ES2236634T3 - Anticuerpos anti-vegf. - Google Patents
Anticuerpos anti-vegf.Info
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Abstract
Un anticuerpo anti-factor de crecimiento del endotelio vascular que inhibe la angiogénesis inducida por VEGF in vivo y/o se une a VEGF humano con un valor Kd de no más de 1 x 10-8 M y/o tiene un valor ED50 de no más de 5 nM para inhibir la proliferación inducida por VEGF de células endoteliales in vitro, teniendo el anticuerpo un dominio variable de la cadena pesada que comprende las regiones flanqueantes consenso del subgrupo III de cadenas pesadas humanas como se muestra en SEC.ID.Nº 11 y las regiones hipervariables CDRH1, CDRH2 y CDRH3, teniendo las siguientes secuencias de aminoácidos: CDRH1: GYX1X2X3X4YGX5N (SEC.ID.Nº 117), donde X1 es D, T o E, X2 es F, W, o Y, X3 es T, Q, G o S, X4 es H o N; y X5 es M o I; CDRH2: WINTX1TGEPTYAADFKR (SEC.ID.Nº 118), donde X1 es Y o W; y CDRH3: YPX1YX2X3X4X5HWYFDV (SEC.ID.Nº 119), donde X1 es H o Y; X2 es Y, R, K, I, T, E, o W, X3 es G, N, A, D, Q, E, T, K, o S, X4 es S, T, K, Q, N, R, A, E, o G, y X5 es S o G.
Description
Anticuerpos anti-VEGF.
Esta invención se refiere, en líneas generales, a
anticuerpos anti-VEGF y, en particular, a
anticuerpos anti-VEGF humanizados y a variantes de
anticuerpos anti-VEGF.
Ahora está bien establecido que la angiogénesis
está implicada en la patogénesis de una diversidad de trastornos.
Estos incluyen tumores sólidos, síndromes neovasculares
intraoculares tales como retinopatías proliferativas o degeneración
macular relacionada con la edad (AMD), artritis reumatoide, y
psoriasis (Folkman et al. J. Biol. Chem.
267:10931-10934 (1992); Klagsbrun et al. Annu.
Rev. Physiol. 53:217-239 (1991); y Garner A,
Vascular diseases. In: Pathobiology of ocular disease. A dynamic
approach. Garner A, Klintworth GK, Eds. 2ª Edición Marcel
Dekker, NY, pág. 1625-1710 (1994)). En el caso de
tumores sólidos, la neovascularización permite a las células
tumorales conseguir una ventaja de crecimiento y autonomía
proliferativa en comparación con células normales. Por
consiguiente, se ha observado una correlación entre la densidad de
microvasos en secciones tumorales y en pacientes que sobreviven a
cáncer de mama así como a varios tumores distintos (Weidner et
al. N Engl J Med 324:1-6 (1991); Horak et
al. Lancet 340:1120-1124 (1992); y Macchiarini
et al. Lancet 340:145-146 (1992)).
La búsqueda de reguladores positivos de la
angiogénesis ha producido muchos candidatos, que incluyen aFGF,
bFGF, TGF-\alpha, TGF-\beta,
HGF, TNF-\alpha, angiogenina,
IL-8, etc. (Folkman et al. y Klagsbrun et
al). Los reguladores negativos identificados hasta ahora
incluyen trombospondina (Good et al. Proc. Natl. Acad. Sci.
USA. 87:6624-6628 (1990)), el fragmento
N-terminal de 16 kilodalton de prolactina (Clapp
et al. Edocrinology, 133:1292-1299 (1993)),
angiostatina (O'Reilly et al. Cell,
79:315-328 (1994)) y endostatina (O'Reilly et al.
Cell, 88:277-285 (1996)).
El trabajo hecho durante los últimos años ha
establecido el papel clave el factor de crecimiento del endotelio
vascular (VEGF) en la regulación de la angiogénesis normal y anormal
(Ferrara et al. Endocr. Rev. 18:4-25 (1997)).
El descubrimiento de que la pérdida de incluso un único alelo de
VEGF da como resultado letalidad embrionaria, apunta a que este
factor juega un papel irremplazable en el desarrollo y
diferenciación del sistema vascular (Ferrara et al.).
Además, se ha mostrado que VEGF es un mediador clave en la
neovascularización asociada a tumores y trastornos intraoculares
(Ferrara et al.). El ARNm de VEGF se
sobre-expresa en la mayoría de los tumores humanos
examinados (Berkaman et al. J Clin Invest
91:153-159 (1993); Brown et al. Human
Pathol. 26:86-91 (1995); Brown et al. Cancer
Res. 53:4727-4735 (1993); Mattern et al.
Brit. J. Cancer. 73:931-934 (1996); y Dvorak
et al. Am J. Pathol. 146:1029-1039 (1995)).
Además, la concentración de VEGF en fluidos oculares está altamente
correlacionada con la presencia de proliferación activa de vasos
sanguíneos en pacientes con diabetes u otras retinopatías
relacionadas con isquemia (Aiello et al. N. Engl. J. Med.
331:1480-1487 (1994)). Además, recientes estudios
han demostrado la localización de VEGF en membranas neovasculares
coroidales en pacientes afectados por AMD (Lopez et al. Invest.
Ophtalmo. Vis. Sci. 37:855-868 (1996)). Los
anticuerpos neutralizantes anti-VEGF suprimen el
crecimiento de una diversidad de líneas celulares tumorales humanas
en ratones desnudos (Kim et al. Nature
362:841-844 (1993); Warren et al. J. Clin.
Invest. 95:1789-1797 (1995); Borgström et
al. Cancer Res. 56:4032-4039 (1996); y Melnyk
et al. Cancer Res. 56:921-924 (1996)) y
también inhiben la angiogénesis intraocular en modelos de trastornos
retinales isquémicos (Adamis et al. Arch. Ophthalmol.
114:66-71 (1996)). Por lo tanto, los anticuerpos
monoclonales anti-VEGF u otros inhibidores de la
acción de VEGF son candidatos prometedores para el tratamiento de
tumores sólidos y diversos trastornos neovasculares
intraoculares.
Como se define en las reivindicaciones, la
invención proporciona anticuerpos anti-VEGF y
variantes de anticuerpos anti-VEGF con propiedades
deseables desde una perspectiva terapéutica, incluyendo fuerte
afinidad de unión por VEGF; la capacidad de inhibir la proliferación
inducida por VEGF de células endoteliales in vitro; y la
capacidad de inhibir la angiogénesis inducida por VEGF in
vivo.
El anticuerpo anti-VEGF
humanizado o variante de anticuerpo anti-VEGF
preferido en este documento se une a VEGF humano con un valor
K_{d} de no más de aproximadamente 1 x 10^{-8} M y
preferiblemente no más de aproximadamente 5 x 10^{-9} M. Además,
el anticuerpo anti-VEGF humanizado o variante puede
tener un valor ED50 de no más de aproximadamente 5 nM para inhibir
la proliferación inducida por VEGF de células endoteliales in
vitro. Los anticuerpos anti-VEGF humanizados o
variantes de particular interés en este documento son los que
inhiben al menos aproximadamente el 50% del crecimiento del tumor
en un modelo tumoral A673 in vivo, a una dosis de anticuerpo
de 5 mg/kg.
En una realización, el anticuerpo
anti-VEGF tiene un dominio variable de la cadena
pesada y la ligera, donde el dominio variable de la cadena pesada
comprende regiones hipervariables con las siguientes secuencias de
aminoácidos: CDRH1 (GYX_{1}FTX_{2}YGMN, donde X_{1} es T o D
y X_{2} es N o H; SEC.ID.Nº 128), CDRH2 (WINTYTGEPTYAADFKR;
SEC.ID.Nº 2) y CDRH3 (YPX_{1}YYGX_{2}SHWYFDV, donde X_{1} es
Y o H y X_{2} es S o T; SEC.ID.Nº 129). Por ejemplo, el dominio
variable de la cadena pesada puede comprender las secuencias de
aminoácidos de CDRH1 (GYTFNYGMN; SEC.ID.Nº 1), CDRH2
(WINTYTGEPTYAADFKR; SEC.ID.Nº 2) y CDRH3 (YPHYYGSSHWY
FDV; SEC.ID.Nº 3). Preferiblemente, las tres regiones hipervariables de la cadena pesada se proporcionan en una región flanqueante humana, por ejemplo, en forma de una secuencia contigua representada por la siguiente fórmula: FR1-CDRH1-FR2-CDRH2-FR3-CDRH3-FR4.
FDV; SEC.ID.Nº 3). Preferiblemente, las tres regiones hipervariables de la cadena pesada se proporcionan en una región flanqueante humana, por ejemplo, en forma de una secuencia contigua representada por la siguiente fórmula: FR1-CDRH1-FR2-CDRH2-FR3-CDRH3-FR4.
La invención también proporciona un dominio
variable de la cadena pesada de un anticuerpo
anti-VEGF que comprende la secuencia de
aminoácidos:
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYX_{1}FTX_{2}YGMNWVRQAPGKGLEWVGWINTYTGEPTYAADFKR
RFTFSLDTSKSTAYLQMNSLRAEDTAVYYCAKYPX_{3}YYGX_{4}SHWYFDVWGQGTLVTVSS (SEC.ID.Nº 125),
donde X_{1} es T o D; X_{2} es N o H; X_{3} es Y o H y X_{4} es S o T. Una secuencia del dominio variable de la cadena pesada particularmente útil es la del anticuerpo humanizado F(ab)-12 del Ejemplo 1 y comprende la secuencia del dominio variable de la cadena pesada de SEC.ID.Nº 7. Dichas secuencias del dominio variable de la cadena pesada preferidas pueden combinarse con las siguientes secuencias del dominio variable de la cadena ligera o con otras secuencias del dominio variable de la cadena ligera, preferidas, a condición de que el anticuerpo producido de este modo se una a VEGF humano.
RFTFSLDTSKSTAYLQMNSLRAEDTAVYYCAKYPX_{3}YYGX_{4}SHWYFDVWGQGTLVTVSS (SEC.ID.Nº 125),
donde X_{1} es T o D; X_{2} es N o H; X_{3} es Y o H y X_{4} es S o T. Una secuencia del dominio variable de la cadena pesada particularmente útil es la del anticuerpo humanizado F(ab)-12 del Ejemplo 1 y comprende la secuencia del dominio variable de la cadena pesada de SEC.ID.Nº 7. Dichas secuencias del dominio variable de la cadena pesada preferidas pueden combinarse con las siguientes secuencias del dominio variable de la cadena ligera o con otras secuencias del dominio variable de la cadena ligera, preferidas, a condición de que el anticuerpo producido de este modo se una a VEGF humano.
El anticuerpo de la invención tiene las
secuencias del dominio variable de la cadena ligera que se definen
en las reivindicaciones que pueden combinarse con las secuencias del
dominio variable de la cadena pesada identificados anteriormente o
con otras secuencias del dominio variable de la cadena pesada, a
condición de que el anticuerpo producido de este modo mantenga la
capacidad de unirse a VEGF humano. Por ejemplo, el dominio variable
de la cadena ligera puede comprender regiones hipervariables con las
siguientes secuencias de aminoácidos: CDRL1 (SASQDISNYLN; SEC.ID.Nº
4), CDRL2 (FTSSLHS; SEC.ID.Nº 5) y CDRL3 (QQYSTVPWT; SEC.ID.Nº 6).
Preferiblemente, las tres regiones hipervariables de la cadena
ligera se proporcionan en una región flanqueante humana, por
ejemplo, en forma de una secuencia contigua representada por la
siguiente fórmula:
FR1-CDRL1-FR2-CDRL2-FR3-CDRL3-FR4.
En una realización, la invención proporciona un
dominio variable de la cadena ligera de un anticuerpo
anti-VEGF humanizado que comprende las secuencias de
aminoácidos:
DIGX_{1}TQSPSSLSASVGDRVTITCSASQDISNYLNWYQQKPGKAPKVLIYFTSSLHSGVPSRFSGSGSGTDF
TLT ISSLQPEDFATYYCQQYSTVPWTFGQGTKVEIKR (SEC.ID.Nº 124), donde X_{1} es M o L. Una secuencia del dominio variable de la cadena ligera particularmente útil es la del anticuerpo humanizado F(ab)-12 del Ejemplo 1 y comprende la secuencia del dominio variable de la cadena ligera de SEC.ID.Nº 8.
TLT ISSLQPEDFATYYCQQYSTVPWTFGQGTKVEIKR (SEC.ID.Nº 124), donde X_{1} es M o L. Una secuencia del dominio variable de la cadena ligera particularmente útil es la del anticuerpo humanizado F(ab)-12 del Ejemplo 1 y comprende la secuencia del dominio variable de la cadena ligera de SEC.ID.Nº 8.
Un anticuerpo de la invención, que se define en
las reivindicaciones, puede ser una variante de un anticuerpo
anti-VEGF parental (dicho anticuerpo parental es
preferiblemente un anticuerpo anti-VEGF humanizado o
humano), donde la variante se une a VEGF humano y comprende una
sustitución de aminoácido en una región hipervariable del dominio
variable de la cadena pesada y la ligera del anticuerpo
anti-VEGF parental. La variante preferiblemente
tiene una o más sustituciones en una o más regiones hipervariables
del anticuerpo anti-VEGF. Preferiblemente, la
sustitución o sustituciones están en el dominio variable de la
cadena pesada del anticuerpo parental. Por ejemplo, la sustitución o
sustituciones de aminoácido pueden estar en el CDRH1 y/o CDRH3 del
dominio variable de la cadena pesada. Preferiblemente, hay
sustituciones en estas dos regiones hipervariables. En este
documento se demuestra que dichas variantes de "afinidad
madurada" se unen a VEGF humano más fuertemente que el anticuerpo
anti-VEGF parental del cual se han generado, es
decir, tienen un valor K_{d} que es significativamente menor que
el del anticuerpo anti-VEGF parental.
Preferiblemente, la variante tiene un valor ED50 para inhibir la
proliferación inducida por VEGF de células endoteliales in
vitro que es al menos aproximadamente 10 veces inferior,
preferiblemente al menos aproximadamente 20 veces inferior, y más
preferiblemente al menos aproximadamente 50 veces inferior, que el
del anticuerpo anti-VEGF parental. Una variante
particularmente preferida es la variante Y0317 del Ejemplo 3, que
tiene un CDRH1 que comprende la secuencia de aminoácidos: GYDFTHYGMN
(SEC.ID.Nº 126) y un CDRH3 que comprende la secuencia de
aminoácidos: YPYYYGTSHWYFDV (SEC.ID.Nº 127). Estas regiones
hipervariables y CDRH2 generalmente se proporcionan en una región
flanqueante humana, por ejemplo, dando como resultado un dominio
variable de la cadena pesada que comprende la secuencia de
aminoácidos de SEC.ID.Nº 116. Dichas secuencias del dominio variable
de la cadena pesada se combinan opcionalmente con un dominio
variable de la cadena ligera que comprende la secuencia de
aminoácidos de SEC.ID.Nº 124, y preferiblemente la secuencia de
aminoácidos del dominio variable de la cadena ligera de SEC.ID.Nº
115.
Se contemplan diversas formas del anticuerpo en
este documento. Por ejemplo, el anticuerpo anti-VEGF
puede ser un anticuerpo de longitud completa (por ejemplo, teniendo
una región Fc humana intacta) o un fragmento de anticuerpo (por
ejemplo, un Fab, Fab' o F(ab')_{2}). Además, el anticuerpo
puede marcarse con un marcador detectable, inmovilizarse en una fase
sólida y/o conjugarse con un compuesto heterólogo (tal como un
agente citotóxico).
Se contemplan usos de diagnóstico y terapéuticos
para el anticuerpo. Una aplicación de diagnóstico concierne a un
método para determinar la presencia de proteína VEGF que comprende
exponer una muestra que se cree que contiene la proteína VEGF al
anticuerpo anti-VEGF y determinar la unión del
anticuerpo a la muestra. Se contempla un kit que comprende el
anticuerpo e instrucciones para usar el anticuerpo para detectar la
proteína VEGF.
La invención también proporciona: un ácido
nucleico aislado que codifica el anticuerpo; un vector que comprende
ese ácido nucleico, opcionalmente unido de manera operativa a
secuencias de control reconocidas por una célula hospedadora
transformada con el vector; un célula hospedadora que comprende ese
vector; un proceso para producir el anticuerpo, que comprende
cultivar la célula hospedadora de modo que se exprese el ácido
nucleico y, opcionalmente, recuperar el anticuerpo del cultivo de
células hospedadoras (por ejemplo, a partir del medio de cultivo de
células hospedadoras). La invención también proporciona una
composición que comprende el anticuerpo anti-VEGF y
un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable. La composición
para uso terapéutico es estéril y puede liofilizarse. La invención
también proporciona un método para tratar un mamífero que padece de
un tumor o trastorno retinal, que comprende administrar una cantidad
terapéuticamente eficaz del anticuerpo anti-VEGF al
mamífero.
Las Figuras 1A y 1B representan las secuencias de
aminoácidos del dominio variable de la cadena pesada
(SEC.ID.
Nº 9) y de la cadena ligera (SEC.ID.Nº 10) de muMAbVEGF A.4.6.1, el dominio variable de la cadena pesada (SEC.ID.Nº 7) y de la cadena ligera (SEC.ID.Nº 8) de F(ab) humanizado (F(ab)-12) y regiones flanqueantes consenso humanas (hum III para el subgrupo III de cadenas pesadas (SEC.ID.Nº 11); hum\kappaI para el subgrupo I de cadenas ligeras \kappa (SEC.ID.Nº 12)). La Figura 1A alinea las secuencias del dominio variable de la cadena pesada y la Figura 1B alinea las secuencias del dominio variable de la cadena ligera. Los asteriscos indican diferencias entre F(ab)-12 humanizado y el Mab murino o entre F(ab)-12 y la región flanqueante humana. Las Regiones Determinantes de Complementariedad (CDR) están subrayadas.
Nº 9) y de la cadena ligera (SEC.ID.Nº 10) de muMAbVEGF A.4.6.1, el dominio variable de la cadena pesada (SEC.ID.Nº 7) y de la cadena ligera (SEC.ID.Nº 8) de F(ab) humanizado (F(ab)-12) y regiones flanqueantes consenso humanas (hum III para el subgrupo III de cadenas pesadas (SEC.ID.Nº 11); hum\kappaI para el subgrupo I de cadenas ligeras \kappa (SEC.ID.Nº 12)). La Figura 1A alinea las secuencias del dominio variable de la cadena pesada y la Figura 1B alinea las secuencias del dominio variable de la cadena ligera. Los asteriscos indican diferencias entre F(ab)-12 humanizado y el Mab murino o entre F(ab)-12 y la región flanqueante humana. Las Regiones Determinantes de Complementariedad (CDR) están subrayadas.
La Figura 2 es un diagrama en cintas del modelo
de los dominios VL y VH del F(ab)-12
humanizado. El dominio VL se muestra en marrón con los CDR en color
canela. La cadena lateral del resto L46 se muestra en amarillo. El
dominio VH se muestra en morado con los CDR en rosa. Las cadenas
laterales de los restos de VH cambiados del humano al murino se
muestran en amarillo.
La Figura 3 representa la inhibición de la
mitogénesis inducida por VEGF por F(ab)-12
anti-VEGF humanizado del Ejemplo 1. Se sembraron
células endoteliales capilares obtenidas de corteza adrenal bovina
a una densidad de 6 x 10^{3} células/pocillo en placas de seis
pocillos, como se describe en el Ejemplo 1. Se añadieron muMAb VEGF
A.4.6.1 o rhuMAb VEGF (IgG1; F(ab)-12) a las
concentraciones indicadas. Después de 2-3 horas, se
añadió rhVEGF165 a la concentración final de 3 ng/ml. Después de
cinco o seis días, las células se trataron con tripsina y se
contaron. Los valores mostrados son medias de determinaciones
duplicadas. La variación de la media no excede el
10%.
10%.
La Figura 4 muestra la inhibición del crecimiento
del tumor in vivo por F(ab)-12
anti-VEGF humanizado del Ejemplo 1. Se inyectaron
células A673 de rabdomiosarcoma en ratones desnudos BALB/c a una
densidad de 2 x 10^{6} por ratón. Comenzando 24 horas después de
la inoculación de las células tumorales, se inyectó a los animales
con un MAb control, muMAb VEGF A.4.6.1 o rhuVEGF MAb (IgG1;
F(ab)-12) dos veces por semana, por vía
intraperitoneal. La dosis de MAb control fue 5 mg/kg; los MAb
anti-VEGF se dieron a 0,5 o 5 mg/kg, como se indica
(n = 10). Cuatro semanas después de la inyección de las células
tumorales, los animales se sometieron a eutanasia y se retiraron los
tumores y se pesaron. *: diferencia significativa cuando se compara
con el grupo control por ANOVA (p < 0,05).
Las Figuras 5A y 5B muestran respectivamente las
secuencias de aminoácidos de los dominios variables de la cadena
pesada y ligera del anticuerpo A.4.6.1 murino (SEC.ID.Nº 10 para el
VL y SEC.ID.Nº 9 para el VH) y las variantes hu2.0 (SEC.ID.Nº 13
para el VL y SEC.ID.Nº 14 para el VH) y hu2.10 (SEC.ID.Nº 15 para
el VL y SEC.ID.Nº 16 para el VH) de A.4.6.1 humanizado del Ejemplo
2. La numeración de secuencias está de acuerdo con Kabat et al.,
Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5ª Ed. Public
Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)
y los desemparejamientos se indican por asteriscos (A.4.6.1 murino
vs hu2.0) o puntos (hu2.0 vs hu2.10). La variante hu2.0 contiene
solo las secuencias CDR (marcadas) del anticuerpo murino injertado
en una región flanqueante consenso del subgrupo I de cadenas ligeras
\kappa humanas (SEC.ID.Nº 12) y la región flanqueante consenso del
subgrupo III de cadenas pesadas (SEC.ID.Nº 11). hu2.10 era el clon
humanizado consenso obtenido de experimentos de clasificación de
fagos descritos en este documento.
La Figura 6 representa los restos flanqueantes
fijados como objetivo para aleatorización en el Ejemplo 2.
La Figura 7 representa la construcción de
fagémido para la presentación superficial de fusiones
Fab-pIII en fagos. El fagémido codifica una versión
humanizada del fragmento Fab para el anticuerpo A.4.6.1 fusionado a
una porción de la proteína de cubierta del gen III de M13. La
proteína de fusión consta del Fab unido al terminal carboxilo de la
cadena pesada a un resto de glutamina único (a partir de la
supresión de un codón ámbar en E. coli supE), después de la
región C-terminal de la proteína del gen III (restos
249-406). La transformación en E. coli
F^{+}, seguida de super-infección con el fago
auxiliar M13KO7, produce partículas fagémidas en las que una pequeña
porción de estas muestra una única copia de la proteína de
fusión.
Las Figuras 8A-E representan la
secuencia de nucleótidos de doble cadena (SEC.ID.Nº 99) para el
vector phMB4-19-1.6 del anticuerpo
presentado en fagos en el Ejemplo 3 y las dos secuencias de
aminoácidos codificadas de ese modo (SEC.ID.Nº 130 y Nº 100).
Las Figuras 9A y 9B representan respectivamente
una alineación de las secuencias de aminoácidos para los dominios
variables de la cadena ligera y pesada de variantes
anti-VEGF de afinidad madurada en el Ejemplo 3, en
comparación con F(ab)-12 del Ejemplo 1
(SEC.ID.Nº 8 y Nº 7 para los dominios variables de la cadena ligera
y pesada, respectivamente). Los CDR están subrayados y denominados
como L, cadena ligera, o H, cadena pesada, y los números
1-3. Los restos están enumerados secuencialmente en
los dominios VL y VH, a diferencia del esquema de numeración Kabat.
Se muestra la molécula molde, MB1.6 (SEC.ID.Nº 101 y Nº 102 para los
dominios variables de la cadena ligera y pesada, respectivamente)
junto con las variantes: H2305.6 (SEC.ID.Nº 103 y Nº 104 para los
dominios variables de la cadena ligera y pesada, respectivamente),
Y0101 (SEC.ID.Nº 105 y Nº 106 para los dominios variables de la
cadena ligera y pesada, respectivamente), e Y0192 (SEC.ID.Nº 107 y
Nº 108 para los dominios variables de la cadena ligera y pesada
respectivamente). Las diferencias con
F(ab)-12 se muestran en recuadros
sombrea-
dos.
dos.
Las Figuras 10A y 10B representan una alineación
de las secuencias de aminoácidos para los dominios variables de la
cadena ligera y pesada respectivamente de variantes
anti-VEGF de afinidad madurada del Ejemplo 3 en
comparación con F(ab)-12 del Ejemplo 1
(SEC.ID.Nº 8 y Nº 7 para los dominios variables de la cadena ligera
y pesada, respectivamente). Los CDR están subrayados y denominados
por L, cadena ligera, o H, cadena pesada, y los números
1-3. Las variantes se denominan
Y0243-1 (SEC.ID.Nº 109 y Nº 110 para los dominios
variables de la cadena ligera y pesada, respectivamente),
Y0238-3 (SEC.ID.Nº 111 y Nº 112 para los dominios
variables de la cadena ligera y pesada, respectivamente),
Y0313-1 (SEC.ID.Nº 113 y Nº 114 para los dominios
variables de la cadena ligera y pesada, respectivamente), e Y0317
(SEC.ID.Nº 115 y Nº 116 para los dominios variables de la cadena
ligera y pesada, respectivamente). Las diferencias con
F(ab)-12 se muestran en recuadros
sombrea-
dos.
dos.
La Figura 11 representa los resultados del ensayo
de actividad HuVEC en el Ejemplo 3 para las variantes
Y0238-3, Y0192 e Y0313-1 así como
F(ab)-12 de longitud completa del Ejemplo
1.
La Figura 12 representa la inhibición de la
mitogénesis inducida por VEGF por F(ab)-12 de
longitud completa del Ejemplo 1 (rhuMAb VEGF), un fragmento Fab de
F(ab)-12 del Ejemplo 1 (rhuFab VEGF), y un
fragmento Fab de la variante Y0317 de afinidad madurada del Ejemplo
3 (rhuFab VEGF (afinidad madurada)).
El término "VEGF humano" como se usa en este
documento se refiere al factor de crecimiento de células del
endotelio vascular humano de 165 aminoácidos, y a los factores de
crecimiento de células del endotelio vascular de 121, 189 y 206
aminoácidos relacionados, como se describe por Leung et al.,
Science 246:1306 (1989), y Houck et al., Mol. Endocrin.
5:1806 (1991) junto con las formas alélicas y procesadas de origen
natural de esos factores de crecimiento.
La presente invención proporciona anticuerpos
antagonistas anti-VEGF que son capaces de inhibir
una o más de las actividades de VEGF, por ejemplo, su actividad
mitogénica o angiogénica. Los antagonistas de VEGF funcionan
interfiriendo con la unión de VEGF a un receptor celular,
incapacitando o eliminando células que se han activado por VEGF, o
interfiriendo con la activación de células del endotelio vascular
después de la unión de VEGF a un receptor celular. Todos estos
puntos de intervención por un antagonista de VEGF se considerarán
equivalentes para los propósitos de esta invención.
El término "receptor de VEGF" o "VEGFr"
como se usa en este documento se refiere a un receptor celular para
VEGF, generalmente un receptor de superficie celular encontrado en
células del endotelio vascular, así como variantes del mismo que
mantienen la capacidad de unir hVEGF. Un ejemplo de un receptor de
VEGF es el receptor fms tipo tirosina quinasa (flt),
un receptor transmembrana de la familia tirosina quinasa. DeVries
et al., Science 255:989 (1992); Shibuya et al.,
Oncogene 5:519 (1990). El receptor flt comprende un
dominio extracelular, un dominio transmembrana, y un dominio
intracelular con actividad tirosina quinasa. El dominio extracelular
está implicado en la unión de VEGF, mientras que el dominio
intracelular está implicado en la transducción de señales. Otro
ejemplo de un receptor VEGF es el receptor
flk-1 (también mencionado como KDR). Matthews
et al., Proc. Nat. Acad. Sci. 88:9026 (1991); Terman et
al., Oncogene 6:1677 (1991); Terman et al., Biochem.
Biophys. Res. Commun. 187:1579 (1992). La unión de VEGF al
receptor flt da como resultado la formación de al menos dos
complejos de alto peso molecular, que tienen peso molecular
aparente de 205.000 y 300.000 Dalton. Se cree que el complejo de
300.000 Dalton es un dímero que comprende dos moléculas de receptor
unidas a una única molécula de VEGF.
El término "epítopo A.4.6.1" cuando se usa
en este documento, salvo que se indique lo contrario, se refiere a
la región de VEGF humano a la que se une el anticuerpo A.4.6.1
descrito en Kim et al., Growth Factors 7:53 (1992) y Kim
et al. Nature 362:841 (1993).
"Tratamiento" se refiere tanto a tratamiento
terapéutico como a medidas profilácticas o preventivas. Los
individuos con necesidad de tratamiento incluyen aquellos que ya
tienen el trastorno así como aquellos en los que el trastorno es
para prevenirlo.
"Mamífero" para propósitos de tratamiento se
refiere a cualquier animal clasificado como mamífero, incluyendo
humanos, animales domésticos y de granja, y animales de zoológico,
deportivos o de compañía, tales como perros, caballos, gatos, vacas,
etc. Preferiblemente, el mamífero es un humano.
"Anticuerpos" (Ab) e "inmunoglobulinas"
(Ig) son glicoproteínas que tienen las mismas características
estructurales. Mientras que los anticuerpos muestran especificidad
de unión a un antígeno específico, las inmunoglobulinas incluyen
tanto anticuerpos como otras moléculas tipo anticuerpo que carecen
de especificidad de antígeno. Los polipéptidos del último tipo se
producen, por ejemplo, a bajos niveles por el sistema linfoide y a
niveles aumentados por mielomas.
