Nothing Special   »   [go: up one dir, main page]

CN109069638B - 用于癌症治疗的三特异性抑制剂 - Google Patents

用于癌症治疗的三特异性抑制剂 Download PDF

Info

Publication number
CN109069638B
CN109069638B CN201780025361.3A CN201780025361A CN109069638B CN 109069638 B CN109069638 B CN 109069638B CN 201780025361 A CN201780025361 A CN 201780025361A CN 109069638 B CN109069638 B CN 109069638B
Authority
CN
China
Prior art keywords
ser
gly
val
thr
leu
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201780025361.3A
Other languages
English (en)
Other versions
CN109069638A (zh
Inventor
盛泽琪
刘波
贾海群
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Jingshang Biopharmaceutical Co
Original Assignee
Jingshang Biopharmaceutical Co
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Jingshang Biopharmaceutical Co filed Critical Jingshang Biopharmaceutical Co
Publication of CN109069638A publication Critical patent/CN109069638A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN109069638B publication Critical patent/CN109069638B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/22—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against growth factors ; against growth regulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/18—Growth factors; Growth regulators
    • A61K38/1891—Angiogenesic factors; Angiogenin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/2818—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against CD28 or CD152
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2863—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against receptors for growth factors, growth regulators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/46—Hybrid immunoglobulins
    • C07K16/468—Immunoglobulins having two or more different antigen binding sites, e.g. multifunctional antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/31—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency multispecific
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
    • C07K2317/622—Single chain antibody (scFv)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/64—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising a combination of variable region and constant region components
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/66—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising a swap of domains, e.g. CH3-CH2, VH-CL or VL-CH1
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2318/00—Antibody mimetics or scaffolds
    • C07K2318/20—Antigen-binding scaffold molecules wherein the scaffold is not an immunoglobulin variable region or antibody mimetics
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Vascular Medicine (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Abstract

一种用于治疗癌症的三特异性抑制剂包括具有由VEGF结合拮抗剂赋予的结合特异性的第一靶向结构域；具有由免疫检查点调节物结合拮抗剂赋予的结合特异性的第二靶向结构域；和具有由Tie2酪氨酸激酶受体结合拮抗剂赋予的结合特异性的第三靶向结构域。所述靶向结构域可包含一个或多个抗体可变区、肽抑制剂、显性阴性蛋白、小分子药物或其组合。

