JPWO2016121701A1 - 免疫グロブリンκ鎖可変領域含有タンパク質精製用アフィニティー分離マトリックス - Google Patents
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Abstract
本発明は、抗体のκ鎖可変領域に対する結合能が優れているペプチド、当該ペプチドをリガンドとして有するアフィニティー分離マトリックス、および当該アフィニティー分離マトリックスを用いたκ鎖可変領域含有タンパク質の製造方法を提供することを目的とする。また、本発明は、当該ペプチドをコードするＤＮＡ、当該ＤＮＡを含むベクター、および当該ベクターにより形質転換された形質転換体を提供することも目的とする。ペプトストレプトコッカス・マグヌス３１２株由来プロテインＬのＢ５ドメインまたはその一部を含むペプチドを利用することによって、上記課題を解決する。
Description
本発明は、免疫グロブリンのκ鎖可変領域に対する結合能が極めて優れている免疫グロブリンのκ鎖可変領域含有タンパク質結合性ペプチドをリガンドとして有するアフィニティー分離マトリックス、当該アフィニティー分離マトリックスを用いる免疫グロブリンのκ鎖可変領域含有ペプチドの製造方法、当該ペプチドをコードするＤＮＡ、当該ＤＮＡを含むベクター、および当該ベクターにより形質転換された形質転換体に関するものである。
タンパク質の重要な機能の一つとして、特定の分子に特異的に結合する機能が挙げられる。この機能は、生体内における免疫反応やシグナル伝達に重要な役割を果たす。この機能を有用物質の分離精製に利用する技術開発も盛んになされている。実際に産業的に利用されている一例として、抗体医薬を動物細胞培養物から一度に高い純度で精製（キャプチャリング）するために利用されるプロテインＡアフィニティー分離マトリックス（以下、プロテインＡを「ＳｐＡ」と略記する場合がある）が挙げられる（非特許文献１，２）。
抗体医薬として開発されているのは基本的にモノクローナル抗体であり、組換え培養細胞技術等を用いて大量に生産されている。「モノクローナル抗体」とは、単一の抗体産生細胞に由来するクローンから得られた抗体を指す。現在上市されている抗体医薬のほとんどは、分子構造的には免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）サブクラスである。また、免疫グロブリンを断片化した分子構造を有する抗体誘導体（断片抗体）からなる抗体医薬も盛んに臨床開発されており、様々な断片抗体医薬の臨床開発が進んでいる（非特許文献３）。
抗体医薬製造工程における初期精製工程には、先述のＳｐＡアフィニティー分離マトリックスが利用されている。しかし、ＳｐＡは基本的にＩｇＧのＦｃ領域に特異的に結合するタンパク質である。よって、Ｆｃ領域を含まない断片抗体は、ＳｐＡアフィニティー分離マトリックスを利用したキャプチャリングができない。従って、抗体医薬精製プロセスのプラットフォーム開発の観点から、ＩｇＧのＦｃ領域を含まない断片抗体をキャプチャリング可能なアフィニティー分離マトリックスに対する産業的なニーズは高い。
ＩｇＧのＦｃ領域以外に結合するペプチドはすでに複数知られている（非特許文献４）。それらの中でも、結合できる断片抗体フォーマットの種類の多さ、および、ＩｇＭやＩｇＡなどにも結合可能という観点からは、可変領域（抗原結合ドメイン）に結合できるペプチドが最も好ましく、例えば、プロテインＬ（以下、プロテインＬを「ＰｐＬ」と略記する場合がある）がよく知られている。ＰｐＬは、複数のκ鎖可変領域結合ドメイン（以下、κ鎖可変領域を「ＶＬ−κ」と略記する場合がある）を含むタンパク質であり、個々のＶＬ−κ結合ドメインのアミノ酸配列は異なる。また、菌株の種類によっても、ＶＬ−κ結合ドメインの数、および個々のアミノ酸配列は異なる。例えば、ペプトストレプトコッカス・マグヌス（Ｐｅｐｔｏｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍａｇｎｕｓ）３１２株のＰｐＬに含まれるＶＬ−κ結合ドメインの数は５個であり、ペプトストレプトコッカス・マグヌス株３３１６のＰｐＬに含まれるＶＬ−κ結合ドメインの数は４個である（非特許文献５〜７、特許文献１〜２）。そして、それら計９個のＶＬ−κ結合ドメインの中に、互いに同じアミノ酸配列であるドメインは無い。
ＰｐＬをリガンドとするアフィニティー分離マトリックスもすでに複数市販されている。しかし、ＳｐＡの場合には、特定の１種類の抗体結合ドメインを複数連結した組換えペプチドをリガンドとする研究が進んでいるが（非特許文献１）、ＰｐＬの場合には、個々のＶＬ−κ結合ドメインのアミノ酸配列の違いによる物性・機能の違いに関してはほとんど研究されておらず、改良の余地が残っている。
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上記の状況下、本発明の目的は、免疫グロブリンのκ鎖可変領域に高い親和性を有し、免疫グロブリンκ鎖可変領域含有タンパク質の精製に有用なアフィニティー分離マトリックスを提供することを目的とする。また、本発明は、当該アフィニティー分離マトリックスを用いる免疫グロブリンκ鎖可変領域含有ペプチドの製造方法、当該ペプチドをコードするＤＮＡ、当該ＤＮＡを含むベクター、および当該ベクターにより形質転換された形質転換体を提供することも目的とする。
本発明者らは、上記課題を解決するために、鋭意研究を進めた。その結果、本発明者らは、プロテインＬ（ＰｐＬ）をリガンドとするアフィニティー分離マトリックスを予備的に評価した際に、軽鎖がκ鎖であるにもかかわらず、断片抗体の種類によってクロマトグラフィー・プロファイルが大きく異なることを発見した。具体的には、断片抗体の種類（配列）によって、結合容量が低い、中間洗浄での漏出が見られる、酸溶出時により強い酸が必要といった問題が挙げられる。そこで本発明者らは、ペプトストレプトコッカス・マグヌス３１２株由来および３３１６由来のＰｐＬのＶＬ−κ結合ドメイン計９種を、アフィニティー・リガンドとしての特性に特化して比較検討した結果、３１２株由来ＰｐＬのＢ５ドメインまたはその一部をリガンドとして利用する方法を見出した。
本発明を以下に示す。
［１］ 水不溶性基材とリガンドを含み、
上記リガンドが上記水不溶性基材に固定化されており、
上記リガンドが、ペプトストレプトコッカス・マグヌス３１２株由来プロテインＬのＢ５ドメインまたはその一部を含む抗体κ鎖可変領域結合性ペプチドであることを特徴とするアフィニティー分離マトリックス。
上記リガンドが上記水不溶性基材に固定化されており、
上記リガンドが、ペプトストレプトコッカス・マグヌス３１２株由来プロテインＬのＢ５ドメインまたはその一部を含む抗体κ鎖可変領域結合性ペプチドであることを特徴とするアフィニティー分離マトリックス。
［２］ 上記抗体κ鎖可変領域結合性ペプチドのアミノ酸配列が、以下のアミノ酸配列である上記［１］に記載のアフィニティー分離マトリックス：
（１） 配列番号７または配列番号１６のアミノ酸配列；
（２） 配列番号７または配列番号１６のアミノ酸配列において１以上１０以下のアミノ酸の欠失、置換および／または付加を有し、且つ、抗体κ鎖可変領域への結合能を有するアミノ酸配列；
（３） 配列番号７または配列番号１６のアミノ酸配列に対して８５％以上の配列相同性を有し、且つ、抗体κ鎖可変領域への結合能を有するアミノ酸配列。
（１） 配列番号７または配列番号１６のアミノ酸配列；
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（３） 配列番号７または配列番号１６のアミノ酸配列に対して８５％以上の配列相同性を有し、且つ、抗体κ鎖可変領域への結合能を有するアミノ酸配列。
［３］ 上記抗体κ鎖可変領域結合性ペプチドのアミノ酸配列が、配列番号７のアミノ酸配列において、第１７位がグルタミン酸、第１９位がイソロイシン、第２０位がチロシン、第２２位がグルタミン酸、第２５位がトレオニン、第２６位がバリン、第３０位がトレオニン、第５０位がセリン、第５３位がヒスチジンであるアミノ酸配列である上記［２］に記載のアフィニティー分離マトリックス。
［４］ 上記抗体κ鎖可変領域結合性ペプチドのアミノ酸配列が、配列番号１６のアミノ酸配列において、第７位がグルタミン酸、第９位がイソロイシン、第１０位がチロシン、第１２位がグルタミン酸、第１５位がトレオニン、第１６位がバリン、第２０位がトレオニン、第４０位がセリン、第４３位がヒスチジンであるアミノ酸配列である上記［２］に記載のアフィニティー分離マトリックス。
［５］ 上記抗体κ鎖可変領域結合性ペプチドのアミノ酸配列が、上記アミノ酸配列の２個以上の繰り返しである上記［２］〜［４］のいずれかに記載のアフィニティー分離マトリックス。
［６］ 抗体κ鎖可変領域を含むタンパク質を製造する方法であって、
上記［１］〜［５］のいずれかに記載のアフィニティー分離マトリックスと、抗体κ鎖可変領域を有するタンパク質を含む液体試料とを接触させる工程、および、
上記アフィニティー分離マトリックスに結合した上記タンパク質を、上記アフィニティー分離マトリックスから分離する工程を含むことを特徴とする方法。
上記［１］〜［５］のいずれかに記載のアフィニティー分離マトリックスと、抗体κ鎖可変領域を有するタンパク質を含む液体試料とを接触させる工程、および、
上記アフィニティー分離マトリックスに結合した上記タンパク質を、上記アフィニティー分離マトリックスから分離する工程を含むことを特徴とする方法。
［７］ 上記［１］〜［５］のいずれかに記載の抗体κ鎖可変領域結合性ペプチドをコードすることを特徴とするＤＮＡ。
［８］ 上記［７］に記載のＤＮＡを含むことを特徴とするベクター。
［９］ 上記［８］に記載のベクターにより形質転換されたものであることを特徴とする形質転換体。
本発明に係るアフィニティー分離マトリックスにより、精製可能な断片抗体の種類を拡張することが可能となる為、産業用精製プロセス構築時のプラットフォーム開発がより容易となる。特に、ペプトストレプトコッカス・マグヌス３１２株由来Ｂ５ドメインは、特許文献１や非特許文献４では、主にＢ１〜Ｂ４ドメインからなるコンストラクトを中心に研究されていたため、Ｂ５ドメインやその一部を含むリガンドを固定化したアフィニティー分離マトリックスが上記のような特性を有していることは、驚くべき効果といえる。
本発明に係るアフィニティー分離マトリックスは、水不溶性基材とリガンドを含み、上記リガンドが上記水不溶性基材に固定化されており、上記リガンドが、ペプトストレプトコッカス・マグヌス３１２株由来プロテインＬのＢ５ドメインまたはその一部を含む免疫グロブリンκ鎖可変領域結合性ペプチドであることを特徴とする。本発明に係るアフィニティー分離マトリックスは、様々な免疫グロブリンκ鎖可変領域に対して親和性を示し、例えば断片抗体の精製に有用である。
