KR100432953B1 - 개선된 종양 살상 효과를 나타내는 재조합 아데노바이러스 - Google Patents

Abstract

본 발명은 개선된 종양 살상 효과를 나타내는 아데노바이러스 및 이를 포함하는 약제학적 항종양 조성물에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 아데노바이러스 ElB 19 유전자의 발현이 억제되도록 ElB 19 유전자에 변이를 유발하여 종양 세포 괴사 및 고사를 동시에 유도하여 종양 세포 살상 효과를 나타내는 재조합 아데노바이러스 및 이를 포함하는 약제학적 항종양 조성물에 관한 것으로서, 본 발명의 재조합 아데노바이러스는 감염된 세포에서 세포 괴사 및 세포 고사를 동시에 유도하여 종양 세포 살상능이 크게 향상되어 종래의 재조합 아데노바이러스에 의한 종양 치료 방법의 한계를 극복할 수 있으며, 더욱이 본 발명의 약제학적 조성물은 종래의 암 치료방법, 특히 세포 고사를 유도하는 암 치료 방법과 병행하여 이용되는 경우에는 치료 효과를 극대화할 수 있다.

Description

개선된 종양 살상 효과를 나타내는 재조합 아데노바이러스{Recombinant Adenovirus with Enhanced Tumoricidal Effect}

본 발명은 아데노바이러스에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 보다 개선된 종양 살상 효과를 나타내는 아데노바이러스 및 이를 포함하는 약제학적 항종양 조성물에 관한 것이다.

1990년, ADA (adenosine deaminase) 결핍증을 대상으로 한 첫 유전자 치료 임상시험 이후 1990년대 중반까지 복제 불능 아데노바이러스 벡터 내에 특정 유전자를 삽입시켜 표적 세포 내에서 발현을 유도하는 유전자 치료법에 대한 연구가 활발해 졌다.

아데노바이러스는 기존의 레트로바이러스 시스템에 비해 고농도로 농축할 수 있고 유전자 전달 효율이 월등히 높다는 장점들 때문에 점차 많은 빈도로 유전자 치료에 이용되어졌으나 증식 불능 아데노바이러스는 1차 감염된 세포에서만 그 치료효과를 보이고 생체 내에서는 원하는 만큼의 유전자 전달 효율을 보이기 어렵고 면역체계에 의한 아데노바이러스의 비활성화 등으로 인하여 치료 효과가 한계에 부딪히게 되었다.

그러나 1996년, McCormick 등은 아데노바이러스 초기 유전자인 E1B 55kD이 부분적으로 결실된 dl1520 (ONYX-015)를 개발하였으며 이는 p53 유전자가 돌연변이 되거나 결실된 종양세포 내에서만 선택적으로 증식이 가능하여 암세포를 특이적으로 살상할 수 있는 아데노바이러스를 보고한 바 있으며 (Bischoff, J. et al.,Science, 274:373-376(1996)), 현재 이를 이용한 임상시험이 진행 중에 있다.

이후 낮은 유전자 도입 효율의 한계를 갖는 증식 불능 아데노바이러스 대신에 복제에 있어 필수적인 E1A 유전자를 재도입하여 복제 가능 재조합 아데노바이러스를 개발하려는 시도가 계속 이루어지고 있으며, 본 발명자들도 암세포를 선택적으로 살상 할 수 있는 재조합 아데노바이러스인 YKL-1을 제작하고 이를 이용한 항종양 실험에서 긍정적인 결과를 보고한 바 있다 (대한민국 특허출원 제 1999-33011호).

또한, 아데노바이러스의 복제에 필수적인 E1A 유전자를 특정 유전자 조절 부위 아래에 삽입시켜 종양 특이적 발현을 유도하는 표적 지향성 아데노바이러스의 개발이나 항 종양 화학치료요법 (anticancer-chemotherapy)을 병행, 또는 헤르페스 심플렉스 바이러스 (herpes simplex virus)의 티미딘 키나아제와 같은 자살 유전자를 증식 가능한 아데노바이러스 내에 삽입시켜 항 종양 효과를 개선한 연구가 계속 진행되고 있다 (Morris, J.C. et al.,Molecular Ther., 1(1):56-62(2000))).

아데노바이러스 복제에 필수적인 역할을 하는 E1A 단백질은 감염된 세포 내에서 S-단계를 유도하여 아데노바이러스의 후기 발현 유전자들의 전사를 촉진시킨다. 또한, E1A 단백질은 RB (retinoblastoma) 단백질과 결합해 E2F 단백질을 해리시켜 세포 주기를 계속적으로 가동시킴으로써 아데노바이러스의 복제에 필요한 여러 전사 단백질들을 제공되게 하며, 감염된 세포 내에서는 종양 억제 단백질로 잘 알려진 p53 등의 활성화로 인한 세포 고사 (apoptosis)를 촉진시킨다 (Shenk, T.Adenoviridae: the viruses and their replication. 3rd ed. New York: Lippincott-Raven, 2111-2148(1996) 및 Shenk, T. et al.,Adv Cancer Res, 57:47-85(1991)).

또 다른 아데노바이러스의 초기 발현 유전자인 E1B 유전자는 E1B 19 kDa과 E1B 55 kDa을 코딩하며, 이들 중 E1B 19 kDa 단백질은 강력한 세포 고사 억제작용을 하며 Bcl-2와 염기 서열 및 그 기능이 유사하다. (Imazu, T. et al.,Oncogene, 18:4523-4529(1999)). E1B 55 kDa 단백질은 p53 단백질과 결합해 그 기능을 억제하고 아데노바이러스의 mRNA들을 세포질로 이동시켜 단백질 합성을 촉진하는 기능을 하며 E1B 55 kDa 단백질이 결실된 아데노바이러스는 p53 단백질의 기능이 비활성화된 종양세포 내에서 선택적으로 증식 가능하다는 보고들이 있었다 (Bischoff, J. et al.,Science, 274:373-376(1996) 및 Heiss, C. et al.,Nature Medicine, 3:639-645(1997)).

