HU224679B1 - Rekombináns adenovírusok és felhasználásuk adeno-asszociált vírusok (AAV) előállítására, komplementáló sejtvonalak és a rekombináns adenovírusokat tartalmazó gyógyszerkészítmények - Google Patents

Description

A találmány tárgya új virális vektorként szolgáló rekombináns adenovírusok, ezek előállítása és alkalmazása. A találmány tárgyát képezik az említett rekombináns adenovírusokat tartalmazó gyógyszerkészítmények is.

A génterápia abból áll, hogy egy hiányosságot vagy rendellenességet (mutációt, rendellenes expressziót stb.) kijavítunk egy genetikai információnak az érintett sejtbe vagy szervbe történő bevezetésével. A genetikai információt in vitro, egy, a szervből kivett sejtbe vezethetjük be, és ekkor a módosított sejtet a szervezetbe visszaültetjük, vagy közvetlenül in vivő a megfelelő szövetbe építhetjük be. A második esetben különböző módszerek léteznek, közöttük különböző transzfekciós eljárások, melyek DNS és DEAE-dextrán [Pagano et al., J. Virol. 1, 891 (1989)], DNS és nukleáris proteinek [Kaneda et al., Science 243, 375 (1989)], DNS és lipidek [Felgner et al., PNAS 84, 7413 (1987)] komplexeit, liposzómákat [Fraley et al., J. Bioi. Chem. 255, 10431 (1980)] stb. használnak.

A közelmúltban a gének átvitelére vírusvektorokat alkalmazó módszerek ígéretes alternatívának tűntek a fenti fizikai transzfekciós eljárásokkal szemben. Ebből a szempontból különböző vírusokat teszteltek arra a tulajdonságra nézve, hogy képesek-e bizonyos sejtpopulációkat fertőzni. Részletesebben ilyen vírusok a retrovírusok (RSV, HMS, MMS stb.), a HSV, az adenoasszociált vírusok és az adenovírusok.

Ami az adenovírusokat illeti, kettős szálú, lineáris, körülbelül 36 kb méretű vírusokról van szó. Genomjuk tartalmaz egy inverz szekvenciát (ITR) mindkét végén, egy részecskeképződésért felelős szekvenciát, korai és késői géneket (vö. 1. ábra). A fő korai géneket az E1, E2, E3 és E4 régiók tartalmazzák. Ezek közül az E1 régióban (nevezetesen az E1a-ban és E1b-ben) levő gének a virális replikációhoz szükségesek. Az E4 és az L5 régiók a virális terjedésben vesznek részt, a fő késői géneket pedig az L1-L5 régiók tartalmazzák. Az Ad5 adenovírus genomját teljes mértékben szekvenálták, és adatbázisokban hozzáférhető (lásd például Genebank M73260). A többi, különböző szerotípusú adenovírus (Ad2, Ad7, Ad12 stb.) genomját is részben, ha nem teljesen szekvenálták. Ezek a vírusvektorok előnyösen széles gazdaspektrummal rendelkeznek, képesek nyugalomban lévő sejteket fertőzni, nem integrálódnak a fertőzött sejt genomjába, és a mai napig nem kapcsolható hozzájuk jelentős emberi betegség. Tulajdonságaikat figyelembe véve ezeket a vektorokat már alkalmazták gének in vivő átvitelére. Ehhez különböző adenovíruseredetű vektorokat állítottak elő, melyek különböző géneket tartalmaztak (β-gal, OTC, a-1AT, citokinek stb.).

Természetesen minden vírusvektor tartalmaz számos virális gént, melynek expressziója viszont nem kívánatos a génterápiában. Szükségszerű, hogy szabályozzuk a vad virális gének és/vagy a belőlük származó proteinek kifejeződését, melyekről feltételezhető, hogy a kezelt szervezet tekintetében nemkívánatos, illetve egyenesen végzetes immunválaszt és/vagy gyulladásos folyamatot indukálnak.

Ehhez a jelenleg ajánlott virális vektorkonstrukciókat olyan módon módosították, hogy a vektorokat képtelenné tegyék a célsejtben való autonóm replikálódásra. Ezeket a vektorokat hiányos vagy detektív vektoroknak nevezzük. Általában a hiányos vírusok genomjából tehát hiányoznak legalább az említett vírusnak a fertőzött sejtben történő replikációjához szükséges szekvenciák. Ezeket a területeket eltávolíthatjuk (teljesen vagy részben), működésképtelenné tehetjük, vagy más szekvenciákkal, például egy kívánt terápiás molekulát kódoló szekvenciával helyettesíthetjük. A hiányos vírus előnyösen mégis megőrzi genomjának azon szekvenciáit, melyek a vírusrészecskék képződéséhez szükségesek.

A rekombináns adenovírusok egy speciális esetében az irodalomban leírt konstrukciók általában olyan adenovírusok, melyekből az E1 (E1a és/vagy E1b) és adott esetben az E3 régió deletált, mely területekre a heterológ DNS-szekvencia van beépítve [Levrero et al., Gene 101, 195 (1991); Gosh-Choudrhury et al., Gene 50, 161 (1986)]. Más konstrukciók az E1 régió területén és az E4 régió egy nem esszenciális részében tartalmaznak egy deléciót [WO 94/12649]. Replikációhiányos adenovírusokat ismertetnek génterápiára a WO 95/02697 számú iratban. Ezeket a hiányos rekombináns adenovírusokat különböző módokon állíthatjuk elő, amelyek vagy használnak, vagy nem a rekombináns adenovírus replikációjához elengedhetetlen hiányzó funkciókat komplementálni képes kompetens sejtvonalat. Jelenleg az adenovíruseredetű vektorokat általában egy komplementáló sejtvonalban (293 sejtvonal) termelik, amelybe az adenovírus genomjának egy részét beépítették. Pontosabban a 293 sejtvonal tartalmazza az 5 szerotípusú adenovírus (Ad5) genomjának bal szélét (körülbelül 11-12%), amely a bal ITR-t, a részecskeképződésért felelős területet, az E1 régiót, beleértve az E1a-t és az E1 b-t is, és a pIX proteint kódoló terület egy részét tartalmazza. Ez a sejtvonal képes transzkomplementálni az E1 régiójában hiányos rekombináns adenovírust, azaz amelyből a replikációhoz szükséges E1 régió vagy annak egy része hiányzik.

Mégis nem zárhatjuk ki teljesen ezen hiányos virális vektorok előállítása során a replikatív vírusrészecskéket létrehozó rekombináció vagy az E1 típusú sejtfunkciók által in vivő történő transzkomplementáció lehetőségét. Magától értetődő, hogy az ilyen események teljesen összeférhetetlenek az elkövetkező génterápiás alkalmazással. A replikatív vírusrészecskék in vivő jelenléte végzetes következményekkel járhat, például a vírus terjedését indukálhatja, és szabályozatlan terjedést idézhet elő, gyulladásos reakció, rekombináció stb. veszélyével.

Ezzel párhuzamosan szükségszerű, hogy a megfelelő vírusfehérjék in vivő expresszióját megelőzzük. Bár a sejt szempontjából nem feltétlenül mutatnak toxikus jelleget, mégis erősen nem kívánatosak, mivel feltételezhető róluk, hogy az immunrendszer gyulladásos és/vagy lázas válaszát váltják ki, ami a kezelt szervezet szempontjából káros [D. Y. Schwarz PNAS 92, 1401-1405 (1995); J. F. Engelhardt, Humán Gene Therapy 5, 1217-1229

HU 224 679 Β1 (1994) és PNAS 91, 6196-6200 (1994); Y. Yang, Immunity 1, 433-442 (1995), J. Virol. 69, 2004-2015 (1994) és Natúré Genetics 7, 362-369 (1994)].

A találmány tárgya egy e hátrányok kiküszöbölését lehetővé tevő megoldás, amely különösen hasznosnak bizonyul megnövekedett biztonsággal rendelkező, nevezetesen replikatív vírusrészecskéktől mentes adenovírus típusú vírussarzs előállítására.

Nem várt módon a bejelentés kimutatta, hogy lehetséges egy eredeti promoterrendszer segítségével hatásosan szabályozni virális gének expresszióját, amely expresszió a vírustermelődés alatt in vitro hatékony, de ezzel ellentétben nem hatékony később, in vivő, az említett rekombináns vírusok terápiás alkalmazásakor.

Pontosabban a találmány egy rekombináns adenovírusra vonatkozik, amelyben legalább az eredeti, homológ vagy heterológ virális gének expresszióját egy indukálható promoter szabályozza.

A találmányban indukálható promoterként értünk minden olyan promotert, amelynek aktivitását egy külső kémiai és/vagy biológiai anyag jelenléte indítja be, amely anyag a találmány keretein belül redukált, ha nem nulla toxicitással rendelkezik. „Külső”-ként azt értjük, hogy a kémiai vagy biológiai anyag nem fordul elő természetes módon az igényelt adenovínjssal kezelt sejtekben.

A találmány szerint feltételezhetően alkalmazható indukálható promoterre példaként említhetjük meg például a klasszikus promotereket, amilyenek például a nehézfémekre válaszoló [CRC Boca Raton, FL 167-220 (1991); Brinster et al., Natúré 296, 39-42 (1982)], a hősokkra, hormonokra [Lee et al., PNAS USA 85, 1204-1208 (1988); 294, 228-232 (1981); Klock et al., Natúré 329, 734-736 (1987); Israél & Kaufman, Nucleic Acids Rés. 17, 2589-2604 (1989)], vagy glukóz, laktóz, galaktóz vagy antibiotikus típusú kémiai anyagokra válaszolók.

A közelmúltban leírtak egy tetraciklinnel indukálható promotert [British Medical Bulletin 51(1), 31-44 (1995); J. Virology 69(4), 2665-73 (1995)], amely különösen előnyös a bejelentés keretein belül.

Ez a tetraciklinnel indukálható promoter egy minimális promotert tartalmaz, amely működőképesen kapcsolódik a tetraciklin egy vagy több operátorához. Egy „transzkripciós aktivátornak” nevezett proteinnek a tetraciklinoperátor-szekvenciákhoz való kapcsolódása az, amely kapcsolódás csak tetraciklin vagy annak analógja jelenlétében jön létre, amely lehetővé teszi a minimális promoter aktiválódását, és így a kapcsolt virális gének vagy gén transzkripcióját.

Ami részletesebben a transzkripciós aktivátornak nevezett fehérjét illeti, ezt a tetraciklin jelenlétében a tetraciklinnel indukálható promoter operátorszekvenciáihoz való kötődés képessége, valamint az jellemzi, hogy képes a minimális promotert aktiválni. Előnyösebben egy két polipeptidből álló fehérjéről van szó, az első polipeptidből, mely tetraciklin vagy egy analógja jelenlétében a tét operátorszekvenciákhoz köt, és a második polipeptidből, melynek funkciója részletesebben az említett transzkripció aktiválása. A transzkripciós aktivátornak nevezett fehérje első polipeptidje egy tetraciklinrepresszor, amely olyan módon mutált, hogy a vad represszorral ellentétes viselkedést mutat, azaz csak tetraciklin jelenlétében, és nem pedig hiányában kapcsolódik a tét operátorszekvenciákhoz. Ami a második polipeptidet illeti, előnyösen a herpes simplex vírus 16 proteinjének aktivációs doménjéről van szó.

Abban az esetben, ha az alkalmazott indukálható promoter például glukózzal vagy galaktózzal indukálható, meg lehet tervezni egy, a fenti modell alapján kidolgozott transzkripciós aktivátor, azaz például Glu-VP16 vagy Gal4-VP16 előállítását.

A találmány egy előnyös megvalósítási módja szerint a kidolgozott indukálható promoter egy tetraciklinnel vagy annak analógjával indukálható promoter, amint azt fentebb leírtuk.

A találmány értelmében egy tetraciklinnel indukálható promoter egy minimális promotert tartalmaz működőképesen kapcsolva egy regulációsnak nevezett szekvenciához, amely legalább egy „tét operátor” tetraciklinoperátort vagy annak analógját tartalmazza.

A tetraciklin analógján értünk minden olyan vegyületet, amely szerkezeti homológiát mutat a tetraciklinnel, és képes a fentebb bemutatott transzkripciós aktivátornak nevezett fehérje transzaktivációs doménjéhez kapcsolt tetraciklinreceptorhoz kötődni legalább 10⁶ M^_1 Ka-val. A bejelentésben feltételezhetően használható analógra példaként említhetjük a doxiciklint, a klór-tetraciklint és az anhidrotetraciklint.

Minimális promoternek nevezünk minden promoterszekvenciát, amely egymagában nem képes hatékonyan biztosítani a hozzá kapcsolt DNS-szekvencia transzkripcióját. Egy ilyen promoter aktivitása teljesen függőnek bizonyul a transzkripciós aktivátor fehérje tetraciklin jelenlétében létrejövő úgynevezett regulációs szekvenciához való kapcsolódásától. A minimális promoter funkciója főként a transzkripció irányítása. Ebből a nézőpontból előnyösen a virális szekvencia felett helyezkedik el, olyan módon, hogy azzal folyamatos nukleotidszekvenciát képezzen.