「免疫グロブリン（ＩｇＧ）」は、リンパ球のＢ細胞が産生する糖タンパク質であり、特定のタンパク質などの分子を認識して結合する働きを持つ。免疫グロブリンは、この特定の分子（抗原）に特異的に結合する機能と、他の生体分子や細胞と協同して抗原を有する因子を無毒化・除去する機能を有する。免疫グロブリンは、一般的に「抗体」と呼ばれるが、それはこのような機能に着目した名称である。全ての免疫グロブリンは、基本的には同じ分子構造からなり、“Ｙ”字型の４本鎖構造（軽鎖・重鎖の２本のポリペプチド鎖が２本ずつ）を基本構造としている。軽鎖（Ｌ鎖）には、λ鎖とκ鎖の２種類があり、すべての免疫グロブリンはこのどちらかを持つ。重鎖（Ｈ鎖）には、γ鎖、μ鎖、α鎖、δ鎖、ε鎖という構造の異なる５種類があり、この重鎖の違いによって免疫グロブリンの種類（アイソタイプ）が変わる。免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）は、単量体型の免疫グロブリンで、２本の重鎖（γ鎖）と２本の軽鎖から構成され、２箇所の抗原結合部位を持っている。
免疫グロブリンの“Ｙ”字の下半分の縦棒部分にあたる場所をＦｃ領域と呼び、上半分の“Ｖ”字の部分をＦａｂ領域と呼ぶ。Ｆｃ領域は抗体が抗原に結合した後の反応を惹起するエフェクター機能を有し、Ｆａｂ領域は抗原と結合する機能を有する。重鎖のＦａｂ領域とＦｃ領域はヒンジ部でつながっており、パパイヤに含まれるタンパク分解酵素パパインは、このヒンジ部を分解して２つのＦａｂ領域（断片）と１つのＦｃ領域に切断する。Ｆａｂ領域のうち“Ｙ”字の先端に近い部分（ドメイン）は、多様な抗原に結合できるように、アミノ酸配列に多彩な変化が見られるため、可変領域（Ｖ領域）と呼ばれている。軽鎖の可変領域をＶＬ領域、重鎖の可変領域をＶＨ領域と呼ぶ。Ｖ領域以外のＦａｂ領域とＦｃ領域は、比較的変化の少ない領域であり、定常領域（Ｃ領域）と呼ばれる。軽鎖の定常領域をＣＬ領域と呼び、重鎖の定常領域をＣＨ領域と呼ぶが、ＣＨ領域はさらにＣＨ１〜ＣＨ３の３つに分けられる。重鎖のＦａｂ領域はＶＨ領域とＣＨ１からなり、重鎖のＦｃ領域はＣＨ２とＣＨ３からなる。ヒンジ部はＣＨ１とＣＨ２の間に位置する。プロテインＬは、軽鎖がκ鎖である可変領域（本明細書では「ＶＬ−κ」と略記する場合がある）に結合する（非特許文献５〜７）。
本発明に係るＦａｂ領域結合性ペプチドは、免疫グロブリンのκ鎖可変領域（ＶＬ−κ領域）に結合する。本発明ペプチドが結合すべきＶＬ−κ領域含有タンパク質は、ＶＬ−κ領域を含むものであればよく、Ｆａｂ領域とＦｃ領域を不足なく含有するＩｇＧであってもよいし、ＩｇＭ、ＩｇＤおよびＩｇＡなどの他のＩｇ類であってもよいし、それらをタンパク質工学的に改変した免疫グロブリン分子の誘導体であってもよい。本発明に係るＶＬ−κ領域結合性ペプチドが結合する免疫グロブリン分子誘導体は、ＶＬ−κ領域を有する誘導体であれば特に制限されない。例えば、免疫グロブリンＧのＦａｂ領域のみに断片化されたＦａｂフラグメント、免疫グロブリンＧの可変領域のみからなるｓｃＦｖ、ヒト免疫グロブリンＧの一部のドメインを他生物種の免疫グロブリンＧのドメインに置き換えて融合させたキメラ型免疫グロブリンＧ、Ｆｃ領域の糖鎖に分子改変を加えた免疫グロブリンＧ、薬剤を共有結合したｓｃＦｖ断片などを挙げることができる。
本発明において「ペプチド」とは、ポリペプチド構造を有するあらゆる分子を含むものであって、いわゆるタンパク質のみならず、断片化されたものや、ペプチド結合によって他のペプチドが連結されたものも包含されるものとする。「ドメイン」とは、タンパク質の高次構造上の単位であり、数十から数百のアミノ酸残基配列から構成され、なんらかの物理化学的または生物化学的な機能を発現するに十分なペプチドの単位をいう。タンパク質やペプチドの「変異体」は、野生型のタンパク質やペプチドの配列に対し、アミノ酸レベルで、少なくとも１つ以上の置換、付加または欠失が導入されたタンパク質またはペプチドをいう。アミノ酸を置換する変異の表記について、置換位置の番号の前に、野生型または非変異型のアミノ酸を付し、置換位置の番号の後に、変異したアミノ酸を付して表記する。例えば、２９位のＧｌｙをＡｌａに置換する変異は、Ｇ２９Ａと記載する。
本発明に係るアフィニティー分離マトリックスは、水不溶性基材とリガンドを含む。本発明において「水不溶性担体」とは、ペプチドの溶液に用いられる水溶媒に対して不溶性を示し、且つリガンドを担持することにより、リガンドへ特異的に結合するペプチドの精製に用いることができるものをいう。
本発明に用いる水不溶性担体としては、ガラスビーズ、シリカゲルなどの無機担体；架橋ポリビニルアルコール、架橋ポリアクリレート、架橋ポリアクリルアミド、架橋ポリスチレンなどの合成高分子や；結晶性セルロース、架橋セルロース、架橋アガロース、架橋デキストランなどの多糖類からなる有機担体；さらにはこれらの組み合わせによって得られる有機−有機、有機−無機などの複合担体などが挙げられる。市販品としては、多孔質セルロースゲルであるＧＣＬ２０００、アリルデキストランとメチレンビスアクリルアミドを共有結合で架橋したＳｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ−１０００、アクリレート系の担体であるＴｏｙｏｐｅａｒｌ、アガロース系の架橋担体であるＳｅｐｈａｒｏｓｅ ＣＬ４Ｂ、および、セルロース系の架橋担体であるＣｅｌｌｕｆｉｎｅなどを例示することができる。但し、本発明における水不溶性担体は、例示したこれらの担体のみに限定されるものではない。
また、本発明に用いる水不溶性担体は、本アフィニティー分離マトリックスの使用目的および方法からみて、表面積が大きいことが望ましく、適当な大きさの細孔を多数有する多孔質であることが好ましい。担体の形態としては、ビーズ状、モノリス状、繊維状、膜状（中空糸を含む）などいずれも可能であり、任意の形態を選ぶことができる。
本発明において「リガンド」とは、抗原と抗体の結合に代表される、分子間の特異的な親和力に基づいて、ある分子の集合から目的の分子を選択的に捕集（結合）する物質や官能基を指す用語であり、本発明においては、免疫グロブリンに対して特異的に結合するペプチドを指す。本発明においては、単に「リガンド」と表記した場合も、「アフィニティーリガンド」と同意である。
本発明は、本発明ペプチドを、免疫グロブリンやその断片、特にＶＬ−κ領域に親和性を有することを特徴とするアフィニティーリガンドとして利用することも、実施形態の１つとして包含する。同様に、当該リガンドを水不溶性担体に固定化したことを特徴とするアフィニティー分離マトリックスも、実施形態の１つとして包含する。
本発明に係るリガンドは、ペプトストレプトコッカス・マグヌス株３１２由来プロテインＬのＢ５ドメインまたはその一部を含む抗体κ鎖可変領域結合性ペプチドである。
「プロテインＬ（ＰｐＬ）」は、ペプトストレプトコッカス属（Ｐｅｐｔｏｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）に属する嫌気性グラム陽性球菌の細胞壁に由来するタンパク質である。本発明では、ペプトストレプトコッカス・マグヌス（Ｐｅｐｔｏｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍａｇｎｕｓ）に由来するＰｐＬであり、ペプトストレプトコッカス・マグヌス３１２株、および、ペプトストレプトコッカス・マグヌス３３１６株に由来する２種類のＰｐＬが好ましく、３１２株に由来するＰｐＬを特に好ましく用いる。なお、本明細書では、ペプトストレプトコッカス・マグヌス３１２株のＰｐＬを「ＰｐＬ３１２」、ペプトストレプトコッカス・マグヌス３３１６株由来のＰｐＬを「ＰｐＬ３３１６」と略記することがある。ＰｐＬ３１２のアミノ酸配列を配列番号１に、ＰｐＬ３３１６のアミノ酸配列を配列番号２に示す（シグナル配列も含む）。
ＰｐＬは、タンパク質中に７０〜８０残基からなる複数のＶＬ−κ結合性ドメインを含有する。ＰｐＬ３１２に含まれるＶＬ−κ結合性ドメインの数は５個であり、ＰｐＬ３３１６に含まれるＶＬ−κ結合性ドメインの数は４個である。ＰｐＬ３１２のＶＬ−κ結合性ドメインは、Ｎ末端から順に、Ｂ１ドメイン（配列番号３）、Ｂ２ドメイン（配列番号４）、Ｂ３ドメイン（配列番号５）、Ｂ４ドメイン（配列番号６）、Ｂ５ドメイン（配列番号７）と呼び、ＰｐＬ３３１６のＶＬ−κ結合ドメインは、Ｎ末端から順に、Ｃ１ドメイン（配列番号８）、Ｃ２ドメイン（配列番号９）、Ｃ３ドメイン（配列番号１０）、Ｃ４ドメイン（配列番号１１）と呼ぶ（非特許文献５〜６）。本明細書で示される、ＰｐＬ３１２のＢ５ドメインのアミノ酸配列は、配列番号７で示されるアミノ酸配列であることが好ましい。
また、ＶＬ−κ結合性ドメインのＮ末端の約２０残基は特定の二次構造を取らないことが研究によって分かっており、Ｎ末端を欠失させた場合にも、ＶＬ−κ結合ドメインとして、三次元構造を保持し、ＶＬ−κ結合性を示す（非特許文献７）。例えば、Ｂ１ドメインに関しては配列番号１２のアミノ酸配列、Ｂ２ドメインに関しては配列番号１３のアミノ酸配列、Ｂ３ドメインに関しては配列番号１４のアミノ酸配列、Ｂ４ドメインに関しては配列番号１５のアミノ酸配列、Ｂ５ドメインに関しては配列番号１６のアミノ酸配列、Ｃ１ドメインに関しては配列番号１７のアミノ酸配列、Ｃ２ドメインに関しては配列番号１８のアミノ酸配列、Ｃ３ドメインに関しては配列番号１９のアミノ酸配列、Ｃ４ドメインに関しては配列番号２０のアミノ酸配列で示されるペプチドも、ＶＬ−κ結合性ドメインとして機能する。本明細書で示される、ＰｐＬ３１２のＢ５ドメインのアミノ酸配列は、配列番号１６で示されるアミノ酸配列であることも好ましい。
また、配列番号１〜２のアミノ酸配列のＮ末端および／またはＣ末端の数残基を欠失させたアミノ酸配列であっても、本発明の範囲に含まれる。欠失させる残基数は、好ましくは、１以上５以下であり、より好ましくは１以上４以下であり、さらにより好ましくは１以上３以下であり、さらにより好ましくは１または２であり、さらにより好ましくは１である。
本発明においてペプチドが「（特定の）アミノ酸配列を有する」とは、そのペプチドのアミノ酸配列が特定されたアミノ酸配列を含んでいればよく、且つ、そのペプチドの機能が維持されていることを意味する。そのペプチドにおいて特定されたアミノ酸配列以外の配列としては、シグナルペプチド、ヒスチジンタグ、固定化のためのリンカー配列の他、ジスルフィド結合などの架橋構造などが挙げられる。