Description

用于癌症治疗的三特异性抑制剂
本申请要求于2016年3月24日提交的美国临时专利申请序列号62/312,965的优先权。上述申请的全部内容通过引用并入本文。
技术领域
本申请大致涉及癌症治疗，并且特别涉及能够调节与血管生成和抗肿瘤免疫相关的多途径的三特异性抑制剂。
背景技术
尽管越来越多的治疗性单克隆抗体已被批准用于治疗各种癌症，但是鉴于作为癌症生长和进展至转移的基础的许多不同分子途径，经常观察到出现对这些抗体的抗性。
血管生成，即先前存在的血管中发展成新血管，对肿瘤生长和转移至关重要。血管生成抑制为治疗诸如癌症的疾病(其中进展(例如，转移)依赖于新血管形成)提供了潜在有价值的策略。两种重要的血管生成途径包括血管内皮生长因子(VEGF)途径和Tie2途径。主要的VEGF途径由跨膜酪氨酸激酶VEGF-R2介导。VEGF的各种同种型，特别是VEGF-A，与VEGF-R2结合，导致通过各种下游酪氨酸激酶的磷酸化的二聚化和活化。Tie2途径是另一种血管生成途径，对其已开发出治疗性抗体和小分子药物。Tie2酪氨酸激酶受体响应其血管生成素(Ang)配体(即Ang1、Ang2、Ang3(小鼠)和Ang4)的结合而激活血管生成。
除了血管生成在癌症进展中的作用之外，宿主不能消除癌细胞是另一个主要问题。虽然免疫系统是预防癌症的主要机制，但癌细胞抵抗免疫监视。自然控制机制已被确定为限制T细胞激活，以防止由于不受限制的T细胞活性造成的附带损伤。这个过程已被肿瘤细胞利用来逃避免疫反应。恢复免疫效应细胞特别是T细胞以识别和消除癌症的能力是免疫疗法的主要目标。因此，仍然需要更有效的癌症治疗。
发明内容
本申请提供了通过同时减少肿瘤组织中的血管生成和增强抗肿瘤免疫力来有效抑制癌症生长的组合物和方法。本申请的一个方面涉及一种三特异性抑制剂，其包含第一靶向结构域，其具有对VEGF或VEGF受体的结合特异性；第二靶向结构域，其具有对免疫检查点调节物的结合特异性；和第三靶向结构域，其具有对Tie2受体或Tie2受体配体的结合特异性。每种结合特异性由一种或多种抗体可变区、肽抑制剂、显性阴性蛋白、小分子药物或其组合赋予。在一些实施方案中，所述三特异性抑制剂包括一种或多种多肽。在一些实施方案中，所述三特异性抑制剂是三特异性抗体。在一些实施方案中，所述三特异性抗体具有三种或更多种结合特异性。在一些实施方案中，所述三特异性抗体仅具有三种结合特异性。
在一些实施方案中，所述靶向结构域借助肽接头通过肽键彼此连接或通过使用本领域已知的适当交联技术通过共价缀合物彼此连接。
在一些实施方案中，三个靶向结构域中的至少两个包含抗体可变区。在一些实施方案中，所述靶向结构域是单结构域抗体(sdAb)、片段可变(Fv)异二聚体、单链Fv(scFv)、Fab片段、TriFab或其组合的形式。
在一些实施方案中，所述第一和第二靶向结构域包含抗体可变区，以及所述第三靶向结构域包含抑制肽。在一些实施方案中，所述抑制肽包含SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述第一靶向结构域包含一个或多个来自贝伐单抗的互补决定区(CDR)，所述第二靶向结构域包含一个或多个来自抗PD-L1抗体的CDR。
在一些实施方案中，所述三特异性抗体中的靶向结构域与寡聚蛋白支架连接。在其他实施方案中，所述靶向结构域通过多肽接头彼此连接而没有寡聚物结合支架。
所述寡聚蛋白支架可以是二聚体、三聚体或四聚体。在一些实施方案中，所述寡聚蛋白支架包含一个或多个形成同型二聚体的免疫球蛋白恒定区。在一些实施方案中，所述寡聚蛋白支架包含一个或多个形成异二聚体的免疫球蛋白恒定区。在一些实施方案中，所述异二聚体支架包含两种不同的单体，其中一种单体包含免疫球蛋白的修饰的CH2或CH3区。在一些实施方案中，所述寡聚蛋白支架包含两个形成同二聚体或异二聚体的亮氨酸拉链结构域。在一些实施方案中，二聚体蛋白支架包含来自jun转录因子的亮氨酸拉链，其与来自fos转录因子的亮氨酸拉链相关。
在一些实施方案中，所述三特异性抑制剂中的一个或多个靶向结构域被配置为与蛋白支架共价连接并从其突出的氨基末端多肽臂。所述多肽臂可包含一条多肽链或彼此缔合的两条多肽链。在每个臂中，一条多肽链与寡聚蛋白支架的单体共价连接。
在一些实施方案中，至少两个靶向结构域与寡聚蛋白支架连接，其中每个靶向结构域包含从所述支架突出的多肽臂，并且每个臂包含至少一个与寡聚蛋白支架的单体共价连接的多肽链。
在一些实施方案中，所述三特异性抑制剂包含含有一个或多个免疫球蛋白恒定区(例如，CH2-CH3)的二聚体蛋白支架，所述免疫球蛋白恒定区形成具有从二聚体蛋白支架的氨基末端侧突出的两个臂的同型二聚体，其中每个臂包含两条彼此缔合的多肽链，包括与二聚体支架中的特定单体共价连接的一条链，其中每个臂包含对应于两种不同结合特异性的免疫球蛋白可变区(例如，VH2-VH1和VL2-VL1)。每个臂可以进一步含有免疫球蛋白恒定区(例如，CH1、CL)。在这种情况下，所述免疫球蛋白恒定区可以位于两个结合特异性之间或在两个结合特异性的羧基末端上。
在一些实施方案中，所述三特异性抑制剂包含含有一个或多个免疫球蛋白恒定区的二聚体蛋白支架，所述免疫球蛋白恒定区形成具有两对单链臂的同型二聚体，每对从二聚体蛋白支架的相对端突出。在这种情况下，第一对臂从二聚体支架的氨基末端突出，而第二对臂从二聚体蛋白支架的羧基末端突出。所述第一对臂中的每个臂包含所述第一靶向结构域，而所述第二对臂中的每个臂包含所述第二靶向结构域。所述第三靶向结构域共价连接到该对臂的任一端或两端。每个臂含有与二聚体支架中的单个多肽链共价连接的单个多肽链，其中所述第一对臂包含与VL1结构域融合的VH1结构域，以及所述第二对臂包含与VL2结构域融合的VH2结构域。
在某些实施方案中，所述三特异性抑制剂包含含有形成“杵臼(knobs-into-holes)”异二聚体的两个突变体免疫球蛋白恒定区链的二聚体蛋白支架。在其他实施方案中，所述二聚体蛋白支架包含两个形成异二聚体的亮氨酸拉链。
在一些实施方案中，两个臂从异二聚体蛋白支架突出，其中第一臂包含含有第一靶向结构域的第一Fab片段，以及第二臂包含含有第二靶向结构域的第二Fab片段。在一个实施方案中，异二聚体蛋白支架包含一个或多个包括CH3在内的免疫球蛋白恒定区，其中两条多肽链中的每一条中的一个或多个突变产生杵臼异二聚体蛋白支架，其防止在共表达三特异性抑制剂的多肽链时，具有一种结合特异性的重链与具有不同结合特异性的重链的错配。在该实施方案中，两个臂中的每一个在第一和第二Fab片段的每一个中的恒定区(例如，CH1和/或CL)中包含一个或多个突变，以防止在共表达三特异性抑制剂中的多肽轻链时，具有一种结合特异性的轻链(例如，VL1)与具有不同结合特异性的轻链(例如，VL2)的错配。
在其他实施方案中，防止轻链错配的可选方法包括制备具有从异二聚体蛋白支架突出的两个臂的三特异性抗体，其中第一臂包含含有第一靶向结构域的第一Fab片段，以及第二臂包含含有第二靶向结构域的第二Fab片段，其相对于第一Fab片段被进一步修饰。两个Fab片段中的每一个包含VH、VL、CH1和CL结构域。然而，与二聚体蛋白支架的两条多肽链之一共价连接的第一臂的多肽链含有与VL1-CL肽缔合的VH1-CH1肽，而与二聚体蛋白支架的另一条多肽链连接的第二臂的多肽链是：(1)与VL-CL肽缔合的VL-CL肽；(2)与VH-CL肽缔合的VL-CH1肽；或(3)与VL-CH1肽缔合的VH-CL肽。
在另一个实施方案中，所述三特异性抑制剂包含从异二聚体蛋白支架突出的两个单链臂，包括第一臂和第二臂，所述第一臂包含含有构成第一靶向结构域的VH1和VL1区的单个多肽链，所述第二臂包含含有构成第二靶向结构域的VH2和VL2结构域的单个多肽链。在另一个实施方案中，所述三特异性抑制剂包含从异二聚体蛋白支架突出的两个单链臂，包括第一臂和第二臂，所述第一臂包含含有融合到来自第二靶向结构域的VL2结构域的来自第一靶向结构域的VH1结构域的单个多肽链，以及所述第二臂包含含有融合到来自第一靶向结构域的VL1结构域的来自第二靶向结构域的VH2结构域的单个多肽链。
在另一个实施方案中，所述三特异性抑制剂包含从二聚体蛋白支架突出的四个臂，包括从二聚体支架的氨基末端突出的第一对臂和从二聚体蛋白支架的羧基末端突出的第二对臂。在这种情况下，每个臂包括与二聚体支架中的单个多肽链共价连接的单个多肽链，其中第一对臂包括含有与CH1结构域融合的VH1结构域的第一臂和含有与CL1结构域融合VL1结构域的第二臂。这两个臂一起形成第一结合特异性。第二对臂包括含有与CH1结构域融合的VH2结构域的第三臂和含有与CL1结构域融合的VL2结构域的第四臂，其中所述第三臂和第四臂形成第二结合特异性。
本申请的另一方面涉及一种三特异性抗体，其包含：第一靶向结构域，其具有对免疫检查点调节物的第一结合特异性；第二靶向结构域，其具有对血管内皮生长因子(VEGF)或血管内皮生长因子受体(VEGFR)的第二结合特异性；和第三靶向结构域，其具有对Tie2酪氨酸激酶受体的配体或Tie2酪氨酸激酶受体的第三结合特异性，其中所述第一靶向结构域和所述第二靶向结构域各自包含一个或多个抗体可变区。
本申请的另一方面涉及用于治疗细胞增殖性疾病的方法，其包括以有效治疗所述增殖性疾病的量向有此需要的受试者施用本申请的三特异性抑制剂或三特异性抗体。
附图说明
图1A-1D描绘了根据本公开内容的某些方面的包含同型二聚体支架的各种三特异性抗体实施方案。图1A和图1B描绘了包含具有双重结合特异性的双链臂的示例性同型二聚体实施方案。对应于第三结合特异性的抑制肽(由圆圈表示)在同型二聚体支架中的每个单体的羧基末端共价连接。图1C和1D描绘了示例性同型二聚体实施方案，其包含对应于一种结合特异性的在同型二聚体支架的一侧上的一对单链臂，以及对应于第二种结合特异性的在同型二聚体支架的另一侧上的第二对单链臂。对应于第三结合特异性的抑制肽(由圆圈表示)在第一对臂中的每一个的氨基末端和在第二对臂中的每一个的羧基末端共价连接。
图2A-2C描绘了根据本公开内容的其他方面的包含异二聚体支架的各种三特异性抗体实施方案。图2A描绘了含有两个双链臂的示例性异二聚体三特异性抗体实施方案，每个臂包含不同的结合特异性。图2B和2C描绘了包含两个scFv臂的示例性异二聚体实施方案。在图2A-2C中的每一幅图中，对应于第三结合特异性的抑制肽(由圆圈表示)在异二聚体支架中的每个单体的羧基末端共价连接。
图3A-3C描绘了根据本公开另一方面的包含异二聚体支架的各种三特异性抗体实施方案。图3A-3C包含两个双链Fab臂，其中第一Fab臂(在左侧)相对于图2A保持不接触，而具有另一结合特异性的另一个Fab臂(在右侧)通过在重链:轻链界面处将轻链中的一个或多个结构域与重链中的一个或多个结构域进行交换来修饰。对应于第三结合特异性的抑制肽(由圆圈表示)在异二聚体支架中的每个单体的羧基末端共价连接。
图4A-4B描绘了根据本公开内容的其他方面的包含异二聚体支架的各种三特异性抗体实施方案。图4A和4B包含从异二聚体支架突出的四个单链臂。在图4A中，支架上方的一对臂构成第一结合特异性，以及支架下方的一对臂构成第二结合特异性。在图4B中，包含两种结合特异性之一的scFv臂存在于支架的上方和下方。对应于第三结合特异性的抑制肽(由圆圈表示)在第一对臂的每一个中的氨基末端和第二对臂中的每一个中的羧基末端共价连接。
图5A-5C描绘了包含在本公开内容中描述的三特异性抗体实施方案中的示例性结合元件。图5A描绘了抗PD1Fab区结合决定簇(VH1:VL1)，包括可变重链(VH1)区的序列(SEQID NO：14)和可变轻链(VL1)区的序列(SEQ ID NO：16)。图5B描绘了抗贝伐单抗Fab区结合决定簇(VH1:VL1)，包括可变重链(VH1)区的序列(SEQ ID NO：6)和可变轻链(VL1)区的序列(SEQ ID NO：7)。图5C描绘了对应于trebanabib TBN-P肽的序列(SEQ ID NO：1)。
图6A和6B描绘了两种示例性三特异性抗体实施方案TS-M1(图6A)和TS-M2(图6B)的结构构造，其各自包含根据本公开内容的某些方面的同型二聚体支架。这两种构造中的每一种包括与两条重链的C末端融合的一对trebanabin(TBN)肽，以及两条臂中的一对抗PD1决定簇和一对抗VEGF决定簇。图6C显示重组贝伐单抗(BVZ)对照mAb、TS-M1、TS-M2和分子量标记物(MWM)的PAGE凝胶。TS-M1的重链和轻链的氨基酸序列分别显示于SEQ ID NO：20和21中。TS-M2的重链和轻链的氨基酸序列分别显示于SEQ ID NO：22和23中。
图7A和7B描绘了两种示例性三特异性抗体实施方案TS-M3(图7A)和TS-M4(图7B)的结构构造，其各自包含根据本公开内容的某些方面的同型二聚体支架。这两种构造中的每一种包括一对与两条重链C末端融合的TBN肽，以及在两条臂中的一对抗PD1决定簇和一对抗VEGF决定簇。图7C显示重组BVZ对照mAb、TS-M3、TS-M4和MWM的PAGE凝胶。TS-M3的重链和轻链的氨基酸序列分别显示于SEQ ID NO：24和25中。TS-M4的重链和轻链的氨基酸序列分别显示于SEQ ID NO：26和27中。
图8A和8B描绘了两种示例性三特异性抗体实施方案TS-M5(图8A)和TS-M6(图8B)的结构构造，其各自包含根据本公开内容的某些方面的同型二聚体支架。这两种构造中的每一种包括与两条重链的C-末端融合的一对TBN肽，以及在两条臂的每一条中的由CH1:CL区域分开的抗PD1决定簇和抗VEGF决定簇对。图8C显示重组BVZ对照mAb、具有与两条BVZ重链的C-末端融合的trebananib肽的重组BVZ抗体(BVZ-TBN-P)、TS-M5和MWM的PAGE凝胶。TS-M5的重链和轻链的氨基酸序列分别显示于SEQ ID NO：28和29中。TS-M6的重链和轻链的氨基酸序列分别显示于SEQ ID NO：30和31中。
图9A和9B描绘了两种示例性三特异性抗体实施方案TS-M7(图9A)和TS-M8(图9B)的结构构造，其各自包含根据本公开内容的某些方面的同型二聚体支架。这两种构造的每一种包括一对针对PD-1或VEGF的scFv，其与两条轻链的C-末端融合，以及一对与两条重链的C-末端融合的TBN肽。TS-M7的重链和轻链的氨基酸序列分别显示于SEQ ID NO：32和33中。TS-M8的重链和轻链的氨基酸序列分别显示于SEQ ID NO：34和35中。
图10A和10B描绘了两种示例性三特异性抗体实施方案TS-M9(图10A)和TS-M10(图10B)的结构构造，其各自包含根据本公开内容的某些方面的同型二聚体支架。这两种构造中的每一种包括一对针对PD-1或VEGF的scFv，其与两条重链的C-末端融合，以及一对与两条轻链的C-末端融合的TBN肽。图10C显示重组BVZ对照mAb、TS-M10和MWM的PAGE凝胶。TS-M9的重链和轻链的氨基酸序列分别显示于SEQ ID NO：36和37中。TS-10的重链和轻链的氨基酸序列分别显示于SEQ ID NO：38和39。
图11A和11B描绘了两种示例性三特异性抗体实施方案TS-M11(图11A)和TS-M12(图11B)的结构构造，其各自包含根据本公开内容的某些方面的异二聚体支架。这两种构造中的每一种包括一对与两条重链的C末端融合的TBN肽，以及一条臂中的抗PD1决定簇和在另一条臂中的抗VEGF决定簇。如图所示，TS-M11具有“杵臼(knob-in-hole)”设计(图11A)。如图11B中的星星所示，TS-M12在轻链和重链中具有突变以减少它们在细胞中合成后重链和轻链的不正确错配，如本文进一步描述。图11C显示重组BVZ对照mAb、trebanabin(TBN-P-IgG)、TS-M1、TS-M11和MWM的PAGE凝胶。TS-M11重链的氨基酸序列分别显示于SEQ ID NO：40和41。TS-M11轻链的氨基酸序列分别显示于SEQ ID NO：42和43。TS-M12重链的氨基酸序列分别显示于SEQ ID NO：44和45。TS-M12轻链的氨基酸序列分别显示于SEQ ID NO：46和47。
图12A-12G描绘了三特异性抗体阻断PD-1/PD-L1相互作用的能力。测试的抗体包括TS-M1(图12A)、TS-M2(图12B)、TS-M3(图12C)、TS-M4(图12D)、TS-M10(图12E)、单特异性抗PD-1对照(图12F)和双特异性抗PD-1-TBN-P对照(图12G)。基于在将人PD-1表达细胞与不同浓度的每种抗体与FITC标记的人PD-1组合共孵育后测量的所得平均荧光强度，测定每种抗体的半数最大抑制浓度(IC50)。
图13描绘了TS-M11和单特异性抗PD-1对照阻断PD-1/PD-L1相互作用的能力。如图12A-12G中所述测定半数最大抑制浓度(IC50)。
图14A-14C描绘了三特异性抗体阻断Ang2/Tie2相互作用的能力。测试的抗体包括Trebananib阳性对照抗体(图14A)、TS-M3(图14B)和TS-M4(图14C)。将人Tie2与不同浓度的每种抗体共孵育后，依次加入抗小鼠IgG-HRP和3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)底物，基于650nm处的吸光度测量确定每种抗体半数最大抑制浓度(IC50)。
图15A-15D描绘了三特异性抗体与人血管生成素2(Ang2)结合的结合亲和力测定的结果。测试的抗体包括作为阳性对照的trebananib(图15A)、TS-M1(图15B)、TS-M3(图15C)、TS-M4(图15D)和TS-M4(图7B)。将测试抗体的系列稀释液与重组人Ang2共孵育，然后进一步与抗人Fc抗体(山羊-IgG)和抗山羊IgG-HRP抗体一起孵育。基于如通过650nM的光吸收程度测量的得到半数最大结合的抗体浓度，计算相应的EC 50值。
图16A-16D描绘了如图15所述进行的三特异性抗体和人血管生成素2(Ang2)之间的第二组结合亲和力测定结果。测试的抗体包括作为阳性对照的trebananib(图16A)、TS-M1(图16B)、TS-M10(图16C)和TS-M2(图16D)。基于如通过650nM的光吸收程度测量的得到半数最大结合的抗体浓度计算相应的EC50值。
图17A-17C描绘了三特异性抗体阻断VEGF/VEGF-R2相互作用的能力。测试的抗体包括TS-M3(图17A)、TS-M4(图17B)和作为阳性对照的贝伐单抗mAb(图17C)。基于在650nm处的吸光度测量确定每种抗体的半数最大抑制浓度(IC50)，所述吸光度在将人KDR(VEGF-R2)与不同浓度的每种抗体共孵育后，然后依次加入VEGF-R2抗体、山羊抗小鼠IgG-HRP和TMB底物之后测量。
图18A-18F描绘了三特异性抗体与人VEGF结合的结合亲和力测定的结果。测试的抗体包括贝伐单抗mAb作为阳性对照(图18A)、TS-M1(图18B)、TS-M3(图18C)、TS-M4(图18D)、TS-M2(图18E)和TS-M10(图18F)。将测试抗体的系列稀释液与重组人VEGF 165共孵育，然后与抗人Fc抗体(山羊-IgG)、抗山羊IgG-HRP抗体和TMB底物进一步孵育，通过测量650nM处的吸光度来检测结合信号。基于如通过650nM的光吸收程度测量的得到半数最大结合的抗体浓度计算相应的EC50值。在每种情况下，阴性对照抗PD-1-TBN-P抗体与测试抗体共孵育。
图19A-19C描绘了TS-M3(图19A)、TS-M4(图19B)和贝伐单抗阳性对照(图19C)与VEGF结合的结合动力学研究的结果。使用贝伐单抗作为参照，使用Octet系统(ForteBio)上的生物层干涉测量法来表征TS-M3和TS-M4与VEGF 165的结合动力学。将TS-M3、TS-M4或贝伐单抗捕获到抗人IgG生物传感器上。跟踪VEGF165的结合和解离15分钟以产生所描绘的传感图。
图20A和20B显示三特异性抗体挽救PD-L1介导的抑制人T细胞功能的能力(作为IFN-γ产生的函数(图20A)或作为T细胞增殖指数的函数(图20B))。在图20A中，将新鲜PBMC(Bioreclamation公司)与2μg/ml葡萄球菌肠毒素B(SEB，Toxin Technology公司)一起孵育3天。加入30,000个NCI-H358人肺腺癌细胞(ATCC)以提供抑制性PD-L1信号。加入64nM抗PD-1mAb(Nivolumab，“Nivo”)，三特异性抗体(TS10、TS1、TS2、TS3和TS4)或同型对照Ab以阻断抑制性PD-L1活性，从而激活T细胞。收集上清液，通过ELISA测量IFN-γ的产生。在图20B中，新鲜PBMC(Bioreclamation公司)用抗CD3(Bio-X-cell)和抗CD28(Biolegend)预活化6天。休眠后，用1μg/ml SEB活化100,000个CellTrace Far Red(ThermoFisher)标记的PBMC 4天。加入20,000个NCI-H358细胞以提供抑制性PD-L1信号。加入64nM的抗PD-1mAb(Nivolumab)、三特异性抗体(TS10、TS1、TS2和TS3)或同型对照Ab以阻断抑制性PD-L1信号。基于门控CD3+T细胞上CellTrace Far Red信号的平均荧光强度降低的降低来计算T细胞增殖指数。
具体实施方式
定义
除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与所公开的方法和组合物所属领域的技术人员通常理解的相同的含义。必须注意的是，除非上下文另外明确指出，否则如本文和所附权利要求中所使用的，单数形式“一”、“一个”和“该”包括复数形式。因此，例如，提及“一种肽”包括“一种或多种”肽或“多种”这样的肽。关于本申请的教导，本申请中描述的任何已发布的专利、未决的专利申请或专利申请公开明确地通过引用并入本文。
如本文所用，短语“三特异性抑制剂”是指包含至少三个具有不同结合特异性的靶向结构域的分子。每个靶向结构域能够特异性结合靶分子并在结合靶分子时抑制靶分子的生物学功能。在一些实施方案中，所述三特异性抑制剂是具有两个或更多个肽的聚合分子。在一些实施方案中，所述靶向结构域包括Tie2酪氨酸激酶受体拮抗剂结构域、VEGF结合拮抗剂结构域或免疫检查点调节物结合拮抗剂结构域。在一些实施方案中，所述靶向结构域包括抗体的抗原结合结构域或CDR。
如本文所用，短语“三特异性抗体”是指包含多个免疫球蛋白抗原结合结构域和至少三个具有不同结合特异性的不同靶向结构域的抗体。因此，所述三特异性抗体可以包括具有来自免疫球蛋白重链和轻链的可变区和恒定区的完整抗体，及其抗体片段。
当描述在各个结构域之间具有连字符的多肽结构域排列时(例如，CH2-CH3)，应该理解所列出的结构域的顺序是从氨基末端到羧基末端。
术语“Tie2酪氨酸激酶受体结合拮抗剂”是指以下功能类药剂，其与Tie2酪氨酸激酶受体或其配体之一结合，因此，作为结合的结果，阻断或抑制通过其一个或多个配体(即，Ang1、Ang2、Ang3和Ang4)的Tie2酪氨酸激酶受体的激活。如本文所用，术语“Tie2酪氨酸激酶受体结合拮抗剂”包括抗体片段、肽抑制剂、显性阴性肽和小分子药物，其以分离形式或作为融合蛋白或缀合物的一部分。
短语“VEGF结合拮抗剂”是指与VEGF-A或其受体VEGFR-2结合的功能类药剂，因此，作为结合的结果，VEGF-A激活VEGFR-2被阻断或抑制。如本文所用，术语“VEGF结合拮抗剂”包括抗体片段、肽抑制剂、显性阴性肽和小分子药物，其以分离的形式或作为融合蛋白或缀合物的一部分。
如本文所用，短语“免疫检查点调节物”是指以下功能类药剂，其通过免疫检查点调节物抑制或刺激信号传导。“免疫检查点调节物”包括受体及其相关配体，它们一起提供抑制或刺激信号通路的手段，这些信号通路会导致T细胞活化。
短语“免疫检查点结合拮抗剂”和“免疫检查点拮抗剂”在本文中可互换使用，参考一类免疫检查点调节物，其干扰(或抑制)免疫检查点调节物的活性，由于与检查点调节物或其配体的结合，通过检查点调节物受体的信号被阻断或抑制。通过抑制这种信号传导，可以逆转免疫抑制，从而可以重建或增强针对癌细胞的T细胞免疫。示例性免疫检查点拮抗剂包括但不限于PD-1及其配体，PD-L1和PD-L2；CTLA-4及其配体，B7-1和B7-2；TIM-3及其配体，Galectin-9；LAG-3及其配体，包括肝窦内皮细胞凝集素(LSECtin)和Galectin-3；T细胞Ig和ITIM结构域(TIGIT)及其CD155配体；CD122及其CD122R配体；CD70，B7H3，B和T淋巴细胞衰减剂(BTLA)和VISTA。免疫检查点调节物拮抗剂包括抗体片段、肽抑制剂、显性阴性肽和小分子药物，其以分离形式或作为融合蛋白或缀合物的一部分。
短语“免疫检查点结合激动剂”和“免疫检查点激动剂”在本文中可互换使用，参考一类免疫检查点调节物，其刺激免疫检查点调节物的活性，使得由于与检查点调节物或其配体结合，通过检查点调节受体的信号受到刺激。通过刺激该信号传导，可以重建或增强针对癌细胞的T细胞免疫。示例性免疫检查点调节物激动剂包括但不限于肿瘤坏死因子(TNF)受体超家族的成员，例如CD27、CD40、OX40、糖皮质激素诱导的TNFR家族相关蛋白(GITR)和CD137及其配体。其他检查点调节物激动剂属于B7-CD28超家族，包括CD28和ICOS。
短语“显性阴性蛋白”或“显性阴性肽”是指衍生自野生型蛋白质的蛋白质或肽，其已经通过突变和/或缺失进行遗传修饰，使得修饰的蛋白质或肽干扰衍生其的内源性野生型蛋白质的功能。
短语“小分子药物”是指分子实体，通常是有机或有机金属，不是聚合物，具有药用活性，并且分子量小于约2kDa，小于约1kDa，小于约900Da，小于约800Da或小于约700Da。该术语包括除蛋白质或核酸之外的大多数称为“药物”的药物化合物，尽管小肽或核酸类似物可被认为是小分子药物。实例包括化学治疗抗癌药物和酶抑制剂。小分子药物可以合成、半合成(即，来自天然存在的前体)或生物学方式获得。
如本文所用，术语“重组的”是指不是天然存在的多肽或多核苷酸，其可以通过以通常不会一起发生的排列组合多核苷酸或多肽而产生。本文所述的三特异性抗体根据定义是“重组的”。
如本文所用，术语“抗体”是指通过一个或多个免疫球蛋白可变区特异性识别和结合抗原的多肽或多肽复合物。抗体可以是完整抗体、抗原结合片段或其单链。
关于抗体的一部分，例如F(ab')2、F(ab)2、Fab'、Fab、Fv、scFv等，使用术语“抗体片段”或“抗原结合片段”等等。无论结构如何，抗体片段都与完整抗体识别的相同抗原结合。术语“抗体片段”包括适体、spiegelmers和双抗体。术语“抗体片段”还包括任何合成的或基因工程蛋白质，其包括通过与特定抗原结合形成复合物而起抗体作用的免疫球蛋白可变区。
“单链片段可变”或“scFv”是指免疫球蛋白的重链(VH)和轻链(VL)的可变区的融合蛋白。在一些方面，所述区域与10至约25个氨基酸的短接头肽连接。所述接头可以富含甘氨酸(柔韧性)，以及丝氨酸或苏氨酸(溶解性)，并且可以连接VH的N-末端和VL的C-末端，反之亦然。尽管去除了恒定区并引入了接头，但该蛋白保留了原始免疫球蛋白的特异性。
如本文所用，术语“VH1”和“VH2”是指对应于两种不同结合特异性的免疫球蛋白重链可变结构域。同样，术语“VL1”和“VL2”是指对应于两种不同结合特异性的轻链可变结构域。当一起使用时，应理解VH1和VL1结构域定义共同的结合特异性，VH2和VL2结构域定义第二结合特异性。
术语“抗体”涵盖可以在生物化学上区分的各种广泛类型的多肽。本领域技术人员将会理解，重链在它们中用一些亚类(例如，γ1-γ4)被分类为alpha、delta、epsilon、gamma和mu，或α、δ、ε、γ和μ)。正是这链的性质决定了抗体的“种类”分别为IgG、IgM、IgA、IgG或IgE。免疫球蛋白亚类(同种型)，例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgG5等已被充分表征，并且已知赋予功能特化。鉴于本公开内容，这些类别和同种型中的每一个的修改版本对于本领域技术人员是容易辨别的，并且因此在本公开的范围内。所有免疫球蛋白类别都在本公开的范围内，下面的讨论通常针对IgG类免疫球蛋白分子。关于IgG，标准免疫球蛋白分子包含两个相同的分子量约为23,000道尔顿的轻链多肽和两个相同的分子量为53,000-70,000的重链多肽。这四条链典型地通过二硫键以“Y”构造连接，其中轻链从“Y”的口开始并继续通过可变区支撑重链。
本公开的抗体、抗原结合多肽、变体或其衍生物包括但不限于多克隆抗体，单克隆抗体，多特异性抗体，人抗体，人源化抗体，灵长类化抗体或嵌合抗体，单链抗体，表位结合片段，例如，Fab、Fab'和F(ab')2、Fd、Fvs、单链Fvs(scFv)、单链抗体、二硫键连接的Fvs(sdFv)、包含VL或VH结构域的片段、由Fab表达文库和抗独特型(抗Id)抗体产生的片段。本公开内容的免疫球蛋白或抗体分子可以是任何类型(例如，IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)，类别(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)或免疫球蛋白分子的亚类。
轻链被分类为κ或λ(K，λ)。每个重链类型可以与κ或λ轻链结合。通常，轻链和重链彼此共价键合，当免疫球蛋白由杂交瘤、B细胞或基因工程宿主细胞产生时，两条重链的“尾部”部分通过共价二硫键或非共价键彼此键合。在重链中，氨基酸序列从Y构造的叉形末端的N末端延伸至每条链底部的C末端。
轻链和重链均分为结构和功能同源性的结构域。术语“恒定”和“可变”在功能上使用。就此而言，应该理解轻链(VL)和重链(VH)链部分的可变结构域决定了抗原识别和特异性。相反，轻链(CL)和重链(CH1，CH2或CH3)的恒定区赋予重要的生物学性质，如分泌、经胎盘流动性、Fc受体结合、补体结合等。按照惯例，常规抗体中恒定区结构域的编号随着它们变得更远离抗体的抗原结合位点或氨基末端而增加。在常规抗体中，N端部分是可变区，在C端部分是恒定区；CH3和CL结构域实际上分别包含重链和轻链的羧基末端。
如上所述，可变区允许抗体选择性识别并特异性结合抗原上的表位。也就是说，抗体的VL结构域和VH结构域，或互补决定区(CDR)的亚类结合形成限定三维抗原结合位点的可变区。该四元抗体结构(quaternary antibody structure)形成存在于Y的每个臂末端的抗原结合位点。更具体地说，抗原结合位点由VH和VL链每条链上的三个CDR(即CDR-H1，CDR-H2，CDR-H3，CDR-L1，CDR-L2和CDR-L3)限定。在一些情况下，例如，某些免疫球蛋白分子来自骆驼科动物物种或基于骆驼科动物免疫球蛋白工程化改造。或者，免疫球蛋白分子可以仅由重链组成，不含轻链，或仅由轻链组成，不含重链。
在天然存在的抗体中，每个抗原结合域中存在的六个“互补决定区”或“CDR”是短的，非连续的氨基酸序列，当抗体在含水环境中呈现其三维构型时，这些氨基酸特异性地定位以形成抗原结合域。被称为“框架”区域的抗原结合域中的其余氨基酸显示出较小的分子间可变性。框架区大部分采用β-折叠构象，并且CDR形成环，其连接，并且在某些情况下形成β-折叠结构的一部分。因此，框架区起到形成支架的作用，该支架通过链间非共价相互作用提供了将CDR置于正确方向的位置。由定位的CDR形成的抗原结合域限定与免疫反应性抗原上的表位互补的表面。该互补表面促进抗体与其同源表位的非共价结合。本领域普通技术人员可以容易地鉴定包含CDR和框架区的氨基酸对于任何给定的重链或轻链可变区，因为它们已被精确定义。
本文公开的抗体可以来自任何动物来源，包括鸟类和哺乳动物。优选地，所述抗体是人、鼠、驴、兔、山羊、豚鼠、骆驼、美洲驼、马或鸡抗体。在一些实施方案中，所述可变区可以来自软骨鱼(condricthoid)(例如，来自鲨鱼)。
如本文所用，术语“重链恒定区”包括衍生自免疫球蛋白重链的氨基酸序列。包含重链恒定区的多肽包含下列中的至少一个：CH1结构域，铰链(例如，上、中和/或下铰链区)结构域，CH2结构域，CH3结构域，或其变体或片段。例如，用于本公开的抗原结合多肽可以包含含有CH1结构域的多肽链；包含CH1结构域、铰链结构域的至少一部分和CH2结构域的多肽链；包含CH1结构域和CH3结构域的多肽链；包含CH1结构域、铰链结构域的至少一部分和CH3结构域的多肽链，或包含CH1结构域、铰链结构域的至少一部分、CH2结构域和CH3结构域的多肽链。在一些实施方式中，本公开内容的多肽包含含有CH3结构域的多肽链。此外，用于本公开的抗体可缺少CH2结构域的至少一部分(例如，CH2结构域的全部或部分)。应该理解，可以修饰重链恒定区使得它们在天然存在的免疫球蛋白分子的氨基酸序列中发生变化。
本文公开的抗体的重链恒定区可以源自不同的免疫球蛋白分子。例如，多肽的重链恒定区可以包含源自IgG1分子的CH1结构域和源自IgG3分子的铰链区。在另一个实例中，重链恒定区可以包含部分衍生自IgG1分子和部分衍生自IgG3分子的铰链区。在另一个实例中，重链部分可以包含部分衍生自IgG1分子和部分衍生自IgG4分子的嵌合铰链。
如本文所用，术语“轻链恒定区”包括衍生自抗体轻链的氨基酸序列。优选地，所述轻链恒定区包括恒定κ结构域或恒定λ结构域中的至少一种。“轻链-重链对”是指可以通过轻链的CL结构域和重链的CH1结构域之间的二硫键形成二聚体的轻链和重链的集合。
各种免疫球蛋白类别的恒定区的亚基结构和三维构型是众所周知的。如本文所用，术语“VH结构域”包括免疫球蛋白重链的氨基末端可变结构域，以及术语“CH1结构域”包括免疫球蛋白重链的第一(大部分氨基末端)恒定区结构域。CH1结构域与VH结构域相邻并且是免疫球蛋白重链分子铰链区的氨基端。
如本文所用，术语“CH2结构域”包括使用常规编号方案例如从抗体的约第244号残基延伸至第360号残基的重链分子的部分(残基244至360，Kabat编号系统；以及残基231-340，EU编号系统)。CH2域是独特的，因为它不与另一个域紧密配对。相反，两个N-连接的分支碳水化合物链插入完整天然IgG分子的两个CH2结构域之间。CH3结构域从CH2结构域延伸至IgG分子的C-末端并包含约108个残基。
如本文所用，术语“铰链区”包括将CH1结构域连接至CH2结构域的重链分子的部分。该铰链区包含约25个残基并且是柔性的，因此允许两个N端抗原结合区独立移动。铰链区可以细分为三个不同的结构域：上部、中部和下部铰链结构域。
如本文所用，术语“二硫键”包括在两个硫原子之间形成的共价键。氨基酸半胱氨酸包含可形成二硫键或与第二巯基桥连的巯基。在大多数天然存在的IgG分子中，CH1和CL区通过二硫键连接，并且两个重链通过两个二硫键在对应于使用Kabat编号系统的239和242的位置连接(位置226或229，EU编号系统)。
如本文所用，短语“人源化抗体”是指源自非人抗体的抗体，通常是小鼠单克隆抗体。或者，人源化抗体可以来源于嵌合抗体，其保留或基本上保留了亲本非人抗体的抗原结合特性，但当施用于人时，与亲本抗体相比，表现出降低的免疫原性。
如本文所用，短语“嵌合抗体”是指其中免疫反应性区域或位点获自或衍生自第一物种并且恒定区(根据本公开可以是完整的、部分的或修饰的)获自第二物种。在某些实施方式中，靶结合区或位点将来自非人源(例如，小鼠或灵长类动物)并且恒定区是人的。
包括在本申请的三特异性抗体的范围内的是各种组合物和方法，包括不对称的IgG样抗体(例如，triomab/细胞杂交瘤，Trion Pharma/Fresenius Biotech)；杵臼抗体(Genetech)；Cross Mabs(Roche)；静电匹配抗体(AMGEN)；LUZ-Y(Genetech)；链交换工程化结构域(SEED)体(EMD Serono；biolonic，Merus)；Fab交换的抗体(Genmab)，对称的IgG样抗体(例如双重靶向(DT)-Ig(GSK/Domantis)；二合一抗体(Genetech)；交联的Mabs(Karmanos癌症中心)，mAb2(F-star)；Cov X-body(Cov X/Pfizer)；双可变区(DVD)-Ig融合(Abbott)；IgG样双特异性抗体(Eli Lilly)；Ts2Ab(Medimmune/AZ)；BsAb(ZymoGenetics)；HERCULES(Biogen Idec，TvAb，Roche)；scFv/Fc融合；SCORPION(Emergent BioSolutions/Trubion,ZymoGenetics/BMS)；双亲和再靶向技术(Fc-DART)，MacroGenics；双(scFv)2-Fabs(国家抗体医学研究中心)；F(ab)2融合(Medarex/AMGEN)；双作用或Bis-Fab(Genetech)；Dock-and-Lock(DNL，ImmunoMedics)；Fab-Fv(UCB-Celltech)；基于scFv和双抗体的抗体(例如，双特异性T细胞接合物(BiTE，Micromet)；串联双抗体(Tandab，Affimed)；DART(MacroGenics)；单链双抗体；TCR样抗体(AIT，Receptor Logics)；人血清白蛋白scFv融合(Merrimack)；COMBODIES(Epigen Biotech)；和IgG/非IgG融合物(例如，免疫细胞因子(EMDSerono，Philogen，ImmunGene，ImmunoMedics)。
通过“特异性结合”或“对……具有特异性”，通常意味着抗体通过其抗原结合域与表位结合，并且该结合需要抗原结合域和表位之间的一些互补性。根据该定义，当抗体相比于其将结合随机的，不相关的表位而言更容易通过其抗原结合域与该表位结合时，抗体被称为“特异性结合”该表位。术语“特异性”在本文中用于限定某种抗体与某个表位结合的相对亲和力。例如，可以认为抗体“A”对给定表位具有比抗体“B”更高的特异性，或抗体“A”可以说比与其相关表位“D”相比结合具有更高的特异性的表位“C”。
术语“免疫缀合物”是指通过共价键与肽或小分子药物融合的三特异性抗体。肽或小分子药物可以连接于恒定重链的C端或可变轻链和/或重链的N端。可以使用“接头”以稳定的共价方式将肽或小分子药物(如美登木素生物碱)与三特异性抗体连接。在化合物或抗体保持活性的条件下，接头可能对酸诱导的切割、光诱导的切割、肽酶诱导的切割、酯酶诱导的切割和二硫键切割敏感或基本上耐受对酸诱导的切割、光诱导的切割、肽酶诱导的切割、酯酶诱导的切割和二硫键切割。合适的接头在本领域中是众所周知的，并且包括例如二硫化物基团、硫醚基团、酸不稳定基团、光不稳定基团、肽酶不稳定基团和酯酶不稳定基团。接头还包括带电接头，以及本文所述和本领域已知的其亲水形式。免疫缀合物可进一步在三特异性抗体与肽和/或小分子药物之间包含柔性3-15个氨基酸的肽(或间隔物)。
术语“治疗(动词)”和“治疗(名词)”是指改善与细胞增殖性疾病相关的一种或多种症状；预防或延迟细胞增殖性病症的一种或多种症状的发作；和/或减轻细胞增殖性病症的一种或多种症状的严重性或频率。
短语“有此需要的患者”、“需要治疗的患者”或“需要治疗的受治疗者”的包括将受益于施用本公开的三特异性抑制剂以治疗细胞增殖性病症的受试者，例如哺乳动物受试者。
术语“治疗有效量”、“药理学有效量”和“生理有效量”可互换使用，是指被需要以在血流中或在目标组织中提供阈水平的活性拮抗剂试剂的三特异性抑制剂的量。确切的量将取决于许多因素，例如特定的活性剂，组合物的组分和物理特征，预期的患者群体，患者考虑因素等，并且可以由本领域技术人员基于本文提供的信息或在相关文献中以其他方式获得的信息容易地确定。
在本上下文中使用的术语“改善”、“增加”或“减少”指示相对于基线测量的值或参数，例如在本文所述的治疗开始之前在同一个体中的测量，或在没有本文所述治疗的情况下在对照个体(或多个对照个体)中的测量。
“对照个体”是患有与正在接受治疗的个体相同的细胞增殖性疾病的个体，其与被治疗个体的年龄大致相同(以确保治疗个体和对照个体的疾病阶段是可比较的)。治疗的个体(也被称为“病人”或“受试者”)可以是具有细胞增殖性疾病的胎儿、婴儿、儿童、青少年或成人。
术语“细胞增殖性病症”是指以细胞异常增殖为特征的病症。增殖性病症并不意味着对细胞生长速度的任何限制，而仅仅表明丧失了影响生长和细胞分裂的正常对照。因此，在一些实施方式中，增殖性病症的细胞可以具有与正常细胞具有相同的细胞分裂速率，但对限制这种生长的信号没有反应。在“细胞增殖性病症”的范围内是新生物(neoplasm)或肿瘤，其是组织的异常生长。“癌症”是指以能够侵入周围组织和/或转移至新的定植部位的细胞增殖为特征的各种恶性新生物中的任何一种，并且包括白血病、淋巴瘤、癌(carcinoma)、黑素瘤、肉瘤、生殖细胞肿瘤和母细胞瘤。用本发明方法治疗的示例性癌症包括脑癌、膀胱癌、乳腺癌、子宫颈癌、结肠癌、头颈癌、肾癌、肺癌、非小细胞肺癌、间皮瘤、卵巢癌、前列腺癌、胃癌和子宫癌、白血病和髓母细胞瘤。
术语“白血病”是指造血器官的进行性恶性疾病，并且通常特征在于血液和骨髓中的白细胞及其前体的变形增殖和发育。示例性白血病包括，例如，急性非淋巴细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病、急性粒细胞白血病、慢性粒细胞白血病、急性早幼粒细胞白血病、成人T细胞白血病、白细胞不增多性白血病、白血病细胞性白血病(leukocythemicleukemia)、嗜碱性颗粒球白血病、干细胞性白血病、牛白血病、慢性粒细胞性白血病、皮肤白血病、胚胎性白血病、嗜酸性粒细胞白血病、格罗斯白血病、毛细胞白血病、成血细胞性白血病(hemoblastic leukemia)、成血细胞性白血病(hemocytoblastic leukemia)、组织细胞性白血病、干细胞白血病、急性单核细胞白血病、白细胞减少性白血病、淋巴性白血病、成淋巴细胞性白血病、淋巴细胞白血病、淋巴原白血病、淋巴样白血病、淋巴肉瘤细胞性白血病、肥大细胞白血病、巨核细胞白血病、微粒白血病、单核细胞白血病、成髓细胞白血病、粒细胞性白血病、髓细胞性白血病、粒单核细胞白血病、内格利白血病、浆细胞白血病、浆细胞性白血病、前髓细胞性白血病、Rieder细胞白血病、希林白血病、干细胞白血病、亚白血病性白血病和未分化细胞性白血病。
术语“癌”是指上皮细胞的倾向于渗透周围组织并引起转移的恶性生长。示例性的癌包括例如腺泡癌(acinar carcinoma)、腺泡癌(acinous carcinoma)、囊性腺样癌、腺样囊性癌、腺癌、肾上腺皮质癌、肺泡癌、肺泡细胞癌、基底细胞癌(basal cell carcinoma)、基底细胞癌(carcinoma basocellulare)、基底细胞样癌、基底鳞状细胞癌、细支气管肺泡癌、细支气管癌、支气管原癌、髓样癌、胆管细胞癌、绒毛膜癌、胶体癌、粉刺状癌、子宫体癌、筛状癌、铠甲状癌、皮肤癌、柱状细胞癌(cylindrical carcinoma)、柱状细胞癌(cylindrical cell carcinoma)、导管癌、硬粒癌、胚胎性癌、髓样癌、表皮样癌(epiennoidcarcinoma)、腺样基底细胞癌、外植癌、溃疡性癌、硬癌、胶样癌(gelatiniformcarcinoma)、胶样癌(gelatinous carcinoma)、巨细胞癌(giant cell carcinoma)、巨细胞癌(carcinoma gigantocellulare)、腺癌、颗粒细胞癌、毛母质癌、多血癌、肝细胞癌、许特尔细胞癌、透明细胞癌、超形态癌(hypemephroid carcinoma)、幼稚型胚胎性癌、原位癌、表皮内癌、上皮内癌、克罗佩赫氏癌、库尔希茨基细胞癌、大细胞癌、豆状癌(lenticularcarcinoma)、豆状癌(carcinoma lenticulare)、脂瘤样癌、淋巴上皮癌、髓质癌、髓样癌、黑色素瘤、软癌、粘液癌(mucinous carcinoma)、粘液癌(carcinoma muciparum)、黏液细胞癌(carcinoma mucocellulare)、粘液表皮样癌、粘液癌(carcinoma mucosum)、粘液癌(mucous carcinoma)、粘液瘤样癌(carcinoma myxomatodes)、鼻咽癌(naspharyngealcarcinoma)、燕麦细胞癌、骨化性癌、类骨质癌、乳头状癌、门静脉癌、浸润前癌、棘细胞癌(prickle cell carcinoma)、粉刺癌、肾细胞癌、储备细胞癌、肉瘤样癌、schneiderian癌、硬癌(scirrhous carcinoma)、阴囊癌、印戒细胞癌、单纯癌、小细胞癌、马铃薯状癌、球状细胞癌、梭形细胞癌、海绵状癌、鳞状癌、鳞状细胞癌、绳捆癌、血管扩张性癌(carcinomatelangiectaticum)、血管扩张性癌(carcinoma telangiectodes)、移行细胞癌、结节性皮癌(carcinoma tuberosum)、结节性皮癌(tuberous carcinoma)、疣状癌和绒毛状癌。
术语“肉瘤”是指由诸如胚胎结缔组织的物质组成的肿瘤，并且通常由包埋在纤维状或均质物质中的紧密排列的细胞组成。示例性肉瘤包括例如软骨肉瘤、纤维肉瘤、淋巴肉瘤、黑素肉瘤、粘液肉瘤、骨肉瘤、Abemethy肉瘤、脂肪肉瘤、脂肉瘤、肺泡软组织肉瘤、成釉细胞肉瘤、葡萄状肉瘤、绿色瘤、绒毛膜癌、胚胎肉瘤、维尔姆斯瘤肉瘤、子宫内膜肉瘤、间质肉瘤、尤因氏肉瘤、筋膜肉瘤、成纤维细胞肉瘤、巨细胞肉瘤、粒细胞肉瘤、何杰金氏肉瘤、特发性多发色素性出血性肉瘤、B细胞免疫母细胞肉瘤、淋巴瘤(例如非霍奇金淋巴瘤)、T-细胞免疫母细胞肉瘤、Jensen肉瘤、卡波西肉瘤、库普弗细胞肉瘤、血管肉瘤、白血病性肉瘤、恶性间叶肉瘤、骨旁骨肉瘤、网状细胞肉瘤、劳氏肉瘤、浆液囊性肉瘤、滑膜肉瘤和毛细血管肉瘤。
术语“黑素瘤”是指由皮肤和其他器官的黑素细胞系统引起的肿瘤。黑色素瘤包括例如肢端黑色素瘤、无黑素性黑色素瘤、良性幼年黑素瘤、Cloudman黑素瘤、S91黑素瘤、Harding-Passey黑素瘤、幼年型黑素瘤、恶性雀斑样黑素瘤、恶性黑素瘤、结节性黑素瘤亚黑素瘤和表面扩散黑素瘤。
其他癌症包括例如霍奇金病、多发性骨髓瘤、神经母细胞瘤、乳腺癌、卵巢癌、肺癌、横纹肌肉瘤、原发性血小板增多症、原发性巨球蛋白血症、小细胞肺肿瘤、原发性脑肿瘤、胃癌、结肠癌、恶性胰腺癌(malignant pancreatic insulanoma)、恶性类癌、恶变前皮肤病变、睾丸癌、甲状腺癌、神经母细胞瘤、食管癌、泌尿生殖道癌、恶性高钙血症、宫颈癌、子宫内膜癌和肾上腺皮质癌。
三特异性抑制剂
本申请的一个方面涉及一种三特异性抑制剂。该三特异性抑制剂包含具有由一种或多种VEGF结合拮抗剂赋予的第一结合特异性的第一靶向结构域，具有由一种或多种检查点调节物赋予的第二结合特异性的第二靶向结构域，和具有由一种或多种Tie2受体结合拮抗剂赋予的第三结合特异性的第三靶向结构域。给定的靶向结构域可以是一种或多种抗体片段的形式，其包括抗原结合结构域、肽抑制剂、显性阴性肽或小分子药物。在某些实施方案中，肽抑制剂、显性阴性肽或小分子药物中的一种或多种与本文所述的免疫球蛋白恒定区、免疫球蛋白Fc片段或寡聚蛋白支架融合或缀合。
在一些实施方案中，所述三特异性抑制剂是三特异性抗体，并且所述结合拮抗剂和/或调节物包括含有抗原结合结构域的抗体片段，所述抗原结合结构域包含在免疫球蛋白重链和轻链中的一种或多种免疫球蛋白可变区(例如，VH1、VH2、VL1、VL2)和它们相关的互补性衍生区(CDR)和框架区(FR)。抗体片段可包含单个多肽链或彼此缔合的一对多肽链。来自这些区域的序列可以通过常规方法通过实验确定，或者可以由公开的免疫球蛋白重链和轻链序列来鉴定。
在一个实施方案中，三种结合特异性中的至少两种由抗体可变区赋予。在另一个实施方案中，所有三种结合特异性均由抗体可变区赋予。当结合特异性由抗体可变区赋予时，结合拮抗剂可以是可结合拮抗剂靶标的任何合适的抗体片段形式，例如单结构域抗体(sdAb)、片段可变(Fv)异二聚体、单链片段可变区(scFv)、Fab片段或其组合。
在某些优选的实施方案中，三特异性抗体中的结合拮抗剂与寡聚蛋白支架(例如免疫球蛋白恒定区或Fc片段)连接。结合拮抗剂可以与寡聚蛋白支架融合(例如通过肽键)或化学缀合。当与寡聚支架连接时，结合拮抗剂可以被构造为从寡聚支架的氨基和/或羧基末端突出的单链或双链多肽“臂”。
在其他实施方案中，结合拮抗剂可以通过多肽接头彼此化学连接(通过化学缀合的肽键)而无需寡聚结合支架。在任一种情况下，可以将柔性肽接头引入两种不同的结合拮抗剂之间，以将它们各自的结合结构域分离成独立的功能结合单位。肽接头也可用于将各个免疫球蛋白结合结构域彼此连接，例如在scFv等中。美国专利申请公开号2016/009823的表1中描述了示例性肽接头。
寡聚蛋白支架可以是二聚体、三聚体或四聚体。在一个实施方案中，寡聚蛋白支架包含一个或多个形成同型二聚体蛋白支架的免疫球蛋白恒定区。或者，寡聚蛋白支架可以是异二聚体蛋白支架的形式。如本文所用，术语“异二聚体”或“异二聚的”是指包含两个不同的单体的二聚体，当在细胞中共表达时，相对于与其自身缔合，这两个不同的单体优先彼此缔合。寡聚蛋白支架可含有来自例如任何IgG同种型(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgG5)，IgA亚型(例如，IgA1和IgA2)或其他免疫球蛋白抗体类别(例如，IgM、IgD、IgA和IgY)的免疫球蛋白恒定区(例如，CH1、CH2、CH3)。
在一些实施方案中，寡聚蛋白支架包括一对亮氨酸拉链结构域，用于形成同型二聚体或异二聚体。亮氨酸拉链是蛋白质中常见的三维结构基序，通常作为各种转录因子中DNA结合结构域的一部分。单个LZ通常以约7个残基间隔包含4-5个亮氨酸残基，形成具有沿一侧延伸的疏水区的两亲性α螺旋。在一个具体实施方案中，异二聚体蛋白支架包含来自c-jun转录因子的LZ，其与来自c-fos转录因子的LZ缔合。虽然已知c-jun形成jun-jun同型二聚体并且c-fos不形成同型二聚体，但是jun-fos异二聚体的形成比jun-jun同型二聚体更有利。亮氨酸拉链可用作支架中的唯一二聚化界面。或者，它可以优选在支架的羧基末端与CH2和/CH2结构域组合使用。
在另一个实施方案中，寡聚蛋白支架和抗原结合臂包含TriFab，其是由两个常规Fab臂组成的IgG形双特异性抗体，所述两个常规Fab臂通过柔性接头肽与一个不对称的第三个Fab大小的结合模块融合。该第三个模块取代了IgG Fc区并且由与具有“knob”突变的CH3融合的重链可变区(VH)构成，其中轻链可变区(VL)与具有匹配性“hole”的CH3融合。铰链区不含二硫化物以促进抗原进入第三结合位点。为了补偿重链之间铰链-二硫化物的损失，CH3knob-hole异二聚体通过S354C-Y349C二硫化物连接，并且茎区的VH和VL可以通过VH44C-VL100C二硫化物连接。在Mayer等人，Int,J.Mol.Sci.，16：27497-27507(2015)中描述了TriFab。
在另一个实施方案中，寡聚蛋白支架是三聚体或四聚体，其分别包含三个或四个单体蛋白质，每个蛋白质包含三聚化或四聚化结构域。在特定实施方案中，三聚体蛋白支架中的每个单体蛋白质包含来自人胶原XV或人胶原XVII的非胶原三聚化结构域，或来自肿瘤坏死因子α(TNF-α)的三聚化结构域。用于本申请的三特异性抗体的三聚化和四聚化结构域序列在美国专利申请号2015/0139991、20015/0038682和2014/0348826中描述。