"Anticuerpos nativos" e "inmunoglobulinas
nativas" son habitualmente glicoproteínas heterotetraméricas de
aproximadamente 150.000 Dalton de dos cadenas ligeras idénticas (L)
y dos cadenas pesadas idénticas (H). Cada cadena ligera está unida a
una cadena pesada mediante un enlace disulfuro covalente, aunque la
cantidad de enlaces disulfuro varía entre las cadenas pesadas de
diferentes isotipos de inmunoglobulinas. Cada cadena pesada y ligera
también tiene puentes disulfuro intracatenarios espaciados de manera
regular. Cada cadena pesada tiene en un extremo un dominio variable
(V_{H}) seguido de varios dominios constantes. Cada cadena ligera
tiene un dominio variable en un extremo (V_{L}) y un dominio
constante en su otro extremo; el dominio constante de la cadena
ligera está alineado con el primer dominio constante de la cadena
pesada, y el dominio variable de la cadena ligera está alineado con
el dominio variable de la cadena pesada. Se cree que restos de
aminoácidos particulares forman una superficie de contacto entre
los dominios variables de la cadena ligera y pesada.
El término "variable" se refiere al hecho de
que ciertas porciones de los dominios variables difieren en gran
medida en la secuencia entre anticuerpos y se usan en la unión y
especificidad de cada anticuerpo particular para su antígeno
particular. Sin embargo, la variabilidad no está distribuida
uniformemente por todos los dominios variables de los anticuerpos.
Está concentrada en tres segmentos llamados regiones hipervariables
tanto en los dominios variables de la cadena ligera como de la
cadena pesada. Las porciones más altamente conservadas de los
dominios variables se llaman regiones flanqueantes (FR). Los
dominios variables de las cadenas pesada y ligera nativas
comprenden cada uno cuatro FR (FR1, FR2, FR3 y FR4,
respectivamente), que adoptan en gran medida una configuración
lámina-\beta, conectadas por tres regiones
hipervariables, que forman bucles que conectan, y en algunos casos
forman parte de la estructura lámina-\beta. Las
regiones hipervariables en cada cadena se mantienen juntas en
estrecha proximidad por las FR y, con las regiones hipervariables
de otra cadena, contribuyen a la formación del sitio de unión a
antígeno de los anticuerpos (véase Kabat et al., Sequences of
Proteins of Immunological Interest, 5ª Ed. Public Health
Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991),
páginas 647-669). Los dominios constantes no están
implicados directamente en la unión del anticuerpo a un antígeno,
pero muestran diversas funciones efectoras, tales como participación
del anticuerpo en la toxicidad celular dependiente de
anticuerpo.
El término "región hipervariable" cuando se
usa en este documento se refiere a los restos de aminoácidos de un
anticuerpo que son responsables de la unión al antígeno. La región
hipervariable comprende restos de aminoácidos de una "región
determinante de complementariedad" o "CDR" (es decir, los
restos 24-24 (L1), 50-56 (L2) y
89-97 (L3) en el dominio variable de la cadena
ligera y 31-35 (H1), 50-65 (H2) y
95-102 (H3) en el dominio variable de la cadena
pesada; Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological
Interest, 5ª Ed. Public Health Service, National Institutes of
Health, Bethesda, MD. (1991)) y/o los restos de un "bucle
hipervariable" (es decir, los restos 26-32 (L1),
50-52 (L2) y 91-96 (L3) en el
dominio variable de la cadena ligera y 26-32 (H1),
53-55 (H2) y 96-101 (H3) en el
dominio variable de la cadena pesada; Chothia y Lesk J. Mol.
Biol. 196:901-917 (1987)). Los restos
"flanqueantes" o "FR" son los restos de los dominios
variables distintos de los restos de la región hipervariable como
se define en este documento.
La digestión de anticuerpos con papaína produce
dos fragmentos de unión a antígeno idénticos, llamados fragmentos
"Fab", cada uno con un único sitio de unión a antígeno, y un
fragmento "Fc" residual, cuyo nombre refleja su capacidad de
cristalizar fácilmente. El tratamiento con pepsina produce un
fragmento F(ab')_{2} que tiene dos sitios de combinación
de antígeno y aún es capaz del entrecruzamiento de antígeno.
"Fv" es el fragmento de anticuerpo mínimo
que contiene un sitio completo de reconocimiento o unión al
antígeno. Esta región consta de un dímero de un dominio variable de
la cadena pesada y uno de la cadena ligera en fuerte asociación no
covalente. Está en la configuración en que las tres regiones
hipervariables de cada dominio variable interaccionan para definir
un sitio de unión a antígeno en la superficie del dímero
V_{H}-V_{L}. Colectivamente, las seis regiones
hipervariables confieren al anticuerpo la especificidad de unión al
antígeno. Sin embargo, incluso un único dominio variable (o medio de
un Fv que comprende sólo tres regiones hipervariables específicas
para un antígeno) tiene la capacidad de reconocer y unir antígeno,
aunque a una afinidad inferior que el sitio de unión completo.
El fragmento Fab también contiene el dominio
constante de la cadena ligera y el primer dominio constante (CH1) de
la cadena pesada. Los fragmentos Fab' difieren de los fragmentos Fab
por la adición de unos pocos residuos en el terminal carboxilo del
dominio CH1 de la cadena pesada que incluye una o más cisteínas de
la región bisagra del anticuerpo. Fab'-SH es la
denominación en este documento para Fab' en el que el resto o
restos de cisteína de los dominios constantes contienen un grupo
tiol libre. Los fragmentos de anticuerpo F(ab')_{2} en un
principio se produjeron como pares de fragmentos Fab' que tienen
cisteínas bisagra entre ellos. También se conocen otros
acoplamientos químicos de fragmentos de anticuerpos.
Las "cadenas ligeras" de anticuerpos
(inmunoglobulinas) de cualquier especie vertebrada pueden asignarse
a dos tipos claramente distintos, llamados kappa (\kappa) y lambda
(\lambda), basados en las secuencias de aminoácidos de sus
dominios constantes.
Dependiendo de la secuencia de aminoácidos del
dominio constante de sus cadenas pesadas, las inmunoglobulinas se
asignan a diferentes clases. Hay cinco clases principales de
inmunoglobulinas: IgA, IgD, IgE, IgG, e IgM, y varias de estas
pueden dividirse adicionalmente en subclases (isotipos), por
ejemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, e IgA2. Los dominios
constantes de la cadena pesada que corresponden a diferentes clases
de inmunoglobulinas se llaman \alpha, \delta, \varepsilon,
\gamma, y \mu, respectivamente. Se conocen bien las estructuras
de las subunidades y las configuraciones tridimensionales de
diferentes clases de inmunoglobulinas.
El término "anticuerpo" se usa en este
documento en el sentido más amplio y cubre específicamente
anticuerpos monoclonales (incluyendo anticuerpos monoclonales de
longitud completa), anticuerpos policlonales, anticuerpos
multiespecíficos (por ejemplo, anticuerpos biespecíficos), y
fragmentos de anticuerpos mientras que muestren la actividad
biológica deseada.
Los "fragmentos de anticuerpo" comprenden
una porción de un anticuerpo de longitud completa, generalmente el
dominio variable o de unión a antígeno del mismo. Los ejemplos de
fragmentos de anticuerpos incluyen fragmentos Fab, Fab',
F(ab')_{2}, y Fv; fragmentos bivalentes; anticuerpos
lineales; moléculas de anticuerpo de cadena simple; y anticuerpos
multiespecíficos formados a partir de fragmentos de
anticuerpos.
El término "anticuerpo monoclonal" como se
usa en este documento se refiere a un anticuerpo obtenido a partir
de una población de anticuerpos sustancialmente homogénea, es decir,
los anticuerpos individuales que comprenden la población son
idénticos excepto para posibles mutaciones de origen natural que
pueden estar presentes en cantidades minoritarias. Los anticuerpos
monoclonales son altamente específicos, estando dirigidos frente a
un sitio antigénico único. Además, en contraste con preparaciones de
anticuerpos (policlonales) convencionales que incluyen típicamente
diferentes anticuerpos dirigidos frente a diferentes determinantes
(epítopos), cada anticuerpo monoclonal está dirigido frente a un
determinante único en el antígeno. El modificador "monoclonal"
indica el carácter del anticuerpo que se obtiene de una población
sustancialmente homogénea de anticuerpos, y no se interpreta que
requiere una producción del anticuerpo por ningún método particular.
Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales a usar de acuerdo con la
presente invención pueden hacerse por el método de hibridoma
descrito por primera vez por Kohler et al., Nature 256:495
(1975), o puede hacerse por métodos de ADN recombinante (véase, por
ejemplo, la Patente de EEUU Nº 4.816.567). Los "anticuerpos
monoclonales" también pueden aislarse de bibliotecas de
anticuerpos en fagos usando las técnicas descritas en Clackson
et al., Nature 352:624-628 (1991) y Marks
et al., J. Mol. Biol. 222:581-597 (1991),
por ejemplo.
Los anticuerpos monoclonales incluyen
específicamente en este documento anticuerpos "quiméricos"
(inmunoglobulinas) en los que una porción de la cadena pesada y/o
ligera es idéntica u homóloga a secuencias correspondientes en
anticuerpos obtenidos de una especie particular o que pertenece a
una clase o subclase de anticuerpo particular, mientras que el resto
de la cadena o cadenas es idéntico u homólogo a secuencias
correspondiente en anticuerpos obtenidos de otra especie o que
pertenecen a otra clase o subclase de anticuerpo, así como
fragmentos de dichos anticuerpos, mientras que muestren la actividad
biológica deseada (Patente de EEUU Nº 4.816.567; y Morrison et
al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855
(1984)).
Las formas "humanizadas" de anticuerpos no
humanos (por ejemplo, murinos) son anticuerpos quiméricos que
contienen una secuencia mínima obtenida de una inmunoglobulina no
humana. Para la mayor parte, los anticuerpos humanizados son
inmunoglobulinas humanas (anticuerpo receptor) en las que los restos
de la región hipervariable del receptor se reemplazan por restos de
la región hipervariable de una especie no humana (anticuerpo
donante) tal como un ratón, rata, conejo o primate no humano que
tiene la especificidad, afinidad, y capacidad deseadas. En algunos
casos, los restos de la región flanqueante (FR) de la
inmunoglobulina humana se reemplazan por los residuos no humanos
correspondientes. Además, los anticuerpos humanizados pueden
comprender restos que no se encuentran en el anticuerpo receptor o
en el anticuerpo donante. Estas modificaciones se hacen para
perfeccionar adicionalmente la función del anticuerpo. En general,
el anticuerpo humanizado comprenderá sustancialmente todo de la
menos uno, y típicamente dos dominios variables, en los que todo o
sustancialmente todo de las regiones hipervariables corresponde a
las de una inmunoglobulina no humana y todo o sustancialmente todo
de los FR es de los de una secuencia de una inmunoglobulina humana.
El anticuerpo humanizado opcionalmente también comprenderá al menos
una porción de una región constante (Fc) de una inmunoglobulina,
típicamente la de una inmunoglobulina humana. Para más detalles,
véase Jones et al., Nature 321:522-525
(1986); Reichmann et al., Nature 332:323-329
(1988); y Presta, Curr. Op. Struct. Biol.
2:593-596 (1992).
Los fragmentos de anticuerpo "Fv de cadena
simple" o "sFv" comprenden los dominios V_{H} y V_{L}
del anticuerpo, donde estos dominios están presentes en una sola
cadena polipeptídica. Generalmente, el polipéptido Fv también
comprende un enlazador polipeptídico entre los dominios V_{H} y
V_{L} que posibilita que el sFv forme la estructura deseada para
la unión al antígeno. Para un análisis de sFv véase Pluckthun en
The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113,
Rosenburg and Moore eds. Springer-Verlag, Nueva
York, pág. 269-315 (1994).
El término "fragmentos bivalentes" se
refiere a pequeños fragmentos de anticuerpo con dos sitios de unión
a antígeno, que comprenden dichos fragmentos un dominio variable de
la cadena pesada (V_{H}) conectado a un dominio variable de la
cadena ligera (V_{L}) en la misma cadena polipeptídica
(V_{H}-V_{L}). Usando un enlazador que es
demasiado corto para permitir el emparejamiento entre dos dominios
en la misma cadena, los dominios se fuerzan a emparejar con los
dominios complementarios de otra cadena y crear dos sitios de unión
a antígeno. Los fragmentos bivalentes se describen más a fondo en,
por ejemplo, el documento EP 404.097; el documento WO 93/11161; y
Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA
90:6444-6448 (1993).
La expresión "anticuerpos lineales" cuando
se usa en toda esta solicitud se refiere a los anticuerpos descritos
en Zapata et al. Protein Eng.
8(10):1057-1062 (1995). Brevemente, estos
anticuerpos comprenden un par de segmentos Fd en tándem
(V_{H}-C_{H}1-V_{H}-C_{H}1)
que forman un par de regiones de unión a antígeno. Los anticuerpos
lineales pueden ser biespecíficos o monoespecíficos.
Una "variante" de un anticuerpo
anti-VEGF, se refiere en este documento a una
molécula que difiere en la secuencia de aminoácidos de una secuencia
de aminoácidos del anticuerpo anti-VEGF parental
debido a la adición, deleción y/o sustitución de uno o más restos de
aminoácidos en la secuencia del anticuerpo parental. En la
realización preferida, la variante comprende una o más sustituciones
de aminoácidos en una o más regiones hipervariables del anticuerpo
parental. Por ejemplo, la variante puede comprender al menos uno,
por ejemplo, de aproximadamente uno a aproximadamente diez, y
preferiblemente de aproximadamente dos a aproximadamente cinco,
sustituciones en una o más regiones hipervariables del anticuerpo
parental. Generalmente, la variante tendrá una secuencia de
aminoácidos que tiene al menos el 75% de identidad de la secuencia
de aminoácidos con las secuencias del dominio variable de la cadena
pesada o ligera del anticuerpo parental (por ejemplo, como en
SEC.ID.Nº 7 o Nº 8), más preferiblemente al menos el 80%, más
preferiblemente al menos el 85%, más preferiblemente al menos el
90%, y mucho más preferiblemente al menos el 95%. La identidad u
homología con respecto a esta secuencia se define en este documento
como el porcentaje de restos de aminoácidos en la secuencia
candidata que son idénticos a los restos del anticuerpo parental,
después de alinear las secuencias e introducir huecos, si es
necesario, para conseguir el máximo porcentaje de identidad de
secuencia. Ninguna extensión, deleción, o inserción
N-terminal, C-terminal, o interna en
la secuencia del anticuerpo se interpretará que afecta a la
identidad u homología de secuencia. La variante mantiene la
capacidad de unir VEGF humano y preferiblemente tiene propiedades
que son superiores a las del anticuerpo parental. Por ejemplo, la
variante puede tener una afinidad de unión más fuerte, capacidad
potenciada de inhibir la proliferación inducida por VEGF de células
endoteliales y/o capacidad aumentada de inhibir la angiogénesis
inducida por VEGF in vivo. Para analizar dichas propiedades,
se debe comparar una forma Fab de la variante a una forma Fab del
anticuerpo parental o una forma de longitud completa de la variante
a una forma de longitud completa del anticuerpo parental, por
ejemplo, aunque se ha descubierto que el formato del anticuerpo
anti-VEGF afecta a su actividad en los ensayos de
actividad biológica descritos en este documento. La variante de un
anticuerpo de interés particular en este documento es uno que
muestra una potenciación de al menos aproximadamente 10 veces,
preferiblemente al menos aproximadamente 20 veces, y más
preferiblemente al menos aproximadamente 50 veces, en la actividad
biológica cuando se compara con el anticuerpo parental.
El anticuerpo "parental" en este documento
es uno que está codificado por una secuencia de aminoácidos usada
para la preparación de la variante. Preferiblemente, el anticuerpo
parental tiene una región flanqueante humana y, si está presente,
tiene una región o regiones constantes de anticuerpo humano. Por
ejemplo, el anticuerpo parental puede ser un anticuerpo humanizado o
humano.
Un anticuerpo "aislado" es uno que se ha
identificado o separado y/o recuperado de un componente de su medio
natural. Los componentes contaminantes de su medio natural son
materiales que podrían interferir con los usos de diagnóstico o
terapéuticos para el anticuerpo, y pueden incluir enzimas, hormonas,
y otros solutos proteicos o no proteicos. En realizaciones
preferidas, el anticuerpo se purificará (1) a más del 95% en peso
del anticuerpo determinado por el método de Lowry, y más
preferiblemente a más del 99% en peso, (2) a un grado suficiente
para obtener al menos 15 restos de la secuencia de aminoácidos
N-terminales o internos por el uso de un
secuenciador de cubeta giratoria, o (3) hasta homogeneidad por
SDS-PAGE en condiciones reductoras o no reductoras
usando azul de Coomassie o, preferiblemente, tinción con plata. Un
anticuerpo aislado incluye el anticuerpo in situ en células
recombinantes ya que al menos un componente del medio natural del
anticuerpo no estará presente. Generalmente, sin embargo, el
anticuerpo aislado se preparará por al menos un etapa de
purificación.
El término "epítopo señalado" cuando se usa
en este documento se refiere al anticuerpo anti-VEGF
fusionado a un "señalador de epítopo". El polipéptido señalador
de epítopo tiene suficientes restos para proporcionar un epítopo
frente al que puede hacerse un anticuerpo, pero es suficientemente
corto para no interferir con la actividad del anticuerpo
anti-VEGF. El señalador de epítopo preferiblemente
es suficientemente único para que el anticuerpo frente al mismo no
reaccione sustancialmente de manera cruzada con otros epítopos. Los
polipéptidos señaladores apropiados generalmente tienen al menos 6
restos de aminoácido y habitualmente entre aproximadamente
8-50 restos de aminoácido (preferiblemente entre
aproximadamente 9-30 restos). Los ejemplos incluyen
el polipéptido señalador flu HA y su anticuerpo 12CA5 (Field et
al. Mol. Cell. Biol. 8:2159-2165 (1988)); el
señalador c-myc y los anticuerpos 8F9, 3C7, 6E10,
G4, B7 y 9E10 frente al mismo (Evan et al., Mol. Cell. Biol.
5(12):3610-3616 (1985)); y el señalador de la
glicoproteína D (gD) del virus de Herpes Simplex y su anticuerpo
(Paborsky et al., Protein Engineering
3(6):547-553 (1990)). En ciertas
realizaciones, el señalador de epítopo es un "epítopo de unión al
receptor de rescate". Como se usa en este documento, el término
"epítopo de unión al receptor de rescate" se refiere a un
epítopo de la región Fc de una molécula IgG (por ejemplo,
IgG_{1}, IgG_{2}, IgG_{3}, o IgG_{4}) que es responsable de
aumentar la vida media en suero in vivo de la molécula
IgG.
El término "agente citotóxico" como se usa
en este documento se refiere a una sustancia que inhibe o evita la
función de células y/o causa la destrucción de células. Se pretende
que el término incluya isótopos radiactivos (por ejemplo,
I^{131}, I^{125}, Y^{90} y Re^{186}), agentes
quimioterapéuticos, y toxinas tales como toxinas enzimáticamente
activas de origen bacteriano, fúngico, vegetal o animal, o
fragmentos de las mismas.
Un "agente quimioterapéutico" es un
compuesto químico útil en el tratamiento del cáncer. Los ejemplos de
agentes quimioterapéuticos incluyen Adriamicina, Doxorrubicina,
5-Fluorouracil, Arabinósido de citosina
("Ara-C"), Ciclofosfamida, Tiotepa, Taxotere
(docetaxel), Busulfan, Citoxina, Taxol, Metotrexato, Cisplatino,
Melfalan, Vinblastina, Bleomicina, Etopósido, Ifosfamida,
Mitomicina C, Mitoxantrona, Vincristina, Vinorelbina, Carboplatino,
Tenipósido, Daunomicina, Carminomicina, Aminopterina, Dactinomicina,
Mitomicinas, Espiramincinas (véase Patente de EEUU Nº 4.675.187),
Melfalan y otras mostazas de nitrógeno relacionadas.
El término "profármaco" como se usa en esta
solicitud se refiere a una forma precursora o derivada de una
sustancia farmacéuticamente activa que es menos citotóxica para las
células tumorales en comparación con el fármaco parental y es capaz
de activarse o convertirse enzimáticamente en la forma parental más
activa. Véase, por ejemplo, Wilman, "Prodrugs in Cancer
Chemotherapy" Biochemical Society Transactions, 14, pág.
375-382, 615ª Meeting Belfast (1986) y Stella et
al., "Prodrugs: A Chemical Approach to Targeted Drug
Delivery", Directed Drug Delivery, Borchardt et
al., (ed.), pág. 247-267, Humana Press (1985).
Los profármacos de esta invención incluyen, aunque sin limitación,
profármacos que contienen fosfato, profármacos que contienen
tiofosfato, profármacos que contienen sulfato, profármacos que
contienen péptidos, profármacos modificados por
D-aminoácidos, profármacos glicosilados,
profármacos que contienen \beta-lactama,
profármacos que contienen fenoxiacetamida opcionalmente sustituida
o profármacos que contienen fenilacetamida opcionalmente sustituida,
5-fluorocitosina y otros profármacos de
5-fluorouridina que pueden convertirse en el fármaco
libre citotóxico más activo. Los ejemplos de fármacos citotóxicos
que pueden derivatizarse en una forma de profármaco para usar en
esta invención incluyen, aunque sin limitación, los agentes
quimioterapéuticos descritos anteriormente.
La palabra "marcador" cuando se usa en este
documento se refiere a un compuesto o composición detectable que se
conjuga directa o indirectamente al anticuerpo. El marcador puede
ser detectable por sí mismo (por ejemplo, marcadores de
radioisótopos o marcadores fluorescentes) o, en el caso de un
marcador enzimático, puede catalizar la alteración química de un
compuesto o composición sustrato que es detectable.
Por "fase sólida" se quiere decir una matriz
no acuosa a la que puede adherirse el anticuerpo de la presente
invención. Los ejemplos de fases sólidas incluidas en este documento
incluyen las formadas parcial o completamente de vidrio (por
ejemplo, vidrio de poro controlado), polisacáridos (por ejemplo,
agarosa), poliacrilamidas, poliestireno, alcohol de polivinilo y
siliconas. En ciertas realizaciones, según el contexto, la fase
sólida puede comprender el pocillo de una placa de ensayo; en otras
es una columna de purificación (por ejemplo, una columna de
cromatografía de afinidad). Este término también incluye una fase
sólida discontinua de partículas discretas, tales como las descritas
en la Patente de EEUU Nº 4.275.149.
Un "liposoma" es una pequeña vesícula
compuesta de diversos tipos de lípidos, fosfolípidos y/o un
tensioactivo que es útil para el suministro de un fármaco (tal como
los anticuerpos anti-VEGF descritos en este
documento y, opcionalmente, un agente quimioterapéutico) a un
mamífero. Los componentes del liposoma se colocan habitualmente en
una formación de bicapa, similar a la colocación lipídica de
membranas biológicas. Una molécula de ácido nucleico "aislada"
es una molécula de ácido nucleico que está identificada y separada
de al menos una molécula de ácido nucleico contaminante que está
generalmente asociada en la fuente natural del ácido nucleico del
anticuerpo. Una molécula de ácido nucleico aislada es distinta en la
forma o el medio en que se encuentra en la naturaleza. Por lo tanto,
las moléculas de ácido nucleico aisladas se distinguen de la
molécula de ácido nucleico que existe en células naturales. Sin
embargo, una molécula de ácido nucleico aislada incluye una molécula
de ácido nucleico contenida en células que expresan generalmente el
anticuerpo donde, por ejemplo, la molécula de ácido nucleico está en
una localización cromosómica distinta de la de las células
naturales.
La expresión "secuencias de control" se
refiere a secuencias de ADN necesarias para la expresión de una
secuencia codificante unida de manera operativa en un organismo
hospedador particular. Las secuencias de control que son apropiadas
para procariotas, por ejemplo, incluyen un promotor, opcionalmente
una secuencia operadora, y un sitio de unión a ribosoma. Se sabe
que las células eucariotas utilizan promotores, señales de
poliadenilación, y potenciado-
res.
res.
Un ácido nucleico está "unido de manera
operativa" cuando está colocado en una relación funcional con
otra secuencia de ácido nucleico. Por ejemplo, el ADN para una
presecuencia o líder de secreción está unido de manera operativa a
un ADN para un polipéptido si se expresa como una preproteína que
participa en la secreción del polipéptido; un promotor o potenciador
está unido de manera operativa a una secuencia codificante si
influye en la transcripción de la secuencia; o un sitio de unión a
ribosoma está unido de manera operativa a una secuencia codificante
si está colocado de modo que facilita la traducción. Generalmente,
"unido de manera operativa" significa que las secuencias de ADN
que se unen son contiguas y, en el caso de un líder secretor,
contiguas en la fase de lectura. Sin embargo, los potenciadores no
tienen que ser contiguos. La unión se consigue por ligamiento en
sitios de restricción adecuados. Si dichos sitios no existen, se
usan adaptadores o enlazadores oligonucleotídicos sintéticos de
acuerdo con la práctica convencional.
Como se usa en este documento, las expresiones
"célula", "línea celular", y "cultivo celular" se
usan de manera intercambiable y todas estas denominaciones incluyen
progenie. Por tanto, las palabras "transformantes" y "células
transformadas" incluyen la célula sujeto primaria y los cultivos
obtenidos de la misma sin considerar la cantidad de transferencias.
También se entiende que toda la progenie puede no ser exactamente
idéntica en el contenido de ADN, debido a mutaciones deliberadas o
involuntarias. Se incluye la progenie mutante que tiene la misma
función o actividad biológica que la investigada en la célula
transformada en un principio. Cuando se pretenden distintas
denominaciones, quedará claro del contexto.
Los ejemplos posteriores describen la producción
de anticuerpos anti-VEGF humanizados y variantes
con propiedades deseables desde una perspectiva terapéutica que
incluyen: (a) fuerte afinidad de unión por el antígeno VEGF; (b)
capacidad para inhibir la proliferación inducida por VEGF de
células endoteliales in vitro; y (c) capacidad para inhibir
la angiogénesis inducida por VEGF in vivo.
Las afinidades de los anticuerpos pueden
determinarse como se describe en los ejemplos posteriores. Los
anticuerpos humanizados o variantes preferidos son los que unen VEGF
humano con un valor K_{d} de no más de aproximadamente 1 x
10^{-7} M; preferiblemente no más de aproximadamente 1 x 10^{-8}
M; y más preferiblemente no más de aproximadamente 5 x 10^{-9}
M.
Aparte de anticuerpos con fuerte afinidad de
unión por VEGF humano, también es deseable seleccionar anticuerpos
humanizados o variantes que tienen otras propiedades beneficiosas
desde una perspectiva terapéutica. Por ejemplo, el anticuerpo puede
ser uno que inhibe el crecimiento celular endotelial en respuesta a
VEGF. En una realización, el anticuerpo puede ser capaz de inhibir
la proliferación celular del endotelio capilar bovino en respuesta a
una concentración de eficacia casi máxima de VEGF (3 ng/ml).
Preferiblemente, el anticuerpo tiene un valor de dosis 50 (ED50)
eficaz de no más de aproximadamente 5 nM, preferiblemente no más de
aproximadamente 1 nM, y mucho más preferiblemente no más de
aproximadamente 0,5 nM, para inhibir la proliferación inducida por
VEGF de células endoteliales en este "ensayo de crecimiento
celular endotelial", es decir, a estas concentraciones el
anticuerpo es capaz de inhibir el crecimiento celular endotelial
inducido por VEGF in vitro al 50%. Un "ensayo de
crecimiento celular endotelial" preferido implica cultivar
células del endotelio capilar obtenidas de corteza adrenal en
presencia de medio de Eagle modificado por Dulbecco bajo en glucosa
(DEMEM) (GIBCO) suplementado con suero de ternera al 10%, glutamina
2 mM, y antibióticos (medio de crecimiento), esencialmente como se
describe en el Ejemplo 1 posterior. Estas células endoteliales se
siembran a una densidad de 6 x 10^{3} células por pocillo, en
placas de 6 pocillos en medio de crecimiento. El anticuerpo
anti-VEGF parental (control), el anticuerpo
anti-VEGF humanizado o la variante se añade después
a concentraciones que varían entre 1 y 5000 ng/ml. Después de
2-3 horas, se añade VEGF purificado a una
concentración final de 3 ng/ml. Para control de especificidad, cada
anticuerpo puede añadirse a las células endoteliales a la
concentración de 5000 ng/ml, solos o en presencia de 2 ng/ml de
bFGF. Después de cinco o seis días, las células de disocian por
exposición a tripsina y se cuentan en un contador Coulter (Coulter
Electronics, Hialeah, FL). Los datos pueden analizarse por un
programa de ajuste a curva de cuatro parámetros (KaleidaGraph).
El anticuerpo anti-VEGF
humanizado o variante preferido también puede ser uno que tiene una
actividad de supresión tumoral in vivo. Por ejemplo, el
anticuerpo puede suprimir el crecimiento de células A673 de
rabdomiosarcoma humanas o células
MDA-MB-435 de carcinoma de mama en
ratones desnudos. Para estudios de tumores in vivo, se
cultivan células A673 de rabdomiosarcoma humano (ATCC; CRL1598) o
células MDA-MB-435 (disponibles por
la ATCC) en DMEM/F12 suplementado con suero bovino fetal al 10%,
glutamina 2 mM y antibióticos como se describe en el Ejemplo 1
posterior. Se inyectan por vía subcutánea ratones desnudos BALB/c
hembra de 6-10 semanas de edad con 2 x 10^{6}
células tumorales en el área dorsal en un volumen de 200 \mul.
Después los animales se tratan con el anticuerpo humanizado o
variante y un anticuerpo control sin actividad en este ensayo. El
MAb anti-VEGF humanizado o variante se administra a
una dosis de 0,5 y/o 5 mg/kg. Cada MAb se administra dos veces por
semana por vía intraperitoneal en un volumen de 100 \mul,
comenzando 24 horas después de la inoculación de las células
tumorales. El tamaño del tumor se determina a intervalos semanales.
Cuatro semanas después de la inoculación de células tumorales, los
animales se someten a eutanasia y se retiran los tumores y se pesan.
El análisis estadístico puede realizarse por ANOVA. Preferiblemente,
el anticuerpo en este "ensayo de tumor in vivo" inhibe
aproximadamente el 50-100%, preferiblemente
aproximadamente el 70-100% y más preferiblemente
aproximadamente el 80-100% del crecimiento de las
células tumorales A673 humanas a una dosis de 5 mg/kg.
