무작위로 변경(라이브러리 및 선택을 악화)할 수 있다(변경하는 방법을 위해 예를 들면, 문헌[Sheedy et al. 2007 and Akamatsu et al. 2007](본원에 참조문헌으로 포함됨) 참조). 이 위치를 메디토프 상호작용의 친화도를 개선하기 위해 비자연적 아미노산, 비천연 아미노산 또는 둘 다로 치환할 수 있다. 최근에, 2중 특이적 항체를 생성하기 위한 항체에서의 비자연적 아미노산의 도입이 기재되어 있다(Hutchins et al. 2001).
수소 결합, 이온, 정전 또는 입체 상호작용을 통한 메디토프 친화도를 개선하기 위해 시스템상으로 또는 무작위로 변경될 수 있는, 메디토프와 접촉하는/ (결합 메디토프-cQFD의 임의의 원자의 8 Å 내의) 공간에 줄지은 잔기는 1개 이상의 경쇄 잔기(예를 들면, 경쇄의 P8, V9, I10, S14, E17, Q38, R39, T40, N41 G42, S43, P44, D82, I83, A84, D85, Y86, Y87, G99, A100, G101, T102, K103, L104, E105, K107, R142, S162, V163, T164, E165, Q166, D167, S168 또는 Y173; 또는 중쇄의 Q6, P9, R38, Q39, S40, P41, G42, K43, G44, L45, S87, D89, T90, A91, I92, Y93, Y94, W109, G110, Q111, G112, T113, L114, V115, T116, Y151, E154, P155, V156, T171, F172, P173, A174, V175, Y182, S183 또는 L184) 또는 이들의 조합을 포함한다. 또한, 메디토프 기가 이를 수화시키고 고친화도로 결합하도록 메디토프 결합 영역에서의 다른 잔기를 돌연변이시킬 수 있다. 예를 들면, 경쇄 잔기의 Tyr87, 중쇄 잔기의 Tyr94, 또는 둘 다 메디토프 동족체 유래의 알데하이드 또는 붕소 함유 화합물과 수화물을 형성할 수 있다.
메디토프 자리의 진전. 메디토프가 항원 결합에 영향을 미치지 않고, 따라서 약물을 전달하고, 치료학적 항체의 효율 및 효능을 증가시키기 위한 다른 항체 또는 다른 방법을 데이지 체인하고/가교결합하는데 사용할 수 있다는 것이 입증되었다. 메디토프 결합 자리의 조성을 변경하여 이것이 더 높은 친화도로 현재의 메디토프, 상이한 메디토프 동족체 또는 소분자 예컨대 (방사성 전달을 위해) DOTA에 결합할 수 있게 할 수 있다. 메디토프 결합 자리에 줄지은 각각의 잔기를 시스템상으로 변경하고, 생성하고, 규명할 수 있다. 그러나, 돌연변이의 수는 어마어마하다(>206 조합, 가능하게는 >2016 조합). 메디토프에 결합이 가능하게 하는 Fab에서의 돌연변이를 더 효과적으로 확인하기 위해, 각각의 아미노산이 소장의 자리에서 치환되도록 IgG의 라이브러리를 DNA 수준에서 생성할 수 있다. 가장 유용한 조합을 선택하고, 자세히 규명하고, 추가의 변형을 위해 사용할 수 있다.
이를 수행하는 한가지 방법은 이 자리에서의 모든 20개의 천연 아미노산을 코딩하기 위해 관심 있는 자리(예를 들면, 중쇄의 Ile90, Thr92, Leu114 및 Thr1 16 및 경쇄의 Lys103 및 Glu165)에서의 올리고물을 변성시키는 DNA 라이브러리를 생성하는 것이다. 또한, GPI 도메인을 IgG 중쇄의 C 말단에 첨가할 수 있다. 라이브러리를 표준 방법을 이용하여 형질감염시키고, 독특한 IgG는 발현하도록 허용될 것이다. 항원 결합이 영향을 받지 않도록 보장하기 위해, 형광 표지된 항원(예를 들면, Her2, EGFR, IGFR, CLTA-4 등)에 결합하는 세포를 FAC에 의해 분류할 수 있다(도 20). 이후, 항원에 결합하는 세포를 특이적 메디토프, 메디토프 동족체, 또는 관심 있는 다른 분자(예를 들면, DOTA)에 대한 결합을 위해 선택한다. 일단 세포를 분류하면, 메디토프/동족체/소분자 결합이 가능하게 하고 이를 증대시키는 생성된 돌연변이를 확인하기 위해 PCR을 이용한다. 결합을 '진전/최적화'시키기 위해 이를 수회 반복할 수 있다.
