DE69619226T2

DE69619226T2 - Monoklonaler antikörper gegen den komplex aus faktor xa und dem inhibitor für den gewebefaktor (xa. tfpi)

Info

Publication number: DE69619226T2
Application number: DE69619226T
Authority: DE
Inventors: Yumiko Itoh; Yuichi Kamikubo; Isao Kohno; Kosuke Kumeta; Gilbu Soe
Original assignee: Chemo Sero Therapeutic Research Institute Kaketsuken; Mitsubishi Kagaku Iatron Inc
Current assignee: LSI Medience Corp
Priority date: 1995-12-26
Filing date: 1996-12-26
Publication date: 2002-08-14
Anticipated expiration: 2016-12-27
Also published as: KR100249314B1; EP0812859A4; KR19980702438A; ES2168521T3; AU706547B2; WO1997023509A1; AU1208997A; JPH09176199A; DE69619226D1; JP3681206B2; EP0812859A1; EP0812859B1

Description

GEBIET DER ERFINDUNG

Die Erfindung betrifft einen monoklonalen Antikörper der gegen den Faktor Xa-Gewebefaktor-Inhibitorkomplex (anti-factor Xa-tissue factor pathway inhibitor complex) gerichtet ist, ein diesen monoklonalen Antikörper sezernierendes Hybridom und ein Verfahren zur immunologischen Bestimmung des anti-Faktor Xa- Gewebefaktor-Inhibitorkomplex (anti-factor Xa-tissue factor pathway inhibitor complex).

STAND DER TECHNIK

Im klinischen Bereich ist es wichtig, Faktor Xa (nachfolgend auch als Xa bezeichnet), der Prothrombin zu Thrombin umwandelt, zu bestimmen, um damit erschwerte Koagulationsbedingungen wie das disseminierende intramuskuläre Koagulations-(DIC)-Syndrom und Thrombose zu untersuchen. Dennoch ist es sehr schwierig, produzierten Xa zu messen. Dies ist der Fall, da er unmittelbar nach seiner Erzeugung, an einen Gewebefaktor- Inhibitor (auch als TFPI bezeichnet) bindet, um einen Faktor Xa-Gewebefaktorweginhibitorkomplex (auch als Xa- TFPI bezeichnet) zu bilden.
Die einfachste Methode zur Bestimmung der Menge von produziertem Xa im Blut ist deshalb die Quantifizierung von Xa-TFPI, was indirekt die Menge von produziertem Xa wiedergibt.
Bis zum heutigen Tag wird zur Bestimmung von Xa-TFPI ein Sandwich-EIA (Enzymimmuntest), der zwei verschiedene Antikörper kombiniert, verwendet. Einer ist ein gegen Faktor X (auch als X bezeichnet) und Xa gerichteter polyklonaler oder monoklonaler Antikörper, der andere, ist ein gegen TFPI gerichteter polyklonaler oder monoklonaler Antikörper.
Dennoch ist es schwierig mit dem bekannten Verfahren Xa-TFPI genau zu bestimmen, da die Messungen durch jeglichen freien X oder freien TFPI, der sich in der Probe befindet, behindert werden kann.

OFFENBARUNG DER ERFINDUNG

Es wurden intensive Experimente durchgeführt, um den Mangel des bekannten Sandwich-EIA, der zur Quantifizierung der im Blut enthaltenen Xa-TFPI verwendet wurde und dessen Bestimmungen im EIA durch jeglichen freien X oder freien TFPI, der in der Probe enthalten ist, behindert wird, zu beseitigen. Als ein Ergebnis wurde gefunden, dass man einen monoklonalen Antikörper, der spezifisch für Xa-TFPI ist, durch Binden von Xa und TFPI unter Komplexbildung, durch das Erzeugen eines Hybridoms, das den monoklonalen Antikörper sezerniert, der den neu auftretenden Antigendeterminanten erkennt, und durch Trennen und Reinigen der Hybridomkultur erhalten kann. So liefert die Erfindung auch ein Verfahren, Xa-TFPI mit einer Einfachheit, einer Genauigkeit und Reproduzierbarkeit durch die Verwendung des neu gefundenen monoklonalen Antikörpers zu bestimmen.
Die Erfindung betrifft somit einen monoklonalen Antikörper, der spezifisch mit Xa-TFPI, aber nicht mit freiem Faktor X, mit freiem Faktor Xa und mit freiem TFPI reagiert.
Ferner bezieht sich die Erfindung auf ein Hybridom oder auf die davon abgeleitete Zelllinie, das (die) den monoklonalen Antikörper, der spezifisch mit Xa-TFPI, aber nicht mit freiem Faktor X, mit freiem Faktor Xa und mit freiem TFPI reagiert, sezerniert und das durch Zellfusion einer Milzzelle eines Säugers, der mit Xa-TFPI immunisiert wurde, und einer Myelomazelle eines Säugers hergestellt wurde.
Des weiteren bezieht sich die Erfindung auf ein Verfahren zur immunologischen Bestimmung von Xa-TFPI unter Verwendung des monoklonalen Antikörpers.

KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN

Fig. 1 ist eine grafische Darstellung, die die Bindungskräfte des gegen Xa-TFPI gerichteten monoklonalen Antikörpers (XT-1) an Xa, TFPI und Xa-TFPI zeigt, welche durch einen enzymatischen Immuntest ermittelt wurden, umfassend die Bestimmung der Reaktionsfähigkeiten von XT- 1 in Ascitesflüssigkeit mit den direkt auf Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen immobilisierten Antigenen.
Fig. 2 ist eine grafische Darstellung, einer Kalibrierungskurve, die sich aus den Reaktionsgeschwindigkeiten der Latexagglutinationen, bestimmt in LPIA-100, und den Konzentrationen von Xa-TFPI zusammensetzt.
Fig. 3 ist eine grafische Darstellung, die die Ergebnisse des Sandwich-Enzymimmuntests bei Xa-TFPI etc. zeigt, wobei der gegen TFPI gerichtete monoklonale Antikörper als erster Antikörper verwendet und der gegen Xa-TFPI gerichtete monoklonale Antikörper (XT-1) als enzymmarkierter zweiter Antikörper verwendet wurde.

BEVORZUGTE AUSFÜHRUNGSFORM DER ERFINDUNG

Nachfolgend wird die Erfindung detailliert erläutert.
Ein gegen Xa-TFPI gerichteter monoklonaler Antikörper kann durch Kultivieren jedes der neuen Maushybridome in Kulturmedium oder in Ascitesflüssigkeit der Mäuse erzeugt werden.
Das in der Erfindung verwendete Maushybridom kann im allgemeinen durch Zellfusion einer Milzzelle eines mit Xa-TFPI-immunisierten Säugers mit einer Mausmyolomzelle, entsprechend der grundlegenden Zellfusionmethode von Köhler und Milistein [Nature, Bd. 256, S. 495 (1975)], hergestellt werden. Einzelheiten dieser Methode werden anschließend beispielhaft erläutert.
Das. Medium, in dem die Hybridome kultiviert werden, kann ein solches sein, das für eine Kultivierung von Hybridomen geeignet ist, vorzugsweise kann "Dulbecco's Modified Eagle's minimum essential medium" (bezeichnet als DME) mit fötalem Rinderserum, L-Glutamin, L- Benztraubensäure und Antibiotika (Penicillin G und Streptomycin) verwendet werden.
Der gegen Xa-TFPI gerichtete monoklonale Antikörper kann aus der Kultur oder der Ascitesflüssigkeit der Maus entsprechend den Verfähren isoliert, gereinigt und präpariert werden, die im allgemeinen zur Isolierung und Reinigung von Proteinen verwendet werden.
Solche Methoden können das Aussalzen, Säulenchromatographie mit einer Ionenaustauschcellulose, Säulenchromatographie mit einem Molekularsieb-Gel, Affinitätschromatographie mit Protein A bindenden Polysacchariden, Dialyse, Lyophilisation oder ähnliche Methoden sein.
Der so erzeugte gegen Xa-TFPI gerichtete monoklonale Antikörper kann die Fähigkeit aufweisen, nur Xa-TFPI aber kein freies X, freies Xa und freies TFPI zu binden und kann als Reagenz zur immunologischen Quantifizierung von Xa-TFPI nützlich sein. Der erfindungsgemäße gegen Xa-TFPI gerichtete monoklonale Antikörper (beispielsweise XT-1, erhältlich durch nachfolgend beschriebene Beispiele) kann als Reagenz in einem Enzymimmuntest (EIA), in einem Fluoreszenziminuntest (FIA), in einem Lumineszenzimmuntest (LIA) oder in Radioaktivimmuntests (RIA) oder ähnlichen verwendet werden. Ein Beispiel für EIA könnte der Einschritt Sandwich-Enzymimmuntest unter Verwendung von Mikroplatten oder Plastikröhrchen sein.
Obwohl die Durchführung des EIA wie im unten beschriebenen Beispiel 6 erfolgen kann, kann sie im allgemeinen wie folgt ausgeführt werden:
Es kann ein gegen Xa-TFPI gerichteter monoklonaler Antikörper verwendet werden. Zuerst wird der erfindungsgemäße gegen Xa-TFPI gerichtete monoklonale Antikörper (XT-1) als erster Antikörper in den Vertiefungen der Mikroplatten oder in Plastikröhrchen immobilisiert. Danach wird eine Probe, enthaltend die Xa- TFPI, und eine Lösung des gegen Xa-TFPI gerichteten Antikörpers, der mit einem Enzym markiert ist, als zweiter Antikörper in die Vertiefungen oder Plastikröhrchen gegeben. Die Vertiefungen oder Plastikröhrchen werden 30 Minuten lang belassen, gewaschen, dann eine Lösung des enzymatischen Substrats hinzugegeben, die enzymatische Reaktion 30 Minuten lang durchgeführt und die Mengen an Xa-TFPI in der Probe durch kolorimetrische Analyse quantitativ bestimmt.
Alternativ kann man Xa-TFPI in Blut unter Verwendung eines gegen Xa-TFPI gerichteten monoklonalen Antikörpers als erstem Antikörper (beispielsweise dem gegen TFPI gerichteten monoklonalen Antikörper, der durch das Hybridom HTFPI-K9, im "Chemo-Sero-Therapeutic Research Institute (Hinterlegungsnummer: FERM-P-14467), erzeugt wurde), quantifizieren, während der erfindungsgemäße gegen Xa-TFPI gerichtete monoklonale Antikörper (XT-1), der mit einem Enzym, etc. markiert ist, entsprechend der oben beschriebenen Vorgehensweise als zweiter Antikörper verwendet wird.
Weiterhin kann der erfindungsgemäße monoklonale Antikörper in einem Latexagglutinations-Immuntest, wie unten beschrieben, verwendet werden, worin Xa-TFPI in einer Probe durch das Inkontaktbringen des Analyten mit dem Latex, an den der monoklonale Antikörper der Erfindung immobilisiert wurde, und durch Bestimmen des sich ergebenden Aggregats bestimmt wird.

EXPERIMENTE

Die Erfindung wird anschließend in den Beispielen detaillierter erläutert.

Beispiel 1: Präparation von Xa-TFPI

Der Xa-TFPI wurde gemäß folgender Verfahrensweise erzeugt. 5 mg gereinigter Xa (10 mi Lösung mit 0,5 mg/ml Xa) und 15 mg TFPI (3 ml Lösung mit 5 mg/ml TFPI) wurden gemischt, reagierten eine Stunde bei 37ºC miteinander, wobei die Reaktion danach durch Zugabe von 13 ml einer Lösung, die 1 M Diisopropylfluorphosphorsäure enthält, in die Reaktionslösung beendet wurde. Das Gemisch wurde auf eine Heparin-Sepharosesäule (Säulenvolumen: 100 ml), die zuvor mit 20 mM Tris-HCl- Puffer mit 0,1 M NaCl (pH 7,4) äquilibriert worden war, gegeben.
Nach Waschen der Säule mit 400 ml des Puffers wurde mit einem linearen Gradienten zwischen 20 mM Tris-HCl- Puffer mit 0,1 M NaCl (pH 7,4) und 20 mM Tris-HCl-Puffer mit 0,5 M NaCl (pH 7,4) eluiert. Das Eluat wurde jeweils in Fraktionen zu 5 ml gesammelt. Ob eine Fraktion den Komplex enthielt oder nicht wurde mittels Polyacrylamidgelelektrophorese bestimmt. Die Fraktionen 61 bis 120, die Xa-TFPI enthielten, wurden gesammelt und gegen 20 mM Tris-HCl-Puffer mit 50 mM NaCl dialysiert.
Danach wurde das Dialysat auf eine DEAE- Sephacelsäule (Säulenvolumen: 50 ml, Parmacia), die zuvor mit 20 mM Tris-HCl-Puffer mit 50 mM NaCl äquilibriert worden wax, gegeben. Nach dem Waschen der Säule mit etwa 200 ml Puffer wurde mit einem linearen Gradienten von 20 Tris-HCl-Puffer mit 0,05 M NaCl eluiert. Das Eluat wurde jeweils in Fraktionen zu 2 ml gesammelt. Die Fraktionen mit Xa-TFPI wurden in derselben Art und Weise gesammelt und durch Ultrafiltration konzentriert, um 5 ml Xa-TFPI (A280 nm = 1,0) zu erhalten. Die erhaltene Xa- TFPI-Lösung wurde als Immunogen und als Antigen in einem ELISA verwendet, der wiederum zur Selektion des gegen Xa- TFPI gerichtete Antikörper produzierenden Hybridoms diente.

