Nothing Special   »   [go: up one dir, main page]

SK282843B6 - Defektný rekombinantný adenovírus a farmaceutický prostriedok s jeho obsahom - Google Patents

Defektný rekombinantný adenovírus a farmaceutický prostriedok s jeho obsahom Download PDF

Info

Publication number
SK282843B6
SK282843B6 SK312-95A SK31295A SK282843B6 SK 282843 B6 SK282843 B6 SK 282843B6 SK 31295 A SK31295 A SK 31295A SK 282843 B6 SK282843 B6 SK 282843B6
Authority
SK
Slovakia
Prior art keywords
gene
recombinant adenovirus
defective recombinant
genes
plasmid
Prior art date
Application number
SK312-95A
Other languages
English (en)
Other versions
SK31295A3 (en
Inventor
Michel Perricaudet
Emmanuelle Vigne
Patrice Yeh
Original Assignee
Rhone-Poulenc Rorer S. A.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from FR9308596A external-priority patent/FR2707664B1/fr
Priority claimed from FR9404590A external-priority patent/FR2718749B1/fr
Application filed by Rhone-Poulenc Rorer S. A. filed Critical Rhone-Poulenc Rorer S. A.
Publication of SK31295A3 publication Critical patent/SK31295A3/sk
Publication of SK282843B6 publication Critical patent/SK282843B6/sk

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C07K14/01—DNA viruses
    • C07K14/075—Adenoviridae
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/10011—Adenoviridae
    • C12N2710/10311—Mastadenovirus, e.g. human or simian adenoviruses
    • C12N2710/10322—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/10011—Adenoviridae
    • C12N2710/10311—Mastadenovirus, e.g. human or simian adenoviruses
    • C12N2710/10323—Virus like particles [VLP]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/10011—Adenoviridae
    • C12N2710/10311—Mastadenovirus, e.g. human or simian adenoviruses
    • C12N2710/10341—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2710/10343—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/10011—Adenoviridae
    • C12N2710/10311—Mastadenovirus, e.g. human or simian adenoviruses
    • C12N2710/10351—Methods of production or purification of viral material
    • C12N2710/10352—Methods of production or purification of viral material relating to complementing cells and packaging systems for producing virus or viral particles
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/10011—Adenoviridae
    • C12N2710/10311—Mastadenovirus, e.g. human or simian adenoviruses
    • C12N2710/10361—Methods of inactivation or attenuation
    • C12N2710/10362—Methods of inactivation or attenuation by genetic engineering
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
    • C12N2830/001—Vector systems having a special element relevant for transcription controllable enhancer/promoter combination
    • C12N2830/002—Vector systems having a special element relevant for transcription controllable enhancer/promoter combination inducible enhancer/promoter combination, e.g. hypoxia, iron, transcription factor

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Abstract

Opisujú sa vírusové vektory odvodené od adenovírusov a farmaceutické prostriedky obsahujúce takéto vektory.ŕ

