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JP3821846B2 - 組換えアデノウイルス、aavを作製するためのその使用、相補的細胞系、及び、該アデノウイルスを含む医薬組成物 - Google Patents

組換えアデノウイルス、aavを作製するためのその使用、相補的細胞系、及び、該アデノウイルスを含む医薬組成物 Download PDF

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Description

本発明は、新規なウイルスベクター、それらの作製及びそれらの使用に関する。本発明はまた、これらのウイルスベクターを含む医薬組成物に関する。
遺伝子療法は、病気に冒された細胞または器官に遺伝情報を導入することによって欠損または異常(突然変異、異常発現、など)を矯正する治療方法である。遺伝情報を、器官から抽出した細胞にin vitro導入し、修飾された細胞を生物体内に再導入してもよく、または、遺伝情報を適正な組織に直接in vivo導入してもよい。後者の場合には種々の技術が存在しており、特に、DNAとDEAE−デキストランとの複合体(Paganoら,J.Virol.1(1967)891)、DNAと核タンパク質との複合体(Kanedaら,Science243(1989)375)、DNAと脂質との複合体(Felgnerら,PNAS 84(1987)7413)を用いる種々のトランスフェクション技術、及び、リポソームの使用(Fraleyら,J.Biol.Chem.255(1980)10431)などがある。
より最近には、遺伝子導入ベクターとしてウイルスを使用する方法が開発され、物理的トランスフェクション技術に代替し得る有望な方法であると考えられている。この観点から、いくつかの細胞集団に感染するウイルスの能力が種々のウイルスについて試験された。これらのウイルスとしては特に、レトロウイルス(RSV、HMS、MMSなど)、HSVウイルス、アデノ関連ウイルス及びアデノウイルスがある。
アデノウイルスに関してより詳細に考察すると、アデノウイルスは約36kbの大きさの直鎖状二重鎖DNAをもつウイルスである。アデノウイルスのゲノムは特に、各末端に逆方向末端反復配列(ITR、Inverted Terminal Repeat)とキャプシド形成配列と初期遺伝子と後期遺伝子とを含む(図1参照)。主要な初期遺伝子は領域E1、E2、E3及びE4に含まれている。これらの初期遺伝子のうちで、領域E1(特にE1a及びE1b)に含まれている遺伝子はウイルス複製に必要である。領域E4及びL5は例えばウイルス増殖に関与し、主要な後期遺伝子は領域L1〜L5に含まれている。アデノウイルスAd5のゲノムは全配列が決定されており、データベースでアクセスできる(特にGenebank M73260参照)。また、種々の血清型のアデノウイルス(Ad2、Ad7、Ad12、など)のゲノムの一部は配列決定されており、全部が配列決定されているものもある。これらのウイルスベクターの利点は、十分に広い宿主スペクトルを有していること、静止細胞に感染し得ること、感染細胞のゲノムに取り込まれないこと、及び、今日までヒトの重大な疾病に関与したことがないこと、などである。これらの特性を考慮して、アデノウイルスは既に遺伝子のin vivo導入に使用されている。従って、種々の遺伝子(β−gal、OTC、α−1AT、サイトカインなど)を組み込んだアデノウイルスに由来の種々のベクターが作製されている。
勿論、これらのウイルスベクターの集合は、その発現が遺伝子治療に望ましくないという反面性をもつ多数のウイルス遺伝子を含んでいる。従って、野生型ウイルス遺伝子及び/または該遺伝子に由来するタンパク質であって治療対象生物に望ましくないかまたは全面的に有害な免疫応答及び/または炎症応答を誘発し得るような遺伝子がin vivoで発現しないようにコントロールすることが是非とも必要である。
このため、現在提案されているウイルスベクター構築物は、これらのベクターが標的細胞内で自律的に複製できないように修飾されている。これらを欠損ベクターと呼ぶ。従って一般には、少なくともウイルス感染細胞中で該ウイルスが複製されるために必要な配列は欠損ウイルスのゲノムから欠失している。これらの領域は(その全部または一部が)除去されるか、非機能性になっているか、または、別の配列、特に治療的に有効な分子をコードする配列によって置換されている。しかしながら、ウイルス粒子のキャプシド形成に必要な配列は欠損ウイルスのゲノム中に保存されているのが好ましい。
特に組換えアデノウイルスの場合、従来技術に記載されている構築物は一般に、領域E1(E1a及び/またはE1b)及び任意にE3が欠失し、欠失場所にヘテロロガスDNA配列が挿入されたアデノウイルスである(Levreroら,Gene101(1991)195;Gosh−Choudhuryら,Gene50(1986)161)。他の構築物は、領域E1の処及び領域E4の必須でない部分に欠失を含む(WO94/12649)。これらの欠損組換えアデノウイルスは、組換えアデノウイルスの複製に必要なすべての欠損機能を相補し得るコンピテント細胞系を使用または非使用の種々の方法で作製できる。実際、アデノウイルスに由来のベクターは一般に、アデノウイルスゲノムの一部が組み込まれた相補性細胞系(293細胞系)において産生される。より詳細には、293細胞系はアデノウイルス血清型5(Ad5)のゲノムの左端(約11〜12%)を含み、この左端には、左側ITR、キャプシド形成領域、E1aとE1bとを含む領域E1、及び、タンパク質pIXをコードする領域の一部が含まれている。この細胞系は、領域E1に関する欠損組換えアデノウイルス、即ち、領域E1の全部または一部が欠失した組換えアデノウイルスをトランスに相補することが可能である。
しかしながら、これらの欠損ウイルスベクターを作製する際に、E1型の細胞機能によって複製され得るウイルス粒子またはトランス相補性をin vivoで生じるような組換えの可能性を完全に排除することはできない。かかるベクターを後で遺伝子治療に使用するためにはこの種のイベントが全く不適合なことは明らかである。複製可能なウイルス粒子がin vivoに存在するとき、ウイルス増殖を誘発する、または、炎症反応、組換えのような危険を伴うコントロール不能な伝播が生じる、などの極めて有害な結果が予測され得る。
同時に、対応するウイルスタンパク質のin vivo発現を防止することが是非とも必要である。これらのタンパク質は、細胞に対して必ずしも毒性でないとしても、治療対象器官に対して有害な炎症及び/または発熱のタイプの免疫系の応答を誘発し得るので極めて望ましくない(D.Y.Schwarz,(1995),P.N.A.S.92,1401−1405;J.F.Engelhardt,(1994),Human Gene Therapy,5,1217−1229及び(1994)P.N.A.S.91,6196−6200;Y.Yang,(1994),Immunity,1,433−442,(1995)J.Virol,69,2004−2015及びNature Genetics(1994)7,362−369)。
より詳細には本発明の目的は、これらの欠点を解消することである。特に、複製可能なウイルス粒子が除去されたことによって安全性が強化されたアデノウイルス型ウイルスのロットを作製するために有用な解決方法を提案することである。
出願人は意外にも、独自のプロモーター系を用いることによってウイルス遺伝子の発現を有効にコントロールすることができ、in vitroでウイルスを産生するときには発現が生じるが、最終的に組換えウイルスを治療目的でin vivoに使用するときには発現が生じないような反面性が得られることを知見した。
より詳細には本発明は、同種または異種のウイルス起原の少なくとも1つの遺伝子の発現が誘導プロモーターによってコントロールされる組換えアデノウイルスに関する。
本発明で使用される誘導プロモーターなる用語は、その活性が外部の化学物質及び/または生物物質の存在によって開始される任意のプロモーターを意味しており、本発明の範囲においてこれらの物質は更に毒性が軽減されているかあるいは全く無いものを意味する。“外部”なる用語は、化学物質及び/または生物物質が請求の範囲に記載のアデノウイルスによって治療される細胞中に天然には存在しないことを意味する。
本発明で使用され得る誘導プロモーターの例としては特に、重金属に応答するプロモーター(CRC Boca Raton,FL(1991)167−220;Brinsterら,Nature(1982),296,39−42)、熱衝撃に応答するプロモーター、ホルモンに応答するプロモーター(Leeら,P.N.A.S.USA(1988),85,1204−1208;(1981),294,228−232;Klockら,Nature(1987),329,734−736;Israel & Kaufman,Nucleic−Acids Res.(1989),17,2589−2604)、または、グルコース、ラクトース、ガラクトースもしくは抗生物質のタイプの化学物質に応答するプロモーター、のような従来のプロモーターが挙げられる。
極めて最近には、テトラサイクリンによって誘導可能なプロモーターが記載されたが、このプロモーターは本発明の範囲において特に有利である。
テトラサイクリン誘導プロモーターと呼ばれるこのプロモーターは、テトラサイクリンの1つまたは複数のオペレーターに操作(機能)的に結合した最小プロモーターを含む。最小プロモーターの活性化、従って1つまたは複数の関連ウイルス遺伝子の転写を可能にするのは、“転写アクチベーター”と呼ばれるタンパク質がテトラサイクリンのオペレーター配列に結合するからであり、この結合はテトラサイクリンまたはその類似体の1つが存在するときにのみ成立する。
転写アクチベーターと呼ばれるタンパク質に関してより詳細に説明すると、このタンパク質の特徴は、テトラサイクリンの存在下でテトラサイクリンによって誘導可能なプロモーターのオペレーター配列に容易に結合し、最小プロモーターを活性化する能力を有することである。より好ましくは、転写アクチベーターは2つのポリペプチドから成るタンパク質であり、その第一ポリペプチドはテトラサイクリンまたはその1つの類似体の存在下でtetオペレーター配列に結合し、第二ポリペプチドは特に転写を活性化する機能を有している。転写アクチベーターと呼ばれるタンパク質の第一ポリペプチドは、野生型リプレッサーの挙動とは逆の挙動を示すように突然変異したテトラサイクリンのリプレッサーである。即ち、テトラサイクリンの存在下ではtetオペレーターに結合するがテトラサイクリンの非存在下ではtetオペレーターに結合しない。第二ポリペプチドに関しては、このポリペプチドの好適例は単純ヘルペスウイルスのタンパク質16の活性化ドメインである。
使用される誘導プロモーターが例えばグルコースまたはガラクトースによって誘導可能なプロモーターである場合、このモデルに基づいて構築された転写アクチベーター、例えばGlu−VP16またはGal4−VP16を使用し得る。
本発明の好ましい実施態様において使用される誘導プロモーターは上記のようなテトラサイクリンまたはその類似体の1つによって誘導可能なプロモーターである。
本発明で使用されたテトラサイクリン誘導プロモーターなる用語は、テトラサイクリンの少なくとも1つのオペレーター“tetオペレーター”またはその類似体の1つを含む所謂調節配列に操作的に結合された最小プロモーターを意味する。