また、実施形態の１つとして、本発明により得られるＶＬ−κ領域結合性ペプチドが、１つの構成成分として、機能の異なる他のペプチドと融合されていることを特徴とする融合ペプチドが挙げられる。当該他のペプチドとしては、例えば、アルブミン、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、シグナルペプチド、ヒスチジンタグなどを挙げることができるが、これに限定されるものではない。また、ＤＮＡアプタマーなどの核酸、抗生物質などの薬物、ＰＥＧ（ポリエチレングリコール）などの高分子が融合されている場合も、本発明で得られたペプチドの有用性を利用するものであれば、本発明に包含される。
本発明で用いる上記抗体κ鎖可変領域結合性ペプチドのアミノ酸配列としては、具体的には、例えば、以下のアミノ酸配列（１）〜（３）を挙げることができる。
（１） 配列番号７または配列番号１６のアミノ酸配列；
（２） 配列番号７または配列番号１６のアミノ酸配列において１以上１０以下のアミノ酸の欠失、置換および／または付加を有し、且つ、抗体κ鎖可変領域への結合能を有するアミノ酸配列；
（３） 配列番号７または配列番号１６のアミノ酸配列に対して８５％以上の配列相同性を有し、且つ、抗体κ鎖可変領域への結合能を有するアミノ酸配列。
（１） 配列番号７または配列番号１６のアミノ酸配列；
（２） 配列番号７または配列番号１６のアミノ酸配列において１以上１０以下のアミノ酸の欠失、置換および／または付加を有し、且つ、抗体κ鎖可変領域への結合能を有するアミノ酸配列；
（３） 配列番号７または配列番号１６のアミノ酸配列に対して８５％以上の配列相同性を有し、且つ、抗体κ鎖可変領域への結合能を有するアミノ酸配列。
本発明の上記アミノ酸配列（２）において、アミノ酸の欠失などの数としては、８以下、６以下または５以下が好ましく、４以下または３以下がより好ましく、２以下がさらに好ましく、１が特に好ましい。
本発明の上記アミノ酸配列（３）において、「上記（１）に規定されるアミノ酸配列に対して８５％以上の相同性を有するアミノ酸配列」における「配列同一性」は、当該アミノ酸配列の相同性を有するペプチドが抗体κ鎖可変領域への結合能を有する限り、特に限定されない。前記アミノ酸配列の相同性は８５％以上であれば特に限定されないが、８６％以上、８８％以上または９０％以上が好ましく、９２％以上、９４％以上または９５％以上がより好ましく、９６％以上、９８％以上または９９％以上がさらに好ましく、９９．５％以上または９９．８％以上が特に好ましい。本発明において「配列の相同性」という語は、２以上のアミノ酸配列の互いに対するアミノ酸の同一性の程度を指す。従って、ある二つのアミノ酸配列の同一性が高い程、それらの配列の同一性ないし類似性は高い。２種類のアミノ酸配列が特定の相同性を有するか否かは、配列の直接の比較によって解析することが可能であり、具体的には、アミノ酸配列多重アラインメント用プログラムであるＣｌｕｓｔａｌ（http://www.clustal.org/omega/）や市販の配列解析ソフトウェア等を用いて解析することができる。
上記アミノ酸配列（２）および（３）において、「抗体κ鎖可変領域への結合能を有する」とは、例えば、後記の実施例２（２）におけるバイオセンサーを用いたＩｇＧ−Ｆａｂに対する親和性試験において、少なくともコントロールに比してＩｇＧ−Ｆａｂに対する親和性の向上が認められることをいう。
また、本発明で用いる上記抗体κ鎖可変領域結合性ペプチドのアミノ酸配列としては、具体的には、例えば、配列番号７のアミノ酸配列において、第１７位がグルタミン酸、第１９位がイソロイシン、第２０位がチロシン、第２２位がグルタミン酸、第２５位がトレオニン、第２６位がバリン、第３０位がトレオニン、第５０位がセリン、第５３位がヒスチジンであるアミノ酸配列、および、配列番号１６のアミノ酸配列において、第７位がグルタミン酸、第９位がイソロイシン、第１０位がチロシン、第１２位がグルタミン酸、第１５位がトレオニン、第１６位がバリン、第２０位がトレオニン、第４０位がセリン、第４３位がヒスチジンであるアミノ酸配列を好ましい例として挙げることができる。
ＰｐＬは、ＶＬ−κ領域結合ドメインが４個または５個タンデムに並んだ形で含まれるタンパク質である。従って、本発明に係るＶＬ−κ領域結合性ペプチドも、実施形態の１つとして、単量体または単ドメインである当該ＶＬ−κ領域結合性ペプチドが２個以上、好ましくは３個以上、より好ましくは４個以上、より好ましくは５個以上連結された複数ドメインの多量体であってもよい。連結されるドメイン数の上限としては、１０個以下が挙げられ、好ましくは８個以下、より好ましくは６個以下である。これらの多量体は、単一のＶＬ−κ領域結合性ペプチドの連結体であるホモダイマー、ホモトリマー等のホモポリマーであってもよいし、ＰｐＬ３１２のＢ１〜Ｂ４ドメイン、および、ＰｐＬ３３１６のＣ１〜Ｃ４ドメインのいずれも含まなければ、複数種類のＶＬ−κ領域結合性ペプチドの連結体であるヘテロダイマー、ヘテロトリマー等のヘテロポリマーであってもよい。
本発明に係る単量体ペプチドの連結のされ方としては、１または複数のアミノ酸残基で連結する方法、および、アミノ酸残基を挟まず直接連結する方法が挙げられるが、これらの方法に限定されるものではない。連結するアミノ酸残基数に特に制限は無いが、好ましくは２０残基以下であり、より好ましくは１５残基以下であり、さらにより好ましくは１０残基以下であり、さらにより好ましくは５残基以下であり、さらにより好ましくは２残基以下である。これらのアミノ酸配列は、単量体ペプチドの３次元立体構造を不安定化しないものが好ましい。
本発明に係るアフィニティー分離マトリックスでは、上記リガンドが上記水不溶性基材に固定化されている。
上記リガンドは、直接またはリンカー基を介して、共有結合により上記水不溶性基材に固定化されている。当該リンカー基としては、例えば、Ｃ1-6アルキレン基、アミノ基（−ＮＨ−）、エーテル基（−Ｏ−）、カルボニル基（−Ｃ（＝Ｏ）−）、エステル基（−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−または−ＯＣ（＝Ｏ）−）、アミド基（−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ−または−ＮＨＣ（＝Ｏ）−）、ウレア基（−ＮＨＣ（＝Ｏ）ＮＨ−）；Ｃ1-6アルキレン基、アミノ基、エーテル基、カルボニル基、エステル基、アミド基およびウレア基からなる群より選択される２以上１０以下の基が連結された基；アミノ基、エーテル基、カルボニル基、エステル基、アミド基およびウレア基からなる群より選択される基を一端または両端に有するＣ1-6アルキレン基を挙げることができる。上記の連結数としては、８以下または６以下が好ましく、５以下がより好ましく、４以下がさらに好ましい。また、上記Ｃ1-6アルキレン基は、水酸基などの置換基などにより置換されていてもよい。
本発明に係るアフィニティー分離マトリックスは、上記リガンドを上記水不溶性担体に固定化することにより製造することができる。
リガンドの固定化方法については、例えば、リガンドに存在するアミノ基、カルボキシル基またはチオール基を利用した、従来のカップリング法で担体に結合してよい。カップリング法としては、臭化シアン、エピクロロヒドリン、ジグリシジルエーテル、トシルクロライド、トレシルクロライド、ヒドラジンまたは過ヨウ素酸ナトリウムなどと担体とを反応させて担体を活性化するか、或いは担体表面に反応性官能基を導入し、リガンドとして固定化する化合物とカップリング反応を行い固定化する方法、また、担体とリガンドとして固定化する化合物が存在する系にカルボジイミドのような縮合試薬、または、グルタルアルデヒドのように分子中に複数の官能基を持つ試薬を加えて縮合、架橋することによる固定化方法が挙げられる。
また、リガンドと担体の間にスペーサー分子を導入してもよいし、担体にリガンドを直接固定化してもよい。従って、固定化のために、本発明に係るＶＬ−κ領域結合性ペプチドを化学修飾してもよいし、固定化に有用なアミノ酸残基を加えてもよい。固定化に有用なアミノ酸としては、側鎖に固定化の化学反応に有用な官能基を有しているアミノ酸が挙げられ、例えば、側鎖にアミノ基を含むＬｙｓや、側鎖にチオール基を含むＣｙｓが挙げられる。本発明の本質は、本発明においてペプチドに付与したＶＬ−κ領域結合性が、当該ペプチドをリガンドとして固定化したマトリックスにおいても同様に付与されることにあり、固定化のためにいかように修飾・改変しても、本発明の範囲に含まれる。
本発明のアフィニティー分離マトリックスを利用して、免疫グロブリンのκ鎖可変領域を含むタンパク質（ＶＬ−κ含有タンパク質）を含むペプチドをアフィニティーカラム・クロマトグラフィ精製法により分離精製することが可能となる。これらのＶＬ−κ含有タンパク質の精製法は、免疫グロブリンのアフィニティーカラム・クロマトグラフィ精製法、例えばＳｐＡアフィニティー分離マトリックスを利用した精製法に準じる手順により達成することができる（非特許文献１）。
具体的には、本発明に係るＶＬ−κ含有タンパク質の製造方法は、上記アフィニティー分離マトリックスと、ＶＬ−κ含有タンパク質を含む液体試料とを接触させる工程、および、上記アフィニティー分離マトリックスに結合した上記タンパク質を、上記アフィニティー分離マトリックスから分離する工程を含むことを特徴とする。
より詳しくは、ＶＬ−κ含有タンパク質を含有する緩衝液を調製（ｐＨは中性付近）した後、当該溶液を本発明のアフィニティー分離マトリックスを充填したアフィニティーカラムに通過させ、ＶＬ−κ含有タンパク質を吸着させる。次いで、アフィニティーカラムに純粋な緩衝液を適量通過させ、カラム内部を洗浄する。この時点では所望のＶＬ−κ含有タンパク質はカラム内の本発明のアフィニティー分離マトリックスに吸着されている。そして、本発明のアフィニティー分離マトリックスは、このサンプル添加の工程からマトリックス洗浄の工程において、目的とするＶＬ−κ含有タンパク質を吸着保持する性能に優れる。次いで、適切なｐＨに調整した酸性緩衝液をカラムに通液し、所望のＶＬ−κ含有タンパク質を溶出することにより、高純度な精製が達成される。ペプチドを溶出するために用いられる上記酸性緩衝液には、マトリックスからの解離を促進する物質を添加してもよい。
本発明のアフィニティー分離マトリックスは、リガンド化合物や担体の基材が完全に機能を損なわない程度の、適当な強酸性、または、強アルカリ性の純粋な再生用緩衝液を通過させて洗浄することにより、再利用が可能である。上記の再生用緩衝液には、適当な変性剤や有機溶剤を配合してもよい。
