JP2015028036A - Ｌｏｘタンパク質とｎｒａｇｅタンパク質との通常の共発現と相互作用を復元させる物質 - Google Patents

Abstract

【課題】皮膚加齢、扁平苔癬、移植片対宿主反応（ＧＶＨ）、湿疹、乾癬、及び癌、特に上皮癌、更に特に基底細胞型または有棘細胞型の皮膚上皮癌の治療及び／又は予防が可能となる新規治療法の提供。【解決手段】ＬＯＸタンパク質とＮＲＡＧＥタンパク質の通常の共発現とこれらの間の相互作用を復元する物質であって、増殖と分化とアポトーシスの細胞現象の間のバランスを制御するために、ＬＯＸタンパク質とＮＲＡＧＥタンパク質間の相互作用を変化させる組成物の製造のための、特定配列のＬＯＸの発現及び／又は活性を変化させる及び／又は特定配列のＮＲＡＧＥの発現及び／又は活性を変化させる少なくとも一種の物質の有効量の使用方法。前記物質がダイズエキス、マオウエキス、シナモンエキス、アルギン酸、人参エキス、キシリトール、イチゴノキエキス、シルクエキス等から選ばれたものである。【選択図】図１

Description

本発明は、ＬＯＸタンパク質とＮＲＡＧＥタンパク質との通常の共発現と相互作用を復元させる物質の利用に関する。

１）背景
多細胞生物では、細胞増殖と、特定の機能に向けた細胞分化とプログラム及び非プログラム細胞死とのバランスで、恒常性が維持されている。

例えば、皮膚は、外的な攻撃からその生物を保護する特異な機能を有する器官であると考えられる。死細胞からなる高度に角質化した角膜層により、物質が外部へ透過しないように保証されている。したがって、表皮細胞、またはケラチン合成細胞の一生のリズムは、次のように、角質化死細胞への分化に至る連続的な変化により支配されている：（１）初期細胞の維持（表皮の基底細胞層の「幹」細胞）、（２）不斉分裂（各幹細胞が二個の姉妹細胞を与える）、（３）分化（「初期幹」細胞の一つより表皮の基底上細胞層の形成）、（４）アポトーシス性細胞死に対する抵抗性の獲得、（５）角化細胞への変化、及び（６）表皮上方細胞層のプログラム細胞死。このバランスのいずれかが崩れると、病気が発生することとなる。

細胞の増殖と分化とアポトーシスの現象のいくつかの側面を説明するいくつかの生物学的メカニズムや分子が、当業界の熟練者には知られている。しかしながら、これらの３つの現象を相互に関連付けるメカニズムであって、疾病の制御や防止の目的での標的となるうるものに関する情報については、データがまったくない。

２） ＬＯＸ （タンパク質）
ＬＯＸは、リジルオキシダーゼ（ＬＯ）群に属する銅依存性のアミンオキシダーゼである。現在までに、五種のＬＯ遺伝子、ＬＯＸ、ＬＯＸＬ ＬＯＸＬ２、ＬＯＸＬ３とＬＯＸＬ４が同定されている。ＬＯＸは、その細胞内及び細胞外におけるコラーゲン架橋の役割で知られるが、ＬＯＸＬは、明らかに弾性繊維の恒常性に関与している。なお、他のアイソフォームの細胞内での役割は不明である。

ＬＯ類は、様々な細胞、例えば繊維芽細胞や平滑筋細胞、内皮細胞、ケラチン合成細胞で合成されている。この酵素は、したがって、皮膚や肝臓、腎臓、脾臓、大動脈など多くの組織に、細胞外及び細胞内レベルの両方で存在している。

２．１）細胞外マトリックスの安定化−細胞外の役割
ＬＯＸの細胞外での役割はよく知られており、結合組織の細胞外マトリックス（ＥＣＭ）の安定化を含んでいる。ＬＯＸの実際の機能は、繊維性コラーゲンとエラスチンの架橋である。このために、このタンパク質は、繊維性プロコラーゲン分子とトロポエラスチンのリジル基とヒドロキシリジル基の酸化的脱アミノ化を触媒する。なお、この反応はアンモニアと過酸化水素の放出を伴っている。生成するアルデヒド基は、次いで近くのアルデヒド基またはアミン基と自発的に縮合し、分子内及び分子間結合を形成する。これらの縮合反応により、コラーゲンやエラスチン繊維に見られる架橋が形成される。このため、ＬＯＸとＬＯは、ＥＣＭの変化を伴う生物医学的な分野（加齢、繊維症、癌、損傷部修復、骨関節性疾患や心臓血管性疾患、血管形成）で研究されている。

有機ニトリル類がＬＯＸの不可逆阻害剤となることが、細胞外で証明されている。したがって、β−アミノプロピオニトリル（β−ＡＰＮ）は、アルキルアミン基質と競争的にＬＯＸの活性サイトに結合してシッフ塩基を形成する（ＬＯはｐ−ＡＰＮを基質として利用している）が、アルデヒド生成物を放出することなく、共有的に活性サイトをブロックして合成作用を持たない。この現象をもとに、本発明者らは、細胞培養の際に系統的に起こる特定の細胞型（軟骨細胞等）の脱分化を避けるための、β−ＡＰＮを含むいろいろなリジルオキシダーゼ阻害剤の使用について記載している。（Ｆａｒｊａｎｅｌ ｅｔ ａｌ．， フランス特許０１．１０４４３， ＣＮＲＳ， 細胞培養と組織培養のためのリジルオキシダーゼ阻害剤の利用、出願：２００１年８月３日、公開番号： ２８２８２０６）。しかしながら、上記文書はリジルオキシダーゼ一般に関するもので、ＬＯＸアイソフォームに特異的なものではない。また、これは、インビトロで培養された細胞の脱分化の阻害のみに関するものであり、増殖と分化とアポトーシスのバランスの維持におけるリジルオキシダーゼの役割やＬＯＸの役割についての記はがなく、またリジルオキシダーゼまたはＬＯＸの新たなパートナーまたは基質についての記述もない。

２．２）細胞内での役割
ＬＯＸの、またＬＯ類一般の細胞内での役割は、よくわかっているとはいいがたい。ＬＯＸは、細胞の発生、分化、運動性または老化の制御に関係していると考えられている（Ｃｓｉｓｚａｒ、リジルオキシダーゼ：新らしい多単官能性アミンオキシダーゼ群． Nucleic Acid Research and Molecular Biology. 2001, 70, 2-28）が、その背後にある分子的なメカニズムはいまだに不明である。

２．２．１）ＬＯＸと細胞の恒常性
ＬＯＸが細胞の恒常性の調整（増殖と分化とアポトーシスの間の生理学的なバランスの維持）に関与している可能性があることは、広く認められている（Ｊｅａｙ ｅｔ ａｌ．． リジルオキシダーゼはＮＦ−ＫＢの活性化を抑制してＲａｓ仲介の形質転換を阻害する。Mol. Cell. Biol., 2003, 23, 2251-2263）が、その背後のメカニズムは、当業界の熟練者には依然として不明である。

現在、当業界の熟練者は、ＬＯＸと分化との間の関係、またＬＯＸと細胞の増殖／形質転換の間の関係の可能性を示唆するいくつかのデータを有している。しかしながら、先行技術には、ＬＯＸとアポトーシスとの間の関係の可能性についての記載はない。

２．２．２）ＬＯＸと表皮の分化
ＬＯＸは、表皮中に存在し、その発現はケラチン合成細胞の分化のレベルの関数として制御されているとされる（Ｎｏｂｌｅｓｓｅ ｅｔ ａｌ．， リジルオキシダーゼ様酵素とリジルオキシダーゼが合成皮膚の真皮と表皮に存在し、弾性繊維と関係している、J. Invest. Dermatol., 2004. 122. 621-630）。しかしながら、現在までの研究では、ケラチン合成細胞はコラーゲンまたはエラスチンを全く作らないか、作っても極く少量であるため、ケラチン合成細胞中でのＬＯＸの役割を規定したり、そのパートナーをスクリーニングすることはできなかった。

２．２．３）ＬＯＸと細胞の形質転換
ＬＯＸ遺伝子は、明らかに細胞の非腫瘍性表現型の維持に関与している。

ＬＯＸの保有するこの役割を説明するのに、二つの仮説が提出された。第一の仮説は、ＥＣＭの架橋が非腫瘍状態の維持に適した三次元環境をもたらすというものである。この仮説は、癌が侵襲性になるとＬＯＸとＬＯＸＬの発現が停止するがこれらは上皮内癌中には存在するという事実により支持される（Ｐｅｙｒｏｌ ｅｔ ａｌ．， 非侵襲性および侵襲性の腺管乳癌に対する間質反応におけるリジルオキシダーゼ遺伝子の発現、Am. J. Pathol. Feb., 150(2), 497-507, 1997）。もう一つの仮説は、細胞内でのＬＯの基質に対する役割に関するものであるが、現在まだ当業界の熟練者にも不明である（Ｌｉ ｅｔ ａｌ．， 線維形成誘導性細胞の核内のリジルオキシダーゼの場所と活性の決定、Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 1997. Nov. 25, 94(24), 12817-22）。

事実、ＬＯＸ酵素がｒａｓオンコジーンのサプレッサーであること、また遺伝子中の体細胞突然変異は各種の癌に関連していることが示された（Ｃｏｎｔｅｎｔｅ ｅｔ ａｌ．， ｒｒｇ遺伝子の発現は、ＬＴＲ−ｃ−Ｈ−ｒａｓで形質転換したＮＩＨ ３Ｔ３の復帰に関係している。Science, 1990, 249, 796-798； Ｃｓｉｓｚａｒ ｅｔ ａｌ．， 結腸直腸の腫瘍における染色体５ｑ２３．１上のリジルオキシダーゼ遺伝子の体細胞突然変異。Int. J. Cancer, 2002. 97, 636-642）。最近の研究では、ｒａｓで形質転換された繊維芽細胞中での低レベルのＬＯＸの発現がＦＧＦ−２オートクリン増殖因子の活性に由来するものであり、抗腫瘍薬スラミンはこの酵素の発現を再誘導できることがわかっている（Ｐａｌａｍａｋｕｍｂｕｒａ ｅｔ ａｌ．， 形質転換された繊維芽細胞内におけるリジルオキシダーゼ発現のオートクライン増殖因子調節、J. Biol. Chem., 2003, Aug. 15, 278(33), 30781-7; Epub 2003 Jun. 4）。別途、これらの繊維芽細胞におけるＬＯＸの再発現が、ＡＫＴタンパク質の位置の調節によりＮＦ−ｋＢシグナル経路上に作用して、この細胞の軟質寒天内での成長を阻害することが明らかとなった（Ｊｅａｙ ｅｔ ａｌ．， リジルオキシダーゼが、ＮＦ−Ｂの活性化を防ぎＲａｓ仲介の形質転換を阻害する、Mol. Cell Biol., 23, 2251-2263, 2003）。

他の腫瘍サプレッサの場合と同様に、ＬＯＸは、細胞内の基質とパートナーの量とその制御に応じて作用しているようではあるが、後者は当業界の熟練者にとって依然として不明である。

２．２．４）アポトーシス
「アポトーシス」という用語は、形態学的特徴が壊死とは異なる特定の形式の細胞死をいう。

アポトーシスは、カスパーゼの獲得が必要な計画的な細胞死のプロセスである。このプロセスにおいて、細胞は特に目覚しい形態学的特徴を示し、例えばクロマチンが縮合して核の分裂が起こり、その結果自己破壊が起こって、近くの細胞に損傷を与えることなくその組織から消滅する。

アポトーシスは、発達中またはホメオスタシスの間に起こる自然な細胞死に相当する。

先行技術には、アポトーシスや分化などの細胞プロセスを用いて細胞サイクルを制御する場合に使用される薬品やメカニズムが数多く示されている。

３）ＮＲＡＧＥ （タンパク質）
細胞サイクルや分化、アポトーシスの制御に関与する一群のタンパク質が、特によく知られている。これは、ＭＡＧＥ（黒色腫関連抗原）タンパク質であり、その中の一群であるＮＲＡＧＥタンパク質（「ニューロトロフィン・レセプター共役ＭＡＧＥ同属体」とも呼ばれる）は、特にその神経栄養性因子ＮＧＦを経由する好アポトーシス的な役割で有名である。

このＮＲＡＧＥタンパク質は、７７８個のアミノ酸からなる。このタンパク質は、中央領域にＭＡＧＥタンパク質に特有の第一ドメイン、即ちＭＡＧＥ相同性ドメイン（ＭＨＤ−１）を有し、Ｎ末端領域に特定のアイソフォームの形で存在する第二ドメイン、即ちＭＨＤ−２を有している。これらの二つのドメインは、リジル基を多く含むゾーンを有している。これらの二つのドメインの間に、ＩＲＤ （散在反復ドメイン）と呼ばれる領域があるが、この領域は、現在既知の他のタンパク質のいずれにも存在しない。

このＮＲＡＧＥタンパク質は、いろいろな経路によりアポトーシスの制御に関与している。

・ ＮＲＡＧＥは、ｐ７５ＮＴＲ、即ち好中球性因子（ＮＧＦ）またはＴＮＦに対する「低親和性」レセプターと相互作用して、細胞サイクルの進行を抑え、カスパーゼ経路を経て好アポトーシス性となる。
・ ＮＲＡＧＥは、アポトーシスタンパク質ＩＡＰの細胞質内阻害剤と相互作用して、好アポトーシス性となる。
・ ＮＲＡＧＥは、組織の形態発生的な調節に加わる核のホメオ因子、例えばＭｓｘ因子やＤｌｘ因子の活性に直接作用することもある。

ＮＲＡＧＥの発現は至るところで起こるが、先行技術には、皮膚中の存在場所についての、またＬＯＸとアポトーシスの間の関係やＬＯＸとＮＲＡＧＥとの間の関係について情報がない。

４）先行技術についての結論
先行技術には、ＬＯＸに対する新たなパートナーまたは基質、特に増殖と分化とアポトーシスとの間の細胞のバランスの維持に関与するものが記載されていない。また、先行技術では、上皮細胞（特にケラチン合成細胞）中のあるいは他の細胞型中のこれらの新しいパートナーまたは基質の名称を開示していない。

また、先行技術は、表皮中で起こりうるＬＯＸ（特にケラチン合成細胞で発現されるＬＯＸ）の発現の変動と、加齢との関係、ＵＶや他の種類の攻撃への暴露の有無との関係、あるいは皮膚に影響を及ぼす疾患（乾癬、移植片対宿主反応、癌など）との関係についての情報を示していない。

先行技術は、アポトーシスへのＬＯＸの関与について述べていない。

先行技術は、健全な皮膚、加齢した皮膚、ＵＶまたは他の種類の攻撃に暴露された皮膚、または病気の皮膚などの皮膚中のＮＲＡＧＥの存在についての情報を提供していない。

先行技術は、上皮由来細胞中または表皮中に存在するＮＲＡＧＥを研究するモデルを提供していない。

先行技術は、いかなる組織におけるＬＯＸとＮＲＡＧＥ間のいかなる相互作用についての情報も提供していない。

先行技術は、ケラチン合成細胞におけるＬＯＸ及び／又はＮＲＡＧＥの発現を変化させることが可能な活性成分を同定するためのモデルを提供していない。

また、ヨーロッパでは、特定の用途では動物試験が現在禁止されており、人体実験は倫理的な議論の的となっている。したがって、本発明者らには、動物または人間を用いるスクリーニング法を実施することが許されなかった。