실시예 6: 메디토프 이용 가능 항체의 생성
특정한 실시양태에서, 다른 IgG, 예컨대 인간, 뮤린, 또는 닭의 잔기의 돌연변이를 통해 lgG1-4(람다 및 카파 아형), IgE, lgA1, lgA2, IgD 및 IgM을 비롯한 이미 존재하는 단일클론 항체 및 모든 미래의 단일클론 항체에서 메디토프 결합 자리를 생성할 수 있다.
메디토프에 결합하는 프레임워크는 Fab 가변 영역(Fv)가 뮤린이고, Fab 불변 영역(CH1)이 인간이므로 독특하다. 더욱이, 이 Fab의 돌연변이는 (공지 IgG의 서열 정렬에 기초하여) 뮤린 또는 인간 키메라 IgG에서 발견되지 않는 각각의 IgG 도메인 내의 잔기의 조합을 생성하였다. 이를 확인하기 위해, 원래 메디토프가 완전 인간 또는 완전 뮤린 혈청 IgG에 결합하지 않는다는 것을 입증하였다. 그러므로, 메디토프 결합이 가능하게 하는 인간 IgG를 비롯하여 메디토프 결합 자리를 임의의 프레임워크에 맵핑(또는 조작 또는 돌연변이)할 수 있다. 이미 존재하는 단일클론 항체의 CDR 그래프팅을 통해 현재의 메디토프 이용 가능 단일클론 항체의 항원 특이성을 변경할 수 있다(도 21).
인간 프레임워크 서열과 세툭시맙 프레임워크 사이의 서열 차이를 세툭시맙 Fab의 결정 구조에 맵핑하였다. 메디토프 자리에 줄지은 인간 프레임워크(트라스투주맙 - 1N8Z.pdb)에서의 잔기를 세툭시맙에서의 상응하는 잔기로 돌연변이시켰다. 중쇄 및 경쇄를 표준 방법을 이용하여 합성하고, 포유동물 발현을 위해 표준 벡터로 서브클로닝하고, 돌연변이된 IgG를 표준 방법을 이용하여 정제하고, Her2 및 메디토프 결합에 대해 규명하였다. 도 23a 및 도 23c는 각각 중쇄(서열 번호 5) 및 경쇄(서열 번호 8)의 핵산 서열을 보여주고; 도 23b 및 도 23d는 메디토프 이용 가능 트라스투주맙의 야생형 서열(서열 번호 7 및 서열 번호 10)과 비교하여 경쇄(서열 번호 6) 및 중쇄(서열 번호 9)의 상응하는 아미노산 서열을 보여준다.
항원 결합을 규명하기 위해, 야생형 트라스투주맙 및 메디토프 이용 가능 트라스투주맙을 표준 프로토콜을 이용하여 Alexa 647로 표지하였다. 마찬가지로, 메디토프-Fc를 동일한 프로토콜을 이용하여 Alexa488로 표지하였다. 메디토프-Fc가 메디토프 이용 가능 트라스투주맙에 결합하고 야생형 트라스투주맙에 결합하지 않는다는 것을 보여주기 위해, Her2를 과발현하는 SKBR3 세포(0.5×106)를 표지된 야생형 트라스투주맙 또는 메디토프 이용 가능 메디토프와 30 분 동안 항온처리하였다. 비결합 항체를 세척하고, 세포를 메디토프-Fc 구성체와 30 분 동안 항온처리하였다. 항체 결합 및 메디토프 결합을 FAC 분석에 의해 분석하였다. "메디토프 그래프팅"의 중요한 성분으로서, FACS 데이터에 의하면 메디토프 이용 가능 트라스투주맙이 SKBR3 세포에서 발현된 Her2에 결합한다는 것을 입증한다(예를 들면, 메디토프 자리를 항원 특이성의 손실 없이 항체에 그래프팅할 수 있다)(도 22a). FAC 데이터에 의하면 또한 메디토프-Fc가 메디토프 이용 가능 트라스투주맙에 결합하지만, 야생형 트라스투주맙에 결합하지 않는다는 것을 입증한다(도 22b).