本発明は、上記抗体κ鎖可変領域結合性ペプチドをコードするＤＮＡにも関する。本発明ペプチドをコードするＤＮＡは、その塩基配列を翻訳したアミノ酸配列が、当該ペプチドを構成するものであればいずれでもよい。かかる塩基配列としては、例えば、配列番号２１の塩基配列を挙げることができる。そのような塩基配列は、通常用いられる公知の方法、例えば、ポリメラーゼ・チェーン・リアクション（以下、「ＰＣＲ」と略記する）法を利用して取得できる。また、公知の化学合成法で合成することも可能であり、さらに、ＤＮＡライブラリーから得ることもできる。当該塩基配列は、コドンが縮重コドンで置換されていてもよく、翻訳されたときに同一のアミノ酸をコードしている限り、本来の塩基配列と同一である必要性は無い。当該塩基配列を一つ又はそれ以上有する組換えＤＮＡ、または、当該組換えＤＮＡを含む、プラスミドおよびファージなどのベクター、さらには、当該ＤＮＡを有するベクターにより形質転換された形質転換微生物／細胞、または、当該ＤＮＡを導入した遺伝子改変生物、または、当該ＤＮＡを転写の鋳型ＤＮＡとする無細胞タンパク質合成系を得ることができる。
また、本発明に係るＶＬ−κ領域結合性ペプチドは、タンパク質発現を補助する作用または精製を容易にするという利点がある公知のタンパク質との融合ペプチドとして取得することができる。即ち、本発明に係るＶＬ−κ領域結合性ペプチドを含む融合ペプチドをコードする組換えＤＮＡを少なくとも一つ含有する微生物、または、細胞を得ることができる。上記タンパク質の例としては、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）等が挙げられるが、それらのタンパク質に限定されるものではない。
本発明のペプチドをコードするＤＮＡを改変するための部位特異的な変異の導入は、以下のように、組換えＤＮＡ技術、ＰＣＲ法等を用いて行うことができる。
即ち、組換えＤＮＡ技術による変異の導入は、例えば、本発明ペプチドをコードする遺伝子中において、変異導入を希望する目的の部位の両側に適当な制限酵素認識配列が存在する場合に、それら制限酵素認識配列部分を前記制限酵素で切断し、変異導入を希望する部位を含む領域を除去した後、化学合成等によって目的の部位のみに変異導入したＤＮＡ断片を挿入するカセット変異法によって行うことができる。
また、ＰＣＲによる部位特異的変異の導入は、例えば、本発明ペプチドをコードする二本鎖プラスミドを鋳型として、＋鎖および−鎖に相補的な変異を含む２種の合成オリゴプライマーを用いてＰＣＲを行うダブルプライマー法により行うことができる。
また、本発明の単量体ペプチド（１つのドメイン）をコードするＤＮＡを、意図する数だけ直列に連結することにより、多量体ペプチドをコードするＤＮＡを作製することもできる。例えば、多量体ペプチドをコードするＤＮＡの連結方法は、ＤＮＡ配列に適当な制限酵素部位を導入し、制限酵素で断片化した２本鎖ＤＮＡをＤＮＡリガーゼで連結することができる。制限酵素部位は１種類でもよいが、複数の異なる種類の制限酵素部位を導入することもできる。また、多量体ペプチドをコードするＤＮＡにおいて、各々の単量体ペプチドをコードする塩基配列が同一の場合には、宿主にて相同組み換えを誘発する可能性があるので、連結されている単量体ペプチドをコードするＤＮＡの塩基配列間の配列同一性が例えば９０％以下、好ましくは８５％以下、より好ましくは８０％以下、さらにより好ましくは７５％以下であることが好ましい。なお、塩基配列の同一性も、アミノ酸配列と同様に、常法により決定することが可能である。
本発明の「発現ベクター」は、前述した本発明ペプチドまたはその部分アミノ酸配列をコードする塩基配列、およびその塩基配列に作動可能に連結された宿主で機能しうるプロモーターを含む。通常は、本発明ペプチドをコードする遺伝子を、適当なベクターに連結もしくは挿入することにより得ることができ、遺伝子を挿入するためのベクターは、宿主中で自律複製可能なものであれば特に限定されず、プラスミドＤＮＡやファージＤＮＡをベクターとして用いることができる。例えば、大腸菌を宿主として用いる場合には、ｐＱＥ系ベクター（キアゲン社）、ｐＥＴ系ベクター（メルク社）およびｐＧＥＸ系ベクター（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社）のベクターなどが挙げられる。
本発明の形質転換細胞は、宿主となる細胞へ本発明の組換えベクターを導入することにより得ることができる。宿主への組換え体ＤＮＡの導入方法としては、例えばカルシウムイオンを用いる方法、エレクトロポレーション法、スフェロプラスト法、酢酸リチウム法、アグロバクテリウム感染法、パーティクルガン法およびポリエチレングリコール法などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。また、得られた遺伝子の機能を宿主で発現する方法としては、本発明で得られた遺伝子をゲノム（染色体）に組み込む方法なども挙げられる。宿主となる細胞については、特に限定されるものではないが、安価に大量生産する上では、大腸菌、枯草菌、ブレビバチルス属、スタフィロコッカス属、ストレプトコッカス属、ストレプトマイセス属（Streptomyces）、コリネバクテリウム属（Corynebacterium）等のバクテリア（真正細菌）を好適に使用しうる。
本発明に係るＶＬ−κ領域結合性ペプチドは、前記した形質転換細胞を培地で培養し、培養菌体中（菌体ぺリプラズム領域中も含む）、または、培養液中（菌体外）に本発明のペプチドを生成蓄積させ、該培養物から所望のペプチドを採取することにより製造することができる。また、本発明ペプチドは、前記した形質転換細胞を培地で培養し、培養菌体中（菌体ぺリプラズム領域中も含む）、または、培養液中（菌体外）に、本発明ペプチドを含む融合ペプチドを生成蓄積させ、当該培養物から当該融合ペプチドを採取し、当該融合ペプチドを適切なプロテアーゼによって切断し、所望のペプチドを採取することにより製造することができる。
本発明の形質転換細胞を培地で培養する方法は、宿主の培養に用いられる通常の方法に従って行われる。得られた形質転換体の培養に用いる培地は、本発明ペプチドを高効率、高収量で生産できるものであれば特に制限は無い。具体的には、グルコース、蔗糖、グリセロール、ポリペプトン、肉エキス、酵母エキス、カザミノ酸などの炭素源や窒素源を使用することができる。その他、カリウム塩、ナトリウム塩、リン酸塩、マグネシウム塩、マンガン塩、亜鉛塩、鉄塩等の無機塩類が必要に応じて添加される。栄養要求性の宿主細胞を用いる場合は、生育に要求される栄養物質を添加すればよい。また、必要であればペニシリン、エリスロマイシン、クロラムフェニコール、ネオマイシンなどの抗生物質が添加されてもよい。
さらに、菌体内外に存在する宿主由来のプロテアーゼによる当該目的ペプチドの分解を抑えるために、公知の各種プロテアーゼ阻害剤、すなわち、Ｐｈｅｎｙｌｍｅｔｈａｎｅ ｓｕｌｆｏｎｙｌ ｆｌｕｏｒｉｄｅ（ＰＭＳＦ）、Ｂｅｎｚａｍｉｄｉｎｅ、４−（２−ａｍｉｎｏｅｔｈｙｌ）−ｂｅｎｚｅｎｅｓｕｌｆｏｎｙｌ ｆｌｕｏｒｉｄｅ（ＡＥＢＳＦ）、Ａｎｔｉｐａｉｎ、Ｃｈｙｍｏｓｔａｔｉｎ、Ｌｅｕｐｅｐｔｉｎ、Ｐｅｐｓｔａｔｉｎ Ａ、Ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｏｎ、Ａｐｒｏｔｉｎｉｎ、Ｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅｔｅｔｒａ ａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ（ＥＤＴＡ）および／またはその他市販されているプロテアーゼ阻害剤を適当な濃度で添加してもよい。
さらに、本発明に係るＶＬ−κ領域結合性ペプチドを正しくフォールディングさせるために、例えば、ＧｒｏＥＬ／ＥＳ、Ｈｓｐ７０／ＤｎａＫ、Ｈｓｐ９０、Ｈｓｐ１０４／ＣｌｐＢなどの分子シャペロンを利用してもよい（例えば、共発現、または、融合タンパク質化などの手法で、本発明のペプチドと共存させる）。なお、本発明ペプチドの正しいフォールディングを目的とする場合には、正しいフォールディングを助長する添加剤を培地中に加える、および、低温にて培養するなどの手法もあるが、これらに限定されるものではない。
大腸菌を宿主として得られた形質転換細胞を培養する培地としては、ＬＢ培地（トリプトン１％，酵母エキス０．５％，ＮａＣｌ１％）、または、２×ＹＴ培地（トリプトン １．６％，酵母エキス１．０％，ＮａＣｌ０．５％）等が挙げられる。
また、培養温度は、例えば１５〜４２℃、好ましくは２０〜３７℃で、通気攪拌条件で好気的に数時間〜数日培養することにより本発明ペプチドを、培養細胞内（ぺリプラズム領域内を含む）、または、培養溶液（細胞外）に蓄積させて回収する。場合によっては、通気を遮断し嫌気的に培養してもよい。組換えペプチドが分泌生産される場合には、培養終了後に、遠心分離、ろ過などの一般的な分離方法で、培養細胞と分泌生産されたペプチドを含む上清を分離することにより生産された組換えペプチドを回収することができる。また、培養細胞内（ぺリプラズム領域内を含む）に蓄積される場合にも、例えば、培養液から遠心分離、ろ過などの方法により菌体を採取し、次いで、この菌体を超音波破砕法、フレンチプレス法などにより破砕し、および／または、界面活性剤等を添加して可溶化することにより、細胞内に蓄積生産されたペプチドを回収することができる。
本発明に係るペプチドの精製はアフィニティークロマトグラフィー、陽イオンまたは陰イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー等を単独でまたは適宜組み合わせることによって行うことができる。得られた精製物質が目的のペプチドであることの確認は、通常の方法、例えばＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動、Ｎ末端アミノ酸配列分析、ウエスタンブロッティング等により行うことができる。
本願は、２０１５年１月２６日に出願された日本国特許出願第２０１５−１２６６３号に基づく優先権の利益を主張するものである。２０１５年１月２６日に出願された日本国特許出願第２０１５−１２６６３号の明細書の全内容が、本願に参考のため援用される。
以下、実施例に基づいて本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