En la realización preferida, el anticuerpo
humanizado o variante no logra provocar una respuesta inmunogénica
sobre la administración de una cantidad terapéuticamente eficaz del
anticuerpo a un paciente humano. Si se provoca una respuesta
inmunogénica, la respuesta preferiblemente será de tal modo que el
anticuerpo aún proporcione un beneficio terapéutico al paciente
tratado con el mismo.
El anticuerpo humanizado o variante también es
preferiblemente uno que es capaz de inhibir la angiogénesis inducida
por VEGF en un humano, por ejemplo, para inhibir el crecimiento
tumoral humano y/o inhibir la angiogénesis intraocular en trastornos
retinales.
Los anticuerpos preferidos se unen al "epítopo
A.4.6.1" como se define en este documento. Para buscar
anticuerpos que se unen al epítopo de un VEGF humano unido por un
anticuerpo de interés (por ejemplo, los que bloquean la unión del
anticuerpo A.4.6.1 al VEGF humano), se puede realizar un ensayo de
bloqueo cruzado de rutina tal como el descrito en Antibodies, A
Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow y
David Lane (1988). Como alternativa, se pude realizar un mapeo de
epítopos, por ejemplo, como se describe en Champe et al., J.
Biol. Chem, 270:1388-1394 (1995), para
determinar si el anticuerpo se une a un epítopo de interés.
Los anticuerpos de la realización preferida en
este documento tienen un dominio variable de la cadena pesada que
comprende una secuencia de aminoácidos representada por la fórmula:
FR1-CDRH1-FR2-CDRH2-FR3-CDRH3-FR4,
donde "FR1-4" representan las cuatros regiones
flanqueantes y "CDRH1-3" representan las tres
regiones hipervariables de un dominio variable de la cadena pesada
de un anticuerpo anti-VEGF. FR1-4
derivan de una "secuencia consenso" (es decir, los aminoácidos
más habituales de una clase, subclase o subgrupo de cadenas pesadas
o ligeras de inmunoglobulinas humanas) como en los ejemplos
posteriores. Muchas secuencias de regiones flanqueantes de
anticuerpos humanos se recopilan en Kabat et al., supra, por
ejemplo. La FR del dominio variable de la cadena pesada se
proporciona por una secuencia consenso de un subgrupo de
inmunoglobulinas humanas recopilado por Kabat et al., supra.
El subgrupo de inmunoglobulinas humanas es el subgrupo III de
cadenas pesadas humanas (por ejemplo, como en SEC.ID.Nº 11).
La secuencia FR del dominio variable de la cadena
pesada humana tiene sustituciones en ella, por ejemplo, donde el
resto de FR humano se reemplaza por un resto no humano
correspondiente (por "resto no humano correspondiente" se
quiere decir el resto no humano con la misma numeración posicional
de Kabat que el resto humano de interés cuando se alinean las
secuencias humana y no humana), pero el reemplazamiento con el resto
no humano no es necesario. Por ejemplo, un reemplazamiento de un
resto de FR distinto del resto no humano correspondiente puede
seleccionarse por la presentación en fagos (véase Ejemplo 2
posterior). Los restos de FR del dominio variable de la cadena
pesada que pueden contener sustituciones incluyen uno cualquiera o
más de los restos de FR con número: 37H, 49H, 67H, 69H, 71H, 73H,
75H, 76H, 78H, 94H (numeración de restos de Kabat empleada aquí).
Preferiblemente están sustituidos al menos dos, o al menos tres, o
al menos cuatro de estos restos. Una combinación particularmente
preferida de sustituciones de FR es: 49H, 69H, 71H, 73H, 76H, 78H,
y 94H.
Con respecto a las regiones hipervariables de la
cadena pesada, éstas tienen las siguientes secuencias de
aminoácidos:
CDRH1
GYX_{1}X_{2}X_{3}X_{4}YGX_{5}N
(SEC.ID.Nº 117), donde X_{1} es D, T o E, pero preferiblemente es
D o T; X_{2} es F, W, o Y, pero preferiblemente es F; X_{3} es
T, Q, G o S, pero preferiblemente es T; X_{4} es H o N; y X_{5}
es M o I, pero preferiblemente es M.
CDRH2
WINTX_{1}TGEPTYAADFKR (SEC.ID.Nº 118), donde
X_{1} es Y o W, pero preferiblemente es Y.
CDRH3
YPX_{1}YX_{2}X_{3}X_{4}X_{5}HWYFDV
(SEC.ID.Nº 119), donde X_{1} es H o Y; X_{2} es Y, R, K, I, T,
E, o W, pero preferiblemente es Y; X_{3} es G, N, A, D, Q, E, T,
K, o S, pero preferiblemente es G; X_{4} es S, T, K, Q, N, R, A,
E, o G, pero preferiblemente es S o T; y X_{5} es S o G, pero
preferiblemente es S.
El dominio variable de la cadena pesada
opcionalmente comprende lo que se ha denominado "CDR7" en este
documento en FR3 (es decir, forma parte de ella) (véanse Figuras 9B
y 10B), donde CDR7 puede tener la siguiente secuencia de
aminoácidos:
CDR7
X_{1}SX_{2}DX_{3}X_{4}X_{5}X_{6}TX_{7}
(SEC.ID.Nº 120), donde X_{1} es F, I, V, L, o A, pero
preferiblemente es F; X_{2} es A, L, V, o I, pero preferiblemente
es L; X_{3} es T, V o K, pero preferiblemente es T; X_{4} es S
o W, pero preferiblemente es S; X_{5} es S o K, pero
preferiblemente es K; X_{6} es N, o S, pero preferiblemente es S;
y X_{7} es V, A, L o I, pero preferiblemente es A.
Los anticuerpos de la realización preferida en
este documento tienen un dominio variable de la cadena ligera que
comprende una secuencia de aminoácidos representada por la fórmula:
FR1-CDRL1-FR2-CDRL2-FR3-CDRL3-FR4,
donde "FR1-4" representan las cuatro regiones
flanqueantes y "CDRL1-3" representan las tres
regiones hipervariables de un dominio variable de la cadena ligera
de un anticuerpo anti-VEGF. FR1-4
derivan de una "secuencia consenso" (es decir, los aminoácidos
más habituales de una clase, subclase o subgrupo de cadenas pesadas
o ligeras de inmunoglobulinas humanas) como en los ejemplos
posteriores. La FR del dominio variable de la cadena ligera se
proporciona por una secuencia consenso de un subgrupo de
inmunoglobulinas humanas recopilado por Kabat et al., supra.
El subgrupo de inmunoglobulinas humanas es el subgrupo I de cadenas
ligeras kappa (por ejemplo, como en SEC.ID.Nº 12).
La secuencia de FR del dominio variable de la
cadena ligera tiene sustituciones en la misma, por ejemplo, donde el
resto de FR humano se reemplaza por un resto de ratón
correspondiente, pero el reemplazamiento con el resto no humano no
es necesario. Por ejemplo, un reemplazamiento de un resto distinto
del resto no humano correspondiente puede seleccionarse por la
presentación en fagos (véase el Ejemplo 2 posterior).
Preferiblemente sólo se sustituye 46L. En otra realización se
sustituyen tanto 4L como 46L (enumeración de restos de Kabat
empleada
aquí).
aquí).
Con respecto a los CDR, éstos tienen las
siguientes secuencias de aminoácidos:
CDRL1
X_{1}AX_{2}X_{3}X_{4}X_{5}SNYLN
(SEC.ID.Nº 121), donde X_{1} es R o S, pero preferiblemente es S;
X_{2} es S o N, pero preferiblemente es S; X_{3} es Q o E, pero
preferiblemente es Q; X_{4} es Q o D, pero preferiblemente es D;
y X_{5} es I o L, pero preferiblemente es I.
CDRL2
FTSSLHS (SEC.ID.Nº 122).
CDRL3
QQYSX_{1}X_{2}PWT (SEC.ID.Nº 123), donde
X_{1} es T, A o N, pero preferiblemente es T; y X_{2} es V o T,
pero preferiblemente es V.
Los anticuerpos anti-VEGF
humanizados preferidos son los que tienen las secuencias de los
dominios variables de la cadena pesada y/o ligera de
F(ab)-12 en el Ejemplo 1 y variantes del
mismo tales como formas de afinidad madurada incluyendo las
variantes Y0317, Y0313-1 e Y0238-3
en el Ejemplo 3, siendo Y0317 la variante preferida. Los métodos
para generar anticuerpos anti-VEGF humanizados de
interés en este documento se elaboran con más detalle a
continuación.
Los métodos para humanizar anticuerpos
anti-VEGF no humanos y generar variantes de
anticuerpos anti-VEGF se describen en los ejemplos
posteriores. Para humanizar un anticuerpo anti-VEGF,
se prepara el material de partida de anticuerpo no humano. Cuando
hay que generar una variante, se prepara el anticuerpo parental. Las
técnicas ejemplares para generar dicho material de partida de
anticuerpos no humanos y anticuerpos parentales se describirán el
las siguientes secciones.
El antígeno VEGF a usar para la producción de
anticuerpos puede ser, por ejemplo, VEGF intacto o un fragmento de
VEGF (por ejemplo, un fragmento de VEGF que comprende el "epítopo
A.4.6.1"). Otras formas de VEGF útiles para la generación de
anticuerpos serán evidentes para los especialistas en la técnica. El
antígeno VEGF usado para generar el anticuerpo es, preferiblemente,
VEGF humano, por ejemplo, como se describe en Leung et al.,
Science 246:1306 (1989), y Houck et al., Mol. Endocrin.
5:1806 (1991).
Los anticuerpos policlonales se aumentan
preferiblemente en animales por múltiples inyecciones subcutáneas
(sc) o intraperitoneales (ip) del antígeno pertinente y un
adyuvante. Puede ser útil conjugar el antígeno pertinente a una
proteína que es inmunogénica en la especie a inmunizar, por ejemplo,
hemocianina de la lapa californiana, albúmina de suero,
tiroglobulina bovina, o inhibidor de tripsina de semilla de soja
usando una agente bifuncional o de derivatización, por ejemplo,
éster de sulfosuccinimida de maleimidobenzoilo (conjugación a través
de restos de cisteína), N-hidroxisuccinimida (a
través de restos de lisina), glutaraldehído, anhídrido succínico,
SOCl_{2}, o R^{1}N=C=NR, donde R y R^{1} son grupos alquilo
diferentes.
Los animales se inmunizan frente al antígeno,
conjugados inmunogénicos, o derivados combinando, por ejemplo, 100
\mug o 5 \mug de la proteína o conjugado (para conejos o
ratones, respectivamente) con 3 volúmenes de adyuvante completo de
Freund e inyectando la solución por vía intradérmica en múltiples
sitios. Un mes después se estimula a los animales con 1/5 a 1/10 de
la cantidad original del péptido o conjugado en adyuvante completo
de Freund por inyección subcutánea en múltiples sitios. De siete a
14 días después se extrae sangre de los animales y el suero se
ensaya para el título del anticuerpo. Los animales se estimulan
hasta el estacionamiento del título. Preferiblemente, el animal se
estimula con el conjugado del mismo antígeno, pero conjugado a una
proteína diferente y/o a través de un reactivo de entrecruzamiento
diferente. Los conjugados también pueden hacerse en cultivo de
células recombinantes como proteínas de fusión. Además, se usan
apropiadamente agentes de agregación tales como alumbre para
potenciar la respuesta inmune.
\newpage
Los anticuerpos monoclonales pueden hacerse
usando el método de hibridoma descrito por primera vez por Kohler
et al., Nature, 256:495 (1975), o pueden hacerse por métodos
de ADN recombinante (Patente de EEUU Nº
4.816.567).
4.816.567).
En el método de hibridoma, se inmuniza un ratón u
otro animal hospedador apropiado, tal como un hámster o mono macaco,
como se ha descrito anteriormente para provocar linfocitos que
produzcan o sean capaces de producir anticuerpos que se unirán
específicamente a la proteína usada para inmunización. Como
alternativa, los linfocitos pueden inmunizarse in vitro.
Después los linfocitos se fusionan a células de mieloma usando un
agente de fusión apropiado, tal como polietilenglicol, para formar
una célula de hibridoma (Goding, Monoclonal Antibodies:
Principles and Practice, pág. 59-103 (Academia
Press, 1986)).
Las células de hibridoma preparadas de este modo
se siembran y se hacen crecer en un medio de cultivo apropiado que
contiene preferiblemente una o más sustancias que inhiben el
crecimiento o supervivencia de las células no fusionadas de mieloma
parentales. Por ejemplo, si las células de mieloma parentales
carecen de la enzima hipoxantina guanina fosforribosiltransferasa
(HGPRT o HPRT), el medio de cultivo para los hibridomas típicamente
incluirá hipoxantina, aminopterina, y timidina (medio HAT),
sustancias que evitan el crecimiento de células deficientes en
HGPRT.
Las células de mieloma preferidas son la que se
fusionan eficazmente, soportan una producción de alto nivel estable
de anticuerpo por las células productoras de anticuerpos
seleccionadas, y son sensibles a un medio como el medio HAT. Entre
estas, las líneas celulares de mieloma preferidas son líneas de
mieloma murinas, tales como las obtenidas de tumores de ratón
MOP-21 y M.C.-11 disponibles por el Salk Institute
Cell Distribution Center, San Diego, California EEUU, y células
SP-2 o X63-Ag8-653
disponibles por la American Type Culture Collection, Rockville,
Maryland EEUU. También se han descrito líneas celulares de mieloma
humano y heteromieloma de ratón-humano para la
producción de anticuerpos monoclonales humanos (Kozbor, J.
Immunol., 133:3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal
Antibody Production Techniques and Applications, pág.
51-63 (Marcel Dekker, Inc., Nueva York,
1987)).
1987)).
El medio de cultivo en el que se hacen crecer las
células de hibridoma se ensaya para la producción de anticuerpos
monoclonales dirigidos frente al antígeno. Preferiblemente, la
especificidad de unión de los anticuerpos monoclonales producidos
por células de hibridoma se determina por inmunoprecipitación o por
un ensayo de unión in vitro, tal como radioinmunoensayo (RIA)
o ensayo inmunoabsorbente de enzimas unidas (ELISA).
La afinidad de unión del anticuerpo monoclonal
puede, por ejemplo, determinarse por el análisis de Scatchard de
Munson et al., Anal. Biochem., 107:220 (1980).
Después de identificar que las células de
hibridoma producen anticuerpos de la especificidad, afinidad, y/o
actividad deseada, los clones pueden subclonarse por procedimientos
de dilución limitante y crecimiento por métodos convencionales
(Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice,
pág. 59-103 (Academia Press, 1986)). Los medios de
cultivo apropiados para este propósito incluyen, por ejemplo, medio
D-MEM o RPMI-1640. Además, las
células de hibridoma pueden crecer in vivo como tumores
ascíticos en un animal.
Los anticuerpos monoclonales secretados por los
subclones se separan apropiadamente del medio de cultivo, fluido
ascítico, o suero por procedimientos de purificación de
inmunoglobulinas convencionales tales como, por ejemplo, proteína
A-Sepharose, cromatografía en hidroxilapatita,
electroforesis en gel, diálisis, o cromatografía de
afini-
dad.
dad.
El ADN que codifica los anticuerpos monoclonales
se aísla y se secuencia fácilmente usando procedimientos
convencionales (por ejemplo, usando sondas oligonucleotídicas que
son capaces de unirse específicamente a genes que codifican las
cadenas pesada y ligera de los anticuerpos monoclonales). Las
células de hibridoma sirven como fuente preferida de dicho ADN. Una
vez aislado, el ADN puede colocarse en vectores de expresión, que
después se transfieren en células hospedadoras tales como células de
E. coli, células COS de simio, células de ovario de hámster
chino (CHO), o células de mieloma que no producen proteína
inmunoglobulina de otro modo, para obtener la síntesis de
anticuerpos monoclonales en las células hospedadoras recombinantes.
La producción recombinante de anticuerpos se describirá con más
detalle posteriormente.
Los Ejemplos 1-2 posteriores
describen procedimientos para la humanización de un anticuerpo
anti-VEGF. En ciertas realizaciones, puede ser
deseable generar variantes de la secuencia de aminoácidos de estos
anticuerpos humanizados, particularmente cuando éstas mejoran la
afinidad de unión u otras propiedades biológicas del anticuerpo
humanizado. El Ejemplo 3 describe metodologías para generar
variantes de la secuencia de aminoácidos de un anticuerpo
anti-VEGF con afinidad potenciada en relación con el
anticuerpo parental.
Las variantes de la secuencia de aminoácidos del
anticuerpo anti-VEGF se preparan introduciendo
cambios de nucleótidos apropiados en el ADN del anticuerpo
anti-VEGF, o por síntesis peptídica. Dichas
variantes incluyen, por ejemplo, deleciones, y/o inserciones y/o
sustituciones en restos en las secuencias de aminoácidos de los
anticuerpos anti-VEGF de los ejemplos en este
documento. Cualquier combinación de deleción, inserción, y
sustitución se hace para llegar a la construcción final, a condición
de que la construcción final tenga las características deseadas.
Los cambios de aminoácidos también pueden alterar procesos
post-traduccionales del anticuerpo
anti-VEGF humanizado o variante, tal como cambiando
el número o posición de los sitios de glicosilación.
Un método útil para la identificación de ciertos
restos o regiones del anticuerpo anti-VEGF que son
posiciones preferidas para mutagénesis se llama "mutagénesis por
exploración de alanina", como se describe por Cunningham y Wells
Science, 244:1081-1085 (1989). Aquí, se
identifica un resto o grupo de restos diana (por ejemplo, restos
cargados tales como arg, asp, his, lys, y glu) y se reemplaza por
un aminoácido cargado negativamente o neutro (más preferiblemente
alanina o polialanina) para lograr la interacción de los aminoácidos
con el antígeno VEGF. Las posiciones de aminoácidos que demuestran
sensibilidad funcional a las sustituciones después se perfeccionan
introduciendo variantes adicionales o distintas a, o para, los
sitios de sustitución. Por tanto, aunque el sitio para introducir
una variación de la secuencia de aminoácidos está predeterminado,
la naturaleza de la mutación per se no necesita estar
predeterminada. Por ejemplo, para analizar el comportamiento de una
mutación en un sitio dado, se dirige mutagénesis por exploración de
ala o aleatoria al codón o región diana y las variantes de
anticuerpos anti-VEGF expresadas se exploran para la
actividad deseada. La mutagénesis por exploración de alanina se
describe en el Ejemplo 3.
Las inserciones en la secuencia de aminoácidos
incluyen fusiones amino y/o carboxil-terminales que
varían en longitud de un resto a polipéptidos que contienen cien o
más restos, así como inserciones dentro de la secuencia de un único
resto o de múltiples restos de aminoácidos. Los ejemplos de
inserciones terminales incluyen un anticuerpo
anti-VEGF con un resto metionilo
N-terminal o el anticuerpo fusionado a un
señalizador de epítopo. Otras variantes de inserción de la molécula
de anticuerpo anti-VEGF incluyen la fusión al N o
C-terminal del anticuerpo anti-VEGF
de una enzima o un polipéptido que aumenta la vida media en suero
del anticuerpo (véase a continuación).
Otro tipo de variante es una variante de
sustitución de aminoácido. Estas variantes tienen al menos un resto
de aminoácido retirado en la molécula de anticuerpo
anti-VEGF y un resto diferente insertado en su
lugar. Los sitios de mayor interés para mutagénesis de sustitución
incluyen las regiones hipervariables, aunque también se contemplan
alteraciones de FR. Se muestran las sustituciones conservativas en
la Tabla 1 con el título de "sustituciones preferidas". Si
dichas sustituciones dan como resultado un cambio en la actividad
biológica, entonces pueden introducirse cambios más sustanciales,
denominados "sustituciones ejemplares" en la Tabla 1, o como se
describe adicionalmente a continuación en referencia a clases de
aminoácidos, y se exploran los productos.
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(Tabla pasa a página
siguiente)
Las modificaciones sustanciales en las
propiedades biológicas del anticuerpo se consiguen seleccionando
sustituciones que difieren significativamente en el efecto en el
mantenimiento de (a) la estructura del eje central polipeptídico en
el área de sustitución, por ejemplo, como una conformación lámina o
helicoidal, (b) la carga o hidrofobicidad de la molécula en el
sitio diana, o (c) el volumen de la cadena lateral. Los restos de
origen natural se dividen en grupos en base a las propiedades
comunes de la cadena lateral:
(1) hidrófobos: norleucina, met, ala, val, leu,
ile;
(2) hidrófilos neutros: cys, ser, thr;
(3) ácidos: asp, glu;
(4) básicos: asn, gln, his, lys, arg;
(5) restos que influyen en la orientación de la
cadena: gly, pro; y
(6) aromáticos: trp, tyr, phe.
Las sustituciones no conservativas implicarán
intercambiar un miembro de estas clases por otra clase.
También puede sustituirse cualquier resto de
cisteína no implicado en el mantenimiento de la conformación
apropiada del anticuerpo anti-VEGF humanizado o
variante, generalmente por serina, para mejorar la estabilidad
oxidativa de la molécula y evitar entrecruzamientos aberrantes. A la
inversa, puede añadirse al anticuerpo un enlace o enlaces de
cisteína para mejorar su estabilidad (particularmente cuando el
anticuerpo es un fragmento de anticuerpo tal como un fragmento
Fv).
Un tipo particularmente preferido de variante de
sustitución implica sustituir uno o más restos de la región
hipervariable de un anticuerpo parental (por ejemplo, un anticuerpo
humanizado o humano). Generalmente, la variante o variantes
resultantes seleccionadas para desarrollo adicional tendrán
propiedades biológicas mejoradas en relación con el anticuerpo
parental del que se han generado. Un modo adecuado para generar
dichas variantes de sustitución es la maduración de afinidad usando
presentación en fagos (véase Ejemplo 3 en este documento).
Brevemente, se mutan varios sitios de la región hipervariable (por
ejemplo, 6-7 sitios) para generar todas las posibles
sustituciones de aminoácidos en cada sitio. Las variantes de
anticuerpo generadas de este modo se muestran de un modo
monovalente en partículas fágicas filamentosas como fusiones al
producto del gen III de M13 empaquetadas en cada partícula. Las
variantes presentadas en fagos se exploran después para su actividad
biológica (por ejemplo, afinidad de unión) como se describe en este
documento. Para identificar sitios de la región hipervariable
candidatos para modificación, puede realizarse mutagénesis por
exploración de alanina (véase Ejemplo 3) a restos de la región
hipervariable identificados que contribuyen significativamente a la
unión de antígeno. Como alternativa, o además, puede ser beneficioso
analizar una estructura cristalina del complejo
antígeno-anticuerpo para identificar puntos de
contacto entre el anticuerpo y el VEGF humano. Dichos restos de
contacto y los restos adyacentes son candidatos para sustitución de
acuerdo con las técnicas elaboradas en este documento. Una vez que
se generan dichas variantes, el panel de variantes se somete a
exploración como se describe en este documento y los anticuerpos con
propiedades superiores en uno o más ensayos relevantes puede
seleccionarse para desarrollo adicio-
nal.
nal.
Otro tipo de variante de aminoácido del
anticuerpo altera el patrón de glicosilación original del
anticuerpo. Por alterar se quiere decir delecionar uno o más restos
de carbohidratos encontrados en el anticuerpo, y/o añadir uno o más
sitios de glicosilación que no están presentes en el anticuerpo.
La glicosilación de los anticuerpos típicamente
tiene lugar con enlaces N o enlaces O. Enlace N se refiere a la
unión del resto de carbohidrato a la cadena lateral de un resto de
asparagina. Las secuencias tripeptídicas
asparagina-X-serina y
asparagina-X-treonina, donde X es
cualquier aminoácido excepto prolina, son las secuencias de
reconocimiento para la unión enzimática del resto de carbohidrato a
la cadena lateral de asparagina. Por tanto, la presencia de
cualquiera de estas secuencias tripeptídicas en un polipéptido crea
un sitio potencial de glicosilación. Glicosilación por enlace O se
refiere a la unión de uno de los azúcares
N-acetilgalactosamina, galactosa, o xilosa a un
hidroxiaminoácido, más habitualmente a serina o treonina, aunque
también puede usarse 5-hidroxiprolina o
5-hidroxilisina.
La adición de sitios de glicosilación al
anticuerpo se consigue de manera práctica alterando la secuencia de
aminoácidos de modo que contenga una o más de las secuencias
tripeptídicas descritas anteriormente (para sitios de glicosilación
por enlace N). La alteración también puede hacerse por adición de,
o sustitución por, uno o más restos de serina o treonina a la
secuencia del anticuerpo original (para sitios de glicosilación por
enlace O).
Las moléculas de ácido nucleico que codifican
variantes de la secuencia de aminoácidos del anticuerpo
anti-VEGF se preparan por una diversidad de métodos
conocidos en la técnica. Estos métodos incluyen, aunque sin
limitación, aislamiento de una fuente natural (en el caso de
variantes de secuencia de aminoácidos de origen natural) o
preparación por mutagénesis mediada por oligonucleótidos (o dirigida
de sitio), mutagénesis por PCR, o mutagénesis por casete de una
variante preparada anteriormente o una versión no variante del
anticuerpo anti-VEGF.
Como alternativa a la humanización, pueden
generarse anticuerpos humanos. Por ejemplo, ahora es posible
producir animales transgénicos (por ejemplo, ratones) que son
capaces, sobre la inmunización, de producir un repertorio completo
de anticuerpos humanos en ausencia de producción endógena de
inmunoglobulinas. Por ejemplo, se ha descrito que la deleción
homocigótica del gen de la región de unión de la cadena pesada del
anticuerpo (J_{H}) en ratones quiméricos o mutantes en la línea
germinal da como resultado la inhibición completa de producción
endógena de anticuerpos. Transferir la serie de genes de las
inmunoglobulinas de la línea germinal humana en dichos ratones
mutantes en la línea germinal dará como resultado la producción de
anticuerpos humanos sobre la estimulación con antígeno. Véase, por
ejemplo, Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA,
90:2551 (1993); Jakobovits et al., Nature,
362:255-258 (1993); Bruggermann et al., Year in
Immuno., 7:33 (1993); y las Patentes de EEUU Nº 5.591.669, Nº
5.589.369 y Nº 5.545.807. Los anticuerpos también pueden obtenerse
de bibliotecas presentadas en fagos (Hoogenboom et al., J. Mol.
Biol., 227:381 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol.,
222:581-597 (1991); y las Patentes de EEUU Nº
5.565.332 y Nº 5.573.905). Como se ha analizado anteriormente, los
anticuerpos humanos también pueden generarse por células B
activadas in vitro (véanse las Patentes de EEUU Nº 5.567.610
y Nº 5.229.275).
En ciertas realizaciones, el anticuerpo
anti-VEGF humanizado o variante es un fragmento de
anticuerpo. Se han desarrollado diversas técnicas para la producción
de fragmentos de anticuerpos. Tradicionalmente, estos fragmentos se
obtenían mediante digestión proteolítica de anticuerpos intactos
(véase, por ejemplo, Morimoto et al., Journal of Biochemical and
Biophysical Methods 24:107-117 (1992) y Brennan
et al., Science 229:81 (1985)). Sin embargo, estos
fragmentos ahora pueden producirse directamente por células
hospedadoras recombinantes. Por ejemplo, los fragmentos
Fab'-SH pueden recuperarse directamente de E.
coli y acoplarse químicamente para formar fragmentos
F(ab')_{2} (Carter et al. Bio/Technology 10:163-167 (1992)). En otra realización, el F(ab')_{2} se forma usando la cremallera de leucina GCN4 para promover el ensamblaje de la molécula F(ab')_{2}. De acuerdo con otro enfoque, los fragmentos Fv, Fab o F(ab')_{2} pueden aislarse directamente de un cultivo de células hospedadoras recombinantes. Otras técnicas para la producción de fragmentos de anticuerpos serán evidentes para los médicos especialistas.
F(ab')_{2} (Carter et al. Bio/Technology 10:163-167 (1992)). En otra realización, el F(ab')_{2} se forma usando la cremallera de leucina GCN4 para promover el ensamblaje de la molécula F(ab')_{2}. De acuerdo con otro enfoque, los fragmentos Fv, Fab o F(ab')_{2} pueden aislarse directamente de un cultivo de células hospedadoras recombinantes. Otras técnicas para la producción de fragmentos de anticuerpos serán evidentes para los médicos especialistas.
En algunas realizaciones, puede ser deseable
generar anticuerpos anti-VEGF multiespecíficos (por
ejemplo, biespecíficos) humanizados o variantes que tienen
especificidades de unión para al menos dos epítopos diferentes. Los
anticuerpos biespecíficos ejemplares pueden unir dos epítopos
diferentes de la proteína VEGF. Como alternativa, puede combinarse
un brazo anti-VEGF con un brazo que se una a una
molécula de señalización en un leucocito tal como una molécula
receptora de células T (por ejemplo, CD2 o CD3), o receptores Fc
para IgG (Fc\gammaR), tal como Fc\gammaRI (CD64), Fc\gammaRII
(CD32) y Fc\gammaRIII (CD16) para concentrar los mecanismos de
defensa celulares hacia la célula que expresa VEGF. Los anticuerpos
biespecíficos también pueden usarse para localizar agentes
citotóxicos para células que expresan VEGF. Estos anticuerpos
tienen un brazo de unión a VEGF y un brazo que se une al agente
citotóxico (por ejemplo, saporina,
anti-interferón-\alpha, alcaloide
de la vinca, cadena A de ricina, metotrexato o hapteno de isótopo
radiactivo). Los anticuerpos biespecíficos pueden prepararse como
anticuerpos de longitud completa o como fragmentos de anticuerpo
(por ejemplo, anticuerpos biespecíficos F(ab')_{2}).
De acuerdo con otro enfoque para hacer
anticuerpos biespecíficos, puede diseñarse la superficie de contacto
entre un par de moléculas de anticuerpo para maximizar el porcentaje
de heterodímeros que se recuperan del cultivo de células
recombinantes. La superficie de contacto preferida comprende al
menos una parte del dominio C_{H}3 de un dominio constante de un
anticuerpo. En este método, se reemplazan una o más cadenas
laterales pequeñas de aminoácidos de la superficie de contacto de la
primera molécula de anticuerpo con cadenas laterales más grandes
(por ejemplo, tirosina o triptófano). Se crean "cavidades" de
tamaño idéntico o similar a la cadena o cadenas laterales grandes en
la superficie de contacto de la segunda molécula de anticuerpo
reemplazando cadenas laterales grandes de aminoácidos con otras más
pequeñas (por ejemplo, alanina o treonina). Esto proporciona un
mecanismo para aumentar la producción del heterodímero sobre otros
productos finales no deseados tales como homodímeros. Véase el
documento WO96/27011 publicado el 6 de septiembre de 1996.