명확한 친화도 감소(예를 들면, 메디토프 이용 가능 트라스투주맙의 최종 농도에서의 비특이성 및 Alexa 647에 의한 이의 표지)의 원인일 수 있는 엄격한 정략적 규명을 위해 더 많은 물질을 허용하도록 메디토프 이용 가능 트라스투주맙의 생성을 최적화해야 한다는 것에 유의한다. 마찬가지로, 본 발명자들은 항원 결합 및 메디토프 결합을 최적화하기 위한 표준 방법(메디토프 결합 자리의 최적화 참조)이 존재한다는 것에 주목하였다. 개의치 않고, 데이터에 의하면 메디토프 이용 가능 트라스투주맙이 SKBR3 세포를 과발현하는 Her2에 결합하고, 메디토프 이용 가능 트라스투주맙으로 전처치된 세포가 메디토프에 결합한다는 것을 명백히 보여준다.
Her2 CDR 그래프팅된 메디토프 이용 가능 항체. CDR 그래프팅은 현재 인간화 단일클론 항체를 생성하기 위한 표준 실행이다. 메디토프 결합 자리는 (인간, 뮤린 또는 다른 뮤린-인간 키메라 - 예를 들면, 리툭시맙이 아닌) 세툭시맙 프레임워크에 독특하다. 다른 실시양태는 다른 항체의 CDR 루프가 트라스투주맙의 CDR 루프를 세툭시맙 프레임워크에 그래프팅함으로써 메디토프 결합을 제공하기 위해 세툭시맙 프레임워크에 그래프팅될 수 있다는 것을 입증한다. mAb의 CDR 루프의 '경계'가 일반적으로 서열 상동성 구조적 방법에 의해 명확히 한정되지만, 본 발명자들은 트라스투주맙의 결정 구조를 세툭시맙에 중첩하였고 각각의 잔기의 위치를 조사하여 CDR 루프의 입체구조에 2차 효과를 가질 수 있는 CDR 루프의 외부에서의 잠재적 차이를 다루었다. 경쇄 및 중쇄의 생성된 아미노산 서열(예를 들면, 세툭시맙 상의 트라스투주맙 CDR 루프)을 DNA 서열로 번역하고, 각각 코딩하는 유전자를 합성하였다. 이후, 유전자를 프레임에서, DNA 서열 결정에 의해 확인된, 남은 IgG DNA 서열로 서브클로닝하고, 개별 발현 벡터에 위치시켰다. 생성된 발현 벡터는 중쇄 및 경쇄의 동시 발현을 위해 NS0 세포로 형질전환되었다. 발현된 전장 CDR 그래프팅된 IgG가 분비되면서, 상청액을 원심분리에 의해 투명하게 하고, 농축시키고, 단백질 A 칼럼을 통과시켰다. IgG를 낮은 pH 용액을 사용하여 용리시키고, 즉시 중화시켰다. 환원 조건 하에 전장 CDR 그래프팅된 IgG의 SDS-PAGE(폴리 아크릴아미드 겔 전기영동)는 경쇄 및 중쇄와 일치하는 겉보기 질량을 갖는 2개의 단백질 밴드를 나타낸다. 밴드의 위치는 야생형 세툭시맙과 비교하여 유사한 위치에서 이동하였다.