A minimális promoter a humán cytomegalovirus nagyon korai promoteréből származhat, előnyösebben a +75.-től a -53., vagy a +75.-től a -31. nukleotidig terjedő részből áll. De az is lehetséges a találmány szerint, hogy egy szokásos promoterből származó minimális promotert alkalmazunk, amilyen például a timidin-kinázt kódoló gén transzkripcióját aktiváló promoter.

Egy szokásos promotert minimálissá tehetünk egy vagy több genetikai mutáció útján, melyek képtelenné teszik arra, hogy egymagában hatékonyan biztosítsa a hozzá kapcsolt gén transzkripcióját. A találmány keretein belül kidolgozhatunk egy közvetlenül az illető virális gén expressziójáért természetesen felelős promoterből származó minimális promotert is. Egy „TATA-less”-nek nevezett promoter alkalmazását is elképzelhetjük, amilyent például E. Martinez és munkatársai írtak le [EMBO Journal 113, no 13, 3115-3126 (1994)], hogy ilyen módon a lehető legalacsonyabb alapzajt kapjuk a nem indukált helyzetben.

Általános módon a minimális promotert azon nukleotidszekvencia fölé helyezzük, amelynek expresszió3

HU 224 679 Β1 ját szabályozza, vagy a természetes promotert helyettesítve, vagy nem azt helyettesítve. A nukleotidszekvencia saját promotere megmaradhat a helyén, de inaktivált formában, vagy különböző, szakember számára ismert eljárásokkal, például szuppresszióval, delécióval, és/vagy egy vagy több bázis hozzáadásával működésképtelenné téve.

A találmány egy különleges megvalósítási módjában a minimális promoter a herpes simplex vírus timidin-kinázának minimális promoteréből származik [Mc Knight et al., Cell. 37, 253-262 (1984)]. Ezt Tk-val jelöljük.

Előnyösebben a promoter részben vagy teljesen az

1. vagy a 2. számú szekvenciák egyike, vagy azok egy származéka.

A találmány keretén belül a származék kifejezés jelöl minden, az adott szekvencia genetikai és/vagy kémiai természetű módosításával kapott szekvenciát, amely megőrzi a kívánt aktivitást. Genetikai és/vagy kémiai természetű módosításon kell értenünk egy vagy több nukleinsav minden mutációját, szubsztitúcióját, delécióját, addícióját és/vagy módosítását.

Ami a regulációsnak nevezett szekvenciát illeti, ez legalább a tetraciklinnek vagy analógjának egy operátorát tartalmazza. Az operátort vagy az operátorokat a transzkripciós aktivátor ismeri fel tetraciklin jelenlétében, és így lehetővé teszi a minimális promoter aktivációját.

A létrehozható tét operátorszekvenciákat például a Hillen & Wissemann [Protein-Nucleic Acid Interaction 10, 143-162, Saeger & Heinemann (eds), Macmillan, London (1989)], a Waters és munkatársai [Nucleic Acids Rés. 11, 525-539 (1983)], a Stüber és munkatársai [PNAS USA 78, 167-171 (1981)], az Unger és munkatársai [Nucleic Acids Rés. 12, 7693-7703 (1984)] vagy a Tovar és munkatársai [Mól. Gén. Génét 215, 76-80 (1988)] által leírtak közül választhatjuk ki.

A regulációs szekvencia tartalmazhat egyetlen egyedi tét operátorszekvenciát, vagy ezzel ellentétben, több tét operátorszekvenciát, melyek száma a 10-et is elérheti, attól függően, hogy a transzkripció szabályozását növelni kívánjuk, vagy sem. A találmány egy különleges megvalósítási módja szerint a regulációs szekvencia két tét operátorszekvenciát tartalmaz, és ekkor Op2-nek nevezzük.

Előnyösebben a regulációs szekvencia részben vagy teljesen a 3. vagy a 4. számú szekvenciák egyike, vagy azok egy származéka.

Klasszikusan a regulációs szekvenciát működőképesen a minimális promoter fölé, azaz annak 5’-végére kapcsoljuk oly módon, hogy lehetővé tegye a virális eredetű gén transzkripcióját a transzkripciós aktivátor és annak tetraciklinliganduma által alkotott komplex jelenlétében. (gy egymás után 5-3’ irányban a következőkkel rendelkezünk: a regulációs szekvencia, közvetlenül vagy nem közvetlenül a minimális promoterhez kapcsolva, a minimális promoter és a virális eredetű gén. Mégis, elképzelhető, hogy a regulációs szekvenciát a minimális promoter környezetében, az átírandó virális szekvencia alatt, azaz annak 3’-végénél helyezzük el. Ekkor a sorrend 5-3’ irányban: minimális promoter, virális gén és regulációs szekvencia.

A találmány egy előnyös megvalósítási módjában a tetraciklinnel indukálható promoterben a timidin-kináz Tk-nak nevezett minimális promoteréhez egy Op2-vel jelölt regulációs szekvencia kapcsolódik. Ezt a konstrukciót a továbbiakban Op2Tk-val jelöljük. Előnyösebben a találmány szerint kialakított indukálható promoter részben vagy teljesen az 5. számú szekvencia vagy annak egy származéka.

A Op2Tk tetraciklinnel indukálható promoter, és előnyösebben az 5. számú szekvenciát teljesen vagy részben tartalmazó promoter vagy annak egy származéka szintén a találmány tárgyát képezi.

Ebből következően az igényelt adenovírusban működőképesen egy indukálható promoterhez kapcsolt virális gén vagy gének expressziója teljes mértékben a transzkripciós aktivátor és a tetraciklin által kialakított komplexnek az említett promoter regulációs szekvenciájához való kötődésétől függ.

A kötődés csak tetraciklin jelenlétében hatékony. Tetraciklin vagy annak analógja hiányában nem jön létre kötés a regulációs szekvencia és a transzkripciós aktivátor között. Ebből következően a minimális promoterhez kapcsolt virális szekvencia transzkripciója nem történik meg. Ráadásul, előnyösen, a transzkripciót indukáló anyagnak nem kell folyamatosan jelen lennie.

A találmány egyik tárgya részletesebben egy rekombináns adenovírus, amely legalább egy olyan homológ, azaz adenovirális gént tartalmaz, mely a vírusreplikációhoz és/vagy a virális terjedéshez szükséges, és melynek expresszióját egy indukálható promoter, előnyösebben egy tetraciklinnel indukálható promoter szabályozza.

Még közelebbről a találmány tárgya egy rekombináns adenovírus, melynek legalább egy, a replikációhoz és/vagy a virális terjedéshez nélkülözhetetlen genomiáiis területét részben vagy egészben egy tetraciklinnel indukálható promoter szabályozása alá helyeztük. A találmány szerinti replikációhoz vagy virális terjedéshez nélkülözhetetlen területet előnyösen az E4, E2, a IVa2 és/vagy az L5 stb. régiók, vagy azok egy része közül választjuk.

Egy különösen előnyös megvalósítási mód szerint a találmány szerinti rekombináns adenovírusok a replikációhoz és/vagy a terjedéshez szükséges szekvenciákként az E2 vagy az E4 régiókat vagy azok egy működőképes részét tartalmazzák. Részletesebben az E4 régióról szólva a lényeges gének az ORF3, az ORF6 és az ORF6/7.

Az E2 régió a virális DNS szabályozásában vesz részt. Az E2 régió két transzkripciós alegységből, az E2A-ból és az E2B-ből áll.

Az E4 régió a késői gének expressziójának szabályozásában, a késői mag RNS stabilitásában, a gazdasejt fehérjéi expressziójának kioltásában és a vírus-DNS replikációjának hatékonyságában játszik szerepet. Az E4 régiót nem tartalmazó mutánsok képtelenek terjedni. Az E4 így a virális terjedéshez nélkülözhetetlen területet képez. Az E4 régiót 7 nyílt leolvasási keret alkotja, ezeket ORF1, ORF2, ORF3, ORF4, ORF3/4, ORF6 és ORF6/7 jelöli (2. ábra). Ezek közül

HU 224 679 Β1 az 0RF3 és az 0RF6 a virális terjedéshez nélkülözhetetlen két gén. Ezen gének mindegyike képes a virális terjedést indukálni, amelyben az 0RF6 mégis fontosabb szerepet játszik, mint az ORF3 [Huang et Hearin, J. Virol. 63, 2605 (1988)].

Egy különleges megvalósítási módban a találmány szerinti vektorban az illető régió egészét egy tetraciklinnel indukálható promoter irányítása alá helyeztük. Az E2 régió esetében a 72 K cDNS-nek, a polimeráz 140 K cDNS-ének vagy a 87 K preterminális protein cDNS-ének megfelelő fragmentumról lehet szó. Ami az E4 régiót illeti, különösen a 35 576-32 490. nukleotidoknak megfelelő Taql-Bglll fragmentumról lehet szó.

Egy másik különleges megvalósítási módban egyedül ezen régiók egy működőképes, azaz a virális terjedés létrejöttéhez elegendő részének expressziója szabályozott. Az E4 régió esetében ez a rész legalább egy működőképes ORF3 vagy ORF6 gént tartalmaz. Előnyösen az E4 működőképes részét alapvetően az ORF6 alkotja. Példaképpen a 34 115-32 490. helyek közötti, az Ad5 ORF6 és az ORF7 szekvenciáit tartalmazó Bglll fragmentumot egy, a találmány szerinti, korábbiakban definiált indukálható promoter alatt helyezhetjük el.

A találmány egy másik különleges megvalósítási módjában a nélkülözhetetlen régió a IVa2 proteint kódoló régió, például annak cDNS-e. Egy másik megvalósítási módban a IVa2 proteint kódoló terület egy, a vad Ad5 adenovírus szekvenciáján a 3328-6316. nukleotidoknak megfelelő Bglll-Nrul fragmentumon, egy, a 4029-5719. nukleotidoknak megfelelő Dral-Nlalll fragmentumon vagy egy, a 4029-5788. nukleotidoknak megfelelő Dral-Xhol fragmentumon található.

A találmány egy előnyös megvalósítási módjában a virális terjedéshez nélkülözhetetlen területek promotereit a vírus genomjában egy indukálható promoterrel, előnyösebben egy tetraciklinnel indukálható promoterrel helyettesítjük.

A találmány egy első különleges megvalósítási módjában a találmány szerinti rekombináns adenovírusok az E1 génnek vagy egy részének delécióját hordozzák, és egy tetraciklinnel indukálható promoter, előnyösen Op2Tk típusú promoter irányítása alatt álló, teljes vagy részleges E4 régióval rendelkeznek.

Egy másik különleges megvalósítási módban a találmány szerinti rekombináns adenovírusok az E1 génnek vagy egy részének delécióját hordozzák, és egy tetraciklinnel indukálható promoter, előnyösen Op2Tk típusú promoter irányítása alatt álló, teljes vagy részleges E2 régióval rendelkeznek.

Egy másik előnyös megvalósítási mód szerint a találmány szerinti rekombináns adenovírusok az E1 és E2 géneknek vagy azok egy részének delécióját hordozzák, és egy tetraciklinnel indukálható promoter, előnyösen Op2Tk típusú promoter irányítása alatt álló, teljes vagy részleges E4 régióval rendelkeznek.

Egy különlegesen előnyös változatban a találmány szerinti rekombináns adenovírusok az E1 és E4 géneknek vagy azok egy részének delécióját hordozzák, és egy tetraciklinnel indukálható promoter, előnyösen

Op2Tk típusú promoter irányítása alatt álló, teljes vagy részleges E2 régióval rendelkeznek.

A találmány szerinti rekombináns adenovírusok előnyösen hordoznak továbbá egy heterológ nukleinsavszekvenciát, amely egy vagy több olyan terápiás gént tartalmaz, melynek transzferé és/vagy expressziója egy sejtben, szervben vagy szervezetben kívánatos.

Az így átvihető gének bármely gének, melyek transzkripciója és adott esetben transzlációja a célsejtben terápiás hatással rendelkező terméket eredményez.

Különösen a terápiás hatással rendelkező fehérjeszerű termékeket kódoló génekről lehet szó. A kódolt fehérjeszerű termék lehet egy protein, egy peptid stb. A fehérjeszerű termék lehet homológ a célsejttel (azaz egy olyan termék, mely természetes módon kifejeződik a célsejtben, amikor az nem mutat semmilyen rendellenességet). Ebben az esetben egy fehérje expressziója lehetővé teszi például, hogy a sejtben az elégtelen expressziót, vagy egy módosulás miatt inaktív vagy gyengén aktív fehérje expresszióját megnöveljük, vagy az említett fehérjét nagymértékben kifejezzük. A terápiás gén egy sejtprotein mutánsát is kódolhatja, amely megnövekedett stabilitással, módosult aktivitással stb. rendelkezik. A fehérjeszerű termék lehet heterológ is a célsejthez viszonyítva. Ebben az esetben a kifejezett fehérje például komplementálhat vagy hordozhat egy sejtből hiányzó aktivitást, lehetővé téve egy betegség elleni küzdelmet.