以下の実施例で取得した変異ペプチドは「ペプチド名−導入した変異」の形で表記し、変位を導入しない野生型ペプチドは「ペプチド名−Ｗｉｌｄ」の形で表記する。例えば、配列番号７で示される野生型ＰｐＬ３１２のＢ５ドメインは「ＬＢ５−Ｗｉｌｄ」で示す。また、単ドメインを複数連結したタンパク質については、ピリオドに続けて連結した数に「ｄ」をつけて併記し、単ドメインは「１ｄ」と表記する。さらに、本実施例においては、二次構造を取らないことが分かっているＮ末端領域を欠失させた配列番号１６で示されるＰｐＬ３１２のＢ５ドメインを実験でメインに利用しており、これを配列番号７と区別するため、「ＬＢ５ｔ−Ｗｉｌｄ」と表記する。
実施例１： ＰｐＬ３１２のＮ末端領域欠失型Ｂ５ドメイン（ＬＢ５ｔ−Ｗｉｌｄ．１ｄ）の調製
（１） 発現プラスミド調製
ＬＢ５ｔ−Ｗｉｌｄ．１ｄ（配列番号１６）のアミノ酸配列から逆翻訳を行い、当該ペプチドをコードする塩基配列（配列番号２１）を設計した。次に、発現プラスミドの作製方法を図１に示す。ＬＢ５ｔ−Ｗｉｌｄ．１ｄをコードするＤＮＡは、同じ制限酵素サイトを有する２種の二本鎖ＤＮＡ（ｆ１とｆ２）を連結する形で調製し、発現ベクターのマルチクローニングサイトに組み込む。実際には、２種の二本鎖ＤＮＡと発現ベクターの計３種の二本鎖ＤＮＡを連結する３断片ライゲーションによって、コードＤＮＡ調製とベクター組込みを同時に実施した。２種の二本鎖ＤＮＡの調製方法は、互いに３０塩基程度の相補領域を含む２種の一本鎖オリゴＤＮＡ（ｆ１−１／ｆ１−２、または、ｆ２−１／ｆ２−２）を、オーバーラップＰＣＲによって伸長し、目的の二本鎖ＤＮＡを調製した。具体的な実験操作については、次の通りとなる。一本鎖オリゴＤＮＡｆ１−１（配列番号２２）／ｆ１−２（配列番号２３）を外注によって合成し（シグマジェノシス社）、ポリメラーゼとしてＰｙｒｏｂｅｓｔ（タカラバイオ社）を用い、オーバーラップＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応生成物をアガロース電気泳動にかけ、目的のバンドを切り出すことで抽出した二本鎖ＤＮＡを、制限酵素ＢａｍＨＩとＨｉｎｄＩＩＩ（いずれもタカラバイオ社）により切断した。同様に、一本鎖オリゴＤＮＡｆ２−１（配列番号２４）／ｆ２−２（配列番号２５）を外注によって合成し、オーバーラップＰＣＲ反応を経て、合成・抽出した二本鎖ＤＮＡを、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩとＥｃｏＲＩ（いずれもタカラバイオ社）により切断した。次に、プラスミドベクターｐＧＥＸ−６Ｐ−１（ＧＥヘルスケア・バイオサイエンス社）のマルチクローニングサイト中のＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＩサイトに上記２種の二本鎖ＤＮＡをサブクローニングした。サブクローニングにおけるライゲーション反応は、Ｌｉｇａｔｉｏｎ ｈｉｇｈ（ＴＯＹＯＢＯ社）を用いて、製品に添付のプロトコルに準ずる形で実施した。
（１） 発現プラスミド調製
ＬＢ５ｔ−Ｗｉｌｄ．１ｄ（配列番号１６）のアミノ酸配列から逆翻訳を行い、当該ペプチドをコードする塩基配列（配列番号２１）を設計した。次に、発現プラスミドの作製方法を図１に示す。ＬＢ５ｔ−Ｗｉｌｄ．１ｄをコードするＤＮＡは、同じ制限酵素サイトを有する２種の二本鎖ＤＮＡ（ｆ１とｆ２）を連結する形で調製し、発現ベクターのマルチクローニングサイトに組み込む。実際には、２種の二本鎖ＤＮＡと発現ベクターの計３種の二本鎖ＤＮＡを連結する３断片ライゲーションによって、コードＤＮＡ調製とベクター組込みを同時に実施した。２種の二本鎖ＤＮＡの調製方法は、互いに３０塩基程度の相補領域を含む２種の一本鎖オリゴＤＮＡ（ｆ１−１／ｆ１−２、または、ｆ２−１／ｆ２−２）を、オーバーラップＰＣＲによって伸長し、目的の二本鎖ＤＮＡを調製した。具体的な実験操作については、次の通りとなる。一本鎖オリゴＤＮＡｆ１−１（配列番号２２）／ｆ１−２（配列番号２３）を外注によって合成し（シグマジェノシス社）、ポリメラーゼとしてＰｙｒｏｂｅｓｔ（タカラバイオ社）を用い、オーバーラップＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応生成物をアガロース電気泳動にかけ、目的のバンドを切り出すことで抽出した二本鎖ＤＮＡを、制限酵素ＢａｍＨＩとＨｉｎｄＩＩＩ（いずれもタカラバイオ社）により切断した。同様に、一本鎖オリゴＤＮＡｆ２−１（配列番号２４）／ｆ２−２（配列番号２５）を外注によって合成し、オーバーラップＰＣＲ反応を経て、合成・抽出した二本鎖ＤＮＡを、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩとＥｃｏＲＩ（いずれもタカラバイオ社）により切断した。次に、プラスミドベクターｐＧＥＸ−６Ｐ−１（ＧＥヘルスケア・バイオサイエンス社）のマルチクローニングサイト中のＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＩサイトに上記２種の二本鎖ＤＮＡをサブクローニングした。サブクローニングにおけるライゲーション反応は、Ｌｉｇａｔｉｏｎ ｈｉｇｈ（ＴＯＹＯＢＯ社）を用いて、製品に添付のプロトコルに準ずる形で実施した。
上記プラスミドベクターｐＧＥＸ−６Ｐ−１を用いて、コンピテント細胞（タカラバイオ社「大腸菌ＨＢ１０１」）の形質転換を、本コンピテント細胞製品に付属のプロトコルに従って行った。上記プラスミドベクターｐＧＥＸ−６Ｐ−１を用いれば、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（以下、「ＧＳＴ」と略記する）が融合したＬＢ５ｔ−Ｗｉｌｄ．１ｄを産生することができる。次いで、プラスミド精製キット（プロメガ社製「Wizard Plus SV Minipreps DNA Purification System」）を用い、キット付属の標準プロトコルに従って、プラスミドＤＮＡを増幅し、抽出した。発現プラスミドのコードＤＮＡの塩基配列確認は、ＤＮＡシークエンサー（Applied Biosystems社製「3130xl Genetic Analyzer」）を用いて行った。遺伝子解析キット（Applied Biosystems社製「BigDye Terminator v.1.1 Cycle Sequencing Kit）と、プラスミドベクターｐＧＥＸ−６Ｐ−１のシークエンシング用ＤＮＡプライマー（ＧＥヘルスケア・バイオサイエンス社）を用いて、添付のプロトコルに従いシークエンシングＰＣＲ反応を行った。そのシークエンシング産物を、プラスミド精製キット（Applied Biosystems社製「BigDye XTerminator Purification Kit」）を用いて、添付のプロトコルに従い精製し、塩基配列解析に用いた。
（２） ペプチドの発現・精製
上記（１）で得られた、ＬＢ５ｔ−Ｗｉｌｄ．１ｄ遺伝子を導入した形質転換細胞を、アンピシリン含有２×ＹＴ培地にて、３７℃で終夜培養した。これらの培養液を、１００倍量程度のアンピシリン含有２×ＹＴ培地に接種し、３７℃で約２時間培養した後で、終濃度０．１ｍＭになるようイソプロピル１−チオ−β−Ｄ−ガラクシド（以下、「ＩＰＴＧ」と略記する）を添加し、さらに３７℃にて１８時間培養した。
上記（１）で得られた、ＬＢ５ｔ−Ｗｉｌｄ．１ｄ遺伝子を導入した形質転換細胞を、アンピシリン含有２×ＹＴ培地にて、３７℃で終夜培養した。これらの培養液を、１００倍量程度のアンピシリン含有２×ＹＴ培地に接種し、３７℃で約２時間培養した後で、終濃度０．１ｍＭになるようイソプロピル１−チオ−β−Ｄ−ガラクシド（以下、「ＩＰＴＧ」と略記する）を添加し、さらに３７℃にて１８時間培養した。
培養終了後、遠心にて集菌し、ＰＢＳ緩衝液５ｍＬに再懸濁した。超音波破砕にて細胞を破砕し、遠心分離して上清画分（無細胞抽出液）と不溶性画分に分画した。ｐＧＥＸ−６Ｐ−１ベクターのマルチクローニングサイトに目的の遺伝子を導入すると、ＧＳＴがＮ末端に付与した融合ペプチドとして発現される。それぞれの画分をＳＤＳ電気泳動により分析したところ、各々の形質転換細胞培養液から調製した各種無細胞抽出液のすべてについて、分子量約２５，０００以上の位置にＩＰＴＧにより誘導されたと考えられるペプチドのバンドを確認した。
ＧＳＴ融合ペプチドを含む各々の無細胞抽出液から、ＧＳＴに対して親和性のあるＧＳＴｒａｐ ＦＦカラム（ＧＥヘルスケア・バイオサイエンス社）を用いたアフィニティークロマトグラフィーにて、ＧＳＴ融合ペプチドを粗精製した。各々の無細胞抽出液をＧＳＴｒａｐ ＦＦカラムに添加し、標準緩衝液（２０ｍＭ ＮａＨ2ＰＯ4−Ｎａ2ＨＰＯ4，１５０ｍＭ ＮａＣｌ，ｐＨ７．４）にてカラムを洗浄し、続いて溶出用緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，２０ｍＭグルタチオン，ｐＨ８．０）にて目的のＧＳＴ融合ペプチドを溶出した。
ｐＧＥＸ−６Ｐ−１ベクターのマルチクローニングサイトに遺伝子を導入すると、配列特異的プロテアーゼＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎ Ｐｒｏｔｅａｓｅ（ＧＥヘルスケア・バイオサイエンス社）でＧＳＴを切断することが可能なアミノ酸配列が、ＧＳＴと目的ペプチドの間に導入される。ＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎ Ｐｒｏｔｅａｓｅを用いて、添付プロトコルに従いＧＳＴ切断反応を行った。このようにＧＳＴを切断した形でアッセイに利用したサンプルから、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ７５ １０／３００ ＧＬカラム（ＧＥヘルスケア・バイオサイエンス社）を用いたゲルろ過クロマトグラフィーにて、目的のペプチドの精製を行った。標準緩衝液にて平衡化したＳｕｐｅｒｄｅｘ ７５ １０／３００ ＧＬカラムに、各々の反応溶液を添加し、目的のペプチドを、切断したＧＳＴやＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎ Ｐｒｏｔｅａｓｅから分離精製した。
なお、以上のカラムを用いたクロマトグラフィーによるペプチド精製は、全てＡＫＴＡ ｐｒｉｍｅ ｐｌｕｓシステム（ＧＥヘルスケア・バイオサイエンス社）を利用して実施した。また、本実施例で得られるＧＳＴ切断後の各々のペプチドのＮ末端側には、ベクターｐＧＥＸ−６Ｐ−１由来のＧｌｙ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒが付加される。
実施例２： ＬＢ５ｔ−Ｗｉｌｄ．１ｄのＩｇＧ−Ｆａｂへの親和性評価
（１） ＩｇＧ由来Ｆａｂフラグメント（ＩｇＧ−Ｆａｂ）の調製