그러나 E1B 55 kDa 단백질은 아데노바이러스의 효과적인 복제에 필요한 유전자로서, 이것이 소실된 재조합 아데노바이러스는 암세포 내에서 제한된 증식을 나타내기 때문에 이로 인한 항종양 효과가 감소되는 문제점이 초래된다.

결국, 이와 같은 문제점들을 극복하기 위해서는 아데노바이러스의 효율적인 증식에 의한 세포 괴사 (necrosis) 촉진과 더불어 세포 고사억제기능을 제거하여 세포고사 유도를 촉진하게 함으로써 결과적으로 암세포의 효과적인 살상을 유도 할 수 있는 재조합 아데노바이러스의 개발이 요구 되어지고 있다.

미합중국 특허 제 5,677,178 호, 제 5,856,181 호 및 제 5972706 호는 p53 또는 Rb 단백질을 비활성화시키는 유전자가 결핍된 복제 불능한 재조합 아데노바이러스를 종양 세포에 처리하여 상기 종양 억제 유전자의 발현이 결핍되어 있는 종양 세포를 선택적으로 제거하는 방법을 개시하고 있다.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 특허문헌 및 논문이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 특허문헌 및 논문의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

따라서, 본 발명의 목적은 종양 세포 살상 효과가 개선된 재조합 아데노바이러스를 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기한 재조합 아데노바이러스를 포함하는 약제학적 항종양 조성물을 제공하는 데 있다.

도 1은 본 발명의 재조합 아데노바이러스의 일 구현예인 YKC-1의 제조방법을 나타내는 개략도;

도 2는 실시예 1-2에서 증폭되는 서열을 보여 주는 개략도;

도 3은 실시예 1-2에서 증폭된 서열의 전기영동 결과를 나타내는 사진;

도 4는 본 발명의 YKC-1 바이러스에서 E1B 19 단백질을 발현되지 않음을 나타내는 웨스턴 블롯팅 결과 사진;

도 5는 본 발명의 YKC-1 바이러스가 다양한 종양 세포에 대하여 살상 효과를 나타냄을 보여주는 세포 병변 분석 사진;

도 6은 본 발명의 YKC-1 바이러스의 증식 속도를 나타내는 플라크 분석 결과 사진;

도 7a는 본 발명의 YKC-1 바이러스의 자궁암 세포 C33A에 대한 살상 효과를 나타내는 그래프;

도 7b는 본 발명의 YKC-1 바이러스의 자궁암 세포 HeLa에 대한 살상 효과를 나타내는 그래프;

도 8a는 본 발명의 YKC-1 바이러스에 의해 감염된 자궁암 세포 C33A에서 바이러스 재생산 효율을 나타내는 그래프;

도 8b는 본 발명의 YKC-1 바이러스에 의해 감염된 자궁암 세포 HeLa에서 바이러스 재생산 효율을 나타내는 그래프;

도 9는 본 발명의 YKC-1 바이러스의 종양 세포 살상능이 세포 괴사 뿐만 아니라 세포 고사 기작을 통해서도 발휘됨을 보여주는 광학 현미경 관찰 사진;

도 10은 본 발명의 YKC-1 바이러스의 종양 세포 살상능이 세포 괴사 뿐만 아니라 세포 고사 기작을 통해서도 발휘됨을 보여주는 전자 현미경 관찰 사진;

도 11은 본 발명의 YKC-1 바이러스에 의해 유도되는 세포 고사를 확인하기 위한 튜널 분석 결과를 보여주는 사진; 및

도 12는 누드 마우스를 모델로 한 본 발명의 YKC-1 바이러스의 항종양 효과를 나타내는 그래프.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 아데노바이러스 ElB 19 유전자의 발현이 억제되도록 ElB 19 유전자에 변이 (mutation)를 유발하여 종양 세포 괴사 (necrosis) 및 고사 (apoptosis)를 동시에 유도하여 종양 세포 살상 효과를 나타내는 재조합 아데노바이러스를 제공한다.

본 발명자들은 종래의 항종양 아데노바이러스가 갖고 있는 종양 세포내 증식 능력을 유지하면서도, 세포 고사를 유발하여 보다 효율적으로 종양 세포를 살상할 수 있는 재조합 아데노바이러스를 개발하고자 하였다. 결국, 본 발명자들은 E1B 영역의 유전자 중 19 kDa 단백질 (세포 고사 억제 단백질)을 코딩하는 유전자의 발현을 억제하여 기능적인 E1B 19 kDa 단백질의 생성을 억제시키면, 상기한 목적에 적합한 재조합 아데노바이러스가 생성됨을 확인하였다.

본 명세서에서 용어 "E1B 19 kDa 유전자" 및 "E1B 19 유전자"는 모두 아데노바이러스의 E1B 19 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 의미한다.

본 발명에 있어서, E1B 19 유전자에서의 변이는 아데노바이러스 ElB 19 유전자의 발현이 억제되도록 하는 것으로서, 아데노바이러스 ElB 19 유전자의 발현 자체를 억제하는 것 뿐만 아니라, 기능성이 없는 아데노바이러스 ElB 19 단백질, 예컨대, 절단된 (truncated) 형태의 ElB 19 단백질이 생성되도록 하는 것을 포함한다. 상기 E1B 19 유전자에서의 변이는 다양한 접근 방법으로 실시될 수 있다. 예컨대, E1B 19 유전자 전체의 제거 (deletion), E1B 19 유전자 내에서의 정지 코돈 형성 등을 통해서, E1B 19 유전자의 발현을 억제하는 변이를 만들 수 있다. 따라서, 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, ElB 19 유전자에서의 변이는 ElB 19 유전자의 개시 코돈에 변이가 발생되도록 한 것이고, 보다 바람직하게는 ElB 19 유전자의 개시 코돈ATG가CTG로 치환되고 개시 코돈 바로 다음의 GAG가 정지 코돈 TAG로 치환된 것이다.