A találmány értelmében a terápiás termékek közül különösen az enzimeket, a vérszármazékokat, a hormonokat, a limfokineket: interleukinek, interferonok, TNF stb. [FR 92 03120], a növekedési faktorokat, a neurotranszmittereket vagy azok prekurzorait, szintézisenzimeit, a trofikus faktorokat: BDNF, CNTF, NGF, IGF, GMF, aFGF, bFGF, NT3, NT5 stb., az apolipoproteineket: ApoAI, ApoAlV, ApoE stb. [FR 93 05125], a disztrofmt vagy egy minidisztrofint [FR 91 11947], a tumorszuppresszorgéneket: p53, Rb, Rap1A, DCC, k-rev stb. [FR 93 04745], a koagulációban szerepet játszó faktorokat kódoló géneket: VII, Vili, IX stb. faktorok, az öngyilkos (szuicid) géneket: timidin-kináz, citozin-deamináz stb., vagy egy természetes vagy mesterséges immunglobulint (Fab, ScFv stb.) vagy annak egy részét stb. említhetjük meg.

A terápiás gén lehet egy antiszensz gén vagy szekvencia is, melynek expressziója a célsejtben gének expresszióját vagy a celluláris mRNS transzkripcióját szabályozhatja, mint például a ribozimok. Az ilyen szekvenciák a célsejtben a celluláris mRNS-sel komplementer szekvenciákká íródhatnak át, ami azok fehérjévé való transzlációját gátolhatja, az EP 140 308 szabadalmi iratban leírt módszer szerint.

A terápiás gén egy antiszensz gén vagy szekvencia is lehet, melynek expressziója a célsejtben gének expressziójának vagy a celluláris mRNS, például a ribozimok transzkripciójának szabályozását teszi lehetővé. Ilyen szekvenciák a célsejtben például a celluláris mRNS-sel komplementer RNS-sé íródhatnak át, és így gátolhatják annak proteinné való fordítását, az EP 140 308 számú szabadalomban leírt eljárás szerint.

HU 224 679 Β1

A terápiás gén lehet egy antigén peptidet kódoló gén is, amely képes az embernél immunválaszt kiváltani. A találmány ebben a különleges megvalósítási módban tehát lehetővé teszi az ember immunizálását lehetővé tevő vakcinák kialakítását, például mikroorganizmusok vagy vírusok ellen. Például az Epstein-Barr-vírusra, a HIV-vírusra, a hepatitis B vírusra [EP 185 573], az Aujeszky-betegség vírusára vagy tumorokra [EP 259 212] specifikus antigén peptídekről lehet szó.

Általában a heterológ nukleinsavszekvencia tartalmaz egy, a fertőzött sejtben működőképes transzkripciós promoterrégiót is, valamint egy, a kívánt géntől 3’-irányban elhelyezkedő területet, amely egy transzkripciós befejezési szignált és egy poliadenilációs helyet határoz meg. Ezen elemek összessége alkotja az expressziós kazettát. Ami a promoterrégiót illeti, az illető gén expressziójáért természetesen felelős promoterterületről lehet szó abban az esetben, ha arról feltételezhető, hogy működik a fertőzött sejtben. De szó lehet eltérő eredetű (más fehérjék expressziójáért felelős vagy szintetikus) területekről is. Részletesen eukarióta vagy virális gének promoterszekvenciáiról lehet szó. Például a fertőzni kívánt sejt genomjából származó promoterszekvenciákról lehet szó. Ezenkívül szó lehet egy vírus genomjából származó promoterszekvenciákról is, beleértve a használt adenovírust is. Ebben a tekintetben például az E1A, MLP, CMV, RSV stb. gének promotereit említhetjük meg. Ezenfelül ezeket a promoterrégiókat aktivációs, regulációs, vagy szövetspecifikus vagy nagymértékű expressziót lehetővé tevő szekvenciák hozzáadásával módosíthatjuk is. Másrészt amennyiben a heterológ nukleinsav nem tartalmaz promoterszekvenciákat, a hiányos vírus genomjába egy ilyen szekvencia alá építhetjük be.

Másrészt a heterológ nukleinsavszekvencia hordozhat, különösen a terápiás gén felett, egy szignálszekvenciát, amely a szintetizált terápiás terméket a célsejt szekréciós útvonalaira irányítja. A szignálszekvencia lehet a terápiás termék természetes szignálszekvenciája, de bármely más működőképes szignálszekvenciáról vagy mesterséges szignálszekvenciáról szó lehet.

A nukleinsavszekvencia előnyösen az E1, E3 vagy E4 régiók területén helyezkedik el, a deletált szekvenciákat kiegészítve vagy azokat helyettesítve.

A találmány másik tárgya egy adenovírus, amely legalább egy víruseredetű heterológ gént tartalmaz, mely az adenoasszociált vírus (AAV) részecskeképződéséhez szükséges, és melynek expresszióját egy indukálható, előnyösen egy tetraciklinnel indukálható promoter irányítja.

A találmány egy előnyös megvalósítási módja szerint a heterológ víruseredetű gén egy AAV-genom-eredetű gén vagy ennek funkcionális származéka.

Az AAV-k viszonylag kisméretű DNS-vírusok, melyek stabil és helyspecifikus módon épülnek be a fertőzött sejt genomjába. A sejtek igen széles spektrumát képesek fertőzni anélkül, hogy a sejtek növekedésére, a morfológiájára vagy a differenciációjára hatással lennének. Másrészt úgy tűnik, nem vesznek részt emberi betegségek kialakításában. Az AAV-k genomját klónozták, szekvenálták és jellemezték. Körülbelül 4680 bázisból áll, és mindkét végén tartalmaz egy körülbelül 145 bázisos inverz ismétlődő régiót (ITR), amely vírusreplikációs origóként működik. A genom fennmaradó része két fő, a részecskeképződés funkcióit hordozó részre osztható: a genom bal része, amely a virális replikációban és a virális gének expresszíójában szerepet játszó rep gént tartalmazza, és a genom jobb része, amely a víruskapszid-fehérjéket kódoló cap gént tartalmazza. Három promotert azonosítottak benne, és térképészeti egységben mért elhelyezkedésük alapján p5-nek, p19-nek és p40-nek nevezték azokat. Minimum négy fehérje szintetizálódik a rep régióból kiindulva, és ezeket látszólagos molekulatömegük alapján Rep78-nak, Rep68-nak, Rep52-nek és Rep40-nek nevezték el. A p5 promoterből átíródó 2 mRNS a Rep78 és a Rep68 szintéziséhez használódik fel. Ami a Rep52-t és a Rep40-et illeti, ezek a p19-ből származó messzendzserből szintetizálódnak. Ami részletesebben a cap gént illeti, ez a vírus burokproteinjeit kódolja (VP1, VP2 és VP3). A VP3 a fő burokprotein, melynek aminosavszekvenciáját a két nagyobb, de kisebb mennyiségben jelen levő VP1 és VP2 fehérje szekvenciája tartalmazza (3. ábra). A rep és cap géneket jellemezték, szekvenciájukat az irodalomban leírták [Srivastava et al., J. Virol. 45, 555 (1983)].

Az AAV-eredetű vektorok alkalmazását gének in vitro és in vivő átvitelére az irodalomban leírták [lásd például WO 91/18088; WO 93/09239; US 4 797 368; US 5 139 941; EP 488 528],

Általában a génterápiában alkalmazott konstrukciókban a rep és/vagy cap gének deletáltak, és azokat egy kívánt gén helyettesíti.

Replikációjukhoz az AAV-knek egy segítő- („helper”) vírusra van szükségük, amely képes transzkomplementálni a replikációhoz szükséges funkciókat. Különösen adenovírusról, herpeszvírusról vagy vakciniavírusról lehet szó. (Egy ilyen helpervírus hiányában az AAV-k latens formában a fertőzött sejt genomjában maradnak, de nem tudnak replikálódni, és így vírusrészecskéket képezni.) Klasszikusan a rekombináns AAV-ket tehát egy, az AAV két inverz ismétlődő szekvenciája (ITR) között a kívánt gént tartalmazó plazmidnak és egy, az AAV részecskeképződésért felelős génjeit (rep és cap gének) hordozó másik plazmidnak egy humán helpervírussal (például egy adenovírussal) fertőzött sejtvonalba történő kotranszformációjával állítják elő. Az adenovírussal történő kotranszfekció egy eseménysorozatot indít el, amely végül magas titerü AAV-termeléshez vezet, és jelentősen lecsökkenti az adenovirusok termelődését. Ez az eseménysorozat az E1a gén termékének szintézisével indul be, amely a p5 és a p19 promoterekből történő transzkripciót indukálja, és kis mennyiségű Rep proteinszintéziséhez vezet. A p5-ből kiindulva szintetizált egy vagy több Rep ezután a 3 promoterből kiindulva nagyobb mennyiségű mRNS szintézisét indítja be sokkal magasabb szinten, és irányított módon. Adenovírus hiányában az AAV genomja vagy elveszik, vagy a gazda kromoszómájába

HU 224 679 Β1 integrálódik. Más, az adenovírus E1a génjétől eltérő gének is szükségesek az AAV génjeinek hatékony expressziójához.

A WO 95/06743 számú közrebocsátási iratban adenovírusvektorokat ismertetnek, amelyek expresszálják a heterológ AAV géneket, és felhasználhatók rekombináns AAV termelésére. Olyan promotert alkalmaznak, amely az AAV konstans, magas szintű expresszióját biztosítja. A találmány előnyösen kimutatta, hogy lehetséges az AAV legalább egy virális génjének expresszióját egy adenovírusban egy indukálható promoter irányítása alá helyezni, mégpedig az AAV részecskeképződésért felelős funkcióinak expresszióját, különösen a rep és/vagy cap géneknek, vagy azok bármely funkcionális homológjának expresszióját szabályozni. Egy funkcionális homológ bármely olyan gén, melyet rep vagy cap gének módosításával (mutáció, szuppresszió, addíció stb.) kaptunk, és amely ugyanolyan természetű aktivitással rendelkezik. Ilyen funkcionális homológ gének lehetnek azok is, melyeket nukleinsavbankokból a rep vagy cap géneknek megfelelő szondákkal való hibridizációval kaptunk. A találmány szerint feltehetőleg szabályozható mutáns rep génre példaképpen említhetjük különösen az in1177 mutánst, amelyet Y. Yang és munkatársai ismertettek [Journal of Virology, 6058-6069 (1992)], és amely a 286. és a 287. kodonok közé egy szerin beépítéséből származik.

A találmány egy előnyös megvalósítási módja szerint a felhasznált indukálható promoter egy, a korábbiakban definiált tetraciklinnel indukálható promoter.

Egy ilyen adenovírus különböző okok miatt előnyös: jelentősen leegyszerűsíti a manipulációk terén az AAV-sarzs előállítási eljárását. Valóban, ebben a különleges esetben alapvetően az említett, a rep és cap géneket az indukálható promoter irányítása alatt hordozó adenovírust, egy rekombináns AAV-t és egy megfelelő sejtvonalat használunk fel. Végül egy ilyen adenovírusból várható AAV-titer magasabbnak bizonyul a klasszikus eljárások szerint kapottaknál.

Az indukálható promotert például az illető gén vagy gének expresszióját természetes módon irányító promoterek egyikének helyettesítésével vezethetjük be, például a p5, a p19 vagy a p40 promoter helyettesítésével. Mivel úgy látszik, hogy a p5 promoter vesz részt leginkább a vírustermeléshez vezető eseménysorozat beindításában, előnyösen ezt helyettesítjük egy tetraciklinnel indukálható, előnyösen egy Op2Tk típusú promoterrel. Egy ilyen konstrukció előnyösen lehetővé teszi a rep és cap gének expressziójának megakadályozását tetraciklin hiányában.

Az indukálható promoter irányítása alatt álló, az AAV részecskeképződéséért felelős funkciókat az igényelt adenovírus genomjának különböző területeire építhetjük be. A részecskeképződésért felelős funkciókat előnyösen a vírus egy olyan területére építjük be, amely nem zavarja meg annak az AAV-ket transzkomplementáló képességét. Lehetséges az is, hogy a részecskeképződésért felelős funkciókat az említett adenovírus genomjának egy funkcionális területére építjük be, amely területet transz-helyzetben egy plazmid vagy a használt sejtvonal szolgáltatja. Lehetséges például, hogy a rep gént, a cap gént, vagy a rep és cap géneket az E1 vagy az E3 régió területére építjük be, a deletált szekvenciákon felül, vagy azokat helyettesítve.

A transzkripció ITR-psi régió közelségéből adódó elszabadulásának megszüntetésére ezenkívül bevezethetünk egy úgynevezett negatív regulációs szekvenciát is. Egy ilyen, például az adenovírus bal ITR-je és psi szekvenciája közé bevezetett szekvencia, valamint a tetraciklinnel indukálható promotert kódoló szekvencia lehetővé teszi, hogy minden zavaró, adott esetben az adenovírus bal ITR-jében és a psi szekvenciában elhelyezkedő enhancer által kiváltott rep és cap transzkripciós aktivitást meggátoljunk. A találmány szerint felhasználható negatív szekvenciára példaképp említhetjük a vimentin promoterben [Salvetti et al., Mól. Cell. Bioi. 1676-1685 (1993)], az interferon promoterben [Whitemore et al., PNAS 87, 7799-7803 (1990)], a szívmiozin

2. könnyű láncának génjében [Ruoquian-Shen et al., Mól. Cell. Bioi., 1676-1685 (1991)] és az egéralbumin promoterében [Herbst et al., Mól. Cell. Bioi., 3896-3905 (1990)] azonosított ilyen szekvenciákat.