テトラサイクリンの類似体なる用語は、テトラサイクリンに構造的に相同であり、上記に定義した転写アクチベーターと呼ばれるタンパク質のトランス活性化ドメインに結合したそのレセプターに少なくとも約106-1のKaで結合し得る任意の化合物を意味する。本発明で使用し得る類似体の例としては特に、ドキシサイクリン、クロロテトラサイクリン及びアンヒドロテトラサイクリンがある。
最小プロモーターなる用語は、結合しているDNA配列の転写を単独では有効に確保できないすべてのプロモーター配列を意味する。このようなプロモーターの活性は、テトラサイクリンの存在下の転写アクチベータータンパク質と調節配列との結合に完全に依存していることが判明した。実際、この最小プロモーターの機能は特に、転写の方向を決めることである。この観点から、最小プロモーターは好ましくは、ウイルス配列の上流に存在して該ウイルス配列と共に連続ヌクレオチド配列を形成するように配置されている。
この最小プロモーターはヒトサイトメガロウイルスの初期プロモーターに由来し、より好ましくはヌクレオチド+75〜−53または+75〜−31の間に含まれている。しかしながら例えばチミジンキナーゼをコードする遺伝子の転写を活性化するプロモーターのような従来のプロモーターに由来の最小プロモーターを本発明に使用することも可能である。
更に、結合している遺伝子の転写を単独では有効に確保できないように1つまたは複数の遺伝的突然変異を与えることによって従来のプロモーターを最小プロモーターにしてもよい。本発明ではまた、考察中のウイルス遺伝子の発現を支配する天然のプロモーターに直接由来する最小プロモーターを使用してもよい。また、非誘導状態で可能な限り基底に近いバックグラウンドノイズを得るように、E.MARTINEZら(EMBO Journal,(1994),13,No.13,3115−3126)に記載された所謂“TATA−less”プロモーターを使用してもよい。
一般にこの最小プロモーターは、その発現をコントロールすべきヌクレオチド配列の上流に天然プロモーターに置換してまたは置換しないで配置される。実際、核酸配列の固有プロモーターは、当業者に公知の種々の技術、特に1つもしくは複数の塩基の削除、欠失及び/または付加によって失活形態または非機能性形態で存続し得る。
本発明の特定実施態様によれば、最小プロモーターは、単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼの最小プロモーターに由来する(Mc Knightら(1984)Cell 37:253−262)。従ってこのプロモーターはTkと命名されている。
より好ましくは、このプロモーターの全部または一部は、配列番号1もしくは2またはその誘導体の1つによって示される配列のいずれかで表される。
本発明で使用された“由来の”なる用語は、所与の配列の遺伝的及び/または化学的な修飾によって作製され所望の活性を維持している任意の配列を意味する。遺伝的及び/または化学的な修飾という表現は、1つまたは複数の核酸の突然変異、置換、欠失、付加及び/または修飾を意味する。
所謂調節配列に関しては、調節配列はテトラサイクリンまたはそのいずれか1つの類似体の少なくとも1つのオペレーターを含む。1つまたは複数のオペレーターはテトラサイクリンの存在下で転写アクチベーターによって認識され、その結果として最小プロモーターを活性化し得る。
使用され得るtetオペレーター配列は特に、Hillen & Wissemann(Protein−Nucleic Acid Interaction,Saeger & Heinemann,eds.,Macmillan,London,(1989),10,143−162),Watersら(Nucleic Acids Res.(1983),11,525−539),Stuberら(P.N.A.S.USA,(1981),78,167−171),Ungerら(Nucleic Acids Res.(1984),12,7693−7703)及びTovarら(Mol.Gen.Genet.(1988),215,76−80)によって記載された配列から選択できる。
調節配列は、転写の調節を強化することが望まれるか否かに従ってtetオペレーターの非反復配列を含んでもよくまたは逆にtetオペレーターの複数の配列例えば10個までの配列を含んでもよい。本発明の特定実施態様によれば、調節配列は2つのtetオペレーター配列を使用する。従ってこの配列をOp2と呼ぶ。
より好ましくは、調節配列の全部または一部が配列番号3もしくは4またはそれらの誘導体の1つによって示された配列で表される。
従来は、転写アクチベーターとそのリガンドであるテトラサイクリンとによって形成された複合体の存在下でウイルス起原の遺伝子の転写が行われるように、この調節配列は最小プロモーターの上流、即ち5′末端に操作的に結合されていた。従って5′から3′の方向で、最小プロモーターに直結または非直結の調節配列と最小プロモーターとウイルス起原の遺伝子とがこの順序で存在していた。しかしながらまた、この調節配列を、最小プロモーターの内部で、転写すべきウイルスのヌクレオチド配列の下流、即ち該配列の3′末端に配置することも可能である。この場合には、5′から3′の方向で、最小プロモーター、ウイルス遺伝子、調節配列という順序で存在する。
本発明の好ましい実施態様によれば、テトラサイクリン誘導プロモーターは、Tkと呼ばれるチミジンキナーゼの最小プロモーターに、Op2で表される調節配列を結合させたものである。この特定の場合を以後の記載ではOp2/Tkで表す。より好ましくは、本発明で使用される誘導プロモーターの全部または一部が配列番号5またはその誘導体の1つによって表される。
このテトラサイクリン誘導プロモーターOp2/Tk、特にその全部または一部が配列番号5またはその誘導体の1つによって表されるプロモーターも本発明の目的の1つを構成する。
従って、請求の範囲に記載のアデノウイルスにおいて、誘導プロモーターに操作的に結合した1つまたは複数のウイルス遺伝子の発現は、転写アクチベーターとテトラサイクリンとによって形成された複合体と上記プロモーターの調節配列との結合に全面的に依存する。
この結合はテトラサイクリンの存在下でしか生じない。テトラサイクリンまたはその任意の類似体が存在しないとき、調節配列と転写アクチベーターとの間に結合は成立しない。その結果として、最小プロモーターに結合したウイルス配列の転写は全く生じない。更に、転写誘導物質を常時存在させる必要がないという利点も得られる。
本発明の第一の目的は、特に誘導プロモーター、特に好ましくはテトラサイクリン誘導プロモーターによってその発現がコントロールされる少なくとも1つの同種遺伝子即ちアデノウイルス遺伝子を含むアデノウイルスを提供することである。
例えば、特定の実施態様において、本発明は、ウイルスの複製及び/または増殖に必須である少なくとも1つのゲノム領域の全部または一部がテトラサイクリン誘導プロモーターのコントロール下に置かれた組換えアデノウイルスを目的とする。本発明によれば、ウイルスの複製及び/または増殖に必須の領域は、領域E4、E2、領域IVa2及び/または領域L5などの全部または一部から有利に選択される。
特に有利な実施態様によれば、本発明の組換えアデノウイルスは、複製及び/または増殖に必須の配列として、領域E2またはE4の機能性部分の全部または一部を含む。より詳細には、領域E4の場合、重要な遺伝子はORF3、ORF6及びORF6/7遺伝子である。
領域E2はウイルスDNAの調節に関与する。この領域E2は2つの転写サブユニットE2A及びE2Bから構成されている。
領域E4は、後期遺伝子の発現の調節、後期核RNAの安定性、宿主細胞のタンパク質の発現の抑制、ウイルスDNAの複製の効率に関与する。E4が除去された突然変異体は増殖できない。従ってE4はウイルス増殖に必須の領域を構成する。この領域E4は、ORF1、ORF2、ORF3、ORF4、ORF3/4、ORF6及びORF6/7と呼ばれる7つの読取り枠から構成されている(図2)。これらのうちで、ORF3及びORF6はウイルス増殖に必須の2つの遺伝子である。これらの遺伝子の各々がウイルス増殖を誘発できるが、ORF6はORF3よりも重要な役割を果たしている(Huanget Hearing(1988),J.Virol.63,2605)。
特定の実施態様においては、本発明のベクター中で、上記に考察した領域の全部がテトラサイクリン誘導プロモーターのコントロール下に置かれている。領域E2の場合、この領域は特に、72KのcDNA、140KのポリメラーゼのcDNAまたは87Kのプレターミナルタンパク質のcDNAに対応するフラグメントである。領域E4の場合、この領域は特に、ヌクレオチド35576−32490に対応するTaq1−Bgl2フラグメントである。
別の特定実施態様において、これらの領域の機能性部分、即ちウイルス増殖を生じさせるに十分な部分の発現だけがコントロールされる。特にE4の場合、この部分は少なくとも1つの機能性遺伝子ORF3またはORF6を含む。好ましくは、E4の機能性部分は実質的にORF6から構成される。例えば、34115位と32490位との間に存在しAd5のORF6及びORF7の配列を含むフラグメントBgl2が上記に定義した本発明の誘導プロモーターの下流に配置され得る。
本発明の別の特定実施態様において、必須領域はタンパク質IVa2をコードする領域、例えばそのcDNAから構成される。別の実施態様では、タンパクIVa2をコードする領域が、野生型アデノウイルスAd5の配列のヌクレオチド3328−6316に対応するBglII−NruIフラグメント、ヌクレオチド4029−5719に対応するDraI−NlaIIIフラグメント、または、ヌクレオチド4029−5788に対応するDraI−XhoIフラグメントに含まれている。
本発明の好ましい実施態様によれば、ウイルス増殖に必須の領域のプロモーターがウイルスゲノムの内部で誘導プロモーター、特に好ましくはテトラサイクリン誘導プロモーターによって置換されている。
第一の特定実施態様によれば、本発明の組換えアデノウイルスは、遺伝子E1の全部または一部を欠失し、領域E4の全部または一部を、好ましくはOp2/Tk型のテトラサイクリン誘導プロモーターのコントロール下に有している。
別の特定実施態様によれば、本発明の組換えアデノウイルスは、遺伝子E1の全部または一部を欠失し、領域E2の全部または一部を、好ましくはOp2/Tk型のテトラサイクリン誘導プロモーターのコントロール下に有している。
同じく本発明の好ましい実施態様によれば、本発明の組換えアデノウイルスは、遺伝子E1及びE2の全部または一部を欠失し、領域E4の全部または一部を、好ましくはOp2/Tk型のテトラサイクリン誘導プロモーターのコントロール下に有している。
特に有利な変形実施態様によれば、本発明の組換えアデノウイルスは、遺伝子E1及びE4の全部または一部を欠失し、領域E2の全部または一部を、好ましくはOp2/Tk型のテトラサイクリン誘導プロモーターのコントロール下に有している。
本発明の組換えアデノウイルスが更に、細胞、器官または生物体内において導入及び/または発現されるのが望ましい1つまたは複数の治療用遺伝子を含む異種核酸配列を含んでいるのが有利である。
このように導入され得る治療用遺伝子は、標的細胞内で転写及び任意に翻訳されることによって治療効果を発揮する産生物を産生する任意の遺伝子である。