이와 같은 변이 방식은 E1B 19 kDa 단백질에 대한 전사물은 합성되지만, 단백질 합성 개시를 전혀 일어나지 못하게 하여 E1B 19 kDa 단백질의 생성이 이루어지지 않는 이점이 있다.

상기 변이는 바람직하게는 위치-지정 변이 유발 (site-directed mutagenesis)를 통하여 실시할 수 있고, 위치-지정 변이 유발은 PCR 등을 통하여 할 수 있다. PCR에 의해 위치-지정 변이 유발을 하는 경우에는, 특정 위치에의 염기가 치환된 서열을 갖는 프라이머를 이용한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 재조합 아데노바이러스는 정상적인 E1A 유전자 및 정상적인 E1B 55 유전자를 포함한다. 상기 두 유전자는 아데노바이러스의 복제 및 증식에 중요한 역할을 하는 것으로서, 이러한 유전자를 갖는 본 발명의 재조합 아데노바이러스는 종양 세포 내에서의 우수한 증식능을 갖게 된다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 재조합 아데노바이러스는 E3 유전자가 제거되어 있다. 상기 E3 유전자는 통상적인 아데노바이러스 벡터에서 제거되어 외래 유전자가 삽입되는 자리를 제공한다 (Thimmappaya, B. et al.,Cell, 31:543-551(1982); 및 Riordan, J. R. et al.,Science, 245:1066-1073(1989)). 따라서, 본 발명의 아데노바이러스는 외래 유전자를 운반 및 발현할 수 있는 벡터로서의 용도도 갖게 된다.

한편, 본 발명의 가장 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 재조합 아데노바이러스는 아데노바이러스 YKC-1 (KFCC-11280)이다.

본 발명의 재조합 아데노바이러스는 다양한 종양 세포, 예컨대 간암 세포, 자궁암 세포, 유방암 세포, 뇌종양 세포 및 폐암 세포 등에 대하여 살상능을 갖을 뿐만 아니라, 살상 효율도 다른 종래의 재조합 아데노바이러스 보다 훨씬 월등하다. 또한, 본 발명의 재조합 아데노바이러스는 복제 및 증식 속도도 매우 크기 때문에, 감염된 세포 주위로 확산되는 속도가 매우 크다. 본 발명이 상기한 이점을 나타내는 것은, 본 발명의 재조합 아데노바이러스가 세포 괴사 뿐만 아니라 세포 고사도 동시에 유도하기 때문이다.

또한, 본 발명의 재조합 아데노바이러스는 개별적 세포 수준에서의인 비트로종양 살상 효과도 우수하지만, 개체 수준에서의인 비보종양 살상 효과도 우수하다. 종래에 개발된 다수의 재조합 아데노바이러스가인 비트로에서만 종양 살상 효과를 나타내고,인 비보에서는 명확한 효과를 발휘하지 못하였다는 점을 고려하면, 본 발명의 재조합 아데노바이러스의 우수성을 파악할 수 있다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 (a) 아데노바이러스 ElB 19 유전자의 발현이 억제되도록 ElB 19 유전자에 변이를 유발하여, 종양 세포 괴사 및 고사를 동시에 유도하여 종양 세포 살상 효과를 나타내는 재조합 아데노바이러스의 치료학적 유효량; 및 (b) 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 항종양 조성물을 제공한다.

본 발명의 조성물에 포함되는 재조합 아데노바이러스는 상술한 바와 같이, 다양한 종양 세포에 대하여 살상 효능을 나타내므로, 본 발명의 약제학적 조성물은 종양과 관련된 다양한 질병 또는 질환, 예컨대 위암, 폐암, 유방암, 난소암, 간암, 기관지암, 비인두암, 후두암, 췌장암, 방광암, 결장암 및 자궁경부암 등의 치료에 이용될 수 있다. 본 명세서에서 용어 "치료"는 (ⅰ) 종양 세포 형성의 예방; (ⅱ) 종양 세포의 제거에 따른 종양과 관련된 질병 또는 질환의 억제; 및 (ⅲ) 종양 세포의 제거에 따른 종양과 관련된 질병 또는 질환의 경감을 의미한다. 따라서, 본 명세서에서 용어 "치료학적 유효량"은 상기한 약리학적 효과를 달성하는 데 충분한 양을 의미한다.

본 발명의 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 ElB 19 유전자에서의 변이는 ElB 19 유전자의 개시 코돈에 변이가 발생되도록 한 것이고, 보다 바람직하게는 ElB 19 유전자의 개시 코돈ATG가CTG로 치환되고 개시 코돈 바로 다음의 GAG가 정지 코돈 TAG로 치환된 것이다.

본 발명의 다른 바람직한 구현예에 따르면, 상기 재조합 아데노바이러스는 정상적인 E1A 유전자 및 정상적인 E1B 55 유전자를 포함한다.

본 발명의 또 따른 변형 예에 따르면, 상기 재조합 아데노바이러스는 E3 유전자가 제거되어 있는 것이다. 본 발명의 가장 바람직한 구현예에 따르면, 상기 재조합 아데노바이러스는 아데노바이러스 YKC-1 (KFCC-11280)이다.

본 발명의 약제학적 조성물은 비경구 투여가 바람직하고, 예컨대 정맥내 투여, 복강내 투여, 근육내 투여, 피하 투여, 또는 국부 투여를 이용하여 투여할 수 있다. 난소암에서 복강내로 투여하는 경우 및 간암에서 문맥으로 투여하는 경우에는 주입 방법으로 투여할 수 있고, 유방암의 경우에는 종양 매스에 직접 주사하여 투여할 수 있으며, 결정암의 경우에는 관장으로 직접 주사하여 투여할 수 있고, 방광암의 경우에는 카테테르 내로 직접 주사하여 투여할 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 질병 증상의 정도, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하며, 보통으로 숙련된 의사는 소망하는 치료에 효과적인 투여량을 용이하게 결정 및 처방할 수 있다. 일반적으로, 본 발명의 약제학적 조성물은 5 ×10¹⁰-5 ×10¹¹pfu/㎖의 재조합 아데노바이러스를 포함하며, 통상적으로 재조합 아데노바이러스는 1×10¹⁰pfu를 이틀에 한번씩 2주 동안 주사한다.