Los anticuerpos biespecíficos incluyen
anticuerpos entrecruzados o "heteroconjugados". Por ejemplo,
uno de los anticuerpos en el heteroconjugado puede unirse a avidina,
el otro a biotina. Los anticuerpos heteroconjugados pueden hacerse
usando cualquier método de entrecruzamiento adecuado. Los agentes de
entrecruzamiento apropiados son bien conocidos en la técnica, y se
describen en la Patente de EEUU Nº 4.676.980, junto con varias
técnicas de entrecruzamiento.
Las técnicas para generar anticuerpos
biespecíficos a partir de fragmentos de anticuerpos también se han
descrito en la bibliografía. Por ejemplo, los anticuerpos
biespecíficos pueden prepararse usando enlaces químicos. Brennan
et al., Science 229:81 (1985) describe un procedimiento donde
se escinden proteolíticamente anticuerpos intactos para generar
fragmentos F(ab')_{2}. Estos fragmentos se reducen en
presencia del agente de arsenito sódico complejante de ditiol para
estabilizar los ditioles vicinales y evitar la formación de
disulfuro intermolecular. Los fragmentos Fab' generados después se
convierten en derivados de tionitrobenzoato (TNB). Uno de los
derivados Fab'-TNB después se reconvierte en el
Fab'-tiol por reducción con mercaptoetilamina y se
mezcla con una cantidad equimolecular del otro derivado
Fab'-TNB para formar el anticuerpo biespecífico.
Los anticuerpos biespecíficos producidos pueden usarse como agentes
para la inmovilización selectiva de enzimas. En una realización
adicional más, los fragmentos Fab'-SH recuperados
directamente de E. coli pueden unirse químicamente in
vitro para formar anticuerpos biespecíficos. Shalaby et al.,
J. Exp. Med. 175:217-225 (1992).
También se han descrito diversas técnicas para
hacer y aislar fragmentos de anticuerpo biespecíficos directamente
de cultivo de células recombinantes. Por ejemplo, se han producido
anticuerpos biespecíficos usando cremalleras de leucina. Kostelny
et al., J. Immunol. 148(5):1547-1553
(1992). Los péptidos de cremallera de leucina de las proteínas Fos
y Jun se unieron a las porciones Fab' de dos anticuerpos diferentes
por fusión génica. Los homodímeros de anticuerpo se redujeron a la
región bisagra para formar monómeros y después se reoxidaron para
formar los heterodímeros de anticuerpo. Este método también puede
utilizarse para la producción de homodímeros de anticuerpo. La
tecnología de "fragmentos bivalentes" descrita por Hollinger
et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA
90:6444-6448 (1993) ha proporcionado un mecanismo
alternativo para hacer fragmentos de anticuerpo biespecíficos. Los
fragmentos comprenden un dominio variable de cadena pesada
(V_{H}) conectado a un dominio variable de cadena ligera
(V_{L}) por un enlazador que es demasiado corto para permitir el
emparejamiento entre los dos dominios de la misma cadena. Por
consiguiente, los dominios V_{H} y V_{L} de un fragmento se
fuerzan a emparejar con los dominios V_{L} y V_{H}
complementarios de otro fragmento, formando de ese modo dos sitios
de unión a antígeno. También se ha informado de otra estrategia
para hacer fragmentos de anticuerpos biespecíficos por el uso de
dímeros Fv de cadena simple (sFv). Véase Gruber et al., J.
Immunol. 152:5368 (1994). Como alternativa, el anticuerpo
biespecífico puede ser un "anticuerpo lineal" producido como
se describe en Zapata et al. Protein Eng.
8(10):1057-1062 (1995).
Se contemplan anticuerpos con más de dos
valencias. Por ejemplo, pueden prepararse anticuerpos
triespecíficos. Tutt et al., J. Immunol. 147:60 (1991).
Se contemplan otras modificaciones del anticuerpo
anti-VEGF humanizado o variante. Por ejemplo, puede
ser deseable modificar el anticuerpo de la invención con respecto a
la función efectora, de modo que se potencie la eficacia del
anticuerpo en el tratamiento del cáncer, por ejemplo. Por ejemplo,
puede introducirse un resto o restos de cisteína en la región Fc,
permitiendo de ese modo la formación de un enlace disulfuro
intercatenario en esta región. El anticuerpo homodimérico generado
de este modo puede tener una capacidad de internalización mejorada
y/o eliminación celular mediada por el complemento y citotoxicidad
celular dependiente de anticuerpo (ADCC). Véase Caron et al., J.
Exp Med. 176:1191-1195 (1992) y Shopes, B. J.
Immunol. 148:2918-2922 (1992). También pueden
prepararse anticuerpos homodiméricos con actividad antitumoral
potenciada usando entrecruzantes heterofuncionales como se describe
en Wolff et al., Cancer Research 53:2560-2565
(1993). Como alternativa, puede diseñarse un anticuerpo que tiene
regiones Fc duales y puede tener de ese modo capacidades de lisis
por complemento y ADCC potenciadas. Véase Stevenson et al.,
Anti-Cancer Drug Design
3:219-230 (1989).
La invención también concierne a inmunoconjugados
que comprenden el anticuerpo descrito en este documento conjugado a
un agente citotóxico tal como un agente quimioterapéutico, toxina
(por ejemplo, una toxina enzimáticamente activa de origen
bacteriano, fúngico, vegetal o animal, o fragmentos de las mismas),
o un isótopo radiactivo (es decir, un radioconjugado).
Los agentes quimioterapéuticos útiles en la
generación de dichos inmunoconjugados se han descrito anteriormente.
Las toxinas enzimáticamente activas y los fragmentos de las mismas
que pueden usarse incluyen la cadena A de la toxina de la difteria,
fragmentos no de unión de la toxina difteria, cadena A de la
exotoxina (de Pseudomonas aeruginosa), cadena A de la ricina,
cadena A de la abrina, cadena A de la modecina,
alfa-sarcina, proteínas de Aleurites fordii,
proteínas de diantina, proteínas de Phytolacca americana
(PAPI, PAPII, y PAP-S), inhibidor de momordica
charantia, curcina, crotina, inhibidor de saponaria officinalis,
gelonina, mitogelina, restrictocina, fenomicina, anomicina y
tricotecenos. Está disponible una diversidad de radionúclidos para
la producción de anticuerpos anti-VEGF
radioconjugados. Los ejemplos incluyen ^{212}Bi, ^{131}I,
^{131}In, ^{90}Y y ^{186}Re.
Los conjugados del anticuerpo y el agente
citotóxico se hacen usando una diversidad de agentes de unión de
proteínas bifuncionales tales como
N-succinimidil-3-(2-piridilditiol)propionato
(SPDP), iminotiolano (IT), derivados bifuncionales de imidoésteres
(tales como adipimidato de dimetilo HCL), ésteres activos (tales
como suberato de disuccinimidilo), aldehídos (tales como
glutaraldehído), compuestos bis-azido (tales como
bis-(p-azidobenzoil)hexanodiamina), derivados
bis-diazonio (tales como
bis(p-diazoniobenzoil)-etilendiamina),
diisocianatos (tales como 2,6-diisocianato de
tolueno), y compuestos bis-flúor activo (tales como
1,5-difluoro-2,4-dinitrobenceno).
Por ejemplo, puede prepararse una inmunotoxina de ricina como se
describe en Vitetta et al., Science 238:1098 (1987). El
ácido
1-isotiocianatobencil-3-metildietilentriaminopentaacético
(MX-DTPA) marcado con carbono 14 es un agente
quelante ejemplar para la conjugación de radionucleótidos al
anticuerpo. Véase documento WO94/11026.
En otra realización, el anticuerpo puede
conjugarse a un "receptor" (tal como estreptavidina) para la
utilización en el premarcaje tumoral donde el conjugado
anticuerpo-receptor se administra al paciente,
seguido de la retirada de la circulación del conjugado no unido
usando un agente de eliminación y después administrando un
"ligando" (por ejemplo, avidina) que se conjuga a un agente
citotóxico (por ejemplo, un radionúclido).
Los anticuerpos anti-VEGF
descritos en este documento también pueden formularse como
inmunoliposomas. Los liposomas que contienen el anticuerpo se
preparan por métodos conocidos en la técnica, tales como los
descritos en Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA
82:3688 (1985); Hwang et al. Proc Natl Acad. Sci. USA
77:4030 (1980); y la Patente de EEUU Nº 4.485.045 y Nº 4.544.545.
Los liposomas con tiempo de circulación potenciado se describen en
la Patente de EEUU Nº 5.013.556.
Pueden generarse liposomas particularmente útiles
por el método de evaporación de fase inversa con una composición
lipídica que comprende fosfatidilcolina, colesterol y
fosfatidiletanolamina derivada de PEG (PEG-PE). Los
liposomas se extruyen a través de filtros de tamaño de poro definido
para producir liposomas con el diámetro deseado. Los fragmentos
Fab' del anticuerpo de la presente invención pueden conjugarse a
los liposomas como se describe en Martin et al., J. Biol.
Chem. 257:286-288 (1982) mediante una reacción
de intercambio de disulfuro. Opcionalmente el liposoma contiene un
agente quimioterapéutico (tal como Doxorrubicina). Véase Gabizon
et al., J. Nacional Cancer Inst.
81(19):1484(1989).
El anticuerpo de la presente invención también
puede usarse en ADEPT conjugando el anticuerpo a una enzima de
activación de profármaco que convierte un profármaco (por ejemplo,
un agente quimioterapéutico peptídico, véase el documento
WO81/01145) a un fármaco anti-cáncer activo. Véase,
por ejemplo, el documento WO 88/07378 y la Patente de EEUU Nº
4.975.278.
El componente enzimático del inmunoconjugado útil
para ADEPT incluye cualquier enzima capaz de funcionar en un
profármaco de modo que lo convierta en su forma citotóxica más
activa.
Las enzimas que son útiles en el método de esta
invención incluyen, aunque sin limitación, fosfatasa alcalina, útil
para convertir profármacos que contienen fosfato en fármacos libres;
arilsulfatasa, útil para convertir profármacos que contienen
sulfato en fármacos libres; citosina desaminasa, útil para
convertir 5-fluorocitosina no tóxica en el fármaco
anti-cáncer, 5-fluoroacilo;
proteasas, tales como la proteasa de serratia, termolisina,
subtilisina, carboxipeptidasas y catepsinas (tales como las
catepsinas B y L), que son útiles para convertir profármacos que
contienen péptidos en fármacos libres;
D-alanilcarboxipeptidasas, útiles para convertir
profármacos que contienen sustituyentes
D-aminoácidos; enzimas de escisión de carbohidratos
tales como \beta-galactosidasa y neuraminidasa,
útiles para convertir profármacos glicosilados en fármacos libres;
\beta-lactamasa, útil para convertir fármacos
derivados con \beta-lactamas en fármacos libres; y
penicilina amidasas, tales como la penicilina V amidasa o
penicilina G amidasa, útiles para convertir fármacos derivatizados
en sus nitrógenos de amina con grupos fenoxiacetilo o fenilacetilo,
respectivamente, en fármacos libres. Como alternativa, pueden usarse
anticuerpos con actividad enzimática, también conocidos en la
técnica como "abzimas", para convertir los profármacos de la
invención en fármacos activos libres (véase, por ejemplo, Massey,
Nature 328:457-458 (1987)). Los conjugados
anticuerpo-abzima pueden prepararse como se describe
en este documento para suministrar la abzima a la población de
células tumorales.
Las enzimas de esta invención pueden unirse
covalentemente a los anticuerpos anti-VEGF por
técnicas bien conocidas en la técnica tales como el uso de los
reactivos entrecruzantes heterobifuncionales analizados
anteriormente. Como alternativa, pueden construirse proteínas de
fusión que comprenden al menos la región de unión al antígeno de
una anticuerpo de la invención unida a al menos una porción
funcionalmente activa de una enzima de la invención usando técnicas
de ADN recombinante bien conocidas en la técnica (véase, por
ejemplo, Neuberger et al., Nature 312:604-608
(1984)).
En ciertas realizaciones de la invención, puede
ser deseable usar un fragmento de anticuerpo, en lugar de un
anticuerpo intacto, para aumentar la penetración tumoral, por
ejemplo. En este caso, puede ser deseable modificar el fragmente de
anticuerpo para aumentar su vida media en suero. Esto puede
conseguirse, por ejemplo, por incorporación de un epítopo de unión a
receptor de rescate en el fragmento de anticuerpo (por ejemplo, por
mutación de la región apropiada en el fragmento de anticuerpo o
incorporando el epítopo en un señalizador peptídico que después se
fusiona al fragmento de anticuerpo al final o en el medio, por
ejemplo, por síntesis de ADN o péptidos). Véase el documento
WO96/32478 publicado el 17 de octubre de 1996.
El epítopo de unión a receptor de rescate
generalmente constituye una región donde uno cualquiera o más restos
de aminoácidos de uno o dos bucles de un dominio Fc se transfieren a
una posición análoga del fragmento del anticuerpo. Aún más
preferiblemente, se transfieren tres o más restos de uno o dos
bucles del dominio Fc. Más preferido todavía, el epítopo se toma del
dominio CH2 de la región Fc (por ejemplo, de una IgG) y se
transfiere a la región CH1, CH3, o V_{H}, o a más de una de
dichas regiones del anticuerpo. Como alternativa, el epítopo se
toma del dominio CH2 de la región Fc y se transfiere a la región
C_{L} o región V_{L}, o ambas, del fragmento de anticuerpo.
En realizaciones preferidas, el epítopo de unión
a receptor de rescate comprende la secuencia: PKNSSMISNTP (SEC.ID.Nº
17), y opcionalmente también comprende una secuencia seleccionada
entre el grupo compuesto por HQSLGTQ (SEC.ID.Nº 18), HQNLSDGK
(SEC.ID.Nº 19), HQNISDGK (SEC.ID.Nº 20), o VISSHLGQ (SEC.ID.Nº 21),
particularmente cuando el fragmento de anticuerpo es un Fab o
F(ab')_{2} o el epítopo de unión a receptor de rescate es
un polipéptido que contiene la secuencia o secuencias: HQNLSDGK
(SEC.ID.Nº 19), HQNISDGK (SEC.ID.Nº 20), o VISSHLGQ (SEC.ID.Nº 21)
y las secuencia: PKNSSMISNTP (SEC.ID.Nº 17).
Las modificaciones covalentes del anticuerpo
anti-VEGF humanizado o variante también se incluyen
en el alcance de esta invención como se define en las
reivindicaciones. Pueden hacerse por síntesis química o por escisión
enzimática o química del anticuerpo, si es aplicable. Se introducen
otros tipos de modificaciones covalentes del anticuerpo en la
molécula haciendo reaccionar restos de aminoácidos marcados del
anticuerpo con un agente de derivatización orgánico que es capaz de
reaccionar con cadenas laterales seleccionadas o los restos N o
C-terminales. Las modificaciones covalentes
ejemplares de polipéptidos se describen en la Patente de EEUU Nº
5.534.615. Un tipo preferido de modificación covalente del
anticuerpo comprende la unión del anticuerpo a uno de una diversidad
de polímeros no proteicos, por ejemplo, polietilenglicol,
propilenglicol, o polioxialquilenos, del modo descrito en las
Patentes de EEUU Nº 4.640.835; Nº 4.496.689; Nº 4.301.144; Nº
4.670.417; Nº 4.791.192 ó Nº 4.179.337.
La invención también proporciona un ácido
nucleico asilado que codifica el anticuerpo
anti-VEGF humanizado o variante, vectores y células
hospedadoras que comprenden el ácido nucleico, y técnicas
recombinantes para la producción del anticuerpo.
Para la producción recombinante del anticuerpo,
puede asilarse el ácido nucleico que lo codifica e insertarse en un
vector de replicación para clonación adicional (amplificación del
ADN) o para expresión. En otra realización, el anticuerpo puede
producirse por recombinación homóloga, por ejemplo, como se describe
en la Patente de EEUU Nº 5.204.244. El ADN que codifica el
anticuerpo monoclonal se aísla y se secuencia fácilmente usando
procedimientos convencionales (por ejemplo, usando sondas
oligonucleotídicas que son capaces de unirse específicamente a genes
que codifican las cadenas pesada y ligera del anticuerpo). Están
disponibles muchos vectores. Los componentes del vector generalmente
incluyen, aunque sin limitación, uno o más de los siguientes: una
secuencia señal, un origen de replicación, uno o más genes
marcadores, un elemento potenciador, un promotor, y una secuencia de
terminación de la transcripción, por ejemplo, como se describe en la
Patente de EE UU Nº 5.534.615 expedida el 9 de julio de 1996.
Las células hospedadoras apropiadas para
clonación y expresión del ADN en los vectores en este documento, son
las células procariotas, levaduras, o eucariotas superiores
descritas anteriormente. Las procariotas apropiadas para este
propósito incluyen eubacterias, tales como organismos
Gram-negativos o Gram-positivos, por
ejemplo, Enterobacteriaceae tales como Escherichia, por
ejemplo, E. coli, Enterobacter, Erwinia, Klebsiella, Proteus,
Salmonella, por ejemplo, Salmonella typhimurium,
Serratia, por ejemplo Serratia marcescans, y
Shigella, así como Bacilli tales como B. subtilis
y B. licheniformis (por ejemplo, B. licheniformis 41P
descrito en el documento DD 266.710 publicado el 12 de abril de
1989), Pseudomonas tales como P. aeruginosa, y
Streptomyces. Un hospedador de clonación de E. coli
preferido es E. coli 294 (ATCC 31.446), aunque son apropiadas
otras cepas tales como E. coli B, E. coli X1776 (ATCC
31.537), y E. coli W3110 (ATCC 27.325). Estos ejemplos son
ilustrativos en lugar de limitantes.
Además de los procariotas, los microbios
eucariotas tales como hongos o levaduras filamentosos son
hospedadores de clonación o expresión apropiados para vectores que
codifican anticuerpo anti-VEGF. Saccharomyces
cerevisiae, o la levadura común del pan, es la más
habitualmente usada entre los microorganismos hospedadores
eucariotas inferiores. Sin embargo, están habitualmente disponibles
varios otros géneros, especies, y cepas, y son útiles en este
documento, tales como Schizosaccharomyces pombe; hospedadores
Kluyveromyces tales como, por ejemplo, K. lactis, K.
fragilis (ATCC 12.424), K. bulgaricus (ATCC 16.045),
K. wickeramii (ATCC 24.178), K. waltii (ATCC 56.500),
K. drosophilarum (ATCC 36.906), K. thermotolerans, y
K. marxiamis; yarrowia (EP 402.226); Pichia pastoris
(EP 183.070); Candida; Trichoderma reesia (EP 244.234);
Neurospora crassa; Schwanniomyces tales como
Schwanniomyces occidentalis; y hongos filamentosos tales
como, por ejemplo, Neurospora, Penicillium, Tolypocladium, y
hospedadores Aspergillus tales como A. nidulans y
A. niger.
Las células hospedadoras apropiadas para la
expresión de anticuerpos anti-VEGF glicosilados se
obtienen de organismos multicelulares. Los ejemplos de células de
invertebrados incluyen células vegetales y de insecto. Se han
identificado numerosas cepas y variantes de baculovirus y células
hospedadoras de insecto permisivas correspondientes de hospedadores
tales como Spodoptera frugiperda (oruga), Aedes
aegypti (mosquito), Aedes albopictus (mosquito),
Drosophila melanogaster (mosca de la fruta), y Bombyx
mori. Están disponibles al público una diversidad de cepas
virales para la transfección, por ejemplo, la variante
L-1 de Autographa californica NPV y la cepa
Bm-5 de Bombyx mori NPV, y dichos virus
pueden usarse en este documento como los virus de acuerdo con la
presente invención, particularmente para transfección de células de
Spodoptera frugiperda. También pueden utilizarse como
hospedadores cultivos de células vegetales del algodón, maíz,
patata, soja, petunia, tomate, y tabaco.
Sin embargo, el interés ha sido mayor en células
de vertebrados, y la propagación de células de vertebrados en
cultivo (cultivos tisulares) ha llegado a ser un procedimiento de
rutina. Los ejemplos de líneas celulares hospedadoras de mamífero
son la línea CV1 de riñón de mono transformada por SV40
(COS-7, ATCC CRL 1651); la línea de riñón
embrionario humano (293 o células 293 subclonadas para el
crecimiento en cultivo en suspensión, Graham et al., J. Gen
Virol. 36:59 (1977)); células de riñón de cría de hámster (BHK,
ATCC CCL 10); células de ovario de hámster chino/-DHFR (CHO, Urlaub
et al., Proc Natl. Acad. Sci. USA 77:4216 (1980)); células
de sertoli de ratón (TM4. Mather, Biol. Reprod.
23:243-251 (1980)); células de riñón de mono (CV1
ATCC CCL 70); células de riñón de mono verde africano
(VERO-76. ATCC CRL-1587); células
de carcinoma cervical humano (HELA, ATCC CCL 2); células de riñón
canino (MDCK, ATCC CCL 34); células de hígado de rata búfalo (BRL
3A, ATCC CRL 1442); células de pulmón humano (W138, ATCC CCL 75);
células de hígado humano (Hep G2, HB 8065); tumor de mama de ratón
(MMT 060562, ATCC CCL51); células TR1 (Mather et al., Annals N.Y.
Acad. Sci. 383:44-68 (1982)); células MRC 5;
células FS4; y una línea de hepatoma humano (Hep G2).
Las células hospedadoras se transforman con los
vectores de expresión o clonación descritos anteriormente para la
producción de anticuerpos anti-VEGF y se cultivan en
medio nutriente convencional modificado del modo apropiado para
inducir promotores, seleccionar transformantes, o ampliar los genes
que codifican las secuencias deseadas.
Las células hospedadoras usadas para producir el
anticuerpo anti-VEGF de esta invención pueden
cultivarse en una diversidad de medios. Los medios disponibles en el
mercado tales como Ham's F10 (Sigma), Medio Esencial Mínimo ((MEM),
Sigma)), RPM1I-1640 (Sigma), y Medio de Eagle
Modificado por Dulbecco ((DMEM), Sigma) son apropiados para cultivar
las células hospedadoras. Además, cualquiera de los medios
descritos en Ham et al., Meth. Enz. 58:44 (1979), Barnes
et al., Anal. Biochem. 102:255 (1980), las Patentes de EE UU
Nº 4.767.704; Nº 4.657.866; Nº 4.927.762; Nº 4.560.655; o Nº
5.122.469; documentos WO 90/03430; WO 87/00195; o la Patente de EEUU
Re. Nº 30.985 pueden usarse como medios de cultivo para las células
hospedadoras. Cualquiera de estos medios puede suplementarse si es
necesario con hormonas y/u otros factores de crecimiento (tales como
insulina, transferrina, o factor de crecimiento epidérmico), sales
(tales como cloruro sódico, calcio, magnesio y fosfato), tampones
(tales como HEPES), nucleótidos (tales como adenosina y timidina),
antibióticos (tales como el fármaco GENTAMYCIN™), elementos traza
(definidos como compuestos inorgánicos habitualmente presentes a
concentraciones finales en el intervalo micromolar), y glucosa o
una fuente de energía equivalente. También pueden incluirse otros
suplementos cualesquiera necesarios a las concentraciones apropiadas
que serían conocidas para los especialistas en la técnica. Las
condiciones de cultivo, tales como temperatura, pH, y similares,
son las previamente usadas con las células hospedadoras
seleccionadas para expresión, y serán evidentes para el especialista
en la técnica.
Cuando se usan técnicas recombinantes, el
anticuerpo puede producirse de manera intracelular, en el espacio
periplásmico, o secretarse directamente en el medio. Si el
anticuerpo se produce de manera intracelular, como primera etapa,
los restos particulados, células hospedadoras o fragmentos lisados,
se retiran, por ejemplo, por centrifugación o ultrafiltración.
Carter et al., Bio/Technology 10:163-167
(1992) describe un procedimiento para asilar anticuerpos que se
secretan al espacio periplásmico de E. coli. Brevemente, se
descongela la pasta celular en presencia de acetato sódico (pH 3.5),
EDTA, y fenilmetilsulfonilfluoruro (PMSF) durante aproximadamente
30 minutos. Los restos celulares pueden retirarse por
centrifugación. Cuando se secreta el anticuerpo en el medio, los
sobrenadantes de dichos sistemas de expresión generalmente primero
se concentran usando un filtro de concentración de proteínas
disponible en el mercado, por ejemplo, una unidad de
ultrafiltración Amicon o Millipore Pellicon. Puede incluirse un
inhibidor de proteasa tal como PMSF en cualquiera de las etapas
anteriores para inhibir la proteolisis y pueden incluirse
antibióticos para evitar el crecimiento de contaminantes
adventicios.
La composición de anticuerpo preparada a partir
de estas células puede purificarse usando, por ejemplo,
cromatografía en hidroxilapatita, electroforesis en gel, diálisis,
y cromatografía de afinidad, siendo con cromatografía de afinidad
la técnica de purificación preferida. Lo apropiada que sea la
proteína A como ligando de afinidad depende de la especie e isotipo
de cualquier dominio Fc de inmunoglobulina que esté presente en el
anticuerpo. Puede usarse la proteína A para purificar anticuerpos
que están basados en las cadenas pesadas \gamma1, \gamma2, o
\gamma4 (Lindmark et al., J. Immunol. Meth.
62:1-12 (1983)). Se recomienda la proteína G para
todos los isotipos de ratón y para \gamma3 humana (Guss et
al., EMBO J. 5:1567-1575 (1986)). La matriz a
la que se une el ligando de afinidad es, de la manera más frecuente,
agarosa, pero están disponibles otras matrices. Las matrices
mecánicamente estables tales como vidrio de poro controlado o
poli(estirenodivinil)benceno permiten velocidades de
flujo más rápidas y tiempos de procesamiento más cortos que los que
pueden conseguirse con agarosa. Cuando el anticuerpo comprende un
dominio C_{H}3, la resina Bakerbond ABX™ (J.T. Baker,
Phillipsburg, NJ) es útil para la purificación. También son
apropiadas otras técnicas para la purificación de proteínas tales
como fraccionamiento en una columna de intercambio iónico,
precipitación con etanol, HPLC de Fase Inversa, cromatografía en
sílice, cromatografía en heparin SEPHAROSE™, cromatografía en una
resina de intercambio aniónico o catiónico (tal como una columna de
ácido poliaspártico), cromatoenfoque, SDS-PAGE, y
precipitación en sulfato de amonio, dependiendo del anticuerpo a
recuperar.
Después de cualquier etapa o etapas de
purificación preliminar, la mezcla que comprende el anticuerpo de
interés y los contaminantes puede someterse a cromatografía de
interacción hidrófoba de bajo pH usando un tampón de elución a un pH
entre aproximadamente 2,5-4,5, preferiblemente
realizada a concentraciones salinas bajas (por ejemplo, solución
salina de aproximadamente 0-0,25 M).
Las formulaciones terapéuticas del anticuerpo se
preparan para almacenarlas mezclando el anticuerpo que tiene el
grado deseado de pureza con vehículos, excipientes o estabilizadores
óptimos fisiológicamente aceptables (Remington's Pharmaceutical
Sciences 16ª edición, Osol, A. Ed. (1980)), en forma de
formulaciones liofilizadas o soluciones acuosas. Los vehículos,
excipientes, o estabilizadores aceptables son no tóxicos para los
receptores a las dosificaciones y concentraciones empleados, e
incluyen tampones tales como fosfato, citrato, y otros ácidos
orgánicos; antioxidantes que incluyen ácido ascórbico y metionina;
conservantes (tales como cloruro de octadecildimetilbencilamonio;
cloruro de hexametonio; cloruro de benzalconio, cloruro de
bencetonio; alcohol fenólico, butílico o bencílico; parabenos de
alquilo tales como parabeno de metilo o propilo; catecol;
resorcinol; ciclohexanol; 3-pentanol; y
m-cresol); polipéptidos de bajo peso molecular
(menos de aproximadamente 10 restos); proteínas, tales como albúmina
de suero, gelatina, o inmunoglobulinas; polímeros hidrófilos tales
como polivinilpirrolidona; aminoácidos tales como glicina,
glutamina, asparagina, histidina, arginina, o lisina; monosacáridos,
disacáridos, y otros carbohidratos que incluyendo glucosa, manosa,
o dextrinas; agentes quelantes tales como EDTA; azúcares tales como
sacarosa, manitol, trealosa o sorbitol; sales que forman contraiones
tales como sodio; complejos metálicos (por ejemplo, complejos
Zn-proteína); y/o tensioactivos no iónicos tales
como TWEEN™, PLURONICS™ o polietilenglicol
(PEG).
(PEG).
La formulación en este documento también puede
contener más de un compuesto activo, si es necesario, para la
afección particular que se está tratando, preferiblemente los de
actividades complementarias que no influyen de manera adversa entre
sí (véase sección F a continuación). Dichas moléculas están
presentes de manera apropiada en combinación en cantidades que son
eficaces para el propósito pretendido.
Los ingredientes activos también pueden atraparse
en microcápsulas preparadas, por ejemplo, por técnicas de
coacervación o por polimerización entre superficies, por ejemplo,
microcápsula de hidroximetilcelulosa o gelatina y microcápsula de
poli-(metilmetacrilato), respectivamente, en sistemas de liberación
de fármaco coloidales (por ejemplo, liposomas, microesferas de
albúmina, microemulsiones, nanopartículas y nanocápsulas) o en
macroemulsiones. Dichas técnicas se describen en Remington's
Pharmaceutical Sciences 16ª edición, Osol, A. Ed. (1980).
Las formulaciones a usar para administración
in vivo deben ser estériles. Esto se consigue fácilmente por
filtración a través de membranas estériles de filtración.
Pueden prepararse preparaciones de liberación
sostenida. Los ejemplos apropiados de preparaciones de liberación
sostenida incluyen matrices semipermeables de polímeros hidrófobos
que contienen el anticuerpo, que están dichas matrices en forma de
artículos con forma, por ejemplo, películas, o microcápsulas. Los
ejemplos de matrices de liberación sostenida incluyen poliésteres,
hidrogeles (por ejemplo,
poli(2-hidroxietil-metacrilato),
o poli(vinilalcohol)), polilactidas (Patente de EE UU Nº
3.773.919), copolímeros de ácido L-glutámico y
\gamma etil-L-glutamato, acetato
de etilen-vinilo no degradable, copolímeros de ácido
láctico- ácido glicólico degradables tales como el Lupron Depot™
(microesferas inyectables compuestas de copolímero de ácido
láctico-ácido glicólico y acetato de leuprolida), y ácido
poli-D-(-)-3-hidroxibutírico.
Mientras que los polímeros tales como acetato de etilenvinilo y
ácido láctico-ácido glicólico posibilitan una liberación de
moléculas durante más de cien días, ciertos hidrogeles liberan
proteínas durante periodos de tiempo más cortos. Cuando permanecen
anticuerpos encapsulados en el cuerpo durante un tiempo largo,
pueden desnaturalizarse o agregarse como resultado de la exposición
a humedad a 37ºC, dando como resultado una pérdida de actividad
biológica y posibles cambios en la inmunogenicidad. Pueden
elaborarse estrategias razonables para la estabilización dependiendo
del mecanismo implicado. Por ejemplo, si se descubre que el
mecanismo de agregación es la formación de enlaces
S-S intermoleculares a través de intercambio de
tio-disulfuro, la estabilización puede conseguirse
modificando los restos sulfhidrilo, liofilizando a partir de
soluciones ácidas, controlando el contenido de humedad, usando
aditivos apropiados, y desarrollando composiciones de matriz
polimérica específicas.
Los anticuerpos de la invención pueden usarse
como agentes de purificación por afinidad. En este proceso, los
anticuerpos se inmovilizan en una fase sólida tal como una resina
Sephadex o papel de filtro, usando métodos bien conocidos en la
técnica. El anticuerpo inmovilizado se hace contactar con una
muestra que contiene la proteína VEGF (o fragmento de la misma) a
purificar, y después se lava el soporte con un disolvente apropiado
que retirará sustancialmente todo el material en la muestra excepto
la proteína VEGF, que se une al anticuerpo inmovilizado. Finalmente,
se lava el soporte con otro disolvente apropiado, tal como tampón
glicina, pH 5,0, que liberará la proteína VEGF del anticuerpo.
Los anticuerpos anti-VEGF también
pueden ser útiles en ensayos de diagnóstico para la proteína VEGF,
por ejemplo, detectando su expresión en células, tejidos, o suero
específicos. Dichos métodos de diagnóstico pueden ser útiles en
diagnosis del cáncer.
Para aplicaciones de diagnóstico, el anticuerpo
típicamente se marca con un resto detectable. Son apropiados
numerosos marcadores que pueden agruparse generalmente en las
siguientes categorías:
(a) Radioisótopos, tales como ^{35}S, ^{14}C,
^{125}I, ^{3}H, e ^{135}I. El anticuerpo puede marcarse con
el radioisótopo usando las técnicas descritas en Current
Protocols in Immunology, Volúmenes 1 y 2, Coligen et
al., Ed. Wiley-Interscience, Nueva York, New
York, Pubs. (1991), por ejemplo, y la radiactividad puede medirse
usando un cuenta de centelleo.
(b) Marcadores fluorescentes tales como quelatos
térreos raros (quelatos de curopio) o fluoresceína o sus derivados,
rodamina y sus derivados, dansil, Lisamina, ficoeritrina y rojo
Texas son apropiados. Los marcadores fluorescentes pueden conjugarse
al anticuerpo usando las técnicas descritas en Current Protocols
in Immunology, supra, por ejemplo. La fluorescencia puede
cuantificarse usando un fluorímetro.
(c) Están disponibles diversos marcadores
enzima-sustrato y la Patente de EE UU Nº 4.275.149
proporciona un análisis de algunos de ellos. La enzima generalmente
cataliza una alteración química del sustrato cromogénico que puede
medirse usando diversas técnicas. Por ejemplo, la enzima puede
catalizar un cambio de color en un sustrato, que puede medirse de un
modo espectrofotométrico. Como alternativa, la enzima puede alterar
la fluorescencia o quimioluminiscencia del sustrato. Las técnicas
para cuantificar un cambio en la fluorescencia se han descrito
anteriormente. El sustrato quimioluminiscente llega a excitarse
electrónicamente por una reacción química y entonces puede emitir
luz que puede medirse (usando un quimioluminómetro, por ejemplo) o
donar energía a un aceptor fluorescente. Los ejemplos de marcadores
enzimáticos incluyen luciferasas (por ejemplo, luciferasa de
luciérnaga y luciferasa bacteriana; Patente de EE UU Nº 4.737.456),
luciferina, 2,3-dihidroftalacinedionas, malato
deshidrogenasa, ureasa, peroxidasa tal como peroxidasa de rábano
rusticano (HRPO), fosfatasa alcalina,
\beta-galactosidasa, glucoamilasa, lisozima,
oxidasas de sacáridos (por ejemplo, glucosa oxidasa, galactosa
oxidasa, y glucosa-6-fosfato
deshidrogenasa), oxidasas heterocíclicas (tales como uricasa y
xantina oxidasa), lactoperoxidasa, microperoxidasa, y similares. Las
técnicas para conjugar enzimas a anticuerpos se describen en O'
Sullivan et al., Methods for the Preparation of
Enzyme-Antibody Conjugates for use in Enzyme
Immunoassay, in Methods in Enzym. (ed J. Langone & H. Van
Vunakis), Academic press, Nueva York, 73:147-166
(1981).
Los ejemplos de combinaciones
enzimas-sustrato incluyen, por ejemplo:
(i) peroxidasa de rábano rusticano (HRPO) con
hidrógeno peroxidasa como sustrato, donde la hidrógeno peroxidasa
oxida un precursor con color (por ejemplo, ortofenilendiamina (OPD)
o clorhidrato de 3,3',5,5'-tetrametilbencidina
(TMB));
(ii) fosfatasa alcalina (AP) con de
para-nitrofenilo como sustrato cromogénico; y
(iii)
\beta-D-galactosidasa
(\beta-D-Gal) con un sustrato
cromogénico (por ejemplo,
p-nitrofenil-\beta-D-galactosidasa)
o el sustrato fluorogénico
4-metilumbeliferil-\beta-D-galactosidasa.
Otras numerosas combinaciones
enzima-sustrato son apropiadas para los
especialistas en la técnica. Para un análisis general de estas,
véanse las Patentes de EEUU Nº 4.275.149 y Nº 4.318.980.
A veces, el marcador está conjugado
indirectamente con el anticuerpo. El especialista en la técnica será
consciente de diversas técnicas para conseguir esto. Por ejemplo, el
anticuerpo puede conjugarse con biotina y cualquiera de las tres
categorías principales de marcadores mencionados anteriormente puede
conjugarse con avidina, o viceversa. La biotina se une de manera
selectiva a avidina y, de este modo, el marcador puede conjugarse
con el anticuerpo en este modo indirecto. Como alternativa, para
conseguir la conjugación indirecta del marcador con el anticuerpo,
el anticuerpo se conjuga con un pequeño hapteno (por ejemplo,
digoxina) y uno de los diferentes tipos de marcadores mencionados
anteriormente se conjuga con un anticuerpo
anti-hapteno (por ejemplo, anticuerpo
anti-digoxina). De este modo, puede conseguirse la
conjugación indirecta del marcador con el anticuerpo.
En otra realización de la invención, el
anticuerpo anti-VEGF no necesita estar marcado, y la
presencia del mismo puede detectarse usando un anticuerpo marcado
que se une al anticuerpo anti-VEGF.
Los anticuerpos de la presente invención pueden
emplearse en cualquier método de ensayo conocido, tal como ensayos
de unión competitiva, ensayos tipo sándwich directos o indirectos,
y ensayos de inmunoprecipitación. Zola, Monoclonal Antibodies: A
Manual of Techniques, pág. 147-158 (CRC Press,
Inc. 1987).
Los ensayos de unión competitiva se basan en la
capacidad de un patrón marcado para competir con el analito de la
muestra de ensayo para unirse con una cantidad limitada de
anticuerpo. La cantidad de proteína VEGF en la muestra de ensayo es
inversamente proporcional a la cantidad de patrón que llega a
unirse a los anticuerpos. Para facilitar la determinación de la
cantidad de patrón que llega a unirse, generalmente se
insolubilizan los anticuerpos antes o después de la competición, de
modo que el patrón y el analito que se unen a los anticuerpos
pueden separarse de manera adecuada del patrón y del analito que
permanecen sin unirse.
Los ensayos tipo sándwich implican el uso de dos
anticuerpos, capaces cada uno de unirse a una porción inmunogénica
diferente, o epítopo, de la proteína a detectar. En un ensayo tipo
sándwich, el analito de la muestra de ensayo se une por un primer
anticuerpo que está inmovilizado en un soporte sólido, y
posteriormente un anticuerpo secundario se une al analito, formando
de este modo un complejo tripartito insoluble. Véase, por ejemplo,
la Patente de EE UU Nº 4.376.110. El anticuerpo secundario puede por
sí mismo estar marcado con un resto detectable (ensayos tipo
sándwich directos) o pueden medirse usando un anticuerpo
anti-inmunoglobulina que está marcado con un resto
detectable (ensayo tipo sándwich indirecto). Por ejemplo, un tipo de
ensayo tipo sándwich es un ensayo ELISA, en cuyo caso el resto
detectable es una enzima.
Para inmunohistoquímica, la muestra tumoral puede
ser fresca o congelada o puede estar embebida en parafina y fijada
con un conservante tal como formalina, por ejemplo.
Los anticuerpos también pueden usarse para
ensayos de diagnóstico in vivo. Generalmente, el anticuerpo
está marcado con un radionúclido (tales como ^{111}In, ^{99}Tc,
^{14}C, ^{131}I, ^{125}I, ^{3}H, ^{32}P o ^{35}S) de
modo que el tumor puede localizarse usando
inmunocentelleografía.
Por motivos de comodidad, el anticuerpo de la
presente invención puede proporcionarse en un kit, es decir, una
combinación empaquetada de reactivos en cantidades predeterminadas
con instrucciones para realizar en ensayo de diagnóstico. Cuando el
anticuerpo está marcado con una enzima, el kit incluirá sustratos y
cofactores requeridos por la enzima (por ejemplo, un sustrato
precursor que proporciona el cromóforo o fluoróforo detectable).
Además, pueden incluirse otros aditivos tales como estabilizadores,
tampones (por ejemplo, un tampón de bloqueo o un tampón de lisis) y
similares. Las cantidades relativas de los diversos reactivos pueden
variar ampliamente para proporcionar concentraciones en solución de
los reactivos que optimizan sustancialmente la sensibilidad del
ensayo. Particularmente, los reactivos pueden proporcionarse como
polvos secos, habitualmente liofilizados, incluyendo excipientes
que, en disolución, proporcionarán una solución de reactivo que
tiene la concentración apropiada.
Para aplicaciones terapéuticas, los anticuerpos
anti-VEGF de la invención se administran a un
mamífero, preferiblemente a un humano, en una forma de dosificación
farmacéuticamente aceptable, tal como las analizadas anteriormente,
incluyendo las que pueden administrarse a un humano por vía
intravenosa como un bolo o por infusión continua durante un periodo
de tiempo, por vía intramuscular, intraperitoneal,
intracerebroespinal, subcutánea, intraarticular, intrasinovial,
intratecal, oral, tópica, o por inhalación. Los anticuerpos también
se administran apropiadamente por vía intratumoral, peritumoral,
intralesional, o perilesional, para ejercer efectos terapéuticos
locales así como sistémicos. Se espera que la vía intraperitoneal
sea particularmente útil, por ejemplo, en el tratamiento de tumores
de ovario.
Para la prevención o tratamiento de la
enfermedad, la dosificación apropiada de anticuerpo dependerá del
tipo de enfermedad a tratar, como se ha definido anteriormente, la
gravedad y el curso de la enfermedad, si el anticuerpo se
administra para propósitos preventivos o terapéuticos, la terapia
previa, la historia clínica del paciente y la respuesta al
anticuerpo, y el juicio del médico que está atendiendo. El
anticuerpo se administra apropiadamente al paciente en una vez o
durante una serie de tratamientos.
Los anticuerpos anti-VEGF son
útiles en el tratamiento de diversas enfermedades y trastornos
neoplásicos y no neoplásicos. Los neoplasmas y afecciones
relacionadas que son susceptibles al tratamiento incluyen carcinomas
de mama, carcinomas de pulmón, carcinomas gástricos, carcinomas
esofágicos, carcinomas colorectales, carcinomas de hígado,
carcinomas de ovario, tecomas, arrenoblastomas, carcinomas
cervicales, carcinoma endometrial, hiperplasia endometrial,
endometriosis, fibrosarcomas, coriocarcinoma, cáncer de cabeza y
cuello, carcinoma nasofaríngeo, carcinoma laríngeo, hepatoblastoma,
sarcoma de Kaposi, melanoma, carcinomas de piel, hemangioma,
hemangioma cavernoso, hemangioblastoma, carcinomas de páncreas,
retinoblastoma, astrocitoma, glioblastoma, Schwannoma,
oligodendroglioma, meduloblastoma, neuroblastoma, rabdomiosarcoma,
sarcoma osteogénico, leiomiosarcomas, carcinomas del tracto
urinario, carcinomas tiroideos, tumor de Wilm, carcinoma de células
renales, carcinoma de próstata, proliferación vascular anormal
asociada con facomatosis, edema (tal como el asociado con tumores
cerebrales), y síndrome de Meig.
Las afecciones no neoplásicas que son
susceptibles al tratamiento incluyen artritis reumatoide, psoriasis,
arteriosclerosis, retinopatías diabéticas y otras retinopatías
proliferativas que incluyen retinopatía del prematuro, fibroplasia
retrolental, glaucoma neovascular, degeneración macular relacionada
con la edad, hiperplasias tiroideas (incluyendo la enfermedad de
Grave), trasplante corneal y transplante de otros tejidos,
inflamación crónica, inflamación pulmonar, síndrome nefrótico,
preeclampsia, ascitis, efusión pericárdica (tal como la asociada
con pericarditis), y efusión pleural.
La degeneración macular relacionada con la edad
(AMD) es una causa que conduce a la pérdida de vista grave en
población anciana. La forma exudativa de AMD está caracterizada por
neovascularización coroidal y desprendimiento de células del
epitelio de pigmentario retinal. Como la neovascularización coroidal
está asociada con un empeoramiento drástico en la prognosis, se
espera que los anticuerpos anti-VEGF de la presente
invención sean especialmente útiles en reducir la gravedad de
AMD.
Dependiendo del tipo y gravedad de la enfermedad,
aproximadamente 1 \mug/kg a aproximadamente 50 mg/kg (por ejemplo,
0,1-20 mg/kg) de anticuerpo es una dosificación
candidata inicial para la administración al paciente, tanto, por
ejemplo, por una o mas administraciones por separado, o por infusión
continua. Una dosificación típica diaria o semanal podría variar de
aproximadamente 1 \mug/kg a aproximadamente 20 mg/kg o más,
dependiendo de los factores mencionados anteriormente. Para
administraciones por repetido el tratamiento se repite varios días o
más, dependiendo de la afección, hasta que sucede la supresión
deseada de los síntomas de la enfermedad. Sin embargo, pueden ser
útiles otros regímenes de dosificación. El progreso de esta terapia
se controla fácilmente por técnicas y ensayos convencionales,
incluyendo, por ejemplo, imágenes radiográficas tumorales.
La eficacia del anticuerpo en prevenir y tratar
la enfermedad puede mejorarse administrando el anticuerpo de manera
seriada o en combinación con otro agente que es eficaz para esos
propósitos, tal como factor de necrosis tumoral (TNF), un anticuerpo
capaz de inhibir o neutralizar la actividad angiogénica del factor
de crecimiento de fibroblastos ácido o básico (FGF) o el factor de
crecimiento de hepatocitos (HGF), un anticuerpo capaz de inhibir o
neutralizar las actividades coagulantes del factor tisular, la
proteína C, o la proteína S (véase Esmon et al., Publicación
de Patente PCT Nº WO 91/01753, publicada el 21 de febrero de 1991),
un anticuerpo capaz de unirse al receptor HER2 (véase Hudziak et
al., Publicación de Patente PCT Nº WO 89/06692, publicada el 27
de julio de 1989), o uno o más agentes terapéuticos convencionales
tales como, por ejemplo, agentes alquilantes, antagonistas de ácido
fólico, antimetabolitos del metabolismo de ácidos nucleicos,
antibióticos, análogos de pirimidina, 5-fluoroacilo,
cisplatino, nucleósidos de purina, aminas, aminoácidos, nucleósidos
de tiazol, o corticoesteroides. Estos otros agentes pueden estar
presentes en la composición que se está administrando o pueden
administrase por separado. Además, el anticuerpo se administra
apropiadamente de manera seriada o en combinación con tratamientos
radiológicos, que implican tanto irradiación como administración de
sustancias radiactivas.
La vascularización de tumores puede combatirse en
terapia de combinación. Se administran el anticuerpo y uno o más
antagonistas anti-VEGF diferentes a los pacientes
que tienen tumor a dosis terapéuticamente eficaces como se
determina, por ejemplo, observando la necrosis del tumor o sus
focos metastásicos, si los hay. Esta terapia se continúa hasta que
no se observan más efectos beneficiosos o los exámenes clínicos no
muestran rastro del tumor o cualquier foco metastásico. Entonces se
administra TNF, solo o en combinación con una agente auxiliar tal
como interferón alfa, beta o gamma, anticuerpo
anti-HER2, heregulina, anticuerpo
anti-heregulina, factor D,
interleuquina-1 (IL-1),
interleuquina-2 (IL-2), factor de
estimulación de colonias de granulocitos-macrófagos
(GM-CSF), o reactivos que promueven la coagulación
vascular en tumores, tales como anticuerpo
anti-proteína C, anticuerpo
anti-proteína S, o proteína de unión C4b (véase
Esmon et al., Publicación de Patente PCT Nº WO 91/01753,
publicada el 21 de Febrero de 1991), o calor o radiación.
Como los agentes auxiliares variarán en su
eficacia, es deseable comparar su impacto en el tumor por
exploración de matriz de un modo convencional. La administración de
anticuerpo anti-VEGF y TNF se repite hasta que se
consigue el efecto clínico deseado. Como alternativa, el anticuerpo
anti-VEGF se administra junto con TNF y,
opcionalmente, agente o agentes auxiliares. En ocasiones, cuando se
encuentran tumores sólidos en las extremidades o en otras
localizaciones susceptibles de asilamiento de la circulación
general, los agentes terapéuticos directos en este documento se
administran al tumor u órgano asilado. Puede administrarse un
antagonista de FGF o factor de crecimiento derivado de plaquetas
(PDGF), tal como un anticuerpo neutralizante
anti-FGF o anti-PDGF, al paciente
junto con el anticuerpo anti-VEGF. El tratamiento
con anticuerpos anti-VEGF puede suspenderse de
manera óptima durante periodos de curación de heridas o
neovascularización deseada.
Se contempla un artículo de fabricación que
contiene materiales útiles para el tratamiento de los trastornos
descritos anteriormente. El artículo de fabricación comprende un
recipiente y un marcador. Los recipientes apropiados incluyen, por
ejemplo, botes, viales, jeringas, y tubos de ensayo. Los
recipientes pueden formarse de una diversidad de materiales tales
como vidrio o plástico. El recipiente contiene una composición que
es eficaz para el tratamiento de la afección y puede tener una vía
de acceso estéril (por ejemplo, el recipiente puede ser una bolsa o
un vial de solución intravenosa que tiene un tapón perforable por
una aguja de inyección hipodérmica). El agente activo en la
composición es el anticuerpo anti-VEGF. El marcador
en, o en asociación con, el recipiente indica que la composición se
usa para tratar la afección de elección. El artículo de fabricación
puede comprender adicionalmente un segundo recipiente que comprende
un tampón farmacéuticamente aceptable, tal como una solución salina
tamponada con fosfato, solución de Ringer y solución de dextrosa.
También puede incluir otros materiales deseables desde un punto de
vista comercial y útil, incluyendo otros tampones, diluyentes,
filtros, agujas, jeringas, y prospectos con instrucciones para su
uso.
Este ejemplo describe la producción de
anticuerpos anti-VEGF humanizados con propiedades
deseables desde un punto de vista terapéutico.
Clonación de MAb A.4.6.1 Murino y Construcción
de Fab Quimérico de Ratón-Humano: El mAb A.4.6.1
anti-VEGF murino se ha descrito previamente por Kim
et al., Growth Factors 7:53 (1992) y Kim et al.,
Nature 362:841 (1993). Se asiló el ARN total de células de
hibridoma que producen el Mab A.4.6.1. anti-VEGF
usando RNAsol (TEL-TEST) y se transcribió a la
inversa a ADNc usando el cebador Oligo-dT y el
sistema SuperScript II (GIBCO BRL, Gaithersburg), MD). Las
combinaciones de cebadores oligonucleotídicos degenerados, basados
en las secuencias de aminoácidos N-terminales de las
cadenas ligeras y pesadas del anticuerpo, se sintetizaron y se
usaron como cebadores directos. Los cebadores inversos se basaron
en las 4 secuencias flanqueantes obtenidas del subgrupo kV de
cadenas ligeras y el subgrupo II de cadenas pesadas murinas (Kabat
et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest. 5ª
ed Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda,
MD. (1991)). Después de la amplificación por reacción en cadena de
la polimerasa (PCR), los fragmentos de ADN se ligaron a un vector de
clonación TA (Invitrogen, San Diego, CA). Se secuenciaron ocho
clones de cada una de las cadenas pesada y ligera. Se subclonaron un
clon con una secuencia consenso para el domino VL de la cadena
ligera y uno con una secuencia consenso para el domino VH de la
cadena pesada, respectivamente, en el vector pEMX1 que contiene los
dominios CL y CH1 humanos (Werther et al., J. Immunol.
157:4986-4995 (1996)), generando una quimera ratón-
humano. Este F(ab) quimérico consta del domino VH A.4.6.1
murino completo fusionado a un domino CH1 humano en el aminoácido
SerH113 y el dominio VL A.4.6.1 murino completo fusionado a un
dominio CL humano en el aminoácido LisL107. La expresión y
purificación del F(ab) quimérico fueron idénticas a las de
los F(ab) humanizados. El F(ab) quimérico se usó como
patrón en los ensayos de unión.
Modelos Gráficos Informáticos de F(ab)
Humanizados y Murinos: Las secuencias de los dominios VL y VH
(Figuras 1A y 1B) se usaron para construir un modelo gráfico
informático de los dominios VL-VH A.4.6.1 murinos.
Este modelo se usó para determinar qué restos flanqueantes deben
incorporarse en el anticuerpo humanizado. También se construyó un
modelo del F(ab) humanizado para verificar la selección
correcta de los restos flanqueantes murinos. La construcción de los
modelos se realizó como se ha descrito previamente (Carter et
al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:4285-4289
(1992) y Eigenbrot et al., J. Mol. Biol.
229:969-995 (1993)).
Construcción de F(ab) humanizados:
El plásmido pEMX1 usado para mutagénesis y expresión de F(ab)
en E. coli se ha descrito previamente (Werther et al.,
supra). Brevemente, el plásmido contiene un fragmento de ADN
que codifica una secuencia consenso del subgrupo I de cadenas
ligeras \kappa humanas (VL\kappaI-CL) y una
secuencia consenso del subgrupo III de cadenas pesadas humanas
(VHIII-CHI) y un promotor de fosfatasa alcalina. El
uso de las secuencias consenso para VL y VH se ha descrito
previamente (Carter et al., supra).
Para construir la primera variante de
F(ab) de A.4.6.1. humanizado, F(ab)-1,
se realizó mutagénesis dirigida de sitio (Kunkel et al., Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 82:488-492 (1985)) en un
molde de pEMX1 que contiene desoxiuridina. Los seis CDR de acuerdo
con Kabat et al., supra, se cambiaron a la secuencia de
A.4.6.1 murino. Por lo tanto, F(ab)-1 consta
de una región flanqueante humana completa (VL \kappa subgrupo I y
VH subgrupo III) con las seis secuencias CDR murinas completas. Se
construyeron plásmidos para todas las otras variantes de
F(ab) a partir del molde plasmídico de
F(ab)-1. Los plásmidos se transformaron en la
cepa XL-1 Blue de E. coli (Stratagene, San
Diego, CA) para la preparación de ADN de cadena doble y cadena
simple. Para cada variante, se secuenció completamente el ADN que
codifica las cadenas ligera y pesada usando el método de
dideoxinucleótidos (Sequenase, U.S. Biochemical Corp., Cleveland,
OH). Los plásmidos se transformaron en la cepa 16C9 de E.
coli, un derivado de MM294, se sembraron en placas de caldo
Luria que contenían 50 \mug/ml de carbenicilina, y se seleccionó
una colonia simple para la expresión de proteína. La colonia simple
se hizo crecer en 5 ml de caldo Luria-100 mg/ml de
carbenicilina durante 5-8 horas a 37ºC. Los 5 ml de
cultivo se añadieron a 500 ml de AP5-50 \mug/ml
de carbenicilina y se dejaron crecer durante 20 horas en un matraz
de agitación impedida de 4 litros a 30ºC. El medio AP5 consta de
1,5 g de glucosa, 11,0 g de Hycase SF, 0,6 g de extracto de levadura
(certificado), 0,19 g de MgSO_{4} (anhidro), 1,07 g de
NH_{4}Cl, 3,73 g de KCl, 1,2 g de NaCl, 120 ml de trietanolamina
1 M, pH 7,4, a 1 litro de agua y después se filtró en esterilidad a
través de un filtro Sealkeen de 0,1 mm. Las células se recogieron
por centrifugación en un bote de centrifugado de 1 litro a 3000 x g
y se recogió el sobrenadante. Después de congelar durante 1 hora, el
sedimento se resuspendió en 25 ml de Tris 10 mM-EDTA
1 mM-sacarosa al 20%, pH 8,0, frío. Se añadieron 250
ml de benzamidina 0,1 M (Sigma. St Louis, MO) para inhibir la
proteolisis. Después de agitar suavemente en hielo durante 3 horas,
la muestra se centrifugo a 40.000 x g durante 15 minutos. Después se
aplicó el sobrenadante a 1 columna de proteína
G-Sepharose CL-4B (Pharmacia,
Uppsala, Suecia) (volumen de lecho 0,5 ml) equilibrada con Tris 10
mM-EDTA 1 mM, pH 7,5. La columna se lavó con 10 ml
de Tris 10 mM-EDTA 1 mM, pH 7,5, y se eluyó con 3 ml
de glicina 0,3 M, pH 3,0, en 125 ml de Tris 1 M, pH 8,0. Después se
intercambió el tampón de F(ab) por PBS usando un Centricon 30
(Amicon, Beberly, MA) y se concentró a un volumen final de 0,5 ml.
Se corrieron geles SDS-PAGE para todos los
F(ab) para determinar la pureza y el peso molecular de cada
variante se verificó por espectrometría de masas por
electronebulización.
Construcción y Expresión de IgG Quimérico y
Humanizado: Para la generación de variantes de IgG humanas de
A.4.6.1 quiméricos (chIgG1) y humanizados (huIgG1), se subclonaron
los dominios VL y VH murinos o humanizados apropiados
(F(ab)-12, Tabla 2) en vectores pRK descritos
previamente, por separado (Eaton et al., Biochemistry
25:8343-8347 (1986)). El AND que codifica la cadena
ligera y pesada completas de cada variante se verificó por
secuenciación de dideoxinucleótidos.
Para la expresión transitoria de las variantes,
los plásmidos de la cadena pesada y ligera se cotrasfectaron en
células 293 humanas (Graham et al., Gen. Virol.
36:59-74 (1977)), usando un procedimiento de alta
eficacia (Gorman et al., DNA Prot. Eng. Tech.
2:3-10 (1990)). El medio se cambió a uno libre de
suero y se recogió diariamente durante hasta cinco días. Los
anticuerpos se purificaron de los sobrenadantes combinados usando
proteína- Sepharose CL-4B (Pharmacia). Se
intercambió el tampón del anticuerpo eluido por PBS usando un
Centricon-30 (Amicon), se concentró a 0,5 ml, se
filtró en condiciones estériles usando un Millex-GV
(Millipore, Bedford, MA) y se almacenó a 4ºC.
Para la expresión estable de la variante de IgG1
humanizada final (rhuMAb VEGF), se transfectaron células de ovario
de hámster chino (CHO) con vectores dicistrónicos diseñados para
coexpresar tanto la cadena pesada como la ligera (Lucas et al.,
Nucleic Acid Res. 24:1774-79 (1996)). Los
plásmidos se introdujeron en células DP12, un derivado patentado de
la línea celular CHO-KI DUX B11 desarrollado por L.
Chasin (Columbia University), mediante lipofección y se seleccionó
para el crecimiento en medio libre de GHT (Chisholm, V. High
efficiency gene transfer in mammalian cells. In: Glover, DM, Hames,
BD. DNA Cloning 4. Mammalian systems. Oxford Univ. Press,
Oxford pág 1-41 (1996)). Se eligieron
aleatoriamente aproximadamente 20 clones no amplificados y se
resembraron en placas de 96 pocillos. La productividad relativa
específica de cada clon se controló usando un ELISA para
cuantificar la IgG humana de longitud completa acumulada en cada
pocillo después de 3 días, y una tinción fluorescente, Calcein AM,
como marcador sustituto de la cantidad de células viables por
pocillo. En base a estos datos, se eligieron varios clones no
amplificados para amplificación adicional en presencia de
concentraciones en aumento de metotrexato. Se eligieron clones
individuales que sobrevivieron a metotrexato 10, 50 y 100 nM y se
transfectaron a placas de 96 pocillos para la exploración de
productividad. Se expandió un clon, que mostraba de manera
reproducible una productividad específica alta, en matraces T y se
usó para inocular un cultivo giratorio. Después de varios pases, se
usaron las células adaptadas a suspensión para inocular cultivos de
producción en medios libres de suero que contienen GHT,
suplementados con diversas hormonas e hidrolizados proteicos. El
fluido de cultivo celular recogido, que contenía rhuMAb VEGF, se
purificó usando proteína A-Sepharose
CL-4B. La pureza después de esta etapa fue de
\sim99%. La purificación posterior a homogeneidad se realizó
usando una etapa de cromatografía de intercambio iónico. El
contenido de endotoxina del anticuerpo purificado final fue de <
0,10 eu/mg.
Cuantificación de F(ab) e IgG: Para
cuantificar las moléculas de F(ab), se recubrieron placas
ELISA con 2 \mug/ml de F(ab) de cabra
anti-IgG humana (Organon Teknika, Durham, NC) en
tampón carbonato 50 mM, pH 9,6, a 4ºC durante una noche y se
bloquearon con PBS-albúmina de suero bovino al 0,5%
(tampón de bloqueo) a temperatura ambiente durante 1 hora. Los
patrones (0,78-50 ng/ml de F(ab) humana) se
adquirieron de Chemicon (Temecula, CA). Se incubaron diluciones
seriadas de las muestras en PBS-albúmina de suero
bovino al 0,5%-polisorbato 20 al 0,05% (tampón de ensayo) en las
palcas durante 2 horas. La unión de F(ab) se detectó usando
F(ab) de cabra anti-IgG humana marcada con
peroxidasa de rábano rusticano (Organon Teknika), seguido de
3,3',5,5'-tetrametilbencidina (Kirkegaard &
Perry Laboratories, Gaithersburg, MD) como sustrato. Las placas se
lavaron entre las etapas. Se leyó la absorbancia a 450 nm en un
lector de placa Vmax (Molecular Devices, Menlo Park, CA). La curva
patrón se ajustó usando un programa de ajuste de curva de regresión
no lineal de cuatro parámetros. Los datos puntuales que cayeron en
el intervalo de la curva patrón se usaron para calcular las
concentraciones de F(ab) de las muestras. La concentración
del anticuerpo de longitud completa se determinó usando Fc de cabra
anti-IgG humana (Cappel, Westchester, PA) para la
captura y Fc de cabra anti-IgG humana marcada con
peroxidasa de rábano rusticano (Cappel) para la detección. Se usó
IgG1 humana (Chemicon) como patrón.
Ensayo de Unión a VEGF: Para medir la
actividad de unión a VEGF de F(ab), se recubrieron placas
ELISA con 2 \mug/ml de F(ab')_{2} de conejo contra Fc de
IgG humana (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA) y se bloquearon
con tampón de bloqueo (descrito anteriormente). El medio
condicionado diluido que contenía 3 ng/ml de KDR-IgG
(Park et al., J. Biol. Chem. 296:25646-25645
(1994)) en tampón de bloqueo, se incubó en la paca durante 1 hora.
Se incubaron patrones (6,9-440 ng/ml de F(ab)
quimérico) y diluciones seriadas de dos veces de las muestras con
VEGF biotinilado 2 nM durante 1 hora en tubos. Después se
transfirieron las soluciones de los tubos a las placas ELISA y se
incubaron durante 1 hora. Después de lavar, se detectó el VEGF
biotinilado unido a KDR usando estreptavidina marcada con
peroxidasa de rábano rusticano (Zymed, South San Francisco, CA o
Sigma, St Louis, MO) seguido de
3,3',5,5'-tetrametilbencidina como sustrato. Las
curvas de titulación se ajustaron con un programa de ajuste de curva
de regresión no lineal de cuatro parámetros (KaleidaGraph, Synergy
Software, Reading PA). Se calcularon las concentraciones de las
variantes de F(ab) que correspondían al punto medio de
absorbancia en la curva de titulación del patrón, y después de
dividieron por la concentración del patrón que corresponde al punto
medio de absorbancia de la curva de titulación patrón. Los ensayos
para IgG de longitud completa fueron iguales que para los
F(ab) excepto en que el tampón de ensayo contenía suero
humano al 10%.
Ensayo de Biosensor BIAcore™: La unión a
VEGF de los F(ab) humanizados y quiméricos se comparó usando
un biosensor BIAcore™ (Karlsson et al., Methods: A
Comparison to Methods in Enzymology 6:97-108
(1994)). Las concentraciones de F(ab) se determinaron por
análisis cuantitativo de aminoácidos. VEGF se unió a un chip
biosensor CM-5 a través de los grupos amina
primaria de acuerdo con las instrucciones del fabricante
(Pharmacia). La cinética de disociación se midió saturando el chip
con F(ab) (35 \mul de F(ab) 2 \muM a una
velocidad de flujo de 20 \mul/min) y después cambiando a tampón
(PBS-polisorbato 20 al 0,05%). Los datos puntuales
de 0-4500 segundos se usaron para el análisis de
cinética de disociación. La constante de velocidad de disociación
(k_{off}) se obtuvo de la pendiente de la gráfica de
ln(R0/R) versus tiempo, donde R0 es la señal a t=0 y R es la
señal a cada tiempo puntual.
La cinética de asociación se midió usando
diluciones seriadas de dos veces de F(ab)
(0,0625-2 mM). La pendiente, K_{s}, se obtuvo de
la gráfica de ln(-dR/dt) versus tiempo para cada concentración de
F(ab) usando el programa de evaluación de cinética BIAcore™
descrito en el manual Pharmacia Biosensor. R es la señal a tiempo t.
Los datos entre 80 y 168, 148, 128, 114, 102, y 92 segundos se
usaron para F(ab) 0,0625, 0,125, 0,25, 0,5, 1, y 2 mM
respectivamente. La constante de velocidad de asociación (k_{on})
se obtuvo de la pendiente de la gráfica de K_{s} versus
concentración de F(ab). Al final de cada ciclo, se retiró el
F(ab) unido inyectando 5 \mul de HCl 50 mM a una velocidad
de flujo de 20 \mul/min para regenerar el chip.
Ensayo de Crecimiento Celular Endotelial:
Se cultivaron células de endotelio capilar obtenidas de corteza
adrenal bovina en presencia de medio de Eagle modificado por
Dulbecco bajo en glucosa (DMEM) (GIBCO) suplementado con suero de
ternera al 10%, glutamina 2 mM, y antibióticos (medio de
crecimiento), esencialmente como se ha descrito previamente (Leung
et al., Science 246:1306-1309 (1989)). Para
ensayos mitogénicos, las células endoteliales se sembraron a una
densidad de 6 x 10^{3} células por pocillo, en placas de 6
pocillos, en medio de crecimiento. Después se añadieron muMAb VEGF
A.4.6.1 o rhuMAb VEGF a concentraciones que varían entre 1 y 5000
ng/ml. Después de 2-3 horas, se añadió rhVEGF165
expresado por E. coli a una concentración final de 3 ng/ml.
Para el control de la especificidad, se añadió cada anticuerpo a
las células endoteliales a la concentración de 5000 ng/ml, solas o
en presencia de 2 ng/ml de bFGF. Después de cinco o seis días, las
células de disociaron por exposición a tripsina y se contaron en un
contador Cuolter (Coulter Electronics, Hialeah, FL). La variación
de la media no excedió el 10%. Los datos se analizaron por un
programa de ajuste de curva de cuatro parámetros
(KaleidaGraph).
Estudios de Tumor In Vivo : Se
cultivaron células A673 de rabdomiosarcoma humano (ATCC; CRL 1598)
como se ha descrito previamente, en DMEM/F12 suplementado con suero
bovino fetal al 10%, glutamina 2 mM y antibióticos (Kim et al.,
Nature 362:841-844 (1993) y Borgström et al.,
Cancer Res. 56:4032-4039 (1996)). Se inyectaron
por vía subcutánea ratones desnudos BALB/c hembras de
6-10 semanas de edad, con 2 x 10^{6} células
tumorales en el área dorsal en un volumen de 200 \mul. Después,
los animales se trataron con muMAb VEGF A.4.6.1, rhuMAb VEGF o un
MAb control dirigido contra la proteína gp120 (Kim et al.,
Nature 362:841-844 (1993)). Se administraron
ambos MAb anti-VEGF a las dosis de 0,5 y 5 mg/kg; el
MAb control se dio a la dosis de 5 mg/kg. Cada MAb se administró
dos veces a la semana por vía intraperitoneal en un volumen de 100
\mul, comenzando 24 horas después de la inoculación de células
tumorales. Cada grupo constaba de 10 ratones. El tamaño del tumor
se determinó a intervalos semanales. Cuatro semanas después de la
inoculación de células tumorales, los animales se sometieron a
eutanasia y los tumores se retiraron y se pesaron. El análisis
estadístico se realizó por ANOVA.
Humanización: Se usó la secuencia consenso
para el subgrupo III de cadenas pesadas humanas y el subgrupo k I
de cadenas ligeras humanas como región flanqueante para la
humanización (Kabat et al., supra) (Figuras. 1A y 1B). Esta
región flanqueante se ha usado de manera exitosa en la humanización
de otros anticuerpos murinos (Werther et al., supra; Carter
et al., supra; Presta et al., J. Immunol.
151:2623-2632 (1993); y Eigenbrot et al.,
Proteins 18:49-62 (1994)).
CDR-H1 incluyó los restos H26-H35.
Los otros CDR fueron de acuerdo con Kabat et al., supra.
Todas las variantes humanizadas se hicieron en un principio y se
exploraron para la unión como los F(ab) expresados en E.
coli. Los rendimientos típicos de los matraces de agitación de
500 ml fueron de 0,1-0,4 mg de F(ab).
Se usó F(ab) quimérico como patrón en los
ensayos de unión. En la variante inicial,
F(ab)-1, los restos de CDR se transfirieron
del anticuerpo murino a la región flanqueante humana y, en base a
los métodos de los F(ab) murinos y humanizados, el resto en
la posición H49 (Ala en humano) se cambió al Gly murina. Además, los
F(ab) que constan de la cadena pesada quimérica/cadena ligera
de F(ab)-1 (F(ab)-2) y
la cadena pesada de F(ab)-1/cadena ligera
quimérica (F(ab)-3) se generaron y se
ensayaron para la unión. F(ab)-1 mostró una
afinidad más de 1000 veces reducida que la de F(ab) quimérico
(Tabla 2). Comparando las afinidades de unión de
F(ab)-2 y F(ab)-3 se
sugiere que los restos de la región flanqueante en el domino VH de
F(ab)-1 necesitan alterarse para aumentar la
unión.
\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{ \begin{minipage}{150mm} ^{a} Las variantes de F(ab) anti-VEGF se incubaron con VEGF biotinilado y después se transfirieron a placas ELISA recubiertas con KDR-IgG (Park et al., supra ).\end{minipage} \cr \begin{minipage}{150mm} ^{b} Los restos murinos están subrayados; los números de resto son de acuerdo con Kabat et al., supra .\end{minipage} \cr \begin{minipage}{150mm} ^{c} La media y desviación estándar son el promedio de las proporciones calculadas para cada uno de los ensayos independientes; el EC50 para F(ab) quimérico fue 0,049 \pm 0,013 mg/ml (1,0 nM).\end{minipage} \cr}
Cambiando los restos humanos H71 y H72 a sus
equivalentes murinos en F(ab)-4 se mejora la
unión en 4 veces (Tabla 2). La inspección de los modelos de los
F(ab) murinos y humanizados se sugiere que el resto L46,
internado en la superficie de contacto VL-VH y que
interacciona con CDR-H3 (Figura 2), también podría
jugar un papel en la determinación de la conformación de
CDR-H3 y/o afectar a la relación de los dominios VL
y VH. Cuando la Val murina se intercambia por la Leu humana en L46
(F(ab)-5), la afinidad de unión aumenta en
casi 4 veces (Tabla 2). Se evaluaron otros tres restos internados en
la región flanqueante en base a los modelos moleculares: H49, H69 y
H78. La posición H69 puede afectar a la conformación de CD- H2
mientras que la posición H78 puede afectar a la conformación de
CDR-H1 (Figura 2). Cuando se cambió cada uno
individualmente del equivalente humano al murino, la unión mejoró en
2 veces en cada caso (F(ab)-6 y
F(ab)-7, Tabla 2). Cuando ambos se cambiaron
de manera simultánea, la mejora en la unión fue de 8 veces
(F(ab)-8, Tabla2). El resto H49 se incluyó en
un principio como la Gly murina; cuando se cambió a la Ala
equivalente consenso humana, la unión se redujo en 15 veces
(F(ab)-9, Tabla 2).
En F(ab)-10 y
F(ab)-11 se cambiaron dos restos en el bucle
flanqueante 3, FR-3, a sus equivalentes murinos:
AsnH76 a Ser murina (F(ab)-10) y LysH75 a Ala
murina (F(ab)-11). Ambos lograron una mejora
relativamente pequeña en la unión (Tabla 2). Finalmente, en la
posición H94 las secuencias humana y murina tiene, de la manera más
frecuente, una Arg (Kabat et al., supra). En
F(ab)-12, esta Arg se reemplaza por la Lys
poco común encontrada en el anticuerpo murino (Figura 1A) y esto da
como resultado una unión que fue 2 veces menor que la de
F(ab) quimérico (Tabla 2). El F(ab)-12
también se comparó con el F(ab) quimérico usando el sistema
BIAcore™ (Pharmacia). Usando esta técnica, el K_{d} del
F(ab)-12 humanizado fue 2 veces más débil que
el de F(ab) quimérico debido a una K_{on}más lenta y una
K_{off} más rápida (Tabla 3).
\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{ \begin{minipage}{150mm} ^{a} La cantidad de F(ab) unido, en unidades de resonancia (RU), se midió usando un sistema BIAcore ^{TM} cuando se inyectaron 2 \mu g de F(ab) en un chip que contenía 2480 RU de VEGF inmovilizadas. La cinética de disociación (k _{off} ) se midió saturando el chip con F(ab) y después controlando la disociación después de cambiar el tampón. La cinética asociación (k _{on} ) se midió usando diluciones seriadas de dos veces de F(ab). La constante de equilibrio de disociación K _{d} se calculó como k _{off} /k _{on} .\end{minipage} \cr \begin{minipage}{150mm} ^{b} quim-F(ab) es un F(ab) quimérico con dominios VL y VH murinos fusionados a dominios CL y CH1 de la cadena pesada humana.\end{minipage} \cr}
Se construyeron mAB de longitud completa
fusionando los dominios VL y VH del F(ab) quimérico y la
variante F(ab)-12 a los dominios constantes
de la cadena ligera k humana y la cadena pesada de IgG1 humana. El
12-IgG1 de longitud completa
(F(ab)-12 fusionado a IgG1 humana) mostró una
unión que fue 1,7 veces más débil que la de IgG1 quimérica (Tabla
4). Tanto 12-IgG1 como la IgG1 quimérica se unieron
ligeramente menos bien que el MAb A.4.6.1 murino original (Tabla
4).
\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{ \begin{minipage}{150mm} ^{a} Las variantes de IgG anti-VEGF se incubaron con VEGF biotinilado y después se transfirieron a placas ELISA recubiertas con KDR-IgG (Park et al ., (1994), supra ).\end{minipage} \cr \begin{minipage}{150mm} ^{b} chIgG1 es una IgG1 quimérica con dominios VL y VH murinos fusionados a CL y cadenas pesadas de IgG1 humanas; el EC50 para chIgG1 fue 0,113 \pm 0,013 \mu g/ml (0,75 nM).\end{minipage} \cr \begin{minipage}{150mm} ^{c} murIgG1 es un muMabVEGF A.4.6.1 purificado de fluido ascítico.\end{minipage} \cr \begin{minipage}{150mm} ^{d} 12-IgG1 es los dominios VL y VH de F(ab)-12 fusionados a CL y cadenas pesadas de IgG1 humanas.\end{minipage} \cr}
Estudios Biológicos: rhuMAb VEGF y muMAb
VEGF A.4.6.1 se compararon para su capacidad de inhibir la
proliferación de células del endotelio capilar bovino en respuesta
a una concentración de eficacia máxima de VEGF (3 ng/ml). Como se
ilustra en la Figura 3, los dos MAb eran esencialmente equivalentes,
tanto en potencia como en eficacia. Los valores ED50 fueron
respectivamente 50 \pm 5 ng/ml y 48 \pm 8 ng/ml (\sim0,3 nM).
En ambos casos se consiguió una inhibición de 90% a la
concentración de 500 ng/ml (\sim3 nM). Ni muMAb VEGF A.4.6.1 ni
rhuMAb VEGF tuvieron ningún efecto en la proliferación basal o
estimulada por bFGF de células del endotelio capilar, confirmando
que la inhibición es específica para VEGF.
Para determinar si dicha equivalencia también se
aplica a un sistema in vivo, los dos anticuerpos se
compararon para su capacidad de suprimir el crecimiento de células
A673 de rabdomiosarcoma humano en ratones desnudos. Los estudios
previos han mostrado que muMAb VEGF A.4.6.1 tiene un efecto
inhibidor drástico en este modelo tumoral (Kim et al., Nature
362:841-844 (1993) y Borgström et al., Cancer
Res 56:4032-4039 (1996)). Como se muestra en la
Figura 4, a ambas dosis ensayadas (0,5 y 5 mg/kg), los dos
anticuerpos suprimieron de manera marcada el crecimiento del tumor
como se evalúa por las mediciones de peso del tumor 4 semanas
después de la inoculación celular. La disminución en el peso del
tumor en comparación con el grupo control fue respectivamente del
85% y el 93% a cada dosis en los animales tratados con muMAb VEGF
A.4.6.1 versus el 90% y el 95% en los tratados con rhuMAb VEGF. Se
obtuvieron resultados similares con la línea celular de carcinoma de
mama MDA-MB 435.
Antecedente
En este ejemplo, el anticuerpo A.4.6.1
anti-VEGF murino analizado anteriormente se humanizó
por aleatorización de una pequeña serie de restos flanqueantes y por
presentación monovalente de la biblioteca resultante de moléculas de
anticuerpo en la superficie de fagos filamentosos para identificar
la secuencias flanqueantes de alta afinidad mediante selección
basada en afinidad.
Construcción del Vector Fagémido
Anti-VEGF, pMB4-19: El mAb
A.4.6.1 anti-VEGF murino se ha analizado
anteriormente en el Ejemplo 1. La primera variante de F(ab)
de A.4.6.1 humanizado, hu2.0, se construyó por mutagénesis dirigida
de sitio usando un molde del plásmido pAK2 que contenía
desoxiuridina (Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.
89:4285-4289 (1992)) que codifica una cadena ligera
V_{L}\kappaI-C\kappa_{1} y un fragmento Fd
de la cadena pesada V_{H}III-C_{H}I\gamma. La
secuencias CDR A.4.6.1 trasplantadas se eligieron de acuerdo con la
definición de secuencia de Kabat et al., supra, excepto para
CDR-H1 que incluyó los restos 26-35.
La secuencia codificante de Fab subclonó en el vector fagémido
phGHamg3 (Bass et al., Proteins 8:309-314
(1990) y Lowman et al., Biochemistry
30:10832-10838 (1991)). Esta construcción,
pMB4-19, codifica el Fab de A.4.6.1 humanizado
inicial, hu2.0, con el C-terminal de la cadena
pesada fusionada de manera precisa a la porción carboxilo de la
proteína de cubierta del gen III de M13. pMB4-19 es
similar en construcción a pDH188, un plásmido descrito previamente
para la presentación monovalente de fragmentos Fab (Garrard et
al., Biotechnology 9:1373-1377 (1991)). Las
diferencias notables entre pMB4-19 y pDH188
incluyen un segmento más corto del gen III de M13 (codones
249-406) y el uso de un codón de parada ámbar
inmediatamente después del fragmento Fd de la cadena pesada del
anticuerpo. Esto permite la expresión de la cadena pesada secretada
o las fusiones cadena pesada-gen III en las cepas
supresoras supE de E. coli.
Expresión y Purificación del Fragmento Fab de
A.4.6.1 humanizado: La cepa 34B8 de E. coli, una cepa no
supresora, se transformó con el fagémido pMB4-19 o
variantes del mismo. Las colonias simples se hicieron crecer durante
una noche a 37ºC en 2 ml de 2YT que contenía 50 \mug/ml de
carbenicilina. Estos cultivos se diluyeron en 200 ml de medio AP5
(Chang et al. Gene 55:189-196 (1987)) que
contenía 20 \mug/ml de carbenicilina y se incubaron durante 26
horas a 30ºC. Las células se sedimentaron a 4000 x g y se congelaron
a -20ºC durante al menos 2 horas. Después se resuspendieron los
sedimentos celulares en 5 ml de Tris-HCl 10 mM (pH
7,6) que contenía EDTA 1 mM, se agitaron a 4ºC durante 90 minutos y
se centrifugaron a 10.000 x g durante 15 minutos. El sobrenadante se
aplicó a una columna proteína G de
estreptococos-Sepharose de 1 ml (Pharmacia) y se
lavó con 10 ml de MES 10 mM (pH 5,5). El fragmento Fab unido se
eluyó con 2,5 ml de ácido acético 100 mM y se neutralizó
inmediatamente con 0,75 ml de Tris-HCl 1 M, pH 8,0.
Se intercambió el tampón de las preparaciones de Fab por PBS y se
concentraron usando concentradores Centricon-30
(Amicon). Los rendimientos típicos de Fab fueron \sim1 mg/l de
cultivo, después de la purificación de proteína G. Las muestras de
Fab purificadas se caracterizaron por espectrometría de masa por
electronebulización, y las concentraciones se determinaron por
análisis de aminoácidos.
Construcción de la Biblioteca de Fagémidos Fab
Anti-VEGF: La biblioteca de fagémidos A.4.6.1
humanizados se construyó por mutagénesis dirigida de sitio de
acuerdo con el método de Kunkel et al., Methods Enzymol.
204:125-139 (1991). Se preparó un derivado de
pMB4-19 que contenía tripletes de parada TAA en los
codones de V_{H} 24, 37, 67 y 93 para usar como el molde de
mutagénesis (toda la numeración de secuencia de acuerdo con Kabat
et al., supra). La modificación fue para evitar la
contaminación de fondo posterior por secuencias de tipo silvestre.
Los codones fijados como objetivo para aleatorización fueron 4 y 71
(cadena ligera) y 24, 37, 67, 69, 71, 73, 75, 76, 78, 93 y 94
(cadena pesada).
Para aleatorizar los codones de la cadena pesada
67, 69, 71, 73, 75, 76, 78, 93, y 94 con un oligonucleótido
mutagénico único, primero se pre-ensamblaron dos
oligonucleótidos 126-mérico a partir de fragmentos
60 y 66-méricos por ligamiento enzimático asistido
por molde. Específicamente, se combinaron 1,5 nmol del
oligonucleótido 5'fosforilado 503-1
(5'-GAT TTC AAA CGT CGT NYT ACT WTT
TCT AGA GAC AAC TCC AAA AAC ACA BYT TAC CTG CAG ATG
AAC-3' (SEC.ID.Nº 22)) o 503-2
(5'-GAT TTC AAA CGT CGT NYT ACT WTT
TCT TTA GAC ACC TCC GCA AGC ACA
BYT TAC CTG CAG ATG AAC-3' (SEC.ID.Nº 23))
con 1,5 nmol de 503-3 (5'-AGC CTG
CGC GCT GAG GAC ACT GCC GTC TAT TAC TGT DYA ARG TAC
CCC CAC TAT TAT GGG-3' (SEC.ID.Nº 24)) (codones
aleatorizados subrayados; N=A/G/T/C; W=A/T; B=G/T/C; D=G/A/T; R=A/G;
Y=C/T). Después, se añadieron 1,5 nmol del oligonucleótido molde
(5'-CTC AGC GCG CAG GCT GTT CAT CTG CAG
GTA-3' (SEC.ID.Nº 25)), con la secuencia
complementaria al extremo 5' de 503-1/2 y el extremo
3' de 503-3, para hibridar a cada extremo de la
unión de ligamiento. Se añadió Taq ligasa (ligasa
termoestable de New England Biolabs) y tampón, y la mezcla de
reacción se sometió a 40 rondas de ciclación térmica, (95ºC durante
1,25 minutos; 50ºC durante 5 minutos) para ciclar el oligonucleótido
molde entre las uniones ligadas y no ligadas. El producto de los
oligonucleótidos 126-méricos se purificó en un gel
de urea al 6%/TBE poliacrilamida y se extrajo de la poliacrilamida
en tampón. Los dos productos 126-méricos se
combinaron en una proporción igual, se precipitaron en etanol y
finalmente se solubilizaron en Tris-HCl 10 mM, EDTA
1mM. El producto de los oligonucleótidos
126-méricos fue 504-01 marcado.
La aleatorización de los codones flanqueantes
seleccionados (V_{L}, 4, 71, V_{H}, 24, 37, 67, 69, 71, 73, 75,
76, 93, 94) se logró en dos etapas. Primero, se consiguió la
aleatorización de V_{L} preparando tres derivados adicionales del
molde pMB4-19 modificado. Los codones flanqueantes 4
y 71 de la cadena ligera se reemplazaron individualmente o por
pares usando los dos oligonucleótidos mutagénicos
5'-GCT GAT ATC CAG TTG ACC CAG TCC
CCG-3' (SEC.ID.Nº 26) y 5'-TCT GGG
ACG GAT TAC ACT CTG ACC ATC-3' SEC.ID.Nº
27).El molde que contiene desoxiuridina se preparó a partir de cada
uno de estos nuevos derivados. Junto con el molde original, estas
cuatro construcciones codificaban cada una de las cuatro posibles
combinaciones de secuencias flanqueantes de la cadena ligera (Tabla
5).
Se usaron los oligonucleótidos
504-1, una mezcla de dos oligonucleótidos
126-méricos (véase lo anterior), y
5'-CGT TTG TCC TGT GCA RYT TCT GGC TAT ACC
TTC ACC AAC TAT GGT ATG AAC TGG RTC CGT CAG GCC CCG GGT
AAG-3' (SEC.ID.Nº 28) para aleatorizar los codones
flanqueantes de la cadena pesada usando cada uno de los moldes
recién descritos. Las cuatro bibliotecas se electroporaron en
células XL-1 Blue de E. coli (Stratagene) y
se combinaron. La cantidad total de transformantes independientes se
estimó a >1,2 x 10^{8}, aproximadamente 1500 veces mayor que
la cantidad máxima de secuencias de ADN en la biblioteca.
Se ha desarrollado una diversidad de sistemas
para presentar de manera funcional los fragmentos de anticuerpo en
la superficie de fagos filamentosos. Winter et al., Ann. Rev.
Immunol. 12, 433 (1994). Estos incluyen presentar los
fragmentos Fab o Fv de cadena simple (scFv) como fusiones a las
proteínas de cubierta del gen III o el gen VIII del bacteriófago
M13. El sistema seleccionado en este documento es similar al
descrito por Garrard et al., Biotechn, 9, 1373 (1991) en el
que un fragmento Fab se presenta de manera monovalente como una
fusión del gen III (Figura 7). Este sistema tiene dos
características notables. En particular, a diferencia de scFv, los
fragmentos Fab no tienen tendencia a formar especies diméricas, la
presencia de las cuales puede evitar la selección de los
aglutinantes más fuertes debido a los efectos de avidez.
Adicionalmente, la monovalencia de la proteína presentada elimina
una fuente secundaria potencial de efectos de avidez que podrían
ser, de otro modo, el resultado de la presencia de múltiples copias
de una proteína en cada partícula fagémida. Bass y Wells,
Proteins 8:309 (1990) y Lowman et al., Biochemistry
30:10832 (1991).
Las partículas fagémidas que presentan los
fragmentos Fab de A.4.6.1 humanizado se propagaron en células
XL-1 Blue de E. coli. Brevemente, las células
que contenían la construcción pMB4-19 aleatorizada
se hicieron crecer durante una noche a 37ºC en 25 ml de medio 2YT
que contenía 50 \mug/ml de carbenicilina y aproximadamente
10^{10} fagos auxiliares M13KO7 (Vieira & Messing Methods
Enzymol. 153:3-11 (1987)). Las soluciones madre
de fagémidos se purificaron de los sobrenadantes del cultivo por
precipitación con una solución de polietilenglicol salina, y se
resuspendieron en 100 \mul de PBS (\sim10^{14}
fagémidos/ml).
Selección de Variantes de Fab de A.4.6.1
Humanizado: El VEGF_{121} purificado (100 \mul a 10
\mug/ml en PBS) se recubrió en un pocillo de placa de
microtitulación durante una noche a 4ºC. La solución de
recubrimiento se desechó y este pocillo, además de un pocillo no
recubierto, se bloquearon con leche desnatada al 6% durante 1 hora y
se lavaron con PBS que contenía TWEEN 20™ al 0,05% (detergente).
Después, se añadieron 10 \mul de solución madre de fagémido,
diluida a 100 \mul con Tris 20 mM (pH 7,5) que contenía BSA al
0,1% y TWEEN 20™ al 0,05% a cada pocillo. Después de 2 horas se
lavaron los pocillos y el fago unido se eluyó con 100 \mul de
glicina 0,1 M (pH 2,0), y se neutralizó con 25 \mul de Tris 1 M
pH 8,0. Se usó una alícuota de esto para titular la cantidad de
fago eluido. El fago restante eluido del pocillo recubierto con
VEGF se propagó para usar en el siguiente ciclo de selección. Se
realizaron un total de 8 rondas de selección después de lo que se
seleccionaron 20 clones individuales y se secuenciaron (Sanger
et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.
74:5463-5467(1977)).
Determinación de Afinidades de Unión a
VEGF: Las constantes de velocidad de asociación (k_{on}) y de
disociación (k_{off}) para la unión de variantes de Fab de
A.4.6.1 humanizado a VEGF_{121} se midieron por resonancia de
plasmón superficial (Karlsson et al., J. Immun. Methods
145:229-240 (1991)) en un instrumento Pharmacia
BIAcore. El VEGF_{121} se inmovilizó de manera covalente en el
chip biosensor mediante grupos amino primario. La unión de las
variantes de Fab de A.4.6.1 humanizado se midieron por soluciones
fluyentes de Fab en PBS/TWEEN 20™ al 0,05% sobre el chip a una
velocidad de flujo de 20 \mul/min. Después de cada medida de
unión, se extrajo el Fab residual del ligando inmovilizado lavando
con 5 \mul de HCl acuoso 50 mM a 3 \mul/min. Los perfiles de
unión se analizaron por regresión no lineal usando un modelo de
unión monovalente simple (programa BIAevaluation v2.0;
Pharmacia).