三次元モデルであるマイムスキン（Ｒ）（コレチカ、フランス）においては、ＬＯＸは表皮中で発現され、その発現は、ケラチン合成細胞の分化のレベルに応じて制御されていた（Ｎｏｂｌｅｓｓｅ ｅｔ ａｌ．， ２００４）。これらの研究には、ＮＲＡＧＥの発現や、ＬＯＸとアポトーシスの間にある可能性のある関係の研究は含まれていない。したがって、当業界の熟練者が、増殖と分化とアポトーシスのバランスが崩れた（加齢、ストレス、疾患）場合にこれを元に戻すことを目的に、細胞のＬＯＸ及び／又はＮＲＡＧＥの発現を変化させて恒常性を制御することに興味を持つかどうか不明である。また、これは新たな技術的な問題でもある。

したがって、先行技術では、ＬＯＸの細胞内パートナーの発現を変化させることの可能な活性成分（例えばＮＲＡＧＥ）を提供することができない。また、この細胞内パートナーが、細胞の調節の目的でのＬＯＸの発現の変化に関係するかどうかも不明である。この点で、これらの活性成分のインパクトを評価する客観的な基準を得ることは非常に難しい。

フランス特許０１．１０４４３

本発明の主たる目的は、上述の技術的な問題を解決することであり、特に、ＬＯＸとＮＲＡＧＥとの間の相互作用が欠乏しているか変化している場合にＬＯＸタンパク質とＮＲＡＧＥタンパク質間の相互作用を改善する活性成分を同定する方法に関する技術的問題を解決することである。

特に本発明の目的は、加齢による変化した皮膚、またはＵＶまたは他の種類の攻撃に曝された皮膚、及び／又は乾癬、湿疹、移植片対宿主反応、扁平苔癬及び／又は癌疾患などの症状の皮膚の場合のように、増殖と分化とアポトーシスとの間の細胞のバランスが崩れた場合、それを制御することである。

本発明はまた、増殖と分化とアポトーシスとの間の細胞のバランスを、特に例えば加齢による変化した皮膚、またはＵＶまたは他の種類の攻撃に曝された皮膚、及び／又は乾癬、湿疹、移植片対宿主反応、扁平苔癬及び／又は癌疾患などの皮膚の場合で、そのバランスが崩れた場合に制御するために、ＬＯＸ及び／又はＮＲＡＧＥの発現を変化させる活性成分の利用に関する。特に、本発明は、ＬＯＸとＮＲＡＧＥとの間の相互作用が欠乏しているか変化している場合における、ＬＯＸタンパク質とＮＲＡＧＥタンパク質間の相互作用を改善するための活性成分に関する。

本発明により、ＮＲＡＧＥの発現位置を決めこの発現を追跡する方法、特に皮膚の細胞モデルにおける方法に関わる技術的な問題を解決することができる。本発明によりまた、ＬＯＸとＮＲＡＧＥとの間の相互作用の調節が不良の状態を診断する方法を提供する場合の技術的な問題を解決することができる。

本明細書に用いる用語の、本発明者らが意図する意味を、以下に述べる：
「ＬＯＸ」：ヒトリジルオキシダーゼタンパク質のアイソフォーム、特にアミノ配列識別番号１で規定されるＬＯＸ；
「ＮＲＡＧＥ」：ヒトタンパク質のＮＲＡＧＨ、特にアミノ配列識別番号２で規定されるもの：
「ＬＯＸの発現の変化」：ＬＯＸをコードする遺伝子の変化、特にＬＯＸをコードするメッセンジャーＲＮＡの発現の変化、このメッセンジャーＲＮＡからのＬＯＸの合成の変化、及びＬＯＸ活性の変化。
「ＮＲＡＧＥの発現の変化］：ＮＲＡＧＥをコードする遺伝子の変化、特にＲＡＧＥをコードするメッセンジャーＲＮＡの発現の変化、および、メッセンジャーＲＮＡからＮＲＡＧＥの合成の変化とＮＲＡＧＥの生物学的効果の変化。

増殖と分化とアポトーシスとの間のバランスが崩れた場合、これらの変化によりそのバランスのとれた状態を再誘導できなければならない。

ＬＯＸに対して効果的と考えられる活性成分は、少なくとも一種の細胞種がこれらの活性成分と接触して大きなＬＯＸ発現及び／又は活性を示すモデルにおいて、コントロールモデル（一般的には活性成分に非接触）のＬＯＸ発現及び／又は活性レベルと比較して、好ましくはＬＯＸのｍＲＮＡの発現で約±５０％の差異を与えるもの及び／又はＬＯＸの発現及び／又はＬＯＸ活性に約±１５％の差異を与えるものである。

ＮＲＡＧＥに対して効果的と考えられる活性成分は、少なくとも一種の細胞種がこれらの活性成分と接触して大きなＬＯＸ発現及び／又は活性を示すモデルで、コントロールモデル（一般的には活性成分に非接触）のＮＲＡＧＥ発現及び／又は活性レベルと比較して、好ましくはＮＲＡＧＥのｍＲＮＡの発現に約±５０％の差異を与えるもの及び／又はＮＲＡＧＥの発現及び／又はＮＲＡＧＥの生物学的効果に約±１５％の差異を与えるものである。

したがって、本発明の第一の側面は、増殖と分化とアポトーシスの細胞現象の間のバランスを制御するために、特にこれらの現象の間のバランスが崩れている場合にまた特にＬＯＸとＮＲＡＧＥとの間の相互作用が欠乏しているか変化している場合に制御するためにＬＯＸタンパク質とＮＲＡＧＥタンパク質間の相互作用を変化させる組成物の製造のための、配列識別番号１のＬＯＸの発現及び／又は活性を変化させる及び／又は配列識別番号２のＮＲＡＧＥの発現及び／又は活性を変化させる少なくとも一種の物質の有効量の使用方法に関する。

本発明は、ＬＯＸとＮＲＡＧＥとの間の相互作用が欠乏しているか変化している場合にＬＯＸタンパク質とＮＲＡＧＥタンパク質間の相互作用を改善するための組成物の製造のための配列識別番号１のＬＯＸの発現及び／又は活性を変化させる及び／又は配列識別番号２のＮＲＡＧＥの発現及び／又は活性を変化させる少なくとも一種の物質配列の有効量の使用方法に関する。

本発明はさらに、増殖と分化とアポトーシスとの間の細胞のバランスが欠乏しているか変化している少なくとも一種の状態を予防又は治療する組成物の製造のための、少なくとも配列識別番号２のＮＲＡＧＥタンパク質の発現及び／又は活性を変化させ、必要に応じて配列識別番号１のＬＯＸタンパク質の発現及び／又は活性を変化させる少なくとも一種の物質の有効量の使用方法に関する。

好ましくは、ＬＯＸ及び／又はＮＲＡＧＥの発現が、上皮細胞内で、特にケラチン合成細胞内で変化させられる。

好ましくは、上記の物質の目的がＬＯＸタンパク質とＮＲＡＧＥタンパク質との間の相互作用を変化させることであり、この相互作用が、特にＮＲＡＧＥタンパク質のＩＲＤドメイン中で起こる。

好ましくは、ＬＯＸとＮＲＡＧＥとの相互作用が、ＬＯＸで誘起された酵素触媒によるＮＲＡＧＥの重合、特に二量体化を含む。

好ましくは、ＬＯＸとＮＲＡＧＥとの間の相互作用が、ＬＯＸの酵素活性の結果起こるＨ₂Ｏ₂の生産を含み、このＨ₂Ｏ₂が、他の分子、特に中性のスフィンゴミエリナーゼまたはＮＦ−ｋＢの活性剤となる。

好ましくは、ＬＯＸとＮＲＡＧＥとの間の相互作用が、ＬＯＸの非酵素的な活性、特にＬＯＸのプロ領域（Ａ２２〜Ｄ１６９）により発揮される活性である。

好ましくは、上記物質の目的が、細胞のストレスへの暴露、特に細胞の熱への暴露または細胞の放射線、特に太陽放射線への暴露、または細胞の毒性薬品、例えば化学薬品または微生物薬品への暴露、皮膚の加齢、扁平苔癬、移植片対宿主反応（ＧＶＨ）、湿疹、乾癬及び癌、特に上皮癌からなる群から選ばれる条件の治療及び／又は予防である。

好ましくは、上記物質の目的が、細胞の過剰増殖の場合、特に癌の場合、特に上皮癌、更に特に基底細胞または有棘細胞型の皮膚上皮癌、乾癬または湿疹の場合の細胞増殖の抑制である。

好ましくは、上記物質の目的が、特に皮膚加齢や、皮膚のストレスへの暴露、特に熱への、または皮膚の放射線、特に太陽放射線への暴露、または皮膚の毒性薬品、例えば化学薬品または微生物薬品への暴露、または移植片対宿主反応（ＧＶＨ）による実質的なアポトーシス場合に、表皮中でのアポトーシスを抑制することである。

好ましくは、上記物質の目的が、特に加齢や、皮膚の熱への暴露、皮膚の放射線、特に太陽放射線ヘの暴露、または移植片対宿主反応（ＧＶＨ）による表皮中の細胞の低増殖の場合、細胞増殖を増加させることである。

好ましくは、上記物質の目的が、皮膚加齢や、皮膚のストレスヘの暴露、特に熱への暴露、または皮膚の放射線、特に太陽放射線への暴露、または皮膚の毒性薬品、例えば化学薬品または微生物薬品への暴露、または移植片対宿主反応（ＧＶＨ）の際のＬＯＸの発現の増加と、必要に応じて行うＮＲＡＧＲの発現の阻害である。

好ましくは、上記物質の目的が、乾癬または湿疹の予防あるいは治療のための、表皮中でのＮＲＡＧＥの発現及び／又は活性の増加と、必要に応じて行うＬＯＸの発現及び／又は活性の阻害である。

好ましくは、上記物質の目的が、癌、特に上皮癌、更に特に基底細胞型または有棘細胞型の皮膚上皮癌、または扁平苔癬の予防又は治療のために、ＬＯＸとＮＲＡＧＥの発現を増加させることである。

好ましくは、上記組成物が化粧用、栄養補助、皮膚医薬または医薬組成物である。

好ましくは、上記の増殖と分化とアポトーシスと間の細胞のバランスが、ケラチン合成細胞の増殖と分化とアポトーシスの間のバランスである。

好ましくは、活性成分の製造に用いる出発原料が、植物 （好ましくは根、茎、皮、花、果実、種子、胚、樹脂、浸出物、葉または植物全体）またはタンパク質である場合、放射線、例えばベータ線またはガンマ線で、好ましくは照射量５ｋＧｙで滅菌してもしなくてもよく、また必要なら、例えば室温で粉砕して粉末としてもよい。この粉末を、次いで、例えば２〜５％（重量）、好ましくは５％の量で、粉体として、極性溶媒、例えば水、アルコール、ブチレングリコールなどのグリコール、ポリオール、及び／又は極性溶媒の混合物中に、好ましくはいろいろな比率の水とアルコール、グリコールまたはポリオール（例えばエタノール、グリセリン、ブチレングリコール、グリコール、キシリトールなど）との混合物、好ましくは７５／２５または５０／５の比率の水／ブチレングリコール混合物、またはアルカンなどの非極性溶剤、または非極性溶剤の混合物、極性溶媒と非極性溶剤の混合物に分散する。好ましくは、少なくとも２時間攪拌後、例えば磁気攪拌後、必要なら溶剤を加熱した後、試料を、好ましくはデカンテーションまたは遠心分離で清澄化させ、次いで、好ましくは０．４５μｍ〜０．２２μｍのフィルターで濾過する。

好ましくは、活性成分の生産に用いる出発原料が、構造の明確な分子（例えば、合成分子または半合成分子、精製して得られた生体内分子）である場合、溶剤に、好ましくは水またはスルホキシドに溶解する（当該分子に応じて、濃度は、好ましくは１０^-6Ｍ〜１０^-2Ｍ、特に好ましくは１０^-4Ｍのオーダー、または好ましくは１重量％〜５重量％）。得られた溶液は、必要に応じて濾過、好ましくは０．４５μｍまたは０．２２μｍのフィルターで濾過する。

好ましくは、上述の方法の一つで得られた活性成分は、最終濃度が好ましくは０．０１〜１０体積％（ｖ／ｖ）で、特に好ましくは０．１％〜１％ （ｖ／ｖ）で使用される。

好ましくは、上記物質は、ダイズエキスやマオウエキス、ホップエキス、シナモンエキスからなる群から選ばれる。

本発明の第二の側面は、増殖と分化とアポトーシスとの間の細胞のバランスが欠乏しているか変化している少なくとも一種の状態を予防又は治療するために、ＬＯＸとＮＲＡＧＥとの間の相互作用を変化させる少なくとも一種の活性成分を同定する方法であって、
−この活性成分をＬＯＸタンパク質（配列識別番号１）及び／又はＮＲＡＧＥタンパク質（配列識別番号２）を発現可能な少なくとも一種の生細胞と接触させること、及び
−特に、増殖と分化とアポトーシスとの間の細胞のバランスの改善を目的に、ＬＯＸ及び／又はＮＲＡＧＥの発現及び／又は活性を変化させる活性成分を特定するために、ＬＯＸ及び／又はＮＲＡＧＥの発現を分析することを含むことを特徴とする方法に関する。

本発明はさらに、ＬＯＸとＮＲＡＧＥとの間の相互作用が欠乏しているか変化している場合、ＬＯＸタンパク質とＮＲＡＧＥタンパク質間の相互作用を改善する目的で、ＬＯＸとＮＲＡＧＥとの間の相互作用を変化させる少なくとも一種の活性成分を同定する方法であって、
−この活性成分をＬＯＸタンパク質（配列識別番号１）及び／又はＮＲＡＧＥタンパク質（配列識別番号２）を発現可能な少なくとも一種の生細胞と接触させること、及び
−特に、ＬＯＸとＮＲＡＧＥとの間の相互作用が欠乏しているか変化している場合に、ＬＯＸタンパク質とＮＲＡＧＥタンパク質間の相互作用を改善する目的で、ＬＯＸ及び／又はＮＲＡＧＥの発現及び／又は活性を変化させる活性成分を特定するために、ＬＯＸ及び／又はＮＲＡＧＥの発現を分析することを含む方法に関する。

ＬＯＸ及び／又はＮＲＡＧＥタンパク質の発現が可能な上記生細胞の増殖と分化とアポトーシスのバランスが、またはＬＯＸタンパク質とＮＲＡＧＥタンパク質間の相互作用が、活性成分と接触させられる前に、なくなっているか変化していることが好ましい。

好ましくは、上記生細胞が、上皮細胞、特にケラチン合成細胞である。
好ましくは、上記方法が、ＬＯＸ及び／又はＮＲＡＧＥのメッセンジャーＲＮＡの発現を分析することを含む。

好ましくは、上記方法が以下のプライマーを用いる定量的ＲＴ−ＰＣＲを用いる：
ＬＯＸ遺伝子用：
センス：ＡＣＧＴＡＣＧＴＧＣＡＧＡＡＧＡＴＧＴＣＣ
アンチセンス：ＧＧＣＴＧＧＧＴＡＡＧＡＡＡＴＣＴＧＡＴＧ
ＮＲＡＧＥ遺伝子用：
センス：ＴＧＣＡＣＡＧＡＣＡＴＣＡＧＣＡＧＡＴＧＧ
アンチセンス：ＴＴＣＡＣＧＧＡＴＧＡＴＡＴＣＴＣＴＣＡＧＣ。

好ましくは、本方法は、例えば定量ＲＴ−ＰＣＲによるメッセンジャーＲＮＡの速度論的分析を含んでいる。

本発明はさらに、少なくとも一種の細胞型において細胞の増殖と分化とアポトーシスの現象間バランスが崩れている患者の化粧的手入れまたは治療を行う方法であって、ＬＯＸ及び／又はＮＲＡＧＥの発現を変化させる物質を塗布又は投与することで上記ＬＯＸとＮＲＡＧＥとの間の相互作用を改善させることを含む方法に関する。