Description

Oblasť techniky
Vynález sa týka nových vírusových vektorov a spôsobu ich prípravy a použitia v génovej terapii. Vynález sa tiež týka farmaceutických prostriedkov obsahujúcich tieto vírusové vektory. Vynález sa týka najmä rekombinantných adenovírusov použitých vo funkcii vektorov na génovú terapiu.
Doterajší stav techniky
Génová terapia spočíva v korekcii niektorých nedostatočnosti a abnormalít (mutácia, aberačná expresia atď.) zavedením genetickej informácie do postihnutej bunky alebo do postihnutého orgánu. Táto genetická informácia sa môže zaviesť buď in vitro do bunky extrahovanej z orgánu, pričom takto modifikovaná bunka sa potom opätovne zavedie do organizmu, alebo in vivo priamo do príslušného tkaniva. Pokiaľ ide o tento druhý spôsob, existujú rôzne techniky, z ktorých sa môžu uviesť jednotlivé techniky transfekcie zahŕňajúce použitie komplexov DNA a DEAE-dextránu (Pagano a kol., J. Virol. 1 (1967) 891), DNA a obalových proteínov (Kaneda a kol., Science 243 (1989) 375), DNA a lipidov (Felgner a kol., PNAS 84 (1987) 7413), použitie lipozómov (Fraley a kol., J. Biol. Chem. 225 (1980) 10431) atď. Nedávno sa ako sľubná alternatíva týchto fyzikálnych techník transfekcie ukázalo použitie vírusov ako vektorov na prenos génov. V tejto súvislosti sa testovali rôzne vírusy na určenie ich schopnosti infikovať rôzne bunkové populácie. Takto sa testovali najmä retrovírusy (RSV, HMS, MMS atď.), vírus HSV, adeno-pridružené vírusy a adenovirusy.
Ukázalo sa, že z týchto vírusov majú najmä adenovírusy niektoré zaujímavé vlastnosti z hľadiska ich použiteľnosti pri génovej terapii. Adenovírusy majú najmä dosť široké hostiteľské spektrum, sú schopné infikovať nehybné bunky, nepridružujú sa ku genómu infikovanej bunky a až doposiaľ neboli združené s významnými patológiami u človeka.
Adenovírusy sú vírusy s lineárnou dvojreťazovou DNA s dĺžkou asi 36 kb. Ich genóm obsahuje najmä obrátenú repetitívnu sekvenciu (ITR) na ich konci, opuzdrovaciu sekvenciu, skoré a neskoré gény (pozri obr. 1). Základnými skorými génmi sú gény E1 (Ela a Elb), E2, E3 a E4. Základnými neskorými génmi sú gény L1 až L5.
Vzhľadom na tieto vlastnosti sa adenovírusy už použili na prenos génov in vivo. Na tento účel sa pripravili rôzne vektory odvodené od adenovírusov, do ktorých sa zabudovali rôzne gény (beta-gal, OTC, alfa-1 AT, cytokíny atď.). V každom takto konštruovanom systéme sa adenovírus modifikoval tak, aby nebol schopný replikácie v infikovanej bunke. V týchto doposiaľ známych systémoch sú takto použité adenovírusy s deléciami oblastí E1 (Ela a/alebo Elb) a prípadne E3, pričom v úrovni týchto oblasti sú inzerované sekvencie heterológnej DNA (Levrero a kol., Gene 101 (1991) 195; Gosh-Choudhury a kol., Gene 50 (1986) 161). A predsa doposiaľ opísané vektory majú početné nedostatky, ktoré obmedzujú ich využitie v rámci génovej terapie. Všetky tieto vektory obsahujú najmä početné vírusové gény, ktorých expresia in vivo v rámci génovej terapie je nežiaduca. Navyše tieto vektory neumožňujú inkorporáciu fragmentov DNA značnej dĺžky, čo môže byť pri niektorých aplikáciách nevyhnutné.
Podstata vynálezu
Vynález umožňuje eliminovať tieto nedostatky. V rámci vynálezu sú opísané rekombinantné adenovírusy pre génovú terapiu, ktoré sú schopné účinne prenášať in vivo DNA (až do 30 kb), exprimovať túto DNA in vivo vo veľkej miere a stabilným spôsobom, pričom sa eliminuje akékoľvek riziko produkcie vírusových proteínov, prenosu vírusov, patogenity atď. Predovšetkým sa zistilo, že sa môže značne redukovať veľkosť genómu adenovírusu bez toho, aby sa bránilo tvorbe opuzdrených vírusových častíc. Táto skutočnosť je prekvapujúca vzhľadom na to, že v prípade niektorých ďalších vírusov, napríklad retrovírusov, sa pozorovalo, že niektoré sekvencie distribuované pozdĺž genómu boli na účinné opuzdrenie vírusových častíc nevyhnutné. Dôsledkom toho sa silno obmedzila realizácia vektorov, majúcich výrazné interné dclccic. Vynález tiež ukazuje, že ani supresia podstatnej časti vírusových génov nebráni tvorbe takej vírusovej častice. Okrem toho si takto získané rekombinantné adenovírusy zachovávajú napriek významným modifikáciám v ich genómovej štruktúre svoje výhodné vlastnosti, najmä silnú infekčnú schopnosť a stabilitu in vivo.
Vektory podľa vynálezu sú mimoriadne výhodné, pretože umožňujú inkorporáciu požadovaných sekvencií DNA značnej dĺžky. Takto sa môže inzerovať gén s dĺžkou presahujúcou 30 kb. To je obzvlášť zaujímavé pri niektorých patoíogických stavoch, ktorých liečenie vyžaduje koexpresiu niekoľkých génov alebo expresiu veľmi dlhých génov. Napríklad v prípade svalovej dystrofie sa až doposiaľ nemohla prenášať DNA zodpovedajúca natívnemu génu zodpovednému za tento patologický stav (gén dystrofínu) vzhľadom najej značnú dĺžku (14 kb).
Vektory podľa vynálezu sú tiež veľmi výhodné vzhľadom na to, že majú veľmi málo funkčných vírusových oblastí a že je teda veľmi obmedzené alebo celkom potlačené riziko spojené s použitím vírusu ako vektora pri génovej terapii (imunogenicita, patogenicita, transmisia, replikácia, rekombinácia atď.).
Vynález takto poskytuje vírusové vektory, ktoré sú obzvlášť prispôsobené na prenos a expresiu in vivo požadovaných sekvencií DNA.
Prvý predmet vynálezu sa teda týka defektného rekombinantného adenovírusu zahŕňajúceho:
- obrátenú repetitivnu sekvenciu (ITR),
- sekvenciu umožňujúcu opuzdrenie,
- sekvenciu heterológnej DNA, pričom v tomto adenovíruse:
- gén E1 je nefunkčný a
- aspoň jeden z génov E2, E4, L1-L5 je nefunkčný.
Výraz „defektný adenovírus“ v rámci vynálezu označuje adenovírus, ktorý nie je schopný sa autonómne replikovať v cieľovej bunke. Všeobecne je teda genóm defektného adenovírusu podľa vynálezu zbavený aspoň tých sekvencií, ktoré sú nevyhnutné na replikáciu tohto vírusu v infikovanej bunke. Tieto oblasti sa môžu buď odstrániť (celkom alebo čiastočne), alebo urobiť nefunkčnými, alebo nahradiť inými sekvenciami a to najmä heterológnej DNA.
Obrátené repetitívne sekvencie (ITR) tvoria pôvod replikácie adenovírusov. Tieto sekvencie sa nachádzajú na koncoch 3' a 5' vírusového genómu (pozri obr. 1), odkiaľ sa môžu ľahko izolovať klasickými technikami molekulárnej biológie. Nukleotidová sekvencia obrátených repetitívnych sekvencií ľudských adenovírusov (najmä sérotypov Ad2 a Ad5), rovnako ako psích adenovírusov (najmä CAV1 a CAV2) je opísaná v odbornej literatúre. Pokiaľ ide napríklad o adenovírus Ad5, zodpovedá ľavá sekvencia ITR oblasti zahŕňajúcej nukleotidy 1 až 103 genómu.
Opuzdrovacia sekvencia (tiež označovaná ako sekvencia Psi) je nevyhnutná na opuzdrenie vírusovej DNA. Táto oblasť teda musí byť prítomná, aby sa mohol pripraviť defektný rekombinantný vírus podľa vynálezu. Táto opuzdrovacia sekvencia sa v genóme adenovírusov nachádza medzi ľavou obrátenou repetitívnou sekvenciou (5') a génom E1 (pozri obr. 1). Táto sekvencia sa môže izolovať alebo syntetizovať umelo klasickými technikami molekulárnej biológie. Nukleotidová sekvencia opuzdrovacej sekvencie ľudských adenovírusov (najmä sérotypov Ad2 a Ad5), rovnako ako psích adenovírusov (najmä CAV1 a CAV2) sa opísala v príslušnej odbornej literatúre. Pokiaľ ide napríklad o adenovírus Ad5, zodpovedá opuzdrovacia sekvencia oblasti zahŕňajúcej nukleotidy 194 až 358 genómu.
Existujú rôzne sérotypy adenovírusu, ktorých štruktúra a vlastnosti sa trocha menia. Tieto vírusy však majú porovnateľnú genetickú organizáciu a inštrukcie opísané v tejto patentovej prihláške môže odborník ľahko využiť pre ľubovoľný typ adenovírusu.
Adenovírusy podľa vynálezu môžu byť ľudského, zvieracieho alebo zmiešaného (ľudského a zvieracieho) pôvodu.
Pokiaľ ide o adenovírusy ľudského pôvodu, potom je výhodné použiť adenovírusy klasifikované v skupine C. Ešte výhodnejšie sa z rôznych sérotypov ľudského adenovírusu používajú v rámci vynálezu adenovírusy typu 2 alebo 5 (Ad 2 alebo Ad 5).
Ako sa už uviedlo, môžu byť adenovírusy podľa vynálezu taktiež zvieracieho pôvodu alebo môžu zahŕňať sekvencie z adenovírusov zvieracieho pôvodu. Prihlasovateľ skutočne preukázal, že adenovírusy zvieracieho pôvodu sú schopné veľmi účinne infikovať ľudské bunky, a že sú neschopné množiť sa v ľudských bunkách, v ktorých sa testovali (pozri patentová prihláška FR 93 05954). Prihlasovateľ tiež preukázal, že adenovírusy zvieracieho pôvodu nie sú nijako transkomplemcntované adenovírusmi ľudského pôvodu, čo eliminuje riziko rekombinácie a propagácie in vivo v prítomnosti ľudského adenovírusu, čo by mohlo viesť k tvorbe infekčnej častice. Použitie adenovírusov alebo oblastí adenovírusov zvieracieho pôvodu je teda obzvlášť výhodné, pretože sú ešte ďalej obmedzené riziká spojené s použitím vírusu ako vektora pri génovej terapii.
Adenovírusy zvieracieho pôvodu použiteľné v rámci vynálezu môžu byť psieho, hovädzieho, myšieho, (napríklad: Mavl, Beard a kol., Virology 75 (1990) 81), ovčieho, prasacieho, vtáčieho alebo tiež opičieho (napríklad: SAV) pôvodu. Z vtáčích adenovírusov sa môžu najmä uviesť sérotypy 1 až 10 dostupné v ATCC, napríklad kmene Phelps (ATCC VR-432), Fontes (ATCC VR-280), P7-A (ATCC VR-827), IBH-2A (ATCC VR-828), J2-A (ATCC VR-829), T8-A (ATCC VR-830), K-l 1 (ATCC VR-921) alebo tiež kmene uvádzané ako ATCC VR-831. Z hovädzích adenovírusov sa môžu použiť rôzne známe sérotypy a najmä sérotypy dostupné v ATCC (typy 1 až 8) pod označením ATCC VR-313, 314, 639 - 642, 768 a 769. Taktiež sa môžu uviesť myšie adenovírusy FL (ATCC VR-550) a E20308 (ATCC VR-528), ovčí adenovírus typu 5 (ATCC VR-1343) alebo typu 6 (ATCC VR-1340), prasací adenovírus 5359 alebo opičie adenovírusy, akými sú najmä adenovírusy uvedené v ATCC pod číslami VR-591-594, 941-943, 195-203 atď.
Výhodne sa z rôznych adenovírusov zvieracieho pôvodu používajú v rámci vynálezu adenovírusy alebo oblasti adenovírusov psieho pôvodu a najmä všetky kmene adenovírusov CAV2 (napríklad kmeň manhattan alebo A26/61 (ATCC VR-800)). Psie adenovírusy boli predmetom početných štruktúrnych štúdií. V rámci doterajšieho stavu techniky sa takto opísali úplné reštrikčné mapy adenovírusov CAV1 a CAV2 (Spibey a kol. J. Gen. Virol. 70 (1989) 165) a klonované a sekvenované gény Ela a E3, ako aj sekvencie ITR (pozri najmä Spibey a kol., Vírus Res. 14 (1989) 241, Linné, Vírus Res. 23 (1992) 119, WO 91/11525).
Ako sa už uviedlo, obsahujú adenovírusy podľa vynálezu sekvenciu heterológnej DNA. Táto sekvencia heterológnej DNA označuje akúkoľvek sekvenciu DNA zavedenú do rekombinantného vírusu, ktorej prenos do cieľovej bunky a/alebo expresia v cieľovej bunke sú žiaduce.
Táto sekvencia heterológnej DNA môže zahŕňať jeden alebo niekoľko terapeutických génov kódujúcich antigénovc peptidy.
Terapeutickými génmi, ktoré sa môžu takto preniesť, sú všetky gény, ktorých transkripcia alebo translácia v cieľovej bunke generuje produkty majúce terapeutický účinok.
Môže isť najmä o gény kódujúce proteínové produkty s terapeutickým účinkom. Takto kódovaným proteínovým produktom môže byť proteín, peptid, aminokyselina atď. Tento proteínový produkt môže byť vzhľadom na cieľovú bunku homológny (to znamená produkt, ktorý je v cieľovej bunke normálne exprimovaný v prípade, že táto bunka nemá žiadnu patológiu). V tomto prípade expresia proteinu napríklad umožňuje zlepšiť nedostatočnú expresiu v cieľovej bunke tohto proteinu alebo nahradiť expresiu neaktívneho alebo málo aktívneho proteinu expresiou aktívneho proteinu. Terapeutický gén môže tiež kódovať mutant bunkového proteinu majúci zvýšenú stabilitu, modifikovanú aktivitu atď. Uvedený proteínový produkt môže byť tiež heterológny vzhľadom na cieľovú bunku. V tomto prípade môže exprimovaný proteín napríklad dopĺňať a zlepšovať nedostatočnú funkciu bunky a tým umožňovať, aby bola bunka schopná boja proti patologickému stavu.
Z uvedených terapeutických produktov sa v zmysle vynálezu môžu uviesť najmä enzýmy, krvné deriváty, hormóny, lymfokíny: interleukíny, interferóny, TNF atď. (FR 9203120), rastové faktory, prenášače nervových vzruchov alebo ich prekurzory, alebo syntézne enzýmy, trofické faktory: BDNF, CNTF, NGF, 1GF, GMF, aFGF, bFGF, NT3, NT5 atď., apolipoproteíny: ApoAI, ApoAIV, ApoE atď. (FR 9305125), dystrofín alebo minidystrofin (FR 9111947), gény so supresným účinkom proti nádorom: p53, Rb, RaplA, DCC, k-rev atď. (FR 9304745), gény kódujúce faktory uplatňujúce sa pri koagulácii: faktory VII, VIII, IX atď.
Terapeutickým génom môže tiež byť antimediátorový gén alebo antimediátorová sekvencia, ktorých expresia v cieľovej bunke umožňuje regulovať expresiu génov alebo prepis bunkových mRNA. Také sekvencie môžu byť napríklad v cieľovej bunke prepísané na komplementárne RNA bunkových mRNA a takto blokujú ich transláciu na proteíny technikou opísanou v patente EP 140 308.
Ako sa už uviedlo, môže sekvencia heterológnej DNA tiež obsahovať jeden alebo niekoľko génov, kódujúcich antigénový peptid, ktorý je u človeka schopný generovať imunitnú odpoveď. Pri tomto špecifickom uskutočnení vynález tak umožňuje vyhotoviť vakcíny umožňujúce urobiť človeka imúnnym, najmä proti mikroorganizmom alebo vírusom. Môže ísť najmä o špecifické antigénové peptidy vírusu Epstein-Barr, vírusu HIV, vírusu hepatitídy B (EP 185 573), vírusu nepravej besnoty alebo tiež o špecifické antigénové peptidy nádorov (EP 259 212).
Všeobecne sekvencia heterológnej DNA tiež obsahuje sekvencie umožňujúce expresiu terapeutického génu a/alebo génu kódujúceho antigénový peptid v infikovanej bun ke. Môže ísť o sekvencie ktoré sú prirodzene zodpovedné za expresiu uvažovaného génu v prípade, že sú tieto sekvencie schopné funkcie v infikovanej bunke. Tiež môže ísť o sekvencie rôzneho pôvodu (zodpovedné za expresiu ďalších proteínov alebo dokonca o syntetické sekvencie). Môže ísť najmä o promótorové sekvencie eukaryotických alebo vírusových génov. Môže napríklad ísť o promótorové sekvencie z genómov bunky, ktorá sa má infikovať. Rovnako tak môže ísť o promótorové sekvencie z genómu vírusu, vrátane použitého adenovírusu. V tejto súvislosti sa napríklad môžu uviesť promótory génov E1A, MLP, CMV, RSV atď. Okrem toho sa môžu tieto expresné sekvencie modifikovať pridaním aktivačných sekvencii, regulačných sekvencii atď. Keď génový inzert neobsahuje expresnú sekvenciu, potom sa môže inzerovať do genómu defektného vírusu za takou sekvenciou.
Sekvencia heterológnej DNA môže napokon tiež obsahovať, a to najmä pred terapeutickým génom, signálnu sekvenciu smerujúcu syntetizovaný terapeutický produkt do sekrečných ciest cieľovej bunky. Touto signálnou sekvenciou môže byť signálna sekvencia terapeutického produktu, i keď môže tiež ísť o ľubovoľnú inú funkčnú signálnu sekvenciu alebo o umelú signálnu sekvenciu.
Ako sa už uviedlo, majú vektory podľa vynálezu aspoň jeden z génov E2, E4, L1-L5 nefunkčný. Uvažovaný vírusový gén sa môže urobiť nefunkčným ľubovoľnou známou technikou používanou na tento účel, najmä supresiou, substitúciou, deléciou alebo adíciou jednej alebo niekoľkých báz do uvažovaného génu alebo uvažovaných génov. Tieto modifikácie sa môžu dosiahnuť in vitro (na izolovanej DNA) alebo in situ, napríklad použitím technik génového inžinierstva alebo tiež pôsobením mutagénnych činidiel.
Z uvedených mutagénnych činidiel sa môžu uviesť napríklad fyzikálne činidlá, akými sú energetické žiarenia (rôntgenové lúče, žiarenie gama, ultrafialové žiarenie atď.), alebo chemické činidlá schopné reagovať s rôznymi funkčnými skupinami báz DNA, akými sú napríklad alkylačné činidlá (etylmetánsulfonát (EMS), N-metyl-N'-nitro-N-nitrózoguanidín, N-nitrochinolín-l-oxid (NQO)), bialkylačné činidlá, interkalačné činidlá atď.
Deléciou sa v rámci tohto vynálezu rozumie akákoľvek supresia uvažovaného génu. Môže ísť najmä o celú kódujúcu oblasť uvedeného génu alebo o časť tejto oblasti a/alebo o celú promótorovú oblasť prepisu uvedeného génu alebo o časť tejto oblasti. Uvedená supresia sa môže uskutočniť štiepením pomocou príslušných reštrikčných enzýmov, potom ligáciou použitím klasických techník molekulárnej biológie, ako je to ilustrované v ďalej zaradených príkladoch.
Genetické modifikácie sa môžu dosiahnuť tiež génovým rozkladom, uskutočneným napríklad podľa protokolu pôvodne opísaného Rothsteinom (Meth. Enzymol. 101 (1983) 202). V tomto prípade sa časť kódujúcej sekvencie alebo celá táto sekvencia výhodne poruší, aby sa mohla nahradiť homológnou rekombináciou genómovej sekvencie nefunkčnou alebo mutantnou sekvenciou.
Uvedená genetická modifikácia alebo genetické modifikácie sa môžu lokalizovať do kódujúcej časti uvažovaného génu alebo mimo takúto kódujúcu oblasť, napríklad do oblastí zodpovedných za expresiu a/alebo prepisovú reguláciu uvedených génov. Nefunkčný charakter uvedených génov sa teda môže prejavovať produkciou inaktívneho proteínu spôsobenú štruktúrnymi alebo konformačnými modifikáciami, produkciou proteínu so zhoršenou aktivitou alebo tiež produkciou prírodného proteínu v zmenšenej miere alebo podľa požadovaného regulačného režimu.