Beispiel 2

(a) Präparation von immunisierten Milzzellen:

Die Xa-TFPI-Immunogen-Lösung (A280 = 0,1) wurde mit einem äquivalenten Volumen von Freund's vollständigem Adjuvan't zu einer Emulsion vermischt und eine Immunisierung durch eine intraperitoneale Verabreichung von 200 ul des Gemischs in Mäuse durchgeführt (Erstimmunisierung): Nach dreißig Tagen wurde die Lösung der Maus in derselben Weise intraperitoneal verabreicht (zweite Immunisierung). Einundzwanzig Tage nach der zweiten Immunisierung wurde die Xa-TFPI-Immunogenlösung (A280 = 0.1) mit der äquivalenten Menge Salzlösung verdünnt und 200 ml der verdünnten Lösung der Maus intravenös verabreicht (endgültige Immunisierung). Drei Tage nach der letzten Immunisierung wurden die Milzzellen aus der Maus herausgeschnitten und danach zur Zellfusion verwendet.

(b) Zellfusion:

Die Milz wurde unter aseptischen Bedingungen herausgeschnitten und in eine Petrischale, in der sich 5 ml DME-Medium mit 10 bis 15% fötalem Rinderserum befanden, gebracht. Die Milz wurde danach mit etwa 15 ml DME-Medium mit 10 bis 15% fötalem Rinderserum durchtränkt, um sie zu Zellen aufzulösen, danach wurde die Suspension der Milzzellen durch ein Nylonnetz passiert. Die Milzzellen wurden in einem 50 ml Zentrifugenröhrchen gesammelt und bei 500 xg 10 Minuten zentrifugiert. Zu dem sich ergebenden Pellet wurden zur Bildung einer Suspension 3 bis 5 ml hämolysierende Lösung (155 mM NH&sub4;Cl, 10 mM KHCO&sub3;, 1 mM Na&sub2;EDTA, pH 7,0) hinzugegeben. Ein Stehenlassen bei 0ºC über einen Zeitraum von 5 bis 10 Minuten führte zum Aufbrechen der Erythrocyten in der Suspension. Zu der Suspension wurden 10 bis 20 ml DME-Medium mit 10 bis 15% fötalem Rinderserum hinzugegeben und diese anschließend zentrifugiert. Das erhaltene Pellet wurde mit DME-Medium durch Zentrifugation gewaschen und die Anzahl der lebenden Milzzellen bestimmt.
1 · 10&sup8; Milzzellen wurden zu etwa 2 · 10&sup7; Myelomzellen SP2/0-Ag14, die vorkultiviert waren, hinzugegeben, diese wurden gut in DME-Medium gemischt und das Gemisch zentrifugiert (500 xg, 10 Minuten). Der Überstand wurde abgesaugt, das Pellet wurde erneut gut gelöst, 0,5 ml 40%ige Polyethylenglycol 4000-Lösung bei 38ºC wurde tropfenweise hinzugegeben und die Polyethylenglykollösung und das Zellpellet wurden durch vorsichtiges, einminütiges Drehen des Zentrifugenröhrchens mit der Hand vermischt. Danach wurde 1 ml DME-Medium, das bei 38ºC gehalten wurde, alle 30 Sekunden in das Röhrchen gegeben, das danach vorsichtig gedreht wurde.
Die zuvor beschriebene Vorgehensweise wurde zehnmal wiederholt, dann 20 bis 30 ml DME-Medium mit 10 bis 15% fötalem Rinderserum in das Röhrchen gegeben und zentrifugiert (500 xg, 10 Minuten). Nach dem Entfernen des Überstands wurde das Zellpellet zweimal mit HAT- Medium (4 · 10&supmin;&sup7; M Aminopterin, 1,6 · 10&supmin;&sup5; M Thymidin und 1 · 10&supmin;&sup4; M Hypoxanthin in DME-Medium) mit 10 bis 15% fötalem Rinderserum durch Zentrifugieren gewaschen und das Pellet dann in 40 ml HAT-Medium suspendiert. 200 ul der Zellsuspension wurden jeweils pro Vertiefung einer Kulturplatte mit 96 Vertiefungen aufgeteilt und in einem Kohlendioxidfermenter mit 5% Kohlendioxid kultiviert.
Während des Kultivierens wurden jeweils 100 ul des Mediums einer jeden Vertiefung alle zwei oder drei Tage entfernt und 100 ul frisches HAT-Medium hinzugegeben. Dadurch konnten die Hybridome, die in HAT-Medium wachsen, selektiert werden. Nach dem Kultivieren von fast 8 Tagen wurde das Kulturmedium durch HAT-Medium (1,6 · 10&supmin;&sup5; M Thymidin und 1 · 10&supmin;&sup4; M Hypoxantin in DME) mit 10 bis 15% fötalem Rinderserum ersetzt, das Wachstum der Hybridome beobachtet und die Hybridome, die gegen Xa-TFPI gerichteten Antikörper produzieren, wurden, wie nachstehend ausgeführt, durch ELISA ermittelt.