ヒト化モノクローナルＩｇＧ製剤を原料として、これをパパインによって、ＦａｂフラグメントとＦｃフラグメントに断片化し、Ｆａｂフラグメントのみを分離精製することで調製した。今回調製したＦａｂは計６種類であり、各々のＦａｂについて、名称、原料となるヒト化モノクローナルＩｇＧ製剤などを表１にまとめた。
（１） ＩｇＧ由来Ｆａｂフラグメント（ＩｇＧ−Ｆａｂ）の調製
ヒト化モノクローナルＩｇＧ製剤を原料として、これをパパインによって、ＦａｂフラグメントとＦｃフラグメントに断片化し、Ｆａｂフラグメントのみを分離精製することで調製した。今回調製したＦａｂは計６種類であり、各々のＦａｂについて、名称、原料となるヒト化モノクローナルＩｇＧ製剤などを表１にまとめた。
ここでは、抗ＲＳＶモノクローナル抗体（一般名「パリビズマブ」）由来のＩｇＧ−Ｆａｂの調製方法を代表的に示す。なお、明細書中において、他のＩｇＧ−Ｆａｂを評価に用いている場合においても、基本的には同様の方法で調製している。具体的には、ヒト化モノクローナルＩｇＧ製剤を、パパイン消化用緩衝液（０．１Ｍ ＡｃＯＨ−ＡｃＯＮａ，２ｍＭ ＥＤＴＡ，１ｍＭシステイン，ｐＨ５．５）に溶解し、パパイン固定化アガロース（ＳＩＧＭＡ社「Ｐａｐａｉｎ Ａｇａｒｏｓｅ ｆｒｏｍ ｐａｐａｙａ ｌａｔｅｘ」）を添加し、ローテーターで混和させながら、３７℃で約８時間インキュベートした。パパイン固定化アガロースから分離した反応溶液（ＦａｂフラグメントとＦｃフラグメントが混在）から、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅカラム（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社）を利用したアフィニティークロマトグラフィーにより、素通り画分でＩｇＧ−Ｆａｂを回収することで分離精製した。分取したＩｇＧ−Ｆａｂ溶液を、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ７５ １０／３００ ＧＬカラム（平衡化および分離には標準緩衝液を使用）を用いたゲルろ過クロマトグラフィーにて精製し、ＩｇＧ−Ｆａｂ溶液を得た。なお、実施例１と同様に、クロマトグラフィーによるペプチド精製は、ＡＫＴＡｐｒｉｍｅ ｐｌｕｓシステムを利用して実施した。
（２） ＬＢ５ｔ−Ｗｉｌｄ．１ｄのＩｇＧ−Ｆａｂに対する親和性の解析
表面プラズモン共鳴を利用したバイオセンサーＢｉａｃｏｒｅ３０００（ＧＥヘルスケア・バイオサイエンス社）を用いて、実施例１（２）で取得したＬＢ５ｔ−Ｗｉｌｄ．１ｄの計６種ＩｇＧ−Ｆａｂとの親和性を解析した。本実施例では、実施例２（１）で取得したＩｇＧ−Ｆａｂをセンサーチップに固定化し、各種ペプチドをチップ上に流して、両者の相互作用を検出した。ＩｇＧ−ＦａｂのセンサーチップＣＭ５への固定化は、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）、および、Ｎ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）を用いたアミンカップリング法にて行い、ブロッキングにはエタノールアミンを用いた（センサーチップや固定化用試薬は、全てＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）。ＩｇＧ−Ｆａｂ溶液は、固定化用緩衝液（１０ｍＭ ＣＨ3ＣＯＯＨ−ＣＨ3ＣＯＯＮａ，ｐＨ４．５）を用いて１０倍程度に希釈し、Ｂｉａｃｏｒｅ ３０００付属のプロトコルに従い、センサーチップへ固定した。また、チップ上の別のフローセルに対して、ＥＤＣ／ＮＨＳにより活性化した後にヒト血清アルブミン（和光純薬社製）を固定化する処理を行うことで、ネガティブ・コントロールとなるリファレンスセルも用意した。ＬＢ５ｔ−Ｗｉｌｄ．１ｄは、ランニング緩衝液（２０ｍＭ ＮａＨ2ＰＯ4−Ｎａ2ＨＰＯ4，１５０ｍＭ ＮａＣｌ，０．００５％ Ｐ−２０，ｐＨ７．４）を用いて、０．０１、０．１、１、１０μＭに濃度を調整したタンパク質溶液を、流速４０μＬ／ｍｉｎで１分間センサーチップに添加した。測定温度２５℃にて、添加時（結合相、１分）、および、添加終了後（解離相、１分）の結合反応曲線を順次観測した。各々の観測終了後に、約２０ｍＭ ＮａＯＨを添加して洗浄した。得られた結合反応曲線（リファレンスセルの結合反応曲線を差し引いた結合反応曲線）に対して、システム付属ソフトＢＩＡ ｅｖａｌｕａｔｉｏｎを用いた１：１の結合モデルによるフィッティング解析を行い、ヒトＩｇＧ−Ｆａｂに対する親和定数（ＫA＝ｋon／ｋoff）を算出した。解析結果を表２に示す。
表面プラズモン共鳴を利用したバイオセンサーＢｉａｃｏｒｅ３０００（ＧＥヘルスケア・バイオサイエンス社）を用いて、実施例１（２）で取得したＬＢ５ｔ−Ｗｉｌｄ．１ｄの計６種ＩｇＧ−Ｆａｂとの親和性を解析した。本実施例では、実施例２（１）で取得したＩｇＧ−Ｆａｂをセンサーチップに固定化し、各種ペプチドをチップ上に流して、両者の相互作用を検出した。ＩｇＧ−ＦａｂのセンサーチップＣＭ５への固定化は、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）、および、Ｎ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）を用いたアミンカップリング法にて行い、ブロッキングにはエタノールアミンを用いた（センサーチップや固定化用試薬は、全てＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）。ＩｇＧ−Ｆａｂ溶液は、固定化用緩衝液（１０ｍＭ ＣＨ3ＣＯＯＨ−ＣＨ3ＣＯＯＮａ，ｐＨ４．５）を用いて１０倍程度に希釈し、Ｂｉａｃｏｒｅ ３０００付属のプロトコルに従い、センサーチップへ固定した。また、チップ上の別のフローセルに対して、ＥＤＣ／ＮＨＳにより活性化した後にヒト血清アルブミン（和光純薬社製）を固定化する処理を行うことで、ネガティブ・コントロールとなるリファレンスセルも用意した。ＬＢ５ｔ−Ｗｉｌｄ．１ｄは、ランニング緩衝液（２０ｍＭ ＮａＨ2ＰＯ4−Ｎａ2ＨＰＯ4，１５０ｍＭ ＮａＣｌ，０．００５％ Ｐ−２０，ｐＨ７．４）を用いて、０．０１、０．１、１、１０μＭに濃度を調整したタンパク質溶液を、流速４０μＬ／ｍｉｎで１分間センサーチップに添加した。測定温度２５℃にて、添加時（結合相、１分）、および、添加終了後（解離相、１分）の結合反応曲線を順次観測した。各々の観測終了後に、約２０ｍＭ ＮａＯＨを添加して洗浄した。得られた結合反応曲線（リファレンスセルの結合反応曲線を差し引いた結合反応曲線）に対して、システム付属ソフトＢＩＡ ｅｖａｌｕａｔｉｏｎを用いた１：１の結合モデルによるフィッティング解析を行い、ヒトＩｇＧ−Ｆａｂに対する親和定数（ＫA＝ｋon／ｋoff）を算出した。解析結果を表２に示す。
比較例２の解析結果も反映し、他のＶＬ−κ結合ドメインのＩｇＧ−Ｆａｂ結合力と比較する形でまとめたグラフを図２に示した。
表２と図２、および後記の表３と表４に示す結果のとおり、ＬＢ５ｔ−Ｗｉｌｄ．１ｄは、ａＲＳＶ−Ｆａｂ、ａＴＮＦａ−Ｆａｂなど、いくつかのＦａｂに対して、他のドメインよりも高い結合力を示した。このような事実は今まで知られておらず、驚くべき結果であるといえる。特に、ａＴＮＦａ−ＦａｂやａＥＧＦＲ−Ｆａｂなど、全体的に結合力が弱い（一部のＶＬ−κ結合ドメインに関しては結合が検出できない）傾向にあるＦａｂ類に対して、試験されたペプチドの中で最も強い結合を示したことは、Ｂ５ドメインをベースとしたリガンドを固定化したアフィニティー分離マトリックスが対応可能なＦａｂの種類を拡大できる可能性を示す結果といえる。
比較例１： ＰｐＬの他のＮ末端領域欠失型ＶＬ−κ結合ドメインの調製
Ｎ末端を欠失させたＰｐＬ３１２のＢ５ドメイン（ＬＢ５ｔ−Ｗｉｌｄ．１ｄ）の比較対象として、Ｂ１〜Ｂ４およびＣ１〜Ｃ４ドメインのＮ末端領域欠失型のコンストラクトを調製した。各々のコンストラクト名とアミノ酸配列番号は、ＬＢ１ｔ−Ｗｉｌｄ．１ｄ（配列番号１２）、ＬＢ２ｔ−Ｗｉｌｄ．１ｄ（配列番号１３）、ＬＢ３ｔ−Ｗｉｌｄ．１ｄ（配列番号１４）、ＬＢ４ｔ−Ｗｉｌｄ．１ｄ（配列番号１５）、ＬＣ１ｔ−Ｗｉｌｄ．１ｄ（配列番号１７）、ＬＣ２ｔ−Ｗｉｌｄ．１ｄ（配列番号１８）、ＬＣ３ｔ−Ｗｉｌｄ．１ｄ（配列番号１９）、および、ＬＣ４ｔ−Ｗｉｌｄ．１ｄ（配列番号２０）となる。各々に関して、実施例１と同様の手法にて、発現プラスミド・形質転換細胞を調製し、培養・精製を経て、各種タンパク質溶液を調製した。なお、制限酵素に関して、ＨｉｎｄＩＩＩ以外の制限酵素を用いた場合もあったが、詳細は省略する。
Ｎ末端を欠失させたＰｐＬ３１２のＢ５ドメイン（ＬＢ５ｔ−Ｗｉｌｄ．１ｄ）の比較対象として、Ｂ１〜Ｂ４およびＣ１〜Ｃ４ドメインのＮ末端領域欠失型のコンストラクトを調製した。各々のコンストラクト名とアミノ酸配列番号は、ＬＢ１ｔ−Ｗｉｌｄ．１ｄ（配列番号１２）、ＬＢ２ｔ−Ｗｉｌｄ．１ｄ（配列番号１３）、ＬＢ３ｔ−Ｗｉｌｄ．１ｄ（配列番号１４）、ＬＢ４ｔ−Ｗｉｌｄ．１ｄ（配列番号１５）、ＬＣ１ｔ−Ｗｉｌｄ．１ｄ（配列番号１７）、ＬＣ２ｔ−Ｗｉｌｄ．１ｄ（配列番号１８）、ＬＣ３ｔ−Ｗｉｌｄ．１ｄ（配列番号１９）、および、ＬＣ４ｔ−Ｗｉｌｄ．１ｄ（配列番号２０）となる。各々に関して、実施例１と同様の手法にて、発現プラスミド・形質転換細胞を調製し、培養・精製を経て、各種タンパク質溶液を調製した。なお、制限酵素に関して、ＨｉｎｄＩＩＩ以外の制限酵素を用いた場合もあったが、詳細は省略する。
比較例２： 各種Ｎ末端領域欠失型ＶＬ−κ結合ドメインのＩｇＧ−Ｆａｂへの親和性評価
比較例１で調製した各種Ｎ末端領域欠失型ＶＬ−κ結合ドメインに関し、実施例２（１）で調製した計６種ＩｇＧ−Ｆａｂとの親和性を、実施例２（２）と同様の手法にて解析した。その解析結果を、表３と表４に示す。
比較例１で調製した各種Ｎ末端領域欠失型ＶＬ−κ結合ドメインに関し、実施例２（１）で調製した計６種ＩｇＧ−Ｆａｂとの親和性を、実施例２（２）と同様の手法にて解析した。その解析結果を、表３と表４に示す。
表３，４に示す結果のとおり、ペプトストレプトコッカス・マグヌス由来のＢ１〜Ｂ４ドメインとＣ１〜Ｃ４ドメインは、特定のＦａｂ領域に対して高い親和性を示すことがあるものの、他のＦａｂ領域に対して親和性を示さないか或いは親和性が非常に低かった。それに対して、表２に示す結果のとおり、本発明に係るペプトストレプトコッカス・マグヌス由来のＢ５ドメインは、試験したすべてのＦａｂ領域に対して押し並べて高い親和性を示した。よって、本発明に係るＢ５ドメインは、Ｆａｂ領域を含むペプチドの精製に有用であることが明らかとなった。