Pharmacia).
Construcción de A.4.6.1 Humanizado: Se
construyó un fragmento Fab de A.4.6.1 humanizado (hu2.0, Figuras 5A
y 5B), en el que los CDR de A.4.6.1 se injertan en una región
flanqueante V_{L}\kappaI-V_{H}III humana.
Todos los otros residuos en hu2.0 se mantuvieron como la secuencia
humana. La unión de esta variante a VEGF fue tan débil como para
ser indetectable. En base a la afinidad relativa de otras variantes
de A.4.6.1 humanizado de unión débil, el K_{D} para la unión de
hu2.0 se estimó a >7 \muM. Esto contrasta con una afinidad de
1,6 nM para una construcción Fab quimérica que consta de los
dominios V_{L} y V_{H} intactos a partir de A.4.6.1 murino y los
dominios constantes humanos. Por tanto la unión de hu2.0 a VEGF fue
al menos 4000 veces reducida en relación con la quimera.
Diseño de Biblioteca de Anticuerpos: El
grupo de cambios de la región flanqueante en la secuencia
flanqueante humana en este documento se muestra en la Tabla 5 y en
la Figura 6.
\vskip1.000000\baselineskip
\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{ ^{a} Diversidad de aminoácido en biblioteca de fagémidos.\cr \begin{minipage}{150mm} ^{b} Se aleatorizaron V _{H} 71, 73, 75, 76 para producir la tétrada V _{H} III murina completa (L71/T73/A75/S76) o humana completa (R71/D73/K75/N76).\end{minipage} \cr}
Una preocupación en el diseño de la biblioteca de
fagémidos de A.4.6.1 humanizado fue que los restos fijados como
objetivo para aleatrorización estaban distribuidos ampliamente a lo
largo de las secuencias V_{L}y V_{H}. Las limitaciones en la
longitud de los oligonucleótidos sintéticos requiere que la
aleatorización simultánea de cada una de estas posiciones
flanqueantes pueda sólo conseguirse a través del uso de
oligonucleótidos múltiples. Sin embargo, como la cantidad total de
oligonucleótidos aumenta, la eficacia de la mutagénesis disminuye
(es decir, la proporción de mutantes obtenidos que incorporan la
secuencia obtenida de todos los oligonucleótidos mutagénicos). Para
evitar este problema, se incorporaron dos elementos en la
construcción de la biblioteca. El primero fue preparar cuatro moldes
de mutagénesis diferentes que codifican cada una de las posibles
combinaciones flanqueantes de V_{L}. Esto fue simple de hacer dada
la limitada diversidad de la región flanqueante de la cadena ligera
(solo 4 secuencias diferentes), pero fue beneficioso en que se
eliminó la necesidad de dos oligonucleótidos de la estrategia de
mutagénesis. El segundo, fue que se pre-ensamblaron
dos oligonucleótidos de 126 bases a partir de fragmentos sintéticos
más pequeños. Esto hizo posible la aleatorización de los codones 67,
69, 71, 73, 75, 76, 93 y 94 de V_{H} con un único oligonucleótido
largo, en lugar de los dos más pequeños. Por lo tanto, la
estrategia de mutagénesis por aleatorización final empleó sólo dos
oligonucleótidos de manera simultánea en cuatro moldes
diferentes.
Selección de Fab de A.4.6.1 Humanizado de
Unión Fuerte: Las variantes de la biblioteca de fagémidos Fab de
A.4.6.1 humanizado se seleccionó en base a la unión a VEGF. El
enriquecimiento del fagémido funcional medido por comparación de los
títulos del fago eluido de un pocillo de la placa de microtitulación
recubierta con VEGF versus eluido de un pocillo de la placa de
microtitulación no recubierta, aumentó hasta la séptima ronda de
encuadramiento de la afinidad. Después de una ronda adicional de
clasificación, se secuenciaron 20 clones para identificar los restos
flanqueantes preferidos seleccionados en cada posición aleatorizada.
Estos resultados, resumidos en la Tabla 6, muestran un fuerte
consenso entre todos los clones seleccionados. Diez de los veinte
clones tenían la secuencia de ADN idéntica, denominada hu2.10. De
las trece posiciones flanqueantes aleatorizadas, se seleccionaron
ocho sustituciones en hu2.10 (V_{L}, 71; V_{H}, 37, 71, 73, 75,
76, 78 y 94). Es interesante observar que los restos V_{H} 37
(Ile) y 78 (Val) no se seleccionaron ni en la secuencia V_{H}III
humana ni en la secuencia A.4.6.1 murina. Este resultado sugiere
que algunas posiciones flanqueantes pueden beneficiarse del aumento
de la diversidad más allá de las secuencias flanqueantes humana y
murina parental diana.
Las diferencias entre los anticuerpos hu2.0 y
A.4.6.1 murino están subrayadas. La cantidad de clones idénticos que
identifica cada secuencia seleccionada por fago se indica en
paréntesis. Las rayas en las secuencias de los clones seleccionados
por fago indican la selección de la secuencia flanqueante
V_{L}\kappaI-V_{H}III humana (es decir, como
en hu2.0).
Hubo cuatro secuencias de amino ácidos únicas
distintas entre los diez clones restantes analizados: hu2.1, hu2.2,
hu2.6 y hu2.7. Todos estos clones, además de hu2.10, contenían
sustituciones en la región flanqueante idénticas en las posiciones
37 (Ile), 78 (Val) y 94 (Lys) de V_{H}, pero mantuvieron la
secuencia consenso V_{H}III humana en las posiciones 24 y 93.
Cuatro clones habían perdido la secuencia codificante de la cadena
ligera y no se unían a VEGF cuando se ensayaron en un ensayo ELISA
con fagos (Cunningham et al. EMBO J.
13:2508-251 (1994)). Dichos artefactos a menudo
pueden minimizarse reduciendo la cantidad de ciclos de clasificación
o propagando las bibliotecas en medios sólidos.
Expresión y Afinidad de Unión de Variantes de
A.4.6.1 Humanizado: Las variantes seleccionadas por fago hu2.1,
hu2.2, hu2.6, hu2.7 y hu2.10 se expresaron en E. coli usando
matraces de agitación y los fragmentos Fab se purificaron de los
extractos periplásmicos por cromatografía de afinidad a proteína G.
Los rendimientos recuperados de Fab para estos cinco clones variaron
de 0,2 (hu2.6) a 1,7 mg/l (hu2.1). La afinidad de cada una de estas
variantes por el antígeno (VEGF) se midió por resonancia de plasmón
superficial en un instrumento BIAcore (Tabla 7). El análisis de
estos datos de unión muestra que el clon consenso hu2.10 poseía la
afinidad más alta por VEGF entre las cinco variantes ensayadas. Por
tanto, la biblioteca de fagémidos Fab se enriqueció selectivamente
para el clon de unión más fuerte. El K_{D} calculado para hu2.10
fue 55 nM, al menos 125 veces más fuerte que para hu2.0 que no
contiene cambios en la región flanqueante (K_{D}>7 \muM). Las
otras cuatro variantes seleccionadas mostraron todas una unión mas
débil a VEGF, variando por debajo de un K_{D} de 360 nM para la
más débil (hu2.7). Es interesante observar que el K_{D} para
hu2.6, 67 nM, fue sólo ligeramente inferior que el de hu2.10 y
además solo se encontró una copia de este clon entre los 20 clones
secuenciados. Esto puede deberse al bajo nivel de expresión y
presentación, como fue el caso cuando se expresó el Fab soluble de
esta variante. Sin embargo, a pesar de la proporción de expresión
más baja, esta variante es útil como anticuerpo humanizado.
* hu2.10V = hu2.10 con la mutación V_{L} Leu\rightarrow Val |
Los valores estimados en las mediciones de unión de Biacore son+/- 25%. |
** Demasiado débil para medir; estimación de enlace inferior. |
Mejora Adicional de la Variante hu2.1
Humanizada: A pesar de la gran mejora en la afinidad de antígeno
sobre la variante humanizada inicial, la unión de hu2.10 a VEGF aún
era 35 veces más débil que un fragmento Fab quimérico que contenía
los dominios V_{L}y V_{H} de A.4.6.1 murino. Esta diferencia
considerable sugería que la optimización adicional de la región
flanqueante humanizada podría ser posible a través de mutaciones
adicionales. De los restos Vernier identificados por Foote &
Winter J. Mol. Biol. 224:487-499 (1992),
sólo los restos V_{L} 46, V_{H}2 y V_{H} 48 difieren en la
región flanqueante de A.4.6.11 versus la región flanqueante
V_{L}\gammaI-V_{H}III humana (Figuras 5A y
5B) pero no se aleatorizaron en la biblioteca de fagémidos. Un
modelo molecular del fragmento Fv de A.4.6.1 humanizado mostró que
V_{L}46 se sitúa en la superficie de contacto
V_{L}-V_{H} y podría influenciar la conformación
de CDR-H3. Además, este aminoácido es casi siempre
leucina en la mayoría de las regiones flanqueantes V_{L}\kappa
(Kabat et al., supra), pero es valina en A.4.6.1. Por
consiguiente, se hizo una sustitución Leu\rightarrowVal en esta
posición en el antecedente de hu2.10. El análisis de cinética de
unión para esta nueva variante, hu2.10V, indicó una mejora adicional
de 6 veces en el K_{D} para la unión a VEGF, demostrando la
importancia de la valina en la posición V_{L} 46 en el anticuerpo
A.4.6.1. El K_{D} para hu2.10V (9,3 nM) fue por tanto 6 veces el
de la quimera. En contraste con V_{L} 46, no se observó mejora en
la afinidad de unión de hu2.10 para el reemplazamiento de V_{H}2
o V_{H} 48 con el resto correspondiente de A.4.6.1 murino.
En este ejemplo, se usó aleatorización de CDR,
maduración de afinidad por presentación monovalente en fagos Fab, y
combinación acumulativa de mutaciones para potenciar la afinidad de
un anticuerpo anti-VEGF humanizado.
Construcción del Anticuerpo pY0101
Humanizado: El vector de anticuerpo presentado por fago
phMB4-19-1.6 (véanse figuras
8A-E) se usó como parental. En esta construcción, la
función anti-VEGF se expresa como un fragmento Fab
con su cadena pesada fusionada al N-terminal del g3p
truncado. Tanto la cadena pesada como la ligera están bajo el
control del promotor phoA con una secuencia señal stII cadena arriba
para la secreción en el periplasma. Se hicieron mutaciones puntuales
fuera de las regiones CDR por mutagénesis dirigida de sitio para
mejorar la afinidad por VEGF con oligonucleótidos
HL-242, HL-243,
HL-245, HL-246,
HL-254, HL-256, y
HL-257 como se muestra en la Tabla 8 a
continuación:
\vskip1.000000\baselineskip
La variante resultante se llamó Y0101 (figuras 9A
y 9B).
Construcción de la Primera Generación de
Bibliotecas Anticuerpo-Fago: Para evitar la
contaminación por secuencia de tipo silvestre, se prepararon moldes
con el codón de parada TAA en los sitios fijados como objetivo para
aleatorización y se usaron para construir bibliotecas por
mutagénesis dirigida de sitio con oligonucleótidos que usan el
codón NNS degenerado (donde N es una mezcla igual de A, G, C, y T
mientras que S es una mezcla igual de G y C) para mutagénesis por
saturación. Se eligieron VL1 y VH1 como candidatos potenciales para
el potenciamiento de afinidad (Figuras 9A y 9B). En los CDR, se
construyeron dos bibliotecas a partir del molde pY0101. VL1 se mutó
usando los oligonucleótidos de parada del molde
HL-248 y HL-249 (Tabla 9) y los
oligonucleótidos de biblioteca HL-258 y
HL-259 (Tabla 10). De manera similar, se
construyeron tres bibliotecas para VH3 usando los oligonucleótidos
del molde de parada HL-250, HL-251,
y HL-252 (Tabla 9), y los oligonucleótidos de
biblioteca HL-260, HL-261, y
HL-262 (Tabla 10). La construcción de bibliotecas se
resume en las Tablas 9 y 10 a continuación.
Los productos de las reacciones de mutagénesis
aleatoria se electroporaron en células XL1-Blue de
E. coli (Stratagene) y se amplificaron haciéndolas crecer
15-16 horas con el fago auxiliar M13KO7. La
complejidad de cada biblioteca, que varía de 2 x 10^{7} a 1,5 x
10^{8}, se estimó en base a la siembra de la transformación
inicial en placas de carbenicilina.
Selecciones de Afinidad Inicial: Para cada
ronda de selección, se exploraron aproximadamente
10^{9}-10^{10} fagos para la unión a placas
(Nunc Maxisorp 96 pocillos) recubiertas con 2 \mug/ml de VEGF
(recombinante; versión de los restos 9-109) en
tampón carbonato 50 mM, pH 9,6, y se bloquearon con leche en polvo
al 5% en tampón carbonato 50 mM, pH 9,6. Después de una unión de
1-2 horas a temperatura ambiente, en presencia de
albúmina de suero bovino al 0,5% y TWEEN 20™ al 0,05% en PBS, se
retiró la solución de fagos, y la placa se lavó diez veces con
PBS/TWEEN™ (TWEEN 20™ al 0,05% en tampón PBS). Típicamente, para
seleccionar las variantes de afinidad potenciada con velocidades de
disociación lentas, se incubaron las placas con tampón PBS/TWEEN™
durante un periodo de tiempo que se alargó progresivamente para cada
ronda de selección (de 0 minutos para la primera ronda, a 3 horas
para la novena ronda de selección). Después de retirar el tampón
PBS/TWEEN™, los fagos restantes se eludieron con HCl 0,1 M y se
neutralizaron inmediatamente con 1/3 volúmenes de Tris 1 M, pH 8,0.
Los fagos eluidos se propagaron infectando células
XL1-Blue de E. coli (Stratagene) para el
siguiente ciclo de selección.
Los datos de secuenciación mostraron que ambas
bibliotecas VL1, incluso después de la octava/novena ronda de
clasificación, permaneció variada, tolerando varios tipos de restos
en los sitios de aleatorización. En contraste, las bibliotecas VH3
mantuvieron solo los restos de tipo silvestre o tuvieron
sustituciones muy conservativas. Esto sugirió que el VL1 estaba más
expuesto al disolvente y caía fuera de la superficie de contacto de
unión. En contraste, VH3 no mostró sustituciones de cadenas
laterales drásticamente diferentes y, por tanto, podría estar mas
íntimamente implicada en la unión a antígeno.
Ensayo de ELISA de Fagos de Afinidades de
Unión: Para cada una de estas bibliotecas, se ensayaron clones
representativos (los representados por secuencias abundantes) para
sus afinidades en relación con el clon parental pY0101 en un ensayo
ELISA de fagos. En dicho ensayo, los fagos primero se diluyen en
serie para determinar un título de saturación fraccional que después
se mantuvo constante y se usó para incubar con concentraciones
variadas de VEGF (comenzando a 200 nM a 0 nM) en solución. Después
la mezcla se transfirió en una placa pre-recubierta
con VEGF (2 \mug/ml) y se bloqueó con leche en polvo al 5%, y se
dejó equilibrarse durante 1 hora a temperatura ambiente.
Posteriormente, la solución de fagos se retiró y los fagos unidos
restantes se detectaron con una solución de anticuerpo de conejo
anti-fago mezclada con un conjugado de cabra
anti-conejo de peroxidasa de rábano rusticano.
Después de una hora de incubación a temperatura ambiente, la placa
se reveló con un sustrato cromogénico, o-fenilendiamina
(Sigma). La reacción se paró con adición de ½ volumen de
H_{2}SO_{4} 2,5 M. Se midió la densidad óptica a 492 nm en un
lector de placa espectrofotométrico.
Aunque todos los clones seleccionados de estas
cinco bibliotecas mostraron afinidades similares o más débiles que
las del tipo silvestre pY0101 en el ensayo ELISA de fagos, una
variante particular (pY0192) de la biblioteca
HL-258 mostró una ventaja aparente (aproximadamente
10 veces) en el nivel de expresión o presentación del fago en
relación con pY0101. Este clon contenía mutaciones S24R, S26N, Q27E,
D28Q, e I29L en la región VL (Figura 9A). Además, se descubrió que
esta variante tenía una mutación falsa, M34I, en VH. Esta variante
no mostró diferencias significativas en la afinidad de unión a VEGF
en comparación con la variante pY0101. Para mejorar el nivel de
presentación de Fab en el fago, y la proporción
señal-ruido para los ensayos ELISA de fagos, se
incorporaron las sustituciones correspondientes en pY0192 en VL1 en
el molde antecedente para construir tanto CDR
Ala-mutantes como la segunda generación de
bibliotecas anti-VEGF.
Exploración de Ala de los CDR de
Anti-VEGF: Para determinar la energética con la
que contribuye cada uno de los aminoácidos en las regiones CDR y por
tanto seleccionar mejor los restos diana para aleatorización, las
regiones CDR se exploraron sustituyendo alanina para cada resto.
Cada mutante de Ala se construyó usando mutagénesis dirigida de
sitio con un oligonucleótido sintético que codifica la sustitución
de alanina especifica. Cuando Ala era el resto de tipo silvestre,
se sustituyó Ser para ensayar el efecto de una sustitución de
cadena lateral. Los clones fágicos que tenían una mutación Ala
única se purificaron y se ensayaron en ELISA de fagos como se ha
descrito anteriormente. Los resultados de la exploración de Ala
demostraron que una sustitución de Ala en diversas posiciones puede
tener un efecto, que varía de reducciones de 2 a >150 veces, en
la afinidad de unión al antígeno en comparación con pY0192. Además,
se confirmó una observación previa de que VH3, pero no VL1, está
implicada en la unión de antígeno. Los resultados de la exploración
de Ala de CDR se resumen en la Tabla 11 a continuación.
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\vskip1.000000\baselineskip
(Tabla pasa a página
siguiente)
Todas las variantes están en el antecedente de
pY0192 ("wt"; véanse Figuras 9A-B). IC50 se
determinaron en un ensayo ELISA de fagos competitivo.
Los mayores efectos de las sustituciones de Ala
se ven en los CDR H1, H2, y H3, incluyendo Y27A (reducción de la
afinidad de 34 veces), N31A, Y32A, W50A, N52A, Y99A, S106A y W108A
(cada uno reducción de >150 veces); N35A (reducción de 62 veces),
P100A (reducción de 38 veces) y F110A (reducción de 25 veces). En
contraste, sólo una solución en VL tubo un impacto grande en la
afinidad de unión, W96A (reducción de >150 veces). Estos
resultados señalan a los tres CDR de VH como los determinantes
energéticos principales de la unión de Fab a VEGF, con alguna
contribución de VL3.
Diseño de las Bibliotecas de Mutación de CDR
de Segunda Generación: Se diseñaron dos bibliotecas adicionales
que se aleatorizaron en los restos existentes en la versión Y0192
anti-VEGF, en base a la inspección de la estructura
cristalina. En VH2, se aleatorizaron los restos
52-55 porque caen en la superficie de contacto de
unión con VEGF. También se fijó como objetivo para aleatorización
una región adicional del Fab, llamada "CDR7" (véase Figura
10B), porque varios restos en este bucle, que no contactan con VEGF,
tienen contactos con los bucles VH del anticuerpo. Estos representan
sitios potenciales para la mejora de afinidad a través de efectos
secundarios en los restos de la superficie de contacto. Se
aleatorizaron los restos L72, T74, y S77 en esta biblioteca
CDR7.
También en base a la estructura cristalina, se
reconstruyó una de las bibliotecas CDR originales para
re-ensayar el potencial para la maduración de
afinidad en el CDR de VH1. Se aleatorizaron los restos 27, 28, y
30-32 usando el nuevo antecedente de Y0192.
Selecciones de Segunda Generación de
Bibliotecas Anti-VEGF: en base a los resultados
de exploración de Ala así como a la estructura cristalina del
complejo antígeno-anticuerpo
(F(ab)-12), se construyeron un total de
diecisiete bibliotecas usando el molde pY0192 y los oligonucleótidos
de parada del molde (que codifican un codón de parada en los sitios
fijados como objetivo para aleatorización) YC-80,
YC-100, YC-102,
HL-263, y HL-264 (Tabla 9 anterior).
Los oligonucleótidos de aleatorización correspondientes (que emplean
NNS en los sitios fijados como objetivo para aleatorización) fueron
YC81, YC-101, YC-103,
HL-265, y HL-266 (Tabla 10
anterior). Los transformantes resultantes produjeron bibliotecas con
complejidades que varían de 6 x 10^{7} a 5 x 10 que sugiere que
las bibliotecas son completas en cubrir todas las posibles
variantes. Las bibliotecas de fagos se clasifican para
7-8 rondas usando condiciones descritas en la Tabla
12 a continuación.
El tampón ELISA contenía albúmina de suero bovino
al 0,5% y TWEEN 20™ al 0,05% en PBS. Se incluyó VEGF en el tampón
de incubación para minimizar la re-unión de los
fagos a VEGF recubierto en la superficie de la placa. La
clasificación de estas bibliotecas produjo enriquecimientos de fago
durante 7 a 8 rondas de selección.
Ensayos ELISA de Fagos en Clones de Segunda
Generación: Después de ocho rondas de selección, se aislaron de
diez a veinte clones de cada biblioteca de placas que contenían
carbenicilina que albergaban colonias de E. coli. (XL1) que
se habían infectado con una combinación de fagos eluidos. Las
colonias se asilaron y se hicieron crecer con fago auxiliar para
obtener ADN de cadena simple para secuenciarla. Las sustituciones
en CDR seleccionadas para la unión más favorable a VEGF se
dedujeron de la secuencias de AND de los clones fagémidos. Se
muestra un muestreo de los clones seleccionados en la Tabla 13 a
continuación.
La secuencia de la región aleatorizada solo se
muestra deducida de la secuenciación de ADN.
Cuando se ensayaron varios clones junto con el
clon parental pY10192 en ensayo ELISA de fagos, ninguno mostró una
mejora distintiva sobre el clon parental. Esto podría explicarse por
el tiempo en escala en el que el ensayo se realizó (<3
horas).
Para cuantificar la mejora en la unión a antígeno
sobre el clon parental, se trasformaron varios ADN de las variantes
anti-VEGF en la cepa 34B8 de E. coli,
expresadas como Fab, y se purificaron pasando la descarga
periplásmica a través de una columna de proteína G (Pharmacia) como
se ha descrito en el Ejemplo 2 anterior.
Variantes de Combinación de CDR: Para
mejorar más la afinidad de unión a VEGF, se combinaron mutaciones
encontradas en la presentación de fago en diferentes CDR para crear
mutantes CDR múltiples. En particular, se combinaron las mutaciones
identificadas en las variantes de fago de las bibliotecas VH1, VH2,
y VH3 de afinidad más mejorada (Tabla 14) para ensayar la avidez de
sus contribuciones a la afinidad de unión.
Las mutaciones de los vectores parentales
indicados se combinaron con las de los oligonucleótidos indicados
por mutagénesis dirigida de sitio para producir las variantes de
combinación enumeradas.
La versión Y0317 es equivalente a
Y0313-1 excepto en que la mutación de fondo en VL1
se retiró y su secuencia revertió a la de Y0101. Los efectos de
mutar H101Y y S105T se ensayaron construyendo un mutante de
reversión a partir de Y0238-3.
Análisis BIAcore: Las afinidades de unión
a VEGF de los fragmentos Fab se calcularon a partir de las
constantes de velocidad de asociación y disociación medidas usando
un sistema de resonancia de plasmón superficial
BIAcore-2000™ (BIAcore, Inc., Piscataway, NJ). Se
activó un chip biosensor para el acoplamiento covalente de VEGF
usando clorhidrato de
N-etil-N'-(3-dimetilaminopropil)-carbodiimida
(EDC) y N-hidroxisuccinimida (NHS) de acuerdo con
las instrucciones del proveedor (BIAcore, Inc., Piscataway, NJ). Se
intercambió el tampón de VEGF por acetato sódico 20 mM, pH 4,8, y se
diluyó aproximadamente a 50 \mug/ml. Se inyectó una alícuota (35
\mul) a una velocidad de flujo de 2 \mul/min para conseguir
aproximadamente 700-1400 unidades de respuesta (RU)
de proteína acoplada. Finalmente, se inyectó etanolamina 1 M como
agente de bloqueo.
Para las medidas de cinética, se inyectaron
diluciones seriadas de dos veces de Fab en tampón PBS/TWEEN™ (TWEEN
20™ al 0,05% en solución salina tamponada con fosfato) y 25ºC a una
velocidad de flujo de 10 \mul/min. Las velocidades de asociación y
disociación se calcularon usando protocolos convencionales (Karlsson
et al. J. Immun. Methods 145:229-240 (1991)).
Se calcularon las constantes de equilibrio de disociación, Kd, a
partir de las medidas de resonancia de plasmón superficial (SPR)
como koff/kon. Los datos se muestran en la Tabla 15 a
continuación.
\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{ \begin{minipage}{150mm} * La velocidad de disociación observada probablemente refleja un límite superior para la velocidad de disociación real en estos experimentos, aunque la velocidad de disociación se aproxima al límite de detección por BIAcore.\end{minipage} \cr}
Los datos BIAcore™ de la Tabla 15 muestran que en
varias variantes tienen una afinidad mejorara sobre Y0192. Por
ejemplo, una variante de CDRH1, Y0243-1, mostró una
afinidad potenciada 4,1 veces, que surge de las mutaciones T28D y
N31H. La variante Y0238-3 mostró al menos una mejora
de 14 veces en la afinidad de unión sobre Y0192. Ambas mutaciones de
CDRH3 contribuyen a la afinidad mejorada de Y0238-3
porque la reversión de T105 a S (variante Y0313-3)
reduce la afinidad de Y0238-3 de 0,15 nM a 0,65 nM
(véase Tabla 15). La potenciación de afinidad mayor en relación con
Y0192 se vio para Y0313-1, que contenía mutaciones
en CDRH3 combinadas con mutaciones en CDRH1.
Ensayo Basado en Células de Inhibición de
VEGF: Se ensayaron varias versiones del anticuerpo A.4.6.1
anti-VEGF para su capacidad de antagonizar VEGF
(recombinante; versión 1-165) en la inducción del
crecimiento de HuVEC (células endoteliales de la vena umbilical
humana). Se sembraron placas de 96 pocillos con 1000 HuVEC por
pocillo y se dejaron en medio de ensayo (F12:DMEM 50:50 suplementado
con suero bovino fetal diafiltrado al 1,5%) durante 24 horas. La
concentración de VEGF usada para inducir las células se determinó
titulando primero la cantidad de VEGF que puede estimular el 80% de
la síntesis máxima de ADN. Después se añadió medio de ensayo nuevo
que contenía cantidades fijadas de VEGF (concentración final 0,2
nM), y concentraciones en aumento de Fab o Mab
anti-VEGF. Después de 40 horas de incubación, se
midió la síntesis de ADN por incorporación de timidina tritiada.
Las células se pulsaron con 0,5 \muCi por pocillo de
[3H]-timidina durante 24 horas y se recogieron para
contarlas, usando un contador gamma TopCount.
Los resultados (Figura 11) muestran que la forma
de IgG de longitud completa de F(ab)-12 era
significativamente más potente en la actividad de inhibición de VEGF
que la forma Fab (aquí, se usó Y0192). Sin embargo, ambas variantes
Y0238-3 e Y0313-1 mostraron una
actividad de inhibición de VEGF incluso más potente que la de Fab de
Y0192 o Mab de F(ab)-12. Comparando las
formas Fab, la variante Y0313-1 pareció >30 más
potente que el Fab de tipo silvestre. Debe observarse que la
cantidad de VEGF (0,2 nM) usada en este ensayo es potencialmente
limitante para la determinación de un IC50 exacto para el mutante.
Por ejemplo, si la afinidad de unión (Kd) del mutante es de hecho
<0,2 nM, el IC50 en este experimento será mayor que en
condiciones de concentración inferior de VEGF. Por tanto el
resultado mantiene la conclusión de que la variante de afinidad
mejorada tiene al menos una mejora de 30 veces en la afinidad para
VEGF, y que efectivamente bloquea la activad de VEGF in
vitro. Como la variante Y0317 difiere de
Y0313-1 sólo en la reversión de la secuencia VL1 al
tipo silvestre (Figura 10A), se predice que Y0317 tendrá una
actividad similar a Y0313-1.
Se compararon la variante Y0317 (Fab) y la
variante F(ab)-12 humanizada del Ejemplo 1
(longitud completa y Fab) para su capacidad de inhibir la
proliferación de células del endotelio capilar en respuesta a una
concentración de eficacia casi máxima de VEGF usando el ensayo
descrito en el Ejemplo 1. Como se ilustra en la Figura 12, Y0317 fue
marcadamente más eficaz en la inhibición de la proliferación de
células del endotelio capilar bovino que las formas de longitud
completa y Fab de F(ab)-12 en este ensayo. El
Fab de afinidad madura de Y0317 mostró un valor ED50 en este ensayo
que fue al menos aproximadamente 20 veces inferior que el Fab de
F(ab)-12.
(1) INFORMACIÓN GENERAL:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- SOLICITANTE:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: Genentech, Inc.