(c) Nachweis der Hybridome

Das Vorhanden- oder Nichtvorhandensein von produzierten Antikörpern im Überstand von Hybridom- Kulturen wurde durch ELISA festgestellt. 50 ul der oben erwähnten gereinigten Xa-TFPI-Lösung (A280 = 0,05, verdünnt mit Salzlösung) wurden in jede Vertiefung einer ELISA-Platte mit 96 Vertiefungen (Immulon, Nippon Dynatec Co., Ltd.) aufgeteilt und zwei Stunden lang bei 25ºC belassen. Dann wurden die Löcher dreimal mit 0,05% Tween-20 in Salzlösung gewaschen, der Überstand der Kulturen zu jeder Vertiefung hinzugegeben und zur Reaktion eine Stunde bei 25ºC belassen.
50 ul des an Peroxidase gebundenen anti-Maus Antikörpers (Daco, Co., Ltd., Dänemark) wurden zweihundertfach mit 0,05% Tween-20 in Salzlösung verdünnt und in jede der Vertiefungen hinzugegeben. Nach Beendigung der Reaktion wurden die Vertiefungen dreimal mit 0,05% Tween-20 in Salzlösung gewaschen, 200 ul der Lösung mit 0,05 mM Aminoantipyrin, 10 mM Phenol und 0,005% Wassestoffperoxid wurden in jede der Vertiefungen gegeben, dann zur Reaktion 30 Minuten bei 25ºC belassen und die optische Dichte innerhalb jeder Vertiefung bei 490 nm bestimmt. Die Ergebnisse offenbarten, dass in 23 von 192 Vertiefungen Antikörperproduktion festgestellt werden konnte.
Um festzustellen, ob der gegen. Xa-TFPI gerichtete Antikörper, der im Überstand der Kulturen durch ELISA ermittelt worden war, mit TFPI und Xa reagiert, wurde in einer ELISA-Platte mit 96 Vertiefungen, TFPI und Xa in derselben Weise, wie zuvor beschrieben, gebunden. Die Ergebnisse zeigten, dass von den 23 Vertiefungen, in denen der Überstand der Kulturen mit Xa-TFPI reagierte, der Überstand von Kulturen in 18 Vertiefungen, ebenfalls mit TFPI, aber nicht mit allen Xa reagierte.
Das Hybridom in einer Vertiefung, das nicht mit TFPI und Xa reagierte, aber spezifisch nur mit Xa-TFPI reagierte, wurde in eine Platte mit 24 Vertiefungen transferiert und in HT-Medium mit 10 bis 15% fötalem Rinderserum 4 bis 5 Tage lang kultiviert.
Anschließend wurde die. Erzeugung oder fehlende Erzeugung der gegen Xa-TFPI gerichteten spezifischen Antikörper (nachstehend verkürzt als gegen Xa-TFPI gerichtete Antikörper bezeichnet) durch ELISA bestätigt und dann die Hybridome durch limitierende Verdünnungsanalyse kloniert. Zur limitierenden Verdünnungsanalyse wurden 100 ul der Zellsuspension, in der die Hybridome auf fünf Zellen/ml in HT-Medium verdünnt wurden, in jede Vertiefung einer Platte mit 96 Vertiefungen verteilt, in der zuvor 2 · 10&sup4; Zellen pro Loch peritoneale Zellen einer normalen BALB/C-Maus gegeben worden waren. Nach etwa 10 Tagen wurden Klone von Hybridomen, welche den gegen Xa-TEPI gerichteten Antikörper produzierten, mittels ELISA selektioniert. Die Ergebnisse zeigten, dass sich aus jeder der Hybridome 20 bis 40 Klone, die den Antikörper produzierten, ergaben.
Unter den Klonen wurden Klone, die proliferativ waren, eine hohe Antikörpersekretionsfähigkeit hatten und stabil waren, ausgewählt und auf dieselbe Art und Weise, wie zuvor beschrieben, zur Etablierung der Hybridome XT- 1, welche spezifische, gegen Xa-TFPI gerichtete Antikörper produzieren, kloniert.
Die Hybridome XT-1 wurden beim "National Institute of Bioscience and Human-Technology (NIBH), Agency of Industrial Science and Technology" unter der Hinterlegungsnummer FERM P-15357 am 20. Dezember 1995 hinterlegt und am 20. Dezember 1996 an die Internationale Hinterlegungsstelle unter der Hinterlegungsnummer FERM BP-5776 gemäß dem Budapester Vertrag überführt.