実施例３： ＰｐＬ３１２のＢ５ドメインの４ドメイン型（ＬＢ５ｔ−Ｗｉｌｄ．４ｄ）の調製
配列番号１に示されるＰｐＬ３１２に含まれるＶＬ−κ結合ドメイン間のアミノ酸配列を利用し、配列番号１６で示されるＢ５ドメインのアミノ酸配列を４個連結した配列番号２６のアミノ酸配列（「ＬＢ５ｔ−Ｗｉｌｄ．４ｄ」）を設計した。ＬＢ５ｔ−Ｗｉｌｄ．４ｄ（配列番号２６）のアミノ酸配列から逆翻訳を行い、当該ペプチドをコードする塩基配列（配列番号２７）を設計した。配列番号２７のＤＮＡの５’末端にＰｓｔＩ認識サイト、３’末端にＸｂａＩ認識サイトを付与したＤＮＡ（配列番号２８）の人工合成遺伝子を、ユーロフィンジェノミクス社への外注によって全合成した。このサブクローニング後の発現プラスミドを、制限酵素ＰｓｔＩおよびＸｂａＩ（タカラバイオ社）で消化し、取得したＤＮＡ断片を、同じ制限酵素で消化したブレビバチルス発現用ベクターｐＮＣＭＯ２（タカラバイオ社）へライゲーションし、ＬＢ５ｔ−Ｗｉｌｄ．４ｄのアミノ酸配列をコードするＤＮＡがブレビバチルス発現用ベクターｐＮＣＭＯ２に挿入された発現プラスミドを調製した。なおライゲーション反応は、Ｌｉｇａｔｉｏｎ ｈｉｇｈ（ＴＯＹＯＢＯ社）を用いて、製品に添付のプロトコルに準ずる形で実施し、プラスミドの調製にはエシェリヒア・コリＪＭ１０９株（タカラバイオ社）を用いた。各々の発現プラスミドＤＮＡ塩基配列の確認は、ＤＮＡシークエンサー３１３０ｘｌ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いて行った。ＢｉｇＤｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ ｖ．１．１ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いて、付属のプロトコルに従い、各々のプラスミドＤＮＡのシークエンシングＰＣＲ反応を行い、そのシークエンシング産物をプラスミド精製キット（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社，「ＢｉｇＤｙｅ ＸＴｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ」）を用いて添付のプロトコルに従い精製し、配列解析に用いた。
配列番号１に示されるＰｐＬ３１２に含まれるＶＬ−κ結合ドメイン間のアミノ酸配列を利用し、配列番号１６で示されるＢ５ドメインのアミノ酸配列を４個連結した配列番号２６のアミノ酸配列（「ＬＢ５ｔ−Ｗｉｌｄ．４ｄ」）を設計した。ＬＢ５ｔ−Ｗｉｌｄ．４ｄ（配列番号２６）のアミノ酸配列から逆翻訳を行い、当該ペプチドをコードする塩基配列（配列番号２７）を設計した。配列番号２７のＤＮＡの５’末端にＰｓｔＩ認識サイト、３’末端にＸｂａＩ認識サイトを付与したＤＮＡ（配列番号２８）の人工合成遺伝子を、ユーロフィンジェノミクス社への外注によって全合成した。このサブクローニング後の発現プラスミドを、制限酵素ＰｓｔＩおよびＸｂａＩ（タカラバイオ社）で消化し、取得したＤＮＡ断片を、同じ制限酵素で消化したブレビバチルス発現用ベクターｐＮＣＭＯ２（タカラバイオ社）へライゲーションし、ＬＢ５ｔ−Ｗｉｌｄ．４ｄのアミノ酸配列をコードするＤＮＡがブレビバチルス発現用ベクターｐＮＣＭＯ２に挿入された発現プラスミドを調製した。なおライゲーション反応は、Ｌｉｇａｔｉｏｎ ｈｉｇｈ（ＴＯＹＯＢＯ社）を用いて、製品に添付のプロトコルに準ずる形で実施し、プラスミドの調製にはエシェリヒア・コリＪＭ１０９株（タカラバイオ社）を用いた。各々の発現プラスミドＤＮＡ塩基配列の確認は、ＤＮＡシークエンサー３１３０ｘｌ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いて行った。ＢｉｇＤｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ ｖ．１．１ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いて、付属のプロトコルに従い、各々のプラスミドＤＮＡのシークエンシングＰＣＲ反応を行い、そのシークエンシング産物をプラスミド精製キット（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社，「ＢｉｇＤｙｅ ＸＴｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ」）を用いて添付のプロトコルに従い精製し、配列解析に用いた。
ブレビバチルス・チョウシネンシスＳＰ３株（タカラバイオ社）を得られたプラスミドで形質転換し、ＬＢ５ｔ−Ｗｉｌｄ．４ｄを分泌生産する遺伝子組換え体を育種した。この遺伝子組換え体を６０μｇ／ｍＬのネオマイシンを含む３０ｍＬのＡ培地（ポリペプトン ３．０％，酵母エキス ０．５％，グルコース ３％，硫酸マグネシウム ０．０１％，硫酸鉄 ０．００１％，塩化マンガン ０．００１％，塩化亜鉛 ０．０００１％）にて、３０℃で３日間の振盪培養を行った。培養後、培養液を１５，０００ｒｐｍ、２５℃で５分間遠心分離することにより菌体を分離した。
得られた培養上清から、ＵｎｏＳｐｈｅｒｅ Ｓ（バイオラッド社）を利用した陽イオン交換クロマトグラフィーにて、ＬＢ５ｔ−Ｗｉｌｄ．４ｄを精製した。ＵｎｏＳｐｈｅｒｅ ＳはＴｒｉｃｏｒｎ １０／２００（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社）に充填して使用した。具体的には、酢酸ナトリウムを終濃度５０ｍＭになるように添加し、さらに酢酸でｐＨ４．０に調整した培養上清を、陽イオン交換用緩衝液Ａ（５０ｍＭ ＣＨ3ＣＯＯＨ−ＣＨ3ＣＯＯＮａ，ｐＨ４．０）にて平衡化したＵｎｏＳｐｈｅｒｅ Ｓカラムに添加し、陽イオン交換用緩衝液Ａで洗浄後、陽イオン交換緩衝液Ａと陽イオン交換緩衝液Ｂ（５０ｍＭ ＣＨ3ＣＯＯＨ−ＣＨ3ＣＯＯＮａ，１Ｍ ＮａＣｌ，ｐＨ４．０）を利用した塩濃度勾配にて、途中に溶出されるＬＢ５ｔ−Ｗｉｌｄ．４ｄを分取した。次に、Ｎｕｖｉａ Ｑカラム（バイオラッド社）を利用した陰イオン交換クロマトグラフィーにて、ＬＢ５ｔ−Ｗｉｌｄ．４ｄを精製した。Ｎｕｖｉａ ＱはＴｒｉｃｏｒｎ １０／２００（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社）に充填して使用した。具体的には、分取したＬＢ５ｔ−Ｗｉｌｄ．４ｄ溶液を、陰イオン交換用緩衝液Ａ（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８．０）に透析し、陰イオン交換用緩衝液Ａにて平衡化したＮｕｖｉａ Ｑカラムに添加し、陰イオン交換用緩衝液Ａで洗浄後、陰イオン交換緩衝液Ａと陰イオン交換緩衝液Ｂ（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，１．０Ｍ ＮａＣｌ，ｐＨ８．０）を利用した塩濃度勾配にて、途中に溶出されるＬＢ５ｔ−Ｗｉｌｄ．４ｄを分取した。分取したＬＢ５ｔ−Ｗｉｌｄ．４ｄを再び超純水に透析し、ＬＢ５ｔ−Ｗｉｌｄ．４ｄのみを含む水溶液を最終精製サンプルとした。なお、上記のカラムを用いたクロマトグラフィーによるタンパク質精製は、ＡＫＴＡａｖａｎｔ ２５システム（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社）を利用して実施した。
実施例４： ＰｐＬ３１２のＢ５ドメインの４ドメイン型固定化担体の作製
実施例３で調製したＬＢ５ｔ−Ｗｉｌｄ．４ｄを、市販のアガロース担体へ固定化した。この際、ＬＢ５ｔ−Ｗｉｌｄ．４ｄの反応性アミノ酸残基とマレイミドとの結合を利用した。
実施例３で調製したＬＢ５ｔ−Ｗｉｌｄ．４ｄを、市販のアガロース担体へ固定化した。この際、ＬＢ５ｔ−Ｗｉｌｄ．４ｄの反応性アミノ酸残基とマレイミドとの結合を利用した。
具体的には、まず、市販のＮＨＳ活性化担体（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社「ＮＨＳ Ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ」）１．５ｍＬ−ｇｅｌをガラスフィルターに移し、保存溶液であるイソプロパノールを吸引除去した後、氷冷した１ｍＭ塩酸（５ｍＬ）で洗浄した。続いて、カップリング緩衝液（２０ｍＭ ＮａＨ2ＰＯ4−Ｎａ2ＨＰＯ4，１５０ｍＭ塩化ナトリウム，ｐＨ７．２）５ｍＬで担体を洗浄した後、カップリング緩衝液に懸濁させながら担体を回収し遠沈管に移した。カップリング緩衝液で溶解し、１０ｍＭの濃度に調整したＮ−［ε−Ｍａｌｅｉｍｉｄｏｃａｐｒｏｉｃ ａｃｉｄ］ｈｙｄｒａｚｉｄｅ・ＴＦＡ（ＥＭＣＨ，サーモフィッシャーサイエンフィティック社）溶液を担体の入った遠沈管に加え、２５℃で１時間反応させた。その後、担体をガラスフィルターに移し、洗浄緩衝液Ａ（０．５Ｍエタノールアミン，０．５Ｍ塩化ナトリウム，ｐＨ７．２）を１０ｍＬ、カップリング緩衝液を１０ｍＬ、洗浄緩衝液Ａを１０ｍＬの順で担体を洗浄し、２５℃で１５分間静置した。さらにカップリング緩衝液（１０ｍＬ）で担体を洗浄した。ここまでの操作で担体にマレイミドを結合させた。
次に、マレイミドを結合させた担体にＬＢ５ｔ−Ｗｉｌｄ．４ｄを固定化する操作を行った。固定化に使用する前に、ＬＢ５ｔ−Ｗｉｌｄ．４ｄを、１００ｍＭ ＤＴＴ条件下で還元し、さらに脱塩カラム（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社，「ＨｉＴｒａｐ Ｄｅｓａｌｔｉｎｇ」）によるＤＴＴの除去と、カップリング緩衝液へ緩衝液交換をするという前処理を行った。マレイミドを結合させた担体を遠沈管に移し、さらにＬＢ５ｔ−Ｗｉｌｄ．４ｄ溶液を加えて担体を２５℃で２時間反応させた。その後、反応させた担体をガラスフィルターに移し、７ｍＬのカップリング緩衝液で洗浄することで未反応ＬＢ５ｔ−Ｗｉｌｄ．４ｄを回収した。その後、洗浄緩衝液Ｂ（５０ｍＭ Ｌ−システイン，１００ｍＭ ＮａＨ2ＰＯ4−Ｎａ2ＨＰＯ4，０．５Ｍ塩化ナトリウム，ｐＨ７．２）を１０ｍＬ、カップリング緩衝液を１０ｍＬ、洗浄緩衝液Ｂを１０ｍＬの順で担体を洗浄した後、２５℃で１５分間静置した。さらに、カップリング緩衝液１０ｍＬ、超純水１０ｍＬ、２０％エタノール１０ｍＬで担体を洗浄した後、２０％エタノール担体を懸濁、回収することにより、ＬＢ５ｔ−Ｗｉｌｄ．４ｄ固定化担体を得た。