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CALLE: One DNA Way
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: South San Francisco
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: EEUU
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- CÓDIGO POSTAL (ZIP): CA 94080
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Anticuerpos Anti-VEGF
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- NÚMERO DE SECUENCIAS: 130
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- FORMA LEGIBLE POR ORDENADOR:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TIPO DE MEDIO: Disco flexible
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- ORDENADOR: PC IBM compatible
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- PROGRAMA: PatentIn Release Nº 1.0, Versión Nº 1.30
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- DATOS DE LA SOLICITUD ACTUAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- NÚMERO DE SOLICITUD: EP 03004199.0
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- DATOS DE LA SOLICITUD ANTERIOR:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NÚMERO DE SOLICITUD: PCT/US98/06604
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- FECHA DE PRESENTACIÓN: 03-ABR-1998
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- DATOS DE LA SOLICITUD ANTERIOR:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NÚMERO DE SOLICITUD: US 08/833,504
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- FECHA DE PRESENTACIÓN: 07-ABR-1997
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- DATOS DE LA SOLICITUD ANTERIOR:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NÚMERO DE SOLICITUD: US 08/908,469
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- FECHA DE PRESENTACIÓN: 06-AGO-1997
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 1:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 10 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: desconocida
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 1:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr Gly Met
Asn}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 2:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 17 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: desconocida
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 2:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr
Ala Ala Asp Phe Lys}
\sac{Arg}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 3:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 14 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: desconocida
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 3:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Tyr Pro His Tyr Tyr Gly Ser Ser His Trp Tyr
Phe Asp Val}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 4:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 11 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: desconocida
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 4:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Ser Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr Leu
Asn}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 5:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 7 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: desconocida
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 5:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Phe Thr Ser Ser Leu His Ser}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 6:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 9 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: desconocida
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 6:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gln Gln Tyr Ser Thr Val Pro Trp Thr}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 7:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 123 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: desconocida
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 7:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 8:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 108 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: desconocida
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 8:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 9:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 123 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: desconocida
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 9:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 10:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 108 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: desconocida
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 10:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 11:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 113 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: desconocida
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 11:
\newpage
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 12:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 108 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: desconocida
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 12:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 13:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 107 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: desconocida
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 13:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 14:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 123 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: desconocida
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 14:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 15:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 107 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: desconocida
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 15:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 16:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 123 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: desconocida
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 16:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 17:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 11 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: desconocida
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 17:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Pro Lys Asn Ser Ser Met Ile Ser Asn Thr
Pro}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 18:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 8 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: desconocida
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 18:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{His Gln Ser Leu Thr Gly Thr Gln}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 19
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 8 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: desconocida
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 19:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{His Gln Asn Leu Ser Asp Gly Lys}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 20:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 8 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: desconocida
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 20:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{His Gln Asn Ile Ser Asp Gly Lys}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 21:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 8 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: desconocida
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 21:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Val Ile Ser Ser His Leu Gly Gln}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 22:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 67 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: desconocida
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 22:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGATTTCAAAC GTCGTNYTAC TWTTTCTAGA GACAACTCCA AAAACACABY TTACCTGCAG
\hfill60
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipATGAAAC
\hfill67
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 23:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 66 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: desconocida
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 23:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGATTTCAAAC GTCGTNYTAC TWTTTCTTTA GACACCTCCG CAAGCACABY TTACCTGCAG
\hfill60
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipATGAAC
\hfill66
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 24:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 60 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: desconocida
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 24:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipAGCCTGCGCG CTGAGGACAC TGCCGTCTAT TACTGTDYAA RGTACCCCCA CTATTATGGG
\hfill60
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 25:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 30 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: desconocida
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 25:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCTCAGCGCGC AGGCTGTTCA TCTGCAGGTA
\hfill30
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 26:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 27 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: desconocida
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 26:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGCTGATATCC AGTTGACCCA GTCCCCG
\hfill27
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 27:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 27 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: desconocida
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 27:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTCTGGGACGG ATTACACTCT GACCATC
\hfill27
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 28:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 75 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: desconocida
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 28:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCGTTTGTCCT GTGCARYTTC TGGCTATACC TTCACCAACT ATGGTATGAA CTGGRTCCGT
\hfill60
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCAGGCCCCGG GTAAG
\hfill75
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 29:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 24 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: desconocida
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 29:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGATATCCAGT TGACCCAGTC CCCG
\hfill24
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 30:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 21 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: desconocida
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 30:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGCTCCGAAAG TACTGATTTA C
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 31:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 54 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: desconocida
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 31:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCGTCGTTTCA CTTTTTCTGC AGACACCTCC AGCAACACAG TATACCTGCA GATG
\hfill54
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 32:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 25 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: desconocida
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 32:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCTATTACTGT GCAAAGTACC CCCAC
\hfill25
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 33:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 24 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: desconocida
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 33:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGGGACGGATT TCACTCTGAC CATC
\hfill24
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 34:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 26 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: desconocida
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 34:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGGTATGAACT GGGTCCGTCA GGCCCC
\hfill26
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 35:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 57 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: desconocida
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 35:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCGTCGTTTCA CTTTTTCTTT AGACACCTCC AAAAGCACAG CATACCTGCA GATGAAC
\hfill57
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 36:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 53 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: desconocida
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 36:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGGGTCACCAT CACCTGCTAA GCATAATAAT AATAAAGCAA CTATTTAAAC TGG
\hfill53
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 37:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 52 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: desconocida
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 37:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGCGCAAGTCA GGATATTTAA TAATAATAAT AATGGTATCA ACAGAAACCA GG
\hfill52
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 38:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 48 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: desconocida
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 38:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGTCTATTACT GTGCAAAGTA ATAACACTAA TAAGGGAGCA GCCACTGG
\hfill48
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 39:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 49 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: desconocida
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 39:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGGTACCCCCA CTATTATTAA TAATAATAAT GGTATTTCGA CGTCTGGGG
\hfill49
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 40:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 53 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: desconocida
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 40:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCACTATTATG GGAGCAGCCA CTAATAATAA TAAGTCTGGG TCAAGGAACC CTG
\hfill53
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 41:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 53 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: desconocida
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 41:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTCCTGTGCAG CTTCTGGCTA ATAATTCTAA TAATAAGGTA TGAACTGGGT CCG
\hfill53
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 42:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 52 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: desconocida
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 42:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGAATGGGTTG GATGGATTA CTAATAATAA GGTTAACCGA CCTATCGTGC GG
\hfill52
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 43:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 49 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: desconocida
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 43:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCTGTGCAAAG TACCCGTAAT ATTAATAATA ATAACACTGG TATTTCGAC
\hfill49
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 44:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 48 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: desconocida
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 44:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCGTTTCACTT TTTCTTAGA CTAATCCAAA TAAACAGCAT ACCTGCAG
\hfill48
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 45:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 46 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: desconocida
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 45:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGAATGGGTTG GATGGATTTA ATAATAATAA GGTGAACCGA CCTATG
\hfill46
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 46:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 53 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: desconocida
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 46:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGGGTCACCAT CACCTGCNNS GCANNSNNSN NSNNSAGCAA CTATTTAAAC TGG
\hfill53
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 47:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 52 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: desconocida
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 47:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGCGCAAGTCA GGATATTNNS NNSNNSNNSN NSTGGTATCA ACAGAAACCA GG
\hfill52
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 48:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 48 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: desconocida
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 48:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGTCTATTACT GTGCAAAGNN SNNSCACNNS NNSGGGAGCA GCCACTGG
\hfill48
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 49:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 49 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: desconocida
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 49:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGGTACCCCCA CTATTATNNS NNSNNSNNST GGTATTTCGA CGTCTGGGG
\hfill49
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 50:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 54 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: desconocida
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 50:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCACTATTATG GGAGCAGCCA CNNSNNSNNS NNSGTCTGGG GTCAAGGAAC CCTG
\hfill54
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 51:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 53 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: desconocida
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 51:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTCCTGTGCAG CTTCTGGCNN SNNSTTCNNS NNSNNSGGTA TGAACTGGGT CCG
\hfill53
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 52:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 52 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: desconocida
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 52:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGAATGGGTTG GATGGATTAA CNNSNNSNNS GGTNNSCCGA CCTATGCTGC GG
\hfill52
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 53:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 49 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: desconocida
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 53:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCTGTGCAAAG TACCCGNNST ATNNSNNSNN SNNSCACTGG TATTTCGAC
\hfill49
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 54:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 48 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: desconocida
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 54:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCGTTTCACTT TTTCTNNSGA CNNSTCCAAA NNSACAGCAT ACCTGCAG
\hfill48
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 55:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 47 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: desconocida
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 55:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGAATGGGTTG GATGGATTNN NSNNSNNSNN SGGTGAACCG ACCTATG
\hfill47
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 56:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 13 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: desconocida
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 56:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Tyr Pro Tyr Tyr Arg Gly Thr Ser His Trp Tyr
Phe Asp}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 57:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 13 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: desconocida
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 57:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Tyr Pro Tyr Tyr Ile Asn Lys Ser His Trp Tyr
Phe Asp}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 58:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 13 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: desconocida
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 58:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Tyr Pro Tyr Tyr Tyr Gly Thr Ser His Trp Tyr
Phe Asp}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 59:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 13 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: desconocida
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 59:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Tyr Pro Tyr Tyr Tyr Asn Gly Ser His Trp Tyr
Phe Asp}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 60:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 13 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: desconocida
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 60:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Tyr Pro Tyr Tyr Ile Ala Lys Ser His Trp Tyr
Phe Asp}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 61:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 13 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: desconocida
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 61:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Tyr Pro Tyr Tyr Arg Asp Asn Ser His Trp Tyr
Phe Asp}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 62:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 13 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: desconocida
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 62:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Tyr Pro Tyr Tyr Trp Gly Thr Ser His Trp Tyr
Phe Asp}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 63:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 13 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: desconocida
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 63:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Tyr Pro Tyr Tyr Arg Gln Asn Ser His Trp Tyr
Phe Asp}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 64:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 13 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: desconocida
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 64:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Tyr Pro Tyr Tyr Arg Gln Ser Ser His Trp Tyr
Phe Asp}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 65:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 13 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: desconocida
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 65:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Tyr Pro Tyr Tyr Arg Asn Thr Ser His Trp Tyr
Phe Asp}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 66:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 13 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: desconocida
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 66:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Tyr Pro Tyr Tyr Lys Asn Thr Ser His Trp Tyr
Phe Asp}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 67:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 13 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: desconocida
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 67:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Tyr Pro Tyr Tyr Ile Glu Arg Ser His Trp Tyr
Phe Asp}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 68:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 13 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: desconocida
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 68:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Tyr Pro Tyr Tyr Arg Asn Ala Ser His Trp Tyr
Phe Asp}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 69:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 13 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: desconocida
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 69:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Tyr Pro Tyr Tyr Thr Thr Arg Ser His Trp Tyr
Phe Asp}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 70:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 13 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: desconocida
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 70:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Tyr Pro Tyr Tyr Glu Gly Thr Ser Ser His Trp
Tyr Phe Asp}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 71:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 13 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: desconocida
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 71:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Tyr Pro Tyr Tyr Arg Gln Arg Gly His Trp Tyr
Phe Asp}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 72:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 13 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: desconocida
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 72:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Tyr Pro Tyr Tyr Thr Gly Arg Ser His Trp Tyr
Phe Asp}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 73:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 13 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: desconocida
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 73:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Tyr Pro Tyr Tyr Thr Asn Thr Ser His Trp Tyr
Phe Asp}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 74:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 13 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: desconocida
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 74:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Tyr Pro Tyr Tyr Arg Lys Gly Ser His Trp Tyr
Phe Asp}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 75:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 13 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: desconocida
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 75:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Tyr Pro Tyr Tyr Thr Gly Ser Ser His Trp Tyr
Phe Asp}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 76:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 13 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: desconocida
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 76:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Tyr Pro Tyr Tyr Arg Ser Gly Ser His Trp Tyr
Phe Asp}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 77:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 13 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: desconocida
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 77:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Tyr Pro Tyr Tyr Thr Asn Arg Ser His Trp Tyr
Phe Asp}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 78:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 13 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: desconocida
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 78:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Tyr Pro Tyr Tyr Arg Asn Ser Ser His Trp Tyr
Phe Asp}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 79:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 13 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: desconocida
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 79:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Tyr Pro Tyr Tyr Lys Glu Ser Ser His Trp Tyr
Phe Asp}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 80:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 13 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: desconocida
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 80:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Tyr Pro Tyr Tyr Arg Asp Ala Ser His Trp Tyr
Phe Asp}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 81:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 13 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: desconocida
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 81:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Tyr Pro Tyr Tyr Arg Gln Lys Gly His Trp Tyr
Phe Asp}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 82:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 13 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: desconocida
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 82:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Tyr Pro Tyr Tyr Lys Gly Gly Ser His Trp Tyr
Phe Asp}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 83:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 12 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: desconocida
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 83:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Tyr Pro Tyr Tyr Gly Ala Ser His Trp Tyr Phe
Asp}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 84:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 13 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: desconocida
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 84:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Tyr Pro Tyr Tyr Arg Gly Glu Ser His Trp Tyr
Phe Asp}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 85:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 13 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: desconocida
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 85:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Tyr Pro Tyr Tyr Arg Ser Thr Ser His Trp Tyr
Phe Asp}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 86:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 10 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: desconocida
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 86:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gly Tyr Asp Phe Thr His Tyr Gly Met
Asn}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 87:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 10 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: desconocida
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 87:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gly Tyr Glu Phe Gln His Tyr Gly Met
Asn}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 88:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 10 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: desconocida
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 88:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gly Tyr Glu Phe Thr His Tyr Gly Met
Asn}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 89:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 10 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: desconocida
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 89:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gly Tyr Asp Phe Gly His Tyr Gly Met
Asn}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 90:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 10 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: desconocida
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 90:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gly Tyr Asp Phe Ser His Tyr Gly Met
Asn}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 91:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 10 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: desconocida
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 91:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gly Tyr Glu Phe Ser His Tyr Gly Met
Asn}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 92:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 10 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: desconocida
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 92:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Phe Ser Val Asp Val Ser Lys Ser Thr
Ala}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 93:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 10 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: desconocida
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 93:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Phe Ser Leu Asp Lys Ser Lys Ser Thr
Ala}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 94:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 10 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: desconocida
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 94:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Phe Ser Leu Asp Val Trp Lys Ser Thr
Ala}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 95:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 10 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: desconocida
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 95:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Phe Ser Ile Asp Lys Ser Lys Ser Thr
Ala}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 96:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 42 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: desconocida
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 96:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGCAAAGTACC CGTACTATTA TGGGACGAGC CACTGGTATT TC
\hfill42
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 97:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 48 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: desconocida
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 97:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGTCACCATCA CCTGCAGCGC AAGTCAGGAT ATTAGCAAGT ATTTAAAC
\hfill48
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 98:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 33 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: desconocida
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 98:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCCGTACTATT ATGGGAGCAG CCACTGGTAT TTC
\hfill33
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 99:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 6072 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: desconocida
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 390..1101
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: mat_péptido
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 459
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 1185..2423
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: mat_péptido
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 1254
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 99:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 100:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 413 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 100:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 101:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 110 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: desconocida
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 101:
\newpage
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 102:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 119 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: desconocida
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 102:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 103:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 110 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: desconocida
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 103:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 104:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 118 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: desconocida
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 104:
\newpage
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 105:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 110 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: desconocida
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 105:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 106:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 118 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: desconocida
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 106:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 107:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 110 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: desconocida
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 107:
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 108:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 118 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: desconocida
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 108:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 109:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 110 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: desconocida
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 109:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 110:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 118 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: desconocida
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 110:
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 111:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 110 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: desconocida
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 111:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 112:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 118 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: desconocida
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 112:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 113:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 110 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: desconocida
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 113:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 114:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 118 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: desconocida
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 114:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 115:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 110 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: desconocida
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 115:
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 116:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 118 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: desconocida
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 116:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 117:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 10 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: desconocida
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: Sitio modificado
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 3
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: /nota= "Donde la X en la posición 3 representa Ácido aspártico, Treonina o Ácido glutámico".
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: Sitio modificado
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 4
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: /nota= "Donde la X en la posición 4 representa Fenilalanina, Triptófano o Tirosina".
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: Sitio modificado
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 5
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: /nota= "Donde la X en la posición 5 representa Treonina, Glutamina, Glicina o Serina".
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: Sitio modificado
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 6
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: /nota= "Donde la X en la posición 6 representa Histidina o Asparagina".
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: Sitio modificado
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 9
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: /nota= "Donde la X en la posición 9 representa Metionina o Isoleucina".
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 117:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gly Tyr Xaa Xaa Xaa Xaa Tyr Gly Xaa
Asn}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 118:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 17 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: desconocida
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: Sitio modificado
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 5
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: /nota= "Donde la X en la posición 5 representa Tirosina o Triptófano".
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 118:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Trp Ile Asn Thr Xaa Thr Gly Glu Pro Thr Tyr
Ala Ala Asp Phe Lys}
\sac{Arg}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 119:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 14 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: desconocida
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: Sitio modificado
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 3
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: /nota= "Donde la X en la posición 3 representa Histidina o Tirosina".
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: Sitio modificado
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 5
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: /nota= "Donde la X en la posición 5 representa Tirosina, Arginina, Lisina, Isoleucina, Treonina, Ácido glutámico o Triptófano".
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: Sitio modificado
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 6
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: /nota= "Donde la X en la posición 6 representa Glicina, Arginina, Alanina, Ácido aspártico, Glutamina, Ácido glutámico, Treonina, Leucina o Serina".
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: Sitio modificado
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 7
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: /nota= "Donde la X en la posición 7 representa Serina, Treonina, Lisina, Glutamina, Asparagina, Arginina, Alanina, Ácido glutámico o Glicina".
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: Sitio modificado
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 8
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: /nota= "Donde la X en la posición 8 representa Serina o Glicina".
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 119:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Trp Pro Xaa Tyr Xaa Xaa Xaa Xaa His Trp Tyr
Phe Asp Val}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 120:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 10 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: desconocida
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: Sitio modificado
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 1
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: /nota= "Donde la X en la posición 1 representa Fenilalanina, Isoleucina, Valina, Leucina o Alanina".
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: Sitio modificado
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 3
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: /nota= "Donde la X en la posición 3 representa Alanina, Leucina, Valina o Isoleucina".
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: Sitio modificado
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 5
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: /nota= "Donde la X en la posición 5 representa Treonina, Valina o Lisina".
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: Sitio modificado
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 6
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: /nota= "Donde la X en la posición 6 representa Serina o Triptófano".
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: Sitio modificado
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 7
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: /nota= "Donde la X en la posición 7 representa Serina o Lisina".
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: Sitio modificado
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 8
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: /nota= "Donde la X en la posición 8 representa Asparagina o Serina".
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: Sitio modificado
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 10
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: /nota= "Donde la X en la posición 10 representa Valina, Alanina, Leucina o Isoleucina".
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 120:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Xaa Ser Xaa Asp Xaa Xaa Xaa Xaa Thr
Xaa}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 121:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 11 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: desconocida
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: Sitio modificado
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 1
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: /nota= "Donde la X en la posición 1 representa Arginina o Serina".
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: Sitio modificado
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 3
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: /nota= "Donde la X en la posición 3 representa Serina o Asparagina".
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: Sitio modificado
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 4
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: /nota= "Donde la X en la posición 4 representa Glutamina o Ácido glutámico".
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: Sitio modificado
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 5
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: /nota= "Donde la X en la posición 5 representa Glutamina o Ácido aspártico".
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: Sitio modificado
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 6
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: /nota= "Donde la X en la posición 6 representa Isoleucina o Leucina".
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 121:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Xaa Ala Xaa Xaa Xaa Xaa Ser Asn Tyr Leu
Asn}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 122:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 7 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: desconocida
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 122:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Phe Thr Ser Ser Leu His Ser}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 123:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 9 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: desconocida
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: Sitio modificado
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 5
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: /nota= "Donde la X en la posición 5 representa Treonina, Alanina o Asparagina".
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: Sitio modificado
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 6
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: /nota= "Donde la X en la posición 6 representa Valina o Treonina".
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 123:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gln Gln Tyr Ser Xaa Xaa Pro Trp Thr}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 124:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 108 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: desconocida
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: Sitio modificado
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 4
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: /nota= "Donde la X en la posición 4 representa Metionina o Leucina".
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 124:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 125:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 123 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: desconocida
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: Sitio modificado
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 1
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: /nota= "Donde la X en la posición 1 representa Arginina o Serina".
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: Sitio modificado
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 28
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: /nota= "Donde la X en la posición 28 representa Treonina o Ácido aspártico".
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: Sitio modificado
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 31
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: /nota= "Donde la X en la posición 31 representa Asparagina o Histidina".
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: Sitio modificado
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 101
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: /nota= "Donde la X en la posición 101 representa Tirosina o Histidina".
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: Sitio modificado
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 105
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: /nota= "Donde la X en la posición 105 representa Serina o Treonina".
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 125:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 126:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 10 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: desconocida
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 126:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gly Tyr Asp Phe Thr His Tyr Gly Met
Asn}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 127:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 14 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: desconocida
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 127:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Tyr Pro Tyr Tyr Tyr Gly Thr Ser His Trp Tyr
Phe Asp Val}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 128:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 10 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: desconocida
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: Sitio modificado
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 3
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: /nota= "Donde la X en la posición 3 representa Treonina o Ácido aspártico".
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: Sitio modificado
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 6
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: /nota= "Donde la X en la posición 6 representa Asparagina o Histidina".
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 128:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gly Tyr Xaa Phe Thr Xaa Tyr Gly Met
Asn}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 129:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 14 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: desconocida
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: Sitio modificado
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 3
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: /nota= "Donde la X en la posición 3 representa Tirosina o Histidina".
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: Sitio modificado
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 7
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: /nota= "Donde la X en la posición 7 representa Serina o Treonina".
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 129:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Tyr Pro Xaa Tyr Tyr Gly Xaa Ser His Trp Tyr
Phe Asp Val}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 130:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 237 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: desconocida
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 130:
Claims (30)
1. Un anticuerpo anti-factor de
crecimiento del endotelio vascular que inhibe la angiogénesis
inducida por VEGF in vivo y/o se une a VEGF humano con un
valor K_{d} de no más de 1 x 10^{-8} M y/o tiene un valor ED50
de no más de 5 nM para inhibir la proliferación inducida por VEGF de
células endoteliales in vitro, teniendo el anticuerpo un
dominio variable de la cadena pesada que comprende las regiones
flanqueantes consenso del subgrupo III de cadenas pesadas humanas
como se muestra en SEC.ID.Nº 11 y las regiones hipervariables CDRH1,
CDRH2 y CDRH3, teniendo las siguientes secuencias de
aminoácidos:
CDRH1: GYX_{1}X_{2}X_{3}X_{4}YGX_{5}N
(SEC.ID.Nº 117), donde X_{1} es D, T o E, X_{2} es F, W, o Y,
X_{3} es T, Q, G o S, X_{4} es H o N; y X_{5} es M o I;
CDRH2: WINTX_{1}TGEPTYAADFKR (SEC.ID.Nº 118),
donde X_{1} es Y o W; y
CDRH3:
YPX_{1}YX_{2}X_{3}X_{4}X_{5}HWYFDV (SEC.ID.Nº 119), donde
X_{1} es H o Y; X_{2} es Y, R, K, I, T, E, o W, X_{3} es G, N,
A, D, Q, E, T, K, o S, X_{4} es S, T, K, Q, N, R, A, E, o G, y
X_{5} es S o G;
y teniendo un dominio variable de
la cadena ligera que comprende las regiones flanqueantes consenso
del subgrupo I de cadenas ligeras kappa como se muestra en SEC.ID.Nº
12 y las regiones hipervariables CDRL1, CDRL2 y CDRL3, teniendo las
siguientes secuencias de
aminoácidos:
CDRL1: X_{1}AX_{2}X_{3}X_{4}X_{5}SNYLN
(SEC.ID.Nº 121), donde X_{1} es R o S, X_{2} es S o N, X_{3}
es Q o E, X_{4} es Q o D y X_{5} es I o L;
CDRL2: FTSSLHS (SEC.ID.Nº 122);
CDRL3: QQYSX_{1}X_{2}PWT (SEC.ID.Nº 123),
donde X_{1} es T, A o N y X_{2} es V o T,
donde en comparación con SEC.ID.Nº
11 el dominio variable de la cadena pesada tiene una sustitución en
uno cualquiera o más de los siguientes restos de las regiones
flanqueantes: 37H, 49H, 67H, 69H, 71H, 73H, 75H, 76H, 78H y 94H, y
donde en comparación con SEC.ID.Nº 12 el dominio variable de la
cadena ligera tiene una sustitución en, y sólo en el resto 46L de
las regiones flanqueantes consenso o tiene sustituciones en los
restos 4L y 46L de las regiones flanqueantes consenso, donde la
numeración de los restos es como se muestra en la Figura
1.
2. Un anticuerpo de acuerdo con la reivindicación
1, donde el dominio variable de la cadena ligera tiene una
sustitución en, y solo en el resto 46L de las regiones flanqueantes
consenso.
3. Un anticuerpo de acuerdo con cualquier
reivindicación precedente, que tiene sustituciones en al menos dos
de dichos restos de la cadena pesada.
4. Un anticuerpo de acuerdo con la reivindicación
3, que tiene sustituciones en al menos tres de dichos restos de la
cadena pesada.
5. Un anticuerpo de acuerdo con la reivindicación
4, que tiene sustituciones en al menos cuatro de dichos restos de la
cadena pesada.
6. Un anticuerpo de acuerdo con la reivindicación
5, que tiene sustituciones en los restos 49H, 69H, 71H, 73H, 76H,
78H y 94H.
7. Un anticuerpo de acuerdo con cualquier
reivindicación precedente, donde:
en CDRH1, X_{1} es D o T, X_{2} es F, X_{3}
es T y X_{5} es M;
en CDRH2, X_{1} es Y; y
en CDRH3, X_{2} es Y, X_{3} es G, X_{4} es
S o T y X_{5} es S.
8. Un anticuerpo de acuerdo con cualquier
reivindicación precedente, donde:
en CDRL1, X_{1} es S, X_{2} es S, X_{3} es
Q, X_{4} es D y X_{5} es I; y
en CDRL3, X_{1} es T y X_{2} es V.
9. Un anticuerpo de acuerdo con cualquier
reivindicación precedente, donde el dominio variable de la cadena
pesada comprende la secuencia de aminoácidos:
\newpage
"CDR7":
X_{1}SX_{2}DX_{3}X_{4}X_{5}X_{6}TX_{7} (SEC.ID.Nº
120), donde X_{1} es F, I, V, L, o A, X_{2} es A, L, V, o I,
X_{3} es T, V o K, X_{4} es S o W, X_{5} es S o K, X_{6} es
N o S y X_{7} es V, A, L o I.
10. Un anticuerpo de acuerdo con la
reivindicación 9, donde en CDR7, X_{1} es F, X_{2} es L, X_{3}
es T, X_{4} es S, X_{5} es K, X_{6} es S y X_{7} es A.
11. Un anticuerpo de acuerdo con cualquier
reivindicación precedente, que tiene la secuencia de aminoácidos del
dominio variable de la cadena pesada de SEC.ID.Nº 7 y/o la secuencia
de aminoácidos del dominio variable de la cadena ligera de SEC.ID.Nº
8.
12. Un anticuerpo de acuerdo con la
reivindicación 11, que tiene la secuencia de aminoácidos del dominio
variable de la cadena pesada de SEC.ID.Nº 7 y la secuencia de
aminoácidos del dominio variable de la cadena ligera de SEC.ID.Nº
8.
13. Un anticuerpo de acuerdo con cualquier
reivindicación precedente, que se une al factor de crecimiento del
endotelio vascular humano (VEGF) con un valor K_{d} de no más de
aproximadamente 1 x 10^{-8}M.
14. Un anticuerpo de acuerdo con la
reivindicación 13, que se une al VEGF humano con un valor K_{d} de
no más de aproximadamente 5 x 10^{-9}M.
15. Un anticuerpo de acuerdo con cualquier
reivindicación precedente, que es un anticuerpo de longitud
completa.
16. Un anticuerpo de acuerdo con la
reivindicación 15, que es una IgG humana.
17. Un anticuerpo de acuerdo con una cualquiera
de las reivindicaciones 1 a 14, que es un fragmento de
anticuerpo.
18. Un anticuerpo de acuerdo con la
reivindicación 17, que es un Fab.
19. Una composición que comprende el anticuerpo
de cualquier reivindicación precedente y un vehículo
farmacéuticamente aceptable.
20. Un ácido nucleico aislado que codifica el
anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18.
21. Un vector que comprende el ácido nucleico de
la reivindicación 20.
22. Una célula hospedadora que comprende el
vector de la reivindicación 21.
23. Un proceso para producir un anticuerpo
anti-VEGF humanizado, que comprende cultivar la
célula hospedadora de la reivindicación 22 de modo que se exprese el
ácido nucleico.
24. EL proceso de la reivindicación 23, que
también comprende recuperar el anticuerpo anti-VEGF
humanizado del cultivo de células hospedadoras.
25. Un medicamento que comprende un anticuerpo
anti-VEGF humanizado de una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 18, para usar en inhibir la angiogénesis
inducida por VEGF en un mamífero, donde dicho medicamento puede
administrarse en una cantidad terapéuticamente eficaz al
mamífero.
26. El medicamento de la reivindicación 25, donde
el mamífero es humano.
27. EL medicamento de la reivindicación 25 o
reivindicación 26, donde el mamífero tiene un tumor.
28. El medicamento de la reivindicación 25 o
reivindicación 26, donde el mamífero tiene un trastorno retinal.
29. Un dominio variable de la cadena ligera de un
anticuerpo anti-VEGF, que comprende la secuencia de
aminoácidos:
DIQX_{1}TQSPSSLSASVGDRVTITCSASQDISNYLNWYQQKPGKAPKVLIYFTSSLHSGVPSRFSGSGSGTDF
TLT ISSLQPEDFATYYCQQYSTVPWTFGQGTKVEIKR (SEC.ID.Nº 124), donde X_{1} es M o L.
TLT ISSLQPEDFATYYCQQYSTVPWTFGQGTKVEIKR (SEC.ID.Nº 124), donde X_{1} es M o L.
30. Un dominio variable de la cadena pesada de un
anticuerpo anti-VEGF, que comprende la secuencia de
aminoácidos:
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYX_{1}FTX_{2}YGMNWVRQAPGKGLEWVGWINTYTGEPTYAADFKR
RF TFSLDTSKSTAYLQMNSLRAEDTAVYYCAKYPX_{3}YYGX_{4}SHWYFDVWGQGTLVTVSS (SEC.ID.Nº 125),
donde X_{1} es T o D, X_{2} es N o H, X_{3} es Y o H y X_{4} es S o T.
RF TFSLDTSKSTAYLQMNSLRAEDTAVYYCAKYPX_{3}YYGX_{4}SHWYFDVWGQGTLVTVSS (SEC.ID.Nº 125),
donde X_{1} es T o D, X_{2} es N o H, X_{3} es Y o H y X_{4} es S o T.
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