Egy előnyös megvalósítási mód szerint a találmány tárgya egy Op2Tk-rep-cap expressziós kazettát hordozó rekombináns adenovírus.

A találmány tárgya egy ilyen, egy AAV-eredetű vírusszekvenciát egy tetraciklinnel indukálható promoter irányítása alatt egyesítő adenovírus alkalmazása AAV-k előállítására.

Egy előnyös megvalósítási módban a találmány tárgyát képező adenovírusok az ITR szekvenciákat és egy, a részecskeképződésért felelős szekvenciát tartalmaznak. Ezek az adenovírusok az ITR szekvenciákat és egy, a részecskeképződésért felelős szekvenciát tartalmaznak. Ezek az adenovírusok ezenfelül előnyösen működésképtelen E1 régióval rendelkeznek.

Az inverz ismétlődő szekvenciák (ITR) az adenovírusok replikációs origóját alkotják. A virális genom 3'és 5’-végén helyezkednek el (vő. 1. ábra), ahonnan a molekuláris biológia klasszikus, szakemberek által ismert eljárásai szerint könnyen izolálhatok. A humán adenovírusok (különösen az Ad2 és az Ad5 szerotípusok), valamint a kutyaadenovírusok (nevezetesen a CAV1 és CAV2) ITR-jeinek nukleotidszekvenciáját az irodalomban leírták. Ami például az Ad5 adenovírust illeti, a bal ITR szekvenciája a genom 1-103. nukleotidjait tartalmazó területnek felel meg.

A részecskeképződésért felelős szekvencia (amelyet Psi szekvenciának is neveznek) a vírus-DNS pakolódásához szükséges. Ez a terület tehát jelen kell legyen ahhoz, hogy a találmány szerinti hiányos rekombináns adenovírusokat előállíthassuk. A részecskeképződésért felelős szekvencia helyét meghatározták az adenovírusok genomjában, ez a bal ITR (5’) és az E1 gén között van (vö. 1. ábra). A szekvenciát izolálhatjuk, vagy mesterségesen szintetizálhatjuk a molekuláris biológia klasszikus módszereivel. A humán adenovírusok (különösen az Ad2 és az Ad5 szerotípusok), valamint a kutyaadenovírusok (például a CAV1 és a

HU 224 679 Β1

CAV2) részecskeképződésért felelős szekvenciájának nukleotidszekvenciáját az irodalomban leírták. Ami például az Ad5 adenovírust illeti, a részecskeképződésért felelős szekvencia a genom 194-358. nukleotidjainak felel meg.

Egy különösen előnyös megvalósítási mód szerint a találmány szerinti rekombináns adenovírusokban az E1 régiót egy, az Ad5 adenovírus szekvenciáján a 454. nukleotidtól a 3328. nukleotidig tartó Pvull-Bglll fragmentum deléciójával inaktiváltuk. Az Ad5 szekvenciája az irodalomban és adatbázisokban hozzáférhető [lásd például Genebank N° M73260]. Egy másik előnyös megvalósítási mód szerint az E1 régiót egy, a 382. nukleotidtól a 3446. nukleotidig tartó Hinfll-Sau3A fragmentum deléciójával inaktiváltuk.

A találmány szerinti adenovírusokat különböző eredetű adenovírusokból kiindulva állíthatjuk elő. Különböző szerotípusú adenovírusok léteznek, melyek szerkezete és tulajdonságai kissé eltérnek, de melyek összehasonlítható genetikai szervezettséggel rendelkeznek. így a bejelentésben leírt kitanítás könnyen reprodukálható a szakember számára bármely típusú adenovírussal.

Részletesebben a találmány szerinti adenovírusok lehetnek humán, állati vagy kevert (humán és állati) eredetűek.

Ami a humán eredetű adenovírusokat illeti, a C csoportba tartozók alkalmazását részesítjük előnyben. Még előnyösebben a különböző szerotípusú humán adenovírusok közül a találmány keretein belül a 2 vagy az 5 típusú adenovírusok (Ad2 vagy Ad5) alkalmazását részesítjük előnyben.

Amint azt a korábbiakban jeleztük, a találmány szerinti adenovírusok állati eredetűek is lehetnek, vagy hordozhatnak állati eredetű adenovírusból származó szekvenciákat. A bejelentés rámutat, hogy az állati eredetű adenovírusok képesek nagy hatásfokkal fertőzni a humán sejteket, és képtelenek azokban a humán sejtekben terjedni, amelyekben ezt vizsgálták [vö. WO 94/26914]. A bejelentés azt is bemutatja, hogy az állati eredetű adenovírusokat egyáltalán nem transzkomplementálják a humán eredetű adenovírusok, ami a humán adenovírus jelenlétében létrejövő, fertőző részecskék kialakulásához vezető rekombináció és in vivő terjedés veszélyét kizárja. Az állati eredetű adenovirusok vagy adenovírusterületek alkalmazása tehát különösen előnyös, mivel az adenovírusoknak a génterápiában vektorként való alkalmazásában rejlő veszélyek sokkal alacsonyabbak.

A találmány keretein belül alkalmazható állati eredetű adenovírusok közül a kutya-, szarvasmarha-, egér(például Mav1) [Beard et al., Virology 75, 81 (1990)], juh-, sertés-, madár- vagy majom- (például SAV) eredetű adenovírusokat említhetjük meg. Részletesebben a madáradenovírusok közül az ATCC-nél hozzáférhető 1-10. szerotípusokat, például a Phelps [ATCC VR-432], Fontes [ATCC VR-280], P7-A [ATCC VR-827], IBH-2A [ATCC VR-828], J2-A [ATCC VR-829], T8-A [ATCC VR-830], K-11 [ATCC VR-921] törzseket vagy az ATCC VR-831-835 referenciaszámú törzseket említhetjük meg. A szarvasmarha-adenovírusok közül különböző ismert szerotípusokat alkalmazhatunk, például az ATCC-nél ATCC VR-313, 314, 639-642, 768, 769 referenciaszámon hozzáférhetőket (1-8. típusok). Megemlíthetjük még az FL [ATCC VR-550] és E20308 [ATCC VR-528] egéradenovírusokat, az 5 típusú [ATCC VR-1343] vagy 6 típusú [ATCC VR-1340] juhadenovírusokat, a sertés 5359 adenovírust vagy a majomadenovírusokat, például az ATCC-nél VR-591-594, 941-943, 195-203 stb. referenciaszámon nyilvántartottakat.

A találmány keretein belül a különböző állati eredetű adenovírusok közül előnyösen kutyaeredetű adenovírusokat vagy adenovírusterületeket alkalmazunk, nevezetesen a CAV2 adenovírusok bármely törzsét (Manhattan vagy A26/61 törzs például) [ATCC VR-800]. A kutyaadenovírusok számos szerkezeti vizsgálat tárgyát képezték. A CAV1 és CAV2 adenovírusok teljes restrikciós térképét leírták az irodalomban [Spibey et al., J. Gén. Virol. 70, 165 (1989)], és az E1a és E3 géneket, valamint az ITR szekvenciákat klónozták és szekvenálták [lásd Spibey et al., Vírus Rés. 14, 241 (1989); Linné, Vírus Rés. 23, 119 (1992); WO 91/11525],

A találmány tárgya egy eljárás, amely AAV-k előállítására szolgál.

Pontosabban a találmány tárgya egy AAV-k előállítására szolgáló eljárás, azzal jellemezve, hogy tartalmazza egy genomjában egy transzkripciós aktivátor szekvencia expressziós kazettáját tartalmazó sejtvonal kotranszfekcióját egy legalább egy AAV-eredetű gént egy tetraciklinnel indukálható promoter irányítása alatt tartalmazó adenovírussal és egy AAV-eredetű rekombináns vírussal vagy egy plazmiddal, melyek az AAV ITR-jei között egy transzgént hordoznak. Előnyösen egy olyan adenovírusról van szó, amely heterológ virális génként a rep és cap géneket tartalmazza.

A találmány szerinti eljárás azt használja ki, hogy a tetraciklinnel indukálható promoter irányítása alá helyezett rep és cap gének expressziója képes indukálódni egy adenovírusban elegendő mennyiségű tetraciklin és egy transzkripciós aktivátor jelenlétében.

Amint a korábbiakban megmagyaráztuk, az eljárás előnye, hogy a manipulációk terén egyszerű a klasszikus eljárásokhoz képest. Ebben az esetben csak egy sejtvonalnak az igényelt adenovírussal és egy AAVeredetű rekombináns vírussal történő koinfekcióját használjuk fel.

A találmány szerint transzformált adenovíruson kívül az eljárás felhasznál egy sejtvonalat, amely genomjában egy transzkripciós aktivátornak nevezett fehérje expressziós kazettáját tartalmazza, amely transzkripciós aktivátor egy első, tetraciklin vagy analógja jelenlétében az indukálható promoter regulációs szekvenciájához kötődni képes polipeptidből és egy ahhoz kapcsolódó második polipeptidből áll, amely a transzkripciót aktiválja.

Ami a transzkripciós aktivátornak nevezett proteint illeti részletesebben, jellemző rá, hogy tetraciklin jelenlétében a regulációsnak nevezett szekvenciához kapcsolódik, és képes aktiválni a hozzá kapcsolódó mini8

HU 224 679 Β1 mális promotert. Amint a korábbiakban kifejtettük, egy két polipeptidből álló fehérjéről van szó, ahol az első polipeptid a tét operátorhoz kapcsolódik tetraciklin vagy analógja jelenlétében, a második polipeptid funkciója pedig pontosabban az említett transzkripció aktiválása.

A találmány egy előnyös megvalósítási módja szerint a transzkripciós aktivátornak nevezett fehérje első polipeptidje egy olyan módon mutált tetraciklinrepresszor, amely a vad represszorral ellentétes viselkedést mutat, azaz csak tetraciklin jelenlétében, nem pedig hiányában kapcsolódik a tét operátorszekvenciákhoz. Ilyen típusú mutációt a mutagenezis klasszikus biológiai módszereivel hozhatunk létre. A vad represszor és a mutáns represszor közötti, a találmánynak megfelelő animosaveltérés állhat egy vagy több aminosav szubsztitúciójából, deléciójából és/vagy addíciójából. Ennek hatása, hogy az így átalakított represszort két funkcionális tulajdonsággal ruházza fel: a vad represszor analógjaként képes a tetraciklinoperátorok által alkotott regulációs szekvenciához kapcsolódni; a vad formával ellentétes módon szabályozza a tetraciklin.

A vad tetraciklinrepresszorok számos osztályát leírták már az irodalomban, melyek közül például az A, B, C, D és E osztályokat említhetjük meg. A represszorokra példaképpen említhetjük különösen a Tn10-nek nevezett represszort, amely a B osztályba tartozik. A találmány egy előnyös megvalósítási módja szerint az alkalmazott represszor a vad Tn10 represszorból származik. Pontosabban egy legalább a 71., 95., 101. vagy 102. helyeken elhelyezkedő aminosavak egyikében mutált Tn10 represszorról van szó.

Előnyösebben a represszor részben vagy teljesen a 8. számú szekvencián bemutatott aminosavszekvenciával rendelkezik. EztTetR-nek nevezzük.

Ami a transzkripciós aktivátornak nevezett fehérjében levő második polipeptidet illeti, bármilyen már ismert transzkripciós aktivációs doménről szó lehet. A találmány egy előnyös megvalósítási módja szerint a herpes simplex vírus 16. proteinjének aktivációs dolmenjéről van szó, részletesebben a VP16 C-terminális végének 130 aminosaváról, előnyösebben a VP16 C-terminális végének 11 aminosaváról, vagy a VP16 C-terminális részének egy peptidrészéről [Sceipel K. et al., EMBO J. 13, 4961-4968 (1992)], vagy annak származékairól.

Az igényelt AAV-előállítási eljárás esetében a transzkripciós aktivátor expressziós kazettája előnyösen egy 293 sejtvonal genomjába van beépülve.

A találmány egy előnyös megvalósítási módjában a transzkripciós aktivátor expressziója a sejtvonalban egy, a korábbiakban definiált, tetraciklinnel vagy analógjával indukálható promoter irányítása alá van helyezve. Előnyösebben egy genomjába az Op2TkTetR-VP16 kazettát beépítve tartalmazó 293 sejtvonalról van szó.

A találmány tárgya egy olyan sejtvonal is, amely genomjában egy, a korábbiakban definiált transzkripciós aktivátor expressziós kazettát hordoz, amely vagy tartalmaz, vagy nem tartalmaz a korábbiakban definiált, találmány szerinti indukálható promotert. Előnyösebben a genomjában az Op2Tk-TetR-VP16 kazettát beépítve tartalmazó 293 sejtvonalról van szó.

A találmány az ilyen típusú sejtvonalaknak a találmány szerinti adenovírusok vagy AAV-k előállítására való felhasználására is vonatkozik.

A találmány tárgya egy adenovírus előállítására szolgáló eljárás is, amely adenovírus génjeinek legalább egyikét hordozza, és a gén expressziója egy tetraciklinnel indukálható promoter irányítása alatt áll.