回収した未反応ＬＢ５ｔ−Ｗｉｌｄ．４ｄの２８０ｎｍの吸光度を分光計で測定し、アミノ酸配列から算出した吸光係数から未反応ＬＢ５ｔ−Ｗｉｌｄ．４ｄの量を算出した。ＬＢ５ｔ−Ｗｉｌｄ．４ｄの仕込み量と定量した未反応ＬＢ５ｔ−Ｗｉｌｄ．４ｄの量の差からＬＢ５ｔ−Ｗｉｌｄ．４ｄの固定化量を算出し、さらに担体の体積からリガンド密度を算出した。表５に、作製した担体である試作１のリガンド密度と、比較例３として使用する市販Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌ担体（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社「ＨｉＴｒａｐ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌ」）のリガンド密度をまとめた。
実施例５： ＬＢ５ｔ−Ｗｉｌｄ．４ｄ固定化担体のポリクローナルＦａｂに対する吸着確認
実施例４で作製したＬＢ５ｔ−Ｗｉｌｄ．４ｄ固定化担体の結合特性を確認するために、ヒトポリクローナルＦａｂの吸着確認を行った。ヒトポリクローナルＦａｂとして、ヒトポリクローナル抗体（製品名「ガンマグロブリン」，日本製薬社）由来のポリクローナルＦａｂを調製した。実施例２の（１）に準じて調製したが、ヒトポリクローナル抗体はＰｒｏｔｅｉｎ Ａ担体への非吸着成分を含むため、パパイン消化の前に、ＫＡＮＥＫＡ ＫＡＮＥＫＡ ＫａｎＣａｐＡＴＭカラム（カネカ社）を利用したアフィニティークロマトグラフィーにより、吸着成分のＩｇＧを回収し、回収したＩｇＧについてパパイン消化を行った。
実施例４で作製したＬＢ５ｔ−Ｗｉｌｄ．４ｄ固定化担体の結合特性を確認するために、ヒトポリクローナルＦａｂの吸着確認を行った。ヒトポリクローナルＦａｂとして、ヒトポリクローナル抗体（製品名「ガンマグロブリン」，日本製薬社）由来のポリクローナルＦａｂを調製した。実施例２の（１）に準じて調製したが、ヒトポリクローナル抗体はＰｒｏｔｅｉｎ Ａ担体への非吸着成分を含むため、パパイン消化の前に、ＫＡＮＥＫＡ ＫＡＮＥＫＡ ＫａｎＣａｐＡＴＭカラム（カネカ社）を利用したアフィニティークロマトグラフィーにより、吸着成分のＩｇＧを回収し、回収したＩｇＧについてパパイン消化を行った。
ＬＢ５ｔ−Ｗｉｌｄ．４ｄ固定化担体の結合特性の確認方法の具体的な操作を以下に示す。１ｍＬ−ｇｅｌの担体を充填したＴｒｉｃｏｒｎ ５／５０ ｃｏｌｕｍｎ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社）をクロマトシステムＡＫＴＡａｖａｎｔ ２５に接続し、流速０．２５ｍＬ/ｍｉｎで平衡化緩衝液（２０ｍＭ ＮａＨ2ＰＯ4−Ｎａ2ＨＰＯ4，１５０ｍＭ塩化ナトリウム，ｐＨ７．４）を３ＣＶ流して平衡化した。次に、流速０．２５ｍＬ/ｍｉｎで、１ｍｇ／ｍＬのヒトポリクローナルＦａｂ溶液を３５ｍＬ流した。その後、流速０．２５ｍＬ／ｍｉｎで平衡化緩衝液を１０ＣＶ流し、続いて、溶出緩衝液（５０ｍＭクエン酸，ｐＨ３．０）を１０ＣＶ流し、ヒトポリクローナルＦａｂを溶出した。さらに流速０．２５ｍＬ／ｍｉｎで３ＣＶの平衡化緩衝液を流した後、強洗浄緩衝液（５０ｍＭクエン酸，ｐＨ２．５）を５ＣＶ流し、最後に平衡化緩衝液を５ＣＶ流した。比較例３として市販Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌ担体（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社「ＨｉＴｒａｐ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌ」）も同様の操作を行った。得られたクロマトグラフィチャートを図３に、ヒトポリクローナルＦａｂ負荷工程の拡大クロマトグラフィチャートを図４に示す。
図３の溶出画分（２）を見ると、比較例３と比べて実施例４の担体を用いた場合は明らかにピーク面積が大きい。また、ヒトポリクローナルＦａｂ負荷工程（１）を拡大した図４の差異Ａで示すように、比較例３の担体はヒトポリクローナルＦａｂ負荷時に漏出が継続的に上昇する傾向がある一方で、実施例４の担体では漏出が一定であることが分かる。ヒトポリクローナルＦａｂにはλ鎖可変領域を含むＦａｂが存在するため、λ鎖可変領域を含むＦａｂは比較例３および実施例４の担体には吸着されず、ヒトポリクローナルＦａｂ負荷時には漏出することが分かる。さらに差異Ａは、実施例４の担体には吸着されるが比較例３の担体には吸着されないκ鎖可変領域を含むＦａｂが存在することを示している。そのため、各担体に負荷したヒトポリクローナルＦａｂの量が同じであるにも関わらず、比較例３よりも、実施例４の溶出ピークが大きい、すなわち吸着したＦａｂの量が多いということが分かる。
これらの結果は、本発明の抗体κ鎖可変領域結合性ペプチドをリガンドとしたアフィニティー分離マトリックスは、精製可能な断片抗体の種類の拡張が可能であることを示す結果であるといえる。
実施例６： ＬＢ５ｔ−Ｗｉｌｄ．４ｄ固定化担体のモノクローナルＦａｂに対する結合容量評価
実施例４で作製したＬＢ５ｔ−Ｗｉｌｄ．４ｄ固定化担体について、モノクローナルＦａｂに対する結合容量の評価を行った。モノクローナルＦａｂとしては、実施例２の（１）で調製したａＴＮＦａ−Ｆａｂを平衡化緩衝液（２０ｍＭ ＮａＨ2ＰＯ4−Ｎａ2ＨＰＯ4，１５０ｍＭ 塩化ナトリウム，ｐＨ７．４）で１ｍｇ/ｍＬの濃度に調整した溶液を用いた。
実施例４で作製したＬＢ５ｔ−Ｗｉｌｄ．４ｄ固定化担体について、モノクローナルＦａｂに対する結合容量の評価を行った。モノクローナルＦａｂとしては、実施例２の（１）で調製したａＴＮＦａ−Ｆａｂを平衡化緩衝液（２０ｍＭ ＮａＨ2ＰＯ4−Ｎａ2ＨＰＯ4，１５０ｍＭ 塩化ナトリウム，ｐＨ７．４）で１ｍｇ/ｍＬの濃度に調整した溶液を用いた。
クロマトシステムＡＫＴＡａｖａｎｔ ２５に１ｍＬ−ｇｅｌの担体を充填したＴｒｉｃｏｒｎ ５／５０ ｃｏｌｕｍｎ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社）を接続し、流速０．２５ｍＬ/ｍｉｎで平衡化緩衝液（２０ｍＭ ＮａＨ2ＰＯ4−Ｎａ2ＨＰＯ4，１５０ｍＭ塩化ナトリウム，ｐＨ７．４）を３ＣＶ流して平衡化した。次に、流速０．２５ｍＬ/ｍｉｎでａＴＮＦａ−Ｆａｂ溶液を流し、モニタリング吸光度が１００％Ａｂｓ280の５５％を超えるまで続けた。その後、流速０．２５ｍＬ／ｍｉｎで平衡化緩衝液を１０ＣＶ流し、続いて、溶出緩衝液（５０ｍＭクエン酸，ｐＨ２．５）を３ＣＶ流し、ａＴＮＦａ−Ｆａｂを溶出した。モニタリング吸光度が１００％Ａｂｓ280の５５％を超えたときまでに流したａＴＮＦａ−Ｆａｂの総量をａＴＮＦａ−Ｆａｂに対する５５％ＤＢＣとした。比較例として市販Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌ担体（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社「ＨｉＴｒａｐ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌ」）にも同様の操作を行った。測定結果を表６に示す。
表６に示す結果のとおり、ａＴＮＦａ−Ｆａｂに対する５５％ＤＢＣについて、実施例４の担体は比較例３の担体よりも非常に大きいという結果が得られた。本結果は、比較例３では吸着が困難なκ鎖可変領域を含むＦａｂに対して、本発明の抗体κ鎖可変領域結合性ペプチドをリガンドとしたアフィニティー分離マトリックスは、吸着および精製が可能であることを示すものであるといえる。
Claims (9)
- 水不溶性基材とリガンドを含み、
上記リガンドが上記水不溶性基材に固定化されており、
上記リガンドが、ペプトストレプトコッカス・マグヌス３１２株由来プロテインＬのＢ５ドメインまたはその一部を含む抗体κ鎖可変領域結合性ペプチドであることを特徴とするアフィニティー分離マトリックス。 - 上記抗体κ鎖可変領域結合性ペプチドのアミノ酸配列が、以下のアミノ酸配列である請求項１に記載のアフィニティー分離マトリックス：
（１） 配列番号７または配列番号１６のアミノ酸配列；
（２） 配列番号７または配列番号１６のアミノ酸配列において１以上１０以下のアミノ酸の欠失、置換および／または付加を有し、且つ、抗体κ鎖可変領域への結合能を有するアミノ酸配列；
（３） 配列番号７または配列番号１６のアミノ酸配列に対して８５％以上の配列相同性を有し、且つ、抗体κ鎖可変領域への結合能を有するアミノ酸配列。 - 上記抗体κ鎖可変領域結合性ペプチドのアミノ酸配列が、配列番号７のアミノ酸配列において、第１７位がグルタミン酸、第１９位がイソロイシン、第２０位がチロシン、第２２位がグルタミン酸、第２５位がトレオニン、第２６位がバリン、第３０位がトレオニン、第５０位がセリン、第５３位がヒスチジンであるアミノ酸配列である請求項２に記載のアフィニティー分離マトリックス。
- 上記抗体κ鎖可変領域結合性ペプチドのアミノ酸配列が、配列番号１６のアミノ酸配列において、第７位がグルタミン酸、第９位がイソロイシン、第１０位がチロシン、第１２位がグルタミン酸、第１５位がトレオニン、第１６位がバリン、第２０位がトレオニン、第４０位がセリン、第４３位がヒスチジンであるアミノ酸配列である請求項２に記載のアフィニティー分離マトリックス。
- 上記抗体κ鎖可変領域結合性ペプチドのアミノ酸配列が、上記アミノ酸配列の２個以上の繰り返しである請求項２〜４のいずれかに記載のアフィニティー分離マトリックス。
- 抗体κ鎖可変領域を含むタンパク質を製造する方法であって、
請求項１〜５のいずれかに記載のアフィニティー分離マトリックスと、抗体κ鎖可変領域を有するタンパク質を含む液体試料とを接触させる工程、および、
上記アフィニティー分離マトリックスに結合した上記タンパク質を、上記アフィニティー分離マトリックスから分離する工程を含むことを特徴とする方法。 - 請求項１〜５のいずれかに記載の抗体κ鎖可変領域結合性ペプチドをコードすることを特徴とするＤＮＡ。
- 請求項７に記載のＤＮＡを含むことを特徴とするベクター。
- 請求項８に記載のベクターにより形質転換されたものであることを特徴とする形質転換体。
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Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US20170327535A1 (en) | 2017-11-16 |
| US10858392B2 (en) | 2020-12-08 |
| WO2016121701A1 (ja) | 2016-08-04 |
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