항원 결합을 규명하기 위해, 야생형 트라스투주맙 및 트라스투주맙 CDR 그래프팅된 메디토프 이용 가능 mAb를 표준 프로토콜을 이용하여 Alexa 647로 표지할 수 있다. 이전에서처럼, 메디토프-Fc를 동일한 프로토콜을 이용하여 Alexa488로 표지하였다. 메디토프-Fc가 트라스투주맙 CDR 그래프팅된 메디토프 이용 가능 mAb에 결합하고 야생형 트라스투주맙에 결합하지 않는다는 것을 보여주기 위해, Her2를 과발현하는 SKBR3 세포(0.5×106)를 야생형 트라스투주맙 또는 메디토프 이용 가능 메디토프와 30 분 동안 항온처리하였다. 비결합 항체를 세척하고, 세포를 메디토프-Fc 구성체와 30 분 동안 항온처리하였다. 항체 결합 및 메디토프 결합을 FAC 분석에 의해 분석하였다. "CDR 그래프팅"의 중요한 성분으로서, FACS 데이터에 의하면 트라스투주맙 CDR 그래프팅된 메디토프 이용 가능 mAb가 SKBR3 세포에서 발현된 Her2에 결합한다는 것을 입증한다(예를 들면, CDR 루프는 세툭시맙 프레임워크 영역에 그래프팅될 수 있고 Her2에 결합한다)(도 24a). FAC 데이터에 의하면 또한 메디토프-Fc가 트라스투주맙 CDR 그래프팅된 메디토프 이용 가능 mAb에 결합하지만, 야생형 트라스투주맙에 결합하지 않는다는 것을 입증한다(도 24b).
명확한 친화도 감소(예를 들면, 메디토프 이용 가능 트라스투주맙의 최종 농도에서의 비특이성 및 Alexa 647에 의한 이의 표지)의 원인일 수 있는 엄격한 정략적 규명을 위해 더 많은 물질을 허용하도록 메디토프 이용 가능 트라스투주맙의 생성을 최적화해야 한다는 것에 유의한다. 메디토프 결합에 적용될 수 있는 항원 결합을 최적화하기 위한 분야에 공지된 방법이 존재한다. 데이터에 의하면 메디토프 이용 가능 트라스투주맙이 SKBR3 세포를 과발현하는 Her2에 결합하고, 메디토프 이용 가능 트라스투주맙으로 전처치된 세포가 메디토프에 결합한다는 것을 명백히 보여준다. Her2 CDR 그래프팅된 메디토프 결합 mAb 서열은 도 25a(중쇄; 서열 번호 11-12) 및 도 25b(경쇄; 서열 번호 13-14)에 도시되어 있다.
이러한 접근법을 IgA, IgE, IgD, 및 IgM를 비롯한 임의의 항체 및 닭, 뮤린, 랫트, 소, 영장류 및 염소(이들로 제한되지는 않음)를 비롯한 항체를 생성하는 임의의 유기체에 사용할 수 있다. 예로서, IgG 및 IgE 'Fab' 도메인의 서열 및 구조 정렬은 메디토프 결합 자리 근처의 IgE 상의 잔기를 나타낸다(도 26).
실시예 7: pH의 함수로서의 메디토프 결합 친화도
메디토프의 조성을 pH의 함수로서의 결합 친화도에 영향을 미치도록 변경할 수 있다. 도 27에 도시된 바대로, 3개의 상이한 메디토프 변이체의 결합 친화도를 완충액 pH의 함수로서 측정하였다. QYD 메디토프 변이체는 더 낮은 pH에서의 친화도의 현저한 감소를 나타낸다. QYN 변이체에서의 아스파라긴에 대한 아스파라테이트의 치환은 편평한 pH 의존성을 생성한다. 마찬가지로, QFD 변이체의 친화도는 더 높은 pH에서 약간 더 높다. 총체적으로, 이 실험은 메디토프-MAb 상호작용의 친화도가 pH에 조절될 수 있다는 것을 나타낸다.
따라서, 몇몇 실시양태에서, 낮은 pH에서의(예를 들면, 약물 전달을 위해 리소좀에서의) 특이적 방출을 위한 메디토프 변이체(또는 "동족체")의 변형; 및 저산소 환경에서 더 높은 친화도로 결합하도록(예를 들면, 종양 기질 pH는 종종 정상 조직보다 더 낮다) 메디토프의 변형이 제공된다.
상기 실시예 및 본 발명의 방법은 오직 예시적이고 어떠한 방식으로든 본 발명을 제한하도록 의도되지 않는다. 당해 분야의 당업자는 상기의 다양한 변형이 본 발명의 의도된 범위 내에 있다는 것을 인지할 것이다.