本発明はさらに、ＬＯＸとＮＲＡＧＥとの間の相互作用が欠乏しているか変化している被験者の化粧的手入れまたは治療を行う方法であって、配列識別番号１のＬＯＸの発現及び／又は活性を変化させる及び／又は配列識別番号２のＮＲＡＧＥの発現及び／又は活性を変化させる物質を塗布又は投与することを含む方法に関する。

本発明はさらに、ＬＯＸとＮＲＡＧＥとの間の相互作用が欠乏しているか変化している被験者の化粧的手入れまたは治療を行う方法であって、ＮＲＡＧＥの発現及び／又は活性を変化させ、必要の応じてＬＯＸの発現及び／又は活性を変化させる物質の塗布又は投与を含む方法に関する。

本発明の第三の側面は、組成物の製造方法であって、
−増殖と分化とアポトーシスとの間の細胞のバランスの改善を目的に、ＬＯＸ及び／又はＮＲＡＧＥの発現及び／又は活性を変化させる活性成分を同定するために上記に記載の同定方法を使用すること、及び
−増殖と分化とアポトーシスとの間の細胞のバランスが欠乏しているか変化している少なくとも一種の状態を予防又は治療するための化粧用、栄養補助、皮膚医薬または医薬組成物を製造するために、この活性成分を少なくとも一種の添加剤と混合することを含むことを特徴とする組成物の製造方法に関する。

本発明はさらに、
−ＬＯＸタンパク質とＮＲＡＧＥタンパク質との間の相互作用の改善を目的に、ＬＯＸ及び／又はＮＲＡＧＥの発現及び／又は活性を変化させる活性成分を同定するために上記に記載の同定方法を使用すること、及び
−ＬＯＸタンパク質とＮＲＡＧＥタンパク質との間の相互作用が欠乏しているか変化している場合に、ＬＯＸタンパク質とＮＲＡＧＥタンパク質との間の相互作用を改善するための化粧用、栄養補助、皮膚医薬または医薬組成物を製造するために、この活性成分を少なくとも一種の添加剤と混合することを含むことを特徴とする組成物の製造方法に関する。

本発明の第四の側面は、少なくともケラチン合成細胞を含む再構成皮膚モデル中における、または皮膚の切片、好ましくは増殖と分化とアポトーシスとの間の細胞のバランスが欠乏しているか変化している状態の表皮をもつ人由来の皮膚の切片中におけるＮＲＡＧＥの存在を検出し位置決めをするために、少なくとも一種の抗ＮＲＡＧＥ抗体を使用することを特徴とする、ＮＲＡＧＥの位置を決定する方法に関する。

本発明の第五の側面は、細胞レベルで、特に上皮細胞での、好ましくはケラチン合成細胞でのＮＲＡＧＨの発現の変化を検出するための組成物の製造における抗ＮＲＡＧＥ抗体を使用する方法に関する。

好ましくは、上記組成物の目的が、増殖と分化とアポトーシスとの間の細胞のバランスまたはＬＯＸとＮＲＡＧＥとの間の相互作用が、特に表皮中において、欠乏しているか変化している状態を検出することである、なお、上記状態は、細胞のストレスへの暴露、特に細胞の熱への暴露または細胞の放射線、特に太陽放射線への暴露、または細胞の毒性薬品、例えば化学薬品または微生物薬品への暴露、皮膚加齢、扁平苔癬、移植片対宿主反応（ＧＶＨ）、湿疹、乾癬及び癌、特に上皮癌、更に特に基底細胞型または有棘細胞型の皮膚上皮癌からなる群から選ばれる。

好ましくは、上記組成物は、さらに細胞レベルで、特に上皮細胞中で、好ましくはケラチン合成細胞中でＬＯＸの発現の変化を検出する抗ＬＯＸ抗体を含んでいる。

好ましくは、上記組成物は、更にケラチン合成細胞中でのＬＯＸの発現の変化を検出する抗ＬＯＸ抗体を含んでいる。

好ましくは、上記ケラチン合成細胞はヒトケラチン合成細胞である。

予期せずに、本発明者らはＬＯＸタンパク質とＮＲＡＧＥタンパク質との間の相互作用を見出した。この発見が基本であり、本発明の原点である。この発見により、ＬＯＸが、増殖や分化、アポトーシスの経路の交点に存在して細胞の恒常性を支配するタンパクであることが明らかとなった。

また、本発明者らは、このＮＲＡＧＥタンパク質が、特に表皮に存在し、特にケラチン合成細胞で発現されていることを見出した。この発見により、このＬＯＸとＮＲＡＧＥとの間の相互作用を、細胞の恒常性が乱された場合にそれを回復させるための化粧用手入れまたは治療の作用標的とすることが可能となった。

１）生体外でのＬＯＸ／ＮＲＡＧＥ相互作用の発見とその評価
表皮中のＬＯＸの存在の発見（Ｎｏｂｌｅｓｓｅ ｅｔ ａｌ．，リジルオキシダーゼ様酵素及びリジルオキシダーゼが合成皮膚及び人皮膚の真皮と表皮に存在し、弾性繊維に会合している， J. Invest. Dermatol., 122, 621-630, 2004）の後、これらの細胞は、ＬＯＸが存在するレベルでコラーゲンまたはエラスチンを殆どあるいはまったく含んでいないため、これらの細胞中では、ＬＯＸが、その主たる既知の役割、即ちコラーゲンとエラスチンの架橋を果たしている可能性が低いため、本発明者らは、このレベルでＬＯＸが果たす役割について検討を加えた。

この目的のために、酵母ツーハイブリッド法を用いて、ＬＯＸタンパク質のパートナーを検索するとともに、正常のヒト皮膚ケラチン合成細胞ｃＤＮＡのライブラリを、ルアのＧＡＬ４ ＢＤ−ｈＬＯＸｍａｔでスクリーニングして、ＮＲＡＧＥがＬＯＸの潜在的なパートナーであることを特定できるようにした（実施例１参照）。

Ｈｅｌａ細胞中でのツーハイブリッド法により、本発明者らは、この協調関係が哺乳類細胞中で観測されることを示した（実施例２参照）。

次のステップでは、このＬＯＸとＮＲＡＧＥとの間の潜在的な協調関係の同定が、これらの二つのタンパク質の直接的な物理的相互作用に相当するものかを検討した。これは、特に、これらの遺伝子をｃｏｓ７細胞に移入後に生産されるＬＯＸタンパク質とＮＲＡＧＥタンパク質の共免疫沈降を用いる方法で行った。この結果、ＬＯＸとＮＲＡＧＥとの間の物理的相互作用の存在が確認されるとともに、ＬＯＸが、ＩＲＤ（散在反復ドメイン）と呼ばれるＮＲＡＧＥの特定の領域と、即ちＭＡＧＥタンパク質群の中に存在するＮＲＡＧＥに特異的な領域と相互作用を示すことが明らかとなった（実施例３参照）。

この点で、現段階では、一つに、このＮＲＡＧＥタンパク質が、ＬＯＸの触媒作用により二量化しやすいサイトであるリジル基を多く含む二つのドメインを有しているという点、また他方、ＮＲＡＧＥの機能が発揮されるのは二量体の形態であるという点を考えるとき、ＬＯＸとＮＲＡＧＥとの間の相互作用の発見は、特に非常に興味あることであるといえる。

本発明者らは、このように細胞外において、ＮＲＡＧＥのＩＲＤ領域におけるＬＯＸとＮＲＡＧＥとの間の直接的な物理的相互作用の存在を見出したが、生体内においてもこの相互作用が働いているのかどうかを検討した。前述のように、ＬＯＸとは異なって、ＮＲＡＧＥが皮膚中に存在することは過去には知られていなかったことを銘記すべきである。

２）正常のヒト皮膚中のＮＲＡＧＥの存在の確認と再構成の正常ヒト皮膚
本発明者らは、皮膚の真皮と表皮の両方においてＮＲＡＧＥの発現を確認した（実施例４と実施例５を参照）。

本発明においては、本発明者らは、皮膚でのＮＲＡＧＥの発現位置を決定する方法を用いた。

予想外にも、本発明者らは、表皮においては、一般的にその存在がユビキタスであるといわれるタンパク質に予想されるように、ＮＲＡＧＥが均一に発現されるのでなく、ある傾斜を持って発現されていることを見出した。

表皮の構造：
表皮は、基底膜上にある重層の上皮であり、この基底膜は真皮と結合している。その平均厚は、６０〜１００μｍ内で変動し、底部から表面にむけてケラチン合成細胞の分化段階の進んだ次の四種の連続的な層からなっている。

−基底細胞層（単一列の細胞）
−有棘細胞層（５〜６枚の単細胞層）
−顆粒層（ １〜３枚の単細胞層）
−角質層（５〜１０枚の単細胞層）

したがって、ＮＲＡＧＥは基底細胞層には存在せず、分化したケラチン合成細胞の第１層で現れて、その含量は角質層で増加する。表皮の第一基底上細胞層のラベリングは、ＬＯＸのラベリングに相当し、基底細胞層から上方に表れる。一方、ＬＯＸのラベリングは、 ＮＲＡＧＥが存在している表皮上層では減少し、下の３ゾーンとは大きく異なる：
−ＬＯＸのみが発現されている、基底細胞層と第一の増殖性基底上細胞層とからなる表皮下方のゾーン；
−ＬＯＸとＮＲＡＧＥとがともに発現されている、第一の非増殖性基底上細胞層から第一の単細胞性角質層に伸びる中間体ゾーン；
−ＮＲＡＧＥのみが発現されている表皮上方のゾーン。

細胞レベルでの観察の結果、 ＬＯＸとＮＲＡＧＥとが細胞の周辺に、特に亜膜性領域に出現し、ＮＲＡＧＥは細胞質中にも出現する（実施例４と実施例５を参照）。

したがって、本発明者らは、ＮＲＡＧＥが皮膚中に、それも真皮と表皮の両方の中に存在することを初めて発見した。

また、表皮中には、ＬＯＸタンパク質とＮＲＡＧＥタンパク質とがともに発現され、特にケラチン合成細胞中では、細胞レベルで同一場所を共有し、その場所が周辺の亜膜性ゾーンである（ＮＲＡＧＥは細胞質にも存在する）ことを発見した。

したがって、本発明者らは、細胞外で見出した直接的相互作用に好適な条件を、表皮中のＬＯＸとＮＲＡＧＥとが共存するゾーンにおいて達成することができることを示した。

３）加齢に伴うまた特定の病理条件における表皮中でのＬＯＸ及び／又はＮＲＡＧＥの発現阻害の確認
本発明者らはまた、予期せずして、皮膚の加齢やいくつかの病理条件により、表皮中でのＬＯＸ及び／又はＮＲＡＧＨの発現の阻害が起こることを示した。

３．１）表皮中でのＬＯＸとＮＲＡＧＥの状態
３．１．１）年配の人の皮膚
年配の人の皮膚は、表皮の増殖が遅いこと（細胞層数の減少）と高ケラチン化に特徴がある。

本発明者らは、加齢皮膚中には、（用いた方法で検出できる）ＬＯＸが全く存在しないことを発見した。

一方、ＮＲＡＧＥは強く発現されて細胞質中に存在し、第一の基底上細胞層から上方に、発現の傾斜なしに存在しているようであった。

したがって、本発明によれば、特にＬＯＸとＮＲＡＧＥの共発現ゾーンを復元することで、ＮＲＡＧＥの発現（及び／又は活性）の阻害の有無に関係なく、制御された分化ゾーン及び／又はアポトーシスゾーンが再誘導できるように、ＬＯＸの発現（及び／又は活性）を増加させることができる。この結果、皮膚、特に表皮が薄くなる。

したがって、本発明の目的は、特に皮膚の加齢効果を矯正し防止することである。

３．１．２）ＧＶＨ（移植片対宿主）反応
ＧＶＨは、造血幹細胞の同種移植の後に起こる疾患である。これは、患者の正常な器官（特に、皮膚や肝臓、消化管）上の移植片内に含まれている免疫細胞（リンパ球）の影響に関係している。皮膚中では、斑状丘疹性、痒疹性で炎症性の皮疹の形で現れる。

この疾患を持つ患者は、皮膚が非常に薄く、高度にアポトーシス性である表皮を有している。

本発明者らによる組織学的な研究では、ＬＯＸの欠失と非常に多量のＮＲＡＧＥの存在が認められ、ＮＲＡＧＥは、細胞質中及び第一の基底上細胞層が上方に存在していた。

したがって、本発明によれば、ＮＲＡＧＥの発現（及び／又は活性）の阻害の有無に関係なくＬＯＸとＮＲＡＧＥの共発現ゾーンを再誘導して、これらが相互作用を示すようにし、もって皮膚上でのＧＶＨの症状発現を抑え、特に皮膚の、特に表皮の肥厚をもたらすように、ＬＯＸの発現（及び／又は活性）を増加させることができる。

したがって、本発明により、ＧＶＨ患者の皮膚上での、この疾患の症状発現を抑えることができる。

３．１．３）扁平苔癬
苔癬は、未知の原因で引き起こされる皮膚疾患であり、紫色の平坦で固体状で乾燥した非常に痒疹性の丘疹を特徴とし、その直径は数ミリメーターである。

本発明者らは、ＬＯＸ発現の極めて大幅な減少または完全な消失と非常に不規則なＮＲＡＧＥの発現を発見した。これらの観測は、もちろん、検討したこれら二つのタンパク質間の相互作用が消失していることあるいは非常に低レベルであることと関係したものである。

このため、本発明によれば、ＮＲＡＧＥの発現（及び／又は活性）の阻害の有無に関係なく、ＬＯＸとＮＲＡＧＥの共発現ゾーンを再誘導して、これらが相互作用を示すようにし、もって通常の表皮状態に回復させることができるようにＬＯＸの発現（及び／又は活性）を増加させることができる。

したがって、本発明により、扁平苔癬の患者が、この疾患を治療、軽減、予防することが可能となる。

３．１．４）乾癬
癬は、紅斑落屑性の病変を特徴とする慢性皮膚疾患である。この疾患の基本的な特徴としては、ケラチン合成細胞の増殖速度の増加があげられ、この結果、表皮の再生と肥厚が速やかとなる。

組織学的には、末端分化の第一段階に関連する細胞の過剰増殖、即ち不完全な末端分化が認められ、その結果、アポトーシスが消失するか非常に弱くなる。

本発明者らは、ＬＯＸの非常に強い発現を検出し、一方、ＮＲＡＧＥの存在は弱く、問題のゾーンのラベリングはほぼ均一であって、傾斜発現は起こっていなかった。通常とは異なる発現強度を示すこれらの特徴は、問題のタンパク質の位置に影響を及ぼす更に重要な異常と連動している。したがって、乾癬の皮膚では、ＬＯＸは表皮下部で主に発現され、ＮＲＡＧＥのみが上部で発現され、その結果、これらのタンパク質の発現が、健全な皮膚で通常認められる重複なしへとシフトする。細胞レベルでは、ＮＲＡＧＥは、細胞質内にのみ観察され、亜膜性周辺ゾーンには観測されない。

したがって、乾癬においては、ＬＯＸとＮＲＡＧＥタンパク質の両方が表皮中に存在するが、これらが物理的に同一場所に存在していないため、相互に直接的な相互作用を持っていないことがわかる。このように相互作用がない結果、表皮中に機能不全が観察される。このことは、表皮の恒常性を維持する上でのＬＯＸとＮＲＡＧＥとの間の相互作用の役割を反映している。

したがって、ＬＯＸの発現（及び／又は活性）の阻害及び／又は更に、ＮＲＡＧＥの発現（及び／又は活性）の刺激、好ましくは部分的な刺激を行うことで、特に、制御された増殖ゾーンを再誘導してケラチン合成細胞におけるアポトーシスを促進して過剰増殖を減少させるために、ＬＯＸとＮＲＡＧＥ発現の重複ゾーンを得ることが可能となる。