治療用遺伝子としては特に、治療効果を有するタンパク質性産生物をコードする遺伝子がある。このようにコードされるタンパク質性産生物は、タンパク質、ペプチドなどである。このタンパク質性産生物は標的細胞に対して同種の産生物でもよい(即ち、標的細胞がいかなる病的異常も有していないときに標的細胞中で正常に発現される産生物)。この場合、タンパク質の発現によって、例えば細胞内の不十分な発現または修飾によって失活したはもしくは活性低下したタンパク質の発現という問題が解決されたり、あるいは、タンパク質の超発現が得られたりする。治療用遺伝子はまた、安定性が強化されたり活性が修飾されたりした細胞性タンパク質の突然変異体をコードし得る。細胞性タンパク質はまた、標的細胞に対して異種のタンパク質でもよい。この場合、発現されたタンパク質は例えば、細胞の欠損活性を補完または付与して、病的異常に対する抵抗力を細胞に与える。
本発明の治療用産生物としては、特に、酵素;血液誘導体;ホルモン;リンホカイン:インターロイキン、インターフェロン、TNFなど(FR9203120);成長因子;神経伝達物質またはそれらの前駆物質もしくは合成酵素;栄養因子:BDNF、CNTF、NGF、IGF、GMF、aFGF、bFGF、NT3、NT5など;アポリポタンパク質:ApoAI、ApoAIV、ApoE、など(FR9305125);ジストロフィンもしくはミニジストロフィン(FR9111947);腫瘍抑制遺伝子:p53、Rb、Rap1A、DCC、k−rev、など(FR9304745);VII因子、VIII因子、IX因子などの凝固に関与する因子をコードする遺伝子;自殺遺伝子:チミジンキナーゼ、シトシンデアミナーゼなど;あるいは天然または人工の免疫グロブリンの全部または一部(Fab、ScFvなど)がある。
治療用遺伝子はまた、標的細胞内で発現したときに遺伝子の発現またはリボザイムのような細胞性mRNAの発現をコントロールし得る遺伝子またはアンチセンス配列でもよい。このような配列は例えば、欧州特許140308に記載の技術によって、標的細胞内で細胞性mRNAの相補的RNAに転写され、細胞性mRNAがタンパク質に翻訳されることをブロックする。
治療用遺伝子はまた、ヒト体内で免疫応答を誘発し得る抗原性ペプチドをコードする遺伝子でもよい。従ってこの特定実施態様においては特に、本発明は微生物またはウイルスに対してヒトを免疫感作し得るワクチンを製造し得る。これらのワクチンは特に、エプスタイン・バールウイルス、HIVウイルス、肝炎B型ウイルス(EP185573)、偽狂犬病ウイルスに特異的な抗原性ペプチドまたは腫瘍に特異的な抗原性ペプチド(EP259212)である。
一般に、異種核酸配列はまた、感染細胞内の機能性転写のプロモーター領域と、問題の遺伝子の3′に存在し転写終了シグナルとポリアデニル化部位とを特定する領域とを含む。これらの要素の集合が発現カセットを構成する。プロモーター領域に関しては、この領域は、感染細胞内で機能し得るときに該当する遺伝子の発現を支配する天然のプロモーター領域である。この領域はまた、異なる起原の領域(別のタンパク質の発現を支配する領域、あるいは合成領域)でもよい。この領域として特に、真核細胞遺伝子またはウイルス遺伝子のプロモーター配列を挙げることができる。例えば、感染の対象となる細胞のゲノムに由来のプロモーター配列でもよい。また、使用されるアデノウイルスも含めたウイルスのゲノムに由来のプロモーター配列でもよい。これに関しては例えば、遺伝子E1A、MLP、CMV、RSVなどのプロモーターを例示し得る。更に、これらのプロモーター領域は、活性化配列、調節配列、または組織特異的発現もしくは主働的発現を可能にする配列の付加によって修飾されてもよい。更に、異種核酸がプロモーター配列を含まない場合には、該核酸をプロモーター配列の下流で欠損ウイルスのゲノムに挿入してもよい。
更に、異種核酸配列はまた、合成された治療用産生物を標的細胞の分泌経路に導くシグナル配列を、特に治療用遺伝子の上流に含んでいてもよい。このシグナル配列は治療用産生物の天然のシグナル配列でもよいが、全く別の機能性シグナル配列でもよくまたは人工のシグナル配列でもよい。
この核酸配列は好ましくは、領域E1、E3またはE4の処に欠失配列に付加または置換して存在する。
本発明の第二の主要な目的は、その発現が誘導プロモーター、より好ましくはテトラサイクリン誘導プロモーターによってコントロールされる異種ウイルス起原の少なくとも1つの遺伝子を含むアデノウイルスを提供することである。
本発明の好ましい実施態様によれば、異種ウイルス起原の遺伝子はAAVのゲノム遺伝子またはその機能性類似体であるかまたはそれらに由来する。
AAVは比較的小さい大きさのDNAウイルスであり、感染する細胞のゲノムに部位特異的に安定に組み込まれる。AAVはまた、増殖、形態または細胞分化に対する影響を誘発することなく広いスペクトルの細胞に感染し得る。更に、ヒトの病的異常には関与しないと考えられる。AAVのゲノムは、クローニングされ、配列決定され、特性決定されている。このゲノムは、4680塩基を含み、各末端に、ウイルスの複製起点として作用する約145塩基の逆方向末端反復配列(ITR)領域を含んでいる。ゲノムの残りの部分は、キャプシド形成機能を有する2つの本質的な領域に分割される、即ち、ウイルスの複製及びウイルス遺伝子の発現に関与するrep遺伝子を含むゲノムの左側部分と、ウイルスのキャプシドタンパク質をコードするcap遺伝子を含むゲノムの右側部分とに分割される。ここから3つのプロモーターが検出され、マッピング装置で測定した概略位置に従って夫々p5、P19及びp40と命名されている。rep領域からは少なくとも4つのタンパク質が合成され、夫々の見掛け分子量に従ってRep78、Rep68、Rep52及びRep40と命名されている。プロモーターp5に由来の2つのmRNA転写物はRep78及びRep68の合成に使用される。Rep53及びRep40はプロモーターp19に由来のメッセンジャーから合成される。cap遺伝子に関してより詳細に考察すると、この遺伝子はウイルスのキャプシドタンパク質(VP1、VP2及びVP3)をコードしている。VP3は主要キャプシドタンパク質であり、そのアミノ酸配列はより大きいがより少ない2つのタンパク質VP1及びVP2の配列に内包されている(図解)。これらのrep及びcap遺伝子は、特性決定され、夫々の配列は文献に記載されている(Srivastavaら,J.Virol.45(1983)555)。
in vitro及びin vivoの遺伝子導入のためにAAV由来のベクターを使用することは文献に記載されている(特に、WO91/18088;WO93/09239;米国特許第4,797,368号、第5,139,941号、欧州特許第488528号参照)。一般に、遺伝子治療に使用される構築物はrep及び/またはcap遺伝子の欠失を含み、これらが有益な遺伝子によって置換されている。
AAVが複製されるためには、それらを複製するために必要な機能にトランス相補性を与え得る補助(“ヘルパー”)ウイルスの存在が必要である。このような補助ウイルスとしては特に、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、または、ワクチンのウイルスがある(このような補助ウイルスが存在しないとき、AAVは感染細胞のゲノム中に潜伏形態で維持されるが、複製されないのでウイルス粒子を産生しない)。従って従来の方法では、組換えAAVは、ヒト補助ウイルスに感染した細胞(例えばアデノウイルス)中で、AAVの2つの逆方向末端反復配列(ITR)領域で囲まれた問題の遺伝子を含むプラスミドと、AAVのキヤプシド形成遺伝子(rep及びcap遺伝子)を含むプラスミドとをコトランスフェクションすることによって産生される。アデノウイルスとのコトランスフェクションによって、カスケード的連鎖反応が開始され、高力価のAAVが産生され、アデノウイルスの産生が顕著に減少する。この連鎖反応は、プロモーターp5及びp19からの転写を誘発するE1a遺伝子産物の合成によって開始され、最終的に少量のRepタンパク質を合成する。p5から合成された1種または複数のRepタンパク質が3つのプロモーターからmRNAの大量合成を極めて高いレベルで協調的に誘導する。アデノウイルスが存在しないとき、AAVゲノムは消滅するかまたは宿主の染色体に取り込まれる。AAVの遺伝子を有効に発現させるためにはアデノウイルスのE1A以外の遺伝子も必要である。
出願人は、AAVのウイルス遺伝子の1つの発現をアデノウイルスの誘導プロモーターのコントロール下に少なくとも維持できること、より好ましくはAAVのキャプシド形成機能の発現をコントロールできること、特にrep遺伝子及び/またはcap遺伝子または他の任意の機能性相同遺伝子の発現をコントロールできることを証明したが、これらは極めて有利な知見であった。
機能性相同体は、rep遺伝子またはcap遺伝子の修飾(突然変異、削除、付加、など)によって得られた同種類の活性を有している任意の遺伝子を意味する。このような機能性相同遺伝子はまた、rep遺伝子またはcap遺伝子に対応するプローブを用いて核酸バンクからハイブリダイゼーションによって得られる遺伝子であってもよい。本発明によってコントロールされ得る突然変異したrep遺伝子の例として特に、Y.Yangら((1992)Journal of virology,6058−6069)の論文に記載されたコドン286と287の間にセリンを挿入することによって誘導された突然変異体in1177がある。
本発明の好ましい実施態様によれば、使用される誘導プロモーターは前記に定義したようなテトラサイクリン誘導プロモーターである。
このようなアデノウイルスはいくつかの理由で有利である。即ち、操作面でAAV株の作製方法が極めて簡単になる。実際、この特定の場合には、誘導プロモーターのコントロール下のrep遺伝子及びcap遺伝子を含むアデノウイルスと、組換えAAVと、適当な細胞系とが本質的に使用される。最後に、このようなアデノウイルスから得られるAAVの予測される力価は従来の方法で得られる力価を上回ることが判明した。
誘導プロモーターは特に、考察される1つまたは複数の遺伝子の発現を正常に導くプロモーターの1つの置換、特にプロモーターp5、p19またはp40の置換によって導入され得る。プロモーターP5はウイルスの産生に導くカスケード式連鎖反応の開始に最も関与すると考えられるので、プロモーターp5を好ましくはOp2/Tk型のテトラサイクリンによって誘導可能なプロモーターで置換するのが特に好ましい。このような構築物はテトラサイクリンの非存在下ではrep遺伝子及びcapの発現をブロックできるという利点を有している。
誘導プロモーターのコントロール下のAAVのキャプシド形成機能は、請求の範囲に記載のアデノウイルスのゲノムの種々の領域に導入され得る。キャプシド形成機能はAAVにトランス相補性を与えるウイルスの能力を変調させない領域に挿入されるのが有利である。また、キャプシド形成機能を該アデノウイルスのゲノムの機能性領域に挿入することも可能であり、このとき、この領域はプラスミドまたは使用された細胞系によってトランス配置で与えられる。例えば、rep遺伝子、cap遺伝子またはrep及びcapの双方の遺伝子を領域E1またはE3の処に欠失配列に置換または補充して挿入することが可能である。