Beispiel 3: Erzeugung monoklonaler Antikörper

In Vitro Methode

Das Maushybridom XT-1 wurde in DME-Medium mit 15% fötalem Kälberserum bei 37ºCin einer Atmosphäre von 5% Kohlendioxid 72 bis 96 Stunden lang kultiviert. Die Kultur wurde zentrifugiert (10.000 xg, 10 Minuten) und danach dem Überstand stufenweise Ammoniumsulfat bis zu einer Endkonzentration von 50% zugeführt. Das Gemisch wurde 30 Minuten lang in einem Eisbad gerührt, 60 Minuten stehen gelassen, zentrifugiert (10.000 xg, 10 Minuten); der erhaltene Rest in einem kleinen Volumen von 10 mM Phosphatpuffer (pH 8,0) aufgelöst und die Lösung gegen ein tausendfaches Volumen von 10 mM Phosphatpuffern dialysiert.
Die dialysierte Lösung wurde auf eine Säule gegeben, die mit DEAE-Cellulose bepackt, und mit 10 mM Phosphatpuffern äquilibriert worden war. Der monoklonale Antikörper wurde bei einem Gradienten zwischen 10 mM Phosphatpuffer (pH 8,0) und 10 mM Phosphatpuffer (pH 8,0) mit 0,2M NaCl eluiert. Der eluierte monoklonale Antikörper würde mittels Ultrafiltration konzentriert und das Kondensat gegen 0,1 M Phosphat-Puffer (pH 8,0) dialysiert. Um Rinderserum lFgG zu entfernen wurde das Dialysat auf eine mit Ziege-anti-Rinderserum-IgG- Sepharose 4B bepackte Säule gegeben. Die durchgelaufene Flüssigkeit wurde über eine mit Protein A-Sepharose 4B gefüllte Säule, äquilibriert mit 0,1M Phosphatpuffer (pH 8,0), gegeben. Um eine Lösung von aufgereinigtem, gegen Xa-TFPI gerichteten Antikörper XT-1 zu erhalten, wurde die Säule mit dem Puffer bei pH 3,5 eluiert.