본 발명의 약제학적 조성물은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화 됨으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 단독의 요법으로 이용될 수 있으나, 다른 통상적인 화학 요법 또는 방사 요법과 함께 이용될 수도 있으며, 이러한 병행 요법을 실시하는 경우에는 보다 효과적으로 암 치료를 할 수 있다. 본 발명의 조성물과함께 이용될 수 있는 화학 요법제는 시스플라틴 (cisplatin), 카르보플라틴 (carboplatin), 프로카르바진 (procarbazine), 메클로레타민 (mechlorethamine), 시클로포스파미드 (cyclophosphamide), 이포스파미드 (ifosfamide), 멜팔란(melphalan), 클로라부실 (chlorambucil), 비술판 (bisulfan), 니트로소우레아 (nitrosourea), 디악티노마이신 (dactinomycin), 다우노루비신 (daunorubicin), 독소루비신 (doxorubicin), 블레오마이신 (bleomycin), 플리코마이신 (plicomycin), 미토마이신 (mitomycin), 에토포시드 (etoposide), 탁목시펜 (tamoxifen), 택솔 (taxol), 트랜스플라티눔 (transplatinum), 5-플루오로우라실 (5-fluorouracil), 빈크리스틴 (vincristin), 빈블라스틴 (vinblastin) 및 메토트렉세이트 (methotrexate) 등을 포함한다. 본 발명의 조성물과 함께 이용될 수 있는 방사 요법은 X-선 조사 및 γ-선 조사 등이다.

이하, 실시 예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시 예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시 예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 자명할 것이다.

실시예 1: 재조합 아데노바이러스 YKC-1의 제조 및 확인

실시예 1-1:재조합 아데노바이러스 YKC-1의 제조

재조합 아데노바이러스 셔틀 벡터 pΔE1B 19를 제작하기 위해, 우선 pXC1(Microbix, 캐나다국)을XbaI 및BamHI 제한효소로 절단하여 얻어진 1.3 kb DNA를 pSP72 클로닝 벡터 (Promega, 미합중국)에 삽입시켰다. 이어, 상기 벡터를 주형으로 하고, 센스 프라이머 5'-GTTACATCTGACCTCCTGTAGGCTAGCGAGTGTTTGGAAG-3' 및 안티센스 프라이머 5'-CTTCCAAACACTCGCTAGCCTACAGGAGGTCAGATGTAAC-3'를 이용하여 위치-지정 변이유발 (site-directed mutagenesis) PCR을 실시하였다. 위치-지정 변이유발은 Stratagene사의 위치-지정 변이유발 키트를 이용하여 실시하였다. 상기의 E1B19 돌연변이 프라이머는 E1B 19 kD 유전자의 개시 코돈 (ATG)을CTG로 치환하고 개시코돈 바로 다음의GAG를 정지 코돈 (TAG)으로 치환하는 것이다.

PCR은 주형 DNA 10 ng, 프라이머 100 ng 및 pfu DNA 중합효소 (Stratagene) 2 유니트를 사용하여 94℃에서 2 분 동안 예열 단계를 거친 다음, 94℃ 30초, 55℃ 1분 및 68℃ 8분을 주기로 하여 총 18 사이클을 실시하고, 94℃에서 5분 동안 최종 신장 반응을 실시하였다.

상기 위치-지정 변이유발 PCR을 통해 수득한 플라스미드를 "pSP72/pXC1/1.3kb/Δ19mt"라 명명하였고, 목적의 변이 (E1B 19 kD 유전자의 개시 코돈 (ATG)을CTG로 치환하고 개시코돈 바로 다음의GAG를 정지 코돈 (TAG)으로 치환하는 것)를 염기 서열 분석 (ABI Prism 377, Perkin Elmer)으로 확인하였다.

그런 다음, 상기 pSP72/pXC1/1.3kb/Δ19mt 플라스미드를XbaI 및BamHI으로 다시 절단하고 pXC1 내에 재삽입시켜, "pΔE1B 19" 셔틀 벡터를 제작하였다. 그리고 나서, E1 영역 및 E3 영역을 제외한 아데노바이러스 전체 지놈을 갖으며BstBI 제한효소로 처리된 dl324BstBI (스위스국의 Fribourgh 대학의 Verca 박사로부터 구입; Heider, H. et al.,Biotechniques, 28(2):260-265, 268-270(2000))와 함께XmnI 제한효소로 절단한 pΔE1B 19 셔틀벡터를 대장균 BJ5183 (스위스국의 Fribourgh 대학의 Verca 박사로부터 구입)에 42℃ 순간 열처리 방법으로 동시적으로 형질 전환시켜 유전자 상동 재조합을 유도하였다.

이어, 상동 재조합된 플라스미드 DNA를 회수하고,HindⅢ 제한효소로 처리하여 E1B 19 kD 유전자의 개시 코돈 (ATG)을CTG로 치환하고 개시코돈 바로 다음의GAG를 정지 코돈 (TAG)으로 치환된 Ad-pΔE1B 19 생성물을 확인하고 회수하였다. 재조합 아데노바이러스 플라스미드 Ad-pΔE1B 19를PacI으로 절단하여 단일 가닥으로 만든 다음, 293 세포주 (Microbix, 캐나다국)에 트랜스펙션하여 바이러스를 생산하였고, 생산된 재조합 아데노바이러스를 "YKC-1"이라 명명하고, 기탁기관 한국미생물보존센터에 2001년 8월 22일자로 기탁하고, 기탁번호 KFCC-11280을 부여 받았다.

도 1은 본 발명의 YKC-1 바이러스의 제조방법을 개략적으로 나타내는 도면이다. 도 1에서 ψ는 ITR (inverted terminal repeat) 및 패키지 시그널을 포함하는 서열을 나타내며, 기호 Ad는 아데노바이러스의 축약어이고, Δ는 서열의 제거 (deleted)에 대한 기호이다.