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SEQUENCE LISTING <110> WILLIAMS, John DONALDSON, Josh HORNE, David MA, Yulong ZER, Cindy BZYMEK, Krzysztof AVERY, Kendra <120> A MONOCLONAL ANTIBODY FRAMEWORK BINDING INTERFACE FOR MEDITOPES, MEDITOPE DELIVERY SYSTEMS AND METHODS FOR THEIR USE <130> 54435.8081.WO00 <140> PCT/US11/55656 <141> 2011-10-10 <150> US 61/391,558 <151> 2010-10-08 <160> 16 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> unmodified cQFD meditope <400> 1 Cys Gln Phe Asp Leu Ser Thr Arg Arg Leu Lys Cys 1 5 10 <210> 2 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> unmodified cQYN meditope <400> 2 Cys Gln Tyr Asn Leu Ser Ser Arg Ala Leu Lys Cys 1 5 10 <210> 3 <211> 867 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> meditope-Fc tethering agent <400> 3 acacccaagc tggctagcga caccatgaag tgtagctggg tcatcttctt tctgatggca 60 gtcgtgacag gagtgaattc gtgccagttt gacctgtcaa ctcggcgact gaaatgcggt 120 gggggctccg gttcaggctc gggcggttca tcgggaggag ggggagggga acctaagtca 180 tgcgataaga cgcacacctg tcctccatgc ccagcccccg agttgcttgg tgggccctca 240 gtattcctct tccctccaaa acccaaagac accttgatga tttcccgcac gccggaagtc 300 acgtgtgtgg tcgtggatgt gagccatgag gatcccgagg tgaagttcaa ttggtacgtg 360 gatggagtag aggtacacaa cgcgaaaacg aagcccaggg aggaacagta caattccaca 420 tatcgcgtgg tgtccgtgct tactgtgttg catcaagact ggctgaatgg gaaggagtat 480 aagtgcaaag tatcaaacaa ggcgctgcct gctccaatcg aaaagaccat ctcgaaggcg 540 aaaggacaac ccagagaacc ccaagtctac acgcttccgc cctcgcggga tgagctcacc 600 aaaaaccagg tatccctcac ttgtttggta aaaggattct acccgtcgga cattgcagtc 660 gagtgggagt cgaatgggca gccggaaaac aactacaaaa caacaccgcc cgtcttggac 720 tccgatggtt cgttctttct ctattcgaag ctcaccgtag acaagtcgag gtggcagcag 780 ggcaacgtct tttcgtgctc agtgatgcat gaggcccttc acaatcacta tacgcagaaa 840 agcctgagcc tgtcaccggg gaagtaa 867 <210> 4 <211> 288 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> meditope-Fc tethering agent <400> 4 Thr Pro Lys Leu Ala Ser Asp Thr Met Lys Cys Ser Trp Val Ile Phe 1 5 10 15 Phe Leu Met Ala Val 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agtctcgtgg 540 aactcgggtg cccttacaag cggcgtacat acgtttcccg ccgtgctcca atcatccgga 600 ctgtattccc tttcatccgt cgtgactgtg ccgtcctcgt cactcggaac gcaaacttac 660 atttgcaatg tcaaccacaa accgtcaaat acaaaggtcg ataagaaggt cgagccaaag 720 tcgtgtgata agacccacac atgccctccc tgtccagcgc cggagctgtt gggagggcct 780 tcagtgttcc tcttcccgcc caaacccaag gacaccctga tgattagccg cacacccgag 840 gtgacgtgtg tcgtcgtcga tgtctcacat gaggacccgg aggtaaagtt caactggtac 900 gtggatggag tcgaagtgca caacgcaaaa acaaaacctc gggaagagca gtacaatagc 960 acgtacagag tagtcagcgt gctcaccgtg ctgcaccagg attggctcaa tggaaaggag 1020 tacaagtgta aagtgtcgaa taaggcgctg cctgccccca tcgaaaagac aatttccaaa 1080 gctaaagggc aaccccgcga gccgcaagta tacaccctcc caccctcgcg cgatgaactg 1140 accaagaacc aggtgtcatt gacgtgtctc gtcaagggct tctatccgag cgacattgca 1200 gtagaatggg aaagcaacgg acagccggaa aacaactaca agactacacc gcctgtcctt 1260 gattcggatg gttccttctt tctttactca aaacttacag tcgacaaatc gaggtggcag 1320 cagggaaatg tgttttcgtg cagcgtgatg cacgaggcct tgcataatca ctatacacag 1380 aagtcgttgt cactgtcgcc gggaaagtaa 1410 <210> 6 <211> 180 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> meditope-enabled trastuzumab heavy chain <400> 6 Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu 1 5 10 15 Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr Tyr Ile His Trp 20 25 30 Val Arg Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Arg Ile Tyr 35 40 45 Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe 50 55 60 Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn 65 70 75 80 Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ser Arg Trp Gly 85 90 95 Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val 100 105 110 Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala 115 120 125 Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu 130 135 140 Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly 145 150 155 160 Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser 165 170 175 Gly Leu Tyr Ser 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catccgtcgt gactgtgccg 660 tcctcgtcac tcggaacgca aacttacatt tgcaatgtca accacaaacc gtcaaataca 720 aaggtcgata agaaggtcga gccaaagtcg tgtgataaga cccacacatg ccctccctgt 780 ccagcgccgg agctgttggg agggccttca gtgttcctct tcccgcccaa acccaaggac 840 accctgatga ttagccgcac acccgaggtg acgtgtgtcg tcgtcgatgt ctcacatgag 900 gacccggagg taaagttcaa ctggtacgtg gatggagtcg aagtgcacaa cgcaaaaaca 960 aaacctcggg aagagcagta caatagcacg tacagagtag tcagcgtgct caccgtgctg 1020 caccaggatt ggctcaatgg aaaggagtac aagtgtaaag tgtcgaataa ggcgctgcct 1080 gcccccatcg aaaagacaat ttccaaagct aaagggcaac cccgcgagcc gcaagtatac 1140 accctcccac cctcgcgcga tgaactgacc aagaaccagg tgtcattgac gtgtctcgtc 1200 aagggcttct atccgagcga cattgcagta gaatgggaaa gcaacggaca gccggaaaac 1260 aactacaaga ctacaccgcc tgtccttgat tcggatggtt ccttctttct ttactcaaaa 1320 cttacagtcg acaaatcgag gtggcagcag ggaaatgtgt tttcgtgcag cgtgatgcac 1380 gaggccttgc ataatcacta tacacagaag tcgttgtcac tgtcgccggg aaagtaatga 1440 <210> 12 <211> 477 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> meditope-enabled HER2 heavy chain <400> 12 Ser Leu Gly Lys Leu Ala Ala Thr Met Lys Cys Ser Trp Val Ile Phe 1 5 10 15 Phe Leu Met Ala Val Val Thr Gly Val Asn Ser Glu Val Gln Leu Val 20 25 30 Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser 35 40 45 Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr Tyr Ile His Trp Val 50 55 60 Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Arg Ile Tyr Pro 65 70 75 80 Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr 85 90 95 Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser 100 105 110 Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ser Arg Trp Gly Gly 115 120 125 Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr 130 135 140 Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro 145 150 155 160 Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val 165 170 175 Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala 180 185 190 Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly 195 200 205 Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly 210 215 220 Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys 225 230 235 240 Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys 245 250 255 Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu 260 265 270 Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu 275 280 285 Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys 290 295 300 Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys 305 310 315 320 Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu 325 330 335 Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys 340 345 350 Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys 355 360 365 Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser 370 375 380 Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys 385 390 395 400 Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp 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atgcctgctt aacaactttt acccacggga agccaaagta cagtggaagg tggataatgc 540 gctccagagc ggaaactccc aagagagcgt gacagaacag gactcgaagg attcgacgta 600 ctcactcagc tcaacgctga ccctgtcgaa agcggactat gagaaacaca aggtctacgc 660 gtgcgaggtg acccatcagg gcctgagctc ccccgtaact aagtcattca accggggtga 720 atgctaatga 730 <210> 14 <211> 240 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> meditope-enabled HER2 light chain <400> 14 Gly Lys Leu Ala Ala Thr Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val 1 5 10 15 Leu Leu Leu Trp Val Pro Gly Ser Thr Gly Asp Ile Gln Met Thr Gln 20 25 30 Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr 35 40 45 Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln 50 55 60 Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Phe Leu 65 70 75 80 Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Arg Ser Gly Thr Asp 85 90 95 Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr 100 105 110 Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr 115 120 125 Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe 130 135 140 Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys 145 150 155 160 Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val 165 170 175 Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln 180 185 190 Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser 195 200 205 Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His 210 215 220 Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 225 230 235 240 <210> 15 <211> 221 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> cetuximab IgG Fab domain <400> 15 Gln Val Gln Leu Lys Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Gln Pro Ser Gln 1 5 10 15 Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Asn Tyr 20 25 30 Gly Val His Trp Val Arg Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu 35 40 45 Gly Val Ile Trp Ser Gly Gly Asn Thr Asp Tyr Asn Thr Pro Phe Thr 50 55 60 Ser Arg Leu Ser Ile Asn Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Phe 65 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Claims (43)

  1. 메디토프(meditope)에 결합하는 프레임워크(framework) 결합 계면을 포함하는 키메라 뮤린(murine)-인간 항체 또는 이의 항원-결합 단편으로서,
    상기 메디토프는, Kabat 넘버링에 따라, 상기 프레임워크 결합 계면의 경쇄의 9번 위치의 Ile, 10번 위치의 Leu, 39번 위치의 Arg, 40번 위치의 Thr, 41번 위치의 Asn, 42번 위치의 Gly, 43번 위치의 Ser, 83번 위치의 Ile, 85번 위치의 Asp 및 100번 위치의 Ala; 및
    상기 프레임워크 결합 계면의 중쇄의 40번 위치의 Ser 및 89번 위치의 Ile에 결합하고,
    상기 메디토프는 서열 CQFDLSTRRLKC(서열 번호 1) 또는 CQYNLSSRALKC(서열 번호 2)를 가지고;
    상기 항체는 세툭시맙이 아니고,
    상기 항체는 서열 번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열 번호 9의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는,
    키메라 뮤린(murine)-인간 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  2. 제1항에 있어서, 상기 메디토프는 환형인 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  3. 제1항에 있어서, 상기 메디토프는 선형인 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  4. 제1항에 있어서, 상기 프레임워크 결합 계면은 키메라 뮤린-인간 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 Fab 경쇄와 Fab 중쇄 사이에 위치하는 것인, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  5. 제1항에 있어서, 프레임워크 결합 계면은 Fab 일부분을 포함하는 것인, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  6. 제1항의 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 포함하는 질환 또는 병증을 치료하거나, 영상화하거나, 또는 진단하기 위한 약학 조성물.
  7. 제6항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 질환 또는 병증을 진단하거나 영상화하기 위한 1종 이상의 진단제 또는 영상화제, 질환 또는 병증을 치료하기 위한 1종 이상의 치료제, 또는 이들의 임의의 조합에 접합된 것인 약학 조성물.
  8. 삭제
  9. 제1항에 있어서, 상기 85번 위치의 Asp가 상기 메디토프의 9번 위치의 Arg와 결합하는 것인, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  10. 삭제
  11. 제1항에 있어서, 상기 메디토프는 치료 물질, 영상화 물질 또는 이들의 조합 중 1종 이상과 회합된 것인, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  12. 제11항에 있어서, 영상화 물질은 형광 또는 발광 물질, 효소, 성능 향상제(enhancing agent), 방사성 물질 또는 나노입자 중 1종 이상인, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  13. 제11항에 있어서, 치료 물질은 소분자, 화학치료제, 치료학적 항체 또는 이의 기능성 단편, 독소, 방사성 동위원소, 효소, 뉴클레아제, 호르몬, 면역조절제, 올리고뉴클레오타이드, 나노입자, RNAi 분자, 킬레이터, 붕소 화합물, 광활성제, 염료 또는 이들의 임의의 조합 중 1종 이상인, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  14. 제1항에 있어서, 상기 항체는, Kabat 넘버링에 따라, 세툭시맙의 중쇄의 111번 위치의 프레임워크 잔기를 포함하는 것인, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  15. 제1항에 있어서, 상기 항체는, Kabat 넘버링에 따라, 세툭시맙의 경쇄의 104번 위치의 프레임워크 잔기를 포함하는 것인, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
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