In Vivo Methode

0,5 ml Pristan (2,6,10,14-Tetramethylpentadekan) wurde intraperitoneal an 10 bis 12 Wochen alte BALB/C- Mäuse verabreicht und nach 14 bis 20 Tagen wurden die Mäuse intraperitoneal mit 2 · 10&sup6; XT-1 Hybridome, die in vitro gewachsen waren, angeimpft.
Von einer Maus erhielt man etwa 10 bis 15 ml Ascitesflüssigkeit. Die Konzentration der Antikörper betrug 2 bis 10 mg/ml. Die monoklonalen Antikörper in der Ascitesflüssigkeit wurden in derselben Art und Weise wie im "In Vitro" Methodenteil beschrieben, gereinigt mit der Ausnahme, dass die Behandlung mit der Ziege-Anti- Rinderserum-IgG-Sepharose 4B bepackten Säule nicht, erfolgte.

Beispiel 4: Identifizierung der Immunoglobulingruppe und der Spezifität des monoklonalen Antikörpers

Die Immunoglobulinklasse und die Spezifität des Xa- TFPI-monoklonalen Antikörpers XT-1 wurden mittels der Ouchterlony-Immundiffusionsmethode und mittels Enzymimmuntest jeweils identifiziert. Die Ergebnisse zeigten, dass die Immunoglobulinklasse des monoklonalen Antikörpers XT-1 "IgG2A" war. Die Spezifität wurde mittels einer Verdünnungsreihe der Ascitesflüssigkeit einer Maus untersucht und die Ergebnisse in Fig. 1 gezeigt.

Beispiel 5: Latexagglutionationsimmuntest

Der gegen Xa-TFPI gerichtete monoklonale Antikörper wurde wie folgt am Latex (Japan Synthetic Rubber Co., Ltd., 0,497 um) immobilisiert:
Zu 10 ml der Lösung mit 0,1 mg/ml des monoklonalen Antikörpers XT-1 wurde Latex bis zu einer Latexkonzentration von 1% (w/v) hinzugegeben und das Gemisch kräftig bei 25ºC eine Stunde lang gerührt. Es wurden 0,2 ml Rinderalbuminlösung (10 mg/ml) zum Gemisch hinzugegeben, kräftig bei 25ºC für 30 Minuten gerührt und dann 30 Minuten zentrifugiert (20.000 xg, 30 Minuten). Um eine Lösung zu erhalten, in der gegen Xa-TFPI gerichtete monoklonale Antikörper an Latex immobilisiert sind, wurde das Sediment in 50 ml Wasser resuspendiert.
Zum Erhalt einer Latexlösung mit immobilisierten, gegen Xa-TFPI gerichteten monoklonalen Antikörper wurde dieselbe Vorgehensweise wiederholt, mit der Ausnahme, dass der gegen TFPI gerichtete mono klonale Antikörper [der monoklonale Antikörper stammte von dem Hybridom HTFPI-K9 (Hinterlegungsnummer FERM-P-14467)] anstatt des zuvor genannten, gegen Xa-TFPI gerichteten monoklonalen Antikörpers verwendet wurde. Diese wurden im folgenden Latexagglutinationstest eingesetzt.
Die beiden Latexlösungen wurden in gleichen Volumen gemischt, das Gemisch der Latices wurde mit der Probe von Xa-TFPI gemischt und reagieren gelassen und die Geschwindigkeit der Agglutination spektrometrisch in einem LPIA-100 (Mitsubishi Chemical Co., Ltd:) gemessen. Da Xa-TFPI zwei Epitope hat, agglutiniert es; da X und TFPI jedoch jeweils nur ein Epitop besitzen, agglutinieren sie nicht und somit kann Xa-TFPI in der Probe genau gemessen werden. Die Beziehung zwischen Xa- TFPI-Konzentrationen und der Geschwindigkeit der Agglutinationsreaktionen (Kalibrierungskurve) ist in Fig. 2 gezeigt.

Beispiel 6: Einschritt Sandwich-Enzymimmuntest

Peroxidase aus Meerrettich wurde nach einer ähnlichen Methode wie der von Nakane and Kawaoi [Journal of Histochemnistry and Cytochemistry, Bd. 22, S. 1084 bis 1091 (1974)] verwendeten, an gegen Xa-TFPI gerichtete monoklonale Antikörper XT-1 gebunden. Der Sandwich- Enzymimmuntest für Xa-TFPI unter Verwendung von enzymmarkierten Antikörpern war folgender:
100 ul einer Lösung mit 10 ug/ml des gegen TFPI- gerichteten monoklonalen Antikörpers (der monoklonale Antikörper von Beispiel 5) in 20 mm Carbonatpuffer wurde in jede Vertiefung einer Polystyrolmikroplatte des Flachbodentyps mit 96 Vertiefungen dosiert und 30 Minuten bei 25ºC belassen. Die Platte wurde dreimal mit 0,05% Tween-20 in Salzlösung gewaschen. Zu den Vertiefungen in der Platte, an denen der Antikörper immobilisiert worden war, wurden 50 ul der Probe des mit Peroxidase markierten, gegen Xa-TFPI gerichteten monoklonalen Antikörpers, 0,15 M NaCl und 100 ul 20 mM Phosphat-Puffer mit 2% Rinderserumalbumin (pH 8.0) gegeben.
Den Vertiefungen wurden zur Reaktion 30 Minuten bei 25ºC belassen, die Platten wurden dreimal mit 0,05% Tween-20 in Salzlösung gewaschen. Dann wurden 200 ul der Lösung mit dem Enzymsubstrat, das 10 mM Phenol, 20 mM 4- Amminoantipyrin und 0,005% Wasserstoffperoxid enthielt, zu jeder der Vertiefungen hinzugegeben. Die Vertiefungen wurden für 30 Minuten bei 25ºC belassen und die optische Dichte bei 490 nm je Vertiefung mit einem MP-590-Typs Mikro ELISA Minilesegerät (Dynatech Co., Ltd.) bestimmt. Die Menge von Xa-TFPI wurde berechnet mittels einer Kalibrierungskurve, die unter Verwendung der optischen Dichte bei 490 nm aufgezeichnet worden war, die parallel für die Kalibrierungskomplexe bestimmt wurde. Die Kalibrierungskurve wird in Fig. 3 gezeigt.

INDUSTRIELLE ANWENDBARKEIT

Erfindungsgemäß wird der neue gegen Xa-TFPI gerichtete monoklonale Antikörper, der nicht mit freiem TFPI, freiem Xa und freiem X, aber mit Xa-TFPI spezifisch reagiert, bereitgestellt und durch die Verwendung des Antikörpers kann Xa-TFPI, wie zuvor gezeigt wurde, genau quantifiziert werden.
Bezugnahme auf die gemäß der Regeln 13-bis für das Japanische Patentgesetz und die Hinterlegungsbehörde für hinterlegte Mikroorganismen.
Hinterlegungsbehörde: "The National Institute of Bioscience and Human-technology (NIBH)", "Agency of Industrial Science and Technology"
Adresse: 1-3, Higashi 1 chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, Japan
Hinterlegungsnummer und Hinterlegungsdatum: FERM BP- 5776; 20. Dezember 1995

Claims

1. Ein monoklonaler Antikörper, der mit einem Faktor Xa-Gewebefaktor-Inhibitorkomplex (Xa-TFPI) spezifisch reagiert, aber nicht mit freiem Faktor X, freiem Faktor Xa und freiem Gewebefaktor-Inhibitor (TFPI) reagiert.

2. Monoklonaler Antikörper nach Anspruch 1, der von einem Hybridom XT-1, hinterlegt als FERM BP-5776, erzeugt wird.

3. Ein Hybridom oder die davon abgeleitete Zelllinie, hergestellt durch Zellfusion einer Milzzelle eines mit Xa-TFPI-immunisierten Säugers mit einer Myelomzelle, das einen spezifisch mit Xa-TFPI, aber nicht mit freiem Faktor X, freiem Faktor Xa und freiem Faktor TFPI reagierenden monoklonalen Antikörper, sezerniert.

4. Das Hybridom oder die davon ab geleitete Zelllinie nach Anspruch 3, worin das Hybridom das Hybridom XT-1 ist, das als FERM BP-5776 hinterlegt wurde.

5. Ein Verfahren zur immunologischen Bestimmung von Xa- TFPI, das den Einsatz des monoklonalen Antikörpers nach Anspruch 1 oder Anspruch 2 umfasst.