また、ＮＲＡＧＨの発現（及び／又は活性）の刺激及び／又はＬＯＸの発現（及び／又は活性）の阻害、好ましくは部分的な阻害により、特に、ケラチン合成細胞におけるアポトーシスを促進させて過剰増殖を抑制することを可能とするために、ＬＯＸとＮＲＡＧＥの発現の重複ゾーンを得ることが可能となる。

したがって、本発明により、乾癬の予防及び／又は治療、またはその効果の一部を軽減することが可能となる。

３．１．５）湿疹
湿疹とは、臨床的には、強いかゆみを伴う、皮膚の斑点や、ある程度の局所的な膨潤、かさぶたを形成しやすい湿潤性水泡を特徴とする皮膚症状である。慢性の湿疹は、肥厚を伴う皮膚の変性のためより重篤となる。表皮中でのアポトーシスは低下する。

本発明者らは、細胞周辺におけるＬＯＸの非常に強固な発現を発見した。他方、ＮＲＡＧＥの発現は弱く、細胞質にのみに観察される。このことは、もちろん、これら二つのタンパク質間の相互作用が存在しないか非常に弱いレベルであることを反映している。

したがって、ＮＲＡＧＥの発現（及び／又は活性）の刺激、及び／又はＬＯＸの発現（及び／又は活性）の阻害、好ましくは部分的な阻害により、アポトーシスを増加させ、湿疹症状の一部を減少させることができるようになる。

したがって、本発明により、湿疹の予防及び／又は治療が、特に症状の一部の軽減が可能となる。

３．１．６）上皮皮膚癌
二種の上皮皮膚癌を区別する必要がある。

−一つは、基底細胞癌（症例の９０％）で、転移する恐れのない本質的に局所的で低増殖性の腫瘍である。これは、基底細胞層のケラチン合成細胞の非制御な増殖により引き起こされる。
−他方は、有棘細胞癌（症例の１０％）で、局所的に侵略的な増殖をし、転移することもある。有棘細胞層のケラチン合成細胞の非制御な増殖により引き起こされる。

本発明者らは、上記二種の癌（基底細胞癌及び有棘細胞癌）の侵襲性細胞中にはＬＯＸとＮＲＡＧＥが存在しないこと、また腫瘍付近の表皮中では腫瘍に近いほどＬＯＸとＮＲＡＧＥが更に減少することを発見した。本発明者らはまた、腫瘍の周りの間質反応においてＬＯＸが強く発現されるがＮＲＡＧＥはこの反応で発現されていないことを見出した。

まとめると、このようなＬＯＸの発現の停止は、これらの二種の癌の場合に過去に認められていなかったものであり、予想外なものである。ＬＯＸは一般的には上皮内癌に存在すると考えられているため、この現象は、上皮癌に特異的なものであるかもしれない。

ＩＮＲＡＧＥの発現の停止は、全く新たな発見であり、過去いずれの癌においてもこのような記載はない。

したがって、ＮＲＡＧＥの発現（及び／又は活性）とＬＯＸの発現（及び／又は活性）の刺激により、恒常性の復元が可能となる。特に上皮皮膚癌において、腫瘍の表現型の復帰をもたらすことも可能である。

３．２）病理組織の研究の結論
このような観察の結果、本発明者らは、増殖と分化とアポトーシスのバランスの異常で引き起こされる状況は、もし、この異常が年配の被験者の表皮中のものであっても、あるいは表皮に影響を与える他の疾患を持つ患者の表皮中であったとしても、組織的には、ＬＯＸ及び／又はＮＲＡＧＥの発現の不良にその特徴があり、この不良により、これらの間の相互作用が変化したり、相互作用が不可能となったりすることを、見出した。

この発見の結果、本発明者らは、ＬＯＸまたはＮＲＡＧＥによる制御、好ましくはＬＯＸとＮＲＡＧＥの両方の制御を利用して、増殖と分化とアポトーシスのバランスを元に戻す方法を検討した。

したがって、これらの予期しない発見を元に、本発明者らは、それらの相互作用を通じてこれらのタンパク質により行われている制御を復元するために、また組成物の、特に化粧用組成物または医薬組成物の製造のための有効成分を特定するために、ＬＯＸ及び／又はＮＲＡＧＥの発現を調整する有効成分を特定する方法を提供する。

このように、非常に薄い表皮とＬＯＸが非発現であることを特徴とする表皮の過少増殖（加齢皮膚、ＧＶＨ）の場合には、ＮＲＡＧＥの発現の阻害の有無とは無関係に、ＬＯＸの発現を刺激し、ＬＯＸとＮＲＡＧＥとの共発現を調整して制御された分化とアポトーシスゾーンを再誘導し、皮膚の肥厚をもたらす。

ＮＲＡＧＥが発現量が少なくて表皮が過剰増殖である（乾癬、湿疹）の場合、ＬＯＸ発現の阻害の有無とは無関係に、ＮＲＡＧＥの発現を刺激し、制御された増殖ゾーン（ＬＯＸ／ＮＲＡＧＥオーバラップ）を再誘導して過剰増殖を停止させて、アポトーシスを促進させる。

表皮中でのアポトーシスが高レベル（加齢皮膚、皮膚のストレスへの暴露、特に熱への暴露、または皮膚の放射線、特に太陽放射線への暴露、または皮膚のａ毒性試薬、例えば化学品または微生物剤への暴露、または移植片対宿主反応− ＧＶＨ）であり、ＮＲＡＧＥが過剰に発現されている場合には、ＬＯＸの発現の刺激の有無とは無関係に、ＮＲＡＧＥの発現を阻害する。

４）細胞のアポトーシスにおけるＬＯＸの関与の確認
予想外に、本発明者らは、従来知られていなかったＬＯＸとアポトーシスとの間の関係の存在を見出した。したがって、得られたデータは、ＬＯＸのケラチン合成細胞における抗アポトーシス性の役割を示唆し、その役割とは、特に好アポトーシス性のタンパク質ＮＲＡＧＥの制御に関係している。

５）活性成分の探索
活性成分は、特に培養ケラチン合成細胞、好ましくはヒトケラチン合成細胞上でのＬＯＸとＮＲＡＧＥのメッセンジャーＲＮＡの発現を分析して同定した。活性を調べたい活性成分を、培養ケラチン合成細胞に適当な条件下で接触させ、接触が有効となるまで十分な時間放置する。これらの活性成分は、いろいろな濃度で試験すべきであり、このようにすることで濃度の影響がある場合にその検出が可能となる。

本発明においては、スクリーニングに用いる活性成分には、特に化学合成に伴う問題を避けるために、好ましくは植物由来のものを用いた。 植物由来の活性成分の利点は、当業界の、特に医薬品や皮膚医薬品、栄養医薬物、化粧品業界の熟練者には公知である。

活性成分のスクリーニングは、具体的には、トータルＲＮＡを抽出し、定量的ＲＴ−ＰＣＲを行って実施する。特に、好ましいプライマー配列は、実施例１３に示すものであるが、これらに限定されるわけではない。

各アッセイ中のｃＤＮＡの量を、アクチンｃＤＮＡの量に対してプロットする。次いで、活性成分の存否の効果を比較する。もしＮＲＡＧＥ及び／又はＬＯＸの発現及び／又は活性が、コントロールに対して変化している（刺激または阻害）場合、その物質は活性成分となりうる。好ましくは、活性成分は、ＬＯＸ及び／又はＮＲＡＧＥのメッセンジャーＲＮＡの発現を少なくとも５０％、またはＬＯＸ及び／又はＮＲＡＧＥの発現及び／又は活性を少なくとも１５％、変化させることができる。

本発明に係る化合物は、組成物の形で、特に化粧用組成物、皮膚医薬組成物または医薬組成物の形で製造される。これらの組成物の添加剤としては、例えば、保存料や、軟化剤、乳化剤、界面活性剤、保湿剤、増粘剤、コンディショナー、艶消し材、安定剤、酸化防止剤、テキスチャー剤、増白剤、フィルム成形剤、溶解剤、顔料、着色料、香料、太陽フィルターからなる群から選ばれる少なくとも一種の化合物があげられる。これらの添加剤は、好ましくはアミノ酸及びその誘導体、ポリグリセロール類、エステル類、セルロースポリマー類およびその誘導体、ラノリン誘導体、リン脂質類、ラクトフェリン類、ラクトパーオキシダーゼ類、ショ糖系安定剤、ビタミンＥとその誘導体、天然および合成ワックス類、植物性油脂類、トリグリセリド類、不鹸化物類、植物ステロール類、植物エステル類、シリコーン類およびその誘導体、タンパク質加水分解物類．ホホバ油およびその誘導体、脂溶性／水溶性エステル類、ベタイン類、アミンオキシド類、植物エキス類、ショ糖エステル類、二酸化チタン、グリシン類およびパラベン類からなる群から選ばれ、特に好ましくは、ブチレングリコール、ステアレス−２、ステアレス−２１、グリコール−１５ステアリルエーテル、セテアリルアルコール、フェノキシエタノール、メチルパラベン、エチルパラベン、プロピルパラベン、ブチルパラベン、ブチレングリコール、天然のトコフェロール類、グリセリン、ナトリウムジヒドロキシセチルホスフェート、イソプロピルヒドロキシセチルエーテル、グリコールステアレート、トリイソノナノイン、ヤシ脂肪酸オクチル、ポリアクリルアミド、イソパラフィン、ラウレス−７、カルボマー、プロピレングリコール、グリセリン、ビサボロール、ジメチコン、水酸化ナトリウム、ＰＥＧ−３０ジポリヒドロキシステアレート、カプリル酸／カプリン酸トリグリセリド類．オクタン酸セタリル、ジブチルアジペート、グレープシード油、ホホバ油、硫酸マグネシウム、ＥＤＴＡ、シクロメチコン、ザンタンガム、クエン酸、ラウリル硫酸ナトリウム、鉱物ワックス類及び油類、イソステアリルイソステアレート、プロピレングリコールジペラルゴネート、プロピレングリコールイソステアレート、ＰＥＧ−８ミツロウ、水添ヤシ核グリセリド類、水添ヤシグリセリド類、ラノリン油、ごま油、セチルラクテート、ラノリンアルコール、ヒマシ油、二酸化チタン、乳糖、ショ糖、低密度ポリエチレン、等張食塩水からなる群から選ばれる。

好ましくは、上記の組成物は、水性または油性溶液、クリーム状または水性または油性ゲル、特にポットまたはチューブ充填物、特にシャワーゲルまたはシャンプー； 乳液； エマルジョン、マイクロエマルジョンまたはナノエマルジョン、特に、水中油型または油中水型の、多成分のまたはシリコーンエマルジョン； ローション、特にガラスまたはプラスチック瓶充填物；調合ボトルまたはエアゾール；アンプル； シロップ； 液体石鹸；低アレルギー性クレンジングバー； 軟膏； 発泡体； 注射液； 無水で、好ましくは液体、ペースト状または固体状の製品、例えばスティック状、特に口紅の形態； 粉末；及び錠剤からなる群から選ばれる形態で調合される。

添付図において：
−図１は、ＮＲＡＧＥタンパク質の配列と構造を示す；
−図２は、ツーハイブリッド相互作用に関して実施例２で得られた結果の平均を示す；
−図３は、再構成皮膚中のＬＯＸとＮＲＡＧＥの存在の同定を示す；
−図４は、共焦点顕微鏡によるヒト皮膚切片上のＬＯＸとＮＲＡＧＥの位置の観測結果である；
−図５は、９１齢のドナーのヒト皮膚切片上のＬＯＸとＮＲＡＧＥの検出を示す；
−図６は、移植片対宿主反応の患者の皮膚上のＬＯＸとＮＲＡＧＥの検出を示す；
−図７は、基底細胞型または有棘細胞型癌の患者の皮膚上のＬＯＸとＮＲＡＧＥの検出を示す；
−図８は、扁平苔癬患者の皮膚上のＬＯＸとＮＲＡＧＥの検出を示す；
−図９は、乾癬患者の皮膚中のＬＯＸとＮＲＡＧＥの位置の同定を示す；
−図１０は、湿疹患者の皮膚中のＬＯＸとＮＲＡＧＥの位置の同定を示す；
図１１は、エバンスブルーを用いた再構成皮膚グローバルラベリング（表皮層：赤、細胞：青、皮膚基質繊維：赤、真皮表皮接合部：点線）を示す。
図１２は、再構成の皮膚上のサイトケラチン１０の免疫組織学的な検出（強い発現の細胞：赤ラベル、核：青、真皮表皮接合部：点線）を示す。
図１３は、再構成の皮膚上のトランスグルタミナーゼの免疫組織学的検出（強い発現の細胞：赤ラベル、核：青、真皮表皮接合部：点線）を示す。

本発明の他の目的や特徴、利点は、以下の実施例中の説明により、当業界の熟練者には明らかとなろう。ただし、これらは、単に説明のためのものであり本発明の範囲をなんら限定するものではない。

これらの実施例は、本発明の不可欠な要素であり、本明細書の実施例を含むすべてに記載されている、先行技術と比較して新規ないずれの性質も、その機能及びその一般的な用途に関して、本発明の不可欠の要素を構成する。

各実施例は、ある一般的な範囲を有している。

また以下の実施例において、特に断りのない限り、すべての百分率は、質量ベースであり、温度は、摂氏温度であり、圧力は気圧である。

実施例１：酵母ツーハイブリッド法のよるＮＲＡＧＥのクローニング
本発明では、まず、ケラチン合成細胞におけるＬＯＸの潜在パートナーを調べた。酵母ツーハイブリッド法（Ｙ２Ｈ）を用いた。このＹ２Ｈ法で、「ルア」タンパク質と「標的」潜在パートナーとの間の相互作用の存在とその性質の把握が可能となる。このケースの場合、ルアは、Ｇａｉ４遺伝子のＤＮＡ結合ドメイン（ＢＤ）に融合した成熟ＬＯＸ領域である。一個あるいは複数の標的は、ヒトケラチン合成細胞の相補ＤＮＡライブラリによりコードされている遺伝子であり、Ｇａｌ４遺伝子の活性化ドメイン（ＡＤ）に融合しているものである。ルア（ＬＯＸ）のドメインとライブラリ配列でコードされているドメインとの間の相互作用により、Ｇａｌ４プロモーターの結合と活性化され、ＡＨ１０９酵母に栄養素要求性を与える各種の遺伝子の制御可能となり、欠乏培地での成長が可能となり、ガラクトシダーゼ活性を活性化が可能となる。このように、相互作用を示すものを選定するこの方法により、ＬＯＸへの候補パートナーであるタンパク質をコードする遺伝子である、細胞内タンパク質の黒色腫関連抗原Ｄ１（ＭＡＧＥ−Ｄ１）またはＮＲＡＧＥが同定された（図１）。

ルアのＧＡＬ４ ＢＤ−ｈＬＯＸｍａｔ（ヒト成熟ＬＯＸ）を用いた、酵母ツーハイブリッド法によるケラチン合成細胞のライブラリのスクリーニング
ベクターＰＧＡＤ−１０中の正常ヒト皮膚ケラチン合成細胞のｃＤＮＡライブラリを用いた。このスクリーニングに選択したルアは、信号ペプチドまたはプロ領域を持たないＬＯＸ酵素のヒトｃＤＮＡ領域によりコードされるＬＯＸｍａｔであった。この塩基配列を、ベクターＰＢＤ−Ｇａｌ４ Ｃａｍ中のＧＡＬ４転写因子のＤＮＡ結合ドメイン（ＢＤ）に挿入した。挿入するＬＯＸフラグメント＋４９４〜＋１２５４を、ＰＣＲ （ポリメラーゼ連鎖反応）で増幅し、ベクターｐＧａｌ４−ＢＤのＧａｌ４結合ドメインに、次のプライマーを用いて挿入した：