한편, 대조군 바이러스들인 증식 불능 아데노바이러스 Ad-ΔE1 (E1 영역 전체가 결손된 것) 및 증식 가능 아데노바이러스 YKL-1 (E1B 55가 결손된 것, 대한민국 특허출원 제 1999-33011 호 참조)과 Ad-ΔE1B (E1B 영역 전제가 결손된 것), 그리고 야생형 재조합 아데노바이러스 Ad-wt는 각각 pCA14와 pXC1 (Microbix, 캐나다국)를 셔틀벡터로 이용해 동일한 방법으로 획득하였다. 각각의 재조합 아데노바이러스는 293 세포주에서 증폭시킨 다음, 한계 희석 방법 또는 플라크 분석 방법을 이용하여 바이러스의 역가를 결정하였다.

실시예 1-2:재조합 아데노바이러스 DNA의 분리와 PCR 분석

인체 간암 세포주인 Hep3B (ATCC, 미합중국) 에 상기 실시 예 1-1의 Ad-ΔE1, Ad-ΔE1B, YKC-1, YKL-1 및 Ad-wt 바이러스를 MOI (Multiplicity of infection) 10으로 각각 감염시키고. 2일이 경과한 다음, 지놈 분리 키트 (Qiagen, 미합중국)로 바이러스 지놈을 회수하였다. 이어, 분리한 바이러스 지놈을 주형으로 하고, E1A, E1B 19 kD 또는 E1B 55 kD의 증폭에 유용한 각각의 프라이머 세트를 이용하여 상기 실시예 1-1과 동일하게 PCR을 수행하였다. 이용된 프라이머는 E1A의 PCR의 경우, 센스 프라이머 5'-GATCGAAGAGGTACTGGCTGATA-3' 및 안티센스 프라이머 5'-CCACAGGTCCTCATATAGCAAAG-3', E1B 19 kD의 경우, 센스 프라이머 5'-ATCTGACCTCATGGAGGCTTGG-3' 및 안티센스 프라이머 5'-GCGGACGGAAGACAACAGTAGC-3' 그리고 E1B 55 kD의 경우, 센스 프라이머 5'-GATAGATACGGAGGATAGGGTGG-3' 및 안티센스 프라이머 5'-TGGAGTTACCCTCAGACAGGATA-3'이다.

도 2는 증폭되는 서열을 야생형 아데노바이러스 지놈으로 나타낸 것이다.

상기 각각의 PCR 생성물들을 혼합한 다음, 아가르스 겔에 로딩하여 전기영동하였다 (참조: 도 3). 도 3에서 확인할 수 있듯이, 본 발명의 YKC-1 바이러스는 야생형 Ad-wt와 동일하게 E1A, E1B 19 및 E1B 33에 대한 유전자를 모두 갖고 있음을 알 수 있다.

실시예 1-3:재조합 아데노바이러스 감염 세포주의 삽입 DNA 유전자 발현 확인

U343 뇌암 세포주 (ATCC, 미합중국)에 상기 실시예 1-1의 Ad-ΔE1, Ad-ΔE1B, YKC-1, YKL-1 및 Ad-wt 바이러스를 MOI 10으로 감염시키고, 18시간이 경과한 다음, 감염된 세포를 회수하여 용해 완충액 (0.15 M NaCl, 0.5 % Nonidet P-40 and 프로테아제 억제제 (PMSF, TLCK 및 TPCK)를 포함하는 50 mM HEPES, pH 7.5)로 용해시키고, SDS-PAGE (sodium-dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis)로 전기영동 하였다. 이어, PVDF 막에 단백질들을 이동시킨 후 E1A 및 E1B 19 kDa를 특이적으로 인지하는 항체를 (E1A에 대한 항체: sc-430, Santacruz, 미합중국; 및 E1B 19 kDa에 대한 항체: DP17, Oncogene, 미합중국)을 각각 일차 항체로 혼성화시키고 각 일차항체에 대한 이차 항체 (Pierce, 미합중국)를 다시 혼성화시켰다. 그런 다음, ECL (Enhanced Chemi-Luminescence: RPN 2108, Amersham, 미합중국) 방법으로 X-선 필름에 감광시켜 막 상의 단백질과 항체와의 결합 여부를 조사하여 각 단백질의 발현 양상을 확인하였다 (참조: 도 3).

도 4에서 볼 수 있듯이, 본 발명의 YKC-1 바이러스는 E1A 단백질은 정상적으로 발현을 하나, E1B 19 kDa 단백질은 발현하지 못함을 알 수 있다.

실시예 2: YKC-1의 종양 세포 살상능력 규명

실시예 2-1:다양한 종양 세포에서의 살상능 비교

본 발명의 재조합 아데노바이러스 YKC-1의 종양 세포에 대한 세포 살상 능력을 검증하기 위하여, 인간 간암 세포주 (SK-Hep1 및 Hep3B, ATCC, 미합중국), 뇌암 세포주 (U343 및 U-251N, ATCC, 미합중국), 그리고 폐암 세포주 (A549, ATCC, 미합중국) 각각에 MOI 10, 1 및 0.1의 Ad-ΔE1, Ad-ΔE1B, YKC-1, YKL-1, 그리고 Ad-wt 재조합 아데노바이러스를 각각 처리 하였다. 다섯 종류의 바이러스 중 한 종류의 아데노바이러스에 의해 MOI 0.1에서 암세포를 완전히 괴사시킨 시점에 모든 배지를 제거한 다음, 50% 메탄올에 함유되어 있는 0.5% 크리스탈 바이올렛으로 잔존한 세포들을 고정시키고 염색하여 분석하였다 (참조: 도 5).