Niektoré zmeny, ako presné mutácie, sú takého charakteru, že sa môžu bunkovými mechanizmami korigovať alebo zoslabiť. Takéto genetické zmeny majú obmedzený význam v priemyselnom meradle. Je teda obzvlášť výhodné, ak je uvedený nefunkčný charakter dokonale segregačne stabilný a/alebo nevratný.
Výhodne je gén nefunkčný dôsledkom čiastočnej alebo úplnej delécie.
Výhodne sú defektné rekombinantné adenovírusy podľa vynálezu zbavené neskorých génov adenovírusu.
Obzvlášť výhodné uskutočnenie vynálezu zahŕňa defektný rekombinantný adenovírus obsahujúci:
- sekvencie ITR,
- sekvenciu umožňujúcu opuzdrenie,
- sekvenciu heterológnej DNA a
- oblasť nesúcu gén E2 alebo časť tohto génu.
Ďalšie obzvlášť výhodné uskutočnenie vynálezu zahŕňa defektný rekombinantný adenovírus obsahujúci:
- sekvencie ITR,
- sekvenciu umožňujúcu opuzdrenie,
- sekvenciu heterológnej DNA a
- oblasť nesúca gén E4 alebo časť tohto génu.
Ďalšie obzvlášť výhodné uskutočnenie vynálezu zahrnuje replikačne defektný adenovírus, ktorý obsahuje:
- sekvencie ITR,
- sekvenciu umožňujúcu opuzdrenie,
- sekvenciu heterológnej DNA a
- funkčný gén E3 pod kontrolou heterológneho promótora.
V rámci obzvlášť výhodného uskutočnenia vynálezu majú vektory podľa vynálezu okrem toho gén E3, ktorého funkcia je pod kontrolou heterológneho promótora. Výhodnejšie majú uvedené vektory časť génu E3 umožňujúcu expresiu proteínu gpl9K.
Defektné rekombinantné adenovírusy sa môžu pripraviť rôznymi spôsobmi.
Prvý spôsob prípravy uvedených adcnovírusov spočíva v transfekcii DNA defektného rekombinantného vírusu pripravenej in vitro (buď ligáciou, alebo vo forme plazmidu) do kompetentného bunkového radu, t. j. nesúce v polohe trans všetky funkcie navyhnutné ku komplementácii defektného vírusu. Tieto funkcie sú výhodne integrované v genóme bunky, čo umožňuje vyvarovať sa rizika rekombinácie a udeľuje bunkovému radu zvýšenú stabilitu. Príprava takýchto bunkových radov sa opísala v ďalej zaradených príkladoch.
Druhý spôsob prípravy uvedených defektných rekombinantných adenovírusov spočíva v tom, že sa do príslušného bunkového radu súčasne transfekuje DNA defektného rekombinantného vírusu pripravená in vitro (buď ligáciou, alebo vo forme plazmidu) a DNA pomocného vírusu (vírus helper). Pri tomto spôsobe nie je nevyhnutné mať k dispozícii kompetentný bunkový rad schopný komplementovať všetky defektné funkcie rekombinantného adenovírusu. Časť týchto funkcií je v skutočnosti komplementovaná uvedeným pomocným vírusom. Tento pomocný vírus musí byť teda sám defektný a bunkový rad nesie v polohe trans funkcie nevyhnutné k jeho komplementácii. Aj táto príprava defektných rekombinantných adenovírusov je ilustrovaná v ďalej zaradených príkladoch realizácie vynálezu.
Z bunkových radov použiteľných v rámci vynálezu pri druhom spôsobe prípravy adenovírusov sa môže uviesť najmä bunkový rad 293 z obličiek ľudského zárodku, bunky KB, bunky Hela, MDCK, GHK atď. (pozri príklady uskutočnenia vynálezu).
Vektory, ktoré sa multiplifíkovali, sa potom izolujú, purifikujú a amplifikujú použitím klasických technik molekulárnej biológie.
Opisujú sa aj bunkové rady infikovateľné uvedenými adenovírusmi a obsahujúce funkcie združené v ich genóme, ktoré sú nevyhnutné ku komplementárni opísaného defektného rekombinantného adenovírusu. Opisujú sa najmä bunkové rady, ktoré vo svojom genóme obsahujú vo forme združenej v tomto genóme oblasti EI a E2 (najmä oblasť kódujúcu proteín 72K) a/alebo E4 a/alebo gén glukokortikoidového receptora. Výhodne sa tieto bunkové rady získajú z radu 293 alebo gm DBP6.
Vynález sa taktiež týka každého farmaceutického prostriedku obsahujúceho jeden alebo niekoľko defektných rekombinantných adenovírusov, ktoré už boli opísané. Tieto farmaceutické prostriedky podľa vynálezu sa môžu formulovať do formy vhodnej na topické, perorálne, parenterálne, intranazálne, intravenózne, intramuskuláme, subkutánne, intraokulárne, transdermálne alebo iné vhodné podanie.
Výhodne tento farmaceutický prostriedok obsahuje nosiče, ktoré sú farmaceutický prijateľné pre injikovateľný prostriedok. Môže ísť najmä o roztoky solí (dihydrogenfosforečnan sodný, hydrogenfosforečnan sodný, chlorid sodný, chlorid draselný, chlorid vápenatý alebo chlorid horečnatý, atď. alebo zmesi takýchto solí) v sterilnej, izotonickej forme, alebo o prostriedky vo vysušenej, najmä lyofilizovanej forme, z ktorých sa po pridaní sterilizovanej vody alebo fyziologického séra získajú injikovateľné roztoky.
Dávky vírusu použité pre injekciu môžu byť závislé od rôznych parametrov, najmä od použitého spôsobu podania, ošetrovaného patologického stavu, génu, k expresii ktorého má dôjsť, alebo tiež od uvažovanej dĺžky liečenia. Všeobecne sú rekombinantné adenovírusy podľa vynálezu formulované a podávané vo forme dávok obsahujúcich medzi 104 a 1014 pfu/ml, výhodne 106 až 1O10 pfu/ml. Výraz pfo („plaque forming unit“) zodpovedá infekčnej schopnosti roztoku vírusu a je stanovený infekciou príslušnej bunkovej kultúry, pričom sa všeobecne meria po 5 dňoch stanovením počtu infikovaných bunkových oblastí. Techniky, ktoré sa môžu použiť na stanovenie titra pfu roztoku vírusov, sú dostatočne dokumentované v príslušnej odbornej literatúre.
V závislosti od inzerovanej sekvencie heterológnej DNA sa adenovírusy podľa vynálezu môžu použiť na liečenie alebo prevenciu početných patologických stavov, zahŕňajúcich genetické choroby (dystrofia, cystická fibróza atď.), neurodegeneratívne choroby (Alzheimerova choroba, Parkinsonova choroba, ALS atď.), rakoviny, patologické stavy združené s poruchami koagulácie alebo s dyslipoproteinémiami, patologické stavy združené s vírusovými infekciami (hepatitídy, AIDS atď.) atď.
Prehľad obrázkov na výkresoch
Vynález sa ďalej bližšie vysvetlí s použitím odkazov na pripojené výkresy.
Obr. 1 znázorňuje genetickú organizáciu adenovírusu Ad5.
Na báze uvedených údajov je k dispozícii úplná sekvencia adenovírusu Ad5 a táto sekvencia umožňuje odborníkovi vybrať alebo vytvoriť ľubovoľné reštrikčné miesto a takto izolovať ľubovoľnú oblasť genómu.
Obr. 2 znázorňuje reštrikčnú mapu adenovírusu CAV2 (kmeň Manhattan, podľa uvedeného odkazu Spilbey a kol.). Obr. 3 znázorňuje konštrukciu defektného vírusu podľa vynálezu ligáciou.
Obr. 4 znázorňuje konštrukciu rekombinantného vírusu nesúceho gén E4.
Obr. 5 znázorňuje konštrukciu rekombinantného vírusu nesúceho gén E2.
Obr. 6 znázorňuje konštrukciu a zobrazenie plazmidu pPY32.
Obr. 7 znázorňuje zobrazenie plazmidu pPY55. Obr. 8 znázorňuje zobrazenie plazmidu p2.
Obr. 9 znázorňuje zobrazenie intermediámeho plazmidu použitého na konštrukciu plazmidu pITRL5-E4.
Obr. 10 znázorňuje zobrazenie plazmidu pITRL5-E4.
Príklady uskutočnenia vynálezu
V týchto príkladoch sa vynález bližšie objasní formou konkrétnych príkladov uskutočnenia vynálezu, pričom tieto príklady majú iba ilustračný charakter a nijako neobmedzujú rozsah vynálezu, ktorý je jednoznačne vymedzený formuláciou patentových nárokov.
Všeobecné techniky molekulárnej biológie
Metódy klasicky používané v molekulárnej biológii, akými sú preparatívna extrakcia plazmidovej DNA, odstredenie plazmidovej DNA v gradiente chloridu cézneho, elektroforéza na agarovom alebo akrylamidovom géli, purifikácia fragmentov DNA elektroelúciou, extrakcia proteinov fenolom alebo zmesou fenolu a chloroformu, precipitácia DNA v prostredí soli etanolom alebo izopropanolom, transformácia v Escherichia coli atď., sú odborníkovi veľmi dobre známe a sú dostatočne opísané v literatúre (Maniatis T. a kol., „Molecular Cloning, a Laboratory Manual“, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N. Y., 1982, Ausubel F. M. a kol. (nakl.), „Current Protocols in Molecular Biology“, John Wiley and Sons, New York, 1987).
Plazmidy typu pBR322, pUC a fágy radu M13 sú komerčne dostupné (Bethesda Research Laboratories).
Na ligácie sa môžu fragmenty DNA separovať podľa ich veľkosti elektroforézou na agarovom alebo akrylamidovom géli, extrahované fenolom alebo zmesou fenolu a chloroformu, vyzrážané etanolom a potom inkubované v prítomnosti DNA-ligázy fágu T4 (Biolabs) podľa doporučenia dodávateľa.
Doplnenie proeminentných koncov 5' sa môže vykonať s použitím Klenowovho fragmentu DNA-polymerázy I Escherichia coli (Biolabs) podľa inštrukcií dodávateľa. Deštrukcia proeminentných koncov 3' sa realizuje v prítomnosti DNA-polymerázy fágu T4 (Biolabs), použité podľa doporučenia výrobcu. Deštrukcia proeminentných koncov 5' sa realizuje šetrným pôsobením nukleázy SI.
Riadená mutagenéza in vitro s použitím syntetických oligodeoxynukleotidov sa môže uskutočniť metódou vyvinutou Taylorom a kol. (Nucleic Acids Res. 13 (1985) 8749 - 8764), pričom sa používa súprava distribuovaná firmou Amersham.
Enzymatická amplifikácia fragmentov DNA technikou nazvanou PCR (Polymeraze-catalyzed Chain Reaction, Saiki R. K. a kol., Science 230 (1985) 1350 - 1354, Mullis K. B. aFaloonaF. A., Mcth. Enzým. 155 (1987) 335 - 350) sa môže uskutočniť s použitím systému „DNA thermal cycler“ (Perkin Elmer Cetus) podľa inštrukcií výrobcu.
Overenie nukleotidových sekvencií sa môže uskutočniť metódou vyvinutou Sangerom a kol. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74 (1977) 5463 - 5467) s použitím súpravy distribuovanej firmou Amersham.
Použité bunkové rady
V ďalej zaradených príkladoch uskutočnenia sa môžu použiť nasledujúce bunkové rady:
- Bunkový rad 293 z obličiek ľudského zárodku (Graham a kol., J. Gen. Virol. 36 (1977) 59). Tento bunkový rad obsahuje najmä vo forme združenej vo svojom genóme ľavú časť genómu ľudského adenovírusu Ad5 (12 %).
- Ľudský bunkový rad KB: pôvodom z ľudského epidermálneho karcinómu. Tento bunkový rad, rovnako ako podmienky umožňujúce jeho kultiváciu sú dostupné v ATCC (referenčné označenie CCL17).
- Ľudský bunkový rad Hela: pôvodom z karcinómu ľudského epitelu. Tento bunkový rad je dostupný v ATCC (referenčné označenie CCL2). Rovnako sú tu dostupné aj podmienky umožňujúce kultiváciu tohto bunkového radu.
- Psí bunkový rad MDCK: kultivačné podmienky buniek MDCK opísal najmä Macatney a kol. v Science 44 (1988)
9.
- Bunkový rad gm DBP6 (Brough a kol., Virology 190 (1992) 624). Tento bunkový rad tvoria bunky Hela, nesúce gén E2 adenovírusu pod kontrolou LTR (dlhá koncová repetícia) MMTV.
Príklad 1
Tento príklad preukazuje realizovateľnosť rekombinantného adenovírusu zbaveného podstatnej časti vírusových génov. Na tento účel sa ligáciou in vitro konštruoval rad delečných mutantov, pričom každý z týchto mutantov sa súčasne transfekoval s pomocným vírusom (vírus helper) do buniek KB. Pretože tieto bunky neumožňujú propagáciu defektného vírusu v prípade El, je transkomplementácia riadená do oblasti El.
Z adenovírusu Ad5 sa štiepením a potom ligáciou in vitro pripravili rôzne delečné mutanty. Na tento účel sa vírusová DNA adenovírusu Ad5 izoluje technikou opísanou Lippem a kol. (J. Virol. 63 (1989) 5133), nato sa štiepi rôznymi reštrikčnými enzýmami (pozri obr. 3) a produkt získaný týmto štiepením sa podrobí ligácii v prítomnosti T4DNA-ligázy. Veľkosť jednotlivých delečných mutantov sa potom kontroluje na SDS-agarovom géli (0,8 %). Tieto delečné mutanty sa potom mapujú (pozri obr. 3). Tieto jednotlivé mutanty' obsahujú nasledujúce oblasti: mtl: ligácia medzi fragmentmi adenovírusu Ad5 0-20642 (5««I) a (Sau) 33797-35935, mt2: ligácia medzi fragmentmi adenovírusu Ad5 0-19549 (Ndel) a (Ndel) 31089-35935, mt3: ligácia medzi fragmentmi adenovírusu Ad5 0-10754 (ria/I) a (riadi) 25915-35935, mt4: ligácia medzi fragmentmi adenovírusu Ad5 0-11311 (Mlul) a (Mlul) 24392-35935, mt5; ligácia medzi fragmentmi adenovírusu Ad5 0-9462 (Sali) a (ÄÄoI) 29791-35935, mt6: ligácia medzi fragmentmi adenovírusu Ad5 0-5788 (Xhol) a (Aáol) 29791-35935 a mt7: ligácia medzi fragmentmi adenovírusu Ad5 0-3665 (Sphl) a (Sphl) 31224-35935.
Každý z takto pripravených mutantov sa transfekoval spoločne s vírusovou DNA Ad. RSVbetaGal (Stratford-Perricaudet a kol., J. Clin. Invest. 90 (1992) 626) do buniek KB v prítomnosti fosforečnanu vápenatého. 8 dní po transfekcii sa bunky izolovali a supernatanty kultúry sa amplifikovali nad bunkami KB až do času, kedy sa pre každú transfekciu získala zásobná vzorka. Z každej tejto vzorky sa izolovala a rozdelila epizómová DNA na gradiente chloridu cézncho. V každom prípade sa pozorovali dva odlíšiteľné pásy vírusu a tieto pásy sa izolovali a analyzovali. Najťažší zodpovedá vírusovej DNA Ad. RSVbetaGal a najľahší zodpovedá DNA rekombinantného vírusu generovaného ligáciou (obr. 3). Získaný titer pre naposledy uvedený prípad tvorí asi 108 pfu/ml.
S použitím rovnakej metodiky sa ligáciou in vitro konštruoval v adenovíruse druhý rad delečných mutantov. Tieto rôzne mutanty obsahujú nasledujúce oblasti: mt8: ligácia medzi fragmentmi 0-4623 (Apal) Ad RSVbetaGal a (Apal) 31909-35935 Ad5, mt9: ligácia medzi fragmentmi 0-10178 (5g/II) Ad RSVbetaGal a (BamHI) 21562-35935 Ad5.
Tieto mutanty nesúce gén LacZ pod kontrolou promótora LTR vírusu RSV sa potom kotransfikujú do buniek 293 v prítomnosti vírusovej DNA H2dl808 (Weinberg a kol., J. Virol. 57 (1986) 833), ktorá sa podrobila dclccii v oblasti E4. Podľa tejto druhej techniky je transkomplementácia vedená na E4 a už nie na El. Ako sa už uviedlo, umožňuje táto technika takto generovať rekombinantné vírusy majúce ako vírusový gén iba oblasť E4.
Príklad 2
Tento príklad opisuje prípravu defektného rekombinantného adenovírusu podľa vynálezu spočívajúcu v tom, že sa realizuje súčasná transfekcia pomocného vírusu (vírus helper) a DNA rekombinantného vírusu inkorporovaná v plazmide.
Na tento účel sa konštruoval plazmid nesúci spojovací ITR adenovírusu Ad5, opuzdrovaciu sekvenciu, gén E4 pod kontrolou svojho vlastného promótora a ako heterológny gén gén LacZ pod kontrolou promótora LTR vírusu RSV (obr. 4). Tento plazmid, označovaný ako pE4Gal, sa získal klonovaním a ligáciou nasledujúcich fragmentov (pozri obr. 4):
- Fragment HindlII-SacII z plazmidu pFG144 (Graham a kol., EMBO J. 8 (1989) 2077). Tento fragment nesie sekvencie ITR adenovírusu Ad5 na začiatku a na konci a opuzdrovaciu sekvenciu: fragment HindlII (34920)-SacII (352).
- Fragment adenovírusu Ad5 obsiahnutý medzi miestami SacII (lokalizované v úrovni páru báz 3827) a PstI (lokalizované v úrovni páru báz 4245).
- Fragment pSP 72 (Promega) obsiahnutý medzi miestami fttl (pb 32) a Sali (pb 34).
- Fragment Xhol-Xbal plazmidu pAdLTR GaliX opísaného Stratford-Perricaudetom a kol. (JCI 90 (1992) 626). Tento fragment nesie gén LacZ pod kontrolou LTR vírusu RSV.
- Fragment Xbal (pb 40)-AWeí (pb 2379) plazmidu pSP 72.
- Fragment Ndel (pb 31089)-HindlII (pb 34930) adenovírusu Ad5. Tento fragment lokalizovaný na pravom konci genómu adenovírusu Ad5 obsahuje oblasť E4 pod kontrolou svojho vlastného promótora. Klonoval sa v úrovni miest Ndel (2379) plazmidu pSP 72 a HindlII prvého fragmentu.
Tento plazmid sa získal klonovaním rôznych fragmentov vo vyznačenej oblasti plazmidu pSP 72. Je samozrejmé, že odborník môže získať z iných zdrojov aj ekvivalentné fragmenty.
Tento plazmid pE4Gal sa potom transfekuje spoločne s DNA vírusu H2dl808 do buniek 293 v prítomnosti fosforečnanu vápenatého. Postupom opísaným v príklade 1 sa potom pripraví rekombinantný vírus. Tento vírus nesie ako jediný vírusový gén gén E4 adenovírusu Ad5 (obr. 4). Jeho genóm má veľkosť asi 12 kb, čo umožňuje inzerovať heterológnu DNA značnej veľkosti (až 20 kb). Odborník môže takto ľahko nahradiť gén LacZ iným ľubovoľným terapeutickým génom z množiny génov, ktoré sa už spomínali. Okrem toho tento vírus nesie niektoré sekvencie pochádzajúce z plazmidu pSP 72, ktoré sa môžu prípadne eliminovať klasickými technikami molekulárnej biológie.
Príklad 3
Tento príklad opisuje prípravu ďalšieho defektného rekombinantného adenovírusu podľa vynálezu spoločnou transfekciou pomocného vírusu (vírus helper) a DNA rekombinantného vírusu inkorporovanej v plazmide.
Na tento účel sa konštruuje plazmid nesúci spojovaciu ITR adenovírusu Ad5, opuzdrovaciu sekvenciu, gén E2 adenovírusu AD2 pod kontrolou svojho vlastného promótora a ako heterológny gén gén LacZ pod kontrolou promótora LTR vírusu RSV (obr. 5). Tento plazmid označovaný ako pE2Gal sa získal klonovaním a ligáciou nasledujúcich fragmentov (pozri obr. 5):
- Fragment Hindlll-Sacll pochádzajúci z plazmidu pFG144 (Graham a kol., EMBO J. 8 ((1989) 2077). Tento fragment nesie na začiatku a konci sekvencie ITR adenovírusu Ad5 a opuzdrovaciu sekvenciu: fragment Hindlll (34920)-&cII (352). Klonoval sa s nasledujúcim fragmentom v úrovni miest Hindlll (16)-Pstl (32) plazmidu pSP 72.
- Fragment adenovírusu Ad5 obsiahnutý’ medzi miestami SacíI (lokalizované v úrovni páru báz 3827) a Pstl (lokalizované v úrovni páru báz 4245). Tento fragment sa klonoval v úrovni miesta SacII predchádzajúceho fragmentu a miesta Pstl (32) plazmidu pSP 72.