VEGF结合拮抗剂
三特异性抗体包括至少一种VEGF结合拮抗剂。VEGF结合拮抗剂与VEGF-A或其受体VEGFR-2结合，因此，作为结合的结果，VEGF-A活化VEGFR-2被阻断或抑制。优选的VEGF抗体拮抗剂是贝伐单抗(AVASTINTM)，一种人源化抗体。贝伐单抗包含突变的人IgG1框架区和来自鼠抗hVEGF单克隆抗体A.4.6.1的抗原结合互补决定区，其阻断人VEGF-A与VEGFR-2的结合。贝伐单抗大约93％的氨基酸序列(包括大多数框架区)源自人IgG1，并且约7％的序列源自鼠抗体A4.6.1。贝伐单抗具有约149,000道尔顿的分子量并且是糖基化的。
贝伐单抗重链具有以下氨基酸序列：EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTNYGMNWV RQAPGKGLEWVGWINTYTGEPTYAADFKRRFTFSLDTSKSTAYLQMNSLRAEDTAVYYCAKYPHYYGSSHWYFDVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:6)。加下划线的序列鉴定为贝伐单抗重链可变区。在某些实施方案中，三特异性抑制剂可包括贝伐单抗重链可变区而没有相关的恒定区。
贝伐单抗轻链具有以下氨基酸序列：DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCSASQDISNYLNWYQ QKPGKAPKVLIYFTSSLHSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYSTVPWTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ ID NO:7)。加下划线的序列鉴定为贝伐单抗轻链可变区。在某些实施方案中，三特异性抑制剂可包括贝伐单抗轻链可变区而没有相关的恒定区。
贝伐单抗和其他人源化抗VEGF抗体进一步描述于美国专利号6,884,879中。
在一些实施方案中，VEGF结合拮抗剂包含选自以下各序列中的一种或多种氨基酸序列：GYTFTNYGMN(SEQ ID NO:8)、WINTYTGEPTYAADFKR(SEQ ID NO:9),YPHYYGSSHWYFDV(SEQ ID NO:10),SASQDISNYLN(SEQ ID NO:11)和QQYSTVPWTF(SEQ ID NO:12)。
其他抗VEGF抗体包括雷珠单抗(ranibizumab)(商品名LUCENTISTM)，一种衍生自与贝伐单抗相同的亲本鼠抗体的单克隆抗体片段；在美国公开号2006/0280747、2007/0141065和/或2007/0020267中描述的G6或B20系列抗体(例如，G6-23、G6-31、B20-4.1)，以及在美国专利号7,060,269、6,884,879、6,582,959、6,703,020；6,054,297；美国专利申请公开号US2007/059312、US 2006/009360、US 2005/0186208、US 2003/0206899、US 2003/0190317和US 2003/0203409中描述的抗体。
示例性显性阴性抗VEGF拮抗剂是阿柏西普(Aflibercept)，一种重组融合蛋白，其含有来自于与人IgG1Fc部分融合的人VEGF受体1和2的细胞外结构域的VEGF-A结合部分。阿柏西普充当VEGF-A的可溶性受体诱饵。
示例性抗VEGFR-2拮抗剂是人源化IgG1单克隆抗体雷莫芦单抗(Ramucirumab)，其结合VEGFR-2的细胞外结构域，从而阻断其与VEGF-A的相互作用。
VEGF途径的示例性小分子拮抗剂包括VEGFR-2的多激酶抑制剂，包括舒尼替尼(sunitinib)、索拉非尼(sorafenib)、西地尼布(cediranib)、pazonpanib和nintedanib。
Tie2受体结合拮抗剂
三特异性抗体还包括含有至少一种Tie2受体结合拮抗剂的靶向结构域。Tie2受体结合拮抗剂与Tie2酪氨酸激酶受体或其血管生成素(Ang)配体(即，Ang-1、Ang-2、Ang-3和Ang-4)之一结合，因此，作为结合的结果，其一种或多种配体激活Tie2受体被阻断或抑制。在一个实施方案中，Tie2受体结合拮抗剂是来自trebanabin的抑制肽，TBN-P。在一个具体实施方案中，抑制肽包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列，即AQQEECEWDPWTCEHMGSGSATGGSGSTASSGSGSATHQEECEWDPWTCEHMLE。在另一个实施方案中，Tie2受体结合拮抗剂包括trebanabin，其包含与Ig Fc片段融合的SEQ ID NO：1的肽(即TBN-P)。示例性TBN-P-IgG包括以下序列，其中TBN-P区加下划线：DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGGGGAQQEECEWDPWTCEHMGSGSATGGSGSTASSGSGSATHQEE CEWDPWTCEHMLE(SEQ ID NO:2)。
其他Tie2活化的肽抑制剂(包括Ang-2抑制剂)包括A-11(Compugen)，其包含氨基酸序列ETFLSTNKLENQ(SEQ ID NO:3)；CVX-060肽QK(Ac)YQPLDEK(Ac)DK(0P)TLYDQFMLQQG(SEQ ID NO:4,Pfizer)；CVX-037肽(DFB)TNFMPMDDLEK(0P)RLYEQFILQQG(SEQ ID NO:5,Pfizer)；和CGEN-25017(Compugen)。另外的Tie2活化肽抑制剂描述于美国专利号7,138,370中。
Tie2活化(和/或血管生成素-2)的抗体抑制剂包括AMG-780(Amgen)、MEDI-3617(MedImmune/AstraZeneca)、DX-2240(Dyax/Sanofi-Aventis)、REGN-910(Sanofi/Regeneron)、RG7594(Roche)、LC06(Roche)、TAvi6(Roche)、AT-006(Roche/Affitech)。另外的Tie2受体结合抗体拮抗剂及其抗体结合序列描述于美国专利号7,521,053、7,658,924和8,030,025，以及美国专利申请公开号2013/0078248、2013/0259859，和2015/0197578中。
Tie2结合拮抗剂还包括小分子抑制剂，CGI-1842(CGI Pharmaceuticals)、LP-590(Locus Pharmaceuticals)、ACTB-1003(Act Biotech/Bayer AG)、CEP-11981(Cephalon/Teva)、MGCD265(Methylgene)、Regorafenib(Bayer)、Cabozantinib/XL-184/BMS-907351(Exelixis)、Foretnib(Exelixis)、MGCD-265(MethylGene Inc.)。
免疫检查点调节物
三特异性抗体包括针对至少一种免疫检查点调节物的靶向结构域。免疫检查点调节物可以是免疫检查点拮抗剂或免疫检查点激动剂。免疫检查点拮抗剂可以提供抑制信号传导途径的手段，其除此以外会导致T细胞活化，这对于抗肿瘤免疫是重要的。免疫检查点拮抗剂包括受体及其相关配体，它们一起提供抑制信号传导途径的手段，其除此以外会导致T细胞活化。免疫检查点拮抗剂调节或干扰免疫检查点调节物的活性，使得由于与检查点调节物或其配体的结合，经由检查点调节物受体的信号传导被阻断或抑制。通过抑制该信号传导，可以逆转免疫抑制，从而可以重建或增强针对癌细胞的T细胞免疫。
相反，免疫检查点激动剂(例如，共刺激分子)刺激免疫检查点调节物的活性，使得由于与检查点调节物或其配体的结合，经由检查点调节物受体的信号传导受到刺激。通过刺激该信号传导，可以重建或增强针对癌细胞的T细胞免疫。此类免疫检查点激动剂或共刺激分子包括除有效免疫应答所需的抗原受体或其配体之外的细胞表面分子，并且包括但不限于：MHC I类分子、TNF受体蛋白、免疫球蛋白样蛋白、细胞因子受体、整联蛋白、信号传导的淋巴细胞激活分子(SLAM蛋白)、激活的NK细胞受体、BTLA、Toll配体受体、OX40、CD2、CD7、CD27、CD28、CD30、CD40、CDS、ICAM-1、LFA-1(CD11a/CD18)、4-1BB(CD137)、B7-H3、CDS、ICAM-1、ICOS(CD278)、GITR、BAFFR、LIGHT、HVEM(LIGHTR)、KIRDS2、SLAMF7、NKp80(KLRF1)、NKp44、NKp30、NKp46、CD19、CD4、CD8α、CD8β、IL2Rβ、IL2Rγ、IL7Rα、ITGA4、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD11d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD11a、LFA-1、ITGAMCD11b、ITGAX、CD11c、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、NKG2D、NKG2C、TNFR2、TRANCE/RANKL、DNAM1(CD226)、SLAMF4(CD244、2B4)、CD84、CD96(Tactile)、CEACAM1、CRT AM、Ly9(CD229)、CD160(BY55)、PSGL1、CD100(SEMA4D)、CD69、SLAMF6(NTB-A、Ly108)、SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME(SLAMF8)、SELPLG(CD162)、LTBR、LAT、GADS、SLP-76、PAG/Cbp、CD19a和与CD83特异性结合的配体。
近年来，已经鉴定了许多受体及其配体形式的免疫检查点调节物。免疫检查点拮抗剂包括但不限于PD-1及其配体PD-L1和PD-L2；CTLA-4及其配体B7-1和B7-2；TIM-3及其配体Galectin-9；LAG-3及其配体，包括肝窦内皮细胞凝集素(LSECtin)和Galectin-3；T细胞Ig和ITIM结构域(TIGIT)及其CD155配体；CD122及其CD122R配体；CD70，糖皮质激素诱导的TNFR家族-相关蛋白(GITR)，B7H3，B和T淋巴细胞衰减剂(BTLA)和VISTA(Le Mercier等，Front.Immunol.，(6)，Article 418,2015)。此外，已经在各种临床和临床前模型中鉴定和测试了许多检查点调节物抑制剂和/或由FDA批准(Kyi等，FEBS Letters，588：368-376(2014)。例如由于FDA批准PD-1抑制剂nivolumab和pembrolizumab以及抗-CTLA-4抗体伊匹木单抗(ipilimumab)用于转移性黑素瘤，抑制性受体阻断的概念(也称为免疫检查点阻断)已经生效。
在某些实施方案中，检查点调节物结合拮抗剂是结合PD-1、PD-L1或PD-L2的抗体或抗体片段。示例性的抗PD-1抗体包括但不限于nivolumab(BMS-936558，MDX-1106，OPDIVOTM)，人源化免疫球蛋白G4(IgG4)mAb(Bristol-Myers Squibb)；pembrolizumab(MK-3475，lambrolizumab，KEYTRUDATM)(Merck)；pidilizumab(CT-011)(Medivation)；和AMP-224(Merck)。抗PD1抗体可商购获得，例如来自ABCAM(AB137132)、BIOLEGENDTM(EH12.2H7，RMP1-14)和AFFYMETRIX EBIOSCIENCE(J105，J116，MIH4)。
在一些实施方案中，检查点调节物拮抗剂是nivolumab，一种人源化抗PD-1IgG抗体。nivolumab重链具有以下氨基酸序列：
QVQLVESGGGVVQPGRSLRLDCKASGITFSNSGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWYDGSKRYYADSVKGRF TISRDNSKNTLFLQMNSLRAEDTAVYYCATNDDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRW QEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK(SEQ IDNO:13)。带下划线的序列鉴定为nivolumab重链可变区。在某些实施方案中，三特异性抑制剂可包括重链可变区QVQLVESGGGVVQPGRSLRLDCKASGITFSNSGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWYDGSKRYYADSVKGRFTISRDNSKNTLFLQMNSLRAEDTAVYYCATNDDYWGQGTLVTVSS
(SEQ ID NO:14)而没有相关的恒定区。
nivolumab轻链具有以下氨基酸序列：
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSG TDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQSSNWPRTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ IDNO:15)。带下划线的序列鉴定为nivolumab轻链可变区。在某些实施方案中，三特异性抑制剂可包括轻链可变区EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQSSNWPRTFGQGTKVEIK(SEQ ID NO:16)而没有相关的恒定区。
示例性的抗PD-L1抗体包括ztezolizumab(MPDL3280A，RG7446)，一种完全人源化IgG4mAb(Genetech/Roche)；BMS-936559(MDX-1105)，一种完全人源化的IgG4mAb(Bristol-Myers Squibb)；MEDI4736，一种人源化IgG抗体(Medimmune/AstraZeneca)；和MSB0010718C，一种完全人IgG4单克隆抗体(Merck，EMD Serono)。
在一些实施方案中，检查点调节物拮抗剂是atezolizumab，其具有以下的重链氨基酸序列：
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDSWIHWVRQAPGKGLEWVAWISPYGGSTYYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARRHWPGGFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQ YASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKG FYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:17)。加下划线的序列鉴定为atezolizumab重链可变区。在某些实施方案中，三特异性抑制剂可包括重链可变区
DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:18)而没有相关的恒定区。
atezolizumab轻链具有以下氨基酸序列：
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVSTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSGSG TDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYLYHPATFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ IDNO:18)。加下划线的序列鉴定为nivolumab轻链可变区。在某些实施方案中，三特异性抑制剂可包括轻链可变区DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVSTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGV PSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYLYHPATFGQGTKVEIK(SEQ ID NO:19)而没有相关的恒定区。
在其他实施方案中，三特异性抗体或免疫检查点调节物结合拮抗剂包括来自抗-CTLA-4抗体的VL和/或VH链区。示例性的抗-CTLA-4抗体包括伊匹木单抗(ipilimumab)、trevilizumab和曲美木单抗(tremelimumab)。
在某些实施方式中，免疫检查点调节物结合拮抗剂是免疫检查点调节物的显性阴性蛋白。在具体的实施方式中，所述显性阴性蛋白包含源自选自PD-L1、PD-L2、PD-1、B7-1、B7-2、B7H3、CTLA-4、LAG-3、TIM-3、TIGIT、GITR、BTLA、VISTA、CD70及其组合组成的组中的成员的胞外域。在某些特定实施方式中，这些胞外域与目前描述的抗体中的免疫球蛋白恒定区或Fc受体融合。
这种突变体可以结合内源性受体以形成信号传导缺陷的复合体。在某些实施方式中，胞外域与免疫球蛋白恒定区或Fc片段融合或与寡聚蛋白复合物中的单体融合。在某些优选的实施方式中，显性阴性PD-L1拮抗剂包括PD-L1、PD-L2或PD-1的胞外域。在另一个实施方式中，使用显性阴性PD-1拮抗剂，其具有突变以使其不再能够结合PD-L1。示例性的显性阴性蛋白是AMP-224(由Glaxo Smith Kline和Amplimmune共同开发)，其为包含PD-L2的胞外域和人IgG的Fc区的重组融合蛋白。
示例性的抗CTLA-4显性阴性蛋白包括人源化融合蛋白Abatacept(Orencia)，其包括与CTLA-4ECD融合的IgG1的Fc区，以及Belatacept
Figure BDA0001838777670000241
相对于Abatacept，Belatacept为在CTLA-4ECD中具有两个氨基酸替代的、第二代更高亲和力的CTLA-4-Ig变体。
示例性免疫检查点调节物激动剂包括但不限于：肿瘤坏死因子(TNF)受体超家族成员，如CD27、CD40、OX40、GITR和4-1BB(CD137)及其配体，或B7-CD28超家族成员，包括CD28和ICOS(CD278)。其他检查点调节物激动剂包括CD2、CDS、ICAM-1、LFA-1(CD11a/CD18)、CD30、BAFFR、HVEM、CD7、LIGHT、NKG2C、SLAMF7、NKp80、CD160、B7-H3、CD83配体，及上述那些。免疫检查点激动剂可以包括包含一个或多个共刺激结构域的抗体或可溶性融合蛋白激动剂。激动剂抗体包括但不限于：抗-CD40单克隆抗体，如CP-870,893、鲁卡木单抗(lucatumumab)和达西珠单抗(dacetuzumab)；抗CD137mAb，如BMS-663513urelumab和PF-05082566；抗OX40mAb；抗GITR mAb，如TRX518；抗CD27mAb，如CDX-1127；和抗-ICOS mAb。
示例性的GITR激动剂包括例如GITR融合蛋白和抗GITR抗体(例如，二价抗GITR抗体)，如美国专利号：6,111,090和8,586,023；欧洲专利号：090505B1，PCT公开号：WO 2010/003118和2011/090754中描述的GITR融合蛋白。抗GITR抗体描述于以下专利或专利申请中：例如美国专利号7,025,962、7,618,632、7,812,135、8,388,967和8,591,886；欧洲专利号：1947183B1和1866339；PCT公开号：WO2011/028683、WO2013/039954、WO2005/007190、WO2007/133822、WO2005/055808、WO99/40196、WO2001/03720、WO99/20758、WO2006/083289、WO 2005/115451、WO2011/051726。示例性的抗GITR抗体是TRX518。
寡聚蛋白支架
在一些实施方案中，三特异性抗体中的结合拮抗剂和/或激动剂被构造为共价连接至寡聚蛋白支架并从其突出的单链或双链多肽臂。多肽臂可以从支架的氨基末端、支架的羧基末端或两者突出。多肽臂可包含一条多肽链或彼此缔合的两条多肽链。在每个臂中，一条多肽链与寡聚蛋白支架的单体共价连接。或者，三特异性抗体中的一种或多种结合拮抗剂可以构造为从寡聚蛋白支架的氨基末端和羧基末端突出的两对单链多肽臂。
在一个实施方案中，两种结合特异性由抗体可变区赋予，第三种结合特异性由一种或多种抑制肽赋予。在图1A中描绘的示例性实施例中，VEGF结合拮抗剂和免疫检查点调节物结合拮抗剂的结合特异性由抗体可变区赋予，而Tie2受体拮抗剂的结合特异性由抑制肽，如trebanabin肽(TBN-P)赋予。在一个具体实施方案中，抑制性Tie2受体肽，更具体地，TBN-P肽包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列。在某些优选的实施方案中，抑制性Tie2受体肽与Fc片段的C末端融合。示例性抑制性Ang2-IgG1Fc融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。
在图1A中描绘的一个实施方案中，三特异性抗体包含含有一个或多个免疫球蛋白恒定区(例如，CH2-CH3)的同型二聚体蛋白支架，其形成具有从同型二聚体支架的氨基末端侧突出的两个双链臂的同型二聚体。一条链通过铰链区将CH1结构域共价连接到二聚体支架中的CH2结构域。在图7A(TS-M3)和7B(TS-M4)中描绘的某些特定实施方案中，每个臂包含赋予与PD-1(VH1:VL1)和VEGF-A(VH2:VL2)结合的免疫球蛋白可变区。对应于第三结合特异性的抑制肽(由圆圈表示)在同型二聚体支架中的每个单体的羧基末端共价连接。
在图1B中描绘的替代实施方案中，CH1结构域位于两种结合特异性之间。在图8A(TS-M5)和8B(TS-M6)中描绘的某些特定实施方案中，每个臂包含赋予与PD-1(VH1:VL1)和VEGF-A(VH2:VL2)结合的免疫球蛋白可变区。
在图1C中所示的另一个实施方案中，三特异性抗体包含具有两对单链臂的免疫球蛋白恒定区(例如，CH2-CH3)的同型二聚体蛋白支架，每对单链臂从二聚体蛋白支架的相对末端突出。第一对臂从二聚体支架的氨基末端突出，第二对臂从二聚体蛋白支架的羧基末端突出。第一对中的每个臂是抗VEGF-A scFv，而第二对中的每个臂是抗PD-L1scFv。另外，抑制性TBN-P肽(表示为圆圈)在第一对臂的每一个的N末端和第二对臂的每一个的C末端共价连接。
抑制性Ang-2肽或TBN-P肽可以与Fc片段(如IgG1Fc片段(例如，如SEQ ID NO：2))的C末端融合，或者其可以末端融合到从同型二聚体或异二聚体蛋白支架突出的一个或多个单链臂。或者，抑制性Ang-2肽可以与Fc片段(例如IgG1Fc片段)的C末端融合，而一个或两个scFv片段与三特异性抗体或抑制剂中轻链的C末端融合，例如，如图9A(TS-M7)和9B(TS-M8)中所示。
在其他实施方案中，天然地，抑制肽可以与抗体轻链中的一个或两个的C-末端融合，例如，如图10A和10B中所示，而一个或两个scFv片段与三特异性抗体或抑制剂的重链C-末端融合，例如，如图10A(TS-M9)和10B(TS-M10)中所示。
在图1-4和图6-11中举例说明的某些优选实施方案中，三特异性抗体包含抗VEGF结合特异性，其包含来自例如人源化单克隆抗体贝伐单抗的抗原结合位点；抗PD-1结合特异性，其包含来自抗PD-1抗体(例如Nivolumab)的抗原结合位点；和抑制性血管生成素-2(Ang-2)肽(例如，SEQ ID NO：1)。
有效生产双特异性和三特异性抗体制剂的挑战之一有关于当共表达不同结合特异性的链时重链和轻链的错配。表1列出了用于克服不同结合特异性重链之间错配的几种氨基酸取代选择，其“强制”或优先促进期望重链之间的正确结合。根据本公开，可以使用任何防止或减少重链之间错配的方法来制造三特异性抗体。
所述“杵臼(knobs-into-holes)”(KiH)方法依赖于大多数相互作用发生处的两个CH3结构域之间界面的修饰。通常，大体积残基被引入到一个抗体重链的CH3结构域中，并且起到类似钥匙的作用。在另一条重链中，形成了一个“孔(hole)”，能够容纳这种庞大的残基，模仿锁。得到的异二聚体Fc-部分可以通过人造二硫键进一步稳定。
另一种方法是基于具有离子相互作用或空间互补性的带电残基。这包括改变CH3界面中的电荷极性，以便静电匹配的Fc结构域的共表达支持有利的吸引相互作用和异二聚体形成，同时保留疏水核心，而不利的排斥电荷相互作用抑制同源二聚化。参见表1。表1中的氨基酸编号遵循Kabat编号方案并且可以应用于本文所述的抗体的重链氨基酸序列。
在另一种方法中，可以将亮氨酸拉链(LZ)结构域整合到蛋白支架中。亮氨酸拉链是蛋白质中常见的三维结构基序，通常作为各种转录因子中DNA结合域的一部分。单个LZ通常含有约7个残基间隔的4-5个亮氨酸残基，其形成具有沿一侧延伸的疏水区域的两亲性α螺旋。在一个具体的实施方式中，异二聚体蛋白支架包含来自与来自c-fos转录因子的LZ相关的c-jun转录因子的LZ。尽管已知c-jun形成jun-jun同型二聚体并且c-fos不形成同型二聚体，但jun-fos异二聚体的形成大大优于jun-jun同型二聚体。
亮氨酸拉链结构域可以替代在蛋白支架中的CH2-CH3序列而引入，或者可以将其置于三特异性抗体中的两条重链的羧基末端。在后者的情况下，可以在CH3的羧基末端和亮氨酸拉链的氨基末端之间引入弗林蛋白酶切割位点。当在合适的哺乳动物细胞表达系统中共表达三特异性抗体的重链和轻链时，这可以促进在异二聚化步骤后的弗林蛋白酶介导的亮氨酸拉链的切割(参见Wranik等，J.Biol.Chem.,287(5)：43331-43339，2012)。
表1
Figure BDA0001838777670000271
表1中的氨基酸编号遵循Kabat编号方案并且可以应用于本文所述的抗体的重链氨基酸序列。表1中描述的突变可以应用于任何免疫球蛋白IgG1重链的序列(公开的或其他)，以及其他免疫球蛋白类别和其中的亚类(或同种型)。
当共表达双特异性或三特异性抗体的重链和轻链时，一种结合特异性的轻链也可能与具有不同结合特异性的重链错配。因此，在某些实施方式中，重链、轻链或两者的部分可相对于它们来源的“野生型”抗体链进行修饰，以防止或减少两个重链恒定区彼此错配，以及防止或减少轻链恒定区与其重链对应物错配。
轻链错配问题可以通过几种方式解决。在一些实施方式中，空间互补突变和/或二硫键可以被并入两个VL/VH界面中。在其他实施方式中，可以基于离子或静电相互作用掺入突变。在一些实施方式中，通过采用在重链的CH1结构域中具有S183E突变和在轻链的CL结构域中具有S176K突变的第一臂，可以防止或减少轻链错配。第二臂可包含重链CH1结构域中的S183K突变和轻链CL结构域中的S176E突变。在其他实施方式中，如下所述，使用“CrossMab”方法，其中三特异性抗体(例如Fab)中的一个臂保持不变，但在含有其他结合特异性的另一个臂中，在重链:轻链界面处轻链中的一个或多个结构域与重链处的重链中的一个或多个结构域交叉。
在某些实施方案中，两个臂从异二聚体蛋白支架突出，其中第一臂包含含第一结合特异性的第一Fab片段以及第二臂包含含第二结合特异性的第二Fab片段。图2-4和图11B描绘了包含异二聚体蛋白支架的示例性实施方案，其中星星表示免疫球蛋白恒定区中的突变，其防止来自一种结合特异性的轻链或重链与来自另一结合特异性的轻链或重链的错配。类似地，图11A显示包含异二聚体蛋白支架的示例性实施方案，其描绘了CH3结构域中的杵(knob)，以在抗体合成期间防止或减少重链彼此错配。图11B中的星星进一步表示免疫球蛋白恒定区中的突变，其在抗体合成期间防止或减少轻链彼此错配。在美国专利申请公开号2014/0243505、2013/0022601中公开了包含用于防止重链和轻链错配的特定突变的方法、免疫球蛋白结构域序列。
在一个实施方案中，两个双链臂从异二聚体蛋白支架突出，其中第一臂包含含第一结合特异性的第一Fab片段，第二臂包含含第二特异性的第二Fab片段。在一个实施方案中，异二聚体蛋白支架，其中在两个多肽的每一个中包含一个或多个突变，以防止共表达三特异性抗体的多肽链时来自一种结合特异性的重链与不同结合特异性的重链错配。
在一些实施方案中，从异二聚体蛋白支架突出的两个双链臂的每一个在第一和第二Fab片段的每一个的恒定区(例如，CH1和/或CL)中进一步包含一个或多个突变，以便当在培养的细胞中共表达三特异性抗体的多肽轻链时，防止来自一种结合特异性的轻链(例如VL1)与不同结合特异性的轻链(例如VL2)错配。
在图2A中描绘的一个实施方案中，异二聚体蛋白支架包含修饰的CH2-CH3异二聚体，其在CH3结构域中包含几个突变以防止或减少重链之间的错配。在该实施方案中，两个Fab臂的每一个在第一和第二Fab片段的每一个的恒定区(例如，CH1和/或CL)中包含一个或多个突变，以防止在共表达三特异性抗体中的多肽轻链时，来自一种结合特异性的轻链(例如，VL1)与不同结合特异性的轻链(例如，VL2)的错配。在图2A中举例说明的特定实施例中，一条臂包含在重链的CH1结构域中的S183E突变，在重链的CH3结构域中的E356K和D399K突变，及在轻链的恒定区(CL)中的S176K突变。第二臂包含在重链CH1结构域中的S183K的突变，在重链CH3结构域中的K392D和K409D突变，以及在轻链恒定区中的S176E突变。
解决轻链错配问题的另一种方法是使用一对从异二聚体蛋白支架延伸的scFv臂，其包括含有构成第一结合特异性的VH1和VL1结构域的第一scFv臂和含有构成第二结合特异性的VH2和VL2结构域的第二scFv臂。或者，三特异性抗体可包含从异二聚体蛋白支架突出的两个单链臂，包括第一臂和第二臂，所述第一臂包含含来自第一结合特异性的VH1结构域的单个多肽链，所述来自第一结合特异性的VH1结构域与来自第二结合特异性的VL2结构域融合，第二臂包含含来自第二结合特异性的VH2结构域的单个多肽链，所述来自第二结合特异性的VH2结构域与来自第一结合特异性的VL1结构域融合。
举例说明这些实施方案，图2B和2C描绘了从CH2-CH3蛋白支架延伸的一对scFv臂。在图2B中，左臂含有对应于第一抗原结合特异性的重链可变区(VH1)，然后是对应于第二抗原结合特异性的轻链可变区(VL2)，接着是CH1结构域。右臂含有对应于第二抗原结合特异性的重链可变区(VH2)，然后是对应于第二抗原结合特异性的轻链可变区(VL1)，接着是CL1结构域。在图2C中，左臂是具有第一结合特异性的第一scFv，右臂是具有第二结合特异性的第二scFv。与图2B相反，两种结合特异性的可变区没有互换。在图2A-2C的每幅图中，对应于第三结合特异性的抑制肽(由圆圈表示)在异二聚体支架中的每个单体的羧基末端共价连接。
在其他实施方案中，用于防止轻链错配的可选“CrossMab”方法涉及制备具有从异二聚体蛋白支架突出的两个双链臂的三特异性抗体，其中第一臂包含含第一结合特异性的第一Fab片段，以及第二臂包含含第二特异性的修饰的Fab片段。在这种情况下，第一个Fab臂保持不变，而修饰具有其他结合特异性的另一个Fab臂(右侧)，例如对于图2A，通过在重链:轻链界面处使轻链中的一个或多个结构域与重链中的一个或多个结构域互换。
图3A-3C和图11B举例说明了“CrossMab”方法。在这种情况下，修饰的Fab臂含有VH2、VL2、CH1和CL结构域。而第一(或左)Fab臂共价连接到CH2-CH3支架的左链并含有与VL1-CL肽缔合的VH1-CH1肽(如图2A中所示)，与CH2-CH3支架的右链共价连接的第二(或右)Fab臂的多肽链包含(1)与VH2-CH1区轻链缔合的VL2-CL结构域(图3A，图11B)；(2)与VH2-CL区轻链缔合的VL2-CH1区(图3B)；或(3)与VL2-CH1区轻链缔合的VH2-CL区(图3C)。对应于第三结合特异性的抑制肽(由圆圈表示)在异二聚体支架中的每个单体的羧基末端共价连接。
在进一步的实施方案中，三特异性抗体含有从异二聚体蛋白支架突出的四个单链臂，包括从异二聚体支架的氨基末端突出的第一对臂和从异二聚体蛋白支架的羧基末端突出的第二对臂。在这种情况下，每个臂是在氨基末端侧或羧基末端侧与异二聚体支架中的单条多肽链共价连接的单条多肽链。
在图4A中举例说明的一个实施方案中，成对的单链臂存在于异二聚体CH2-CH3支架的两侧。在这种情况下，第一对臂包括含有与CH1结构域融合的VH1结构域的第一(或左)臂以及含有与CL1结构域融合的VL1结构域的第二(或右)臂。一起，该第一对臂构成第一结合特异性。该第二对臂形成第二结合特异性，并包括含有与CH1结构域融合的VH2结构域的第三臂和含有与CL1结构域融合的VL2结构域的第四臂。如图4A中进一步所示，对应于第三结合特异性的抑制肽(表示为圆圈)与第一对臂的氨基末端及第二对臂的羧基末端融合。
在图4B中描绘的另一实施方案中，成对的单链臂存在于异二聚体CH2-CH3支架的两侧，包括在异二聚体支架的氨基末端侧上的第一对臂和在异二聚体支架的羧基末端侧上的第二对臂。第一对臂包括对应于第一结合特异性的第一(或左)scFv臂和对应于第二结合特异性的第二(或右)scFv臂。异二聚体支架的羧基末端侧上的第二对臂包括对应于第一结合特异性的第三(或左)scFv臂和对应于第二结合特异性的第四(或右)scFv。如图4A中，对应于第三结合特异性的抑制肽(表示为圆圈)与第一对臂的氨基末端和第二对臂的羧基末端融合。当然，也考虑本文描述的实施方案的任何四臂异构排列。
在某些实施方式中，二特异性或三特异性抗体与一种或多种肽和/或小分子药物化学缀合。肽或小分子药物可以相同或不同。肽或小分子药物可以附着于例如减少的SH基团和/或碳水化合物侧链。用于制备肽或小分子药物与抗体的共价或非共价缀合物的方法在本领域中是已知的，并且可以使用任何这样的已知方法。
在一些实施方式中，肽或小分子药物通过二硫键形成与减少的抗体组分的铰链区连接。或者，可以使用异双功能交联剂，如N-琥珀酰3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(N-succinyl3-(2-pyridyldithio)propionate，SPDP)来连接这些试剂。用于这种缀合的一般技术是本领域公知的。在一些实施方式中，肽或小分子药物通过抗体的Fc区中的碳水化合物部分缀合。碳水化合物基团可以用于增加与硫醇基团结合的相同试剂的加载，或碳水化合物部分可用于结合不同的治疗剂或诊断剂。通过抗体碳水化合物部分将肽抑制剂或小分子药物缀合至抗体的方法是本领域技术人员熟知的。例如，在一个实施方式中，所述方法包括使具有氧化碳水化合物部分的抗体组分与具有至少一个游离胺官能团的载体聚合物反应。该反应产生初始席夫碱(亚胺)键，其可通过还原为仲胺而形成最终缀合物来稳定。美国专利申请公开号2014/0356385中描述了用于将小分子药物和肽缀合至抗体的示例性方法。
优选地，本公开的三特异性抗体保持抗体的某些期望的特征和药代动力学性质，包括期望的体外和体内稳定性(例如，长半衰期和保质期稳定性)，有效递送到期望的靶细胞，对结合配偶体的亲和力增加，理想的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性和补体依赖性细胞毒性，以及肾清除或排泄减少。因此，在三特异性抗体的设计中可以考虑对特定恒定区域效应子功能的大小和需要的仔细注意。
三特异性抗体的大小范围可以是50kD至300kD，50kD至250kD，60kD至250kD，80kDa至250kD，100kD至250kD，125kD至250kD，150kD至250kD，60kD至225kD，75kD至225kD，100kD至225kD，125kD至225kD，150kD至225kD，60kD至200kD，75kD至200kD，100kD至125kD至200kD，150kD至200kD，60kD至150kD，75kD至150kD，100kD至150kD，60kD至125kD，75kD至125kD，75kD至100kD，或任意上述整数之间的范围。
表达三特异性抗体的核酸组合物
另一方面，本申请提供了用于表达本文所述的三特异性抗体的核酸组合物。编码单克隆抗体中的抗原结合位点的DNA可以使用常规方法从杂交瘤细胞中分离和测序(例如，通过使用能够与编码单克隆抗体的重链和轻链的基因特异性结合的寡核苷酸探针)。可选地，可以通过直接蛋白质测序来确定目的免疫球蛋白的氨基酸序列，并且可以根据通用密码子表设计合适的编码核苷酸序列。在其他情况下，抗原结合位点或其他免疫球蛋白序列(包括恒定区、铰链区等)的核苷酸和氨基酸序列可以从本领域公知的来源获得。
编码三特异性抗体的表达载体可以用于在体外培养的细胞中合成本公开的三特异性抗体，或者它们可以直接施用于患者从而在体内或体外表达三特异性抗体。如本文所用，“表达载体”是指病毒或非病毒载体，其包括编码一个或多个对应于本公开的三特异性抗体的多肽链，其形式适于从宿主细胞中的多核苷酸表达以用于抗体制备目的或用作治疗剂直接施用。
当一核酸序列与另一核酸序列处于功能关系时，前者与后者“可操作地连接”。例如，如果前序列或信号肽的DNA表达为参与多肽分泌的前蛋白，则该前序列或信号肽的DNA可操作地连接至多肽的DNA；如果启动子或增强子影响序列的转录，则该启动子或增强子可操作地连接至编码序列；或者如果核糖体结合位置被定位以便于翻译，则该核酸体结合位点可操作地连接至编码序列。通常，“可操作地连接”是指被连接的DNA序列是连续的，并且在信号肽的情况下是连续的并处于阅读相。但是，增强子不必是连续的。连接通过在方便的限制性位点进行连接来完成。如果这样的位点不存在，则根据常规实践可以使用合成的寡核苷酸衔接子或接头。
用于表达三特异性抗体的核酸序列通常包括从成熟蛋白质中去除的氨基末端信号肽序列。由于信号肽序列可以影响表达水平，所以多核苷酸可以编码多种不同N端信号肽序列中的任何一种。本领域技术人员将理解，表达载体的设计可取决于诸如待转化宿主细胞的选择，所需蛋白质表达水平等因素。
上述“调控序列”是指在一种或多种宿主生物中表达可操作连接的编码序列所必需的DNA序列。术语“调控序列”旨在包括启动子、增强子和其他表达调控元件(例如，聚腺苷酸化信号)。调控序列包括那些在许多类型的宿主细胞中指导核苷酸序列的组成型表达，或者仅在某些宿主细胞(例如组织特异性调控序列)中指导核苷酸序列表达的那些。表达载体通常包含用于转录终止的序列，并且可以另外包含一个或多个正向影响mRNA稳定性的元件。
表达载体包含一种或多种转录调控元件，包括启动子和/或增强子，用于指导三特异性抗体的表达。启动子包括起到转录起始位点相对固定位置起始转录功能的DNA序列。启动子包含RNA聚合酶和转录因子基本相互作用所需要的核心元件，并且可以与其他上游元件和响应元件一起操作。
如本文所使用的，术语“启动子”应为其最广泛的含义，并且包括来自基因组基因或来自其的嵌合TRE的转录调控元件(TRE)，包括用于精确转录起始的TATA盒或起始子元件，带有或没有另外的TRE(即，上游激活序列、转录因子结合位点、增强子和沉默子)，其响应发育和/或外部刺激调节与其可操作地连接的基因的激活或抑制，以及反式作用调节蛋白或核酸。启动子可以包含基因组片段，或其可能含有一个或多个TRE组合在一起的嵌合体。
优选的启动子是能够在目标靶细胞中指导高水平表达的启动子。启动子可以包括组成型启动子(例如，HCMV、SV40、延伸因子-1α(EF-1α))或那些在特定的目标细胞类型中呈现出优先表达的启动子。增强子通常是指远离转录起始位点起作用的DNA序列，并且可以是转录单位的5'或3'。此外，增强子可以在内含子内以及在编码序列内。他们通常在10到300bp之间的长度，且它们以顺式起作用。增强子的功能是增加和/或调控附近启动子的转录。优选的增强子是指导抗体产生细胞中高水平表达的增强子。可以将细胞或组织特异性转录调控元件(TRE)引入表达载体中以将表达限制为期望的细胞类型。Pol III启动子(H1或U6)特别适用于表达siRNAs表达的shRNAs。表达载体可以设计成以促进三特异性抗体在一种或多种细胞类型中的表达。
在某些实施方式中，可以工程化一个或多个表达载体以同时表达三特异性抗体和一种或多种靶向Tie2途径、VEGF途径或免疫检查点调节物的siRNA。
siRNA是双链RNA，其可以被工程化以诱导mRNA的序列特异性转录后基因沉默。合成产生的siRNA在结构上模拟通过Dicer酶在细胞中正常加工的siRNA的类型。当由表达载体表达时，表达载体被工程化以转录在细胞内被加工成靶向siRNA的短双链发夹样RNA(shRNA)。可以使用众所周知的算法设计合成的siRNA和shRNA，并使用常规的DNA/RNA合成器合成。
为了共表达三特异性抗体的单个链，可以引入合适的剪接供体和剪接受体序列以表达两个产物品。可选地，可以使用内部核糖体结合序列(IRES)或2A肽序列来表达来自一个启动子的多个产物。IRES提供了核糖体可以结合的结构，不需要位于mRNA的5'末端。因此它可以指导核糖体在mRNA内的第二个起始密码子处启动翻译，从而允许从单个mRNA产生多于一个多肽。2A肽包含介导自2A位点上游和下游肽的共翻译自我切割的短序列，允许以等摩尔量从单个转录物产生两种不同蛋白质。CHYSEL是2A肽的一个非限制性实例，其引起翻译的真核生物核糖体以释放正在增长的多肽链，其合成不需不从mRNA解离。核糖体继续翻译，从而产生第二多肽。
表达载体可以包括病毒载体或非病毒载体。病毒载体可以来源于腺伴随病毒(AAV)、腺病毒、疱疹病毒、痘苗病毒、脊髓灰质炎病毒、痘病毒、逆转录病毒(包括慢病毒，如HIV-1和HIV-2)、Sindbis和其他RNA病毒、α病毒、星状病毒、冠状病毒、正粘病毒、乳多泡病毒、副粘病毒、细小病毒、小核糖核酸病毒、披膜绦虫病毒等。非病毒载体仅仅是未与病毒衍生组分(例如衣壳和/或包膜)一起包装的“裸”表达载体。
在某些情况下，可以通过使用病毒载体固有的靶向特征或工程化入病毒载体，将这些载体工程化以靶向某些疾病或细胞群。特定细胞可以“靶向”用于递送多核苷酸以及表达。因此，在这种情况下，术语“靶向”可以基于使用用于递送至特定细胞的衣壳、包膜蛋白、抗体的形式的内源或异源结合剂，限制表达到细胞的特定子集，或两者的组织特异性调控元件的使用。
在一些实施方式中，抗体链的表达处于调控元件诸如组织特异性或普遍存在的启动子的控制之下。在一些实施方式中，普遍存在的启动子如CMV启动子、CMV-鸡β-肌动蛋白杂合体(CAG)启动子、组织特异性或肿瘤特异性启动子，以控制来自其的特定抗体重链或轻链或单链衍生物的表达。
非病毒表达载体可以用于非病毒基因转移，可以通过直接注射裸DNA或通过将编码三特异性抗体的多核苷酸包封在脂质体、微粒、微胶囊、病毒样颗粒或红细胞血影中。这种组合物可以通过化学缀合与靶向结构域进一步连接，以促进靶向递送和/或将核酸进入期望的目的细胞。此外，可以将质粒载体与合成的基因转移分子如聚合DNA结合阳离子如聚赖氨酸、鱼精蛋白和白蛋白一起孵育，并与细胞靶向配体如非唾液血清类粘蛋白、胰岛素、半乳糖、乳糖或转铁蛋白连接。
可选地，可以使用裸DNA。裸DNA的摄取效率可以通过压实(compaction)或通过使用可生物降解的乳胶珠来改善。这种递送可以通过处理小珠以增加疏水性并由此促进内体的破坏和将DNA释放到细胞质中而进一步改善。
用于产生三特异性抗体的方法
本申请的另一方面涉及一种产生三特异性抗体的方法，包括：培养在三特异性抗体中瞬时或稳定表达一种或多种编码一种或多种多肽链的构建体的细胞；并从所培养的细胞中纯化三特异性抗体。可以使用任何能够产生功能性三特异性抗体的细胞。在优选的实施方式中，三特异性抗体表达细胞是真核或哺乳动物来源的，优选人细胞。来自各种组织细胞类型的细胞可用于表达三特异性抗体。在其他实施方式中，细胞是酵母细胞、昆虫细胞或细菌细胞。优选地，三特异性抗体产生细胞用表达三特异性抗体的载体来稳定转化。
编码抗体重链或轻链的一种或多种表达载体可通过任何常规方法引入细胞中，例如通过裸DNA技术、阳离子脂质介导的转染、聚合物介导的转染、肽介导的转染、病毒介导的感染、物理或化学试剂或处理、电穿孔等。此外，细胞可以用一种或多种用于表达三特异性抗体的表达载体连同促进选择稳定转化的表达三特异性抗体的克隆的选择标记一起转染。由这些细胞产生的抗体可根据本领域已知的技术来收集和/或纯化，例如通过离心、层析等。
适用于哺乳动物细胞的选择性标记的实例包括：二氢叶酸还原酶(DHFR)、胸苷激酶、新霉素、新霉素类似物G418、水霉素和嘌呤霉素。当这种选择性标记被成功转移到哺乳动物宿主细胞中时，如果置于选择压力下，转化的哺乳动物宿主细胞可以存活。有两种广泛使用的不同类别的选择性制度。第一类是基于细胞的代谢，以及使用独立于补充培养基缺乏生长能力的突变细胞系。两个实例是CHO DHFR-细胞和小鼠LTK-细胞。这些细胞在不添加胸苷或次黄嘌呤等营养素的情况下缺乏生长能力。因为这些细胞缺乏完整的核苷酸合成途径所必需的某些基因，所以它们不能存活，除非在补充的培养基中提供缺失的核苷酸。补充培养基的替代方法是将完整的DHFR或TK基因引入缺乏相应基因的细胞中，从而改变其生长需求。未用DHFR或TK基因转化的个体细胞在非补充培养基中将不能存活。
第二类是显性选择，其指代任何细胞类型中使用的选择方案，并且不需要使用突变细胞系。这些方案通常使用药物来阻止宿主细胞的生长。那些具有新基因的细胞会表达传递耐药性的蛋白质，并能在选择中存活下来。这种显性选择的实例是使用药物新霉素、麦考酚酸或潮霉素。这三个实例在真核细胞控制下使用细菌基因来分别传递对适当的药物G418或新霉素(遗传霉素)、xgpt(霉酚酸)或潮霉素的耐受性。其他包括新霉素类似物G418和嘌呤霉素。
示例性的三特异性抗体表达细胞包括人Jurkat、人胚胎肾(HEK)293、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、小鼠WEHI纤维肉瘤细胞以及单细胞原生动物物种，如利什曼原虫(Leishmania tarentolae)。另外，可以使用由c-myc或其他永生化试剂而永生化的原代细胞来生产稳定转化的产生抗体的细胞系。
在一个实施方式中，所述细胞系包括稳定转化的利什曼原虫细胞系，例如利什曼原虫。众所周知，利什曼原虫可为高水平表达显示哺乳动物型糖基化模式的真核蛋白质提供强大、快速增长的单细胞宿主。市售的利什曼原虫真核表达试剂盒是可用的(JenaBioscience GmbH，Jena，德国)。
在一些实施方式中，所述细胞系表达至少1mg、至少2mg、至少5mg、至少10mg、至少20mg、至少50mg、或至少100mg的三特异性抗体/升培养物。
在任何合适的培养基如RPMI、DMEM和AIM
Figure BDA0001838777670000351
中培养和维持后，三特异性抗体可以从三特异性抗体表达细胞中分离。可以使用常规蛋白质纯化方法(例如亲和纯化、层析等)纯化三特异性抗体，包括使用蛋白质A、或蛋白质-G免疫亲和纯化。在一些实施方式中，三特异性抗体被工程化以分泌到培养上清液中以从中分离。
治疗方法
本申请的另一方面涉及治疗细胞增殖性疾病的方法。该方法包括向有此需要的受试者施用有效量的根据本发明的三特异性抗体。在另一方面，治疗细胞增殖性疾病的方法包括向此有需要的受试者施用有效量的表达根据本发明的三特异性抗体的一种或多种表达载体。
可以采用任何合适的施用途径或方式来为患者提供治疗或预防有效剂量的三特异性抗体。示例性的施用途径或模式包括肠胃外(例如静脉内、动脉内、肌内、皮下、瘤内)、口服、局部(鼻腔、透皮、皮内或眼内)、粘膜(例如，鼻腔、舌下、口腔、直肠、阴道)吸入、淋巴管内、脊柱内、颅内、腹膜内、气管内、膀胱内、鞘内、肠内、肺内、淋巴内、血管内、眶内、囊内和经尿道，以及通过导管或支架局部递送。
根据本公开的包含三特异性抗体的药物组合物可以配制在任何药学上可接受的载体或赋形剂中。如本文所用，术语“药学上可接受的载体”包括生理上相容的任何和所有溶剂、分散介质、包衣、抗菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。药物组合物可以包括合适的固体或凝胶相载体或赋形剂。示例性的载体或赋形剂包括但不限于碳酸钙、磷酸钙、各种糖、淀粉、纤维素衍生物、明胶和聚合物如聚乙二醇。示例性的药学上可接受的载体包括水、盐水、磷酸盐缓冲盐水、右旋糖、甘油、乙醇等中的一种或多种，以及它们的组合。在许多情况下，优选在组合物中包含等渗剂，例如糖，多元醇如甘露醇、山梨糖醇，或氯化钠。药学上可接受的载体可以进一步包括少量辅助物质，例如润湿剂或乳化剂、防腐剂或缓冲剂，其增加了治疗剂的保质期或效力。
三特异性抗体可以被引入适于胃肠外给药的药物组合物中。合适的缓冲剂包括但不限于琥珀酸钠、柠檬酸钠、磷酸钠或磷酸钾。可以使用氯化钠来改变浓度为0-300mM的溶液的毒性(对于液体剂型最佳为150mM)。冷冻保护剂可包含在内用于冻干剂型，主要为0-10％蔗糖(最佳为0.5-1.0％)。其他合适的冷冻保护剂包括海藻糖和乳糖。可以包含填充剂用于冻干剂型，主要是1-10％甘露醇(最佳为2-4％)。稳定剂可用于液体和冻干剂型，主要是1-50mM L-甲硫氨酸(最佳为5-10mM)。其他合适的填充剂包括甘氨酸、精氨酸，可以包含0-0.05％聚山梨酯-80(最佳为0.005-0.01％)。另外的表面活性剂包括但不限于聚山梨酸酯20和BRIJ表面活性剂。
治疗性三特异性抗体制剂可以冻干并作为无菌粉末储存，优选在真空下储存，然后在注射前在抑菌水(包含例如苯甲醇防腐剂)或在无菌水中重构。药物组合物可以配制用于通过注射进行肠胃外给药，例如通过快速浓注或连续输注。
药物组合物中的治疗剂可以以“治疗有效量”或“预防有效量”配制。“治疗有效量”是指在必需的剂量和时间段内有效达到所需治疗结果的量。重组载体的治疗有效量可以根据待治疗的病症，病症的严重程度和过程，施用模式，抗体或药剂是为了预防还是治疗目的施用，特定试剂的生物利用度，三特异性抗体在个体中引起期望的应答的能力，先前的疗法，患者的年龄、体重和性别，患者的临床病史和对抗体的反应，使用的三特异性抗体的类型，主治医师的考量等。治疗有效量也是其中重组载体的任何毒性或有害作用超过治疗有益效果的量。“预防有效量”是指在必要的剂量和时间段内有效达到所需预防结果的量。
优选地，三特异性抗体中的多肽结构域来源于它们将被施用的相同宿主，以便减少针对施用的治疗剂的炎症反应。
三特异性抗体适于一次或通过一系列治疗合适地施用于该患者，并且可以在从诊断开始的任何时间对患者施用。三特异性抗体可作为单一治疗或与可用于治疗所述疾病的其它药物或疗法联合施用。