도 5에서 확인할 수 있듯이, 상기한 모든 세포주에서 본 발명의 YKC-1은 현격히 높은 종양 세포 살상 효과를 보였으며, YKL-1 또는 Ad-ΔE1B 보다는 약 10-100배 정도의 살상효과를, 그리고 야생형 아데노바이러스인 Ad-wt 보다는 약 5-10배 정도의 높은 살상 효과를 나타내었다. 반면 음성 대조군인 복제 불능 아데노바이러스인 Ad-ΔE1으로 감염된 암 세포들에는 아무런 살상효과도 관찰할 수 없었다.

따라서, 본 실시예에서 시험된 모든 종양 세포에 대하여 본 발명의 YKC-1은 야생형 아데노바이러스를 포함한 여러 다른 복제 가능 아데노바이러스와 비교하여 가장 빠른 진행속도의 살상 효과를 나타냄을 알 수 있다.

실시예 2-2:바이러스 감염에 의한 플라크 형성능 비교

상기 실시예 2-1에서는 본 발명의 YKC-1이 야생형 아데노바이러스와 여러 다른 복제 가능 아데노바이러스들 보다 높은 효율의 종양 세포 괴사 효과를 나타내었는데, 본 실시 예에서는 고체 배지에서 각각의 바이러스들이 형성하는 플라크의 진행속도를 조사 하였다. 이러한 플라크 분석은 감염된 종양 세포에서 생성된 바이러스가 주위 종양 세포로 퍼져 나가는 효율을 조사하기 위한 것이다.

우선, 0.7% 아가로스-DMEM 고체 배지 (5% 우태아 혈청 포함)에서 성장하는 세포주 293, Hep3B 및 U343를 상기 실시예 1-1의 Ad-ΔE1, YKC-1 및 Ad-wt로 2×10²pfu 로 감염시킨 다음 37℃에서 7-10일 동안 배양하였다. 이어, 고체 배지를 제거하고, 50% 메탄올에 함유되어 있는 0.5% 크리스탈 바이올렛으로 잔존한 세포들을 고정시키고 염색 하였다.

도 6에서 보는 바와 같이, 복제에 필요한 E1 단백질이 제공되는 293 세포주에서는 각 바이러스들의 E1 유전자 구성과는 무관하게 Ad-ΔE1, YKC-1 및 Ad-wt이 모두 같은 크기의 플라크를 형성하였다. 그러나, Hep3B 및 U343 세포를 대상으로 감염시켰을 때에는 Ad-ΔE1은 플라크를 전혀 형성하지 못하는 반면, YKC-1은 Ad-wt보다 크기가 현저하게 큰 플라크를 형성하였으며, 같은 역가의 바이러스를 첨가하였음에도 더 많은 개수의 플라크를 형성하였다.

따라서, 본 발명의 YKC-1 바이러스는 종양 세포로 이루어진 조직에서 주위 종양 세포로 퍼져 나가는 효율이 우수함을 알 수 있다.

실시예 2-3:다른 종양 세포주에서의 살상 능력 규명

자궁암 세포주 (C33A 및 HeLa; ATCC, 미합중국)에 상기 실시예 1-1의 Ad-ΔE1, Ad-ΔE1B, YKC-1, YKL-1 및 Ad-wt 바이러스를 MOI 1로 감염시킨 다음, 1일, 2일, 3일, 그리고 4일 (C33A의 경우) 또는 1일, 3일, 5일, 그리고 8일 (HeLa의 경우)째 되는 날 각각 상층액을 걷어내고 0.5% 크리스탈 바이롤렛으로 잔존한 세포들을 고정시키고 염색하였다. 염색된 배양기구 내에 잔존한 세포들의 생존량을 조사하기 위해 100% 메탄올을 500 ㎕씩 첨가하고 30분 동안 방치시킨 후 파이펫으로 염색된 잔존세포들을 용출시킨 다음 200 ㎕만 걷어내어 96-웰 투명 플레이트에 첨가하였다. 595 nm 흡광기에서 그 수치를 읽어서 상대적 세포 성장율 곡선 (도 7a 및 도 7b)을 도출하였다. 도 7a, 및 도7b에서 볼 수 있듯이, 본 발명의 YKC-1이 야생형 및 다른 바이러스 보다 훨씬 효율적인 종양세포 살상 효과를 나타내었으며, 특히 HeLa 세포주에서 그 살상 효과가 크게 월등함을 보여주었다. 이와 같은 결과는, 상기 실시예 2-1 및 도 5에서 보여준 결과와 유사한 종양 살상 효과이며, 감염 후 배양 기구 표면으로부터 해리되어 떨어져 나가는 세포들이 C33A 세포주의 경우에는, 2일 후부터 살상 효과의 차이가 발생하였으며, HeLa 세포주의 경우에는 3일 후부터 YKC-1의 살상 효과가 야생형 및 다른 바이러스 보다 현저하게 구별될 수 있을 정도로 차이가 나타났다.

한편, 실제 살상 효과와 살상되어 해리되는 세포들 내에서의 바이러스 생산량이 동일한 효율을 나타내는지를 확인하기 위하여, 상기 감염된 세포와 배양액을 회수한 다음 얼림-녹임 과정 (freeze-and-thaw)을 3번 되풀이 한 다음, 원심분리시켜 상층액을 회수하였다. 이 상층액을 101-106배 희석시키고 6-웰 플레이트에 미리 배양시킨 293 세포주에 감염시키고 실시예 2-2의 0.7% 아가로스-DMEM 고체배지 (5% 우태아 혈청 포함)를 첨가하여 37℃에서 7일-8일 동안 배양시켜 형성되는 플라크 개수를 계산하여 역가를 측정하였다. 도 8a 및 도 8b에 나타난 바와 같이, 복제 불능 재조합 아데노바이러스는 전혀 바이러스를 생산하지 못하는 반면, Ad-△E1B 및 YKL-1은 야생형 아데노바이러스에 비해 낮은 효율로 바이러스를 생산하였다. 그러나 빠른 살상 효과를 보이는 본 발명의 YKC-1은 야생형와 거의 유사한 효율로 바이러스를 재생산해냄을 확인할 수 있었다.