- Fragment plazmidu pSP 72 (Promega) obsiahnutý medzi miestami Pstl (pb 32) a Sali (pb 34).
- Fragment Xhol-Xbal plazmidu pAdLTR GallX opísaného Stratford-Perricaudetom a kol. (JCI 90 (1992) 626). Tento fragment nesie gén LacZ pod kontrolou LTR vírusu RSV. Klonoval sa v úrovni miest Sali (34) a Xbal plazmidu pSP 72.
- Fragment plazmidu pSP (Promega) obsiahnutý medzi miestami äJízI (pb 34) aBamUl (pb 46).
- Fragment SamHI (pb 21606)-SmaI (pb 27339) adenovírusu Ad2. Tento fragment genómu adenovírusu Ad2 obsahuje oblasť E2 pod kontrolou svojho vlastného promótora. Klonoval sa v úrovni miest fiamHI (46) a /ľcoRV plazmidu pSP 72.
- Fragment EcoRV (pb 81 )-Hindlll (pb 16) plazmidu pSP 72.
Tento plazmid sa získal klonovaním rôznych fragmentov vo vyznačenej oblasti plazmidu pSP 72. Je samozrejmé, že odborník môže z iných zdrojov pripraviť tiež ekvivalentné fragmenty.
Plazmid pE2Gal sa potom transfekuje spoločne s DNA vírusu H2dl802 zbaveného oblasti E2 (Rice a kol., J. Virol. 56 (1985) 767) do buniek 293 v prítomnosti fosforečnanu vápenatého. Postupom opísaným v príklade 1 sa potom pripraví rekombinantný vírus. Tento vírus nesie ako jediný vírusový gén gén E2 adenovírusu Ad2 (obr. 5). Jeho genóm má veľkosť asi 12 kb, čo umožňuje inzerciu heterológnej DNA značnej veľkosti (až 20 kb). Odborník môže takto ľahko nahradiť gén LacZ iným ľubovoľným terapeutickým génom z množiny génov, ktoré sa už spomínali. Tento vírus tiež obsahuje niektoré sekvencie pochádzajúce z intermediámeho plazmidu, ktoré sa môžu v prípade potreby odstrániť klasickými technikami molekulárnej biológie.
Príklad 4
Tento príklad opisuje konštrukciu bunkových radov komplementujúcich oblasti EI, E2 a/alebo E4 adenovírusov. Tieto bunkové rady umožňujú konštrukciu rekombinantných adenovírusov podľa vynálezu podrobených v týchto oblastiach delécii a to bez účasti pomocného vírusu (vírus helper). Tieto vírusy sa získajú rekombináciou in vivo a môžu obsahovať významné heterológne sekvencie.
Podľa LTR MMTV (Pharmacia) sa potenciálne cytotoxické oblasti E2 a E4 vložia pod kontrolu indukovateľného promótora, ktorý je indukovaný dexametazónom, buď v natívnej forme, alebo v minimálnej forme opísanej v PNAS 90 (1993) 5603; alebo systém potlačiteľný tetracyklínom opísaný Gossenom a Bujardom (PNAS 89 (1992) 5547). Je samozrejmé, že sa môžu použiť aj ďalšie promótory a to najmä varianty LTR MMTV nesúce napríklad regulačné heterológne oblasti (najmä oblasť „enhancer“). Bunkové rady podľa vynálezu sa pripravili transfekciou v prítomnosti fosforečnanu vápenatého zodpovedajúcich buniek fragmentom DNA nesúcim vyznačené gény (oblasti adenovírusu a/alebo génu glukokortikoidných receptorov) pod kontrolou promótora transkripcie a terminátora (polyadenylačné miesto). Terminátorom môže byť buď prirodzený terminátor transfekovaného génu, alebo odlišný terminátor, napríklad terminátor skorého mediátora vírusu SV40. Výhodne fragment DNA tiež nesie gén umožňujúci selekciu transformovaných buniek a napríklad gén rezistencie proti genicitínu. Tento rezistenčný gén môže tiež niesť odlišný fragment DNA spoločne transfekovaný s prvým fragmentom.
Po transfekcii sa transformované bunky podrobia selekcii a ich DNA sa analyzuje na overenie integrácie fragmentu DNA do genómu.
Táto technika umožňuje získať nasledujúce bunkové rady:
1. bunky 293 obsahujúce gén zo 72K oblasti E2 adenovírusu Ad5 pod kontrolou LTR MMTV,
2. bunky 293 obsahujúce gén zo 72K oblasti E2 adenovírusu Ad5 pod kontrolou LTR MMTV a gén glukokortikoidného receptora,
3. bunky 293 obsahujúce gén zo 72K oblasti E2 adenovírusu Ad5 pod kontrolou LTR MMTV a oblasti E4 pod kontrolou LTR MMTV,
4. bunky 293 obsahujúce gén zo 72K oblasti E2 adenovírusu Ad5 pod kontrolou LTR MMTV, oblasť E4 pod kontrolou LTR MMTV a gén glukokortikoidncho receptora,
5. bunky 293 majúce oblasť E4 pod kontrolou LTR MMTV,
6. bunky 293 majúce oblasť E4 pod kontrolou LTR MMTV a gén glukokortikoidného receptora,
7. bunky gm DBP6 majúce oblasti E1A a E1B pod kontrolou ich vlastného promótora a
8. bunky gm DBP6 majúce oblasti E1A a E1B pod kontrolou ich vlastného promótora a oblasť E4 pod kontrolou LTR MMTV.
Príklad 5
Tento príklad opisuje prípravu defektných rekombinantných adenovírusov podľa vynálezu, ktorých genóm sa podrobil delécii génov El, E3 a E4. Podľa výhodného spôsobu realizácie ilustrovaného v tomto príklade a v príklade 3 je najmä genóm rekombinantných adenovírusov podľa vynálezu modifikovaný takým spôsobom, že aspoň gény El a E4 sú nefunkčné. Takéto adenovírusy majú predovšetkým schopnosť inkorporovať významné heterológne gény. Ináč majú tieto vektory zvýšenú bezpečnosť vzhľadom na deléciu oblasti E4, ktorá sa uplatňuje pri regulácii expresie neskorých génov, v stabilite neskorých obalových RNA, v extinkcii expresie proteínov hostiteľskej bunky a v účinnosti replikácie vírusovej DNA. Tieto vektory majú teda veľmi obmedzený prepisový šum a veľmi obmedzenú expresiu vírusových génov. Napokon je obzvlášť výhodná skutočnosť, že tieto vektory sa môžu produkovať v kon
SK 282843 Β6 centráciách, ktoré sú porovnateľné s koncentráciami dosiahnuteľnými pri divých adenovírusoch.
Tieto adenovírusy sa pripravili z plazmidu pPY55 nesúceho pravú modifikovanú časť genómu adenovírusu Ad5 a to buď spoločnou transfekciou s pomocným plazmidom (plasmid helper) (pozri tiež príklady 1, 2 a 3) alebo s použitím komplementujúceho bunkového radu (príklad 4).
5.1 Konštrukcia plazmidu pPY55
a) Konštrukcia plazmidu pPY55
Fragment A vrII-Bc/1 plazmidu pFG144 (F. L. Graham a kol. EMBO J. 8 (1989) 2077 - 2085) zodpovedajúci pravému koncu genómu adenovírusu Ad5 sa najskôr klonoval medzi miestami Xbal a BamHl vektora pIC19H pripraveného zo štruktúry dam-. Takto sa generuje plazmid pPY23. Významnou charakteristikou plazmidu pPY23 je, že miesto Sali pochádzajúce z klonovacej množiny miest vektora pIC19H zostáva jediné a že je lokalizované vedľa pravého konca genómu adenovírusu Ad5. Fragment HaelII-Sa/I plazmidu pPY23, ktorý obsahuje pravý koniec genómu adenovírusu Ad5 od miesta Haelll lokalizovaného v polohe 35614, sa potom klonuje medzi miestami EcoRV a Xhol vektora pIC20H, čo generuje plazmid pPY29. Zaujímavou charakteristikou tohto plazmidu je, že miesta Xbal a Clal pochádzajúce z klonovacej množiny miest vektora pIC20H sú lokalizované vedľa spojenia £coRVI-/7aeIII rezultujúceho z klonovania. Okrem toho toto spojenie modifikuje nukleotidovú štruktúru bezprostredne priľahlú k miestu Clal, ktoré sa teraz stalo metylovateľným v štruktúre dam+. Fragment Xbal (30470)-WaelI (32811) genómu adenovírusu Ad5 sa potom klonuje medzi miestami Xbal a Clal plazmidu pPY29 pripraveného zo štruktúiy dam-, čo generuje plazmid pPY30. Fragment Sstl plazmidu pPY30, ktorý zodpovedá sekvencii genómu adenovírusu Ad5 od miesta Ss/I v polohe 30556 až k pravému koncu sa potom klonuje medzi miestami Sstl vektora pIC20H, čo generuje plazmid pPY31, ktorého reštrikčná mapa s inzertom lokalizovaným medzi miestami Hindlll je znázornená na obr. 6.
Plazmid pPY32 sa získal po čiastočnom štiepení plazmidu pPY31 s použitím BbHl, úplným štiepením s použitím BamHl a následnou ligáciou. Plazmid pPY32 teda zodpovedá delécii genómu adenovírusu Ad5 situovanej medzi miesto BumHI plazmidu pPY31 a miesto BbHl lokalizované v polohe 30818. Reštrikčná mapa fragmentu Hindlll plazmidu pPY32 je uvedená na obr. 6. Charakteristikou plazmidu pPY32 je, že májediné miesta Sali aXbal.
b) Konštrukcia plazmidu pPY47
Fragment BamHl (21562)-Λ£α1 (28592) genómu adenovírusu AD5 sa najskôr klonoval medzi miestami BamHl a Xbal vektora plC19H pripraveného zo štruktúry dam-, čo generuje plazmid pPY17. Tento plazmid teda obsahuje fragment ΖΛλγΠΙΙ (26328)-Bg/II (28133) genómu adenovírusu Ad5, ktorý sa môže klonovať medzi miestami Hindlll a BgHI vektora pIC20R na generovanie plazmidu pPY34. Jednou z charakteristík tohto plazmidu je, že miesto BamHl pochádzajúce z klonovacej množiny miest je lokalizované v bezprostrednej blízkosti miesta Hindlll (26328) genómu adenovírusu Ad5.
Fragment BamHl (21562)-Hindľll (26328) genómu adenovírusu Ad5 pochádzajúci z plazmidu pPY17 sa potom klonoval medzi miestami BamHl a Hindlll plazmidu pPY34, čo generuje plazmid pPY39. Fragment BamHI-Xbal plazmidu pPY39 pripravený zo štruktúry dam-, obsahujúci časť genómu adenovírusu Ad5 obsiahnutú medzi miestami BamHl (21562) a BgHI (28133), sa potom klono val medzi miestami BamHl aXbal vektora pIC19H pripraveného zo štruktúry dam-. Takto sa generuje plazmid pPY47, ktorého zaujímavou charakteristikou je, že miesto Sali pochádzajúce z klonovacej množiny miest sa lokalizovalo v blízkosti miesta EňmflII (obr. 7).
c) Konštrukcia plazmidu pPY55
Fragment SaH-Xbal plazmidu pPY47 pripravený zo štruktúry dam- a obsahujúci časť genómu adenovírusu Ad5 počínajúc od miesta BamHl (21562) a končiac miestom Bg/II (28133) sa klonoval medzi miestami Sali a Xbal plazmidu pPY32, čo generuje plazmid pPY55. Tento plazmid sa priamo použije na získanie rekombinantného adenovírusu, v ktorom došlo k delécii aspoň v oblasti E3 (delécia medzi miestami BgHI lokalizovanými v polohách 28133 a 30818 genómu adenovírusu Ad5) a v oblasti E4 v jeho integrite (delécia medzi miestami Maell (32811) a Haelll (35614) genómu adenovírusu Ad5 (obr. 7).
5.2 Príprava adenovírusu obsahujúceho aspoň jednu deléciu v oblasti E4 a výhodne aspoň v oblastiach EI a E4
a) Príprava transfekcii do buniek 293 spoločne s pomocným vírusom E4 (vírus helper)
Podstata tejto prípravy spočíva v transkomplementácii medzi „minivírusom“ (vírus helper) exprimujúcim oblasť E4 a rekombinantným vírusom, v ktorom došlo k delécii aspoň v oblasti E3 a E4. Tieto vírusy sa získajú ligáciou in vitro alebo po rekombinácii in vivo podľa nasledujúcich stratégií:
i) Ako DNA vírusu Ad-dl324 (Thimmappaya a kol. Celí 31 (1982) 543), tak aj plazmid pPY55, štiepené s použitím BamHl, sa najskôr podrobia ligácii in vitro, načo sa transfekujú spoločne s plazmidom pEAGal (je opísaný v príklade 2) do buniek 293.
ii) DNA vírusu Ad-dl324 štiepená s použitím £coRI a plazmid pPY55 štiepený s použitím BamHl sa transfekujú spoločne s plazmidom pE4Gal do buniek 293.
iii) Tak DNA adenovírusu Ad5, ako aj plazmid pPY55, štiepené s použitím BamHl, sa podrobia ligácii a potom sa transfekujú spoločne s plazmidom pE4Gal do buniek 293.
iv) DNA adenovírusu Ad5 štiepená s použitím £coRI a plazmid pPY55 štiepený s použitím BamHl sa transfekujú spoločne s pEAGal do buniek 293.
Stratégie i) a ii) umožňujú generovať rekombinantný adenovírus s deléciami v oblastiach El, E3 a E4; stratégie iii) a iv) umožňujú generovať rekombinantný adenovírus s deléciami v oblastiach E3 a E4. Je samozrejmé, že namiesto DNA vírusu Ad-dl324 je možné pri stratégiách i) a ii) použiť DNA rekombinantného vírusu s deléciou v oblasti El, ktorý však exprimuje akýkoľvek transgén, na generovanie rekombinantného vírusu s deléciami v oblastiach El, E3 a E4, exprimujúceho uvedený transgén.
b) Príprava pomocou bunkových radov transkomplementujúcich funkcie El a E4
Podstata tejto prípravy spočíva v skutočnosti, že bunkový rad odvodený od radu exprimujúceho oblasť El, napríklad bunkový rad 293, a exprimujúceho tiež aspoň otvorené fázy ORF'6 a ORF6/7 oblasti E4 adenovírusu Ad5 pod kontrolou promótora, napríklad indukovateľného promótora, je schopný súčasne transkomplementovať tak oblasť El, ako aj oblasť E4 adenovírusu Ad5. Takéto bunkové rady sa opísali v príklade 4.
Rekombinantný vírus s deléciami v oblastiach El, E3 a E4 sa teda môže získať ligáciou in vitro alebo «kombináciou in vivo podľa ďalej opísaných protokolov. Nech už sa na generovanie vírusu s deléciou aspoň v oblasti E4 použil akýkoľvek protokol, po transfekcii do použitých buniek sa pozoroval cytopatický efekt (ukazujúci na produkciu rekombinantných vírusov). Bunky sa potom izolovali, rozrušili v ich supematante tromi cyklami zmrazenie-rozmrazenie a potom odstredili počas 10 minút pri 4000 otáčkach za minútu. Takto získaný supematant sa potom amplifikoval na čerstvej bunkovej kultúre (bunky 293 v prípade protokolov a) a bunky 293 exprimujúce oblasť E4 v prípade protokolu b)). Vírusy sa potom purifikovali a ich DNA sa analyzovala metódou podľa Hirta (ako už bolo uvedené). Na gradiente chloridu cézneho sa potom pripraví zásobná množina vírusu.
Príklad 6
Tento príklad opisuje prípravu defektných rekombinantných adenovírusov podľa vynálezu, ktorých genóm má deléciu génov El, E3, L5 a E4. Tieto vektory sú obzvlášť výhodné, pretože oblasť L5 kóduje reťazec, ktorý je extrémne toxickým proteínom pre bunku.
Tieto adenovírusy sa pripravili z plazmidu p2 nesúceho modifikovanú pravú časť genómu adenovírusu Ad5 spoločnou transfekciou s rôznymi pomocnými plazmidmi (plasmid helper). Uvedené adenovírusy sa môžu tiež pripraviť s použitím komplementujúceho bunkového radu.
6.1 Konštrukcia plazmidu p2
Tento plazmid obsahuje celú pravú oblasť genómu adenovírusu Ad5 počínajúc od miesta BamHI (21562), v ktorej sa uskutočnila delécia fragmentu medzi miestami Xbal (28592) a/1 vr II (35463) nesúceho gény E3, L5 a E4. Plazmid p2 sa získal klonovaním a ligáciou nasledujúcich fragmentov v plazmide pIC19R, ktorý sa linearizoval s použitím BamHI a defosforyloval (obr. 8):
- fragment genómu adenovírusu Ad5 obsiahnutý medzi miestami BamHI (21562) aYbal (28592) a
- pravý koniec genómu adenovírusu Ad5 (obsahujúci pravú ITR) od miesta Avrll (35463) do miesta Beli (kompatibilný BamHI).
6.2 Konštrukcia pomocného plazmidu (pITRL5-E4) nesúceho gén L5
Pomocný plazmid pITRL5-E4 nesie v konfigurácii trans gény E4 a L5. Zodpovedá plazmidu pE4Gal, opísanému v príklade 2 a obsahuje navyše oblasť L5 kódujúcu reťazec pod kontrolou promótora MLP adenovírusu Ad2. Plazmid pITRL5-E4 sa konštruoval nasledujúcim spôsobom (obr. 9 a 10).
Syntetizuje sa oligonukleotid s 58 pb obsahujúci v zmysle 5'-3' miesto Hindlll, ATG reťazca a sekvenciu kódujúcu reťazec až k miestu Ndel v polohe 31089 genómu adenovírusu Ad5. Sekvencia tohto oligonukleotidu je v orientácii 5'-3' nasledujúca:
AAGCTTftTCAftGCGCGCAAGACCGTCTGAftHATACCTTCAACCCCGTGTATCCATATr:
Miesta Hindlll na konci 5' a Ndel na konci 3' sú raz podčiarknuté a ATG reťazec je podčiarknutý dva razy.
Fragment Sspl-Hindlll obsahujúci sekvenciu promótora MLP nasledovanou tripartitným lídrom adenovírusu Ad2 sa izoloval z plazmidu pMLPlO (Ballay a kol. (1987) UCLA Symposia on molecular and cellular biology, New šerieš, zv. 70, Robinson a kol. (nakl.) New York, 481). Tento fragment sa vložil s opísaným oligonukleotidom s 58 pb medzi miesta Ndel a EcoRV plazmidu pIC19R, pričom vznikol intermediárny plazmid (pozri obr. 9). Fragment SacII-(tupé konce)-MZeI plazmidu pE4Gal (príklad 2) sa potom zaviedol do uvedeného intermediámeho plazmidu medzi miesta Sspl a Ndel, pričom vzniká plazmid pITRL5-E4 (obr. 10).
6.3 Príprava defektných rekombinantných adenovírusov obsahujúcich delécie v oblastiach El, E3, L5 a E4
a) Príprava spoločnou transfekciou s pomocným vírusom (vírus helper) do buniek 293
Podstata tejto prípravy spočíva v transkomplementácii medzi „minivírusom“ (vírus helper) exprimujúcim oblasť L5 alebo oblasti E4 a L5 a rekombinantným vírusom s deléciami aspoň v oblastiach E3, E4 a L5.
Tieto vírusy sa získali buď ligáciou in vitro, alebo po rekombinácii in vivo podľa nasledujúcich stratégií:
i) Tak DNA vírusu Ad-dl324 (Thimmappaya a kol. Celí 31 (1982) 543), ako aj plazmid p2, štiepené s použitím BamHI, sa najskôr podrobia ligácii in vitro, načo sa transfekujú spoločne s pomocným plazmidom pITR5-E4 (príklad 6.2) do buniek 293.
ii) DNA vírusu Ad-dl324 štiepená s použitím EcoRI a plazmid p2 štiepený s použitím BamHI sa transfekujú spoločne s plazmidom pITRL5-E4 do buniek 293.
iii) DNA adenovírusu Ad5, a plazmid p2, štiepené s použitím BamHI, sa podrobia ligácii a potom sa transfekujú spoločne s plazmidom pITRL5-E4 do buniek 293.
iv) DNA adenovírusu Ad5 štiepená s použitím EcoRI a plazmid p2 štiepený s použitím BamHI sa transfekujú spoločne s pITRL5-E4 do buniek 293.
Stratégie i) a ii) umožňujú generovať rekombinantný adenovírus s deléciami v oblastiach El, E3, L5 a E4; stratégie iii) a iv) umožňujú generovať rekombinantný adenovírus s deléciami v oblastiach E3, L5 a E4. Je samozrejmé, že namiesto DNA vírusu Ad-dl324 je možné pri stratégiách i) a ii) použiť DNA rekombinantného vírusu s deléciou v oblasti El, exprimujúceho ľubovoľný transgén na generovanie rekombinantného vírusu s deléciami v oblastiach El, E3, L5 a E4, exprimujúceho uvedený transgén.
Opísané protokoly sa môžu tiež realizovať s použitím pomocného vírusu nesúceho iba oblasť L5 a s použitím bunkového radu schopného exprimovať oblasti El a E4 adenovírusu a opísané v príklade 4.
Inak je tiež možné použiť komplementujúci bunkový rad schopný exprimovať oblasti El, E4 a L5 a tým celkom vylúčiť použitie uvedeného pomocného vírusu.
Po transfekcii sa produkované vírusy izolujú, amplifikujú a purifikujú v podmienkach opísaných v príklade 5.