１） ｇｇｇ ａｔｅ ｃｇｃ ａｔｇ ｇｔｇ ｇｇｃ ｇａｃ ｇａｃ （ＢａｍＨＩを導入）
２） ｔｔｇ ｔｃｇ ａｃｔ ａａｔ ａｃｇ ｇｔｇ ａａａ ｔｔｇ ｔｇｃ （保存されたストップにＳａｌＩを導入）。

増幅されたフラグメントを、まずベクターＴＯＰＯに導入し、ついでｐＧａｌ４−ＢＤに挿入した。ＢＤ−ＬＯＸｍａｔ融合タンパク質の発現を確認するため、このＡＨ１０９酵母をルアプラスミドＰＢＤ−ＬＯＸｍａｔで形質転換させた。

この形質転換された酵母をスクリーニングした。ＡＨ１０９酵母６．８８ ×１０⁶ｃｆｕ（欠乏培地で培養）中、アデニン、ヒスチジン、トリプトファ及びロイシン欠乏培地で成長するクローンを８０種選択し、うち増殖が強い２３種を保存した。

実施例２：哺乳類ツーハイブリッド法（Ｍ２Ｈ）によるＬＯＸとＮＲＡＧＥとの間の相互作用の確認
Ｈｅｌａ細胞にプラスミドのｐＡｃｔとｐＡｃｔ−ＮＲＡＧＥを移入させるとともに、別途リポフェクタミンの存在下、 ｐＢｉｎｄとｐＢｉｎｄ−ＬＯＸｍａｔを移入させた。４８時間後にルシフェラーゼ活性を試験し、その結果を、コントロールに対するルシフェラーゼ活性比率（空ｐＢｉｎｄベクター）で表した。この実験を三回繰返し、その結果の平均を図２に示した。

実施例１で酵母ツーハイブリッドスクリーニングに使用したｈＬＯＸ配列を、哺乳類用ツーハイブリッド相互作用用のｐＢｉｎｄベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＵＳＡ）中のＧａｌ４結合ドメインに挿入した。

次いで、ＮＲＡＧＥルアをｐＡｃｔベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）中のＶＰ１６Ｇａｌ４活性化ドメインに挿入した。挿入は、アミノ酸１５２ （ヌクレオチド４５８）から出発する。

実施例３：哺乳類細胞中でのＬＯＸとＮＲＡＧＥとの共免疫沈降
Ｃｏｓ７細胞（哺乳類腎臓上皮細胞）に、コンストラクトｐｃＬＯＸ３２−Ｖ５Ｈｉｓ （ＬＯＸ）、ｐｃＬＯＸ３６−Ｖ５ＨｉｓまたはｐｃＬＯＸ２７−Ｖ５Ｈｉｓを用いて、ＬＯＸ遺伝子 （ヒト完全、ヒト成熟領域及びマウス成熟領域）を共移入させ、またコンストラクトｐＮＭ３−ＨＡ （完全なＮＲＡＧＥ）またはｐＮＭ７−ＨＡ （ＩＲＤ領域）を用いてＮＲＡＧＥ遺伝子を共移入させる。遺伝子の移入は、リポフェクタミンを用いて、直径が１００ ｍｍのペトリ皿中で行う。４８時間後、移入後の細胞は、５００μｌの溶解バッファー中で溶解する。細胞溶解液中のタンパク質を、抗Ｖ５モノクローナル抗体または抗ＨＡモノクローナル抗体とともに培養する。これらの抗Ｖ５または抗ＨＡモノクローナル抗体は、４℃の細胞溶解液に、１／２５０の比率で、１時間３０分かけて攪拌しながら添加する。

このようにして形成した免疫錯体（ＩＣ）は、プロテインＧ−セファロースも用いて、１時間かけて４℃で振盪しながら沈殿させる。溶解バッファーで１０分間の洗浄を三回繰り返し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥバッファーで溶出したのち、全免疫錯体を１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で電気泳動にかけ、ウェスタンブロッティングを行う。免疫錯体をＰＶＤＦ （ポリフッ化ビニリデン）膜に転写し、現像する。

−ＮＲＡＧＥには、１／１０００希釈の抗ＨＡ抗体、次いで１／２０，０００希釈の抗マウス−ＨＲＰ （ホースラディッシュペルオキシダーゼ）を使用する。
−ＬＯＸには、１／５０００希釈抗Ｖ５−ＨＲＰを使用する。

最終的な検出は、ＨＲＰの化学発光でおこなう。

得られた結果は、完全な形のＮＲＡＧＥ（ＮＭ３−ＨＡ）が、ヒト完全ＬＯＸ（ＬＯＸ３２Ｈ）、成熟ヒトＬＯＸ（ＬＯＸ ３６Ｈ）、及び成熟マウスＬＯＸ（ＬＯＸ２７Ｈ）と共免疫沈澱を起こすことを示す。さらに、ＮＲＡＧＥ（ＮＭ７−ＨＡ）は、ＩＲＤ領域に相当するが、同様に、これらの３つの遺伝子組み換えタンパク質と共免疫沈澱し、この領域が相互作用に関与していることを示す。

実施例４：免疫組織化学による再構成の皮膚モデル内のＬＯＸとＮＲＡＧＥの存在の確認
正常のヒト繊維芽細胞を接種した皮膚材料（コラーゲン／グリコサミノグリカン類／キトサン、ミメディスク（Ｒ）、エンゲルハード、リヨン、フランス）で作成した再構成皮膚モデル（「ミメムスキン」、エンゲルハード、リヨン、フランス）を使用し、その表面に正常ヒトケラチン合成細胞を載せて、この確認を行う。

気液界面に暴露してケラチン合成細胞の分化をさせながら４５日間培養後、試料をブワン固定液またはホルムアルデヒドで固定し、次いでパラフィンで覆う。

切片を、以下に述べる抗体で免疫ラベルする。

−Ｓｏｍｍｅｒ ｅｔ ａｌ． （マウス住血吸虫症における肝臓筋線維芽細胞によるリジルオキシダーゼの一時的な発現、Laboratory Investigation, 69, 460-470, 1993）に記載の方法により精製した上記抗ＬＯＸ抗体、
−抗ＮＲＡＧＥ抗体（ヤギポリクローナルＩｇＧ）
−ウサギ抗ヤギ第二抗体。

これらの免疫錯体は、ジアミノベンジジンを基質として用い、ヘマトキシリンで後染色することにより、ペルオキシダーゼ共役型抗ウサギＩｇＧで検出する。

図３は、再構成皮膚上でのＬＯＸとＮＲＡＧＥの免疫組織化学的な検出を示すものである。

真皮表皮接合部の位置を実線で、皮膚基板の位置を矢印で、ケラチン合成細胞の位置を矢じりで示す。

ＬＯＸの発現は、基底細胞層から上方に認められ、基底上細胞層には存在するが、分化した層ではどんどん消失していく。 ＮＲＡＧＥの発現は少しシフトしている。これは、非増殖性基底上細胞層から上方に発現し、顆粒層及び角質層で大きく増加し、ここではＬＯＸは発現されていない。

これらのタンパク質は、再構成皮膚のマイムスキン（Ｒ）モデルの表皮の非増殖性基底上細胞層に、付随している。正常のヒト皮膚上でも、免疫組織学（ＩＨ）的にこの共存が確認された。

本発明者らは、ＬＯＸとＮＲＡＧＥタンパク質が、表皮中で、有棘細胞層中の共存位置ゾーンで発現されていることを示した。

実施例５：共焦点顕微鏡法による正常ヒト皮膚中のＬＯＸとＮＲＡＧＥとの共存の確認
手術的に切除して得た正常ヒト皮膚試料（包皮）の凍結切片を調整した。
実施例４の抗ＬＯＸと抗ＮＲＡＧＥの第一抗体を用いて、ＬＯＸとＮＲＡＧＥの発現を検出した。

使用した第二の抗体は以下の通りである：
−ロバ抗ウサギＩｇＧ−ＦｌＴＣ、緑フルオレセインラベル用、
−ロバ抗ヤギＩｇＧ−Ｒ、赤ローダミンラベル用。

第一抗体の非存在下で、ネガティブコントロールを調整した。

二重ラベリングを、ＺＥＩＳＳ ＡＸＩＯＰＬＡＮ ２ ＬＳＭ５１０共焦点直立顕微鏡を用いて観察した。なお、画像は、画像ブラウザソフトウェアのＺＥＩＳＳ ＬＳＭ５を用いて獲得した。

図４は、共焦点顕微鏡法による正常のヒト皮膚中のＬＯＸとＮＲＡＧＥの免疫検出を示す。

この観察により、実施例４の結果が確認され、正常のヒト皮膚の表皮の有棘細胞層におけるＬＯＸとＮＲＡＧＥとの共存とＬＯＸとＮＲＡＧＥのほぼ完全な並列発現が示された。細胞レベルでの観察の結果、ＬＯＸとＮＲＡＧＥが細胞の周辺（周辺亜膜性ゾーン）に現れ、ＮＲＡＧＥは細胞質にも出現することが明らかとなった。

したがって、本発明者らは、インビトロで認められる直接相互作用の条件を、双方のＬＯＸとＮＲＡＧＥの両方が存在するゾーンの表皮中において満たすことができることを示した。

実施例６：年齢の異なる人の皮膚中のＬＯＸとＮＲＡＧＥの位置の確認
異なる年齢グループ（２０才未満と６０才を超える）に属する人の皮膚の切片を用いて、実施例４に記載の方法による免疫組織学的な検討を行った。

図５は、９１才のドナーの皮膚で実施したラベリングを示す。この観察結果は、非常に薄い低増殖性の表皮（数枚の細胞層まで減少）と高ケラチン化を示している。

本発明者らは、ＬＯＸが全く存在しない（使用した方法で検出可能な量）ことを見出した。他方、ＮＲＡＧＥは強く発現されており、細胞質にまた第一基底上細胞層から上方に発現の傾斜なしに存在していた。

実施例７：移植片対宿主反応（ＧＶＨ）の患者の皮膚中のＬＯＸとＮＲＡＧＥの検出
実施例４に記載の方法により移植片対宿主反応（ＧＶＨ）の患者のヒト皮膚の切片を用いて免疫組織学的検討を行った。この試験には５人の異なるドナーが参加した。

図６は、表皮中でのほほ完全なＬＯＸの消滅（真皮における発現は不変）と細胞質及び第一基底上細胞層から上方における非常に多量のＮＲＡＧＥの存在とを示している。

実施例８：基底細胞型癌と有棘細胞型癌の患者の皮膚中のＬＯＸとＮＲＡＧＥの検出
実施例４に記載の方法により基底細胞癌または有棘細胞癌を呈する患者の皮膚試料を用いて免疫組織学的研究を行った。

図７は、両種の癌において次のことを示している：
−腫瘍の周辺の表皮中でのＬＯＸとＮＲＡＧＥの発現の漸減
−表皮の侵襲性の細胞中におけるＬＯＸとＮＲＡＧＥの非存在、
−腫瘍の周囲の皮膚の間質反応におけるＬＯＸの強固な発現、
−腫瘍の周囲の皮膚の間質反応におけるＮＲＡＧＥの非存在。

実施例９：扁平苔癬患者の皮膚中のＬＯＸとＮＲＡＧＥの検出
実施例４に記載の方法により扁平苔癬の患者三人の皮膚の切片を用いて免疫組織学的研究を行った。

図８に、表皮中でのＬＯＸの発現の大幅な減少または完全な消失が示されている。この変動は表皮中でのＮＲＡＧＥの発現の変動と対応している。

実施例１０：乾癬患者の皮膚におけるＬＯＸとＮＲＡＧＥの位置の特定
実施例４に記載の方法により乾癬患者五人の皮膚切片を用いて免疫組織学的研究を行った。

図９に、観察したすべての切片を示すが、表皮中でのＬＯＸの非常に強固な発現とＮＲＡＧＥのいくらかの存在が認められる。また、当該ゾーンはかなり均一にラベリングされており、発現の傾斜は認められない。発現強度が通常の値から反れるというこのような特徴は、問題のタンパク質の位置に影響を与えるもっと重要な異常と関連している。したがって、乾癬の皮膚の場合、ＬＯＸは特に表皮の下方部分で殆ど発現され、ＮＲＡＧＥは上方部分で発現されるが、これらのタンパク質の発現は、健全な皮膚では通常認められる重複ゾーンなしにシフトする。細胞レベルでは、ＮＲＡＧＥは細胞質のみに観測され、周辺の亜膜性ゾーンには観測されない。

実施例１１：湿疹患者の皮膚におけるＬＯＸとＮＲＡＧＥの位置の特定
実施例４に記載の方法により湿疹患者の皮膚を用いて免疫組織学的研究を行った。

図１０では、表皮の細胞周囲での非常に強固なＬＯＸの発現が認められる。他方、ＮＲＡＧＥの発現は弱く、細胞質のみに観測される。このことは、細胞レベルでこれらが共存しなくなっていることを反映している。

実施例１２：アポトーシスの阻害に対するＬＯＸの関与の特定
試験は、コンフルエンス状態の分化ヒトケラチン合成細胞の単層培養上で行った。通常条件下又は好アポトーシス性条件（４５℃±０．５℃の温度に１時間３０分暴露の熱ショック）下で、β−ＡＰＮ （０．０２％ｗ／ｖ（重量／体積））を添加して活性を阻害することでＬＯＸのアポトーシスに与える影響を特定した。

アポトーシスによる細胞死を、ＴＵＮＥＬ法（末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ仲介ｄＵＴＰニック末端標識）を用いて検出・定量した。なお、この方法は、アポトーシスを伴うＤＮＡ欠失の標識によるものである。

第一段階では、ＤＮＡ切断箇所をＴｄＴで標識する（末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ、ＤＮＡの遊離の３’ＯＨ末端にフルオレセインで標識をしたヌクレオチドを重合する反応を触媒する）。第二段階では、フルオレセインにアルカリフォスファターゼ共役型抗フルオレセイン抗体を加えて培養することでフロオレセインを検出する。

この実験は、ＤＮＡをＤＮａｓｅ溶液でフラグメント化して得られるポジティブコントロールとリン酸緩衝液に添加したネガティブコントロールとを用いて確認される。

得られた結果を、以下の表に示す。

この結果は、次のことを示している。

−熱ショック（４５℃±０．５℃、１時間３０分）が大きく細胞のアポトーシスを誘導する。
−ｐ−ＡＰＮによるＬＯＸの酵素活性の阻害によりアポトーシスが大きく増加する。

これらの結果は、ＬＯＸ活性の抗アポトーシス的な効果を示している。

実施例１３：カルシウム培地中での培養における活性を試験する活性成分の接触の有無とは無関係に、分化ケラチン合成細胞によるＬＯＸとＮＲＡＧＥメッセンジャーＲＮＡの発現の分析（分析は、例えば定量的ＲＴ−ＰＣＲと活性成分のスクリーニングで実施）
これらの活性成分は、若い被験者の正常ヒト包皮のケラチン合成細胞 （正常のヒト包皮の表皮ケラチン合成細胞のコレクション、クローンチクス）を用いて試験した。

これらのケラチン合成細胞を、抗生物質を添加したＫ−ＳＦＭ （ケラチン合成細胞無血清培地）中で３７℃、５％のＣＯ₂下で三回増幅する。

細胞は、例えば９６ウェル板上で培養し、４０，０００細胞／ｃｍ²の濃度から約８０％コンフルエンスまで培養する。これらの細胞は、高カルシウム培地（１．７ｍＭ−ＣａＣｌ₂、３７℃、５％のＣＯ₂）で培養し、細胞分化を誘導した。

活性成分を調整するのに使用した出発原料が植物（好ましくは、根、茎、皮、花、果実、種子、胚、樹脂、浸出物、葉または植物全体）またはタンパク質の場合は、放射線、例えばベータ線またはガンマ線で、好ましくは５ｋＧｙの用量で滅菌してもよく、また滅菌しなくてもよく、その後、必要なら、例えば室温で粉砕して粉末としてもよい。この粉末を、２〜５％（重量）、好ましくは５％の濃度で、水またはブチレングリコールなどの極性溶媒及び／又は極性溶媒の混合物中に、好ましくは水とアルコールグリコールまたはポリオール（例えば、エタノール、グリセリン、ブチレングリコール、他のグリコール、キシリトール等）との任意の比率の混合物中に、更に好ましくは、７５／２５または５０／５０の比率の水／ブチレングリコール混合物、またはアルカンなどの非極性溶剤、非極性溶剤の混合物、または極性溶媒と非極性溶剤の混合物中に分散する。少なくとも２時間、攪拌、例えば磁気攪拌後、試料を、デカンテーションまたは遠心分離で清澄化させ、好ましくは０．４５μｍまたは０．２２μｍのフィルターで濾過する。

活性成分の調整に使用した出発原料が組成のはっきりとした分子（例えば、合成分子または半合成分子、精製して得られた生体内分子）である場合は、溶剤に、好ましくは水またはスルホキシドに溶解する（濃度は、その分子にもよるが、好ましくは１０⁶Ｍ〜１０²Ｍで、特に好ましくは１０⁴Ｍのオーダー、または好ましくは１重量％〜５重量％）。得られた溶液は、次いで好ましくは０．４５μｍまたは０．２２μｍフィルターで濾過する。

上記の方法のいずれかにより得られた活性成分は、最終濃度が好ましくは０．０１％体積／体積（ｖ／ｖ）〜１０％ （ｖ／ｖ）、好ましくは０．１％〜１％ （ｖ／ｖ）、例えば１％（ｖ／ｖ）で試験される。

細胞存在下の培養は、好ましくは、高カルシウムＫ−ＳＦＭ中で無増殖因子で２４時間実施される。この細胞をリン酸緩衝液ｐＨ ７．４で洗浄後、−８０℃で凍結乾燥する。
トータルＲＮＡの抽出
トータルＲＮＡは、ＳＶトータルＲＮＡ分離システム（プロメガ、メラン、フランス）を用い、 製造業者の方法に準じて、９６ウェル板条件で抽出した。

遺伝子の発現は、各遺伝子のアクチン（ハウスキーピング遺伝子）に対する相対的発現量を測定し、未処理ネガティブコントロールの％で表示し、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲで調整した。

定量リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ（Ｑ−ＲＴ−ＰＣＲ）
５ｎｇ／μｌで１０μｌのトータルＲＮＡを、４０μｌのＰＣＲミックス（２５μｌのＳＹＢＲグリーンバッファーミックス２×、０．５μｌの酵素ミックス、最終濃度が０．５μＭのセンスプライマーと、最終濃度が０．５μＭのアンチセンスプライマーと、ＲＮａｓｅとＤＮａｓｅを含まない水からなる、合計：４０μｌ）に添加する。

ＲＴ−ＰＣＲは、５０℃、３０分のレトロ転写、９５℃、１５分のポリメラーゼ活性化、及びＰＣＲサイクルの実施（９５℃、１５秒； ６０℃、３０秒； ７２℃、３０秒）×５０サイクルからなる異なるステップで進行する。

融合曲線の作成
９０℃、１分
３０℃、１分
５０℃〜９５℃、１０ ｓ／℃（融合曲線）
刺激率または阻害率（百分率）は、未処理のコントロール（試験物質の非存在下）に対するものである。

アクチン遺伝子−ハイブリダイゼーション６０℃
センス：ＧＴＧＧＧＧＣＧＣＣＣＣＡＧＧＣＡＣＣＡ
アンチセンス：ＣＴＣＣＴＴＡＡＴＧＴＣＡＣＧＣＡＣＧＡＴＴＴＣ
ＬＯＸ遺伝子−ハイブリダイゼーション６０℃
センス：ＡＣＧＴＡＣＧＴＧＣＡＧＡＡＧＡＴＧＴＣＣ
アンチセンス：ＧＧＣＴＧＧＧＴＡＡＧＡＡＡＴＣＴＧＡＴＧ
ＮＲＡＧＥ遺伝子−ハイブリダイゼーション６０℃
センス：ＴＧＣＡＣＡＧＡＣＡＴＣＡＧＣＡＧＡＴＧＧ
アンチセンス：ＴＴＣＡＣＧＧＡＴＧＡＴＡＴＣＴＣＴＣＡＧＣ
インボルクリン遺伝子−ハイブリダイゼーション６０℃
センス：ＴＧＴＴＣＣＴＣＣＴＣＣＡＧＴＣＡＡＴＡＣＣＣ
アンチセンス：ＡＴＴＣＣＴＣＡＴＧＣＴＧＴＴＣＣＣＡＧＴＧＣ

存在する細胞集団を考慮して、すべての結果は、ハウスキーピング遺伝子として用いた「アクチン」信号と比較した。実験によっては、Ｃ（Ｔ）の測定閾値（サイクル閾値）は、Ｔが０．０５〜０．０１の値に固定した。また、各々の遺伝子に対する測定単位は、下記式により求めた。

Ｓｇｅｎｅ＜＜Ｘ＞＞１０⁷ ×（１／２）^{C(T)gene<<X>>}

Ｃ（Ｔ）ｇｅｎｅ＜＜Ｘ＞＞は、遺伝子＜＜Ｘ＞＞が蛍光閾値の０．０１〜０．０５に達するのに必要なサイクル数を表す。

これらの対象遺伝子の数値は、次の比率で計算した「アクチン」信号と比較した。

Ｒ ＝ Ｓｇｅｎｅ＜＜Ｘ＞＞／Ｓａｃｔｉｎ

これらの比率を、処理品と未処理品とで比較した。ただし、＜＜Ｘ＞＞は、アクチン、ＬＯＸまたはＮＲＡＧＥ遺伝子である。

活性成分のスクリーニング

各アッセイのｃＤＮＡの量を、アクチンｃＤＮＡの量、またさらにネガティブコントロール（活性成分を含まない）と比較する。測定された効果が約２倍に達する場合、この結果はかなり大きいと考えられる。調べた１２０種の活性成分のうち、３種が試験濃度で本条件下のこれらの基準を満たした。これらの活性成分を下の表に示す。

好ましくは、このマオウエキスは、植物全体の抽出によるものであり、特に水または水／ブチレングリコール混合物（例えば、７５／２５または５０／５０）、好ましくは水などの極性溶媒で抽出したものであることが好ましい。

このホップエキスは、球果を、特に水または水／ブチレングリコール混合物（７５／２５または５０／５０）、好ましくは水などの極性溶媒で抽出したものが好ましい。

このダイズエキスは、種子を、特に水またはａ水／ブチレングリコール混合物（７５／２５または５０／５０）、好ましくは水などの極性溶媒で抽出したものが好ましい。

結論
本条件下で考察した１２０種の活性成分の中で、
−１活性成分は、 ＮＲＡＧＥとＬＯＸをコードする遺伝子のｍＲＮＡの合成速度を大きく増加させることができる。

−１活性成分は、ＮＲＡＧＥをコードする遺伝子のｍＲＮＡの合成速度をかなり大きく増加させることができるが、ＬＯＸをコードする遺伝子には効果がない。
−また、１活性成分は、ＬＯＸをコードする遺伝子のｍＲＮＡの合成速度をかなり大きく増加させるが、ＮＲＡＧＥをコードする遺伝子には効果がない。

この研究により、増殖と分化とアポトーシスのバランスを、少なくともケラチン合成細胞でのそれを調整することのできる活性成分の選択が可能となった。

マオウエキスは、例えば癌、好ましくは皮膚上皮癌（基底細胞または有棘細胞）、または扁平苔癬などの疾患の治療に使用でき、また場合によっては、特定の皮膚のＧＶＨの症状の治療や皮膚の加齢効果の低下に使用できる。

ダイズエキスは、皮膚上皮癌（基底細胞または有棘細胞）などの癌、ＧＶＨまたは扁平苔癬のなどの疾患の治療に使用でき、また加齢の治療予防に使用できる。ダイズエキスは、特に細胞の過剰増殖の治療に使用できる。

ホップエキスは、例えば、皮膚上皮癌（基底細胞のまたは有棘細胞）などの癌や湿疹または乾癬なとの疾患の治療に使用できる。ホップエキスは特に、細胞の増殖低下の治療に使用できる。

ダイズエキスとホップエキスは、皮膚上皮癌（基底細胞または有棘細胞）などの癌または苔癬などの疾患の治療に併用できる。

ダイズエキスとマオウエキスは、皮膚上皮癌（基底細胞のまたは有棘細胞）などの癌や扁平苔癬の治療に併用できる。

ホップエキスとマオウエキスは、例えば皮膚上皮癌（基底細胞のまたは有棘細胞）などの癌や扁平苔癬などの疾患の治療に併用できる。

実施例１４：定量的ＲＴ−ＰＣＲによる、カルシウム分化中のケラチン合成細胞上でのＮＲＡＧＥとＬＯＸのメッセンジャーＲＮＡの発現の速度論的解析と活性成分の発現速度に及ぼす影響
８０％コンフルエンスで細胞を得るのに使用した実験条件は、実施例１３に記載のものと同じである。カルシウム（１．７ｍＭのＣａＣｌ₂）と活性成分の存在下で分化が起こる。分析は、培養２日、３日及び４日後にＱ−ＲＴ−ＰＣＲ （実施例１３に記載の方法）で行った。

このようにして、他の九種の物質を試験した。そのうちの一つのシナモンエキスは、検討した実験条件下では、ＬＯＸとＮＲＡＧＥの両方に対して阻害した。

好ましくは、このシナモンエキスは、茎の抽出、特に水または水／ブチレングリコール混合物（７５／２５または５０／５０）、好ましくは水などの極性溶媒で抽出して得る。

結論
シナモンエキスは、例えば、乾癬などの疾患の治療に使用できる。

シナモンエキスとダイズエキス（その効果は前記実施例で検出）は、例えば、特定の皮膚のＧＶＨの症状、湿疹または乾癬等の疾患の治療や、または皮膚の加齢効果の低下に併用できる。

実施例１５：試験対象の活性成分との接触に有無とは無関係に、カルシウム分化非存在下での培養におけるケラチン合成細胞によるＬＯＸメッセンジャーＲＮＡの発現の解析（例えば定量ＲＴ−ＰＣＲと活性成分スクリーニングによる分析）
手術的切除によるヒト生検の酵素抽出により若い被験者から得た正常のヒトケラチン合成細胞を用い、抗生物質を添加したＫ−ＳＦＭ培地（ケラチン合成細胞血清を含まないサプリメント含有培地）中で、３７℃、５％のＣＯ₂下で、単層として培養したものを用いて活性成分を試験した。

この細胞を、２４−ウェル板上で、例えば３００００細胞／ｃｍ²から約９５％コンフルエンスまで二回培養する。試験対象の活性成分の接触前に、細胞層を、リン酸緩衝液ｐＨ７．４、好ましくはカルシウム及びマグネシウム添加緩衝液で、または抗生物質以外のサプリメントを含まないＫ−ＳＦＭ培地で希釈した参照ポジティブコントロールで洗浄する。

いろいろな起源の活性成分（例えば、植物性、バイオテクノロジー由来または合成分子）を、０．１％体積／体積（ｖ／ｖ）〜１％（ｖ／ｖ）で試験した。植物由来の活性成分は、例えば１％（ｖ／ｖ）で、合成分子は、例えば０．１％（ｖ／ｖ）で試験した。

特に、植物性由来の活性成分は、溶剤または溶媒混合物に、好ましくは１００：０〜０：１００の水／（アルコール、グリコールまたはポリオール） （例えば、エタノール、グリセリン、ブチレングリコール、他のグリコール、キシリトール等）混合物に、植物（好ましくは根、根茎、茎、皮、花、果実、種子、胚または葉）を２〜５％（ｗ／ｗ）で浸漬することで得られるエキスである。この得られたエキスから濾過又は蒸留により可溶性画分を得て、さらに好ましくは０．４５μｍで濾過する。バイオテクノロジー的加水分解物は、微生物の存在下で、好ましくは乳酸桿菌またはサッカロミセス族の微生物の存在下で植物エキスを発酵することで得られる。これらの加水分解物は、好ましくは０．４５μｍのフィルターで濾過する。

培養は、好ましくは抗生物質を含み増殖因子を含まないＫ−ＳＦＭ培地中で、３７℃、５％のＣＯ₂下で２４時間実施する。ネガティブコントロールは、培養培地そのもの、または試験エキスを抽出の方法に用いた溶媒を０．１％ （ｖ／ｖ）〜１％ （ｖ／ｖ）含む培養培地である。細胞分化の誘導に用いられる参照のポジティブコントロールは、塩化カルシウム溶液（ＣａＣｌ₂：最終濃度：１．７ｍＭ）である。

未処理の細胞（ＮＴコントロール）は、ｐＨ７．４のリン酸緩衝液で洗浄後 −８０℃で凍結乾燥する。活性生物またはコントロールの存在下に２４時間処理後、細胞ｓをｐＨ７．４のリン酸緩衝液で洗浄後 −８０℃で凍結乾燥する。

トータルＲＮＡの抽出
トータルＲＮＡは、ＳＶトータルＲＮＡ分離システム（プロメガ、メラン、フランス）を用いて、製造業者の方法に準じて２４ウェル板の条件で抽出した。

遺伝子発現の調整を、アクチン（ハウスキーピング遺伝子）に対する各遺伝子の相対発現量を測定して、未処理のネガティブコントロール（ＩＳＴ）の％で表示して、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲにより行った。

定量リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ（Ｑ−ＲＴ−ＰＣＲ）
１０μｌの５ｎｇ／μｌ濃度のトータルＲＮＡを、４０μｌのＰＣＲミックス（２５μｌのＳＹＢＲグリーンバッファーミックス２×、０．５μｌの酵素ミックス、最終濃度が０．５μＭのセンスプライマーと最終濃度が０．５μＭのアンチセンスプライマーと、ＲＮＡｓｅとＤＮａｓｅを含まない水からなり、合計：４０μｌ）に添加した。

ＲＴ−ＰＣＲは、５０℃、３０分のレトロ転写と、９５℃、１５分のポリメラーゼ活性化、ＰＣＲサイクル（９５℃−１５秒、６０℃−３０秒、７２℃−６３秒、７８℃−３０秒）×５０サイクルをからなる異なる工程で実施した。

溶融曲線の作成
９０℃、１分
３０℃、１分
５０℃ 〜 ９５℃、１０秒／℃ （溶融曲線）

使用したプライマー：
アクチン遺伝子−ハイブリダイゼーション、６０℃
センス：ＧＴＧ ＧＧＧ ＣＧＣ ＣＣＣ ＡＧＧ ＣＡＣ ＣＡ
アンチセンス：ＣＴＣ ＣＴＴ ＡＡＴ ＧＴＣ ＡＣＧ ＣＡＣ ＧＡＴ ＴＴＣ
ＬＯＸ遺伝子−ハイブリダイゼーション、６０℃
センス：ＡＣＧ ＴＡＣ ＧＴＧ ＣＡＧ ＡＡＧ ＡＴＧ ＴＣＣ
アンチセンス：ＧＧＣ ＴＧＣ ＧＴＡ ＡＧＡ ＡＡＴ ＣＴＧ ＡＴＧ

存在する細胞集団を考慮して、すべての結果は、ハウスキーピング遺伝子として用いた「アクチン」信号と比較したものである。実験により、０．０５〜０．０１のＴに対する閾値Ｃ（Ｔ）（サイクル閾値）を決定し、次いで、各遺伝子に対する任意の測定単位を次式により求めた：

Ｓｇｅｎｅ“ＬＯＸ”１０⁷×（１／２）Ｃ（Ｔ）ｇｅｎｅ“ＬＯＸ”