A találmány szerinti hiányos rekombináns adenovírusokat különböző módokon állíthatjuk elő.

Egy eljárás abból áll, hogy az in vitro (ligálással vagy plazmid formájában) előállított hiányos rekombináns vírus DNS-ét egy kompetens, azaz transz-helyzetben a vírus komplementálásához szükséges funkciókat és egy transzkripciós aktivátort hordozó sejtvonalba transzfektáljuk. Ezek a funkciók előnyösen a sejt genomjába beépültek, ami lehetővé teszi, hogy a rekombináció veszélyét elkerüljük, és a sejtvonalnak megnövekedett stabilitást biztosít.

Végül az elegendő mennyiségű tetraciklin vagy analógja jelenlétében megsokszorozódott vektorokat a molekuláris biológia klasszikus eljárásai szerint összegyűjtjük, tisztítjuk és amplifikáljuk.

Egy megvalósítási mód szerint lehetséges, hogy in vitro, ligálással vagy plazmid formájában állítsuk elő a megfelelő deléciókat hordozó hiányos rekombináns vírus-DNS-t, egy vagy több, tetraciklinnel vagy analógjával indukálható promoter szabályozása alatt álló virális gént és egy vagy több terápiás gént. A szuppressziókat általában a hiányos rekombináns vírus-DNS-en valósítjuk meg, a megfelelő restrikciós enzimekkel végzett emésztések, majd ligálások felhasználásával, a molekuláris biológia módszerei szerint, valamint a példákban bemutatott módon. A virális vagy a terápiás gének és az indukálható promoter azután ebbe a DNS-be enzimatikus hasítással és ligálással építhető be, a kiválasztott helyre, a választott orientációban. Az így kapott DNS, amely tehát a megfelelő deléciókat, egy vagy több, tetraciklinnel indukálható promoter szabályozása alatt álló virális gént és egy vagy több terápiás gént hordoz, lehetővé teszi, hogy közvetlenül az igényelt rekombináns adenovírust hozzuk létre.

Az is lehetséges, hogy a rekombináns vírust egymást követő, a heterológ gének és az indukálható promoter egymás utáni bevezetését lehetővé tevő lépésekkel állítjuk elő. így egy első rekombináns vírus-DNS-t állítunk elő ligálással vagy plazmid formájában, amely a megfelelő deléciókat (vagy az említett deléciók egy részét) és egy indukálható promotert, például az Op2Tk promotert hordozza. Ezt a DNS-t használjuk azután egy első rekombináns vírus kialakítására, amely az említett deléciókat hordozza egy indukálható promoterrel. Az első vírus DNS-ét azután izoláljuk és kotranszfektáljuk egy második plazmiddal vagy egy második hiányos rekombináns vírus DNS-ével, amely a megfelelő deléciókat, nevezetesen az E1 régióban lévő deléciót, egy homológ rekombinációt lehetővé

HU 224 679 Β1 tevő területet, és adott esetben egy terápiás gént hordoz. Ez a második lépés alakítja ki így a találmány szerinti rekombináns vírust.

A találmány tárgya minden gyógyszerkészítmény, amely egy vagy több, a korábbiakban leírt rekombináns adenovírust tartalmaz. A találmány szerinti gyógyszerkészítményeket helyi, orális, parenterális, intranazális, intravénás, intramuszkuláris, szubkután, intraokuláris, transzdermikus stb. úton történő beadáshoz formulázhatjuk.

Előnyösen a gyógyszerkészítmény az injektálható formulázáshoz gyógyszerészetileg elfogadható hordozókat tartalmaz. Különösen steril, izotóniás sóoldatokról (mononátrium-, dinátrium-foszfát, nátrium-, kálium-, kalcium- vagy magnézium-klorid stb., vagy ilyen sók keveréke) vagy szárított, például liofilezett készítményekről lehet szó, melyek az adott esettől függően steril víz vagy fiziológiás szérum hozzáadásával injektálható oldatok előállítását teszik lehetővé.

Az injekcióhoz alkalmazott vírusok dózisa különböző paraméterek, nevezetesen az alkalmazott beadási mód, az illető betegség, a kifejezni kívánt gén vagy a kívánt kezelési időtartam függvényében választható meg. Általános módon a találmány szerinti rekombináns adenovírusokat 10⁴—10¹⁴ pfu/ml közötti dózisban, előnyösen 10⁶- 1O¹⁰ pfu/ml dózisban formulázzuk és adjuk be. A pfu („plaque forming unit”) kifejezés egy vírusoldat fertőzőképességét fejezi ki, és egy megfelelő sejtkultúra fertőzésével és általában 5 nap elteltével a fertőzött sejtplakkok számának mérésével határozzuk meg. Egy vírusoldat pfu titerének meghatározásának technikáit az irodalom bőségesen ismerteti.

A találmány szerinti adenovírusokat számos betegség kezelésére vagy megelőzésére használhatjuk. Különösen előnyösek hiperproliferatív betegségek (rákok, resztenózis stb.) kezelésére, az illető helyre történő közvetlen injekcióval. Ebben a tekintetben a találmány tárgya egy eljárás proliferatív sejtek elpusztítására, amely eljárás magában foglalja az említett sejteknek vagy azok egy részének fertőzését egy, a korábbiakban definiált adenovírusvektorral. Abban az esetben, ha az öngyilkos gén („szuicid gén”) egy olyan gén, amely egy terápiás szerre való érzékenységet nyújt, a találmány szerinti elpusztítás! eljárás magában foglalja a sejteknek az említett terápiás szerrel való kezelését. Az eljárás felhasználásához a találmány tárgya a korábbiakban meghatározott rekombináns adenovírust, melyekben az öngyilkos gén egy olyan gén, amely egy terápiás szerre való érzékenységet nyújt; és az említett terápiás szert tartalmazó termék is, mint kombinációs termék, egyidejű, elkülönített, vagy időben szétválasztott alkalmazáshoz, hiperproliferatív megbetegedések kezeléséhez. Részletesebben az öngyilkos gén egy timidin-kináz-gén, és a terápiás szer a gancyclovir vagy az acyclovir vagy azok analógja.

A találmány szerinti rekombináns vektorok különösen vonzó tulajdonságokkal rendelkeznek a génterápiás felhasználás szempontjából. A vektorok egyesítik a fertőzés, a biztonság és a gének igen magas szintű átviteli képességének tulajdonságait.

A találmányt a következő példák és ábrák segítségével írjuk le részletesebben, amelyek azonban nem korlátozzák a találmány oltalmi körét, csupán illusztrációként szolgálnak.

Az ábrák ismertetése

1. ábra: Az Ad5 adenovírus genetikai szerveződése. Az Ad5 teljes szekvenciája adatbázisokban hozzáférhető, és lehetővé teszi egy szakember számára, hogy bármilyen restrikciós helyet kiválasszon vagy létrehozzon, és így a genom bármely régióját izolálja.

2. ábra: Az E4 régió genetikai szerveződése.

3. ábra: Az AAV genetikai szerveződése.

A molekuláris biológia általános technikái

A molekuláris biológiában klasszikusan alkalmazott eljárások, mint a plazmid DNS preparatív extrakciója, a plazmid DNS cézium-kloríd-gradiensen történő centrifugálása, az agaróz- vagy akrilamidgélen végzett elektroforézis, a DNS-fragmentumok tisztítása elektroelúcióval, a fehérjék fenolos vagy fenol/kloroformos extrahálása, a DNS kicsapása sós közegben etanollal vagy izopropil-alkohollal, a transzformálás Escherichia coliban stb. a szakemberek számára jól ismertek, és az irodalom bőségesen ismerteti azokat [Maniatis T. et al., „Molecular Cloning, a Laboratory Manual”, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N. Y. (1982); Ausubel F. M. et al. (eds), „Current Protocols in Molecular Biology”, John Wiley & Sons, N. Y. (1987)].

A pBR322, pUC típusú plazmidok és az M13 sorozat fágjai kereskedelmi eredetűek (Bethesda Research Laboratories).

A ligálásokhoz a DNS-fragmentumokat agarózvagy akrilamidgélen elektroforézissel méretük szerint elválaszthatjuk, fenollal vagy fenol/kloroform eleggyel extraháljuk, etanolban kicsapjuk, majd T4 fág DNS-ligáz (Biolabs) jelenlétében inkubáljuk a forgalmazó előírásai szerint.

Az 5’ túllógó végek betöltését E. coli DNS-polimeráz Klenow-fragmentumával végezhetjük (Biolabs) a forgalmazó előírásai szerint. A 3’ túllógó végek eltávolítását T4 fág DNS-polimeráz (Biolabs) jelenlétében végezzük, melyet a gyártó előírásai szerint alkalmazunk. Az 5’ túllógó végek eltávolítását S1 nukleázos kezeléssel végezzük.

Az in vitro szintetikus oligodezoxinukleotidok által irányított mutagenezist a Taylor és munkatársai által kifejlesztett módszer szerint végezhetjük [Nucleic Acids Rés. 13, 8749-8764 (1985)], az Amersham által forgalmazott kitet használva.

A DNS-fragmentumok úgynevezett PCR- (Polymerase-catalyzed Chain Reaction, polimerázkatalizált láncreakció) technikával végzett enzimatikus amplifikálását [Saiki R. K. et al., Science 230, 1350-1354 (1985); Mullis K. B. et Faloona F. A., Meth. Enzym. 155, 335-350 (1987)] egy „DNA thermal cycler (Perkin-Elmer Cetus) alkalmazásával végezhetjük, a gyártó előírásai szerint.

HU 224 679 Β1

A nukleotidszekvenciák ellenőrzését a Sanger és munkatársai által kidolgozott eljárás szerint végezhetjük [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74, 5463-5467 (1977)], az Amersham által forgalmazott kitet alkalmazva.

Az alkalmazott sejtvonalak

Az ezt követő példákban a következő sejtvonalakat alkalmaztuk vagy alkalmazhatjuk:

- 293 humán embrionális vesesejtvonal [Graham et al., J. Gén. Virol. 36, 59 (1977)]. A sejtvonal genomjába integrált módon tartalmazza a humán Ad5 adenovírus genomjának bal részét (12%).

- KB humán sejtvonal: egy humán epidermiszkarcinómából származik, a sejtvonal, valamint a tenyésztését lehetővé tevő körülmények az ATCC-nél hozzáférhetőek (CCL17 referenciaszámon).

- Hela humán sejtvonal: egy humán epitheliumkarcinómából származik, a sejtvonal, valamint a tenyésztését lehetővé tevő körülmények az ATCC-nél hozzáférhetőek (CCL2 referenciaszámon).

- MDCK kutyasejtvonal: az MDCK sejtek tenyésztési feltételeit Macatney és munkatársai írták le [Science 44, 9 (1988)].

- gm DBP6 sejtvonal [Brough et al., Virology 190, 624 (1992)]. A sejtvonalat az adenovírus E2 génjét az MMTV LTR promotere alatt hordozó Hela-sejtek alkotják.

1. példa

Egy E4 doménjét egy Op2Tk promoter irányítása alatt hordozó adenovírus kialakítása

1. A plC20H/Op2Tk plazmid kialakítása

A plazmid a minimális Tk promoterszekvenciáját hordozza, melyet két tetraciklinoperátor-szekvencia előz meg, ezeket a szekvenciákat ismeri fel a tetraciklinrepresszor, amikor tetraciklinhez kapcsolódik.

A plazmid előállításához a plC20H plazmidot [Marsh et al., Gene 32, 481 (1984)] Clal-BamHI-gyel emésztjük, és az 5. számú szekvenciát, amely a két tetraciklinoperátort tartalmazza egy timidin-kináz-promoter felett, e két hely közé vezetjük be.

2. A plC20H/ITR-Op2Tk plazmid kialakítása

A plazmidot úgy kapjuk, hogy a plC20H/Op2Tk plazmidot Clal-gyel emésztjük, és az Ad5 ITR-jét tartalmazó Hpall fragmentumot (koordináták: 1 ±122) beépítjük. Ez a fragmentum a kereskedelmi forgalomban kapható pSL1180 vektorból származik (Pharmacia), melyet Hindlll-mal emésztettünk, amely helyen egy PCR-rel előállított ITR van beépítve, az amplifikált fragmentum mindkét végén egy Hindlll hellyel. A következő sorrendet kapjuk: ITR-Op2Tkprom.

3. A plC20H/ITR-Op2Tk-E4 plazmid kialakítása

A plazmid a Hindlll-mal emésztett plC20H/ITROp2Tk plazmidnak felel meg, amely helyre a PY6-nak az Ad5 E4 régióját tartalmazó Nhe-Xbal fragmentuma van beépítve. Ami a pPY6 plazmidot illeti, azt a következő eljárás szerint kaptuk meg.

A plC20H plazmidból kiindulva előállítunk egy pPY2 plazmidot. A pPY2 plazmid a pMSG plazmidnak (Pharmacia) a plC20H plazmid Xbal és Sáli helyei közé klónozott Avrll-Sall fragmentumának (körülbelül 1,3 kb, amely az MMTV promotert tartalmazza) felel meg, melyet E. coli dam+ környezetben állítottunk elő. A pPY4 a pPY2 plazmidból származik egy 35 bp fragmentum BamHI és Bglll hasítás, majd ligálás utáni kivágásával. A pPY5 plazmid a plC20H plazmidnak felel meg, amelyben az 5 típusú adenovírus 35 576 (Taql) és 32 490 (Bglll) helyek között elhelyezkedő E4 régióját tartalmazó Taql-Bglll fragmentumot a Clal és BamHI helyek közé klónoztuk. A pPY5 plazmid E4 régióját tehát tartalmazza egy EcoRI-Sphl fragmentum, amelyet részleges emésztés után a pPY4 plazmid Smal és Sphl helyei közé klónozunk, miáltal a pPY6 plazmid jön létre.

4. A plC20H/ITR-Op2Tk-E4-L5 plazmid kialakítása

A plazmidot a plC20H/ITR-Op2Tk-E4 KpnI és Xbal emésztésével, és az Ad5 teljes L5 régiót tartalmazó 3,1 kb Kpnl-Xbal fragmentumának (koordináták: 33 595-30 470) beépítésével kaptuk meg.

5. A pYG4-EP plazmid kialakítása

A plC20H/ITR-Op2Tk-E4-L5 plazmidot Xbal-gyel és Nrul-gyel emésztjük, hogy a megfelelő fragmentumot, amely sorrendben az ITR-t, az Op2-t, a Tk promotert, az E4 és L5 régiókat tartalmazza, kinyerjük. Ezt a fragmentumot az adenovírus szekvenciáját az Xbal helytől az Sphl helyig tartalmazó pYG4 plazmid Xbal és Nrul helyeire építjük be. Ez a pYG4-EP plazmid egy plC20H vektor, amelyben az Ad5 Sphl-Xbal fragmentuma (koordináták: 25 095-28 590) az Sphl és Xbal helyek közé van beépítve.

A pYG4-EP vektor, amelyből az adenovírus E3 régió deletált, elegendő adenovírusszekvenciával rendelkezik az Sphl és Xbal helyek között ahhoz, hogy lehetővé tegye az adenovírus komplementáló rekombinációját a rekombináns adenovírusok termeléséhez.

6. Rekombináns adenovírusok kialakítása

Ezt az alábbi 3. példában leírt módon előállított 293/TetR-VP16 sejteknek az Sphl-emésztéssel linearizált pYG4 plazmiddal és az Srfl-emésztéssel linearizált RSV-pgal adenovírussal vagy egy transzgént hordozó adenovírussal történő kotranszfekciójával állítottuk elő tetraciklin jelenlétében vagy hiányában. Ezután a virológia klasszikus eljárásai szerint járunk el a rekombináns adenovírusok szelektálásához és amplifikálásához.

2. példa

Az AA V rep-cap génjeit az Op2Tk promoter irányítása alatt hordozó rekombináns adenovírusok előállítása

1. A pXL2630 intermedier plazmid kialakítása

Ez az intermedier plazmid lehetővé teszi, hogy az Op2Tk alá egy EcoRl helyet vezessünk be. Egy restrikciós hely jelenléte ebben a pozícióban két előnnyel jár. A p5 promoter eltávolítása után az Op2Tk promoter rep-cap gének fölé történő bevezetésére szolgál, és lehetővé teszi, hogy a hibrid promotert a TetR-VP16 fölé építsük be egy, a következőkben, a 3. példában leírt transzformált 293 sejtvonal előállításához.

HU 224 679 Β1

Ehhez a plC20H/Op2Tk plazmidot, melyet az 1. példában leírt módon kaptunk, BamHI-gyel emésztettük, a végek tompává tételéhez T4 DNS-polimerázzal kezeltük, majd EcoRV-tel emésztettük, és az ebből az emésztésből származó, az Op2Tk promotert tartalmazó fragmentumot a kereskedelmi forgalomban kapható pBSSK+ plazmid EcoRV helyére építettük be. A fragmentum orientációját a promoter alatt meglévő EcoRI hely jelenlétével választottuk ki.

3. EcoRI hely bevezetése a p5-nek a transzkripció kezdetéhez viszonyított +1 helyzetű területére

A p5 promoter eltávolításához a p5 transzkripciós +1 területére, a Rep78 kódolószekvencia fölé egy EcoRI helyet vezetünk be PCR-technikával a pAV2 plazmidon [Laughlin C., Gene 23, 69-73 (1983)]. A reakciót a következő olígonukleotidok segítségével valósítottuk meg:

6. számú szekvencia (seq5269):

5’ GAATTCTTTTGAAGCGGGAGGTTTGAACGCG 3’

EcoRI

7. számú szekvencia (seq5039):

5’ CTCCATGTACCTGGCTGA 3’

Az így kialakított fragmentumot pCRII-be (Invitrogen) építettük be, és így a pMA4 plazmidot kaptuk. A fragmentum nukleotidszekvenciáját ellenőriztük.

4. Az Op2Tk-rep-cap kapcsolódást hordozó pMA6 plazmid kialakítása

Ez az intermedier plazmid lehetővé teszi, hogy az indukálható promotert összekapcsoljuk a rep-pel. A pXL2631 Sall-EcoRI fragmentumát és a pMA4 EcoRl-Nrul fragmentumát a plC20R [Marsh et al., Gene 32, 481 (1984)] Xhol (a Sall-gyel kompatibilis) és Nrul helyeire építjük be, és így a pMA6 plazmidot kapjuk.

5. A pC01 plazmid (7. ábra, EX94008) kialakítása, amely az Ad5 adenovírus bal részét tartalmazza a Hinfl (382) helyig, valamint egy multiklónozóhelyet, és azAd5 adenovírus Sau3A (3446)-Nrul (6316) fragmentumát

5a) A pCE plazmid kialakítása

Először az Ad5 adenovírus genomja bal szélének megfelelő EcoRI-Xbal fragmentumot a plC19H vektor [Marsh et al., Gene 32, 481 (1984)] EcoRI és Xbal helyei közé klónoztuk. Ez a pCA plazmidot hozza létre. A pCA plazmidot azután Hinfl-gyel vágtuk, túllógó 5’-végeit E. coli DNS-polimeráz I Klenow-fragmentumával betöltöttük, majd EcoRI-gyel vágtuk. A pCA plazmid így kialakított fragmentumát, amely az Ad5 adenovírus genomjának bal szélét tartalmazza, a plC20H vektor [Marsh et al., Gene 32, 481 (1984)] EcoRI és Smal helyei közé klónoztuk. így a pCB plazmid jön létre. A pCB plazmidot azután EcoRI-gyel vágtuk, túllógó 5’-végeit E. coli DNS-polimeráz I Klenow-fragmentumával betöltöttük, majd BamHI-gyel vágtuk. A pCB plazmid így kialakított fragmentumát, amely az Ad5 adenovírus genomjának bal szélét tartalmazza, a plC20H vektor Nrul és Bglll helyei közé klónoztuk. így a pCE plazmid jön létre, melynek érdekes jellemzője, hogy rendelkezik az Ad5 adenovírus első 382 bázispárjával, amit egy multiklónozóhely követ.

5b) A pCD’ plazmid kialakítása

Az Ad5 adenovírus genomjának Sau3A (3346)-Sstl (3645) és Sstl (3645)-Narl (5519) fragmentumait először ligáltuk, és a plC20H vektor Clal és BamHI helyei közé klónoztuk, ami a pPY53 plazmidot hozta létre. A pPY53 plazmid dam- környezetben előállított SallTaql fragmentumát, amely az Ad5 adenovírus genomjának a Sau3A (3346) és Taql (5207) helyek közötti részét tartalmazza, azután a plC20H vektor Sáli és Clal helyei közé klónoztuk, ami a pCA’ plazmidot hozta létre. Az Ad5 adenovírus genomjának dam- környezetben előállított Taql (5207)-Narl (5519) fragmentumát és a pCA’ plazmid Sall-Taql fragmentumát azután ligáltuk, és a plC20H vektor Sáli és Narl helyei közé klónoztuk. Ezzel a pCC’ plazmidot hoztuk létre. Az Ad5 adenovírus genomjának dam- környezetben előállított Narl (5519)-Nrul (6316) fragmentumát és a pCC' plazmid Sall-Narl fragmentumát azután ligáltuk, és a plC20H vektor Sáli és Nrul helyei közé klónoztuk. Ezzel a pCD’ plazmidot hoztuk létre.

5c) A pC01 plazmid kialakítása

A pCD’ plazmid részleges Xhol-emésztése, majd teljes Sall-emésztése egy olyan restrikciós fragmentumot hoz létre, amely az Ad5 adenovírus szekvenciáját a Sau3A (3446) helytől a Nrul (6316) helyig tartalmazza. Ezt a fragmentumot a pCE plazmid Sáli helyére klónoztuk. Ezzel a pC01 plazmidot hoztuk létre.

6. A pMA7 és pMA8 plazmidok kialakítása

A pMA6-nak az AAV Op2Tk-rep-cap-poliA+ fragmentumát (az AAV szekvenciáján a SnaBI helyig, 4495 helyzetig) tartalmazó EcoRV-SnaBI fragmentumát a pC01 EcoRV helyére vezettük be, az adenovírus ITR-hez viszonyítva kétféle orientációban. Az igy kapott plazmidokat pMA7-tel (az adenovírus ITR-jével ellentétes orientációjú kazetta) és pMA8-cal (azonos orientáció) jelöltük.

7. Az Op2Tk-rep-cap-ot tartalmazó rekombináns adenovírus kialakítása

Ez a rész az AAV Op2Tk-rep-cap-ját tartalmazó hiányos rekombináns adenovírus kialakítását írja le. Ezt az adenovírust a pMA7 vagy a pMA8 plazmidoknak egy hiányos adenovírusvektorral segítősejtekbe (293 sejtvonal) történő kotranszfekciójával kaptuk, amely sejtek transz-helyzetben hordozzák az adenovírus E1 területei (E1A és E1B) által kódolt funkciókat.

Pontosabban az AdMA7 és az AdMA8 adenovírusokat az AdRSVpgal adenovírus és a pMA7 és pMA8 plazmidok közötti in vivő homológ rekombinációval állítottuk elő a következő eljárás szerint: Az Ndel-gyel linearizált pMA7 vagy pMA8 plazmidot és a Clal-gyel linearizált AdRSVPgal adenovírust kotranszfektáltuk a 293 sejtvonalba kalcium-foszfát jelenlétében, hogy lehetővé tegyük a rekombinációt. Az így kialakított rekombináns adenovírusokat plakktisztítással szelektáltuk. Izolálás után a rekombináns adenovírust 293 sejtvonalban amplifikáltuk, ami körülbelül 10¹° pfu/ml titerű nem tisztított hiányos rekombináns adeno12

HU 224 679 Β1 vírust tartalmazó tenyészet-felülúszóhoz vezetett. A tisztításhoz a virális részecskéket cézium-klorid-gradiensen centrifugáltuk az ismert technikák, például Graham és munkatársai eljárása [Virology 52, 456 (1973)] szerint.

Az AdMA7 vagy AdMA8 adenovírusokat -80 °C-on 20% glicerolban tároltuk.

8. Az E3 régióban az Op2Tk-rep-cap-poliA+AAV-t hordozó rekombináns adenovírus kialakítása A rész egy E1-ben deleiéit, az E3 régióban az

Op2Tk-rep-cap-poliA+AAV-t hordozó rekombináns adenovírus kialakítását iga le.

A pMA28 plazmid az E3 régióban az Op2Tk-repcap-poliA+AAV-t hordozó Ad(E1-, E3-) teljes szekvenciáját tartalmazza. Ezt rekombinációval állítottuk elő E. coliban, a pMA24 plazmidnak például a C2110(pXL2639) (E1-, E3-) törzsbe történő bevezetésével, melyet a referenciaként beépített PCT/FR96/00215 számú bejelentésben írtak le.

8.1. A pMA22 intermedier plazmid kialakítása

A pMA7 plazmid Op2Tk-rep-cap-poliA+AAV-t hordozó Xbal-Xbal fragmentumát a pYG4-EP Xbal helyére építettük be, az E3 régió helyére oly módon, hogy az Op2Tk-rep-cap-poliA+AAV az E3 régióval ellentétes orientációban legyen. Az így létrehozott plazmid a pMA22.

8.2. Az E. coliban való rekombináció megvalósításához használt pMA24 plazmid kialakítása

A pMA22-nek az adenovírus 27 082-28 593 és a 3471-31 509 szekvenciáival végződő Op2Tk-rep-cappoliA+AAV kazettát tartalmazó Nhel-Spel fragmentumát a pXL2756 plazmid kompatibilis helyére építettük be, és így a pMA24 plazmidot hoztuk létre, amely az Op2Tk-rep-cap-poliA+AAV kazetta körül a rekombinációhoz szükséges területeket, a B. subtilis sacB génjét és a kanamicinrezisztencia-gént hordozza.

8.3. Az E3 régióban az Op2Tk-rep-cap-poliA+AAV-t hordozó rekombináns adenovírus kialakítása

Ezt E. coliban rekombinációval végeztük, a pMA24 plazmidot a C2110(pXL2688) vagy C2110(pXL2789) törzsbe elektroporálva, és LB, szacharóz, tetraciklin közegen egy második rekombinációs eseményre szelektálva. így egy pMA28 plazmidot hordozó C2110 törzset kaptunk.

A plazmidot azután 293 sejtekbe transzfektáltuk Paci-emésztés után.

3. példa

A termelő 293 Op2Tk-TetR-Vp16 sejtvonal kialakítása

A rész egy olyan 293 sejtvonal kialakítását írja le, amely genomjában a hibrid TetR-VP16 transzaktivátor kazettát hordozza az Op2Tk promoter irányítása alatt. Ehhez a pMA2 plazmidot alakítottuk ki, hogy a pMA2 plazmid és a neomicinrezisztencia-gént a PGK (foszfoglicerát-kináz) promoter irányítása alatt hordozó pMSCV plazmid [Hawley et al., J. Exp. Med. 176, 1149-1163 (1993)] kotranszfekciójával egy sejtvonalat hozzunk létre. A pMA2-t úgy alkottuk meg, hogy a pYL2530 Sall-EcoRI fragmentumát egy pUHD17.1 plazmid kompatibilis Shol-EcoRI helyei közé építettük be. A pUHD17.1 plazmid egy mutáns tetraciklinrepresszort kódoló szekvenciát működőképesen a VP16 szekvenciához kapcsolva tartalmazó plazmid. Ez a vektor a pUHD15.1 vektorból származik [H. Bujard, P.N.A.S. USA 89, 5547-5551 (1992)], amely a vad tetraciklinrepresszor-szekvenciát a herpes simplex vírus VP16 C-terminális végének 130 aminosavával kapcsolva tartalmazza. A pUHD17.1 kialakításához egy 399 bázispáros Xbal-Eco47lll fragmentumot, amely a mutáns tetraciklinrepresszor 3-135. aminosavainak felel meg, a pUHD15.1 megfelelő restrikciós fragmentumával cseréltük ki.

A találmány szerinti 293 Op2Tk-TetR-VP16 sejtvonalakat a választott sejteknek a pMA2 és a pMSCV plazmiddal, és egy glükokortikoidreceptort kódoló konstrukcióval [Hollenberg et al., (1985)] kalcium-foszfát jelenlétében végzett kotranszfekciójával állítjuk elő. Pontosabban a 293 sejtvonal sejtjeit 5 cm átmérőjű Petri-csészékben 1-5 pg pMA2 plazmiddal transzfektáltuk.

A geneticinrezisztens kiónok kiválasztása

A sejtek transzfekciója után mostuk azokat, majd borjúmagzatszérummal kiegészített (7% végső koncentráció) tápközeget (MÉM, Sigma) adtunk hozzá, és a sejteket 20 órán át inkubáltuk. Másnap geneticin G418 (Gibco-BRL, Life Technologies) 400 mg/l hatékony koncentrációja jelenlétében a sejteket szelektáltuk. A geneticint minden harmadik napon lecseréltük, és a szelektálható kiónok körülbelül 3 hét után jelentek meg. Amikor minden nem transzfektált sejt elpusztult, csak a rezisztenciagént beépített sejtek éltek túl, és osztódtak, sejtklónokat alkotva. Amikor a sejtklónok elég nagyok, azaz szabad szemmel láthatóak lettek, egyenként átvittük 24 lyukas tenyésztőlemez lyukaiba. Ezután minden kiónt progresszíven amplifikáltunk először geneticin jelenlétében egy 12 lyukas tenyésztőlemez lyukaiban, majd 6 lyukú lemezen, és végül sejttenyésztő edényben amplifikáltunk. Ezután minden sejtklónt folyékony nitrogénben fagyasztással konzerváltunk.

Egy bizonyos számú kiónt izoláltunk, amplifikáltunk és szelektáltunk arra a képességre, hogy egy riportergént, például a lacZ-t ki tud fejezni az Op2Tk promoter irányítása alatt tetraciklin megfelelő koncentrációban történő hozzáadása után. Az alkalmazott plazmid a pMA9, és ezt az E. coli β-galaktozidázt kódoló szekvenciáját hordozó pRSVgalIX plazmid Stul-BamHI fragmentumának és egy nukleáris lokalizációs szignálnak az előzőleg EcoRI-gyel linearizált pMA2 plazmidba történő bevezetésével, a végek tompává tételéhez T4 bakteriofág DNS-polimerázával végzett kezeléssel, majd BamHI-gyel végzett emésztéssel hoztuk létre.

A kiónok közül a rep-cap feltételes expresszióját lehetővé tevőket, melyeket az előzőleg leírt adenovírus hordoz, és AAV-k termelését magas titerrel lehetővé tevőket használtuk termelő sejtvonalakként.

HU 224 679 Β1

SZEKVENCIÁK JEGYZÉKE (1) AZ 1. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

(A) HOSSZ: 61 bázispár (B) TÍPUS: nukleotid (C) SZÁLAK SZÁMA: egyetlen (D) KONFIGURÁCIÓ: lineáris (ii) MOLEKULATÍPUS: cDNS (xi) AZ 1. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

GATCCGGTCG CTCGGTGTTC GAGGCCACGC GTCACCTTAA TATGCGAAGT

GGACCTCGGA (2) A 2. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

(A) HOSSZ: 64 bázispár (B) TÍPUS: nukleotid (C) SZÁLAK SZÁMA: egyetlen (D) KONFIGURÁCIÓ: lineáris (ii) MOLEKULATÍPUS: cDNS (xi) A 2. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

AGATCTGCGG TCCGAGGTCC ACTTCGCATA TTAAGGTGAC CGTGGCCTCG ACACCGAGCG ACCG (3) A 3. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

(A) HOSSZ; 67 bázispár (B) TÍPUS: nukleotid (C) SZÁLAK SZÁMA: egyetlen (D) KONFIGURÁCIÓ: lineáris (ii) MOLEKULATÍPUS: cDNS (xi) A 3. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

CGATACTTTT CTCTATCACT GATAGGGAGT GGTCTCGAGA CTTTTCTCTA CACTGATAGG GAGTGGT (4) A 4. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

(A) HOSSZ: 75 bázispár (B) TÍPUS: nukleotid (C) SZÁLAK SZÁMA: egyetlen (D) KONFIGURÁCIÓ: lineáris (ii) MOLEKULATÍPUS: cDNS (xi) A 4. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

CGCAGATCTA CCACTCCCTA TCAGTGATAG AGAAAAGTCT CGAGACCACT CCCTATCAGT GATAGAGAAA AGTAT (5) AZ 5. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

(A) HOSSZ: 141 bázispár (B) TÍPUS: nukleotid (C) SZÁLAK SZÁMA: egyetlen (D) KONFIGURÁCIÓ: lineáris (ii) MOLEKULATÍPUS: cDNS (xi) AZ 5. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA: ATCGATACTT TTCTCTATCA CTGATAGGGA AGGGAGTGGT AGATCTGCGG TCCGAGGTCC GAACACCGAG CGACCGGATC C

GTGGTCTCGA

ACTTCGCATA

GACTTTTCTC

TTAAGGTGAC

TATCACTGAT

GCGTGGCCTC

120

141 (6) A 6. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI: (i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

(A) HOSSZ: 31 bázispár

HU 224 679 Β1 (B) TÍPUS: nukleotid (C) SZÁLAK SZÁMA: egyetlen (D) KONFIGURÁCIÓ: lineáris (ii) MOLEKULATÍPUS: cDNS (xi) A 6. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

GAATTCTTTT GAAGCGGGAG GTTTGAACGC G 31 (7) A 7. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

(A) HOSSZ: 18 bázispár (B) TÍPUS: nukleotid (C) SZÁLAK SZÁMA: egyetlen (D) KONFIGURÁCIÓ: lineáris (ii) MOLEKULATÍPUS: cDNS (xi) A 7. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

CTCCATGTAC CTGGCTGA 18 (8) A 8. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

(A) HOSSZ: 206 aminosav (B) TÍPUS: aminosav (C) SZÁLAK SZÁMA: egyetlen (D) KONFIGURÁCIÓ: lineáris (ii) MOLEKULATÍPUS: fehérje (xi) A 8. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

Met 1

Ser

Arg

Leu Asp 5

Lys

Ser

Lys

Val

Ile 10

Asn

Ser

Alá

Leu

Glu 15

Leu

Leu

Asn

Glu

Val

Gly

Ile

Glu

Gly

Leu

Thr

Thr

Arg

Lys

Leu

Alá

Gin

20

25

30

Leu

Leu

Gly

Val

Glu

Gin

Pro

Thr

Leu

Tyr

Trp

His

Val

Lys

Asn

Lys

35

40

45

Arg

Alá

Leu

Leu

Asp

Alá

Leu

Alá

Ile

Glu

Met

Leu

Asp

Arg

His

Thr

50

55

60

His

Phe

Cys

Pro

Leu

Lys

Gly

Glu

Ser

Trp

Gin

Asp

Phe

Leu

Arg

Asn

65

70

75

80

Asn

Alá

Lys

Ser

Phe

Arg

Cys

Alá

Leu

Leu

Ser

His

Arg

Asn

Gly

Alá

85

90

95

Lys

Val

His

Ser

Glu

Thr

Arg

Pro

Thr

Glu

Lys

Gin

Tyr

Glu

Thr

Leu

100

105

110

Glu

Asn

Gin

Leu

Alá

Phe

Leu

Cys

Gin

Gin

Gly

Phe

Ser

Leu

Glu

Asn

115

120

125

Alá

Leu

Tyr

Alá

Leu

Ser

Alá

Val

Gly

His

Phe

Thr

Leu

Gly

Cys

Val

130

135

140

Leu

Glu

Asp

Gin

Glu

His

Gin

Val

Alá

Lys

Glu

Glu

Arg

Glu

Thr

Pro

145

150

155

160

Thr

Thr

Asp

Ser

Met

Pro

Pro

Leu

Leu

Arg

Gin

Alá

Ile

Glu

Leu

Phe

165

170

175

HU 224 679 Β1

Asp

His

Gin

Gly 180

Alá

Glu

Pro

Alá

Phe 185

Leu

Phe

Gly

Leu

Glu 190

Ile

Cys

Gly

Leu

Glu

Lys

Gin

Leu

Lys

Cys

Glu

Ser

Gly

Ser

195

200

205

SZABADALMI IGÉNYPONTOK

Claims (68)

1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK

   1. Rekombináns adenovírus, amelyben legalább egy virális homológ vagy heterológ gén expressziója egy indukálható promoter irányítása alá van helyezve, ahol a homológ gén az adenovírus replikációjához és/vagy virális terjedéséhez szükséges genomiális területet hordozza, a heterológ gén egy adenoasszociált vírus részecskeképződésért felelős funkcióit hordozza.
2. 2. Az 1. igénypont szerinti rekombináns adenovírus, azzal jellemezve, hogy az indukálható promoter egy nehézfémekre, hősokkra, hormonokra vagy tetraciklinre válaszoló promoter.
3. 3. Az 1. vagy a 2. igénypont szerinti rekombináns adenovírus, azzal jellemezve, hogy a promoter tetraciklinnel vagy annak analógjaival indukálható promoter.
4. 4. A 3. igénypont szerinti rekombináns adenovírus, azzal jellemezve, hogy a tetraciklinnel indukálható promoter tartalmaz egy minimális promotert működőképesen kapcsolva egy, legalább egy tetraciklinoperátort tartalmazó regulációs szekvenciához.
5. 5. A 4. igénypont szerinti rekombináns adenovírus, azzal jellemezve, hogy a regulációs szekvencia legalább két tetraciklinoperátort tartalmaz.
6. 6. A 4. vagy az 5. igénypont szerinti rekombináns adenovírus, azzal jellemezve, hogy a regulációs szekvencia részben vagy teljesen a 3. számú szekvencián vagy a 4. számú szekvencián bemutatott szekvencia, vagy azok funkcionális származéka.
7. 7. A 4-6. igénypontok bármelyike szerinti rekombináns adenovírus, azzal jellemezve, hogy a minimális promoter a humán CMV-ből származik.
8. 8. A 4-7. igénypontok bármelyike szerinti rekombináns adenovírus, azzal jellemezve, hogy a minimális promoter a humán CMV promoter +75 és -53 közötti vagy +75 és -31 közötti nukleotidjainak felel meg.
9. 9. A 4-6. igénypontok bármelyike szerinti rekombináns adenovírus, azzal jellemezve, hogy a minimális promoter a virális génnel homológ vagy heterológ promoter, amely olyan módon mutált, hogy képtelen egymagában biztosítani az általa szabályozott virális gén transzkripcióját.
10. 10. A 9. igénypont szerinti rekombináns adenovírus, azzal jellemezve, hogy a minimális promoter az illető virális génnel homológ promoterből származik.
11. 11. A 9. igénypont szerinti rekombináns adenovírus, azzal jellemezve, hogy a minimális promoter a herpes simplex vírus timidin-kinázának promoteréből származik.
12. 12. A 11. igénypont szerinti rekombináns adenovírus, azzal jellemezve, hogy a minimális promoter részben vagy teljesen az 1. számú szekvencián vagy a 2. számú szekvencián bemutatott promoter vagy ezek funkcionális származéka.
13. 13. A 4-12. igénypontok bármelyike szerinti rekombináns adenovírus, azzal jellemezve, hogy a minimális promoter az átírandó virális gén felett helyezkedik el, annak saját promoterét helyettesítve vagy nem helyettesítve.
14. 14. A 4-13. igénypontok bármelyike szerinti rekombináns adenovírus, azzal jellemezve, hogy az említett minimális promoteren kívül az illető virális gén saját promoterét is tartalmazza, de inaktivált vagy működésképtelen formában.
15. 15. A 4-14. igénypontok bármelyike szerinti rekombináns adenovírus, azzal jellemezve, hogy a regulációs szekvencia a minimális promoter felett helyezkedik el.
16. 16. A 4-14. igénypontok bármelyike szerinti rekombináns adenovírus, azzal jellemezve, hogy a regulációs szekvencia az illető virális gén alatt helyezkedik el.
17. 17. A 16. igénypont szerinti rekombináns adenovírus, azzal jellemezve, hogy a regulációs szekvencia az illető virális génhez közvetlenül vagy nem közvetlenül kapcsolódik.
18. 18. Az 1-17. igénypontok bármelyike szerinti rekombináns adenovírus, azzal jellemezve, hogy az indukálható promoter az Op2Tk.
19. 19. Az 1-6. vagy a 9-18. igénypontok bármelyike szerinti rekombináns adenovírus, azzal jellemezve, hogy az indukálható promoter részben vagy teljesen az 5. számú szekvencián bemutatott promoter vagy annak funkcionális származéka.
20. 20. Az 1-19. igénypontok bármelyike szerinti rekombináns adenovírus, amelyben legalább egy virális, az adenovírus replikációjához és/vagy virális terjedéséhez szükséges genomiális területet hordozó homológ gén expressziója egy indukálható promoter irányítása alatt áll.
21. 21. Az 1-20. igénypontok bármelyike szerinti rekombináns adenovírus, amelyben a homológ gén expressziója tetraciklinnel vagy annak analógjával indukálható promoter irányítása alatt áll.
22. 22. A 20. vagy 21. igénypont szerinti rekombináns adenovírus, azzal jellemezve, hogy az adenovírus replikációjához és/vagy virális terjedéséhez szükséges genomiális terület részben vagy egészben az említett promoter irányítása alatt áll.
23. 23. A 22. igénypont szerinti rekombináns adenovírus, azzal jellemezve, hogy a replikációhoz és/vagy terjedéshez szükséges területet az E4, E2 terület, a IVa2 és/vagy az L5 terület vagy azok részei közül választjuk.

    HU 224 679 Β1
24. 24. A 23. igénypont szerinti rekombináns adenovírus, azzal jellemezve, hogy az E2 régiónak megfelelő fragmentum egy, a 72 K cDNS-nek, a 140 K polimeráz cDNS-nek vagy a 87 K preterminális protein cDNSének megfelelő fragmentum.
25. 25. A 23. igénypont szerinti rekombináns adenovírus, azzal jellemezve, hogy az E4 régió az Ad5 adenovírus szekvenciáján a 35 576-32 490 nukleotidoknak megfelelő Taql-Bglll fragmentum.
26. 26. A 23. igénypont szerinti rekombináns adenovírus, azzal jellemezve, hogy az E4 régió legalább az ORF6-ot kódoló régió.
27. 27. A 23. vagy 25. igénypont szerinti rekombináns adenovírus, azzal jellemezve, hogy az E4 régió az ORF6 és ORF7 szekvenciákat tartalmazó, az Ad5 adenovírus szekvenciáján a 34 115-32 490 helyek közötti Bglll fragmentum.
28. 28. A 23. igénypont szerinti rekombináns adenovírus, azzal jellemezve, hogy a IVa2-t kódoló régió egy, az Ad5 adenovírus szekvenciáján a 3328-6316 nukleotidokat tartalmazó Bglll-Nrul fragmentum vagy a 4029-5719 nukleotidoknak megfelelő Dral-Nlalll fragmentum vagy a 4019-5788 nukleotidoknak megfelelő Dral-Shol fragmentum.
29. 29. Az 1-23. vagy a 25-27. igénypontok bármelyike szerinti rekombináns adenovírus, azzal jellemezve, hogy az E1 gén egészének vagy egy részének delécióját hordozza, és az E4 régió egészével vagy egy részével rendelkezik, amely egy indukálható Op2Tk promoter szabályozása alatt áll.
30. 30. Az 1-24. igénypontok bármelyike szerinti rekombináns adenovírus, azzal jellemezve, hogy az E1 gén egészének vagy egy részének delécióját hordozza, és az E2 régió egészével vagy egy részével rendelkezik, amely egy indukálható Op2Tk promoter szabályozása alatt áll.
31. 31. Az 1-27. vagy a 29. igénypontok bármelyike szerinti rekombináns adenovírus, azzal jellemezve, hogy az E1 és E2 gének egészének vagy egy részének delécióját hordozza, és az E4 régió egészével vagy egy részével rendelkezik, amely egy indukálható Op2Tk promoter szabályozása alatt áll.
32. 32. Az 1-27. vagy a 30. igénypontok bármelyike szerinti rekombináns adenovírus, azzal jellemezve, hogy az E1 és E4 gének egészének vagy egy részének delécióját hordozza, és az E2 régió egészével vagy egy részével rendelkezik, amely egy indukálható Op2Tk promoter szabályozása alatt áll.
33. 33. A 20-32. igénypontok bármelyike szerinti rekombináns adenovírus, azzal jellemezve, hogy az Op2Tk promoter irányítása alá helyezett terület saját promotere deletált.
34. 34. A 20-33. igénypontok bármelyike szerinti rekombináns adenovírus, azzal jellemezve, hogy továbbá egy vagy több terápiás gént kódoló nukleinsavszekvenciát tartalmaz.
35. 35. A 34. igénypont szerinti rekombináns adenovírus, azzal jellemezve, hogy az említett nukleinsavszekvencia az E1, E3 vagy az E4 régió területén van jelen, a deletált szekvenciákat kiegészítve vagy helyettesítve.
36. 36. Az 1-19. igénypontok bármelyike szerinti rekombináns adenovírus, amelyben legalább egy virális, egy adenoasszociált vírus (AAV) részecskeképződésért felelős funkcióit hordozó heterológ gén expressziója egy indukálható promoter irányítása alatt áll.
37. 37. Az 1-19. vagy a 36. igénypontok bármelyike szerinti rekombináns adenovírus, amelyben a heterológ gén expressziója tetraciklinnel vagy egy analógjával indukálható promoter irányítása alatt áll.
38. 38. A 36. vagy 37. igénypont szerinti rekombináns adenovírus, azzal jellemezve, hogy a heterológ gén az AAV genomjának génje vagy annak egy funkcionális származéka.
39. 39. A 36-38. igénypontok bármelyike szerinti rekombináns adenovírus, azzal jellemezve, hogy az AAV rep és/vagy cap génjeit vagy azok egy homológját tartalmazza egy indukálható promoter irányítása alatt.
40. 40. A 36-39. igénypontok bármelyike szerinti rekombináns adenovírus, azzal jellemezve, hogy egy Op2Tk-rep-cap expressziós kazettát hordoz.
41. 41. A 40. igénypont szerinti rekombináns adenovírus, azzal jellemezve, hogy az Op2Tk promoter az eredeti p5 promotert helyettesíti.
42. 42. A 36-41. igénypontok bármelyike szerinti rekombináns adenovírus, azzal jellemezve, hogy a virális eredetű heterológ gén és az indukálható promoter az említett adenovírus genomjának E1 régiójának területén van jelen, a deletált szekvenciákat kiegészítve vagy helyettesítve.
43. 43. A 36-42. igénypontok bármelyike szerinti rekombináns adenovírus, azzal jellemezve, hogy tartalmazza az AAV ITR-jeit és egy részecskeképződésért felelős szekvenciát.
44. 44. Az 1-43. igénypontok bármelyike szerinti rekombináns adenovírus, melyben legalább az E1 régió működésképtelen.
45. 45. Az 1-44. igénypontok bármelyike szerinti rekombináns adenovírus, azzal jellemezve, hogy az adenovírusgenom humán, állati vagy kevert eredetű.
46. 46. A 45. igénypont szerinti rekombináns adenovírus, azzal jellemezve, hogy a humán eredetű adenovírus egy C csoportba tartozó adenovírus, előnyösen 2 vagy 5 típusú (Ad2 vagy Ad5) adenovírus.
47. 47. A 46. igénypont szerinti rekombináns adenovírus, azzal jellemezve, hogy az állati eredetű adenovírus egy kutya-, szarvasmarha-, egér-, juh-, sertés-, madár- vagy majomeredetű adenovírus.
48. 48. Legalább egy AAV-eredetű gént egy tetraciklinnel indukálható promoter szabályozása alatt tartalmazó rekombináns adenovírus alkalmazása AAV-k előállítására.
49. 49. Eljárás AAV-k előállítására, azzal jellemezve, hogy genomjában egy transzkripciós aktivátor expressziós kazettáját tartalmazó sejtvonalat kotranszfektálunk tetraciklin vagy egy analógja jelenlétében legalább egy AAV-eredetű gént egy tetraciklinnel indukálható promoter szabályozása alatt tartalmazó adenovírussal és egy AAV-eredetü rekombináns vírussal vagy egy részecskeképződésért felelős plazmiddal, amelyek az AAV ITR-jei között egy transzgént hordoznak.

    HU 224 679 Β1
50. 50. A 49. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az adenovírus tartalmazza a rep és cap géneket egy tetraciklinnel indukálható promoter irányítása alatt.
51. 51. A 49. vagy az 50. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az AAV termelődését tetraciklin vagy egy analógja elegendő mennyiségének jelenléte indukálja.
52. 52. A 49-51. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a transzformált sejtvonal a 293 sejtvonalból származik.
53. 53. Az 52. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy egy olyan 293 sejtvonalról van szó, amely genomjában egy első, tetraciklin vagy analógja jelenlétében az adenovírusban jelen levő indukálható promoter regulációs szekvenciájával kapcsolódni képes polipeptidből és egy ehhez kapcsolódó második, a transzkripciót aktiváló polipeptidből álló transzkripciós aktivátor expressziós kazettáját tartalmazza.
54. 54. Az 53. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az első polipeptid egy vad típusú tetraciklinrepresszor, amely olyan módon mutált, hogy az említett, kizárólag tetraciklin vagy analógja jelenlétében indukálható promoter regulációs szekvenciájához képes kötődni.
55. 55. Az 54. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a mutáció egy deléció, szubsztitúció és/vagy a vad típusú tetraciklin represszort kódoló szekvencia legalább egy aminosavának deléciója.
56. 56. Az 54. vagy az 55. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a mutáns tetraciklinrepresszor a vad Tn10 represszor, amely a 71., 95., 101. vagy 102. helyzetekben levő aminosavak közül legalább egyben mutált.
57. 57. Az 54-56. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a tetraciklinrepresszor részben vagy teljesen a 8. számú szekvencián bemutatott szekvenciával rendelkezik.
58. 58. Az 54-57. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a második polipeptid egy fehérje transzkripciós aktivátor doménjét tartalmazza.
59. 59. Az 58. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a HSV virion 16, VP16 fehérjéjéről van szó.
60. 60. Az 50-59. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az említett transzkripciós aktivátor expressziós kazetta tartalmaz egy tetraciklinnel vagy analógjával indukálható promotert.
61. 61. Az 50-60. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a genomjában Op2TkTetR-VP16 expressziós kazettát beépítve tartalmazó 293 sejtvonalat kotranszfektálunk.
62. 62. Sejtvonal, azzal jellemezve, hogy olyan 293 sejtvonal, amely genomjába beépítve tartalmaz egy, az 53-59. igénypontok bármelyikében definiált transzkripciós aktivátor expressziós kazettát.
63. 63. A 62. igénypont szerinti sejtvonal, azzal jellemezve, hogy genomjába beépítve tartalmazza az Op2Tk-TetR-VP16 expressziós kazettát.
64. 64. A 62. vagy a 63. igénypont szerinti sejtvonal alkalmazása adenovírusok vagy AAV-k előállítására.
65. 65. Eljárás az 1-35. igénypontok bármelyike szerinti adenovírusok előállítására, azzal jellemezve, hogy egy, transz-helyzetben az adenovírus komplementálásához szükséges funkciókat és az 53-59. igénypontok bármelyikében definiált transzkripciós aktivátort hordozó sejtvonalat kotranszfektálunk

    - egy első, az említett, E1 régiójában egy delécióval rendelkező adenovírus genomjának bal szélét tartalmazó DNS-sel és

    - egy második DNS-sel, amely legalább az említett adenovírus genomjának legalább a replikációjához szükséges területet egy tetraciklinnel indukálható promoter irányítása alatt tartalmazó jobb szélét és egy, az első DNS-sel közös részt tartalmaz, tetraciklin vagy egy analógja jelenlétében, és a rekombinációval létrejött adenovírusokat összegyűjtjük.
66. 66. A 65. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az első vagy a második DNS egy kívánt heterológ DNS-szekvenciát is hordoz.
67. 67. Gyógyszerkészítmény, amely legalább egy 1-35. igénypontok bármelyike szerinti rekombináns adenovírust tartalmaz.
68. 68. A 67. igénypont szerinti gyógyszerkészítmény, amely injektálható formulázáshoz egy gyógyászatilag elfogadható hordozót tartalmaz.