Claims (21)

  1. PATENTOVÉ NÁROKY
    1. Defektný rekombinantný adenovírus, vyznačujúci sa tým, že obsahuje
    - sekvencie ITR,
    - sekvenciu umožňujúcu opuzdrenie a
    - sekvenciu heterológnej DNA, pričom v tomto adenovíruse je gén El a aspoň jeden z génov E2, E4 a L1-L5 nefunkčný.
  2. 2. Defektný rekombinantný adenovírus podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že je ľudského, zvieracieho alebo zmiešaného pôvodu.
  3. 3. Defektný rekombinantný adenovírus podľa nároku 2, vyznačujúci sa tým, že adenovírusy ľudského pôvodu sa zvolili z adenovírusov klasifikovaných v
    SK 282843 Β6 skupine C, výhodne z adenovírusov typu 2 alebo 5 onačených ako Ad2 alebo Ad5.
  4. 4. Defcktný rekombinantný adenovírus podľa nároku 2, vyznačujúci sa tým, že adenovírusy zvieracieho pôvodu sa zvolili z adenovírusov psieho, bovinného, myšieho, ovčieho, prasacieho, vtáčieho a opičieho pôvodu.
  5. 5. Defektný rekombinantný adenovírus podľa niektorého z predchádzajúcich nárokov, vyznačujúci sa t ý m , že aspoň gény E1 a E4 sú nefunkčné.
  6. 6. Defektný rekombinantný adenovírus podľa niektorého z predchádzajúcich nárokov, vyznačujúci sa t ý m , že je zbavený neskorých génov L1-L5.
  7. 7. Defektný rekombinantný adenovírus podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že obsahuje
    - sekvencie ITR,
    - sekvenciu umožňujúcu opuzdrenie,
    - sekvenciu heterológnej DNA a
    - oblasť nesúcu gén E2 alebo jeho časť.
  8. 8. Defektný rekombinantný adenovírus podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že obsahuje
    - sekvencie ITR,
    - sekvenciu umožňujúcu opuzdrenie,
    - sekvenciu heterológnej DNA a
    - oblasť nesúcu gén E4 alebo jeho časť.
  9. 9. Defektný rekombinantný adenovírus podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že ďalej E3 gény sa pomocou delécie stali nefunkčnými, a že jeho genóm má deléciu génov El, E3 a E4.
  10. 10. Defektný rekombinantný adenovírus podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že ďalej E3 gény sa pomocou delécie stali nefunkčnými, a že jeho genóm má deléciu génov El, E3, E4 a L5.
  11. 11. Replikačne defektný rekombinantný adenovírus podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 8, vyznačujúci sa tým, že obsahuje
    - sekvencie ITR,
    - sekvenciu umožňujúcu opuzdrenie,
    - sekvenciu heterológnej DNA a
    - funkčný gén E3 pod kontrolou heterológneho promótora.
  12. 12. Defektný rekombinantný adenovírus podľa niektorého z predchádzajúcich nárokov, vyznačujúci sa t ý m , že sekvencia heterológnej DNA obsahuje jeden alebo niekoľko terapeutických génov a/alebo jeden alcbo niekoľko génov kódujúcich antigénové peptidy.
  13. 13. Defektný rekombinantný adenovírus podľa nároku 12, vyznačujúci sa tým, že terapeutický gén sa zvoli z génov kódujúcich enzýmy, krvné deriváty, hormóny, lymfokíny, ako sú interleukíny, interferóny TNF atď., rastové faktory, prenášače nervových vzruchov alebo ich prekurzory, alebo syntézne enzýmy, alebo trofické faktory, ako sú BDNF, CNTF, NGF, IGF, GMF, aFGF, bFGF, NT3, NT5 atď., apolipoproteíny, ako sú ApoAI, ApoIV, ApoE atď., dystrofln alebo minidystrofin, z génov potlačujúcich nádory alebo z génov kódujúcich faktory uplatňujúce sa pri koagulácii, ako sú faktory VII, VIII, IX atď.
  14. 14. Defektný rekombinantný adenovírus podľa nároku 12, vyznačujúci sa tým, že terapeutickým génom je antimediátorový gén alebo sekvencia, ktorých expresia v cieľovej bunke umožňuje regulovať expresiu génov alebo prepis bunkových mRNA.
  15. 15. Defektný rekombinantný adenovírus podľa nároku 12, vyznačujúci sa tým, že gén kóduje antigénový peptid schopný generovať u človeka imunitný ohlas proti mikroorganizmom alebo vírusom.
  16. 16. Defektný rekombinantný adenovírus podľa nároku 15, vyznačujúci sa tým, že gén kóduje špe cifický antigénový peptid vírusu Epstein-Barr, vírusu HIV, vírusu hepatitídy B, vírusu nepravej besnoty alebo tiež špecifický antigénový peptid nádorov.
  17. 17. Defektný rekombinantný adenovírus podľa niektorého z predchádzajúcich nárokov, vyznačujúci sa t ý m , že sekvencia heterológnej DNA tiež obsahuje sekvencie umožňujúce expresiu terapeutického génu a/alebo génu kódujúceho antigénový peptid v infikovanej bunke.
  18. 18. Defektný rekombinantný adenovírus podľa niektorého z predchádzajúcich nárokov, vyznačujúci sa t ý m , že sekvencia heterológnej DNA obsahuje pred terapeutickým génom signálnu sekvenciu smerujúcu syntetizovaný terapeutický produkt do sekrečných ciest cieľovej bunky.
  19. 19. Farmaceutický prostriedok, vyznačujúci sa t ý m , že obsahuje aspoň jeden defektný rekombinantný adenovírus podľa niektorého z nárokov 1 až 18.
  20. 20. Farmaceutický prostriedok podľa nároku 19. vyzná í u j ú c i sa tým, že obsahuje defektný rekombinantný adenovírus podľa niektorého z nárokov 5 až
    10.
  21. 21. Farmaceutický prostriedok podľa nárokov 19 alebo 20, vyznačujúci sa tým, že obsahuje farmaceutický prijateľný nosič pre injikovateľnú formuláciu.
SK312-95A 1993-07-13 1994-07-08 Defektný rekombinantný adenovírus a farmaceutický prostriedok s jeho obsahom SK282843B6 (sk)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
FR9308596A FR2707664B1 (fr) 1993-07-13 1993-07-13 Vecteurs viraux et utilisation en thérapie génique.
FR9404590A FR2718749B1 (fr) 1994-04-18 1994-04-18 Vecteurs viraux et utilisation en thérapie génique.
PCT/FR1994/000851 WO1995002697A1 (fr) 1993-07-13 1994-07-08 Vecteurs adenoviraux defectifs et utilisation en therapie genique

Publications (2)

Publication Number Publication Date
SK31295A3 SK31295A3 (en) 1996-05-08
SK282843B6 true SK282843B6 (sk) 2002-12-03

Family

ID=26230472

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
SK312-95A SK282843B6 (sk) 1993-07-13 1994-07-08 Defektný rekombinantný adenovírus a farmaceutický prostriedok s jeho obsahom

Country Status (23)

Country Link
US (1) US20030096787A1 (sk)
EP (1) EP0667912B1 (sk)
JP (1) JP4190028B2 (sk)
KR (1) KR100356615B1 (sk)
CN (1) CN1115414C (sk)
AT (1) ATE399873T1 (sk)
AU (1) AU7264694A (sk)
BR (1) BR9405507A (sk)
CA (1) CA2144040A1 (sk)
CZ (1) CZ287157B6 (sk)
DE (1) DE69435108D1 (sk)
DK (1) DK0667912T3 (sk)
ES (1) ES2310924T3 (sk)
FI (1) FI951138A (sk)
HU (1) HU216871B (sk)
IL (1) IL110284A0 (sk)
NO (1) NO321309B1 (sk)
NZ (1) NZ269156A (sk)
PL (1) PL179877B1 (sk)
PT (1) PT667912E (sk)
RU (1) RU2219241C2 (sk)
SK (1) SK282843B6 (sk)
WO (1) WO1995002697A1 (sk)