결론적으로 상기한 실시예 2-1 내지 2-3을 종합해 보면, 본 발명의 YKC-1이 야생형 및 다른 재조합 바이러스 보다 훨씬 높은 효율로 종양 세포를 살상하며 또한 새롭게 생성되어지는 바이러스들도 다른 재조합 바이러스 보다 높은 효율로 재생산되고, 야생형과 유사한 짐을 확인할 수 있었다. 또한, 주위 종양세포가 훨씬 많이 둘러 싸여져 있을 경우에는, 그 확산효과가 훨씬 더 배가될 수 있음을 추측할 수 있었다.

실시예 2-4:재조합 아데노바이러스로 감염된 종양 세포의 형태학적 변화

상기 실시예 1-1의 Ad-ΔE1, YKC-1 및 Ad-wt 각각을 Hep3B 간암 세포주에 MOI 10으로 감염시킨 다음, 플라크 형성 과정을 광학 현미경 (Axiovert25; Zeiss, 독일) 및 전자 현미경으로 관찰 하였다.

광학 현미경적 관찰 (100배 배율)에 따르면, Ad-wt에 의해 괴사되는 세포들은 배양 플라스크 표면으로부터 둥글게 형성되어져 떨어져 나가는 전형적인 아데노바이러스에 의한 세포 살상 형태를 보였으나, YKC-1으로 감염된 세포들은 플라크 중심부와 가장 자리에 있는 세포들의 세포막이 찢겨진 형태로 괴사되어 가는 것을 관찰할 수 있었다 (참조: 도 9).

도 10에서 확인할 수 있듯이, 전자 현미경적 관찰 (4,400배 및 20,000배 배율)에 따르면, 감염되지 않은 Hep3B 세포의 핵 및 세포 내 다른 소기관들은 정상적인 모양을 갖추고 있었다. 또한, Ad-wt으로 감염된 세포의 경우, 핵 내에 고루 퍼져 있는 바이러스 입자를 쉽게 발견할 수 있었으며, 세포 내 소기관들은 정상적인 형태를 갖추고 있었고, 세포막 및 핵막 역시 감염되지 않은 세포처럼 잘 보존되어 있었으며 전반적으로 아데노바이러스 감염 시 나타나는 전형적인 세포 괴사 형태를 보였다.

본 발명의 YKC-1으로 감염된 세포에서는 세포 내 소기관들의 형태를 구별하기 힘들었으며, 세포막 및 핵막 또한 심하게 찢겨져 있어 생성된 아데노바이러스들이 세포질에 널리 흩어져 있는 것을 관찰할 수 있었다. 그리고 염색체들이 덩어리지면서 핵막 쪽으로 심하게 밀리는 세포 고사 초기 단계 모양을 나타내었다. 그러나 세포 고사의 또 하나의 특징인 세포막의 쭈그러짐 현상 (membrane blebbing)은 발견할 수 없었다. Ad-wt으로 감염된 세포에서도 염색체가 덩어리져 핵막 쪽으로 이동된 모습을 발견할 수 있었으나, 아주 낮은 빈도였고 비정상적으로 핵이 비대해져 있음을 관찰할 수 있었으나 대부분의 염색체는 핵막 내에 고루 퍼져있어 정상적인 핵 모양을 나타내었다.

따라서, 본 발명의 YKC-1 바이러스는 종양 세포의 괴사 뿐만 아니라 고사를 유발하여 종양 세포를 살상함을 알 수 있다.

실시예 2-5:튜널 분석을 통한 YKC-1의 세포 고사 유발 검증

아데노바이러스가 숙주세포 내로 감염되면, 세포 내에서 아데노바이러스의 초기 발현 단백질인 E1A가 발현되어 이에 의한 p53의 활성화가 유도되고, 이에 따라 세포 성장 중지 (G_o-G₁arrest) 또는 세포 고사 등을 초래하게 되는데, 이때 아데노바이러스의 또 다른 초기 발현 단백질인 E1B 19 kD이 발현되어 백스 (Bax) 및 카스파아제 (caspase)와 같이 세포 고사를 직접 또는 간접적으로 유도하는 단백질들에 E1B 19 kD 단백질이 결합하거나 또는 백스 및 카스파아제 단백질의 발현을 유도하는 기전을 방해해 세포 고사를 억제한다는 실험 결과들이 보고된 바 있다 (Pearson, A.S. et al.,Clinical Cancer Research, 6:887-890(2000)).

이러한 세포 고사 억제 단백질인 E1B 19 kD을 선택적으로 합성하지 못하도록 변이시킨 본 발명의 YKC-1이 E1B 19 kD를 발현하는 야생형 아데노바이러스에 비해 감염 시 세포 고사를 더욱 증폭하는지를 알아보기 위하여, 튜널 분석법 (TUNEL Assay; Moore, M. et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93:11295-11301(1996))을 통해 A549 폐암 세포주를 이용하여 세포 고사의 한 특징인 DNA 절편화 (DNA fragmentation)를 조사하였다. 우선, A549 폐암 세포주 (2 ×10⁴세포)를 챔버 슬라이드에 분주한 다음, Ad-wt 및 YKC-1 바이러스 각각을 상기 세포주에 MOI 10으로 감염시켰다. 4일 후 배지를 제거하고, 아폽택 키트 (ApopTag Kit; Oncor, Inc., 미합중국)를 이용하여 튜널 분석을 실시한 다음, 그 결과를 광학현미경으로 관찰 하였다. 세포 고사 유도 화학물질인 캄토테킨 (Camptothecin: CPT, Sigma Aldrich, 미합중국)을 1 μM 처리한 A549 종양 세포주를 양성 대조군으로 이용하였다.

도 11에서 확인할 수 있듯이, Ad-wt에 의해 감염된 A549 세포는 전체 중 약 5% 미만의 세포들이 진한 갈색으로 염색되었다. 반면, YKC-1에 의해 감염된 세포는 약 70-80% 정도가 갈색으로 염색되어, E1B 19 kD 단백질을 발현하는 Ad-wt에 비해 훨씬 높은 빈도로 세포 고사가 진행되고 있음을 확인할 수 있었다.

따라서, 세포 고사 억제 (antiapoptotic) 기능을 하는 것으로 잘 알려진 E1B 19 kD 단백질의 존재 유무에 따라, 아데노바이러스의 세포 고사 진행 경로가 달라짐을 알 수 있었으며, 본 발명의 YKC-1 아데노바이러스가 암세포 내에서 증식할 뿐만 아니라 세포 고사까지 유도시킴으로써 보다 빠른 살상 효과를 초래한다는 것을 확인할 수 있다.

실시예 2-6:누드 마우스를 모델로 한 재조합 아데노바이러스 YKC-1의 항종양 효과

상기한 실시예는 재조합 아데노바이러스 YKC-1의 종양세포 살상능 효과가 다른 증식 가능 아데노바이러스들 뿐만 아니라 야생형 아데노바이러스 보다 훨씬 우수함을인 비트로수준에서 보여 준다. 본 실시예는 실제로 누드 마우스를 모델로 하여, 본 발명의 YKC-1 바이러스가인 비보수준에서도 항종양 효과가 우수한지를 확인하기 위한 것이다.

우선, 5-6주령의 누드 마우스 (Charles River Japan Inc., 일본국)의 복부 피하에 인체 간암 세포주 Hep3B를 주사하여 종양의 크기가 5 × 5 ㎜ 정도에 도달했을 때, 재조합 아데노바이러스 (초원심분리로 회수하여 PBS로 투석한 바이러스) 5 ×10⁸pfu/50 ㎕를 종양 내에 주사한 다음, 2-3일에 한번씩 캘리퍼로 종양의 크기를 측정하였다.

도 12에서 볼 수 있듯이, 음성 대조군으로 PBS를 주사한 경우에는 종양의 크기가 계속 성장해 나가는 반면 본 발명의 YKC-1를 주사한 경우에는 종양의 성장이 현저히 억제되었으며 완전히 종양이 괴사되어 없어지는 경우도 관찰할 수 있었다. 또한, 다른 증식 가능 아데노바이러스들 (Ad-ΔE1B 및 YKL-1)을 주사한 경우에도 YKC-1을 주사한 경우처럼 종양의 성장이 억제되었으나 재조합 아데노바이러스 YKC-1에 비해 항종양 효능이 떨어짐을 확인할 수 있었다.

따라서, 본 발명의 재조합 아데노바이러스 YKC-1는인 비보에서도 우수한 항종양 효과를 나타냄을 알 수 있고, 세포 고사를 동시에 유발하는 특성 때문에 기존의 세포 고사를 유도하는 시스플라틴 (cisplantin)과 같은 항암제와 함께 병행요법을 실시할 때 보다 우수한 항암 효과를 기대할 수 있게 된다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

이상에서 상세히 설명하였듯이, 본 발명은 종양 세포 살상 효과가 개선된 재조합 아데노바이러스를 제공한다. 또한, 본 발명은 본 발명의 재조합 아데노바이러스를 포함하는 약제학적 항종양 조성물을 제공한다. 본 발명의 재조합 아데노바이러스는 감염된 세포에서 세포 괴사 및 세포 고사를 동시에 유도하여 종양 세포 살상능이 크게 향상되어 종래의 재조합 아데노바이러스에 의한 종양 치료 방법의 한계를 극복할 수 있으며, 더욱이 본 발명의 약제학적 조성물은 종래의 암 치료방법, 특히 세포 고사를 유도하는 암 치료 방법과 병행하여 이용되는 경우에는 치료효과를 극대화할 수 있다.

Claims (12)

1. 삭제
2. 아데노바이러스 ElB 19 유전자의 발현이 억제되도록 ElB 19 유전자의 개시 코돈에 치환 변이가 발생되어 있고, 정상적인 E1A 유전자 및 정상적인 E1B 55 유전자를 포함하며, E3 유전자는 제거되어, 종양 세포 괴사 및 고사를 동시에 유도하며, 간암 세포주, 뇌종양 세포주, 폐암 세포주 및 자궁암 세포주에 대하여 세포 살상 효과를 나타내는 것을 특징으로 하는 종양 세포 살상 효과를 나타내는 재조합 아데노바이러스.
3. 제 2 항에 있어서, 상기 변이는 ElB 19 유전자의 개시 코돈ATG가CTG로 치환되고 개시 코돈 바로 다음의 GAG가 정지 코돈 TAG로 치환된 것을 특징으로 하는 종양 세포 살상 효과를 나타내는 재조합 아데노바이러스.
4. 삭제
5. 삭제
6. 제 2 항 또는 제 3 항에 있어서, 상기 재조합 아데노바이러스는 아데노바이러스 YKC-1 (KFCC-11280)인 것을 특징으로 하는 재조합 아데노바이러스.
7. 삭제
8. (a) 아데노바이러스 ElB 19 유전자의 발현이 억제되도록 ElB 19 유전자의 개시 코돈에 치환 변이가 발생되어 있고, 정상적인 E1A 유전자 및 정상적인 E1B 55 유전자를 포함하며, E3 유전자는 제거되어, 종양 세포 괴사 및 고사를 동시에 유도하며, 간암 세포주, 뇌종양 세포주, 폐암 세포주 및 자궁암 세포주에 대하여 세포 살상 효과를 나타내는 것을 특징으로 하는 종양 세포 살상 효과를 나타내는 재조합 아데노바이러스의 치료학적 유효량; 및

   (b) 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 항종양 조성물.
9. 제 8 항에 있어서, 상기 변이는 ElB 19 유전자의 개시 코돈ATG가CTG로 치환되고 개시 코돈 바로 다음의 GAG가 정지 코돈 TAG로 치환된 것을 특징으로 하는 약제학적 항종양 조성물.
10. 삭제
11. 삭제
12. 제 8 항 또는 제 9 항에 있어서, 상기 재조합 아데노바이러스는 아데노바이러스 YKC-1 (KFCC-11280)인 것을 특징으로 하는 약제학적 항종양 조성물.