ITR−psi領域が近接していることに起因する転写漏出を完全に防止するために、負の調節配列と呼ばれる配列を更に導入してもよい。一方でこのような配列が特に請求の範囲に記載のアデノウイルスの左側ITRとpsi配列との間に挿入されているとき、テトラサイクリン誘導プロモーターをコードする配列は、アデノウイルスの左側ITRとpsi配列との間にときには存在するエンハンサーによって誘発されるrep及びcapの寄生的転写活性化を完全に阻止し得る。本発明で使用され得る負の配列の例としては、特に、ビメンチンプロモーター(Salvettiら,(1993),Mol.Cell.Biol.,1676−1685)、インターフェロンプロモーター(Whitemoreら,(1990),P.N.A.S.,87,7799−7803)、心筋ミオシンのL鎖2の遺伝子(Ruoquian−Shenら,(1991),Mol.Cell.Bio1.,1676−1685)、マウスアルブミンプロモーター(Herbstら,(1990),Mol.Cell.Biol.,3896−3905)に同定されている配列が挙げられる。
好ましい実施態様によれば、本発明は、発現カセットOp2/Tk−repcapを含む組換えアデノウイルスに関する。
本発明の目的はまた、AAV起原のウイルス配列がテトラサイクリン誘導プロモーターのコントロール下に組み込まれているこれらのアデノウイルスをAAVの作製に使用することである。
好ましい実施態様において、本発明の目的となるアデノウイルスは、ITR配列とキャプシド形成可能配列とを含む。好ましくは、これらのアデノウイルスは更に、非機能性の領域E1を有している。
逆方向末端反復配列(ITR)はアデノウイルスの複製起点を構成する。これらの配列はウイルスゲノムの3′末端及び5′末端に局在している(図1参照)。当業者に公知の分子生物学の慣用技術によってこれらの配列を容易に単離し得る。ヒトアデノウイルス(特に血清型Ad2及びAd5)及びネコアデノウイルス(特にCAV1及びCAV2)のITR配列のヌクレオチド配列は文献に記載されている。例えば、アデノウイルスAd5の場合、左側ITR配列はゲノムのヌクレオチド1−103を含む領域に対応する。
キャプシド形成配列(Psiとも呼ばれる)はウイルスDNAのキャプシド形成に必要である。従って本発明の欠損組換えアデノウイルスを作製できるためにはこの領域が存在しなければならない。キャプシド形成配列はアデノウイルスのゲノム内の左側ITR(5′)とE1遺伝子との間に局在している(図1)。この配列は分子生物学の慣用技術によって単離または人工的に合成できる。ヒトアデノウイルス(特に血清型Ad2及びAd5)及びネコアデノウイルス(特にCAV1及びCAV2)のキャプシド形成配列のヌクレオチド配列は文献に記載されている。例えばアデノウイルスAd5の場合、キャプシド形成配列はゲノムのヌクレオチド194−358を含む領域に対応する。
本発明の組換えアデノウイルスの特に有利な実施態様によれば、領域E1はアデノウイルスAd5の配列のヌクレオチド454からヌクレオチド3328までのPvuII−BglIIフラグメントの欠失によって不活性化されている。この配列は文献にも記載されており、また、データベースからも入手できる(特に、Genebank No.M73260参照)。別の好ましい実施態様では、領域E1はヌクレオチド382からヌクレオチド3446までのHinfII−Sau3Aフラグメントの欠失によって不活性化されている。
本発明のアデノウイルスは、種々の起原のアデノウイルスから作製できる。実際、アデノウイルスの種々の血清型が存在しており、その構造及び特性は多少違っているが、遺伝的編成は類似している。従って、当業者は任意の型のアデノウイルスに対して本出願に記載の教示を容易に再現し得る。
より特定的には本発明のアデノウイルスはヒト起原、動物起原または混成型(ヒト及び動物)である。
ヒト起原のアデノウイルスの場合、好ましくはグループCに分類されるアデノウイルスを使用する。より好ましくは、ヒトアデノウイルスの種々の血清型のうちで、2型または5型のアデノウイルス(Ad2またはAd5)を本発明に使用する。
上記に指摘したように、本発明のアデノウイルスは動物起原でもよく、または動物起原のアデノウイルスに由来の配列を含んでもよい。出願人は実際、動物起原のアデノウイルスが高い効率でヒト細胞に感染でき、試験に用いたヒト細胞中で増殖できないことを証明した(国際特許出願WO94/26914参照)。出願人はまた、動物起原のアデノウイルスがヒト起原のアデノウイルスによってトランス相補性を与えられないこと、従ってヒトアデノウイルスの存在下では感染性粒子の形成に導くin vivoの組換え及び増殖の危険が完全に除去されていることを証明した。従って、動物起原のアデノウイルスまたはアデノウイルスの領域の使用は、遺伝子治療のベクターとしてウイルスを使用する際に伴う危険性がいっそう軽減されるので特に有利である。
本発明で使用できる動物起原のアデノウイルスは、ネコ、ウシ、ネズミ(例えばMav1、Beardら,Virology75(1990)81)、ヒツジ、ブタ、トリまたはサル(例えばSAV)に由来し得る。トリアデノウイルスのうちでは特に、ATCCで入手し得る血清型1〜10、例えばPhelps(ATCC VR−432)、Fontes(ATCC VR−280)、P7−A(ATCC VR−827)、IBH−2A(ATCC VR−828),J2−A(ATCC VR−829),T8−A(ATCC VR−830),K−11(ATCC VR−921)またはATCC VR−831〜835で照合できる菌株がある。ウシアデノウイルスとしては特に、公知の種々の血清型、特に、ATCCから参照番号ATCCVR−313、314、639−642、768及び769で入手し得る血清型(1〜8型)を使用し得る。また、ネズミアデノウイルスFL(ATCC VR−550)及びE20308(ATCC VR−528)、ヒツジアデノウイルス5型(ATCC VR−1343)または6型(ATCC VR1340)、ブタアデノウイルス5359、またはサルアデノウイルス、特に参照番号VR−591〜594、941〜943、195〜203でATCCから入手し得るものなどがある。
好ましくは、動物起原の種々のアデノウイルスのうちでも、ネコ起原のアデノウイルスまたはアデノウイルスの領域、特にアデノウイルスCAV2の全部の菌株〔例えば、マンハッタン株またはA26/61(ATCC VR−800)〕を本発明に使用する。ネコアデノウイルスは多くの構造的研究の対象となっている。従って、アデノウイルスCAV1及びCAV2の完全な制限地図が従来の技術文献に記載されており(Spibeyら,J.Gen.Virol.70(1989)165)、また、遺伝子E1a、E3及び配列ITRがクローニングされ、配列決定されている(特に、Spibeyら,Virus Res.14(1989)241;Linne,Virus Res.23(1992)119,WO91/11525参照)。
本発明は更に、AAVを作製するための有効な方法に関する。
より詳細には本発明の目的を成すAAVの作製方法は、テトラサイクリンまたはその類似体の1つの存在下で、転写アクチベーターの発現カセットをゲノムに含む細胞系を、テトラサイクリン誘導プロモーターの存在下の少なくとも1つのAAV起原の遺伝子と、AAV由来の組換えウイルスまたはAAVのITR間のトランスジーンを含むプラスミドと共にコトランスフェクションすることを特徴とする。より好ましくはこのAAVはrep遺伝子及びcap遺伝子を異種ウイルス遺伝子として含むアデノウイルスである。
本発明方法は、十分な量のテトラサイクリンと転写アクチベーターとの存在下では、アデノウイルス内部でテトラサイクリン誘導プロモーターのコントロール下に配置されたrep遺伝子及びcap遺伝子の発現が誘発され得るという特性を利用している。
前述のようにこの方法の利点は、従来の方法に比べて操作が容易なことである。本発明の場合には、請求の範囲に記載のようなアデノウイルス由来の細胞系とAAVに由来の組換えウイルスとを同時感染させるだけでよい。
本発明の形質転換アデノウイルスだけでなく、テトラサイクリンまたはその類似体の1つの存在下でアデノウイルス中に存在する誘導プロモーターの調節配列に結合し得る第一のポリペプチドと転写を活性化する第二ポリペプチドとから構成された転写アクチベーターと呼ばれるタンパク質の発現カセットをそのゲノムに含む細胞系を用いて方法を行うことも可能である。
特に転写アクチベーターと呼ばれるタンパク質に関しては、このタンパク質は、テトラサイクリンの存在下で所謂調節配列に結合する傾向を有していること、及び、対応する最小プロモーターを活性化する能力を有していることを特徴としている。上記に説明したように、このタンパク質は2つのポリペプチドから成り、第一ポリペプチドはテトラサイクリンまたはその類似体の1つの存在下でtetオペレーター配列に結合でき、第二ポリペプチドは特に転写を活性化する機能を有している。
本発明の特に有利な実施態様によれば、転写アクチベーターと呼ばれるタンパク質の第一ポリペプチドは、野生型リプレッサーの挙動とは逆の挙動を示すように突然変異したテトラサイクリンのリプレッサーである。即ち、このポリペプチドはテトラサイクリンの存在下でtetオペレーター配列に結合するが、テトラサイクリンの非存在下では結合しない。この種の突然変異は慣用の突然変異誘発型生物学的技術によって惹起され得る。野生型リプレッサーと本発明の突然変異リプレッサーとのアミノ酸の違いは、1つまたは複数のアミノ酸の置換、欠失及びまたは付加から成る。その結果として、形質転換リプレッサーに2つの機能的特性が与えられる。形質転換リプレッサーは野生型リプレッサーとの類似によってテトラサイクリンオペレーターが表す調節配列に結合し得る。その反面で、形質転換リプレッサーはテトラサイクリンによって逆方向に調節される。
テトラサイクリンの野生型リプレッサーの多数のクラスが既に記載されており、そのうちでも特にクラスA、B、C、D及びEを挙げることができる。これらのリプレッサーの代表例としては特にクラスBに属するリプレッサーTn10がある。本発明の好ましい実施態様に使用されるリプレッサーはこの野生型リプレッサーTn10に由来する。より詳細には、71、95、101または102位に局在するアミノ酸の少なくとも1つが突然変異したリプレッサーTn10が使用される。
より好ましくは、このリプレッサーは配列番号8で表されるアミノ酸配列の全部または一部を有している。このリプレッサーはTetRと呼ばれる。
転写アクチベーターと呼ばれるタンパク質中に存在する第二ポリペプチドに関しては、このポリペプチドは既知のいかなる転写活性化ドメインでもよい。本発明の好ましい実施態様によれば、このポリペプチドは、単純ヘルペウウイルのタンパク質16の活性化ドメインであり、より特定的にはVP16のC末端の130個のアミノ酸であり、より好ましくは、VP16のこのC末端の11個のアミノ酸またはVP16もしくはその誘導体のC末端部のペプチド部分である(Sceipel K.ら,EMBO J.1992;13,4961−4968)。
請求の範囲に記載のAAVの作製方法の場合には、この転写アクチベーターの発現カセットが好ましくは293細胞系のゲノムに組み込まれている。
本発明の好ましい実施態様によれば、細胞系内のこの転写アクチベーターの発現も前記に定義したようなテトラサイクリンまたはその類似体の1つによって誘導可能なプロモーターのコントロール下に置かれている。より好ましくは、293細胞系のゲノムにカセットOp2/Tk−TetR−VP16が組み込まれている。
本発明の目的はまた、本発明で定義した誘導プロモーターを任意に含む前記に定義したような転写アクチベーターの発現カセットをそのゲノムに含む細胞系を提供することである。より好ましくは、細胞系のゲノムにカセットOp2/Tk−TetR.−VP16が組み込まれている。
本発明はまた、本発明のアデノウイルスまたはAAVを産生するためのこの種の細胞系の使用に関する。
その発現がテトラサイクリン誘導プロモーターのコントロール下に維持された少なくとも1つの遺伝子を含むアデノウイルスの作製方法も本発明の目的の1つである。
本発明の欠損組換えアデノウイルスは種々の方法で作製され得る。
第一の方法では、in vitroで(例えば結合によってまたはプラスミドの形態で)作製した欠損組換えウイルスのDNAを、コンピテント細胞系、即ちウイルスの相補性に必要な全部の機能と転写アクチベーターとをトランス配置で含む細胞系に導入する。これらの機能は好ましくは細胞のゲノムに組み込まれており、このため組換えが生じる危険性が排除され、細胞系の安定性が強化される。
次いで、十分な量のテトラサイクリンまたはその類似体の1つの存在下で増殖するベクターを、分子生物学の慣用技術によって回収し、精製し、増幅する。
変形実施態様によれば、適正な欠失とテトラサイクリン誘導プロモーターのコントロール下の1つまたは複数のウイルス遺伝子と1つまたは複数の治療用遺伝子とを含む欠損組換えウイルスのDNAを結合によるかまたはプラスミドの形態でin vitroで作製することが可能である。通常は、実施例で説明するような分子生物学で慣用の技術に従って欠損組換えウイルスのDNAを適正な制限酵素によって消化し次いで結合させることによって欠失を生じさせる。次いで、酵素開裂及び結合を順次行ってウイルス遺伝子または治療用遺伝子と誘導プロモーターとを選択領域の処で選択方向でこのDNAに挿入する。この結果、適正な欠失を有し、テトラサイクリン誘導プロモーターのコントロール下の1つまたは複数のウイルス遺伝子と1つまたは複数の治療用遺伝子とを含むDNAが得られる。このDNAは請求の範囲に記載の組換えアデノウイルスを直接産生し得る。
また、異種遺伝子及び誘導プロモーターを順次に導入し得る順次段階によって組換えウイルスを作製することも可能である。即ち、適正な欠失(または欠失の一部)と例えばOp2/Tkのような誘導プロモーターとを含む第一の組換えウイルスのDNAを結合によるかまたはプラスミドの形態で構築する。次いでこのDNAを使用して、上記欠失を誘導プロモーターと共に含む第一の組換えウイルスを産生させる。次に、この第一ウイルスのDNAを単離し、第二のプラスミド、または、適正な欠失特に相同組換え可能領域である領域E1に欠失を有しかつ任意に治療用遺伝子を含む第二の欠損組換えウイルスのDNAとコトランスフェクトする。この第二段階で本発明の組換えウイルスが得られる。
本発明はまた、上記のような1つまたは複数の組換えアデノウイルスを含む医薬組成物全般に関する。本発明の医薬組成物は、局所投与、経口投与、非経口投与、鼻孔内投与、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、眼内投与、経皮投与、などに適した形態に製剤化され得る。
好ましくは医薬組成物は、注射用製剤を得るための医薬として許容される担体を含む。このような医薬組成物は特に、無菌で等張性の生理的塩類溶液(一リン酸ナトリウム、二リン酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウムまたは塩化マグネシウムなど、またはこれらの塩の混合物)の形態であるか、または、場合に応じて滅菌水または生理的血清を添加して注射可能な溶質を復元し得る乾燥組成物、特に凍結乾燥組成物である。
注射に使用されるウイルスの用量は種々のパラメーター、特に使用される投与形態、対応する病的異常、発現させる遺伝子、または所望の治療期間に従って調節される。一般的に、本発明の組換えアデノウイルスは、104〜1014pfu/ml、好ましくは106〜1010pfu/mlの用量の剤形で製剤化され投与される。pfu(“プラーク形成単位”)なる用語はウイルス溶液の感染力価に対応し、適当な細胞培養物を感染させ、通常は5日後の感染細胞のプラーク数を計測することによって測定される。ウイルス溶液のpfu力価の測定方法は文献に詳しく記載されている。
本発明のアデノウイルスは多くの病的異常の治療または予防に使用され得る。これらのアデノウイルスは該当部位の処に直接注入することによって過増殖性病的異常(癌、再発狭窄症、など)の治療に有利である。この点で、本発明はまた、上記に定義したようなアデノウイルスベクターを上記細胞またはその一部に感染させることから成る増殖性細胞の破壊方法を提供する。自殺遺伝子が治療薬に対する感受性を与える遺伝子である場合、本発明の破壊方法では、細胞を治療薬によって処理する。この方法を実施するために、本発明はまた、治療薬に対する感受性を与える遺伝子から成る自殺遺伝子を含む上記に定義したような組換えアデノウイルスを含む産生物を提供することを目的とする。上記治療薬は、過増殖性病的異常を治療するために時間的に同時に、異なる時期にまたは時差的に併用薬剤として使用される。より特定的には、自殺遺伝子はチミジンキナーゼ遺伝子であり、治療薬はガンシクロビルまたはアシクロビルまたはその類似体である。
本発明の組換えベクターは遺伝子治療における使用に特に好適な特性を有している。これらのベクターは実際、感染性、安全性及び極めて高い遺伝子導入能力を合わせて有している。
添付図面を参照しながら実施例に基づいて本発明をより詳細に以下に説明する。これらの実施例及び図面は本発明を例示するもので本発明を限定するものではない。
図1は、アデノウイルスAd5の遺伝子編成を示す。Ad5の完全配列はデータベースから入手でき、当業者は任意の制限部位を選択または作成し、従ってゲノムの任意の領域を単離し得る。
図2は領域E4の遺伝子編成を示す。
図3はAAVの遺伝子編成を示す。
分子生物学の汎用技術
プラスミドDNAの分離用抽出、プラスミドDNAの塩化セシウム勾配遠心、アガロースゲルまたはアクリルアミドゲルにおける電気泳動、DNAフラグメントの電気溶出による精製、フェノールまたはフェノール−クロロホルムによるタンパク質の抽出、塩媒体中のエタノールまたはイソプロパノールによるDNAの沈殿、大腸菌の形質転換、などのような分子生物学で慣用の方法は当業者に公知であり、文献にも十分に記載されている〔Maniatis T.ら,“Molecular Cloning,a Laboratory Manual”,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,N.Y.,1982;Ausubel F.M.ら(eds),“Current Protocols in Molecular Biology”,John Wiley & Sons,New York,1987〕。
pBR322、pUC型のプラスミド及びM13シリーズのファージは市販製品である(Bethesda Research Laboratories)。
結合のためには、アガロースゲルまたはアクリルアミドゲル中の電気泳動によってDNAフラグメントを大きさに基づいて分離し、フェノールまたはフェノール/クロロホルム混合物によって抽出し、エタノールで沈殿させ、次いで製造業者の指示通りに用いたファージT4のDNAリガーゼ(Biolabs)の存在下でインキュベートする。
5′の突出末端の埋め戻しは、大腸菌のDNAポリメラーゼIのクレノウフラグメント(Biolabs)を製造業者の指示通りに用いて行う。3′の突出末端の破壊は、製造業者の指示通りに用いたファージT4のDNAポリメラーゼ(Biolabs)の存在下で行う。5′の突出末端の破壊はヌクレアーゼS1によって調節される処理によって行う。
合成オリゴヌクレオチドによってin vitroで誘発される突然変異はTaylorらによって開発された方法〔Nucleic Acids Res.13(1985)8749−8764〕に従い、Amershamによって販売されているキットを使用して行う。
所謂PCR技術〔olymerase−catalyzed hain eaction,Saiki R.K.ら,Science 230(1985)1350−1354;Mullis K.B.,Faloona F.A.,Meth.Enzym.155(1987)335−350〕によるDNAフラグメントの酵素増幅は“DNAサーマルサイクラー”(Perkin Elmer Cetus)を製造業者の指示通りに使用して行う。
ヌクレオチド配列の確認はSangerらによって開発された方法〔Proc.Natl.Acad.Sci.USA,74(1977)5463−5467〕に従ってAmershamによって販売されているキットを用いて行う。
使用細胞系
以下の実施例では以下の細胞系を使用したかまたは使用し得る。
−ヒト胎児腎臓293細胞系(Grahamら,J.Gen.Virol.36(1977)59)。この細胞系のゲノムには、ヒトアデノウイルスAd5のゲノムの左側部分(12%)が組み込まれている。
−ヒト表皮癌に由来のヒトKB細胞系。この細胞系はその培養可能条件と共にATCCから入手できる(参照番号CCL17)。
−ヒト表皮癌に由来のヒトHeLa細胞系。この細胞系はその培養可能条件と共にATCCから入手できる(参照番号CCL2)。
−ネコMDCK細胞系。MDCK細胞の培養条件は特にMacatneyら,Science 44(1988)9によって記載されている。
−gm DBP6細胞系(Broughら,Virology190(1992)624)。この細胞系はアデノウイルスのE2遺伝子をMMTVのLTRのコントロール下に含むHeLa細胞から成る。
実施例1
プロモーターOp2−Tkのコントロール下のドメインE4を含むアデノウイルスの構築
1.プラスミドpIC20H/Op2−Tkの構築
このプラスミドは、テトラサイクリンオペレーターの2つの配列の直後に最小プロモーターTkの配列を含む。これらの配列はテトラサイクリンに結合するとテトラサイクリンリプレッサーによって認識される。
このプラスミドを得るために、プラスミドpIC20H(Marshら,Gene 32(1984)48)をClaI−BamHIによって消化し、チミジンキナーゼ最小プロモーターの上流に2つのテトラサイクリンオペレーターを含む配列番号5の配列をこれらの2つの部位の間に導入する。
2.プラスミドpIC20H/ITR−Op2Tkの構築
このプラスミドは、プラスミドpIC20H/Op2TkをClaIによって消化し、Ad5のITRを含むHpa2フラグメントを挿入することによって得られる(配位:1/+122)。このHpa2フラグメントは、市販のベクターpSL1180(Pharmacia)をHind3によって消化し、増幅フラグメントの両側にHind3部位をもつようにPCR作製したITRをこの部位に導入することによって得られる。ITR−Op2−TKpromの順序の配列が得られる。
3.プラスミドpIC20H/ITR−Op2Tk−E4の構築
このプラスミドは、プラスミドpIC20H/ITR−Op2TkをHind3によって消化し、Ad5の領域E4を含むPY6のNhe−Xba1フラグメントをこの部位に挿入することによって得られる。プラスミドpPY6は以下のプロトコルに従って得られる。