Families Citing this family (227)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6410010B1 (en) 1992-10-13 2002-06-25 Board Of Regents, The University Of Texas System Recombinant P53 adenovirus compositions
US5747469A (en) * 1991-03-06 1998-05-05 Board Of Regents, The University Of Texas System Methods and compositions comprising DNA damaging agents and p53
WO1992015680A1 (en) 1991-03-06 1992-09-17 Board Of Regents, The University Of Texas System Methods and compositions for the selective inhibition of gene expression
CA2162497A1 (en) 1993-06-10 1994-12-22 Sheila Connelly Adenoviral vectors for treatment of hemophilia
US7252989B1 (en) * 1994-04-04 2007-08-07 Board Of Regents, The University Of Texas System Adenovirus supervector system
US5851806A (en) * 1994-06-10 1998-12-22 Genvec, Inc. Complementary adenoviral systems and cell lines
JP3816518B2 (ja) * 1994-06-10 2006-08-30 ジェンベク、インコーポレイティッド 相補的なアデノウイルスベクター系と細胞系
DE69531387T2 (de) * 1994-08-16 2004-04-22 Crucell Holland B.V. Von Adenovirus abgeleitete rekombinante Vektoren, für Gentherapie
FR2723697B1 (fr) * 1994-08-17 1996-09-20 Rhone Poulenc Rorer Sa Methode de traitement de la restenose par la therapie genique
CA2203809C (en) * 1994-10-28 2008-06-03 James M. Wilson Recombinant adenovirus and methods of use thereof
US5856152A (en) * 1994-10-28 1999-01-05 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Hybrid adenovirus-AAV vector and methods of use therefor
FR2727867B1 (fr) * 1994-12-13 1997-01-31 Rhone Poulenc Rorer Sa Transfert de genes dans les motoneurones medullaires au moyen de vecteurs adenoviraux
IL116816A (en) * 1995-01-20 2003-05-29 Rhone Poulenc Rorer Sa Cell for the production of a defective recombinant adenovirus or an adeno-associated virus and the various uses thereof
FR2738575B1 (fr) * 1995-09-08 1997-10-10 Centre Nat Rech Scient Cellules pour la production d'adenovirus recombinants
FR2741891B1 (fr) * 1995-06-01 1998-01-09 Centre Nat Rech Scient Cellules pour la production d'adenovirus recombinants
FR2729674B1 (fr) * 1995-01-20 1997-04-11 Centre Nat Rech Scient Cellules pour la production d'adenovirus recombinants
FR2730504B1 (fr) * 1995-02-13 1997-03-28 Rhone Poulenc Rorer Sa Procede de preparation de genomes d'adenovirus recombinants
US5637456A (en) * 1995-02-17 1997-06-10 The University Of Texas, Board Of Regents Rapid test for determining the amount of functionally inactive gene in a gene therapy vector preparation
US5652224A (en) 1995-02-24 1997-07-29 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Methods and compositions for gene therapy for the treatment of defects in lipoprotein metabolism
EA001616B1 (ru) 1995-02-28 2001-06-25 Зе Риджентс Оф Зи Юнивесити Оф Кэлифоньэ Способ лечения болезни сердца, способ лечения недостаточности периферических сосудов и способ ограничения доставки и экспрессии трансгенной конструкции в определенном органе или структуре
US6752987B1 (en) 1995-02-28 2004-06-22 The Regents Of The University Of California Adenovirus encoding human adenylylcyclase (AC) VI
US20020103147A1 (en) 1997-09-05 2002-08-01 Hammond H. Kirk Gene therapy for congestive heart failure
FR2731710B1 (fr) * 1995-03-14 1997-04-30 Rhone Poulenc Rorer Sa Virus recombinants exprimant la lecithine cholesterol acyltransferase et utilisations en therapie genique
JP3770333B2 (ja) * 1995-03-15 2006-04-26 大日本住友製薬株式会社 組換えｄｎａウイルスおよびその製造方法
US5707618A (en) * 1995-03-24 1998-01-13 Genzyme Corporation Adenovirus vectors for gene therapy
FR2732357B1 (fr) * 1995-03-31 1997-04-30 Rhone Poulenc Rorer Sa Vecteurs viraux et utilisation pour le traitement des desordres hyperproliferatifs, notamment de la restenose
EP0821739B1 (en) * 1995-04-17 2003-06-18 The Board Of Regents, The University Of Texas System An adenovirus helper-virus system
FR2734826B1 (fr) * 1995-06-01 1997-07-04 Rhone Poulenc Rorer Sa Deltap62, ses variants, sequences nucleiques et leurs utilisations
US6019978A (en) * 1995-06-05 2000-02-01 The Wistar Institute Of Anatomy And Biology Replication-defective adenovirus human type 5 recombinant as a vaccine carrier
US5698202A (en) * 1995-06-05 1997-12-16 The Wistar Institute Of Anatomy & Biology Replication-defective adenovirus human type 5 recombinant as a rabies vaccine carrier
US6281010B1 (en) 1995-06-05 2001-08-28 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Adenovirus gene therapy vehicle and cell line
US5756283A (en) * 1995-06-05 1998-05-26 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Method for improved production of recombinant adeno-associated viruses for gene therapy
US6783980B2 (en) * 1995-06-15 2004-08-31 Crucell Holland B.V. Packaging systems for human recombinant adenovirus to be used in gene therapy
US5994128A (en) 1995-06-15 1999-11-30 Introgene B.V. Packaging systems for human recombinant adenovirus to be used in gene therapy
US6265212B1 (en) 1995-06-15 2001-07-24 Introgene B.V. Packaging systems for human recombinant adenovirus to be used in gene therapy
WO1997000954A1 (en) * 1995-06-23 1997-01-09 Board Of Regents, The University Of Texas System C-cam expression constructs and their application in cancer therapy
FR2735789B1 (fr) 1995-06-23 1997-07-25 Centre Nat Rech Scient Adenovirus recombinants, leur utilisation pour preparer des aav, lignee cellulaire complementaire et compositions pharmaceutiques les contenant
FR2737222B1 (fr) * 1995-07-24 1997-10-17 Transgene Sa Nouveaux vecteurs viraux et lignee pour la therapie genique
FR2737221B1 (fr) * 1995-07-24 1997-10-17 Transgene Sa Nouveaux vecteurs viraux pour la therapie genique
AUPN477695A0 (en) * 1995-08-14 1995-09-07 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Gene therapy
US6482803B1 (en) 1995-09-01 2002-11-19 Board Of Regents, The University Of Texas System Modification of mutated P53 gene in tumors by retroviral delivery of ribozyme A
AU7674896A (en) * 1995-10-31 1997-05-22 Board Of Regents, The University Of Texas System Adenovirus-antisense k-ras expression vectors and their application in cancer therapy
US6004797A (en) * 1995-11-09 1999-12-21 Avigen, Inc. Adenovirus helper-free recombinant AAV Virion production
JP2006075171A (ja) * 1995-11-09 2006-03-23 Avigen Inc 組換えａａｖビリオン産生における使用のための補助機能
JP2000500017A (ja) * 1995-11-17 2000-01-11 ウォルフガンク−エム フランツ 遺伝子治療核酸構造体、その製造と心臓疾患治療へのその利用
FR2746110B1 (fr) * 1996-03-14 1998-04-17 Methode de traitement par therapie genique des tumeurs humaines et virus recombinants correspondants
US6132989A (en) * 1996-06-03 2000-10-17 University Of Washington Methods and compositions for enhanced stability of non-adenoviral DNA
US20040156861A1 (en) 1996-07-11 2004-08-12 Figdor Carl Gustav Melanoma associated peptide analogues and vaccines against melanoma
US5958892A (en) 1996-07-30 1999-09-28 Board Of Regents, The University Of Texas System 2-methoxyestradiol-induced apoptosis in cancer cells
US6083716A (en) * 1996-09-06 2000-07-04 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Chimpanzee adenovirus vectors
US7232899B2 (en) 1996-09-25 2007-06-19 The Scripps Research Institute Adenovirus vectors, packaging cell lines, compositions, and methods for preparation and use
CA2266342C (en) * 1996-09-25 2010-06-08 Novartis Ag Packaging cell lines for use in facilitating the development of high-capacity adenoviral vectors
US6544523B1 (en) 1996-11-13 2003-04-08 Chiron Corporation Mutant forms of Fas ligand and uses thereof
US7008776B1 (en) 1996-12-06 2006-03-07 Aventis Pharmaceuticals Inc. Compositions and methods for effecting the levels of high density lipoprotein (HDL) cholesterol and apolipoprotein AI very low density lipoprotein (VLDL) cholesterol and low density lipoprotein (LDL) cholesterol
BR9713847A (pt) 1996-12-06 2000-02-29 Rhone Poulenc Rorer Pharma Polipeptìdeo isolado codificado por um gene semelhante a lipase, composição, composição farmacêutica, fragmento antigênico, ácido nucleico isolado, vetor, célula recombinante, anticorpo, célula de hibridoma, processos para preparar um polipeptìdeo, para triar agonistas ou antagonistas de atividade llg, para a hidrólise enzimática de um éster de fosfatidilcolina, e para melhorar o perfil de lipìdeo no soro de um humano ou outro animal tendo um perfil de lipìdeo indesejável, e, camundongo transgênico.
WO1998032860A1 (en) * 1997-01-28 1998-07-30 Baxter International Inc. Methods for highly efficient generation of adenoviral vectors
US6403370B1 (en) 1997-02-10 2002-06-11 Genstar Therapeutics Corporation Oncolytic/immunogenic complementary-adenoviral vector system
EP0979290A2 (en) 1997-04-28 2000-02-16 Aventis Pharma S.A. Adenovirus-mediated intratumoral delivery of an angiogenesis antagonist for the treatment of tumors
AUPO856097A0 (en) * 1997-08-14 1997-09-04 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Vector
US6251677B1 (en) 1997-08-25 2001-06-26 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Hybrid adenovirus-AAV virus and methods of use thereof
US6875606B1 (en) 1997-10-23 2005-04-05 The United States Of America As Represented By The Department Of Veterans Affairs Human α-7 nicotinic receptor promoter
US6653088B1 (en) 1997-10-24 2003-11-25 Aventis Pharma S.A. Interaction test for the investigation of inhibitory molecules of the interaction between a presenilin and the β-amyloid peptide
CA2671261A1 (en) 1997-11-06 1999-05-20 Novartis Vaccines And Diagnostics S.R.L. Neisserial antigens
ATE302267T1 (de) 1998-01-08 2005-09-15 Aventis Pharma Inc Transgenes kaninchen, dass ein funktionelles menschliches lipoprotein(a) exprimiert
ES2333071T5 (es) 1998-01-14 2015-08-17 Novartis Vaccines And Diagnostics S.R.L. Antígenos de Neisseria meningitidis
US6670188B1 (en) 1998-04-24 2003-12-30 Crucell Holland B.V. Packaging systems for human recombinant adenovirus to be used in gene therapy
BR9910089A (pt) 1998-05-01 2004-06-08 Chiron Corp Composições e antìgenos de neisseria meningitidis
US6225456B1 (en) 1998-05-07 2001-05-01 University Technololy Corporation Ras suppressor SUR-5
US6506889B1 (en) 1998-05-19 2003-01-14 University Technology Corporation Ras suppressor SUR-8 and related compositions and methods
US6413776B1 (en) 1998-06-12 2002-07-02 Galapagos Geonomics N.V. High throughput screening of gene function using adenoviral libraries for functional genomics applications
US6328958B1 (en) * 1998-08-28 2001-12-11 Duke University Deleted adenovirus vectors and methods of making and administering the same
US6441156B1 (en) 1998-12-30 2002-08-27 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Calcium channel compositions and methods of use thereof
US6387368B1 (en) 1999-02-08 2002-05-14 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Hybrid adenovirus-AAV virus and methods of use thereof
US6291226B1 (en) * 1999-02-25 2001-09-18 National Research Council Of Canada Adenovirus mutants with deleted protease gene
PT1533380E (pt) * 1999-04-15 2010-02-09 Crucell Holland Bv Produção de proteínas recombinantes numa célula humana compreendendo pelo menos uma proteína e1 de adenovírus
BR0010130A (pt) 1999-04-30 2002-06-04 Chiron Spa Antìgenos de neisseria conservados
GB9911683D0 (en) 1999-05-19 1999-07-21 Chiron Spa Antigenic peptides
US6793926B1 (en) 1999-05-27 2004-09-21 Genovo, Inc. Methods for production of a recombinant adeno-associated virus
FR2794771B1 (fr) 1999-06-11 2001-08-10 Aventis Pharma Sa Adenovirus recombinants codant pour le transporteur specifique de l'iode (nis)
GB9916529D0 (en) 1999-07-14 1999-09-15 Chiron Spa Antigenic peptides
FR2799472B1 (fr) 1999-10-07 2004-07-16 Aventis Pharma Sa Preparation d'adenovirus recombinants et de banques adenovirales
PT2275551E (pt) 1999-10-29 2015-06-29 Novartis Vaccines & Diagnostic Péptidos antigénicos de neisseria
ES2507100T3 (es) 2000-01-17 2014-10-14 Novartis Vaccines And Diagnostics S.R.L. Vacuna OMV suplementada contra meningococo
WO2001074900A2 (en) 2000-03-31 2001-10-11 Aventis Pharmaceuticals Products Inc. Nuclear factor kb inducing factor
GB0018307D0 (en) 2000-07-26 2000-09-13 Aventis Pharm Prod Inc Polypeptides
WO2001092550A2 (en) * 2000-05-31 2001-12-06 Human Gene Therapy Research Institute Methods and compositions for efficient gene transfer using transcomplementary vectors
EP1328543B1 (en) 2000-10-27 2009-08-12 Novartis Vaccines and Diagnostics S.r.l. Nucleic acids and proteins from streptococcus groups a & b
US7060442B2 (en) 2000-10-30 2006-06-13 Regents Of The University Of Michigan Modulators on Nod2 signaling
BR0116756A (pt) 2000-12-28 2005-01-04 Wyeth Corp Proteìna protetora recombinante de streptococcus pneumoniae e uso da mesma
GB0107658D0 (en) 2001-03-27 2001-05-16 Chiron Spa Streptococcus pneumoniae
GB0107661D0 (en) 2001-03-27 2001-05-16 Chiron Spa Staphylococcus aureus
AUPR518501A0 (en) 2001-05-22 2001-06-14 Unisearch Limited Yin yang-1
US6682929B2 (en) 2001-07-23 2004-01-27 Genvec, Inc. Adenovector complementing cells
US7569217B2 (en) 2001-09-24 2009-08-04 University Of Saskatchewan Porcine adenovirus E1 and E4 regions
MX339524B (es) 2001-10-11 2016-05-30 Wyeth Corp Composiciones inmunogenicas novedosas para la prevencion y tratamiento de enfermedad meningococica.
ATE406912T1 (de) 2001-12-12 2008-09-15 Novartis Vaccines & Diagnostic Immunisierung gegen chlamydia tracheomatis
EP1465664A1 (en) * 2002-01-18 2004-10-13 Schering Aktiengesellschaft Stabilized formulations of adenovirus
US7319001B2 (en) 2002-03-09 2008-01-15 Neurogenex Co., Ltd. High throughput system for producing recombinant viruses using site-specific recombination
EP2316921B1 (en) 2002-05-24 2014-05-14 Merck Sharp & Dohme Corp. Neutralizing human anti-IGFR antibody
CA2421269A1 (en) 2002-08-09 2004-02-09 President And Fellows Of Harvard College Methods and compositions for extending the life span and increasing the stress resistance of cells and organisms
US7977049B2 (en) 2002-08-09 2011-07-12 President And Fellows Of Harvard College Methods and compositions for extending the life span and increasing the stress resistance of cells and organisms
US7785608B2 (en) 2002-08-30 2010-08-31 Wyeth Holdings Corporation Immunogenic compositions for the prevention and treatment of meningococcal disease
RU2244928C2 (ru) * 2003-02-19 2005-01-20 Пинигина Нина Максимовна Эндогенная фармацевтическая композиция, полученная на основе целенаправленной активации гуморальных медиаторов нервных окончаний коры головного мозга
GB0308198D0 (en) 2003-04-09 2003-05-14 Chiron Srl ADP-ribosylating bacterial toxin
WO2005012537A2 (en) * 2003-07-25 2005-02-10 Genvec, Inc. Adenoviral vector-based vaccines
DE602004025726D1 (de) 2003-11-14 2010-04-08 Genvec Inc Pharmazeutische verbindung zur behandlung von lokal fortgeschrittenem primär inoperablen pankreaskarzinom (lapc).
US7432057B2 (en) 2004-01-30 2008-10-07 Michigan State University Genetic test for PSE-susceptible turkeys
US8268324B2 (en) 2004-03-29 2012-09-18 Galpharma Co., Ltd. Modified galectin 9 proteins and use thereof
CA2563396A1 (en) 2004-04-12 2005-11-24 The Government Of The United States Of America, As Represented By The Se Cretary, Department Of Health And Human Services Method of using adenoviral vectors to induce an immune response
BRPI0510475B8 (pt) 2004-05-26 2021-05-25 Bayer Pharma AG adenovírus quimérico recombinante, uso do mesmo no tratamento de câncer e métodos de inibição de crescimento de uma célula de câncer, de fornecimento de uma proteína terapêutica a uma célula e para o isolamento do adenovírus
JP5022217B2 (ja) 2004-06-18 2012-09-12 デューク ユニバーシティー 匂い物質受容体のモジュレーター
US7604798B2 (en) 2004-07-15 2009-10-20 Northwestern University Methods and compositions for importing nucleic acids into cell nuclei
AU2005274948B2 (en) 2004-07-16 2011-09-22 Genvec, Inc. Vaccines against aids comprising CMV/R-nucleic acid constructs
JP2008511336A (ja) * 2004-09-01 2008-04-17 アメリカ合衆国 免疫原性が増加したアデノウイルスベクターをインビボで用いる方法
EP2002003B1 (en) 2005-05-27 2015-12-30 Ospedale San Raffaele S.r.l. Gene vector comprising mi-rna
EP1929021A2 (en) 2005-08-31 2008-06-11 Genvec, Inc. Adenoviral vector-based malaria vaccines
EP1951297A2 (en) 2005-11-10 2008-08-06 GenVec, Inc. Adenoviral vector-based foot-and-mouth disease vaccine
EP2054431B1 (en) 2006-06-09 2011-08-31 Novartis AG Conformers of bacterial adhesins
MY151438A (en) 2006-07-28 2014-05-30 Sanofi Aventis Compositions and method for treatment of tumors
EP2068922B1 (en) 2006-10-19 2012-06-27 CSL Limited Anti-il-13r alpha 1 antibodies and their uses thereof
EP2829551B1 (en) 2006-10-19 2017-12-13 CSL Limited High affinity antibody antagonists of interleukin-13 receptor alpha 1
AR064642A1 (es) 2006-12-22 2009-04-15 Wyeth Corp Polinucleotido vector que lo comprende celula recombinante que comprende el vector polipeptido , anticuerpo , composicion que comprende el polinucleotido , vector , celula recombinante polipeptido o anticuerpo , uso de la composicion y metodo para preparar la composicion misma y preparar una composi
KR20090128494A (ko) 2007-03-24 2009-12-15 겐자임 코포레이션 인간 아포리포프로틴 ｂ에 상보적인 안티센스 올리고뉴클레오타이드 투여
CN101067139B (zh) * 2007-05-14 2010-05-26 清华大学深圳研究生院 一种RNAi载体及其应用
CN101619324B (zh) * 2008-07-01 2013-06-26 中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所 复制缺陷型重组腺病毒Ad41载体系统及其应用
WO2010045659A1 (en) 2008-10-17 2010-04-22 American Gene Technologies International Inc. Safe lentiviral vectors for targeted delivery of multiple therapeutic molecules
JP2012508174A (ja) 2008-11-05 2012-04-05 ワイス・エルエルシー β溶血性連鎖球菌（ＢＨＳ）疾患を予防するための多成分免疫原性組成物
EP2373338B1 (en) 2008-12-03 2017-02-15 The Johns Hopkins University Annexina2 as immunological target
KR20110091796A (ko) 2008-12-04 2011-08-12 오피케이오 큐알엔에이, 엘엘씨 종양 억제 유전자에 대한 천연 안티센스 전사체의 억제에 의해 종양 억제 유전자 관련된 질환의 치료
WO2010096561A1 (en) 2009-02-18 2010-08-26 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Synthetic hiv/siv gag proteins and uses thereof
WO2011047316A1 (en) 2009-10-16 2011-04-21 The United States Of America, As Represented By The Secretary Department Of Health And Human Services Nucleic acid sequences encoding expandable hiv mosaic proteins
BR112012010824A2 (pt) 2009-11-09 2018-03-06 Genvec Inc adenovirus simios e métodos de uso
WO2011057254A2 (en) 2009-11-09 2011-05-12 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Simian adenoviral vector-based vaccines
EP2547362B1 (en) 2010-03-17 2021-08-25 Cornell University Disrupted adenovirus-based vaccine against drugs of abuse
WO2012021730A2 (en) 2010-08-11 2012-02-16 Genvec, Inc. Respiratory syncytial virus (rsv) vaccine
PL3246044T5 (pl) 2010-08-23 2024-06-17 Wyeth Llc Stabilne preparaty antygenów rLP2086 Neisseria meningitidis
ES2728282T3 (es) 2010-09-10 2019-10-23 Wyeth Llc Variantes no lipidadas de antígenos ORF2086 de Neisseria meningitidis
WO2012083297A2 (en) 2010-12-17 2012-06-21 Genvec, Inc. Adenoviral vectors with modified hexon regions
EP2654786B1 (en) 2010-12-20 2019-02-20 GenVec, Inc. Adenoviral vector-based dengue fever vaccine
AU2012236345B2 (en) 2011-03-29 2014-10-02 Dynavax Technologies Corporation TLR8 transgenic animals
CN102240405A (zh) * 2011-05-09 2011-11-16 上海市第十人民医院 ApoA-Ⅰmilano基因药物
WO2012162428A1 (en) 2011-05-23 2012-11-29 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health & Human Services Prime-boost vaccination for viral infection
CA2851251C (en) 2011-10-05 2023-09-12 Genvec, Inc. Simian (gorilla) adenovirus or adenoviral vectors and methods of use
US9580476B2 (en) 2011-10-05 2017-02-28 Genvec, Inc. Adenoviral vector-based respiratory syncytial virus (RSV) vaccine
BR112014008249B1 (pt) 2011-10-05 2022-03-15 Genvec Inc Adenovírus ou vetor adenoviral e composição com os mesmos
EP2764012B1 (en) 2011-10-05 2022-02-23 GenVec, Inc. Adenoviral vectors and methods of use
CA3132111A1 (en) 2011-12-28 2013-07-04 Nippon Shinyaku Co., Ltd. Antisense nucleic acids for skipping of exon 55 of human dystrophin gene
US20150157700A1 (en) 2012-02-02 2015-06-11 GanVec, Inc. Adenoviral vector-based malaria vaccine
RU2491097C1 (ru) * 2012-02-16 2013-08-27 Общество с ограниченной ответственностью "НТфарма" Фармацевтическая композиция и способ терапии нейродегенеративных заболеваний, в частности бокового амиотрофического склероза
RU2665841C2 (ru) 2012-03-09 2018-09-04 Пфайзер Инк. Композиции neisseria meningitidis и способы их применения
SA115360586B1 (ar) 2012-03-09 2017-04-12 فايزر انك تركيبات لعلاج الالتهاب السحائي البكتيري وطرق لتحضيرها
EP2855511B1 (en) 2012-05-29 2019-07-24 GenVec, Inc. Herpes simplex virus vaccine
WO2013181128A1 (en) 2012-05-29 2013-12-05 Genvec, Inc. Modified serotype 28 adenoviral vectors
WO2014107739A1 (en) 2013-01-07 2014-07-10 Eleven Biotherapeutics, Inc. Antibodies against pcsk9
CA2903716C (en) 2013-03-08 2019-04-09 Pfizer Inc. Immunogenic fusion polypeptides
US10981961B2 (en) 2013-03-11 2021-04-20 University Of Florida Research Foundation, Incorporated Delivery of card protein as therapy for occular inflammation
DK2970398T3 (da) 2013-03-13 2024-08-05 Us Health Præfusions-rsv-f-proteiner og anvendelse deraf
RU2662968C2 (ru) 2013-09-08 2018-07-31 Пфайзер Инк. Иммуногенная композиция против neisseria meningitidis (варианты)
RU2710307C2 (ru) * 2013-09-12 2019-12-26 Байомарин Фармасьютикал Инк. Векторы экспрессии фактора viii на основе аденоассоциированного вируса
CA3183645A1 (en) 2013-10-25 2015-04-30 Psioxus Therapeutics Limited Oncolytic adenoviruses armed with heterologous genes
WO2015127094A1 (en) 2014-02-19 2015-08-27 University Of Florida Research Foundation, Inc. Delivery of nrf2 as therapy for protection against reactive oxygen species
EP3189067B1 (en) 2014-09-04 2021-05-19 The United States of America, as represented by The Secretary, Department of Health and Human Services Recombinant hiv-1 envelope proteins and their use
EP3236998A1 (en) 2014-12-24 2017-11-01 The U.S.A. as represented by the Secretary, Department of Health and Human Services Recombinant metapneumovirus f proteins and their use
CN107406835A (zh) 2015-01-20 2017-11-28 美利坚合众国,由健康及人类服务部部长代表 表达嵌合rsv/bpiv3f蛋白的重组人/牛副流感病毒3(b/hpiv3)及其用途
CN107427666B (zh) 2015-01-30 2022-11-04 加利福尼亚大学校董 脊髓软膜下基因递送系统
RU2723045C2 (ru) 2015-02-19 2020-06-08 Пфайзер Инк. Композиции neisseria meningitidis и способы их получения
WO2016138160A1 (en) 2015-02-24 2016-09-01 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Middle east respiratory syndrome coronavirus immunogens, antibodies, and their use
ES2780366T3 (es) 2015-04-30 2020-08-25 Psioxus Therapeutics Ltd Adenovirus oncolítico que codifica una proteína b7
EP3307894A4 (en) * 2015-06-10 2019-01-16 American Gene Technologies International, Inc. SYSTEM AND METHOD FOR NONINTEGRAL VIRAL OUTPUT AND METHOD FOR USE THEREOF
WO2017007994A1 (en) 2015-07-08 2017-01-12 American Gene Technologies International Inc. Hiv pre-immunization and immunotherapy
CN108289909A (zh) 2015-10-19 2018-07-17 巴尔的摩马里兰大学 用于产生工程改造的人原代血液树突细胞系的方法
EA201891021A1 (ru) 2015-12-17 2018-11-30 Псайоксус Терапьютикс Лимитед Аденовирус группы b, кодирующий антитело к комплексу tcr или фрагмент указанного антитела
US10137144B2 (en) 2016-01-15 2018-11-27 American Gene Technologies International Inc. Methods and compositions for the activation of gamma-delta T-cells
AU2017207906B2 (en) 2016-01-15 2021-03-11 American Gene Technologies International Inc. Methods and compositions for the activation of gamma-delta T-cells
WO2017139392A1 (en) 2016-02-08 2017-08-17 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Recombinant hiv-1 envelope proteins and their use
WO2017139065A1 (en) 2016-02-08 2017-08-17 American Gene Technologies International Inc. Hiv vaccination and immunotherapy
EP3426291A1 (en) 2016-03-09 2019-01-16 The U.S.A. as represented by the Secretary, Department of Health and Human Services Recombinant hiv-1 envelope proteins and their use
EP3426777B1 (en) 2016-03-09 2022-02-16 American Gene Technologies International Inc. Combination vectors and methods for treating cancer
US11472859B2 (en) 2016-03-28 2022-10-18 The Regents Of The University Of California Method and composition for treating neuronal hyper-excitabtiity
US11560412B2 (en) 2016-04-01 2023-01-24 University Of Maryland, Baltimore Compositions comprising GRIM-19 therapeutics and methods of use
WO2017213697A1 (en) 2016-06-08 2017-12-14 American Gene Technologies International Inc. Non-integrating viral delivery system and methods related thereto
CA2971303A1 (en) * 2016-06-21 2017-12-21 Bamboo Therapeutics, Inc. Optimized mini-dystrophin genes and expression cassettes and their use
JP6971492B2 (ja) 2016-07-08 2021-11-24 アメリカン ジーン テクノロジーズ インターナショナル インコーポレイテッド Ｈｉｖ予備免疫化および免疫療法
US11583562B2 (en) 2016-07-21 2023-02-21 American Gene Technologies International Inc. Viral vectors for treating Parkinson's disease
JP2019532621A (ja) 2016-08-29 2019-11-14 サイオクサス セラピューティクス リミテッド 二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ＢｉＴＥ）で武装したアデノウイルス
GB201713765D0 (en) 2017-08-28 2017-10-11 Psioxus Therapeutics Ltd Modified adenovirus
TWI817933B (zh) 2016-09-20 2023-10-11 德商百靈佳殷格翰維美迪加股份有限公司 新穎ehv插入位點orf70
EA201990717A1 (ru) 2016-09-20 2019-10-31 Новая вакцина против гриппа свиней
CA3036293A1 (en) 2016-09-20 2018-03-29 Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh New promoters
CN109715219B (zh) 2016-09-20 2024-03-01 勃林格殷格翰动物保健有限公司 犬腺病毒载体
US11155832B2 (en) 2016-09-30 2021-10-26 Genvec, Inc. Adenovectors for delivery of therapeutic genetic material into T cells
EP3518968B1 (en) 2016-10-03 2022-01-05 The U.S.A. as represented by the Secretary, Department of Health and Human Services Hiv-1 env fusion peptide immunogens and their use
WO2018081318A1 (en) 2016-10-25 2018-05-03 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Prefusion coronavirus spike proteins and their use
US11147249B2 (en) 2016-12-08 2021-10-19 Alector Llc Siglec transgenic mice and methods of use thereof
CA3043790A1 (en) 2016-12-16 2018-06-21 Institute For Research In Biomedicine Novel recombinant prefusion rsv f proteins and uses thereof
PE20191107A1 (es) 2017-01-31 2019-08-26 Pfizer Composiciones de neisseria meningitidis y metodos respectivos
US11235056B2 (en) 2017-03-24 2022-02-01 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Glycan-masked engineered outer domains of HIV-1 gp120 and their use
EP3607072A4 (en) 2017-04-03 2021-01-06 American Gene Technologies International Inc. COMPOSITIONS AND METHODS OF TREATMENT OF PHENYLCETONURISM
WO2019079242A1 (en) 2017-10-16 2019-04-25 Voyager Therapeutics, Inc. TREATMENT OF AMYOTROPHIC LATERAL SCLEROSIS (ALS)
EP4124658A3 (en) 2017-10-16 2023-04-19 Voyager Therapeutics, Inc. Treatment of amyotrophic lateral sclerosis (als)
US11136356B2 (en) 2017-10-16 2021-10-05 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Recombinant HIV-1 envelope proteins and their use
AU2018359420A1 (en) 2017-10-31 2020-06-04 Kalivir Immunotherapeutics, Inc. Platform oncolytic vector for systemic delivery
US11470827B2 (en) 2017-12-12 2022-10-18 Alector Llc Transgenic mice expressing human TREM proteins and methods of use thereof
WO2019173463A1 (en) 2018-03-06 2019-09-12 Intrexon Corporation Hepatitis b vaccines and uses of the same
US20210361318A1 (en) 2018-07-02 2021-11-25 Voyager Therapeutics, Inc. Cannula system and use thereof
US20210254103A1 (en) 2018-07-02 2021-08-19 Voyager Therapeutics, Inc. Treatment of amyotrophic lateral sclerosis and disorders associated with the spinal cord
CA3117390A1 (en) 2018-10-22 2020-04-30 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Recombinant gp120 protein with v1-loop deletion
CN114761546A (zh) 2019-10-08 2022-07-15 波士顿学院董事会 含有多个不同非天然氨基酸的蛋白质以及制备和使用此类蛋白质的方法
CN110714027A (zh) * 2019-10-28 2020-01-21 嘉铭(固安)生物科技有限公司 一种表达质粒、用于包装二代腺病毒的细胞株及其应用
AU2021221127A1 (en) 2020-02-11 2022-09-22 Board Of Regents, The University Of Texas System SARS-CoV-2 vaccine
US11213482B1 (en) 2020-03-05 2022-01-04 University of Pittsburgh—Of the Commonwealth System of Higher Educat SARS-CoV-2 subunit vaccine and microneedle array delivery system
EP4114449A2 (en) 2020-03-05 2023-01-11 Neotx Therapeutics Ltd. Methods and compositions for treating cancer with immune cells
US11773391B2 (en) 2020-04-01 2023-10-03 University of Pittsburgh—of the Commonwealth System of Higher Education Therapeutic and diagnostic target for SARS-CoV-2 and COVID-19
EP4142785A2 (en) 2020-04-29 2023-03-08 The United States of America, as represented by the Secretary, Department of Health and Human Services Recombinant human metapneumovirus f proteins and their use
WO2021247995A2 (en) 2020-06-04 2021-12-09 Voyager Therapeutics, Inc. Compositions and methods of treating neuropathic pain
WO2022035860A2 (en) 2020-08-10 2022-02-17 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Replication-competent adenovirus type 4-hiv env vaccines and their use
US20240228549A1 (en) 2021-04-29 2024-07-11 The U.S.A., As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Prefusion-stabilized lassa virus glycoprotein complex and its use
CN117241813A (zh) 2021-04-30 2023-12-15 卡利威尔免疫治疗公司 用于修饰的mhc表达的溶瘤病毒
CA3217862A1 (en) 2021-05-05 2022-11-10 Radius Pharmaceuticals, Inc. Animal model having homologous recombination of mouse pth1 receptor
US20240277829A1 (en) 2021-08-03 2024-08-22 The U.S.A., As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Hiv-1 vaccination and samt-247 microbicide to prevent hiv-1 infection
AU2022371414A1 (en) 2021-10-20 2024-05-02 University Of Copenhagen Isolated glial progenitor cells for use in the competition treatment of age-related white matter loss
EP4426331A1 (en) 2021-11-02 2024-09-11 University of Rochester Tcf7l2 mediated remyelination in the brain
WO2023091696A1 (en) 2021-11-19 2023-05-25 Christiana Care Gene Editing Institute, Inc. Adenovirus delivery system for cancer treatment
WO2023192835A1 (en) 2022-03-27 2023-10-05 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Base-covered hiv-1 envelope ectodomains and their use
WO2023196898A1 (en) 2022-04-07 2023-10-12 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Beta globin mimetic peptides and their use
WO2024091824A1 (en) 2022-10-26 2024-05-02 Ada Forsyth Institute, Inc. Differentiation and reprogramming of chondrocyte
WO2024163747A2 (en) 2023-02-02 2024-08-08 University Of Rochester Competitive replacement of glial cells

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5585362A (en) * 1989-08-22 1996-12-17 The Regents Of The University Of Michigan Adenovirus vectors for gene therapy
US5670488A (en) * 1992-12-03 1997-09-23 Genzyme Corporation Adenovirus vector for gene therapy
FR2681786A1 (fr) * 1991-09-27 1993-04-02 Centre Nat Rech Scient Vecteurs recombinants d'origine virale, leur procede d'obtention et leur utilisation pour l'expression de polypeptides dans des cellules musculaires.
CA2145641C (en) * 1992-12-03 2008-05-27 Richard J. Gregory Pseudo-adenovirus vectors
FR2705686B1 (fr) * 1993-05-28 1995-08-18 Transgene Sa Nouveaux adénovirus défectifs et lignées de complémentation correspondantes.

Also Published As

Publication number Publication date
JP4190028B2 (ja) 2008-12-03
EP0667912A1 (fr) 1995-08-23
EP0667912B1 (fr) 2008-07-02
NO950939D0 (no) 1995-03-10
KR100356615B1 (ko) 2003-04-03
CZ287157B6 (en) 2000-10-11
FI951138A0 (fi) 1995-03-10
JPH08501703A (ja) 1996-02-27
FI951138A (fi) 1995-04-13
NO950939L (no) 1995-03-10
CA2144040A1 (fr) 1995-01-26
RU2219241C2 (ru) 2003-12-20
US20030096787A1 (en) 2003-05-22
HU216871B (hu) 1999-09-28
KR950703649A (ko) 1995-09-20
SK31295A3 (en) 1996-05-08
WO1995002697A1 (fr) 1995-01-26
CN1115414C (zh) 2003-07-23
HU9500732D0 (en) 1995-04-28
ATE399873T1 (de) 2008-07-15
CN1113390A (zh) 1995-12-13
ES2310924T3 (es) 2009-01-16
PT667912E (pt) 2008-10-15
CZ63995A3 (en) 1995-11-15
NO321309B1 (no) 2006-04-24
NZ269156A (en) 1996-03-26
DK0667912T3 (da) 2008-11-10
RU95108217A (ru) 1997-06-10
BR9405507A (pt) 1999-05-25
AU7264694A (en) 1995-02-13
PL308122A1 (en) 1995-07-24
DE69435108D1 (de) 2008-08-14
PL179877B1 (pl) 2000-11-30
IL110284A0 (en) 1994-10-21
HUT72558A (en) 1996-05-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
SK282843B6 (sk) Defektný rekombinantný adenovírus a farmaceutický prostriedok s jeho obsahom
JP3821846B2 (ja) 組換えアデノウイルス、ａａｖを作製するためのその使用、相補的細胞系、及び、該アデノウイルスを含む医薬組成物
US8236293B2 (en) Means and methods for nucleic acid delivery vehicle design and nucleic acid transfer
KR100510822B1 (ko) 재조합 아데노바이러스 제조용 세포
JP3816952B2 (ja) 治療遺伝子と免疫保護遺伝子とを含む欠陥アデノウイルス
US5891690A (en) Adenovirus E1-complementing cell lines
US6156497A (en) Recombinase-mediated generation of adenoviral vectors
KR100424803B1 (ko) 생존성오염입자-비함유아데노바이러스,이의제조방법및용도
WO2001023597A9 (en) Cell lines and constructs useful in production of e1-deleted adenoviruses in absence of replication competent adenovirus
JP2005503797A (ja) アデノウイルスベクター及び関連する系、並びに製造及び使用の方法
SK110097A3 (en) Method for preparing a recombinant adenovirus genome
US6200798B1 (en) Defective recombinant adenoviruses with inactivated IVa2 gene
MXPA97001766A (en) Defective recombinant adenovirus with a vat iva2 inactiv
AU780822B2 (en) Bovine cells expressing adenovirus essential functions for propagation of recombinant adenoviral vectors
AU725843B2 (en) Defective adenovirus vectors and use thereof in gene therapy
US7264818B2 (en) BAV packaging regions and E1 transcriptional control regions

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Patent lapsed due to non-payment of maintenance fees

Effective date: 20090708