作为一般建议，三特异性抗体的治疗有效量或预防有效量将以约1ng/kg体重/天至约100mg/kg体重/天的范围施用，不论是通过一次或多次施用。在一个具体实施方式中，每个三特异性抗体以以下范围施用：约1ng/kg体重/天至约10mg/kg体重/天，约1ng/kg体重/天至约1mg/kg体重/天，约1ng/kg体重/天至约100μg/kg体重/天，约1ng/kg体重/天至约10μg/kg体重/天，约1ng/kg体重/天至约1μg/kg体重/天，约1ng/kg体重/天至约100ng/kg体重/天，约1ng/kg体重/天至约10ng/kg体重/天，约10ng/kg体重/天至约100mg/kg体重/天，约10ng/kg体重/天至约10mg/kg体重/天，约10ng/kg体重/天至约1mg/kg体重/天，约10ng/kg体重/天至约100μg/kg体重/天，约10ng/kg体重/天至约10μg/kg体重/天，约10ng/kg体重/天至约1μg/kg体重/天，10ng/kg体重/天至约100ng/kg体重/天，约100ng/kg体重/天至约100mg/kg体重/天，约100ng/kg体重/天至约10mg/kg体重/天，约100ng/kg体重/天至约1mg/kg体重/天，约100ng/kg体重/天至约100μg/kg体重/天，约100ng/kg体重/天至约10μg/kg体重/天，约100ng/kg体重/天到约1μg/kg体重/天，约1μg/kg体重/天至约100mg/kg体重/天，约1μg/kg体重/天至约10mg/kg体重/天，约1μg/kg体重约1mg/kg体重/天，约1μg/kg体重/天至约100μg/kg体重/天，约1μg/kg体重/天至约10μg/kg体重体重/天，约10μg/kg体重/天至约100mg/kg体重/天，约10μg/kg体重/天至约10mg/kg体重/天，约10μg/kg体重/天至约1mg/kg体重体重/天，约10μg/kg体重/天至约100μg/kg体重/天，约100μg/kg体重/天至约100mg/kg体重/天，约100μg/kg体重体重/天至约10mg/kg体重/天，约100μg/kg体重/天至约1mg/kg体重/天，约1mg/kg体重/天至约100mg/kg体体重/天，约1mg/kg体重/天至约10mg/kg体重/天，约10mg/kg体重/天至约100mg/kg体重/天。
在其他实施方式中，三特异性抗体以每三天500μg至20g、或每三天25mg/kg体重的剂量施用。
在其他实施方式中，每个三特异性抗体施用的范围为：每个个体施用约10ng至约100ng，每个个体施用约10ng至约1μg，每个个体施用约10ng至约10μg，每个个体施用约10ng至约100μg，每个个体施用约10ng至约1mg，每个个体施用约10ng至约10mg，每次单独施用约10ng至约10mg，约10ng至约100mg，每次注射约10ng至约1000mg，每个个体施用约10ng至约10,000mg，每个个体施用约100ng至约1μg，每个个体施用约100ng至约10μg，每个个体施用约100ng至约100μg，每个个体施用约100ng至约1mg，每个个体施用约100ng至约10mg，每个个体施用约100ng至约100mg，每次注射约100ng至约1000mg，每个个体施用约100ng到约10,000mg，每个个体使用约1μg至约10μg，每个个体施用约1μg至约100μg，每个个体施用约1μg至约1mg，每个个体施用约1μg至约10mg，每个个体施用1μg至约100mg，每次注射约1μg至约1000mg，每个个体施用约1μg至约10,000mg，每个个体施用约10μg至约100μg，每个个体施用约10μg至约1mg，每个个体施用约10μg至约10mg，每个个体约10μg至约100mg，每次注射约10μg至约1000mg，每个个体施用约10μg至约10,000mg，每个体施用约100μg至约1mg，每个个体施用约100μg至约10mg，每个个体施用约100μg至约100mg，每次注射约100μg至约1000mg，每个个体施用约100μg至约10,000mg，每个个体施用约1mg至约10mg，每个个体施用约1mg至约100mg，每次注射约1mg至约1000mg，每个个体施用约1mg至约10,000mg，每个个体施用约10mg至约100mg，每次注射约10mg至约1000mg，每个个体施用约10mg至约10,000mg，每次注射约100mg至约1000mg，每个个体施用约100mg至约10,000mg，和每个个体施用约1000mg至约10,000mg。三特异性抗体可以每2、3、4、5、6或7天或每1、2、3或4周日常给药。
在其他具体实施方式中，三特异性抗体的量可以以以下剂量施用：约0.0006mg/天，0.001mg/天，0.003mg/天，0.006mg/天，0.01mg/天，0.03mg/天，0.06mg/天，0.1mg/天，0.3mg/天，0.6mg/天，1mg/天，3mg/天，6mg/天，10mg/天，30mg/天，60mg/天，100mg/天，300mg/天，600mg/天，1000mg/天，2000mg/天，5000mg/天或10,000mg/天。如预期的那样，剂量将取决于患者的病症、大小、年龄和状况。
在某些实施方式中，将三特异性抗体的编码序列引入合适的表达载体(例如病毒或非病毒载体)中，用于在患有细胞增殖性病症的患者中表达有效量的三特异性抗体。在包含施用例如一种或多种重组AAV(rAAV)病毒的某些实施方式中，所述药物组合物可以包括rAAV，其量为包含至少1010、至少1011、至少1012、至少1013、或至少1014个基因组拷贝(GC)或重组病毒颗粒/每千克，或其任何范围。在某些实施方式中，所述药物组合物包括有效量的重组病毒，如rAAV，其量为包含至少1011、至少1012、至少1013、至少1014、至少1015个基因组拷贝或重组病毒颗粒/受试者，或其任何范围。
剂量可以在适用于任何特定细胞增殖性病症的几种本领域接受的动物模型中进行测试。
递送方法学还可以包括使用聚阳离子缩合DNA连接或不连接至已杀死的病毒、配体连接的DNA、脂质体、真核细胞递送载体细胞、光聚合水凝胶材料的沉积、使用手持基因转移颗粒枪、电离辐射、核电荷中和或与细胞膜融合、颗粒介导的基因转移等。
包括以下实施例以说明本发明公开主题的方式。鉴于本公开和本领域技术人员的一般技术水平，本领域技术人员将理解，以下实施例仅是示例性的，并且在不脱离本公开的主题范围的情况下，可以采用许多变化、修改和变更。
实施例1.三特异性抗体的产生
用携带各种三特异性分子或参照分子的载体转染CHO-S细胞。在34℃下，6天，产生稳定的池并在Mix6培养基(50％CD-CHO培养基和50％EX-CELL CHO 5培养基加上8mM谷氨酰胺，0.1％HT)中产生相应的分子。收获、处理条件培养基，并使用Gelcode Blue Safeprotein Stain溶液通过4-12％梯度SDS-PAGE进行分析。
实施例2：三特异性抗体阻断PD-1/PD-L1相互作用
测试三特异性抗体TS-M1(图6A)、TS-M2(图6B)、TS-M3(图7A)、TS-M4(图7B)、TS-M10(图10B)和两种不同的阳性对照抗体(抗PD-1mAb(nivolumab)和抗PD-1-TBN-P))阻断PD-1/PD-L1相互作用的能力。简言之，用FACS缓冲液(PBS中0.5％BSA，2mM EMTA)洗涤表达人PD-1的CHOK1细胞，并以106个细胞/ml的浓度用FITC标记的人PD-L1(Adipogen)重悬，终浓度为5μg/ml。将20μl的悬浮液加入96孔圆底板(Costar)中。将20μl每种三特异性抗体(TS-M1、TS-M2、TS-M3、TS-M4、TS-M10、TS-M11)，单特异性抗PD-1对照和双特异性抗PD-1-TBN-P对照加入不同的孔中，连同各种2倍连续稀释液，得到最终抗体浓度为64nM，32nM，16nM，8nM，4nM，2nM，1nM，500pM，250pM，125pM，62.5pM和31.3pM。将细胞在冰上孵育30分钟，然后用200μl FACS缓冲液洗涤一次。在iQue IntelliCyt系统(IntelliCyt Corporation)上进行流式细胞术分析。基于测量的所得平均荧光强度，测定每种抗体的半数最大抑制浓度(IC50)。
该分析的结果如图12A-12G和图13中所示。如这些图所示，发现TS-M3(图12C；IC50＝1.8nM)和TS-M4(图12D；IC50＝2.6nM)在阻断PD1/PD-L1相互作用中表现出与亲本PD-1受体mAb(图12F；IC50＝1.5nM)相当的IC50浓度。这些结果表明，与单特异性PD-1抗体相比，这些三特异性抗体中，TS-M3和TS-M4基本上保留了阻断PD1/PDL1相互作用的能力。此外，未发现Trebananib肽(TBN-P)与亲本PD-1抗体的羧基末端融合的双特异性抗体阻碍抗PD-1阻断活性(图12G；IC50＝1.5nM)。发现TS-M11表现出显著的阻断能力丧失(图13；IC50＝14nM)。与亲本PD-1抗体相比，TS-M1(图12A；IC50＝7nM)、TS-M2(图12B；IC50＝43nM)和TS-M10(图12E；IC50＝12E)显示IC50显著增加。
实施例3：三特异性抗体结合PD-1的结合动力学
使用Octet系统(Pall ForteBio LLC)进行生物层干涉测量(BLI)用于表征抗体对His标记的人PD-1(内部制作)的结合动力学。将20nM每种mAb(TS-M3、TS-M4和亲本抗-PD-1mAb)上样到抗人IgG捕获生物传感器上。通过将生物传感器放置在含有3倍连续稀释的分析物(0.3nM至235nM)的孔中5分钟，实现分析物(PD-1-His)的结合。将生物传感器单独转移到动力学缓冲液中并监测干涉信号10分钟后测定结合复合物的解离。使用包含所有测试浓度的1:1结合全局拟合模型拟合观察到的开和关速率(Ka和Kd)，并计算平衡结合常数(KD)。该分析的结果如下表2所示。
表2抗体与PD-1的结合亲和力
Ab名称 K<sub>D</sub>(nM) K<sub>a</sub>(M<sup>-1</sup>s<sup>-1</sup>) K<sub>d</sub>(s<sup>-1</sup>)
抗-PD-1mAb 6.23 2.04E+05 1.27E-03
TS-M3 3.26 2.11E+05 6.88E-04
TS-M4 5.25 1.28E+05 6.72E-04
该结合动力学研究的结果证实，三特异性抗体TS-M3和TS-M4表现出与亲本对照抗体相似的人PD-1结合亲和力。这些结果与这些三特异性分子构造中不存在PD1的结合亲和力损失的观点一致。
实施例4：三特异性抗体阻断Ang2/Tie2相互作用
进一步测试三特异性抗体阻断Ang2/Tie2相互作用的能力。简言之，用1μg/ml的重组人Ang2(R&D)(PBS中)涂布96孔测定板在37℃下保持1小时，然后在室温下用3％BSA/PBS封闭1小时。将系列稀释的三特异性抗体和重组人Tie2加入孔中，并将板在室温下培养过夜。在该测定中测试的抗体包括TS-M3(图7A)、TS-M4(图7B)和Trebananib(作为阳性对照)。用洗涤缓冲液(0.1％的Tween-20，在PBS中)洗涤孔，然后将其与抗Tie2抗体在室温下孵育1小时。用洗涤缓冲液洗涤后，向孔中加入山羊抗小鼠IgG-HRP并在室温下孵育1小时。在向孔中加入3,3',5,5'-四甲基联苯胺TMB后，通过测量650nm处的吸光度来检测Tie2结合。基于测量的所得平均荧光强度，测定每种抗体的半数最大抑制浓度(IC50)。
与关于PD-1阻断/结合的结果类似，从TS-M3(图14B；IC50＝43pM)和TS-M4(图14C；IC50＝40pM)的阻断测定计算的IC50与Trebananib(图14A，IC50＝39pM)的阻断测定计算的IC50相当。因此，类似地发现TS-M3和TS-M4在其三特异性抗体构造中保留其Trebananib肽阻断能力，表明将Trebananib肽与重链恒定区的C末端融合不会对其活性产生负面影响。
实施例5：三特异性抗体结合Ang2的结合亲和力测定
用0.5μg/ml PBS中的重组人血管生成素2涂布96孔测定板在37℃下保持1小时，然后用洗涤缓冲液(0.1％的Tween-20，在PBS中)洗涤一次，然后在4℃下用PBS中3％的BSA封闭过夜。然后将系列稀释的抗体加入孔中并在室温下孵育1小时，然后用洗涤缓冲液洗涤。测试的抗体包括TS-M1(图6A)、TS-M2(图6B)、TS-M3(图7A)、TS-M4(图7B)、TS-M10(图10B)、作为阳性对照的Trebananib和作为阴性对照的抗VEGF抗体—贝伐单抗。如所示出的，在每种情况下，对阴性对照进行并排比较。将抗人Fc抗体(山羊-IgG)加入孔中，在室温下孵育1小时，然后用洗涤缓冲液洗涤。然后将抗山羊IgG-HRP抗体加入孔中并在室温下孵育1小时。通过测量650nM处的吸光度，使用TMB底物检测结合信号。计算相应的EC 50值作为产生半数最大结合的抗体浓度或吸光度。
来自两个独立实验的分析结果分别显示在图15和16中，其中每条曲线对应于检测的不同Ang2结合活性。在每种情况下，阴性对照贝伐单抗抗体未显示任何明显的结合，如其缺乏吸光度所反映的。因此，在图中仅显示对应于Ang2结合抗体的EC50。
与阻断数据一致，发现TS-M3(图15C；EC50＝0.1nM)和TS-M4(图15D；EC50＝0.12nM)表现出与作为阳性对照的Trebananib(图15A，EC50＝0.08nM)相当的与Ang2的结合。在第二组实验中，发现与Trebananib(图16A，EC50＝4pM)相比，TS-M10(图16C，EC50＝16pM)表现出相似的Ang2结合活性。这表明Trebananib肽可以可选地与抗体轻链的C末端融合(如图10B所示)并且仍然保留其功能。此外，尽管在TS-M10中重链的C末端的抗PD1scFv融合(图10B)导致特异性结合PD-1(图12E，IC50＝14nM)，纵然少于亲本抗PD1mAb(图12F，IC50＝1.5nM)，但这些结果表明另一种抗PD1scFv可被TS-M10中的现有scFv取代，以改善该构造的总体结合性能。同样地，鉴于在第二组实验中发现与Trebananib相比，TS-MS2表现出相对相似的Ang2结合活性(图16D，EC50＝21pM)，可以使用其他抗PD1VR代替TS-M2构造中的抗PD-1部分以改善TS-M2的整体性能，包括其PD-1结合活性。
实施例6：三特异性抗体阻断VEGF/VEGFR-2相互作用
用0.5μg/ml在碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液(pH 9.6)中的重组人VEGF165(R&D)涂布96孔测定板，4℃下过夜，然后用3％BSA/PBS在室温下封闭1小时。然后将系列稀释的抗体加入板中的孔中，并在室温下孵育30分钟。将重组人KDR(VEGF-R2)加入孔中的抗体中，并在室温下孵育1小时。用洗涤缓冲液(0.1％的Tween-20，在PBS中)洗涤孔，然后在室温下与抗VEGFR2抗体孵育1小时。用洗涤缓冲液洗涤后，向孔中加入山羊抗小鼠IgG-HRP并在室温下孵育1小时。在板上加入TMB后通过测量650nm处的吸光度来检测VEGF-R2结合的量。
与关于PD-1和Ang2阻断结果的结果类似，由对TS-M3(图17A；IC 50＝6.9nM)和TS-M4(图17B；IC50＝2.7nM)的阻断测定计算的IC50与阳性对照Trebananib(图17C，IC50＝5.2mM)的阻断测定计算的IC50相当。因此，类似地，发现TS-M3和TS-M4在其三特异性抗体构造中保留其Trebananib肽阻断能力，表明Trebananib肽与重链恒定区的C末端融合不会对其活性产生负面影响。
实施例7：三特异性抗体结合VEGF的结合亲和力测定
用0.5μg/ml在碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液(pH 9.6)中的重组人VEGF 165(R&D)涂布96孔测定板，4℃下过夜，然后用缓冲溶液(0.1％的Tween-20，在PBS中)洗涤一次，然后在室温下用3％在PBS中的BSA封闭1小时。然后将系列稀释的抗体加入孔中并在室温下孵育1小时，然后用洗涤缓冲液洗涤。测试的抗体包括TS-M1(图6A)、TS-M2(图6B)、TS-M3(图7A)、TS-M4(图7B)、TS-M10(图10B)、作为阳性对照的贝伐单抗以及作为阴性对照的双特异性抗体(抗PD-1-TBN-P)。如所示出的，在每种情况下，对阴性对照进行并排比较。然后将抗人Fc抗体(山羊-IgG)加入孔中并在室温下孵育1小时，然后用洗涤缓冲液洗涤。然后将抗山羊IgG-HRP抗体加入孔中并在室温下孵育1小时。使用TMB底物，通过测量650nM处的吸光度来检测结合信号。
该分析的结果显示在图18中，其中每条曲线对应测试的不同的VEGF结合活性。在每种情况下，阴性对照抗PD-1-TBN-P抗体抗体没有显示任何明显的结合，如其缺乏吸光度所反映的。与实施例6中的阻断数据一致，发现TS-M3(图18C；EC50＝1.5nM)和TS-M4(图18D；EC50＝0.34nM)表现出与阳性对照贝伐单抗(图18A，EC50＝0.12nM)相当的VEGF结合。此外，还发现TS-M2(图18E，EC50＝0.27nM)和TS-M10(图18F，EC50＝0.34nM)的VEGF结合活性表现出的VEGF结合与阳性对照贝伐单抗(图18A，EC50＝0.12nM)相当。因此，TS-M2、TS-M3、TS-M4和TS-M10中的每种三特异性抗体构造与它们的3个靶标(PD-1、Ang2和VEGF)中的每种保持结合，尽管TS-M2和TS-M10与PD-1的结合较弱。
实施例8：三特异性抗体结合VEGF的结合动力学
使用Octet系统(Pall ForteBio LLC)进行生物层干涉测量(BLI)来表征抗体对His标记的人PD-1(内部制作)或VEGF 165(R&D)的结合动力学。将20nM的每种mAb(TS-M3、TS-M4和亲本抗-PD-1mAb)上样到抗人IgG捕获生物传感器上。通过将生物传感器放置在含有3倍连续稀释的分析物(0.3nM至235nM)的孔中5分钟来实现分析物(PD-1-His)的结合。在将生物传感器单独转移到动力学缓冲液中并监测干涉测量信号10分钟后，测量结合复合物的解离。使用包含所有测试浓度的1:1结合全局拟合模型拟合观察到的开和关速率(Ka和Kd)，并计算平衡结合常数(KD)。该分析的结果如下表2所示。
使用Octet系统(Pall ForteBio LLC)进行生物层干涉测量(BLI)来表征抗体对His标记的人VEGF 165(R&D)的结合动力学。将20nM的每种mAb(TS-M3、TS-M4和贝伐单抗)上样到抗人IgG捕获生物传感器上。通过将生物传感器置于含有3倍连续稀释的分析物(0.3nM至235nM)的孔中5分钟来实现VEGF 165-His的结合。在将生物传感器单独转移到动力学缓冲液中并监测干涉测量信号10分钟后，测量结合复合物的解离。得到的传感图显示TS-M3、TS-M4或贝伐单抗与VEGF 165(R&D Systems)的相互作用。拟合用红线表示，而传感图用蓝色表示每个浓度。虚线划分结合和解离阶段。在图19中，X轴表示结合(快速)和解离(非常慢)阶段的时间(以秒为单位)，而Y轴表示传感器上结合信号，以nM为单位。
与实施例6中的阻断数据和实施例7中的结合数据一致，发现TS-M3(图19A)和TS-M4(图19B)显示出与阳性对照贝伐单抗mAb(图19C)相似的结合和解离动力学的传感图，表明相当的人VEGF结合亲和力。
实施例9：三特异性抗体挽救PD-L1介导的人T细胞功能的抑制
测试三特异性抗体挽救PD-L1介导的人T细胞功能抑制的能力，作为IFN-γ产生的函数(图20A)或作为T细胞增殖指数的函数(图20B)。在图20A中，将新鲜PBMC(Bioreclamation Inc.)与2μg/ml葡萄球菌肠毒素B(SEB，Toxin Technology Inc.)一起孵育3天。加入30,000个NCI-H358人肺腺癌细胞(ATCC)以提供抑制性PD-L1信号。加入64nM抗PD-1mAb(Nivolumab，“Nivo”)、三特异性抗体(TS10、TS1、TS2、TS3和TS4)或同型对照Ab以阻断抑制性PD-L1活性，从而激活T细胞。收集上清液，通过ELISA测量IFN-γ的产生。在图20B中，用抗CD3(Bio-X-cell)和抗CD28(Biolegend)预活化新鲜PBMC(Bioreclamation Inc.)6天。休眠后，用1μg/ml SEB活化100,000个CellTrace Far Red(ThermoFisher)标记的PBMC4天。加入20,000个NCI-H358细胞以提供抑制性PD-L1信号。加入64nM的抗PD-1mAb(Nivolumab)、三特异性抗体(TS10、TS1、TS2和TS3)或同型对照Ab以阻断抑制性PD-L1信号。基于门控CD3+T细胞上CellTrace Far Red信号的平均荧光强度降低的减低来计算T细胞增殖指数。
这些分析的结果显示，作为IFN-γ产生的函数(图20A)和作为T细胞增殖指数的函数(图20B)，三特异性抗体挽救PD-L1介导的人T细胞功能的抑制，表明三特异性抗体与抗PD-1对照抗体具有相似的基于细胞的功能。
以上描述是为了教导本领域普通技术人员如何实施本发明，并非旨在详述对于当本领域技术人员阅读说明书时变得显而易见的所有这些明显的修改和变化。但是，所有这些明显的修改和变化都意图包括在由以下权利要求限定的本发明的范围内。权利要求旨在以任何顺序覆盖要求保护的组件和步骤，其有效地满足其预期的目标，除非上下文具体指明相反。
序列表
<110> 源晟生物制药股份有限公司
<120> 用于癌症治疗的三特异性抑制剂
<130> 229468
<150> US 62/312,965
<151> 2016-03-24
<160> 47
<170> PatentIn 版本3.5
<210> 1
<211> 54
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 1
Ala Gln Gln Glu Glu Cys Glu Trp Asp Pro Trp Thr Cys Glu His Met
1 5 10 15
Gly Ser Gly Ser Ala Thr Gly Gly Ser Gly Ser Thr Ala Ser Ser Gly
20 25 30
Ser Gly Ser Ala Thr His Gln Glu Glu Cys Glu Trp Asp Pro Trp Thr
35 40 45
Cys Glu His Met Leu Glu
50
<210> 2
<211> 286
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 2
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
1 5 10 15
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
20 25 30
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
35 40 45
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
50 55 60
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
65 70 75 80
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
85 90 95
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
100 105 110
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
115 120 125
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
130 135 140
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
145 150 155 160
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
165 170 175
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
180 185 190
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
195 200 205
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
210 215 220
Pro Gly Lys Gly Gly Gly Gly Gly Ala Gln Gln Glu Glu Cys Glu Trp
225 230 235 240
Asp Pro Trp Thr Cys Glu His Met Gly Ser Gly Ser Ala Thr Gly Gly
245 250 255
Ser Gly Ser Thr Ala Ser Ser Gly Ser Gly Ser Ala Thr His Gln Glu
260 265 270
Glu Cys Glu Trp Asp Pro Trp Thr Cys Glu His Met Leu Glu
275 280 285
<210> 3
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 3
Glu Thr Phe Leu Ser Thr Asn Lys Leu Glu Asn Gln
1 5 10
<210> 4
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<220>
<221> MOD_RES
<222> (2)..(2)
<223> 乙酰化
<220>
<221> MOD_RES
<222> (9)..(9)
<223> 乙酰化
<220>
<221> misc_feature
<222> (11)..(12)
<223> 0P: 肽和AZD接头之间没有PEG单元
<400> 4
Gln Lys Tyr Gln Pro Leu Asp Glu Lys Asp Lys Thr Leu Tyr Asp Gln
1 5 10 15
Phe Met Leu Gln Gln Gly
20
<210> 5
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> DFB: 1,5-二氟苯甲酰
<220>
<221> misc_feature
<222> (11)..(12)
<223> 0P: 肽和AZD接头之间没有PEG单元
<400> 5
Thr Asn Phe Met Pro Met Asp Asp Leu Glu Lys Arg Leu Tyr Glu Gln
1 5 10 15
Phe Ile Leu Gln Gln Gly
20
<210> 6
<211> 453
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 6
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Ala Asp Phe
50 55 60
Lys Arg Arg Phe Thr Phe Ser Leu Asp Thr Ser Lys Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Tyr Pro His Tyr Tyr Gly Ser Ser His Trp Tyr Phe Asp Val
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly
115 120 125
Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly
130 135 140
Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val
145 150 155 160
Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe
165 170 175
Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val
180 185 190
Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val
195 200 205
Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys
210 215 220
Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu
225 230 235 240
Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
245 250 255
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
260 265 270
Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
275 280 285
Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser
290 295 300
Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu
305 310 315 320
Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala
325 330 335
Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro
340 345 350
Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln
355 360 365
Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala
370 375 380
Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr
385 390 395 400
Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu
405 410 415
Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
420 425 430
Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser
435 440 445
Leu Ser Pro Gly Lys
450
<210> 7
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 7
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Val Leu Ile
35 40 45
Tyr Phe Thr Ser Ser Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Thr Val Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 8
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 8
Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr Gly Met Asn
1 5 10
<210> 9
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 9
Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Ala Asp Phe Lys
1 5 10 15
Arg
<210> 10
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 10
Tyr Pro His Tyr Tyr Gly Ser Ser His Trp Tyr Phe Asp Val
1 5 10
<210> 11
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 11
Ser Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr Leu Asn
1 5 10
<210> 12
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 12
Gln Gln Tyr Ser Thr Val Pro Trp Thr Phe
1 5 10
<210> 13
<211> 440
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 13
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Asp Cys Lys Ala Ser Gly Ile Thr Phe Ser Asn Ser
20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Lys Arg Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Phe
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Thr Asn Asp Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser
100 105 110
Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser
115 120 125
Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp
130 135 140
Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr
145 150 155 160
Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr
165 170 175
Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys
180 185 190
Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp
195 200 205
Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala
210 215 220
Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
225 230 235 240
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
245 250 255
Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val
260 265 270
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
275 280 285
Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
290 295 300
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly
305 310 315 320
Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
325 330 335
Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr
340 345 350
Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
355 360 365
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
370 375 380
Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr
385 390 395 400
Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe
405 410 415
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
420 425 430
Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
435 440
<210> 14
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 14
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Asp Cys Lys Ala Ser Gly Ile Thr Phe Ser Asn Ser
20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Lys Arg Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Phe
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Thr Asn Asp Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser
100 105 110
Ser
<210> 15
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 15
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Ser Asn Trp Pro Arg
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 16
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 16
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Ser Asn Trp Pro Arg
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 17
<211> 448
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 17
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Ser
20 25 30
Trp Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Trp Ile Ser Pro Tyr Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg His Trp Pro Gly Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
115 120 125
Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly
130 135 140
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
145 150 155 160
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
165 170 175
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
180 185 190
Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser
195 200 205
Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr
210 215 220
His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser
225 230 235 240
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
245 250 255
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro
260 265 270
Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
275 280 285
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Ala Ser Thr Tyr Arg Val Val
290 295 300
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
305 310 315 320
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr
325 330 335
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
340 345 350
Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys
355 360 365
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
370 375 380
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
385 390 395 400
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
405 410 415
Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
420 425 430
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
435 440 445
<210> 18
<211> 227
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 18
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
1 5 10 15
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
20 25 30
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
35 40 45
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
50 55 60
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Ala Ser Thr Tyr
65 70 75 80
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
85 90 95
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
100 105 110
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
115 120 125
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser
130 135 140
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
145 150 155 160
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
165 170 175
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
180 185 190
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
195 200 205
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
210 215 220
Pro Gly Lys
225
<210> 19
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 19
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Leu Tyr His Pro Ala
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 20
<211> 628
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的: TS-M1, 重链
<400> 20
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Asp Cys Lys Ala Ser Gly Ile Thr Phe Ser Asn Ser
20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Lys Arg Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Phe
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Thr Asn Asp Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser
100 105 110
Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly
115 120 125
Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser
130 135 140
Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro
145 150 155 160
Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu
165 170 175
Pro Thr Tyr Ala Ala Asp Phe Lys Arg Arg Phe Thr Phe Ser Leu Asp
180 185 190
Thr Ser Lys Ser Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu
195 200 205
Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Lys Tyr Pro His Tyr Tyr Gly Ser
210 215 220
Ser His Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val
225 230 235 240
Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys
245 250 255
Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys
260 265 270
Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu
275 280 285
Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu
290 295 300
Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr
305 310 315 320
Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val
325 330 335
Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro
340 345 350
Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
355 360 365
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
370 375 380
Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr
385 390 395 400
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
405 410 415
Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
420 425 430
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
435 440 445
Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln
450 455 460
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met