プラスミドpIC20HからプラスミドpPY2を作製する。このプラスミドpPY2は、コンテキストE.coli dam+から作製されたプラスミドpIC20HのXba1部位とSal1部位との間にプラスミドpMSG(Pharmacia)のAvr2−Sal1フラグメント(MMTVのプロモーターを含む約1.3kb)のクローニングしたものである。プラスミドpPY4は、BamH1及びBgl2で切断し次いで再結合した35bpのフラグメントをプラスミドpPY2から欠失させることによって得られる。プラスミドpPY5は、35576位(Taq1)と32490位(Bgl2)との間に位置する5型アデノウイルスの領域E4を含むTaq1−Bgl2フラグメントをCla1部位とBamH1部位との間にクローニングしたプラスミドpIC20Hに対応する。従ってプラスミドpPY5の領域E4は、部分消化後にプラスミドpPY4のSma1部位とSph1部位との間にクローニングされたEcoRV−Sph1フラグメントに含まれている。この結果としてプラスミドpPY6が得られる。
4.プラスミドpIC20H/ITR−Op2Tk−E4−L5の構築
このプラスミドは、プラスミドpIC20H/ITR−Op2Tk−E4をKpn1及びXba1によって消化し、領域L5の全部を含むAd5の3.1KbのKpn1−Xba1フラグメント(配位:33595−30470)を挿入することによって得られる。
5.プラスミドpYG4−EPの構築
ITR、Op2、Tkプロモーター、E4及びL5を順次に含む対応フラグメントを回収するためにプラスミドpIC20H/ITR−Op2Tk−E4−L5をXba1及びNru1によって消化する。このフラグメントを、Xba1部位からSph1部位までのアデノウイルスの配列全部を含むプラスミドpYG4のXba1部位とNru1部位とに挿入する。このプラスミドpYG4−EPは、Ad5のSph1−Xba1フラグメントがSph1部位とXba1部位(配位:25095−28590)との間に挿入されたベクターpIC20Hである。
アデノウイルスの領域E3が欠失したこのベクターpYG4−EPは、アデノウイルスの相補的組換えに十分なアデノウイルス配列をSph1部位とXba1部位との間に有しており、組換えアデノウイルスの作製に使用し得る。
6.組換えアデノウイルスの構築
この構築は、以下の実施例3の手順で作製した293/TetR−VP16細胞と、Sph1消化によって直鎖化したプラスミドpYG4及びアデノウイルスRSV−βgalまたはテトラサイクリンの存在下もしくは非存在下でSrf1消化によって直鎖化したトランスジーンを含むアデノウイルスとのコトランスフェクションによって行う。次に、組換えアデノウイルスを選択及び増幅するために慣用のウイルス学の技術に従って処理する。
実施例2
AAVのrep−cap遺伝子をOp2/Tkプロモーターのコントロール下に含む組換えアデノウイルスの構築
1.中間プラスミドpXL2630の構築
この中間プラスミドは、Op2−Tkの下流にEcoRI部位を導入し得る。この位置の制限部位の存在は2つの利点を有している。この制限部位はプロモーターp5の削除後のrep−capの上流にこのプロモーターを導入する役割を果たし、また、実施例3に後述する手順で形質転換した293細胞系を作製するためにこのハイブリッドプロモーターをTetR−VP16の上流に挿入し得る。
このために、実施例1に記載のプロトコルに従って得られたプラスミドpIC20H/Op2−TkをBamHIによって消化し、平滑末端にするためにT4のDNAポリメラーゼによって処理し、次いでEcoRVで再消化し、この消化後に得られたOp2−Tkプロモーターを含むフラグメントを市販のプラスミドpBSSK+のEcoRV部位に導入する。このフラグメントの方向はEcoRI部位がプロモーターの下流に存在するように選択する。
3.p5の転写レベル+1のEcoRIの導入
プロモーターp5を削除するために、プロモーターp5の転写レベル+1のEcoRIをRep78のコーディング配列の上流に、プラスミドpAV2に対するPCR技術によって導入する(Laughlin C.,Gene(1983),23,69−73)。この反応は以下のオリゴヌクレオチドを用いて行う。
配列番号6(配列5269):
5′GAATTCTTTTGAAGCGGGAGGTTTGAACGCG3′
EcoRI
配列番号7(配列5039):
5′CTCCATGTACCTGGCTGA3′
このようにして作製したフラグメントをpCRII(Invitrogen)に導入してプラスミドpMA4とした。このフラグメントのヌクレオチド配列を確認した。
4.Op2−Tk−rep−capの結合体を含むプラスミドpMA6の構築
この中間プラスミドは誘導プロモーターとrepとを結合し得る。pXL2630のSalI−EcoRIフラグメントとpMA4のEcoRI−NruIフラグメントとをpIC20R(Marshら,Gene 32(1984)481)のXhoI部位(SalIと適合性)及びNruIに導入して、プラスミドpMA6を作製する。
5.HinfI(382)部位までのアデノウイルスAd5の左側部分、多重クローニング部位及びアデノウイルスAd5のSau3A(3446)−NruI(6316)フラグメントを含むプラスミドpC01(図7 EX94008)の構築
5−a.プラスミドpCEの構築
アデノウイルスAd5のゲノムの左端に対応するEcoRI−XbaIフラグメントを先ずベクターpIC19H(Marshら,Gene 32(1984)481)のEcoRI部位とXbaI部位との間にクローニングした。これによってプラスミドpCAが得られる。プラスミドpCAを次にHinfIによって切断し、その5′突出末端を大腸菌のDNAポリメラーゼIのクレノウフラグメントによって埋め戻し、次いでEcoRIによって切断した。このようにして作製したアデノウイルスAd5のゲノムの左末端を含むプラスミドpCAのフラグメントを次に、ベクターpIC20H(Marshら,Gene 32(1984)481)のEcoRI部位とSmaI部位との間にクローニングした。これによってプラスミドpCBが得られる。プラスミドpCBを次にEcoRIによって切断し、その5′突出末端を大腸菌のDNAポリメラーゼIのクレノウフラグメントによって埋め戻し、次いでBamHIによって切断した。このようして作製したアデノウイルスAd5のゲノムの左末端を含むプラスミドpCBを次にベクターpIC20HのNruI部位とBglII部位との間にクローニングした。これによってプラスミドpCEが得られる。プラスミドpCEの重要な特徴は、アデノウイルスAd5の最初の382塩基対を含み、その直後に多重クローニング部位を含むことである。
5−b.プラスミドpCD′の構築
アデノウイルスAd5のゲノムのSau3A(3346)−SstI(3645)フラグメントとSstI(3645)−NarI(5519)フラグメントとを先ずベクターpIC20HのClaI部位とBamHI部位との間に結合し、クローニングした。これによりプラスミドpPY53が得られる。コンテキストdam−から調製したSau3A(3346)部位とTaqI(5207)部位との間のアデノウイルスAd5のゲノムの部分を含むプラスミドpPY53のSalI−TaqIフラグメントを次に、ベクターpIC20HのSalI部位とClaI部位との間にクローニングして、プラスミドpCA′を作製する。コンテキストdam−から調製したアデノウイルスAd5のゲノムのTaqI(5207)−NarI(5519)フラグメントとプラスミドpCA′のSalI−TaqIフラグメントとを次に、ベクターpIC20HのSalI部位とNarI部位との間に結合しクローニングした。これによってプラスミドpCC′が得られる。コンテキストdam−から調製したアデノウイルスAd5のゲノムのNarI(5519)−NruI(6316)フラグメントとプラスミドpCC′のSalI−NarIフラグメントとを次に、ベクターpIC20RのSalI部位とNruI部位との間に結合しクローニングした。これによってpCD′が得られる。
5−c.プラスミドpC01の構築
プラスミドpCD′のXhoIによる部分消化及びSalIによる完全消化を順次行うことによって、アデノウイルスAd5のSau3A(3446)部位からNruI(6316)部位までの配列を含む制限フラグメントを作製する。このフラグメントをプラスミドpCEのSalI部位にクローニングした。これによってプラスミドpC01が得られる。
6−プラスミドpMA7及びMA8の構築
AAVのOp2−Tk−rep−cap−ポリA+を含むpMA6のEcoRV−SnaBIフラグメント(AAVの配列の4495位のSnaBI部位まで)をアデノウイルスのITRに対して2つの方向でpC01のEcoRV部位に導入する。このようにして得られたプラスミドをpMA7(カセットの方向はアデノウイルスのITRに逆方向)及びpMA8(同方向)と命名する。
7.Op2−Tk−rep−capを含む組換えアデノウイルスの構築
この項では、AAVのカセットOp2−Tk−rep−cap−ポリA+を含む欠損組換えアデノウイルスの構築を説明する。このアデノウイルスは、アデノウイルスの領域E1(E1A及びE1B)によってコードされた機能をトランス配置で与えるヘルパー細胞(293細胞系)中でプラスミドpMA7またはpMA8と欠損アデノウイルスベクターとをコトランスフェクションすることによって得られる。
より詳細には、アデノウイルスAdRSVβgalとプラスミドpMA7及びpMA8との間のin vivo相同組換えを以下のプロトコルに従って行うことによってアデノウイルスAdMA7及びAdMA8を作製する。NdeIによって直鎖化したプラスミドpMA7またはpMA8とClaIによって直鎖化したアデノウイルスAdRSVBgalとをリン酸カルシウムの存在下で293細胞中でコトランスフェクトして組換えを生じさせる。このようにして得られた組換えアデノウイルスをプラーク精製によって選択する。単離後、組換えアデノウイルスを293細胞系中で増幅させると、約1010pfu/mlの力価を有する未精製の組換え欠損アデノウイルスを含む培養上清が得られる。精製のために、ウイルス粒子を塩化セシウム勾配上で公知の技術(特にGrahamら,Virology52(1973)456参照)によって遠心する。
アデノウイルスAdMA7またはAdMA8を20%グリセロール中で−80℃で保存する。
8.領域E3にOp2/Tk rep−cap ポリA+AAVを含む組換えアデノウイルスの構築
この項では領域E3にOp2:Tk repcap ポリA+AAVを含むE1の欠失した組換えアデノウイルスの構築を記載する。
プラスミドpMA28は領域E3にOp2:Tk repcapポリ+AAVを含むAd(E1−,E3−)の全配列を含む。このプラスミドは大腸菌中で組換えによって構築され、例えば国際特許出願PCT/FR96/00215に記載の菌株C2110(pXL2638)(E1−,E3−)にプラスミドpMA24を導入することによって構築する。この国際特許出願は参照によって本発明に含まれるものとする。
8.1.中間プラスミドpMA22の構築
Op2:Tk repcap ポリA+AAVを含むプラスミドpMA7のXbaI−XbaIフラグメントを領域E3に置換してpYG4−EPのXbaI部位に導入し、Op2:Tk repcap ポリA+AAVが領域E3の方向に対して逆方向になるようにした。このようにして構築したプラスミドがpMA22である。
8.2.大腸菌中で組換えを行うために使用されるプラスミドpMA24の構築
アデノウイルスの27082から28593までの配列及び3471から31509までの配列が両側に隣接したカセットOp2:Tk repcap ポリA+AAVを含むpMA22のNheI−SpheIフラグメントをプラスミドpXL2756の適合部位に導入することによって、カセットOp 2:Tk repcap ポリA+AAV、B.subtilisのsacB遺伝子及びカナマイシン耐性遺伝子を内包した組換えに必要な領域を含むプラスミドpMA24を作製した。
8.3.領域E3にOp2:Tk repcap ポリA+AAVを含む組換えアデノウイルスの構築
この構築は大腸菌中での組換えによって行った。即ち、プラスミドpMA24をC2110(pXL2688)またはc2110(pXL2789)菌株にエレクトロポレートし、LB培地、ショ糖、テトラサイクリン上で第二の組換えイベントを選択した。このようにしてプラスミドpMA28を含む菌株C2110が得られる。
次いでこのプラスミドをPacI消化後の293細胞にトランスフェクトした。
実施例3
293 Op2−Tk−TetR−VP16産生細胞系の構築
この項では、そのゲノムに組み込まれたハイブリッドトランスアクチベーターのカセットTetR−VP16をプロモーターOp2−Tkのコントロール下に含む293細胞系の構築を記載する。このために、プラスミドpMA2を構築し、このプラスミドpMA2とネオマイシン耐性遺伝子をプロモーターPGK(ホスホグリセレートキナーゼ)のコントロール下に含むプラスミドpMSCV(Hawleyら,J.Exp.Med.(1993),vol176,1149−1163)とのコトランスフェクションによって細胞系を樹立した。pMA2は、プラスミドpUHD17.1の適合性部位XhoI−EcoRIの間にpXL2630のSalI−EcoRIフラグメントを挿入することによって構築する。プラスミドpUHD17.1は、配列VP16に操作的に結合した突然変異テトラサイクリンのリプレッサーをコードする配列を含むプラスミドである。このベクターは、単純ヘルペスウイルスVP16のC末端の130個のアミノ酸に結合した野生型テトラサイクリンリプレッサーの配列を含むベクターpUHD15.1(H.Bujard;P.N.A.S.U.S.A.1992,89,55476−5551)に由来する。突然変異したテトラサイクリンのリプレッサーのアミノ酸3〜135に対応する399塩基対のXbaI−Eco47IIIフラグメントをpUHD15.1の対応する制限フラグメントに置換することによってpUHD17.1が得られる。
本発明の293 Op2−Tk−TetR−VP16細胞系は、リン酸カルシウムの存在下でプラスミドpMA2及びpMSCVによって選択された細胞と、グルココルチコイドのレセプターをコードする構築物(Hollenbergら,1985)とのコトランスフェクションによって構築した。より詳細には、直径5cmの容器に入れた293系の細胞に1〜5μgのプラスミドpMA2をトランスフェクトした。
ジェネティシン(geneticine)耐性クローンの選択
細胞のトランスフェクション後、細胞を洗浄し、次いでウシ胎仔血清を(最終濃度7%)補充した培養培地(MEM,Sigma)を加えて、細胞を20時間インキュベートする。翌日、実効濃度400mg/リットルのジェネティシンG418(Gibco−BRL,Life Technologies)の存在下で細胞を選択する。ジェネティシンを3日毎に交換すると、約3週後に選択可能なクローンが出現する。トランスフェクトされなかった細胞が残らず死亡したとき、耐性遺伝子が挿入された細胞だけが生き残り、分裂して細胞クローンを産生する。細胞クローンが肉眼で観察できる十分な大きさになったとき、これらのクローンを個々に、“24ウェル”の培養プレートの培養ウェルに移す。次いで、各クローンをジェネティシンの存在下で、先ず“12ウェル”の培養プレート、次いで“6ウェル”の培養プレートのウェルで漸次増幅させ、最後に細胞培養容器で増殖させる。各細胞クローンを液体窒素中で凍結保存する。
いくつかのクローンを単離し、増幅し、適当な濃度のテトラサイクリンを添加した後、プロモーターOp2−Tkのコントロール下にリポーター遺伝子、例えばlacZを発現させる能力に基づいて選択した。使用したプラスミドはpMA9であった。このプラスミドpMA9は、大腸菌のβ−ガラクトシダーゼをコードする配列を含むpRSVgalIXのStuI−BamHIフラグメントと核局在シグナルとを、EcoRIによって予め直鎖化しバクテリオファージT4のDNAポリメラーゼで処理して平滑末端を形成し次いでBamHIによって再度消化したプラスミドpMA2に導入することによって構築した。
これらのクローンのうちで、前記のアデノウイルスに含まれていたrep−capを条件付きで発現させAAVを高力価で産生し得るクローンを産生細胞系として使用した。
配列表
配列番号:1
配列の長さ:61
配列の型:ヌクレオチド
鎖の数:一本鎖
トポロジー:直鎖状
配列の種類:cDNA
配列
Figure 0003821846
配列番号:2
配列の長さ:64
配列の型:ヌクレオチド
鎖の数:一本鎖
トポロジー:直鎖状
配列の種類:cDNA
配列
Figure 0003821846
配列番号:3
配列の長さ:67
配列の型:ヌクレオチド
鎖の数:一本鎖
トポロジー:直鎖状
配列の種類:cDNA
配列
Figure 0003821846
配列番号:4
配列の長さ:75
配列の型:ヌクレオチド
鎖の数:一本鎖
トポロジー:直鎖状
配列の種類:cDNA
配列
Figure 0003821846
配列番号:5
配列の長さ:141
配列の型:ヌクレオチド
鎖の数:一本鎖
トポロジー:直鎖状
配列の種類:cDNA
配列
Figure 0003821846
配列番号:6
配列の長さ:31
配列の型:ヌクレオチド
鎖の数:一本鎖
トポロジー:直鎖状
配列の種類:cDNA
配列
Figure 0003821846
配列番号:7
配列の長さ:18
配列の型:ヌクレオチド
鎖の数:一本鎖
トポロジー:直鎖状
配列の種類:cDNA
配列
Figure 0003821846
配列番号:8
配列の長さ:206
配列の型:アミノ酸
鎖の数:一本鎖
トポロジー:直鎖状
配列の種類:タンパク質
配列
Figure 0003821846

Claims (69)

  1. ウイルス起原の同種または異種の少なくとも1つの遺伝子の発現が誘導性プロモーターのコントロール下に置かれており、前記同種または異種の遺伝子が当該ウイルスの複製または増殖に必須であるゲノム領域の全体または一部であることを特徴とする、組換えアデノウイルス。
  2. 誘導性プロモーターが、重金属、ヒートショック、ホルモンまたはテトラサイクリンに応答するプロモーターから選択されることを特徴とする、請求項1に記載の組換えアデノウイルス。
  3. プロモーターが、テトラサイクリンまたはその類似体の1つによって誘導可能なプロモーターであることを特徴とする、請求項1または2に記載のアデノウイルス。
  4. テトラサイクリンによって誘導可能なプロモーターが、少なくとも1つのテトラサイクリンオペレーターを含む調節配列に作動可能に結合した最小プロモーターから成ることを特徴とする、請求項3に記載のアデノウイルス。
  5. 調節配列が少なくとも2つのテトラサイクリンオペレーターを含むことを特徴とする、請求項4に記載のアデノウイルス。
  6. 調節配列の全部または一部が、配列番号3もしくは配列番号4の配列またはそれらの誘導体の1つによって表されることを特徴とする、請求項4または5に記載のアデノウイルス。
  7. 最小プロモーターがヒトCMVに由来することを特徴とする、請求項4から6のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルス。
  8. 最小プロモーターが、ヒトCMVプロモーターのヌクレオチド+75〜−53または+75〜−31の領域に相当することを特徴とする、請求項4から7のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルス。
  9. プロモーターが、それがコントロールするウイルス起原の遺伝子の転写を単独では確実にコントロールできないように突然変異したウイルス遺伝子の同種または異種のプロモーターであることを特徴とする、請求項4から6のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルス。
  10. 最小プロモーターが、前記ウイルス遺伝子の同種プロモーターに由来することを特徴とする、請求項9に記載のアデノウイルス。
  11. 最小プロモーターが単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼのプロモーターに由来することを特徴とする、請求項9に記載のアデノウイルス。
  12. 最小プロモーターの全部または一部が、配列番号1もしくは配列番号2の配列またはそれらの誘導体の1つによって表されることを特徴とする請求項11に記載のアデノウイルス。
  13. 最小プロモーターが、転写すべきウイルス遺伝子の上流に、該遺伝子の固有のプロモーターに置換するかまたは置換しないで配置されていることを特徴とする、請求項4から12のいずれか一項に記載のアデノウイルス。
  14. 前記最小プロモーターに加えて、前記ウイルス遺伝子の固有のプロモーターを不活性化形態または非機能性形態で含むことを特徴とする、請求項4から13のいずれか一項に記載のアデノウイルス。
  15. 調節配列が最小プロモーターの上流に配置されていることを特徴とする、請求項4から14のいずれか一項に記載のアデノウイルス。
  16. 調節配列が、前記ウイルス遺伝子の下流に配置されていることを特徴とする、請求項4から14のいずれか一項に記載のアデノウイルス。
  17. 調節配列が、前記ウイルス遺伝子に直結しているかまたは直結していないことを特徴とする、請求項16に記載のアデノウイルス。
  18. 誘導性プロモーターがOp2/Tkによって表されることを特徴とする、請求項1から17のいずれか一項に記載のアデノウイルス。
  19. 誘導性プロモーターの全部または一部が配列番号5の配列またはその誘導体の1つによって表されることを特徴とする請求項1から6または9から18のいずれか一項に記載のアデノウイルス。
  20. その発現が誘導性プロモーターのコントロール下に置かれている同種遺伝子を少なくとも1つ含むことを特徴とする、請求項1から19のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルス。
  21. その発現がテトラサイクリンまたはその類似体の1つによって誘導可能なプロモーターのコントロール下に置かれている同種遺伝子を少なくとも1つ含むことを特徴とする、請求項1から20のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルス。
  22. 当該1または複数の遺伝子が、前記アデノウイルスの複製及び/または増殖に必須である前記アデノウイルスのゲノム領域の全部または一部であることを特徴とする、請求項20または21に記載の組換えアデノウイルス。
  23. その複製及び/または増殖に必須の領域が、領域E4、E2、領域IVa2及び/または領域L5の全部または一部から選択されることを特徴とする、請求項22に記載の組換えアデノウイルス。
  24. 領域E2が、72KのcDNA、140KのポリメラーゼのcDNA及び87Kのプレターミナルタンパク質のcDNAに対応するフラグメントから選択されたフラグメントによって表されることを特徴とする、請求項23に記載の組換えアデノウイルス。
  25. 領域E4が、ヌクレオチド35576−32490に対応するTaq1−Bgl2フラグメントによって表されることを特徴とする請求項23に記載の組換えアデノウイルス。
  26. 領域E4が、少なくとも読取り枠ORF6によって表されることを特徴とする請求項23に記載の組換えアデノウイルス。
  27. 領域E4が、ORF6及びORF7の配列を含む34115位と32490位との間に存在するBgl2フラグメントによって表されることを特徴とする、請求項23または25に記載の組換えアデノウイルス。
  28. IVa2をコードする領域が、アデノウイルスAd5の配列上のヌクレオチド3328−6316を含むBglII−NruIフラグメント、ヌクレオチド4029−5719に対応するDraI−NlaIIIフラグメント、及び、ヌクレオチド4029−5788に対応するDraI−XhoIフラグメントから選択されたフラグメントから成ることを特徴とする、請求項23に記載の組換えアデノウイルス。
  29. 遺伝子E1の全部または一部が欠失しており、領域E4の全部または一部を誘導性プロモーターOp2/Tkのコントロール下に含むことを特徴とする、請求項1から23及び25から27のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルス。
  30. 遺伝子E1の全部または一部が欠失しており、領域E2の全部または一部を誘導性プロモーターOp2/Tkのコントロール下に含むことを特徴とする、請求項1から24のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルス。
  31. 遺伝子E1及びE2の全部または一部が欠失しており、領域E4の全部または一部を誘導性プロモーターOp2/Tkのコントロール下に含むことを特徴とする、請求項1から27及び29のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルス。
  32. 遺伝子E1及びE4の全部または一部が欠失しており、領域E2の全部または一部を誘導性プロモーターOp2/Tkのコントロール下に含むことを特徴とする、請求項1から27及び30のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルス。
  33. プロモーターOp2/Tkのコントロール下に置かれた領域からその固有のプロモーターが除去されていることを特徴とする、請求項20から32のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルス。
  34. 更に、1つまたは複数の治療用遺伝子をコードする核酸配列を含むことを特徴とする、請求項20から33のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルス。
  35. 前記核酸配列が、欠失配列に追加または置換して領域E1、E3またはE4の処に存在することを特徴とする、請求項34に記載の組換えアデノウイルス。
  36. その発現が誘導性プロモーターのコントロール下に置かれた、ウイルス起原の異種遺伝子を少なくとも1つ含むことを特徴とする、請求項1から19のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルス。
  37. その発現がテトラサイクリンまたはその類似体の1つによって誘導可能なプロモーターのコントロール下に置かれたウイルス起原の異種遺伝子を少なくとも1つ含むことを特徴とする、請求項1から19及び36のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルス。
  38. 遺伝子が、アデノ関連ウイルス(AAV)のゲノムの遺伝子またはその機能性相同体の1つであるかまたはそれから誘導されることを特徴とする、請求項36または37に記載の組換えアデノウイルス。
  39. 遺伝子がアデノ関連ウイルス(AAV)のキャプシド形成機能を表す遺伝子であることを特徴とする請求項38に記載の組換えアデノウイルス。
  40. AAVのrep遺伝子及び/またはcap遺伝子またはそれらの相同体の1つの発現を誘導性プロモーターのコントロール下に含むことを特徴とする請求項36から39のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルス。
  41. 発現カセットOp2/Tk−rep−capを含むことを特徴とする、請求項36から40のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルス。
  42. 固有のプロモーターp5がプロモーターOp2/Tkによって置換されていることを特徴とする、請求項41に記載の組換えアデノウイルス。
  43. ウイルス起原の異種遺伝子と誘導性プロモーターとが、欠失配列に追加または置換して前記アデノウイルスのゲノムの領域E1の処に存在することを特徴とする、請求項36から42のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルス。
  44. 自身のITRとキャプシド形成配列とを含むことを特徴とする請求項1から43のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルス。
  45. 少なくとも領域E1が非機能性であることを特徴とする、請求項1から44のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルス。
  46. アデノウイルスのゲノムがヒトもしくは動物に由来するかまたは混成型であることを特徴とする、請求項1から45のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルス。
  47. ヒト起原のアデノウイルスが、グループCに分類されるアデノウイルスから選択されることを特徴とする、請求項46に記載の組換えアデノウイルス。
  48. 動物起原のアデノウイルスが、イヌ、ウシ、ネズミ、ヒツジ、ブタ、トリ及びサルのアデノウイルスから選択されることを特徴とする、請求項4に記載の組換えアデノウイルス。
  49. AAVを作製するための、AAV起原の少なくとも1つの遺伝子をテトラサイクリン誘導性プロモーターのコントロール下に含む組換えアデノウイルスの使用。
  50. テトラサイクリンまたはその類似体の1つの存在下で、転写アクチベーターの発現カセットをそのゲノムに含む細胞系を、テトラサイクリン誘導性プロモーターのコントロール下のAAV起原の少なくとも1つの遺伝子を含むアデノウイルスと、AAV由来の組換えウイルスまたはAAVのITR間にトランスジーンを含むキャプシド形成プラスミドと共にコトランスフェクションする段階から成ることを特徴とするAAVの産生方法。
  51. アデノウイルスがrep遺伝子及びcap遺伝子をテトラサイクリン誘導性プロモーターのコントロール下に含むことを特徴とする、請求項50に記載の方法。
  52. AAVの産生が、十分な量のテトラサイクリンまたはその類似体の1つの存在によって誘発されることを特徴とする、請求項50または51に記載の方法。
  53. 形質転換細胞系が293細胞系に由来することを特徴とする、請求項50から52のいずれか一項に記載の方法。
  54. 細胞系が、テトラサイクリンまたはその類似体の1つの存在下でアデノウイルス中に存在する誘導性プロモーターの調節配列に結合し得る第一ポリペプチドと転写を活性化する第二ポリペプチドとの組合せから成る転写アクチベーターの発現カセットをそのゲノムに含む293細胞系であることを特徴とする、請求項53に記載の方法。
  55. 第一ポリペプチドが、テトラサイクリンまたはその類似体の1つが存在するときに限って前記誘導性プロモーターの調節配列に結合する能力をもつように突然変異させたテトラサイクリンの野生型リプレッサーであることを特徴とする請求項54に記載の方法。
  56. 突然変異が、野生型テトラサイクリンリプレッサーをコードする配列の少なくとも1つのアミノ酸の欠失、置換及び/または付加であることを特徴とする請求項55に記載の方法。
  57. 突然変異したテトラサイクリンリプレッサーが、71、95、101または102位に局在するアミノ酸の少なくとも1つが突然変異した野生型リプレッサーTn10であることを特徴とする、請求項55または56に記載の方法。
  58. テトラサイクリンリプレッサーの全部または一部が配列番号8の配列によって表されることを特徴とする、請求項54から57のいずれか一項に記載の方法。
  59. 第二ポリペプチドがタンパク質の転写活性化ドメインを含むことを特徴とする、請求項54から58のいずれか一項に記載の方法。
  60. タンパク質がHSVのビリオンタンパク質16(VP16)であることを特徴とする、請求項59に記載の方法。
  61. 前記転写アクチベーターの発現カセットが、テトラサイクリンまたはその類似体の1つによって誘導可能なプロモーターを含むことを特徴とする、請求項50から60のいずれか一項に記載の方法。
  62. 発現カセットOp2/Tk−TetR−VP16をそのゲノムに組み込んだ293細胞系を使用することを特徴とする、請求項50から61のいずれか一項に記載の方法。
  63. 請求項54から60に定義された転写アクチベーターの発現カセットをそのゲノムに組み込んだ293細胞系であることを特徴とする細胞系。
  64. 発現カセットOp2/Tk−TetR−VP16をそのゲノムに組み込んでいることを特徴とする、請求項63に記載の細胞系。
  65. アデノウイルスまたはAAVを産生するための請求項63または64に記載の細胞系の使用。
  66. アデノウイルスの相補性に必要な機能と請求項54から60に定義された転写アクチベーターとをトランス配置で含む細胞系を、
    領域E1に欠失を有する前記アデノウイルスのゲノムの左側部分を含む第一DNAと、
    前記アデノウイルスのゲノムの少なくとも右側部分を含み、その複製に必須の少なくとも1つの領域をテトラサイクリンによって誘導可能なプロモーターのコントロール下に有し、更に第一DNAに共通の部分を有している第二DNAと共に、テトラサイクリンまたはその類似体の1つの存在下でコトランスフェクションする段階と、
    組換えによって産生されたアデノウイルスを回収する段階とから成ることを特徴とする請求項1から35のいずれか一項に記載のアデノウイルスの産生方法。
  67. 更に、第一または第二のDNAが異種DNA配列を含むことを特徴とする、請求項66に記載の方法。
  68. 請求項1から35のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルスを少なくとも1つ含むことを特徴とする医薬組成物。
  69. 注射可能な製剤に許容される医薬用担体を含む請求項68に記載の医薬組成物。
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