なお、Ｃ（Ｔ）ｇｅｎｅ“ＬＯＸ”は、“ＬＯＸ”遺伝子の蛍光閾値が０．０１〜０．０５に達するのに必要なサイクル数を意味する。

これらの対象遺伝子の値は、次式で求めた「アクチン」信号に対する相対比率である。

Ｒ ＝ Ｓｇｅｎｅ“ＬＯＸ”／ Ｓａｃｔｉｎｅ

これらの比率は、処理物と未処理物間で比較した。

活性成分のスクリーニング
各試験のｃＤＮＡ量は、アクチンのｃＤＮＡ量に対する相対値であり、またネガティブコントロール（ＮＴ）に対する相対値である。測定効果が約２倍（刺激）または０．５倍（阻害）の変動である場合、この結果は大きいと考える。試験した６０種の活性成分のうち、３０種は、上記の条件下でこの基準に合致する。これらの活性成分は、次のようなもので、次式にまとめる。

結論
考慮した条件下では、手持ちの６０種の活性成分中で、
−３種の活性成分が、ＬＯＸをコードする遺伝子のｍＲＮＡの合成速度を大きく阻害することが可能であった。
−２８種の活性成分は、ＬＯＸをコードする遺伝子のｍＲＮＡの合成速度を大幅に増加させることが可能であった。

この研究で、増殖と分化とアポトーシスの平衡を、少なくともケラチン合成細胞レベルで変化させることが可能な活性成分を選択することができた。

実施例１６：再構成皮膚モデルにおける、活性を調べたい活性成分との接触の有無による、表皮の分化／増殖／恒常性の調節に関与するタンパク質の発現の組織学的分析（マオウエキスで例示）
正常のヒト繊維芽細胞を接種した皮膚の基質（コラーゲン／グリコサミノグリカン／キトサン（ＭＩＭＥＤＩＳＫ（登録商標）、エンゲルハード、リヨン、フランス）から調整した再構成皮膚モデル（ＭＩＭＥＳＫＩＮ（登録商標）、エンゲルハード、リヨン、フランス）において、増殖または分化のラべリングを行った。なお、表面に接種した細胞は、手術的切除で得た生検を酵素処理して抽出して得た正常ヒトケラチン合成細胞である。

この再構成皮膚モデルは、特に次の方法により調整した：
０．５〜１．１０⁶個の正常ヒト皮膚の繊維芽細胞をコラーゲン／グリコサミノグリカン／キトサンからなるマトリックス基質に接種し、ある栄養培地、例えば１０％コウシ血清、アスコルビン酸、好ましくは最終濃度で１ｍＭ； ＥＧＦ（表皮成長因子）、好ましくは最終濃度で１０ｎｇ／ｍｌ：ノルモシン、好ましくは最終濃度で１００μｇ／ｍｌを含むＤＭＥＭ−グルタマックス中で２１日間培養した。

０．５〜１．１０⁶個の正常ヒト皮膚の繊維芽細胞を、この皮膚等価物に接種し、栄養培地、例えばコウシ血清、アスコルビン酸、好ましくは最終濃度が１ｍＭ； ＥＧＦ（表皮の増殖因子）、好ましくは最終濃度が１０ｎｇ／ｍｌ；ハイドロコルチゾン、好ましくは最終濃度が０．４／μｇ／ｍｌ；ウムリン、好ましくは最終濃度が０．１２ＩＵ／ｍｌ；イスプレル、好ましくは最終濃度が０．４μｇ／ｍｇ；トリヨードチロニン、好ましくは最終濃度が２．１０^-9Ｍ；アデニン、好ましくは最終濃度が２４．３μｇ／ｍｌ；ノルモシン、好ましくは最終濃度が１００μｇ／ｍｌを含むＤＭＥＭ−グルタマックスとＨａｍ Ｆ−１２の混合培地（比率：３：１ｖ／ｖ）中で培養した。浸漬条件下で、培養を７日間継続した。その後、コウシ血清、ハイドロコルチゾン、イスプレル、トリヨードチロニン、ウムリン以外は上記の浸漬培養と同一である培地を用いて、培養物を、気液界面においてさらに１４日間培養した。

活性成分（マオウエキス）は、好ましくは上述の培養培地にそれぞれ０．５と１％で希釈して、繊維芽細胞とケラチン合成細胞の接種後それぞれ３日後から使用する（即ち、３〜２１日目と２４〜４２日目）。ポジティブコントロールとしては、好ましくは、表皮の分化を刺激するため、再構成皮膚が出現する段階で（即ち、２８〜４２日目）、塩化カルシウムを最終濃度１．５ｍＭで添加する。

培養終了後、試料を凍結し、感熱性樹脂と混合し、５μｍに凍結切断した。
切片のラベリングは、以下の試薬を使用して実施した：
−ヒト第一抗トランスグルタミナーゼ抗体
−ヒト第一抗サイトケラチン１０抗体
−アレクサフルオール共役第二抗体
−エバンスブルー
−Ｄａｐｉ

免疫ラベリングは、光子顕微鏡（アキオスコープ２プラス−ツァイス、ドイツ）で観察し、トランスグルタミナーゼ免疫ラベリングの定量を、画像解析（ルシア−ニロン、フランス）で行って、活性成分処理の効果を評価した（ホルム・サイダック統計検定、ｐ＜０．０１）。

これらの結果は、この活性成分が、一定の容量効果関係でもって、ポジティブコントロールと同じタイプの表皮分化を誘導することを示している。実際、処理された皮膚では、トランスグルタミナーゼを発現するケラチン合成細胞層の数、特にいわゆる顆粒層中で発現するケラチン合成細胞層の数が増加している。また、表皮部拡大図に示されるように、得られたラベリングはより強く、また輪郭がはっきりしている。定量結果は、処理後、特に１％活性成分濃度での処理後（２回誘導）に、このタンパク質の誘導が起こっていることを示している。

図１１に、エバンスブルーを用いた再構成皮膚のグローバルラベリングの結果を示す（赤の表皮層、青の細胞、赤の皮膚基質の繊維、点線の真皮表皮接合部）。

これらの結果は、ある容量効果関係でもって、この活性成分がポジティブコントロールと同じタイプの表皮分化を誘導することを示している。実際、処理された皮膚では、トランスグルタミナーゼを発現するケラチン合成細胞層の数、特にいわゆる顆粒層中で発現するケラチン合成細胞層の数が増加が認められる。また、マオウエキスで処理した皮膚では、繊維芽細胞密度に興味ある効果が認められた。

図１２は、再構成皮膚上でのサイトケラチン１０の免疫組織学的な検出の結果を示している（細胞は濃赤色ラベル、核は青、真皮表皮接合部は点線で示す）。

これらの結果は、この活性成分が、一定の容量効果関係でもって、ポジティブコントロールと同じタイプの表皮分化を誘導することを示している。実際、処理された皮膚では、トランスグルタミナーゼを発現するケラチン合成細胞層の数、特にいわゆる顆粒層中で発現するケラチン合成細胞層の数が増加している。

図１３は、再構成皮膚上でのトランスグルタミナーゼの免疫組織学的な検出結果を示している（細胞は濃赤ラベル、核は青、真皮表皮接合部は点線で示す）。

実施例１７：本発明の製品の水中油エマルジョン型の化粧用のまたは医薬用製剤としての利用

製剤１７ａ：

Ａ 水 合計１００
ブチレングリコール ２
グリセリン ３
ナトリウムジヒドロキシセチルホスフェート ２
イソプロピルヒドロキシセチルエーテル

Ｂ グリコールステアレートＳＥ １４
トリイソノナノイン ５
ココア脂肪酸オクチル ６

Ｃ ブチレングリコール、メチルパラベン、 ２
エチルパラベン、プロピルパラベン、
ｐＨ、５．５に調整

Ｄ 本発明の製品 ０．０１ 〜 １０％

製剤１７ｂ：

Ａ 水 合計１００
ブチレングリコール ２
グリセリン ３
ポリアクリルアミド、イソパラフィン、 ２．８
ラウレス−７

Ｂ ブチレングリコール、メチルパラベン、 ２
エチルパラベン、プロピルパラベン
フェノキシエタノール、メチルパラベン、 ２
プロピルパラベン、ブチルパラベン、
エチルパラベン
ブチレングリコール ０．５

Ｄ 本発明の製品 ０．０１ 〜 １０％

製剤１７ｃ：

Ａ カルボマー ０．５０
プロピレングリコール ３
グリセリン ５
水 合計で１００

Ｂ ヤシ脂肪酸オクチル ５
ビサボロール ０．３０
ジメチコン ０．３０

Ｃ 水酸化ナトリウム １．６０

Ｄ フェノキシエタノール、メチルパラベン、 ０．５０
プロピルパラベン、ブチルパラベン、
エチルパラベン

Ｅ 香料 ０．３０

Ｆ 本発明の製品 ０．０１ 〜 １０％

本発明の実施例１８：油中水型の本発明の製剤の利用

Ａ ＰＥＧ−３０ ジポリヒドロキシステアレート ３
カプリン酸トリグリセリド ３
オクタン酸セテアリル ４
ジブチルアジペート ３
グレープシード油 １．５
ホホバ油 １．５
フェノキシエタノール、メチルパラベン、 ０．５
プロピルパラベン、ブチルパラベン、
エチルパラベン

Ｂ グリセリン ３
ブチレングリコール ３
硫酸マグネシウム ０．５
ＥＤＴＡ ０．０５
水 合計で１００

Ｃ シクロメチコン １
ジメチコン １

Ｄ 香料 ０．３

Ｅ 本発明の製品 ０．０１ 〜 １０％

本発明の実施例１９：シャンプーまたはシャワーゲル型製剤の本発明の製品の利用

Ａ ザンタンガム ０．８
水 合計で１００

Ｂ ブチレングリコール、メチルパラベン、 ０．５
エチルパラベン、プロピルパラベン
フェノキシエタノール、メチルパラベン、 ０．５
プロピルパラベン、ブチルパラベン、
エチルパラベン

Ｃ クエン酸 ０．８

Ｄ ナトリウムラウレススルフェート ４０．０

Ｅ 本発明の製品 ０．０１〜１０％

本発明の実施例２０：口紅型製剤や他の無水製品の本発明の製品の利用

Ａ 鉱物ワックス １７．０
イソステアリルイソステアレート ３１．５
プロピレングリコールジペラルゴネート ２．６
プロピレングリコールイソステアレート １．７
ＰＥＧ−８ミツロウ ３．０
水添パーム核油 ３．４
グリセリド、
水添ヤシ油グリセリド
ラノリン油 ３．４
ごま油 １．７
セチルラクテート １．７
鉱油、ラノリンアルコール ３．０

Ｂ ヒマシ油 合計で１００
二酸化チタン ３．９
Ｃｌ １５８５０：１ ０．６１６
Ｃｌ ４５４１０：１ ０．２５６
Ｃｌ １９１４０：１ ０．０４８
Ｃｌ ７７４９１ ２．０４８

Ｃ 本発明の製品 ０．０１〜５％

本発明の実施例２１：水性ゲル製剤（アイ・コンチュアゲル、スリムゲル等）の本発明の製品の利用

Ａ 水 合計で１００
カルボマー ０．５
ブチレングリコール １５
フェノキシエタノール、メチルパラベン、 ０．５
プロピルパラベン、ブチルパラベン、
エチルパラベン

Ｂ 本発明の製品 ０．０１〜１０％

本発明の実施例２２：三エマルジョン型製剤の本発明の製品の利用

第一エマルジョンＷ１／Ｏ
Ａ ＰＥＧ−３０ジポリヒドロキシステアレート ４
カプリル酸トリグリセリド ７．５
イソヘキサデカン １５
ＰＰＧ−１５ステアリルエーテル ７．５

Ｂ 水 ６５．３

Ｃ フェノキシエタノール、メチルパラベン． ０．７
プロピルパラベン、ブチルパラベン、
エチルパラベン

第二エマルジョンＷ１／Ｏ／Ｗ２

Ａ 第一エマルジョン ６０

Ｂ ポロキサマー４０７ ２
フェノキシエタノール、メチルパラベン、 ０．３
プロピルパラベン、２−ブロモ−２−
ニトロプロパン−１，３−ジオール
水 合計で１００

Ｃ カルボマー １５

Ｄ トリエタノールアミン ｐＨ ６．０〜６．５

本発明の実施例２３：本発明の製品を含む医薬製剤の調整

製剤２３ａ：錠剤の調整
Ａ 賦形剤 錠剤当たり
乳糖 ０．３５９
ショ糖 ０．２４０

Ｂ 本発明の製品＊ ０．００１〜０．１
＊本発明の製品は、実施例１３に記載の抽出方法と続く乾燥工程により得られたものである。

製剤２３ｂ：軟膏の調整

Ａ 賦形剤
低密度ポリエチレン ５．５
流動パラフィン 合計で１００

Ｂ 本発明の製品＊ ０．００１〜０．１
＊本発明の製品は、実施例１３に記載の抽出方法と続く乾燥工程により得られたものである。

製剤２３ｃ：注射剤の調整

Ａ 賦形剤
等張食塩水 ５ｍｌ

Ｂ 本発明の製品＊ ０．００１〜０．１ｇ
＊本発明の製品は、実施例１３に記載の抽出方法と続く乾燥工程により得られたものである。

実施例２４：本発明の対象を含む製剤の化粧品としての適性の評価
実施例２のようにして得られた化合物を０．５％キサンタンゲルに１０％の濃度で添加して、その毒性試験を、ウサギでの接眼評価や、ラットでの単一経口投与による異常毒性の不在の評価、モルモットによる感作の評価により行った。

ウサギにおける主皮膚刺激の評価：
「皮膚に対する急性の刺激腐食作用」の試験に関するＯＥＣＤ指令で推奨の方法により、上述の製剤を希釈せずに、０．５ｍｌの量でウサギの皮膚に塗布する。

これらの製品は、ＯＪＲＦ（２１／０２／８２）に記載の指令１／２／１９８２に定義される基準に従って評価分類した。

この結果、本発明の製品が皮膚に対する刺激性を有さないという結論となった。

ウサギにおける眼球刺激の評価：
「眼に対する急性刺激腐食作用」に関するＯＥＣＤ指令Ｎｏ． ４０５（２４ Ｆｅｂｒｕａｒｙ １９８７）で推奨する方法により。上述の製剤を、三匹のウサギの眼に０．１ｍｌの量で一回投与した。

この試験の結果、そのままあるいは希釈して使用する場合、指令９１／３２６ ＥＥＣにおいて、眼に対して非刺激的であると考えられるという結論となった。

ラットにおける単一経口投与による異常毒性の欠如の試験：
ＯＦＣＤ指令Ｎｏ． ４０１（１９８７年２月２４日）をもとに化粧品用に採用された方法により、上記の製剤を５ｇ／ｋｇ体重の用量で５匹のオスラットと５匹のメスラットに単一経口投与した。

ＬＤ₀とＬＤ₅₀は、それぞれ５０００ｍｇ／ｋｇより大きかった。試験した製剤は、摂取が危険な製剤には分類されなかった。

モルモットにおける皮膚の感作性の評価：
上記の製剤を、マグヌソンとクリグマンの方法、即ちＯＥＣＤ指令Ｎｏ．４０６の方法による感作性試験に供した。

これらの製剤は、皮膚と接触しても感作性がないと分類された。

図１：ＮＲＡＧＥタンパク質の配列と構想（ニューロトロフィン−レセプター共役ＭＡＧＥ同属体またはＭＡＧＥ Ｄ１） 図２：哺乳類用のツーハイブリッド相互作用 図３：再構成の皮膚中のＬＯＸとＮＲＡＧＥの存在の確認（対物レンズ×２５） 図４：共焦点顕微鏡によるヒト皮膚切片上のＬＯＸとＮＲＡＧＥの共存 図５：ヒト皮膚切片（９１歳ドナー）上のＬＯＸとＮＲＡＧＥの免疫検出 図６：移植片対宿主反応（ＧＶＨ）患者のＬＯＸとＮＲＡＧＥの検出 図７：基底細胞癌及び有棘細胞型癌の患者の皮膚中のＬＯＸとＮＲＡＧＥの検出 図８：扁平苔癬患者の皮膚中のＬＯＸとＮＲＡＧＥの検出 図９：乾癬患者の皮膚中のＬＯＸとＮＲＡＧＥの同定 図１０：湿疹患者の皮膚中のＬＯＸとＮＲＡＧＥの同定 図１１に、エバンスブルーを用いた再構成皮膚のグローバルラベリングの結果を示す（赤の表皮層、青の細胞、赤の皮膚基質の繊維、点線の真皮表皮接合部）。 図１２は、再構成皮膚上でのサイトケラチン１０の免疫組織学的な検出の結果を示している（細胞は濃赤色ラベル、核は青、真皮表皮接合部は点線で示す）。 図１３は、再構成皮膚上でのトランスグルタミナーゼの免疫組織学的な検出結果を示している（細胞は濃赤ラベル、核は青、真皮表皮接合部は点線で示す）。

Claims (29)

1. 増殖と分化とアポトーシスの細胞現象の間のバランスを制御するために、特にこれらの現象の間のバランスが崩れている場合に、また特にＬＯＸとＮＲＡＧＥとの間の相互作用が欠乏しているか変化している場合に制御するためにＬＯＸタンパク質とＮＲＡＧＥタンパク質間の相互作用を変化させる組成物の製造のための、配列識別番号１のＬＯＸの発現及び／又は活性を変化させる及び／又は配列識別番号２のＮＲＡＧＥの発現及び／又は活性を変化させる少なくとも一種の物質の有効量の使用方法。
2. ＬＯＸとＮＲＡＧＥとの間の相互作用が欠乏しているか変化している場合にＬＯＸタンパク質とＮＲＡＧＥタンパク質間の相互作用を改善する組成物の製造のための、配列識別番号１のＬＯＸの発現及び／又は活性を変化させる及び／又は配列識別番号２のＮＲＡＧＥの発現及び／又は活性を変化させる少なくとも一種の物質の有効量の使用方法。
3. 増殖と分化とアポトーシスとの間の細胞のバランスが欠乏しているか変化している少なくとも一種の状態を予防又は治療する組成物の製造のための、少なくとも配列識別番号２のＮＲＡＧＥタンパク質の発現及び／又は活性を変化させ、必要に応じて配列識別番号１のＬＯＸタンパク質の発現及び／又は活性を変化させる少なくとも一種の物質の有効量の使用方法。
4. ＬＯＸの発現及び／又は活性、及び／又はＭＲＡＧＥの発現及び／又は活性が、上皮細胞内で、特にケラチン合成細胞内で変化させられることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の使用方法。
5. 上記の物質の目的がＬＯＸタンパク質とＮＲＡＧＥタンパク質との間の相互作用を変化させることであり、この相互作用が、特にＮＲＡＧＥタンパク質のＩＲＤドメイン中で起こることを特徴とする請求項１〜４のいずれか１項に記載の使用方法。
6. ＬＯＸとＮＲＡＧＥとの相互作用が、ＬＯＸで誘起された酵素触媒によるＮＲＡＧＥの重合、特に二量体化を含むことを特徴とする請求項１〜５のいずれか１項に記載の使用方法。
7. ＬＯＸとＮＲＡＧＥとの間の相互作用が、ＬＯＸの酵素活性の結果起こるＨ₂Ｏ₂の生産を含み、このＨ₂Ｏ₂が、他の分子、特に中性のスフィンゴミエリナーゼまたはＮＦ−ｋＢの活性剤となることを特徴とする請求項１〜５のいずれか１項に記載の使用方法。
8. ＬＯＸとＮＲＡＧＥとの間の相互作用が、ＬＯＸの非酵素的な活性、特にＬＯＸのプロ領域により発揮される活性であることを特徴とする請求項１〜５のいずれか１項に記載の使用方法。
9. 細胞のストレスへの暴露、特に細胞の熱への暴露または細胞の放射線、特に太陽放射線への暴露、または細胞の毒性薬品、例えば化学薬品または微生物薬品への暴露、皮膚の加齢、扁平苔癬、移植片対宿主反応（ＧＶＨ）、湿疹、乾癬及び癌、特に上皮癌からなる群から選ばれる条件の治療及び／又は予防のための請求項１〜８のいずれか１項に記載の使用方法。
10. 細胞増殖の場合、特に癌の場合、特に上皮癌、更に特に基底細胞または有棘細胞型の皮膚上皮癌、乾癬または湿疹の場合の過剰増殖の抑制のための請求項１〜９のいずれか１項に記載の使用方法。
11. 特に皮膚加齢や、皮膚のストレスへの暴露、特に熱への、または皮膚の放射線、特に太陽放射線への暴露、または皮膚の毒性薬品、例えば化学薬品または微生物薬品への暴露、または移植片対宿主反応（ＧＶＨ）による実質的なアポトーシス場合に、表皮中でのアポトーシスを抑制するための請求項１〜９のいずれか１項に記載の使用方法。
12. 特に加齢や、皮膚の熱への暴露、皮膚の放射線、特に太陽放射線ヘの暴露、または移植片対宿主反応（ＧＶＨ）により表皮中の細胞が低増殖の場合に、細胞増殖を増加させるための請求項１〜９のいずれか１項に記載の使用方法。
13. 皮膚加齢や、皮膚のストレスヘの暴露、特に熱への暴露、または皮膚の放射線、特に太陽放射線への暴露、または皮膚の毒性薬品、例えば化学薬品または微生物薬品への暴露、または移植片対宿主反応（ＧＶＨ）の際の、ＬＯＸの発現の増加と必要に応じてＮＲＡＧＲの発現の阻害のための請求項１〜９のいずれか１項に記載の使用方法。
14. 乾癬または湿疹の予防あるいは治療の目的での、表皮中でのＮＲＡＧＥの発現及び／又は活性の増加と、必要に応じてＬＯＸの発現及び／又は活性の阻害のための請求項１〜４のいずれか１項に記載の使用方法。
15. 癌、特に上皮癌、更に特に基底細胞型または有棘細胞型の皮膚上皮癌、または扁平苔癬の予防又は治療のために、ＬＯＸとＮＲＡＧＥの発現を増加させるための請求項１〜９のいずれか１項に記載の使用方法。
16. 上記組成物が化粧用、栄養補助、皮膚医薬または医薬組成物であることを特徴とする請求項１〜１５のいずれか１項に記載の使用方法。
17. 上記の増殖と分化とアポトーシスと間の細胞のバランスが、ケラチン合成細胞の増殖と分化とアポトーシスの間のバランスである請求項１〜１６のいずれか１項に記載の使用方法。
18. 上記物質が、ダイズエキス、マオウエキス（Ｅｐｈｅｄｒａ ｓｉｎｉｃａ）、ホップエキス（Ｈｕｍｉｄｕｓ Ｌｕｐｕｌｕｓ）、シナモンエキス（Ｃｉｎｎａｍｏｍｕｍ ｓｐｐ）、カスミソウエキス（Ｇｙｐｓｏｐｈｉｌａ ｓｓｐ）、赤ビャクダンエキス（シタン（Ｐｔｅｒｏｃａｒｐｕｓ ｓａｎｔａｌｉｕｓ））、普通ブリオニアエキス（ホワイトブリオニー）、ナギイカダエキス（Ｒｕｓｃｕｓ ａｃｕｌｅａｔｕｓ）、レモンエキス（レモン（Ｃｉｔｒｕｓ ｌｅｍｏｎｉａ））、タンジェリンエキス（Ｃｉｔｒｕｓ ｒｅｔｉｃｕｌａｔａ）、エチルトランス３−ヘキサノエート、ケーラエキス（Ａｍｎｉ Ｖｉｓｎａｇａ）、アルギン酸、人参エキス（Ｄａｕｃｕｓ ｃａｒｏｔａ）、メチル−２−メチルブチレート、ダイウイキョウエキス（Ｉｌｌｉｃｉｕｍ ｖｅｒｕｍ）サイプレスエキス（Ｃｕｐｒｃｓｓｕｓ ｓｅｍｐｅｒｖｉｒｅｎｓ）、アサックフェチダガムエキス、キシリトール、スピノサスモモ（Ｐｒｕｎｕｓ ｓｐｉｎｏｓａ）、イチゴノキエキス（Ａｒｂｕｔｕｓ ｕｎｅｄｏ）、オオウメガサソウエキス（Ｃｈｉｍａｐｈｉｌａ ｕｍｂｅｌｌａｔａ）、クルマバソウエキス（Ａｓｐｃｒｕｌａ ｏｄｏｒａｔａ）マグワートエキス（Ａｒｔｅｍｉｓｉａ ｖｕｌｇａｒｉｓ）、普通エルダーベリーエキス（Ｓａｍｂｕｃｕｓ ｎｉｇｒａ）、チャイニーズキャベツエキス（Ｂｒａｓｓｉｃａ Ｂｒａｓｓｉｃａ ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ ｖａｒ． Ｐｅｋｉｎｅｎｓｉｓ）、ビターアッシュ（Ｃａｓｓｉａ ａｍａｒａ）、カカオノキエキス（Ｔｈｅｏｂｒｏｍａ ｃａｃａｏ）、シルクエキス（Ｓｅｒｉｃａ）、ジャマイカサルサバリラ（Ｓｍｉｌａｘ ｏｒｎａｔａ）、アカフサスグリエキス（Ｒｉｂｅｓ ｒｕｂｒｕｍ）、ペリトリーエキス（Ａｎｎａｃｙｃｌｕｓ ｐｙｒｅｔｈｒｕｍ）、及びスイートフェンネルエキス（Ｆｏｅｎｉｃｕｌｕｍ）からなる群から選ばれることを特徴とする請求項１〜１７のいずれか１項に記載の使用方法。
19. 増殖と分化とアポトーシスとの間の細胞のバランスが欠乏しているか変化している少なくとも一種の状態を予防又は治療するために、ＬＯＸとＮＲＡＧＥとの間の相互作用を変化させる少なくとも一種の活性成分を同定する方法であって、
    −上記活性成分をＬＯＸタンパク質（配列識別番号１）及び／又はＮＲＡＧＥタンパク質（配列識別番号２）を発現可能な少なくとも一種の生細胞と接触させること、及び
    −特に、増殖と分化とアポトーシスとの間の細胞のバランスの改善を目的に、ＬＯＸ及び／又はＮＲＡＧＥの発現及び／又は活性を変化させる活性成分を特定するために、ＬＯＸ及び／又はＮＲＡＧＥの発現を分析することを含むことを特徴とする方法。
20. ＬＯＸとＮＲＡＧＥとの間の相互作用が欠乏しているか変化している場合に、ＬＯＸタンパク質とＮＲＡＧＥタンパク質間の相互作用を改善するためにＬＯＸとＮＲＡＧＥとの間の相互作用を変化させる少なくとも一種の活性成分を同定する方法であって、
    −この活性成分をＬＯＸタンパク質（配列識別番号１）及び／又はＮＲＡＧＥタンパク質（配列識別番号２）を発現可能な少なくとも一種の生細胞と接触させること、及び
    −特に、ＬＯＸとＮＲＡＧＥとの間の相互作用が欠乏しているか変化している場合に、ＬＯＸタンパク質とＮＲＡＧＥタンパク質間の相互作用を改善するために、ＬＯＸ及び／又はＮＲＡＧＥの発現及び／又は活性を変化させる活性成分を特定するために、ＬＯＸ及び／又はＮＲＡＧＥの発現を分析することを含む方法。
21. ＬＯＸタンパク質及び／又はＮＲＡＧＥタンパク質の発現が可能な上記生細胞の増殖と分化とアポトーシスのバランスが、またはＬＯＸタンパク質とＮＲＡＧＥタンパク質間の相互作用が、活性成分と接触させられる前に、なくなっているか変化していることを特徴とする請求項１９または２０に記載の同定方法。
22. 上記生細胞が、上皮細胞、特にケラチン合成細胞であることを特徴とする、請求項１９〜２１のいずれか１項に記載の同定方法
23. 上記方法が、ＬＯＸ及び／又はＮＲＡＧＥのメッセンジャーＲＮＡの発現を分析することを含むことを特徴とする請求項１９〜２２のいずれか１項に記載の同定方法。
24. 以下のプライマー：
    ＬＯＸ遺伝子用：
    センス：ＡＣＧＴＡＣＧＴＧＣＡＧＡＡＧＡＴＧＴＣＣ
    アンチセンス：ＧＧＣＴＧＧＧＴＡＡＧＡＡＡＴＣＴＧＡＴＧ
    ＮＲＡＧＥ遺伝子用：
    センス：ＴＧＣＡＣＡＧＡＣＡＴＣＡＧＣＡＧＡＴＧＧ
    アンチセンス：ＴＴＣＡＣＧ ＧＡＴＧＡＴＡＴＣＴＣＴＣＡＧＣ
    を用いる定量的ＲＴ−ＰＣＲを用いることを含む請求項１９〜２３のいずれか１項に記載の同定方法。
25. −増殖と分化とアポトーシスとの間の細胞のバランスの改善を目的に、ＬＯＸ及び／又はＮＲＡＧＥの発現及び／又は活性を変化させる活性成分を同定するために請求項１９〜２４のいずれか１項に記載の同定方法を使用すること、及び
    −増殖と分化とアポトーシスとの間の細胞のバランスが欠乏しているか変化している少なくとも一種の状態を予防又は治療するための化粧用、栄養補助、皮膚医薬または医薬組成物を製造するためにこの活性成分を少なくとも一種の賦形剤と混合することを含むことを特徴とする組成物の製造方法。
26. −増殖と分化とアポトーシスとの間の細胞のバランスの改善を目的に、ＬＯＸ及び／又はＮＲＡＧＥの発現及び／又は活性を変化させる活性成分を同定するために請求項１９〜２４のいずれか１項に記載の同定方法を使用すること、及び
    −ＬＯＸとＮＲＡＧＥとの間の相互作用が欠乏しているか変化している場合にＬＯＸタンパク質とＮＲＡＧＥタンパク質間の相互作用を改善することを目的に、化粧用、栄養補助、皮膚医薬または医薬組成物を製造するために上記活性成分を少なくとも一種の賦形剤と混合することを含むことを特徴とする組成物の製造方法。
27. 少なくともケラチン合成細胞を含む再構成皮膚モデル中における、または皮膚の切片、好ましくは増殖と分化とアポトーシスとの間の細胞のバランスが欠乏しているか変化している状態の表皮をもつ人由来の皮膚の切片中におけるＮＲＡＧＥの存在を検出し位置決めをするために、少なくとも一種の抗ＮＲＡＧＥ抗体を使用することを特徴とする、ＮＲＡＧＥの位置を決定する方法。
28. 細胞レベルで、特に上皮細胞での、好ましくはケラチン合成細胞でのＮＲＡＧＨの発現の変化を検出するための組成物の製造に抗ＮＲＡＧＥ抗体を使用する方法。
29. 上記組成物の目的が、増殖と分化とアポトーシスとの間の細胞のバランスまたはＬＯＸとＮＲＡＧＥとの間の相互作用が、特に表皮中において、欠乏しているか変化している状態を検出することであり、上記状態が、細胞のストレスへの暴露、特に細胞の熱への暴露または細胞の放射線、特に太陽放射線への暴露、または細胞の毒性薬品、例えば化学薬品または微生物薬品への暴露、皮膚加齢、扁平苔癬、移植片対宿主反応（ＧＶＨ）、湿疹、乾癬及び癌、特に上皮癌、更に特に基底細胞型または有棘細胞型の皮膚上皮癌からなる群から選ばれることを特徴とする請求項２８に記載の使用方法。

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