465 470 475 480
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro
485 490 495
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn
500 505 510
Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
515 520 525
Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val
530 535 540
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln
545 550 555 560
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys Gly Gly Gly Gly Gly Ala Gln
565 570 575
Gln Glu Glu Cys Glu Trp Asp Pro Trp Thr Cys Glu His Met Gly Ser
580 585 590
Gly Ser Ala Thr Gly Gly Ser Gly Ser Thr Ala Ser Ser Gly Ser Gly
595 600 605
Ser Ala Thr His Gln Glu Glu Cys Glu Trp Asp Pro Trp Thr Cys Glu
610 615 620
His Met Leu Glu
625
<210> 21
<211> 327
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的: TS-M1, 轻链
<400> 21
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Ser Asn Trp Pro Arg
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val
115 120 125
Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn
130 135 140
Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Val Leu
145 150 155 160
Ile Tyr Phe Thr Ser Ser Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser
165 170 175
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln
180 185 190
Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Thr Val Pro
195 200 205
Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala
210 215 220
Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser
225 230 235 240
Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu
245 250 255
Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser
260 265 270
Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu
275 280 285
Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val
290 295 300
Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys
305 310 315 320
Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
325
<210> 22
<211> 628
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的: TS-M2, 重链
<400> 22
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Ala Asp Phe
50 55 60
Lys Arg Arg Phe Thr Phe Ser Leu Asp Thr Ser Lys Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Tyr Pro His Tyr Tyr Gly Ser Ser His Trp Tyr Phe Asp Val
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly
115 120 125
Pro Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly
130 135 140
Arg Ser Leu Arg Leu Asp Cys Lys Ala Ser Gly Ile Thr Phe Ser Asn
145 150 155 160
Ser Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
165 170 175
Val Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Lys Arg Tyr Tyr Ala Asp Ser
180 185 190
Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu
195 200 205
Phe Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
210 215 220
Cys Ala Thr Asn Asp Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val
225 230 235 240
Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys
245 250 255
Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys
260 265 270
Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu
275 280 285
Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu
290 295 300
Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr
305 310 315 320
Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val
325 330 335
Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro
340 345 350
Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
355 360 365
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
370 375 380
Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr
385 390 395 400
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
405 410 415
Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
420 425 430
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
435 440 445
Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln
450 455 460
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met
465 470 475 480
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro
485 490 495
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn
500 505 510
Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
515 520 525
Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val
530 535 540
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln
545 550 555 560
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys Gly Gly Gly Gly Gly Ala Gln
565 570 575
Gln Glu Glu Cys Glu Trp Asp Pro Trp Thr Cys Glu His Met Gly Ser
580 585 590
Gly Ser Ala Thr Gly Gly Ser Gly Ser Thr Ala Ser Ser Gly Ser Gly
595 600 605
Ser Ala Thr His Gln Glu Glu Cys Glu Trp Asp Pro Trp Thr Cys Glu
610 615 620
His Met Leu Glu
625
<210> 23
<211> 327
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的: TS-M2, 轻链
<400> 23
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Val Leu Ile
35 40 45
Tyr Phe Thr Ser Ser Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Thr Val Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro
115 120 125
Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser
130 135 140
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
145 150 155 160
Ile Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser
165 170 175
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu
180 185 190
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Ser Asn Trp Pro
195 200 205
Arg Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala
210 215 220
Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser
225 230 235 240
Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu
245 250 255
Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser
260 265 270
Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu
275 280 285
Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val
290 295 300
Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys
305 310 315 320
Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
325
<210> 24
<211> 622
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的: TS-M3, 重链
<400> 24
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Ser Asn Trp Pro Arg
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly
115 120 125
Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn
130 135 140
Tyr Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
145 150 155 160
Val Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Ala Asp
165 170 175
Phe Lys Arg Arg Phe Thr Phe Ser Leu Asp Thr Ser Lys Ser Thr Ala
180 185 190
Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
195 200 205
Cys Ala Lys Tyr Pro His Tyr Tyr Gly Ser Ser His Trp Tyr Phe Asp
210 215 220
Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys
225 230 235 240
Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu
245 250 255
Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro
260 265 270
Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr
275 280 285
Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val
290 295 300
Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn
305 310 315 320
Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser
325 330 335
Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly
340 345 350
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
355 360 365
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln
370 375 380
Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
385 390 395 400
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr
405 410 415
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
420 425 430
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile
435 440 445
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
450 455 460
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser
465 470 475 480
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
485 490 495
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
500 505 510
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val
515 520 525
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
530 535 540
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
545 550 555 560
Leu Gly Lys Gly Gly Gly Gly Gly Ala Gln Gln Glu Glu Cys Glu Trp
565 570 575
Asp Pro Trp Thr Cys Glu His Met Gly Ser Gly Ser Ala Thr Gly Gly
580 585 590
Ser Gly Ser Thr Ala Ser Ser Gly Ser Gly Ser Ala Thr His Gln Glu
595 600 605
Glu Cys Glu Trp Asp Pro Trp Thr Cys Glu His Met Leu Glu
610 615 620
<210> 25
<211> 333
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的: TS-M3, 轻链
<400> 25
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Asp Cys Lys Ala Ser Gly Ile Thr Phe Ser Asn Ser
20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Lys Arg Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Phe
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Thr Asn Asp Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser
100 105 110
Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser
115 120 125
Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala
130 135 140
Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly
145 150 155 160
Lys Ala Pro Lys Val Leu Ile Tyr Phe Thr Ser Ser Leu His Ser Gly
165 170 175
Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu
180 185 190
Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln
195 200 205
Gln Tyr Ser Thr Val Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu
210 215 220
Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser
225 230 235 240
Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn
245 250 255
Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala
260 265 270
Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys
275 280 285
Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp
290 295 300
Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu
305 310 315 320
Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
325 330
<210> 26
<211> 612
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的: TS-M4, 重链
<400> 26
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Val Leu Ile
35 40 45
Tyr Phe Thr Ser Ser Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Thr Val Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly
115 120 125
Arg Ser Leu Arg Leu Asp Cys Lys Ala Ser Gly Ile Thr Phe Ser Asn
130 135 140
Ser Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
145 150 155 160
Val Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Lys Arg Tyr Tyr Ala Asp Ser
165 170 175
Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu
180 185 190
Phe Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
195 200 205
Cys Ala Thr Asn Asp Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val
210 215 220
Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys
225 230 235 240
Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys
245 250 255
Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu
260 265 270
Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu
275 280 285
Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr
290 295 300
Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val
305 310 315 320
Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro
325 330 335
Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
340 345 350
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
355 360 365
Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr
370 375 380
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
385 390 395 400
Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
405 410 415
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
420 425 430
Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln
435 440 445
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met
450 455 460
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro
465 470 475 480
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn
485 490 495
Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
500 505 510
Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val
515 520 525
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln
530 535 540
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys Gly Gly Gly Gly Gly Ala Gln
545 550 555 560
Gln Glu Glu Cys Glu Trp Asp Pro Trp Thr Cys Glu His Met Gly Ser
565 570 575
Gly Ser Ala Thr Gly Gly Ser Gly Ser Thr Ala Ser Ser Gly Ser Gly
580 585 590
Ser Ala Thr His Gln Glu Glu Cys Glu Trp Asp Pro Trp Thr Cys Glu
595 600 605
His Met Leu Glu
610
<210> 27
<211> 343
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的: TS-M4, 轻链
<400> 27
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Ala Asp Phe
50 55 60
Lys Arg Arg Phe Thr Phe Ser Leu Asp Thr Ser Lys Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Tyr Pro His Tyr Tyr Gly Ser Ser His Trp Tyr Phe Asp Val
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly
115 120 125
Pro Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro
130 135 140
Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser
145 150 155 160
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
165 170 175
Ile Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser
180 185 190
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu
195 200 205
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Ser Asn Trp Pro
210 215 220
Arg Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala
225 230 235 240
Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser
245 250 255
Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu
260 265 270
Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser
275 280 285
Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu
290 295 300
Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val
305 310 315 320
Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys
325 330 335
Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
340
<210> 28
<211> 642
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的: TS-M5, 重链
<400> 28
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Asp Cys Lys Ala Ser Gly Ile Thr Phe Ser Asn Ser
20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Lys Arg Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Phe
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Thr Asn Asp Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser
100 105 110
Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser
115 120 125
Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp
130 135 140
Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr
145 150 155 160
Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr
165 170 175
Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys
180 185 190
Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp
195 200 205
Lys Arg Val Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln
210 215 220
Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg
225 230 235 240
Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr Gly Met Asn
245 250 255
Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Gly Trp Ile
260 265 270
Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Ala Asp Phe Lys Arg Arg
275 280 285
Phe Thr Phe Ser Leu Asp Thr Ser Lys Ser Thr Ala Tyr Leu Gln Met
290 295 300
Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Lys Tyr
305 310 315 320
Pro His Tyr Tyr Gly Ser Ser His Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln
325 330 335
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
340 345 350
Gly Ser Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
355 360 365
Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
370 375 380
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
385 390 395 400
Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp
405 410 415
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe
420 425 430
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
435 440 445
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu
450 455 460
Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
465 470 475 480
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys
485 490 495
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
500 505 510
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
515 520 525
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
530 535 540
Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser
545 550 555 560
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
565 570 575
Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys Gly Gly Gly Gly Gly Ala Gln Gln Glu
580 585 590
Glu Cys Glu Trp Asp Pro Trp Thr Cys Glu His Met Gly Ser Gly Ser
595 600 605
Ala Thr Gly Gly Ser Gly Ser Thr Ala Ser Ser Gly Ser Gly Ser Ala
610 615 620
Thr His Gln Glu Glu Cys Glu Trp Asp Pro Trp Thr Cys Glu His Met
625 630 635 640
Leu Glu
<210> 29
<211> 331
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的: TS-M5, 轻链
<400> 29
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Ser Asn Trp Pro Arg
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
210 215 220
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
225 230 235 240
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr
245 250 255
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Val Leu Ile
260 265 270
Tyr Phe Thr Ser Ser Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
275 280 285
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
290 295 300
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Thr Val Pro Trp
305 310 315 320
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
325 330
<210> 30
<211> 642
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的: TS-M6, 重链
<400> 30
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Ala Asp Phe
50 55 60
Lys Arg Arg Phe Thr Phe Ser Leu Asp Thr Ser Lys Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Tyr Pro His Tyr Tyr Gly Ser Ser His Trp Tyr Phe Asp Val
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly
115 120 125
Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser
130 135 140
Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val
145 150 155 160
Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe
165 170 175
Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val
180 185 190
Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val
195 200 205
Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Gly Gly Gly
210 215 220
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly
225 230 235 240
Gly Val Val Gln Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Asp Cys Lys Ala Ser
245 250 255
Gly Ile Thr Phe Ser Asn Ser Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro
260 265 270
Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Lys
275 280 285
Arg Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp
290 295 300
Asn Ser Lys Asn Thr Leu Phe Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu
305 310 315 320
Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Thr Asn Asp Asp Tyr Trp Gly Gln
325 330 335
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
340 345 350
Gly Ser Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
355 360 365
Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
370 375 380
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
385 390 395 400
Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp
405 410 415
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe
420 425 430
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
435 440 445
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu
450 455 460
Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
465 470 475 480
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys
485 490 495
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
500 505 510
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
515 520 525
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
530 535 540
Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser
545 550 555 560
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
565 570 575
Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys Gly Gly Gly Gly Gly Ala Gln Gln Glu
580 585 590
Glu Cys Glu Trp Asp Pro Trp Thr Cys Glu His Met Gly Ser Gly Ser
595 600 605
Ala Thr Gly Gly Ser Gly Ser Thr Ala Ser Ser Gly Ser Gly Ser Ala
610 615 620
Thr His Gln Glu Glu Cys Glu Trp Asp Pro Trp Thr Cys Glu His Met
625 630 635 640
Leu Glu
<210> 31
<211> 331
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的: TS-M6, 轻链
<400> 31
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Val Leu Ile
35 40 45
Tyr Phe Thr Ser Ser Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Thr Val Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
210 215 220
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
225 230 235 240
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr
245 250 255
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
260 265 270
Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
275 280 285
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro
290 295 300
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Ser Asn Trp Pro Arg
305 310 315 320
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
325 330
<210> 32
<211> 499
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的: TS-M7, 重链
<400> 32
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Asp Cys Lys Ala Ser Gly Ile Thr Phe Ser Asn Ser
20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Lys Arg Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Phe
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Thr Asn Asp Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser
100 105 110
Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser
115 120 125
Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp
130 135 140
Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr
145 150 155 160
Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr
165 170 175
Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys
180 185 190
Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp
195 200 205
Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala
210 215 220
Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
225 230 235 240
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
245 250 255
Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val
260 265 270
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
275 280 285
Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
290 295 300
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly
305 310 315 320
Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
325 330 335
Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr
340 345 350
Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
355 360 365
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
370 375 380
Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr
385 390 395 400
Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe
405 410 415
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
420 425 430
Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys Gly Gly Gly Gly Gly Ala Gln Gln
435 440 445
Glu Glu Cys Glu Trp Asp Pro Trp Thr Cys Glu His Met Gly Ser Gly
450 455 460
Ser Ala Thr Gly Gly Ser Gly Ser Thr Ala Ser Ser Gly Ser Gly Ser
465 470 475 480
Ala Thr His Gln Glu Glu Cys Glu Trp Asp Pro Trp Thr Cys Glu His
485 490 495
Met Leu Glu
<210> 33
<211> 469
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的: TS-M7, 轻链
<400> 33
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Ser Asn Trp Pro Arg
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
210 215 220
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
225 230 235 240
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
245 250 255
Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
260 265 270
Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Ala Asp Phe
275 280 285
Lys Arg Arg Phe Thr Phe Ser Leu Asp Thr Ser Lys Ser Thr Ala Tyr
290 295 300
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
305 310 315 320
Ala Lys Tyr Pro His Tyr Tyr Gly Ser Ser His Trp Tyr Phe Asp Val
325 330 335
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser
340 345 350
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln
355 360 365
Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr
370 375 380
Cys Ser Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln
385 390 395 400
Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Val Leu Ile Tyr Phe Thr Ser Ser Leu
405 410 415
His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp
420 425 430
Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr
435 440 445
Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Thr Val Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr
450 455 460
Lys Val Glu Ile Lys
465
<210> 34
<211> 509
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的: TS-M8, 重链
<400> 34
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Ala Asp Phe
50 55 60
Lys Arg Arg Phe Thr Phe Ser Leu Asp Thr Ser Lys Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Tyr Pro His Tyr Tyr Gly Ser Ser His Trp Tyr Phe Asp Val
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly
115 120 125
Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser
130 135 140
Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val
145 150 155 160
Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe
165 170 175
Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val
180 185 190
Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val
195 200 205
Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys
210 215 220
Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly
225 230 235 240
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
245 250 255
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu
260 265 270
Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
275 280 285
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg
290 295 300
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
305 310 315 320
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu
325 330 335
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
340 345 350
Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
355 360 365
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
370 375 380
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
385 390 395 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp
405 410 415
Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
420 425 430
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu
435 440 445
Gly Lys Gly Gly Gly Gly Gly Ala Gln Gln Glu Glu Cys Glu Trp Asp
450 455 460
Pro Trp Thr Cys Glu His Met Gly Ser Gly Ser Ala Thr Gly Gly Ser
465 470 475 480
Gly Ser Thr Ala Ser Ser Gly Ser Gly Ser Ala Thr His Gln Glu Glu
485 490 495
Cys Glu Trp Asp Pro Trp Thr Cys Glu His Met Leu Glu
500 505
<210> 35
<211> 459
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的: TS-M8, 轻链
<400> 35
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Val Leu Ile
35 40 45
Tyr Phe Thr Ser Ser Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Thr Val Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
210 215 220
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
225 230 235 240
Ser Leu Arg Leu Asp Cys Lys Ala Ser Gly Ile Thr Phe Ser Asn Ser
245 250 255
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
260 265 270
Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Lys Arg Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
275 280 285
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Phe
290 295 300
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
305 310 315 320
Ala Thr Asn Asp Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser
325 330 335
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
340 345 350
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
355 360 365
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr
370 375 380
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
385 390 395 400
Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
405 410 415
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro
420 425 430
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Ser Asn Trp Pro Arg
435 440 445
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
450 455
<210> 36
<211> 695
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的: TS-M9, 重链
<400> 36
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Asp Cys Lys Ala Ser Gly Ile Thr Phe Ser Asn Ser
20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Lys Arg Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Phe
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Thr Asn Asp Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser
100 105 110
Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser
115 120 125
Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp
130 135 140
Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr
145 150 155 160
Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr
165 170 175
Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys
180 185 190
Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp
195 200 205
Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala
210 215 220
Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
225 230 235 240
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
245 250 255
Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val
260 265 270
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
275 280 285
Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
290 295 300
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly
305 310 315 320
Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
325 330 335
Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr
340 345 350
Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
355 360 365
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
370 375 380
Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr
385 390 395 400
Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe
405 410 415
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
420 425 430
Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
435 440 445
Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro
450 455 460
Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr
465 470 475 480
Asn Tyr Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu
485 490 495
Trp Val Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Ala
500 505 510
Asp Phe Lys Arg Arg Phe Thr Phe Ser Leu Asp Thr Ser Lys Ser Thr
515 520 525
Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
530 535 540
Tyr Cys Ala Lys Tyr Pro His Tyr Tyr Gly Ser Ser His Trp Tyr Phe
545 550 555 560
Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly
565 570 575
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met
580 585 590
Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr
595 600 605
Ile Thr Cys Ser Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr Leu Asn Trp Tyr
610 615 620
Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Val Leu Ile Tyr Phe Thr Ser
625 630 635 640
Ser Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly
645 650 655
Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala
660 665 670
Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Thr Val Pro Trp Thr Phe Gly Gln
675 680 685
Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
690 695
<210> 37
<211> 273
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的: TS-M9, 轻链
<400> 37
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Ser Asn Trp Pro Arg
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys Gly Gly Gly Gly Gly Ala Gln Gln Glu Glu
210 215 220
Cys Glu Trp Asp Pro Trp Thr Cys Glu His Met Gly Ser Gly Ser Ala
225 230 235 240
Thr Gly Gly Ser Gly Ser Thr Ala Ser Ser Gly Ser Gly Ser Ala Thr
245 250 255
His Gln Glu Glu Cys Glu Trp Asp Pro Trp Thr Cys Glu His Met Leu
260 265 270
Glu
<210> 38
<211> 695
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的: TS-M10, 重链
<400> 38
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Ala Asp Phe
50 55 60
Lys Arg Arg Phe Thr Phe Ser Leu Asp Thr Ser Lys Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Tyr Pro His Tyr Tyr Gly Ser Ser His Trp Tyr Phe Asp Val
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly
115 120 125
Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser
130 135 140
Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val
145 150 155 160
Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe
165 170 175
Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val
180 185 190
Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val
195 200 205
Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys
210 215 220
Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly
225 230 235 240
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
245 250 255
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu
260 265 270
Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
275 280 285
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg
290 295 300
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
305 310 315 320
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu
325 330 335
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
340 345 350
Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
355 360 365
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
370 375 380
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
385 390 395 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp
405 410 415
Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
420 425 430
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu
435 440 445
Gly Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu
450 455 460
Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu
465 470 475 480
Asp Cys Lys Ala Ser Gly Ile Thr Phe Ser Asn Ser Gly Met His Trp
485 490 495
Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Val Ile Trp
500 505 510
Tyr Asp Gly Ser Lys Arg Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe
515 520 525
Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Phe Leu Gln Met Asn
530 535 540
Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Thr Asn Asp
545 550 555 560
Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly
565 570 575
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Ile Val Leu
580 585 590
Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr
595 600 605
Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr Leu Ala Trp Tyr
610 615 620
Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Asp Ala Ser
625 630 635 640
Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly
645 650 655
Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala
660 665 670
Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Ser Asn Trp Pro Arg Thr Phe Gly Gln
675 680 685
Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
690 695
<210> 39
<211> 273
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的: TS-M10, 轻链
<400> 39
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Val Leu Ile
35 40 45
Tyr Phe Thr Ser Ser Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Thr Val Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys Gly Gly Gly Gly Gly Ala Gln Gln Glu Glu
210 215 220
Cys Glu Trp Asp Pro Trp Thr Cys Glu His Met Gly Ser Gly Ser Ala
225 230 235 240
Thr Gly Gly Ser Gly Ser Thr Ala Ser Ser Gly Ser Gly Ser Ala Thr
245 250 255
His Gln Glu Glu Cys Glu Trp Asp Pro Trp Thr Cys Glu His Met Leu
260 265 270
Glu
<210> 40
<211> 509
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 40
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Ala Asp Phe
50 55 60
Lys Arg Arg Phe Thr Phe Ser Leu Asp Thr Ser Lys Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Tyr Pro His Tyr Tyr Gly Ser Ser His Trp Tyr Phe Asp Val
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly
115 120 125
Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser
130 135 140
Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val
145 150 155 160
Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe
165 170 175
Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val
180 185 190
Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val
195 200 205
Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys
210 215 220
Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly
225 230 235 240
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
245 250 255
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu
260 265 270
Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
275 280 285
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg
290 295 300
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
305 310 315 320
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu
325 330 335
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
340 345 350
Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
355 360 365
Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
370 375 380
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
385 390 395 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp
405 410 415
Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
420 425 430
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu
435 440 445
Gly Lys Gly Gly Gly Gly Gly Ala Gln Gln Glu Glu Cys Glu Trp Asp
450 455 460
Pro Trp Thr Cys Glu His Met Gly Ser Gly Ser Ala Thr Gly Gly Ser
465 470 475 480
Gly Ser Thr Ala Ser Ser Gly Ser Gly Ser Ala Thr His Gln Glu Glu
485 490 495
Cys Glu Trp Asp Pro Trp Thr Cys Glu His Met Leu Glu
500 505
<210> 41
<211> 499
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 41
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Asp Cys Lys Ala Ser Gly Ile Thr Phe Ser Asn Ser
20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Lys Arg Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Phe
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Thr Asn Asp Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser
100 105 110
Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser
115 120 125
Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp
130 135 140
Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr
145 150 155 160
Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr
165 170 175
Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys
180 185 190
Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp
195 200 205
Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala
210 215 220
Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
225 230 235 240
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
245 250 255
Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val
260 265 270
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
275 280 285
Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
290 295 300
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly
305 310 315 320
Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
325 330 335
Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr
340 345 350
Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
355 360 365
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
370 375 380
Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr
385 390 395 400
Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe
405 410 415
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
420 425 430
Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys Gly Gly Gly Gly Gly Ala Gln Gln
435 440 445
Glu Glu Cys Glu Trp Asp Pro Trp Thr Cys Glu His Met Gly Ser Gly
450 455 460
Ser Ala Thr Gly Gly Ser Gly Ser Thr Ala Ser Ser Gly Ser Gly Ser
465 470 475 480
Ala Thr His Gln Glu Glu Cys Glu Trp Asp Pro Trp Thr Cys Glu His
485 490 495
Met Leu Glu
<210> 42
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 42
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Val Leu Ile
35 40 45
Tyr Phe Thr Ser Ser Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Thr Val Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 43
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 43
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Ser Asn Trp Pro Arg
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 44
<211> 512
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 44
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Ala Asp Phe
50 55 60
Lys Arg Arg Phe Thr Phe Ser Leu Asp Thr Ser Lys Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Tyr Pro His Tyr Tyr Gly Ser Ser His Trp Tyr Phe Asp Val
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly
115 120 125
Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly
130 135 140
Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val
145 150 155 160
Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe
165 170 175
Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Glu Ser Val Val
180 185 190
Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val
195 200 205
Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys
210 215 220
Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu
225 230 235 240
Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
245 250 255
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
260 265 270
Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
275 280 285
Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Cys Glu Glu Gln Tyr Gly Ser
290 295 300
Thr Tyr Arg Cys Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu
305 310 315 320
Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala
325 330 335
Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro
340 345 350
Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Lys Glu Met Thr Lys Asn Gln
355 360 365
Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala
370 375 380
Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr
385 390 395 400
Pro Pro Val Leu Lys Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu
405 410 415
Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
420 425 430
Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser
435 440 445
Leu Ser Pro Gly Lys Gly Gly Gly Gly Gly Ala Gln Gln Glu Glu Cys
450 455 460
Glu Trp Asp Pro Trp Thr Cys Glu His Met Gly Ser Gly Ser Ala Thr
465 470 475 480
Gly Gly Ser Gly Ser Thr Ala Ser Ser Gly Ser Gly Ser Ala Thr His
485 490 495
Gln Glu Glu Cys Glu Trp Asp Pro Trp Thr Cys Glu His Met Leu Glu
500 505 510
<210> 45
<211> 502
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 45
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Asp Cys Lys Ala Ser Gly Ile Thr Phe Ser Asn Ser
20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Lys Arg Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Phe
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Thr Asn Asp Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser
100 105 110
Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser
115 120 125
Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp
130 135 140
Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr
145 150 155 160
Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr
165 170 175
Ser Leu Lys Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln
180 185 190
Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp
195 200 205
Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro
210 215 220
Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro
225 230 235 240
Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr
245 250 255
Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn
260 265 270
Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Cys
275 280 285
Glu Glu Gln Tyr Gly Ser Thr Tyr Arg Cys Val Ser Val Leu Thr Val
290 295 300
Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser
305 310 315 320
Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys
325 330 335
Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu
340 345 350
Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe
355 360 365
Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu
370 375 380
Asn Asn Tyr Asp Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe
385 390 395 400
Phe Leu Tyr Ser Asp Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly
405 410 415
Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr
420 425 430
Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Gly Gly Gly Gly Gly
435 440 445
Ala Gln Gln Glu Glu Cys Glu Trp Asp Pro Trp Thr Cys Glu His Met
450 455 460
Gly Ser Gly Ser Ala Thr Gly Gly Ser Gly Ser Thr Ala Ser Ser Gly
465 470 475 480
Ser Gly Ser Ala Thr His Gln Glu Glu Cys Glu Trp Asp Pro Trp Thr
485 490 495
Cys Glu His Met Leu Glu
500
<210> 46
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 46
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Val Leu Ile
35 40 45
Tyr Phe Thr Ser Ser Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Thr Val Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 47
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 47
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Ser Asn Trp Pro Arg
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210

Claims (6)

1.一种三特异性抗体，包括：
第一靶向结构域，其特异性结合人PD-1；
第二靶向结构域，其阻断人VEGF-A与VEGFR-2的结合；和
第三靶向结构域，其特异性结合人Tie2酪氨酸激酶受体，
其中，所述三特异性抗体包括选自以下各组的重链/轻链的组合：SEQ ID NO：20和SEQID NO：21、SEQ ID NO：22和SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24和SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：26和SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：38和SEQ ID NO：39，以及其中，所述三特异性抗体表现出与nivolumab在同一数量级的对人PD-1的结合活性，与贝伐单抗在同一数量级的对VEGF的结合活性，以及与trebananib在同一数量级的对人Ang-2的结合活性。
2.如权利要求1所述的三特异性抗体，其中，所述三特异性抗体包含SEQ ID NO：24和SEQ ID NO：25。
3.如权利要求1所述的三特异性抗体，其中，所述三特异性抗体包含SEQ ID NO：26和SEQ ID NO：27。
4.如权利要求1所述的三特异性抗体，其中，所述三特异性抗体包含SEQ ID NO：38和SEQ ID NO：39。
5.如权利要求1所述的三特异性抗体，其中，所述三特异性抗体包含SEQ ID NO：20和SEQ ID NO：21。
6.如权利要求1所述的三特异性抗体，其中，所述三特异性抗体包含SEQ ID NO：22和SEQ ID NO：23。
CN201780025361.3A 2016-03-24 2017-03-23 用于癌症治疗的三特异性抑制剂 Active CN109069638B (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201662312965P 2016-03-24 2016-03-24
US62/312,965 2016-03-24
PCT/US2017/023867 WO2017165681A1 (en) 2016-03-24 2017-03-23 Trispecific inhibitors for cancer treatment

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN109069638A CN109069638A (zh) 2018-12-21
CN109069638B true CN109069638B (zh) 2022-03-29

Family

ID=59897772

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201780025361.3A Active CN109069638B (zh) 2016-03-24 2017-03-23 用于癌症治疗的三特异性抑制剂

Country Status (4)

Country Link
US (2) US10894823B2 (zh)
EP (1) EP3432927A4 (zh)
CN (1) CN109069638B (zh)
WO (1) WO2017165681A1 (zh)

Families Citing this family (31)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU2007237096C1 (en) 2006-04-07 2012-12-13 EyePoint Pharmaceuticals, Inc. Antibodies that bind human protein tyrosine phosphatase beta (HPTPbeta) and uses thereof
AU2012323856B2 (en) 2011-10-13 2017-05-25 EyePoint Pharmaceuticals, Inc. Methods for treating Vascular Leak Syndrome and cancer
US9840553B2 (en) 2014-06-28 2017-12-12 Kodiak Sciences Inc. Dual PDGF/VEGF antagonists
IL290457B1 (en) 2015-12-30 2024-10-01 Kodiak Sciences Inc Antibodies and their conjugates
CN109069638B (zh) 2016-03-24 2022-03-29 璟尚生物制药公司 用于癌症治疗的三特异性抑制剂
WO2018014260A1 (en) 2016-07-20 2018-01-25 Nanjing Legend Biotech Co., Ltd. Multispecific antigen binding proteins and methods of use thereof
BR112019001206A2 (pt) 2016-07-20 2019-06-25 Aerpio Therapeutics Inc anticorpos monoclonais humanizados que visam ve-ptp (hptp-ss)
WO2018068201A1 (en) 2016-10-11 2018-04-19 Nanjing Legend Biotech Co., Ltd. Single-domain antibodies and variants thereof against ctla-4
WO2018071500A1 (en) 2016-10-11 2018-04-19 Agenus Inc. Anti-lag-3 antibodies and methods of use thereof
WO2018128939A1 (en) 2017-01-05 2018-07-12 Gensun Biopharma Inc. Checkpoint regulator antagonists
AU2018277227A1 (en) * 2017-06-02 2019-10-31 Boehringer Ingelheim International Gmbh Anti-cancer combination therapy
US11912754B2 (en) 2017-10-12 2024-02-27 Immunowake Inc. VEGFR-antibody light chain fusion protein
US20200377571A1 (en) * 2017-12-08 2020-12-03 Elstar Therapeutics, Inc. Multispecific molecules and uses thereof
EP3732202A4 (en) 2017-12-28 2022-06-15 Nanjing Legend Biotech Co., Ltd. SINGLE DOMAIN ANTIBODIES AND VARIANTS THEREOF AGAINST TIGIT
US20200369770A1 (en) * 2018-01-08 2020-11-26 Nanjing Legend Biotech Co., Ltd. Multispecific antigen binding proteins and methods of use thereof
SG11202004233UA (en) 2018-01-15 2020-06-29 Nanjing Legend Biotech Co Ltd Single-domain antibodies and variants thereof against pd-1
KR20200140817A (ko) 2018-03-02 2020-12-16 코디악 사이언시스 인코포레이티드 Il-6 항체 그리고 이의 융합 작제물 및 접합체
KR20210028222A (ko) 2018-06-29 2021-03-11 젠선 바이오파마, 인코포레이티드 항종양 면역 체크포인트 조절 길항제
EP3836959A4 (en) * 2018-08-17 2022-05-11 Trican Biotechnology Co., Ltd ANTI-ANGIOGENESIS FUSION PROTEIN AND USES ITS
CN109053895B (zh) * 2018-08-30 2020-06-09 中山康方生物医药有限公司 抗pd-1-抗vegfa的双功能抗体、其药物组合物及其用途
CN113164597A (zh) 2018-09-24 2021-07-23 爱尔皮奥制药公司 靶向HPTP-β（VE-PTP）和VEGF的多特异性抗体
CN113166258B (zh) * 2018-12-03 2023-06-20 宜明昂科生物医药技术（上海）股份有限公司 靶向pd-l1和vegf的重组蛋白
CN111423512B (zh) * 2019-01-10 2024-01-05 北京比洋生物技术有限公司 阻断血管内皮细胞生长且活化t细胞的多靶向融合蛋白和包含其的药物组合物
EP3918323A4 (en) 2019-01-30 2022-12-28 TrueBinding, Inc. ANTI-GAL3 ANTIBODIES AND THEIR USES
CA3134006A1 (en) * 2019-03-26 2020-10-01 Forty Seven, Inc. Multispecific agents for treatment of cancer
US10851157B2 (en) 2019-07-01 2020-12-01 Gensun Biopharma, Inc. Antagonists targeting the TGF-β pathway
CA3157509A1 (en) 2019-10-10 2021-04-15 Kodiak Sciences Inc. Methods of treating an eye disorder
EP4296286A1 (en) * 2021-02-19 2023-12-27 Innovent Biologics (Suzhou) Co., Ltd. Anti-gprc5d×bcma×cd3 trispecific antibody and use thereof
US20220389120A1 (en) * 2021-06-03 2022-12-08 Gensun Biopharma Inc. Multispecific antagonists
WO2024067474A1 (zh) * 2022-09-29 2024-04-04 上海宏成药业有限公司 靶向pd-1，ctla-4和vegf的三特异性抗体及其应用
WO2024114799A1 (zh) * 2022-12-01 2024-06-06 信达生物制药(苏州)有限公司 三特异性融合蛋白及其用途

Family Cites Families (70)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB2116183B (en) 1982-03-03 1985-06-05 Genentech Inc Human antithrombin iii dna sequences therefore expression vehicles and cloning vectors containing such sequences and cell cultures transformed thereby a process for expressing human antithrombin iii and pharmaceutical compositions comprising it
US6582959B2 (en) 1991-03-29 2003-06-24 Genentech, Inc. Antibodies to vascular endothelial cell growth factor
US20030206899A1 (en) 1991-03-29 2003-11-06 Genentech, Inc. Vascular endothelial cell growth factor antagonists
WO1994004679A1 (en) 1991-06-14 1994-03-03 Genentech, Inc. Method for making humanized antibodies
US6121022A (en) 1995-04-14 2000-09-19 Genentech, Inc. Altered polypeptides with increased half-life
US5869046A (en) 1995-04-14 1999-02-09 Genentech, Inc. Altered polypeptides with increased half-life
US6410690B1 (en) 1995-06-07 2002-06-25 Medarex, Inc. Therapeutic compounds comprised of anti-Fc receptor antibodies
US5922845A (en) 1996-07-11 1999-07-13 Medarex, Inc. Therapeutic multispecific compounds comprised of anti-Fcα receptor antibodies
DK0920505T3 (da) 1996-08-16 2008-09-08 Schering Corp Pattedyrcelleoverfladeantigener og tilhörende reagenser
US6111090A (en) 1996-08-16 2000-08-29 Schering Corporation Mammalian cell surface antigens; related reagents
SI1325932T1 (zh) 1997-04-07 2005-08-31 Genentech Inc
US6884879B1 (en) 1997-04-07 2005-04-26 Genentech, Inc. Anti-VEGF antibodies
US20070059302A1 (en) 1997-04-07 2007-03-15 Genentech, Inc. Anti-vegf antibodies
US20020032315A1 (en) 1997-08-06 2002-03-14 Manuel Baca Anti-vegf antibodies
WO1999020758A1 (en) 1997-10-21 1999-04-29 Human Genome Sciences, Inc. Human tumor necrosis factor receptor-like proteins tr11, tr11sv1, and tr11sv2
JP2002502607A (ja) 1998-02-09 2002-01-29 ジェネンテク・インコーポレイテッド 新規な腫瘍壊死因子レセプター相同体及びそれをコードする核酸
US6703020B1 (en) 1999-04-28 2004-03-09 Board Of Regents, The University Of Texas System Antibody conjugate methods for selectively inhibiting VEGF
AU6085700A (en) 1999-07-12 2001-01-30 Genentech Inc. Promotion or inhibition of angiogenesis and cardiovascularization by tumor necrosis factor ligand/receptor homologs
US6528959B2 (en) 2000-07-19 2003-03-04 Honda Giken Kogyo Kabushiki Kaisha Driving force control system for front-and-rear wheel drive vehicles
AU2001296494A1 (en) 2000-10-02 2002-04-15 Arizeke Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for the transport of biologically active agents across cellular barriers
AR039067A1 (es) 2001-11-09 2005-02-09 Pfizer Prod Inc Anticuerpos para cd40
AU2004205684A1 (en) * 2003-01-23 2004-08-05 Genentech, Inc. Methods for producing humanized antibodies and improving yield of antibodies or antigen binding fragments in cell culture
RU2369636C2 (ru) 2003-05-23 2009-10-10 Уайт Лиганд gitr и связанные с лигандом gitr молекулы и антитела и варианты их применения
JP2007525466A (ja) 2003-05-30 2007-09-06 ジェネンテック・インコーポレーテッド 抗ｖｅｇｆ抗体での治療
EP1660126A1 (en) 2003-07-11 2006-05-31 Schering Corporation Agonists or antagonists of the clucocorticoid-induced tumour necrosis factor receptor (gitr) or its ligand for the treatment of immune disorders, infections and cancer
US7758859B2 (en) 2003-08-01 2010-07-20 Genentech, Inc. Anti-VEGF antibodies
US20050106667A1 (en) 2003-08-01 2005-05-19 Genentech, Inc Binding polypeptides with restricted diversity sequences
JP2007518399A (ja) 2003-12-02 2007-07-12 ジェンザイム コーポレイション 肺癌を診断および治療する組成物並びに方法
GB0409799D0 (en) 2004-04-30 2004-06-09 Isis Innovation Method of generating improved immune response
WO2006083289A2 (en) 2004-06-04 2006-08-10 Duke University Methods and compositions for enhancement of immunity by in vivo depletion of immunosuppressive cell activity
WO2006053301A2 (en) 2004-11-12 2006-05-18 Xencor, Inc. Fc variants with altered binding to fcrn
US8367805B2 (en) 2004-11-12 2013-02-05 Xencor, Inc. Fc variants with altered binding to FcRn
PT2343320T (pt) 2005-03-25 2018-01-23 Gitr Inc Anticorpos anti-gitr e as suas utilizações
WO2006117910A1 (ja) 2005-04-28 2006-11-09 Mochida Pharmaceutical Co., Ltd. 抗血小板膜糖蛋白質ⅵモノクローナル抗体
WO2006121168A1 (en) * 2005-05-09 2006-11-16 Ono Pharmaceutical Co., Ltd. Human monoclonal antibodies to programmed death 1(pd-1) and methods for treating cancer using anti-pd-1 antibodies alone or in combination with other immunotherapeutics
US8475798B2 (en) 2005-06-16 2013-07-02 Inhibitex, Inc. Monoclonal antibodies recognizing a coagulase-negative staphylococcal protein
WO2007133822A1 (en) 2006-01-19 2007-11-22 Genzyme Corporation Gitr antibodies for the treatment of cancer
DK2175884T3 (en) 2007-07-12 2016-09-26 Gitr Inc Combination USING GITR BINDING MOLECULES
US8574577B2 (en) * 2008-01-03 2013-11-05 The Scripps Research Institute VEGF antibodies comprising modular recognition domains
NZ590667A (en) 2008-07-02 2013-01-25 Emergent Product Dev Seattle Tgf-b antagonist multi-target binding proteins
JPWO2010030002A1 (ja) 2008-09-12 2012-02-02 国立大学法人三重大学 外来性ｇｉｔｒリガンド発現細胞
US8268314B2 (en) * 2008-10-08 2012-09-18 Hoffmann-La Roche Inc. Bispecific anti-VEGF/anti-ANG-2 antibodies
SG175077A1 (en) 2009-04-07 2011-11-28 Roche Glycart Ag Trivalent, bispecific antibodies
PE20120540A1 (es) * 2009-05-27 2012-05-09 Hoffmann La Roche Anticuerpos triespecificos o tetraespecificos
RU2595409C2 (ru) 2009-09-03 2016-08-27 Мерк Шарп И Доум Корп., Анти-gitr-антитела
GB0919054D0 (en) 2009-10-30 2009-12-16 Isis Innovation Treatment of obesity
KR20120125611A (ko) 2009-12-29 2012-11-16 이머전트 프로덕트 디벨롭먼트 시애틀, 엘엘씨 이종이량체 결합 단백질 및 이의 용도
US8962804B2 (en) * 2010-10-08 2015-02-24 City Of Hope Meditopes and meditope-binding antibodies and uses thereof
WO2012088290A2 (en) * 2010-12-22 2012-06-28 Abbott Laboratories Tri-variable domain binding proteins and uses thereof
US20130108641A1 (en) 2011-09-14 2013-05-02 Sanofi Anti-gitr antibodies
WO2013092998A1 (en) 2011-12-23 2013-06-27 Innate Pharma Enzymatic conjugation of antibodies
KR101704893B1 (ko) 2012-06-15 2017-02-08 화이자 인코포레이티드 Gdf-8에 대한 개선된 길항물질 항체 및 그의 용도
EP2906295A4 (en) 2012-10-15 2016-06-01 Oncomed Pharm Inc METHODS OF TREATING OCULAR DISEASES
JP6571527B2 (ja) 2012-11-21 2019-09-04 ウーハン ワイゼットワイ バイオファルマ カンパニー リミテッドＷｕｈａｎ Ｙｚｙ Ｂｉｏｐｈａｒｍａ Ｃｏ．， Ｌｔｄ． 二重特異性抗体
US20140308285A1 (en) * 2013-03-15 2014-10-16 Amgen Inc. Heterodimeric bispecific antibodies
CA2907181C (en) * 2013-03-15 2023-10-17 Viktor Roschke Multivalent and monovalent multispecific complexes and their uses
DK3021869T3 (da) 2013-07-16 2020-09-21 Hoffmann La Roche Fremgangsmåder til behandling af cancer ved anvendelse af PD-1-aksebindende antagonister og TIGIT-hæmmere
MX2016008190A (es) * 2014-01-06 2016-10-21 Hoffmann La Roche Modulos de lanzadera de barrera cerebral sanguinea monovalente.
TWI681969B (zh) * 2014-01-23 2020-01-11 美商再生元醫藥公司 針對ｐｄ-１的人類抗體
WO2015118175A2 (en) 2014-02-10 2015-08-13 Merck Patent Gmbh TARGETED TGFβ INHIBITION
KR102349370B1 (ko) 2014-05-26 2022-01-10 삼성전자주식회사 인간화 또는 친화도 성숙된 항 앤지오포이에틴-2 항체 및 그의 용도
TWI790593B (zh) 2014-08-19 2023-01-21 美商默沙東有限責任公司 抗tigit抗體
CA2971732A1 (en) 2014-12-23 2016-06-30 Bristol-Myers Squibb Company Antibodies to tigit
EP3932428A1 (en) 2015-05-21 2022-01-05 Harpoon Therapeutics, Inc. Trispecific binding proteins and methods of use
TWI715587B (zh) 2015-05-28 2021-01-11 美商安可美德藥物股份有限公司 Ｔｉｇｉｔ結合劑和彼之用途
CN105175545B (zh) * 2015-10-20 2019-01-25 安徽瀚海博兴生物技术有限公司 一种抗vegf-抗pd-1双功能抗体及其应用
RU2744959C2 (ru) 2016-03-23 2021-03-17 Мэбспейс Байосайнсиз (Сучжоу) Ко., Лтд Новые анти-pd-l1 антитела
CN109069638B (zh) 2016-03-24 2022-03-29 璟尚生物制药公司 用于癌症治疗的三特异性抑制剂
US10787518B2 (en) 2016-06-14 2020-09-29 Xencor, Inc. Bispecific checkpoint inhibitor antibodies
WO2018128939A1 (en) 2017-01-05 2018-07-12 Gensun Biopharma Inc. Checkpoint regulator antagonists

Also Published As

Publication number Publication date
CN109069638A (zh) 2018-12-21
US10894823B2 (en) 2021-01-19
EP3432927A1 (en) 2019-01-30
US20210115123A1 (en) 2021-04-22
US20170275353A1 (en) 2017-09-28
EP3432927A4 (en) 2019-11-20
WO2017165681A1 (en) 2017-09-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN109069638B (zh) 用于癌症治疗的三特异性抑制剂
CN109071656B (zh) 检查点调节物拮抗剂
JP7043422B2 (ja) Ｃ末端融合ｔｎｆファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子
JP7575100B2 (ja) 免疫細胞活性化のための二重特異性抗体
ES2788979T3 (es) Moléculas de unión a antígeno que comprenden un trímero de ligando de la familia de TNF
CN112739717A (zh) 三特异性拮抗剂
TW201831513A (zh) 結合物件(一)
CN112424229B (zh) 结合cd137和ox40的抗体分子
JP2019524053A (ja) Ｔｎｆファミリーリガンドトリマーとｐｄ１結合部分とを含む抗原結合分子
CA2957146A1 (en) Combination therapies with anti cd40 antibodies
CA3106046A1 (en) Antibody molecules that bind pd-l1 and cd137
TW202219065A (zh) 免疫活化 Fc 域結合分子
JP2024028761A (ja) 変異したＴＧＦβ１－ＲＩＩ細胞外ドメインおよび免疫グロブリン足場で構成される抗腫瘍アンタゴニスト
CN114026122A (zh) 结合t细胞相关癌细胞的多功能分子及其用途
JP2023527583A (ja) Ｌａｇ３に結合する抗体およびその使用
JP2024099018A (ja) 免疫細胞関与効果を調節するための手段および方法。
KR20210110818A (ko) Rank 길항제 및 이에 대한 용도
JP2023503399A (ja) 抗ｔｉｍ３抗体と組み合わせて抗ｏｘ４０抗体を用いるがんを治療する方法
CN114729048A (zh) 使用抗ox40抗体与tlr激动剂组合治疗癌症的方法
CN112638401B (zh) 抗肿瘤拮抗剂
CN114340735B (zh) 突变的TGFβ1-RII胞外域和免疫球蛋白支架组成的抗肿瘤拮抗剂
WO2023199927A1 (ja) がん治療におけるｐｄ－１シグナル阻害剤との組み合わせによる抗ｔｓｐａｎ８－抗ｃｄ３二重特異性抗体の使用
WO2024076864A2 (en) Anti-ror1 antibodies and uses thereof
WO2024182475A2 (en) Anti-ror2 antibodies and uses thereof
WO2024102604A1 (en) Anti-5t4 antibodies and uses thereof

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
CB02 Change of applicant information

Address after: American California

Applicant after: Wong Shang Biopharmaceutical Company

Address before: American California

Applicant before: Yuansheng Biopharmaceutical Co., Ltd.

CB02 Change of applicant information
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant